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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf spezifische Inhibitoren der
Pankreaslipase und auf deren Anwendungen bei der Behandlung von
und Vorsorge gegen kardiovaskuläre
Krankheiten, Hyperlipämie
und Fettleibigkeit, sowie auf deren Verwendung als Diagnosereagens
oder für
die Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, die Lipolyse
von Triglyceridsubstraten zu hemmen.
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Nahrungsfette
stellen eine wirksame Energiequelle für den Organismus dar. Die aus
Lipiden verstoffwechselte Energiemenge ist nämlich deutlich höher als
diejenige, die aus Kohlehydraten oder Proteinen vestoffwechselt
wird. Doch kann, wobei praktisch alle aufgenommenen Lipide durch
den Organismus assimiliert werden, eine Nahrungsüberversorgung mit Lipiden starke
Gesundheitsbeschwerden hervorrufen: kardiovaskuläre Beschwerden, Hyperlipämie und
Fettleibigkeit.
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Diese
Beschwerden sind häufig
in Industrieländern
anzutreffen, wo sich die Bevölkerung
oftmals mit Nahrungsmitteln ernährt,
die zu reich an gesättigten
Fettsäuren
sind.
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Um
diese unterschiedlichen Krankheitsbilder zu bekämpfen, ist eine Nahrungsmittelhygiene
notwendig, aber nicht immer ausreichend, die darin besteht, die
Aufnahme von Fettstoffen einzuschränken. Obwohl nämlich manche
Fettstoffe leicht aufzufinden und aus der Nahrung zu verbannen sind
(Butter, Öle, etc.),
sind dies andere durch ihren Einbau in Nahrungsmittel (Fleisch,
Milchprodukte) viel weniger.
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In
den Fällen,
in denen sich die Anordnung einer Diät als unzureichend erweist,
werden medikamentöse
Behandlungen vorgeschlagen. Die meisten der gegenwärtigen Behandlungen
zielen vor allem darauf ab, Hyperlipämien dadurch zu bekämpfen, dass
unter anderem Inhibitoren gegen die Cholesterinsynthese eingesetzt
werden.
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Die
modernen Forschungen wenden sich aber immer mehr Produkten zu, die
eine allgemeinere Hemmung der Fettstoffwechselaktivität bewirken.
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Vor
diesem Hintergrund besteht eine der Ausrichtungen, die besonders
erforscht wurde, in der Hemmung der Pankreaslipase, die ein Schlüsselenzym
bei der Verdauung von Nahrungsmitteltriglyceriden ist; die Verdauung
dieser Nahrungsmitteltriglyceride, die Hauptbestandteile von Lipiden
(ca. 95%) sind, die im oberen Verdauungstrakt durch Lipasen präduodenalen
Ursprungs (Gastrolipase beim Menschen) ausgelöst wird, findet unter der Einwirkung von
Pankreaslipase im Wesentlichen im Darm statt. Diese Pankreaslipase
wandelt die Triglyceride in freie Fettsäuren und 2-Monoglyceride um,
die höherpolige
Hydrolyseprodukte sind, die nach dem Einbau in die Mischmizellen
von Gallensalzen und Phospholipiden in der Lage sind, durch die
Membran des Bürstensaums
von Enterozyten hindurch zu treten.
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Pankreaslipase
spielt also eine wichtige Rolle beim Auftreten von Krankheiten,
die mit dem Vorhandensein eines Lipidüberschusses verbunden sind,
wie kardiovaskuläre
Krankheiten, Hyperlipämien
und Fettleibigkeit, indem sie die Assimilation praktisch aller aufgenommenen
Triglyceride ermöglicht. Darüber hinaus
begünstigt
sie in dem Maße
die Absorption des Cholesterins im Darm, wie die Löslichkeit
des Cholesterins in den Mischmizellen, die reich an Fettsäuren sind,
erhöht
ist.
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Die
Wirkungsweise der Pankreaslipase umfasst mehrere Schritte: die Adsorption
des Enzyms in den Darm auf der Lipidgrenzschicht im Beisein von Gallensalzen
und einer Colipase, deren Aufgabe es ist, die Lipase an der Grenzschicht
zu verankern (C. Chapus et al., FEBS Letters, 1975, 58, 1, 155–158), gefolgt
von der Hydrolyse der sn-1,3-Esterverbindungen von Triacylglycerinen.
