JP2671349B2

JP2671349B2 - 酵素の改質方法および油脂の加水分解方法

Info

Publication number: JP2671349B2
Application number: JP63038633A
Authority: JP
Inventors: 正秀中田; 正船田
Original assignee: 日本油脂株式会社
Priority date: 1988-02-23
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1997-10-29
Anticipated expiration: 2012-10-29
Also published as: JPH01215294A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はキャンディダ・シリンドラセ（Candida cyli
ndracea）より得られるリパーゼ（以下単にキャンディ
ダ・シリンドラセリパーゼと略す）をアルカリで処理す
る酵素の改質方法に関する。

また、本発明は油脂を前記リパーゼにより加水分解す
る方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、油脂工業においては油脂の加水分解を高温高圧
下で行う方法がとられていたが、最近では高度不飽和脂
肪酸など熱に対して不安定な物質の製造に、常温常圧で
の酵素法が行われるようになってきた。例えば特開昭58
−205499号、特開昭57−170193号などが挙げられる。こ
れら高度不飽和脂肪酸はアラキドン酸、エイコサペンタ
エン酸、ドコサヘキサエン酸など、その生理活性が注目
され、医薬品あるいはその前駆体として有望なものと考
えられている。

酵素法による油脂の加水分解には、キャンディダ・シ
リンドラセリパーゼ、膵臓リパーゼ、リゾプスリパーゼ
など種々のものが用いられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

工業的に酵素を用いるためには、安価で大量に入手で
きるものが必要であるが、現在までに市販されているリ
パーゼはキャンディダ・シリンドラセリパーゼ以外は、
いずれも高価であり、また大量に生産することが困難な
ものである。従ってキャンディダ・シリンドラセリパー
ゼが最も工業的なコストに適したものと言えるのである
が、従来このリパーゼはトリグリセリドの３つの結合即
ちSn−１位、２位、３位のエステル結合をすべて加水分
解する酵素として知られていた。従って位置特異性は示
さないと言われていた。

高度不飽和脂肪酸はトリグリセリドのSn−２位に多く
存在するため、これらの化合物をより高濃度で得るには
Sn−２位のみを加水分解し、遊離型としてこれらの物を
取り出す方法と、Sn−１位、３位のみを加水分解してグ
リセリド型で濃縮する方法が考えられる。しかしながら
通常のキャンディダ・シリンドラセリパーゼでは、これ
らの位置特異的な加水分解ができないという問題点があ
った。

本発明の目的は、キャンディダ・シリンドラセリパー
ゼを改質すること、また、キャンディダ・シリンドラセ
リパーゼを用いて高度不飽和脂肪酸を位置特異的に加水
分解する方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の発明は、キャンディダ・シリンドラセ
リパーゼをアルカリで処理することを特徴とする２−モ
ノグリセリドリパーゼ活性を有する酵素への改質方法で
あり、第２の発明は、この方法によって得られた２−モ
ノグリセリドリパーゼ活性を有することを特徴とするキ
ャンディダ・シリンドラセリパーゼの改質酵素を用いて
油脂の加水分解を行い、トリグリセリドのSn−２位のエ
ステル結合を特異的に分解する油脂の加水分解方法であ
る。

本発明に用いるキャンディダ・シリンドラセを培養し
て得られるリパーゼは、市販のリパーゼ等を用いること
ができ、例えばリパーゼOF（名糖産業（株）製、キャン
ディダ・シリンドラセの培養液をアセトン処理して得ら
れる酵素粉末）等を好ましく挙げることができる。

本発明者らは工業的コストに有利なキャンディダ・シ
リンドラセリパーゼの用途を研究してきたが、その一端
としてこの酵素の精製を試みたところ、２−モノグリセ
リドリパーゼと1,3−ジグリセリドリパーゼの２種の酵
素を含んでいることがわかった。

またこれらのうち1,3−ジグリセリドリパーゼはアル
カリに弱く、pH7.5〜12の範囲で処理すると容易に失活
し、また同じ条件下では２−モノグリセリドリパーゼは
全く失活しないことを見出した。すなわち、位置特異性
を示さないキャンディダ・シリンドラセリパーゼをアル
カリで処理して、1,3−ジグリセリドリパーゼのみを失
活させ、２−モノグリセリド活性のみを示す酵素に改質
することができる。

本発明で用いられるアルカリとしては種々のものが挙
げられるが、例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウ
ム、トリス、アンモニア、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナ
トリウムなどの水溶液で、pHが7.5〜12の範囲にあるも
の、あるいは20mM〜1Mのリン酸ナトリウムバッファー、
トリス−塩酸バッファー、グリシン−水酸化ナトリウム
バッファー、炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウムバッ
ファー等で、pHが7.5〜12の範囲内にあるものなどが挙
げられる。pHが7.5より小さいとSn−１、３ジグリセリ
ドリパーゼの失活が不十分となり、Sn−２モノグリセリ
ドリパーゼの位置特異性が悪くなる。特に好ましいpHは
８〜12である。

