NO326318B1 - Fremgangsmater for bearbeidelse av skalldyr, fremgangsmate for fremstilling av et konsumerbart produkt og anvendelse av en fosfolipase for fremstilling av et karotenoidholdig produkt. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for enzymatisk bearbeidelse av skalldyr for å tilveiebringe nyttige produkter fra disse, fremgangsmåte for fremstilling av et konsumerbart produkt og anvendelse av en fosfolipase for fremstilling av et karotenoidholdig produkt.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Anvendelsen av karotenoidpigmenter, slik som astaxantin, er økende innenfor området mat- og foradditiver, som et fargestoff og/eller som en antioksidant, særlig til oppdrettsfisk. Sjødyr kan, på samme måte som landdyr, generelt ikke syntetisere astaxantin eller andre karotenoider, men flere av disse dyrene, inkludert skalldyr, akkumulerer astaxantin som er til stede i maten deres. Skalldyr har evne til å omdanne karotener til astaxantin. Laksefisk og røde havkarusser akkumulerer kost-astaxantin, men disse fiskene kan ikke omdanne andre karotener til astaxantin. Astaxantiner som er til stede i laksefisk, må således avledes direkte fra kostkilder.

For tiden anvendes syntetisk astaxantin som foradditiv for farging av oppdrettsfisk, for å tilveiebringe dens ønskede karakteristiske rødlige farge. Forbrukerinteresser har imidlertid resultert i et forsterket krav om å tilveiebringe naturlig astaxantin for å erstatte det syntetisk produserte astaxantin. Dette bør også ses i lys av den nåværende generelle preferanse for naturlige produkter.

Ekspansjonen av den skalldyrsbearbeidende industri har vært ledsaget av fremstillingen av store mengder av skalldyrsavfall som innholder astaxantin. Rekebearbeidelse involverer fjerningen av hodet og det harde ryggskjoldet, som utgjør opp til ca. 70 % av hele reken. Selv om pigmentering av fiskekjøtt kan oppnås ved å fore fisken med skalldyrsavfall, er det flere ulemper ved denne fremgangsmåten. Disse omfatter det variable pigmentnivå, tilbøyeligheten til det urensede skalldyrsavfall til å ødelegges hurtig, stort volum og høye transportkostnader, og et høyt kitininnhold. Innholdet av karotenoidpigmenter i skalldyrsavfall er således for lavt sammenlignet med det uønsket høye innhold av kitin og kalsium, for dets anvendelse i store mengder i fiskefor.

Forskjellige kjemiske metoder for å ekstrahere pigmenter, for eksempel fra skalldyrsavfall, og deres inkorporering i fiskefor er blitt beskrevet. Chen et al., Journal of Food Science, vol. 47/3, 892-900, 1982, beskriver ekstraksjon av astaxantin fra skalldyr med soyaolje alene eller i kombinasjon med anvendelse av proteaser. Anvendelse av organiske oppløsningsmidler for ekstraksjon av astaxantin er også blitt beskrevet.

Flere litteraturhenvisninger beskriver metoder som involverer proteasebehandling for ekstraksjon av astaxantin fra skalldyr, jfr. for eksempel: Simpson and Haard, Journal of Applied Biochemistry, 7, 212-222, 1985; Chen and Meyers, Journal of Food Science, vol. 47, 892-900, 1982.1 CA 1 313 935 beskrives også behandling av skalldyrsavfall med protease. I Abstract of Papers, American Chemical Society, vol. 231 p7-IEC 1997 er det beskrevet ekstraksjon av karotenoproteiner fra skalldyrsavfall ved hjelp av trypsin.

IJP 60-35057A beskrives ekstraksjon av oransje fargestoff fra krill med et opp-løsningsmiddel, og deretter tilsetning av lipase eller et alkali til ekstraktoppløsningen etter ekstraksjonen for å dekomponere fettsyre, og anvendelse av en væske i superkritisk tilstand for å separere fargestoffet fra ekstraksjonsoppløsningen.

I JP 62-00179A beskrives ekstraksjonen og separasjonen av fargestoff fra krill, hvor protein ekstraheres med karbondioksid i superkritisk tilstand fra krillen under anvendelse av en protease.

I JP 9301950A beskrives ekstraksjon av astaxantin fra skall fra ulike skall-dyrsarter. Det benyttes saltsyre for å fjerne kalsium fra skallet og natriumhydroksid-oppløsning til nøytralisering. Proteiner i skallet fjernes deretter, og det preparerte skall dyppes i et oppløsningsmiddel av alkohol og vann.

I JP 62-190090A beskrives ekstraksjonen av pigment fra vegetabilsk materiale, slik som gulrot, gresskar, ved anvendelse av enzymer, slik som amylase, protease og cellulase.

I korthet er det et krav om å erstatte det syntetisk produserte astaxantin som for tiden er på markedet, og ett formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for tilveiebringelse av naturlig fargepigment, slik som astaxantin.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinneren har funnet at enzymatisk behandling av skalldyrsmateriale med lipolytiske enzymer som har fosfolipaseaktivitet, fremmer ekstraksjonen av fargepigment fra skalldyrsmaterialet. Denne behandlingen er også gunstig for ekstraksjonen av andre nyttige komponenter fra skalldyrsmaterialet. Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig ved ett aspekt utvinning av fargepigment, for eksempel astaxantin, og/eller kitin eller kitosan og/eller lysolecitiner, fra skalldyrsmateriale.

Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyr som omfatter trinnet med å behandle et skalldyrsmateriale med et lipolytisk enzym som har fosfolipaseaktivitet. Skalldyrsmaterialet som er behandlet med lipolytisk enzym, kan underkastes ytterligere bearbeidelsestrinn. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer flere egnede produkter og flere anvendelser av slike produkter. Oppfinnelsen vedrører således også fremgangsmåte for fremstilling av et konsumerbart produkt og anvendelse av en fosfolipase for fremstilling av et karotenoidholdig produkt.

NÆRMERE BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinneren har utviklet en effektiv fremgangsmåte for fremstilling av naturlige pigmenter. Vet ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for utvinning av fargepigment, for eksempel astaxantin, fra skalldyrsmateriale. Oppfinnelsen vedrører som nevnt en fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyr som omfatter trinnet (i) med å behandle skalldyrsmateriale med et lipolytisk enzym som har fosfolipaseaktivitet.

