BRPI0710694B1

BRPI0710694B1 - Methods for producing a yeast extract, and, use of a purified phospholipase

Info

Publication number: BRPI0710694B1
Application number: BRPI0710694-7A
Authority: BR
Inventors: Kalum Lisbeth; Munk Nielsen Per; Ernst Steffen
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2006-05-10
Filing date: 2007-05-03
Publication date: 2017-06-20
Also published as: RU2008148606A; US9309549B2; MX2008014281A; WO2007128766A1; EP2018423A1; US20070292938A1; EP2018423B1; BRPI0710694A2; RU2445355C2; AU2007247146B2; CN101432423A; AU2007247146A1; NZ571941A

Abstract

métodos para extrair um ou mais componentes de levedura e para produzir um extrato de levedura, e,uso de uma fosfolipase purificada a presente invenção refere-se a um método para extrair componentes de células de levedura com uma fosfolipase purificada.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM EXTRATO DE LEVEDURA, E, USO DE UMA FOSFOLIPASE PURIFICADA” CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um método para extrair componentes a partir de uma cultura de célula de levedura com uma fosfolipase.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As culturas de levedura são usadas com uma fonte para a extração de vários componentes. O termo “extrato de levedura” é usado de um modo geral para um concentrado de material solúvel derivado a partir de células de levedura, que foram submetidas à hidrólise de material celular, em particular de proteínas, carboidratos solúveis e ácidos nucléícos. As células de levedura podem ser também usadas como uma fonte para componentes específicos, que são extraídos e purificados a partir de células de levedura, Estes componentes podem ser produzidos naturalmente pela levedura em questão ou podem ser produzidos por células de levedura após a manipulação genética. Tanto quando da produção do extrato de levedura, como quando da purificação de componentes específicos a partir de culturas de células de levedura, existe um desejo para aumentar o rendimento do produto de interesse, de modo a aperfeiçoar a economia de produção. A produção de extratos de levedura é descrita nas páginas 240- 251 de Nagodawithana (1995) Savory Fia vou rs, Esteekay Associates, Inc., Wisconsin, USA. SUMÁRIO DA INVENCÀO

Os inventores verificaram que o tratamento de uma cultura de célula de levedura com uma fosfolipase facilita a extração de componentes a partir da cultura. Deste modo, a presente invenção está relacionada a um método para a extração de um ou mais componentes a partir da levedura, o método compreendendo: i) tratar as células de levedura com uma fosfolipase;e ii) separar um ou mais componentes desejados a partir das células de levedura tratadas. Em outros aspectos, a invenção refere-se a um método para a produção de um extrato de levedura e ao uso de uma fosfolipase purificada, de modo a extrair um ou mais componentes a partir de uma cultura de célula de levedura. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Levedura Uma cultura de célula de levedura a ser usada no método da invenção pode ser uma cultura de qualquer levedura, por exemplo uma cepa de Saccharomyces, por exemplo S. cerevisiae, S. uvarum; uma cepa de Kluyveromyces, por exemplo K. fragilis e K. marxianus; ou uma cepa de Candida, por exemplo C. utílis. A cultura de célula de levedura pode ser selecionada para a sua produção a partir de um ou mais componentes desejados e/ou pode ter sido geneticamente modificada, de modo a produzir um ou mais componentes específicos e/ou para aumentar o rendimento de um ou mais componentes específicos. Os métodos para a modificação genética de células de levedura, por exemplo, através da inserção de DNA que codifica um componente de proteína desejado, é bem conhecido na técnica. A cultura da célula de levedura pode ser propagada sob condições favoráveis ao crescimento da cultura da célula e/ ou favorável à produção de um ou mais componentes desejados em um alto rendimento, antes de ser submetida ao método da invenção.

Componente a ser extraído Um componente a ser extraído a partir de levedura através do método da invenção pode ser qualquer componente produzido naturalmente por uma levedura ou qualquer componente produzido por uma levedura, que tenha sido geneticamente modificado, de modo a produzir o componente desejado. Os componentes, que podem ser produzidos em levedura incluem, por exemplo, enzimas; vitaminas, por exemplo Bl, B6 e BI2; antibióticos; astaxantina; poliidróxialcanoatos; licopeno; beta-caroteno; Albumina de Soro Humano; gama- deltalactona; e cis-3-hexanol. Em uma modalidade da invenção, um componente a ser extraído a partir de levedura é uma proteína, de modo particular uma enzima, por exemplo uma lactase. Em uma outra modalidade da invenção, um componente a ser extraído a partir de levedura é um componente não- proteína, por exemplo um carboidrato. Em uma modalidade da invenção, o um ou mais componentes a serem extraídos são um extrato de levedura, tal como abaixo descrito.

