JPH0265781A - ヒト膵蔵ホスホリパーゼａ↓２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトホスホリパーゼＡ２を遺伝子組換え技術
を用いて効率よく製造する方法に関する。

（従来の技術） ホスホリパーゼＡＸ　（ＰＬＡｚ　；ＥＣ３，１，１，
４）は３−ｓｎホスホグリセリドの２−アシルエステル
結合を加水分解するリン脂質分解酵素であり、哺乳類の
膵臓やヘビの毒液などに存在することが知られている。

膵臓のＰＬＡ、は膵液中に分）必される消化酵素の一つ
であり１通常は前駆体として存在し、トリプシンなどの
タンパク分解酵素により加水分解されて活性型となる。

ＰＬＡｚは、細胞内酵素（多くは膜結合型の酵素である
）としても、哺乳類、微生物などに広く分布することが
知られている。

膵臓やヘビ４中に存在するＰＬＡ　２は、ホスホリパー
ゼＣ〔クロストリデイウム　ウェルチ（Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍｗｅｌｃｈｉｉ）、バシラス　セレウス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ）由来などが知られてい
る〕とともに、生体膜の研究、特に、生体膜の主成分と
して重要なリン脂質の構造解析に欠かせない酵素である
。さらに、膵臓のＰＬＡ　Ｚは膵臓疾患時に血中に放出
され、それにより血中レベルが上昇することが知られて
いるので、膵臓疾患の診断のよい指標となる。これらの
研究および疾病の診断に使用するためには、十分な量の
ＰＬＡ、が必要とされる。しかし、ヒト膵臓ＰＬＡ　２
は、従来はヒト膵臓または膵液中から分離精製されてい
たため、大量に得ることができなかった。

そのため、ヒト膵臓Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚを大量に製造する方
法の開発が望まれている。

近年、所望のタンパクを大量に得る方法として。

遺伝子組換え技術を用いる方法が採用されてきている。

遺伝子組換え技術を用いてＰＬＡ２を宿主に産生させた
例としては、ウシ膵ＦｉＰＬＡ、を酵母で分泌発現させ
た口中ら（第１０回日本分子生物学会講演要旨集、２０
７＠（１９８７）およびＧｅｎｅ、６４．２５７（１９
８８））の報告がある。この報告によると、ウシ膵ＦＩ
ＰＬＡ２プロ酵素をコードするＤＮＡ塩基配列を酵母の
コドンに合わせて設計し、これを平均鎖長４２ｍｅｒの
オフゴマ−２２本から合成している。上記ＰＬΔ２プロ
酵素をコードするＤＮＡ塩基配列は、ウシ膵臓ＰＬＡ、
の成熟タンパクをコードする遺伝子にイヌＰＬＡ２のシ
グナル配列を付加して調製される。上記ＤＮＡ塩基配列
を酵母のｐｔ１０５　（酸性ホスファターゼ）プロモー
ターの下流に連結し、酵母−Ｅ、　ｃｏ目シャトルベク
ターｐＡＴ４０５に挿入して酵母で発現させると、天然
物とほぼ同等のウシ膵臓ＰＬＡ　２が酵母培養液中に分
ｌ必されることが確認されている。

ヒト膵臓ＰＬＡｚについては、そのアミノ酸配列がＶｅ
ｒｈｅｉｊ　　ら（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ、７４７　（１９８３）。

９３−９９　）によりタンパク化学的手法を用いて明ら
かにされている。さらに５　ヒト肺由来のヒト膵臓ＰＬ
Ａ　２クンバクをコードする遺伝子のＤＮＡ塩基配列が
Ｓｅｉ　Ｉｈａｎ＋ｅｒら（ＤＮＡ、　５（６）（１９
８６）、　５１９−５２７）によって明らかにされてお
り、該配列から推定されるアミノ酸配列も示されている
。しかし、　Ｖｅｒｂｅｉｊらが明らかにしたアミノ酸
配列と、　　ＳｅｉｌｈａｍｅｒらのＤＮＡ配列から推
定されるアミノ酸配列とを比較すると、　Ｃ末端の５ア
ミノ酸残基が若干異なっている（第２図）。さらに、後
者のアミノ酸配列のアミノ酸残基数は１２６であるのに
対して、前者の配列のアミノ酸残基数は１２５である。

これは、おそら＜　ＰＬＡ、試料を採取した個体にＰＬ
＾２のアイソザイムが存在したためか、またはアミノ酸
分析上のエラーと考えられるが明らかではない。このよ
うに、ヒト膵ｊＪ　Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚについても種々の研
究がなされているが、該ヒト膵Ｈｐ１．Ａ２を遺伝子！
ＦＪ１換え技術を用いて宿主細胞に産生させた例はない
。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、遺伝子組換え技術を用いてヒ
ト膵臓Ｐ　Ｌ　Ａ　ｔを製造する方法を提供することに
ある。本発明の他の目的は、ヒト膵臓Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚを
大量・安価に製造する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明のヒト膵臓ホスホリパーゼＡ２の製造方法は、ヒ
ト膵臓ホスホリパーゼＡ２を発現するプラスミドを酵母
に導入し、該酵母を培地に培養してヒト膵臓ホスホリパ
ーゼΔ２を分泌発現させ、培養混合物からヒト膵臓ホス
ホリパーゼＡ２を採取することを特徴とし、そのことに
よって上記目的が達成される。

さらに詳しくは２本発明のヒト膵臓ホスホリパーゼへ２
の製造方法は、（ａ）ヒト膵臓からｍＲＮＡを分離し、
該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリ
ーを調製する工程；　（ｂ）　該ｃＤＮＡライブラリー
からヒト膵臓ホスホリパーゼＡ２をコードする遺伝子を
有するｃＤＮＡクローンをスクリーニングする工程；（
ｃ）　咳ｃＤＮＡクローンに含まれるヒト膵臓ホスホリ
パーゼへ２をコードする遺伝子をプラスミドベクターに
挿入して組み換えプラスミドを構築する工程；（ｄ）　
Ｅｌｍみ換えプラスミドを導入して宿主細胞を形質転換
する工程；および（ｅ）得られた形質転換体を栄養培地
中で培養して、培養混合物中にヒト膵臓ホスホリパーゼ
Ａ２を生成させる工程を包含し。

