JPS62289184A - Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 - Google Patents
Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法Info
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- JPS62289184A JPS62289184A JP61131089A JP13108986A JPS62289184A JP S62289184 A JPS62289184 A JP S62289184A JP 61131089 A JP61131089 A JP 61131089A JP 13108986 A JP13108986 A JP 13108986A JP S62289184 A JPS62289184 A JP S62289184A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
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- C12Y114/17—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野〕
この発明は、ペプチドのＣ末端をアミド化する酵素、及
びその製造法に関する。この酵素はペプチドのＣ末端を
アミド化するために有用である。
びその製造法に関する。この酵素はペプチドのＣ末端を
アミド化するために有用である。
ペプチドのＣ末端がアミド化される過程は、プロホルモ
ンの活性化において最も重要な工程の１つである。この
アミド化に関与する酵素が、Ｂｒａｄｂｕｒｙらにより
、ブタ下垂体中に存在するごとが初めて報告された。彼
らは、基質として合成ペプチドＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙを用い、これがＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＯ□に変換
されること、及びＣ末端の−ＧｌｙがアミドのＮの供与
体として必須であることを示した（Ｂｒａｄｂｕｒｙ
、 八、Ｆｌ等 ； Ｎａｔｕｒｅ ２９８ ６
８６−６８８．１９８２）。
ンの活性化において最も重要な工程の１つである。この
アミド化に関与する酵素が、Ｂｒａｄｂｕｒｙらにより
、ブタ下垂体中に存在するごとが初めて報告された。彼
らは、基質として合成ペプチドＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙを用い、これがＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＯ□に変換
されること、及びＣ末端の−ＧｌｙがアミドのＮの供与
体として必須であることを示した（Ｂｒａｄｂｕｒｙ
、 八、Ｆｌ等 ； Ｎａｔｕｒｅ ２９８ ６
８６−６８８．１９８２）。
Ｍｉ織における、ペプチドＣ末端アミド化の機構を明ら
かにすることの重要性に加えて、近年、組み換えＤＮＡ
技術を用いて作り出されるペプチドのＣ末端をアミド化
する手段としても、この活性を有する酵素が注目され、
酵素の生化学的解析や精製・物理化学的解析が試みられ
た。Ｅｉｐｐｅｒらは、下垂体のα−アミド化酵素活性
には銅イオンとアスコルビン酸が必要であると報告した
（Ｐｒｏｃ。
かにすることの重要性に加えて、近年、組み換えＤＮＡ
技術を用いて作り出されるペプチドのＣ末端をアミド化
する手段としても、この活性を有する酵素が注目され、
酵素の生化学的解析や精製・物理化学的解析が試みられ
た。Ｅｉｐｐｅｒらは、下垂体のα−アミド化酵素活性
には銅イオンとアスコルビン酸が必要であると報告した
（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳ、８０５１４４−
５１４８．１９８３ ） 、この報告も含め、ペプチド
のＣ末端α−アミド化酵素の精製が試みられたが、充分
に精製された酵素が得られた例はこれまでにない。（Ｈ
ｕｓａｉｎ、 ｒ、等ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 １５２２
２７−２８１，１９８３；Ｋｉｚｅｒ、Ｊ、Ｓ、等、Ｐ
ＮＡＳ ８１３２２８−３２３２．１９８４等）。最近
、Ｍｕｒｔｈｙらは、牛の下垂体よりＣ末端アミド化酵
素を部分精製した結果、分子量、電荷の異なる複数の型
が存在することを示した（Ｍｕｒｔｈｙ、 Ａ、Ｓ、Ｎ
等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
５１４８．１９８３ ） 、この報告も含め、ペプチド
のＣ末端α−アミド化酵素の精製が試みられたが、充分
に精製された酵素が得られた例はこれまでにない。（Ｈ
ｕｓａｉｎ、 ｒ、等ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 １５２２
２７−２８１，１９８３；Ｋｉｚｅｒ、Ｊ、Ｓ、等、Ｐ
ＮＡＳ ８１３２２８−３２３２．１９８４等）。最近
、Ｍｕｒｔｈｙらは、牛の下垂体よりＣ末端アミド化酵
素を部分精製した結果、分子量、電荷の異なる複数の型
が存在することを示した（Ｍｕｒｔｈｙ、 Ａ、Ｓ、Ｎ
等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
２６１１８１５−１８２２）が、いずれの型の酵素につ
いても、単一で純粋な状態にまで精製されていない。
いても、単一で純粋な状態にまで精製されていない。
本発明は、充分に精製されたペプチドＣ末端アミド化酵
素と、その製造法を提供しようとするものである。
素と、その製造法を提供しようとするものである。
本発明者らは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌ
ａｅｖｉｓ）の体皮で、Ｃ末端アミド化ペプチドである
ＴＲｔｌ（−Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ Ｒｅｌｅａｓｉ
ｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ ）やセルレイン（ｃａｅｒｕ
ｌｅ ｉｎ）が生合成されている事に着目し、この体皮
に口約とするペプチドＣ末端アミド化酵素が存在する事
を確認し、ここから本発明の酵素を抽出・精製した。又
