DE69825733T2

DE69825733T2 - Spezifische inhibitoren der pankreatischen lipase und deren anwendungen

Info

Publication number: DE69825733T2
Application number: DE69825733T
Authority: DE
Inventors: Catherine Chapus
Original assignee: Lipogel
Current assignee: Lipogel
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1998-01-06
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2018-01-07
Also published as: CA2277778C; EP0970118B1; HUP0001458A2; CZ294206B6; WO1998030588A1; AU5868698A; DE69825733D1; HUP0001458A3; CN1248264A; EP0970118A1; CZ241499A3; ATE273995T1; FR2758143B1; AU727469B2; NZ337087A; FR2758143A1; ZA9894B; BR9806857A; US6432400B1; CA2277778A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf spezifische Inhibitoren der Pankreaslipase und auf deren Anwendungen bei der Behandlung von und Vorsorge gegen kardiovaskuläre Krankheiten, Hyperlipämie und Fettleibigkeit, sowie auf deren Verwendung als Diagnosereagens oder für die Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, die Lipolyse von Triglyceridsubstraten zu hemmen.
Nahrungsfette stellen eine wirksame Energiequelle für den Organismus dar. Die aus Lipiden verstoffwechselte Energiemenge ist nämlich deutlich höher als diejenige, die aus Kohlehydraten oder Proteinen vestoffwechselt wird. Doch kann, wobei praktisch alle aufgenommenen Lipide durch den Organismus assimiliert werden, eine Nahrungsüberversorgung mit Lipiden starke Gesundheitsbeschwerden hervorrufen: kardiovaskuläre Beschwerden, Hyperlipämie und Fettleibigkeit.
Diese Beschwerden sind häufig in Industrieländern anzutreffen, wo sich die Bevölkerung oftmals mit Nahrungsmitteln ernährt, die zu reich an gesättigten Fettsäuren sind.
Um diese unterschiedlichen Krankheitsbilder zu bekämpfen, ist eine Nahrungsmittelhygiene notwendig, aber nicht immer ausreichend, die darin besteht, die Aufnahme von Fettstoffen einzuschränken. Obwohl nämlich manche Fettstoffe leicht aufzufinden und aus der Nahrung zu verbannen sind (Butter, Öle, etc.), sind dies andere durch ihren Einbau in Nahrungsmittel (Fleisch, Milchprodukte) viel weniger.
In den Fällen, in denen sich die Anordnung einer Diät als unzureichend erweist, werden medikamentöse Behandlungen vorgeschlagen. Die meisten der gegenwärtigen Behandlungen zielen vor allem darauf ab, Hyperlipämien dadurch zu bekämpfen, dass unter anderem Inhibitoren gegen die Cholesterinsynthese eingesetzt werden.
Die modernen Forschungen wenden sich aber immer mehr Produkten zu, die eine allgemeinere Hemmung der Fettstoffwechselaktivität bewirken.
Vor diesem Hintergrund besteht eine der Ausrichtungen, die besonders erforscht wurde, in der Hemmung der Pankreaslipase, die ein Schlüsselenzym bei der Verdauung von Nahrungsmitteltriglyceriden ist; die Verdauung dieser Nahrungsmitteltriglyceride, die Hauptbestandteile von Lipiden (ca. 95%) sind, die im oberen Verdauungstrakt durch Lipasen präduodenalen Ursprungs (Gastrolipase beim Menschen) ausgelöst wird, findet unter der Einwirkung von Pankreaslipase im Wesentlichen im Darm statt. Diese Pankreaslipase wandelt die Triglyceride in freie Fettsäuren und 2-Monoglyceride um, die höherpolige Hydrolyseprodukte sind, die nach dem Einbau in die Mischmizellen von Gallensalzen und Phospholipiden in der Lage sind, durch die Membran des Bürstensaums von Enterozyten hindurch zu treten.
Pankreaslipase spielt also eine wichtige Rolle beim Auftreten von Krankheiten, die mit dem Vorhandensein eines Lipidüberschusses verbunden sind, wie kardiovaskuläre Krankheiten, Hyperlipämien und Fettleibigkeit, indem sie die Assimilation praktisch aller aufgenommenen Triglyceride ermöglicht. Darüber hinaus begünstigt sie in dem Maße die Absorption des Cholesterins im Darm, wie die Löslichkeit des Cholesterins in den Mischmizellen, die reich an Fettsäuren sind, erhöht ist.
