CN100365072C - 加工甲壳纲动物物料的方法 - Google Patents

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Abstract

发明人业已发现，用脂解酶对甲壳纲动物进行的酶处理促进了有色色素的提取。因此，本发明涉及从甲壳纲动物回收有色色素例如虾青素和/或甲壳质或脱乙酰壳多糖和/或溶血卵磷脂的方法。脂解酶可以是例如脂肪酶或磷脂酶。可以将脂解酶处理过的甲壳纲动物物料进行另外的加工步骤，包括用非脂解酶例如蛋白酶进行处理。本发明的方法提供若干适用产物及这些产物的若干用途。此外，本发明还涉及由此制成的化妆品和消费品(饲料和食品(包括饮料)以及饲料添加剂和食品添加剂)。

Description

加工甲壳纲动物物料的方法
发明领域
本发明涉及酶法加工甲壳纲动物以便由此提供有用产物的方法。
发明背景
在食品和饲料添加剂领域，特别在水产养殖鱼类方面，作为着色剂和/或抗氧化剂的类胡萝卜素色素如虾青素的用途正在不断增大。水生动物例如陆栖动物通常不能合成虾青素或其他类胡萝卜素，但这类动物中的一些，包括甲壳纲动物，能积累存在于其饮食中的虾青素。甲壳纲动物具有将胡萝卜素转变为虾青素的能力。鲑鱼和红海鲤鱼能积累食物中的虾青素，但这些鱼不能将其他胡萝卜素转变为虾青素。因此，存在于鲑鱼中的虾青素必须由食物这一来源取得。
近来，合成的虾青素被用作饲养鱼的供染色的饲料添加剂，以生成它所需的特征微红色。然而，消费者的关心已导致提供天然虾青素以取代合成虾青素这一不断增长的要求。考虑到近来对天然产物的广泛青睐，这应该是不言自明的。
甲壳纲动物加工工业的发展伴随着产生大量含虾青素的甲壳纲动物废弃物。虾的加工包括除去虾头和硬壳，它们的数量高达整虾的70％。虽然用甲壳纲动物废弃物喂养鱼能够对鱼肉进行染色，但这一办法有若干缺点。这些缺点包括染色水平不恒定，原始的甲壳纲废弃物易于迅速腐败。它们的体积庞大、运输费用高及甲壳质含量高。对它被大量用作鱼饲料来说，与其中所不希望的高含量甲壳质和高含量钙相比，甲壳纲动物废弃物中的类胡萝卜素色素含量是太低了。
提取色素的各种化学方法例如从甲壳纲动物废弃物提取，以及将它们加到鱼饲料中，这些均已有所描述。Chen等人在《食品科学杂志》(Journalof Food Science)vol 47/3，892-900，1982中描述了单独用豆油或与蛋白酶一起从甲壳纲动物中提取虾青素。也描述用有机溶剂提取虾青素。
若干参考文献公开了包括从甲壳纲动物中提取虾青素的蛋白酶处理方法，这可以参考例如，Simpson及Haard，《应用生物化学杂志》(Journal of AppliedBiochemistry)7，212-222，1985；Chen及Meyers，《食品科学杂志》(Journal ofFood Science)vol 47，892-900，1982加拿大专利CA1,313,935也公开了用蛋白酶处理甲壳纲动物废弃物。在《美国化学会论文摘要》(Abstract of Papers，American Chemical Society)vol.231p7-IEC，1997中公开了用胰蛋白酶从甲壳纲动物废弃物中提取胡萝卜素蛋白质。
JP 60-35057A公开了用溶剂从磷虾中提取橙色染料，提取后往提取液中加入脂肪酶或碱以分解脂肪酸，以及在超临界态用一种液体从提取液中分离出此染料。
JP 62-00179A公开了从磷虾中提取和分离有色物，其中使用蛋白酶，在超临界态用二氧化碳从磷虾中提取蛋白质。
JP 62-190090A公开了使用酶例如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶从蔬菜物料例如胡萝卜、南瓜中提取色素。
总的来说，近来在市场上要求取代合成法生产的虾青素，本发明的一个目的是提供一种生产天然的有色色素如虾青素的方法。
发明概述
本发明人已发现，用具有磷脂酶活性的脂解酶对甲壳纲动物物料进行的酶处理促进了从甲壳纲动物物料提取带色色素。该处理法对提取甲壳纲动物物料中的其他有用组分也是有利的。因此，本发明的一个方面提供了一种从甲壳纲运动物料回收带色色素例如虾青素和/或甲壳质或脱乙酰壳多糖和/或溶血卵磷脂的方法。
本发明涉及加工甲壳纲动物的方法，包括用脂解酶例如脂肪酶或磷脂酶处理甲壳纲动物物料。可以将脂解酶处理后的甲壳纲动物物料可进行另外的加工步骤。本发明的方法生成若干种适用的产物和这些产物的若干用途。因此，本发明也涉及用这里所述的方法所获得的产物，并涉及这些产物的用途，如喂养动物。
本发明的详细说明
本发明人已开发一种生产天然色素的有效方法。本发明的一个方面提供了一种从甲壳纲动物物料回收有色色素例如虾青素的方法。因此，本发明涉及一种加工甲壳纲动物的方法，包括用脂解酶处理甲壳纲动物物料的步骤(i)。
甲壳纲动物物料
在本发明的方法中，此甲壳纲动物物料可以是包括完整的甲壳纲动物或其一部分的任何物料。此甲壳纲动物可以是任何来源的；因此此甲壳纲动物可以得自海水源或淡水源。这类甲壳纲动物包括但不限地生物体例如磷虾、虾(包括对虾)、蟹、龙虾(包括挪威龙虾)及海葵。因此，在本发明方法中加工的甲壳纲动物物料可以得自选自这一组的生物体。得自不同种甲壳纲动物的混合物的甲壳纲动物物料也被包括在内，例如这里所提及的这些生物体的任何两种或多种的混合物。就实现步骤(i)的酶处理的目的来说，此甲壳纲动物物料可以是任何含微红色/橙色色素的甲壳纲动物有机体或其一部分。甲壳纲动物物料优选是含所需色素的固体甲壳纲动物物料。因此应该明白，在本发明方法的步骤(i)中被处理的甲壳纲动物物料含有色素，特别是类胡萝卜素。因而在步骤(i)之前这些化合物尚未被从甲壳纲动物物料中提取出来。然而人们期待，在步骤(i)中甲壳纲动物物料的脂解酶处理除了促进从该甲壳纲动物物料提取色素外，还具有其他优点。因而对本发明的某些实施方案来说，在甲壳纲动物物料中存在微红色/橙色色素不是必不可少的标准，这取决于这种酶处理的目的。人们注意到在本发明的上下文中，虾和磷虾是特别令人感兴趣的甲壳纲动物生物体。
