BRPI0710694A2 - métodos para extrair um ou mais componentes de levedura e para produzir um extrato de levedura, e, uso de uma fosfolipase purificada - Google Patents

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Abstract

MéTODOS PARA EXTRAIR UM OU MAIS COMPONENTES DE LEVEDURA E PARA PRODUZIR UM EXTRATO DE LEVEDURA, E,USO DE UMA FOSFOLIPASE PURIFICADA A presente invenção refere-se a um método para extrair componentes de células de levedura com uma fosfolipase purificada.

Description

ARA EXTRAIR UM OU MAIS COMPONENTES DELEVEDURA E PARA PRODUZIR UM EXTRATO DE LEVEDURA, E,USO DE UMA FOSFOLIPASE PURIFICADA"CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a um método para extraircomponentes a partir de uma cultura de célula de levedura com umafosfolipase.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
As culturas de levedura são usadas com uma fonte para aextração de vários componentes. O termo "extrato de levedura" é usado deum modo geral para um concentrado de material solúvel derivado a partir decélulas de levedura, que foram submetidas à hidrólise de material celular, emparticular de proteínas, carboidratos solúveis e ácidos nucléicos. As células delevedura podem ser também usadas como uma fonte para componentesespecíficos, que são extraídos e purificados a partir de células de levedura.Estes componentes podem ser produzidos naturalmente pela levedura emquestão ou podem ser produzidos por células de levedura após a manipulaçãogenética. Tanto quando da produção do extrato de levedura, como quando dapurificação de componentes específicos a partir de culturas de células delevedura, existe um desejo para aumentar o rendimento do produto deinteresse, de modo a aperfeiçoar a economia de produção. A produção deextratos de levedura é descrita nas páginas 240- 251 de Nagodawithana(1995) Savory Flavours, Esteekay Associates, Inc., Wisconsin, USA.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores verificaram que o tratamento de uma cultura decélula de levedura com uma fosfolipase facilita a extração de componentes apartir da cultura. Deste modo, a presente invenção está relacionada a ummétodo para a extração de um ou mais componentes a partir da levedura, ométodo compreendendo: i) tratar as células de levedura com umafosfolipase;e ii) separar um ou mais componentes desejados a partir dascélulas de levedura tratadas. Em outros aspectos, a invenção refere-se a ummétodo para a produção de um extrato de levedura e ao uso de umafosfolipase purificada, de modo a extrair um ou mais componentes a partir deuma cultura de célula de levedura.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Levedura
Uma cultura de célula de levedura a ser usada no método dainvenção pode ser uma cultura de qualquer levedura, por exemplo uma cepade Saccharomyces, por exemplo S. eerevisiae, S. uvarum; uma cepa deKluyveromyces, por exemplo K. fragilis e K. marxianus; ou uma cepa deCandida, por exemplo C. utilis. A cultura de célula de levedura pode serselecionada para a sua produção a partir de um ou mais componentesdesejados e/ou pode ter sido geneticamente modificada, de modo a produzirum ou mais componentes específicos e/ou para aumentar o rendimento de umou mais componentes específicos. Os métodos para a modificação genética decélulas de levedura, por exemplo, através da inserção de DNA que codificaum componente de proteína desejado, é bem conhecido na técnica. A culturada célula de levedura pode ser propagada sob condições favoráveis aocrescimento da cultura da célula e/ ou favorável à produção de um ou maiscomponentes desejados em um alto rendimento, antes de ser submetida aométodo da invenção.
Componente a ser extraído
Um componente a ser extraído a partir de levedura através dométodo da invenção pode ser qualquer componente produzido naturalmentepor uma levedura ou qualquer componente produzido por uma levedura, quetenha sido geneticamente modificado, de modo a produzir o componentedesejado. Os componentes, que podem ser produzidos em levedura incluem,por exemplo, enzimas; vitaminas, por exemplo BI, B6 e B12; antibióticos;astaxantina; poliidróxialcanoatos; licopeno; beta-caroteno; Albumina de SoroHumano; gama- deltalactona; e cis-3-hexanol. Em uma modalidade dainvenção, um componente a ser extraído a partir de levedura é uma proteína,de modo particular uma enzima, por exemplo uma lactase. Em uma outramodalidade da invenção, um componente a ser extraído a partir de levedura éum componente não- proteína, por exemplo um carboidrato. Em umamodalidade da invenção, o um ou mais componentes a serem extraídos sãoum extrato de levedura, tal como abaixo descrito.
Separação
De acordo com a invenção, o um ou mais componentesdesejados são separados a partir da cultura da célula de levedura após otratamento com uma fosfolipase. A separação pode ser alcançada através dequalquer método conhecido na técnica, dependendo do um ou maiscomponentes específicos a serem separados. A separação pode ser alcançada,por exemplo, através de centrifugação; filtração, por exemplo microfiltraçãoou ultrafiltração; técnicas cromatográficas, por exemplo cromatografia deexclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia deafinidade, cromatografia de interação hidrofóbica; e/ ou precipitação, porexemplo através da adição de um sal, tal que, por exemplo, sulfato de amônio.
