JP3022131B2 - ホスホリパーゼａ１とその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リン脂質の１位のアシ
ル基を選択的に加水分解し、２−アシル型のリゾリン脂
質を生成するホスホリパーゼＡ１、特に、アスペルギル
ス（Aspergillus ）属の糸状菌が生産するホスホリパー
ゼＡ１及びこのような酵素の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】リン脂質は界面活性作用、酸化防止作
用、生理活性作用等を有するため、食品、飼料、化粧
品、医薬品分野等で幅広く使用されている。

【０００３】一方、リン脂質の界面活性作用は、一般に
他の合成界面活性剤に比べ乳化特性が劣るため、酵素を
利用して乳化特性を改善する試みがなされている。

【０００４】リゾリン脂質とはリン脂質のグリセリン残
基に結合した脂肪酸の一部を加水分解して得られる部分
分解リン脂質である。このリゾリン脂質は、もとのリン
脂質に比べて０／Ｗ型の乳化性が強くなり、ｐＨや温度
変化に対してより安定なエマルジョンを形成し、また、
カルシウムやマグネシウム等の金属イオンが高濃度に共
存しても乳化性が低下しない等、優れた特性を持つこと
が報告されている。このため、リゾリン脂質はリン脂質
に比べ、更に幅広く利用され得る。

【０００５】また、リン脂質含有物中のリン脂質のリゾ
化は、その現象単独で又は他の共存物質との相乗効果等
により食品物性の向上に結びつくことがある。

【０００６】リン脂質を分解する酵素としてはホスホリ
パーゼが知られており、その作用部位によって更に再分
類されている。このうちリン脂質をリゾリン脂質に分解
するものとしては、ホスホリパーゼＡ１又はホスホリパ
ーゼＡ２が知られているが、いずれもリン脂質のリゾ化
を目的とした用途に使用され得る。

【０００７】既に微生物が生産するホスホリパーゼＡ
（特開昭58-212783 号公報）やリパーゼ類（特開昭63-4
2691号公報）を利用したリン脂質の分解方法が示され、
また、「酵素の宝庫」と呼ばれている麹カビ、アスペル
ギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）起源のタカヂア
スターゼ（登録商標）にも、古くからリン脂質分解活性
を含むリパーゼの存在が知られていた（Biochem.Z.,26
1,275(1933)）が、これらの酵素を用いる方法は、酵素
活性がパンクレアチンに比べて低かったり、基質特異性
に劣る酵素を利用した場合には、リゾリン脂質の収率が
悪化したり、副生物の共存によるリゾリン脂質の品質の
低下を招く等の欠点がある。

【０００８】従って、上記の問題点、欠点を克服するた
め、優れた活性及び選択性を有し、安価に定常的に供給
できる酵素の開発が望まれている。

【０００９】現在、酵素を利用してリン脂質を分解した
リゾリン脂質が市販されているが、これはブタ膵臓由来
の酵素剤パンクレアチンに含まれるホスホリパーゼＡ２
を利用したものである。ところが、パンクレアチンは、
臓器特有の臭みがあったり、給源がブタ膵臓のためその
生産コスト低減に限界があること等が問題とされ、更
に、以下に示すような問題点が指摘されている。

【００１０】第一点は、一般に、ホスホリパーゼＡ１、
Ａ２作用時には、ｐＨの調整が必要とされる点である。
ホスホリパーゼＡ１、Ａ２作用時には、遊離する脂肪酸
により反応系のｐＨは低下するが、ブタ膵臓ホスホリパ
ーゼＡ２の至適ｐＨは、中性乃至弱アルカリ性である。
そのため、酵素作用時にはｐＨの調整が必要であり、酵
素反応後にはｐＨ調整のために添加した物質の除去工程
等が必要となる。

【００１１】この問題を解決するために、溶剤分別（米
国特許第3,652,397 号等）、非イオン性無極性有機溶媒
中で酵素反応させる方法（特開平3-98590 号公報）又は
遊離脂肪酸と金属セッケンを作るような化合物を反応液
中に添加する方法（特開昭62-14790号公報、特公平4-81
431 号公報）等が提案されている。しかし、これらの方
法は、操作が煩雑であり、製品の安全性が問題とされる
場合もある。

【００１２】第二点は、酵素反応後、得られた生成物中
に、加熱や有機溶媒等に対して極めて高い安定性を持つ
ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２が残存する点である。最終
製品中に加水分解を受けていないリン脂質が存在する
と、ホスホリパーゼＡ２によりリン脂質から新たに脂肪
酸が遊離し、その商品価値を著しく損ねることがある。
そのため、熱処理により残存酵素を失活させる方法が考
えられるが、酵素反応生成物を９５℃で、３０分程度の
加熱処理をするだけでは、ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２
は十分には失活せず、また１２０℃位の加熱処理をし
て、失活させると、リン脂質又は遊離脂肪酸の劣化を引
き起こす等の問題が生じる。

【００１３】そのため、ホスホリパーゼＡ２の残存活性
を実質的に有さないリゾリン脂質含有物を得るために、
種々の方法が試みられている。例えば、その製造工程に
おいて各種の溶剤を用いた溶剤分別及びシリカゲル等を
用いたカラム処理等を組み合わせた方法、ホスホリパー
ゼＡ２で処理したリン脂質を乾燥させた後、極性溶媒を
用いて分別する方法（特開昭62-262998 号公報、特公平
2-11234 号公報）又は酵素処理した後、反応生成物中の
ホスホリパーゼＡ２をプロテアーゼで処理し、ついで該
プロテアーゼを加熱失活させる方法（特開昭63-233750
号公報）等である。しかし、それらの操作には、時間や
費用がかかり、しかも収率も低下するなど種々の問題点
がある。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、長年に
亘り、ホスホリパーゼを生産する微生物及びホスホリパ
ーゼ、並びにホスホリパーゼを用いてリン脂質からリゾ
リン脂質を製造する方法について、鋭意検討を行い、ア
スペルギルス（Aspergillus ）属の糸状菌が生産する酵
素を単離精製して、優れた活性及び選択性を有する高度
に精製された酸性ホスホリパーゼＡ１を見出し、並びに
リン脂質を酸性ホスホリパーゼＡ１で処理することによ
り、酵素作用時にｐＨの調整を必要とせず、温和な加熱
処理により残存活性を失活させることができ、リゾ化率
が高く、品質が良いリゾリン脂質を製造する方法を見出
して、本発明を完成させた。

