JPH01215286A - 酵素の改質方法および油脂の加水分解方法 - Google Patents

酵素の改質方法および油脂の加水分解方法

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JPH01215286A
JPH01215286A JP63038632A JP3863288A JPH01215286A JP H01215286 A JPH01215286 A JP H01215286A JP 63038632 A JP63038632 A JP 63038632A JP 3863288 A JP3863288 A JP 3863288A JP H01215286 A JPH01215286 A JP H01215286A
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中田 正秀
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はキャンディダ・シリンドラセ(Candida
91土I工肛旦り−より得られるリパーゼ(以下単にキ
ャンディダ・シリンドラセリパーゼと略す)を酸で処理
する酵素の改質方法に関する。
また、本発明は油脂を前記リパーゼにより加水分解する
方法に関する。
〔従来の技術〕
従来、油脂工業においては油脂の加水分解を高温高圧下
で行う方法がとられていたが、最近では高度不飽和脂肪
酸など熱に対して不安定な物質の製造に、常温常圧での
酵素法が行われるようになってきた。例えば特開昭58
−205499号、特開昭57−170193号などが
挙げられる。これら高度不飽和脂肪酸はアラキドン酸、
エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸など、その
生理活性が注目され、医薬品あるいはその前駆体として
有望なものと考えられている。
酵素法による油脂の加水分解には、キャンディダ・シリ
ンドラセリパーゼ、膵臓リパーゼ、リゾプスリパーゼな
ど種々のものが用いられている。
〔発明が解決しようとする課題〕
工業的に酵素を用いるためには、安価で大量に入手でき
るものが必要であるが、現在までに市販されているリパ
ーゼはキャンディダ・シリンドラセリパーゼ以外は、い
ずれも高価であり、また大量に生産することが困難なも
のである。従ってキャンディダ・シリンドラセリパーゼ
が最も工業的なコストに適したものと言えるのであるが
、従来このリパーゼはトリグリセリドの3つの結合、即
ちSn−1位、2位、3位のエステル結合をすべて加水
分解する酵素として知られていた。従って位置特異性は
示さないと言われてい゛た。
高度不飽和脂肪酸はトリグリセリドのSn−2位に多く
存在するため、これらの化合物をより高濃度で得るには
Sn−2位のみを加水分解し、遊離型としてこれらの物
を取り出す方法と、Sn−1位、3位のみを加水分解し
てグリセリド型で濃縮する方法が考えられる。しかしな
がら通常のキャンディダ・シリンドラセリパーゼでは、
これらの位置特異的な加水分解ができないという問題点
があった。
本発明の目的は、キャンディダ・シリンドラセリパーゼ
を改質すること、また、キャンディダ・シリンドラセリ
パーゼを用いて高度不飽和脂肪酸を位置特異的に加水分
解する方法を提供することである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明の第1の発明は、ギャンディダ・シリンドラセリ
パーゼを酸で処理することを特徴とする1、3−ジグリ
セリドリパーゼ活性を有する酵素への改質方法であり、
第2の発明は、油脂にキャンディダ・シリンドラセリパ
ーゼを用いてpl(3〜5の酸性下で加水分解反応を行
い、トリグリセリドのSn−1位およびSn−3位のエ
ステル結合を特異的に分解することを特徴とする油脂の
分解方法である。
本発明に用いるキャンディダ・シリンドラセを培養して
得られるリパーゼは、市販のリパーゼ等を用いることが
でき、例えばリパーゼOF(名糖産業■製、キャンディ
ダ・シリンドラセの培養液をアセトン処理して得られる
酵素粉末)等を好ましく挙げることができる。
キャンディダ・シリンドラセリパーゼを精製すると、2
−モノグリセリドリパーゼと1.3−ジグリセリドリパ
ーゼの2種の酵素が得られる。また、この2種の酵素の
性質を調べたところ、2−モノグリセリドリパーゼは酸
に弱<、pH1〜5の範囲で処理すると容易に失活する
ことが明らかとなった。また同じ条件下では1.3−ジ
グリセリドリパーゼは全く失活しない。すなわち、位置
特異性を示さないリパーゼを酸で処理すると、1.3−
ジグリセリドのみを加水分解する酵素に改質することが
できる。
本発明で用いられる酸は、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リ
ン酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸などの酸や、ギ
酸−ギ酸ナトリウムバッファー、塩酸−塩化カリウムバ
ッファ−1酢酸−酢酸ナトリウムバッファー、クエン酸
−クエン酸ナトリウムバッファー、グリシン−塩酸バッ
ファー、塩酸−塩化カリウムバソフア−等の緩衝液が挙
げられる。これらの酸性水溶液はpHが1〜5であるこ
とが好ましい。pHが1より小さいと酵素活性が害され
