KR0136611B1 - 알파-아미드화 효소를 코드하는 dna서열 및 아미드화된 펩티드 제조방법 - Google Patents

알파-아미드화 효소를 코드하는 dna서열 및 아미드화된 펩티드 제조방법

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KR0136611B1
KR0136611B1 KR1019880010344A KR880010344A KR0136611B1 KR 0136611 B1 KR0136611 B1 KR 0136611B1 KR 1019880010344 A KR1019880010344 A KR 1019880010344A KR 880010344 A KR880010344 A KR 880010344A KR 0136611 B1 KR0136611 B1 KR 0136611B1
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로날드 에스. 레비
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Abstract

내용 없음.

Description

알파-아미드화 효소를 코드하는 DNA서열 및 아미드화된 펩티드 제조방법
댄실-Tyr-Val-Gly 1.7 21
(본원의 것)
두 기질에 대한 최대속도 (Vmax=pmol 생성물/분/ μl)를 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, D-Tyr-Val-Gly(종래 기술)은 댄실-Tyr-Val-Gly (본원인의 것) 보다 대략 1.48배 더 많은 활성을 준다. 이것은 상기 언급한 것과 일치하며 그것을 확증한다.
활성의 비교
에이퍼 의(PNAS)는 5147 페이지 제 4도에서 시간당 마이크로그램당 39 피코몰의 Vmax를 명시하고 있다.
이것은 분당 0.65mU/mg 단백질의 비활성과 같다. 이것은 모든 인용된 종래기술에서 보고된 최고의 활성이다.
이것을 전술한 1.5의 전환이자로 나누면 분당 0.4mU/mg 단백질의 비활성이 유도된다. 이 값은 이제 본원인에 의해 달성된 전술한 비활성과 직접 비교될 수 있다. 앞서 가리킨 바와같이 본원인은 적어도 25mU/mg 단백질과 1500mU 이상/mg 단백질의 활성을 달성하였다.
본원인은 따라서 에이퍼의 (PNAS) 보고된 활성보다 60 내지 3,750배 이상의 활성을 달성하였다.
실시예 3
쥐 MTC 종양으로부터 알파-아미드화 효소의 정제 및 특성화
동결된 쥐 MTC 조직을 미세한 단편으로 분쇄하고 폴리트론호모제나이저를 사용하여 수성 완충액에 호모제나이즈 시켰다. 저속원심분리후, 상징액을 따로두고 펠릿을 신선한 완충액으로 재추출하였다. 이 제2의 호모제네이트를 다시 저속원심 분리시키고 이 상징액을 처음것과 합한다. 다음에 두개의 모은 상징액을 고속원심분리에 의해 투명하게 하고 고속상징액을 효소의 정제를 위한 출발물질로 사용하였다.
고속 상징액의 황산암모늄 분별화를 수행하였다.
효소활성의 대부분은 26-40% 황상암모늄 분율에서 침전함이 발견되었고 이 분율로부터의 펠릿을 아래와 같이 더 정제하였다.
크기배타 크로마토그라피를 세파크릴 S-300 컬럼상에서 수행 하였다. 여기 실시예 1에서 모든 요소는 이 컬럼으로부터 단일 피이크의 활성으로 용리되었다. 이 실시예에서, 컬럼 길이를 증가시켰으며 컬럼의 유속든 감소시켰다. 이들 새 용리 조건하에, 활성의 주 피이크가 (실시예 1과 같이)나타났고 이어서 효소의 저분자량 형태에 해당하는 작은 꼬리달린 피이크가 나타났다. 이점에서 효소의 저분자량 형태가 체내에서 존재하는지 아니면 추출 및 정제의 과정동안에 부분적인 단백질 분해소화에 의해 제조되는지는 분명치 않다.
S-300 컬럼으로부터 활성의 주 피이크를 모으고 pH 6.0 에서 모노 Q 컬럼상에서 크로마토그라피 하였다.
실시예 1에서 보다 더 큰 예비 크기 컬럼을 이 실시예에서 사용하였으며 (모노 Q HR 10/10) 이것을 덜 가파른 선형염 구배를 사용하여 용리시켰다. 이들 변화의 결과, 160mM, 200mM, 220mM 및 240mM NaCl 에서 용리하면서 알파-아미드화 효소활성의 4피이크가 이 단계에서 검출되었다. (각각 피이크 I, II, III 및 IV, 제 13도)이것은 효소의 다중형태가 있다는 것과 이들 형태는 하전 불균일성을 가짐을 가리킨다. 더 나아가서, 효소활성 피이크에서 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 분석은 피이크 II, III 및 IV 가 대략 같은 분자량 (즉, 73,000-75,000 달톤)의 알파-아미드화 효소를 함유하는 한편, 피이크 I은 다른, 아마도 더 작은 분자량 효소를 가짐을 가리킨다. 피이크 III에서의 활성은 다음과 같이 호모제니어스하게 정제 하였다 : 피이크 III 효소를 모으고 pH 8.0 에서 모노 Q HR 10/10 컬럼상에서 크로마토그라피하였다 (제 14도). 효소는 이 컬럼으로부터 250mM NaCl 에서 단일 피이크로서 용리되었고 겔 분석은 효소가 호모제니어스하게 정제되었음을 나타내었다 (제 15a도, 6통로). 다음의 특성화 실험을 피이크 III 정제된 효소에서 수행하였다.
1. 피이크 III 효소의 분자량을 7% 폴리아크릴아미드 겔 분석에 의해 약 75,000 달톤임이 결정되었다 (제15b도).
2. 효소의 활성에 대한 최적 pH는 기질로서 N 댄실 Tyr-Val-Gly를 사용하여 pH 5.0-5.0 임이 결정되었다
(제16도). 그러나, 중성의 pH에서 효소의 향상된 안정도로 인해, 이러한 pH 에서 아미드화 반응을 수행하는 것이 유리할 수도 있다.
3. 효소활성에 대해 보조인자로서 요구된 구리의 양은 효소의 순도에 역비례하는 것으로 결정되었다. 호모제니어스하게 정제된 효소는 최대활성에 대해 0.1 μM 또는 미만의 Cu++이 요구된 한편, 효소의 미정제 제제는 2 μMCu++을 요한다.
4. 효소의 등전점(pI)은 4.8이었다.
5. 호모제니어스 피이크 III 효소의 비활성은 2,100 mU/mg 단백질 이었다.
피이크 II 효소도 또한 호모제니어스하게 정제되었다.
그러나, 이 효소로, pH 8.0 에서의 모노 Q 크로마토그라피는 호모 제니어스 제제를 얻기에 불충분함이 발견되었다. 그러므로 pH 6.0 의 모노 Q컬럼으로 부터의 피이크 II 효소의 모은것(제13도)을 1M 트리스 pH 7.0에 대해 투석하고 같은 완충액으로 평형화된 페닐 세파로오스상에 적하시켰다. 오염되는 단백질종의 대부분을 컬럼의 유출물에서 회수하고 나중 단계에서 용리된 아미드화 효소가 실질적으로 정제되었다. 모노 Q HR 10/10 pH 8.0 컬럼상의 페닐 세파로오스 컬럼으로부터 모아진 효소의 더 이상의 정제는 220mM 또는 그이상의 NaCl에서 컬럼으로 부터 용리하는 피이크 II 효소의 호모제니어스 제제를 가져왔다.
피이크 II효소의 특성화는 다음을 나타내었다.
1. 7% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 피이크 II효소의 분자량은 약 73,000-75,000 달톤이었다. 따라서, 피이크 II 및 피이크 III 효소는 그들의 분자 질량과 비교하여 구별할 수 없었다.
2. 피이크 II효소의 활성에 대한 최적 pH 는 pH5.0-5.0 이었다. 다시, 피이크 II효소의 이 특징은 피이크 III 효소의 특징과 같다.
3. 피이크 II 효소의 등전점(pI)은 대략 5.8이었다.
실시예 4
CA-77 세포 조직배양매체로 부터 유도된 알파-아미드화 효소의 정제 및 특성화 쥐 수질 갑상선 암 세포주 CA-77을 8% CO2에서 150cm2T-플라스크 (코닝)에서 단층 배양으로서 성장시켰다. 배지를 Dulbecco's Modified Eagle Medium : F-10(1:1). 3.7g/리터의 NaHCO3, 5 g/ml의 트랜스퍼린, 10 /ml 인슈린, 30nM 셀레늄, 및 4 g/ml 의 겐타마이신 황산염으로 구성되는 규정된 매체에서 유지시켰다. 이 방법으로 성장된 배지는 만일 매체가 매 48시간마다 변한다면 무한하게 유지될 수 있다. 세포의 저장공급을 증가시키기 위해, 그것들을 혈청 (5% 말 및 2.5% 우태아 혈청)을 함유하는 배지에서 3일간 계대배양 및 성장시켰다. 다음에 세포를 인산염 완충 식염수로 2회 세척하고 규정 배지로 재보충하였다.
조직배양매체를 48-시간 스케줄상에서 무균 수집하고 정제될때까지 -20℃에서 보관하였다. 조직배양매체 (일상적으로 6리터)를 탈염수(3:1)2리터로 희석하고, 4℃에서 20mM 비스 트리스 : HCl pH 6.0 1.0 리터로 사전 평형화한 DEAE 약한 음이온 교환 카트리지 (Cuno #250)에 50ml/분의 유속으로 적용시켰다. 알파-아미드화 효소 (알파-AE)를 대략 50ml/분의 유속으로 500mM NaCl 함유 50mM 트리스 HCl pH 7.0으로 단계적 방식으로 카트리지로 부터 용리시켰다. 두가지 음이온 교환 제제로부터 알파-AE 활성을 함유하는 분율(비활성 10-15, mU/mg)을 모으고 Savant RH-100 예비 회전자를 사용하여 감압하에 4-내지 5-배 농축시켰다.
이 물질을 세파크릴 300-SF(파마시아)를 함유 하는 5 x 50cm 컬럼에 직접 적용시켰다. 이동상은 1.0ml/분의 유속으로 100mM 트리스:HCl pH 7.0이었다. 모든 겔 여과 크로마토그라피를 또한 4℃에서 수행하였다. (제17도)
이 정제 단계에서의 아미드화 효소제제는 비특이적 단백질 분해활성이 없었으며 적어도 50mU/mg 단백질의 활성을 가졌다. 이 단계로 부터의 아미드화 효소제제는 재결합 글리-익스텐드된 사람 칼시토닌과 성장 호르몬 방출인자의 아미드화에 성공적으로 사용되었다. 1-1.5 x 106세포/ml (T-플라스크로부터)의 세포밀도로 출발하여 본 발명자는 이들 두 정제 단계에 이어서 산란된 매체 리터당 200-350mU 의 아미드화 효소활성의 수율을 일상적으로 얻었다. 효소는 안정하고 용액에서 또는 고체 지지체에의 고정화 후 사용하기에 적당하다.
알파-AE활성을 함유하는 컬럼분율을 모은 다음 6리터의 20mM 비스 트리스:HCl pH 6.0 에 대해 투석하였다.
효소를 20mM 비스 트리스 : HCℓ pH 6.0 으로 사전 평형화된 모노 Q HR 10/10 강력 음이온 교환 컬럼(파마시아)에 적용시켰다. 효소를 2.5ml/분의 유속으로 3시간 기간에 걸쳐 0-300mM NaCl의 선형구배를 사용하여 컬럼으로 부터 용리하였다. 4가지 크로마토그라피상으로 구별된 형태의 알파-아미드화효소 활성을 이 정제 단계의 동안에 분해시켰다. 피이크를 컬럼으로부터의 용리순서대로 번호를 매겼다 (제18도). 피이크 III 과 IV는 고분자량 형태의 효소를 나타내며 MTC 종양으로부터 유도된 피이크 II와 III에 해당한다. 피이크 I 과 II는 저분자량 형태의 효소를 나타내는데 이것은 피이크 III 과 IV의 단백질 분해 단편을 나타낼 것이다.
본원인 실험실에서 확인된 4가지 형태의 알파-아미드화 효소는 강력 음이온 교환 크로마토그라피의 동안에 그들의 다른 보유시간으로 증거되는 바와같이 그들의 실 표면전하에 있어서 서로 다르다 (제18도). 이들 4가지 크로마토그라피상으로 구별되는 형태의 효소에 대한 pH 최적치도 또한 다르다. 제 19도에서의 결과는 피이크 III과 IV가 pH 5.0 과 5.5 사이의 동일한 pH 최적치를 가짐을 증명한다. 이들 결과는 MTC 종양으로부터 정제된 피이크 II와 III 에 대해 결정된 pH 최적치와 일치한다. 피이크 I과 II는 pH 5와 8.5 사이의 최적치를 가진 훨씬 더 넓은 pH 활성범위를 갖는다 (제19도). 이들 결과는 에이퍼외(Eipper et al., 펩티드, Vol. 4, pp 921-28(1983))와 머티(Murthy et al., J. Biol Chem, Vol. 261, pp 1815-22(1986))에 의해 보고된 pH 최적치에 밀접하게 일치한다.
피이크 II와 IV로 부터의 효소의 Na125I로의 방사성 표지와 이어서 SDS-PAGE 는 피이크 IV 효소활성은 73-75 kDal 의 대략의 분자질량을 가진 한편, 피이크 II효소활성은 55kD 미만이었다. 정확한 분자량은 피이크 II 효소에 대해서는 그것이 호모제니어스하게 정제되지 않았기 때문에 미지이다 (몇가지 단백질띠는 45-55 kDal 범위에서 명백하다).
