RU2445355C2 - Способ экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток - Google Patents
Способ экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2445355C2 RU2445355C2 RU2008148606/10A RU2008148606A RU2445355C2 RU 2445355 C2 RU2445355 C2 RU 2445355C2 RU 2008148606/10 A RU2008148606/10 A RU 2008148606/10A RU 2008148606 A RU2008148606 A RU 2008148606A RU 2445355 C2 RU2445355 C2 RU 2445355C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phospholipase
- yeast
- enzyme
- activity
- yeast cells
- Prior art date
Links
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims abstract description 106
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 33
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 70
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 70
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 12
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 claims description 10
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 10
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims description 10
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 54
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 20
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 66
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 23
- 102000011720 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 description 15
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 13
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 11
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 11
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- -1 for example Proteins 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 7
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 4
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 4
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 4
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 3
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 3
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000177202 Chimonobambusa utilis Species 0.000 description 2
- 241001656807 Clostridium haemolyticum Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 2
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 2
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 2
- 101710096328 Phospholipase A2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 2
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 description 2
- 241000187176 Streptomyces violaceoruber Species 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 239000011552 falling film Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005141 piperazine Drugs 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- IHNKQIMGVNPMTC-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxy-3-octadecanoyloxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C IHNKQIMGVNPMTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N Astaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C(=C/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)/C)C=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)C(O)CC2(C)C JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186225 Corynebacterium pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000918600 Corynebacterium ulcerans Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 240000008990 Cyperus javanicus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 206010013911 Dysgeusia Diseases 0.000 description 1
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241000146406 Fusarium heterosporum Species 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 241000223192 Fusarium sporotrichioides Species 0.000 description 1
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 description 1
- UXDDRFCJKNROTO-UHFFFAOYSA-N Glycerol 1,2-diacetate Chemical compound CC(=O)OCC(CO)OC(C)=O UXDDRFCJKNROTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000766694 Hyphozyma Species 0.000 description 1
- 241000221775 Hypocreales Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 241000223201 Metarhizium Species 0.000 description 1
- 241000223250 Metarhizium anisopliae Species 0.000 description 1
- 235000005135 Micromeria juliana Nutrition 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241001149951 Mucor mucedo Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 241000131448 Mycosphaerella Species 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000193465 Paeniclostridium sordellii Species 0.000 description 1
- 240000006460 Panicum notatum Species 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 241000193157 Paraclostridium bifermentans Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 102100035200 Phospholipase A and acyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100032967 Phospholipase D1 Human genes 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000588778 Providencia stuartii Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000872726 Rhizopus pusillus Species 0.000 description 1
- 241000235546 Rhizopus stolonifer Species 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 244000253897 Saccharomyces delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 240000002114 Satureja hortensis Species 0.000 description 1
- 235000007315 Satureja hortensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000186988 Streptomyces antibioticus Species 0.000 description 1
- 241000147083 Streptomyces chromofuscus Species 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 241000235006 Torulaspora Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 1
- 241000223229 Trichophyton rubrum Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241001360088 Zymoseptoria tritici Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 description 1
- MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N 0.000 description 1
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUHOQUVVVLNYQR-MRVPVSSYSA-N choline alfoscerate Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP([O-])(=O)OC[C@H](O)CO SUHOQUVVVLNYQR-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 125000000422 delta-lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 108010007119 flavourzyme Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004956 glycerylphosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- ZOCHHNOQQHDWHG-UHFFFAOYSA-N n-hexan-3-ol Natural products CCCC(O)CC ZOCHHNOQQHDWHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 150000008103 phosphatidic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N phosphorylcholine chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 1
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
- A23L33/145—Extracts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения дрожжевого экстракта включает обработку дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae очищенной фосфолипазой А и отделение дрожжевого экстракта от обработанных дрожжевых клеток. При этом во время обработки фосфолипазой дрожжевые клетки подвергают гидролизу белка. Обработку фосфолипазой проводят при рН 2-10, а количество фосфолипазы составляет от 0,001 до 1 мг ферментного белка/г сухого вещества. Способ позволяет получить целевой продукт с высоким выходом, содержанием белка и степенью гидролиза. Выход дрожжевого экстракта составляет до 68,8%, выход белка до 67,4%, а степень гидролиза до 71,8%. 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток при участии фосфолипазы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Дрожжевые культуры используются в качестве источника для экстракции нескольких компонентов. Термин «дрожжевой экстракт» обычно используют в отношении концентрата растворимого материала, полученного из дрожжевых клеток, которые подвергли гидролизу клеточного материала, главным образом, белков, растворимых углеводов и нуклеиновых кислот. Дрожжевые клетки также могут быть использованы в качестве источника определенных самостоятельных компонентов, которые экстрагируют и очищают из дрожжевых клеток. Эти компоненты могут продуцироваться рассматриваемыми дрожжами естественным образом или могут продуцироваться дрожжевыми клетками после генетической манипуляции. Как при продукции дрожжевого экстракта, так и при очистке определенных компонентов из культур дрожжевых клеток существует желание повысить выход интересуемого продукта для большей экономии продукции. Получение дрожжевых экстрактов описывается на страницах 240-251 Nagodawithana (1995) Savory Flavours, Esteekay Associates, Inc., Wisconsin, USA.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения обнаружили, что обработка культуры дрожжевых клеток фосфолипазой способствует экстракции компонентов из культуры. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу экстракции одного или нескольких компонентов из дрожжей, включающему: i) обработку дрожжевых клеток фосфолипазой; и ii) выделение желаемого одного или нескольких компонентов из обработанных дрожжевых клеток. В других аспектах изобретение относится к способу получения дрожжевого экстракта и использования очищенной фосфолипазы для экстракции одного или нескольких компонентов из культуры дрожжевых клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Дрожжи
Используемой в способе по изобретению культурой дрожжевых клеток может быть культура любых дрожжей, например, штамм рода Saccharomyces, например, S. cerevisiae, S. uvarum; штамм рода Kluyveromyces, например, K. fragilis и K. marxianus; или штамм рода Candida, например, C. utilis. Культура дрожжевых клеток может быть отобрана по признаку продукции одного или нескольких желаемых компонентов и/или может быть генетически модифицирована для продукции одного или нескольких конкретных компонентов и/или для повышения выхода одного или нескольких конкретных компонентов. Способы генетической модификации дрожжевых клеток, например, путем инсерции ДНК, кодирующей желаемый белковый компонент, хорошо известны в данной области. Культуру дрожжевых клеток перед тем как подвергнуть ее способу по изобретению, можно размножить в условиях, благоприятных для роста клеточной культуры и/или благоприятных для продукции одного или нескольких желаемых компонентов с высоким выходом.
