JPH01231888A - アミド化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ペプチドまたは蛋白質のＣ末端α位カルボキ
シル基をアミド化する酵素、及びその製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

近年、神経及び内分泌組織より単離された多（の生物学
的活性を有するペプチドおよび蛋白質は、そのカルボキ
シル基末端（Ｃ末端）α位がアミ゛ド化（−ＣＯＮＦｌ
ｔ）されていることが知られており、しばしばこの構造
は、これらペプチドまたは蛋白質の生理活性に必須であ
ることが知られている。−方、この生合成機構は、これ
らペプチドおよび蛋白質に対応するｃＤＮＡの解析から
、まず式■：χ−Ｒ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは任意のアミノ
酸配列、Ｒは任意のアミノ酸残基、Ｇｌｙはグリシン残
基を示す）で示される前駆体（プレカーサー）が生合成
された後、Ｃ−末端α−アミド化酵素と呼ばれる酵素に
より、式ＩＩ　：　Ｘ−’Ｒ−ＮＨｚ（式中、Ｘは任意
のアミノ酸配列、Ｒ−Ｎｌ２は任意のアミノ酸残基Ｒの
α位カルボキシル基がアミド化、すなわち−ｃｏｏｎが
−ＣＯＮＨｚに変換されたアミノ酸残基を示す）で示さ
れるＣ−末端α位がアミド化されたペプチドおよび蛋白
質に変換されることが判った。最近、この酵素は生体内
でのＣ−末端アミド構造を明らかにする上での重要性に
加えて、化学合成によりまたは組換えＤＮＡ技術により
作り出されるペプチドまたは蛋白質のＣ−末端をアミド
化する手段としても、この活性を有する酵素が注目され
、酵素の精製・単離・生物学的解析および物理化学的解
析が試みられている。１９ｉ２年、Ｂｒａｄｂｕｒｙら
は、初めてこの酵素活性がブタ下垂体中に存在すること
を報告した。彼らは、基質として合成ペプチドＤ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−ＯＨを用い、これがＤ−Ｔｙｒ−
Ｖａｌ−ＮＨｚに変換することおよびＣ−末端のＧｕｙ
残基がアミドのＮ末端供与体として必須であることを示
した（Ｂｒａｄｂｕｒｙ、　Ａ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　
Ｎａｔｕｒｅ、　２９８．６８６−６８８＋１９８２）
。Ｅｉｐｐｅｒらは、この酵素活性がラント下垂体の前
葉、中葉および後葉に存在していることを報告し、この
酵素の最大酵素活性を得るためには、分子状酵素の外に
銅イオン（Ｃｕ”）とアスコルビン酸が必要であること
を報告した（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　ａ、．５１４４−
５１４８．１９８３）。また、この報告も含め多くの研
究者により種々の哺乳動物由来組織からＣ−末端α−ア
ミド化酵素の単離・精製が試みられている（Ｈｕｓａｉ
ｎ、Ｉ　ｅｔ　ａｌ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ−ｔｅｒ、１
５２．２２７−２８１．１９８３　；　Ｋｉｚｅｒ、Ｊ
、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、
　８１，３２２８−３２３２．１９８４；Ｍｕｒｔｈｙ
、八、Ｓ、Ｎ、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｊ、Ｂｉｏ　
　１．ｃｈｅｎ＋、＋　　２６Ｌ１８１５−１８２２．
１９８６）。しかし、これらの報告は何れもこれらの酵
素を単一で純粋な状態にまで精製するには至っていない
。

一方、本発明者らは、両種類であるアフリカッメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）の体皮よりＣ−末端
α−アミド化酵素を単一で純粋な状態にまで精製するこ
とに成功しくＭｉｚｕｎｏ、に、　ｅｔ　ａｔ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　１３７．
９８４−９９１．１９８６）、更にそのｃＤＮＡを得る
ことによりアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａ
ｅｖｉｓ）体皮由来のＣ−末端α−アミド化酵素の全ア
ミノ酸−次配列を決定するのに成功した（Ｍｉｚｕｎｏ
、に、、　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４８．５４６−５５２．
１９８７）。しかしながら、前記したように哺乳類由来
のＣ−末端α−アミド化酵素に関しては微量であること
及び不安定性、不均一性などのために、その分離・精製
が困難なことから、現在に至るまでＣ−末端α−アミド
化酵素を単一で純粋にまで精製するには至っていない、
従って、現在のところ哺乳類由来のＣ−末端α−アミド
化酵素は一種類であるのかまたは複数存在しているのか
は不明であり、更に、もし複数存在していれば、各々の
酵素において基質特異性が有るか否かは不明である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は物理化学的に単一かつ純粋な哺乳類由
来（特にブタ心房由来）のＣ−末端α−アミド化酵素と
その製造方法を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