【００１５】従って、本発明はアスペルギルス（Asperg
illus ）属の糸状菌が生産するホスホリパーゼＡ１を提
供する。

【００１６】本発明は更に、リン脂質からのリゾリン脂
質の製造において、酸性ホスホリパーゼＡ１、特にアス
ペルギルス（Aspergillus ）属の糸状菌から得られる酸
性ホスホリパーゼＡ１の使用を可能にする。

【００１７】

【発明の構成】

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明のホスホリパーゼ
Ａ１は、分子量が３２，０００であり、等電点がｐＩ
３．０である酵素蛋白であり、次の特性を有する。

【００１９】１．作用及び基質特異性 本酵素は、リン脂質の１位のアシル基のみを加水分解
し、その作用形成は、ホスホリパーゼＡ１（酵素番号EC
3.1.1.32）に属する。

【００２０】２．作用至適ｐＨ 本酵素の作用至適ｐＨは、通常の活性測定系（トライト
ンX-100(登録商標) の存在下、３７℃で１０分間反応）
では、４乃至５である。また、トライトンＸ−１００を
含まない活性測定系（３７℃で１０分間反応）では、
４．５乃至５．５である。

【００２１】３．ｐＨ安定性 本酵素の安定なｐＨ領域は、酵素それ自身の濃度、共存
する物質の種類や濃度等の影響を受け変化する。

【００２２】４．作用至適温度 本酵素は、３０℃乃至６５℃で作用を有し、至適温度
は、５０℃乃至６０℃であり、５５℃付近で酵素の最大
活性を示す。

【００２３】５．阻害、活性化及び安定化 本酵素は、水銀、鉛、鉄等の金属多価イオンによる阻害
は特に認められない。また、エチレンジアミン4 酢酸
（EDTA）による活性の変化も認められない。

【００２４】６．精製方法 アスペルギルス（Aspergillus ）属の糸状菌の麹培養抽
出液に、撹拌しながら、冷却アセトンを終濃度６０乃至
８０（v/v ）％になるように加え、しばらく放置して、
遠心分離して、沈殿を収得する。また、アセトンの変わ
りにエタノールを使用しても、同様に沈殿が得られる。
この沈殿を５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）に溶か
し、硫酸アンモニウムで塩析し、遠心分離して、沈殿を
分離する。得られた沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む
５０ｍＭ酢酸塩緩衝溶液（ｐＨ５．５）に溶かし、不溶
物を濾別した後、カラムクロマトグラフィー[ カラム：
ブチルトヨパールパック650S(Butyl Toyopearl pak 650
S ）、東ソー社製、流出溶剤：硫酸アンモニウム含有５
０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）] を用いて精製す
る。得られた半精製酵素を２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
５．５）で透析した後、カラムクロマトグラフィー[ カ
ラム：Ｑ−セファロース(Q-Sepharose) 、ファルマシア
社製、流出溶剤：食塩含有２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
５．５)]を用いて精製し、ホスホリパーゼＡ１を得る。
更に、これを硫酸アンモニウムで塩析し、カラムクロマ
トグラフィー[ カラム：スーパーロース12(Superose 1
2) 、ファルマシア社製] により精製し、酵素蛋白ホス
ホリパーゼＡ１をうる。

【００２５】７．結晶構造 本酵素は、結晶状に得られていないため、その結晶構造
は決定できない。

【００２６】本発明のホスホリパーゼＡ１を生産する生
産菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspe
rgillus niger ：例えば、ATCC-9642 、IFO-4407等）、
アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae：例え
ば、SANK-11870、IFO-30102 等）、アスペルギルス・ウ
サミイ（Aspergillus usamii、：たとえば、IAM-2414、
IFO-6082等）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillu
s awamori ：例えば、IAM-2112、IFO-4033等）、アスペ
ルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae ：例えば、IAM-
2666等）、アスペルギルス・ホエニシス（Aspergillus
phoenicis ：例えばIAM-2215）、アスペルギルス・ウェ
ンティ（Aspergillus wentii：例えば、IAM-2133）のよ
うなアスペルギルス属に属する糸状菌があげられ、好適
にはアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリ
ゼである。

【００２７】上記糸状菌は、いずれも、公知菌（例え
ば、特公昭46-32792号公報、J.Gen.Appl.Microbiol.,1
7,281(1971)、Biochem.Z.,261 275(1933)等）であり、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amer
ican Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）、財団法人
発酵研究所（Institute for Fermentation Osaka：ＩＦ
Ｏ）、東京大学応用微生物研究所微生物微細藻類総合セ
ンター（Institute of Applied Microbiology ：ＩＡ
Ｍ）等の保存機関にそれぞれの番号で保存され、自由に
分譲を受けることができる。

【００２８】また、アスペルギルス・オリゼ(A.oryzae)
SANK 11870は、微工研条寄第3887号(FERM BP-3887)とし
て工業技術院微生物工業技術研究所（現在では生命工学
工業技術研究所と改称）に寄託されている。

【００２９】また、これらの菌株は、天然の元株のほ
か、その人工変異株をも含む。

【００３０】本発明のホスホリパーゼＡ１は、例えば、
以下の方法で製造される。

【００３１】即ち、菌株の培養は、ふすまに、水を０．
５乃至２倍重量（好適には、等量）加えて、蒸煮して得
た固体培地に種菌を接種して、麹式培養法で行う。培地
原料としては、ふすまの他に、穀類（例えば、米、麦
等）、各種雑穀類（例えば、トウモロコシ、大豆、ゴマ
等）、綿実かす等を単独で又は組み合わせて用いること
もできる。

