KR20020048464A

KR20020048464A - 효소를 이용한 모노글리세리드의 선택적 제조방법

Info

Publication number: KR20020048464A
Application number: KR1020000077566A
Authority: KR
Inventors: 정대원; 송재현
Original assignee: 정대원
Priority date: 2000-12-16
Filing date: 2000-12-16
Publication date: 2002-06-24

Abstract

본 발명은 식품첨가제 용도의 계면활성제로 널리 사용되고 있는 모노글리세리드의 선택적 제조방법에 관한 것이다. 본 발명자는 리파제가 에스테르교환반응에서도 기질 선택성을 지니고 있는 점에 착안하여, 글리세린과 지방산의 에스테르 화합물을 리파제의 존재하에서 에스테르교환시킴으로써, 디글리세리드의 생성없이 선택적으로 모노글리세리드만 제조할 수 있었다.

Description

효소를 이용한 모노글리세리드의 선택적 제조방법{METHOD FOR SELECTIVE PREPARATION OF MONOGLYCERIDE BY ENZYMATIC PROCESS}

식품첨가제 용도의 계면활성제로 널리 사용되고 있는 모노글리세리드는 일반적으로 다음과 같은 3가지 방법에 의해서 제조되고 있다(Porter, M.R., Handbook of surfactants, 2nd Ed. Blackie Academic & Professional).

① 알칼리 촉매하에서 유지와 글리세롤의 알코올교환반응(Glycerolysis)

② 유지의 부분가수분해

③ 정제된 지방산과 글리세롤의 에스테르화 반응

그러나, 이와 같은 화학적 방법은 고온에서 반응을 시키므로 생성물의 색상이 변색되거나 역겨운 냄새를 내기도 하고 불포화지방산을 사용할 경우에는 산화에 의해 변성되는 경우도 발생한다. 또한, 화학적 방법에 의해서는 모노글리세리드만을 선택적으로 생성하는 것이 아니라 디글리세리드(경우에 따라서는 트리글리세리드)도 동시에 생성되므로 일반적으로 판매되고 있는 모노글리세리드에는 어느 정도의 디글리세리드가 포함되어 있다.

따라서, 이와 같은 단점을 보완하기 위해서 에스테르 화합물의 가수분해 반응 및 그의 역반응에 관여하는 효소인 리파제를 이용한 모노글리세리드 합성 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 효소반응은 온화한 조건에서 수행가능하며 선택적인 반응이 가능한 특징을 지니고 있을 뿐만 아니라 환경친화적이라는 점에서 모노글리세리드의 선택적 합성에 가장 최적인 공정으로 인식되고 있다.

리파제를 이용한 모노글리세리드의 합성도 기본적으로는 상기에 열거한 화학적 방법을 적용하나, 촉매로 리파제를 사용하는 것이다.

첫째는 트리글리세리드를 glycerolysis시키는 방법(Yamane et. al, J. Am, Oil Chem. Soc., 68, 1, 1991; ibid., 68, 6, 1991, EP 445,692) 또는 고정화한 리파제를 이용하는 방법(Ferreira, S., Fonseca, M.M.R., Biopro. Eng., 327, 12, 1995) 등이 있으나, 이 방법에 의해서 생성되는 모노글리세리드는 트리-, α,α-디-, α,β-디-글리세리드 및 유리지방산과 혼합되어 있으므로 모노글리세리드만을 정제하는 것이 매우 어렵다는 문제점이 있다.

둘째는 트리글리세리드를 가수분해하는 방법 또는 트리글리세리드를 알코올과 에스테르교환반응시키는 방법(Zaks, A., Gross, A., 미국특허 5,316,927) 등이 알려져 있으나, 이 방법에서는 리파제에 의해서 반응이 우선적으로 일어나는 부위가 트리글리세리드에 존재하는 두개의 α-위치이므로 결국 생성되는 물질은 β-모노글리세리드이다.

셋째는 글리세롤과 지방산을 에스테르화하는 방법으로 가장 보편적으로 연구되고 있는 분야이다. 이 방법은 기본적으로 친수성 기질인 글리세롤과 소수성 기질인 지방산을 에스테르화하는 것으로 리파제에 의한 반응은 계면에서만 일어나므로반응이 일어나기 매우 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 유기용매(Akoh, C., Cooper, C., Nwosu. C., J. Am, Oil Chem. Soc., 257, 69, 1992) 또는 reverse micelle(Hayes, D., Gulari, E., Biotech. and Bioeng., 507, 38, 1991)을 사용하거나, 실리카겔에 흡착시킨 글리세롤을 사용하므로서 반응효율을 높일 수 있었다(Berger, M., Schneider, M., J. Am, Oil Chem. Soc., 69, 10, 1992). 그러나, 생성물중에는 여전히 디글리세리드 및 트리글리세리드가 남아있는 문제점을 기본적으로 해결하지는 못했다.