Die Wirkungsweise der Pankreaslipase umfasst mehrere Schritte: die Adsorption des Enzyms in den Darm auf der Lipidgrenzschicht im Beisein von Gallensalzen und einer Colipase, deren Aufgabe es ist, die Lipase an der Grenzschicht zu verankern (C. Chapus et al., FEBS Letters, 1975, 58, 1, 155–158), gefolgt von der Hydrolyse der sn-1,3-Esterverbindungen von Triacylglycerinen.
Somit bringt die Verdauung der Triglyceride Wechselwirkungen von Lipase/Colipase ins Spiel, die durch eine Lipidgrenzschicht reguliert werden.
Schweinelipase ist zum Beispiel ein Glycoprotein mit 499 Aminosäuren, deren Polysaccharidketten an der Stelle 166 an Asparagin (Asn) gebunden sind. Sie umfasst zwei durch die Verbindung Phe³³⁶-ala³³⁷ getrennte Bereiche (M. Bousset-Risso et al., FEBS Letters, 1985, 182, 2, 323–326). Jeder Bereich umfasst eine Erkennungsstelle, und zwar: eine Grenzschichterkennungsstelle (N-endständiger Bereich), die die eigentliche Hydrolysestelle ist, und eine Erkennungsstelle für seinen Proteinpartner (C-endständiger Bereich), die Colipase. Der N-endständige Bereich (Radikale 1-335), der das Aktivzentrum des Enzyms trägt, ist vom C-endständigen Bereich (Radikale 336–449) durch eine schmale Zone getrennt, die sehr widerstandsfähig gegen Proteolyse ist. Diese Aufteilung in zwei Bereiche entspricht den beiden vorstehend angesprochenen spezifischen Funktionen: der N-endständige Bereich ist für die Katalyse zuständig, während der C-endständige Bereich mit der Erkennung der Colipase zu tun hat (C. Abousalham et al., Protein Engineering, 1992, 5, 1, 105–111).
Colipase ist ein kleines, aufgrund des Vorhandenseins von 5 Disulfurbrücken stark vernetztes Molekül (10 kDa). Sie trägt drei für ihre Funktion essentielle Erkennungsstellen, und zwar: eine Grenzschichterkennungsstelle (H. van Tilbeurgh et al., Nature, 1993, 362, 814–820), eine Lipaseerkennungsstelle (C. Chaillan et al., FEBS Letters, 1989, 257, 2, 443–446; H. van Tilbeurgh et al., Nature, 1992, 359, 159–162) und eine Mizellenerkennungsstelle (J. Hermoso et al., EMBO J., 1997, 16, 18, 5531–5536). Diese drei Stellen sind topologisch unterschiedlich.
Extensive Forschungen, die seit einigen Jahren durchgeführt werden, ermöglichten eine Vertiefung der Kenntnisse über die Beziehungen Struktur/Funktion des Pankreaslipase-/Pankreascolipasesystems (C. Chaillan et al., 1989, s.o.).
Ergänzende strukturelle Forschungen, die sowohl die menschliche Lipase (Winkler F.K. et al., Nature, 1990, 343, 771–774) als auch die Lipase des Pferds betreffen (B. Kerfelec et al., Eur. J. Biochem., 1992, 206, 279–287; Y. Bourne et al., J. Mol. Biol., 1994; 238, 709–732) haben die Bestätigung der Existenz der beiden vorgenannten Bereiche in Lipasen unterschiedlichen Ursprungs bestätigt.
Das Erkennen zwischen Lipase und Colipase lässt insbesondere hydrophobe (N. Mahé-Gouhier et al., BBA, 1988, 962, 91–97) und elektrostatische Wechselwirkungen ins Spiel bringen.
Erfahrung über kovalente Brückenbildung zwischen Pankreaslipase und -colipase (C. Chaillan et al., 1989, s.o.), sowie die Auflösung der dreidimensionalen Struktur auf 3,1 Å des Lipase-/Colipasekomplexes (H. van Tilbeurgh et al., 1992, s.o.), haben zur Identifizierung der Erkennungszonen an den beiden Molekülen in Lösung geführt.
Um die Pankreaslipase zu hemmen und eine therapeutische Wirkung bei Hyperlipämien und Fettleibigkeit zu erzielen, wurden verschiedene Lösungswege vorgeschlagen:

– der Einsatz kovalenter Inhibitoren, die sich am Aktivzentrum des Enzyms festsetzen; hier kann beispielsweise Tetrahydrolipstatin (THL) genannt werden [US-amerikanisches Patent Nr. 4 598 089; P. Hadvary et. al, J. Biol. Chemistry, 1991, 266, 4, 2021–2027; D. Hermier et al., FEBS Letters, 1991, 286, 1, 186–188]; man erhält eine vollständige Inhibition der Lipolyseaktivität bei Dosen von 1 mol THL/mol Enzym (P. Hadvary et. al, 1991, s.o.) oder Dosen von 10 bis 400 mg zweimal täglich (J. Hauptmann et al., Am. J. Clin. Nutr., 1992, 55, 309S–313S); ein solches Verfahren weist eine bestimmte Anzahl von Nachteilen auf, wobei der Hauptnachteil der Mangel an Spezifität ist: Tetrahydrolipstatin ist nämlich für die Pankreaslipase nicht spezifisch und hemmt andere Lipasen wie die Carboxylesterlipase, die Gastrolipase und die Lipase, die durch die Gallensalze menschlicher Muttermilch stimuliert werden; und
– die Modifizierung der Art der Grenzschicht durch Beigabe von amphiphilen Proteinen (Gargouri Y. et al., J. Biol. Chem., 1985, 260, 2268–2273), Detergentien (Gargouri Y. et al., J. Lip. Res., 1983, 24, 1336–1342) oder Fasern (Borel P. et al., Am. J. Clin. Nutr., 1989, 49, 1192–1202); ein solches Verfahren weist eine sehr relative Effizienz auf.

Diese beiden Lösungswege umfassen darüber hinaus ein nicht zu vernachlässigendes Risiko an unerwünschten Nebenwirkungen (Übelkeit, etc.).
Folglich hat es sich der Anmelder zur Aufgabe gemacht, einen neuartigen Inhibitor für Pankreaslipase bereitzustellen, der besser auf die praktischen Bedürfnisse anspricht als die Inhibitoren für Lipase aus dem Stand der Technik, insbesondere als er eine wirkliche Spezifizität der Wirkung gegenüber Pankreaslipase aufweist.
Die vorliegende Erfindung hat ein Peptid zum Gegenstand, das aus einem C-endständigen Fragment einer Pankreaslipase besteht, das die Erkennungsstelle einer Colipase umfasst (nachstehend als C-endständiges Peptid bezeichnet), für dessen Einsatz als Medikament, insbesondere bei der Behandlung von Hyperlipämien, kardiovaskuläre Erkrankungen und Fettleibigkeit.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid ein C-endständiges Fragment einer Pankreaslipase, die aus gereinigten oder rekombinierten Pankreaslipasen vom Mensch, Schwein oder Pferd ausgewählt ist.
Unerwarteter Weise ermöglicht es das C-endständige Peptid dieser unterschiedlichen Pankreaslipasen, wirksam als Köder zu dienen und einen Wettbewerb zwischen diesem Peptid und der nativen Lipase bei der Colipase in Gang zu setzen und somit auf signifikante Weise die lipolytische Wirkung der Lipase zu senken.
Die Verabreichung eines solchen Peptids bremst die Wirkung der Pankreaslipase und hemmt überraschender Weise zumindest teilweise die Hydrolyse von Nahrungstriglyceriden, die nicht absorbiert werden (Hemmwirkung des C-endständigen Peptids auf Lipolyse).
Die Affinität dieses C-endständigen Peptids beträgt nämlich in vitro:

– in Lösung um die 10⁶ gegenüber der Colipase, während
– an der Lipidgrenzschicht die Affinität des C-endständigen Peptids um die 2·10⁸ M beträgt.

