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Die
Erfindung betrifft ein gereinigtes proteolytisches Enzym und ein
Verfahren zur Reinigung eines proteolytischen Enzyms, insbesondere
von Trypsin.
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Die
handelsüblichen
Proteasen, insbesondere handelsübliches
Trypsin, enthält
selbst nach Reinigung durch Spezialbehandlung, beispielsweise durch
doppelte Kristallisation, Restlipasen, insbesondere die Phospholipase
A2, die gegenüber
der thermischen Deaktivierung besonders resistent ist, der man die
Protease nach ihrer Verwendung in einem Hydrolyseprozess unterzieht.
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Bei
der Herstellung von Proteinhydrolysaten, die insbesondere für die Zusammensetzung
von Kleinkinderprodukten bestimmt sind, verwendet man gewöhnlich Trypsin.
Um den Proteinanteil in ein fertiges Produkt, beispielsweise eine
Kleinkindermilch, einzugliedern, muss die gesamte lipolytische enzymatische
Restaktivität,
die von dem Proteinhydrolysat kommt, beseitigt werden. Dies ist
erforderlich, um das Auftreten von Abbauprodukten von Lecithin,
das man der endgültigen
Formulierung aus technologischen Gründen, beispielsweise zur Verbesserung
der Benetzbarkeit der Pulver zusetzt, als Lysolecithin insbesondere
während
der Lagerung zu vermeiden. Derartige Abbauprodukte können sich
sowohl in den flüssigen
Produkten als auch in den Pulvern im Auftreten von Stabilitäts- oder
organoleptischen Fehlern, beispielsweise Flecken, schlechter Geschmack,
oder in ihrer Toxizität äußern, die
zu Nebenwirkungen, beispielsweise entzündlicher Art bei Säuglingen,
führen
kann.
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Nun
ist jedoch die vollständige
Beseitigung insbesondere der Phospholipasen schwer durchzuführen. Die
vollständige
Reinigung der Proteasen erfordert im Allgemeinen verschiedene Schritte
der Ausfällung,
chromatografische Trennungen, thermische Behandlungen unter genau
bestimmten Bedingungen oder Inaktivierungen auf chemischem Weg.
Die vollständige
Entfernung der Phospholipase A2, die sehr wärmeresistent ist, erfordert
eine anhaltende Wärmebehandlung,
die leider auch die Protease beeinträchtigt.
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Ziel
der Erfindung ist die Herstellung einer gereinigten Protease, deren
proteolytische Aktivität
quantitativ und qualitativ beibehalten wird, die aber frei von lipolytischer
Aktivität,
insbesondere von Phospholipase A2, ist, durch ein einfaches und
wirtschaftliches Verfahren.
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Man
kennt ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Trypsin, das
beispielsweise in US-A-3886043 beschrieben wird und bei dem man
die Chromatographie einer Pufferlösung von kristallisiertem Trypsin
durch Passage über
ein Harz vornimmt, das aus Dextrangel mit gepfropften Sulfongruppen
besteht, um die verschiedenen aktiven Formen von Schweinetrypsin
zu trennen.
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Ferner
kennt man die Herstellung von lipasefreiem mikrobiellen Lab beispielsweise
mit Hilfe des in US-A-4136201 beschriebenen Verfahrens durch Kultur
von Mucor miehei auf einem geeigneten Nährmedium.
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Die
Erfindung betrifft eine gereinigte proteolytische enzymatische Zubereitung,
die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Phospholipase A2-Restaktivität von höchstens
20 mU/g reinem Enzym besitzt, das durch Analyse mit Hilfe von Hoch leistungschromatographie
der Phospholipide nach Inkubation mit einer Kleinkinderformulierung
nachweisbar ist, deren Phospholipase A2-Aktivität nicht nachweisbar ist, und
dass ihre Protease-Aktivität
auf mindestens 75% der Anfangsaktivität des Enzyms gehalten wird.
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Die
Messungen der enzymatischen Aktivitäten werden in den nachstehenden
Beispielen ausführlich beschrieben.
Insbesondere versteht man unter "nicht
nachweisbar" eine
Phospholipase A2-Restaktivität < 6 mU/g Enzym.