、本発明における酵素活性の測定法として、（１２Ｊ）
−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを基質として用いる
筒便かつ高感度の測定法を開発し、これを用いた。
ａｅｖｉｓ）の体皮で、Ｃ末端アミド化ペプチドである
ＴＲｔｌ（−Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ Ｒｅｌｅａｓｉ
ｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ ）やセルレイン（ｃａｅｒｕ
ｌｅ ｉｎ）が生合成されている事に着目し、この体皮
に口約とするペプチドＣ末端アミド化酵素が存在する事
を確認し、ここから本発明の酵素を抽出・精製した。又
、本発明における酵素活性の測定法として、（１２Ｊ）
−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを基質として用いる
筒便かつ高感度の測定法を開発し、これを用いた。
以下、本発明の詳細な説明する。
（酵素の性質）
（１）作用・基質特異性
Ｃ末端にグリシン残基を有するペプチドを基質とし、Ｃ
末端グリシンが欠失しかつＣ末端がα−アミド化された
ペプチドを与える。即ち、ペプチド−ｃｒｙ → ペ
プチド−ＮＨｚ（１） （ｎ） で示される変換に関与する酵素である。（Ｎで示される
一Ｇｌｙは必須で、これが（ＩＩ）で示されるＣ末端ア
ミドのＮの供与体となる。
末端グリシンが欠失しかつＣ末端がα−アミド化された
ペプチドを与える。即ち、ペプチド−ｃｒｙ → ペ
プチド−ＮＨｚ（１） （ｎ） で示される変換に関与する酵素である。（Ｎで示される
一Ｇｌｙは必須で、これが（ＩＩ）で示されるＣ末端ア
ミドのＮの供与体となる。
（２）分子量
ＳＤＳゲル電気泳動法により測定した分子量は約３９．
０００である。
０００である。
（３）至適ｐＨ
至適ｐＨは６〜７である。
（４）各種物質に対する酵素活性の応答■ Ｃｕ”イオ
ンが酵素活性発現に必須である。
ンが酵素活性発現に必須である。
また、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡによって阻害されるが、
これに０．１２ｍＭ以上のＣｕ５Ｏ，を添加すると酵素
活性は回復する。
これに０．１２ｍＭ以上のＣｕ５Ｏ，を添加すると酵素
活性は回復する。
０１ｍＭジチオスレイトールによって阻害される。チオ
ール化合物により阻害された酵素活性は１．２ ｍＭ
ＣｕＳＯ４又は５ｍＭＮ−エチルマレイミドによって回
復する。
ール化合物により阻害された酵素活性は１．２ ｍＭ
ＣｕＳＯ４又は５ｍＭＮ−エチルマレイミドによって回
復する。
■ 反応液中にアスコルビン酸が存在しないと酵素活性
は低下する。
は低下する。
（５）アミノ酸配列
Ｎ末端にＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ・・・の配列を有する
。
。
（製造方法）
この発明の酵素を抽出するための組織としてアフリカッ
メガエルの体皮が挙げられる。
メガエルの体皮が挙げられる。
この発明の酵素を、この体皮から抽出するには、まず、
この体皮を適当な緩衝液を用いて洗浄した後物理的手段
を用いて破砕して酵素を溶出させ、この溶出液から常法
に従い酵素を回収・精製する。例えば、酵素溶出液を遠
心分離して不溶物を除去し、得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを添加し、８０％飽和として酵素を塩析した後、
遠心分離により沈澱物として回収する。
この体皮を適当な緩衝液を用いて洗浄した後物理的手段
を用いて破砕して酵素を溶出させ、この溶出液から常法
に従い酵素を回収・精製する。例えば、酵素溶出液を遠
心分離して不溶物を除去し、得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを添加し、８０％飽和として酵素を塩析した後、
遠心分離により沈澱物として回収する。
この沈澱を適当な溶媒に溶屏して透析後、ＤＥＡＥセル
ロースＤＥ−５２カラムクロマトグラフィーのリン酸ナ
トリウムバッファー直ｖＡ濃度勾配で溶出する。次に溶
出液の活性画分をアフィジェルブルー力ラムによるアフ
ィニティークロマトグラフィーにおいてＮａＣ１直線濃
度勾配により溶出する。活性画分をセファクリルＳ−３
００でゲル濾過した後、ヒドロキシルアパタイトにより
精製すると２つの活性画分を得られる。このうち、主活
性画分（第３図中、■の両分）をさらにバイパフォーマ
ンスヒドロキシルアバタイトで精製した後、５ｕｐｅｒ
ｏｓｅ １２によりゲル濾過して、本発明の酵素である
Ｃ末端アミド化酵素ＡＥ−１の最終精製品が得られる。
ロースＤＥ−５２カラムクロマトグラフィーのリン酸ナ
トリウムバッファー直ｖＡ濃度勾配で溶出する。次に溶
出液の活性画分をアフィジェルブルー力ラムによるアフ
ィニティークロマトグラフィーにおいてＮａＣ１直線濃
度勾配により溶出する。活性画分をセファクリルＳ−３
００でゲル濾過した後、ヒドロキシルアパタイトにより
精製すると２つの活性画分を得られる。このうち、主活
性画分（第３図中、■の両分）をさらにバイパフォーマ
ンスヒドロキシルアバタイトで精製した後、５ｕｐｅｒ
ｏｓｅ １２によりゲル濾過して、本発明の酵素である
Ｃ末端アミド化酵素ＡＥ−１の最終精製品が得られる。
上述のヒドロキシルアパタイト処理で得られる２つの活
性画分のうち、副活性画分（第３図中のＨの両分）につ
いて同様に精製を進め、５ｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム
処理すると、ＳＤＳゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）
で分子量約３４，０００と約３９．０００を示す２つの
物質が得られる（第５図参照）。これらも先の本発明酵
素（ＡＥ−１）と同様にペプチドＣ末端アミド化活性を
示す。
性画分のうち、副活性画分（第３図中のＨの両分）につ
いて同様に精製を進め、５ｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム
処理すると、ＳＤＳゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）
で分子量約３４，０００と約３９．０００を示す２つの
物質が得られる（第５図参照）。これらも先の本発明酵