如已指出的，此甲壳纲动物物料可以由完整的甲壳纲动物(例如完整的虾)或其一部分(例如壳)组成。此甲壳纲动物物料也可含有来自例如虾加工工业的甲壳纲动物(如虾)的废壳、卵和头，或由这些废壳、卵和头组成。因此，在某些实施方案中，此甲壳纲动物物料可以基本上由虾壳组成。所以此甲壳纲动物物料可含有“完整的”甲壳纲动物生物体(即例如是甲壳纲动物壳和甲壳纲动物“肉”)或它们的一部分(即例如仅是壳)，或由它们组成。形成或构成甲壳纲动物物料的“完整的”甲壳纲动物有机体或甲壳纲动物有机体的“一部分”，在进行酶处理之前或之中可以被分割为更细的部分，例如是但不限于研碎的壳片，或者它可以是完整的，例如是但不限于整磷虾或整虾。
人们了解，在步骤(i)中的被脂解酶处理的甲壳纲动物物料不是这里所定义的甲壳纲动物提取液。
酶处理
除了用脂解酶进行的甲壳纲动物物料的处理外，根据本发明的方法可以包括用一种或多种非脂解酶进行的甲壳纲动物物料的处理。这种甲壳纲动物物料用一种或多种非脂解酶进行的处理可以在脂解酶活性处理之前、之中或之后进行。一种优选实施方案中，此甲壳纲动物物料用一种蛋白酶进行处理。也注意到在其他实施方案中此甲壳纲动物物料不用蛋白酶处理。这种蛋白酶处理可以与磷脂酶处理同时进行。在另一些实施方案中，甲壳纲动物物料首先在水溶液中用蛋白酶处理，随后将从液相中分离而得的固相用一种或多种脂解酶进行处理。
用于本发明方法的酶可以是单组份酶制剂(例如仅存在一种蛋白酶)，或者它可以是混合酶制剂(例如若干种酶的混合物和/或若干种不同酶的混合物，例如脂解酶(如脂肪酶和磷脂酶)的混合物)。
本发明的方法还可还包括灭活和/或除去所加酶的步骤，以获得基本上不含该酶活性的产品。在一种优选实施方案中，本发明方法包括使脂解酶失活和/或除去脂解酶以获得基本上不含该脂解活性的产品。
在广泛方面，本发明涉及从甲壳纲动物物料中提取出有色色素的方法，包括用能促进这种提取的脂解酶处理甲壳纲动物物料的步骤。
在另一方面，本发明涉及从含类胡萝卜素物质(例如甲壳纲动物或植物)中提取出类胡萝卜素的方法，包括用能促进这种提取的脂解酶处理含类胡萝卜素的物质。
本发明特别感兴趣的脂解酶是这里所述的能促进从甲壳纲动物物料提取出类胡萝卜素的脂解酶，或者能促进从任何别的物质分离出类胡萝卜素的脂解酶。
这种类胡萝卜素是任何存在于用这里所述的脂解酶处理的物质之中的类胡萝卜素。这种类胡萝卜素可以是例如虾青素或虾青素衍生物如虾青素酯，β-胡萝卜素、斑蝥黄(cantaxanthin)和玉米黄质、叶黄素、tunaxanthin、岩藻黄质及halocynthiaxanthin，或者前述各物质的任何组合。在本发明方法的优选实施方案中，在步骤(i)用脂解处理法从甲壳纲动物物料中将虾青素提取出来。另一种描述酶处理效果的方法关于是从甲壳纲动物物料提取出的色素的颜色，即关于提取液的颜色。本发明的方法提供了一种加工甲壳纲动物的方法，其中，与不用这种脂解酶处理的方法相比，在步骤(i)中，用脂解酶处理，从该甲壳纲动物物料中提取出更多微红色和/或橙色色素(例如虾青素)。在一些本发明方法的实施方案中，与不用这种脂解酶处理的相似方法相比，步骤(i)中用酶处理，至少多于1/2倍、至少多于2倍或至少多于10倍的类胡萝卜素，例如虾青素被从该甲壳纲动物物料中提取出来。
用于本发明方法中的脂解酶可以是任何脂解酶。
脂解酶是将羧酸酯键水解的酶。取决于底物的特性，即于所选择的底物中在所选择酯键上的活性，此活性可进行分类，例如脂肪酶、溶血磷脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2或二半乳糖基二甘油脂(DGDG)水解酶。
底物特性：因此，脂解酶是将羧酸酯键水解的酶。这些酶可具有下列活性中的一种或多种，每一种以在底物中的某一酯键上的作用来定义。圆括号内的数字是根据酶的酶活性类型，由国际生物化学联盟酶委员会指定的系统数。
■脂肪酶(三酰基甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)，对三酸甘油酯特别是长链(C16-C20)的三酸甘油酯中的脂肪酰基起作用。
■磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)，对完整磷脂例如卵磷脂1-位的脂肪酰基起作用。
■磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，对完整磷脂例如卵磷脂2-位的脂肪酰基起作用。
■溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)，对溶血磷脂例如溶血卵磷脂的脂肪酰基起作用。
每一种活性均可以或者用国际单位(IU)或者用在WO 00/32758中所给出的或在本说明书中给出的检验方法进行定量。
因此，本发明提供了一种加工甲壳纲动物物料的方法，包括将脂解酶例如磷脂酶加到甲壳纲动物物料之中。一种实施方案涉及一种加工甲壳纲动物物料的方法，包括将至少两种具有不同底物特性例如磷脂酶活性和脂肪酶活性的脂解酶(例如两种脂解酶)加到甲壳纲动物物料之中。
脂肪酶活性(LU)：使用阿拉伯胶作乳化剂，通过使三丁精(三丁酸甘油酯)乳化而制备脂肪酶用的底物。三丁精在pH7之下于30℃水解后接着进行pH滴定实验。脂肪酶活性1单位(1LU)等于在标准条件下可释放出1微摩尔丁酸/分钟的酶的数量。
磷脂酶活性(P阻U)：磷脂酶活性(PHLU)以从卵磷脂释放出的游离脂肪酸测定。往50微升4％L-α-磷脂酰胆碱(由Avanti得到的植物卵磷脂)，4％Triton X-100，在50毫摩尔HEPES中的5毫摩尔CaCl2，pH7中，加入在50毫摩尔HEPES中的己稀释到合适浓度的50微升酶溶液，pH7。此样品在30℃下培养10分钟，在离心(7000rpm下5分钟)之前于95℃下停止反应5分钟。用购自Wako Chemicals GmbH的NEFA C试剂盒测定游离的脂肪酸；25微升反应混合物中加入250微升试剂A，并在37℃下培养10分钟。然后加500微升试剂B，又在37℃将样品在37℃下再培养10分钟。用HP8452A二极管阵列分光光度计在550nm处测定其吸收。样品试验至少两次。底物与酶掩蔽物(已预热的酶样品(在95℃下10分钟)+底物)也被包括在内。油酸被用作脂肪酸标准。1PHLU等于在这些条件下可释放出1微摩尔游离脂肪酸/分钟的酶的数量。