Skalldyrsmaterialet

Ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan skalldyrsmaterialet være hvilket som helst materiale som omfatter hele skalldyr eller deler derav. Skalldyrene kan være av hvilken som helst opprinnelse; og skalldyrene kan således erholdes fra marine kilder og/eller ferskvannskilder. Slike skalldyr omfatter, men er ikke begrenset til slike organismer som krill, reker (inkludert stor reke), krabbe, hummer (inkludert sjø-kreps) og sjøanemone. Skalldyrsmaterialet bearbeidet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan følgelig for eksempel erholdes fra en organisme valgt fra denne gruppen. Inkludert er også skalldyrsmateriale erholdt fra en blanding av forskjellige arter av skalldyr, slik som en blanding av to eller flere av hvilken som helst av disse organismene som nevnt her. Så lenge formålet er å utføre den enzymatiske behandling ifølge trinn (i), kan skalldyrsmaterialet være fra hvilken som helst skalldyrsorganisme eller deler derav som omfatter rødlige/oransje pigmenter. Skalldyrsmaterialet er fortrinnsvis et fast skalldyrsmateriale som inneholder de ønskede pigmenter. Det skal således forstås at det skalldyrsmaterialet som skal behandles i trinn (i) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfatter pigmenter, særlig karotenoider. Forbindelsene er således ikke blitt ekstrahert fra skalldyrsmaterialet før trinn (i). Det er imidlertid også meningen at i trinn (i) har den lipolytiske enzymatiske behandling av skalldyrsmaterialet også andre fordeler enn å fremme ekstraksjonen av pigmenter fra skalldyrsmaterialet. For noen utførelsesformer av oppfinnelsen er således tilstedeværelsen av rødlige/oransje pigmenter i skalldyrsmaterialet ikke et ufravikelig kriterium, avhengig av formålet med slik enzymatisk behandling. Det menes at reke og krill er særlig interessante skalldyrsorganismer i foreliggende opp-finnelses sammenheng.

Som allerede angitt kan skalldyrsmaterialet være sammensatt av hele skalldyr (for eksempel hele reker) eller deler derav (for eksempel skallet). Skalldyrsmaterialet kan også omfatte eller bestå av skalldyrsavfalls- (for eksempel reke-) skall, rogn og hoder som skriver seg fra for eksempel rekebearbeidelsesindustrien. Ved noen utførelsesformer kan således skalldyrsmaterialet bestå hovedsakelig av rekeskall. Skalldyrsmaterialet kan følgelig omfatte eller bestå av "hel" skalldyrsorganisme (det vil si for eksempel både skalldyrsskallet og skalldyrs-"kjøttet") eller "del" derav (det vil si for eksempel bare skall). "Hele" skalldyrsorganismen eller "delene" av skalldyrsorganismen som danner en del av eller utgjør skalldyrsmaterialet, kan ha blitt delt opp i mindre deler før eller under den enzymatiske behandling, slik som, men ikke begrenset til, knuste skalldeler, eller det kan være helt, slik som, men ikke begrenset til, hel krill eller hele reker.

Det skal forstås at skalldyrsmateriale som skal behandles med lipolytisk enzym i trinn (i), ikke er skalldyrsekstrakten som definert her.

Enzymbehandling

I tillegg til behandlingen av skalldyrsmateriale med lipolytisk enzym, kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatte behandling av skalldyrsmaterialet med ett eller flere ikke-lipolytiske enzymer. Denne behandlingen av skalldyrsmaterialet med ett eller flere ikke-lipolytiske enzymer kan utføres før, under eller etter behandlingen med lipolytisk aktivitet. Ved en foretrukket utførelsesform behandles skalldyrsmaterialet med en protease. Det er også meningen at skalldyrsmaterialet i andre utførelsesformer ikke behandles med protease. Proteasebehandlingen kan for eksempel utføres samtidig med fosfolipasebehandling. Ved andre utførelsesformer behandles skalldyrsmaterialet først med protease i en vandig oppløsning, og den faste fasen som skriver seg fra separasjon fra væskefasen, behandles deretter med ett eller flere lipolytiske enzymer.

Enzymene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan være én-komponentenzympreparater (for eksempel bare én protease til stede), eller det kan være blandet enzympreparat (for eksempel en blanding av flere proteaser og/eller blandinger av flere forskjellige enzymer, slik som en blanding av lipolytiske enzymer, for eksempel lipaser og fosfolipaser).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte trinnet med å inaktivere og/eller fjerne det eller de tilsatte enzymer, hvorved man får et produkt som i det vesentlige er fritt for aktiviteten til enzymet eller enzymene. Ved en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inaktivering og/eller fjerning av det eller de lipolytiske enzymene, hvorved man får et produkt som er i det vesentlige fritt for den nevnte lipolytiske aktivitet.

Den lipolytiske enzymaktivitet av særlig interesse for foreliggende oppfinnelse er lipolytiske enzymer som er i stand til å lette ekstraksjon av karotenoider fra skalldyrsmateriale som beskrevet her, eller fra hvilket som helst annet materiale hvorfra det er ønsket å frigjøre karotenoider, og hvor lipolytiske enzymer letter slik frigjøring.

Karotenoidet kan være hvilket som helst karotenoid som er til stede i materialet som skal behandles med lipolytisk enzym som beskrevet her. Karotenoidet kan som et eksempel, være astaxantin eller et astaxantinderivat, slik som en astaxantinester, beta-karoten, cantaxantin og zeaxantin, lutein, tunaxantin, fucoxantin og halocyntiaxantin, eller hvilke som helst kombinasjoner av det ovenfor nevnte. Ved en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ekstraheres astaxantin ved hjelp av den lipolytiske behandling i trinn (i) fra skalldyrsmaterialet. En annen måte å beskrive effekten av den enzymatiske behandling på, er ved hjelp av fargen til pigmentene som ekstraheres fra skalldyrsmaterialet som er til stede, det vil si ved hjelp av fargen på ekstrakten. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en metode for bearbeidelse av skalldyr, hvor det ved hjelp av den lipolytiske enzymbehandling i trinn (i) ekstraheres mer rødlige og/eller oransje pigmenter (for eksempel astaxantin) fra skalldyrsmaterialet sammenlignet med en fremgangsmåte uten den lipolytiske enzymbehandling. Ved noen utførelsesformer av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ekstraheres det ved hjelp av enzymbehandlingen i trinn (i) minst 1/2 gang mer, minst 2 ganger eller minst 10 ganger mer karotenoider, for eksempel astaxantin, fra skalldyrsmaterialet sammenlignet med en lignende fremgangsmåte uten den lipolytiske enzymbehandling.