Um die angestrebte Wirkung zu erzielen, d.h. eine Affinität zur Grenzschicht um die 2·10⁸ M, wird das C-endständige Peptid vorzugsweise in Dosen von 0,5 bis 10 mg/Tag über 1 bis 3 Einnahmen verteilt verabreicht, was Dosen von 0,2 bis 10 mg pro Einnahme entspricht.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die das C-endständige Peptid einer Pankreaslipase umfasst, das die Erkennungsstelle einer wie vorstehend beschriebenen Colipase und mindestens einen pharmazeutisch zugelassenen Arzneistoffträger beinhaltet.
Die pharmazeutische Zusammensetzung stellt sich vorteilhafter Weise in einer Einheitsform dar, die über den oralen Weg verabreicht werden kann, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Weich- oder Hartkapseln, Tabletten, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen besteht.
Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise zu einer oralen Verabreichung in magensaftresistenter Form bestimmt.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls weitere Anwendungen des C-endständigen Peptids von Pankreaslipase zum Gegenstand, beispielsweise als Diagnosereagens, insbesondere bei der Durchführung eines Immunenzymtests zur Dosierung der Lipase durch ein Verfahren der kompetitiven Art, sowie seine Verwendung zur Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, die Lipolyse von Triglyceridsubstraten zu hemmen.
Außer den vorstehenden Dispositionen umfasst die Erfindung noch weitere Dispositionen, die sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, die sich auf Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung sowie die beigefügten Zeichnungen bezieht, worin:
1 und 2 Scatchard-Kurven darstellen, die aus Differentialkurven [(C-endständiges Colipase-Peptid)-C-endständiges Peptid] in wässriger Lösung bei 1 und im Beisein einer Tributyrin-/Wassergrenzschicht bei 2 erhalten wurden;
3 und 4 die Inhibition der Lipaseaktivität durch das C-endständige Peptid der Lipase (Substrat: Triolein, Phospholipide, ganze Gallensalze) in Abwesenheit (3) oder im Beisein (4) von Ölsäure darstellen.
Es sollte jedoch klar sein, dass diese Beispiele nur zu Zwecken der Darstellung des Erfindungsgegenstands wiedergegeben werden, für den sie in keiner Weise eine Einschränkung darstellen.
Beispiel 1: Isolierung des C-endständigen Peptids des Schweins

– Reinigung der Pankreaslipase und der Colipase

Die Schweinepankreaslipase wird gereinigt, wie es bei M. Rovery et al. (Biochim. Biophys. Acta, 1978, 525, 373–379) beschrieben ist, ausgehend von einem Acetonpankreaspulver.
Die Reinigung der Schweinecolipase wird nach C. Chapus et al. (Eur. J. Biochem., 1982, 115, 99–105) durchgeführt.
Die Proteinkonzentrationen werden bei 280 nm bestimmt, indem ein Molekülabsorptionskoeffizient von 6,65·10⁴ M^–1 cm^–1 für die Lipase und von 0,4·10^–4 M^–1 cm^–1 für die Colipase verwendet wird.

– Erhalt, Reinigung und Analyse des C-endständigen Peptids der Schweinepankreaslipase