在一种优选实施方案中，脂解酶是具有磷脂酶活性的脂解酶，例如脂肪酶和/或磷脂酶，或它们的组合。在一种优选实施方案中，此脂解酶是磷脂酶。在另一优选实施方案中，此酶是脂肪酶。
磷脂类，例如卵磷脂，由被两个脂肪酸酯化的甘油组成，在甘油的外部(sn-1)及中间(sn-2)这两个位置被酯化，在第三个位置则被磷酸酯化；此磷酸本身则又被氨基醇酯化。磷脂酶是参与磷脂的水解的酶。可以区分若干类型的磷脂酶，包括磷脂酶A1和A2，它们水解1个脂肪酰基(分别在sn-1和sn-2位置)，形成溶血磷脂；而溶血磷脂酶(或磷脂酶B)，它能将溶血磷脂中残留的脂肪酰基水解。因此，在一种实施方案中，本发明涉及有能力把在磷脂中的一个和/或两个脂肪酰基水解的酶的用途。
磷脂酶活性可由也具有其他活性的酶例如具有磷脂酶活性的脂肪酶来提供。磷脂酶活性可以例如来自具有磷脂酶次活性的脂肪酶。在本发明的其他实施方案中，磷脂酶活性由基本上仅具有磷脂酶活性的酶来提供，其中磷脂酶酶活性不是次活性。在本发明的一种实施方案中，磷脂酶不是具有如WO 98/26057所定义的磷脂酶次活性的脂肪酶。
此磷脂酶可以是具有一种多种下列活性的酶：磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)，磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，磷脂酶B，溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)。
在一种更优选实施方案中，脂解酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。在一种实施方案中，在步骤(i)中的甲壳纲动物物料用1种或多种选自磷脂酶A1和A2的磷脂酶进行培养。
在一种实施方案中，磷脂酶在磷脂酶处理条件下不具有或仅具有低的甘油三酯脂肪酶活性(EC 3.1.1.3)。脂肪酶与磷脂酶的合适比例可以低于0.001LU/LEU或低于0.005(特别是低于0.001)PHLU/KLU(其单位如上所定义)。
为了处理甲壳纲动物物料，甲壳纲动物物料如这里所公开的用有效量的酶进行培养。术语“有效量”在这里被定义为它足以在至少一种与加工甲壳纲动物(特别是提取色素，例如从甲壳纲动物物料提取虾青素)有关的性能方面产生适当作用的酶数量。
磷脂酶的使用剂量，以干固体的重量计，典型地为0.001-0.05％酶蛋白质。市场供应的活性为10,000LEU/g的磷脂酶产品的使用剂量，以干固体的重量计为20-500ppm。
用于本发明的酶在适于加工甲壳纲动物的pH和温度范围内优选具有合适的酶活性。在一种实施方案中，在宽广的pH和温度范围内，这些酶具有活性。
在一种优选实施方案中，用于本发明方法的酶，包括这里所述的脂解酶，其最佳pH在约3～10的范围内。在更优选的实施方案中，这些酶，包括在这里所述的脂解酶，其最佳pH在约4.5～8.5的范围内。
在别的实施方案中，这些酶，包括这里所述的脂解酶，其最佳温度在约5℃～100℃的范围内。在更优选的实施方案中，这些酶，包括这里所述的脂解酶，其最佳温度在约25℃～75℃的范围内。
用于本发明方法的这些酶，特别是脂解酶可以由任何来源例如植物、微生物体或动物获得。这些酶包括脂解酶，可以是真核生物的，例如来自霉菌源或动物源的。得自动物源的脂解酶的例子是得自蜂毒液或蛇毒液，或者得自哺乳动物胰腺例如猪胰腺的磷脂酶。在一种优选实施方案中，这些酶优选得自微生物源例如细菌或霉菌，如细丝霉菌或酵母。在一种优选实施方案中，脂解酶是原核酶，具体是细菌酶，例如来自假单胞菌属(Pseudmonas)或芽孢杆菌属(Bacillus)的。
在一种优选实施方案中，这些酶来自细菌源。例如，这些酶可来自醋杆菌属(Acetobacter)，不动杆菌属(Acinetobacter)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，节杆菌属(Arthrobacter)，固氮杆菌属(Azotobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)，丛毛单孢菌属(Comamonas)，梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)，盐杆菌属杆菌属(Acetobacter)，不动杆菌属(Acinetobacter)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，节杆菌属(Arthrobacter)，固氮杆菌属(Azotobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)，丛毛单孢菌属(Comamonas)，梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)，盐杆菌属(Halobacterium)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，根瘤菌属(Rhizobium)，沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，链霉菌属(Streptomyces)，大肠杆菌属(E.coli)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沃林氏菌属(Wolinella)，或甲基营养生物的细菌菌株。