A separação pode ser alcançada através de uma combinação de várias técnicasde separação, por exemplo a centrifugação pode ser usada para remover osfragmentos da parede celular, e uma ou mais técnicas cromatográficas podemser subseqüentemente usadas para separar o um ou mais componentesespecíficos.
De modo a facilitar a separação, as células de levedura podemser submetidas a métodos para a ruptura das células de levedura antes daseparação, por exemplo, a homogeneização e/ ou a adição de um ou maiscomponentes que facilitam a ruptura da célula, por exemplo cloreto de sódio,acetato de etila ou isopropanol.O método da invenção pode facilitar a separação de um oumais componentes desejados a partir de uma cultura de levedura, por exemploatravés da redução da quantidade de material em partículas a ser removido. Ométodo pode ainda aumentar o rendimento de um ou mais componentesdesejados, comparado a métodos de extração similares, não incluindo otratamento com uma fosfolipase.
Hidrólise
Em uma modalidade da invenção, a cultura da célula delevedura é submetida à hidrólise de proteína antes, após ou durante otratamento com fosfolipase. A hidrólise de proteína pode ser alcançadaatravés de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo através deenzimas proteolíticas. As enzimas proteolíticas podem, por exemplo, serenzimas proteolíticas presentes nas células de levedura e liberadas, porexemplo, através da ruptura mecânica das células, através de plasmólise ou deautólise. Uma ou mais enzimas proteolíticas purificadas podem ser tambémadicionadas à cultura de célula de levedura. A hidrólise pode ser alcançadacomo descrito abaixo sob extratos de levedura.
Extrato de Levedura
Em uma modalidade da invenção, o um ou mais componentesa serem extraídos são um extrato de levedura. Deste modo, em umamodalidade, a invenção refere-se a um método para a produção de um extratode levedura, em que o método compreende : i) tratar as células de leveduracom uma fosfolipase purificada; e ii) submeter as células de levedura tratadasà hidrólise de proteína;e iii) remover os componentes da célula de levedura;em que o estágio ii) é conduzido antes, após ou durante o estágio i).
O extrato de levedura é um concentrado de material solúvelderivado a partir de culturas de célula de levedura após a hidrólise do materialcelular, em especial proteínas, carboidratos solúveis e ácidos nucléicos. Osextratos de levedura são úteis em aplicações alimentares como agentes /aperfeiçoadores aromatizantes, assim como na promoção do crescimentomicrobiano em fermentações industriais. O valor dos extratos de leveduradepende, em um alto grau, da quantidade de proteína no extrato, havendo,deste modo, um desejo de que seja alcançado um rendimento de proteína maisalto possível. A matéria prima para a produção dos extratos de levedura podeser qualquer cultura de célula de levedura a partir de qualquer fonte. De ummodo usual, a matéria prima é ou uma cultura de célula de leveduradesenvolvida especialmente para a produção de extrato de levedura ou delevedura de cervejaria gasta, que é descartada pelas cervejarias após o uso nacerveja. A produção de extrato de levedura é bem conhecida na técnica. Asculturas de levedura usadas para a produção de extrato de levedura incluem,por exemplo, cepas de Saccharomyces, por exemplo S. eerevisiae, S. uvarum,cepas de Kluyveromyces, por exemplo K. fragilis e K. marxianus, e cepas deCandida, por exemplo C. utilis. Se levedura de cervejaria gasta for usada, elaé, de um modo freqüente, submetida à desacidificação, de modo a remover osaromatizantes amargos, por exemplo através de lavagem em um pH de 8-9,antes da produção do extrato.
A hidrólise é executada, de um modo usual, como umaautólise, em que as enzimas hidrolíticas das próprias células de levedura sãoutilizadas para a ruptura de células e para a hidrólise de componentescelulares. Para a autólise, o pH e a temperatura são controlados, de um modousual, de modo a que seja alcançada a morte das células de levedura sem ainiciação das enzimas internas. A autólise pode, por exemplo, ser executadaem um pH de 7, em de 55-60°C, durante 20 horas. Aquele versado na técnicapode selecionar as condições de pH e de temperatura adequadas para a culturade levedura específica e as características de aromatizante desejadas. Ascondições de pH e de temperatura podem também afetar o rendimento doextrato alcançado. O grau de autólise pode, por exemplo, ser medido atravésda razão de amino nitrogênio (NA) em relação à quantidade de nitrogêniototal (TN) no autolisado. Para meios altamente autolisados, uma razão de AN/TN de 0,4- 0,5 é comum.