【００３２】培養温度は、１０℃乃至４０℃（好適に
は、１５℃乃至３５℃、特に好適には、１８℃乃至３２
℃）であり、培養時間は、培地組成、培養温度等により
異なるが、通常３日乃至２０日間（好適には、４日乃至
８日間）である。

【００３３】培養終了後、麹に水又は適当な緩衝液（例
えば、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液等）を１乃至２０
倍重量加え、良く撹拌した後、圧搾濾過して、酵素液を
得ることができる。 更に、酵素を採取精製するための
常法、例えば、塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換体
等を吸着体として用いる吸着法、限外濾過法、真空乾燥
法等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、
上記酵素液から本発明の酵素が採取され、単離精製され
る。

【００３４】本発明のホスホリパーゼＡ１は、優れた活
性及び選択性を有し、微生物由来の安価に定常的に供給
できる酵素であり、極めて有用なホスホリパーゼであ
る。

【００３５】本発明は更に、上記ホスホリパーゼＡ１と
同じ酵素特性のホスホリパーゼＡ１を、リゾリン脂質の
製造に用いることで、酵素作用時にｐＨの調整を必要と
せず、温和な加熱処理により残存活性を失活させること
ができ、リゾ化率が高く、品質が良いリゾリン脂質の製
造を可能にする。

【００３６】本発明のリゾリン脂質の製造法に利用され
得るホスホリパーゼＡ１の分子量及び等電点は、その生
産菌株により変化し、分子量は約３０，０００〜４０，
０００好適には約３２，０００〜３７，０００であり、
等電点（ｐＩ）は、等電点電気泳動法による測定で、ｐ
Ｉ２．８〜４．５、好適にはｐＩ３．０〜４．３であ
る。

【００３７】また、更に本酵素は以下の特性を有するも
のである。

【００３８】１．作用及び基質特異性 本酵素は、リン脂質の１位のアシル基のみを加水分解
し、その作用形成は、ホスホリパーゼＡ１（酵素番号EC
3.1.1.32）に属する。

【００３９】２．活性領域 本酵素は、ｐＨ２．５乃至６、好適にはｐＨ３乃至５．
５の活性領域を有する。

【００４０】３．安定上限温度 本酵素は、４５℃乃至９０℃、好適には５０℃乃至８０
℃の安定上限温度を有する。

【００４１】４．作用至適ｐＨ 本酵素の作用至適ｐＨは、通常の活性測定系（トライト
ンＸ−１００の存在下、３７℃で１０分間反応）では、
ｐＨ３．２乃至５．０である。

【００４２】５．ｐＨ安定性 本酵素の安定なｐＨ領域は、酵素それ自身の濃度、共存
する物質の種類や濃度等の影響を受け変化する。

【００４３】６．作用至適温度 本酵素は、３０℃乃至６５℃で作用し、作用至適温度
は、５０℃乃至６０℃である。

【００４４】７．温度安定性 本酵素は、ｐＨ４．０、３０分間処理では、約３０℃乃
至５５℃で安定である。

【００４５】本発明に利用され得るホスホリパーゼＡ１
で、リン脂質を分解させる反応は、酵素と基質を、水性
媒体中又は湿潤状態で接触させることにより行われ、場
合によっては非イオン性無極性有機溶媒（例えば、ジエ
チルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類、ヘキサ
ン、ベンゼン、トルエンのような炭化水素類、酢酸エチ
ル、酢酸ブチルのようなエステル類等）共存下で酵素反
応させることも可能である。

【００４６】使用される基質は、リン脂質自身又はリン
脂質含有物質であり、その給源、含有率、性状を問わな
い。それらは、例えば、大豆、小麦、大麦、トウモロコ
シ、ナタネ、ヒマワリ、落花生、綿実等の植物性リン脂
質、卵黄、動物の脳（ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ
等）等の動物性リン脂質、クロレラ細胞、糸状菌菌体等
の微生物菌体リン脂質等であり得、好適には、大豆、小
麦又は卵黄のリン脂質である。

【００４７】水性又は湿潤媒体は、例えば、イオン交換
水、蒸留水、井水、水道水等であり得、必要に応じて、
酸（例えば、酢酸等）、アルカリ（例えば、水酸化ナト
リウム等）又は緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液）を加え
て、ｐＨ２．５乃至６．５（好適には、ｐＨ３．５乃至
５．５）に調整することもできる。また、イオン交換
水、蒸留水等の軟質の水を用いる場合には、塩化カルシ
ウム等を添加する方が好ましいことがある。

【００４８】ホスホリパーゼＡ１の添加量は、反応温
度、反応時間、反応時のｐＨ、基質の性状や品質、夾雑
する物質、要求される効果の程度等により異なるが、好
適には、１，０００単位／ｇの酵素を用いて、リン脂質
（例えば、大豆リン脂質）に対して、０．０５重量％乃
至１０重量％（好適には、０．２重量％乃至２重量％）
である。

【００４９】本酵素の反応温度は、１０℃乃至７０℃
（好適には、２０℃乃至６５℃、特に好適には、３０℃
乃至６０℃）であり、反応に要する時間は、反応温度、
ｐＨ等により異なるが、通常１０分乃至１０日間（好適
には、１時間乃至２日間）である。

【００５０】また、得られるリゾリン脂質中にホスホリ
パーゼＡ１活性が残存することは、通常好ましくなく、
酵素反応を行った後、必要に応じて、簡便な操作、即
ち、温和な加熱処理によって、酵素反応生成物中の残存
ホスホリパーゼＡ１活性を容易に失活させることができ
る。この処理は、４５℃乃至９０℃（好適には、５０℃
乃至８０℃）で、５分乃至５時間（好適には、１０分乃
至２時間）加熱することにより行われる。