そのことによって上記目的が達成される。

本発明に用いられるヒト膵ｆｆ１ＰＬＡ２をコードする
遺伝子は、ヒト膵臓細胞から調製される。この遺伝子の
塩基配列は、すでにＳｅｉｌｈａｍｅｒら（前出）に記
載されており１合成によっても調製することが可能であ
る。しかし、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列
は、　Ｖｅｒｈｅｉｊ　ら（前出）が報告したヒト膵Ｗ
＆ＰＬＡ２のアミノ酸配列とはＣ末端が若干異なる。そ
のため、正しい遺伝子配列を得るために、ヒト膵臓から
直接に遺伝子を調製する必要があった。

本発明方法によるヒト膵９　Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚの製造は１
例えば、以下の工程に従って行われる。本発明方法を以
下の工程の順に詳細に説明する。

１ヒト　　ｃＤＮＡ−イブーリーの ヒト膵臓ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーは、常法を用いて
調製される。それにはまず、ヒト膵臓から全細胞ＲＮＡ
をグアニジン・フェノール／クロロホルム法（Ｇｅｎｅ
。

到（１９８４）、　２６３−２７０　）により分離し、
これをオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー
で繰り返し精製してポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを得、該
ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。二本鎖ｃＤＮ
Ａの合成は。

Ｇｕｂｌｅｒおよび１Ｉｏｆｆｎ＋ａｎの方法（Ｇｅｎ
ｅ、　２５　（１９８３）。

２６３−２６９　）に従って行うことができる。得られ
た二本鎖ｃＤＮＡに適当なリンカ−配列を付加して制限
酵素切断部位を形成し、クローニング用ベクターの、上
記リンカ−配列と同じ制限酵素切断部位（例えば、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−配列を付加した場合にはＥｃｏＲＩ切断
部位）に挿入することにより、ヒト膵臓ｃＤＮパライフ
゛ラリ−が３周製される。クローニング用ベクターとし
てはファージベクターλｇＬ１０が好適に使用されるが
２　これに限定されず、当業者に公知のクローニング用
ベクターがいずれも使用され得る。

ヒ　　　ｃＤＮへのクローニング 上記（１）項で得られるヒト膵臓ｃＤＮパライブラリ−
を適当な宿主細胞（ファージブレーティング用細胞）に
導入し２形質転換およびクローニングを行う。ファージ
ブレーティング用細胞としては１例えば、　Ｅ、　　ｃ
ｏｌｉ　ＮＭ５１４株などの大腸菌が好適に用いられる
。この菌株は前もって１例えば、　６００ｎｉにおける
ｏ、ｏ、＝０．５　　（分光光度計により測定される）
となるまで振盪培養し、集めた菌体を硫酸マグネシウム
懸濁液とし、低温で保存しておく。このファージブレー
ティング用細胞と上記ｃＤＮＡライブラリーのファージ
液とを、混合してインキュベートすることにより、大腸
菌が形質転換体が得られる。この混合液を適当な培地に
接種して培養すると形質転換体はプラークを生じる。こ
れをニトロセルロースフィルターにレプリカし、アルカ
リ処理による溶菌とＤＮＡ変性を行い、プラーク中のフ
ァージＤＮＡをフィルター上に固定する。その後。

このフィルターを用いてプラークハイブリダイゼーショ
ンを行うことにより、目的とするヒト膵臓ＰＬＡｔをコ
ードする遺伝子を有する組み換えファージを含んだプラ
ークが検出される。

このプラークハイブリダイゼーションに使用する標識プ
ローブには２例えば、イヌ膵臓ＰＬＡ　ＺのｃＤＮＡ（
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　、９９，７３３−７３９．　
（１９８６））を制限酵素Ｒｓａ　１で切断した４１９
ｂｐ断片を放射性標識したものが使用できる。放射性標
識は９例えば、市販のマルチプライムＤＮＡ　ラベリン
グシステム（Ａｍｅｒｓｈａｔｍ社製）を用いて〔３２
Ｐ−α）　ｄＣＴＰで標識するのが便利である。イヌｃ
ＤＮＡは、ヒト膵ＫＰＬＡ、と塩基レベルで８３％の相
同性を有する（第３図を参照のこと）のでプローブとし
て適している。その他、ヒト膵臓ＰＬＡｚとハイブリダ
イズしうる塩基配列を有する他の動物のＤＮＡ　、合成
りＮ＾、　ＲＮＡなどもプローブとして利用され得る。

プラークハイブリダイゼーションを行うには。

まず上記ファージＤＮＡを固定したフィルターをＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡを含む緩衝液中でプレハイブリダイズ
させ、次いで標識プローブ（２Ｘ　１１０６ｃｐ　／フ
ィルター）を含む？容液中で該プローブとハイブリダイ
ズさせることにより行われる。このフィルターを洗浄後
、オートラジオグラフィーで分析することにより、目的
のヒト膵臓Ｐ　Ｌ　Ａ　ｔをコードする遺伝子を有する
ファージベクターのクローンがスクリーニングされる。

３ｃＤＮＡクローンの 上記（２）項で得られた陽性クローンに含まれるｃＤＮ
Ａを分析するために、８亥クローンからファージＤＮＡ
を調製する。ファージＤＮＡの調製は、　Ｍａｎｉａｔ
ｊｓら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　　Ｌ
ａｂｏｒａＬｏｒｙ　　ｍａｎｕａｌ、　　ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）のプロトコ
ルにより行うことができる。

得られたファージＤＮＡ　　（例えば１発明者らにより
ＨＰＬＩＩおよびＨＰ　Ｌ　２１　と命名されたファー
ジＤＮＡが得られた）をＥｃｏＲＩなどの制限酵素で切
断し。

フェノール抽出およびエタノール沈澱を行い、軽く減圧
乾燥した後に水に溶かす。各酵素処理後には、毎回この
フェノール抽出およびエタノール沈澱の操作を行うこと
が望ましい。得られるＥｃｏＲ１消化物をアガロースゲ
ル電気泳動により分離し。

エチジウムブロマイドで染色すると、上記ファージＯＮ
Ａ　ＩＩＰＬＩＩおよび１（ＰＬ２１に含まれるＤＮＡ
挿入断片が、それぞれ約６００ｂｐおよび約６７５ｂｐ
のバンドとして確認される。

