JPH0412112B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は部分グリセライドリパーゼの存在下、
脂肪酸または脂肪酸エステルとグリセロールを反
応させて、乳化剤、抗菌剤などとして有用なトリ
グリセライドを全く若しくはほとんど含まないグ
リセライドを製造する方法に関する。 従来の技術 リパーゼは脂肪または高級脂肪酸のエステルを
加水分解する酵素であるが、適当な条件のもとで
は脂肪酸とグリセロールまたは脂肪酸とアルコー
ルから加水分解の逆反応によつてグリセライドま
たはエステルを生成することが知られている（J.
Gen.Appl.Microbiol.、第10巻、第13〜22頁、
1964年、Proc. IFS：Ferment.Technol.
Today、第315−320頁、1972年、特公昭51−
7754、特公昭57−23535、特開昭59−118094、特
開昭59−118095など）。これら先行技術で使用さ
れているリパーゼ、並びに一般に、最もよく知ら
れているリパーゼは、いわゆるトリアシルグリセ
ロールリパーゼ（別名：トリグリセライドリパー
ゼ）であり、この酵素はトリグリセライドのみな
らずジグリセライドおよびモノグリセライドに
も、程度の差はあるものの特異性を有する酵素で
ある。このトリグリセライドリパーゼにより、前
記逆反応によつて生成されるグリセライドは、一
般にトリグリセライド、ジグリセライドおよびモ
ノグリセライドの混合物であるか、または実質的
にモノグリセライドおよびジグリセライドから成
る場合でも、そのモノグリセライドの割合が低い
という欠点がある。 モノグリセライドおよびジグリセライドは食
品、化粧品、医薬品などの乳化剤として広汎に使
用されているが、乳化剤としての能力はモノグリ
セライドの方がジグリセライドよりもはるかに優
れており、トリグリセライドの存在は好ましくな
いとされている。一般に乳化剤として使用される
グリセライドは、そのモノグリセライド含量が約
90モル％以上であることが要求され、従つて、従
来はグリセライド混合物を分子蒸留などに付して
モノグリセライド含量を高める操作が必要であつ
た。 また、グリセライドのその他の用途として、特
定のモノグリセライド（ラウリン酸モノグリセラ
イド、カプリン酸モノグリセライドなど）が食品
などの抗菌剤、防腐剤として利用されている。 本発明において使用される酵素としての部分グ
リセライドリパーゼとは、モノグリセライドおよ
び／またはジグリセライドを特異的に加水分解す
るリパーゼを意味するが、このような性質を有す
る酵素の存在は動物および微生物の中にわずかに
知られているに過ぎない。本発明において、特に
好適に用いられるペニシリウム・サイクロピウム
（Penicillium cyclopium）の生産する部分グリ
セライドリパーゼ、それ自体は本願出願前の文献
に公知である（J.Biochem.、第87巻、第205−
211頁、1980年）。この酵素は、モノグリセライド
およびジグリセライドに特異性を有する酵素で、
トリグリセライドに対する作用は極めて低いとい
う特徴を有する。 発明が解決しようとする問題点 本発明は、乳化剤、抗菌剤などとして有用なト
リグリセライドを全く若しくはほとんど含まない
グリセライドを提供することを目的とする。ま
た、本発明の好ましい態様においては、生成グリ
セライド中のモノグリセライドおよびジグリセラ
イドの割合を幅広く調節して、最も好ましくは実
質的にモノグリセライドのみより成るグリセライ
ドを製造することを目的とする。 問題点を解決するための手段、作用 本発明によれば、部分グリセライドリパーゼの
存在下、脂肪酸または脂肪酸エステルとグリセロ
ールを適当な条件下に反応させることによりトリ
グリセライドを全く若しくはほとんど含まないグ
リセライドが生成される。 本発明で使用される部分グリセライドリパーゼ