Uma ou mais enzimas hidrolíticas podem ser adicionadas, demodo a facilitar a hidrólise. O mais comum é a adição de protease, de modo aaumentar a taxa de hidrólise de proteína. Qualquer protease, que seja ativa sobcondições específicas pode ser usada, dependendo das característicasdesejadas do produto. Uma protease a ser usada pode, por exemplo, ser deuma origem animal, de planta ou microbiana, pode exemplo derivada de umabactéria ou fungo. As proteases, que podem ser adicionadas, incluem papaína,subtilisina, por exemplo Subtilisina Carlsberg, ou proteases fungicas, porexemplo derivadas a partir de uma cepa de Aspergillus, por exemplo A.oryzae. Exemplos de proteases comerciais, úteis no processo da invenção,incluem Alcalase® e Flavourenzyme®, ambas disponíveis de NovoenzymesA / S, Bagsvaerd, Dinamarca. Em uma modalidade da invenção, uma ou maisproteases purificadas são adicionadas, de modo a facilitar a hidrólise daproteína.
A hidrólise pode ser também alcançada através da plasmólise,em que é adicionado um composto, por exemplo, cloreto de sódio, acetato deetila ou isopropanol, que induz a morte celular e a ruptura celular, conduzindoà liberação de enzimas hidrolíticas internas. A autólise e a plasmólise podemser combinadas, por exemplo, através da adição de cloreto de sódio ao meio,após o processo de autólise ter sido permitido durante um período de tempodefinido .
A hidrólise ácida pode ser também usada para a obtenção dehidrólise de componentes de célula de levedura. A hidrólise ácida pode, porexemplo, ser executada através da adição de ácido clorídrico a uma cultura delevedura, de um modo usual a cultura de levedura estando sob a forma de umasuspensão com uma concentração de sólidos de 65 - 80%. A hidrólise éexecutada, de modo freqüente, em temperaturas elevadas, por exemplo de atécerca de 100°C, e pode, por exemplo, ser executada em um evaporador defilme cadente. Após ser alcançado o nível de amino nitrogênio requerido, ohidrolisado pode ser ajustado para o pH desejado, por exemplo, um pH de 5-7, de um modo usual com hidróxido de sódio.
Após a hidrólise dos componentes indesejáveis, os fragmentoscelulares tipicamente não- hidrolisados são removidos através de separação,de modo a produzir o extrato de levedura. A separação pode ser alcançadaatravés de qualquer método adequado conhecido na técnica, de um modotípico através de centrifugação e/ ou filtração. O extrato pode ser submetido àpasteurização, de modo a exterminar quaisquer células vegetativas, de modo ainativar enzimas e a evitar o crescimento de contaminantes microbiológicos.O extrato deverá ser, de um modo usual, concentrado, por exemplo, através deevaporação em um evaporador de filme cadente. O concentrado pode sertambém secado, por exemplo, através de secagem por pulverização ousecagem em tambor, de modo a que seja fornecido um pó de extrato delevedura. O produto final é vendido, de um modo usual, como um líquido,pasta ou pó.
Fosfolipase
Uma fosfolipase usada no processo da presente invenção podeincluir a fosfolipase Αχ, fosfolipase A2, fosfolipase B, fosfolipase C, efosfolipase D, e qualquer combinação das mesmas. No processo da invenção,uma cultura de célula de levedura é tratada com uma fosfolipase, por exemplouma fosfolipase única; duas ou mais fosfolipases, por exemplo duasfosfolipases, incluindo, sem limitação, o tratamento com ambos os tipos A eB; ambos os tipos A1 e A2; ambos os tipos Ai e B; ambos os tipos A2 e B;ambos os tipos A1 e C; ambos os tipos A2 e C; ou o tratamento com duas oumais fosfolipases diferentes, do mesmo tipo. Está também incluído otratamento com um tipo de fosfolipase, tal que A1, A2, B, C ou D.
A atividade de fosfolipase pode ser provida por enzimas tendotambém outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase com atividade defosfolipase. A atividade de fosfolipase pode ser, por exemplo, a partir de umalipase com atividade colateral de fosfolipase. Em outras modalidades dainvenção, a atividade da enzima fosfolipase é provida por uma enzima tendoessencialmente apenas atividade de fosfolipase e em que a atividade defosfolipase não é uma atividade colateral.
A fosfolipase Aj é definida de acordo com a classificação deenzima padrão EC como EC 3.1.1.32.
Nome Oficial: Fosfolipase A1
Reação catalisada:
Fosfatidilcolina + água <=> 2-acilglicerofosfocolina + ânion de
ácido graxo
Observação : possui uma especificidade muito mais ampla doque EC 3. 1.1.4.
A fosfolipase A2 é definida de acordo com a classificação deenzima padrão EC como EC 3.1.1.4.
Nome Oficial: Fosfolipase A2
Nomes alternativos : fosfatidilcolina 2- acilidrolase
Lecitinase a : fosfatidase; ou fosfatidolipase.
Reação catalisada:
fosfatidilcolina + água <^>1- acilglicerofosfocolina + ânion de
ácido graxo
Observação : age também em fosfatidiletanolamina, colinaplasmalogênio e fosfatídeos, removendo o ácido graxo ligado à posição 2.