素（ＡＥ−１）と同様にペプチドＣ末端アミド化活性を
示す。
（酵素活性の測定方法）
この発明のα−アミド化酵素の活性は、合成したペプチ
ド（Ｉ２Ｊ）−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを基質と
して用いて測定する。ｌｐｍｏｌｅの基質（７０，００
０〜１５０．ＯＯＯｃｐｍ）を、０．２ Ｍ トリス−
塩酸バックｙ （２，１７Ｍ ＣｕＳＯ４、０，２
５ｍＭアスコルビン酸、２５μｇカタラーゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ社製）及び０．１％ルブロール（Ｔｙｐｅ
ＰＸ） （牛丼化学薬品−社製）を含む、ｐＨ７，０
〕２５０μβ中で被験酵素液と３７℃、１〜４時間反応
させる。これにＩＭトリス塩酸バッフｙ −（ｐＨ７，
０） ０．７５ｍ ｌ。
ド（Ｉ２Ｊ）−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを基質と
して用いて測定する。ｌｐｍｏｌｅの基質（７０，００
０〜１５０．ＯＯＯｃｐｍ）を、０．２ Ｍ トリス−
塩酸バックｙ （２，１７Ｍ ＣｕＳＯ４、０，２
５ｍＭアスコルビン酸、２５μｇカタラーゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ社製）及び０．１％ルブロール（Ｔｙｐｅ
ＰＸ） （牛丼化学薬品−社製）を含む、ｐＨ７，０
〕２５０μβ中で被験酵素液と３７℃、１〜４時間反応
させる。これにＩＭトリス塩酸バッフｙ −（ｐＨ７，
０） ０．７５ｍ ｌ。
と、酢酸エチル／蒸留水混合液の有機溶媒層２ｍｌとを
加え強（攪拌した後、３０００ｒｐｍ 、３分間遠心分
離して有機溶媒層と水層を分離する。
加え強（攪拌した後、３０００ｒｐｍ 、３分間遠心分
離して有機溶媒層と水層を分離する。
ここで未反応基質（（”’Ｉ） −Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ）の９８％以上が水層に、本発明の酵素によ
りＣ末端がアミド化された基質（〔１２５Ｉ〕−胱−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨｚ）の９８％以上が有機溶媒層に移
項するため両者を容易に分離することができる。Ｃ末端
アミド化生成物への変換率は、総放射能活性に対する有
機溶媒層の放射能活性の比から求めることができる。こ
の測定法において、１時間当りＣｌ２’Ｉ）−Ａｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−ＧｌｙがＣｌ２Ｊ） −Ａｃ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−ＮＨｚに５０％変換する酵素量を１ユニツトと
定義する。被験酵素液として、アフリカッメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ）体皮の粗抽出物を用いた
場合の酢酸エチル層の放射能活性は、マイクロボンダバ
ックＣ−１８（μＢｏｎｄａｐａｋＣ−１８、Ｗａｔｅ
ｒｓ社）の逆相ＨＰＬＣを用いて溶出した両分について
測定する。溶出は１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐｌ＋
４．０ ）の、１０〜５０％ＣＨ，ＣＮ直線濃度勾配で
行なう（流速２．０ｔｒｌ／分、４０分、）（第１図参
照）。第１図の放射能活性のピークは、同じ条件で溶出
されるＡｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｎｔ＋。
ｅ−Ｇｌｙ）の９８％以上が水層に、本発明の酵素によ
りＣ末端がアミド化された基質（〔１２５Ｉ〕−胱−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨｚ）の９８％以上が有機溶媒層に移
項するため両者を容易に分離することができる。Ｃ末端
アミド化生成物への変換率は、総放射能活性に対する有
機溶媒層の放射能活性の比から求めることができる。こ
の測定法において、１時間当りＣｌ２’Ｉ）−Ａｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−ＧｌｙがＣｌ２Ｊ） −Ａｃ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−ＮＨｚに５０％変換する酵素量を１ユニツトと
定義する。被験酵素液として、アフリカッメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ）体皮の粗抽出物を用いた
場合の酢酸エチル層の放射能活性は、マイクロボンダバ
ックＣ−１８（μＢｏｎｄａｐａｋＣ−１８、Ｗａｔｅ
ｒｓ社）の逆相ＨＰＬＣを用いて溶出した両分について
測定する。溶出は１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐｌ＋
４．０ ）の、１０〜５０％ＣＨ，ＣＮ直線濃度勾配で
行なう（流速２．０ｔｒｌ／分、４０分、）（第１図参
照）。第１図の放射能活性のピークは、同じ条件で溶出
されるＡｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｎｔ＋。
構造をもつ標準ペプチドと同一の位置に現われ、本発明
の酵素により （”’Ｄ −Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙが（”５ｒ）−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ，に変
換されていることが認められる。
の酵素により （”’Ｄ −Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙが（”５ｒ）−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ，に変
換されていることが認められる。
次淘」１ユ アフリカッメガエルか°Ｃがアミアフリカ
ッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｉａｅｖｉｓ） ８匹の
体皮４８ｇを、２０ ｉｔ Ｍ Ｃｕ５Ｏａを含む１０
ｍＭｈリス塩酸バ・ノファー（ｐＨ７，０） １１で
ポリトロンホモジナイザーを用いて破砕した後、３０，