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Somit
bringt die Verdauung der Triglyceride Wechselwirkungen von Lipase/Colipase
ins Spiel, die durch eine Lipidgrenzschicht reguliert werden.
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Schweinelipase
ist zum Beispiel ein Glycoprotein mit 499 Aminosäuren, deren Polysaccharidketten
an der Stelle 166 an Asparagin (Asn) gebunden sind. Sie umfasst
zwei durch die Verbindung Phe336-ala337 getrennte Bereiche (M. Bousset-Risso et
al., FEBS Letters, 1985, 182, 2, 323–326). Jeder Bereich umfasst
eine Erkennungsstelle, und zwar: eine Grenzschichterkennungsstelle
(N-endständiger Bereich),
die die eigentliche Hydrolysestelle ist, und eine Erkennungsstelle
für seinen
Proteinpartner (C-endständiger
Bereich), die Colipase. Der N-endständige Bereich (Radikale 1-335),
der das Aktivzentrum des Enzyms trägt, ist vom C-endständigen Bereich
(Radikale 336–449)
durch eine schmale Zone getrennt, die sehr widerstandsfähig gegen
Proteolyse ist. Diese Aufteilung in zwei Bereiche entspricht den
beiden vorstehend angesprochenen spezifischen Funktionen: der N-endständige Bereich
ist für die
Katalyse zuständig,
während
der C-endständige Bereich
mit der Erkennung der Colipase zu tun hat (C. Abousalham et al.,
Protein Engineering, 1992, 5, 1, 105–111).
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Colipase
ist ein kleines, aufgrund des Vorhandenseins von 5 Disulfurbrücken stark
vernetztes Molekül
(10 kDa). Sie trägt
drei für
ihre Funktion essentielle Erkennungsstellen, und zwar: eine Grenzschichterkennungsstelle
(H. van Tilbeurgh et al., Nature, 1993, 362, 814–820), eine Lipaseerkennungsstelle
(C. Chaillan et al., FEBS Letters, 1989, 257, 2, 443–446; H.
van Tilbeurgh et al., Nature, 1992, 359, 159–162) und eine Mizellenerkennungsstelle
(J. Hermoso et al., EMBO J., 1997, 16, 18, 5531–5536). Diese drei Stellen
sind topologisch unterschiedlich.
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Extensive
Forschungen, die seit einigen Jahren durchgeführt werden, ermöglichten
eine Vertiefung der Kenntnisse über
die Beziehungen Struktur/Funktion des Pankreaslipase-/Pankreascolipasesystems
(C. Chaillan et al., 1989, s.o.).
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Ergänzende strukturelle
Forschungen, die sowohl die menschliche Lipase (Winkler F.K. et
al., Nature, 1990, 343, 771–774)
als auch die Lipase des Pferds betreffen (B. Kerfelec et al., Eur.
J. Biochem., 1992, 206, 279–287;
Y. Bourne et al., J. Mol. Biol., 1994; 238, 709–732) haben die Bestätigung der
Existenz der beiden vorgenannten Bereiche in Lipasen unterschiedlichen
Ursprungs bestätigt.
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Das
Erkennen zwischen Lipase und Colipase lässt insbesondere hydrophobe
(N. Mahé-Gouhier et
al., BBA, 1988, 962, 91–97)
und elektrostatische Wechselwirkungen ins Spiel bringen.
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Erfahrung über kovalente
Brückenbildung zwischen
Pankreaslipase und -colipase (C. Chaillan et al., 1989, s.o.), sowie
die Auflösung
der dreidimensionalen Struktur auf 3,1 Å des Lipase-/Colipasekomplexes
(H. van Tilbeurgh et al., 1992, s.o.), haben zur Identifizierung
der Erkennungszonen an den beiden Molekülen in Lösung geführt.