【００５１】また、加熱処理の他に、酵素を失活させる
ための常法、例えば、ｐＨ処理、加圧処理等を単独で又
は適宜組み合わせて用いても、残存ホスホリパーゼＡ１
活性を失活させることができる。

【００５２】本酵素の反応により、反応生成物は、その
まま使用することが可能であるが、必要に応じて、薄層
濃縮等の濃縮機による濃縮又は精製、更には、噴霧乾燥
又は凍結乾燥等の乾燥手段、等の常法を施して、濃縮、
精製又は乾燥製品とすることもできる。

【００５３】本発明に利用され得るホスホリパーゼＡ１
は、その使用用途により、部分精製して用いることが好
ましい。例えば、本酵素を、小麦粉に直接添加する場合
等には、プロテアーゼ等が夾雑していないことが適当で
ある。

【００５４】更に、パン、麺等の小麦粉製品の物性改良
を目的として生地に直接添加するような場合には、必要
に応じて、ホスホリパーゼＤ、乳化剤（例えば、モノグ
リセライド、カルシウムステアリルラクチレート等）を
添加することが可能である。また、本酵素使用による効
果は、生地物性及び製品物性に現れ、生地は、本酵素添
加により、適度の弾力性と伸展性を有するようになり、
また粘着性も抑制されて、各作業工程での操作が容易と
なる。

【００５５】

【実施例】以下に本発明のうち、ホスホリパーゼＡ１、
特にアスペルギルス（Aspergillus ）属の糸状菌が生産
するホスホリパーゼＡ１について更に具体的に説明する
が、本発明は、これによってなんら限定されるものでは
ない。

【００５６】［実施例１］アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger ）からの
粗ホスホリパーゼＡ1の製造 アスペルギルス・ニガー(A.niger) ATCC 9642 株を、ふ
すまと水の等量混合物からなる培地１２ｇで、３０℃に
て６日間培養し前培養を行い、得られた全菌体を、ふす
まと水の混合物６００ｇを金属皿［４２ｘ２４ｘ７（深
さ）ｃｍ］に入れ１２０℃にて３０分間煮沸した本培養
培地に植菌し、３０℃にて１５時間、更に１９℃にて５
日間培養した。こうして調製した麹に、水３ｌを加え、
よく混合し、３７℃にて２時間放置した後、濾過して、
酵素抽出液を得た。この酵素抽出液に１Ｎ酢酸を加え、
ｐＨを４．０に調整し、冷却したアセトンを倍量加え、
冷所に一夜放置した。その後上澄を捨て、沈殿部をアセ
トンでよく洗い、真空乾燥して、ホスホリパーゼＡ１を
含む酵素サンプル１９．２ｇを得た。本酵素１ｇ当たり
の主な酵素活性を表５に示す。なお、各酵素活性は、後
述する方法により測定した。

【００５７】［実施例２］アスペルギルス・ニガー （A.niger ）からのホスホリパ
ーゼＡ１の製造 実施例１の粗製ホスホリパーゼＡ１ １０ｇを水約１０
０ｍｌに溶かし、１Ｎ酢酸を加えて、ｐＨ４．０に調整
し、水を加えて２００ｍｌとした後、２００ｍｌの冷ア
セトンを加えて混合し、１時間放置した。その後、混合
液を遠心分離して、第１沈殿を得た。上澄に６００ｍｌ
の冷アセトンを加えて混合し、１時間放置した。その
後、混合液を遠心分離して、第２沈殿を得た。この第２
沈殿を５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）５００ｍｌ
に溶かし、硫酸アンモニウム３００ｇを加えて塩析し
た。遠心分離して得た沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含
む５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、不溶
物を濾別した後、ブチルトヨパールパック650S（Butyl
Toyopearl pak 650S、東ソー社製）、Ｑ−セファロース
（Q-Sepharose 、ファルマシア社製）及びスーパーロー
ス12（Superose 12 、ファルマシア社製）を用いたカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、ホスホリパーゼＡ
１ ３１．５単位を含む酵素サンプルを得た。

【００５８】本酵素１ｇ当たりの主な酵素活性を表５に
示す。なお、各酵素活性は、後述する方法により測定し
た。

【００５９】上記の実施例２において調製した酵素サン
プルは、リパーゼ活性をほとんど伴わないこと（ホスホ
リパーゼＡ１活性の約０．１％以下）を確認した。

【００６０】次に、本発明者は、上記の実施例２におい
て調製した酵素サンプル０．０２３６単位を（Ｉ）２位
のパルミトイル基を¹⁴Ｃ（NEN 社,NEC 764 ）で標識し
たＬ−α- ジパルミトイルホスファチジルコリン（１mC
i /mmole）０．１μmole、及び（ＩＩ）１−及び２−位
のパルミトイル基を¹⁴Ｃ（NEN 社,NEC 682 ）で標識し
たＬ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（２mC
i/mmole ）０．１μmoleに添加し１０分間反応させた。
その際の最終反応液は９０μｌであった。その結果、１
と２位のパルミトイル基が¹⁴Ｃ標識されたホスファチジ
ルコリンからのみ¹⁴Ｃ標識されたパルミチン酸が遊離
し、この酵素サンプルが１−アシル基のみに作用してい
ることを確認した。

【００６１】以下に実施例２において調製したホスホリ
パーゼＡ１の特性を示す。 ホスホリパーゼＡ１ 分子量：３２，０００（スーパーロース12を用いたゲル
濾過法による）。 等電点：ｐＩ３．０（等電点電気泳動法による）。 作用至適ｐＨ：トライトンＸ−１００存在下では、図１
に示すようにｐＨ４乃至５、トライトンＸ−１００不存
在下では、図２に示すようにｐＨ４．５乃至５．５であ
る。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、０．２Ｍ酢酸塩
緩衝液を用いて、酵素液を調製し、後述する方法で測定
し、ｐＨ４における活性を１００％とした。