０ＯＯＸ ｇ、３０分間遠心分離して上清を得た。沈澱
物は、さらに同バッファー６００ｍ１でポリトロンホモ
ジナイザーを用いて破砕・遠心分離し、得られた上清を
先の上清と合わせ粗抽出液とした。この粗抽出液に、硫
酸アンモニウム８０％飽和となる様加えることにより塩
析し、生成した不溶物を、２ｍＭリン酸ナトリウムバッ
ファー（２０μＭ ＣｕＳＯ４を含む、ｐＨ８，６）
１２０ ｍａｌに）脈濁し、同バッファーに対して透析
した。透析内液を、同バッファーで平衡化したＤＥＡＥ
セルロースＤＥ５２を充填したカラム（４Ｘ３２ｃｍ）
に吸着せしめた。吸着物を２ｍＭ〜２５０ｍＭ リン酸
ナトリウムパンファー（ｐＨ８，６）を用いる直線濃度
勾配法により溶出し、既述の方法によりＣ末端アミド化
酵素活性を測定して活性両分を得た。この活性画分に、
硫酸アンモニウム８０％飽和となる様に加えて塩析し、
生成した不溶物を少量の５ｍＭｈリス塩酸バッファー（
２ＭＭＣｕＳＯ，を含む、ｐＨ７，０）に溶解し、同バ
ッファーに対して透析する事により濃縮した。透析内液
を、同バッファーで平衡化したアフィジェルブルー（バ
イオランド社製）を充填したカラム（４，ＯＸ３２ｃｍ
）に吸着せしめた。吸着物を、ＮａＣｌ濃度を０〜１．
０Ｍとした同バッファー溶液を用いる直線濃度勾配法に
より溶出した（流速４０ｍ１１時）（第２図）。活性画
分を、ＹＭ−１０メンプラン（アミコン社製）を用いる
限外濾過により濃縮した。この濃縮内液を、５０１ｎＭ
）リス塩酸（０，１ＭＮａＣ１，２μＭ ＣｕＳＯ４を
含む、ｐＨ７，０）で平衡化したセファクリルＳ−３０
０を充填したカラム（３，０Ｘ１４０ｃｍ）にかけ、同
溶液により溶出しく流速４０ｍＩ２／時）活性画分をＹ
Ｍ−１０メンプラン（先述）で濃縮した後、１０ｍＭリ
ン酸カリウムバッフｙ （１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ、
０．１％ルブロール（牛丼化学社製）を含む、ｐＨ６
，８）で平衡化したヒドロキシルアパタイトを充填した
カラムに吸着せしめた。１０ｍＭ〜４００ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（１０ｍＭ ＣａＣＩｚ 、 ０．１
％ルブロールを含む、ｐＨ６，８）を用いる直線濃度勾
配法により溶出しく流速１２ｍｊ！／時）２つの活性画
分を得た（第３図）。
ッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｉａｅｖｉｓ） ８匹の
体皮４８ｇを、２０ ｉｔ Ｍ Ｃｕ５Ｏａを含む１０
ｍＭｈリス塩酸バ・ノファー（ｐＨ７，０） １１で
ポリトロンホモジナイザーを用いて破砕した後、３０，
０ＯＯＸ ｇ、３０分間遠心分離して上清を得た。沈澱
物は、さらに同バッファー６００ｍ１でポリトロンホモ
ジナイザーを用いて破砕・遠心分離し、得られた上清を
先の上清と合わせ粗抽出液とした。この粗抽出液に、硫
酸アンモニウム８０％飽和となる様加えることにより塩
析し、生成した不溶物を、２ｍＭリン酸ナトリウムバッ
ファー（２０μＭ ＣｕＳＯ４を含む、ｐＨ８，６）
１２０ ｍａｌに）脈濁し、同バッファーに対して透析
した。透析内液を、同バッファーで平衡化したＤＥＡＥ
セルロースＤＥ５２を充填したカラム（４Ｘ３２ｃｍ）
に吸着せしめた。吸着物を２ｍＭ〜２５０ｍＭ リン酸
ナトリウムパンファー（ｐＨ８，６）を用いる直線濃度
勾配法により溶出し、既述の方法によりＣ末端アミド化
酵素活性を測定して活性両分を得た。この活性画分に、
硫酸アンモニウム８０％飽和となる様に加えて塩析し、
生成した不溶物を少量の５ｍＭｈリス塩酸バッファー（
２ＭＭＣｕＳＯ，を含む、ｐＨ７，０）に溶解し、同バ
ッファーに対して透析する事により濃縮した。透析内液
を、同バッファーで平衡化したアフィジェルブルー（バ
イオランド社製）を充填したカラム（４，ＯＸ３２ｃｍ
）に吸着せしめた。吸着物を、ＮａＣｌ濃度を０〜１．
０Ｍとした同バッファー溶液を用いる直線濃度勾配法に
より溶出した（流速４０ｍ１１時）（第２図）。活性画
分を、ＹＭ−１０メンプラン（アミコン社製）を用いる
限外濾過により濃縮した。この濃縮内液を、５０１ｎＭ
）リス塩酸（０，１ＭＮａＣ１，２μＭ ＣｕＳＯ４を
含む、ｐＨ７，０）で平衡化したセファクリルＳ−３０
０を充填したカラム（３，０Ｘ１４０ｃｍ）にかけ、同
溶液により溶出しく流速４０ｍＩ２／時）活性画分をＹ
Ｍ−１０メンプラン（先述）で濃縮した後、１０ｍＭリ
ン酸カリウムバッフｙ （１０ｍＭ ＣａＣ１ｚ、
０．１％ルブロール（牛丼化学社製）を含む、ｐＨ６
，８）で平衡化したヒドロキシルアパタイトを充填した
カラムに吸着せしめた。１０ｍＭ〜４００ｍＭリン酸カ
リウムバッファー（１０ｍＭ ＣａＣＩｚ 、 ０．１
％ルブロールを含む、ｐＨ６，８）を用いる直線濃度勾
配法により溶出しく流速１２ｍｊ！／時）２つの活性画
分を得た（第３図）。
このうち、大きなピークの活性画分（第３図中■の両分
）をＡＥ−１画分、小さなピークの活性画分をＡＥ−Ｉ
Ｉ画分とした。ＡＥ−Ｉ画分を蒸留水で３倍希釈した後
、高力価のヒドロキシルアパタイト（バイオランド社製
）を充填したカラムに吸着せしめ、０．０１〜０．３５
Ｍリン酸ナトリウムハソフｙ （１０ＭＭ ＣａＣ
１ｚ、 ０．１％ルブロールを含む、ｐ＋＋ ６．８
）を用いた直線濃度勾配法により溶出した。
）をＡＥ−１画分、小さなピークの活性画分をＡＥ−Ｉ
Ｉ画分とした。ＡＥ−Ｉ画分を蒸留水で３倍希釈した後
、高力価のヒドロキシルアパタイト（バイオランド社製
）を充填したカラムに吸着せしめ、０．０１〜０．３５
Ｍリン酸ナトリウムハソフｙ （１０ＭＭ ＣａＣ
１ｚ、 ０．１％ルブロールを含む、ｐ＋＋ ６．８
）を用いた直線濃度勾配法により溶出した。
活性画分を、５ｕｐｅｒｏｓｅｌ ２ （ファルマシ
ア社製）ゲルを充填したカラム（１，６Ｘ５０ｃｍ）に
付し、１０ｍＬトリス塩酸バッフｙ （０，１Ｍ
ＮａＣｌ 。
ア社製）ゲルを充填したカラム（１，６Ｘ５０ｃｍ）に
付し、１０ｍＬトリス塩酸バッフｙ （０，１Ｍ
ＮａＣｌ 。
０．１％ルブロールを含む、ｐＨ７，０）を用いて溶出
した（流速１．５ｍｊｌ！／分）。精製酵素ＡＥ−１を
得た（第４図）。一方、ＡＥ−ＩＩ画分について、先述
のＡＥ−Ｉの場合と同様に精製を進め、精製酵素ＡＥ−
ＩＩを得た。ＡＥ−１，ＡＥ−ＩＩについて、１２．５
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下及び非存在下
