DE69633480T2

DE69633480T2 - Verwendung von Phospholipasen in Tierfutter

Info

Publication number: DE69633480T2
Application number: DE69633480T
Authority: DE
Inventors: Robert Franciscus Beudeker; Arie Karst Kies
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2016-05-16
Also published as: DE69633480D1; AU700385B2; WO1996036244A1; JPH0998726A; ATE277524T1; IL118245A; CN1156955A; AU5225596A; US6183739B1; NL1003096A1; CZ11197A3; NZ286574A; MY134684A; TW480175B; AR001939A1; SI9620013B; NL1003096C2; BR9606365A; CZ296039B6; IL118245A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Enzymen in Viehfutter.
Hintergrund der Erfindung
Im Magen-Darm-Trakt von Tieren werden zur Verdauung des Futters eine Anzahl von Enzymen sezerniert. Jedes dieser Enzyme wirkt auf bestimmte Komponenten in einer bestimmten Umgebung eines Teils des Magen-Darm-Trakts ein. Beispielsweise sind Pepsine in der sauren Umgebung des Magens aktiv, während andere Proteasen, wie Chymotrypsin und Carboxypeptidasen, im oberen Teil des Dünndarms bei einem pH-Wert von 6–7 aktiv sind. Viele dieser Enzyme bedürfen einer Vorstufe, bevor sie aktiviert werden. Beispielsweise entsteht Pepsin nur aus Pepsinogen in einer sauren Umgebung. Chymotrypsin und Carboxypeptidasen werden beide in einer inaktiven Form sezerniert und durch die Protease Trypsin aktiviert.
Die Verdauung von Fett ist ein komplizierter Vorgang. Die meisten Fette in der Tiernahrung stehen in Form von Triglyceriden bereit. Diese Triglyceride werden vom Darm kaum (wenn überhaupt) resorbiert und müssen zu Mono- und Diglyceriden, Glyzerin und freien Fettsäuren abgebaut werden. Diese Umwandlung wird durch das Enzym Lipase, das vom Pankreas sezerniert wird, katalysiert. Dieses Enzym ist an der Grenzfläche von Wasser und Öl aktiv. Für eine gute Verdauung ist es wesentlich, dass sehr kleine Tröpfchen von Fett in einer Öl-in-Wasser-Emulsion vorliegen. Emulgatoren sind oberflächenaktive Substanzen, die die Dispersion von Fett in einer wässrigen Phase ermöglichen. Der wichtigste Emulgator im Magen-Darm-Trakt ist die Gallenflüssigkeit. Gallenflüssigkeit wird von der Leber sezerniert und kann in der Gallenblase gelagert werden. Gallenflüssigkeit enthält u. a. Gallensäuren und -salze, Cholesterin und Phospholipide. Vom Gemisch der Komponenten der Gallenflüssigkeit werden mit den (verbleibenden) Triglyceridprodukten kleine Teilchen, nämlich Mizellen, gebildet.
Diese Mizellen diffundieren in die jejunalen Epithelzellen, wo ihr Inhalt freigesetzt und resorbiert wird. In diesen Epithelzellen werden Triglyceride rekonstituiert. Zusammen mit Cholesterin, Cholesterinestern, Phospholipiden und Proteinen bilden sie neue, wasserlösliche Teilchen mit der Bezeichnung Chylomikrone.
Phospholipide, wie Lecithin, werden enzymatisch durch Einwirkung von Phospholipasen A und B abgebaut, die ebenfalls vom Pankreas sezerniert werden.
Lecithin ist ein Gemisch von polaren und neutralen Lipiden, bei dem der Anteil an polaren Lipiden mindestens 60% beträgt. Aufgrund ihres hydrophoben/hydrophilen Charakters werden polare Lipide (und somit Lecithine) als Emulgatoren verwendet. Zu polaren Lipiden gehören (Glycero)-phospholipide und Glycolipide.
Nachstehend ist die Grundstruktur eines Glycerophospholipids angegeben:
X = Cholin
Ethanolamin
Inosit
Serin
Wasserstoff

Glycerophospholipide bestehen grundlegend aus einem Glyzerinrest mit Fettsäuren an der C1- und C2-Position. Die C3-Position ist mit Phosphorsäure verestert. Diese Phosphorsäure ist häufig mit einer Alkoholgruppe verknüpft, so dass die folgenden Verbindungen entstehen:

– Phosphatidylethanolamin	(PE; X = Ethanolamin)
– Phosphatidylcholin	(PC; X = Cholin)
– Phosphatidylserin	(PS; X = Serin)
– Phosphatidylinosit	(PI; X = Inosit)
– Phosphatidylsäure	(PA; X = Wasserstoff)