Экстрагируемый компонент
Экстрагируемый способом по изобретению из дрожжей компонент может представлять собой любой компонент, естественным образом продуцируемый дрожжами, или любой компонент, продуцируемый дрожжами, которые генетически модифицировали для продукции желаемого компонента. К компонентам, которые продуцируют в дрожжах, относятся, например, ферменты; витамины, например, В1, В6 и В12; антибиотики; астаксантин; полигидроксиалканоаты; ликопин; бета-каротин; сывороточный альбумин человека; гамма-дельталактон; и цис-3-гексанол. В одном из вариантов осуществления изобретения экстрагируемый из дрожжей компонент представляет собой белок, в частности, фермент, например, лактазу. В другом варианте осуществления изобретения экстрагируемый из дрожжей компонент представляет собой небелковый компонент, например углевод. В одном из вариантов осуществления изобретения один или несколько экстрагируемых компонентов представляют собой дрожжевой экстракт, как описано ниже.
Выделение
Согласно изобретению один или несколько желаемых компонентов выделяют из культуры дрожжевых клеток после обработки фосфолипазой. Выделение можно осуществить любым известным в данной области способом, зависящим от конкретных одного или нескольких выделяемых компонентов. Выделение можно осуществить, например, с помощью центрифугирования; фильтрации, например, микрофильтрации или ультрафильтрации; хроматографических методик, например, гель-хроматографии, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия; и/или преципитации, например, добавлением соли, такой как, например, сульфат аммония. Выделение можно осуществить путем сочетания нескольких методик выделения, например, для удаления фрагментов клеточной стенки можно использовать центрифугирование, а для выделения одного или нескольких конкретных компонентов могут быть последовательно использованы одна или несколько хроматографических методик.
Для облегчения выделения перед выделением дрожжевые клетки могут быть подвергнуты способам разрушения дрожжевых клеток, например, гомогенизации и/или добавлению одного или нескольких компонентов, которые облегчают разрушение клеток, например, хлорида натрия, этилацетата или изопропанола.
Способ по изобретению может способствовать выделению одного или нескольких желаемых компонентов из дрожжевой культуры, например, путем снижения количества отделенного материала, который необходимо удалить. Способ также может повысить выход одного или нескольких желаемых компонентов по сравнению с подобными способами экстракции, не включающими обработку фосфолипазой.
Гидролиз
В одном из вариантов осуществления изобретения культуру дрожжевых клеток подвергают гидролизу белка перед, после или во время обработки фосфолипазой. Гидролиз белка можно осуществить любым известным в данной области способом, например, с помощью протеолитических ферментов. Протеолитическими ферментами могут быть, например, протеолитические ферменты, присутствующие в дрожжевых клетках и высвобождающиеся, например, путем механического разрушения клеток, плазмолизом или аутолизом. В культуру дрожжевых клеток также могут быть добавлены один или несколько очищенных протеолитических ферментов. Гидролиз можно осуществить, как описано ниже в разделе о дрожжевых экстрактах.
Дрожжевой экстракт
В одном из вариантов осуществления изобретения один или несколько экстрагируемых компонентов представляют собой дрожжевой экстракт. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения дрожжевого экстракта, включающему: i) обработку дрожжевых клеток очищенной фосфолипазой; и ii) гидролиз белка обработанных дрожжевых клеток; и iii) удаление компонентов дрожжевых клеток; где стадию ii) проводят перед, после или во время стадии i).
Дрожжевой экстракт представляет собой концентрат растворимого вещества, полученного из культур дрожжевых клеток после гидролиза клеточного материала, преимущественно белков, растворимых углеводов и нуклеиновых кислот. Дрожжевые экстракты можно использовать в пищевой промышленности в качестве ароматизаторов/ усилителей запаха, а также в стимуляции микробного роста в промышленных ферментерах. Ценность дрожжевых экстрактов в большой степени зависит от количества белка в экстракте, существует, таким образом, желание достигнуть максимально возможного выхода белка. Сырой материал для продукции дрожжевых экстрактов может представлять собой любую культуру дрожжевых клеток из любого источника. Как правило, сырой материал представляет собой либо культуру дрожжевых клеток, выращенную специально для продукции экстракта дрожжевых клеток, либо отработанные пивные дрожжи, которые отбрасываются пивоварами после использования в приготовлении пива. Получение дрожжевого экстракта хорошо известно в данной области. К культурам дрожжей, используемым для получения дрожжевого экстракта, относятся, например, штаммы рода Saccharomyces, например, S. cerevisiae, S. uvarum; штамм рода Kluyveromyces, например, K. fragilis и K. marxianus, и штаммы рода Candida, например, C. utilis. При использовании отработанных пивных дрожжей перед получением экстракта из них часто устраняют горечь, чтобы удалить горький привкус, например, отмывкой при значениях рН 8-9.