피이크 III 과 IV 효소는 소수성 상호작용 크로마토그라피와 pH 8.0 에서의 강력 음이온 교환 크로마토그라피의 조합을 사용하여 호모제니어스하게 정재될 수 있다. 피이크 IV 효소 (제18도)활성을 모으고 진공하에 대략 2ml로 농축시키고 500mM 트리스 : HCl pH 7.0으로 평형화시킨 페닐세파로오스 (파마시아)의 1.3 x8cm 컬럼에 직접 적용하였다. 알파-AE 활성을 함유하는 분율을 0.5ml/분의 유속으로 평형완충액으로 용리하였다 (제20도).
알파-아미드화 활성을 함유하는 피이크 분율을 모으고, 50mM 트리스-HCl pH 8.0 에 대해 투석한 다음 50mM 트리스 : HCl pH 8.0으로 평형화된 모노 Q HR 10/10 컬럼에 적용시켰다. 효소를 2.0ml/분의 유속으로 3시간의 기간에 걸쳐 0-300mM NaCl의 선형구배를 사용하여 컬럼으로 부터 용리하였다 (제21도). 약 240mM에서 또는 이상에서 용리된 알파-AE 활성을 함유하는 분율을 모으고 트리톤 X-100에서 0.001%(v/v)로 조절하고 4℃에서 보관하였다. 정제된 효소의 비활성은 pH 7.0에서 대략 1500mU/mg 단백질임이 결정되었다. 피이크 III 알파-AE 화성은 피이크 IV에 대해 기술된 것들과 동일한 방법을 사용하여 호모제니어스하게 정제되었다.
분자질량(73,000-75,000 달톤)을 포함하는 종양피이크(실시예 3으로 부터)와 조직배양피이크 IV(실시예 4로부터)의 물리화학적 특성, pH 최적치(5.0-5.5), 아미노 말단서열, 및 용리위치(pH 8.0 에서 수행된 강력음이온 교환 크로마토그라피로부터 약 240mM염화나트륨 이상)는 이들 두 피이크가 같은 효소를 나타냄을 증명한다.
실시예 5
알파-아미드화 효소를 사용하는 생물학적으로 관련된 펩티드 호르몬의 α-아미드화 연어 및 사람 칼시토닌에 대한 것, 사람 서장호르몬 방출인자, 및 사람 칼시토닌 유전자-관련 펩티드를 포함하는 몇가지 재결합 펩티드 호르몬 기질을 제조하고 계속해서 본 발명의 알파-아미드화 효소 제제에 의해 알파-아미드화 하였다. 예시할 목적으로, 재결합 연어칼시토닌, 사람 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 및 사람 성장호르몬 방출인자의 제조에 사용된 방법을 아래에 요약한다. 비슷한 형태의 접근이 다른 재결합 펩티드에 사용될 수 있다.
연어 칼시토닌은 그의 카르복실 말단에 알파 아미드화 프롤릴 잔기를 지니는 32-구성원 펩티드 호르몬이다.
미생물을 연어 칼시토닌에 해당하는 아미노산 서열을 함유한 재결합 융합 단백질을 제조하기 위해 유전공학 처리하였다. 융합 단백질 유전자는 연어 칼시토닌 서열을 그의 아미노말단상의 메티오닐 잔기에 의해 묶고 또한 재결합 융합 단백질의 말단에 있는 글리실 잔기에 의해 그의카르복실 말단에서 묶어지도록 설계되었다. 연어 카시토닌 유전자의 플라스미드로의 연결 반응에 따라 미생물은 이 플라스미드로 형질전환되었고 융합 단백질의 발현이 얻어졌다. 이 칼시토닌 함유 단백질을 침전에 의해 재결합 미생물의 용해물로 부터 분리하고 그의 시스체이닐잔기를 S-술폰산염으로 전환시켰다. 연어 칼시토닌은 메티오닌을 함유하지 않기 때문에 재결합 융합 단백질의 브롬화 시아노겐 절단은 카르복실-말단 글리신 익스텐션을 가진 연어 칼시토닌 서열을 함유하는 펩티드를 발생시켰다. 이 펩티드는 역상 HPLC 나 아니면, 이온 교환 크로마토그라피에 의해 분리하였고 그의 구조는 아미노산 조성 및 마이크로시컨스 분석에 의해 확립되었다.
끝에서 두번째의 프롤릴잔기는 알파-아미드화 효소의 작용에 의해 프롤린아미드로 전환되었다. 이 펩티드의 알파-아미드화에 사용된 조건의 예는 다음과 같다 : 동결건조된 펩티드기질(글리신-익스텐드된 연어 칼시토닌 전구체, 200-300 나노몰)을 대략 750 uU의 알파-아미드화 효소를 함유하는 200 l의 150mM 트리스 - HCl 완충액, pH7 에 용해시켰다. 효소는 MTC종양이나 아니면 쥐 MTC CA-77 세포주로 부터의 산란된 조직배양 매체로부터 유도될 수 있다. 효소는 모든 외인성 단백질 분해효소 활성이 제거될 정도로 정제되어야 한다. 이것은 보통 이온-교환 및 크기 배타크로마트그라피의 조합에 의해 달성된다 (실시예 4참조). 순수한, 호모제니어스 효소가 필요사항은 아니다. 대음에 각각 대략 3mM과 2 M 의 최종농도를 얻기에 충분한 양으로 이 혼합물에 첨가하였다.
카탈라데(7.5 g/ml),에탄올(1%,v/v)및 요오드화칼륨(50mM) 도 또한 알파-아미드화 연어 칼시토닌의 수율을 개선하기 위해 반응혼합물에 포함시킬 수 있다. 결과용액을 혼합하고 37℃ 에서 5-6시간동안 배양시켰다.
베타-메츠캅토에탄올 처리로 S-술포네이트기의 제거에 이어서, 재결합 연어 칼시토닌을 역상 HPLC에 의해 정제 하였다. 최종생성물은 역상 HPLC 상의 그의 보유, 정량적 트립신 맵핑, 및 아미노산 분석으로 특징지어졌다. 모든 경우에 재결합 연어 칼시토닌은 합성 연어 칼시토닌과 구별되지 않았다.
사람 칼시토닌 유전자 관련 펩티드는 그의 카르복실 말단에 알파-아미드화 페닐알라닐잔기를 지니는 37-구성원 펩티드 호르몬이다. 융합 단백질 유전자는 사람 칼시토닌 유전자 관련 펩티즈 서열이 그의 아미노 말단사으이 메티오닐 잔기에 의해 묶이고 또한 재결합 융합 단백질의 말단인 글리실 잔기에 의해 그의 카르복실 말단에서 묶인 점에서 연어 칼시토닌과 (상기 참조)비슷한 방식으로 설계되었다. 유리, 정제, 알파-아미드화 및 재결합 사람 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체의 특성화도 또한 재결합 연어 칼시토닌에 사용된 것과 유사한 방법으로 달성되었다.
사람 성장호르몬 방출인자(hCHRF)는 그의 카르복실 말단에 알파-아미드화 로이실 잔기를 지니는 44-구성원 펩티드 호르몬이다. hGHRF 에 대한 융합 단백질 유전자는 펩티드 호르몬에 대한 아미노산 서열이 그의 아미노말단에서 트립토파닐 잔기에 의해 묶이고 또한 재결합 융합 단백질의 말단인 글리실 잔기에 의해 그의 카르복실 말단에서 묶이도록 설계되었다. hGHRF-함유 융합 단백질을 침전에 의해 재결합 미생물의 용해물로 부터 분리되었다. 융합 단백질의 비-hGHRF 부분은 시스테이닐 잔기의 S-술폰산염 유도체로의 전환에 의해 변성되었다. hGHRF는 트립토판을 함유하지 않기 때문에 시약 BNPS-스카톨로 재결합 융합 단백질의 화학적 소화는 융합 단백질을 산화 절단시키고 이로써 카르복실-말단 글리신 인스텐션을 가진 아미드화 되지 않은 hGHRF를 발생시킨다. 동시에, hGHRF 분자의 27위치에서 메티오닐 잔기는 메티오닐 술폭시드로 산화되었다.
이 글리신 익스텐드된 펩티드는 겔여과 및 역상 HPLC를 사용하여 분리되었다. 그의 구조는 트립신 소화에 의해 생성된 단편 펩티드의 아미노산 분석에 의해 달성되었다.
끝에서 두번째 로이실 잔기는 본 발명의 알파-아미드화 효소의 작용에 의해 로이신 아미드로 전환되었다.
알파-아미드화 hGHRF의 제조에 사용된 조건의 예는 다음과 같다 : 동결건조된 펩티드 기질(20-40나노몰)을 150 μl 탈염수에 용해시키고 쥐 MTC 종양이나 아니면 쥐 CA-77 세포주로부터 산란된 조직 배양배체로 부터 유도된 알파-아미드화 효소 제제 90 l(500 U)(pH 7.0)과 혼합하였다. 효소를 크기배타 및 이온 교환 크로마토그라피의 조합에 의해 정제하여 모든 외인성 단백질 분해효소 활성을 제거하였다. 다음에 아스코르브산과 황산구리를 각 3mM과 2 μM 의 농도를 얻기에 충분한 양으로 효소와 기질의 혼합물에 첨가하였다. 결과 용액을 혼합하고 37℃ 에서 4-6시간동안 배양시켰다. 기질의 생성물로의 전형적인 전환 백분율은 트립신으로 95%이다. 최종적으로 메티오닌 술폭시드 잔기는 80℃ 에서 10 mM 아세트산나트륨으로 1시간동안 pH4에서 완충시킨 4M 베타메르캅토에탄올의 작용에 의해 메티오닌으로 환원시켰다. 최종생성물은 역상 HPLC에 의해 정제하고 그의 보유시간, 트립신 소화분석, 및 아미노산 분석에 의해 특성화 되었다. 재결합, 알파-아미드화 생성물을 생물학적 활성에 대해서 또한 시험하였다. 모든 경우에, 재결합 hGHRF는 합성 hGHRF와 구별되지 않았다.
상기 연구이외에, 두가지 시중구입되는 글리신-익스텐드된 펩티드 호르몬을 알파-아미드화 효소에 대한 기질로서 작용하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 이것들은 알파-멜라노사이트 자극호르몬과 물질 P의 전구체들이다. 두경우에, 결과는 두 펩티드가 알파-아미드화 효소에 대한 알맞는 기질임을 가리킨다.
실시예 6
정제된 쥐 알파-아미드화 효소의 서열분석
정제된 알파-아미드화 효소를 함유하는 분율을 쥐 MTC 종양조직이나 아니면 CA-77 세포 배양상징액으로 부터 모으고 효소의 술프히드릴기를 환원시키고 이어서 카르복시메틸화시켰다. 다음에 결과 반응혼합물을 0.1% 수성트리플루오르아세트산을 평형화시킨 Vydac C4역상 HPLC 컬럼( 5 입도, 33nm 기공도)에 적용시켰다.
컬럼을 이용액으로 세척하여 과량의 완충염을 제거하였다. 탈염된 효소를 0.08%트리플루오로아세트산을 함유하는 80% 아세트니트릴로 용리함으로써 HPLC 컬럼으로부터 제거하였다. 컬럼 유출액을 220nm 에서 UV 검출에 의해 모니터 하였다. 결과 단백질 분율을 수립하고 모으고 동결건조시켰다. 다음에 이 물질을 0.1% SDS 100μl에 재용해시킨 다음 어플라이드 바이오시스템스 모ㄷ 470A 단백질 시컨서에 적용시켰다. 마이크로시컨스 분석에 사용된 방법은 어플라이드 바이오시스템스에 의해 명시된 것이었다. 결과 페닐티오히단토인 아미노산을 Hewlett-Packard 1090 액체 크로마토그라피시스템상에서 269 및 313nm 에서 모니터된 흡광도로 Hypersil C18 컬럼(5 μM 입도, 10 nm기공도)상에서 HPLC 에 의해 분석하였다. 종양조직으로부터 주성분 효소피이크(피이크III)의 아미노-말단서열은 다음과 같았다.
Figure kpo00001
CA-77 세포조직 배양상징액으로 부터의 효소의 주성분에 대한 아미노-말단서열 데이타 (피이크 IV)는 그것이 종양 조직 효소의 것(피이크III)과 동일하다. 그러나, 소량성분도 또한 주형태의 알파-아미드화 효소와 비교할때 아미노 말단 익스텐션을 함유하는 것으로 나타나는 이 효소의 마이크로시컨스 분석의 동안에 검출되었다. 이 성분의 존재는 아마도 효소의 분화 번역후 프로세싱에 기인한다. 이 성분의 아미노-말단아미노산 서열은 다음과 같았다:
Figure kpo00002
추가의 아미노산 서열 데이타는 다음 과정에 의해 쥐 MTC 종양조직으로 부터 α-아미드화 효소에 대해 얻어졌다 : 대략 400 μg의 정제된 효소를 환원 및 카르복시메틸화 시켰다. 이 과정에 이어서, 효소 용액을 투석 튜빙에 이동하고 25mM트리스 - HCI pH 8.0/0.5M 요소에 대해 18시간동안 투석시켰다. 보유물은 다음에 1.5ml 원심분리관에 이동시키고 감압하에 600 μl의 부피로 농축시켰다. 효소용액에 트립신 2 μl(2㎍)를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 이점에서, 트립신의 제 2의 알리컷(2 g)을 첨가하고 배양을 37℃ 에서 2시간동안 계속하였다. 소화를 200 μl of 4M 요소/ 10% 아세트산의 첨가에 의해 종결시켰다. 다이제스트를 다음에 0.1% 수성트리플루오로아세트산으로 평형화시킨 Vydac C18 역상 HPLC 컬럼(5 μM 입도, 33nm 기공도)에 적용시켰다. 다음에 컬럼을 4시간에 걸쳐 50%의 농도까지의 아세트니트릴의 선형구배로 용리시키고 분율을 2분간격으로 수집하였다. 효소의 트립신 다니제스트에 대한 결과된 특성 역상 HPLC 용리피이크를 제 23도에 그래프로 나타내었다. 3개의 결과된 트립신 펩티드를 상기한 바와같이 자동화 서열분석을 시키고 결과를 아래에 제공한다. (펩티드는 그들의 분율번호로 지칭한다.)