Glycerophospholipide, die genau einen Fettsäurerest (anstelle der üblichen zwei Fettsäurereste) tragen, werden als Lysophospholipide bezeichnet.
Lecithin wird als Emulgator für zahlreiche Anwendungen eingesetzt, wozu Nahrungsmittel und Futtermittel gehören.
Bei Emulgatoren handelt es sich um oberflächenaktive Substanzen, die die Dispersion einer flüssigen Ölphase in einer Wasserphase ermöglichen. Emulgatoren besitzen sowohl hydrophile als auch lipophile Gruppen innerhalb des gleichen Moleküls. Das Verhältnis von hydrophilen zu lipophilen Gruppen, bekannt als HLB-Wert, ist ein charakteristischer Indikator für Emulgatoren.
Fettlösliche hydrophobe Emulgatoren mit HLB-Werten im Bereich von 0 bis weniger als 10 sind zwar wasserlösliche Verbindungen, weisen aber HLB-Werte zwischen mehr als 10 und 20 auf.
Emulgatoren, wie Lecithin, werden Tierfutter zugesetzt, um einen verbesserten Nährwert des Futters zu erreichen oder um eine bessere Dispersion im Fall eines flüssigen Futters zu erzielen. Ferner ist es bekannt, Tierfutter mit Lysolecithin (unter der Warenbezeichnung Lysoforte^® von der Kemin Company vertrieben) zu versetzen, das verbesserte emulgierende Eigenschaften aufweist, die zu einem besseren Nährwert führen (Pluimveehouderijk, Bd. 24 (18. März 1994), S. 20–21).
Die emulgierenden Eigenschaften von Lecithin werden nicht nur in der Viehzucht durch Zugabe von Lecithin zu trockenen Futtermitteln ausgenützt, sondern auch in Bereichen, wo Tiere flüssiges Futter mit einem großen Fettanteil erhalten. Hierbei handelt es sich vorwiegend um Milchersatzprodukte für Kälber und Milchersatzprodukte für Ferkel. Die Funktion von Lecithinen besteht darin, eine möglichst feine Dispersion des Fettes im bereits zubereiteten flüssigen Futter zu erzielen. Die feine Dispersion führt zu einer verbesserten Verdaubarkeit des Fettes durch die Tiere. Ferner weist das Lecithin eine günstige Wirkung auf das Absetzen von unlöslichen Bestandteilen in einem flüssigen Futtermittel auf.
In den letzten Jahren hat die Futtermittelindustrie damit begonnen, industriell erzeugte Enzyme zur Ergänzung der Enzyme, die im Magen-Darm-Trakt der Tiere erzeugt werden, herzustellen. Zu Beispielen hierfür gehören Phytasen, α-Amylasen, Proteasen und verschiedene Pflanzenzellwand-abbauende Enzyme. Jedoch wird im Stand der Technik nirgends die direkte Zugabe von Phospholipasen zu Tierfutter mit dem Ziel einer Wachstumsförderung der Tiere beschrieben, da die Tiere selbst bereits große Mengen dieser Enzyme im oberen Teil des Dünndarms sezernieren.
EP-A-0 619 079 beschreibt u. a. die Verwendung von Phospholipiden als Überzüge für Granulate mit einem Gehalt an biologisch aktiven Substanzen zur Zugabe zur Nahrung für Wiederkäuer. Die Beschichtung dient dazu, die biologisch aktiven Substanzen im Pansen zu schützen, um eine anschließende Verdauung und Resorption dieser Substanzen über Verdauungsorgane im Anschluß an den Labmagen zu ermöglichen. EP-A-0 619 079 führt ferner aus, dass den Schutzüberzügen gegebenenfalls eine Phospholipase einverleibt werden kann, um deren Hydrolyse zu unterstützen. Jedoch wird in EP-A-0 619 079 die Tatsache, dass Phospholipasen dem Futter zu einer Förderung des Wachstums oder zu einer Verbesserung der Futtermittelverwertung zugesetzt werden kann, weder beschrieben noch nahegelegt.
GB-A-2 267 033 betrifft die Wachstumsförderung, lehrt jedoch die Zugabe einer Kombination aus dem Phospolipidlecithin zusammen mit einem Streptomyces-Stamm zur Silage. Es wurde darauf hingewiesen, dass der Streptomyces-Stamm während der Fermentation der Silage dazu befähigt ist, eine Phospholipase A2 zu erzeugen. Daraus folgt, dass die Verwendung dieser Kombination auf Tierfutter beschränkt ist, dessen Herstellungsverfahren eine Fermentationsstufe umfasst, die mit der Erzeugung von Phospholipase durch diesen Streptomyces-Stamm verträglich ist. Somit besteht immer noch ein Bedürfnis nach einem breit anwendbaren, vielseitigen und gebrauchsfertigen Phospholipase-Futtermittelzusatz zur Verbesserung des Wirkungsgrads der Futterverwertung und/oder zur Förderung des Wachstums von Tieren.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Verbessern der Wirksamkeit einer Futtermittelverwendung bereit, bei dem ein Tier mit einer Diät gefüttert wird, welche eine Zusammensetzung enthält, die einen Futtermittelstoff und ein gebrauchsfertiges Phospholipase-Additiv beinhaltet.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Fördern des Wachstums von Tieren bereit, bei dem ein Tier mit einer Diät gefüttert wird, welche eine Zusammensetzung enthält, die einen Futtermittelstoff und ein gebrauchsfertiges Phospholipase-Additiv beinhaltet.