るおそれがあり、またpiが5を越えるとSn−2リパ
ーゼの失活が不十分となり、Sn−1,3リパーゼの位
置特異性が悪くなる。
酵素の酸性水溶液に対する割合は0.1から30重量パ
ーセントの間であるが、好ましくは1〜10重量パーセ
ントの範囲である。
処理温度は目的とする1、3−ジグリセリドリパーゼが
失活しないように、1〜5℃の範囲で行うことが好まし
い。
処理時間は1〜10時間で十分である。
酸処理を終えた酵素液は水酸化す、トリウムでpH7,
0に中和し、48時間の透析により脱塩してから凍結乾
燥して、改質酵素が得られる。本発明は安価で工業的コ
ストに適しており、従来、位置特異性を示さなかったキ
ャンディダ・シリンドラセリパーゼを、そのpH依存性
を利用して位置特異性を発現させることができる。
また、本発明は、この位置特異性を発現する条件下で油
脂を加水分解して、目的の脂肪酸を効率的に得る方法で
ある。本発明に用いる油脂は、動物性油、植物性油のい
ずれも使用可能であり、例えば牛脂、肝脂、魚油、大豆
油、コーン油、月見草油、オリーブ油等が挙げられ、特
に生理活性のある高度不飽和酸を含む魚油、オリーブ油
、月見草油などが好ましい。
本発明において油脂を加水分解する場合、市販のキャン
ディダ・シリンドラセリパーゼをそのまま用いる場合は
pH3〜5の酸性下で行うのが好ましく、pHが3より
小さいと油脂の加水分解性が低下し、またpHが5を超
えるとSn−2リパーゼの失活が不十分となり、Sn−
1,3位の特異的分解性が低下する。反応においてpH
を3〜5に保つために用いる酸は、前記の酸およびバッ
ファー液が使用できる。基質に用いる油脂により固有の
最適pHを示すので、あらかじめ、この最適pHを測定
しておいてから、上記の酸のうち適したものを1種選ん
で用いる。
なお、本発明の第1の発明で得た改質酵素を用いて油脂
を分解する場合は、中性または弱酸性で反応させるのが
好ましい。アルカリサイドでは酵素が失活して使用でき
ない。
酵素の添加量は油脂1gに対して0.01■〜50■、
好ましくは0.1〜10■であり、反応温度は10℃か
ら50℃の範囲で行われるが、好ましくは20から40
℃の間が良い。
この反応は水と油の2層系で行われるので、十分な攪拌
が必要である。通常100から50Or、p、m。
の範囲で行われる。
高度不飽和脂肪酸が空気と接触して酸化するのを防ぐた
め窒素バブリングにより空気を追い出しながら行う。
反応時間は通常1〜5時間の範囲内で行われる。
〔発明の効果〕
本発明の改質方法によれば、位置特異性を全く示さない
市販のリパーゼから、油脂のSn−1位、および3位に
特異的に反応する1、3−ジグリセリドリパーゼを選択
的に得ることができる。
また本発明の油脂の加水分解方法によれば市販のリパー
ゼを用いてトリグリセリドのSn−1位およびSn−3
位のエステル結合を特異的に分解することができるので
、天然油脂から生理活性の強い高度不飽和脂肪酸を分離
ta縮したり、所望の2−モノグリセリドを得ることが
できる。
(実施例) 以下、実施例と比較例に基づき本発明を具体的に説明す
る。
実施例1 0.5Mのグリシン−塩酸バッファー、pH3,0,1
00−にキャンディダ・シリンドラセリパーゼリパーゼ
(名糖産業側製品、リパーゼOF)5gを4°Cで溶解
し、4℃で5時間放置する。その後0.1規定の水酸化
ナトリウムでPH7,0に中和し、4℃の水中で48時
間透析して塩とバッファーを除く。
これを凍結乾燥すると約5gの改質酵素が得られる。次
にこの酵素5■を5艷の水に溶解し、魚油(日本油脂側
製品)Igを加え、37℃、500 r、p。
m、で5時間加水分解を行った後に、その生成物を薄層
クロマトグラフィーにて分析したところ、トリグリセリ
ド、ジグリセリドのスポットは存在せず、2−モノグリ
セリドと脂肪酸のみが検出された。これにより該酵素は
1.3−ジグリセリドリパーゼであることが明らかであ
る。また2−モノグリセリド中の脂肪酸の組成をガスク
ロマトグラフィーにて1周べたところ、エイコサペンク
エン酸が20%、ドコサヘキサエン酸が19.1%含ま
れていた。
原料中にはエイコサペンクエン酸が13.5%、ドコサ
ヘキサエン酸が9.5%含まれていたので、これら高度
不飽和脂肪酸はモノグリセリド中に濃縮されたものと考
えられる。
実施例2 実施例1において、0.5Mグリシン−塩酸バッファー
、pH3,0を0.2 Mギ酸−ギ酸ナトリウムバフフ
ァー、pH2,0に変えた他は同様に行った。この改質
酵素による魚油分解物中にはトリグリセリド、ジグリセ
リドは存在せず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出さ
れた。またモノグリセリド中の脂肪酸組成は、エイコサ
ペンクエン酸20.4%、ドコサヘキサエン酸19.6
%であった。
実施例3 実施例1において、0.5Mグリシン−塩酸バッファー
、pH3,0を0.2 M−酸一塩化カリウムバソファ
ー、pH1,2に、処理時間を2時間に変えた他は同様
に行った。この改質酵素による魚油加水分解中にはトリ
グリセリド、ジグリセリドは存在せず、モノグリセリド
と脂肪酸のみが検出された。
またモノグリセリド中の脂肪酸組成を調べたところ、エ
イコサペンクエン酸20.1%、ドコサヘキサエン酸1
9.6%であった。
実施例4 オリーブ油(米山薬品工業■製品−) 500gに0.
