JP2586084B2

JP2586084B2 - 酵素の改質方法および油脂の加水分解方法

Info

Publication number: JP2586084B2
Application number: JP63038632A
Authority: JP
Inventors: 正秀中田; 正船田
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1988-02-23
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1997-02-26
Anticipated expiration: 2012-02-26
Also published as: JPH01215286A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はキャンディダ・シリンドラセ（Candida cyli
ndracea）より得られるリパーゼ（以下単にキャンディ
ダ・シリンドラセリパーゼと略す）を酸で処理する酵素
の改質方法に関する。

また、本発明は油脂を前記リパーゼにより加水分解す
る方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、油脂工業においては油脂の加水分解を高温高圧
下で行う方法がとられていたが、最近では高度不飽和脂
肪酸など熱に対して不安定な物質の製造に、常温常圧で
の酵素法が行われるようになってきた。例えば特開昭58
−205499号、特開昭57−170193号などが挙げられる。こ
れら高度不飽和脂肪酸はアラキドン酸、エイコサペンタ
エン酸、ドコサヘキサエン酸など、その生理活性が注目
され、医薬品あるいはその前駆体として有望なものと考
えられている。

酵素法による油脂の加水分解には、キャンディダ・シ
リンドラセリパーゼ、膵臓リパーゼ、リゾプスリパーゼ
など種々のものが用いられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

工業的に酵素を用いるためには、安価で大量に入手で
きるものが必要であるが、現在までに市販されているリ
パーゼはキャンディダ・シリンドラセリパーゼ以外は、
いずれも高価であり、また大量に生産することが困難な
ものである。従ってキャンディダ・シリンドラセリパー
ゼが最も工業的なコストに適したものと言えるのである
が、従来このリパーゼはトリグリセリドの３つの結合、
即ちSn−１位、２位、３位のエステル結合をすべて加水
分解する酵素として知られていた。従って位置特異性は
示さないと言われていた。

高度不飽和脂肪酸はトリグリセリドのSn−２位に多く
存在するため、これらの化合物をより高濃度で得るには
Sn−２位のみを加水分解し、遊離型としてこれらの物を
取り出す方法と、Sn−１位、３位のみを加水分解してグ
リセリド型で濃縮する方法が考えられる。しかしながら
通常のキャンディダ・シリンドラセリパーゼでは、これ
らの位置特異的な加水分解ができないという問題点があ
った。

本発明の目的は、キャンディダ・シリンドラセリパー
ゼを改質すること、また、キャンディダ・シリンドラセ
リパーゼを用いて高度不飽和脂肪酸を位置特異的に加水
分解する方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の発明は、キャンディダ・シリンドラセ
リパーゼを酸で処理することを特徴とする1,3−ジグリ
セリドリパーゼ活性を有する酵素への改質方法であり、
第２の発明は、油脂にキャンディダ・シリンドラセリパ
ーゼを用いてpH3〜５の酸性下で加水分解反応を行い、
トリグリセリドのSn−１位およびSn−３位のエステル結
合を特異的に分解することを特徴とする油脂の分解方法
である。

本発明に用いるキャンディダ・シリンドラセを培養し
て得られるリパーゼは、市販のリパーゼ等を用いること
ができ、例えばリパーゼOF（名糖産業（株）製、キャン
ディダ・シリンドラセの培養液をアセトン処理して得ら
れる酵素粉末）等を好ましく挙げることができる。

キャンディダ・シリンドラセリパーゼを精製すると、
２−モノグリセリドリパーゼと1,3−ジグリセリドリパ
ーゼの２種の酵素が得られる。また、この２種の酵素の
性質を調べたところ、２−モノグリセリドリパーゼは酸
に弱く、pH1〜５の範囲で処理すると容易に失活するこ
とが明らかとなった。また同じ条件下では1,3−ジグリ
セリドリパーゼは全く失活しない。すなわち、位置特異
性を示さないリパーゼを酸で処理すると、1,3−ジグリ
セリドにのみを加水分解する酵素に改質することができ
る。