이에, 본 발명자는 리파제를 이용한 모노글리세리드의 선택적 제조방법에 관하여 예의 연구한 결과, 글리세롤과 지방산의 에스테르화합물의 에스테르 교환반응을 유기용매중에서 수행하므로써, 디글리세리드의 생성없이 60% 이상의 전환률로 순수한 모노글리세리드를 합성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 결국, 본 발명의 목적은 온화한 반응조건하에서 모노글리세리드를 선택적으로 합성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 반응혼합물로부터 모노글리세리드를 회수하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 글리세린과 스테아린산 메틸에스테르(이하, MS로 약함)를 1:1 내지 1:9 의 몰비로, 바람직하게는 1:3 내지 1:6의 몰비로, 가장 바람직하게는 1:6의 몰비로 첨가하여 1,4-디옥산, 테트라히드로퓨란(이하 THF로 약함) 또는 아세톤과 같은 유기용매 내에서 리파제(PPL, Porcine Pancreatic Lipase)를 촉매로 하여 글리세린의 하이드록시기와 MS의 에스테르기를 에스테르 교환반응시켜 모노글리세리드를 제조한다.

이와같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는, 글리세린과 MS의 혼합물에 용매를 넣어주고 교반하여 준다. MS가 완전하게 용해된 것을 확인한 후, 리파제를 첨가하고 실온에서 계속 교반하여 준다. 반응후 일정한 시간 간격으로 소량의 반응물을 채취하여 메틸렌클로라이드를 첨가한 후, 여과하여 리파제를 제거하고 가스크로마토그라피를 통하여 반응의 진행상황을 추적한다. 일정 시간이 경과한 후에, 반응물을 여과하여 리파제를 제거하고 감압하에서 용매를 제거한다. 60℃에서 최소량의 n-헥산으로 용해시킨 후 실온으로 유지하면, 순수한 모노글리세리드의 결정을 얻을 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1.

250㎖의 둥근바닥 플라스크에 글리세린 0.25g, MS 4.83g (몰비, 글리세린 : MS = 1 : 6)을 넣고 1,4-디옥산 25㎖를 첨가하고 교반하여 준다. MS가 완전하게 용해된 것을 확인하고 리파제인 PPL(Activity; 35-70 units per ㎎ protein usingtriacetin, Sigma 제품) 2.5g을 첨가한다. 23℃에서 계속 교반하면서 6시간 간격으로 소량의 반응물을 채취하여, 반응중에 생성되었을 가능성이 있는 디글리세리드를 용해시키기 위하여 메틸렌클로리드(MC)를 첨가하고 여과하여 리파제를 제거한다. 가스크로마토그라피(컬럼 : Ultra 1, 25m)를 측정하여, 미리 작성한 검량선을 이용하여 미반응 글리세리드와 생성된 모노글리세리드(MG)의 몰비를 계산하여 반응전환률을 결정함과 동시에 디글리세리드(DG)의 생성 여부를 확인한다. 또한 DG의 생성여부는 박막크로마토그래피(TLC)를 통하여 재확인한다.

반응시간 변화에 따른 반응전환률의 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 괄호안의 숫자는 아래와 같이 정의된 DG의 생성률이며, 숫자가 없는 경우는 DG가 생성되지 않은 것을 의미한다.

DG 생성률 (%) = [DG] / {[DG] + [G]} x 100 (%)

실시예 2 - 5

글리세린과 MS의 몰비를 3:1, 1:1, 1:3, 1:9 등으로 바꾸어 반응을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다. 반응시간 변화에 따른 반응전환률의 결과를 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보듯이, 글리세린과 MS의 몰비를 1:6으로 하여 반응을 수행하는 것이 최적으로 나타났으며 반응전환률 60% 이하에서는 DG가 생성되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

표 1. 반응몰비의 변화에 따른 반응전환률 (%)

Conversion^*(%) = [MG] / {[MG] + [G]} x 100 (%)

실시예 6-7

반응용매를 THF 및 아세톤으로 바꾸어 반응을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다. 반응시간 변화에 따른 반응전환률의 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에서 괄호안의 숫자는 아래와 같이 정의된 DG의 생성율이며, 숫자가 없는 경우는 DG가 생성되지 않은 것을 의미한다.

DG 생성율 (%) = [DG] / {[DG] + [G]} x 100 (%)

표 2에서 알 수 있듯이 THF와 아세톤에서도 유사한 경향을 나타내었으나, 1,4-디옥산을 용매로 사용하는 것이 최적으로 나타났다.

표 2. 반응용매의 변화에 따른 반응전환률 (%)

Conversion^*(%) = [MG] / {[MG] + [G]} x 100 (%)

실시예 8-10

반응용매인 1,4-dioxane의 양을 15㎖, 50㎖ 및 75㎖로 바꾸어 반응을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다. 반응시간 변화에 따른 반응전환률의 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에서 괄호안의 숫자는 아래와 같이 정의된 디글리세리드(DG)의 생성율이며, 숫자가 없는 경우는 DG가 생성되지 않은 것을 의미한다.