Гидролиз, как правило, осуществляют в виде аутолизиса, при котором для разрушения клеток и гидролиза компонентов клетки используют собственные гидролитические ферменты дрожжевых клеток. В процессе аутолиза чтобы достичь гибели дрожжевых клеток без инактивации внутренних ферментов, обычно контролируют значение рН и температуру. Аутолиз можно проводить, например, при значении рН 7 при 55-60°С в течение 20 часов. Специалист может менять значение рН и температуру подходящим образом для конкретной культуры дрожжей и желаемых вкусовых характеристик. Значения рН и температуры также могут влиять на выход полученного экстракта. Степень аутолиза можно оценить, например, с помощью отношения аминного азота (AN) к количеству общего азота (TN) в аутолизате. Для сильно аутолизованных сред соотношение AN/TN обычно составляет 0,4-0,5.
Для облегчения гидролиза могут быть добавлены один или несколько гидролитических ферментов. Для повышения степени гидролиза белков наиболее распространенным является добавление протеазы. Можно использовать любую протеазу, активную в конкретных условиях, зависящих от желаемых характеристик продукта. Используемая протеаза может быть, например, животного, растительного или микробного происхождения, например, полученной из бактерии или гриба. К протеазам, которые могут быть добавлены, относятся папаин, субтилизин, например, субтилизин Carlsberg, или протеазы грибов, например, полученные из штамма рода Aspergillus, например, A. oryzae. К примерам коммерческих протеаз, которые можно использовать в способе по изобретению, относятся Alcalase® и Flavourzyme®, обе можно получить от производителя Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark. В одном из вариантов осуществления изобретения для облегчения гидролиза белка добавляют одну или несколько очищенных протеаз.
Гидролиз также может быть получен плазмолизом, при котором добавляют соединение, например хлорид натрия, этилацетат или изопропанол, которое индуцирует гибель и разрушение клеток, что приводит к высвобождению внутренних гидролитических ферментов. Аутолиз и плазмолиз можно сочетать, например, добавляя в среду хлорид натрия после проведения процесса аутолиза в течение определенного периода времени.
Для получения гидролиза компонентов дрожжевых клеток также можно использовать кислотный гидролиз. Кислотный гидролиз может быть осуществлен, например, добавлением к дрожжевой культуре соляной кислоты, как правило, дрожжевая культура должна находиться в форме суспензии с концентрацией твердой фазы 65-80%. Гидролиз часто осуществляют при повышенных температурах, например, вплоть до около 100°С, и он может быть проведен, например, в испарителе с падающей пленкой. После достижения необходимого уровня аминного азота гидролизат можно отьюстировать до желаемого значения рН, например, рН 5-7, как правило, гидроксидом натрия.
После гидролиза для получения дрожжевого экстракта лишние компоненты, обычно не гидролизованные фрагменты клеток, удаляют путем выделения. Выделение можно осуществить любым подходящим способом, известным в данной области, обычно центрифугированием и/или фильтрацией. Экстракт может быть подвергнут пастеризации для уничтожения любых растительных клеток, инактивации ферментов и предотвращения роста микробиологических контаминантов. Экстракт, как правило, необходимо сконцентрировать, например, испарением в испарителе с падающей пленкой. Для получения порошка дрожжевого экстракта концентрат также можно высушить, например, сушкой с распылением или сушкой в барабанной сушилке. Конечный продукт, как правило, продается в виде жидкости, пасты или порошка.
Фосфолипаза
К фосфолипазе, используемой в способе по настоящему изобретению, относятся фосфолипаза А1, фосфолипаза А2, фосфолипаза В, фосфолипаза С и фосфолипаза D и любое их сочетание. В способе по изобретению культуру дрожжевых клеток обрабатывают фосфолипазой, например, единственной фосфолипазой; двумя или несколькими фосфолипазами, например, двумя фосфолипазами, включая без ограничения обработку обоими типами А и В; обоими типами А1 и А2; обоими типами А1 и В; обоими типами А2 и В; обоими типами А1 и С; обоими типами А2 и С; или обработку двумя или несколькими различными фосфолипазами одного и того же типа. Включается также обработка одним типом фосфолипазы, таким как А1, А2, В, С или D.
Фосфолипазная активность может обеспечиваться ферментами, обладающими и другими видами активностей, такими как, например, липаза с фосфолипазной активностью. Фосфолипазной активностью может обладать, например, липаза с побочной фосфолипазной активностью. В других вариантах осуществления изобретения фосфолипазная ферментная активность создается ферментом, обладающим по существу лишь фосфолипазной активностью и в котором фосфолипазная ферментная активность не является побочной активностью.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу А1 определяют как ЕС 3.1.1.32.
Официальное название: Фосфолипаза А1.
Катализируемая реакция:
фосфатидилхолин+вода⇔2-ацилглицерофосфохолин+анион жирной кислоты.
Примечание: обладает более широкой специфичностью, чем ЕС 3.1.1.4.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу А2 определяют как ЕС 3.1.1.4.
Официальное название: Фосфолипаза А2.
Альтернативные названия: фосфатидилхолин 2-ацилгидролаза, лецитиназа а; фосфатидаза; или фосфатидолипаза.
Катализируемая реакция:
фосфатидилхолин+вода⇔1-ацилглицерофосфохолин+анион жирной кислоты.
Примечание: также влияет на фосфатидилэтаноламин, холин-плазмалоген и фосфатиды, удаляя жирную кислоту, присоединенную во 2-позиции.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу В определяют как ЕС 3.1.1.5.
Официальное название: лизофосфолипаза.
Альтернативные названия: лецитиназа b; лизолецитиназа; фосфолипаза В; или PLB.
Катализируемая реакция:
2-лизофосфатидилхолин+вода ⇔ глицерофосфохолин+анион жирной кислоты.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу С определяют как ЕС 3.1.4.3.
Фосфолипаза С гидролизует фосфатную связь фосфатидилхолина и других глицерофосфолипидов, например, фосфатидилэтаноламина, приводя к образованию диацилглицерина; этот фермент также будет гидролизовать фосфатные связи сфингомиелина, кардиолипина, холин-плазмалогена и церамид фосфолипидов.