次いで、　ＤＮＡ挿入断片の塩基配列を決定するために
、制限酵素切断地図を作成する。それにはまず上記ファ
ージＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけることによりＤＮＡ断片を分離する。

ポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡ断片の回収は２例
えば、　ＤＥＡＥメンブランフィルタ−（ＮＡ−４５，
５ｃｈｌｅｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いて電
気的泳動的に吸着および溶出することにより行われる。

得られた溶出液のフェノール抽出およびエタノール沈澱
を行った後、適当な制限酵素でＤＮＡを消化し、制限酵
素切断部位のパターン分析を行う。制限酵素としては１
例えば、Ｓｍａｌ、ハｔｕ　ＩＴ　。

恒量１．Ｒｓ且Ｉ、均ｉａ［およびその他が挙げられる
がこれに限定されず、当業者が使用しうる制限酵素から
適宜選択して使用される。これらの制限酵素は、各酵素
に適した条件下で使用するのが好ましい。このパターン
分析により確認すると、上記ファージＤＮＡ　）ＩＰＬ
ｌｌおよびＨＰＬ２１に含まれるＤＮＡ挿入断片中のＰ
ＬＡ　を構造遺伝子は全く同じものであることがわかる
。

ヒト　　ＰＬ八へｃＤＮＡクローンの　　配　の■ 上記ＤＮＡ挿入断片塩基配列の決定は２例えば。

ＤＮＡ　シーケンシングキット（宝酒造）により行うこ
とができる。このキットでは１Ｍ１３フアージ系ベクタ
ーに調べようとするＤＮＡ断片を挿入して組み換えファ
ージを得、該組み換えファージで適当な宿主を形質転換
してスクリーニングを行う。旧３ファージ系ベクターと
しては、　Ｍ１３ｍｐｌＯおよびＭ１３ｍｐＨが好適に
用いられる。この分析により、ファージＤＮＡ　ＨＰＬ
ＩＩおよびＨＰＬ２１中のＤＮＡ挿入断片は。

ヒト膵Ｗ＆ＰＬＡｆの構造遺伝子領域を完全にカバーし
ていることがわかる。

第１図に、　ＨＰＬＩＩのＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ塩基
配列（上段）および該ＤＮＡ塩基配列に基づいた推定ア
ミノ酸配列（下段）を示す。ここで２図中の下段に示す
記号は、以下のアミノ酸を意味する。Ｇ　ニゲリシン（
Ｇｌｙ　）　；Ａ　　：アラニン（Ａｌａ　）　；Ｓ　
　：セリン（Ｓｅｒ　）　　；Ｔ　　：　）レオニン（
Ｔｈｒ　）　　；Ｃニジスティン（Ｃｙｓ　）　；Ｎ　
：アスパラギン（八ｓｐ）　ｉ　Ｑ　：グルタミン（Ｇ
ｌｕ　）　　；Ｌ　　：ロイシン（シｅｕ）　；　Ｔ　
　：イソロイシン（Ｉｌｅ　）　　；Ｖ　：バリン（Ｖ
ａｌ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）　；　Ｆ　：フ１−
ルアラニン（Ｐｈｅ）　　；Ｙ　：チロシン（Ｔｙｒ）
　；讐ニトリブトファン（Ｔｒｐ）　　；Ｐ　ニブロリ
ン（Ｐｒｏ）　；Ｄ　：アスパラギン酸（Ａｓｐ）　　
；Ｅ　：グルタミン酸（Ｇｌｕ）　；ＩＩ　：ヒスチジ
ン（Ｈｉｓ）　　；に　：リシン（Ｌｙｓ）　；および
Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）。

第１図から、このＤＮＡ挿入断片の塩基配列は。

翻訳開始コドンＡＴＧ　　（メチオニンをコードする）
から始まるシグナルペプチドおよびプロペプチド配列を
存し、　ＡＡＴＡＡＡのポリＡシグナル、およびポリ八
尾部を有する。そして、成熟ＰＬＡ　２ポリペプチドは
、推定アミノ酸配列のＮ末端から２３番目のＡ（アラニ
ン）から始まる１２６個のアミノ酸残基から成る。この
ＰＬＡ、をコードするＤＮＡ塩基配列配列（シグナルペ
プチドおよびプロペプチドを含む）は、　Ｓｅｉｈａｍ
ｅｒら（前出）の報告しているヒト膵臓ＰＬＡ、配列と
全く同じである。

このヒト膵１ｆＪｉＰＬＡ、のアミノ酸配列は、すでに
タンパク化学的手法を用いて明らかにされているアミノ
配列（シｅｒｈｅ：ｊ　ら、前出）よりもアミノ酸残基
が１個だけ多く、Ｃ末端のみが異なる。このＣ末端配列
の比較を第２図に示す。第２図において上段はＨＰＬＩ
Ｉから得られたアミノ酸配列のＣ末端領域を、そして下
段はＶｅｒｈｅｉｊ　らのアミノ酸配列のＣ末端領域を
示す。本発明方法で得られるヒト膵［ＰＬＡ　Ｚをコー
ドするＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、ヒト
肺由来のヒト膵ＩＩＰＬＡｚのアミノ酸配列（Ｓｅｉｈ
ａｏ＋ｅｒら、前出）と全く同じであることから、　Ｖ
ｅｒｈｅｉｊ　らのアミノ酸配列のＣ末端付近が異なっ
ているのは、おそらくアミノ酸分析のエラーではないか
と考えられる。

第３図に１本発明方法で得られるＤＮＡ塩基配列（これ
は、ファージＤＮＡ　ＩＩＰＬＩＩのＤＮＡ挿入断片か
ら得られ、ヒト膵臓ＰＬＡ　２をコードする）から推定
されるアミノ酸配列（上段）と、イヌ膵ｗｔＰＬＡｚの
アミノ酸配列（下段）と、を比較して示す。図中の京印
は、下段のアミノ酸配列が上段と同じであることを示す
。この比較によると、ヒトＩＦｊＦＩｉｉＰＬ、Ａ！と
イヌ膵Ｘｐｕ２とは、アミノ酸レベルで８２％、そして
塩基レベルで８３％の相同性が認めらる。