【００６２】ｐＨ安定性：ｐＨ安定性は図３の通りであ
る。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、３３ｍＭ酢酸塩
緩衝液（ｐＨ３．２〜６．０）、３３ｍＭトリスアミノ
メタン- マレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．５）及び
３３ｍＭグリシン・食塩- 水酸化ナトリウム（ｐＨ８〜
１２．５）を用いて、ホスホリパーゼＡ１約１０単位／
ｍｌの酵素液を調製し、３７℃で６０分間放置の後、後
述する方法で活性測定した。なお、最も安定であった際
の活性を１００％とした。

【００６３】作用至適温度：作用最適温度は、図４に示
すように５０℃乃至６０℃である。なお、３７℃での活
性を１００％とした。 温度安定性：ｐＨ４における温度安定性は、図５の通り
である。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、酵素液を、
３０〜７０℃で３０分間加熱処理した後、後述する方法
で測定し、加熱処理しない場合の活性を１００％とし
た。

【００６４】以下に、本発明のうちホスホリパーゼＡ１
の使用について、更に説明するが、本発明は、これによ
ってなんら限定されるものではない。

【００６５】［実施例３］リゾリン脂質の製造 実施例２で調製した、アスペルギルス・ニガ−(A.nige
r) 由来ホスホリパーゼＡ１のリン脂質分解に対するｐ
Ｈの影響を調べるために、以下の試験を行った。下記の
実験番号1-A 及び2-A ５０ml及び塩化カルシウム０．２
ｇを１００ｍｌ容ビーカーに入れ、超音波ホモジナイザ
ーで十分に分散させた。３７℃で予備加温した後、実験
番号1-A 及び2-A に、それぞれ、実施例２で調製したホ
スホリパーゼＡ１ ９００単位を添加し、撹拌子で撹拌
しながら３７℃で、酵素反応を進行させた。酵素反応進
行中は、水分の蒸発を防ぐためビーカーにシーロンフィ
ルム（富士フィルム社製）をかぶせた。

【００６６】実験番号1-A ：水４５mlにSLP-ホワイト
（ツルーレシチン工業社製）５ｇを添加した１０％（w/
w ）懸濁液 実験番号2-A ：２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）４
５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加した１０％（w/w ）懸
濁液 反応開始時、１時間後、２時間後及び３時間後に反応液
を採取し、サンプル中の遊離脂肪酸を遊離脂肪酸定量試
薬デタミナーNEFA（協和メディクス社製）を用いて定量
した。見かけのリン脂質リゾ化率は、SLP-ホワイト中の
リン脂質の平均分子量を７６５であると仮定して、式 Ａ／Ｂｘ１００ Ａ：リゾリン脂質のモル数（酵素反応により遊離した脂
肪酸のモル数） Ｂ：基質リン脂質のモル数 を用いて求めた。その結果を表１に示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】アスペルギルス・ニガ−(A.niger) 由来の
ホスホリパーゼＡ１は、ｐＨ調整剤を使用しない場合で
も、優れたリン脂質リゾ化率を示した。

【００６９】［実施例４］リゾリン脂質の製造 後述する実施例８で調製した、アスペルギルス・オリゼ
（A.oryzae）由来ホスホリパーゼＡ１のリン脂質分解に
対するｐＨの影響を調べるために、以下の試験を行っ
た。

【００７０】下記の実験番号3-A 、4-A 、1-B 、2-B 及
び3-B ５０ml及び塩化カルシウム０．２ｇを１００ｍ
ｌ容ビーカーに入れ、超音波ホモジナイザーで十分に分
散させた。３７℃で予備加温した後、実験番号3-A 及び
4-A には、実施例８で調製したホスホリパーゼＡ１ ８
６５単位を、実験番号1-B 、2-B 及び3-B には、ブタ膵
臓由来ホスホリパーゼＡ２（シグマ社製）８６５単位を
それぞれ添加し、撹拌子で撹拌しながら３７℃で、酵素
反応を進行させた。酵素反応進行中は、水分の蒸発を防
ぐためビーカーにシーロンフィルム（富士フィルム社
製）をかぶせた。ただし、ブタ膵臓由来ホスホリパーゼ
Ａ２の活性はｐＨ８．０で測定した。

【００７１】実験番号3-A ：水４５mlにSLP-ホワイト
（ツルーレシチン工業社製）５ｇを添加した１０％（w/
w ）懸濁液 実験番号4-A ：２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）４
５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加した１０％（w/w ）懸
濁液 実験番号1-B ：水４５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加し
た１０％（w/w ）懸濁液 実験番号2-B ：２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．
０）４５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加した１０％（w/
w ）懸濁液 実験番号3-B ：水４５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加
し、酵素反応中のｐＨを７．５〜８．５に保持するため
適宜水酸化ナトリウムを添加した１０％（w/w ）懸濁
液。

【００７２】反応開始時、１時間後、２時間後及び３時
間後に反応液を採取し、サンプル中の遊離脂肪酸を遊離
脂肪酸定量試薬デタミナーNEFAを用いて定量した。

【００７３】見かけのリン脂質リゾ化率は、実施例３に
準じて求めた。その結果を表２に示す。

【００７４】

【表２】

【００７５】アスペルギルス・オリゼ(A.oryzae)由来ホ
スホリパーゼＡ１は、ｐＨ調整剤を使用しない場合で
も、ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２に比べて、優れたリン
脂質リゾ化率を示した。

【００７６】また、実験番号3-A の見かけのリン脂質リ
ゾ化率及びｐＨの経時変化を図６に示す。

【００７７】［実施例５］熱処理による残存する酵素の失活 アスペルギルス・ニガー （A.niger ）から得られるホス
ホリパーゼＡ１ 下記の実験番号5-A に記載の懸濁液１０ｍｌ及び塩化カ
ルシウム０．０４ｇをビーカーに入れ、超音波ホモジナ
イザーで十分に分散させた。３７℃で予備加温した後、
実施例２のホスホリパーゼＡ１（１５１単位）を添加
し、撹拌子で撹拌しながら、３７℃で５時間酵素反応を
進行させた。