Реакция с фосфатидилхолином:
фосфатидилхолин+вода⇔1,2-диацилглицерин+фосфат холина.
В соответствии со стандартной ЕС-классификацией ферментов фосфолипазу D определяют как ЕС 3.1.4.4.
Фосфолипаза D гидролизует фосфатные связи фосфолипидов и сфингомиелина с образованием соответствующей фосфатидной кислоты.
Реакция с фосфатидилхолином: фосфатидилхолин+вода ⇔ холин+фосфатидат.
Фосфолипаза А
Активность фосфолипазы А, включая фосфолипазу А1, фосфолипазу А2 и их сочетания, может быть получена с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, таких как, например, липаза с активностью фосфолипазы А. Активностью фосфолипазы А может обладать, например, липаза с побочной фосфолипазной активностью. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы А обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы А и в котором ферментная активность фосфолипазы А не является побочной активностью.
Фосфолипаза А может иметь любое происхождение, например, быть животного происхождения (такой как, например, от млекопитающих), например, из поджелудочной железы (например, поджелудочной железы быка или свиньи), или змеиного яда или пчелиного яда. Альтернативно, фосфолипаза А может иметь микробное происхождение, например, из гифомицетов, дрожжей или бактерий, таких как род или вид Aspergillus, например, A. niger; Dictyostelium, например, D. Discoideum; Mucor, например, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, например, N. crassa; Rhizomucor, например, R. pusillus; Rhizopus, например, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, например, S. libertiana; Trichophyton, например, T. rubrum; Whetzelinia, например, W. sclerotiorum; Bacillus, например, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, например, C. freundii; Enterobacter, например, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, например, E. herbicola; Escherichia, например, E.coli; Klebsiella, например, K. pneumoniae; Proteus, например, P. vulgaris; Providencia, например, P. stuartii; Salmonella, например, S. typhimurium; Serratia, например, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, например, S. flexneri; Streptomyces, например, S. violaceoruber; Yersinia, например, Y. enterocolitica. Таким образом, фосфолипаза А может быть получена из грибов, например, из класса Pyrenomycetes, например, рода Fusarium, например, штамма F. culmorum, F. heterosporum, F. solani или штамма F. oxysporum. Фосфолипаза А также может быть получена из штамма гифомицетов, принадлежащего к роду Aspergillus, такого как штамм Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. Предпочтительную фосфолипазу А получают из штамма рода Fusarium, в частности F. venenatum или F. oxysporum, например, из штамма DSM2672, как описано в WO 98/26057, главным образом, в пункте 36 формулы изобретения и SEQ ID NO. 2 заявки WO 98/26057. Другой предпочтительной фосфолипазой А является PLA2 из рода Streptomyces, такая как, например, PLA2 из S. violaceoruber. В дополнительных вариантах осуществления фосфолипаза представляет собой фосфолипазу, описанную в WO 00/32758 (Novozymes A/S, Denmark).
Активность фосфолипазы типа А может быть выражена, например, в единицах лецитазы (LEU). Фосфолипазную активность в единицах лецитазы определяют относительно стандарта фосфолипазы, используя в качестве субстрата лецитин. Фосфолипаза А катализирует гидролиз лецитина до лизолецитина и свободной жирной кислоты. Освобожденную жирную кислоту титруют 0,1 N раствором гидроксида натрия в стандартных условиях (рН 8,00; 40,00°С ±0,5). Активность фосфолипазы А определяют как степень потребления гидроксида натрия в процессе нейтрализации жирной кислоты и выражают в единицах лецитазы (LEU) относительно лецитазного (фосфолипазного) стандарта (доступен от производителя Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark). 1 LEU определяют как количество фермента, которое в стандартных условиях (рН 8,00; 40,00°С ±0,5) приводит к той же степени потребления гидроксида натрия (мкмоль/мин), что и лецитазный стандарт, разведенный до условной активности 1 LEU/г.
Фосфолипаза В
Под термином «фосфолипаза В», использованным в данном документе в связи с ферментом по изобретению, понимают фермент с активностью фосфолипазы В.
Активность фосфолипазы В можно получить с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, такими как, например, липаза с активностью фосфолипазы В. Активность фосфолипазы В можно получить, например, от липазы с побочной активностью фосфолипазы В. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы В обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы В и в котором ферментная активность фосфолипазы В не является побочной активностью. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфолипаза В не представляет собой липаз, обладающих побочной активностью фосфолипазы В, как определено в WO 98/26057.
Фосфолипаза В может быть получена из любого источника, например, быть животного происхождения (такой как, например, от млекопитающих), например, из печени (например, печени крысы). Альтернативно, фосфолипаза В может быть микробного происхождения, например, из гифомицетов, дрожжей или бактерий, таких как род или вид Aspergillus, например, A. foetidus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae; Botrytis, например, B. cinerea; Candida, например, C. albicans; Cryptococcus, например, C. neoformans, Escherichia, например, E. coli, Fusarium, например, F. sporotrichioides, F. venenatum, F. verticillioides; Hyphozyma; Kluyveromyces, например, K. lactis; Magnaporte, например, M. grisea; Metarhizium, например, M. anisopliae; Mycosphaerella, например, M. graminicola; Neurospora, например, N. crassa; Penicillium, например, P. notatum; Saccharomyces, например, S. cerevisiae; Schizosaccharomyces, например, S. pombe; Torulaspora, например, T. delbrueckii; Vibrio; например, V. cholerae. Предпочтительную фосфолипазу В получают из штамма рода Aspergillus, в частности, фосфолипазу LLPL-1 или LLPL-2 из A. niger, например, содержащуюся в клонах Escherichia coli DSM 13003 или DSM 13004, или фосфолипазу LLPL-1 или LLPL-2 из A. oryzae, например, содержащуюся в клонах E. coli DSM 13082 или DSM 13083, как описано в WO 01/27251, конкретно в пункте 1 формулы изобретения и SEQ ID NOs. 2, 4, 6 или 8 заявки WO 01/27251.