【庫二危共乙文人ｌ上免揺築 上記（３）項で得られるヒト膵ＫＰＬＡ２をコードする
ＯＮ八を有するファージＤＮＡ　（ＩＩＰＬＩ　１また
は１ｌＰＬ２１）から、　該ｐ＋、ａ、をコードする配
列部分を制限酵素を用いて切り出し、得られるＤＮＡ断
片をフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱、
アガロースゲル電気泳動などの常法により分離する。分
離したＤＮＡ断片は９例えば、（３）項で述べたのと同
様にＤＥＡＥメンブランフィルタ−を用いて電気泳動的
に吸着および溶出して回収される。このＤＮＡ断片を適
当なプラスミドに組み込み、大腸菌などの宿主細胞に導
入することによりスクリーニングする。

例えば、市販のプラスミドｐＧＥＭ３を用いてこの操作
を行うことにより１例えば、所望のＤＮＡ断片を有する
組み換えプラスミドＨｕＰＬＡｚ／　ｐＧＥＭ３が得ら
れる。

次いで、この組み換えプラスミドから所望のＤＮＡ断片
を制限酵素を用いて切り出し、該ＤＮＡ断片を適当なプ
ラスミドベクターに組み込むことによりＰＬＡｚ発現プ
ラスミドが得られる。例えば、１）プラスミドｌ１ｕＰ
ＬＡ　ｚ　／　ｐＧＥＭ３を５ａｉｌおよびＰｖｕ　Ｈ
で切断処理した７５０ｂｐ断片；および２）プラスミド
ｐＡ？ｌ８２（後述）をＸｈｏ　Ｉおよびハラ■で切断
処理した大断片を、　Ｔ４リガーゼを用いて連結するこ
とにより発現プラスミドｐＡＭ８２　ＨｕＰＬＡｚが構
築される。この発現プラスミドｐＡＭ８２　ＨｕＰＬＡ
ｚの構築の概略を第４図に示す。この構築に用いられる
ベクターは、大腸菌および酵母の両方で増殖しうる。シ
ャトルベクターが好ましい。例えば、上記プラスミドｐ
ＡＭ８２が好適に用いられる。このプラスミドｐＡＭ８
２は特公昭６１−５５９５０お・よび特公昭６１−５５
９５１に記載されている。このｐＡＭ８２を酵母サツカ
ロミセス　セルビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡＨ２２に組み込んだものは
微工研菌寄第６６６８号：微工研条寄第３１３号（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−３１３）として寄託されており、入手可能
である。このプラスミドベクターは、酵母の遺伝子と大
腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵母の抑制酸性ホスファタ
ーゼ遺伝子（ＰＨ０５）およびプロモーターを有する。

この他にも、上記ヒト膵ＰｉｌＰＬＡ。

をコードする遺伝子を運搬して大腸菌および酵母の両方
で発現し得るものであれば、当業者に公知のいずれのシ
ャトルベクターも使用され得る。

上記ｌ）および２）から構築される発現プラスミドは、
大腸菌（例えば、大腸菌に１２株Ｃ６００）などの適当
な宿主に導入され、薬剤耐性によりスクリーニングされ
、制限酵素切断パターン分析により所望のＤＮＡ断片が
ＰＨ０５プロモーターに対して適切な位置および方向で
挿入されていることが確認される。

（６）ヒト　　ＰＬＡ、の　　での 上記（５）項で構築した発現プラスミドｐＡＭ８２　Ｈ
ｕＰＬＡｚを酵母に導入して形質転換させことにより、
ヒト膵ＷｔＰＬＡＺが生産される。酵母としては１例え
ばＡＨ２２株が好適に用いられるがこれに限定されず、
上記発現プラスミドを導入することによりヒト膵臓ＰＬ
Ａ、を発現しうるいずれの酵母も使用し得る。形質転換
は、木材らの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５
３（１９８３）１６３−１６８）に従って行うことがで
きる。目的とする発現プラスミドを有する形質転換体ク
ローンは。

ヒスチジン含有平板寒天上でロイシン非要求性について
選択することにより得られる（ＰＹＩＡＭ８２ＨｕＰＬ
Ａｚ／ＡＨ２２）　−このクローンＰＹＩＡＭ８２−Ｈ
ｕＰＬ八２／Ａｌ＋２２はｐＨ０５プロモーターを有す
るので、培地中の無機リン酸の有無によって簡単に発現
の開始および停止を行うことができる（Ｎａｋａｏら、
　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏ＋、　６　（１９８６）　２６１
３−２６２３　）　、例えば。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ　８０（１９８３）　１−５）　ニ従ってリ
ン酸を含有する培地およびリン酸を含有しない培地を調
製し、リン酸欠乏条件下で発現を誘導することができる
。

発現されたヒト膵臓ＰＬＡｚは分泌型であるので培養液
中に蓄積され、遠心分離上清画分を採取することにより
簡単に得られる。この上清両分中のＰＬＡｚ活性は、　
Ｏｋａｍｏｔｏらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（Ｔ
ｏｋｙｏ）９３　（１９８３０３５３）により放射性標
識した基質（例えば、■−バルミトイルー２　［１−１
４Ｇ　）リルオイルホスファチジルエタノールアミン）
を用いて測定することにより確認される。このようにし
て酵母で発現されたヒト膵臓ＰＬＡｚは１該酵母培養液
からゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの
各種クロマトグラフィーを適当に組み合わせた常法を用
いて精製できる。

このように９本発明方法により遺伝子組換え技術を用い
て、天然のヒト膵臓ＰＬＩｈと実質的に同じアミノ酸配
列および活性を有するＰＬＡｚが得られる。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

外科手術により除去したヒト膵臓を直ちに液体窒素中で
凍結し、−７０°Ｃで保存した。このヒト膵臓から全細
胞ＲＮＡを、グアニジン・フェノール／クロロホルム法
（Ｇｅｎｅ、　２８　（１９８４Ｌ　２６３−２７０）
により分離した。次いで、オリゴｄＴセルロースカラム
クロマトグラフィーを繰り返し行うことにより全細胞Ｒ
Ｎ八からポリ（八）を含むｎ＋ＲＮ八を精製し。

ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆ　ｆｍａｎの方法（Ｇｅｎｅ
、　２５　（１９８３）。

２６３−２６９）に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。

得られた二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカ−を付加し
、クローニング用ファージベクターλｇｔｌＯのＥｃｏ
ＲＩ切断部位に挿入することにより、ヒト膵臓ｃ　Ｄ　
Ｎ＾ライブラリーを調製した。