すでに本発明者らは、ラットにおいてＣ−末端α−アミ
ド化酵素の組織分布を調べた結果、心房中にその活性が
高（認められることを報告した（Ｓａｋａｔａ、Ｊ、、
　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、。

１４０、２３０−２３６．１９８６）。本発明者らはこ
の点に着目し、今回哺乳類由来Ｃ−末端α−アミド化酵
素を精製するにあたり、より大量に入手可能な組織とし
てブタ心房についてＣ−末端α−アミド化酵素の存在を
検討した結果、ブタ心房の膜抽出画分に前記酵素活性が
あることを確認し、これより本発明における酵素を抽出
・精製することを試みた。

本酵素の精製は、ブタ心房の膜画分より５段階のクロマ
トグラフィーを行うことにより最終的に単一かつ純粋な
状態にまで精製することができた。

なお、本酵素の純度は５ＯＳ−ＰＡＧＥで単一バンドで
あること及びＨＰＬＣにおいても単一ピークを示すこと
から確認した。更に、該酵素を特定化するために酵素を
トリプシンで加水分解し、得られた酵素のトリブチイッ
クフラグメントの一部についてそのアミノ酸配列を決定
した。一方、該酵素のＣ−末端α−アミド化酵素活性は
合成基質Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＧｌｙおよびＴｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖ
ａｌ　−Ｇｌｙを用い、これらが各々Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−ＮＨ，およびＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ，に変換される
ことにより確認した。

以上の研究の結果に基き、本発明は、次の性質：３０作
用及び基質特異性 式Ｉ　：　Ｘ−Ｒ−Ｇ１３１で示されるＣ末端にグリシ
ン残基を有するペプチドまたは蛋白質を基質とし、これ
に対応する式Ｉｆ　：　　Ｘ−Ｒ−ＮＨ２で示される該
グリシン残基が欠失したＣ末端α位アミド体に変換する
； ｂ、至適ｐＨ：６．５−８．５； ｃ、分子量：約９２．０００　（ＳＯＳ−ＰＡＧＥによ
る測定）；ｄ、以下のペプチドフラグメントを含有する
：…Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ・；を有するブタ由来のＣ末端αアミ
ド化酵素；並びに上記酵素活性を有するブタ心房から該
酵素を抽出・精製することを特徴とする該酵素の製造方
法を提供するものである。

〔具体的な説明〕

以下、本発明の詳細な説明する。

（１）■素勿性１ （Ａ）作用・基質特異性 Ｃ末端にグリシン残基を有するペプチドまたは蛋白質を
基質とし、Ｃ末端グリシンが欠失し、かつＣ末端がαア
ミド化されたペプチドまたは蛋白質を与える。すなわち
、式Ｉ　：　　Ｘ−Ｒ−Ｇｌｙ　（式中、Ｘは任意のア
ミノ酸配列、Ｒは任意のアミノ酸残基、Ｇｌｙはグリシ
ン残基を示す）を基質とし、これに対応する式ＩＩ　：
　　Ｘ−Ｒ−Ｎｌ（、（式中、Ｘは任意のアミノ酸配列
、Ｒ−ＮＨ，は任意のアミノ酸残基Ｒのα位カルボキシ
ル基がアミド化、すなわち−ＣＯＯＩ（が−ＣＯＮＨｚ
に変換されたアミノ酸残基を示す）に変換する酵素であ
る。式■におけるＧｕｙは必須で、式■におけるＣ末端
αアミド化の窒素（Ｎ）供与体となる。

（Ｂ）分子量 約９２．０００　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）（Ｃ
）至適ｐＨ ｐＨ６，５−８，５ （Ｄ）各種物質に対する酵素活性の応答■Ｃ，＋＊イオ
ンが酵素活性発現に必須である。また、ＥＤＴＡによっ
て阻害されるが、これにＥＤＴＡｔｌｉ度以上のＣＬＩ
ＳＯ４を添加すると酵素活性は回復する。

■ジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって阻害される。

チオール化合物により阻害された酵素活性はＤＴＴ濃度
以上のＣＬＩＳＯ４またはＮ−エマルマレイミドによっ
て回復する。

■反応液中にアスコルビン酸が存在しないと酵素活性は
低下する。

（Ｅ）アミノ酸配列 本酵素のトリプツチイックフラグメントは以下の配列を
有する。

−Ｇ　ｌ　ｕ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　・・・（２）製造方法 この発明の酵素を抽出するための組織としてブタの心房
を用いることができる。酵素をブタ心房から抽出するに
は、まず、この心房を適当な緩衝液を用いて洗浄した後
、物理的手段を用いて破砕して酵素を溶出させ、この溶
出液から常法に従い酵素を回収し精製する。例えば、酵
素溶出液を遠心分離して、得られた沈澱物を緩衝液で洗
浄する。

さらに遠心分離して得られた沈澱物を界面活性剤で処理
し、再び遠心分離する。不溶物を除去し、得られた上滑
を回収して、ＤＥＡＲセルロースＤＨ−２５カラムクロ
マトグラフイーを用い、目的物を塩化ナトリウムの直線
濃度勾配で溶出する。次に、溶出液の活性画分をＱ−セ
ファロースカラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ
　Ｆｌｏｗ　ｃｏｌｕｍｎ；　ファルマシア社製）を用
い、目的物を塩化ナトリウム直線濃度勾配で溶出する。

次に、この溶出液の活性画分をアフィジェルプルー力ラ
ム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製
）にかけ、さらに素通り画分をアフィニティークロマト
グラフィー、すなわちＴｒｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＣＩ−
セファロースカラムにかける。さらに、ゲル濾過して、
本発明における酵素であるＣ−末端α−アミド化酵素の
最終精製品が得られる。

（３）ｊｌｉ　　の濱ｌ　　゛ 本発明のＣ−末端α−アミド化酵素の活性は、合成した
ペプチド［＋２５１コーＡｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ
を基質として用いて測定する。ｌ　ｐ　ｍｏｌｅの基質
（７０，０００−１５帆０００ｃｐｍ）を０．２　Ｍ　
ＣｕＳＯ４，０，２５ｍＭアスコルビン酸、２５ｍカタ
ラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）０．１％ルブロー
ル（ＰＸ　ｔｙｐｅ　；半井化学薬品社製；ｐＨ７，０
）２５０　ｕｌ中で被験酵素液と３７℃で１〜３時間反
応させる。これにＬＭ）リス塩酸バッファー（ｐＨ７：
Ｏ）０．７５−と酢酸エチル／蒸留水混合液の有機溶媒
層２＠ｌとを加え、強く撹拌した後、３．００Ｏｒｐｍ
　、　３分間遠心分離して有機溶媒層と水層とを分離す
る。

ここで未反応基質（［”Ｓ■］　−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ）の９８％以上が水層に、本発明における酵
素によりＣ末端がアミド化された基質（［”！］　−Ａ
ｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨｚ）の９８％以上が有機溶媒
層に移行するために両者を容易に分離することができる
。

Ｃ末端αアミド化生成物への変換率は、総放射能活性に
対する有機溶媒層の放射能活性の比から求めることがで
きる。この測定方法において、１時間当りｌ　ｐ　ｍｏ
ｌｅの［”ＳＩ］−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙが［
Ｉ２Ｊ］−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨｚに５０％変換
する酵素量を１ユニツト（ｕｎｉｔ）と定義する。

〔発明の効果〕

本発明における酵素を用いれば、式Ｉ：Ｘ−Ｒ−。

Ｇｌｙで示されるペプチドまたは蛋白質を基質として、
これに対応するＸ−Ｒ−Ｎｌ２、すなわちＣ−末端α−
アミド体に変換でき、多くの生理活性ペプチドおよび蛋
白質の製造が容易かつ効率的に行うことができる。なお
、本発明においてはブタ心房から本酵素を抽出・精製し
、Ｃ−末端α−アミド化酵素を製造したが、本発明にお
いてこの酵素の部分アミノ酸配列が明かになったことか
ら、このアミノ酸配列を基にｃＤＮＡプローブを作製し
、これを用いて対応する酵素のｃＤＮＡを単離すること
が可能であり、更にこのｃＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ
技術を用いれば本酵素を大量に生産することは当業者に
とっては自明である。