Die Erfindung stellt ferner Tierfutterzusammensetzungen bereit, die einen Futtermittelstoff und ein gebrauchsfertiges Phospholipase-Additiv beinhalten.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittels bereitgestellt, welches das Mischen einer gebrauchsfertigen Phospholipase mit einem Futtermittelstoff beinhaltet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart die Verwendung von exogen zugesetzten und gebrauchsfertigen Phospholipasen in Tierfutter zur Verbesserung der emulgierenden Eigenschaften von Phospholipiden im Magen-Darm-Trakt und somit zum Verbessern der Wirksamkeit der Futterverwertung und/oder zur Förderung des Wachstums des Tiers. Die Wachstumsförderung von Tieren wird hier als eine Förderung des Wachstums in bezug auf eine Gewichtszunahme im zeitlichen Verlauf (Wachstumsgeschwindigkeit) und/oder als eine Wachstumsförderung in bezug auf den Futterwirkungsgrad (Futter-Umwandlungsverhältnis) definiert.
Zu Phospholipasen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören Phospholipase A1 (EC 3.1.1.32), Phospholipase A2, Phospholipase B (Lysophospholipase), Phospholipase C und Phospholipase D.
Speziell beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Futter, dem Phospholipase A2 (EC 3.1.1.4) zugesetzt worden ist. Phospholipase A2 läßt sich beispielsweise durch Isolieren aus Schweinepankreas als Nebenprodukt der Insulinerzeugung herstellen. Alternativ lässt sich Phospholipase A2 auf rekombinante Weise durch Expression eines heterologen Gens in einem Mikroorganismus, wie Kluyveromyces lactis, herstellen. Das Enzym wird aus derartigen Mikroorganismen durch Fermentation und eine nachgeschaltete Verarbeitung zur Gewinnung des Enzyms erhalten.
Eine weitere Möglichkeit für die exogene Zugabe von Phospholipasen zu Lecithin enthaltendem Tierfutter besteht in der Zugabe von Phospholipase enthaltenden, transgenen Pflanzenmaterialien, vorzugsweise transgenem Saatgut, in denen die Phospholipase durch heterologe Genexpression synthetisiert worden ist. Um dies zu erreichen, wird das für die Phospholipase kodierende Gen in einem Pflanzenexpressionsvektor unter Kontrolle durch entsprechende Pflanzenexpressionssignale, z. B. einen gewebespezifischen Promotor, wie einen saatgutspezifischen Promotor, kloniert. Der das Phospholipasegen enthaltende Expressionsvektor wird anschließend in Pflanzenzellen transformiert und transformierte Pflanzenzellen werden für eine Regeneration zu vollständigen Pflanzen ausgewählt. Die auf diese Weise erhaltenen transgenen Pflanzen können für die Züchtung und Ernte herangezogen werden. Die Teile der Pflanzen, die die heterologe Phospholipase enthalten, können dem Tierfutter entweder direkt oder nach einer Weiterverarbeitung zugesetzt werden. Die heterologe Phospholipase kann in den Samen der transgenen Pflanzen oder in anderen Pflanzenmaterialien, wie Wurzeln, Stielen, Blättern, Holz, Blüten, Rinde und/oder Früchten enthalten sein.
Somit ist unter einem Phospholipase-Additiv eine Phospholipase zu verstehen, die keinen natürlichen Bestandteil der Hauptfutterstoffe darstellt oder darin nicht in ihrer natürlichen Konzentration vorliegt. Z. B. wird die Phospholipase getrennt den Futtermittelstoffen, allein oder in Kombination mit anderen Futtermitteladditiven, zugesetzt oder die Phospholipase stellt einen Bestandteil eines der Futtermittelstoffe dar, ist aber darin durch rekombinante DNA-Technik erzeugt worden.
Ein gebrauchsfertiges Phospholipase-Additiv wird hier als ein Additiv definiert, das nicht in situ im Tierfutter entsteht. Ein gebrauchsfertiges Phospholipase-Additiv kann an Tiere direkt oder vorzugsweise nach Vermischen mit anderen Futtermittelbestandteilen verfüttert werden. Gebrauchsfertige Phospholipase-Additive umfassen Phospholipasen, die in der inaktiven Vorform vorliegen, die aber im Magen-Darm-Trakt aktiviert werden können, z. B. durch proteolytische Verarbeitung.
Ein bevorzugtes Futtermittel enthält ein Phospholipid, vorzugsweise Lecithin, das in Ausgangsmaterialien, beispielsweise in Sojabohnen mit vollem Fettgehalt, Rapssamen mit vollem Fettgehalt, Sojaöl, Rapsöl oder beliebigen anderen Ölsaaten oder Öl, die reich an Lecithin sind, vorhanden ist, zusätzlich zur exogen zugesetzten Phospholipase, bei der es sich vorzugsweise um (mikrobiell erzeugte) Schweine-Phospholipase A2 handelt. Jedoch muß das Futtermittel nicht notwendigerweise ein Phospholipid enthalten, da der Pankreas bereits Phospholipide sezerniert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, dass Phospholipase, vorzugsweise (mikrobiell erzeugte) Schweine-Phospholipase A2, Milchersatzprodukten für Jungtiere mit einem Gehalt an Lecithin zugesetzt wird. Dadurch wird die Verdaubarkeit von Fett durch die Jungtiere verbessert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Zugabe einer Phospholipase zu Diäten für Fische und Krustentiere, um deren Wachstum und Futterumwandlungsverhältnis zu verbessern.
Beispielsweise wird bei Behandlung mit Phospholipase A2 (PLA2) der HLB-Wert von Lecithin von 7 auf etwa 8 oder 9 erhöht, was zu den günstigen Einflüssen einer Phospholipase A2-Behandlung auf die Emulgiereigenschaften von Lecithin beitragen kann.
Schweine-Phospholipase A2 zeigt in vitro unter einem pH-Wert von 6,0 keine Aktivität. Der vorherrschende pH-Wert im Magen-Darm-Trakt von monogastrischen Tieren liegt in Kropf und Magen unter 6,0.
Aus folgenden Gründen sind an sich überhaupt keine vorteilhaften Wirkungen durch eine Zugabe von Phospholipase A2 zu erwarten:

a) es ist sich keine Aktivität einer zugesetzten Phospholipase in Kropf und Magen zu erwarten, was auf die fehlende Übereinstimmung zwischen dem vorherrschenden pH-Wert und der pH-Abhängigkeit des Enzyms zurückzuführen ist; und
b) die Tiere sezernieren selbst große Mengen dieses Enzyms im oberen Teil des Dünndarms, wo der vorherrschende pH-Wert im Einklang mit der pH-Abhängigkeit des Enzyms steht.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Zugabe von exogener Schweine-Phospholipase A2 zu einem deutlich verbesserten Futterumwandlungsverhältnis bei Junghühnern (Broilern) führt (Beispiel 3).
Abgesehen von monogastrischen Tieren, kann Phospholipase A2 auch in vorteilhafter Weise bei polygastrischen Tieren verwendet werden. Beispielsweise ist es während der frühen Laktation von Milchkühen mit hoher Milchleistung von Interesse, den Diäten hohe Konzentrationen an Fett zuzusetzen, um die stark negative Energiebilanz teilweise auszugleichen. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Verdaubarkeit von Fettsäuren im Magen-Darm-Trakt von Milchkühen u. a. in Abhängigkeit von der Futterzusammensetzung und der Futterquelle variiert. Es wurde festgestellt, dass die Verdaubarkeit von Fettsäuren zwischen 87% für eine Diät mit einem Gehalt an 500 g gesättigtem Fett mit einem hohen Gehalt an Palmitinsäure (C16:0) und 64% für eine Diät mit einem Gehalt an 1000 g gesättigtem Fett mit einem hohen Gehalt an Stearinsäure (C18:0) variiert (Weisbjerg et al., Acta Agric. Scand. Section A, Animal Sciences, Bd. 42 (1992), S. 115–120).
Die Variation der Verdaubarkeit von Fettsäuren durch Milchkühe lässt sich großenteils durch eine Variation der Verdaubarkeit im Dünndarm erklären (a. a. O., S. 114–120). Die Wirkung von Phospholipase A2 im Dünndarm von Milchkühen verstärkt vermutlich die Verdaubarkeit von Fettsäuren.
Proteine, wie das Enzym Phospholipase A2, werden üblicherweise im Pansen rasch abgebaut. Deshalb sollen diese Proteine im Dünndarm so abgegeben werden, dass der Abbau im Pansen verhindert wird. Dem Fachmann stehen eine Reihe von Zubereitungsverfahren zur Verfügung, um eine Inaktivierung von Enzymen im Pansen zu verhindern.
Eine signifikante Verbesserung wurde ferner in der Fettverdaubarkeit durch nicht-wiederkäuende Kälber nach Zugabe von Phospholipase, insbesondere von Schweine-Phospholipase A2 (Beispiel 4), festgestellt.
Diäten für Fische und Krustentiere werden häufig mit relativ hohen Konzentrationen an Phospholipiden ergänzt, um annehmbare Ergebnisse in bezug auf Wachstum, Gesundheit und Futterverwertung zu erzielen. Erfindungsgemäß kann diesen Diäten ferner Phospholipase zugesetzt werden, um die Ergebnisse in bezug auf Wachstum und das Futterumwandlungsverhältnis weiter zu verbessern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, dass die Zugabe von Phospholipase und gegebenenfalls von Phospholipiden zu Tierfutter es ermöglicht, den Anteil an teuren Futtermittelbestandteilen, wie Vitaminen und/oder farbgebenden Mitteln, die dem Futter einzuverleiben sind, zu verringern.
Phospholipase kann dem Futter in einer Konzentration zugesetzt werden, die in Abhängigkeit von Typ und Konzentration des Phospholipids und in Abhängigkeit vom zu fütternden Tier im allgemeinen zwischen etwa 1000 und 5000000 Internationalen Einheiten (IU, bezüglich der Definition wird auf Beispiel 1 verwiesen) pro kg Phospholipid variiert. Vorzugsweise werden etwa 10000–500000 IU pro kg Phospholipid zugesetzt. Im allgemeinen enthalten Tierfutterzusammensetzungen etwa 1–2 g Phospholipid pro kg. Infolgedessen erweist sich ein Bereich von 1–10000 IU/kg oder vorzugsweise von 10–1000 IU/kg als angemessen, wobei der bevorzugte Bereich jedoch etwa 100–1000 IU/kg Futtermittel beträgt. Daraus folgt, dass die Dosierung an Phospholipase, die dem Futter zugesetzt wird, angepasst werden kann, sofern ein ungewöhnlicher Phospholipidgehalt im Futtermittel vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Phospholipase unter Anwendung von rekombinanter DNA-Technik erhalten. Die Phospholipase wird auf rekombinante Weise durch heterologe Expression eines Phospholipase-Gens oder -cDNA in einem geeigneten Wirtsorganismus oder alternativ durch homologe Überexpression eines geeigneten endogenen Gens hergestellt.
Die speziellen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung setzen Schweine-Phospholipase A2 ein, die durch heterologe Genexpression in der Hefe Kluyveromyces lactis erzeugt worden ist. Für den Fachmann ist es jedoch ersichtlich, dass Phospholipasen, die aus anderen Quellen erhalten worden sind, ebenfalls für die vorliegende Erfindung funktionsfähig sind. Derartige Phospholipasen können von anderen Säugern, z. B. von Ratten, Mäusen oder Menschen, für die alle die Phospholipase A2-Gene im Stand der Technik verfügbar sind, abgeleitet sein. Alternativ lassen sich die Phospholipasen von Organismen, die nicht zu den Säugern gehören, ableiten, z. B. mikrobielle oder sogar Pflanzen-Phospholipasen.
Gleichermaßen ist der Mikroorganismus, der für die Erzeugung der erfindungsgemäßen Phospholipase herangezogen wird, nicht notwendigerweise nur auf die Hefe Kluyveromyces lactis beschränkt. Abgesehen von K. lactis wurde über eine erfolgreiche heterologe Expression des Schweine-Phospholipase A2-Gens in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus niger berichtet (Übersichtsartikel von Swinkels et al., Antonie van Leeuwenhoek, Bd. 64 (1993), S. 187–201). Es ist daher zu erwarten, dass eine erfolgreiche (heterologe) Expression der erfindungsgemäßen Phospholipasen in einem breiten Spektrum von Mikroorganismen erzielt werden kann. Bevorzugte Mikroorganismen für diesen Zweck sind Bakterien der Gattungen Bacillus und Escherichia, Hefen der Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia und Candida oder filamentöse Pilze der Gattungen Aspergillus, Fusarium und Trichoderma.
Bezüglich der Verfahren zur Expression von Phospholipasen in transgenen Pflanzenmaterialien, vorzugsweise in Saatgut, verweisen wir auf die internationale Patentanmeldung WO-91/14772, worin allgemeine Verfahren für die (heterologe) Expression von Enzymen in Pflanzen (unter Einschluß von Verfahren für die saatgutspezifische Expression von Enzymen) beschrieben werden.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass eine Zugabe der Phospholipase in Form von transgenem Pflanzenmaterial, z. B. transgenem Saatgut, das die Phospholipase enthält, die Bearbeitung des Pflanzenmaterials erforderlich machen kann, um das Enzym verfügbar zu machen oder zumindest dessen Verfügbarkeit zu verbessern. Derartige Bearbeitungstechniken können verschiedene Mahl- und Zerkleinerungstechniken oder thermomechanische Behandlungen, z. B. eine Extrusion oder Expansion, umfassen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung von Streptomyces-Stämmen, die zur Erzeugung einer Phospholipase A2 während einer Silagefermentierung befähigt sind, beschränkt, was u. a. die folgenden Vorteile mit sich bringt:

– Es können beliebige Phospholipasen zugesetzt werden. Dies ermöglicht die Verwendung von Phospholipasen, die bei dem Tier, bei dem das Enzym eingesetzt wird, endogen sind, was eine Genehmigung des Produkts durch die Zulassungebehörden erleichtert.
– Dies ermöglicht die Auswahl einer Phospholipase, die zur Anwendung als Futtermitteladditiv besonders gut geeignet ist.
– Die Notwendigkeit, das Futtermittel zu fermentieren, um das Enzym in situ zu erzeugen, entfällt. Dies ermöglicht eine genaue Steuerung der Menge an Phospholipase-Additiv im Futtermittel, was im Hinblick auf das Optimum im Bereich der Phospholipase-Konzentrationen bei bestimmten Anwendungen wichtig ist (vergl. Beispiel 3).
– Ferner wird eine große Flexibilität in bezug auf die Zubereitung sowohl des Enzym-Additivs als auch des Futtermittels, das dieses Additiv enthält, ermöglicht.
– Die Zugabe von Säugetier-Phospholipase A2 sorgt für einen unerwartet starken Einfluß auf die Wachstumsförderung.

Beispiel 1
Expression von Schweine-Phospholipase A2 (PLA₂) in der Hefe Kluyveromyces lactis
Die Identifizierung und molekulare Klonierung des Gens, das für Schweine-Phospholipase A2-Protein kodiert, wird ausführlich von Geus et al. (Nucl. Acid Res., Bd. 15 (1987), S. 3743–3759) und van den Bergh et al. (Eur. J. Biochem., Bd. 170 (1987), S. 241–246) beschrieben.
Mit einem dieser gut charakterisierten Klone, nämlich pCB08T, das die gesamte PLA₂-cDNA-Sequenz und für Kluyveromyces spezifische genetische regulatorische Elemente enthält, konstruierten wir die Expressionskassette pKLAPLA-11, um die Expression von Schweine-PLA₂ in der Hefe Kluyveromyces lactis zu erreichen. Da die PLA₂-cDNA-Sequenz und die Sequenzen für die regulatorischen Elemente von K. lactis in öffentlichen Datenbanken verfügbar sind, kann der Fachmann sämtliche Materialien, die zur Konstruktion von Expressionskassetten für die Expression von PLA₂ in K. lactis nötig sind, erhalten.
Sämtliche üblichen molekularen Klonierungstechniken, wie Isolierung und Reinigung von Nucleinsäure, Elektrophorese von Nucleinsäuren, enzymatische Modifikation, Spaltung und/oder Amplifikation von Nucleinsäuren, Transformation von E. coli und dergl., wurden gemäß den Angaben in der Literatur durchgeführt (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York (1989); und Innis et al. (Herausgeber) "PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego (1990). Die Synthese von oligo-Desoxynucleotiden und die DNA-Sequenzanalyse wurden an einem Applied Biosystems 380B DNA-Synthesegerät bzw. einem 373A-DNA-Sequenziergerät gemäß den Angaben im Handbuch des Herstellers durchgeführt.
Um die Konstruktion von pKLAPLA-11 zu erleichtern, wurden zunächst geeignete flankierende Restriktionsstellen an den Rändern der reifen PLAcDNA-Sequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingeführt. Am 5'-Rand, unmittelbar an der Spaltungsstelle von pro- und reifem PLA₂-Protein, wurden gleichzeitig eine SmaI-Stelle und am 3'-Rand, unmittelbar stromabwärts vom Stoppcodon, XhoI- und KpnI-Restriktionsstellen eingeführt. Um dies vorzunehmen, wurden zwei Oligonucleotide synthetisiert:
Oligomeres 1
Oligomeres 2
Die PCR-Amplifikation wurde mit den Oligomeren 1 und 2 als Primern und mit pCB08T als Matrize durchgeführt. Das erhaltene amplifizierte 400 bp-PLAcDNA-Fragment wurde mit SmaI und KpnI verdaut und anschließend durch molekulare Klonierung in die entsprechenden Stellen von pTZ18R eingeführt. Der erhaltene Vektor erhielt die Bezeichnung pPLA-1. Dieses modifizierte PLAcDNA-Fragment wurde vollständig sequenziert, um die PCR-Amplifikationsreaktion und die eingeführten flankierenden Restriktionsstellen zu bestätigen.
Zur Einführung einer SalI-Restriktionsstelle und optimaler Hefe-Translationsinitiationssequenzen am 5'-Rand der Präpro-Signalsequenz von PLA₂ wurden zwei komplementäre synthetische Oligonucleotide synthetisiert.
Nach Annealing dieser beiden Oligomeren wurde das erhaltene doppelsträngige DNA-Fragment einer molekularen Klonierung in die entsprechenden Stellen (SalI und SmaI) des pPLA-1 unterzogen. Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pKLAPLA-5 und umfasst die gesamte präproPLA₂cDNA, flankiert am 5'-Ende durch eine einzige SalI-Restriktionsstelle und am 3'-Ende durch eine XhoI-Restriktionsstelle.
Zur Expression von Schweine-PLA₂ in K. lactis wird der starke Lactase-Promotor (P_LAC) von K. lactis verwendet.
Neben der Erzeugung von Lactase in K. lactis wurde diese P_LAC-Promotorsequenz früher dazu verwendet, in K. lactis Rinder-Chymosin (J. van den Berg et al., Bio/Technol, Bd. 8 (1990), S. 135–139) und Humanserumalbumin (HSA) zu exprimieren. Für die Expression von HSA wurde das Plasmid pGBHSA-20 konstruiert (gemäß den Angaben von Swinkels et al., Antonie van Leeuwenhoek Bd. 64 (1993), S. 187–201).