A fosfolipase B é definida de acordo com a classificação deenzima padrão EC como EC 3.1.1.5
Nome Oficial: lisofosfolipase
Nomes Alternativos : lecitinase b; lisolecitinase;
Fosfolipase B; ou PLB.Reação catalisada :
2-lisofosfatidilcolina + água glicerofosfocolina + ânion deácido graxo.
A fosfolipase C é definida de acordo com a classificação deenzima EC como EC 3.1.4.3.
A fosfolipase C hidrolisa a ligação de fosfato defosfatidilcolina e outros glicerofosfolipídeos, por exemplofosfatidiletanolamina, fornecendo diacilglicerol; esta enzima irá tambémhidrolisar as ligações de fosfato de esfingomielina, cardiolipina, colinaplasmalogênio e fosfolipídeos de ceramida.
Reação com fosfatidilcolina :
Fosfatidilcolina + água <=> 1,2- diacilglicerol + fosfato decolina
A fosfolipase D é definida de acordo com a classificação deenzima padrão EC como EC 3.1.4.4.
A fosfolipase D hidrolisa as ligações de fosfato defosfolipídeos e esfingomielina de modo a fornecer o ácido fosfatídicocorrespondente.
Reação com fosfatidilcolina : A fosfatidilcolina + água Ocolina + um fosfatidato
Fosfolipase A
A atividade de fosfolipase A, que inclui fosfolipase A,fosfolipase A2, e combinações dos mesmos podem ser providas pelas enzimastendo igualmente outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase comatividade de fosfolipase A. A atividade de fosfolipase A pode, por exemplo,ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase. Em outrasmodalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase A é provida poruma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipase, e em que aatividade de enzima fosfolipase A não é uma atividade colateral.A fosfolipase A pode ser de qualquer origem, por exemplo deorigem animal (tal que, por exemplo, de mamífero) por exemplo, do pâncreas(por exemplo, pâncreas bovino ou porcino) ou de veneno de cobra ou deveneno de abelhas. De um modo alternativo, a fosfolipase A pode ser deorigem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, de levedura ou debactérias, tais que do gênero ou espécie Aspergillus, por exemplo A. niger;Dictyostelium, por exemplo, D. diseoideum·, Mucor, por exemplo Mjavanieus, M. mueedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo N. crassa;Rhizomueor, por exemplo R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R.japonieus, R. stolonifer, Selerotinia, por exemplo S. libertiana; Triehophyton,por exemplo T. rubrum\ Whetzelinia, por exemplo W. selerotiorum; Bacillus,por exemplo B. megaterium, B. subtilis; Citrobaeter, por exemplo C.frendir,Enterobaeter, por exemplo E. aerogenes, E. eloaeae Edwardsiella, E. tarda;Erwinia, por exemplo E. herbicola\ Eseheriehia, por exemplo E. eoli;Klebsiella, por exemplo K. pneumoniae\ Proteus, por exemplo P. vulgaris;Providencia, por exemplo P. Stuartii; Salmonella, por exemplo S.typhimurium\ Serratia, por exemplo S. Iiquefaseiens, S. macescens; Shigella,por exemplo S. flexnerv, Streptomyces, por exemplo, S. violaeeoruber;Yersinia, por exemplo Y. enterocolitica. Deste modo, a fosfolipase A pode serfungica, por exemplo a partir da classe Pyrenomycetas, tal que do gêneroFusarium, tal que uma cepa de F. eulmorum, F. heerosporum, F. solani, ouuma cepa de F. oxysporum. A fosfolipase A pode ser também de uma cepa defungo filamentoso dentro do gênero Aspergillus, tal que uma cepa deAspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Uma fosfolipase A preferida é derivada a partirde uma cepa de Fusarium, em particular de F. veneratum ou de F. oxysporum,por exemplo a partir da cepa DSM 2672, tal como descrito na WO 98 / 26057,descrita em especial na reivindicação 36 e na SEQ ID NO. 2, da WO 98/2600057. Uma outra fosfolipase A preferida é PLA de Streptomyces, tal que,por exemplo, PLA 2 de S. violaceoruber. Em outras modalidades, afosfolipase é uma fosfolipase, tal como descrita na WO 00/ 32758(Novoenzymes A / S, Dinamarca).
A atividade de uma fosfolipase do tipo A pode ser expressa emUnidades de Lecitase (LEU). A atividade de fosfolipase em Unidades deLecitase é medida em relação a um padrão de fosfolipase usando lecitinacomo um substrato. A fosfolipase A catalisa a hidrólise de lecitina paraisolecitina e um ácido graxo livre. O ácido graxo liberado é titulado comhidróxido de sódio 0,1 N, sob condições convencionais (pH 8,00; 40, OO0C ±0,5). A atividade de fosfolipase A é determinada como a taxa de consumo dehidróxido de sódio durante a neutralização do ácido graxo e é expressa emunidades de Lecitase (LEU) em relação a um padrão de Lecitase (fosfolipase)(disponível de Novoenzymes A / S, Bagsvaerd, Dinamarca). 1 LEU é definidocomo a quantidade de enzima, que sob condições convencionais (pH 8,00, 40,OO0C ± 0,5) resulta na mesma taxa de consumo de hidróxido de sódio (μmol/minuto) como o padrão de Lecitase diluído para uma atividade nominal de 1LEU/g.