트립신 펩티드 No. 65
-Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser-Gln-Pro-Thr-
트립신 펩티드 No. 58
-Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg-
트립신 펩티드 No. 86
-Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-
실시예 7
쥐 MTC 또는 CA-77세포 알파 아미드화 효소를 코드하는 유전자 또는 DNA 서열의 분자 클로닝
알파-아미드화 효소를 코드하는 유전자 또는 DNA 서열을 클론하는 능력은 몇가지 중대한 정보 및 시약으로 부터 유도된다. 따라서, 효소의 메센저 RNA(mRNA)와 궁극적으로 그의 상보 DNA(cDNA)의 공급원으로서 제공될 효소 단백질의 신뢰할만한 공급원을 발견해야 한다. 효소의 유전자 또는 cDNA의 분리는 또한 관심있는 효소에 특이적인 분자프로브를 요한다. 일반적으로 이 분자프로브는 두 형태 중 한가지를 취하는데 즉, 서열이 효소유전자의 부분에 상보적인 올리고 뉴클레오티드이거나 아니면 효소 단백질을 특이적으로 인식하는 항체분자(또는 항체분자의 콜렉션)이다. 이들 분자프로브의 유도는 효소 특이성 항체가 제조될 수 있거나 아니면 효소의 아미노산 서열이 올리고 뉴클레오티드프로브를 설계하기 위해 결정될 수 있도록 효소를 정제하는 방법의 개발을 요한다. 이들 개발의 조건은 본 출원의 알파-아미드화 효소에 대해 만족되었다.
알파-아미드화 효소는 쥐 MTC조직과 CA-77세포 콘디션된 매체로 부터 정제되었다. 이것은 이들 세포 공급원이 효소 단백질을 코드하는 mRNA를 함유함을 확립하였다. 본 발명자가 알파-아미드화 효소에 대한 cDNA를 제조하는데 사용한 방법은 분자생물학 분야에서 공지이다. 이들 여러가지 방법에 대한 특정 프로토콜은 Moleular Cloning (1982), DNA Cloning(Volume 1) a Practical Approach, (1985)와 같은 실험실 매뉴얼 또는 Gubler, V. Hoffman, B. J.Gene, Vol. 25, p262-69 (1983); 또는 Young, R.A., 및 Davis, R.W., PNAS, Vol. 80, pp 1194-98, (1983)과 같은 주 참고문헌에서 발견될 수 있다. 이들 방법은 일반적인 적용성을 갖는데
증대변수는 이용된 mRNA의 공급원이다. 아미드화 효소 특이적 cDNA 를 제조하기 위해 본 발명자는 쥐 MTC조직 mRNA와 CA-77세포 mRNA를 둘다 사용하였다. 합성된 이중 스트랜즈 cDNA를 차례로 공지의 방법에 의한 별개의 유전자 라이부러리를 제조하는데 사용되었다.
상기 논의한 바와같이, 알파-아미드화 효소 mRNA를 위한 특정 cDNA들의 확인은 특정 라이브러리에서 다른 재결합체로부터 이들 재결합체를 구별할 수 있는 분자프로브를 요한다. 실시예 3과 4는 분자프로브의 유도에 필요한 효소를 제조하는데 사용된 정제방법을 상술한다. 실시예 6은 아미노산 서열을 결정하는데 이 단백질의 사용을 기술하는 한편, 실시예 8은 효소 특이적 항체를 제조하는데 정제된 단백질의 사용을 기술한다. 실시예 6의 아미노산 서열은 특이적이고 선택적인 올리고 뉴클레오티드 프로브를 발생시키기에 충분하다. 올리고 뉴클레오티드 프로브의 제조시 프로브는 선택적으로 만들기 위해 몇가지 인자가 중요하다. 이들 고찰에 대한 충분한 논의는 Lathe, R.J., J. Mol. Biol.,Vol.183, pp 1-12, (1985)에서 발견될 수 있다. 일반적으로 하나이상의 뉴클레오티드 서열이 같은 아미노산서열을 코드할 수 있기 때문에 (유전자 코드의 축중으로 알려진 원리), 어떤 단일의 뉴클레오티드 서열은 많은 가능한 유전자 서열중 하나만을 나타낼 것이다. 올리고 뉴클레오티드 프로브가 관심있는 유전자를 확인함을 보증하기 위해 아미드화 효소 특이적 아미노산 서열을 코드할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오티드 서열의 등몰 혼합물을 제조할 수 있다. 이러한 혼합물의 복합성은 종종 그들로 하여금 덜 절대적으로 선택적이 되게하고 따라서 일반적으로 단백질로부터 하나이상 영역의 아미노산 서열에 해당하는 올리고뉴클레오티드 혼합물을 주어진 유전자에 대한 절대적으로 특이적인 선택성을 얻는데 사용되어야 한다. 또 다르게는, 관심있는 유전자에 대해 선택적인 올리고 뉴클레오티드는 원하는 유전자에 약간 불완전한 상보성 조차도 안정한 하이브리드를 생성하게 되는 충분한 길이의 독특한 뉴클레오티드 서열을 제조함으로써 제조될 수 있다. 이 독특한 서열은 다른 유전자 서열과 안정한 하이브리드를 형성할 매우 작은(길이 의존)가능성을 가질 것이다. 독특한 서열은 단백질 서열의 각 아미노산에 대한 가장 빈번히 사용된 코든으로 이루어진다. 주어진 종에 대한 코든사용 빈도는 공지의 유전자 서열의 편집으로 부터 결정될 수 있다. 이들 방법은 분자 생물학 분야 숙련자에게 공지이다.
특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조하는데 사용될 수 있는 또다른 방법은, 최대축중의 위치에서 데옥시이노신잔기의 올리고뉴클레오티드로의 함입을 수반한다. 이 뉴클레오티드 치환은 프로브 시료의 축중을 감소시키기위해 제공되고 따라서 선택방법에 유리한 효과를 줄 수 있다.(올리고뉴클레오티드 프로브에 데옥시이노신의 사용에 대한 논의는 Ohtsuka et al,. J. Biol. Chem., Vol.260, pp2605-8(1985)참조).
본 발명자는 효소 cDNA분리를 아미드화 하는데 유용한 각종 올리고뉴클레오티드 프로브를 계획(Project)하는데 알파-아미드화 효소 단백질 서열을 사용하였다. 사용된 서열과 본 발명자가 제조한 프로브는 표 II 에 나타내었다. 만일 아미노산 서열을 제공한다면 프로브 하이브리드화에 의한 유전자 분리를 위한 다른 전략은 분자생물학자로서 숙련자에 의해 전개될 수 있음이 인정되어야 한다.
그리하여 발생된 올리고뉴클레오티드 프로브는 플라스미드와 박테리오파아지 cDNA라이브러리를 둘다 스크린하고 알파이미드화 효소 cDNA 들을 분리하는 잘 확립된 방법에 의해 사용되었다(Molecular Cloning 1982 참조).
표 II
이 표는 알파 아미드화 효소 단백질의 선택된 영역에 해당하는 모든 가능한 유전자 서열을 예시한다. 계획된 서열 아래에 cDNA 확인 및 분리에 유용한 유전자 상보 올리고뉴클레오티드 프로브 몇가지를 나타내었다.
아미노 말단 서열
Figure kpo00003
Figure kpo00004
Figure kpo00005
실시예 8
A.알파-아미드화 효소에 특이적인 모노클로날 항체의 쥐에서의 발생
11마리의 Balb/cJ 쥐를 아미드화 효소의 정제된 제제로 면역시키고 추가 면역시켰다. 이들 쥐를 출혈시키고 혈청을 처리하여 ELISA검정에 의해 정제된 효소에 대해 적정하였다. 검정(사용된 기술은 잘 확립되어 있다)을 정제된 효소를 플라스티렌판에 흡수시킴으로써 수행한 다음 이것을 소혈청알부민(BSA)으로 세척 및 저지(판에 항체의 외인성 결합을 방지하기 위해)시켰다.
희석된 쥐혈청(아미드화 효소에 대한 추정상의 항체를 함유함)을 다음에 아미드화 효소 피복된 판에서 배양시키고 세척하였다.
제2의 항체(마아커로 표지됨, 알칼리성 포스파타제, 이것은 제1항체의 판-결합된 효소에 결합의 확인을 용이하게 한다)를 다음에 웰에서 배양시켰다.
세척과, 기질용액의 첨가후 분광광도체 기록계에 의해 신호가 비색분석적으로 모니터 되었다.
포지티브 혈청도 적어도 2 : 1의 신호-대-잡음비를 나타내었다.
마우스 #7, 이것은 ELISA에서 높은 타니터를 증명하는데, 최종 추가면역 4일후 희생시켰다.
비장을 무균 제거하고 보풀을 내어 (기계적 파괴) 총 132.6 x 106개의 스플레노사이트를 얻고 이것을 1.28 ml의 PEG(폴리에틸렌글리콜) 4000과 함께 122.8 x 106NS-1 골수종세포에 융합시켰다.
세포를 Balb/cJ 티모사이트와 스플레노사이트로 사전피복된 5개의 24-웰판에 알리컷 취하고 이것을 피이더 세포로서 제공하였다.
세포를 선택적인 HAT매체에 유지시키고 이것은 하이브리드 세포만의 생존을 허용한다.
클로날 성장을 나타낸 116웰로 부터의 상징액을 항체생산을 위해 방사면역 특정과 ELISA법에 의해 스크린시켰다.
방사면역 측정법은 제2항체를125I를 표지하고 방사능 계수를 감마계수기로 측정한 것만을 제외하고는 앞서 기술된 ELISA와 유사하였다.
116 웰중 56개는 항체 생성에 양성이었고 알파-아미드화 효소에의 반응성을 위해 이어서 스크린시켰다.
알파-아미드화 효소에 대해 양성으로 나타난 25 클론은 연속희석법에 의해 완전히 클론시켰다.
1차 클론은 알파-아미드화 효소와 BSA 둘다에 대해 스크린시켜(폴리스티렌 판은 BSA로 저지되고, 판에 결합된 항체는 단순히 BSA에 결합되거나 비특이적 방식으로 BSA에 의해 흡수될 수 있기 때문에)그들이 아미드화 효소에 참으로 특이적인지를 결정하였다.
BSA에 대해 증명된 것에 적어도 2배인 알파-아미드화 효소에 대한 신호를 증명한 클론을 1세포/2웰 분포비로 완전히 클론시켰다.
21개의 양성의 하이브리드마 (표III 참조)를 3차 클로닝 단계로 수행하였고 그들중 20개는 Ouchterlony 및 ELISA 기법에 의해 항체 부류에 관해 특성화하였다.
클론중 17개는 IgG2a중 사슬을 가지며 3개는 IgG1중 사슬을 갖는다.
유형된 모든 20개 클론은 경사슬을 가진 항체를 분비한다.
각 주를 벌크배지에서 개별 성장시키고 세포알리컷을 액체질소에서 동결시켰다.
프라스탄-프라임드 Balb/cJ 쥐를 5 x 106하이브리도마 세포로 복강내 주사하였다.
1주일후, 복수종양의 개시가 나타나지 않은 쥐에 세포를 추가 주사시켰다.
복수액과 혈액을 1-2주후 제거하였다.
처리후, 복수 및 혈청을 항체 특이성을 보증하기 위해 음성항원(예를들면, 소혈청알부민, 단백알부민, 카르보닉 언하이드라제, 및 성장호르몬 방출인자) 에 대해서 뿐만아니라 알파-아미드롸 효소에 대해 스크린 및 타이터시켰다.
표 III
Balb/c 알파-아미드화 효소 모노클로날 세포주
Figure kpo00006
복수액을 고상 ELISA에서 100ng의 순수효소로 타이터 시켰다.
B. 쥐에서 생성된 모노클로날 항체에 대한 정제 방법
상기한 방법에 의해 제조된 -아미드화 효소에 특이적인 모노클로날 항체를 다음과 같이 정제하였다.
같은 클론으로 점종한 몇마리 쥐로부터 수집된 복수액을 항체원으로서 사용하였다.
복수액을 10mM MES pH 5.6으로 희석시켰다.(5배)
희석된 복수액을 10mM MES pH 5. 완충액으로 사전 평형화시킨 40 m, ABX 혼합-모드 실리카수지(J. T. Baker)를 함유하는 1.5 × 20 cm컬럼에 적용시켰다.
모노클로날 향체를 0-500mM 아세트산나트륨 pH 7.0 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다.
정제된 항체를 함유하는 분율을 합하고 비활성 시험하고 다음 사용지까지 4℃에서 보관하였다.
C. -아미드화 효소에 특이적인 폴리클로날 항체의 닭에서의 발생
정맥내, 근육내 및 피하주사를 각 닭에 대해 리비 애주번트중의 정제된 α-아미드화 효소 대략 총 50 ㎍으로 2마리의 산란 닭에 투여하였다.