Фосфолипаза С
Активность фосфолипазы С может быть получена с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, таких как, например, липаза с активностью фосфолипазы С или фосфатаза с активностью фосфолипазы С. Активность фосфолипазы С может исходить, например, от липазы с побочной активностью фосфолипазы С. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы С обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы С и в котором ферментная активность фосфолипазы С не является побочной активностью.
Фосфолипаза С может быть получена из любого источника, например, быть животного происхождения, например, от млекопитающего, растительного происхождения или микробного происхождения, например, из грибов или бактерий, например, из штамма рода Mycobacterium, например, M. tuberculosis или M. bovis; штамма рода Bacillus, например, B. cereus; штамма рода Clostridium, например, C. bifermentans, C. haemolyticum, C. novyi, C. sordellii или C. perfringens; штамма рода Listeria, например, L. monocytogenes; штамма рода Pseudomonas, например, P. aeruginosa; или штамма рода Staphylococcus, например, S. aureus; или штамма рода Burkholderia, например, B. pseudomallei.
Фосфолипаза D
Активность фосфолипазы D может быть получена с помощью ферментов, обладающих равным образом и другими активностями, таких как, например, липаза с активностью фосфолипазы D, фосфатаза с активностью фосфолипазы D или холинэстераза с активностью фосфолипазы D. Активность фосфолипазы D может исходить, например, от липазы с побочной активностью фосфолипазы D. В других вариантах осуществления изобретения ферментная активность фосфолипазы D обеспечивается ферментом, обладающим по существу лишь активностью фосфолипазы D и в котором ферментная активность фосфолипазы D не является побочной активностью.
Фосфолипаза D может происходить из любого источника, например, быть животного происхождения, например, от млекопитающего, например, от мыши, крысы или китайского хомячка; растительного происхождения, например, из капусты, кукурузы, риса, касторового боба, табака, коровьего гороха или Arabidopsis thaliana; или микробного происхождения, например, бактериального происхождения, например, из штамма рода Corynebacterium, например, C. pseudotuberculosis, C.ulcerans или C. haemolyticum; или грибкового происхождения, например, из штамма рода Streptomyces, например, S. antibioticus или S. chromofuscus; штамма рода Trichoderma, например, T. reesei; штамма рода Saccharomyces, например, S. cerevisiae; или штамма рода Aspergillus, например, A. oryzae, A. niger, A. nidulans или A. fumigatus.
Источники фермента и формулировка
Фосфолипаза, использованная в способе по изобретению, может быть получена или доступна из любого упомянутого в данном документе источника. Термин «полученный» в этом контексте означает, что фермент может быть выделен из организма, в котором он присутствует исходно, т.е. вид аминокислотной последовательности фермента идентичен исходному ферменту. Термин «полученный» также означает, что ферменты можно продуцировать с помощью рекомбинантных технологий в организме-хозяине, причем фермент, полученный посредством рекомбинаций, либо имеет вид, идентичный нативному ферменту, либо имеет модифицированную аминокислотную последовательность, например, имеет одну или несколько аминокислот, которые являются удаленными, вставленными и/или замещенными, т.е. фермент, полученный посредством рекомбинаций, является мутантом и/или фрагментом исходной аминокислотной последовательности. В понятие нативного фермента включаются природные варианты. Более того, термин «полученный» включает ферменты, продуцированные искусственным способом, например, пептидным синтезом. Термин «полученный» также охватывает ферменты, которые модифицировали, например, путем гликозилирования, фосфорилирования и т.д. либо in vivo, либо in vitro. Термин «доступный» в этом контексте означает, что фермент имеет аминокислотную последовательность, идентичную нативному ферменту. Термин охватывает фермент, который выделили из организма, в котором он присутствует исходно, или из организма того же или другого типа, в котором его экспрессировали с помощью рекомбинантных технологий, или ферменты, продуцированные искусственным образом, например, пептидным синтезом. В отношении фермента, полученного рекомбинантным способом, термины «доступный» и «полученный» относятся к виду фермента, а не к виду организма-хозяина, в котором его получают рекомбинантным способом.
Соответственно, фосфолипаза может быть получена из микроорганизма с использованием любой подходящей техники. Например, ферментный препарат фосфолипазы может быть получен путем культивирования подходящего микроорганизма и последующего выделения препарата фосфолипазы из полученного ферментационного бульона или микроорганизма способами, известными в данной области. Фосфолипаза также может быть получена с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Такой способ обычно включает культивирование клетки-хозяина, трансформированной рекомбинантным ДНК-вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую рассматриваемую фосфолипазу и последовательность ДНК, функционально связанную с соответствующим сигналом экспрессии так, что он способен экспрессировать фосфолипазу в культуральной среде в условиях, позволяющих экспрессию фермента и получение фермента из культуры. Последовательность ДНК также может быть встроена в геном клетки-хозяина. Последовательность ДНК может быть геномной, кДНК или искусственно синтезированной или представлять собой любые их сочетания, и может быть выделена или синтезирована в соответствии со способами, известными в данной области.
Подходящие фосфолипазы являются коммерчески доступными. К примерам коммерческих ферментов относятся, например, Lecitase® (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark), YieldMAX® (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark и Chr. Hansen S/S, Hørsholm, Denmark), Lysomax® (Genencor International, Inc., Palo Alto, California) или PurifineTM (Diversa Corp., San Diego, California). Подходящая фосфолипаза В представляет собой, например, фосфолипазу LLPL-2 из Aspergillus niger, которую можно получить рекомбинантными технологиями в A. niger, как описано в WO 01/27251.