とは、モノグリセライドおよび／またはジグリセ
ライドを加水分解する性質を有し、トリグリセラ
イドに対する特異性は全く若しくはほとんど有し
ない酵素である。このような酵素の例としては、
ラツト小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来の
モノグリセライドリパーゼまたはジグリセライド
リパーゼ、ペニシリウム・サイクロピウム
（Penicillium cyclopium）ATCC34613由来のモ
ノグリセライドおよびジグリセライドに特異性を
有する酵素などが挙げられる。とくに好ましくは
上記ペニシリウム属菌由来の酵素が用いられる。 上記ペニシリウム属菌株から部分グリセライド
リパーゼを得るには、本菌株を通常の微生物の培
養に用いられる培地に増殖せしめ、培養物中に酵
素を蓄積せしめ、これより採取することができ
る。培養物から採取した酵素の純化は、公知の精
製手段により行うことができるが、本発明の目的
にはあえて純粋の状態にまで精製する必要はな
い。ただし、培養物中または粗製酵素中にトリグ
リセライドリパーゼが含まれる場合にはそれを除
去しなければならない。 本発明において、グリセライド合成の原料とし
て用いられる脂肪酸および脂肪酸エステルとして
は、炭素数４〜22の飽和または不飽和の脂肪酸お
よびそのメチル、エチル、プロピル、ブチル、ベ
ンジル、アミル、ビニルなどのエステル、並びに
これらの混合物が挙げられる。また、加圧蒸気
法、トイツチエル法、鹸化などの物理化学的手段
或いはトリグリセライドリパーゼを用いる酵素的
手段による油脂の加水分解物を原料として用いる
こともできる。これらの脂肪酸並びに脂肪酸エス
テルの脂肪酸部分の炭素鎖は直鎖または分枝のい
ずれでもよい。部分グリセライドリパーゼの存在
下、これらの脂肪酸または脂肪酸エステルとグリ
セロールを、水分含量約30重量％以下、温度20〜
55℃において、１時間〜５日間反応せしめること
により、トリグリセライドを全く若しくはほとん
ど含まず、実質的にモノグリセライドとジグリセ
ライドより成るグリセライドが生成される。リパ
ーゼの使用量は、原料の脂肪酸または脂肪酸エス
テル１モル当り1.3〜6700単位が好ましい。原料
の脂肪酸または脂肪酸エステルに対するグリセロ
ールの比率は、モル比で0.2〜200が好ましい。反
応のPHは使用するリパーゼが有効に働く範囲内で
あればよい。部分グリセライドリパーゼとしてペ
ニシリウム・サイクロピウムの酵素を使用した場
合はトリグリセライドが全く生成されないことが
確認された。 生成されるグリセライド中のモノグリセライド
およびジグリセライドの割合は、反応の条件を適
当に選択することにより幅広く調節することがで
きる。即ち、全グリセライドに占めるモノグリセ
ライドの割合が約50％（モリ比）から実質的に副
生物を含まないところまで変えることが可能であ
る。そのような条件とは、反応の時間、酵素の使
用量、原料の脂肪酸または脂肪酸エステルとグリ
セロールの使用割合、反応混合物中の水分含量な
どである。即ち、反応の時間は１〜50時間が好ま
しく、リパーゼの使用量は原料の脂肪酸または脂
肪酸エステル１モル当り1.3〜3300単位が好まし
く、原料の脂肪酸または脂肪酸エステルに対する
グリセロールの比率はモル比で0.2〜50が好まし
い。 生成されたグリセライドは石油エーテルなどの
有機溶媒に抽出し、続いて真空蒸留、アルカリ精
製などの手段で未反応の脂肪酸を除去して、反応
混合物より分離する。得られたグリセライド中の
モノグリセライド含量が十分に高い場合にはその
まま乳化剤、抗菌剤として利用することが可能で
あり、またモノグリセライド含量が低い場合には
分子蒸留などの手段によりその含量を高めた後に
利用することができる。本発明によれば、前記し
たように、実質的にモノグリセライドのみから成
るグリセライドを生成することが可能であるの