ヒト　　ｃＤＮへのクローニング ファージブレーティング用細胞に使用するために、Ｌ　
並旦ＩＪＭ５１４株をＬＢアガープレート（１％トリプ
トン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化
ナトリウムおよび１．５％アガー）に接種し。

３７°Ｃで一晩インキユベートした。このプレートから
シングルコロニーを拾い、　ＬＢ培地（１％トリプトン
、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナト
リウムおよび０．４％マルトース）５ｍ２に接種し、３
７°Ｃで一晩振盪培養した。この培養液２−を上記と同
様のＬＢ培地１００ｄに添加し、　６００ｎｍにおイテ
０．０．　＝０．５　　（島津分光光度計ＵＶ１５０−
０２を用いて測定）となるまで３７°Ｃで振盪培養した
。得られた培養液を３．０００ｒｐｍで１０分間、４°
Ｃにて遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂを使用）
して菌体を集め、予め水冷しておいた１０ｍＭ硫酸マグ
ネシウム１０−に懸濁した。このように調製したファー
ジブレーティング用細胞懸濁液は４°Ｃで保存した。

次に、上記（１）項で得られたヒト膵ｉ１ｉ　ｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａライブラリーのファージ液をファージ希釈液（１
０ＩＩＩＭトリスー塩酸（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭ
塩化ナトリウムおよび０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で希釈し
、１戚あたり４ＸｌＯ’個ファージ液とした。この希釈
ファージ液０．１　ｄと上述のファージブレーティング
用細胞懸濁液０．１−とを混合し、３７’Ｃで１５分間
インキヱベートした後、　ＬＢソフト・トップアガロー
ス（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト
、０．５％塩化ナトリウム、　０．２５％硫酸マグネシ
ウムおよび０．７２％アガロース＞４ｍｌを添加し、Ｌ
Ｂアガープレートに流し込んだ。このプレートを室温で
１０分間静置した後、プラークの直径が１〜１．５ｍｍ
になるまで３７°Ｃでインキエベートした。ファージが
導入されて生じた４Ｘ１０’個のプラークを１０枚のニ
トロセルロースフィルターに移しとり、アルカリ溶液（
０，５台水酸化ナトリウムおよび１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム）に１分間浸漬した。次いで、このフィルターを中和
液（０，５Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）および１．
５Ｍ塩化ナトリウム）に８分間、さらに３　Ｘ５ＳＣ（
Ｉ　Ｘ５ＳＣは、　１５０　ｍＭ塩化ナトリウムおよび
１５ｍＭクエン酸３ナトリウムを含有する）に５分間浸
漬した。その後、このフィルターを風乾し、８０”Ｃの
真空オーブン中で２時間処理した。

このフィルターを４　Ｘ５ＳＣ、ＩＯＸデンハーツ溶液
（Ｂｉｏｃｈｅｆｆｌ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅ
ｓ、　　Ｃｏｍ１１１．２３．　６４１−６４６（１９
６６）　）および２００　ｕ　ｇ　／　ｍｌのＥ、　　
ｃｏｌｉ　ＤＮＡ中で６５゛Ｃにて４時間プレハイブリ
ダイズし２次いで５０％ホルムアミド、　　４　Ｘ５ｓ
ｃ　、　ＩＯＸデンハーツ？容？夜。

２００ｕｇ／ｍｌｌ　　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＤＮ＾およ
び３２Ｐ−プローブ（２Ｘ　１．ｏ６ｃｐｎ＋／フィル
ター）中で４２°Ｃで１６時間ハイブリダイズすること
により１　プラークハイブリダイゼーションを行った。

上記ｆｆ２ｐ−プローブには。

イヌ膵臓ＰＬＡ、のｃＤＮＡ　（Ｊ、　Ｂ　１ｏｃｈｅ
ｎ＋、　、　９９　（１９８６）　、　７３３７３９）
を制限酵素Ｒｓａ　Ｉで切断して４１９ｂｐ断片とし。

使用に先立ってマルチプライムＤＮＡラベリングシステ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に従って（３２Ｐ−α）　
ｄＣＴＰでラベルし、比放射活性を５〜７　Ｘ１０’ｃ
ｐｍ／μｇＤＮＡ断片としたものを用いた。このハイブ
リダイゼーション後のフィルターを４　ｘｓｓｃで室温
にて洗浄し、オートラジオグラフィーで分析することに
よりスクリーニングを行った。その結果、１９５個の陽
性クローンが得られた。

３ｃＤＮ八クローンのへ 上記（２）項でスクリーニングされた１９５個の陽性ク
ローンの、フィルター上の位置に相当する培地上のプラ
ークを任意に２個選択し、パスツールピペットを用いて
打ち抜いた。これをそれぞれファージ希釈液１　ｍｌ中
に入れて水浴中にて一晩静置し。

ファージの抽出を行った。得られた抽出液をｉｏ、ｏｏ
。

ｒｐｍで１０分間、４゛Ｃにて遠心分離した後、上清液
をｌＯμ２のクロロホルムを入れたチューブに添加し、
４°Ｃにて保存した。このファージ抽出液をクロロホル
ムから分取し５希釈液で希釈して大腸菌に導入し、培養
後のプラーク数を測定することにより該ファージ抽出液
中に含まれるファージ数を調べた。その後、このファー
ジ抽出液（１０９個ファージ）と、上記（２）項に記述
したファージブレーティング用細胞（１０”個細胞）と
を、３７°Ｃで１５分間インキュベートした。これを、
予め３７°Ｃに保温しておいた５ＩＩＭ塩化カルシウム
を含有するしＢ培地Ｉ２に添加し、３７°Ｃで６時間イ
ンキュベートした。