Separação De acordo com a invenção, o um ou mais componentes desejados são separados a partir da cultura da célula de levedura após o tratamento com uma fosfolipase. A separação pode ser alcançada através de qualquer método conhecido na técnica, dependendo do um ou mais componentes específicos a serem separados. A separação pode ser alcançada, por exemplo, através de centrifugação; filtração, por exemplo microfiltração ou ultrafiltração; técnicas cromatográficas, por exemplo cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica; e/ ou precipitação, por exemplo através da adição de um sal, tal que, por exemplo, sulfato de amônio. A separação pode ser alcançada através de uma combinação de várias técnicas de separação, por exemplo a centrifugação pode ser usada para remover os fragmentos da parede celular, e uma ou mais técnicas cromatográficas podem ser subseqüentemente usadas para separar o um ou mais componentes específicos.

De modo a facilitar a separação, as células de levedura podem ser submetidas a métodos para a ruptura das células de levedura antes da separação, por exemplo, a homogeneização e/ ou a adição de um ou mais componentes que facilitam a ruptura da célula, por exemplo cloreto de sódio, acetato de etila ou isopropanol. O método da invenção pode facilitar a separação de um ou mais componentes desejados a partir de uma cultura de levedura, por exemplo através da redução da quantidade de material em partículas a ser removido. O método pode ainda aumentar o rendimento de um ou mais componentes desejados, comparado a métodos de extração similares, não incluindo o tratamento com uma fosfolipase.

Hidrólise Em uma modalidade da invenção, a cultura da célula de levedura é submetida à hidrólise de proteína antes, após ou durante o tratamento com fosfolipase. A hidrólise de proteína pode ser alcançada através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo através de enzimas proteolíticas. As enzimas proteolíticas podem, por exemplo, ser enzimas proteolíticas presentes nas células de levedura e liberadas, por exemplo, através da ruptura mecânica das células, através de plasmólise ou de autólise. Uma ou mais enzimas proteolíticas purificadas podem ser também adicionadas à cultura de célula de levedura. A hidrólise pode ser alcançada como descrito abaixo sob extratos de levedura.

Extrato de Levedura Em uma modalidade da invenção, o um ou mais componentes a serem extraídos são um extrato de levedura. Deste modo, em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para a produção de um extrato de levedura, em que o método compreende : i) tratar as células de levedura com uma fosfolipase purificada; e ii) submeter as células de levedura tratadas à hidrólise de proteína;e iii) remover os componentes da célula de levedura; em que o estágio ii) é conduzido antes, após ou durante o estágio i). O extrato de levedura é um concentrado de material solúvel derivado a partir de culturas de célula de levedura após a hidrólise do material celular, em especial proteínas, carboidratos solúveis e ácidos nucléicos. Os extratos de levedura são úteis em aplicações alimentares como agentes / aperfeiçoadores aromatizantes, assim como na promoção do crescimento microbiano em fermentações industriais. O valor dos extratos de levedura depende, em um alto grau, da quantidade de proteína no extrato, havendo, deste modo, um desejo de que seja alcançado um rendimento de proteína mais alto possível. A matéria prima para a produção dos extratos de levedura pode ser qualquer cultura de célula de levedura a partir de qualquer fonte. De um modo usual, a matéria prima é ou uma cultura de célula de levedura desenvolvida especialmente para a produção de extrato de levedura ou de levedura de cervejaria gasta, que é descartada pelas cervejarias após o uso na cerveja. A produção de extrato de levedura é bem conhecida na técnica. As culturas de levedura usadas para a produção de extrato de levedura incluem, por exemplo, cepas de Saccharomyces, por exemplo S. cerevisiae, S. uvarum, cepas de Kluyveromyces, por exemplo K. fragilis e K. marxianus, e cepas de Candida, por exemplo C. utilis. Se levedura de cervejaria gasta for usada, ela é, de um modo freqüente, submetida à desacidificação, de modo a remover os aromatizantes amargos, por exemplo através de lavagem em um pH de 8-9, antes da produção do extrato. A hidrólise é executada, de um modo usual, como uma autólise, em que as enzimas hidrolíticas das próprias células de levedura são utilizadas para a ruptura de células e para a hidrólise de componentes celulares. Para a autólise, o pH e a temperatura são controlados, de um modo usual, de modo a que seja alcançada a morte das células de levedura sem a iniciação das enzimas internas. A autólise pode, por exemplo, ser executada em um pH de 7, em de 55-60°C, durante 20 horas. Aquele versado na técnica pode selecionar as condições de pH e de temperatura adequadas para a cultura de levedura específica e as características de aromatizante desejadas. As condições de pH e de temperatura podem também afetar o rendimento do extrato alcançado. O grau de autólise pode, por exemplo, ser medido através da razão de amino nitrogênio (NA) em relação à quantidade de nitrogênio total (TN) no autolisado. Para meios altamente autolisados, uma razão de AN /TN de 0,4- 0,5 é comum.