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Um
die Pankreaslipase zu hemmen und eine therapeutische Wirkung bei
Hyperlipämien
und Fettleibigkeit zu erzielen, wurden verschiedene Lösungswege
vorgeschlagen:
- – der Einsatz kovalenter Inhibitoren,
die sich am Aktivzentrum des Enzyms festsetzen; hier kann beispielsweise
Tetrahydrolipstatin (THL) genannt werden [US-amerikanisches Patent
Nr. 4 598 089; P. Hadvary et. al, J. Biol. Chemistry, 1991, 266,
4, 2021–2027;
D. Hermier et al., FEBS Letters, 1991, 286, 1, 186–188]; man
erhält
eine vollständige
Inhibition der Lipolyseaktivität
bei Dosen von 1 mol THL/mol Enzym (P. Hadvary et. al, 1991, s.o.)
oder Dosen von 10 bis 400 mg zweimal täglich (J. Hauptmann et al.,
Am. J. Clin. Nutr., 1992, 55, 309S–313S); ein solches Verfahren
weist eine bestimmte Anzahl von Nachteilen auf, wobei der Hauptnachteil
der Mangel an Spezifität
ist: Tetrahydrolipstatin ist nämlich
für die
Pankreaslipase nicht spezifisch und hemmt andere Lipasen wie die
Carboxylesterlipase, die Gastrolipase und die Lipase, die durch
die Gallensalze menschlicher Muttermilch stimuliert werden; und
- – die
Modifizierung der Art der Grenzschicht durch Beigabe von amphiphilen
Proteinen (Gargouri Y. et al., J. Biol. Chem., 1985, 260, 2268–2273),
Detergentien (Gargouri Y. et al., J. Lip. Res., 1983, 24, 1336–1342) oder
Fasern (Borel P. et al., Am. J. Clin. Nutr., 1989, 49, 1192–1202);
ein solches Verfahren weist eine sehr relative Effizienz auf.
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Diese
beiden Lösungswege
umfassen darüber
hinaus ein nicht zu vernachlässigendes
Risiko an unerwünschten
Nebenwirkungen (Übelkeit,
etc.).
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Folglich
hat es sich der Anmelder zur Aufgabe gemacht, einen neuartigen Inhibitor
für Pankreaslipase
bereitzustellen, der besser auf die praktischen Bedürfnisse
anspricht als die Inhibitoren für
Lipase aus dem Stand der Technik, insbesondere als er eine wirkliche
Spezifizität
der Wirkung gegenüber
Pankreaslipase aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung hat ein Peptid zum Gegenstand, das aus einem
C-endständigen
Fragment einer Pankreaslipase besteht, das die Erkennungsstelle
einer Colipase umfasst (nachstehend als C-endständiges Peptid bezeichnet),
für dessen
Einsatz als Medikament, insbesondere bei der Behandlung von Hyperlipämien, kardiovaskuläre Erkrankungen
und Fettleibigkeit.
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Nach
einer vorteilhaften Ausführungsform der
Erfindung ist das Peptid ein C-endständiges Fragment einer Pankreaslipase,
die aus gereinigten oder rekombinierten Pankreaslipasen vom Mensch, Schwein
oder Pferd ausgewählt
ist.
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Unerwarteter
Weise ermöglicht
es das C-endständige
Peptid dieser unterschiedlichen Pankreaslipasen, wirksam als Köder zu dienen
und einen Wettbewerb zwischen diesem Peptid und der nativen Lipase
bei der Colipase in Gang zu setzen und somit auf signifikante Weise
die lipolytische Wirkung der Lipase zu senken.
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Die
Verabreichung eines solchen Peptids bremst die Wirkung der Pankreaslipase
und hemmt überraschender
Weise zumindest teilweise die Hydrolyse von Nahrungstriglyceriden,
die nicht absorbiert werden (Hemmwirkung des C-endständigen Peptids
auf Lipolyse).
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Die
Affinität
dieses C-endständigen
Peptids beträgt
nämlich
in vitro:
- – in
Lösung
um die 106 gegenüber der Colipase, während
- – an
der Lipidgrenzschicht die Affinität des C-endständigen Peptids
um die 2·108 M beträgt.