리비 애주번트는 닭 림프구에 대한 미토겐과 닭에서 항원에 대한 항체 반응을 높이기위한 애주번트로 구성되는 완전히 대사성 지질 유제이다(리비 이뮤노켐 리서어치, 몬타나). 초기면역후, 2회 추가 주사를 닭 한마리당 효소 대략 30 ㎍으로 2부 간격으로 제공하였다.
동물을 21째와 35일째에 출혈시키고 혈청시키고 혈청을 치리하고 다음 방법으로 특이적 항체의 존재에 대해 스크린 시켰다:
두마리 닭으로부터의 0일(면역전), 21일, 및 35일째의 혈청을 정제된 α-아미드화효소 100ng에 대해 고상 ELISA에 의해 스크린 시켰다.
소혈청알부민을 비특이적 항체 결합을 위한 음성 대조표준으로서 사용하였다.
효소-특이적 항체는 토끼 항- 닭 IgG 알칼리성 포스파타제-표지된 혈청으로 검출되었다.
상기 방법으로 부터의 결과는 특이적 항체가 35일째에 닭 257의 혈청에서 검출될수 있음을 증명하였다.
1:10,000으로 희석된 혈청은 대략 4:1 의 신호-대-잡음비를 제공하였다.
닭 258은 21일째와 35일째에서 효소-특이적 항체를 나타내었다.
양 혈액으로부터 1:10,000으로 희석된 혈청은 대략 4:1 의 신호 대 잡음비를 제공하였다.
양 닭으로부터의 계란의 수집을 56일째에 시작하였다.
면역전 계란과 면역후 계란의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전으로부터 분리된 IgY의 항체를 Oucdterlony기법에 의해 분석하였고 효소 특이적 항체를 ELISA에 의해 스크린하였다.
D. 닭 IgY 항체의 정제
α-아미드화 효소에 특이적인 폴리클로날 조류항체에 상기한 바와같이 닭에서 제조하였다.
면역된 닭으로부터의 계란을 수집하고 파라핀에 묻거나 또는 IgY의 정제를 위한 사용때까지 동결시켰다.
난백을 나황으로부터 분리하였는데, 이것은 α-AE 특이적 항체를 포함한다.
난황은 0.1M NaCl과 0.01% 소디움 아지드를 함유하는 10mM 인산나트륨 pH 7.5를 사용하여 3배 희석시켰다.
초기의 PEG 침전단계를 3.5% 최종농도의 PEG 8000을 사용하여 수행하였다.
침전을 형성하도록 실온에서 30분간 둔 다음, 원심분리하고 상징액(IgY 함유)을 따로 두었다.
추가의 PEG를 12.5% PEG로 최종농드를 가져오기 위해 상징액에 첨가하였다.
IgY 항체가 이농도의 PEG에서 침전하였고 원심분리에 의해 펠릿으로 만들었다.
이 정제 단계에서의 IgY 항체를 다음 두방법에 의해 더 정제하였다.
1) 침전된 IgY 항체를 10mM MES pH5.6 에 재현탁시킨다음, 같은 완충액에 대해 4℃에서 밤새 투석시켰다.
다음에 시료를 40 μm, 혼합-모드 ABX 실리카수지(J. T. Baker)를 함유하는 1.5 20cm 컬럼에 적용시켰다.
후속 정제 프로토콜은 복수액에 대해 기술된 것과 동일하였다.
2) 또 다르게는, IgY를 함유하는 펠릿을 출발 완충액에 재현탁시킨다음 포화 황산 암모늄(3:1 v/v)을 사용하여 재침전시켰다.
IgY룰 함유하는 펠릿을 작은 부피의 증류수에 재현탁시키고 다음 사용시까자 4oC에서 보관하였다.
닭 IgG에 대한 고정화 방법은 실시예 12에 기재 한다.
실시예 9
알파-아미드화 효소활성의 동역학적연구
본 발명자가 호모제니어스하게 정제한 알파-아미드화 효소(배양물중의 수질 갑상성 암 CA-77 세포로부터와, 실험실쥐로부터 제거된 해당 종양 조직으로부터 모두)는 비활성 글리신-익스텐드된 펩티드 프로호르몬의 생체활성 C-말단 아미드를 전환시키는 작용을 한다.
본 발명자의 연구를 기토로하면, 프로호르몬의 C-말단 아미노산은 효소가 그것을 인식하고 다음과 같이 아미드화하기 위해 글리신 잔기이어야 한다.
Figure kpo00007
환원제 산화된환원제
이 활성의 시험관내 재구성은 펩티드기질 이외에 분자산소 및 환원제(L-아스코르브산)를 절대적으로 요한다.
그러나 본 발명자는 효소 활성은 Cu+ 2이온(황산구리)과 카탈라제의 첨가에 의해 실질적으로 증가될수 있음을 발견하였다.
이 외인성 구리는 효소에 의해 결합되고 분자산소 결합 및 활성화의 부위로서 사용된다.
한편, 카탈라제는 과산화수소를 배기하기위해 제공되는 효소인데, 과산화수소는 그렇지않으면 산소, 아스코르베이트, 구리를 수반하는 부반응을 통하여, 축적되고 아미드화효소를 파괴하게된다.
본 발명자는 알파-아미드화 효소 활성의 검출을 위한 감도 좋은 비-방사법 검정 방법을 개발하였다.
이들 검정은 합성 트리펩티드 기질의 사용을 포함한다.
이들 기질의 아미드화는 HPLC를 사용하여 생성물(아미드화 디펩티드 및 기질트리펩티드)의 분리 및 정량화에 의해 편리하게 모니터 된다.
개발한 가장 감도좋은 검정법은 모노 댄실 L-Tyr-Val-Gly를 기질로서 이용한다.
이 화합물은 댄실기가 형광성이기 때문에 매우 낮은 수준으로 검출될 수 있다.
결과적으로 이 검정의 감도는 다른 실험실에서 개발한 것과 비교된다.
본 발명자는 알파-아미드화효소의 동역학적 특성을 조사하기 위해 이 검정법을 사용하였다.
특히, 동역학적 파라미터 Km과 Vmax는 효소 활성에 대한 기질농도의 변동효과의 조사에 의해 결정되었다.
Km은 효소가 특징 기질에 대해 지니는 친화도의 척도이다.
Km이 작을수록 친화도가 더 크다.
Vmax는 효소가 기질을 생성물로 전환하게 되는 최대 속도이며 기질의 포화농도에서 관찰된다(즉, 기질은 효소보다 크게 과량으로 존재한다).
대표적인 아미드화 효소 검정에 있어서, 반응계(50 ㎕)는 pH 7.0에서의 60mM TES 완충액중의 효소(대락 7 μg), 댄실 L-Tyr-Val-Gly(40μM까지), L-아스코르브산(3mM), 카탈라제(0 내지 100 g ml-1) 및 황산구리(0내지 2μM)로 이루어지게 된다.
반응은 효소의 첨가에 의해 37oC에서 개시되고 규정시간후 0.1M EDTA(최종농도)의 첨가에 의해 종결되는데, 이것은 구리를 결합하여 효소에 유용하지 못하게 한다.
알파-아미드화 효소는 댄실 L-Tyr-Val-Gly의 효소 아미드화에 대한 높은 친화도를 나타내며 Km은 1-2μM 범위에 이른다.
이값은 효소의 정제상태에 무관하게 일정한 것 같다.
따라서, 세파크릴 S-300 크로마토그라피로 부터 유도되 효소푸울은 모노 Q pH 8.0 크로마토그라피로부터 유도된 효소의 전기영동으로 순수한 제제 또는 모노 Q pH 6.0 크로마토그라피상에서 분해된 저분자량 형태와 같은 Km을 나타낸다.
한편, 예상되는 바와같이, Vmax 값(단백질 mg당으로 표현됨)은 실질적으로 정제의 상태에 따라 변동한다.
따라서, 새파크릴 S-300 유도된 푸울의 Vmax는 mg 단백질당분당 형성된 대략 50 내지 100nmol 생성물인 한편 순수한 종양 효소에 대한 Vmax는 mg 단백질당 형성된 약 5000nmol 생성물이다.
본 발명자는 아스코르베이트와 기질은 같은 조건하에 효소에 대해 서로 경합할 수 있다.
예를들면, 만일 기질의 농도가 실질적으로 포화수준이외로 증가된다면, 효소활성은 효소와 아스코르브간의 손상된 상호 작용으로 인해 약해진다.
따라서 각 특정 기질에 대해, 특정기질에 대한 효소의 친화도에 따라 최적 기질/아스코르베이트 수준간의 미세한 균형을 나타낸다.
글리신-익스텐드된 펩티드에 대한 이미드화 효소의 친화도
본 발명자는 아미드화 효소와 몇가지 gly-익스텐드된 펩티드 프로호르몬간의 반응에 대한 민감한 프로브로서 모노댄실 L-Tyr-Val-Gly 아미드화의 검정을 사용하였다.
이 연구의 목적은 어떤 다른 형태의 펩티드 기질을 걸합하는 효소의 관련 친화도를 조사하는 것이었다.
본 발명자가 효소는 사람 칼시토닌 및 사람 성장 호르몬 방출인자의 글리신-익스텐드된 전구체 기질을 성공적으로 아미드화함을 일찌기 나타내었을지라도, 이것은 이들 및 다른 펩티드를 서로에 대하여 선호적으로 결합하는 효소의 능력에 대해서는 언급한 바 없다.
본 발명자는 글리신- 익스텐드된 알파-멜라노사이트 자극 호르몬, 기질P, 배소프레신 유사체, 및 성장 호르몬 방출인자가 아이드화 효소와 높은 친화도로 성호 적용하게 되어 댄실 L-Tyr-Val-Gly를 대사작용하는 것을 방지함을 나타내었다.
더우기, 글리신-익스텐드된 사람 칼시토닌, 뉴로 펩티드Y, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀 방출인자 및 칼시토닌 관련 펩티드의 5개의 C-말단 아미노산 잔기에 해당하는 펜타 펩티드 모델들은 이 검정에서 경합을 나타낸다.
환언하면, 효소는 모든 이들 글리신-익스텐드된 펩티드 기질을 결합 및 추측상 아미드화하는 능력을 갖는다.
반대로, 이듬 기질에 해당하는 아미드화된 펩티드를 조사할때, 그것들은 효소와 훨씬 덜 상호 작용할 수 있음을 발견하였다.
크게 다양한 글리신-익스텐드된 기질을 인식하는 이 효소촉매부위의 용량은 재결합 DNA 기법에 의해 발생된 펩티드 프로호르몬의 상용 아미드화를 위한 매우 유용한 일반시약이 되게 해야한다.
실시예 10
피이크III α-아미드화효소를 코드하는 DNA 서열의 분리
RNA 제조:
총 RNA 를 구아니딘 티오시아네이트 방법을 사용하여 쥐 MTC 조직으로부터 제조하였다.
폴리 A RNA는 올리고 dT 셀롤로오스로 선택되었다.
cDNA 합성
이중 스트랜드 cDNA를 공지의 방법으로 제조하였다.
주형으로서 쥐 MTC 조직으로 부터의 폴리A RNA와 프라이머로서 올리고 dT 12-18을 사용하여, 제1스트랜드 합성은 역 트랜스크립타제와의 효소 반응에서 달성되었다.
cDNA와 RNA를 분리하고 RNA를 알칼리로 분해시켰다.
cDNA의 제2 스트랜드 합성은 E. coli DNA 폴리머라제I를 사용하여 자기 프라임되었다.
SI 뉴클레아제 소화를 cDNA에서 헤어핀 루프를 제거하고 cDNA의 모든 단일 스트랜드된 영역을 분해하기위해 사용하였다.
cDNA상에 플러시 말단을 발생시키기 이해 DNA 폴리머라제 I와의 반응후, 이중 스트랜드 cDNA를 EcoR1 메틸라제와 S-아데노실 메티오닌으로 처리하여 EcoR1 부위를 메틸화하고 그들을 후속 효소 절단으로부터 보호한다.
EcoR1 링커를 cDNA에 연결시켰다.
EcoR1 소화에 이어서, 과량의 링커를 cDNA로부터 분리하고 cDNA를 세파로오스 4B 컬럼상에서 크기 분별시켰다.
한가지 이런한 합성에 대해서는, 500염기쌍 이상의 분자를 수집하고 한편, 제2의 1000염기쌍 이상의 분자를 클로닝을 위해 모았다.
λ gtll cDNA 라이브러리 제조
링커 적합시킨 이중 스트랜드 cDNA의 합성에 이어서, 분자를 벡터 λgt 11에서 cDNA 라이브러리를 발생시키기위해 사용하였다.
이것은, EcoR1으로 절단되고 벡터 DNA의 자기 연결을 방지히기 위해 포스파타제로 처리한 λgt 11 DNA로의 cDNA의 연결에 의해 달성되었다.
DNA들의 연결에 이어서, 재결합 DNA는 시헙관내에서 패키지시켜 감염성 박테리오 파아지 입자를 형성시켰다(패키징을 위한 추출물은 Promega Biotech 또는 Clontech Laboratories로부터 시중 구입되거나 표준 방법에 따라 제조될수 있다).
DNA를 패키지시킨후, 패키징 혼합물 알리큇을 시험하여 라이브러리내의 재결합체의 수를 결정하였다.
라이브러리중 하나는 약 2.57 x 106감염성 입자를 함유하며, 그중 대략 78%는 겉보기 재결합체임(IPTG의 존재하에 성장시켰을때 X - Gal 판상에 투명한 플라아크를 제공함)이 발견되었다.
다른 라이브러리는 악 2.75 x 106총 플라이크 형성단위와 대략 81% 겉보기 재결합체를 가짐이 발견되었다.