Uma ou mais enzimas hidrolíticas podem ser adicionadas, de modo a facilitar a hidrólise. O mais comum é a adição de protease, de modo a aumentar a taxa de hidrólise de proteína. Qualquer protease, que seja ativa sob condições específicas pode ser usada, dependendo das características desejadas do produto. Uma protease a ser usada pode, por exemplo, ser de uma origem animal, de planta ou microbiana, pode exemplo derivada de uma bactéria ou fungo. As proteases, que podem ser adicionadas, incluem papaína, subtilisina, por exemplo Subtilisina Carlsberg, ou proteases fungicas, por exemplo derivadas a partir de uma cepa de Aspergillus, por exemplo A. oryzae. Exemplos de proteases comerciais, úteis no processo da invenção, incluem Alcalase® e Flavourenzyme®, ambas disponíveis de Novoenzymes A / S, Bagsvaerd, Dinamarca. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais proteases purificadas são adicionadas, de modo a facilitar a hidrólise da proteína. A hidrólise pode ser também alcançada através da plasmólise, em que é adicionado um composto, por exemplo, cloreto de sódio, acetato de etila ou isopropanol, que induz a morte celular e a ruptura celular, conduzindo à liberação de enzimas hidrolíticas internas. A autólise e a plasmólise podem ser combinadas, por exemplo, através da adição de cloreto de sódio ao meio, após o processo de autólise ter sido permitido durante um período de tempo definido. A hidrólise ácida pode ser também usada para a obtenção de hidrólise de componentes de célula de levedura. A hidrólise ácida pode, por exemplo, ser executada através da adição de ácido clorídrico a uma cultura de levedura, de um modo usual a cultura de levedura estando sob a forma de uma suspensão com uma concentração de sólidos de 65 - 80%. A hidrólise é executada, de modo ffeqüente, em temperaturas elevadas, por exemplo de até cerca de 100°C, e pode, por exemplo, ser executada em um evaporador de filme cadente. Após ser alcançado o nível de amino nitrogênio requerido, o hidrolisado pode ser ajustado para o pH desejado, por exemplo, um pH de 5-7, de um modo usual com hidróxido de sódio.

Após a hidrólise dos componentes indesejáveis, os fragmentos celulares tipicamente não- hidrolisados são removidos através de separação, de modo a produzir o extrato de levedura. A separação pode ser alcançada através de qualquer método adequado conhecido na técnica, de um modo típico através de centrifiigação e/ ou filtração. O extrato pode ser submetido à pasteurização, de modo a exterminar quaisquer células vegetativas, de modo a inativar enzimas e a evitar o crescimento de contaminantes microbiológicos. O extrato deverá ser, de um modo usual, concentrado, por exemplo, através de evaporação em um evaporador de filme cadente. O concentrado pode ser também secado, por exemplo, através de secagem por pulverização ou secagem em tambor, de modo a que seja fornecido um pó de extrato de levedura. O produto final é vendido, de um modo usual, como um líquido, pasta ou pó.

Fosfolipase Uma fosfolipase usada no processo da presente invenção pode incluir a fosfolipase Ah fosfolipase A2, fosfolipase B, fosfolipase C, e fosfolipase D, e qualquer combinação das mesmas. No processo da invenção, uma cultura de célula de levedura é tratada com uma fosfolipase, por exemplo uma fosfolipase única; duas ou mais fosfolipases, por exemplo duas fosfolipases, incluindo, sem limitação, o tratamento com ambos os tipos A e B; ambos os tipos Ai e A2; ambos os tipos Aj e B; ambos os tipos A2 e B; ambos os tipos Αχ e C; ambos os tipos A2 e C; ou o tratamento com duas ou mais fosfolipases diferentes, do mesmo tipo. Está também incluído o tratamento com um tipo de fosfolipase, tal que A\, A2, B, C ou D. A atividade de fosfolipase pode ser provida por enzimas tendo também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase com atividade de fosfolipase. A atividade de fosfolipase pode ser, por exemplo, a partir de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase. Em outras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase é provida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipase e em que a atividade de fosfolipase não é uma atividade colateral. A fosfolipase é definida de acordo com a classificação de enzima padrão EC como EC 3.1.1.32.

Nome Oficial: Fosfolipase Ai Reação catalisada : Fosfatidilcolina + água <=> 2-acilglicerofosfocolina + ânion de ácido graxo Observação : possui uma especificidade muito mais ampla do que EC 3. 1.1.4. A fosfolipase A2 é definida de acordo com a classificação de enzima padrão EC como EC 3.1.1.4.

Nome Oficial : Fosfolipase A2 Nomes alternativos : fosfatidilcolina 2- acilidrolase Lecitinase a : fosfatidase; ou fosfatidolipase.