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Um
die angestrebte Wirkung zu erzielen, d.h. eine Affinität zur Grenzschicht
um die 2·108 M, wird das C-endständige Peptid vorzugsweise in
Dosen von 0,5 bis 10 mg/Tag über
1 bis 3 Einnahmen verteilt verabreicht, was Dosen von 0,2 bis 10
mg pro Einnahme entspricht.
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Die
vorliegende Erfindung hat ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung
zum Gegenstand, die das C-endständige
Peptid einer Pankreaslipase umfasst, das die Erkennungsstelle einer
wie vorstehend beschriebenen Colipase und mindestens einen pharmazeutisch
zugelassenen Arzneistoffträger
beinhaltet.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung stellt sich vorteilhafter Weise
in einer Einheitsform dar, die über
den oralen Weg verabreicht werden kann, die aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Weich- oder Hartkapseln, Tabletten, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen
besteht.
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Eine
solche pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise zu einer
oralen Verabreichung in magensaftresistenter Form bestimmt.
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Die
vorliegende Erfindung hat ebenfalls weitere Anwendungen des C-endständigen Peptids
von Pankreaslipase zum Gegenstand, beispielsweise als Diagnosereagens,
insbesondere bei der Durchführung
eines Immunenzymtests zur Dosierung der Lipase durch ein Verfahren
der kompetitiven Art, sowie seine Verwendung zur Herstellung eines
Medikaments, das dazu bestimmt ist, die Lipolyse von Triglyceridsubstraten
zu hemmen.
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Außer den
vorstehenden Dispositionen umfasst die Erfindung noch weitere Dispositionen,
die sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, die sich auf Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung sowie die beigefügten Zeichnungen bezieht, worin:
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1 und 2 Scatchard-Kurven
darstellen, die aus Differentialkurven [(C-endständiges Colipase-Peptid)-C-endständiges Peptid]
in wässriger Lösung bei 1 und
im Beisein einer Tributyrin-/Wassergrenzschicht bei 2 erhalten
wurden;
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3 und 4 die
Inhibition der Lipaseaktivität
durch das C-endständige Peptid
der Lipase (Substrat: Triolein, Phospholipide, ganze Gallensalze)
in Abwesenheit (3) oder im Beisein (4) von Ölsäure darstellen.
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Es
sollte jedoch klar sein, dass diese Beispiele nur zu Zwecken der
Darstellung des Erfindungsgegenstands wiedergegeben werden, für den sie
in keiner Weise eine Einschränkung
darstellen.
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Beispiel 1: Isolierung
des C-endständigen
Peptids des Schweins
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- – Reinigung
der Pankreaslipase und der Colipase
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Die
Schweinepankreaslipase wird gereinigt, wie es bei M. Rovery et al.
(Biochim. Biophys. Acta, 1978, 525, 373–379) beschrieben ist, ausgehend
von einem Acetonpankreaspulver.
Die Reinigung der Schweinecolipase
wird nach C. Chapus et al. (Eur. J. Biochem., 1982, 115, 99–105) durchgeführt.
Die
Proteinkonzentrationen werden bei 280 nm bestimmt, indem ein Molekülabsorptionskoeffizient
von 6,65·104 M–1 cm–1 für die Lipase
und von 0,4·10–4 M–1 cm–1 für die Colipase
verwendet wird.
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- – Erhalt,
Reinigung und Analyse des C-endständigen Peptids der Schweinepankreaslipase
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100
mg Schweinelipase wird in 20 ml einer Pufferlösung aus 60 mM Ammoniumbicarbonat,
pH 8,5, aufgelöst,
die 1 mM Benzamidin enthält.
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1
mg mit TLCK (Tosyl-Lysinchlormethylceton) behandeltes Chymotrypsin
wird zugegeben und die Mischung 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Zu unterschiedlichen Zeitpunkten werden Teilmengen entnommen, durch
SDS-PAGE analysiert und auf ihre Lipaseaktivität hin geprüft.
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Der
Chymotrypsinangriff wird durch Zugabe von 0,2 mM PMSG (Phenylmethylsulfonylfluorid)
gestoppt.