라이브러리 스크리닝
어느 재결합 박테리오파아지가 알파아미드화 효소 단백질에 대한 cDNA를 함유했는지 확인하기 위해, 파아지를 알파 아미드화 효소의 특이적 아미노산 서열로부터 설계된 방사표지된 올리고 뉴클레오티드 프로브로 스크린시켰다(실시예7, 표II 참조).
스크리닝은 박테리오 파아지의 시료를 플레이팅하고 파아지를 니트로셀룰로오스 필터 디스크상에 올림으로써 달성되었다.
니트로셀룰로오스 필터상의 파아지 고정화를 위한 방법은 널리 공지이다.
각 판으로부터 두벌 필터를3 2P-표지된 올리고뉴클레오티드 AE 9로 하이브리드시켰다.
하이브리드화는 0.3-0.4 pmols/ml에서 올리고 뉴클레오티드프로브로 6xNET, 0.5% NP40, 5xDenhardt's solution, 100 g/ml 연어정자 DNA에서 37oC에서 20-24시간동안 수행되었다.
하이브리드화에 이어서 필터를 44-45℃에서 몇시간동안 6xSCC에서 세척하고 X-선 필름에 노출시켰다.
양성으로 하이브리드하는 파아지를 두벌 필터상에서 일치하는 것으로서 확인되었다.
이들은 플레이팅과 하이브리드화의 몇 차례를 통해 연속적으로 풍부하게 함으로써 정제하였다.
스크린된 약 4-5 x 104파아지로 부터 18개가 AE 9 으로 확인되었다.
선택에 대한 특이성을 주기위해, 제2의 알파 아미드화 효소 올리고 뉴클레오티드, AE 8로 하이브리드화를 수행하였다.
이 프로빙은 18 파아지중 적어도 4개가 알파 아미드화 효소 단백질 서열에 대한 cDNA를 운반함을 나타내었다.
이 발견은 DNA 서열 분석에 의해서 뿐만아니라 추가의 특이적 올리고 뉴클레오티드 하이브리드화에 의해 (AE 4 및 AE 5로) 확인되었다.
α-아미드화 효소 발현:
본 발명자가 단백질 서열을 결정한 피이크 III AE 는 약 75,000 달톤의 분자량을 갖는다.
만일 아미노산의 평균 분자량이 120달톤으로서 취해진다면, 그때 아미드화 효소는 기껏해야 625 아미노산을 갖는다.
625 아미노산에 대한 유전자는 적어도 1875 염기쌍을 함유해야 한다.
본 발명자가 특이적 아미드화 효소로서 분리한 네가지 cDNA는 모두 α-아미드화 효소 단백질을 완전히 코드할 정도로 충분히 크다.
cDNA 클론중 하나인 λAE1 은 길이에 있어서 대략 2,200 뉴클레오티드이다.
한 단부로부터 처음 50 뉴클레오티드내에서 피이크 III효소의 아마노말단으로서 확인된 아미노산서열을 코드하기 시작한다.
그러므로, 이 cDNA가 피이크 III효소에 필요한 전체 코드하는 용량을 함유함이 추리될수 있다.
이 정보와 2,200 bp cDNA의 단부에서 뉴클레오티드 서열을 제공할때, 발현 클로닝을 위한 cDNA를 E.coli와 같은 원핵 숙주로 적합시키는 것을 비교적 간단한 방법이다.
λ AE1 cDNA에 적용될수 있는 한 가능한 방법은 제22도에 개설하였다.
예를들면, λAE1의 2,200 염기쌍 삽입물 cDNA는 재결합 박테리오 파아지 DNA의 EcoR1소화 및 아가로오스 겔전기영동에 따라 분리된다.
그것은 pBR322의 EcoRl 부위로 클론시켜 플라스미드 pAE8-1을 발생시킨다.
pAE8-1은 cDNA 서열내의 독특한 KpnI 절단 및 pBR 322서열 내의 독특한 Hind III 부위를 함유한다. Kpn I와 Hind III로 pAE 8-1의 소화는 cDNA의 약 62 염기쌍을 잃은(cDNA의 아미노말단 코드 단부에서) 약 2.15Kb의 단편을 산출한다.
피이크 III 아미드화 효소의 아미노말단에서 발견된 아미노산을 원래대로 만들고 발현 플라스미드로의 클로닝을 위해 cDNA를 적합시키기위해 Kpn I-Hind III 단부로된 단편을 올리고 뉴클레오티드 링커 어댑터에 연결시킨다.
나타낸 실시예에서, 파마시아로부터 구입한 E.coli 발현 플라스미드 pKK 233-2가 사용되고 있다.
Figure kpo00008
CAAGGCATTCATTGGAAAATGA 로 이루어지는 이중 스트랜드 링커-어댑터에 연결시킨다.
적합된 단편을 다음에 NcoI와 Hind III를 사전절단된 플라스미드 pKK 233-2 DNA에 연결시켜 4.6kb 선형 벡터를 산출한다. 연결된 생성물, pAE 12는 ATG 출발 코돈과 리보소옴 결합부위에 의해 하이브리드, IPTG 유발성 프로모터등의 조절하에 진행된 알파 아미드화 효소를 위한 cDNA를 함유한다.
유전자는 5S RNA 유전자와 전사 종결부위가 이어진다.
pAE 12의 IPTG 유발성 발현은 플라스미드 DNA의 laciq제노 타입을 가진 E.coli 균주로 형질전환에 따라 얻어진다.
AE1의 2.2kb cDNA 삽입물의 부분 DNA 서열
2.2kb 삽입물은 λAE1 의 EcoRl 소화에 의해 절출되고 삽입물은3 2P로 표지되었다. Hinc II로 2차 소화후, 결과 1.6kb 및 0.6kb 단편은 맥삼 앤드 길버트(Maxam and Gilbert)의 화합적 분해방법에 의해 시켄스 되었다.
EcoR1 단부로부터 λAE-1의 600bp 단편의 맥삼-길버트시켄싱에 의해 얻은 DNA 서열:
Figure kpo00009
올리고 뉴클레오티드 프로브 AE 8(-)22에 대한 서열 상동에 대한 조사
프로브 AE 8 (Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Val-Thr)을 발생시키기 위해 사용된 아미노산과 λAE1의 600bp 단편의 부분 DNA서열의 번역물 간의 상동에 대한 컴퓨터 조사를 수행하였다.
완전한 상동의 영역이 얻어졌고 이 영역은 DNA 서열상에 아미노산의 대문자 활자상에 별표로 표시하였다.
정재된 아미드화 효소의 NH2- 말담 시켄싱에 의해 확인된 아미노산은 괄호로 묶었다.
DNA 서열에 의해 예상된 것과 다른 것으로 발견되는 아미노산 지정은 + 로 표시하였다.
Figure kpo00010
실시예 11
효소 고정화
α-AE 의 정체: α -아미드화 효소를 고정화하기에 앞서 약-음이온 교환 및 겔 여과 크로마토그라피를 통해 정계하였다(실시예4).
어떤 경우에는 효소제제를 이뮤노어피니티 크로마토그라피나 아니면 페닐 세파로오스 크로마토그라피를 사용하여 더 정계할 수도 있다.
후속 정제 방법은 정계 과정에 무관하나, 일상적으로 비활성이 적어도 25mU 및 바람직하게는 50mU 또는 이상이어야 한다.
α-AE 의 고정화: α-아미드화 효소의 고정화 기술은 세성분, 즉, 효소, 아크릴 아미드의 수용성 공중합체(PN) 및 저분자량 가교제(TET)의 동시 반응이 기초가 될 수 있다.
사전 형성된 중합체(PAN) 는 아크릴아미드와 N-아크릴옥시 숙신이미드로 구성되는데 이것은 아조비스(이소부터로 니트릴)과 열 개시반응을 사용하여 THF 용액에서 중합된다.
가교제는 α, ω-디아민, 트리에틸렌테트라아민,(TET)시스타민이 될 수 있다.
PAN의 활성 에스테르기와의 디아민의 반응은 아미드 결합을 거쳐 중합체 사슬을 가교 결합하고 불용성 겔을 형성한다.
효소의 아미노 관능(바람직하게는 리신의 -아미노기)은 겔상의 잔유 활성 에스테르와 동시에 반응하고 안정한 아미드 결합을 형성한다.
고정화 과정은 기질과 보조인자의 존재하에 수행된다. Km 보다 더큰 농도로 높은 친화도 기질과 보조인자의 존재는 효소의 촉매 부위에서 또는 근처에서 PAN활성 에스테르와 친핵성기 간의 반응을 억제하여 따라서 화학적 불활성화로 부터 효소를 보호한다.
고정화 조건:
부분 정제된 α-AE는 30mM HEPES 완충액 pH 7.0에서 용해화 된다.
PAN와 TET의 비율은 활성 에스테르의 15%가 미반응한채 남아 α-아미드화 효소를 위한 결합부위로서 제공되도록 확립한다.
표준 PAN 용액은 20%(w/w)이다.
α-아미드화 효소 반응 혼합물은 0.2 M CuSo4, 40 M 댄실 His-Phe-Gly- 및 10mM 아스코르베이트와 0.5-0.2mg α-AE/그램 PAN으로 구성된다.
TET 농도는 0.85 당량의 1차아민/활성에스테르 당량과 같도록 계산된다.
일상적으로 최적 조건을 결정하기위해, 효소없는 반응을 실행하여 겔 타임 즉, 겔 형성을 달성하는데 요하는 TET의 부가에 따르는 지속시간을 확립한다.
α-아미드화 효소의 고정화를 위한 최적 수율은 효소의 첨가가 겔 포인트에 더 가깝게 이동할때 얻어진다.
일반적인 규칙은 효소가 겔 형성전에 PAN에 노출되는 시간에 짧을수록 활성 고정화 효소의 수율은 더 높다.
대부분의 반응에 대해 α-AE(-2.0mg/그램 PAN)을 PAN 45-60 초후 첨가한다.
효소함유겔을 실온에서 대략 1사간동안 방치해두어 짝지음 반응이 완결되도록 허용한다.
60분뒤 겔을 막자사발로 갈아 평균크기 100μ의 단편들을 얻는다.
이들 입자를 황산암모늄으로 세척하여 미결합 반응물을 제거하고 잔유 활성 에스테르기를 이미드로 전환시켜 이로써 반응성기를 캡핑시킨다.
고정화후 활성 α- 아미드화효소의 수율은 60% 미만인 것으로 예상된다.
고정화후 세척한 것은 출발 활성의 30 내지 40%를 함유할 수 있다.
α-아미드화효소는 황산암모늄 농도를 45%로 증가시킴으로써 세척물로부터 회수될수있는데 이것은 활성 α-아미드화 효소의 침전을 가져온다.
고정화된 겔입자는 입자가 기계 교반기로 현택액에 유지되어 있는 배치 α-아미드화 반응에 적절하다.
효소반응이 완결된후,입자를 가라앉히고 아미드화된 펩티드 생성물을 함유하는 상징액을 따른다.
이 과정은 더 큰 규모의 반응에는 적합하지 않다.
효소함유 겔입자는 컬럼에 충전하여 합리적인 유속을 얻기에 충분할 만큼 단단하지 않다.
이 문제를 회피하기 위해 두가지 양자택일 방법이 가능하다:
1. 겔을 유리 비이드의 존재하에 중합하도록 둔다; 전형적으로는 겔포인트 1분전에 유리 비이드를 반응 혼합물에 첨가하고 비이드가 PAN 용액층으로 덮힐때까지 기계 교반기로 교반한다.
이 복합물의 유동 특성은 겔입자만의 특성보다 훨씬 더 좋다.
2. 또 달리는 PAN 입자를 여과보조제 Celite 545와 혼합한다.
전형적으로는 PAN과 Celite의 혼합물을 혼합물의 8% w/w (건조중량) 미만을 구성하는 PAN으로 제조한다.
이 형태의 컬럼을 발생시키기위해 겔 입자를 50mM 트리스: HCl pH 7.0에 현탁시키고 일정하게 교반하면서 Celite 545 를 첨가하고 2시간동안 혼합하도록 둔다.
컬럼을 이 슬러리로 충전시키고 (3 40cm) 컬럼 온도를 아미드화 반응이 용이하도록 37℃에서 유지시킨다.
이 방법을 사용하여 8-10리터/일의 유속을 유지시킨다.
컬럼 크로마토그라피에 매력있는 대안은 접선유동시스템의 사용이다.
겔포인트에 앞서 PAN 중합체를 폴리술폰 0.4μ5 m 기공 지지체 시이트 상에 붓는다.
겔형성에 이어서 시이트를 밀리 기공 또는 Ncw Brunswick 접선유동 초여과 유니트에 적합하도록 자를수 있다.
이 설계에서 폴리술폰-PAN 고정화 효소겔의 복합시이트를 층으로 쌓아 표면적에 있어서 엄청난 증가를 가져온다.
이 방법은 분당 리터에 접근하는 유속까지 직접 비율에 따라 늘일 수 있다.
이 형태의 시스템은 또한 펩티드 기질의 아미드화를 최대화하기 위해 반응 혼합물을 재순환시키는 편리한 방법을 또한 제공한다.
α-아미드화 효소를 고정화시킴으로써 제공된 이점은 효소의 회수 및 재사용을 포함한다.
둘째로, 고정화 매트릭스는 효소 안정도를 증가시키고 장기간에 걸쳐 대규모 아미드화반응(그램 내지 kg양의 기질)을 할수있는 효소의 작업 형태를 제공한다.