Reação catalisada: fosfatidilcolina + água <=> 1 - acilglicerofosfocolina + ânion de ácido graxo Observação : age também em fosfatidiletanolamina, colina plasmalogênio e fosfatídeos, removendo o ácido graxo ligado à posição 2. A fosfolipase B é definida de acordo com a classificação de enzima padrão EC como EC 3.1.1.5 Nome Oficial : lisofosfolipase Nomes Alternativos : lecitinase b; lisolecitinase;

Fosfolipase B; ou PLB.

Reação catalisada: 2-lisofosfatidilcolina + água o glicerofosfocolina + ânion de ácido graxo. A fosfolipase C é definida de acordo com a classificação de enzima EC como EC 3.1.4.3. A fosfolipase C hidrolisa a ligação de fosfato de fosfatidilcolina e outros glicerofosfolipídeos, por exemplo fosfatidiletanolamina, fornecendo diacilglicerol; esta enzima irá também hidrolisar as ligações de fosfato de esfingomielina, cardiolipina, colina plasmalogênio e fosfolipídeos de ceramida.

Reação com fosfatidilcolina : Fosfatidilcolina + água <» 1,2- diacilglicerol + fosfato de colina A fosfolipase D é definida de acordo com a classificação de enzima padrão EC como EC 3.1.4.4. A fosfolipase D hidrolisa as ligações de fosfato de fosfolipídeos e esfingomielina de modo a fornecer o ácido fosfatídico correspondente.

Reação com fosfatidilcolina : A fosfatidilcolina + água «· colina + um fosfatidato Fosfolipase A A atividade de fosfolipase A, que inclui fosfolipase A, fosfolipase A2, e combinações dos mesmos podem ser providas pelas enzimas tendo igualmente outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase com atividade de fosfolipase A. A atividade de fosfolipase A pode, por exemplo, ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase. Em outras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase A é provida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipase, e em que a atividade de enzima fosfolipase A não é uma atividade colateral. A fosfolipase A pode ser de qualquer origem, por exemplo de origem animal (tal que, por exemplo, de mamífero) por exemplo, do pâncreas (por exemplo, pâncreas bovino ou porcino) ou de veneno de cobra ou de veneno de abelhas. De um modo alternativo, a fosfolipase A pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, de levedura ou de bactérias, tais que do gênero ou espécie Aspergillus, por exemplo A. niger; Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Mucor, por exemplo M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo N. crassa; Rhizomucor, por exemplo R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer.; Sclerotinia, por exemplo S. libertiana; Trichophyton, por exemplo T rubrum; Whetzelinia, por exemplo W sclerotiorum; Bacillus, por exemplo B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, por exemplo C.frendii; Enterobacter, por exemplo E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo E. herbicola; Escherichia, por exemplo E. coli; Klebsiella, por exemplo K. pneumoniae; Proteus, por exemplo P. vulgaris; Providencia, por exemplo P. Stuartii; Salmonella, por exemplo S. typhimurium; Serratia, por exemplo S. liquefasciens, S. macescens; Shigella, por exemplo S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. violaceoruber; Yersinia, por exemplo Y enterocolitica. Deste modo, a fosfolipase A pode ser füngica, por exemplo a partir da classe Pyrenomycetas, tal que do gênero Fusarium, tal que uma cepa de F. culmorum, F. heerosporum, F. solani, ou uma cepa de F. oxysporum. A fosfolipase A pode ser também de uma cepa de fungo filamentoso dentro do gênero Aspergillus, tal que uma cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Uma fosfolipase A preferida é derivada a partir de uma cepa de Fusarium, em particular de F. veneratum ou de F. oxysporum, por exemplo a partir da cepa DSM 2672, tal como descrito na WO 98 / 26057, descrita em especial na reivindicação 36 e na SEQ ID NO. 2, da WO 98/ 2600057. Uma outra fosfolipase A preferida é PLA de Streptomyces, tal que, por exemplo, PLA 2 de S. violaceoruber. Em outras modalidades, a fosfolipase é uma fosfolipase, tal como descrita na WO 00/ 32758 (Novoenzymes A / S, Dinamarca). A atividade de uma fosfolipase do tipo A pode ser expressa em Unidades de Lecitase (LEU). A atividade de fosfolipase em Unidades de Lecitase é medida em relação a um padrão de fosfolipase usando lecitina como um substrato. A fosfolipase A catalisa a hidrólise de lecitina para isolecitina e um ácido graxo livre. O ácido graxo liberado é titulado com hidróxido de sódio 0,1 N, sob condições convencionais (pH 8,00; 40, 00°C ± 0,5). A atividade de fosfolipase A é determinada como a taxa de consumo de hidróxido de sódio durante a neutralização do ácido graxo e é expressa em unidades de Lecitase (LEU) em relação a um padrão de Lecitase (fosfolipase) (disponível de Novoenzymes A / S, Bagsvaerd, Dinamarca). 1 LEU é definido como a quantidade de enzima, que sob condições convencionais (pH 8,00, 40, 00°C ± 0,5) resulta na mesma taxa de consumo de hidróxido de sódio (pmol/ minuto) como o padrão de Lecitase diluído para uma atividade nominal de 1 LEU/g.