Det lipolytiske enzymet som skal anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan være hvilket som helst lipolytisk enzym.

Lipolytiske enzymer er enzymer som hydrolyserer karboksylsyreesterbindinger. Avhengig av substratspesifisiteten, det vil si aktiviteten på utvalgte esterbindinger i utvalgte substrater, kan aktiviteten klassifiseres for eksempel som lipase, lysofosfolipase, fosfolipase Ai, fosfolipase A2 eller digalaktosyldiglyserid (DGDG) hydrolase.

Substratspesifisitet: Lipolytiske enzymer er således enzymer som hydrolyserer karboksylsyreesterbindinger. Slike enzymer kan ha én eller flere av de følgende aktiviteter som hver er definert ved virkningen på en bestemt esterbinding i et substrat. Tallene i paranteser er de systematiske numrene som er tildelt av Enzyme Commission of the Inter-national Union of Biochemistry i overensstemmelse med typen av den enzymatiske re-aktivitet til enzymet.

lipase (triacylglyserollipase, EC 3.1.1.3), virker på fettacylgrupper i triglyserider, særlig langkjedede (Ci6-C2o) triglyserider,

fosfolipase Ai (EC 3.1.1.32), virker på fettacylgrupper i 1-stillingen til intakte fosfolipider, slik som lecitin,

fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), virker på fettacylgrupper i 2-stillingen til intakte fosfolipider, slik som lecitin,

lysofosfolipase (EC 3.1.1.5), virker på fettacylgrupper i lyso-fosfolipider, slik som lyso-lecitin.

Hver av aktivitetene kan kvantifiseres enten i internasjonale enheter (IU) eller ved hjelp av analysemetoder angitt i WO 00/32758 eller i denne beskrivelsen.

Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyrsmaterialet, som omfatter å tilsette til skalldyrmaterialet et lipolytisk enzym, slik som en fosfolipase. En utførelsesform vedrører en fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyrsmaterialet, som omfatter å tilsette til skalldyrsmaterialet minst to lipolytiske enzymer, slik som to lipolytiske enzymer som har forskjellige substratspesifisiteter, slik som for eksempel fosfolipase- og lipaseaktivitet.

Lipaseaktivitet ( LU ) : Et substrat for lipase fremstilles ved å emulgere tributyrin (glyseroltributyrat) under anvendelse av gummi arabicum som emulgeringsmiddel. Hydrolysen av tributyrin ved 30 °C, ved pH 7, følges i et pH-stat-titreringsforsøk. Én enhet lipaseaktivitet (1 LU) er lik med mengden av enzymet som er i stand til å frigjøre 1 umol smørsyre/min ved standardbetingelsene.

Fosfolipaseaktivitet ( PHLU): Fosfolipaseaktivitet (PHLU) måles som frigjørelsen av frie fettsyrer fra lecitin. 50 |il 4 % L-alfa-fosfatidylkolin (plantelecitin fra A vanti), 4 % Triton X-100, 5 mm CaCl2 i 50 mm HEPES, pH7 tilsettes 50 (il enzymoppløsning for-tynnet til en passende konsentrasjon i 50 mm HEPES, pH 7. Prøvene inkuberes i 10 min ved 30 °C og reaksjonen stanses ved 95 °C 5 min før sentrifugering (5 min ved 7000 rpm). Frie fettsyrer bestemmes ved å anvende NEFA C-settet fra Wako Chemicals GmbH; 25ul reaksjonsblanding tilsettes 250 ul reagens A og det inkuberes i 10 min ved 37 °C. Så tilsettes 500 (il reagens B og prøven inkuberes på nytt, 10 min ved 37 °C. Ab-sorpsjonen ved 550 nm måles ved å anvende et HP 8452A diode-rekke-spektrofotometer. Prøver kjøres minst in duplo. Substrat og enzymblindprøver (forvarmede enzymprøver (10 min ved 95 °C) + substrat) er inkludert. Oljesyre brukes som en fettsyrestandard. 1 PHLU er lik med den mengden av enzym som er i stand til å frigjøre 1 umol fri fettsyre/min ved disse betingelsene.

Ved en foretrukket utførelsesform er det lipolytiske enzym et lipolytisk enzym som har fosfolipaseaktivitet, slik som en lipase og/eller en fosfolipase, eller en kombinasjon derav. Ved en foretrukket utførelsesform er det lipolytiske enzym fosfolipase. Ved en annen foretrukket utførelsesform er enzymet en lipase.

Fosfolipider, slik som lecitin, består av glyserol forestret med to fettsyrer i en ytre (sn-1) og den midtre (sn-2) stillingen, og forestret med fosforsyre i den tredje stillingen; fosforsyren kan igjen være forestret til et aminoalkohol. Fosfolipaser er enzymer som deltar i hydrolysen av fosfolipider. Det kan skjelnes mellom flere typer fosfolipaseaktivitet, inkludert fosfolipasene Aj og A2 som hydrolyserer én fettacylgruppe (i henholdsvis sn-1- og sn-2-stillingen) som danner lysofosfolipid; og lysofosfolipase (eller fosfolipase B) som kan hydrolysere den gjenværende fettacylgruppe i lysofosfolipid. Ved en foretrukket utførelsesform vedrører således oppfinnelsen anvendelse av enzymer som har evne til å hydrolysere én og/eller begge fettacylgruppene i et fosfolipid.

Fosfolipaseaktiviteten kan tilveiebringes ved hjelp av enzymer som også har andre aktiviteter, slik som for eksempel en lipase med fosfolipaseaktivitet. Fosfolipaseaktiviteten kan for eksempel være fra en lipase med fosfolipase-biaktivitet. Ved andre utførelsesformer av oppfinnelsen tilveiebringes fosfolipaseenzymaktiviteten ved hjelp av et enzym som har hovedsakelig bare fosfolipaseaktivitet, og hvor fosfolipaseenzymaktiviteten ikke er en biaktivitet. Ved én utførelsesform av oppfinnelsen er fosfolipasen ikke en lipase som har fosfolipase-biaktivitet som definert i WO 98/26057.

Fosfolipasen kan være et enzym som har én eller flere av de følgende aktiviteter: Fosfolipase Aj (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), fosfolipase B, lysofosfolipase (EC 3.1.1.5).