在更优选实施方案中，这些酶来自醋酸化醋杆菌(Acetobacter aceti)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans)，棕色固氮杆菌(Azotobacter vinelandii)，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，anitratum芽孢杆菌(Bacillus anitratum)，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，络丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumtyrobutyricum)，dioxyaceticus葡糖杆菌(Gluconobacter dioxyaceticus)，液化葡糖杆菌(Gluconobacter liqueifaciens)，弱氧化葡糖杆菌(Gluconobactersuboxydans)，红皮盐杆菌(Halobacterium cutirubrum)，旋卷分枝杆菌(Mycobacterium convolutum)，苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，变青链霉菌(Streptomyces lividans)，鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，或产琥珀酸沃林氏菌(Wolinellasuccinogenes)菌株。
在另一种优选实施方案中，这些酶来自霉菌源。例如，这些酶可以来自酵母菌株，如假丝酵母属(Candida)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，毕赤氏酵母属(Pichia)，糖酵母属(Saccharomyces)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia菌株；或来自细丝霉菌菌株如支顶孢属(Neurospora)，拟青霉属(Paecilomyces)，青霉属(Penicillium)，Phanerochaete，Piromyces，裂褶菌科(Schizophyllum)，小核菌属(Sclerotium)，孢子丝菌属(Sporotrichum)，踝节菌属(Talaromyces)，热子囊菌属(Thermoascus)，草根霉属(Thielavia)，Tolypocladium，或木霉属(Trichoderma)菌株。
在另一更优选实施方案中，这些酶来自卡尔斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)，douglasii糖酵母(Saccharomyces douglasii)，kluyveri糖酵母(Saccharomyces kluyveri)，norbensis糖酵母(Saccharomycesnorbensis)，或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)菌株。
在另一更优选实施方案中，这些酶来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑色曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，lignorum金孢子菌(Chrysosporiumlignorum)，杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)，cerealis镰孢(Fusariumcerealis)，crookwellense镰孢(Fusarium crookwellense)，大刀镰孢(Fusariumculmorum)，禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，禾赤镰孢(Fusariumgraminum)，异孢镰孢(Fusarium heterosporum)，合欢木镰孢(Fusariumnegundi)，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)，多枝镰孢(Fusarium reticulatum)，玖瑰色镰孢(Fusarium roseum)，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)，硫色镰孢(Fusarium sulphureum)，toruloseum镰孢(Fusarium toruloseum)，trichothecioides镰孢(Fusarium trichothecioides)，venenatum镰孢(Fusarium venenatum)，insolens腐质霉(Humicola insolens)，lanuginose腐质霉(Humicola lanuginosa)，好食念珠霉(Monilia sitophila)，米赫毛霉菌(Mucor miehei)，thermophila毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，粗糙链孢链孢霉(Neurospora crassa)，产青青霉(Penicillium purpurogenum)，(Phanerochaete chrysporum)，pinsitus多孔菌(Polyporus pinsitus)，变色多孔菌(Polyporus versicolour)，整齐小核菌(Sclerotium rolfsii)，thermophile孢子丝菌Sporotrichum thermophile，citrinoviride木霉(Trichoderma citrinoviride)，hamatum木霉(Trichoderma hamatum)，harzianum木霉(Trichodermaharzianum)，康宁氏木霉(Trichoderma koning)，longibrachiatum木霉(Trichoderma longibrachiatum)，polysporum木霉(Trichoderma ploysporum)，reesei木霉(Trichoderma reesei)，satumisporum木霉(Trichodermasaturnisporum)，或者绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