Fosfolipase B O termo “fosfolipase B” usado aqui em conexão com uma enzima da invenção, tem a intenção de abranger uma enzima com atividade de fosfolipase B. A atividade de fosfolipase B pode ser provida pelas enzimas que possuem também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase com atividade de fosfolipase B. A atividade de fosfolipase B pode, por exemplo, ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase B. Em outras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase B é provida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipase B, e em que a atividade da enzima fosfolipase B não é uma atividade colateral. Em uma modalidade da invenção, a fosfolipase B não se refere a lipases tendo atividade colateral de fosfolipase B, tal como definido na WO 98 / 26057. A fosfolipase B pode ser de qualquer origem, por exemplo, de origem animal (tal que, por exemplo, de mamífero), por exemplo do fígado (por exemplo, fígado de rato). De um modo alternativo, a fosfolipase B pode ser de origem microbiana, por exemplo de fungos filamentosos, leveduras ou bactérias, tais que do gênero ou espécie Aspergillus, por exemplo A. foetidus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae; Botrytis, por exemplo, B. cinerea; Candida, por exemplo C. alicans; Cryptococcus, por exemplo C. neoformans, Escherichia, por exemplo E. coli, Fusarium, por exemplo F. sporotrichoides, F. veneratum, F. veticilloides; Hyphozyma; Kluyveromyces, por exemplo, K. lactis’, Magnaporte, por exemplo M. grisea; Metarhizium, por exemplo, M. anisopliae; Mycosphaerella, por exemplo M. raminicola; Neurospora, por exemplo N. crassa; Peniicilllium, por exemplo P. notatum; Saccharomyces, por exemplo S. cerevisiae; Schizosaccharomyces, por exemplo, S. pombe; Torulaspora, por exemplo T. delbrueckii; Vibrio, por exemplo V. cholarae. Uma fosfolipase B preferida é derivada a partir de uma cepa de Aspergillus, em particular fosfolipase LLPL-1 ou LLPL-2 de A. niger, por exemplo como contida nos clones de Escherichia coli DSM 13003 ou DSM 13004, ou fosfolipase LLPL-1 ou LLPL-2, de A. oryzae, por exemplo, como contida nos clones de E. coli DSM 13082 ou DSM 13083, conforme descrito na WO 01/ 27251, em especial conforme descrito na reivindicação 1 e SEQ ID N°s. 2, 4, 6 ou 8 da WO 01/27251.

Fosfolipase C A atividade de fosfolipase C pode ser provida por enzimas tendo também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase com atividade de fosfolipase C ou uma fosfatase com atividade de fosfolipase C. A atividade de fosfolipase C pode, por exemplo, ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase C. Em outras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase C é provida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade e fosfolipase C e em que a atividade da enzima fosfolipase C não é uma atividade colateral. A fosfolipase C pode ser de qualquer origem, por exemplo de origem animal, tal que de origem de mamífero, ou de origem de planta, ou de origem microbiana, tal que de origem fungica ou de origem bacteriana, tal que a partir de uma cepa de Mycobacterium, por exemplo M. tuberculosis ou M. bovis; uma cepa de Bacillus, por exemplo B. cereus; uma cepa de Clostridium, por exemplo C. bifermentans, C. haemolyticum, C. novyi, C. sordelli, ou C. perfringens; uma cepa de Listeria, por exemplo L. monocytogenes; uma cepa de Pseudomonas, por exemplo P. aeruginosa, ou uma cepa de Staphylococcus, por exemplo S. aureus; ou uma cepa de Burkolderia, por exemplo B. pseudomallei.

Fosfolipase D A atividade de fosfolipase D pode ser provida por enzimas tendo também outras atividades, tais que, por exemplo, uma lipase com atividade de fosfolipase D, uma fosfatase com atividade de fosfolipase D, ou uma colinesterase com atividade de fosfolipase D. A atividade de fosfolipase D pode, por exemplo, ser de uma lipase com atividade colateral de fosfolipase D. Em outras modalidades da invenção, a atividade da enzima fosfolipase D é provida por uma enzima tendo essencialmente apenas atividade de fosfolipase D, e em que a atividade da enzima fosfolipase D não é uma atividade colateral. A fosfolipase D pode ser de qualquer origem, por exemplo de origem animal, tal que de origem de mamífero, por exemplo de camundongo, rato ou criceto chinês; de origem de planta, por exemplo, de repolho, milho, arroz, mamona, tabaco, ervilha, ou Arabidopsis thaliana\ ou de origem microbiana, tal que de origem bacteriana, por exemplo de uma cepa de Coryne bacterium, por exemplo de C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, ou C. haemolyticum; ou de origem fungica, tal que, por exemplo, a partir de uma cepa de Strepomyces, por exemplo S. antibioticus ou S. chromofuscus; uma cepa de Trichoderma, por exemplo T. resei; uma cepa de Saccharomyces, por exemplo S. cerevisiae; ou uma cepa de Aspergillus, por exemplo A. oryzae, A. niger, A. nidulans ou A. fumigatus.