Ved en mer foretrukket utførelsesform er det lipolytiske enzym en fosfolipase A] eller en fosfolipase A2. Ved én utførelsesform inkuberes skalldyrsmaterialet i trinn (i) med én eller flere lipase(r) valgt fra gruppen bestående av fosfolipase Ai og A2.

Ved én utførelsesform har fosfolipasen ingen eller bare lav triglyseridlipase-aktivitet (EC 3.1.1.3) ved betingelsene for fosfolipasebehandlingen. Forholdet mellom lipase og fosfolipase kan passende være under 0,001 LU/LEU, eller under 0,005 (særlig under 0,001) PHLU/kLU (enheter definert ovenfor).

Skalldyrsmaterialet inkuberes med en effektiv mengde av enzymene som beskrevet her for behandling av skalldyrsmaterialet. Uttrykket "effektiv mengde" er her definert som en mengde av enzymene som er tilstrekkelig til å tilveiebringe en målbar effekt på minst én egenskap av interesse for bearbeidelse av skalldyr, særlig for å ekstrahere pigmenter, slik som astaxantin fra skalldyrsmaterialet.

Fosfolipasen anvendes vanligvis ved en dosering på 0,0001-0,05 % av enzym-protein i forhold til vekt av tørrstoffer. Et kommersielt fosfolipaseprodukt med en aktivitet på 10 000 LEU/g anvendes vanligvis ved en dosering på 20-500 ppm basert på vekt av tørrstoffer.

Enzymene anvendt ved foreliggende oppfinnelse har fortrinnsvis en egnet enzymaktivitet i et pH- og temperaturområde som er passende for bearbeidelse av skalldyr. Ved én utførelsesform er enzymet eller enzymene aktive over brede pH- og temperaturområder.

Ved en foretrukket utførelsesform har enzymet eller enzymene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, inkludert det eller de lipolytiske enzymer som beskrevet her, et pH-optimum i området fra ca. 3 til ca. 10. Ved en mer foretrukket utførelsesform har enzymet eller enzymene, inkludert det eller de lipolytiske enzymene som beskrevet her, et pH-optimum i området fra ca. 4,5 til ca. 8,5.

Ved en annen utførelsesform har enzymet eller enzymene, inkludert det eller de lipolytiske enzymene som beskrevet her, et temperaturoptimum i området fra ca. 5 °C til ca. 100 °C. Ved en mer foretrukket utførelsesform har enzymet eller enzymene, inkludert det eller de lipolytiske enzymer som beskrevet her, et temperaturoptimum i området fra ca. 25 °C til ca. 75 °C.

Enzymet eller enzymene, særlig det eller de lipolytiske enzymene, anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fås fra hvilken som helst kilde, slik som en plante, en mikroorganisme eller et dyr. Enzymene inkludert det lipolytiske enzym, kan være eukaryotisk, for eksempel fra sopp- eller dyrekilder. Eksempler på lipolytiske enzymer fra dyrekilder er fosfolipaser fra bie- eller ormegift, eller fra pattedyrbukspytt-kjertel, for eksempel porcin bukspyttkjertel. Ved en foretrukket utførelsesform fås enzymene fortrinnsvis fra en mikrobiell kilde, slik som en bakterie eller en sopp, for eksempel en filamentær sopp eller gjær. Ved en foretrukket utførelsesform er det lipolytiske enzym prokaryotisk og særlig bakterielt enzym for eksempel fra Pseudomonas eller Bacillus.

Ved en foretrukket utførelsesform erholdes enzymene fra en bakteriekilde. For eksempel kan enzymene fås fra en Acetobacter-, Acinetobacter-, Agrobacterium-, Alcaligenes-, Arthrobacter-, Azotobacter-, Bacillus-, Comamonas-, Clostridium-, Gluconobacter-, Halobacterium-, Mycobacterium-, Rhizobium-, Salmonella-, Serratia-, Streptomyces-, E. coli-, Pseudomonas-, Wolinella- eller metylotrofisk bakteriestamme.

Ved en mer foretrukket utførelsesform fås enzymene fra en Acetobacter aceti-, Alcaligenes faecalis-, Arthrobacter oxidans-, Azotobacter vinelandii-, Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus anitratum-, Bacillus brevis-, Bacillus circulans-, Bacillus coagulans-, Bacillus lautus-, Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus megaterium-, Bacillus stearothermophilus-, Bacillus subtilis-, Bacillus thuringiensis-, Comamonas testosteroni-, Clostridum tyrobutyricum-, Gluconobacter dioxyaceticus-, Gluconobacter liquefaciens-, Gluconobacter suboxydans-, Halobacterium cutirubrum-, Mycobacterium convolutum-, Rhizobium melioti-, Salmonella typhimurium-, Serratia marcescens-, Streptomyces lividans-, Streptomyces murinus-, Pseudomonas aeruginosa-, Pseudomonas fluorescens-, Pseudomonas putida- eller Wolinella succinogens- stamme.

Ved en annen foretrukket utførelsesform fås enzymene fra en soppkilde. For eksempel kan enzymene fås fra en gjærstamme, slik som en Candida-, Kluyveromyces-, Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- eller Yarrowia- stamme; eller fra en filamentær soppstamme, slik som en Acremonium-, Aspergillus-, Aureobasidium-, Chrysosporium-, Cryptococcus-, Filibasidium-, Fusarium-, Humicola-, Magnaporthe-, Monilia-, Mucor-, Myceliophthora-, Neocallimastix-, Neurospora-, Paecilomyces-, Penicillium-, Phanerochaete-, Piromyces-, Schizophyllum-, Sclerotium-, Spor otr ichum-, Talaromyces-, Thermoascus-, Thielavia-, Tolypociadium- eller Trichoderma- stamme.

Ved en annen mer foretrukket utførelsesform fås enzymene fra en Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-, Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces norbensis- eller Saccharomyces oviformis- stamme.