【００７８】実験番号5-A ：５ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
４．５）９ｍｌにSLP-ホワイト１ｇを添加した１０％
（w/w ）懸濁液。

【００７９】反応開始５時間後の見かけのリン脂質リゾ
化率は、９０％以上であった。

【００８０】酵素反応後、反応液約２ｇずつを数本の試
験管に分注し、水分が蒸発しないようにシーロンフィル
ム（富士フィルム社製）をかぶせて、５０〜８０℃で３
０分間放置した。

【００８１】各反応液中に残存するホスホリパーゼＡ１
活性は、後述する方法で測定し、熱処理しない反応液中
のホスホリパーゼＡ１活性に対する百分率で表した。そ
の結果を表３に示す。

【００８２】

【表３】

【００８３】ホスホリパーゼＡ１を使用した場合には、
８０℃で完全にその酵素活性を失活させることができ
た。

【００８４】［実施例６］熱処理による残存する酵素の失活 アスペルギルス・オリゼ （A.oryzae）から得られるホス
ホリパーゼＡ１ 下記の実験番号6-A 、7-A 、4-B 及び5-B に記載の懸濁
液５０ｍｌ及び塩化カルシウム０．２ｇを１００ｍｌ容
ビーカーに入れ、超音波ホモジナイザーで十分に分散さ
せた。３７℃で予備加温した後、実施例８のホスホリパ
ーゼＡ１ ２１６０単位又はブタ膵臓ホスホリパーゼＡ
２（シグマ社製）２１６０単位を添加し、撹拌子で撹拌
しながら、３７℃で５時間酵素反応を進行させた。

【００８５】実験番号6-A ：５ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
４．５）４５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加した１０％
（w/w ）懸濁液 実験番号7-A ：５ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）２５
ｍｌにSLP-ホワイト２５ｇを添加した５０％（w/w ）懸
濁液 実験番号4-B ：５ｍＭトリス- 塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）４５ｍｌにSLP-ホワイト５ｇを添加した１０％（w/
w ）懸濁液 実験番号5-B ：５ｍｌトリス- 塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２５ｍｌにSLP-ホワイト２５ｇを添加した５０％
（w/w ）懸濁液。

【００８６】反応開始５時間後の見かけのリン脂質リゾ
化率は、実験番号5-B 、即ち５０％SLP-ホワイトにブタ
膵臓ホスホリパーゼＡ２を作用させた系では、約６５％
であり、その他の系、即ち6-A 、7-A 及び4-B では９０
％以上であった。

【００８７】酵素反応５時間後に、各々の反応液約７ｇ
ずつを数本のソモギー（Somogyi ）試験管に分注し、水
分が蒸発しないようにシーロンフィルムをかぶせて、５
０〜８０℃で３０分間放置した。

【００８８】各反応液中に残存するホスホリパーゼＡ
１、Ａ２活性は、後述する方法で測定し、それぞれ熱処
理しない反応液中のホスホリパーゼＡ１、Ａ２活性に対
する百分率で表した。その結果を表４に示す。ただし、
ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２の活性は、ｐＨ８で測定し
た。

【００８９】

【表４】

【００９０】ホスホリパーゼＡ１を使用した場合には、
ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２を使用した場合に比べて、
低温で完全にその酵素活性を失活させることができた。

【００９１】［実施例７］ アスペルギルス・オリゼ （Aspergillus oryzae）からの
粗ホスホリパーゼＡ１の製造 アスペルギルス・ニガー（A.niger）の代わりに、アス
ペルギルス・オリゼ（A.oryzae）SANK 11870 株を用い
た以外は、実施例１と同様の操作を行って、ホスホリパ
ーゼＡ１を含む酵素サンプル１１．１ｇを得た。

【００９２】本酵素１ｇ当たりの主な酵素活性を表５に
示す。なお、各酵素活性は、後述する方法により測定し
た。

【００９３】［実施例８］ アスペルギルス・オリゼ （A.oryzae）からのホスホリパ
ーゼＡ１の製造 実施例７ の粗製ホスホリパーゼＡ１ １０ｇを用いた以
外は、実施例２と同様のアセトン分画操作を行って、第
２沈殿を得た。この第２沈殿を５０ｍＭ酢酸塩緩衝液
（ｐＨ５．５）５００ｍｌに溶かし、硫酸アンモニウム
３００ｇを加えて塩析した。遠心分離して得た沈殿を１
Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
５．５）に溶かし、不溶物を濾別した後、カラムクロマ
トグラフィー[ カラム：ブチルトヨパールパック650S
（Butyl Toyopearl pak 650S、東ソー社製、流出溶剤：
硫酸アンモニウム含有５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．
５）硫酸アンモニウム濃度、１〜０Ｍ；グラジェント溶
出] を実施した。硫酸アンモニウム濃度０．６Ｍ以下
で、ホスホリパーゼＡ１活性画分が溶出した。この画分
を脱塩、濃縮して、酵素サンプル４０ｍｇを得た。な
お、本酵素サンプルに含まれる２種類のホスホリパーゼ
Ａ１の分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定し、その値はそれぞれ３７，０００又は
３５，０００であり、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ電気泳動法で
求められた等電点はそれぞれｐＩ３．９又はｐＩ４．３
であった。

【００９４】本酵素１ｇ当たりの主な酵素活性を表５に
示す。なお、各酵素活性は、後述する方法により測定し
た。

【００９５】上記の実施例８において調製したホスホリ
パーゼＡ１は、リパーゼ活性をほとんど伴わないこと
（ホスホリパーゼＡ１活性の約０．１％以下）を確認し
た。

【００９６】更に、本酵素０．０２３６単位を（Ｉ）２
位のパルミトイル基を¹⁴Ｃ（NEN 社,NEC 764 ）で標識
したＬ−α- ジパルミトイルホスファチジルコリン（１
mCi/mmole ）０．１μmole、及び（ＩＩ）１−及び２−
位のパルミトイル基を¹⁴Ｃ（NEN 社,NEC 682 ）で標識
したＬ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（２
mCi/mmole ）０．１μmoleに添加し１０分間反応させ
た。その際の最終反応液は90μl であった。その結果、
１と２位のパルミトイル基が¹⁴Ｃ標識されたホスファチ
ジルコリンからのみ¹⁴C 標識されたパルミチン酸が遊離
し、本酵素が１−アシル基のみに作用していることを確
認した。