で、この場合にはモノグリセライドの含量を高め
る操作は必要としない。なお、上記反応におい
て、未反応の原料は繰り返しグリセライド生成の
反応に使用可能である。 本発明法により得られたグリセライドの成分お
よびその割合を分析した典型的な例を添付図面に
示す。即ち、反応終了後の混合物中の油層成分を
シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフイー／水
素炎イオン化検出器（TLC／FID；商品名：
IatroscanTH−10型、ヤトロン社製）により分
析した。図面より明らかのように、グリセライド
混合物中の成分はほとんどがモノグリセライド
（MG）であり、１，２−ジグリセライド（１，
２−DG）および１，３−ジグリセライド（１，
３−DG）はわずかであること、そしてトリグリ
セライドは全く検出されないことが分かる。な
お、FAのピークは未反応の脂肪酸を表す。 以下に試験例および実施例を示して本発明を詳
細に説明する。ただし、グリセライドの分析、グ
リセライドの合成に使用された原料の脂肪酸また
は脂肪酸エステルの割合（以下消費率という）の
測定および酵素の単位の定義は次のとおりであ
る。 グリセライドの成分およびその割合の分析は次
のように行つた。反応混合物中の油層成分を石油
エーテルに抽出した後、調整用シリカゲル薄層プ
レート（PLK5、ワツトマン社製）に供し、石油
エーテル：ジエチルエーテル：酢酸（80：30：
１、容量比）で展開後、沃素蒸気でスポツトを検
出した。各グリセライドに相当するスポツトを回
収し、トリグリセライド分析用試薬組成物（商品
名：Triglyceride Ｇ−test Wako、和光純薬社
製）を用いてグリセライドを定量した。各分子種
の割合はモル比（％）で表示した。 原料の脂肪酸または脂肪酸エステルの消費率
は、反応混合物の油層成分を前掲のTLC／FIDを
用いる方法で分析し、得られたグリセライドと脂
肪酸または脂肪酸エステルのピーク面積の合計に
対するグリセライドのピーク面積の合計の割合
（％）で表示した。 本発明において用いられる酵素の単位は次のよ
うに定義される。5.0ｇのグリセロール、0.5ｇの
オレイン酸、およびリパーゼを含む0.4mlの50ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH6.0）を混合し、撹拌下、40
℃において60分間インキユベートした。反応混合
物に20mlのアセトン：エタノール（１：１）を添
加して反応を停止した。次いで、0.1N水酸化ナ
トリウムの滴定により残存するオレイン酸を定量
した。酵素の単位は、上記反応において、１分間
に１マイクロモル当量のオレイン酸を減少させる
酵素の量を１単位とした。 試験例 １ 部分グリセライドリパーゼの調製 米糖２％およびコーン・ステイープ・リカー
1.5％より成る培地（PH6.0）にペニシリウム・サ
イクロピウムATCC34613を接種し、26℃におい
て通気、撹拌下、２日間培養した。得られた培養
液より菌体をろ別した後、ろ液を限外ろ過により
濃縮した。次いで、この濃縮液をDEAE−セフア
ロースCL−6B（フアルマシア社製）を用いたク
ロマトグラフイーに付し、共存するトリグリセラ
イドリパーゼを分離除去し、精製部分グリセライ
ドリパーゼ標品を得た。この標品はモノグリセラ
イドおよびジグリセライドを加水分解するが、ト
リグリセライドに対する作用は全く有しないこと
が確認された。 試験例 ２ 反応時間と生成グリセライドの組成 オレイン酸1.77ｇ、グリセロール8.0ｇ、ペニ
シリウム・サイクロピウムの部分グリセライドリ
パーゼ0.2ml（3.3単位）および水0.35mlを混合し
て、撹拌しながら、40℃において反応を行つた。
反応開始後、８、24、48、72および96の各時間に
反応混合物を採取し、生成グリセライド中のモノ
グリセライド、ジグリセライドおよびトリグリセ