실시예 12
불순한 알파-암드화 효소 조성물의 정제를 위한 이뮤노어피니티의 컬럼의 제조
A. 고정화 방법:
사용된 고정화 매트릭스는 브롬화 시아노겐- 활성호된 세파로오스 4B(파마시아) 이었다.
건조한 겔을 먼저 1mM Hcl(200㎖/그램수지)로 세척하여 고체 지지체를 팽윤 및 세척하였다.
닭 난황으로부터 정제된 대략 40mg의 정제된 폴리클로날 항체를 0.5M Nacl을 함유하는 100mM NaHO3pH 8.3에 대하여 투석하였다.
사전에 팽윤 및 세척된 고체 지지체 8ml를 사용하여 짝지음을 수행하였다.
반응은 고체지지체에 단백질의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 포함시킨 500mM NaC1을 함유하는 100mM 중탄산 나트륨 완충액 pH 8.3에서 실온에서 3시간동안 수행하였다.
겔의 잔유 활성기를 0.2M 그릴신을 사용하여 차단 시켰다.
블로킹 단계에 이어서, 겔을 고 및 저 Ph완충액(고pH 완충액 100 M NaHCO3pH 8.3 + 500mM NaCL, 저 pH 완충액 100mM 아세테이트 pH 4.0 + 500mM NaCI) 사이클을 사용하여 4내지 5회 세척하였다.
이들 세척 단계는 수지로부터 모든 미결한 단백질 및 차단 시약(글리신)을 제거하였다.
이뮤노어피니티 수지를 세균발육저지제로서 머어티올레이트(merthiolate)를 함유하는 염기성 pH 완충액에서 4oC에서 보관하였다.
모든 후속 이뮤노어피니티 크로마토그라피는 4℃에서 수행된다.
유사한 방법이 정제된 모노클로날 항체를 고정화 하기위해 사용될 수 있다.
B. 이뮤노어피니티 크로마토그라피:
이뮤노어피니티컬럼이 α-AE의 정제에 또다른 고효율단계로서 사용된다.
CA-77 세포로부터의 조직배양매체(실시예4 참조)를 중류수로 희석하고 20mM 비스 트리스-HC1 pH 6.0 으로 사전에 평형화시킨 DEAE 음이온 교환 카트리지를 통해 뿜어낸다.
α-아미드화 효소를 500mM NaCl을 함우하는 50mM 트리스: HCI pH 7.0으로 카트리지로부터 용리시킨다.
α-AE 활성을 함유하는 분율을 트리스 : HCI pH 7.0 완충액에 대해 투석시키거나 아니면 이뮤노어피니티 크로마토그라피에 앞서 겔여과 크로마토그라피 (실시예4)를 사용하여 더 정제한다.
α-AE를 함유하는 시료를 중성 pH 에서 면역 흡착 컬럼을 통과시킨다.
항체는 α-아미드화 효소를 특이적으로 결합하는 한편 오염되어있는 단백질은 결합되지 않을 것이며 용출액에서 제거된다.
α-AE 활성은 100mM 글리신: HCI 완충액 pH 3.0을 사용하여 컬럼으로 부터 용리시킬수 있다. (요소, 디옥산, 에틸렌글리콜, 및 NaI를 포함하는 다른 흡착제도 사용될수 있다).
분율을 1.0 트리스: HCI pH 7.0에 수집하여 완충액 시스템을 중화하여 이로써 α-AE 활성을 보전시킨다.
제 1도 내지 제 5도는 실시예 1에 관한 도면, 제 6도 내지 제 12도는 실시예 2에 관한 도면,
제 13도 내지 제 16도는 실시예 3에 관한 도면, 제 17도 내지 제 21도는 실시예 4에 관한 도면,
제 22도는 실시예 10에 관한 도면, 제 23도는 실시예 6에 관한 도면이다.
본 발명은 알파-아미드화 효소, 알파-아미드화 효소의 제조방법 및 글리신-익스텐드된 기질상의 효소의 작용에 의한 알파-아미드화 생성물의 제조시 그의 용도에 관한 것이다. 어떤 바람직한 구체예에서는, 본 발명의 알파-아미드화 효소는 유용한 알파-아미드화 호르몬과, 칼시토닌, 성장호르몬 방출인자, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 및 다른 알파-아미드화 생성물을 포함하는 농업 및 의료용도의 생성물 제조시 사용될 수 있다.
핵산 코우드 서열로부터의 번역후의 천연단백질의 전구체 형태의 세포내 프로세싱 (절단 및/ 또는 작용기 수정)은 분명히 증명되어 왔다.
일반적으로, 포유동물 세포 및 다른 진핵세포는 일정한 번역후 프로세싱 과정을 수행할 수 있는 반면에, 원핵세포는 할 수 없다. E. coli 와 같은 일정한 원핵세포는 재결합 DNA (rDNA)기법을 거쳐 포유동물 단백질의 제조를 위한 숙주로서 널리 사용되는데 그들은 배치 발효과정에서 쉽게 성장하기 때문이며, 유전학적으로 잘 특징지어져 있기 때문이다. 그러나, 유전공학기술에 의해 제조된 많은 포유동물 단백질은 어떤 형태의 번역후 프로세싱을 요하며 이것은 종종 대규모 제조에 이용하기 위해 엄청나게 비싼 시험관내 화학적 과정으로 착물을 사용함으로써 달성되어야 한다.
한 형태의 프로세싱 과정은 단백질의 카르복실-말단 아미노산의 특이적 아미드화를 수반한다. 많은 천연 발생호르몬 및 펩티드는 이러한 수정을 포함하는데, 이것은 종종 단백질이 생물학적으로 활성이 되어야 한다면 필수적이다. 예로는 캄시토닌이 있는데, 이때 비아미드화 프롤린 잔기의 천연형의 아미드화 프롤린을 대신한 치환은 생물학적 활성에 있어서 3,000배 감소를 가져온다.
이 C-말단(알파) 아미드화를 실행하는 약품은 글리신 잔기를 인식하는데 이것은 즉시 아미노산을 아미드화(R-X-gly, 여기서 R 은 단백질의 주체이며, X 는 아미드화되는 잔기이고, gly는 글리신 잔기이다) 시키는 것으로 이어진다. 글리신은 절단되고 실제로 아미노기를 끝에서 두번째 아미노산에 주어 이로써 아미드화된다. α-아미드화 효소에 대한 대략의 분자량을 보고하는 첫번째 저자는 브래드베리(Bradbury A.F., et al., Nature, Vol. 298, 1982, p. 686-88) 이었다. 세파덱스 G-100을 사용하여 그들은 대략 60,000 달톤의 최소 겉보기 분자량을 제안하였다.
후속 연구는 효소의 분자량이 60,000 과 70,000 달톤 사이인 것으로 제안하였다. (겔여과 크로마토그라피로 측정한 것). 이들은 Husain I., and Tate S.S., FEBS Letters, Vol. 152, #2,1983, p. 277-281 ; Eipper, et al., PNAS Vol. 80, 1983 p. 5144-5148; Gomez et al., FEBS Letters, Vol 167, #1, 1984, p. 160-164, and Kizer J.S., et al., PNAS, Vol. 81, 1984, p. 3228-3232를 포함한다. 에이퍼(Eipper et al., PNAS, Vol. 80, 1983, p. 5144-48)는 분자 산소이외에, 최대 효소아미드화 활성을 위해 두가지 보조인자가 요구되며 이들은 아스코르브산과 구리(II)이온임을 보고하였다.
펩티드의 카르복실 말단의 아미드화를 가져오는 화학반응은 이미노기에 대한 공급원을 요한다. 브래드베리(Bradbury A.F., et al., Nature, Vol. 298, 1982, p. 686-688)는 글리신은 절단되고 끝에 두번째 아미노산에 아미노기를 주어 후자의 아미드화를 가져옴을 증명하였다. 글리신에 대한 아미노기 공여체로서의 요구는 다른 저자에 의해 실현되었다.
랜디모어(Landymore, A.E.N., et al., BBRC Vol. 117, #1, 1983, p. 289-293)는 D-알라닌도 또한 아미드화 반응에 아미노 공여체로서 제공될 수 있음을 증명하였다. 카이저(Kizer et al., PNAS, Vol. 81,1984, p. 3228-3232)에 의한 후속 연구는 -아미등화 반응을 촉매작용할 수 있는 쥐 뇌에서의 두가지 현저한 효소활성을 나타내었다. 더 높은 분자량 종(70,000 달톤)은 기질의 카르복실 말단에서 글리신에 대해 제한된 특이성을 갖는다. 더 낮은 분자질량 효소는 카르복실-말단 아미노산으로서 -알라닌을 갖는 기질을 받아들인다.
돼지 뇌하수체로부터 추출되고 부분적으로 정제된 -아미드화 효소에 대한 pH 최적치는 대략 7.0인 것으로 브래드베리와 스미드(Bradbury A.F., and Smythe D.G., BBRC, Vol 112, #2, 1983, p. 372-377)에 의해 보고되었다. 에이퍼(Eipper, B.A., et al., PNAS, Vol. 80,1983, p. 5144-5148)는 쥐 뇌하수체로 부터 부분적으로 정제된 -아미드화 효소에 대해 7의 pH 최적치를 보고함으로써 이들 결과를 확증하였다. 그들은 또한 효소활성이 6.5 이하 또는 7.5 이상의 pH 수준에서 급속히 감퇴되었음을 기재하였다.
모든 상기한 논문들 (여기서 참고로 포함됨)에서는 기술된 추출물 및 부분정제된 효소 혼합물은 알파-아미드화 효소 자체 뿐만이 아니라 가능한 기질과 생성물을 분해시킬수 있는 추가의 단백질 분해효소를 함유하여 천연공급원으로부터 정제되거나 재결합 DNA 기법에 의해 제조된 펩티드 또는 폴리펩티드의 이러한 효소들에 의한 아미드화를 지연시킨다.
광범위하게는, 다른 사람들이 앞서 측정한 모든 아미드화 활성은 트리펩티드, D-Tyr-Val-Gly-COOH와 같은 D-기질의 D-Tyr-Val-CONH2로의 전환을 기초로 하였다. 가능한 두 구조 (D 또는 L)중, 천연 발생의 생물학적으로 중요한 아미노산은 L형태로 일어난다. 그러나, 이들 다른 연구자들에 의한 D형의 사용은 이들 연구자들이 사용한 불순한 아미드화 효소제제 중의 외인성 단백질 분해효소의 존재를 중화하는 것을 필요로 하였다. 이들 외인성 효소들은 D-기질에는 거의 영향을 주지 않으면서 L-아미노산 기질에 대한 현저한 단백질 분해영향을 줄수 있다. 연구자들은 그들의 효소중의 단백질 분해효소 및 다른 불순물들에 대한 부담을 지고, 불순물의 영향을 어느정도 회피하기 위해 부자연적인 D기질을 사용하였다. 종래의 어느 기술도 그들의 효소제제가 어떠한 생리학적 관련 기질, 즉, 생물학적 활성의 알파-아미드화 L-생성물로 전환하기 위한 L-기질을 효율적으로 아미드화 할 수 있음을 증명할 수 없었다.
여기서 증명한 바와 같이, 본 발명 제제는 L-기질을 효과적으로 아미드화 할 수 있으며, D-기질상에서 본원인이 알고 있는 바, 어떤 종래기술에 기재된 최고의 활성보다도 60 내지 1,000배이상 더 큰 활성을 갖는다. 펩티드 및 단백질의 카르복실 말단을 아미드화할 수 있는 효소학적 제제는 각종 자료에 기재되어 왔다.
예를들면, 브래드베리(Bradbury, A.F., et al., Nature Vol 298, 1982, p. 686-688: 이 논문의 전체 내용이 참고로 여기에 포함된다)는 α-아미드화 효소활성이 돼지 뇌하수체에 존재하는 것으로 보고하고 있다. 효소를 함유하는 돼지 뇌하수체 제제는 글리신이 말단인 펩티드를 해당 글리신 제거된 펩티드 아미드로 전환시키는 능력을 갖는다. 그러나 브래드베리는 제제가 천연공급원으로부터 정제된 펩티드 또는 폴리펩티드를 아미드화 하지 못함을 인정하고 있다. 즉, 뇌하수체에서의 아미드화 활성을 검출 및 추정하는 검정(assay)시스템은 합성 트리펩티드 D-티로실발릴글리신을 해당 디펩티드 아미드 D-티로실발린아미드로 전환시키는 효소제제의 능력을 조사함으로써 얻어졌다. ... D-티로신잔기는 조직 호모제네이트에 존재하는 아미노 펩티다제에 의한 분해에 대한 안정성을 주었다. ... 대조표준실험은 합성의 ... D-티로실발린아미드를 같은 조건에서 배양했을 때 그것은 서서히 분해되었다. 따라서 외하수체 효소에 의한 디펩티드 아미드의 형성은 뇌하수체 추출물에 존재하는 다른 효소에 의한 파괴가 뒤따랐다.
따라서, 브래드베리는 기술된 제제가 펩티드 또는 폴리펩티드를 분해하는 다른 단백질 분해효소를 함유한다
는 것과 비천연 발생 D-티로신 잔기는 이러한 분해를 최소화 하는데 이용됨을 인정하고 있다.
또한, 브래드베리는 허용될 정도로 단백질분해효소가 오염되어 남아있는 아미드화 효소를 정제하기 위해 호모제네이트화 또는 세포이하 분별화에 이어서 겔 투과 크로마토그라피이 사용을 가르쳐 준다.
휴사인과 테이트(Husain, I., Tate, S.S., FEBS Letters, Vol. 152, #2, 1983, p. 277-281)는 α-아미드화 활성이 소 뇌하수체 신경분비 과립에 존재하는 것으로 기술하였다.