以下、実施例により更に本発明の詳細な説明する。

ブタ心房（湿重量；１ｋｇ）を１０ｉｇＭ）リス塩酸バ
フファー（ｐＨ７，０）　１０　ｉｔでポリトロンホモ
ジナイザーを用いて破砕した後、１２．０００　ｇで３
０分間遠心分離し、その沈澱画分を得た。該沈澱画分を
前記バッファー５１で抽出、再び、１２．０００　ｇで
３０分間遠心分離し、その沈澱画分を得た。該沈澱画分
より１１０１１Ｉトリス塩酸バツフアー（０，１％ルブ
ロールを含む：ｐＨ８，０）５Ａで抽出し、該抽出物を
１２．０００ｇで３０分間遠心分離して上清を得た。こ
の上清を同バッファーで平衡化したＤＥＡＥセルロース
ＤＥ５２を充填したカラム（４，５Ｘ６３ｃｍ）に吸着
させた。吸着物をＯ−０，３Ｍ塩化ナトリウムバッファ
ー（ｐＨ８，０）４ｆｆｉを用いた直線濃度勾配法によ
り溶出させた（第１図）。

第１図におけるフラクション番号１２０−１４５に酵素
活性が認められ、これをｌｏｍＭ）リス塩酸バッファー
（０，１％ルブロール含有；ｐＨ８，０）で透析した。

透析物にプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチン（ｌｅ
ｕｐｅｐｔｉｎ）　とＰＭＳＦ　（フェニルメチルスル
ホニルフルオリド）を最終濃度が各々５０ｍＭ。

０、５　ｍＭとなるように加えた。次に、０．１％ルブ
ロール含有１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８，０
）で平衡化されたＱ−セファロース（Ｑ−３ｅｐｈａｒ
ｏｓｅＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　、ファルマシア社製）を充
填したカラム（２Ｘ３５ａｉ）にかけ吸着させた。同バ
ッファーでカラムを洗浄後、吸着物を０−０．５　Ｍ塩
化ナトリウムバッファー（ｐＨ８，０）２１を用いる直
線濃度勾配法により溶出した（第２図）。

第２図におけるフラクション番号４３−５４の活性画分
を同量の１０ｍＭ）リス塩酸バッファー（０，１％ルブ
ロール含有、ｐＨ８，０）で希釈し、希釈溶液を同バッ
ファー（０，１％ルブロール、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１
を含有；ｐＨ８，０）で平衡化したアフィジェルブル−
（Ａｆｉｉ−Ｇｅｌ　ＢｌｕｅＨＢｉｏ−Ｒａｄ社製）
を充填したカラム（１，７ｘｌ１ｃｍ）にかけた。次に
、アフィニティーカラム、すなわちＴｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−ＣＨ−セファロ−スを同バッファー（０，２Ｍ　
ＮａＣ１含有）で平衡化したカラム（０，７Ｘ　５　ｃ
ｍ）に溶出液を直ちに吸着させた。活性画分は１Ｍイミ
ダゾール液（０，１％ルブロールを含有、ｐＨ７，０）
で溶出させた（第３図、第４図）。

次に、５０ｍＭ）リス塩酸バッファー（０，１％ルブロ
ール、０．２　Ｍ　ＮａＣ１を含有；ｐＨ７，０）で平
衡化されたセファデックスＧ−１００を充填したカラム
（１，８Ｘ　１３０ｃｍ）を用いたゲル濾過により最終
精製を行い、アラクアヨン番号４１−４５の活性画分を
集め、本発明における精製酵素として用いた（第５図）
。第５図中のａ、ｂ、及びＣは標準蛋白の溶出位置を示
し、各々ａ：Ｔ−グロブリン、ｂ：ウシ血清アルブミン
、Ｃ：オバルブミンを示す。