В способе по изобретению фосфолипаза представляет собой очищенную фосфолипазу. Термин «очищенный» в рамках изобретения включает ферментные препараты фосфолипазы, в которых были удалены компоненты организма, из которого ее получают. Термин «очищенный» также включает белок фермента фосфолипазы, свободный от компонентов исходного организма, из которого его получают, что также называют «фактически чистая» фосфолипаза, термин может преимущественно относиться к фосфолипазам, которые встречаются в природе и которые не модифицировали генетически, например, делецией, заменой или инсерцией одного или нескольких аминокислотных остатков.
Соответственно, фосфолипаза является очищенной, то есть в ней присутствуют лишь минорные количества других белков. Выражение «другие белки» относится, в частности, к другим ферментам. Термин «очищенная» в рамках изобретения также относится к удалению других компонентов, в особенности других белков и, что особенно важно, других ферментов, присутствующих в клетке источника фосфолипазы. Фосфолипаза может быть «по существу чистой», т.е. свободной от других компонентов организма, из которого она получена, т.е., например, организма-хозяина в отношении фосфолипазы, получаемой с помощью рекомбинантных техник. Предпочтительно ферменты являются по меньшей мере на 75% (по массе) чистыми, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или даже по меньшей мере на 95% чистыми. В еще более предпочтительном варианте осуществления фосфолипаза является по меньшей мере на 98% чистым препаратом белка-фермента.
Термин «фосфолипаза» включает любые вспомогательные компоненты, которые могут быть необходимы для каталитической активности фермента, такие как, например, подходящий акцептор или кофактор, которые могут или не могут присутствовать в реакционной системе в природе.
Фосфолипаза может находиться в любой форме, подходящей для рассматриваемого использования, такой как, например, сухой порошок или гранулят, непылящий гранулят, жидкость, стабилизированная жидкость или защищенный фермент. Грануляты могут быть получены, например, как описано в US 4106991 и US 4661452 и при желании могут быть покрыты способами, известными в данной области. Жидкие ферментные препараты могут быть стабилизированы, например, добавлением стабилизаторов, таких как сахар, сахарный спирт или другой полиол, молочная кислота или другая органическая кислота, в соответствии с установленными способами. Защищенные ферменты могут быть получены по способу, описанному в ЕР 238216.
Обработка фосфолипазой
В соответствии с изобретением дрожжевые клетки обрабатывают очищенной фосфолипазой. Обработку можно провести любым подходящим способом, например, добавлением фосфолипазы к культуре дрожжевых клеток. При обработке фосфолипазой культура дрожжевых клеток может быть, например, суспендирована в воде. Обработку фосфолипазой можно провести перед, после или одновременно с гидролизом белка культуры дрожжевых клеток.
Подходящие условия для осуществления обработки фосфолипазой специалист может найти среди принятых способов, известных в данной области, для оптимизации ферментативных реакций. Специалист должен знать, как подобрать параметры, такие как рН, температура и количество фосфолипазы для достижения желаемых результатов. В одном из вариантов осуществления изобретения обработку фосфолипазой проводят при значениях рН от рН 2 до рН 10, например, от рН 3 до рН 9, от рН 2 до рН 6, или от рН 4 до рН 6. Количество фосфолипазы, используемой в способе по изобретению, может зависеть от активности конкретной фосфолипазы. При использовании фосфолипазы А количество фосфолипазы может находиться, например, в интервале от 0,001 до 1 мг ферментного белка/г сухого вещества, например, от 0,005 до 0,1 мг ферментного белка/г сухого вещества. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфолипазу добавляют в количестве, достаточном для достижения повышенного выхода одного или нескольких экстрагируемых компонентов по сравнению с аналогичным процессом экстракции, при котором обработку фосфолипазой не проводят. Выход может быть увеличен, например по меньшей мере на 1%, например по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению очищенной фосфолипазы, например, фосфолипазы А1, для экстракции одного или нескольких компонентов из культуры дрожжевых клеток.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Объединенную культуру дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisia смешивали с деионизованной водой до получения 14% содержания сухого вещества и перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 60 мин при комнатной температуре. Количество азота в этой дрожжевой смеси определяли способом окисления на анализаторе Leco FP-528. Взвешиванием определяют сухой остаток в дрожжевой смеси (после высушивания при 105°С). Дрожжевую смесь нагревали до 55°С и доводили значение рН 4N раствором NaOH до 6,5. Образцы обрабатывали 0,25% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором фосфолипазы (Lecitase® Ultra, 10 кLU/г Novozymes A/S, Denmark) и/или 0,5% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором протеолитического фермента (Alcalase® 2,4L, Novozymes A/S, Denmark). Ферменты добавляли к дрожжевой смеси после десятиминутного предварительного нагрева при 55°С. Контрольный образец (blank) ферментом не обрабатывали. Аутолизис осуществляли в течение 22 часов при 55°С при перемешивании с использованием магнита. Образцы объемом 20 мл вынимали и взвешивали точное количество. Образцы инактивировали при 85°С в течение 10 мин. После инактивации образцы центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об/мин, используя центрифугу Multifuge 3S-R фирмы Heraeus. После декантации взвешивали количество экстракта. Путем взвешивания (после высушивания при 105°С) в экстракте измеряли сухой осадок. Количество азота в экстракте определяли способом окисления на анализаторе Leco FP-528. Количество белка рассчитывали как 6,25-кратное количество азота. Свободный аминный азот определяли, используя способ ОРА (о-фталдиальдегид). На основании указанных выше измерений рассчитывали следующие показатели:
Выход экстракта (%)=(масса экстракта в граммах после центрифугирования)/(масса дрожжевой смеси в граммах перед центрифугированием)*100
Выход белка (%)=(масса экстракта в граммах после центрифугирования* Содержание белка в экстракте)/(масса дрожжевой смеси в граммах перед центрифугированием* содержание белка в дрожжевой смеси)*100
Степень гидролиза=(Количество расщепленных пептидных связей/общее количество пептидных связей)*100=(h/htot)*100,
где h выражается как функция мэкв NH2 серина: h=(NH2 серина -0,4)/1; и htot=7,8. NH2 серина определяли, измеряя поглощение при 340 нм относительно стандарта серина, содержащего 100 мг/л.