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Das
Enzym kann jede Protease pflanzlichen, mikrobioellen oder tierischen
Ursprungs oder biogenetischen Ursprungs sein. Vorzugsweise ist es
eine Protease tierischen Ursprungs, wie Pancreatin, insbesondere vom
Schwein stammendes Trypsin.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass:
- 1) man den
pH-Wert einer Lösung
der Protease auf einen Wert zwischen 6 und 9 einstellt und dass
man die Lösung
während
mindestens 15 min und höchstens
120 min auf diesem pH-Wert und auf 20–35°C hält, so dass die proteolytische
Aktivität
der Protease verwendet wird, um die lipolytische Aktivität der Lipasen und
der Phospholipasen des Reaktionsmediums zu zerstören, und
- 2) man den pH-Wert der Lösung
auf einen Wert kleiner als oder 3,5 senkt, wobei die Reihenfolge
der vorhergehenden Schritte 1) und 2) umgekehrt werden kann.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform,
die auch die Entfernung der Spuren von anderen Restlipasen als Phospholipase
A2 gestattet, umfasst das Verfahren einen Endschritt der thermi schen
Behandlung vorzugsweise durch UHT. Auf diese Weise werden die Spuren
von wärmeempfindlichen
Lipasen entfernt.
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Die
Einstellung des pH-Werts auf den alkalischen Bereich zu findet vorzugsweise
vor dem Absenken des pH-Werts in den sauren Bereich statt, da man
auf diese Weise die Verwendung der Protease aufschieben kann. Bei
der Variante, bei der die beiden Schritte miteinander vertauscht
werden, muss man die Protease unmittelbar nach der Behandlung verwenden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführung
setzt man dem Reaktionsmedium ein in ihm lösliches Magnesiumsalz zu, und
zwar vorzugsweise zu Beginn der Reaktion, was die Stabilisierung
der Proteasen gestattet und gleichzeitig den Abbau der Phospholipasen
begünstigt.
Vorzugsweise setzt man Magnesiumchlorid in einer Menge von 10 bis
200 mM/l Reaktionsmedium, beispielsweise 50 bis 100 mM/l Reaktionsmedium,
zu.
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Die
Konzentration an reiner Protease in der Lösung vor Behandlung kann zwischen
0,5 und 6 Gew.-% und vorzugsweise etwa 2,5 Gew.-% betragen.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittels
für Kleinkinder
auf der Grundlage von Proteinhydrolysat, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man ein Molkeprodukt enzymatisch mit Hilfe einer oben
beschriebenen gereinigten Protease hydrolysiert, dass man das Hydrolysat
mit 75–85°C/3–5 min behandelt,
dass man flüssiges
Fett und Mineralstoffe zusetzt, dass man eine UHT-Behandlung bei
125–135°C/2–3 min vornimmt
und dass man dann Kohlenhydrate, Vitamine und Oligoelemente zusetzt,
dass man das flüssige
Produkt durch UHT sterilisiert und keimfrei verpackt.
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Gemäß einer
Abwandlung dieses Verfahrens trocknet man die Flüssigkeit insbesondere durch Sprühtrocknung
nach einer UHT-Sterilisierungsbehandlung.
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Das
erfindungsgemäße gereinigte
Enzym kann außerhalb
des Nahrungsmittelbereichs in den Anwendungsbereichen der Proteasen
verwendet werden, beispielsweise bei der Herstellung einer Nährzusammensetzung,
einer kosmetischen Zusammensetzung oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
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In
diesem Zusammenhang kann man beispielsweise entzündungshemmende Anwendungen,
die Behandlung von Verdauungsstörungen,
die Behandlung von Thrombosen, die Versorgung von Wunden und Verletzungen
und die Entfernung von nekrotisiertem Gewebe nennen.
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Die
nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
In ihnen beziehen sich die Anteile und Prozentsätze auf das Gewicht, außer wenn
es anders angegeben ist.
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Beispiel 1
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Man
bringt 1 kg handelsübliches
Schweinetrypsin 6.0 S (Novo, Dänemark)
in 10 kg entmineralisiertem Wasser mit 25°C unter Rühren in einem Behälter in
Lösung,
wobei die Proteasekonzentration 9,1% und der Anfangs-pH-Wert 5 beträgt. Um sicherzugehen,
dass man keine nicht gelöste
Protease in den folgenden Schritt überträgt, überträgt man die Lösung in
einen neuen Behälter.
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Man
setzt eine verdünnte
wässrige
NaOH-Lösung
zu 1 M/l zu, um den pH-Wert der Lösung auf 8 einzustellen. Man
hält den
pH-Wert während 15
min durch Zusatz, je nach Bedarf, der vorhergehenden wässrigen NaOH-Lösung beispielsweise
mit Hilfe eines pH-stats unter Rühren
konstant, um die Phospholipasen zu hydrolisieren.