Formulação e fontes de enzima A fosfolipase usada no processo da invenção pode ser derivada de ou obtenível a partir de quaisquer fontes aqui mencionadas. O termo “derivado” significa, neste contexto, que a enzima pode ser sido isolada a partir de um organismo, em que ela está presente de um modo nativo, isto é a identificação da seqüência de aminoácido da enzima é idêntica à de uma enzima nativa. O termo “derivado” também significa que as enzimas podem ter sido produzidas de modo recombinante em um organismo hospedeiro, a enzima produzida de modo recombinante tendo ou uma identidade idêntica a uma enzima nativa ou tendo uma seqüência de aminoácido modificada, por exemplo tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ ou substituídos, isto é, uma enzima produzida de modo recombinante, que é um mutante e/ ou um fragmento de uma seqüência de aminoácido nativa. Dentro do significado de uma enzima nativa estão incluídas as variantes naturais. Além disso, o termo “derivado” inclui enzimas produzidas sinteticamente, por exemplo, através da síntese de peptídeo. O termo “derivado” também abrange enzimas, que foram modificadas, por exemplo, através de glicosilação, fosforilação, etc., seja in vivo ou in vitro. O termo “ obtenível” neste contexto significa que a enzima possui uma seqüência de aminoácido idêntica a uma enzima nativa. O termo abrange uma enzima, que foi isolada a partir de um organismo, em que ela estava presente de um modo nativo, ou uma em que ele foi expresso, de modo recombinante, no mesmo tipo de organismo ou outro, ou enzimas produzidas, de um modo sintético, através da síntese de peptídeo. Com relação à enzima produzida de um modo recombinante, os termos “ obtenível” e “derivado” referem-se à identidade da enzima e não à identidade do organismo hospedeiro, no qual ela é produzida de um modo recombinante.

Deste modo, a fosfolipase pode ser obtida a partir de um microorganismo através do uso de qualquer técnica adequada. Por exemplo, uma preparação de enzima fosfolipase pode ser obtida pela fermentação de um microorganismo adequado e subseqüente isolamento de uma preparação de fosfolipase a partir do caldo fermentado resultante ou do microorganismo, através de métodos conhecidos na técnica. A fosfolipase pode ser também obtida através do uso de técnicas de DNA recombinante. Um tal método compreende o cultivo de uma célula hospedeira, transformada com um vetor de DNA recombinante, que compreende uma seqüência de DNA, que codifica a fosfolipase em questão e a seqüência de DNA sendo operacionalmente ligada com um sinal de expressão apropriado, de tal modo que seja capaz de expressar a fosfolipase em um meio de cultura, sob condições que permitam a expressão da enzima e a recuperação da enzima a partir da cultura. A seqüência de DNA pode ser também incorporada no genoma da célula hospedeira. A seqüência de DNA pode ser de origem genômica, cDNA ou sintética, ou quaisquer combinações destas, e pode ser isolada ou sintetizada de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

Fosfolipases adequadas estão disponíveis comercialmente. Exemplos de enzimas comerciais são, por exemplo, Lecitase® (Novozymes A /S, Bagsvaerd, Dinamarca), YieldMAX® (Novozymes A/ S, Bagsvaerd, Dinamarca e Chr. Hansen AJ S, Horsholm, Dinamarca), Lysomax® (Genencor International, Inc. Paio Alto, Califórnia) ou Purifine™ (diversa Corp., San Diego, Califórnia). Uma fosfolipase B adequada é, por exemplo, a fosfolipase Aspergillus niger LLPL-2, que pode ser produzida, de um modo recombinante, em A. niger, conforme descrito na WO 01/17251.

No processo da invenção, a fosfolipase é uma fosfolipase purificada. O termo “ purificado”, como aqui usado, abrange as preparações de enzima fosfolipase, em que os componentes do organismo, a partir do qual ela é derivada, foram removidos. O termo “ purificado” também abrange a proteína da enzima fosfolipase livre de componentes do organismo nativo, a partir dos quais ela é obtida, e é também denominada fosfolipase “essencialmente pura” e pode ser particularmente relevante para as fosfolipases que são de ocorrência natural e que não foram modificadas geneticamente, tal que por deleção, substituição ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido.