【００９７】以下に実施例８において調製したホスホリ
パーゼＡ１の酵素の特性を示す。

【００９８】作用至適ｐＨ：通常の活性測定系での作用
最適ｐＨは、図１に示すようにｐＨ３．２乃至５であ
る。 ｐＨ安定性：ｐＨ安定性は図３に示すようにｐＨ３乃至
８．５である。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、０．
２Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ３．２〜６．５）及び０．０１
Ｍトリス- 塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜９．０）を用い
て、１（w/v ）％酵素液を調製し、３７℃で６０分間放
置した後、後述する方法で測定し、ｐＨ５．５におい
て、３７℃で６０分間放置した場合の活性を１００％と
した。

【００９９】作用至適温度：作用最適温度は、図４に示
すように５０℃乃至６０℃である。なお、３７℃での活
性を１００％とした。 温度安定性：ｐＨ４における温度安定性は、図５に示す
ように３０℃乃至５５℃である。なお、ホスホリパーゼ
Ａ１活性は、酵素液を、３０〜７０℃で３０分間加熱処
理した後、後述する方法で測定し、加熱処理しない場合
の活性を１００％とした。

【０１００】実施例で調製した酵素サンプルの主な酵素
活性は、以下の方法により測定した。

【０１０１】ホスホリパーゼＡ1 活性試験 ２．０(w/v) ％SLP-ホワイト（ツルーレシチン工業社
製）及び４(v/v) ％トライトン(Triton)Ｘ−１００水溶
液０．５ｍｌに、０．１Ｍ塩化カルシウム０．０５ｍｌ
０．２Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）０．２５ｍｌを
加えた。次いで、酵素液０．１ｍｌを加えて撹拌して均
一にして、３７℃で静置し、１０分間酵素反応を行っ
た。その後、１Ｎ塩酸０．１ｍｌを加えて、酵素反応を
停止させた。反応液０．０２ｍｌを採り、遊離脂肪酸定
量試薬デタミナーNEFA（協和メディクス社製）を用い
て、遊離脂肪酸を定量した。酵素反応１分当たり脂肪酸
１μモルを生成させる酵素活性を１単位と定義した。

【０１０２】リパーゼ活性試験 ２．０(w/v) ％オリーブ油（和光純薬工業社製）エマル
ジョン[ オリーブ油０．２ｇに０．５ｍ１５(w/w) ％ア
ラビアゴム水溶液１０ｍｌを加え、超音波ホモジナイザ
ーで５分間分散させたもの］０．５ｍｌに０．１Ｍ塩化
カルシウム０．０５ｍｌと０．２Ｍ７酢酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）０．２５ｍｌを加えた。次いで、酵素液０．
１ｍｌを加えて、撹拌して均一にして、３７℃で静置
し、１０分間酵素反応を行った。その後、１Ｎ塩酸０．
１ｍｌを加えて、酵素反応を停止させた。反応液０．０
２ｍｌを採り、遊離脂肪酸定量試薬デタミナーNEFAを用
いて、遊離脂肪酸を定量した。酵素反応１分当たり脂肪
酸１μモルを生成させる酵素活性を１単位と定義した。

【０１０３】アミラーゼ（糖化型）活性試験 試験管に、基質[ 可溶性デンプン２ｇに水２０ｍｌ( 適
当量) を加えて加熱溶解し、冷却した後、０．２Ｍ酢酸
塩緩衝液（ｐＨ４．５) を２０ｍｌ加え、さらに水を加
えて50mlに調製したもの］５ｍｌを入れ、３７℃恒温水
槽にて予備加温した後、酵素液０．２５ｍｌを添加し
た。３０分間の酵素反応の後、０．５Ｎ水酸化ナトリウ
ム０．２５ｍｌを加えて反応停止させた。これを酵素反
応液とし、ソモギーネルソン（Somogyi-Nelson）還元糖
測定法（J.Biol.Chem.,160,61-68(1945)、J.Biol.Che
m.,153,375-380(1944)）を用いて、酵素反応によって生
じた還元糖を定量した。酵素反応１分当たりグルコース
１μモル相当量の還元糖を生成させる酵素活性を１単位
と定義した。

【０１０４】プロテアーゼ活性試験 萩原の方法（酵素研究法２ 朝倉書店,237-246(1956)）
により測定した。なお、基質のｐＨは３．０（酸性プロ
テアーゼ) 又は７．０（中性・アルカリ性プロテアー
ゼ) とした。酵素活性の単位は、ノースロプ（Northro
p,J.Gen.Physiol.,16，41(1932)）およびアンソン（Ans
on,J.Gen.Physiol.,22,79 (1938) ）に準じて基準条件
下で１分間にチロシン（tyrosine）１μg 相当量の２７
５ｎｍにおける吸収を示す非蛋白性物質を生成する酵素
活性を１単位と定義した。

【０１０５】

【表５】

【０１０６】＊ ：リン脂質からの脂肪酸遊離活性 ＊＊：測定下限（１０単位）以下

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２（○）及び実施例８（●）のホスホリ
パーゼＡ１のｐＨ活性曲線（トライトンＸ−１００存在
下）