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Die
Verdauungsmischung wird in einer Säule Ultrogel AcA 54 (2,5 × 200 mm)
einer Molekülsortierung
unterzogen mit 10 mM einer Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5, die 0,2 M NaCl
und 1 mM Benzamidin enthält,
ins Gleichgewicht gebracht: die Eluierung wird mit demselben Puffer
durchgeführt.
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Die
Aminosäurenanalyse
findet in einer automatischen Analysevorrichtung (Beckmann 6300) nach
24-stündiger
Hydrolyse der Proben in verschlossenen Reagenzgläsern statt, die 6 M dreifach destillierte
HCl enthalten. Die N-endständige
Sequenz des Peptids wird durch Abbau nach dem Edman-Verfahren erzielt,
indem ein Sequenzanalysegerät
(Applied Biosystems 470A) verwendet wird. Die erhaltenen Phenylthiohydantoine
werden durch HPLC (Säule
C18, Brownlee, 5 μm,
2, 1 × 220
mm) analysiert. Sie werden unter Verwendung eines Methanolgefälles (10–46%) in
einem 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,84 eluiert.
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Die
erhaltenen Fragmente werden einer Gel-Elektrophorese (PAGE-SDS) nach dem Verfahren
von Laemmli U.K. (Nature, 1970, 227, 680–685) unterzogen. Die Proteine
und Peptidfragmente werden mit Brillantblau von Coomassie eingefärbt und die
Gelscheiben mit Hilfe einer Mischung aus Ethanol/Essigsäure/Wasser
(5 : 7,5 : 87,5 vol/vol) entfärbt.
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Die
durch den Proteolyseangriff entstandenen Peptide werden im Doppel
in 18%-ige Polyacrylamidgelfragmente gepackt und durch Elektrophorese im
Beisein von SDS getrennt.
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Nach
der Übertragung
auf PVDF (Polyvinylidendifluorid) wird eine Spur eingefärbt, um
das C-endständige
Peptid zu lokalisieren, und die andere wird abgeschnitten, um die
Sequenzanalyse dieser Sequenz durchzuführen.
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Die
Analyse durch SDS-PAGE des isolierten und gereinigten C-endständigen Peptids
sowie die Aminosäureanalyse
zeigt, dass dieses Peptid das erwartete Molekulargewicht und die
erwartete Aminosäurenzusammensetzung
hat (siehe N. Mahé-Gouhier
et al., 1988, s.v., und M. Bousset-Risso et al., 1985, s.v.). Die
Sequenzanalyse des N-endständigen Teils
der Kette weist folgende Sequenz auf: Ala-Arg-Trp-Arg-Tyr-Lys-Ser, was
deutlich zeigt, dass das Chymotrypsin die Sequenz auf Höhe der Verbindung
Phe336-Ala337 spaltet,
welche die Verbindungsstelle der C- und N-endständigen Bereiche der Pankreaslipase
ist.
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Beispiel 2: Nachweis der
Wechselwirkung des C-endständigen
Peptids der Schweinelipase mit der Colipase in wässriger Lösung
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Die
Wechselwirkung zwischen dem C-endständigen Bereich und Colipase
in wässrigem
Medium (in Abwesenheit einer Lipidgrenzschicht) wurde durch Spektralfluorometrie
ermittelt.
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Die
Fluoreszenzemissionsspektren des C-endständigen Peptids werden in einem
Spektralfluorometer Kontron (SFM235) aufgezeichnet, das mit einer
thermostabilisierten Zelle und einem magnetischen Rührsystem
ausgestattet ist. Dieses Spektralfluorometer ist darüber hinaus
an einen Rechner (Apple IIe) angeschlossen.
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Alle
Versuche fanden bei 25°C
und einem pH von 7,5 statt. Die Erregerwellenlänge von 290 nm wurde ausgewählt, weil
die Schweinepankreascolipase keine Tryptophanreste umfasst und die
Veränderungen
bei der Fluoreszenzemission somit den Tryptophanresten des C-endständigen Peptids
bei der Interaktion mit der Colipase zugesprochen werden können.