、不連続緩衝液系（ｄ １ｓｃｏｎ ＊ １ｎｕｏｕｓ
ｂｕｆｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いた５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、銀染色法により蛋白の染色を行った。その結
果を第５図に示す。ＤＴＴの有無にかかわらずＡＥ−１
は分子量約３９．０００に相当する位置に１本のハンド
が得られ、ＡＥ−ＩＩは分子量約３４．０００及び約３
９，０００に相当する位置に各１本のハンドが得られた
。ＡＥ−■酵素の精製度について更に、ハイボアＲＰ−
３０４（バイオラッド社製）による逆相高速液体クロマ
トグラフィー（ＩＩＰＬＣ）を用いて分析した。即ちＡ
Ｅ−Ｉ２ＭｇをハイボアＲＰ−３０４を充填したカラム
に吸着せしめ、１０〜６０％Ｃ１１３ＣＮの０．１％ト
リフルオロ酢酸溶液を用いた直線ン農度勾配法により溶
出したところ（流速１．５ｍＮ／分）（第６図）、単一
のピークを示す酵素画分を得た。表１には各精製工程で
の総蛋白量、Ｃ末端α−アミド化醇素活性および、比活
性、収率、精製倍率を示す。
した（流速１．５ｍｊｌ！／分）。精製酵素ＡＥ−１を
得た（第４図）。一方、ＡＥ−ＩＩ画分について、先述
のＡＥ−Ｉの場合と同様に精製を進め、精製酵素ＡＥ−
ＩＩを得た。ＡＥ−１，ＡＥ−ＩＩについて、１２．５
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下及び非存在下
、不連続緩衝液系（ｄ １ｓｃｏｎ ＊ １ｎｕｏｕｓ
ｂｕｆｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いた５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、銀染色法により蛋白の染色を行った。その結
果を第５図に示す。ＤＴＴの有無にかかわらずＡＥ−１
は分子量約３９．０００に相当する位置に１本のハンド
が得られ、ＡＥ−ＩＩは分子量約３４．０００及び約３
９，０００に相当する位置に各１本のハンドが得られた
。ＡＥ−■酵素の精製度について更に、ハイボアＲＰ−
３０４（バイオラッド社製）による逆相高速液体クロマ
トグラフィー（ＩＩＰＬＣ）を用いて分析した。即ちＡ
Ｅ−Ｉ２ＭｇをハイボアＲＰ−３０４を充填したカラム
に吸着せしめ、１０〜６０％Ｃ１１３ＣＮの０．１％ト
リフルオロ酢酸溶液を用いた直線ン農度勾配法により溶
出したところ（流速１．５ｍＮ／分）（第６図）、単一
のピークを示す酵素画分を得た。表１には各精製工程で
の総蛋白量、Ｃ末端α−アミド化醇素活性および、比活
性、収率、精製倍率を示す。
実止阻２． Ｍ１込Ｅｌのアミノ ヨエｌ定上記ＩＩ
Ｐ Ｌ Ｃで得られた酵素画分について、Ａｐｐｌｉ
ｅｄＢ １ｏｓｙｓ ｔｅｍｓ社製のＰｒｏｔｅｉｎ
５ｅｑｕｅｎｃｅｒ ４７０Ａを用い、常法に従いアミ
ノ酸配列を調べた結果、Ｎ末端のアミノ酸配列は、Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ・・・であった。
Ｐ Ｌ Ｃで得られた酵素画分について、Ａｐｐｌｉ
ｅｄＢ １ｏｓｙｓ ｔｅｍｓ社製のＰｒｏｔｅｉｎ
５ｅｑｕｅｎｃｅｒ ４７０Ａを用い、常法に従いアミ
ノ酸配列を調べた結果、Ｎ末端のアミノ酸配列は、Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ・・・であった。
１皇±１
基質としてＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
八ｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ ４ ｎｍｏ＋を用い
、０．２ Ｍ トリス塩酸バッファ（２μＭ Ｃｕ５Ｏ
＜ 、 ０．２５Ｍアスコルビン酸、２５μｇカタラー
ゼ、０．１％ルブロールを含む、ｐＨ７，０）中実施例
１で得たＣ末端アミド化酵素ＡＥ−Ｉ ０．１Ｍｇと３
７℃、２４時間インキユヘートした。１％トリフルオロ
酢酸２５０μｌを加えることにより反応を停止させた後
、この溶液を、ＴＳＫｏｏＳ−１２ＯＡ （東洋曹達社
製）を充填したカラム（０，４Ｘ２５ｃｍ）にかけ、１
２〜６０％ＣＨ３ＣＮの０．１％トリフルオロ酢酸溶液
を用いて、直ＶＡ？Ｈ度勾配法により溶出した（流速１
．５ｒｒｌ／分）。？容量液の２１ＯＡｍにおける吸光
度を測定することによりペプチドの溶出画分を分析した
ところ、基質とじて用いたペプチドのＣ末端のＧｌｙが
欠失しかつＣ末端のα−アミド化されたアドレノルフィ
ンとして知られるペプチド（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨｚ）の
標品と一致する位置のみに単一のピークが得られた（第
７図中１で示した。第７図中ａの矢印はアドレノルフィ
ン標品の溶出ピークの位置を、ｂの矢印は基質標品の溶
出ピークの位置を、各々示している）。第７図より、・
・・Ｖａｌ−Ｇｌｙ体の７５〜８０％が、・・・Ｖ ａ
ｌ −Ｎ ）ｌ ｚ体に変換されていることがわかる
。第７図中１の画分をとって６Ｍ塩酸存在下で１１０℃
、２４時間反応させることにより、ペプチドを加水分解
した後、アミノ酸分析機を用いて、アミノ酸組成を分析
した。このアミノ酸組成並びに、サーモライシン消化後
の薄層クロマ） （ＴＬＣ）によるＣ末端アミドの分析
、およびＩＩＰＬＣでのペプチド標品との保持時間の比
較から、第７図に示したピークｂは、アドレノルフィン
であると同定された。
八ｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ ４ ｎｍｏ＋を用い
、０．２ Ｍ トリス塩酸バッファ（２μＭ Ｃｕ５Ｏ
＜ 、 ０．２５Ｍアスコルビン酸、２５μｇカタラー
ゼ、０．１％ルブロールを含む、ｐＨ７，０）中実施例
１で得たＣ末端アミド化酵素ＡＥ−Ｉ ０．１Ｍｇと３
７℃、２４時間インキユヘートした。１％トリフルオロ
酢酸２５０μｌを加えることにより反応を停止させた後
、この溶液を、ＴＳＫｏｏＳ−１２ＯＡ （東洋曹達社
製）を充填したカラム（０，４Ｘ２５ｃｍ）にかけ、１
２〜６０％ＣＨ３ＣＮの０．１％トリフルオロ酢酸溶液
を用いて、直ＶＡ？Ｈ度勾配法により溶出した（流速１
．５ｒｒｌ／分）。？容量液の２１ＯＡｍにおける吸光
度を測定することによりペプチドの溶出画分を分析した
ところ、基質とじて用いたペプチドのＣ末端のＧｌｙが