에이퍼(Eipper et al., PNAS Vol. 80, 1983, 5144-5148)는 α-아미드화 효소활성이 쥐 뇌하수체선의 전엽, 중엽 및 후엽에 존재함을 보고하였다. 그러나, 이 문헌은 알파-아미드화 활성을 연구하기 위한 합성 D-Tyr-Val-Gly 기질의 이용만을 가르쳐주며, 생성된 제제의 불순물을 인정하고 있다.
고메즈(Gomez et al., FEBS Letters, Vol. 167, #1, 1984, p. 160-164)는 쥐 시상하부가 또한 α-아미드화 효소활성을 포함함을 결정하였다.
브래드베리와 스미드(Bradbury, A.F., Smythe D.G., 펩티드 구조 및 작용 : Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium; p. 249-52(1983), Editors Hruby, V.J., and Rich D.H.,)는 쥐 갑상선에 α 아미드화 효소활성의 존재를 기술하고 있다.
메인(Mains R.E. et al., Endocrinology, Vol. 114, 1984, p. 1522-1530)은 뇌하수체 전엽(ATT-20)으로부터 유도된 쥐과 셀라인이 α-아미드화 효소활성을 포함하는데 배양시 시간에 따라 명백히 감소함을 보고하였다.
아미드화 펩티드를 포함하는 것으로 알려진 선 또는 기관은 아미등화 반응을 촉매작용할 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 예를들면, 곱상어(Squalus acanthias)와 같은 하등생활형은 뇌하수체 추출물에 아미드화된 펩티
드를 포함하는 것으로 오도노휴(O'Donohue T.L., et al., Peptides3, 1082, p. 353-395)에 의해 보고되었다. 쉘러(Scheller, R.H. et al., Cell, Vol. 32, 1983, p. 7-22)는 바다달팽이(Aplysia)에 아미드화 신호 펩티드의 존재를 보고 하였다. 이 활성의 자연계에 명백히 편재하는 분포에도 불구하고 효소의 물리화학적 특성에 대한 정보는 거의 공개 되어 있지 않다. 이것은 이들 신경내분비 기관에 존재하는 매우 낮은 수준의 효소에 기인할 수 있다.
특정조직내의 아미드화된 펩티드의 존재는 높은 수준의 알파-아미드화 효소와 반드시 같은 뜻은 아니다.
예를들면, 쥐 뇌하수체 전엽조직은 높은 알파-아미드화 활성을 함유하나 기질로서 알려져 있지 않다 [Eipper et al., PNAS 80, 5144-5148(1983)]. 쥐 뇌하수체 후엽조직은 아미드화된 펩티드 (옥시토신 및 바소 프레신)를 함유하나 알파-아미드화 활성은 거의 없다 [Eipper et al., Endo 116, 2497-2504(1985)]. 그러므로, 재재의 조직을 알파-아미드화 활성에 대해 시험하기 전에는 효소의 존재 또는 가능한 수준을 예상할 수 없다.
본 발명의 목적 및 요약은 다음과 같다.
본 발명의 목적은 천연 공급원으로 부터 정제되거나 재결합 DNA 기법에 의해 제조된 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 L-아미노산을 함유하는 기질로부터도 유용한 알파-아미드화 생성물을 효율적으로 생성할 수 있는 알파-아미드화 효소조성물을 제공하는 것이다.
발명의 더이상의 목적은 효소 조성물의 제조를 위한 효과적이고 비용면에서 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
발명의 더이상의 목적은 알파-아미드화 효소에 특이적인 모노 클로날 항체와 고정화된 항체, 상기 항체를 이용하여 알파-아미드화 효소를 효율적으로 정제하는 정제수지, 이뮤노어피니티 컬럼등을 제공하는 것이다.
발명의 더이상의 목적은 알파-아미드화 효소의 고수율 발현을 할 수 있는 유전공학적으로 만든 숙주 세포를 제공하는 것이다.
발명의 더이상의 목적은 C-말단 글리신잔기를 함유하는 기질로부터 효소 조성물의 존재하에 기질을 반응시킴으로써 알파-아미드화된 생성물을 제조하는 것이다.
이들 목적과 다른 목적들은 본 명세서를 충분히 판독할 때 명백해질 것이다.
본 발명에 따르면, 본 원인은 효소 조성물에 존재하는 단백질의 mg당 적어도 약 25mU, 바람직하게는 50 이상 또는 150 mU 이상/mg 단백질의 알파-아미드화 비활성을 나타내는 충분한 순도의 신규한 알파-아미드화 효소 조성물을 제공한다. 여기에 제시된 모든 비활성 단위(specific activity units)는 댄실-D-Tyr-Val -Gly-COOH의 댄실-D-Tyr-Val-CONH2로의 전환을 기초로 한다. 1 mU는 2mM농도 (효소, 기질, 보조인자등을 포함하는 총 반응 혼합물 기준)의 아스코르베이트 이온, 기질 보다 1몰 과량의 분자산소 및 활성을 최대화하는데 효과적인 제 2구리이온 농도(효소의 순도의 상태에 따라 보통 약2 M)의 존재하에 37℃및 pH 7.0 에서 분당 1 나노몰 (nmole)의 댄실-D-Tyr-Val-COOH를 1 나노몰의 댄실-D-Tyr-Val-CONH2로 전환시키는데 필요한 활성의 양으로서 정의된다.
펩티딜 글리신 알파-아미드화 모노옥시제나제와 같은 본 발명의 알파-아미드화 효소는 펩티드 사슬의 C-말단에서 적어도 글리신 잔기를 갖는 펩티딜 화합물의 C-말단 글리신의 대신에 아미노기를 갖는 해당 펩티딜 아미드 화합물로의 전환을 촉매 작용할 수 있다. 여기서 사용한 바와같이, 펩티드 사슬 이라는 용어는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 두개의 아미노산을 갖는 모든 폴리펩티드를 의미한다. 용어 펩티딜 화합물은 펩티드 사슬을 갖는 모든 화합물을 포함한다. 용어 해당 펩티딜 아미드는 펩티드 사슬의 C-말단 글리신의 대신에 아미노기로 치환되는 반응의 모든 생성물을 일컫는다.
알파-아미드화 반응은 산소 및 환원제의 존재하에 일어나는 것이 바람직하다. 유용한 환원제는 아스코르브산, 아스코르브산염, 디히드록시푸마르산염, 시안화금속화합물, 및 테트라히드로 프테린을 포함하나 여기에 제한되지는 않는다. 어떤 보조인자는 반응의 진행을 돕고 효소의 분해 또는 불활성화를 지연시킴이 발견되었다.
이들 보조인자는 카탈라제, 에탄올, 요오드화칼륨 및 제 2구리 이온을 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 본 발명의 정제된 효소 조성물은 바람직하게는 알파-아미드화 효소나 아니면 알파-아미드화 반응의 생성물 또는 반응물을 분해시킬 수 있는 단백질 분해활성이 충분히 없으며, 따라서 효소조성물은 기질과 생성물이 L-아미노산으로 이루어져 있을때에도 알파-아미드화 반응을 촉매 작용시킬 수 있다. 아미드화 반응혼합물에서의 단백질 분해활성은 프로테아제의 농도를 직접 나타내지는 않을 수도 있다. 높은 프로테아제 농도에서도 활성은 예를들면, 여러가지 억제제의 작용에 의해 억제될 수 있다. L-아미노산으로 이루어진 기질을 사용하기 위한 효소조성물의 상업적 및 실용상의 바람직함을 증가시키는 단백질 분해활성의 결핍은 어쨋든 L-아미노산을 함유하지 않는 기질을 사용하기 위한 조성물의 매력을 감소시키지 못한다.
상세한 설명에서 더 제시되는 바와 같이, 본 원인은 실질적인 알파-아미드화 활성을 지니는 다수의 특이적 단백질 종을 정제하였다. 여기서 사용된 알파-아미드화 활성은 기질 펩티딜 화합물의 C-말단 글리신에 의해 사전 점유된 위치에서 아미노기만을 이탈시키는 경향이 있는 모든 활성을 의미한다. 이러한 치환은 글리신의 아미노기만의 분해를 수반하여 전체 글리신기에 의해 사전 점유된 위치에 아미노기만을 남기도록 할 수 있다.
여기서 사용한 바와같은 알파-아미드화 효소는 알파-아미드화 활성을 나타내는 모든 조성물 또는 화합물을 말하며 그의 활성 상동체 및 단편을 말한다.
본 발명에 따라 정제된 효소 조성물은 호모제니어스할 때 까지 정제될 수 있다.
여기서 사용한 호모제니어스는 도데실 황산나트륨/폴리아크릴 아미드 겔 상의 전기영동에 따라 단일의, 잘 규정된 띠를 나타내며 통상의 시퀀싱법에 반응하여 단일의 아미노산 서열 데이타를 나타내는 효소제제를 말한다.
본 발명에 따라 호모제니어스하게 정제된 어떤 알파-아미드화 효소는 약 1500mU/mg 단백질 이상의 효소 비활성을 나타내었다.
본 발명에 따라 제조된 효소 조성물은 유용한 알파-아미드화 펩티딜 생성물의 제조에 이러한 생성물의 알파-아미드화를 촉매 작용시키기 위해 효소조성물을 사용함에 의해 사용될수 있다. C-말단 글리신에 대한 아미노기의 치환을 원하는 생성물에 가져오는 펩티드 사슬의 C-말단에서 적어도 글리신 잔기를 갖는 펩티질 화합물인 기질이 제공된다. 기질은 펩티딜 화합물을 해당 펩티딜 아미드로 전환시키기에 충분한 시간동안 본 발명에 따라 제조된 효소 조성물의 존재하에 바람직하게는 산소와 환원제의 존재하에 반응시킨다. 전환은 실질적으로 기질과 효소의 첫번째 접촉에서 시작되나 반응속도는 pH, 온도, 기질의 종류, 보조인자의 농도 및 반응을 최적화 하기 위해 공지의 방법으로 조절될 수 있는 다른 파라미터들에 따라 상당히 다양하다. 반응은 보통 원하는 전환백분율(생성물에 대한 기질의 백분율)의 견지에서 선택된 시간동안 진행하도록 허용한다. 바람직한 구체예에서, 앞서 논의된 것과 같은 보조인자가 반응의 진행을 돕고 또는 효소의 활성을 높이거나 지속시키기위해 사용된다.
알파-아미드화가 바람직하거나 필요한 천연호르몬등을 포함하는 다수의 유용한 생성물들을 본 발명에 따라 알파-아미드화 효소 조성물의 존재하에 글리신-익스텐드된 펩티딜 화합물을 반응시킴으로써 만들 수 있다. 예를들면 농업에서 또는 호르몬 결핍에 의한 질병의 치료에 사용될 수 있는 이들 생성물은 각종 칼시토닌, 성장호르몬 방출인자, 칼시토닌 유전자 관련펩티드 등을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 전술한 칼시토닌, 성장호르몬 방출인자 및 칼시토닌 유전자 관련 펩티드와 같은 여기서 언급한 호르몬은 본분야 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 지정한 호르몬의 특징적 활성을 나타내는 C-말단 아미드 단백질 종을 포함한다. 예를들면, 칼시토닌은 공지의 칼시토닌을 특징으로 하는 뼈에 칼슘섭취의 조절을 나타내는 모든 종을 포함한다. 여기서 논의된 여러가지 단백질 종의 상동체는 종의 정의를 포함하며 여기서 제시된 어떤 뉴클레오티드서열 또는 아미노산 서열도 치환, 부가 또는 삭제가 제시된 서열에 의해 부여된 기능에 실직적으로 영향을 미치지 않는 상동서열을 포함함을 의도한다. 바람직하게는, 펩티드내의 적어도 약 40%, 가장 바람직하게는 50%의 아미노산의 제시된 것들에 해당한다. 뉴클레오티드 서열에 관해서는, 코돈도 물론 같은 아미노산을 코드하는 동등한 코돈에 의해 치환될 수 있다.
L-아미노산으로 이루어지는 기질상에서도 알파-아미드화 반응을 촉매작용시키는 본 발명 효소조성물의 능력은 천연공급원으로 부터 정제되거나 또는 재결합 DNA 기법에 의해 생성된 기질을 사용하여 이들 생성물의 효과적이고 비용면에서 효율적인 제조를 가능하게 한다.
어떤 바람직한 구체예에서는, 알파-아미드화 반응은 수성매체에 불용성이고 반응 조건하에 분해 저항성인 고체지지체 및 고정화된 효소상에 통과하는 기질 상에, 바람직하게는 적절한 보조인자의 존재하에 효소를 고정화시킴으로써 용이해질수 있다. 여기서 사용한 고정화는 지지체에 효소를 결합시킴을 말한다. 이 목적으로 유용할 수 있는 지지체는 콘트롤-기곡유리, 또는 브롬화 시아노겐-활성화된 세파로오스와 같은 활성화된 흡수제를 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 이 방법으로 고정화된 효소는 장차 사용을 위해 효소를 계속보유하는 고체지지체로 부터 반응혼합물을 제거함으로써 재사용될 수 있다.
본원인은 본 발명에 따르는 효소조성물이 많은 방법에 의해 얻어질 수 있고 정제될 수 있음을 발견하였다.