在一种优选实施方案中，霉菌脂解酶来自下列的属或种：腐质霉属(Humicola)(异名Thermomyces)，lanuginosa腐质霉素(H.lanuginosa)(异名：T.lanuginosus)，insolens腐质霉素(H.insolens)，镰孢属(Fusarium)，尖孢镰孢(F.oxysporum)，茄病镰孢(F.solani)，异孢镰孢(F.heterosporum)，曲霉属(Aspergillus)，塔宾曲霉(A.tubigensis)，黑色曲霉(A.niger)，米曲霉(A.oryzae)，Rhizomucor，假丝酵母属(Candida)，antarctica假丝酵母(C.antarctica)，青霉属(Penicillium)，沙门氏柏干酪青霉(P.camembertii)，根霉属(Rhizopus)，米根霉(Rhizopus oryzae)，或梨头霉属(Absidia)。
脂解酶的一些具体例子如下：
·得自猪胰腺的磷脂酶A2，Novozymes A/S以商品名LECITASETM出售的。
·得自H.lanuginose的脂肪酶，在EP 305216有描述，其氨基酸序列表示在US 5869438的SEQ ID No.2的位置1-269(以后称作Hll或H.lanuginosa脂肪酶)。
·得自在WO 98/26057中描述的尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)，具有脂肪酶和磷脂酶A1活性的酶(以后称作FoL或尖孢镰孢(F.oxysporum)脂肪酶/磷脂酶)。其分子量为30±2KDa，等电点为5.8-6.8，大于pH9具有最佳磷脂酶活性。
在WO 01/27251中描述的酶。
或者，此脂解酶可以是通过改变如上面所述的天然存在酶的氨基酸序列而得到的变异体。脂解酶变异体的例子描述在WO 00/32758。
在一种实施方案中，磷脂酶A1得自镰孢属菌株，具体是尖孢镰孢，例如得自在WO 98/26057中描述的菌株DSM 2627，具体描述在权利要求36中和其中的SEQ ID No.2。
用于本发明方法中的这些酶，包括脂解酶(例如磷脂酶)可以是这样一种酶，其氨基酸序列相同于天然酶，或者它可以具有改进的氨基酸序列，例如具有一个或多个缺失的、插入的和/或取代的氨基酸，即一种重组生成的或合成生成的酶，它是天然氨基酸序列的突变型和/或片段。天然变异体包括在天然酶的含义内。
用于本发明方法的酶可以采用任何适用方法获得。例如，通过合适微生物的发酵及随后用本技术领域公知方法从所得已发酵的发酵液或微生物中分离出磷脂酶制剂，而获得磷脂酶制剂。因此，这些酶可以用任何适用技术，特别是使用本领域公知的重组DNA技术(见Sambrook，J.等人，1989，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)，从所述有机体获得。重组DNA技术的采用通常包括在允许酶表达以及从培养物回收酶的条件下，在培养介质中，将用重组DNA载体转化的宿主细胞进行培养，而这种宿主细胞由在合适启动子与终止子之间插入的人们所关切的产品基因组成。此DNA序列可以是基因组的cDNA或合成的起点，或者是它们的任何混合物，而且它可以按照本技术领域公知的方法进行分离或合成。如上所述，这种酶也可以从它的天然存在源例如植物或有机物，或从它的有关部分获得。这些酶也可以由商业供应商例如丹麦的Novozymes A/S获得。
因此，用于本发明方法的酶可以是任何适于所述使用的形态，例如干粉形态、聚集粉形态或粒状形态(具体是非撒粉粒)、液体(具体是已稳定的液体)、或者是已保护的酶。此酶制剂优选是液体形态。
用于本发明中的术语“蛋白酶”在这里定义为催化肽链的水解的酶。应该明白，术语“蛋白酶”包括肽链内切酶和肽链端解酶(氨基肽酶和羧基肽酶)。
加工步骤、所得产物及其用途
本发明提供一种加工甲壳纲动物的方法，它包括用一种或多种脂解酶处理甲壳纲动物物料的步骤(i)。
对本发明的方法来说，在步骤(i)中用脂解酶处理甲壳纲动物物料优选在水成液中进行。因此，甲壳纲动物物料在步骤(i)之前或之中可以悬浮在水成液之中。
在酶处理之前，此悬浮的甲壳纲动物物料可被加热，或者可省去热处理。
在步骤(i)中，酶处理可以在适于这种酶的任何温度、pH及培养时间下进行。在本发明方法的一个实施方案中，在用酶处理之前调整pH。在另一实施方案中，在用酶处理之前pH不调整。
在优选实施方案中，pH值在约3～12的范围。在另一实施方案中，pH在约4.5～8.5的范围。
酶处理优选在最佳于该酶的温度下进行。在某些实施方案中，酶处理在约5～100℃的温度范围下进行。在其他实施方案中，此温度在约10～90℃的范围内。在更优选的实施方案中，此温度在约20～75℃的范围内。
酶处理在任何适合时间内进行，这取决于存在的酶活性。酶处理可以进行例如约10分钟～约10时内，如约30分钟～约6小时。
在一实施方案中，由得自胰腺的磷脂酶A2在30-70℃、pH3-12(特别优选4.5～8.5)下使用。在另一实施方案中，使用得自尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)的磷脂酶A1，温度为20-50℃，pH3-12(特别优选4.5～8.5)。