Ved en annen mer foretrukket utførelsesform fås enzymene fra en Aspergillus aculeatus-, Aspergillus awamori-, Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-, Aspergillus niger-, Aspergillus oryzae-, Chrysosporium lignorum-, Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-, Fusarium graminum-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-, Fusarium sarcochroum-, Fusarium sulphureum-, Fusarium toruloseum-, Fusarium trichothecioides-, Fusarium venenatum-, Humicola insolens-, Humicola lanuginosa-, Monilia sitophila-, Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora crassa-, Penicillium purpurogenum-, Phanerochaete chrysporum-, Polyporus pinsitus-, Polyporus versicolour-, Sclerotium rolfsii-, Sporotrichum thermophile-, Trichoderma citrinoviride-, Trichoderma hamatum-, Trichoderma harzianum-, Trichoderma koningii-, Trichoderma longibrachiatum-, Trichoderma polysporum-, Trichoderma reesei-, Trichoderma saturnisporum- eller Trichoderma v/nafe-stamme.

Ved foretrukne utførelsesformer fås det lipolytiske soppenzym fra følgende slekter eller arter: Humicola (synonym Thermomyces), H lanuginosa (synonym T. lanuginosus), H. insolens, Fusarium, F. oxysporum, F. solani, F. heterosporum, Aspergillus, A. tubigensis, A. niger, A. oryzae, Rhizomucor, Candida, C. antarctica, Penicillium, P. camembertii, Rhizopus, Rhizopus oryzae eller Absidia.

Noen bestemte eksempler på lipolytiske enzymer følger nedenunder:

• En fosfolipase A2 fra porcin bukspyttkjertel, solgt av Novozymes A/S under handelsnavnet LECITASE. • En lipase fra H. Languginosa er beskrevet i EP 305 216, og har aminosyresekvensen vist i stillingene 1-269 i SEQ ID NO: 2 i US patentskrift nr.

5 869 438 (heretter henvist til som HII eller H. lanuginosa-lipase).

• Et enzym fra Fusarium oxysporum beskrevet i WO 98/26057 har lipase- og fosfolipase Ai-aktiviteter (heretter henvist til som FoL eller F. oxysporum-lipase/fosfolipase). Det har en molekylvekt på 30 ± 2 kDA et isoelektrisk punkt på 5,8-6,8, og optimal fosfolipaseaktivitet over pH 9.

• Enzymet beskrevet i WO 01/27251.

Alternativt kan det lipolytiske enzym være en variant erholdt ved å endre aminosyresekvensen til et naturlig forekommende enzym, slik som det ovenfor nevnte. Eksempler på lipolytiske varianter er beskrevet i WO 00/32758.

Ved én utførelsesform er fosfolipase Ai fra en stamme av Fusarium, særlig F. oxysporum, for eksempel fra stamme DSM 2627 som beskrevet i WO 98/26057, spesielt beskrevet i krav 36 og SEQ ID NO.2.

Enzymene inkludert det lipolytiske enzym (slik som for eksempel fosfolipasen) anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være et enzym som har en aminosyresekvens som er identisk med den til et naturlig forekommende enzym, eller det kan ha en modifisert aminosyresekvens, for eksempel har én eller flere aminosyrer som er delert, innføyet og/eller byttet ut, det vil si et rekombinant fremstilt eller syntetisk fremstilt enzym som er en mutant og/eller et fragment av en naturlig forekommende aminosyresekvens. Innenfor betydningen av et naturig forekommende enzym er det inkludert naturlige varianter.

Enzymene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan fås ved anvendelse av hvilken som helst egnet teknikk. For eksempel kan et fosfolipaseenzym-preparat erholdes ved hjelp av fermentering av en egnet mikroorganisme og etterfølgende isolering av et fosfolipasepreparat fra den resulterende, fermenterte næringsvæske eller mikroorganisme ved hjelp av metoder som er kjent innenfor fagområdet. Enzymene kan følgelig fås fra den aktuelle organisme ved hjelp av hvilken som helst egnet teknikk, og særlig ved anvendelse av teknikker med rekombinant DNA som er kjent innenfor fagområdet (jfr. J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Anvendelsen av teknikker med rekombinant DNA omfatter generelt dyrking av en vertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor, bestående av det aktuelle produktgen innføyet mellom en promoter og terminator, i et kulturmedium under betingelser som muliggjør ekspresjonen av enzymet og utvinning av enzymet fra kulturen. DNA-sekvensen kan være av genom-isk, cDNA- eller syntetisk opprinnelse, eller hvilken som helst blanding av disse, og kan isoleres eller syntetiseres i overensstemmelse med metoder som er kjent innenfor fagområdet. Som beskrevet kan enzymet også fås fra dets naturlig opptredende kilde, slik som en plante eller organisme, eller en relevant del derav. Men enzymene kan også fås fra kommersielle leverandører, for eksempel fra Novozymes A/S, Danmark.

Enzymene som skal anvendes ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan således være i hvilken som helst form egnet for den aktuelle anvendelse, for eksempel i form av et tørt pulver, agglomerert pulver eller granulat, særlig et ikke-støvende granulat, en væske, særlig en stabilisert væske, eller et beskyttet enzym. Enzympreparatet er fortrinnsvis i form av en væske.

Uttrykket "protease" er, slik det er brukt ved den foreliggende oppfinnelse, her definert som et enzym som katalyserer hydrolysen av peptidbindinger. Det vil forstås at uttrykket "proteaser" omfatter endoproteaser og eksopeptidaser (aminopeptidaser og karboksypeptidaser).

Fremgangsmåtetrinn, erholdte produkter og anvendelser derav

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyr, som

omfatter trinnet (i) med å behandle et skalldyrsmateriale med et lipolytisk enzym som har fosfolipaseaktivitet. For fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres behandlingen i trinn (i) av skalldyrsmaterialet med lipolytisk enzym fortrinnsvis i en vandig væske. Skalldyrsmaterialet kan således oppslemmes i en vandig væske før og/eller under trinn (i).

Det oppslemmede skalldyrsmateriale kan varmebehandles før enzymbehandling eller varmebehandlingen kan utelates.

Den enzymatiske behandling i trinn (i) kan utføres ved hvilken som helst temperatur, pH og inkubasjonstid som finnes egnet for det aktuelle enzym. Ved én utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen reguleres pH før behandlingen med enzym. Ved andre utførelsesformer reguleres pH ikke før behandlingen med enzymet eller enzymene.

Ved en foretrukket utførelsesform er pH-verdien i området ca. 3 til ca. 12. Ved andre utførelsesformer er pH i området ca. 4,5 til ca. 8,5.

