JPH01215286A

JPH01215286A - 酵素の改質方法および油脂の加水分解方法

Info

Publication number: JPH01215286A
Application number: JP63038632A
Authority: JP
Inventors: Masahide Nakada; 中田　正秀; Tadashi Funada; 船田　正
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1988-02-23
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1989-08-29
Anticipated expiration: 2012-02-26
Also published as: JP2586084B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はキャンディダ・シリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄａ
９１土Ｉ工肛旦り−より得られるリパーゼ（以下単にキ
ャンディダ・シリンドラセリパーゼと略す）を酸で処理
する酵素の改質方法に関する。

また、本発明は油脂を前記リパーゼにより加水分解する
方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、油脂工業においては油脂の加水分解を高温高圧下
で行う方法がとられていたが、最近では高度不飽和脂肪
酸など熱に対して不安定な物質の製造に、常温常圧での
酵素法が行われるようになってきた。例えば特開昭５８
−２０５４９９号、特開昭５７−１７０１９３号などが
挙げられる。これら高度不飽和脂肪酸はアラキドン酸、
エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸など、その
生理活性が注目され、医薬品あるいはその前駆体として
有望なものと考えられている。

酵素法による油脂の加水分解には、キャンディダ・シリ
ンドラセリパーゼ、膵臓リパーゼ、リゾプスリパーゼな
ど種々のものが用いられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

工業的に酵素を用いるためには、安価で大量に入手でき
るものが必要であるが、現在までに市販されているリパ
ーゼはキャンディダ・シリンドラセリパーゼ以外は、い
ずれも高価であり、また大量に生産することが困難なも
のである。従ってキャンディダ・シリンドラセリパーゼ
が最も工業的なコストに適したものと言えるのであるが
、従来このリパーゼはトリグリセリドの３つの結合、即
ちＳｎ−１位、２位、３位のエステル結合をすべて加水
分解する酵素として知られていた。従って位置特異性は
示さないと言われてい゛た。

高度不飽和脂肪酸はトリグリセリドのＳｎ−２位に多く
存在するため、これらの化合物をより高濃度で得るには
Ｓｎ−２位のみを加水分解し、遊離型としてこれらの物
を取り出す方法と、Ｓｎ−１位、３位のみを加水分解し
てグリセリド型で濃縮する方法が考えられる。しかしな
がら通常のキャンディダ・シリンドラセリパーゼでは、
これらの位置特異的な加水分解ができないという問題点
があった。

本発明の目的は、キャンディダ・シリンドラセリパーゼ
を改質すること、また、キャンディダ・シリンドラセリ
パーゼを用いて高度不飽和脂肪酸を位置特異的に加水分
解する方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の発明は、ギャンディダ・シリンドラセリ
パーゼを酸で処理することを特徴とする１、３−ジグリ
セリドリパーゼ活性を有する酵素への改質方法であり、
第２の発明は、油脂にキャンディダ・シリンドラセリパ
ーゼを用いてｐｌ（３〜５の酸性下で加水分解反応を行
い、トリグリセリドのＳｎ−１位およびＳｎ−３位のエ
ステル結合を特異的に分解することを特徴とする油脂の
分解方法である。

本発明に用いるキャンディダ・シリンドラセを培養して
得られるリパーゼは、市販のリパーゼ等を用いることが
でき、例えばリパーゼＯＦ（名糖産業■製、キャンディ
ダ・シリンドラセの培養液をアセトン処理して得られる
酵素粉末）等を好ましく挙げることができる。

キャンディダ・シリンドラセリパーゼを精製すると、２
−モノグリセリドリパーゼと１．３−ジグリセリドリパ
ーゼの２種の酵素が得られる。また、この２種の酵素の
性質を調べたところ、２−モノグリセリドリパーゼは酸
に弱＜、ｐＨ１〜５の範囲で処理すると容易に失活する
ことが明らかとなった。また同じ条件下では１．３−ジ
グリセリドリパーゼは全く失活しない。すなわち、位置
特異性を示さないリパーゼを酸で処理すると、１．３−
ジグリセリドのみを加水分解する酵素に改質することが
できる。

本発明で用いられる酸は、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リ
ン酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸などの酸や、ギ
酸−ギ酸ナトリウムバッファー、塩酸−塩化カリウムバ
ッファ−１酢酸−酢酸ナトリウムバッファー、クエン酸
−クエン酸ナトリウムバッファー、グリシン−塩酸バッ
ファー、塩酸−塩化カリウムバソフア−等の緩衝液が挙
げられる。これらの酸性水溶液はｐＨが１〜５であるこ
とが好ましい。ｐＨが１より小さいと酵素活性が害され
るおそれがあり、またｐｉが５を越えるとＳｎ−２リパ
ーゼの失活が不十分となり、Ｓｎ−１，３リパーゼの位
置特異性が悪くなる。