Fosfolipase B
O termo "fosfolipase B" usado aqui em conexão com umaenzima da invenção, tem a intenção de abranger uma enzima com atividadede fosfolipase B.
A atividade de fosfolipase B pode ser provida pelas enzimasque possuem também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipasecom atividade de fosfolipase Β. A atividade de fosfolipase B pode, porexemplo, ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase B. Emoutras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase B éprovida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipaseB, e em que a atividade da enzima fosfolipase B não é uma atividadecolateral. Em uma modalidade da invenção, a fosfolipase B não se refere alipases tendo atividade colateral de fosfolipase B, tal como definido na WO98 / 26057.
A fosfolipase B pode ser de qualquer origem, por exemplo, deorigem animal (tal que, por exemplo, de mamífero), por exemplo do fígado(por exemplo, fígado de rato). De um modo alternativo, a fosfolipase B podeser de origem microbiana, por exemplo de fungos filamentosos, leveduras oubactérias, tais que do gênero ou espécie Aspergillus, por exemplo A. foetidus,A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae; Botrytis, por exemplo, B.cinerea; Candida, por exemplo C. alicans\ Cryptococcus, por exemplo C.neoformans, Eseheriehia, por exemplo E. eoli, Fusarium, por exemplo F.sporotriehoides, F. veneratum, F. vetieilloides; Hyphozyma; Kluyveromyces,por exemplo, K. laetis\ Magnaporte, por exemplo M. grisea; Metarhizium,por exemplo, M anisopliae; Myeosphaerella, por exemplo M. raminieola\Neurospora, por exemplo N. crassa; Peniicilllium, por exemplo P. notatum\Saccharomyees, por exemplo S. eerevisiae; Sehizosaccharomyees, porexemplo, S. pombe\ Torulaspora, por exemplo T. delbrueekii; Vibrio, porexemplo V. eholarae. Uma fosfolipase B preferida é derivada a partir de umacepa de Aspergillus, em particular fosfolipase LLPL-I ou LLPL-2 de A. niger,por exemplo como contida nos clones de Eseheriehia eoli DSM 13003 ouDSM 13004, ou fosfolipase LLPL-I ou LLPL-2, de A. oryzae, por exemplo,como contida nos clones de E. eoli DSM 13082 ou DSM 13083, conformedescrito na WO 01/ 27251, em especial conforme descrito na reivindicação 1e SEQ ID N°s. 2, 4, 6 ou 8 da WO 01/27251.Fosfolipase C
A atividade de fosfolipase C pode ser provida por enzimastendo também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase comatividade de fosfolipase C ou uma fosfatase com atividade de fosfolipase C. Aatividade de fosfolipase C pode, por exemplo, ser de uma lipase comatividade colateral de fosfolipase C. Em outras modalidades da invenção, aatividade da enzima fosfolipase C é provida por uma enzima tendoessencialmente apenas atividade e fosfolipase C e em que a atividade daenzima fosfolipase C não é uma atividade colateral.
A fosfolipase C pode ser de qualquer origem, por exemplo deorigem animal, tal que de origem de mamífero, ou de origem de planta, ou deorigem microbiana, tal que de origem fungica ou de origem bacteriana, tal quea partir de uma cepa de Mycobacterium, por exemplo M. tuberculosis ou M.bovis; uma cepa de Bacillus, por exemplo B. cereus; uma cepa deClostridium, por exemplo C. bifermentans, C. haemolyticum, C. novyi, C.sordelli, ou C. perfringens\ uma cepa de Listeria, por exemplo L.monocytogenes; uma cepa de Pseudomonas, por exemplo P. aeruginosa, ouuma cepa de Staphylococcus, por exemplo S. aureus; ou uma cepa deBurkolderia, por exemplo B. pseudomallei.
Fosfolipase D
A atividade de fosfolipase D pode ser provida por enzimastendo também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase comatividade de fosfolipase D, uma fosfatase com atividade de fosfolipase D, ouuma colinesterase com atividade de fosfolipase D. A atividade de fosfolipaseD pode, por exemplo, ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipaseD. Em outras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase D éprovida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipaseD, e em que a atividade da enzima fosfolipase D não é uma atividadecolateral.
A fosfolipase D pode ser de qualquer origem, por exemplo deorigem animal, tal que de origem de mamífero, por exemplo de camundongo,rato ou criceto chinês; de origem de planta, por exemplo, de repolho, milho,arroz, mamona, tabaco, ervilha, ou Arabidopsis thaliana\ ou de origemmicrobiana, tal que de origem bacteriana, por exemplo de uma cepa deCoryne bacterium, por exemplo de C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, ou C.haemolyticum-, ou de origem fungica, tal que, por exemplo, a partir de umacepa de Strepomyces, por exemplo S. antibioticus ou S. chromofuscus; umacepa de Trichoderma, por exemplo T. resei; uma cepa de Saccharomyces, porexemplo S. eerevisiae; ou uma cepa de Aspergillus, por exemplo A. oryzae, A.niger,A. nidulans ou A. fumigatus.