Enzymbehandlingen utføres fortrinnsvis ved et temperaturoptimum for det aktuelle enzym. Ved noen utførelsesformer utføres enzymbehandlingen ved en temperatur i området ca. 5 °C til ca. 100 °C. Ved andre utførelsesformer er temperaturen i området ca. 10 til ca. 90 °C. Ved en mer foretrukket utførelsesform er temperaturen i området ca. 20 til ca. 75 °C.

Enzymbehandlingen utføres på hvilket som helst tidspunkt som finnes egnet, avhengig av enzymaktiviteten som er til stede. Enzymbehandlingen kan for eksempel utføres i ca. 10 minutter til ca. 10 timer, slik som for eksempel fra ca. 30 minutter til ca. 6 timer.

Ved én utførelsesform anvendes fosfolipase A2 utvunnet fra bukspyttkjertel ved 30-70 °C, pH 3-12 (særlig fortrukket er 4,5-8,5). Ved andre utførelsesformer anvendes fosfolipase A] fra Fusarium oxysporum ved 20-50 °C, pH 3-12 (særlig foretrukket 4,5-8,5).

Ved noen utførelsesformer bringes skalldyrsmaterialet også i kontakt med én eller flere av de følgende forbindelser: et antioksidativt middel (for eksempel en slik kjemisk antioksidant som for eksempel BHA = butylert hydroksyanisol og HT = butylert hydroksytoluen, en slik fysikalsk antioksidant som for eksempel nitrogenteppe), en oksygenrenser, for eksempel et enzymatisk rensemiddel, slik som en lakkase, sitronsyre, EDTA, et tensid, gelateringsforbindelser, syre/base for å reguler pH, og generelt forbindelser som bedrer aktiviteten av enzymene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Det kan være foretrukket å utføre ekstraksjonen av astaxantin under lavt oksygeninnhold. Ved én utførelsesform tilveiebringes dette ved lakkasebehandling som beskrevet i WO 96/31133. Uttrykket "lakkase" som anvendt ved foreliggende oppfinnelse, er her definert som en benzendiol: oksygen-oksidoreduktase som katalyserer omdannelsen av fire benzendioler i nærvær av molekylært oksygen til fire benzosemikinoner og to vannmolekyler.

Innenfor omfanget av oppfinnelsen er fremgangsmåter hvor skalldyrsmaterialet behandlet med lipolytisk enzym bearbeides videre til et konsumerbart produkt, inkludert for eksempel for- eller matprodukt (matprodukter som omfatter drikker), inkludert også for- eller matadditiver. Innenfor omfanget av oppfinnelsen er også fremgangsmåter hvor skalldyrsmaterialet behandlet med lipolytisk enzym bearbeides videre til et kosmetisk produkt eller et helsekostprodukt eller funksjonelt matprodukt eller et farmasøytisk legemiddel.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte etter og/eller under trinn (i), trinnet (ii) med å separere væskefasen (også kalt "skalldyrsekstrakt" eller bare "ekstrakt") fra det faste skalldyrsmaterialet. Separasjonen kan utføres ved hjelp av hvilke som helst egnede teknikker, for eksempel ved sentrifugering, sikting eller dekantering.

Ved ytterligere utførelsesformer separeres væskefasen ikke fra det faste skalldyrsmateriale, verken etter eller under trinn (i).

Innenfor omfanget av oppfinnelsen er fremgangsmåter hvor det faste skalldyrsmaterialet i trinn (ii) bearbeides videre til et konsumerbart produkt, inkludert for eksempel for- eller matprodukt (matprodukter omfatter drikker), inkludert er også for-eller matadditiver. Innenfor omfanget av oppfinnelsen er også fremgangsmåter hvor skalldyrsfaststoffet i trinn (ii) bearbeides videre til et kosmetisk produkt eller et helsekostprodukt eller funksjonelt matprodukt eller et farmasøytisk legemiddel.

Ved én utførelsesform bearbeides det faste skalldyrsmaterialet videre for å gjenvinne kitin eller kitosan fra det.

Innenfor omfanget av oppfinnelsen er også fremgangsmåter hvor

skalldyrsekstrakten i trinn (ii) bearbeides videre til et konsumerbart produkt, inkludert for eksempel et for- eller matprodukt (matprodukter omfatter drikker), inkludert er for- eller matadditiver. Innenfor omfanget av oppfinnelsen er også fremgangsmåter hvor skalldyrsekstrakten i trinn (ii) bearbeides videre til et kosmetisk produkt, et helsekostprodukt eller funksjonelt matprodukt eller et farmasøytisk legemiddel.

Ekstrakten kan konsentreres. Konsentreringen kan utføres ved hjelp av hvilke som helst egnede teknikker, slik som for eksempel inndamping, membranfiltrering og tørking. Ved én utførelsesform omfatter fremgangsmåten et trinn hvor ekstrakten gjøres i det vesentlige tørr, det vil si har et lavere vanninnhold, slik som for eksempel ca. 5 %, for eksempel i området ca. 3 til ca. 10 %.

Ved en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten videre trinnet med å rense de ekstraherte karotenoidforbindelsene fra væskefasen, hvorved man får et preparat anriket på karotenoidforbindelser. Karotenoidpreparatet som uvinnes kan for eksempel være i en form som inneholder minst 100 ppm karotenoid. Ved en annen utførelsesform skilles karotenoidforbindelsene fra de hydrolyserte forbindelsene, slik som lysolecitinet. Ved andre utførelsesformer av oppfinnelsen separeres karotenoidforbindelsen ikke fra de hydrolyserte fettforbindelsene, slik som lysolecitin. Fremgangsmåter for separasjon kan være membranfiltrering eller andre filtreringstrinn, og/eller ionebytting.

Det er foretrukket at skalldyrsmaterialet før trinn (i) ikke er blitt behandlet med et organisk oppløsningsmiddel. Ved en foretrukket utførelsesform er skalldyrsmaterialet før trinn (i) ikke blitt behandlet med ett eller flere organiske oppløsningsmidler valgt fra gruppen bestående av aceton, n-heksan og etylacetat.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å ekstrahere fargepigment som finnes i krill, som omfatter dekomponering av krillen med protease for å fjerne proteiner og behandling av restkrillen med lipolytisk enzym.

Ved ett aspekt ekstraheres fargepigment ved hjelp av trinn (i) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra skalldyrsmaterialet.

Ved ett aspekt ekstraheres rødlige og/eller oransje pigmenter ved hjelp av trinn (i) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra skalldyrsmaterialet.