これにクロロホルム５ｄを添加してさらに１５分間イン
キュベートした後、直ちに水冷し、　５，０００ｒｐｍ
で１５分間遠心分離した。その後、得られた上清液にＲ
ＮａｓｅおよびＤＮａｓｅをそれぞれＩｇｇ、ｍｌの濃
度となるように添加し、３７°Ｃで１時間処理した。続
いて、室温において、上清１ｆ当り６０ｇの塩化ナトリ
ウムを攪拌しながら小量づつ添加し、完全に溶解させた
。得られた溶液ＩＩ！、当り１００ｇのポリエチレング
リコール１６０００を攪拌しながら小量づつ添加して完
全に溶解させ、水浴中で１時間以上静置した。１０．０
００ｒｐｍで２０分間、４゛Ｃにて遠心分離した後、沈
澱物を５Ｍ緩衝液（５０１１１Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）、　８ｍＭ硫酸マグネシウム、　１００ｍＭ塩
化ナトリウムおよび０．０１％ゼラチン）に懸濁して９
　ｍｌとした。この懸濁液に塩化セシウム６．７５　ｇ
を添加して完全に溶解させた後、塩化セシウム密度勾配
沈降法により遠心分離して（ベックマン超遠心機（ロー
ター５０Ｔｉ）　　；　２８，００Ｏｒｐｍ　、　１５
”Ｃで２４時間）ファージを回収した。このファージ回
収液をＳＭＩ衝液に対して透析した後、５ＯＳ（ラウリ
ル硫酸ナトリウム）およびＥＤＴ＾（ｐＨ８，０）をそ
れぞれ０．２％および１０＋ｎＭとなるように添加し、
６５°Ｃで１０分間処理した。水浴中で急冷した後、ブ
ロテイナーゼにタノールを添加してエタノール沈澱を行
い、軽く減圧乾燥した後に水に溶解した。以下の工程に
おいて、各酵素処理後には毎回このフェノール抽出およ
びエタノール沈澱の操作を行った。得られた１ＥｃｏＲ
Ｉ消化物を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、
エチジウムブロマイドで染色したところ、　ＩＩＰＬｌ
ｌおよびＨＰＬ２１のｃＤＮ＾挿入断片として。

それぞれ約６００ｂρおよび約６７５ｂｐのバンドが確
認された。

次にＤＮＡ塩基配列を決定するために、上記ファージＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ消化物を３．５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分離した。これをエチジウムブロマイド
で染色した後、紫外線（ＵＶ）を照射することによりＤ
ＮＡ断片の泳動位置を決定し、所望のＤＮＡ断片をＤＥ
ＡＥメンブランフィルタ−（ＮＡ−４５。

５ｃｈｌｅｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　）を用いて
電気的泳動的に回収した。このフィルターを０．１塩化
ナトリウム１０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐｌ＋８．０　）
および１ｍＭ　［ｉＤＴ＾で軽く洗浄後、　１Ｍ塩化ナ
トリウム、１０ｍＭ１−リス−塩酸（ｐＨ８，０）およ
び１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で６５゛Ｃにて３０分間処理し
てＤＮＡを溶出し、上記と同様にフェノール抽出および
エタノール沈澱を行った後、得られた沈澱を水に熔解し
た。この水溶液中のＤＮＡをＳｍａ　Ｉハ慣■、Σｔｕ
ｌ、咳］Ｉ、均巳Ｉおよびその他の適当な制限酵素で消
化した。制限酵素は、以下の表１に示した各酵素に適し
た条件下で使用した。

酵素　　トリス−塩酸 ｐＨＫＣＩ　　　ＮａＣｌ　　　ＭｇＣｌ　　　２−メ
ルカプトｍａ　Ｉ ｖｕ　Ｕ ｔｕ　Ｉ ｓａ　Ｉ Ｐｓｔ［ ８，０ ７，５ ８，０ ７，５ ７，５ 制限酵素切断部位のパターン分析により、　ＩＩＰＬＩ
ＩとＨＰＬ２１　とは全く同じものであることが確認さ
れた。

ヒト　　ＰＬＡｚ　ｃＤＮＡクローンの　　配　の捉 ＤＮＡ塩基配列の決定を、クローニングベクターとして
Ｍ１３ｍｐＩＯおよびＭ１３ｍｐＨを用い、　ＤＮＡ　
シーケンシングキット（宝酒造から購入）により行った
。その結果、ファージＤＮＡ　ＨＰＬＩＩおよび１ｌＰ
Ｌ２１中のＤＮＡ挿入断片がコードするタンパクは同一
であり、かつヒト膵ＷｔＰＬＡ−ｚの構造遺伝子領域を
完全にカバーしていた。第１図に、　）ＩＰＬＩＩに含
まれる１３ＮＡ挿入断片の塩基配列および該ＤＮＡ塩基
配列に基づいた推定アミノ酸配列を示す。この押入断片
は翻訳開始コドンＡＴＧ（メチオニンをコードする）か
ら始まるシグナルペプチドおよびプロペプチド配列を有
し、　ＡＡＴＡ＾＾のポリ＾シグナル、およびポリ八尾
部を有していた。そして、成ｐ　Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚポリペ
プチドは推定アミノ酸配列のＮ末端から２３番目の＾　
（アラニン）から始まる１２６個のアミノ酸残基から成
ることがわかった。

ぶ１ｌＪＬ曳ブラじ（支上ｒｔ袋 上記（３）項で得られたファージＤＮＡ　ＨＰＬＩＩ　
または１１　Ｐ　Ｌ　２１の１０μｇを、　８０単位の
影巴Ｉ’ｌｌを用いては遼Ｒ１緩衝液（１００ＩＩＩＭ
　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　、　７ｍＭ塩化マグネ
シウム、　５０１Ｍ塩化ナトリウム、　７ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノールおよび０．０１％ウシ血清アルブミ
ン）中で３７゛Ｃにて６０分間処理した。反応終了後。

フェノール・クロロホルム抽出を行い１次いで１／１０
量の３と＃酸ナトリウム（ｐＨ５，３）および２．５倍
量のエタノールを加えてエタノール沈澱を行った。

得られた沈澱を軽く減圧乾燥した後に水に熔かした。こ
のＥｃｏＲＩ消化物を１％アガロースゲル電気泳動で分
離し、エチジウムブロマイドで染色し。

紫外線を照射することによりＤＮＡ断片の位置を決定し
、所望の断片をゲルからＤＥＡＥメンブランフィルタ−
を用いて電気泳動的に回収した。このＤＥＡＥメンブラ
ンフィルタ−を、洗浄液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム／
ＴＥ　）中で洗浄後、溶出液（１Ｍ塩化すトリウム／Ｔ
Ｅ　）中で６５°Ｃで３０分間処理してＤＮＡを溶出し
、この溶出液のエタノール沈澱を行い所望のＤＮＡ断片
を回収した。