本発明で用いられる酸は、例えば塩酸、硫酸、硝酸、
リン酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸などの酸や、
ギ酸−ギ酸ナトリウムバッファー、塩酸−塩化カリウム
バッファー、酢酸−酢酸ナトリウムバッファー、クエン
酸−クエン酸ナトリウムバッファー、グリシン−塩酸バ
ッファー、塩酸−塩化カリウムバッファー等の緩衝液が
挙げられる。これらの酸性水溶液はpHが１〜５であるこ
とが好ましい。pHが１より小さいと酵素活性が害される
おそれがあり、またpHが５を越えるとSn−２リパーゼ失
活が不十分となり、Sn−１、３リパーゼの位置特異性が
悪くなる。

酵素の酸性水溶液に対する割合は0.1から30重量パー
セントの間であるが、好ましくは１〜10重量パーセント
の範囲である。

処理温度は目的とする1,3−ジグリセリドリパーゼが
失活しないように、１〜５℃の範囲で行うことが好まし
い。

処理時間は１〜10時間で十分である。

酸処理を終えた酵素液は水酸化ナトリウムでpH7.0に
中和し、48時間の透析により脱塩してから凍結乾燥し
て、改質酵素が得られる。本発明は安価で工業的コスト
に適しており、従来、位置特異性を示さなかったキャン
ディダ・シリンドラセリパーゼを、そのpH依存性を利用
して位置特異性を発現させることができる。

また、本発明は、この位置特異性を発現する条件下で
油脂を加水分解して、目的の脂肪酸を効率的に得る方法
である。本発明に用いる油脂は、動物性油、植物性油の
いずれも使用可能であり、例えば牛脂、豚脂、魚油、大
豆油、コーン油、月見草油、オリーブ油等が挙げられ、
特に生理活性のある高度不飽和酸を含む魚油、オリーブ
油、月見草油などが好ましい。

本発明において油脂を加水分解する場合、市販のキャ
ンディダ・シリンドラセリパーゼをそのまま用いる場合
はpH3〜５の酸性下で行うのが好ましく、pHが３より小
さいと油脂の加水分解性が低下し、またpHが５を超える
とSn−２リパーゼの失活が不十分となり、Sn−１、３位
の特異的分解性が低下する。反応においてpHを３〜５に
保つために用いる際は、前記の酸およびバッファー液が
使用できる。基質に用いる油脂により固有の最適pHを示
すので、あらかじめ、この最適pHを測定しておいてか
ら、上記の酸のうち適したものを１種選んで用いる。

なお、本発明の第１の発明で得た改質酵素を用いて油
脂を分解する場合は、中性または弱酸性で反応させるの
が好ましい。アルカリサイドでは酵素が失活して使用で
きない。

酵素の添加量は油脂1gに対して0.01mg〜50mg、好まし
くは0.1〜10mgであり、反応温度は10℃から50℃の範囲
で行われるが、好ましくは20から40℃の間が良い。

この反応は水と油の２層系で行われるので、十分な撹
拌が必要である。通常100から500r.p.m.の範囲で行われ
る。

高度不飽和脂肪酸が空気と接触して酸化するのを防ぐ
ため窒素バブリングにより空気を追い出しながら行う。

反応時間は通常１〜５時間の範囲内で行われる。

〔発明の効果〕

本発明の改質方法によれば、位置特異性を全く示さな
い市販のリパーゼから、油脂のSn−１位、および３位に
特異的に反応する1,3−ジグリセリドリパーゼを選択的
に得ることができる。

また本発明の油脂の加水分解方法によれば市販のリパ
ーゼを用いてトリグリセリドのSn−１位およびSn−３位
のエステル結合を特異的に分解することができるので、
天然油脂から生理活性の強い高度不飽和脂肪酸を分離濃
縮したり、所望の２−モノグリセリドを得ることができ
る。