Результаты, основанные на двукратных определениях, представлены в Таблице 1
Таблица 1 | |||
Фермент | Выход белка (%) | Выход экстракта (%) | Степень гидролиза |
Blank | 21,2 | 62,1 | 33,9 |
0,5% алкалаза 2,4L | 59,2 | 60,9 | 66,9 |
0,25% лецитаза ультра | 21,8 | 61,8 | 35,7 |
0,5% алкалаза 2,4L 0,25% лецитаза ультра |
67,4 | 66,8 | 61,1 |
Пример 2
Дрожжевой экстракт получали тем же способом, как и в Примере 1, за исключением того, что использовали отличную фосфолипазу (YieldMax®, Chr. Hansen A/S и Novozymes A/S, Denmark) и ферментную обработку осуществляли при 40°С и значении рН 6,0. Результаты представлены в Таблице 2 (однократные определения).
Таблица 2 | |||
Фермент | Выход белка (%) | Выход экстракта (%) | Степень гидролиза |
Blank | 13,9 | 64,0 | 36,6 |
0,5% алкалаза 2,4L | 15,2 | 64,7 | 41,5 |
0,5% YieldMax | 13,4 | 63,7 | 37,3 |
0,5% алкалаза 2,4L 0,5% YieldMax |
24,0 | 64,4 | 29,6 |
Пример 3
Объединенную культуру дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisia смешивали с деионизованной водой до получения 14% содержания сухого вещества и перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 60 мин при комнатной температуре. Количество азота в этой дрожжевой смеси определяли способом окисления на анализаторе Leco FP-528. Взвешиванием определяли сухой остаток в дрожжевой смеси (после высушивания при 105°С). Дрожжевую смесь нагревали до 55°С и либо использовали при природном значении рН (около 5-5,3), либо рН доводили 4N раствором NaOH до значения 5,8. Образцы обрабатывали 0,25% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором фосфолипазы (Lecitase® Ultra, 10 кLU/г Novozymes A/S, Denmark) и/или 0,3% (по массе сухого вещества дрожжевых клеток) раствором протеолитического фермента (Papain, Pang Bo Biological Co. Ltd). Ферменты добавляли к дрожжевой смеси после десятиминутного предварительного нагрева при 55°С. Контрольный образец (blank) ферментом не обрабатывали. Аутолизис осуществляли в течение 22 часов при 55°С при перемешивании с использованием магнита. Образцы объемом 30 мл вынимали и взвешивали точное количество. Образцы инактивировали при 85°С в течение 10 мин. После инактивации образцы центрифугировали в течение 10 мин при 3500 об/мин, используя Multifuge 3S-R фирмы Heraeus. Анализ экстрактов описан в Примере 1. Мутность определяли, используя нефелометр 2100AN фирмы HACH.
Результаты, основанные на двукратных определениях, показаны в Таблице 3.
Таблица 3 | |||||
Фермент | Значение рН в гидролизате | Выход белка (%) | Выход экстракта (%) | Степень гидролиза | Мутность (NTU) |
Контроль | 5 | 47,2 | 66,7 | 48,6 | 3820 |
0,25% лецитаза ультра | 5 | 52,5 | 65,9 | 45,9 | 1421 |
Контроль с приведенным значением рН | 5,8 | 24,8 | 64,5 | 44,3 | 1579 |
0,25% лецитаза ультра | 5,8 | 26,1 | 64,6 | 47,93 | 1449 |
0,3% папаин | 5,8 | 63,5 | 68,8 | 71,8 | 2179 |
0,3% папаин и 0,25% лецитаза ультра | 5,8 | 66,5 | 67,3 | 67,8 | 157 |
Claims (6)
1. Способ получения дрожжевого экстракта, включающий:
i) обработку дрожжевых клеток штамма Saccharomyces cerevisiae очищенной фосфолипазой А; и
ii) отделение дрожжевого экстракта от обработанных дрожжевых клеток, причем дрожжевые клетки подвергают гидролизу белка во время стадии i) и причем обработку фосфолипазой проводят при pH от pH 2 до pH 10, а количество фосфолипазы составляет от 0,001 до 1 мг ферментного белка/г сухого вещества.
i) обработку дрожжевых клеток штамма Saccharomyces cerevisiae очищенной фосфолипазой А; и
ii) отделение дрожжевого экстракта от обработанных дрожжевых клеток, причем дрожжевые клетки подвергают гидролизу белка во время стадии i) и причем обработку фосфолипазой проводят при pH от pH 2 до pH 10, а количество фосфолипазы составляет от 0,001 до 1 мг ферментного белка/г сухого вещества.
2. Способ по п.1, в котором белок гидролизуют протеолитическими ферментами.
3. Способ по п.2, в котором белок гидролизуют аутолизисом.
4. Способ по п.2, в котором используют один или несколько очищенных протеолитических ферментов.
5. Способ по п.1, в котором на стадии i) используют фосфолипазу A1.