Formulação e fontes de enzima
A fosfolipase usada no processo da invenção pode ser derivadade ou obtenível a partir de quaisquer fontes aqui mencionadas. O termo"derivado" significa, neste contexto, que a enzima pode ser sido isolada apartir de um organismo, em que ela está presente de um modo nativo, isto é aidentificação da seqüência de aminoácido da enzima é idêntica à de umaenzima nativa. O termo "derivado" também significa que as enzimas podemter sido produzidas de modo recombinante em um organismo hospedeiro, aenzima produzida de modo recombinante tendo ou uma identidade idêntica auma enzima nativa ou tendo uma seqüência de aminoácido modificada, porexemplo tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ ousubstituídos, isto é, uma enzima produzida de modo recombinante, que é ummutante e/ ou um fragmento de uma seqüência de aminoácido nativa. Dentrodo significado de uma enzima nativa estão incluídas as variantes naturais.Além disso, o termo "derivado" inclui enzimas produzidas sinteticamente, porexemplo, através da síntese de peptídeo. O termo "derivado" também abrangeenzimas, que foram modificadas, por exemplo, através de glicosilação,fosforilação, etc., seja in vivo ou in vitro. O termo " obtenível" neste contextosignifica que a enzima possui uma seqüência de aminoácido idêntica a umaenzima nativa. O termo abrange uma enzima, que foi isolada a partir de umorganismo, em que ela estava presente de um modo nativo, ou uma em queele foi expresso, de modo recombinante, no mesmo tipo de organismo ououtro, ou enzimas produzidas, de um modo sintético, através da síntese depeptídeo. Com relação à enzima produzida de um modo recombinante, ostermos " obtenível" e "derivado" referem-se à identidade da enzima e não àidentidade do organismo hospedeiro, no qual ela é produzida de um modorecombinante.
Deste modo, a fosfolipase pode ser obtida a partir de ummicroorganismo através do uso de qualquer técnica adequada. Por exemplo,uma preparação de enzima fosfolipase pode ser obtida pela fermentação deum microorganismo adequado e subseqüente isolamento de uma preparaçãode fosfolipase a partir do caldo fermentado resultante ou do microorganismo,através de métodos conhecidos na técnica. A fosfolipase pode ser tambémobtida através do uso de técnicas de DNA recombinante. Um tal métodocompreende o cultivo de uma célula hospedeira, transformada com um vetorde DNA recombinante, que compreende uma seqüência de DNA, que codificaa fosfolipase em questão e a seqüência de DNA sendo operacionalmenteligada com um sinal de expressão apropriado, de tal modo que seja capaz deexpressar a fosfolipase em um meio de cultura, sob condições que permitam aexpressão da enzima e a recuperação da enzima a partir da cultura. Aseqüência de DNA pode ser também incorporada no genoma da célulahospedeira. A seqüência de DNA pode ser de origem genômica, cDNA ousintética, ou quaisquer combinações destas, e pode ser isolada ou sintetizadade acordo com os métodos conhecidos na técnica.
Fosfolipases adequadas estão disponíveis comercialmente.Exemplos de enzimas comerciais são, por exemplo, Lecitase® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), YieldMAX® (Novozymes AJ S, Bagsvaerd,Dinamarca e Chr. Hansen AJ S, Horsholm, Dinamarca), Lysomax®(Genencor International, Inc. Palo Alto, Califórnia) ou Purifine™ (diversaCorp., San Diego, Califórnia). Uma fosfolipase B adequada é, por exemplo, afosfolipase Aspergillus niger LLPL-2, que pode ser produzida, de um modorecombinante, em A. niger, conforme descrito na WO 01/17251.
No processo da invenção, a fosfolipase é uma fosfolipasepurificada. O termo " purificado", como aqui usado, abrange as preparaçõesde enzima fosfolipase, em que os componentes do organismo, a partir do qualela é derivada, foram removidos. O termo " purificado" também abrange aproteína da enzima fosfolipase livre de componentes do organismo nativo, apartir dos quais ela é obtida, e é também denominada fosfolipase"essencialmente pura" e pode ser particularmente relevante para asfosfolipases que são de ocorrência natural e que não foram modificadasgeneticamente, tal que por deleção, substituição ou inserção de um ou maisresíduos de aminoácido.