5gのキャンディダ・シリンドラセリパーゼ(名糖産業
側製品、リパーゼOF)を溶解し、0.1M酢酸−酢酸
ナトリウムバッファーpH4,5,500mlを加え、
37℃、500 r、p、m、で3時間反応させ、分解
物490gを得た。この生成物を薄層クロマトグラフィ
ーにて分析した結果、トリグリセリド、ジグリセリドの
スポットは認られず、モノグリセリドと脂肪酸のスポッ
トのみが検出された。
実施例5 実施例4において、オリーブ油を魚油(日本油脂■製品
)に、酵素量を0.5gから5gに変えた他は同様に行
った。生成物中にトリグリセリド、ジグリセリドの存在
は認められず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出され
た。また、このモノグリセリドを精製し、その脂肪酸組
成をガスクロマトグラフィーにて分析した結果、エイコ
サペンクエン酸19%、ドコサヘキサエン酸15%とな
り、原料中の組成(13,5%および9.5%)よりも
高濃度であった。
実施例6 実施例4において、オリーブ油を月見草種子油(サミソ
ト製油■製品)に、0.1M酢酸−酢酸ナトリウムバッ
ファー、pH4,5を0.1Mギ酸−ギ酸ナトリウムバ
ッファー、pH4,0に変えた他は同様に行った。その
生成物中にトリグリセリド、ジグリセリドの存在は認ら
れず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出された。また
このモノグリセリド中の脂肪酸組成を分析したところ、
T−リルン酸含量は20.5%であり、原料中の10.
2%を上回っていた。
比較例 実施例4において、0.1M酢酸−酢酸ナトリウムバッ
ファー、p)I 4.5を0.1Mリン酸ナトリウムバ
ッファー、p)I 7.0に変えた他は同様に行った。
その生成物中にトリグリセリド、ジグリセリド、モノグ
リセリドは殆ど検出されず、脂肪酸のみが検出された。
これからSn−1,2,3位に関係なく、全ての位置が
分解されたことがわかる。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)キャンディダ・シリンドラセリパーゼを酸で処理
    し、1,3−ジグリセリドリパーゼ活性を有する酵素に
    改質することを特徴とする酵素の改質方法。
  2. (2)油脂にキャンディダ・シリンドラセリパーゼを用
    いてpH3〜5の酸性下で加水分解反応を行い、トリグ
    リセリドのSn−1位およびSn−3位のエステル結合
    を特異的に分解することを特徴とする油脂の加水分解方
    法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935828A (en) * 1989-05-01 1999-08-10 Opta Food Ingredients, Inc. Enzymatic production of monoglycerides containing omega-3 unsaturated fatty acids
JP2002136298A (ja) * 2000-11-01 2002-05-14 Tama Seikagaku Kk Dhaを高濃度に含有するアシルグリセリドの製造方法
JP2016037556A (ja) * 2014-08-07 2016-03-22 横浜ゴム株式会社 ゴム組成物および空気入りタイヤ

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2002136298A (ja) * 2000-11-01 2002-05-14 Tama Seikagaku Kk Dhaを高濃度に含有するアシルグリセリドの製造方法
JP2016037556A (ja) * 2014-08-07 2016-03-22 横浜ゴム株式会社 ゴム組成物および空気入りタイヤ

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