6. Способ по п.1, в котором на стадии i) используют фосфолипазу А2.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200600658 | 2006-05-10 | ||
DKPA200600658 | 2006-05-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008148606A RU2008148606A (ru) | 2010-06-20 |
RU2445355C2 true RU2445355C2 (ru) | 2012-03-20 |
Family
ID=38222103
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008148606/10A RU2445355C2 (ru) | 2006-05-10 | 2007-05-03 | Способ экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9309549B2 (ru) |
EP (1) | EP2018423B1 (ru) |
CN (1) | CN101432423A (ru) |
AU (1) | AU2007247146B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0710694B1 (ru) |
MX (1) | MX2008014281A (ru) |
NZ (1) | NZ571941A (ru) |
RU (1) | RU2445355C2 (ru) |
WO (1) | WO2007128766A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2889651B1 (fr) * | 2005-08-09 | 2007-09-21 | Specialites Pet Food Soc Par A | Facteur d'appetence fermente et depourvu de proteines animales pour animaux |
EP2097510B1 (en) * | 2006-12-22 | 2016-10-05 | Novozymes A/S | Method for producing a yeast extract |
CN107849513A (zh) * | 2015-06-23 | 2018-03-27 | 明尼苏达-达科塔农民合作社 | 经皂苷增强的酵母自溶的方法 |
US20220010262A1 (en) * | 2020-07-13 | 2022-01-13 | Grain Processing Corporation | Method For Dissociation Of Cells |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4218481A (en) * | 1978-10-06 | 1980-08-19 | Standard Oil Company (Indiana) | Yeast autolysis process |
GB2075054A (en) * | 1980-05-02 | 1981-11-11 | Nestle Sa | Process for the production of a yeast extract |
RU2148636C1 (ru) * | 1995-05-10 | 2000-05-10 | Тимофарма АГ | Способ получения дрожжевого низкомолекулярного экстракта и вещество, получаемое этим способом |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR9400600A (pt) * | 1994-02-17 | 1995-10-24 | Finep Financiadora De Estudos | Processos para produção de uma protéina recombinante e/ou de glicosilfosfatidilinositol (GPI) em células de microorganismos eucariontes e para a obtenção de leveduras de S. cerevisae; célula de levedura sequência de nucleotídios; meio de cultura; medicamento ou vacina; e produto dos ditos processos |
-
2007
- 2007-05-03 RU RU2008148606/10A patent/RU2445355C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-05-03 WO PCT/EP2007/054284 patent/WO2007128766A1/en active Application Filing
- 2007-05-03 CN CNA2007800155566A patent/CN101432423A/zh active Pending
- 2007-05-03 MX MX2008014281A patent/MX2008014281A/es active IP Right Grant
- 2007-05-03 EP EP07728737.3A patent/EP2018423B1/en active Active
- 2007-05-03 AU AU2007247146A patent/AU2007247146B2/en not_active Ceased
- 2007-05-03 NZ NZ571941A patent/NZ571941A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-05-03 BR BRPI0710694-7A patent/BRPI0710694B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-05-08 US US11/745,537 patent/US9309549B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4218481A (en) * | 1978-10-06 | 1980-08-19 | Standard Oil Company (Indiana) | Yeast autolysis process |
GB2075054A (en) * | 1980-05-02 | 1981-11-11 | Nestle Sa | Process for the production of a yeast extract |
RU2148636C1 (ru) * | 1995-05-10 | 2000-05-10 | Тимофарма АГ | Способ получения дрожжевого низкомолекулярного экстракта и вещество, получаемое этим способом |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CONWAY J. ET AL. The effect of the addition of proteases and glucanases during yeast autolysis on the production and properties of yeast extracts // Can. J. Microbiol. 47: 18-24 (2001). TRIVEDI A. ET AL. Effect of phospholipase A on the structure & function of yeast Candida albicans // Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, vol. 19, 1982, pp.336-341. Enzymes produced by genetically modified microorganisms. Найдено в Интернете: <www.novozymes.com/en/about-us/positions/Pages/Enzymes-produced-by-…>. Enzymes. Найдено в Интернете:<www.chr-hansen.com/products/product_areas/enzymes/yieldmaxr.html>. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008148606A (ru) | 2010-06-20 |
US9309549B2 (en) | 2016-04-12 |
MX2008014281A (es) | 2008-11-26 |
WO2007128766A1 (en) | 2007-11-15 |
BRPI0710694B1 (pt) | 2017-06-20 |
EP2018423A1 (en) | 2009-01-28 |
US20070292938A1 (en) | 2007-12-20 |
EP2018423B1 (en) | 2020-02-12 |
BRPI0710694A2 (pt) | 2011-08-23 |
AU2007247146B2 (en) | 2013-01-31 |
CN101432423A (zh) | 2009-05-13 |
AU2007247146A1 (en) | 2007-11-15 |
NZ571941A (en) | 2011-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0575133B1 (en) | Novel phospholipase A1, process for its preparation and the use thereof | |
EP0756457B1 (en) | A method for improving the solubility of vegetable proteins | |
JP4933432B2 (ja) | 新規なリン脂質加工剤 | |
EP1954808A2 (en) | Enzyme preparations yielding a clean taste | |
RU2445355C2 (ru) | Способ экстракции компонентов из культуры дрожжевых клеток | |
US10604780B2 (en) | Low gluten yeast hydrolysates | |
Bayarjargal et al. | Utilization of spent brewer’s yeast Saccharomyces cerevisiae for the production of yeast enzymatic hydrolysate | |
JPH08322471A (ja) | 食用加水分解物製品を得る方法 | |
US20010018197A1 (en) | Method for producing ultrapure vegetable protein materials | |
US6773731B2 (en) | Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein | |
US11649445B2 (en) | Compositions comprising digestive enzymes | |
US10457890B2 (en) | Phospholipase C | |
EP1443825B1 (en) | Modified whey protein compositions having improved foaming properties | |
CA2587488A1 (en) | Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein | |
US20020160445A1 (en) | Method of providing polypeptide preparations with reduced enzymatic side activities | |
US20020127288A1 (en) | Method for producing ultrapure vegetable protein materials | |
CA2311193C (en) | Method for producing ultrapure vegetable protein materials | |
US6420156B2 (en) | Purified proteolytic enzyme and method of purification | |
AU750447B2 (en) | Method for producing ultrapure vegetable protein materials | |
US20020123090A1 (en) | Ultrapure vegetable protein materials | |
Purushothaman et al. | Pepstatin A | |
MXPA00006376A (es) | Metodo para producir materiales ultrapuros de proteina vegetal. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170504 |