Deste modo, a fosfolipase é purificada, ou seja, apenasquantidades menores de outras proteínas estando presentes. A expressão "outras proteínas" refere-se, de modo particular, a outras enzimas. O termo"purificado", como aqui usado, refere-se à remoção de outros componentes,em particular de outras proteínas e de modo mais particular outras enzimaspresentes na célula de origem da fosfolipase. A fosfolipase pode ser "substancialmente pura", isto é livre de outros componentes a partir doorganismo no qual ela é produzida, isto é, por exemplo, um organismohospedeiro para a fosfolipase produzida de modo recombinante.Preferivelmente, as enzimas são pelo menos 75% (p/p) puras, de um modomais preferido pelo menos 80%, 85%, 90% ou ainda pelo menos 95% puras.Em uma modalidade ainda mais preferida, a fosfolipase está em pelo menos98% da preparação de enzima pura.
Os termos "fosfolipase" incluem quaisquer compostosauxiliares, que possam ser necessários para a atividade catalítica da enzima,tal que, por exemplo, um aceitador ou co-fator apropriado, que pode ou nãoestar naturalmente presente no sistema de reação.
A fosfolipase pode estar em qualquer forma adequada para ouso em questão, tal que, por exemplo, sob a forma de um pó seco ougranulado, um granulado não- pulverizado, um líquido, um líquidoestabilizado, ou uma enzima protegida. Os granulados podem ser produzidos,por exemplo, como exposto na US 4.106. 991 e US. 4.661.452, e podem, deum modo opcional, ser revestidos através de métodos conhecidos na técnica.Preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas através da adição de estabilizadores, tais que um açúcar, um álcool de açúcar ou umoutro poliol, ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo com osmétodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas deacordo com o método exposto na EP 238216.
Tratamento com fosfolipase
De acordo com a invenção, as células de levedura são tratadascom uma fosfolipase purificada. O tratamento pode ser conduzido através dequalquer método apropriado, por exemplo através da adição da fosfolipase àcultura da célula de levedura. A cultura da célula de levedura pode, porexemplo, ser suspensa em água quando tratada com uma fosfolipase. Otratamento com uma fosfolipase pode ser conduzido antes, após ousimultaneamente com que a cultura de célula de levedura seja submetida àhidrólise de proteína.
Condições adequadas, sob as quais executar o tratamento defosfolipase, podem ser encontradas pela pessoa versada na técnica através dosmétodos usuais conhecidos na técnica para a otimização das reaçõesenzimáticas. Aquele versado na técnica saberá como ajustar os parâmetros,tais que o pH, temperatura, e quantidade de fosfolipase, de modo a alcançar osresultados desejados. Em uma modalidade da invenção, o tratamento comfosfolipase é conduzido em um pH de entre o pH 2 e o pH 10, tal que entre opH 3 e o pH 9, entre o pH 2 e o pH 6, ou entre o pH 4 e o pH 6. A quantidadede fosfolipase a ser usada no método da invenção pode depender da atividadeda fosfolipase específica. Quando uma fosfolipase A é usada, a quantidade defosfolipase pode, por exemplo estar entre 0,001 e 1 mg de proteína deenzima/g de matéria seca, tal que, por exemplo, entre 0,005 e 0,1 mg deproteína de enzima /g de matéria seca. Em uma modalidade da invenção, umafosfolipase é adicionada em uma quantidade suficiente para alcançar umrendimento aumentado de um ou mais componentes a serem extraídos,comparado a um processo de extração de similar, em que não ocorretratamento com uma fosfolipase. O rendimento pode, por exemplo, seraumentado em pelo menos 1 %, tal que em pelo menos 2 %, pelo menos 5%,pelo menos 10%, ou pelo menos 20%.
Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso de umafosfolipase purificada, por exemplo, uma fosfolipase A, para a extração de umou mais componentes a partir de uma cultura de célula de levedura.
EXEMPLO
Exemplo 1
Um cultura de célula de levedura em bloco de Saccharomyceseerevisiae foi misturada com água deionizada, de modo a alcançar um teor dematéria seca de 14% e foi agitada em um agitador magnético, durante 60minutos, em temperatura ambiente. A quantidade de nitrogênio nesta misturade levedura foi determinada através de um método de combustão em um LecoFP - 528. Os sólidos secos são medidos na mistura de levedura através depesagem (após a secagem a 105°C). A mistura de levedura foi aquecida a55°C e o pH ajustado para 6,5 com NaOH 4 N. As amostras foram tratadascom 0,25% (peso/ peso de matéria seca de levedura) de uma fosfolipase(Lecitase® Ultra, 10 kLU/ g de Novozymes AJ S, Dinamarca) e /ou 0,5%(peso/ peso de matéria seca de levedura) de uma enzima proteolítica(Alcalase® 2, 4 1, Novozymes AJ S, Dinamarca). As enzimas foramadicionadas à mistura de levedura após dez minutos de aquecimento prévio a55°C. Uma amostra de controle (neutra) não foi tratada com a enzima. Aautólise foi executada durante 22 horas a 55°C, sob agitação magnética.Amostras de 20 ml foram tomadas e a quantidade exata foi pesada. Asamostras foram inativadas a 85°C, durante 10 minutos. Após a inativação, asamostras foram centrifugadas durante 10 minutos, a 3500 rpm, usando umaparelho Multifuge 3 S -R de Heraeus. A quantidade de extrato foi pesadaapós a decantação. Os sólidos secos foram medidos no extrato pela pesagem(após a secagem a 105°C). A quantidade de nitrogênio no extrato foideterminada por um método de combustão em um aparelho Leco FP - 528. Aquantidade de proteína foi calculada como de 6,5 vezes a quantidade denitrogênio. O amino nitrogênio livre foi determinado usando um método deOPA (o-ftaldialdeído). Com base nas medições acima, foi calculado oseguinte:
% de Rendimento do Extrato = (g de extrato após acentrifugação)/ (g de mistura de levedura antes da centrifugação )* 100
% de Rendimento de Proteína = (g de extrato após acentrifugação * teor de proteína no extrato)/ (g de mistura de levedura antesda centrifugação * teor de proteína da mistura de levedura )* 100Grau de hidrólise = (número de ligações de peptídeo clivadas /número total de ligações de peptídeo ) * 100 = (h/ htot) * 100Quando h é expresso como uma função de meqv serina NH2:h= (serina NH2 - 0,4)/ 1; e htot = 7, 8. Serina NH2 foi medido em relação aopadrão de serina contendo 00 mg/ L através de medição de absorção a 340 nm.