他方、市販のプラスミドｐＧＥＭ３　（Ｐｒｏｍｅｇａ
　Ｂｉｏｔｅｃより購入、アンピシリン耐性遺伝子を有
する）の１μｇをＥｃｏＲｌで切断した後、３０μＰの
１？Ｉ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）中で０．５単位のア
ルカリホスファターゼを用いて６５“Ｃで９０分間処理
した。

上記で得られたヒト膵臓ＰＬＡ、の構造遺伝子を含むＥ
ｃｏＲＩ断片と、ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＧ
ＥＭ３の０．１６　ｕ　ｇとを、　Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼ緩衝液（６６ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７，６）　、
　６．６＋ｎＭ塩化マグネシウム。

０．４ｍＭΔＴＰおよび１０ｍＭジチオスレイトール）
中で３５０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて４°Ｃ
で１８時間処理することにより連結反応させた。

この反応液を用いて、大腸菌に１２株Ｃ６００の形質転
換を行った。形質転換菌をアンピシリン含有平板寒天培
地でアンピシリン耐性について選択した。

得られたアンピシリン耐性コロニーかう数個ｃｖ　コロ
ニーを任意に選択し、プラスミドＤＮＡを単離し。

所望のＤＮＡ断片の存在および方向を制限酵素切断パタ
ーンの分析により確認した。この分析により造遺伝子を
含む５ａｌＩ−も１■断片が挿入された発現プラスミド
ｐＡＭ８２　ＨｕＰＬＡｚを構築した。この発現プラス
ミドの構築の概略を第４図に示す。この発現プラスミド
ｐＡＭ８２　ＨｕＰＬＡｚを大腸菌に１２株Ｃ６００に
導入し、形質転換を行った。

形質転換菌をアンピシリン含有平板寒天培地で選択し、
得られたアンピシリン耐性コロニーから数個のコロニー
を任意に選択した。これらのコロニーからプラスミドＤ
ＮＡを単離し、所望のヒト膵臓ＰＬＡ　ｚ構造遺伝子を
含むＤＮＡ挿入断片が存在すること、およびＡｉ　Ｄ　
Ｎ　Ａ挿入断片がＰＨ０５プロモーターに対して正しい
方向で挿入されていることを制限酵素切断パターンの分
析により確認した。

ヒト　　ＰＬＡ、の　　での 上記（５）項で構築した発現プラスミドｐＡＭ８２　Ｈ
ｕＰＬＡｚを用いて、木材らの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、　１５３（１９８３）　１６３−１６８）に
従って酵母ＡＨ２２株を形質転換した。形質転換体をヒ
スチジン含有平板寒天上で選択し、得られたロイシン非
要求性の酵母（ＰＹＩＡＭ８２ＨｕＰＬＡｚ／ＡＨ２２
）を以下の発現に使用した。

目的とする発現プラスミドを有することが確認された酵
母のクローン（ＰＹＩＡＭ８２−ｔｌｕＰＬＡｚ／八Ｈ
２２）はＰへ０５プロモーターを有するので、培地中の
無機リン酸の有無によって簡単に発現の開始および停止
を行うことができる（Ｎａｋａｏ　ら、　Ｍｏ１ｅｃ、
　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、β−（１９８６）　２６１３−２６２３）　
、つまり、このプロモーターは、リン酸欠乏条件下で誘
導されるので。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、八８０（１９８３）
　１−５）に従ってｐ十培地（リン酸を含有する培地）
およびｐ−培地（リン酸を含有しない培地）を調製し、
以下のようにしてＰＬＡ、の発現実験を行った。

府厄■皿製 Ｂｕｒｋｈｏ　Ｉｄｅｒの最小培地にリン酸を添加した
培地（ｐ十培地；リン酸二水素カリウム１．５ｇ／　ｆ
ｆを含有）およびリン酸を添加しない培地（ｐ−培地；
塩化カリウム１．５ｇ／／！を含有）を調製した。その
ために。

まずこのｐ十培地およびｐ−培地に使用する金属成分の
ストック溶液（表２）およびビタミンストンク溶ｉ（表
３）を調製した。これらを用いてｐ十培地および叶培地
の４倍濃縮ストック溶液（それぞれ表４および表５）、
ならびにｐ十培地およびｐ−培地を調製した。

ホウ酸　　　　　　　　　　３０ｍｇ 硫酸マンガン７水和物　　　　５０ｍｇ硫酸亜鉛７水和
物　　　　　１５０ｍｇべ酸嗣５永和物　　　　　　　
２０ｍｇ（以上を滅菌水に溶解して５０ｍとする）Ｆｅ
Ｘ　ｈ」じ」勧献℃没≠と 塩化鉄６水和物　　　　　　１２５■ （滅菌水に溶解して５０ｔｎｌｌとする）Ｍｏストック
ｔ９ｔ５０ｍｌ モリブデン　酸ナトリウム　２　水和物　　　　　１０
０ｍｇａ）オートクレーブによる滅菌は行わない。

ピリドキシン ニコチン酸 パントテン酸カルシウム ビオチン イノシトール ０ｍｇ ０ｍｇ ２０■ ０　、２　ｍｇ １ｇ リン酸二水素カリウム　　　　　　６ｇ硫酸マグネシウ
ム７水和物　　　　２ｇ塩化カルシウム２水和物　　　
　　１．．３２ｇ０．０５％ヨウ化カリウム　　　　　
　０　、８　ｍＡ金属成分ストック溶液（表２） Ｂ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｕストック溶液　０．２ｄＦｅ
ストツク溶液　　　　　　　　　０．２ｍ１Ｍｏストッ
クン容ン夜　　　　　　　　　０．２ｍ１Ｃ）オートク
レーブによる滅菌は行わない。