在某些实施方案中，甲壳纲动物物料也与下列化合物中的一种或多种相接触：抗氧化剂(例如化学抗氧化剂如BHA＝丁基化羧基茴香醚和HT＝丁基化羟基甲苯)，物理抗氧化剂(例如氮氧层)，氧清除剂，例如酶清除剂，如漆酶，柠檬酸，EDTA，表面活性剂，凝胶化合物，调整pH的酸/碱，通常还有提高本发明方法可用的酶活性的化合物。
在低氧含量下进行虾青素的提取可能是优选的。在一实施方案中，如WO 96/31133所述，用漆酶处理来进行提取。在本发明中所用的术语“漆酶”在这里定义为苯二酚：氧化还原酶，它在分子氧存在下将4个苯二酚催化转化为4个苯并半醌和2个水。
在本发明的范围内，有一些方法，其中脂解酶处理过的甲壳纲动物物料被进一步加工成为消耗产物，包括例如饲料或食品(食品中包括饮料)，还包括饲料添加剂和食品添加剂。在本发明的范围内，还有一些方法，其中脂解酶处理过的甲壳纲动物物料被再加工成为化妆品或保健食品或功能食品或药物。
本发明的方法，在步骤(i)之后或之中，还可包括从固体甲壳纲动物物料中分离出液相(或称作“甲壳纲动物提取液”或仅称“提取液”)。这一分离可采用任一合适工艺进行，例如用离心法、筛分法或倾析法进行。
在其他实施方案中，既不在步骤(i)之后也不在其过程中将液相从固体甲壳纲动物物料中分离出。
在本发明的范围内，有一些方法，其中步骤(ii)的固体甲壳纲动物物料被进一步加工成为消费品，包括例如饲料或食品(食品中包括饮料)，还包括饲料添加剂和食品添加剂。在本发明的范围内，还有一些方法，其中步骤(ii)的甲壳纲动物固体被进一步加工成为化妆品或保健食品或功能食品或药物。
在一种实施方案中，固体甲壳纲动物物料被进一步加工，以便由它回收甲壳质或脱乙酰壳多糖。
在本发明的范围内，还有一些方法，其中步骤(ii)的甲壳纲动物提取液被进一步加工为消费品，包括例如饲料或食品(食品中包括饮料)，还包括饲料添加剂或食品添加剂。在本发明的范围内，还有一些方法，其中步骤(ii)的甲壳纲动物提取液被再加工成为化妆品、保健品或功能食品或药物。
可将提取液浓缩。可用任何适用工艺例如蒸发、膜过滤和干燥进行浓缩。在一种实施方案中，此方法包括一个步骤，其中提取液被制成基本上是干的，即水份低例如约为5％，例如在约3％～10％的范围。
在一种优选实施方案中，本方法还包括从液相提纯已提取的类胡萝卜素化合物，以获得富含类胡萝卜素化合物的制剂。此回收的类胡萝卜素制剂可以例如为含至少100ppm类胡萝卜素的形式。在另一实施方案中，类胡萝卜素化合物被从已水解的脂肪化合物如溶血卵磷脂中分离出来。在本发明的另一实施方案中，不将类胡萝卜素化合物从已水解的脂肪化合物例如溶血卵磷脂中分离出来。分离方法可以是膜过滤或其他的过滤步骤，和/或离子交换。
优选的是，在步骤(i)之前甲壳纲动物物料还未用有机溶剂处理。在一优选实施方案中，在步骤(i)之前，甲壳纲动物物料还未用一种或多种有机溶剂处理，这些有机溶剂选自丙酮、正己烷和乙酸乙酯。
本发明还涉及提取含在磷虾中的有色色素的方法，此方法包括用蛋白酶分解磷虾以除去蛋白质，以及用脂解酶处理残留的磷虾。
在一个方面，用本发明方法的步骤(i)，从该甲壳纲动物物料中提取有色色素。
在一个方面，用本发明方法的步骤(i)，从该甲壳纲动物物料中提取微红色和/或橙色色素。
在一个方面，用本发明方法的步骤(i)，从该甲壳纲动物物料中提取类胡萝卜素。
在一个方面，用本发明方法的步骤(i)，从该甲壳纲动物物料中提取一种或多种类胡萝卜素，这些类胡萝卜素选自虾青素，虾青素衍生物例如虾青素酯类，β-胡萝卜素，斑蝥黄和玉米黄质，叶黄素，tunaxanthin，岩藻黄质和halocynthiaxanthin。
在一个方面，用本发明方法的步骤(i)，从该甲壳纲动物物料中提取虾青素。
在一个方面，在本发明方法的步骤(i)，其中脂解酶是磷脂酶(例如磷脂酶A1和/或A2)，用磷脂酶酶处理法形成溶血卵磷脂，此产物被加至消费品例如饲料或食品中，消费品还包括饲料添加剂或食品添加剂。
优选实施方案涉及生产有色色素的方法，包括下列步骤：(i)在适于保证所述酶的酶活性的条件下，用含有有效量脂解酶的水成液来培养甲壳纲动物物料；及(ii)从固体甲壳纲动物物料中分离出含有已提取的有色色素的液相。
一种更优选的实施方案涉及生产虾青素的方法，包括下列步骤：(i)在适于保证所述酶的酶活性的条件下，用含有有效量脂解酶的水成液来培养基本上已粉碎的虾壳；及(ii)从固体碎虾壳中分离出含有已提取的虾青素的液相。
本发明还涉及用这里所公开的本发明任何方法特别是这里所公开的加工甲壳纲动物物料的方法可获得的或已获得的产品的用途。
一个优选实施例涉及用本发明的方法能获得的或已获得的产品，其中步骤(i)中的脂解酶的磷脂酶，包括例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，其中该可得到的或已得到的产品含有类胡萝卜素例如虾青素，和溶血卵磷脂。
本发明还涉及制备消费品的方法，此方法包括一个步骤，在此步骤中，由本发明任一方法(加工甲壳纲动物物料)可获得的或已获得的产品被加至该消费品中。此消费品是例如饲料或食品，包括饲料添加剂或食品添加剂。
一种优选实施方案涉及制备消费品的方法，包括一个步骤，其中：
(a)用本发明的加工甲壳纲动物物料的方法可获得的或已获得的产品，而且在该方法的步骤(i)中的脂解酶是磷脂酶包括例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，以及其中该可获得的或已获得的产品包含类胡萝卜素例如虾青素，和溶血卵磷脂；将这一可获得的或已获得的产品加至该消费品中。这种消费品是例如饲料或食品，包括饲料添加剂或食品添加剂。
本发明还涉及一种制备消费品的方法，这一方法包括一个步骤，其中在这里所述的加工甲壳纲动物物料的方法步骤(ii)中所已获得的或可获得的甲壳纲动物提取液，被加到该消费品中；在步骤(ii)之后和加至消费品之前，此甲壳纲动物提取液可被进一步加工。此消费品是例如饲料或食品，包括饲料添加剂或食品添加剂。在一种优选实施方案中，此被加至消费品中的甲壳纲动物提取液是用这里所述的加工甲壳纲动物方法已获得的或可获得的，其中在步骤(i)中的脂解酶是磷脂酶，包括磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，而且该可获得的或已获得的产品含有类胡萝卜素例如虾青素，和溶血卵磷脂。