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Das
Fluoreszenzemissionsspektrum des C-endständigen Peptids wird bei einer
Endkonzentration von 0,26·10–6 M
im 10 mm Puffer Tris-HCl, 7,5 pH, der 0,1 M NaCl enthält, zwischen
300 und 400 nm gemessen. Die Colipase-Ausgangslösung wird im selben Puffer
hergestellt; die Colipasekonzentration variiert von 2,8·10–8 bis
1,4·10–6 M.
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Die
Bewertung der Dissoziationskonstante wird unter Verwendung der folgenden
Scatchard-Formel bestimmt:
worin L
b und
L
f den gebundenen Colipasekonzentrationen
und der freien Colipase im Gleichgewicht, P
o der
Gesamtkonzentration an C-endständigem
Peptid und K
d der Dissoziationskonstante
entsprechen.
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Ergebnisse
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Die
Differentialspektren [(C-endständiges Colipase-Peptid)-C-endständiges Peptid]
zeigen eine Abnahme der Fluoreszenzemission. Die aus diesen Spektren
erhaltenen Scatchard-Kurven lassen eine Schätzung der Dissoziationskonstante
von Colipase/C-endständigem
Peptid bei 10–6 M
in Lösung
unter den vorstehend (1) genau angegebenen Bedingungen
zu.
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In
dieser 1 stellen die Abszissen die Menge des gebundenen
C-endtsändigen
Peptids dar [Colipase-/C-endständiger
(TC) Komplex], und die Ordinaten stellen das Verhältnis von
gebundenem C-endständigem
Peptid/freiem C-endständigen
Peptid [Colipase-/C-endständiger
(TC)/freier C-endständiger
Komplex (C) (TC/T)] dar.
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Beispiel 3: Nachweis der
Wechselwirkung des C-endständigen
Bereichs der Schweinelipase mit der Colipase und in vitro-Hemmwirkung auf die
Lipase an der Grenzschicht (Substrat: Tributyrin)
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– Messbedingungen
der Hemmung der Lipase- und Colipaseaktivitäten durch das C-endständige Peptid
der Lipase im Beisein einer Grenzschicht
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Die
Lipaseaktivität
wird durch Titrimetrie bei 25°C
in einem Medium, das aus einem 1 mM Puffer aus Tris-HCl mit einem
pH von 7,5 besteht, der 0,1 M NaCl und und 5 mM CaCl2 enthält, im Beisein
von Natriumtaurodesoxycholat (NaTDC) mit einer Endkonzentration
von 1 mM ermittelt.
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Die
Colipaseaktivität
wird unter denselben Bedingungen aber im Beisein von 4 mM NaTDC
ermittelt.
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Das
Endvolumen beträgt
15 ml: das verwendete Substrat ist Tributyrin in Emulsionsform mit
einer Endkonzentration von 0,11 M.
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Die
Aktivitäten
werden in Ab- und Anwesenheit von zunehmenden Mengen einer C-endständigen Peptidausgangslösung (10–6 M)
ermittelt.
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- – Hemmung
der Lipaseaktivität
durch das C-endständige
Peptid der Lipase
-
Das
Molverhältnis
Lipase/Colipase beträgt
1, und die Endkonzentration von Lipase und Colipase beträgt 0,19·10–9 M.
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Die
C-endständige
Peptidkonzentration variiert von 0,2·10–9 bis
30·10–9 M.
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Der
höchste
Hemmbetrag der Lipaseaktivität,
der unter diesen Bedingungen verzeichnet wurde, beträgt ca. 50%.
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- – Hemmung
der Colipaseaktivität
durch das C-endständige
Peptid der Lipase
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Das
Molverhältnis
Lipase/Colipase beträgt 0,75
(Lipase 0,19·10–9 M;
Colipase 0,25·10–9 M).
Die C-endständige
Peptidkonzentration variiert wie zuvor. Der höchste verzeichnete Hemmbetrag
der Colipaseaktivität
beträgt
ebenfalls 50%. Die Dissoziationskonstante; die aus der Scatchard-Kurve geschätzt wurde,
beträgt
2·10–8 M
(2).