DG 생성율 (%) = [DG] / {[DG] + [G]} x 100 (%)

표 3에서 알 수 있듯이 반응용매인 1,4-디옥산의 양을 15㎖로 한 경우(즉, 농도를 높여준 경우)에는 반응전환률의 저하가 나타났으며, 25㎖ 이상인 경우에는 거의 동일한 경향을 나타내었다.

표 3. 반응용매의 양에 따른 반응전환률 (%)

Conversion^*(%) = [MG] / {[MG] + [G]} x 100 (%)

실시예 11

MS를 메틸올레이트로(MO)로 바꾸어 반응을 수행한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다. 반응시간 변화에 따른 반응전환률의 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에서 괄호안의 숫자는 아래와 같이 정의된 디글리세리드(DG)의 생성율이며, 숫자가 없는 경우는 DG가 생성되지 않은 것을 의미한다.

DG 생성율 (%) = [DG] / {[DG] + [G]} x 100 (%)

불포화지방산인 올레인산의 메틸에스테르를 사용하여도 본 발명의 공정이 적용될 수 있음을 알 수 있다.

표 4. MO를 사용한 경우의 반응전환률 (%)

Conversion^*(%) = [MG] / {[MG] + [G]} x 100 (%)

실시예 12

사용한 PPL을 회수하여 재사용 가능성을 다음과 같이 확인하였다.

실시예 1의 72시간 반응물을 여과하여 PPL을 회수한 후, MC로 세척하고 실시예 1과 동일한 반응을 수행하였다. 반응시간 변화에 따른 반응전환률의 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5에서 괄호안의 숫자는 아래와 같이 정의된 디글리세리드(DG)의 생성률이며, 숫자가 없는 경우는 DG가 생성되지 않은 것을 의미한다.

DG 생성율 (%) = [DG] / {[DG] + [G]} x 100 (%)

한번 반응에 사용한 PPL을 회수한 후에 사용하여도 반응전환률에 약간의 저하가 있으나 실시예 1과 거의 동일한 경향을 나타내었다. 따라서, 본 발명에서의 PPL은 용이하게 회수가 가능하며 또한 재사용할 수 있음을 알 수 있다.

표 5. PPL을 재사용한 경우의 반응전환률 (%)

Conversion^*(%) = [MG] / {[MG] + [G]} x 100 (%)

실시예 12

실시예 1과 동일하나, 다음과 같이 반응 스케일을 크게 하고 24시간 반응 후에 MG를 회수하여 수율을 확인하였다.

1ℓ의 둥근바닥 플라스크에 글리세린 2.5g, MS 48.3g (몰비, 글리세린 : MS = 1 : 6)을 넣고 1,4-디옥산 250㎖를 첨가하고 교반하여 준다. MS가 완전하게 용해된 것을 확인하고 리파제인 PPL(Activity; 35-70 units per ㎎ protein using triacetin, Sigma 제품) 25g을 첨가하고 23℃에서 계속 교반하면서 반응을 진행한다. 24시간 후에 반응물을 여과하여 리파제를 제거하고 감압하에서 용매인 1,4-디옥산을 제거한다. 200㎖의 n-헥산을 첨가하여 60℃에서 완전하게 용해시킨 후 실온에서 24시간 방치함으로써 무색의 결정을 얻을 수 있었다. 여과하여 얻어진 생성물을 30℃에서 진공건조하여 4.86g의 순수한 모노글리세리드를 얻었으며, 생성물의 융점은 76℃를 나타내었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 리파제를 이용한 모노글리세리드의 선택적 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의해서 온화한 조건하에서 디글리세리드의 생성없이 모노글리세리드를 선택적으로 제조할 수 있게 되었으며, 순수한 모노글리세리드를 높은 수율로 얻을 수 있게 되었다.

Claims

효소의 존재하에서 글리세린과 지방산의 에스테르 화합물을 유기용매중에서 에스테르 교환반응시킴으로써 모노글리세리드를 선택적으로 제조하는 방법
제 1항에 있어서,

효소는 리파제인 것을 특징으로 하는 모노글리세리드의 선택적 제조방법.
제 1항에 있어서,

지방산은 탄소수가 12 내지 22개이며, 불포화도가 0 내지 3인 것을 특징으로 하는

모노글리세리드의 선택적 제조방법.
제 1항에 있어서,

지방산의 에스테르 화합물은 지방산의 메틸에스테르, 지방산의 에틸에스테르인 것을 특징으로 하는

모노글리세리드의 선택적 제조방법.
제 1항에 있어서,

유기용매는 1,4-디옥산, 테트라히드로퓨란, 아세톤인 것을 특징으로 하는

모노글리세리드의 선택적 제조방법.
제 1항에 있어서,

에스테르 교환반응은 글리세린과 지방산의 메틸에스테르 화합물을 1:1 내지 1:9의 몰비로 수행하는 것을 특징으로 하는

모노글리세리드의 선택적 제조방법.
제 1항에 있어서,

에스테르 교환반응은 10시간 내지 48시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는

모노글리세리드의 선택적 제조방법.
제 1항에 있어서,

에스테르 교환반응은 15℃내지 60℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는

모노글리세리드의 선택적 제조방법.