本发明还涉及含有虾青素和溶血卵磷脂的组合物。
本发明还涉及消费品，例如食品或饲料，或食品添加剂或饲料添加剂，它们含有用这里公开的本发明的任何方法，特别是这里公开的加工甲壳纲动物物料的方法可获得或已获得的产品，或由这些产品组成。
本发明还涉及消费品，例如饲料或食品，或者饲料添加剂或食品添加剂，它们含有用本发明的加工甲壳纲动物物料的任何方法可获得的或已获得的产品，或由这些产品组成，其中步骤(i)的脂解酶是磷脂酶，包括例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2，而且该可获得的或已获得的产品含有类胡萝卜素例如虾青素，和溶血卵磷脂。
本发明在其另一方面涉及喂养动物的方法，此方法包括用本发明的饲料或饲料添加剂喂养动物。此动物可例如是鱼或家禽。此动物可选自但不限于鲑科鱼(salmonoid species)、菱羊鲷(sea bream)、虾(shrimp)及龙虾(lobster)。鲑科鱼可以是鳟鱼(trout)或鲑鱼(salmon)。鲑鱼可以是虹鳟(rainbow salmon)，鲑(atlantic salmon)、大鳞大麻哈鱼(chinook salmon)，银大麻哈鱼(coho salmon)，细鳞大麻哈鱼(pink salmon)，大麻哈鱼(chumsalmon)或大麻哈鱼属(pacific salmon)。此动物也可以是甲壳纲动物。家禽可选自但不限于产蛋母鸡。
在一种优选实施方案中，本发明涉及喂养鱼特别是幼鱼的方法，此方法包括用包含虾青素和溶血卵磷脂的饲料或饲料添加剂喂养鱼(包括例如幼鱼)。
用本发明方法获得的类胡萝卜素可用作着色剂和/或用作抗氧化剂。
本发明在另一方面涉及磷脂酶在生产虾青素方面的用途。
在一种优选实施方案中，本发明涉及脂解酶(例如磷脂酶如磷脂酶A1或磷脂酶A2)在从甲壳纲动物物料提取虾青素方面的用途。
虾青素也可用于加至食品例如幼鱼和蛋、每日食品、点心等之中。
本发明在又一方面涉及磷脂酶在制备甲壳纲动物食品或饲料，或者食品添加剂或饲料添加剂方面的用途。具体地说，本发明涉及磷脂酶在以甲壳纲动物类胡萝卜素为来源制备含类胡萝卜素产品方面的用途。这也包括合有这里所公开的磷脂酶如磷脂酶A1或A2的酶制剂在以甲壳纲动物类胡萝卜素为来源制备含类胡萝卜素产品方面的用途。
本发明的方法在下列方面优于通常的虾青素提取方法：本发明方法高产率地得到有色色素，例如虾青素，以及其他有用组份例如甲壳质或脱乙酰壳多糖和/或溶血卵磷脂。此外，酶提取法被认为是比化学提取法更为消费者希望的，因为化学提取法使用有机溶剂。此外，本发明的方法提供对于合成法生产虾青素来说期望的用自然资源的替代方法。
本发明用下列实施进一步说明，这不应被认为是对本发明范围的限制。
实施例
实施例1
在这一实验中，检测了通过加不同量的酶所从虾壳提取有色色素的效率差异。
方法
按1∶1往细研的虾壳(剥虾工厂的副产物)中加入水，掺混。把温度调为55℃。
酶处理时间为55℃下5小时，随后在85℃加热10分钟。加热后把样品离心(3000rpm，10分钟)以获得作为上层清液的提取液。
有色色素的测定：用美能达制的套装(coordinates)Lab测量颜色。
使用下列的酶：
1.来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的中性内切蛋白酶制剂(NEUTRASE 0.8LTM)
2.从猪胰腺提取的胰蛋白酶(PTN 6.0STM)
3.从猪胰腺提取的具有很高磷脂酶A2活性的脂解酶制剂(LECITASE10LTM)
4.源自Rhizomucor miehei的脂肪酶(PALATASE 20,000LTM)所有这些酶均得自丹麦的Novozymes A/S。
酶的剂量按表1
表1实验方案
1 2 3 4 5 6
  蛋白酶：NEUTRASE 0.8L<sup>TM</sup>，对于虾的％(w/w)   0.5   0.5
  蛋白酶：PTN 6.0S<sup>TM</sup>，对于虾的％(w/w)   0.1   0.1
  磷脂酶A<sub>2</sub>：LECITASE 10L，对于虾的％(w/w)   0.1   0.1   0.1
  脂肪酶：PALATASE 20,000L<sup>TM</sup>，对于虾的％(w/w)   0.1
  对颜色的描述   浅黄色   红色/橙色   浅橙色   灰橙色   红色/橙色   橙色
结果：提取液的优选颜色是红色。当单独使用LECITASE 10LTM(磷脂酶A2)时得到的红色强度最高(试样5)。次最强红色是试样2，其中使用了LECITASE 10LTM(磷脂酶A2)和蛋白酶。因此，蛋白酶(NEUTRASETM)不增大红色强度。用脂肪酶PALATASETM提取时，与LECITASE 10L(磷脂酶A2)的试样(5和2)相比，得到的橙色提取液在红色强度方面低很多。单独用蛋白酶提取的两个试样(分别使用中性酶(Neutrase)和胰蛋白酶，试样1和3)仅显示浅黄色。
实施例2
在这一实验中，试验了使用具有磷脂酶活性的不同脂解酶制剂从虾壳提取有色色素的效率差异。作为参考，对比了不加酶的提取。
方法：
按1∶1往细研的虾壳(虾剥离工厂的副产物)中加入水，掺混。把温度调为55℃。
酶处理时间为55℃下5小时，随后在85℃加热，时间为10分钟。加热后将样品离心(3000rpm下离心10分钟)以上层清液的形式得到提取液。
如实施例1测定有色色素。
使用了下列的酶：
1.得自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amyloliquefaciens)的中性内切蛋白酶。(NEUTRASE 0.8LTM)
2.提取自猪胰腺的具有很高磷脂酶A2活性的脂解酶制剂(LECITASE10LTM)