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Affinität der Colipase in Lösung für das C-endständige Peptid in
der gleichen Größenordnung
ist wie die Affinität der
Colipase für
die Lipase, und dass diese Affinität im Beisein einer Grenzschicht
Tributyrin/Wasser um einen Faktor 50 bis 100 zunimmt.
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Beispiel 4: Nachweis der
Wechselwirkung des C-endständigen
Bereichs der Lipase mit der Colipase im Beisein einer Lipidgrenzschicht:
in vitro Hemmung der Lipaseaktivität durch den C-endständigen Bereich
(physiologisches Substrat: emulgiertes Triolein)
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Die
kinetischen Untersuchungen der Hemmung der Lipase durch den C-endständigen Bereich wurden
im Beisein einer Lipidgrenzschicht durchgeführt, die höherphysiologisch war als im
Beispiel 3, wobei das verwendete Substrat emulgiertes Triolein war.
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Die
Aktivität
der Lipase wird durch Titrimetrie mit Hilfe eines pH-Gebers bei 25°C an einer
Trioleinemulsion unter Bedingungen ermittelt, bei denen die Aktivität des Enzyms
stark vom Vorhandensein der Colipase abhängt.
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Das
Reaktionsmedium (15 ml) enthält:
- – 8
mM Triolein
- – 4
mM Natriumtaurodesoxycholat
- – 1
mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM CaCl2, 0,1 M NaCl
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Die
kompetitiven Versuche werden im Beisein von nativer Lipase und Colipase
und des durch Proteolyse erhaltenen C-endständigen Bereichs durchgeführt.
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- Hemmung der Lipaseaktivität durch den C-endständigen Bereich:
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Die
Endkonzentrationen von Lipase und Colipase betragen 1,7 × 10–9 M
bzw. 1,4 × 10–9 M.
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Das
Molverhältnis
Lipase/Colipase beträgt 1,2.
Für eine
Konzentration des C-endständigen
Bereichs gleich 2 × 10–7 M
beträgt
der höchste
beobachtete Hemmbetrag ca. 50%.
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Beispiel 5: Nachweis der
Wechselwirkung des C-endständigen
Bereichs der Schweinelipase mit der Colipase und in vitro Hemmwirkung
auf die Lipase an der Grenzschicht unter physiologischeren Bedingungen
(Substrat: Triolein, Phospholipide und ganze Gallensalze)
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- – Die
Hemmung der Lipaseaktivität
durch das C-endständige
Peptid der Lipase wird wie in Beispiel 3 beschrieben ermittelt,
aber die verwendeten Substrate bestehen aus Emulsionen von langkettigen
Triglyceriden (10 mM) Triolein im Beisein von Phospholipiden (Verhältnis Triolein/Lecithin
= 20) und einer Mischung aus ganzen Gallensalzen (6 mM) in der Abwesenheit (3)
oder Anwesenheit (4) von Ölsäure (5 mM). Die Ölsäure ist
ein Produkt der Lipolyse. Bei der Ankunft der Speise im Duodenum
wurde ein Teil der Nahrungsmitteltriglyceride bereits hydrolisiert,
und es befinden sich langkettige Fettsäuren (wie die Ölsäure) im
Duodenum. Diese freien Fettsäuren
vermischen sich mit der Gallenflüssigkeit
und finden sich auch teilweise an der Lipidgrenzschicht wieder.
Somit spielen sie also eine Rolle bei der Lipolyse.
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Ergebnisse
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In
allen Fällen
werden 50% Hemmung der Lipolyse im Beisein von 2.10–7 M
C-endständigem
Peptid erzielt, was einer 5-fachen Zunahme der Affinität des C-endständigen Bereichs
für Colipase
im Beisein der Lipidgrenzschicht im Vergleich mit den Werten darstellt,
die in Abwesenheit der Lipidgrenzschicht erhalten werden (1).
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Wie
aus dem Vorstehenden hervorgeht, beschränkt sich die Erfindung keinesfalls
auf die soeben ausführlicher
beschriebenen Ausführungs-
und Anwendungsformen, sondern umfasst ohne den Rahmen noch den Aussagegehalt
der vorliegenden Erfindung zu verlassen, vielmehr alle Varianten,
die dem Fachmann einfallen könnten.