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Nach
dieser Behandlung stabilisiert man die Proteasen, d.h. das Trypsin
und das Chymotrypsin, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediums
durch Zusatz einer wässrigen
HCl-Lösung
zu 1 M/l auf 3 senkt. Man kann die Proteasenlösung sofort in einer Hydrolysereaktion
verwenden oder sie beispielsweise bei –25°C zum Zweck einer aufgeschobenen
Verwendung zwischenlagern.
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Die
nachstehenden Analysen zeigen die enzymatische Aktivität des erfindungsgemäß erhaltenen
gereinigten proteolytischen Enzyms im Vergleich mit derjenigen des
handelsüblichen
kristallisierten Ausgangsenzyms (Trypsin PTN 6.0 S, Novo, Dänemark),
das nicht der erfindungsgemäßen Behandlung
unterzogen wurde:
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1. Bestimmung der Phospholipasen:
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- 1.1 Bestimmung der Phospholipase A2 durch die
Radioisotopenmethode.
Die Methode beruht auf der Spaltung von
Phosphatidylcholin (C14-Dioleyl) durch die Phospholipase A2 und der
punktuellen radiometrischen Erfassung der markierten Fraktionen
nach chromatografischer Trennung.
- 1.2 Bestimmung der gesamten Phospholipasen durch Titrimetrie.
Die
Methode ist nicht für
die Phospholipase A2 spezifisch und erfasst alle Phospholipasen.
Sie beruht auf der Titrierung der Fettsäuren, die aus den Eigelb-Phospholipiden
(FLuka, Buchs, Schweiz) durch die Phospholipasen bei pH 8 (durch
pH-stat gehalten) und bei konstanter Temperatur von 40°C mit 1,4
mM Natriumdeoxycholat und 3 mM CaCl2 freigesetzt werden. Man verwendet
2 g gereinigtes Eigelb-Phospholipid mit Zusatz von 250 mG Puteneiweiß-Trypsin-Hemmer
(Sigma, St. Louis, USA) auf 1 g Trypsin.
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2. Bestimmung von Lipase
und Esterase:
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- 2.1 Man bestimmt die Aktivität der Lipasen
durch Titrimetrie unter Verwendung von Olivenöl als Substrat in einer Menge
von 100 g/l bei konstantem pH von 8,9 (pH-stat) in Gegenwart von
1,25 g/l Taurocholat und 82,5 g/l Gummi Arabicum.
- 2.2 Man bestimmt die Aktivität
der Esterasen unter Verwendung der vorhergehenden Methode (2.1),
wobei jedoch mittelkettige Triglyceride (MCT) als Substrat genommen
werden.
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3. Bestimmung der Proteasen:
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- 3.1 Bei Trypsin verwendet man die Methode,
die von Erlanger u. Mitarb. in Arch. Biochem. Biophys. 95, 271–278, beschrieben
wird.
- 3.2 Bei Chymotrypsin verwendet man die Methode von US Pharmacopeia
XXI (1985).
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Die
Ergebnisse der Analysen von Aktivitäten bei der Enzymzubereitung
sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt:
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Man
stellt fest, dass die Behandlung eine beträchtliche Verringerung der Aktivität der anderen
Enzyme als den Proteasen und insbesondere die Beseitigung derjenigen
der Phospholipase A2 gestattet, wobei die proteolytische Aktivität qualitativ
und quantitativ unberührt
gelassen wird, insbesondere das Gleichgewicht zwischen Trypsin (93%
Aktivität
bezüglich
des nicht behandelten Enzyms) und Chymotrypsin (86% Aktivität bezüglich des
nicht behandelten Enzyms).
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Beispiel 2
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Man
bringt 1 kg handelsübliches
Schweinetrypsin 6.0 S (Novo, Dänemark)
in 10 kg entmineralisiertem Wasser mit 25°C unter Rühren in einem Behälter in
Lösung,
wobei die Proteasekonzentration 9,1% und der Anfangs-pH-Wert 5 beträgt. Um sicher
zu sein, dass keine nicht gelöste
Protease in den nächsten Schritt
befördert
wird, überträgt man die
Lösung
in einen neuen Behälter.