Für die Expression von HSA in K. lactis wird die HSAcDNA-Sequenz in pGBHSA-20 durch den K. lactis-LAC 4-Promotor gesteuert. Am 3'-Ende ist die HSAcDNA von LAC4-Terminatorsequenzen flankiert. Ferner enthält pGBHSA-20 für die Selektion von Transformanten das Tn5-Phosphotransferase-Gen, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 verleiht (Geneticin, BRL; Reiss et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 3317–3322), gesteuert durch den S. cerevisiae ADH1-Promotor (Bennetzen und Hall, J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 3018–3025). In der einzigen SstII-Stelle des LAC4-Promotors enthält pGBHSA-20 den E. coli-Vektor pTZ19R, der für die Amplifikation in E. coli verwendet wird. Vor der Transformation von K. lactis werden die E. coli-pTZ19R-Sequenzen aus pGBHSA-20 durch SstII-Verdau und Agarosegel-Reinigung entfernt. Die Transformation von pGBHSA-20, das in der SstII-Stelle des LAC4-Promotors linearisiert ist, in K. lactis führt durch homologe Rekombination zur Integration in den genomischen LAC4-Promotor.
Für die Expression von Schweine-PLA₂ in K. lactis wurde die präproPLA₂-Sequenz in geeigneter Weise mit der K. lactis-Lactase-Promotorsequenz in pGBHSA-20 fusioniert. Hierzu wurde pGBHSA-20 mit SalI und XhoI verdaut und die HSAcDNA-Sequenz wurde durch molekulares Klonieren anstelle des SalI-Xhol-DNA-Fragments von pKLAPLA-5 eingesetzt. Wie vorstehend beschrieben, umfasst dieses SalI-XhoI-DNA- Fragment von pKLAPLA-5 die präproPLA₂-Kodierungssequenz. Der endgültige Expressionsvektor für PLA₂ erhielt die Bezeichnung pKLAPLA-11.
Hefetransformanten wurden gemäß den in unserer veröffentlichten Patentanmeldung EP-A-0 635 574 beschriebenen Verfahren, die auf dem Verfahren von H. Ito et al. (J. Bacteriol., Bd. 153 (1983), S. 163–168) beruhen, erzeugt. PKLAPLA-11 wurde im LAC 4-Promotor durch SstII-Verdau linearisiert. Die pTZ19r-Sequenzen wurden durch Fraktionierung und Reinigen unter Verwendung von Agarosegelen entfernt. 15 μg dieses DNA-Fragments wurden in die K. lactis-Stämme CBS 2360 und CBS 683 übertragen. G418-resistente Kolonien wurden von beiden Stämmen nach 3-tägiger Inkubation bei 30°C erhalten.
Eine begrenzte Anzahl an Transformanten für jeden Wirtsstamm wurde zunächst ausgewählt, um einen Test auf Expression von aktiver Schweine-PLA₂ im Kulturmedium vorzunehmen. Transformanten wurden in K. lactis-YEPD-Kulturmedium mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen inokuliert: 1% (Gew./Vol.) Hefeextrakt; 2% (Gew./Vol.) Pepton; 2% (Gew./Vol.) Glucose und 50 μg/ml G418. Nach 3-tägiger Züchtung bei 30°C wurden die Überstände gewonnen und auf die Anwesenheit von aktiver PLA₂ mit dem Hühnereidotter-Aktivitätstest gemäß den nachstehenden Angaben im Anschluß an eine Behandlung der Proben mit Trypsin getestet. Die Spaltung des Propeptids ist erforderlich, um das inaktive Proenzym (erzeugt durch die K. lactis-Transformanten) zu aktiver, reifer PLA₂ zu aktivieren.
Sämtliche Transformanten erzeugten offensichtlich aktive Schweine-PLA₂ im Bereich von 5 bis 40 U/ml.
1 Einheit (IU) ist als die Enzymmenge definiert, die unter folgenden Standardbedingungen 1 Mikromol freie Fettsäure pro Minute erzeugt: Eidottersubstrat (0,4% Phospholipide), pH-Wert 8, 40°C, 6 mM Ca²⁺.
Beispiel 2
Herstellung von stabilen Enzympräparaten
Kulturbrühe von Kluyveromyces lactis wird einer Plattenfiltration und anschließend einer Ultrafiltration unterworfen. Das Ultrafiltrat wird beim pH-Wert 8,0 in Gegenwart von 10 mM CaCl₂ 2,5 Stunden mit 0,3% Trypsin behandelt, wodurch das Heptapeptid des Proenzyms zur Aktivierung des Enzmys entfernt wird.
Benzoesäure und Sorbinsäure werden als Konservierungsmittel beim pH-Wert 4,0 zugegeben. Die verbleibende Trypsinaktivität wird 30 Minuten bei 70°C inaktiviert. Das Endprodukt ist bräunlich gefärbt und weist eine Aktivität von 10000 IU/ml auf.
Die Stabilität dieses Präparats kann durch weitere Reinigung und Lagerung bei niederen Temperaturen verbessert werden. Nach 1-monatiger Lagerung bei 4°C wird kein Verlust an Enzymaktivität festgestellt.
Beispiel 3
Anwendung von Phospholipase A2 in Tierfutter
Versuche werden mit Junghühnern (Broilern) durchgeführt, um die Wirksamkeit von Phospholipase A2 zu testen. Männliche Hähnchen (Ross) werden 1 bis 5 Tage mit einer Standarddiät versorgt. Am 5. Tag werden Tiere aus dieser Gruppe ausgewählt und auf Käfige verteilt. Das Gewicht der Tiere und die Gewichtsvariation werden berücksichtigt. Das Durchschnittsgewicht und die Abweichungen davon sind für jeden Käfig gleich. 15 Tiere werden in einem Käfig gehalten. Die Käfige befinden sich in einem künstlich erwärmten, belüfteten und beleuchteten Hühnerhaus. Die Bodenfläche eines jeden Käfigs beträgt 0,98 m², wobei Drahtböden vorliegen. Das Hühnerhaus wird 24 Stunden am Tag beleuchtet. Während der Versuchsdauer wird die Lichtintensität allmählich verringert. Die Temperatur wird allmählich von 28°C während der ersten Woche auf 23°C während der letzten Woche der Versuchsdauer verringert. Die Feuchtigkeit in der Hühneranlage beträgt während der Versuchsdauer etwa 60%. Die Tiere sind gegen die New Castle-Krankheit durch ein Sprühverfahren im Alter von 1 und 14 Tagen geimpft worden. Der Versuch dauert 33 Tage, einschließlich einer Periode von 5 Tagen vor dem Test und einer Testdauer von 28 Tagen.
Die experimentellen Diäten werden den Tieren nach Belieben angeboten. Wasser steht zur freien Verfügung.
Es handelt sich um ein in der Kälte pelletisiertes Futter (die Temperaturen werden unter 65°C gehalten) mit einem Durchmesser von 3 mm.
Der Versuch umfasst die folgenden Behandlungen:

a) Mais/Weizen/Soja-Diät (negative Kontrolle)
b) Mais/Weizen/Soja-Diät + 100 IU/kg
c) Mais/Weizen/Soja-Diät + 500 IU/kg

Jede Behandlung wird 6-mal wiederholt (90 Vögel pro Behandlung insgesamt). Die Gewichtszunahme und die Futterumwandlung werden gemessen. Die Zusammensetzung des verwendeten Futters ist in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Zusammensetzung der Mais/Weizen/Soja-Diät in Versuchen mit Junghühnern

Bestandteile	Anteil (%)
Mais	25,0
Weizen	15,0
Sojaöl	3,5
tierisches Fett	2,0
Maniok	11,68
Sojamehl (50% rohes Protein)	19,45
geröstete Sojabohnen mit vollem Fettgehalt	10,0
Fischmehl	1,0
Fleischmehl, hoher Ölgehalt	4,0
Erbsen	5,0
Vitamine/Mineralien-Vormischung	1,0
Kalkstein	0,82
Monocalciumphosphat	1,00
Salz (NaCl)	0,30
DL-Methionin	0,25
	100,00

ME-Junghühner (MJ/kg)	12,55
rohes Protein (%)	22,1
rohes Fett (%)	9,6
Lysin (verfügbar) (%)	1,23 (1,04)
Methionin + Cystein (verfügbar) (%)	0,91 (0,79)

Das Enzym wird der Diät zugesetzt, indem es zunächst einem Trägerstoff zugemischt wird.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 Einfluß von Phospholipase A2 in einer Mais/Weizen/Soja-Diät auf das Wachstum und das Futterumwandlungsverhältnis bei Junghühnern im Alter von 5 bis 33 Tagen
In einem zweiten Versuch, der im wesentlichen auf identische Weise wie der vorstehende Versuch durchgeführt wird, wird eine Weizen/Roggen/Soja-Diät gemäß den Angaben in Tabelle 3 als Grunddiät verwendet.
Der Versuch umfasst die folgenden Behandlungen:

a) Weizen/Roggen/Soja-Diät (negative Kontrolle)
b) Weizen/Roggen/Soja-Diät + 100 IU/kg
c) Weizen/Roggen/Soja-Diät + 500 IU/kg
d) Weizen/Roggen/Soja-Diät + 1000 IU/kg

Sämtliche übrigen Parameter entsprechen den vorstehenden Angaben für den Mais/Weizen/Soja-Versuch. Tabelle 3 Zusammensetzung der Weizen/Roggen/Soja-Diät bei Versuchen mit Junghühnern

Bestandteile	Anteil (%)
Weizen	40,0
Roggen	10,0
Sojaöl	1,0
tierisches Fett	6,0
Maniok	4,28
Sojamehl (45,4% rohes Protein)	22,0
geröstete Sojabohnen mit vollem Fettgehalt	10,0
Fleischmehl (58% Rohprotein)	3,0
Vitamine/Mineralien-Vormischung	1,0
Kalkstein	0,94
Monocalciumphosphat	1,20
Salz (NaCl)	0,26
L-Lysin·HCl	0,11
DL-Methionin	0,21
	100,00

ME-Junghühner (MJ/kg)	11,9
rohes Protein (%)	21,4
rohes Fett (%)	10,5
Lysin (verfügbar) (%)	1,23 (1,05)
Methionin + Cystein (verfügbar) (%)	0,90 (0,77)