100 mg Schweinelipase wird in 20 ml einer Pufferlösung aus 60 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,5, aufgelöst, die 1 mM Benzamidin enthält.
1 mg mit TLCK (Tosyl-Lysinchlormethylceton) behandeltes Chymotrypsin wird zugegeben und die Mischung 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten werden Teilmengen entnommen, durch SDS-PAGE analysiert und auf ihre Lipaseaktivität hin geprüft.
Der Chymotrypsinangriff wird durch Zugabe von 0,2 mM PMSG (Phenylmethylsulfonylfluorid) gestoppt.
Die Verdauungsmischung wird in einer Säule Ultrogel AcA 54 (2,5 × 200 mm) einer Molekülsortierung unterzogen mit 10 mM einer Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5, die 0,2 M NaCl und 1 mM Benzamidin enthält, ins Gleichgewicht gebracht: die Eluierung wird mit demselben Puffer durchgeführt.
Die Aminosäurenanalyse findet in einer automatischen Analysevorrichtung (Beckmann 6300) nach 24-stündiger Hydrolyse der Proben in verschlossenen Reagenzgläsern statt, die 6 M dreifach destillierte HCl enthalten. Die N-endständige Sequenz des Peptids wird durch Abbau nach dem Edman-Verfahren erzielt, indem ein Sequenzanalysegerät (Applied Biosystems 470A) verwendet wird. Die erhaltenen Phenylthiohydantoine werden durch HPLC (Säule C18, Brownlee, 5 μm, 2, 1 × 220 mm) analysiert. Sie werden unter Verwendung eines Methanolgefälles (10–46%) in einem 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,84 eluiert.
Die erhaltenen Fragmente werden einer Gel-Elektrophorese (PAGE-SDS) nach dem Verfahren von Laemmli U.K. (Nature, 1970, 227, 680–685) unterzogen. Die Proteine und Peptidfragmente werden mit Brillantblau von Coomassie eingefärbt und die Gelscheiben mit Hilfe einer Mischung aus Ethanol/Essigsäure/Wasser (5 : 7,5 : 87,5 vol/vol) entfärbt.
Die durch den Proteolyseangriff entstandenen Peptide werden im Doppel in 18%-ige Polyacrylamidgelfragmente gepackt und durch Elektrophorese im Beisein von SDS getrennt.
Nach der Übertragung auf PVDF (Polyvinylidendifluorid) wird eine Spur eingefärbt, um das C-endständige Peptid zu lokalisieren, und die andere wird abgeschnitten, um die Sequenzanalyse dieser Sequenz durchzuführen.
Die Analyse durch SDS-PAGE des isolierten und gereinigten C-endständigen Peptids sowie die Aminosäureanalyse zeigt, dass dieses Peptid das erwartete Molekulargewicht und die erwartete Aminosäurenzusammensetzung hat (siehe N. Mahé-Gouhier et al., 1988, s.v., und M. Bousset-Risso et al., 1985, s.v.). Die Sequenzanalyse des N-endständigen Teils der Kette weist folgende Sequenz auf: Ala-Arg-Trp-Arg-Tyr-Lys-Ser, was deutlich zeigt, dass das Chymotrypsin die Sequenz auf Höhe der Verbindung Phe³³⁶-Ala³³⁷ spaltet, welche die Verbindungsstelle der C- und N-endständigen Bereiche der Pankreaslipase ist.
Beispiel 2: Nachweis der Wechselwirkung des C-endständigen Peptids der Schweinelipase mit der Colipase in wässriger Lösung
Die Wechselwirkung zwischen dem C-endständigen Bereich und Colipase in wässrigem Medium (in Abwesenheit einer Lipidgrenzschicht) wurde durch Spektralfluorometrie ermittelt.
Die Fluoreszenzemissionsspektren des C-endständigen Peptids werden in einem Spektralfluorometer Kontron (SFM235) aufgezeichnet, das mit einer thermostabilisierten Zelle und einem magnetischen Rührsystem ausgestattet ist. Dieses Spektralfluorometer ist darüber hinaus an einen Rechner (Apple IIe) angeschlossen.
Alle Versuche fanden bei 25°C und einem pH von 7,5 statt. Die Erregerwellenlänge von 290 nm wurde ausgewählt, weil die Schweinepankreascolipase keine Tryptophanreste umfasst und die Veränderungen bei der Fluoreszenzemission somit den Tryptophanresten des C-endständigen Peptids bei der Interaktion mit der Colipase zugesprochen werden können.
Das Fluoreszenzemissionsspektrum des C-endständigen Peptids wird bei einer Endkonzentration von 0,26·10^–6 M im 10 mm Puffer Tris-HCl, 7,5 pH, der 0,1 M NaCl enthält, zwischen 300 und 400 nm gemessen. Die Colipase-Ausgangslösung wird im selben Puffer hergestellt; die Colipasekonzentration variiert von 2,8·10^–8 bis 1,4·10^–6 M.
Die Bewertung der Dissoziationskonstante wird unter Verwendung der folgenden Scatchard-Formel bestimmt:
worin L_b und L_f den gebundenen Colipasekonzentrationen und der freien Colipase im Gleichgewicht, P_o der Gesamtkonzentration an C-endständigem Peptid und K_d der Dissoziationskonstante entsprechen.
Ergebnisse
Die Differentialspektren [(C-endständiges Colipase-Peptid)-C-endständiges Peptid] zeigen eine Abnahme der Fluoreszenzemission. Die aus diesen Spektren erhaltenen Scatchard-Kurven lassen eine Schätzung der Dissoziationskonstante von Colipase/C-endständigem Peptid bei 10^–6 M in Lösung unter den vorstehend (1) genau angegebenen Bedingungen zu.
In dieser 1 stellen die Abszissen die Menge des gebundenen C-endtsändigen Peptids dar [Colipase-/C-endständiger (TC) Komplex], und die Ordinaten stellen das Verhältnis von gebundenem C-endständigem Peptid/freiem C-endständigen Peptid [Colipase-/C-endständiger (TC)/freier C-endständiger Komplex (C) (TC/T)] dar.
Beispiel 3: Nachweis der Wechselwirkung des C-endständigen Bereichs der Schweinelipase mit der Colipase und in vitro-Hemmwirkung auf die Lipase an der Grenzschicht (Substrat: Tributyrin)
– Messbedingungen der Hemmung der Lipase- und Colipaseaktivitäten durch das C-endständige Peptid der Lipase im Beisein einer Grenzschicht
Die Lipaseaktivität wird durch Titrimetrie bei 25°C in einem Medium, das aus einem 1 mM Puffer aus Tris-HCl mit einem pH von 7,5 besteht, der 0,1 M NaCl und und 5 mM CaCl₂ enthält, im Beisein von Natriumtaurodesoxycholat (NaTDC) mit einer Endkonzentration von 1 mM ermittelt.
Die Colipaseaktivität wird unter denselben Bedingungen aber im Beisein von 4 mM NaTDC ermittelt.
Das Endvolumen beträgt 15 ml: das verwendete Substrat ist Tributyrin in Emulsionsform mit einer Endkonzentration von 0,11 M.
Die Aktivitäten werden in Ab- und Anwesenheit von zunehmenden Mengen einer C-endständigen Peptidausgangslösung (10^–6 M) ermittelt.