（実施例）以下、実施例と比較例に基づき本発明を具体的に説明
する。

実施例１ 0.5Mのグリシン−塩酸バッファー、pH3.0、100mlにキ
ャンディダ・シリンドラセリパーゼリパーゼ（名糖産業
（株）製品、リパーゼOF）5gを４℃で溶解し、４℃で５
時間放置する。その後0.1規定の水酸化ナトリウムでpH
7.0に中和し、４℃の水中で48時間透析して塩とバッフ
ァーを除く。これを凍結乾燥すると約5gの改質酵素が得
られる。次にこの酵素5mgを5mlの水に溶解し、魚油（日
本油脂（株）製品）1gを加え、37℃、500r.p.m.で５時
間加水分解を行った後に、その生成物を薄層クロマトグ
ラフィーにて分析したところ、トリグリセリド、ジグリ
セリドのスポットは存在せず、２−モノグリセリドと脂
肪酸のみが検出された。これにより該酵素は1,3−ジグ
リセリドリパーゼであることが明らかである。また２−
モノグリセリド中の脂肪酸の組成をガスクロマトグラフ
ィーにて調べたところ、エイコサペンタエン酸が20％、
ドコサヘキサエン酸が19.1％含まれていた。原料中には
エイコサペンタエン酸が13.5％、ドコサヘキサエン酸が
9.5％含まれていなので、これら高度不飽和脂肪酸はモ
ノグリセリド中に濃縮されたものと考えられる。

実施例２実施例１において、0.5Mグリシン−塩酸バッファー、
pH3.0を0.2Mギ酸−ギ酸ナトリウムバッファー、pH2.0に
変えた他は同様に行った。この改質酵素による魚油分解
物中にはトリグリセリド、ジグリセリドは存在せず、モ
ノグリセリドと脂肪酸のみが検出された。またモノグリ
セリド中の脂肪酸組成は、エイコサペンタエン酸20.4
％、ドコサヘキサエン酸19.6％であった。

実施例３実施例１において、0.5Mグリシン−塩酸バッファー、
pH3.0を0.2M塩酸−塩化カリウムバッファー、pH1.2に、
処理時間を２時間に変えた他は同様に行った。この改質
酵素による魚油加水分解中にはトリグリセリド、ジグリ
セリドは存在せず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出
された。またモノグリセリド中の脂肪酸組成を調べたと
ころ、エイコサペンタエン酸20.1％、ドコサヘキサエン
酸19.6％であった。

実施例４オリーブ油（米山薬品工業（株）製品）500gに0.5gの
キャンディダ・シリンドラセリパーゼ（名糖産業（株）
製品、リパーゼOF）を溶解し、0.1M酢酸−酢酸ナトリウ
ムバッファーpH4.5、500mlを加え、37℃、500r.p.m.で
３時間反応させ、分解物490gを得た。この生成物を薄層
クロマトグラフィーにて分析した結果、トリグリセリ
ド、ジグリセリドのスポットは認められず、モノグリセ
リドと脂肪酸のスポットのみが検出された。

実施例５実施例４において、オリーブ油を魚油（日本油脂
（株）製品）に、酵素量を0.5gから5gに変えた他は同様
に行った。生成物中にトリグリセリド、ジグリセリドの
存在は認められず、モノグリセリドと脂肪酸のみが検出
された。また、このモノグリセリドを精製し、その脂肪
酸組成をガスクロマトグラフィーにて分析した結果、エ
イコサペンタエン酸19％、ドコサヘキサエン酸15％とな
り、原料中の組成（13.5％および9.5％）よりも高濃度
であった。

実施例６実施例４において、オリーブ油を月見草種子油（サミ
ット製油（株）製品）に、0.1M酢酸−酢酸ナトリウムバ
ッファー、pH4.5を0.1Mギ酸−ギ酸ナトリウムバッファ
ー、pH4.0に変えた他は同様に行った。その生成物中に
トリグリセリド、ジグリセリドの存在は認められず、モ
ノグリセリドと脂肪酸のみが検出された。またこのモノ
グリセリド中の脂肪酸組成を分析したところ、γ−リノ
レン酸含量は20.5％であり、原料中の10.2％を上回って
いた。

比較例実施例４において、0.1M酢酸−酢酸ナトリウムバッフ
ァー、pH4.5を0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0
に変えた他は同様に行った。その生成物中にトリグリセ
リド、ジグリセリド、モノグリセリドは殆ど検出され
ず、脂肪酸のみが検出された。これからSn−１、２、３
位に関係なく、全ての位置が分解されたことがわかる。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】キャンディダ・シリンドラセリパーゼを酸
で処理し、1,3−ジグリセリドリパーゼ活性を有する酵
素に改質することを特徴とする酵素の改質方法。
【請求項２】油脂にキャンディダ・シリンドラセリパー
ゼを用いてpH3〜５の酸性下で加水分解反応を行い、ト
リグリセリドのSn−１位およびSn−３位のエステル結合
を特異的に分解することを特徴する油脂の加水分解方
法。