欠失しかつＣ末端のα−アミド化されたアドレノルフィ
ンとして知られるペプチド（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＮＨｚ）の
標品と一致する位置のみに単一のピークが得られた（第
７図中１で示した。第７図中ａの矢印はアドレノルフィ
ン標品の溶出ピークの位置を、ｂの矢印は基質標品の溶
出ピークの位置を、各々示している）。第７図より、・
・・Ｖａｌ−Ｇｌｙ体の７５〜８０％が、・・・Ｖ ａ
ｌ −Ｎ ）ｌ ｚ体に変換されていることがわかる
。第７図中１の画分をとって６Ｍ塩酸存在下で１１０℃
、２４時間反応させることにより、ペプチドを加水分解
した後、アミノ酸分析機を用いて、アミノ酸組成を分析
した。このアミノ酸組成並びに、サーモライシン消化後
の薄層クロマ） （ＴＬＣ）によるＣ末端アミドの分析
、およびＩＩＰＬＣでのペプチド標品との保持時間の比
較から、第７図に示したピークｂは、アドレノルフィン
であると同定された。
更に、基質としてＴｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、八ｃ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ。
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ。
Ｄ−Ｔｙｒ−シａｌ−Ｇｌｙ、 Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ、 Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ 、及びＢ Ａ Ｍ １２
Ｐ （Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−へｒ
ｇ−へｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
） 、を用いＡＥ−１の存在下、Ｃ末端アミド化体へ
の変換率を求めた。結果を第８図に示した。Ｃ末端にＧ
ｌｙ残基を有するペプチドはいずれもＣ末端アミド化物
に経時的に変換されたが、Ｃ末端にｃｔｙを有さない基
質は４８時間後においても、Ｃ末端アミド化体への変換
は見られず、本発明の酵素が、Ｃ末端にＧｌｙ残基を有
するペプチドを特異的にアミド体に変換する有用な酵素
であることが確認された。
Ｇｌｙ、 Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ 、及びＢ Ａ Ｍ １２
Ｐ （Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−へｒ
ｇ−へｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
） 、を用いＡＥ−１の存在下、Ｃ末端アミド化体へ
の変換率を求めた。結果を第８図に示した。Ｃ末端にＧ
ｌｙ残基を有するペプチドはいずれもＣ末端アミド化物
に経時的に変換されたが、Ｃ末端にｃｔｙを有さない基
質は４８時間後においても、Ｃ末端アミド化体への変換
は見られず、本発明の酵素が、Ｃ末端にＧｌｙ残基を有
するペプチドを特異的にアミド体に変換する有用な酵素
であることが確認された。
ＡＥ−１のかわりにＡＥ−ＩＩを用いて同様に゛活性を
見たところ、上述と同様の結果が得られた。
見たところ、上述と同様の結果が得られた。
策」−五
アフリカッメガエルの体皮からのα−アミド化計素（Ａ
Ｅ−１）の精製段 階 全蛋白質 全°活性
比活性 収 率 精製倍率（ｍｇ）
（１ニツト） （ユニット／ｍｇ）
（％）１、粗抽出物 １１３７６
４６３６８ ４．０８ （１００，０）
（１，０）２、 ６メビシ鍼アンモニウム
１６８１．Ｌ ４０４０３
２４．０３ ８７．１＠
５．９ ３、ＤＥ−５２７２９，０２４４０７３３，４８５２，
６８，２４、Ａｆｆｉ−ＧｅｌＢｌｕｅ ５６
．３０ １３０３７ ２３１．４８ ２Ｂ、１
５６．７５．５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００４５
，２０１１５８４２５６，２Ｂ ２５．０ ６
２．８６、ｈｙｄｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ １
．２６３ ３７８４．２ ２９９６．２ ８．
２ ７３４．４７、 ｌ＋ＰＩＩＴ
Ｏ，１１５１５０９，０１３１２２３，３３２１
６，１８、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ ０．０２
７ ９２１．４ ３４１２６ ２．０ ８３
６４．２
Ｅ−１）の精製段 階 全蛋白質 全°活性
比活性 収 率 精製倍率（ｍｇ）
（１ニツト） （ユニット／ｍｇ）
（％）１、粗抽出物 １１３７６
４６３６８ ４．０８ （１００，０）
（１，０）２、 ６メビシ鍼アンモニウム
１６８１．Ｌ ４０４０３
２４．０３ ８７．１＠
５．９ ３、ＤＥ−５２７２９，０２４４０７３３，４８５２，
６８，２４、Ａｆｆｉ−ＧｅｌＢｌｕｅ ５６
．３０ １３０３７ ２３１．４８ ２Ｂ、１
５６．７５．５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００４５
，２０１１５８４２５６，２Ｂ ２５．０ ６
２．８６、ｈｙｄｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ １
．２６３ ３７８４．２ ２９９６．２ ８．
２ ７３４．４７、 ｌ＋ＰＩＩＴ
Ｏ，１１５１５０９，０１３１２２３，３３２１
６，１８、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ ０．０２
７ ９２１．４ ３４１２６ ２．０ ８３
６４．２
第１図は、この発明のα−アミド化酵素ＡＥ−■により
アミド化された基質（ペプチド）の、マイクロボンダパ
ックＣ−１８を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー
における溶出経過を示す。 第２図は、７フイジエルブルーを用いるカラムクロマト
グラフィーにおける溶出経過を示す。 第３図は、ヒドロキシルアパタイトを用いるカラムクロ
マトグラフィーにおける溶出経過を示す。 第４図は、この発明の酵素ＡＥ−１の、５ｕｐｅｒｏｓ
ｅ１２ゲルを用いるカラムクロマトグラフィーにおける