酵素の酸性水溶液に対する割合は０．１から３０重量パ
ーセントの間であるが、好ましくは１〜１０重量パーセ
ントの範囲である。

処理温度は目的とする１、３−ジグリセリドリパーゼが
失活しないように、１〜５℃の範囲で行うことが好まし
い。

処理時間は１〜１０時間で十分である。

酸処理を終えた酵素液は水酸化す、トリウムでｐＨ７，
０に中和し、４８時間の透析により脱塩してから凍結乾
燥して、改質酵素が得られる。本発明は安価で工業的コ
ストに適しており、従来、位置特異性を示さなかったキ
ャンディダ・シリンドラセリパーゼを、そのｐＨ依存性
を利用して位置特異性を発現させることができる。

また、本発明は、この位置特異性を発現する条件下で油
脂を加水分解して、目的の脂肪酸を効率的に得る方法で
ある。本発明に用いる油脂は、動物性油、植物性油のい
ずれも使用可能であり、例えば牛脂、肝脂、魚油、大豆
油、コーン油、月見草油、オリーブ油等が挙げられ、特
に生理活性のある高度不飽和酸を含む魚油、オリーブ油
、月見草油などが好ましい。

本発明において油脂を加水分解する場合、市販のキャン
ディダ・シリンドラセリパーゼをそのまま用いる場合は
ｐＨ３〜５の酸性下で行うのが好ましく、ｐＨが３より
小さいと油脂の加水分解性が低下し、またｐＨが５を超
えるとＳｎ−２リパーゼの失活が不十分となり、Ｓｎ−
１，３位の特異的分解性が低下する。反応においてｐＨ
を３〜５に保つために用いる酸は、前記の酸およびバッ
ファー液が使用できる。基質に用いる油脂により固有の
最適ｐＨを示すので、あらかじめ、この最適ｐＨを測定
しておいてから、上記の酸のうち適したものを１種選ん
で用いる。

なお、本発明の第１の発明で得た改質酵素を用いて油脂
を分解する場合は、中性または弱酸性で反応させるのが
好ましい。アルカリサイドでは酵素が失活して使用でき
ない。

酵素の添加量は油脂１ｇに対して０．０１■〜５０■、
好ましくは０．１〜１０■であり、反応温度は１０℃か
ら５０℃の範囲で行われるが、好ましくは２０から４０
℃の間が良い。

この反応は水と油の２層系で行われるので、十分な攪拌
が必要である。通常１００から５０Ｏｒ、ｐ、ｍ。

の範囲で行われる。

高度不飽和脂肪酸が空気と接触して酸化するのを防ぐた
め窒素バブリングにより空気を追い出しながら行う。

反応時間は通常１〜５時間の範囲内で行われる。

〔発明の効果〕

本発明の改質方法によれば、位置特異性を全く示さない
市販のリパーゼから、油脂のＳｎ−１位、および３位に
特異的に反応する１、３−ジグリセリドリパーゼを選択
的に得ることができる。

また本発明の油脂の加水分解方法によれば市販のリパー
ゼを用いてトリグリセリドのＳｎ−１位およびＳｎ−３
位のエステル結合を特異的に分解することができるので
、天然油脂から生理活性の強い高度不飽和脂肪酸を分離
ｔａ縮したり、所望の２−モノグリセリドを得ることが
できる。

（実施例）以下、実施例と比較例に基づき本発明を具体的に説明す
る。

実施例１０．５Ｍのグリシン−塩酸バッファー、ｐＨ３，０，１
００−にキャンディダ・シリンドラセリパーゼリパーゼ
（名糖産業側製品、リパーゼＯＦ）５ｇを４°Ｃで溶解
し、４℃で５時間放置する。その後０．１規定の水酸化
ナトリウムでＰＨ７，０に中和し、４℃の水中で４８時
間透析して塩とバッファーを除く。