さらに、本酵素の精製度を確認する目的でＴＳＫＰｈｅ
ｎｙｌ−５ＰＷ　（東ソー社製）による逆相ＨＰＬＣを
用いて分析した。すなわち、精製した本酵素（２■）を
ＴＳＫ　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷを充填したカラム（４，
６ｘ７５ｃｍ）に吸着させ、０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）を含有する１０−６０％ＣＨ、ＣＮを用いた
直線濃度勾配法により溶出（流速１．　Ｑ　ｍｌ　／　
ｍｉｎ、　４０分）させ、前記方法でαアミド化活性を
調べたところ、単一のピークを示す酵素画分が得られ、
酵素活性を示す両分と一致した（第７図）。得られた精
製酵素について、ＤＴＴ非存在下、及び１２．５ｍＭ　
ＤＴＴ存在下４−２０％のアクリルアミド勾配ゲルによ
り、不連続緩衝液系（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｂ
ｕｆｆｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いた５ＯＳ−ＰＡＧＥ
にかけ、銀染色法により蛋白質の染色を行った（第６図
）。ＤＴＴの有無に関わらず、本酵素は分子量約９２．
０００に相当する位置に１本のバンドが得られた。また
、第１表に、各精製行程における総蛋白量、Ｃ末端αア
ミド化酵素活性、比活性、収率及び精製倍率を示す。

なお、ステップ１−２においてはチオール化合物の影響
を除くために酵素溶液中に１０ｍＭＮ−エチルマレイミ
ドを含む。ステップ５と６以外の各ステップにおける蛋
白質濃度は２ａ、ｎｍの吸光度により測定した。ステッ
プ５においては２ａ、ｎＩ１１により測定するためにイ
ミダゾールのαアミド化活性阻害作用により総蛋白質量
及び正確な総括性は測定できなかった。ステップ６にお
ける蛋白質濃度は５Ｏ５−ＰＡＧＥにより決定した。

ス」目側」エ　アミノ　配置の１ 精製酵素（１５塀）を１００４の５ｍＭトリス塩酸塩酸
バッフ−（２ｍＭ　ＣａＣ１ｇ含有；ｐＨ８，０）に溶
かし、３００ｎｇのＴＰＣＫ処理したトリプシン（Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）と３７℃で１２時間反応させ
た。さらに、３００ｎｇのＴＰＣＫ−１−リプシンを加
え１２時間反応させた。反応液を０．１％ＴＦＡで平衡
化したＣｈｅｍｃｏ−ｓｏｒｂ　３０ＤＳ−Ｈカラム（
８Ｘ　７５１ｍ、　Ｃｈｅｍｃｏ社製）にかけ、０−６
０％ＣＨ３ＣＮの直線濃度勾配により溶出させた（流速
；　２　ｍ！／ｍｉｎ　、ａ、分）。このようにして得
られたトリブチイックフラグメントのひとつについて、
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｒｏｔ
ｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　４７０Ａを用い、アミノ
酸配列を調べた結果、 ・・・Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　−であった。

実詣貞１　Ｈ素孟立夏貴定 基質として（Ａ　）　Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、
及び（Ｂ）Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを各々４ｎ　１ｌｏｌ
用い、０．２　Ｍ　）リス塩酸バッフｙ−（２ｍＣｕＳ
Ｏｉ　、０．２５Ｍアスコルビン酸、２５躍カタラーゼ
、０．１％ルブロール含有、ｐＨ７，０）中で、実施例
１で得たＣ末端αアミド化酵素０．１ｇと３７℃、２４
時間反応させた。１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　　
２．５０ｔ１１を加えることにより反応を停止させた後
、この溶液をＴＳＫ　０ＤＳ−１２ＯＡ　（東ソー社製
）を充填したカラム（０，４Ｘ　２５ＣＪｌ）にかけ、
（１１０−６０％ＣＨｓＣＮ　（１２０分）、（Ｂ）１
２−６０％Ｃ）ｌｆｆｃＮ（１９２分）の条件下で０．
１％ＴＦＡ溶液を用いた直線濃度勾配法により溶出した
。（流速１．５ａｆ／分）。