溶出経過を示す。 第５図は、この発明の酵素ＡＥ−Ｉを、ジチオスレイト
ールの存在下（図中（＋）で示す）および非存在下（図
中（−）で示す）で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示
す。 第６図は、この発明の酵素ＡＥ−１の、ハイボアＲＰ−
３０４を用いたカラムクロマトグラフィーにおける溶出
経過を示す。 第７図はＴＳＫ ０ＤＳ−１２ＯＡを用いたカラムクロ
マトグラフィーを示し、■は、基質として用いたＴｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙの反応０時の溶出パターンを、■は■で
用いた基質と発明の酵素ＡＥ−１とを２４時間作用させ
得られた反応生成物の溶出パターンを示す。 また、■のａ、ｂの矢印は、標準のアドレノルフィンお
よびＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ｃ＋ｙが溶出される位置を示す。Ｏ
の１の位置は■のａの矢印の位置と、２はｂの矢印の位
置と一致する。 第８図は、この発明の酵素ＡＥ−１による各種基質のＣ
末端α−アミド化体への変換率を示すグラフである。
アミド化された基質（ペプチド）の、マイクロボンダパ
ックＣ−１８を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー
における溶出経過を示す。 第２図は、７フイジエルブルーを用いるカラムクロマト
グラフィーにおける溶出経過を示す。 第３図は、ヒドロキシルアパタイトを用いるカラムクロ
マトグラフィーにおける溶出経過を示す。 第４図は、この発明の酵素ＡＥ−１の、５ｕｐｅｒｏｓ
ｅ１２ゲルを用いるカラムクロマトグラフィーにおける
溶出経過を示す。 第５図は、この発明の酵素ＡＥ−Ｉを、ジチオスレイト
ールの存在下（図中（＋）で示す）および非存在下（図
中（−）で示す）で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示
す。 第６図は、この発明の酵素ＡＥ−１の、ハイボアＲＰ−
３０４を用いたカラムクロマトグラフィーにおける溶出
経過を示す。 第７図はＴＳＫ ０ＤＳ−１２ＯＡを用いたカラムクロ
マトグラフィーを示し、■は、基質として用いたＴｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙの反応０時の溶出パターンを、■は■で
用いた基質と発明の酵素ＡＥ−１とを２４時間作用させ
得られた反応生成物の溶出パターンを示す。 また、■のａ、ｂの矢印は、標準のアドレノルフィンお
よびＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ｃ＋ｙが溶出される位置を示す。Ｏ
の１の位置は■のａの矢印の位置と、２はｂの矢印の位
置と一致する。 第８図は、この発明の酵素ＡＥ−１による各種基質のＣ
末端α−アミド化体への変換率を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）Ｃ末端にグリシン残基をもったペプチドを該グリ
シン残基が欠失したＣ末端α−アミド体に変換する； （２）ＳＤＳゲル電気泳動法により測定した分子量が約
３９，０００である；及び、 （３）Ｎ末端のアミノ酸配列が、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ・・・で表わされる； を有する、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅ
ｖｉｓ）由来のＣ末端アミド化酵素ＡＥ− I 。 ２、次の性質： （１）Ｃ末端にグリシン残基をもったペプチドを該グリ
シン残基が欠失したＣ末端α−アミド体に変換する； （２）ＳＤＳゲル電気泳動法により測定した分子量が約
３９，０００である；及び、 （３）Ｎ末端のアミノ酸配列が、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ・・・で表わされる； を有する、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅ
ｖｉｓ）由来のＣ末端アミド化酵素ＡＥ− I の製造方
法において、上記酵素活性を有するアフリカツメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の体皮から該酵素を
抽出・精製することを特徴とする方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61131089A JPH0775541B2 (ja) | 1986-06-07 | 1986-06-07 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
| DE8787304994T DE3781832T2 (de) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal-alpha-amidierendes enzym und verfahren zu dessen herstellung und verwendung. |
| AT87304994T ATE80911T1 (de) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal-alpha-amidierendes enzym und verfahren zu dessen herstellung und verwendung. |
| US07/058,919 US4921797A (en) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal alpha-amidating enzyme and process for production and use thereof |
| EP87304994A EP0249412B1 (en) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal alpha-amidating enzyme and process for production and use thereof |