【図２】実施例２（○）のホスホリパーゼＡ１のｐＨ活
性曲線（トライトンＸ−１００不存在下）

【図３】実施例２（○）及び実施例８（●）のホスホリ
パーゼＡ１のｐＨ安定性

【図４】実施例２（○）及び実施例８（●）のホスホリ
パーゼＡ１の温度活性曲線

【図５】実施例２（○）及び実施例８（●）のホスホリ
パーゼＡ１の温度安定性

【図６】実施例８のホスホリパーゼＡ１による見かけの
リン脂質リゾ化率（●）及びｐＨ（○）の経時変化

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:685） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (29)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リン脂質を加水分解し、リゾリン脂質を生
   成する作用を有し、作用至適ｐＨが４．０乃至５．０で
   あり、作用至適温度が５０℃乃至６０℃であり、分子量
   が３２，０００であり、等電点がｐＩ３．０である、酸
   性ホスホリパーゼＡ１。
2. 【請求項２】ｐＨ２．５乃至６．０の活性領域を有す
   る、請求項１記載の酸性ホスホリパーゼＡ１。
3. 【請求項３】４５℃乃至９０℃の安定上限温度を有す
   る、請求項１又は２記載の酸性ホスホリパーゼＡ１。
4. 【請求項４】５５℃以下の温度安定性を有する、請求項
   １乃至３のいずれか一つに記載の酸性ホスホリパーゼＡ
   １。
5. 【請求項５】アスペルギルス（Aspergillus）属の糸状
   菌が生産する、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の
   酸性ホスホリパーゼＡ１。
6. 【請求項６】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus ni
   ger）が生産する、請求項５記載の酸性ホスホリパーゼ
   Ａ１。
7. 【請求項７】アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus or
   yzae）が生産する、請求項５記載の酸性ホスホリパーゼ
   Ａ１。
8. 【請求項８】リン脂質を、請求項１乃至７のいずれか一
   つに記載の酸性ホスホリパーゼＡ１で処理することを特
   徴とする、リゾリン脂質の製造法。
9. 【請求項９】リン脂質を加水分解し、リゾリン脂質を生
   成する作用を有し、作用至適ｐＨが４．０乃至５．０で
   あり、作用至適温度が５０℃乃至６０℃であり、分子量
   が３０，０００乃至４０，０００であり、等電点がｐＩ
   ２．８乃至４．５である、酸性ホスホリパーゼＡ１。
10. 【請求項１０】分子量が３２，０００乃至３７，０００
    である、請求項９記載の酸性ホスホリパーゼＡ１。
11. 【請求項１１】分子量が３２，０００である、請求項９
    又は１０記載の酸性ホスホリパーゼＡ１。
12. 【請求項１２】等電点がｐＩ３．０乃至４．３である、
    請求項９乃至１１のいずれか一つに記載の酸性ホスホリ
    パーゼＡ１。
13. 【請求項１３】等電点がｐＩ３．０である、請求項９乃
    至１２のいずれか一つに記載の酸性ホスホリパーゼＡ
    １。
14. 【請求項１４】ｐＨ２．５乃至６の活性領域を有する、
    請求項９乃至１３のいずれか一つに記載の酸性ホスホリ
    パーゼＡ１。
15. 【請求項１５】４５℃乃至９０℃の安定上限温度を有す
    る、請求項９乃至１４のいずれか一つに記載の酸性ホス
    ホリパーゼＡ１。
16. 【請求項１６】５５℃以下の温度安定性を有する、請求
    項９乃至１５のいずれか一つに記載の酸性ホスホリパー
    ゼＡ１。
17. 【請求項１７】アスペルギルス（Aspergillus）属の糸
    状菌が生産する、請求項９乃至１６のいずれか一つに記
    載の酸性ホスホリパーゼＡ１。
18. 【請求項１８】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
    niger）が生産する、請求項１７記載の酸性ホスホリパ
    ーゼＡ１。
19. 【請求項１９】アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
    oryzae）が生産する、請求項１７記載の酸性ホスホリパ
    ーゼＡ１。
20. 【請求項２０】リン脂質を、請求項９乃至１９のいずれ
    か一つに記載の酸性ホスホリパーゼＡ１で処理すること
    を特徴とする、リゾリン脂質の製造法。
21. 【請求項２１】 リン脂質を加水分解し、リゾリン脂質を
    生成する作用を有し、作用至適ｐＨが、４．０乃至５．
    ０であり、作用至適温度が、５０℃乃至６０℃であり、
    分子量が３７，０００であり、等電点がｐＩ３．９であ
    る、酸性ホスホリパーゼＡ１。
22. 【請求項２２】 リン脂質を加水分解し、リゾリン脂質を
    生成する作用を有し、作用至適ｐＨが、４．０乃至５．
    ０であり、作用至適温度が、５０℃乃至６０℃であり、
    分子量が３５，０００であり、等電点がｐＩ４．３であ
    る、酸性ホスホリパーゼＡ１。
23. 【請求項２３】 ｐＨ２．５乃至６．０の活性領域を有す
    る、請求項２１又は２２に記載の酸性ホスホリパーゼＡ
    １。
24. 【請求項２４】 ４５℃乃至９０℃の安定上限温度を有す
    る、請求項２１乃至２３のいずれか一つに記載の酸性ホ
    スホリパーゼＡ１。
25. 【請求項２５】 ５５℃以下の温度安定性を有する、請求
    項２１乃至２４のいずれか一つに記載の酸性ホスホリパ
    ーゼＡ１。
26. 【請求項２６】 アスペルギルス（Aspergillus）属の糸
    状菌が生産する、請求項２１乃至２５のいずれか一つに
    記載の酸性ホスホリパーゼＡ１。
27. 【請求項２７】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
    niger）が生産する、請求項２６記載の酸性ホスホリパ
    ーゼＡ１。
28. 【請求項２８】 アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
    oryzae）が生産する、請求項２６記載の酸性ホスホリパ
    ーゼＡ１。
29. 【請求項２９】 リン脂質を、請求項２１乃至２８のいず
    れか一つに記載の酸性ホスホリパーゼＡ１で処理するこ
    とを特徴とする、リゾリン脂質の製造法。