Ved ett aspekt ekstraheres karotenoider ved hjelp av trinn (i) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelse fra skalldyrsmaterialet.

Ved ett aspekt ekstraheres ett eller flere karotenoider ved hjelp av trinn (i) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra skalldyrsmaterialet, idet karotenoidene fra gruppen bestående av astaxantin, astaxantinderivater, slik som astaxantinestere, beta-karoten, cantaxantin og zeaxantin, lutein, tunaxantin, fucoxantin og halocyntiaxantin.

Ved ett aspekt ekstraheres astaxantin ved hjelp av trinn (i) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra skalldyrsmaterialet.

Ved ett aspekt dannes lysolecitin i trinn (i) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvor det lipolytiske enzym er en fosfolipase (slik som for eksempel fosfolipase A\ og/eller 1A2), ved hjelp av den enzymatiske fosfolipasebehandling. Produktet kan inkorporeres i et konsumerbart produkt, slik som et for- eller matprodukt, inkludert for- eller matadditiver.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et konsumerbart produkt, som omfatter et trinn hvor et produkt som lar seg erholde eller er erholdt ved hjelp av hvilken som helst av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen (for bearbeidelse av et skalldyrsmateriale) inkorporeres i det konsumerbare produkt. Det konsumerbare produkt er for eksempel et for- eller matprodukt, inkludert for- eller matadditiver.

En foretrukket utførelsesform vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et konsumerbart produkt, som omfatter et trinn hvor: (a) et produkt som lar seg erholde eller er erholdt ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen for bearbeidelse av et skalldyrsmateriale, og hvor det lipolytiske enzym i trinn (i) i nevnte fremgangsmåte er en fosfolipase, inkludert for eksempel fosfolipase Ai og/eller fosfolipase A2, og hvor nevnte erholdbare eller erholdte produkt omfatter karotenoid(er), slik som for eksempel astaxantin, og

lysolecitin(er),

inkorporeres i det konsumerbare produkt. Det konsumerbare produkt er for eksempel et for- eller matprodukt, inkludert for- eller matadditiver.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et konsumerbart produkt, hvor fremgangsmåten omfatter et trinn hvor en skalldyrsekstrakt som er erholdt eller er erholdbar fra trinn (ii) i fremgangsmåten for bearbeidelse av et skalldyrsmateriale som beskrevet her, inkorporeres i det konsumerbare produkt, idet skalldyrsekstrakten kan være blitt ytterligere bearbeidet etter trinn (ii) før inkorporeringen i det konsumerbare produkt. Det konsumerbare produkt er for eksempel et for- eller matprodukt, inkludert for- eller matadditiver. Ved en foretrukket utførelsesform er skalldyrsekstrakten som skal inkorporeres i det konsumerbare produkt, erholdt eller er erholdbar ved hjelp av en fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyr som beskrevet her, hvor det lipolytiske enzym i trinn (i) er en fosfolipase, inkludert for eksempel fosfolipase Ai og/eller fosfolipase A2, og hvor det erholdbare eller erholdte produkt omfatter karotenoid(er), for eksempel astaxantin, og lysolecitin(er).

Karotenoidpigmentene erholdt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan for eksempel anvendes som et fargestoff og/eller som en antioksidant.

Ved en foretrukket utførelsesform vedrører oppfinnelsen anvendelsen av et lipolytisk enzym (for eksempel en fosfolipase, slik som for eksempel fosfolipase Ai eller fosfolipase A2) til å ekstrahere astaxantin fra et skalldyrsmateriale.

Astaxantinet kan også anvendes til inkorporering i matvarer, slik som fjærkre og egg, meieriprodukter, knask og liknende.

Oppfinnelsen vedrører i et ytterligere aspekt anvendelsen av fosfolipase til fremstillingen av et karotenoidholdig produkt ved å starte fra en skalldyrskilde. Dette omfatter også anvendelse av et enzympreparat som omfatter fosfolipase som beskrevet her, som for eksempel fosfolipase Ai eller A2, til fremstillingen av et karotenoidholdig produkt ved å starte fra en skalldyrskarotenoidkilde.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er fordelaktige sammenlignet med vanlige astaxantinekstraksjonsmetoder ved at fremgangsmåtene gir et høyt utbytte av fargepigmenter, slik som astaxantin, samt andre nyttige bestanddeler, slik som kitin eller kitosan og/eller lysolecitiner. Dessuten anses enzymatiske ekstraksjonsmetoder for å være mer forbrukerønskelige sammenlignet med kjemiske ekstraksjonsmetoder på grunn av bruken av organiske oppløsningsmidler. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer dessuten et ønsket alternativ til det syntetisk fremstilt astaxantin ved å være fra en naturlig kilde.

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet ytterligere ved hjelp av de følgende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Ved dette forsøket ble forskjellen i virkningsfullhet mellom fargepigmentekstraksjon fra rekeskall under anvendelse av forskjellige enzymtilsetninger testet. Metode: Finoppmalt rekeskjell (biprodukt fra en fabrikk hvor man rensker reker) ble tilsatt vann i forholdet 1:1 og blandet. Temperatur ble regulert til 55 °C. Enzymbehandlingstid var 5 timer og ved 55 °C, etterfulgt av en oppvarming i 10 minutter ved 85 °C. Etter oppvarming ble prøvene sentrifugert (3000 rpm i 10 minutter), hvorved man fikk ekstrakten som supernatant.

Fargepigmentmåling: Fargemåling med koordinatene Lab, Minolta.

De følgende enzymer ble brukt:

1. Et nøytralt endoproteasepreparat fra Bacillus amyloliquefaciens (NEUTRASE 0,8 L)

2. Trypsin ekstrahert fra porcin bukspyttkjertel (PTN 6,0S)

3. Et lipolytisk enzympreparat med svært høy fosfolipase A2-aktivitet, ekstrahert fra porcin bukspyttkjertel (LECITASE 10L)

4. Lipase som skriver seg fra Rhizomucor miehei (PALATASE 20 000L)

Alle ble erholdt fra Novozymes A/S, Danmark.

Enzymdosering ifølge tabell 1.