Das Enzym wird dieser Diät zugesetzt, indem man es zunächst mit einem Träger vermischt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4 Einfluß von Phospholipase A2 in einer Weizen/Roggen/Soja-Diät auf das Wachstum und das Futterumwandlungsverhältnis bei Junghühnern im Alter von 5 bis 33 Tagen
Wie in Tabelle 4 gezeigt, besteht ein Optimum im Bereich der Phospholipase-Konzentrationen, die bei dieser speziellen Junghühnerdiät einzusetzen ist, von mehr als etwa 100 IU/kg und weniger als etwa 1000 IU/kg Futter. Für andere Systeme können unterschiedliche Optimalwerte vorliegen, die durch Routineexperimente ermittelt werden können.
Beispiel 4
Verwendung von Phospholipase A2 in Milchersatzprodukten
Ein Versuch wird unter Verwendung von drei Gruppen mit jeweils 5 männlichen "Friesian Dutch Holstein-Friesian"-Kälbern durchgeführt.
Während einer Vorversuchsperiode wird ein handelsübliches Milchersatzprodukt gefüttert. Nach 14 Tagen werden die Tiere unter Berücksichtigung von Gewicht und Gewichtsvariation in drei Behandlungsgruppen aufgeteilt. Die Tiere werden in Einzelboxen gehalten. Der Stall wird natürlich belichtet. Er wird belüftet und bei einer Temperatur von etwa 18°C gehalten.
Die Tiere werden 14 Tage an ihre Diät gewöhnt. Anschließend wird der Kot an fünf aufeinanderfolgenden Tagen 24 Stunden täglich gesammelt. Die Tiere werden vor Versuchsbeginn angeschirrt. Der Kot wird in Kunststoffbeuteln, die am Geschirr angebracht sind, gesammelt. Einmal täglich wird der Kot gewogen, vereinigt und bei –20°C aufbewahrt. Vor den Analysen wird der Kot gründlich vermischt und in Unterproben aufgeteilt.
Die Tiere werden entsprechend ihrem Gewicht unter Einhaltung eines Fütterungsschemas individuell gefüttert. Das verwendete Milchersatzprodukt weist die nachstehend angegebene Zusammensetzung auf:

%

Magermilchpulver 58,5

Fett 19,8

Lactose 17,6

Stärke, Vitamine, Mineralien 4,1

ME 4450 kcal/kg

rohes Protein (N*6,25) 21,5%

rohes Fett 19,5%
Das Pulver des Milchersatzprodukts wird vor der Fütterung mit Wasser vermischt und bei einer Temperatur von etwa 40°C verfüttert.
Bei der Behandlung besteht das Fett aus 18% Rindertalg, Kokosnussfett oder Speck. Lecithin wird in einer Konzentration von 10% des Fettgehalts zugegeben.
Schweine-Phospholipase A2 wird diesen Diäten in einer Endkonzentration von 500 IU/kg Milchersatzprodukt zugesetzt. Die Verdaubarkeit des Fettes wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5 Einflüsse der Phospholipase A2-Behandlung auf die Verdaubarkeit verschiedener Fette durch nicht-wiederkäuende Kälber, die 18% Fett in ihren Diäten und 1,8% Lecithin (10% des Fettgehalts) erhalten. Phospholipase A2 wird gemäß Beispiel 2 hergestellt und der Diät in einer Endkonzentration von 500 IU/kg Milchersatzprodukt zugesetzt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Verbessern der Wirksamkeit einer Futtermittelverwendung, bei der ein Tier mit einer Diät gefüttert wird, welche eine Zusammensetzung enthält, die durch ein Verfahren erhältlich ist, welches das Mischen eines gebrauchsfertigen Phospholipase-Additivs mit einem Futtermittelstoff beinhaltet.
Verfahren zum Fördern des Wachstums von Tieren, bei dem ein Tier mit einer Diät gefüttert wird, welche eine Zusammensetzung enthält, die durch ein Verfahren erhältlich ist, welches das Mischen eines gebrauchsfertigen Phospholipase-Additivs mit einem Futtermittelstoff umfasst.
Tierfutterzusammensetzung, welche die Wirksamkeit der Futtermittelverwendung verbessert, erhältlich durch ein Verfahren, welches das Mischen eines gebrauchsfertigen Phospholipase-Additivs mit einem Futtermittelstoff umfasst.
Wachstumsfördernde Tierfutterzusammensetzung, erhältlich durch ein Verfahren, welches das Mischen eines gebrauchsfertigen Phospholipase-Additivs mit einem Futtermittelstoff umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, die ein Phospholipid enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das Phospholipid Lecithin enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei der die Phospholipase aus einem Säugetier, einer Pflanze oder einem Mikroorganismus erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Phospholipase eine Säugetierphospholipase A2 ist, ausgewählt aus Rinder-, Schweine-, Mäuse-, Ratten- und Humanphospholipase A2.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, bei der die Phospholipase durch Expression einer rekombinanten DNA in einem Wirtsorganismus erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, bei welcher der Wirtsorganismus ein Mikroorganismus ist, ausgewählt aus Bakterien, Hefen und Fadenpilzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei welcher der Mikroorganismus aus den Gattungen Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Candida, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Fusarium und Humicola ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, bei welcher der Mikroorganismus Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis oder Aspergillus niger ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, die ein Pflanzenmaterial aufweist, das die Phospholipase enthält, die aus einer transgenen Pflanze erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, welche die Samen einer transgenen Pflanze aufweist, die eine Phospho lipase enthält, welche durch Expression einer rekombinanten DNA erhältlich ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, die 1.000 bis 5.000.000 Internationale Einheiten von Phospholipase pro kg Phospholipid enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 15, worin das Phospholipase-Additiv mit einer Konzentration im Bereich von 100 bis 1.000 Internationalen Einheiten pro kg Futtermittel vorliegt.
Verfahren zur Herstellung eines Tierfuttermittels nach einem der Ansprüche 3 bis 16, welches das Mischen einer gebrauchsfertigen Phospholipase mit einem Futtermittelstoff umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, welches das Mischen einer gebrauchsfertigen Phospholipase mit einem Futtermittelstoff und mindestens einem Phospholipid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin die Phospholipase rekombinant gebildet worden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Phospholipase in Form eines transgenen Pflanzenmaterials zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das transgene Pflanzenmaterial derart verarbeitet wird, daß die Phospholipase zugänglich gemacht wird.
Verwendung einer Zusammensetzung, die durch ein Verfahren erhältlich ist, welches das Mischen eines gebrauchsfertigen Phospholipase-Additivs mit einem Fut termittelstoff umfasst, zum Füttern von nichtwiederkäuenden Tieren.
Verwendung einer Zusammensetzung, die durch ein Verfahren erhältlich ist, welches das Mischen eines gebrauchsfertigen Phospholipase-Additivs mit einem Futtermittelstoff umfasst, zum Füttern von Nichtwiederkäuenden Kälbern.