これを凍結乾燥すると約５ｇの改質酵素が得られる。次
にこの酵素５■を５艷の水に溶解し、魚油（日本油脂側
製品）Ｉｇを加え、３７℃、５００　ｒ、ｐ。

ｍ、で５時間加水分解を行った後に、その生成物を薄層
クロマトグラフィーにて分析したところ、トリグリセリ
ド、ジグリセリドのスポットは存在せず、２−モノグリ
セリドと脂肪酸のみが検出された。これにより該酵素は
１．３−ジグリセリドリパーゼであることが明らかであ
る。また２−モノグリセリド中の脂肪酸の組成をガスク
ロマトグラフィーにて１周べたところ、エイコサペンク
エン酸が２０％、ドコサヘキサエン酸が１９．１％含ま
れていた。

原料中にはエイコサペンクエン酸が１３．５％、ドコサ
ヘキサエン酸が９．５％含まれていたので、これら高度
不飽和脂肪酸はモノグリセリド中に濃縮されたものと考
えられる。

実施例２実施例１において、０．５Ｍグリシン−塩酸バッファー
、ｐＨ３，０を０．２　Ｍギ酸−ギ酸ナトリウムバフフ
ァー、ｐＨ２，０に変えた他は同様に行った。この改質
酵素による魚油分解物中にはトリグリセリド、ジグリセ
リドは存在せず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出さ
れた。またモノグリセリド中の脂肪酸組成は、エイコサ
ペンクエン酸２０．４％、ドコサヘキサエン酸１９．６
％であった。

実施例３実施例１において、０．５Ｍグリシン−塩酸バッファー
、ｐＨ３，０を０．２　Ｍ−酸一塩化カリウムバソファ
ー、ｐＨ１，２に、処理時間を２時間に変えた他は同様
に行った。この改質酵素による魚油加水分解中にはトリ
グリセリド、ジグリセリドは存在せず、モノグリセリド
と脂肪酸のみが検出された。

またモノグリセリド中の脂肪酸組成を調べたところ、エ
イコサペンクエン酸２０．１％、ドコサヘキサエン酸１
９．６％であった。

実施例４オリーブ油（米山薬品工業■製品−）　５００ｇに０．
５ｇのキャンディダ・シリンドラセリパーゼ（名糖産業
側製品、リパーゼＯＦ）を溶解し、０．１Ｍ酢酸−酢酸
ナトリウムバッファーｐＨ４，５，５００ｍｌを加え、
３７℃、５００　ｒ、ｐ、ｍ、で３時間反応させ、分解
物４９０ｇを得た。この生成物を薄層クロマトグラフィ
ーにて分析した結果、トリグリセリド、ジグリセリドの
スポットは認られず、モノグリセリドと脂肪酸のスポッ
トのみが検出された。

実施例５実施例４において、オリーブ油を魚油（日本油脂■製品
）に、酵素量を０．５ｇから５ｇに変えた他は同様に行
った。生成物中にトリグリセリド、ジグリセリドの存在
は認められず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出され
た。また、このモノグリセリドを精製し、その脂肪酸組
成をガスクロマトグラフィーにて分析した結果、エイコ
サペンクエン酸１９％、ドコサヘキサエン酸１５％とな
り、原料中の組成（１３，５％および９．５％）よりも
高濃度であった。

実施例６実施例４において、オリーブ油を月見草種子油（サミソ
ト製油■製品）に、０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウムバッ
ファー、ｐＨ４，５を０．１Ｍギ酸−ギ酸ナトリウムバ
ッファー、ｐＨ４，０に変えた他は同様に行った。その
生成物中にトリグリセリド、ジグリセリドの存在は認ら
れず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出された。また
このモノグリセリド中の脂肪酸組成を分析したところ、
Ｔ−リルン酸含量は２０．５％であり、原料中の１０．
２％を上回っていた。

比較例実施例４において、０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウムバッ
ファー、ｐ）Ｉ　４．５を０．１Ｍリン酸ナトリウムバ
ッファー、ｐ）Ｉ　７．０に変えた他は同様に行った。

その生成物中にトリグリセリド、ジグリセリド、モノグ
リセリドは殆ど検出されず、脂肪酸のみが検出された。

これからＳｎ−１，２，３位に関係なく、全ての位置が
分解されたことがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）キャンディダ・シリンドラセリパーゼを酸で処理
し、１，３−ジグリセリドリパーゼ活性を有する酵素に
改質することを特徴とする酵素の改質方法。
（２）油脂にキャンディダ・シリンドラセリパーゼを用
いてｐＨ３〜５の酸性下で加水分解反応を行い、トリグ
リセリドのＳｎ−１位およびＳｎ−３位のエステル結合
を特異的に分解することを特徴とする油脂の加水分解方
法。