– Hemmung der Lipaseaktivität durch das C-endständige Peptid der Lipase

Das Molverhältnis Lipase/Colipase beträgt 1, und die Endkonzentration von Lipase und Colipase beträgt 0,19·10^–9 M.
Die C-endständige Peptidkonzentration variiert von 0,2·10^–9 bis 30·10^–9 M.
Der höchste Hemmbetrag der Lipaseaktivität, der unter diesen Bedingungen verzeichnet wurde, beträgt ca. 50%.

– Hemmung der Colipaseaktivität durch das C-endständige Peptid der Lipase

Das Molverhältnis Lipase/Colipase beträgt 0,75 (Lipase 0,19·10^–9 M; Colipase 0,25·10^–9 M). Die C-endständige Peptidkonzentration variiert wie zuvor. Der höchste verzeichnete Hemmbetrag der Colipaseaktivität beträgt ebenfalls 50%. Die Dissoziationskonstante; die aus der Scatchard-Kurve geschätzt wurde, beträgt 2·10^–8 M (2).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Affinität der Colipase in Lösung für das C-endständige Peptid in der gleichen Größenordnung ist wie die Affinität der Colipase für die Lipase, und dass diese Affinität im Beisein einer Grenzschicht Tributyrin/Wasser um einen Faktor 50 bis 100 zunimmt.
Beispiel 4: Nachweis der Wechselwirkung des C-endständigen Bereichs der Lipase mit der Colipase im Beisein einer Lipidgrenzschicht: in vitro Hemmung der Lipaseaktivität durch den C-endständigen Bereich (physiologisches Substrat: emulgiertes Triolein)
Die kinetischen Untersuchungen der Hemmung der Lipase durch den C-endständigen Bereich wurden im Beisein einer Lipidgrenzschicht durchgeführt, die höherphysiologisch war als im Beispiel 3, wobei das verwendete Substrat emulgiertes Triolein war.
Die Aktivität der Lipase wird durch Titrimetrie mit Hilfe eines pH-Gebers bei 25°C an einer Trioleinemulsion unter Bedingungen ermittelt, bei denen die Aktivität des Enzyms stark vom Vorhandensein der Colipase abhängt.
Das Reaktionsmedium (15 ml) enthält:

– 8 mM Triolein
– 4 mM Natriumtaurodesoxycholat
– 1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM CaCl₂, 0,1 M NaCl

Die kompetitiven Versuche werden im Beisein von nativer Lipase und Colipase und des durch Proteolyse erhaltenen C-endständigen Bereichs durchgeführt.

Hemmung der Lipaseaktivität durch den C-endständigen Bereich:

Die Endkonzentrationen von Lipase und Colipase betragen 1,7 × 10^–9 M bzw. 1,4 × 10^–9 M.
Das Molverhältnis Lipase/Colipase beträgt 1,2. Für eine Konzentration des C-endständigen Bereichs gleich 2 × 10^–7 M beträgt der höchste beobachtete Hemmbetrag ca. 50%.
Beispiel 5: Nachweis der Wechselwirkung des C-endständigen Bereichs der Schweinelipase mit der Colipase und in vitro Hemmwirkung auf die Lipase an der Grenzschicht unter physiologischeren Bedingungen (Substrat: Triolein, Phospholipide und ganze Gallensalze)

– Die Hemmung der Lipaseaktivität durch das C-endständige Peptid der Lipase wird wie in Beispiel 3 beschrieben ermittelt, aber die verwendeten Substrate bestehen aus Emulsionen von langkettigen Triglyceriden (10 mM) Triolein im Beisein von Phospholipiden (Verhältnis Triolein/Lecithin = 20) und einer Mischung aus ganzen Gallensalzen (6 mM) in der Abwesenheit (3) oder Anwesenheit (4) von Ölsäure (5 mM). Die Ölsäure ist ein Produkt der Lipolyse. Bei der Ankunft der Speise im Duodenum wurde ein Teil der Nahrungsmitteltriglyceride bereits hydrolisiert, und es befinden sich langkettige Fettsäuren (wie die Ölsäure) im Duodenum. Diese freien Fettsäuren vermischen sich mit der Gallenflüssigkeit und finden sich auch teilweise an der Lipidgrenzschicht wieder. Somit spielen sie also eine Rolle bei der Lipolyse.

Ergebnisse
In allen Fällen werden 50% Hemmung der Lipolyse im Beisein von 2.10^–7 M C-endständigem Peptid erzielt, was einer 5-fachen Zunahme der Affinität des C-endständigen Bereichs für Colipase im Beisein der Lipidgrenzschicht im Vergleich mit den Werten darstellt, die in Abwesenheit der Lipidgrenzschicht erhalten werden (1).
Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, beschränkt sich die Erfindung keinesfalls auf die soeben ausführlicher beschriebenen Ausführungs- und Anwendungsformen, sondern umfasst ohne den Rahmen noch den Aussagegehalt der vorliegenden Erfindung zu verlassen, vielmehr alle Varianten, die dem Fachmann einfallen könnten.

Claims

Peptid, das aus einem C-Endgruppenfragment von Pankreaslipase besteht, das die Erkennungsstelle für eine Colipase enthält, für seine Verwendung als Medikament.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einem Fragment einer Pankreaslipase entspricht, die aus gereinigten oder rekombinanten Pankreaslipasen von Mensch, Schwein oder Pferd ausgewählt ist.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, für seine Verwendung in der Behandlung von Hyperlipämien.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, für seine Verwendung in der Behandlung von Adipositas.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, für seine Verwendung in der Behandlung von kardiovaskulären Störungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und mindestens einen pharmazeutisch zugelassenen Arzneistoffträger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des Peptids zwischen 0,2 und 10 mg beträgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich in einer Einheitsform darstellt, die sich zur Verabreichung auf oralem Weg eignet, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Weich- oder Hartkapseln, Tabletten, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie magensaftresistent ist.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 als Diagnosereagens.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, die Lipolyse von Triglyceridsubstraten zu hemmen.