Os resultados baseados em determinações duplas sãoapresentados na Tabela 1:
Tabela 1:
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Exemplo 2
O extrato de levedura foi preparado pelo menos método que noExemplo 1, exceto que uma fosfolipase diferente foi usada (YieldMax®, Chr.Hansen AJ S e Novozymes AJ S, Dinamarca), e o tratamento enzimática foiexecutado a 40°C e pH de 6,0. Os resultados são fornecidos na Tabela 2(determinações únicas).
Tabela 2
Exemplo 3
<table>table see original document page 21</column></row><table>
Uma cultura de célula de levedura em bloco de Saccharomycescerevisiae foi misturada com água deionizada, de modo a alcançar um teor dematéria seca de 14% e foi agitada em um agitador magnético, durante 60minutos, em temperatura ambiente. A quantidade de nitrogênio nesta misturade levedura foi determinada através de um método de combustão em umaparelho Leco FP - 528. Os sólidos secos foram misturados na mistura delevedura através de pesagem (após secagem a 105°C). A mistura de levedurafoi aquecida a 55°C e ou aplicada no pH natural (cerca de 5- 5:3 ) ou ajustadapara 5, 8 com NaOH 4 N. As amostras foram tratadas com 0, 25% (peso/pesode matéria seca de levedura) de uma fosfolipase (Lecitase® Ultra, 10 kLU/ gNovozymes A / S, Dinamarca) e/ ou 0,3% (peso/ peso de matéria seca delevedura) de uma enzima proteolítica (Papain, Pang BO Biological Co. Ltd.).As enzimas foram adicionadas à mistura de levedura após dez minutos deaquecimento prévio a 55°. Uma amostra de controle neutra) não foi tratadacom a enzima. A autólise foi executada durante 22 horas a 55°C, sob agitaçãomagnética. Amostras de 30 ml foram tomadas e a quantidade exata foi pesada.As amostras fora inativadas a 85°C, durante 10 minutos. Após a inativação, asamostras foram centrifugadas durante 10 minutos, a 3500 rpm, usando umaparelho Multifuge 3 S - R de Heraus. A análise dos extratos foi comodescrita no Exemplo 1. A turvação foi determinada usando um aparelhoTurbidimeter 2100 AN de HACH.
Os resultados baseados em determinações duplas sãoapresentados na Tabela 3.
Tabela 3
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Claims (11)

1. Método para extrair um ou mais componentes de levedura,caracterizado pelo fato de que compreende:i) tratar as células de levedura com uma fosfolipase; eii) separar um ou mais componentes desejados a partir dascélulas de levedura tratadas.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as células de levedura são submetidas à hidrólise de proteínaantes, após, ou durante o estágio i).
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a proteína é hidrolisada por enzimas proteolíticas.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a proteína é hidrolisada por autólise.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que uma ou mais enzimas proteolíticas purificadas são usadas.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que uma fosfolipase Ai é usada noestágio i).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que uma fosfolipase A2 é usada noestágio i).
8. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,caracterizado pelo fato de que o um ou mais componentes a serem extraídoscompreendem uma proteína.
9. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,caracterizado pelo fato de que um ou mais componentes a serem extraídoscompreendem uma enzima.
10. Método para produzir um extrato de levedura,caracterizado pelo fato de que compreende:i) tratar células de levedura com uma fosfolipase purificada; eii) submeter as células de levedura tratadas à hidrólise deproteína; eiii) remover os componentes de célula de levedura;em que o estágio ii) é conduzido antes, após ou durante oestágio i).
11. Uso de uma fosfolipase purificada, caracterizado pelo fatode ser para extrair um ou mais componentes a partir de uma cultura de célulade levedura.
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