3.具有很高磷脂酶A1活性的尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)脂解酶制剂(LECITASE NOVOTM)
所有的酶均得自丹麦的Novozymes A/S。
酶剂量按表2。在用HCl调整至pH5.0下进行试验2。
表2实验方案
  1   2   参考例
  蛋白酶：NEUTRASE0.8L<sup>TM</sup>，对于虾的％(w/w)   0.5   0.5
  磷脂酶A<sub>2</sub>：LECITASE10L，对于虾的％(w/w)   0.1
  磷脂酶A<sub>1</sub>：LECITASE NOVO<sup>TM</sup>，对于虾的％(w/w)   0.2
  对颜色的描述   红色/橙色   橙色/红色   浅黄色
结果：具有不同磷脂酶活性(A1和A2)的两种酶制剂均呈现显著的所想要的红色/橙色强度。在使用LECITASE 10L(磷脂酶A2)的试验1中获得了最高的红色强度。与参考实施例相比，试验2(磷脂酶A1)也呈现更显著的颜色强度。

Claims (42)

1.一种加工甲壳纲动物的方法，该方法包括用具有磷脂酶活性的脂解酶处理甲壳纲动物物料的步骤(i)。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(i)用所述脂解酶对该甲壳纲动物物料进行的处理在水成液中进行。
3.权利要求1或2的方法，其中脂解酶处理过的甲壳纲动物物料被加工成为饲料或食品。
4.权利要求3的方法，其中所述的饲料或食品，包括饲料添加剂或食品添加剂。
5.根据权利要求1的方法，其中甲壳纲动物物料是固相，并且酶处理在水成液中进行，而且该方法还包括在步骤(i)之后和/或之中，从固体甲壳纲动物物料中分离出液相的步骤(ii)。
6.权利要求2的方法，还包括从液相中提纯类胡萝卜素化合物以获得富含类胡萝卜素化合物的制剂的步骤。
7.权利要求5的方法，其中所述方法在步骤(ii)之后还包括加工该固体物料以回收甲壳质或脱乙酰壳多糖的步骤。
8.根据权利要求1的方法，其中在步骤(i)之前该甲壳纲动物物料还未用有机溶剂处理。
9.根据权利要求1的方法，包括用一种或多种非脂解酶处理甲壳纲动物物料。
10.权利要求9的方法，其中非脂解酶是蛋白酶。
11.根据权利要求1的方法，还包括将所加的酶灭活和/或除去，以获得基本上没有该酶活性的产品。
12.根据权利要求1的方法，其中甲壳纲动物物料得自选自磷虾、虾、蟹、龙虾及海葵的生物体；或者此甲壳纲动物物料得自任何所述生物体的混合物。
13.权利要求12的方法，其中所述的虾为对虾。
14.权利要求12的方法，其中所述的龙虾为挪威龙虾。
15.如权利要求12的方法，其中此生物体是虾和/或磷虾。
16.如权利要求15的方法，其中此甲壳纲动物物料基本上由虾壳、虾头和虾卵组成。
17.根据权利要求1的方法，其中在步骤(i)中包括提取步骤，通过提取从该甲壳纲动物物料中获得微红色和/或橙色色素。
18.根据权利要求1的方法，其中在步骤(i)中包括提取步骤，通过提取从该甲壳纲动物物料中获得类胡萝卜素。
19.权利要求18的方法，其中类胡萝卜素选自虾青素、虾青素衍生物、β-胡萝卜素、斑蝥黄和玉米黄质、叶黄素、tunaxanthin、岩藻黄质及halocynthiaxanthin以及上述各物质的任何组合。
20.根据权利要求6或权利要求18的方法，其中溶血卵磷脂被从类胡萝卜素中分离出来，而且此溶血卵磷脂任选加到消耗产品中。
21.根据权利要求20的方法，其中所述的消耗产品为幼鱼的饲料。
22.根据权利要求1的方法，其中脂解酶具有脂肪酶活性和磷脂酶活性。
23.根据权利要求1的方法，其中脂解酶是脂肪酶或磷脂酶或它们的组合。
24.根据权利要求23的方法，其中在步骤(i)中甲壳纲动物物料与一种或多种选自磷脂酶A1或A2或它们的混合物的磷脂酶一起培养。
25.根据权利要求1的方法，其中脂解酶得自微生物源。
26.根据权利要求1的方法，它包括把所得的产品加到消耗产品之中的步骤。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的消耗产品是饲料或食品。
28.根据权利要求26的方法，其中所述的消耗产品是饲料添加剂或食品添加剂。
29.一种生产有色色素的方法，它包括下列步骤：
(i)在适于保证所述酶的酶活性的条件下，用含有有效量的具有磷脂酶活性的脂解酶的水成液培养甲壳纲动物物料；及
(ii)从固体甲壳纲动物物料中分离出含有已提取出的有色色素的液相。
30.根据权利要求29的方法，其中有色色素含有微红色和/或橙色色素。
31.根据权利要求17或30的方法，其中与不用所述脂解酶处理的方法相比，在步骤(i)中，用脂解酶处理，从该甲壳纲动物物料中把更多的微红色和/或橙色色素提取出来。
32.根据权利要求29的方法，其中有色色素含有虾青素。
33.根据权利要求29-30或32中的任一项的方法，其中甲壳纲动物物料也用非脂解酶进行处理。
34.根据权利要求31的方法，其中甲壳纲动物物料也用非脂解酶进行处理。
35.根据权利要求33的方法，其中所述的非脂解酶为蛋白酶。
36.根据权利要求34的方法，其中所述的非脂解酶为蛋白酶。
37.一种生产虾青素的方法，它包括下列步骤：
(i)在适于保证所述酶的酶活性的条件下，用含有有效量的具有磷脂酶活性的脂解酶的水成液培养碎虾壳；及
(ii)从固体碎虾壳中分离出含有已提取出的虾青素的液相。
38.一种制造消耗产品的方法，它包括将如权利要求5所定义的液相加至该消耗产品之中的步骤。
39.一种制造消耗产品的方法，它包括将用权利要求1～37中的任一项的方法可制得的或已制得的甲壳纲动物产品加至该消耗产品之中的步骤。
40.磷脂酶在生产虾青素方面的用途。
41.磷脂酶在制造由甲壳纲动物源制备含类胡萝卜素的产品方面的用途。
42.根据权利要求40或权利要求41的用途，其中磷脂酶是磷脂酶A1或A2。
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