Deste modo, a fosfolipase é purificada, ou seja, apenas quantidades menores de outras proteínas estando presentes. A expressão “ outras proteínas” refere-se, de modo particular, a outras enzimas. O termo “purificado”, como aqui usado, refere-se à remoção de outros componentes, em particular de outras proteínas e de modo mais particular outras enzimas presentes na célula de origem da fosfolipase. A fosfolipase pode ser “ substancialmente pura”, isto é livre de outros componentes a partir do organismo no qual ela é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiro para a fosfolipase produzida de modo recombinante. Preferivelmente, as enzimas são pelo menos 75% (p/p) puras, de um modo mais preferido pelo menos 80%, 85%, 90% ou ainda pelo menos 95% puras. Em uma modalidade ainda mais preferida, a fosfolipase está em pelo menos 98% da preparação de enzima pura.

Os termos “fosfolipase” incluem quaisquer compostos auxiliares, que possam ser necessários para a atividade catalítica da enzima, tal que, por exemplo, um aceitador ou co-fator apropriado, que pode ou não estar naturalmente presente no sistema de reação. A fosfolipase pode estar em qualquer forma adequada para o uso em questão, tal que, por exemplo, sob a forma de um pó seco ou granulado, um granulado não- pulverizado, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida. Os granulados podem ser produzidos, por exemplo, como exposto na US 4.106. 991 e US. 4.661.452, e podem, de um modo opcional, ser revestidos através de métodos conhecidos na técnica. Preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas através da adição de estabilizadores, tais que um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo com os métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método exposto na EP 238216.

Tratamento com fosfolipase De acordo com a invenção, as células de levedura são tratadas com uma fosfolipase purificada. O tratamento pode ser conduzido através de qualquer método apropriado, por exemplo através da adição da fosfolipase à cultura da célula de levedura. A cultura da célula de levedura pode, por exemplo, ser suspensa em água quando tratada com uma fosfolipase. O tratamento com uma fosfolipase pode ser conduzido antes, após ou simultaneamente com que a cultura de célula de levedura seja submetida à hidrólise de proteína.

Condições adequadas, sob as quais executar o tratamento de fosfolipase, podem ser encontradas pela pessoa versada na técnica através dos métodos usuais conhecidos na técnica para a otimização das reações enzimáticas. Aquele versado na técnica saberá como ajustar os parâmetros, tais que o pH, temperatura, e quantidade de fosfolipase, de modo a alcançar os resultados desejados. Em uma modalidade da invenção, o tratamento com fosfolipase é conduzido em um pH de entre o pH 2 e o pH 10, tal que entre o pH 3 e o pH 9, entre o pH 2 e o pH 6, ou entre o pH 4 e o pH 6. A quantidade de fosfolipase a ser usada no método da invenção pode depender da atividade da fosfolipase específica. Quando uma fosfolipase A é usada, a quantidade de fosfolipase pode, por exemplo estar entre 0,001 e 1 mg de proteína de enzima/g de matéria seca, tal que, por exemplo, entre 0,005 e 0,1 mg de proteína de enzima /g de matéria seca. Em uma modalidade da invenção, uma fosfolipase é adicionada em uma quantidade suficiente para alcançar um rendimento aumentado de um ou mais componentes a serem extraídos, comparado a um processo de extração de similar, em que não ocorre tratamento com uma fosfolipase. O rendimento pode, por exemplo, ser aumentado em pelo menos 1 %, tal que em pelo menos 2 %, pelo menos 5%, pelo menos 10%, ou pelo menos 20%.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso de uma fosfolipase purificada, por exemplo, uma fosfolipase A, para a extração de um ou mais componentes a partir de uma cultura de célula de levedura. EXEMPLO Exemplo 1 Um cultura de célula de levedura em bloco de Saccharomyces cerevisiae foi misturada com água deionizada, de modo a alcançar um teor de matéria seca de 14% e foi agitada em um agitador magnético, durante 60 minutos, em temperatura ambiente. A quantidade de nitrogênio nesta mistura de levedura foi determinada através de um método de combustão em um Leco FP - 528. Os sólidos secos são medidos na mistura de levedura através de pesagem (após a secagem a 105°C). A mistura de levedura foi aquecida a 55°C e o pH ajustado para 6,5 com NaOH 4 N. As amostras foram tratadas com 0,25% (peso/ peso de matéria seca de levedura) de uma fosfolipase (Lecitase® Ultra, 10 kEU/ g de Novozymes A/ S, Dinamarca) e /ou 0,5% (peso/ peso de matéria seca de levedura) de uma enzima proteolítica (Alcalase® 2, 4 1, Novozymes AJ S, Dinamarca). As enzimas foram adicionadas à mistura de levedura após dez minutos de aquecimento prévio a 55°C. Uma amostra de controle (neutra) não foi tratada com a enzima. A autólise foi executada durante 22 horas a 55°C, sob agitação magnética. Amostras de 20 ml foram tomadas e a quantidade exata foi pesada. As amostras foram inativadas a 85°C, durante 10 minutos. Após a inativação, as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos, a 3500 rpm, usando um aparelho Multifuge 3 S -R de Heraeus. A quantidade de extrato foi pesada após a decantação. Os sólidos secos foram medidos no extrato pela pesagem (após a secagem a 105°C). A quantidade de nitrogênio no extrato foi determinada por um método de combustão em um aparelho Leco FP - 528. A quantidade de proteína foi calculada como de 6,5 vezes a quantidade de nitrogênio. O amino nitrogênio livre foi determinado usando um método de OPA (o-ftaldialdeído). Com base nas medições acima, foi calculado o seguinte: % de Rendimento do Extrato = (g de extrato após a centrifugação)/ (g de mistura de levedura antes da centrifugação )* 100 % de Rendimento de Proteína = (g de extrato após a centrifugação * teor de proteína no extrato)/ (g de mistura de levedura antes da centrifugação * teor de proteína da mistura de levedura )* 100 Grau de hidrólise = (número de ligações de peptídeo clivadas / número total de ligações de peptídeo ) * 100 = (h/ htot) * 100 Quando h é expresso como uma função de meqv serina NH2:h = (serina NH2 - 0,4)/ 1; e htot = 7, 8. Serina NH2 foi medido em relação ao padrão de serina contendo 00 mg/ L através de medição de absorção a 340 nm.