| ES87304994T ES2044928T3 (es) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | Enzima alfa-amidante en terminal c y procedimiento para la produccion y el uso del mismo. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61131089A JPH0775541B2 (ja) | 1986-06-07 | 1986-06-07 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62289184A true JPS62289184A (ja) | 1987-12-16 |
| JPH0775541B2 JPH0775541B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=15049719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61131089A Expired - Lifetime JPH0775541B2 (ja) | 1986-06-07 | 1986-06-07 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4921797A (ja) |
| EP (1) | EP0249412B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0775541B2 (ja) |
| AT (1) | ATE80911T1 (ja) |
| DE (1) | DE3781832T2 (ja) |
| ES (1) | ES2044928T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02190193A (ja) * | 1989-01-17 | 1990-07-26 | Suntory Ltd | アミド化ペプチドの製造方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6319685B1 (en) | 1984-09-27 | 2001-11-20 | Unigene Laboratories, Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| JP2598050B2 (ja) * | 1987-07-17 | 1997-04-09 | サントリー株式会社 | Ｃ−末端α−アミド化酵素 |
| US5789234A (en) * | 1987-08-14 | 1998-08-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| JP2653820B2 (ja) * | 1988-03-14 | 1997-09-17 | 壽之 松尾 | アミド化酵素及びその製造方法 |
| JP2845468B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1999-01-13 | サントリー株式会社 | ヒト甲状腺由来Ｃ―末端α―アミド化酵素 |
| ES2079054T3 (es) * | 1990-06-01 | 1996-01-01 | Ciba Geigy Ag | Peptidilhidroxiglicina n-c-liasa y adn codificante de la misma. |
| US5580751A (en) * | 1990-09-14 | 1996-12-03 | Carlsberg A/S | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4708934A (en) * | 1984-09-27 | 1987-11-24 | Unigene Laboratories, Inc. | α-amidation enzyme |
| GB8515630D0 (en) * | 1985-06-20 | 1985-07-24 | Celltech Ltd | Enzyme purification |
-
1986
- 1986-06-07 JP JP61131089A patent/JPH0775541B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-05 DE DE8787304994T patent/DE3781832T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 US US07/058,919 patent/US4921797A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 EP EP87304994A patent/EP0249412B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 ES ES87304994T patent/ES2044928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 AT AT87304994T patent/ATE80911T1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02190193A (ja) * | 1989-01-17 | 1990-07-26 | Suntory Ltd | アミド化ペプチドの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0775541B2 (ja) | 1995-08-16 |
| ES2044928T3 (es) | 1994-01-16 |
| EP0249412A3 (en) | 1989-02-22 |
| EP0249412A2 (en) | 1987-12-16 |
| DE3781832T2 (de) | 1993-04-01 |
| DE3781832D1 (de) | 1992-10-29 |
| US4921797A (en) | 1990-05-01 |
| EP0249412B1 (en) | 1992-09-23 |
| ATE80911T1 (de) | 1992-10-15 |
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