ライドの分析を行つた。第１表に示すように、グ
リセライド中のモノグリセライドの割合は70％以
上に達し、特に８時間目のサンプルはほとんどが
モノグリセライドであつた。一方、トリグリセラ
イドの生成は何れの時間の反応混合物にも認めら
れなかつた。

【表】 試験例 ３ 酵素使用量と生成グリセライドの組成 試験例２において、酵素の使用量を種々変化さ
せ、40℃、20時間反応せしめた。第２表に示すよ
うに、酵素の使用量が少ない程、モノグリセライ
ド含量が高かつた。一方、トリグリセライドの生
成は全く認められなかつた。

【表】 試験例 ４ 原料のグリセロール／脂肪酸の割合と生成グリ
セライドの組成 試験例２において、原料のオレイン酸とグリセ
ロールの割合（モル比）を種々変化させ、40℃に
おいて20時間反応せしめた。第３表に示すよう
に、グリセロール／オレイン酸の割合が小さい
程、モノグリセライドの含量が高かつた。一方、
トリグリセライドの生成は全く認められなかつ
た。

【表】 実施例 １ オレイン酸1.77ｇ、グリセロール8.0ｇおよび
ペニシリウム・サイクロピウムの部分グリセライ
ドリパーゼ0.2ml（3.3単位）を混合して、30℃に
おいて20時間反応を行つた。オレイン酸の消費率
は47％であつた。生成したグリセライドを石油エ
ーテルに抽出し、その成分を分析したところ、全
グリセライドに占めるモノオレインの割合は98.4
％であり、ジオレインのそれは1.6％であつた。
一方、トリオレインは検出されなかつた。 実施例 ２ オレイン酸0.44ｇ、グリセロール9.5ｇおよび
ペニシリウム・サイクロピウムの酵素0.2ml（3.3
単位）を混合し、40℃において20時間反応せしめ
た。オレイン酸の消費率は75％であり、また生成
したグリセライドの割合は、モノオレイン88.2
％、ジオレイン11.8％、トリオレイン０％であつ
た。 実施例 ３ オレイン酸1.77ｇ、グリセロール8.0ｇ、ペニ
シリウム・サイクロピウムの酵素0.05ml（3.7単
位）および水0.05mlを混合し、30℃において20時
間反応せしめた。オレイン酸の消費率は23％であ
り、生成したグリセライドの割合は、モノオレイ
ン94.9％、ジオレイン5.1％、トリオレイン０％
であつた。 実施例 ４ ラウリン酸1.77ｇ、グリセロール8.0ｇ、ペニ
シリウム・サイクロピウムの酵素0.2ml（3.3単
位）および水0.35mlを混合し、40℃において20時
間反応せしめた。ラウリン酸の消費率は30％であ
り、また生成したグリセライドの割合は、モノラ
ウリン95.8％、ジラウリン4.2％、トリラウリン
０％であつた。 実施例 ５ 実施例４において、ラウリン酸に代えて、カプ
リン酸を用い同様に操作したところ、カプリン酸
の消費率は40.9％であり、また生成したグリセラ
イドの割合は、モノカプリン95.2％、ジカプリン
4.8％、トリカプリン０％であつた。 実施例 ６ ラウリン酸ビニル1.77ｇ、グリセロール8.0ｇ
およびペニシリウム・サイクロピウムの酵素0.55
ml（27.7単位）を混合し、40℃において20時間反
応せしめた。ラウリン酸ビニルの消費率は94％で
あり、生成したグリセライドの割合は、モノラウ
リン96.2％、ジラウリン3.8％、トリラウリン０
％であつた。 実施例 ７ カプリン酸ビニル1.77ｇ、グリセロール8.0ｇ、
ペニシリウム・サイクロピウムの酵素0.2ml（3.3
単位）および水0.35mlを混合し、40℃において20
時間反応をい行つた。カプリン酸ビニルの消費率
は91％であり、生成したグリセライドの割合は、
モノカプリン95.9％、ジカプリン4.1％、トリカ
プリン０％であつた。 実施例 ８ ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、
カプリル酸またはカプロン酸の1.77ｇとグリセロ