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Man
setzt 224 g Magnesiumchlorid (MgCl2·6H2O) zu, man stellt den
pH-Wert in 15 min mit einer verdünnten
wässrigen
NaOH-Lösung zu
1 M/l auf 8,5 ein. Man lässt
das Medium während
120 min bei 25°C
ohne pH-Kontrolle reagieren, um die Phospholipasen zu hydrolysieren.
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Nach
dieser Behandlung stabilisiert man die Proteasen, d.h. das Trypsin
und das Chymotrypsin, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediums
durch Zusatz einer wässrigen
HCl-Lösung
zu 1 M/l auf 3 senkt, und lässt
die Lösung
während
16 h bei 4°C
ruhen. Die gereinigte Trypsinlösung
ist nun verwendungsbereit.
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Man
stellt fest, dass die relative Aktivität des Trypsins 93% der Ausgangsaktivität beträgt und dass
die relative Aktivität
des Chymotrypsins 86% der Ausgangsaktivität beträgt.
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Beispiel 3
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Man
verwendet die gereinigte enzymatische Zubereitung von Beispiel 2
zur Herstellung einer hypoallergenen Kleinkinderformulierung. Man
nimmt die Hydrolyse von Molkeproteinen vor und behandelt das Hydrolysat
dann mit 75–85°C/3–5 min,
setzt Fett und Mineralstoffe zu, nimmt eine UHT-Behandlung mit 125°C/2 min vor
und setzt dann Maltodextrin und Vitamine zu, sterilisiert durch
UHT mit 148°C/5
s und verpackt das flüssige
Produkt keimfrei.
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Zum
Testen der enzymatischen Restaktivität setzt man 10 ml gereinigte
Trypsinlösung
gemäß Beispiel 1
zu 100 ml der vorhergehenden flüssigen
Kleinkinderformulierung zu, deren Akti vität der Phospholipase A2 < 6 mU/g Trypsin
ist. Nach Mischung reduziert man die Aktivitäten der Lipase und der Esterase
durch eine Wärmebehandlung
mit 75–85°C/3–5 min im
Wasserbad. Nach Abkühlen
auf Umgebungstemperatur setzt man 55 mg Natriumazid zu und inkubiert
die Lösung
mit 40°C/4
Tage. Nach Inkubation analysiert man die Zusammensetzung der Phospholipide
durch Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) und berechnet die Aktivität
der Phospholipase A2, ausgedrückt
in mU/100 g Produkt (mU PL-A2) ausgehend von den Konzentrationsdifferenzen
der Lysophospholipide gemäß der Formel:
mit LPC
= Lysophosphatidylcholin und LPE = Lysophosphatidyl
sowie diesen
Wert bezogen auf die Konzentration von reinem Trypsin in g/100 g,
d.h. mU PL-A2/g reines Trypsin.
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Man
ermittelt auch den Abbau des Trypsins und des Chymotrypsins in %
bezüglich
der Anfangsaktivität
sowie den Abbau der Phospholipide nach 9 Monaten Lagerung bei 20°C in % der
Ausgangsphospholipide.
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Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt:
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Beispiel 4
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Man
stellt ein Kleinkinderprodukt wie in Beispiel 3 her, wobei man jedoch
der flüssigen
Mischung vor ihrer Sprühtrocknung
ein Phospholipid zusetzt. Man stellt fest, dass die Aktivität der Phospholipasen
stark mit dem Abbau der Phospholipide des Produkts verbunden ist.
Große
Chargenvolumen, eine unterbrochene Produktion, kombiniert mit einer
hohen Aktivität
der Phospholipasen, zersetzt die Phospholipide bis zu einem gewissen
Grad, bevor das Produkt getrocknet ist. Die Produkte, die das erfindungsgemäß gereinigte
Trypsin enthalten, zeigen einen deutlich geringeren Abbau der zugesetzten
Phospholipide, je nach der Gesamtmenge der in der Formulierung zugesetzten
Phospholipide, von < 1%,
während
er 20 bis 90% beträgt,
wenn man dasselbe Trypsin ohne erfindungsgemäße Reinigungsbehandlung verwendet.
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Außerdem hat
die Analyse der Restproteine durch SDS-PAGE und die Analyse der
immunologisch aktiven Antigene durch ELISA keine signifikanten Differenzen
durch Verwendung von erfindungsgemäß gereinigtem Trypsin bezüglich einer
Produktion mit nicht gereinigtem Trypsin gezeigt.