Os resultados baseados em determinações duplas são apresentados na Tabela 1: Exemplo 2 O extrato de levedura foi preparado pelo menos método que no Exemplo 1, exceto que uma fosfolipase diferente foi usada (YieldMax®, Chr. Hansen AJ S e Novozymes Al S, Dinamarca), e o tratamento enzimática foi executado a 40°C e pH de 6,0. Os resultados são fornecidos na Tabela 2 (determinações únicas).

Tabela 2 Uma cultura de célula de levedura em bloco de Saccharomyces cerevisiae foi misturada com água deionizada, de modo a alcançar um teor de matéria seca de 14% e foi agitada em um agitador magnético, durante 60 minutos, em temperatura ambiente. A quantidade de nitrogênio nesta mistura de levedura foi determinada através de um método de combustão em um aparelho Leco FP - 528. Os sólidos secos foram misturados na mistura de levedura através de pesagem (após secagem a 105°C). A mistura de levedura foi aquecida a 55°C e ou aplicada no pH natural (cerca de 5- 5:3 ) ou ajustada para 5, 8 com NaOH 4 N. As amostras foram tratadas com 0, 25% (peso/peso de matéria seca de levedura) de uma fosfolipase (Lecitase® Ultra, 10 kLU/ g Novozymes A / S, Dinamarca) e/ ou 0,3% (peso/ peso de matéria seca de levedura) de uma enzima proteolítica (Papain, Pang BO Biological Co. Ltd.). As enzimas foram adicionadas à mistura de levedura após dez minutos de aquecimento prévio a 55°. Uma amostra de controle neutra) não foi tratada com a enzima. A autólise foi executada durante 22 horas a 55°C, sob agitação magnética. Amostras de 30 ml foram tomadas e a quantidade exata foi pesada. As amostras fora inativadas a 85°C, durante 10 minutos. Após a inativação, as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos, a 3500 rpm, usando um aparelho Multifuge 3S - R de Heraus. A análise dos extratos foi como descrita no Exemplo 1. A turvação foi determinada usando um aparelho Turbidimeter 2100 AN de HACH.

Os resultados baseados em determinações duplas são apresentados na Tabela 3.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para produzir um extrato de levedura, caracterizado pelo fato de que compreende: I) tratar células de levedura com uma fosfolipase purificada selecionada de fosfolipase A], fosfolipase A?, fosfolipase B, fosfolipase C e fosfolipase D e qualquer combinação das mesmas, em que a fosfolipase é usada em uma concentração entre 0,001 e Img de proteína enzimãtica/g de matéria seca; e ii) separar o extrato de levedura a partir das células tratadas, em que as células de levedura são submetidas à hidrólise de proteína antes, após, ou durante o estágio í) e em que as células de levedura podem opcional mente ser tratadas com cloreto de sódio, acetato de etila ou isopropanol.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína é hidrolisada por enzimas protcolíticas.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína é hidrolisada por autólise.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que uma protease purificada é usada.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma fosfolipase Ai é usada no estágio i).

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma fosfolipase A2 é usada no estágio i).

7. Uso de uma fosfolipase purificada, caracterizado pelo fato de ser para produzir um extrato de levedura de acordo com o método como definido na reivindicação 1.