ール8.0ｇ、ペニシリウム・サイクロピウムの酵
素0.2ml（3.3単位）および水0.35mlを混合し、そ
れぞれ40℃において20時間反応を行つた。生成し
たグリセライドは、ほとんどがモノグリセライド
であり、ジグリセライドは痕跡程度にしか生成さ
れず、またトリグリセライドは全く検出されなか
つた。 実施例 ９ リノール酸1.76ｇ、リノレン酸1.75ｇまたはイ
ソステアリン酸1.78ｇとグリセロール8.0ｇ、ペ
ニシリウム・サイクロピウムの酵素0.2ml（3.3単
位）および1M McIlvaine緩衝液（PH6.0）0.35ml
を混合し、40℃において20時間反応を行つた。脂
肪酸の消費率および生成グリセライドの組成を第
４表に示す。

【表】 実施例 10 オレイン酸1.0ｇ、パルミチン酸1.0ｇ、グリセ
ロール8.0ｇ、ペニシリウム・サイクロピウムの
酵素0.2ml（3.3単位）および水0.35mlを混合し、
40℃において20時間反応せしめた。脂肪酸の消費
率は28％であり、また生成したグリセライドの割
合は、モノグリセライド94.4％、ジグリセライド
5.6％、トリグリセライド０％であつた。 実施例 11 パルミチン酸ビニル1.77ｇまたはステアリン酸
ビニル1.95ｇとグリセロール8.0ｇ、ペニシリウ
ム・サイクロピウムの酵素0.2ml（9.2単位）およ
び水0.35mlを混合し、40℃において５時間反応を
行つた。脂肪酸エステルの消費率および生成グリ
セライドの組成を第５表に示す。

【表】 発明の効果 本発明によれば、脂肪酸または脂肪酸エステル
とグリセロールよりトリグリセライドを全く若し
くはほとんど含まないグリセライドの製造法が提
供される。本発明の好ましい態様によれば、実質
的にモノグリセライドのみより成るグリセライド
の製造法が提供される。本発明法によつて得られ
たグリセライドは、そのまま或いはそのモノグリ
セライド含量を高めた後、乳化剤、抗菌剤などと
して使用可能である。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明法により生成されたグリセライ
ドの分析例を表す図であり、図中MGはモノグリ
セライド、１，２−DGは１，２−ジグリセライ
ド、１，３−DGは１，３−ジグリセライド、
FAは脂肪酸をそれぞれ意味する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 部分グリセライドリパーゼの存在下、脂肪酸
   または脂肪酸エステルとグリセロールを反応させ
   てトリグリセライドを全く若しくはほとんど含ま
   ないグリセライド生成せしめることを特徴とする
   酵素によるグリセライドの製造法。 ２ グリセライドがモノグリセライドとジグリセ
   ライドの混合物である特許請求の範囲第１項記載
   の酵素によるグリセライドの製造法。 ３ グリセライドが実質的にモノグリセライドの
   みより成る特許請求の範囲第１項記載の酵素によ
   るグリセライドの製造法。 ４ 次の条件 (1) 反応の時間、 (2) 部分グリセライドリパーゼの使用量、 (3) 原料の脂肪酸または脂肪酸エステルとグリセ
   ロールの割合 をそれぞれ適当に選択することにより生成グリセ
   ライド中のモノグリセライドおよびジグリセライ
   ドの割合を調節する特許請求の範囲第１〜３項の
   いずれかに記載の酵素によるグリセライドの製造
   法。 ５ 部分グリセライドリパーゼがモノグリセライ
   ドリパーゼおよび／またはジグリセライドリパー
   ゼである特許請求の範囲第１項記載の酵素による
   グリセライドの製造法。 ６ ペニシリウム・サイクロピウム（Penici−
   llium cyclopium）由来のモノグリセライドおよ
   びジグリセライドに特異性を有するリパーゼを使
   用する特許請求の範囲第５項記載の酵素によるグ
   リセライドの製造法。