溶出液の２１０ｎｍに於ける吸光度を測定することによ
りペプチドの溶出画分を分析したところ、各々期待通り
のピーク（１、２）が得られた。すなわち、標品ペプチ
ドとのアミノ酸組成、Ｃ末端アミド分析、）ＩＰＬＣの
保持時間の比較に基づき各ピークは以下のごとく同定さ
れた。（Ａ）　　１．　　Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ
ｚ　、２．　Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　、　　（
Ｂ）　１．　　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅ
ｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ２，２，Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−＾ｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ　、また、標品ペプチドの流出位置はａ　、
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ，、ｂ、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｙ　、　ｃ、　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−八ｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨ，、ｄ、
　　Ｔｒｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ　。

以上のように、基質として用いたペプチドのＣ末端のＧ
ｌｙが欠失し、かつＣ末端のα位カルボキシル基がアミ
ド化されたＡｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ，及びアドレノ
ルフィンとして知られるペプチド；　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｎ
Ｈｚの標品と一致する位置のみに単一のピークが得°ら
れた（第８図）。

ス１１１エ　αアミ゛　２　に番　　Ｈ゛　スフαアミ
ド化活性におけるｐｔ＋及びアスコルビン酸の影響を前
記方法により測定した。ｐＨは酢酸エチルバッファー（
ｐＨ４，０〜５．０　）　、ＫＪＰＯ４−ＫＨｚＰＯ４
バッフファー（ｐＨ５，０〜７．０）、）リス塩酸バッ
ファー（ｐＨ７，０〜９．０）及び炭酸ナトリウム−重
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９，０〜１１．０）を
用いて調製した。結果を第９図及び第１０図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＤＥＡＥ−セルロースＤＥ　−５２を用いる
クロマトグラフィーにおける溶出経過を示す。 第２図は、Ｑ−セファロースを用いるクロマトグラフィ
ーにおける溶出経過を示す。 第３図は、アフィゲル−ブルーを用いるクロマトグラフ
ィーにおける溶出経過を示す。 第４図は、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−セファロースを用
いるアフィニティクロマトグラフィーにおける溶出経過
を示す。 第５図は、Ｇ−１００カラムを用いたゲル濾過における
溶出経過を示す。図中のａ、ｂ、ｃは標準蛋白の溶出位
置を示し、各々ａ：γ−グロブリン、ｂ：ウシ血清アル
ブミン、Ｃ：オバルブミンを示す。 第６図は、ＤＴＴ非存非存性条件下び１２．５ｍＭＤＴ
Ｔ存在条件下４−２０％濃度勾配アクリルアミドゲルを
用いた非連続溶媒システムによるＳＯ３−’ＰＡＧＥに
よる泳動パターンを示す。 第７図は、ＴＳＫ　Ｐｈｅｎｙｌ−５Ｐ−を用いたカラ
ムによる溶出経過を示す。 第８図は、ＴＳＫ　０ＤＳ−１２ＯＡを用いたカラムク
ロマトグラフィーを示し、基質としてＡは＾ｃ−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを、ＢはＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｎｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを用い
た時の反応生成物の溶出パターンを示す。 第９図は、各ｐ）ｉにおけるαアミド化活性を示す圓で
ある。 第１０図は、各アスコルビン酸濃度におけるαアミド化
活性を示す図である。 第１回 フラノン−１７Ｎｏ、（ＩＱｍｌ／ｆｒ）＄２図 第３１２？ フラクシ７ンＮ。 第４回 第５図 Ｍｒ　ｘ　Ｔ０３ ２００．０− ６６．２−　　　　− Ｄ丁Ｔ　　　　−−）− ＄６図 保持時間（分） 保持時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： ａ、作用及び基質特異性 式 I ：Ｘ−Ｒ−Ｇｌｙで示されるＣ末端にグリシン残
   基を有するペプチドまたは蛋白質を基質とし、これに対
   応する式II：Ｘ−Ｒ−ＮＨ＿２で示される該グリシン残
   基が欠失したＣ末端α位アミド体に変換する； ｂ、至適ｐＨ：６．５−８．５； ｃ、分子量：約９２．０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
   測定）；ｄ、以下のペプチドフラグメントを含有する：
   …Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− I ｌｅ
   −Ｌｅｕ−Ｇｌｙ…；を有するブタ由来のＣ末端αアミ
   ド化酵素。 ２、請求項１記載の酵素の製造方法において、上記酵素
   活性を有するブタ心房から該酵素を抽出・精製すること
   を特徴とする製造方法。