酵素のアルカリに対する量は0.1から30重量パーセン
トの範囲内であるが、好ましくは１〜10重量パーセント
である。

処理時間は１〜10時間の範囲内で十分である。

処理温度は目的とする２−モノグリエリドリパーゼが
失活しないように、１〜５℃の範囲内で行うことが好ま
しい。

アルカリ処理を終えた酵素液は塩酸等でpH7.0に中和
し、48時間の透析により脱塩してから凍結乾燥して、改
質酵素が得られる。本発明は安価で工業的コストに適し
ており、従来位置特異性を示さなかったキャンディダ・
シリンドラセリパーゼを、そのpH依存性を利用して位置
特異性を発現させることができる。

また、本発明は、この位置特異性を発現する条件下で
油脂を加水分解して、目的の脂肪酸を効率的に得る方法
である。本発明に用いる油脂は、動物性油、植物性油の
いずれも使用可能であり、例えば牛脂、豚脂、魚油、大
豆油、コーン油、月見草油、オリープ油等が挙げられ、
特に生理活性のある高度不飽和酸を含む魚油、オリーブ
油、月見草油などが好ましい。

本発明において油脂を加水分解する場合に用いるアル
カリは、前記のアルカリおよびバッファー液が使用でき
る。

なお、本発明の第１の発明で得た改質酵素を用いて油
脂を分解する場合は、中性または弱アルカリ性で反応さ
せるのが好ましい。酸性下では酵素が失活して使用でき
ない。

酵素の添加量は油脂1gに対して0.01mg〜50mg、好まし
くは0.1〜10mgであり、反応温度は10℃から50℃の範囲
で行われるが、好ましくは20から40℃の間が良い。

この反応は水と油の２層系で行われるので、十分な撹
拌が必要である。通常100から500r.p.m.の範囲で行われ
る。

高度不飽和脂肪酸が空気と接触して酸化するのを防ぐ
ため窒素バブリングにより空気を追い出しながら行う。

反応時間は通常１〜５時間の範囲内で行われる。

〔発明の効果〕

本発明の改質方法によれば、位置特異性を全く示さな
い市販のリパーゼから、油脂のSn−２位に特異的に反応
する２−ジグリセリドリパーゼを選択的に得ることがで
きる。

また本発明の油脂の加水分解方法によれば市販のリパ
ーゼを用いてトリグリセリドのSn−２位のエステル結合
を特異的に分解することができるので、天然油脂から生
理活性の強い高度不飽和脂肪酸を分離濃縮したり、所望
のSn−１、３ジグリセリドを得ることができる。

（実施例）以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１キャンディダ・シリンドラセリパーゼ（名糖産業
（株）製品、キャンディダ・シリンドラセ（Candida cy
lindracea）の生産するリパーゼ、商品名リパーゼOF）5
gを0.1Mのグリシン−水酸化ナトリウムバッファー、pH1
0.0、100mlに溶解し、４℃で５時間放置した。その後、
0.05規定の塩酸でpH7.0に中和し、48時間水中で透析し
てバッファーおよび塩類を除き、凍結乾燥して約5gの酵
素粉末を得た。この酵素5mg、水5ml、魚油（日本油脂
（株）製品）を1g加えて37℃、500r.p.m.で５時間反応
させた。その生成物を薄層クロマトグラフィーにより分
析した結果、トリグリセリドの存在は認められず、1,3
−ジグリセリドと脂肪酸が大部分であり、転位により生
じたと思われる微量の1,2−ジグリセリドと１−および
３−モノグリセリドが検出された。これにより該酵素は
２−モノグリセリドリパーゼであることがわかる。

実施例２実施例１において、0.1Mグリシン−水酸化ナトリウム
バッファー、pH10.0を0.2M、炭酸水素ナトリウム−炭酸
ナトリウムバッファー、pH11.0に、処理時間を５時間か
ら３時間に変えた他は同様に行った。この改質酵素を用
いて同様の加水分解を行ったところ、その生成物中にト
リグリセリドは存在せず、1,3−ジグリセリドと脂肪酸
が大部分であり、転位により生じたと思われる微量の1,
2−ジグリセリドと１−および３−モノグリセリドが検
出された。

実施例３実施例１において、0.1Mグリシン−水酸化ナトリウム
バッファー、pH10.0を水酸化ナトリウム溶液、pH12.0
に、処理時間を５時間から３時間に変えた他は同様に行
った。得られた改質酵素を用いて同様の加水分解を行っ
たところ、その生成物中にはトリグリセリドは存在せ
ず、1,3−ジグリセリドと脂肪酸が大部分であり、転位
により生じたと思われる微量の1,2−ジグリセリドと１
−および３−モノグリセリドが検出された。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】キャンディダ・シリンドラセリパーゼをア
ルカリで処理し、２−モノグリセリドリパーゼ活性を有
する酵素に改質することを特徴とする酵素の改質方法。
【請求項２】請求項１記載の改質方法によって得られた
２−モノグリセリドリパーゼ活性を有することを特徴と
するキャンディダ・シリンドラセリパーゼの改質酵素を
用いて、油脂の加水分解反応を行い、トリグリセリドの
Sn−２位のエステル結合を特異的に分解することを特徴
とする油脂の加水分解方法。