Resultater: Den foretrukne farge på ekstrakten er rød. Den sterkeste rødfarge ble erholdt når LECITASE 10L (fosfolipase A2) ble brukt alene (prøve 5). Nest-sterkeste var prøve 2, hvor både LECITASE 10L (fosfolipase A2) og protease ble brukt. Proteasen (NEUTRASE) økte således styrken til rødfargen. Ekstraksjon med lipasen PALATASE resulterte i en oransjefarget ekstrakt som er mye sterkere i rødfarge sammenlignet med LECITASE 10L (fosfolipase A2)-prøver (5 og 2). De to prøvene ekstrahert med protease alene (Neutrase og trypsin, henholdsvis prøve 1 og 3) utviklet bare en blekgul farge.

Eksempel 2

I dette forsøket ble forskjellen i virkningsfulhet av fargepigmentekstraksjon fra rekeskall under anvendelse av forskjellige lipolytiske enzympreparater med fosfolipaseaktivitet testet. En sammenligning med ekstraksjon uten noe enzym tilsatt ble gjort som referanse.

Metode:

Finoppmalt rekeskjell (biprodukt fra en fabrikk hvor man rensker reker) ble tilsatt vann i forholdet 1:1 og blandet. Temperatur ble regulert til 55 °C. Enzymbehandlingstid var 5 timer og ved 55 °C, etterfulgt av en oppvarmingstid på 10 minutter ved 85 °C. Etter oppvarming ble prøvene sentrifugert (sentrifugering 3000 rpm i 10 minutter), hvorved man fikk ekstrakten som supernatant.

Fargepigmentmåling som i eksempel 1.

Følgende enzymer ble brukt:

1. Neutral endoprotease fra Bacillus amyloliquefaciens (NEUTRASE 0,8L)

2. Lipolytisk enzympreparat med svært høy fosfolipase A2-aktivitet, ekstrahert fra porcin bukspyttkjertel (LECITASE 10 L) 3. Lipolytisk enzympreparat fra Fusarium oxysporum med svært høy fosfolipase A2-aktivitet (LECITASE NOVO)

Alle ble erholdt fra Novozymes A/S, Danmark.

Enzymdosering ifølge tabell 2, forsøk nr. 2, ble utført ved pH 5,0 regulert med HC1.

Resultater:

Begge enzympreparater med forskjellig fosfolipaseaktivitet (Ai og A2) utviklet betydelig styrke av den ønskede rød/oransje farge. Den høyeste styrken i rødfarge ble oppnådd i forsøk 1 med LECITASE 10L (fosfolipase A2). Forsøk 2 (fosfolipase Ai) var også betydelig sterkere i farge sammenlignet med referanseprøven.

Claims (27)

1. Fremgangsmåte for bearbeidelse av skalldyr, karakterisert ved at den omfatter trinnet (i) med å behandle et skalldyrsmateriale med et lipolytisk enzym som har fosfolipaseaktivitet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor behandlingen i trinn (i) av skalldyrsmaterialet med det lipolytiske enzym utføres i en vandig væske.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor skalldyrsmaterialet behandlet med lipolytisk enzym bearbeides inn i et for- eller matprodukt, som inkluderer for- eller matadditiver.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, som omfatter etter og/eller under trinn (i), trinnet (ii) med å skille væskefasen fra det faste skalldyrsmateriale.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av krav 2-4, som omfatter trinnet med å rense karotenoidforbindelser fra væskefasen, hvorved man får et preparat anriket på karotenoidforbindelser.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor fremgangsmåten etter trinn (ii) omfatter trinnet med å bearbeide det faste materialet for å utvinne kitinet eller kitosanet.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor skalldyrsmaterialet før trinn (i) ikke er blitt behandlet med et organisk oppløsningsmiddel.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, som omfatter å behandle skalldyrsmaterialet med ett eller flere ikke-lipolytiske enzymer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor det ikke-lipolytiske enzym er en protease.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, som videre omfatter trinnet med å inaktivere og/eller fjerne det eller de tilsatte enzymer, hvorved man får et produkt som er i det vesentlige fritt for aktiviteten til enzymet eller enzymene.

11. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor skalldyrsmaterialet erholdes fra en organisme valgt fra gruppen bestående av krill, reker (inkludert stor reke), krabbe, hummer (inkludert sjøkreps) og sjøanemone, eller skalldyrsmaterialet erholdes fra en blanding av hvilke som helst av organismene.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor organismen er reke og/eller krill.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor skalldyrsmaterialet består hovedsakelig av rekeskall, -hoder og -rogn.

14. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor det ved hjelp av trinn (i) ekstraheres rødlige og/eller oransje pigmenter fra skalldyrsmaterialet.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor det ved hjelp av trinn (i) ekstraheres karotenoider fra skalldyrsmaterialet.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, hvor karotenoidet er valgt fra gruppen bestående av astaxantin, astaxantinderivater, beta-karoten, cantaxantin og zeaxantin, lutein, tunaxantin, fucoxantin og halocyntiaxantin, og hvilke som helst kombinasjoner av de ovenfor nevnte.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor det lipolytiske enzym har lipase- og fosfolipaseaktivitet.

18. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-17, hvor det lipolytiske enzym er en lipase eller en fosfolipase eller en kombinasjon derav.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, hvor skalldyrsmaterialet i trinn (i) inkuberes med én eller flere fosfolipaser valgt fra gruppen bestående av fosfolipase A\ og A2, eller en blanding derav.

20. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor det lipolytiske enzym er utvunnet fra en mikrobiell kilde.

21. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, som omfatter trinnet med å inkorporere produktet erholdt derfra i et konsumerbart produkt, slik som et for- eller matprodukt, som inkluderer for- eller matadditiver.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 5 eller krav 15, hvor lysolecitiner skilles fra karotenoidene og lysolecitinene inkorporeres eventuelt i et konsumerbart produkt, for eksempel et forprodukt for fiskeyngel.

23. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor det ved hjelp av behandlingen med lipolytisk enzym i trinn (i) ekstraheres mer rødlige og/eller oransje pigmenter fra skalldyrsmaterialet sammenlignet med en fremgangsmåte uten behandlingen med lipolytisk enzym.

24. Fremgangsmåte for fremstilling av et konsumerbart produkt, karakterisert ved at den omfatter trinnet med å inkorporere et skalldyrsprodukt som lar seg erholde eller er erholdt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 1-23, i det konsumerbare produkt.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, som omfatter et trinn hvor en væskefase som definert i krav 4, inkorporeres i det konsumerbare produkt.

26. Anvendelse av en fosfolipase for fremstilling av et karotenoidholdig produkt ved å starte fra en skalldyrskilde.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor fosfolipasen er fosfolipase A! eller A2.