塩化カリウム　　　　　　　　　　　６ｇ硫酸マグネシ
ウム７水和吻　　　　２ｇ塩化カルシウム２水和物　　
　　　１．３２ｇ０．０５％ヨウ化カリウム　　　　　
　０．８ｄ金金属分ストック溶液（表２） Ｂ、Ｍ−、ＺｎおよびＣｕストックン容液　０．２ｍ１
Ｆｅストツク溶液　　　　　　　　０．２ｍ１Ｍｏスト
ック溶液　　　　　　　　０．２戚このｐ＋培地または
ｐ−培地のストック溶液のいずれか２５（ｌｄ、　　ビ
タミンストック溶液１ｍ１．グルコース２０ｇおよびア
スパラギン２ｇに水を加えて１℃とし、攪拌した。これ
に５０■のヒスチジン塩酸塩を添加し、　０．２Ｎ水酸
化ナトリウムでｐ＋培地はｐＨ６，０に、そしてｐ−培
地はｐＨ７，５にそれぞれ調整した。

その後、　ｐ＋培地は１２０°Ｃで１０分間、そしてｐ
−培地は１１０°Ｃで１０分間それぞれオートクレーブ
にかけて滅菌した。

旦り光里久誘盪 上記ヒスチジン含有平板寒天上で生育したコロニーを、
ｐ＋培地１０ｄに植菌し、３０’Ｃで２昼夜振盪培養し
た。培養液０．２　ｄを、２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，
２）　０．０５ａ＋ｆを添加したｐ−培地ｉｏ＊　ニ加
え、３０’Ｃで振盪培養した。

匹り益比至亙定 上記ｐ−培地での培養液を２，５００　Ｘｇで５分間遠
心分離し、上清を分泌画分として保存した。この分泌画
分のＰＬＡ、活性を、主に０ｋａｎ＋ｏｔｏらの方法（
Ｊ、　８ｉｏｃｈｅｍ、（Ｔｏｋｙｏ）９３（１９８３
）１３５３）に従って測定した。まず、エツベンドルフ
チューブ中で、上記分泌画分とニーバルミトイル−２（
Ｉコ’Ｃ〕＋））レオイルホスファチジルエタノールア
ミン（５５，０００ｄｐｍ。

５０ｎｍｏｌ　）とを、　１０ｍＭ塩化カルシウムおよ
びｏ、ｉ％デオキシコール酸ナナトリウム共存下３０分
間反応させた。その後、　５０ｍＭ塩化ナトリウム−５
０Ｉ１１？Ｉトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）０．１
！ｎｆｆ１．１００ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｏ，０１雁、およ
びドール試薬（イソブロパノール：ヘブタン：　ＩＮ　
ＩＩｚｓＯ＜、　４０：１０：１０（Ｖ／Ｖ／Ｖ）　）
　０．４　ｍｌｌを添加して反応を停止させ、　０．２
　ｍＱの蒸留水と０．２４ｄのへブタンを添加してポル
テックスミキサーで１分間攪拌した。その後、　１０，
０００Ｘｇで３分間遠心分月１を行い、上層（ヘプタン
層）０．２ｄを別のエノペンドルフチューブに採った。

これにさらにヘプタン０．４ｍｌを添加した後、約１０
０　ｍｇのシリカゲル粉末を加えてヘプタン層に混入し
た水およびリン脂質をシリカゲルに吸着させた。ポルチ
ックスミ４−サーで１分間？Ｒ，拌後、　１０，０００
Ｘｇで３分間遠心分離し、上清液０．４ｍｌを液体シン
チレーション用バイアル瓶に採り、５ｍ２のシンチレー
タ−を添加して放射能を測定した。結果を表６に示す。

（以下余白） スタンダードとしてラット膵ＦＪＰＬＡｚ　（９ｎｇ　
）を用い、その放射活性と、酵母培養液の放射活性とを
比較することにより酵母によるＰＬＡ　ｚの発現ｆｉｔ
（ｎｇ／　ｍｌｌ　）を算出した。この計算は、ラット
膵臓Ｐ　Ｌ　Ａ　ｚとヒト膵臓ＰＬＡ、の基質特異性の
差を考慮して、換算係数２．２７を用いて行った。

表６から、培養時間を長くとるにつれ酵母培養液中のＰ
ＬＡｚの生成量が増加し、酵母によりＰＬＡ２が発現さ
れていることがわかる。

（発明の効果） 本発明方法によれば、天然のヒト膵Ｆａｐｕ　２と同し
アミノ酸配列を有する組み換えヒト膵臓ＰＬＡ　２が提
供される。このヒト膵臓円２Ａ２は遺伝子組み換え技術
を用いて生産されるので、大量・安価に得ることができ
る。このようにして得られた組み換えヒ１−膵臓囚、Ａ
ｔは、膵炎などの膵臓疾患時の臣３床検査の診断試薬と
して有用である。その他、生体膜の主成分であるリン脂
質の代謝の基礎研究の分野で広く利用され得る。

す４−−−−図−血Φ−簡１ｊらＷ朋−第１図は１本発
明で使用するヒト膵ＦＩｉ　Ｐ　Ｌ　Ａ　２をコードす
るＤＮＡ塩基配列（クローンＨＰＬＩＩ　から得られる
）およびｇ５ｏＮａ塩基配列に対応するアミノ酸配列を
示す配列図； 第２図は２本発明で使用するヒト膵ＫｉＰＬＡｚをコー
ドするＤＮＡ塩基配列（クローンＩＩＰＬＩＩから得ら
れる）に対応するアミノ酸配列のＣ末端領域とＶｅｒｈ
ｅｉｊ　　らによるヒト膵臓ＰしＡ２のアミノ酸配列の
Ｃ末端領域との比較を示す配列図； 第３図は１本発明で使用する成熟ヒト膵ＩＰＬＡ。

をコードするＯＮ八へ基配列（ｃＤＮＡクローンｌ（円
、１１から得られる）に対応するアミノ酸配列と、イヌ
膵臓ＰＬＡ、のアミノ酸配列との比較を示す配列図；そ
して。

第４図は１本発明で使用するヒト膵１ｆａＰ　Ｌ　Ａ　
ｚをコードする遺伝子を有する発現プラスミドｐＡＭ８
２　ＨｕＰＩ、Ａ２の構築の概略を示す説明図である。

以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ヒト膵臓ホスホリパーゼＡ＿２を発現するプラスミ
   ドを酵母に導入し、該酵母を培地に培養してヒト膵臓ホ
   スホリパーゼＡ＿２を分泌発現させ、培養混合物からヒ
   ト膵臓ホスホリパーゼＡ＿２を採取することを特徴とす
   るヒト膵臓ホスホリパーゼＡ＿２の製造方法。