바람직하게는 쥐로 부터 유도된 수질 갑상선 암 조직, 그의 세포주(cell lines), 및/또는 상기 세포주로 부터의 세포배양 매체가 미정제 알파-아미드화 효소의 특히 바람직한 공급원이다. 불순한 알파-아미드화 효소는 미정제 조성물을 크기 배타 크로마토그라피와 음이온 교환 크로마토그라피, 바람직하게는 강력한 음이온 교환 크로마토그라피를 둘다 시킴으로써 정제될 수 있다. 여기서 사용한 강력음이온 교환 크로마토그라피는 pH 2-12의 범위에서 일정한 순수 양전하를 유지하는 모든 수지 상에서 행하는 음이온 교환 크로마토그라피에 관한 것이다. 발명의 어떤 바람직한 구체예에서는, 크기배타 크로마토그라피는 강력 음이온 교환 크로마토그라피에 선행되며, 크기배타크로마토그라피 단계는 역시 또다른 음이온 교환 크로마토그라피 단계에도 선행될 수 있다.
제 1단계에 후속되는 제 2의 강력 음이온 교환 크로마토크라피 단계가 바람직하며, 한 구체예에서는, 제 1의 강력 음이온 교환 크로마토그라피와 제 2의 강력 음이온 교환 크로마토그라피중 어느 하나는 염기성 pH에서 행해지는 한편 다른 하나는 산성 pH에서 행해진다.
본 발명에 따라 실질적으로 호모제니어스하게 정제된 효소종을 사용하여, 효소에 특이적인 모조클로날 및 폴리클로날 항체가 항원으로서 정제된 효소를 사용하여 쥐와 닭에서 각각 면역 반응을 유도함으로써 제조되었다. 모든 종으로부터 이 방법으로 유도된 항체는 효소에 특이적인 이뮤노어피니티 컬렴을 제조할 목적으로 고체 지지체상에 정제 및 고정화 될 수 있다. 이 컬럼은 미정제 효소물질의 정제에 사용될 수 있고 증가된 효율 및 효소의 재사용성을 가져온다. 트립신 단편과 함께 본 발명에 따라 정제된 효소는 공지의 방법으로 시퀸싱 되었고 서열 데이타는 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조에 사용되었다. 이 방법으로 제조된 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여, 본원인은 쥐 수질 갑상선 암조직으로부터 유도된 폴리 ARNA로 부터 합성된 cDNA 라이브러리로부터 알파-아미드화 효소를 코드하는 유전자를 단리시켰다. 본원의 상세한 설명부분에서 더 구체적으로 특징지어지는 유전자는 적절한 발현벡터로 연결될 수 있고 유전자를 발현할 수 있는 어떤 숙주세포로도 형질전환될 수 있다. 적절한 숙주는 E. coli, S. cervisiae 와 같은 효모균주, 또는 효소가 원래 정제되어나온 세포주와 같은 고급 성숙핵 세포를 포함하나 이들에 제한되지는 않는다. 상업적 대량생산이 다량의 알파-아미드화 효소를 발현하는 상기 제시된 바와같이 유전공학적으로 만든 미생물에 의해 용이해짐을 기대할 수 있다.
천연공급원으로 부터의 효소의 상업적 대량생산은 음이온교환 크로마토그라피 컬럼에 의해 보유된 효소종을 약 250mM 이상, 바람직하게는 350mM 또는 500mM 만큼 높은 농도를 갖는 식염수 용액을 사용하여 용리시키는 크기배타 크로마토그라피와 음이온 교환 크로마토그라피 둘다로 이루어지는 정제 방법에 의해 용이 해질 수 있다. 높은 식염수 농도에서 대부분의 보유된 효소종이 용리될 것이다. 크기배타 크로마토그라피는 약 58,000 내지 67,000 달톤, 바람직하게는 60,000 내지 65,000 달톤의 겉보기 분자량을 가진 종을 분리하도록 설계되어야 한다. 정제된 제제는 천연공급원으로 부터 정제되거나 재결합 DNA 기법에 의해 제조된 펩티딜 화합물, 즉, L-아미노산으로 이루어진 펩티드를 아미드화 할 수 있다.
발명의 바람직한 구체예들을 상세히 설명하면 다음과 같다. 현재 크기배타와 이온교환 크로마토크라피를 조합하여 사용하는 다단계 과정을 통하여 고형 종양 조직추출물, 종양세포주 및 이러한 세포주로 부터의 조직배양매체로 부터 호모제니어스 하게 정제된 α-아미드화 효소를 얻을 수 있음을 발견하였다.
효소는 부스(Roos, B.A., et al., Endocrinology, 1979, Vol. 150, #1, p. 27-32) 에 의해 기술된 바와 같이 WAG/Rij 위스타르 쥐에 전개된 수질 갑상선 암(MTCs)으로 부터 추출하였다. 이 조직은 IVI-10028로서 기탁되었다. 효소는 또한 다른 공급원으로부터 추출되었는데, 현저히는 사람 및 쥐 수질 갑상선 암세포주로 부터이다. 쥐 세포주(CA-77)는 머스진스키(Muszynski,M. et al., JBC 1983, Vol. 258, p. 11678-83)에 의해 기술된 바와같이 일련의 통로에 의해 쥐 수질 갑상선 암종양으로 부터 유도되었다. 이 세포주는 IVI-10029로서 기탁되었다. 사람세포주 HTT 54(34) 는 제 1배양액에 대한 사람 수질 갑상선 암세포를 사용하여 부스(B.A.Roos, VA Medical Center in Cleveland, Ohio)에 의해 개발되었다. 사람세포주 HTT 54(34) 는 IVI-10031로서 기탁되었다.(이들 기탁을 증명하는 Recognition of the Deposit of Micro-Organisms for the Purposes of Patent Procedure 와 Budapest Notification No. 34, Nov. 3, 1983 참조, 이것의 모든 내용은 참고로 여기에 포함된다).
사람과 쥐 세포주 둘다로부터 규정된 조직배양매체는 효소의 일부는 세포로 부터 분비됨을 지적하면서 상당한 수준의 -아미드화 효소활성을 포함함이 증명되었다.
효소는 바람직하게는 미정제 물질을 음이온 교환 크로마토그라피에 먼저 종속시킴으로써 얻어지고 정제된다. 샘플은, 예를 들면, CUNO Corp로 부터 구입되는 CUNO 250 과 같은 디에틸 아미노 에틸(DEAE)카트리지와 같은 예비스케일 음이온 교환 컬럼상에 대량 적하시킬 수 있다.
알파-아미드화 활성-함유조성물은 다음에 적당한 분해능력의 수지 상에 크기 배타 크로마토그라피, 예를들면 파마시아 화인 케미칼스로 부터 구입되는 세파크릴 S-200 초미세 컬럼에 종속 시킨다. 활성-함유 용출액 분율을 다음에 강력 음이온 교환 매트릭스를 사용하여 이온 교환 크로마토그라피를 시킨다. 사용될 수 있는 수지는 파마시아 화인 케미칼로 부터의 모노 Q HR 5/5 강력 음이온 교환 수지이며 효소의 호모제니어스한 정제를 위해서 컬럼상에 1 회 또는 그 이상의 통과가 필요할 수 있다. 모노 Q HR 5/5 컬럼은 10 m 의 입도, 40%의 빈 부피 및 하전된 기가 CH2-N+ -(CH3)3 인 겔을 가지며 그의 이온용량은 0.28 내지 0.36 mmoles/ml 이다.
각 정제 단계는 단백질 함량과 α-아미드화 활성의 수준 둘다에 대해 모니터될 수 있다.
이 정보는 효소의 상대순도의 지시약으로서 제공되는 효소의 비활성을 계산하는데 사용된다.
본 발명에 따라 정제된 펩티딜-글리신 알파-아미드화 모노 옥제나제 (기탁된 쥐 유도된 효소, IVI-10032 ;
기탁된 사람 유도된 효소, IVI-10033)는 겔여과에 의해 구한바, 약 60,000 내지 65,000 달톤의 겉보기 분자질량을 갖는다.
효소는 단백질 mg 당 적어도 대략 25mU, 바람직하게는 적어도 대략 50mU/mg 단백질의 효소 비활성을 나타내도록 정제되었다. 단백질 mg 당 약 150mU이상의 비활성(specific activity)이 특히 바람직하다. 알파-아미드화 효소는 또한 도데실 황산나트륨/폴리아크릴아미드겔 (SDS-PAGE) 상에서 전기영동 후단일의 균일한 잘 규정된 띠를 나타내도록 정제되었다.
정제된 펩티딜-클리신 α-아미드화 모노옥시제나제는 말단 글리신 잔기를 갖는 폴리펩티드의 알파-카르복실기를 아미드화하는데 사용되는데 여기서 글리신은 아미노기 공여체로서 작용한다. 기질펩티드 또는 폴리펩티드는 천연공급원으로 부터 정제될 수 있으며 그의 성분 아미노산으로 부터 합성되거나 또는 재결합 DNA 기법으로 제조될 수 있다. 글리신 말단의 폴리펩티드는 효소 유효량의 존재하에 산소와 결합된다. 요구된 효소의 양은 본 분야에 공지된 몇가지 변수들에 의존하는데 특히 다음을 포함하나 이들에 제한되지는 않는다. 다음 : 주어진 효소제제의 비활성, 전환되는 기질의 양 및 화학적 성질, 전환이 일어나는 시간 및 반응혼합물의 온도와 pH. 본분야 숙려자는 주어진 상황에서 요구된 효소의 정확한 양에 영향을 미칠 수 있는 다른 변수들을 인정할 것이다. 산소는 보통 기질농도에 비하영 반응에서 1몰 과량으로 보통 존재한다. 구리이온의 원하는 농도는 음이온이 반응에 불리하게 영향을 미치지 않는 어떤 구리염에 의해서도 제공 될 수 있다. 단지 약 1 mU/mg 단백질의 효소 비활성을 갖는 효소로는 최대 알파-아미드화가 야 4 μM 제 2구리이온의 비교적 높은 농도로 일어난다. 효소의 순도가 증가함에 따라, 외인성 구리이온에 대한 농도요구가 감소한다. 효소활성은 또한 어떠한 아스코르브산염에 의해서도, 그 염의 양이온이 반응에 불리하게 영향을 미치지 않는 한 제공될 수 있는 아스크르베이트 이온의 존재에 의해 향상될 수 있다. 대략 50mU/mg 단백질의 효소 비활성을 갖는 정제된 효소에 재해 알파-아미드화의 최대활성은 약 5mM 아스코르베이트에서 일어난다. 알파-아미드화 활성은 카탈라제의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 생물학적 관련기질의 아미드화 생성물로의 전환을 위한 최적 pH는 6.5와 7.5 사이이다.
효소에 관한 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 호모제니어스 효소를 항원으로 사용하여 각각 쥐와 닭에서 면역반응을 일으킴으로써 얻었다. 모노클로날 및 폴리크로날 항체는 둘다 실시예 8에 제시된 바와 같이 본원인에 의해 제조되고 정제되었다. 알파-아미드화 효소에 특이적인 항체의 목록은 본원인의 실험실에 유지되어 있다.
항체는 사용되는 매체에 용해성이 아닌 고체 매트릭스상에 고정화 될 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스는 분해에 저항성인 것이다. 매트릭스는 단백질을 결합할 수 있는 작용기를 갖추고 있는데 여기서 관능기는 그때 항체에 공유 결합된다. 이러한 항체의 고정화는 천연 및/또는 재결합 공급원으로부터 α-아미드화 효소의 분리를 용이하게 할 것이다. 이것은 고정화된 항체를 효소의 미정제 제제와 혼합함으로써 달성된다. 항체는 α-아미드화 효소분자를 특이적으로 결합할 것이다. 오염되어 있는 단백질은 항체에 결합하지 않게 되며 용리 또는 온화한 원심분리에 의해 쉽게 제거된다. 오염물의 제거 후, α-아미드화 효소는 이온강도 또는 pH의 변화에 의해, 또는 카오트로픽 이온의 첨가에 의해 (어피니티 크로마토그라피: 원리 및 방법, 매뉴얼, 파마시아 화인 케미칼스, 업살라, 스웨덴) 고정화된 항체로부터 제거될 수 있고 고도로 정제된 형태로 회수될 수 있다.
효소는 또한 충분히 정제되어 그의 아미노산 서열이 결정되도록 허용한다. 이 정보는 효소를 코드하는 핵산을 분리하는데 이용되었다.
적절한 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로 부터 분리된 숙주세포로의 후속병합은 여기에 참고로 포함되는 분자 클로닝(Maniais, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982 ; 또는 Wu, R., ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, 1979)에서 발견되는 바와 같은 표준 재결합 DNA 과정에 의해 달성된다. 알파-아미드화 효소를 코드하는 비대응(heterologous)DNA를 함유하는 결과 세포는 시험관내에서의 번역후 알파-아미드화를 수행하기 위해 충분량의 효소의 제조를 허용하며 이론상 이들세포로 하여금 체내에서 펩티드 또는 폴리펩티드의 이 수정을 허용한다.
본 발명은 그의 바람직한 구체예와 관련하여 기술되나, 많은 변경 및 수정이 본 분야 숙련자에게 명백할 것이다. 발명의 바람직한 구체예는 다음의 실시예에 의해 더 예시한다.
실시예 1
MTC 종양으로 부터 알파-아미드화 효소의 정제 방법
동결된 쥐 MTC 종양을 미세한 단편으로 분쇄하고 250mM 수크로오스, 0.25% N-아세틸 글루코피라노시드, 0.1mM PMSF, 20 g/ml 펩스타탄 및 100 g/ml 대두 트립신 억제제를 함유하는 150mM 트리스 pH 7.5에 호모제나이즈 시킨다. 전형적으로, 25그램의 종양조직을 얼음상의 상기 완충액 200 ml에 호모제나이즈 시켰다.
호모제나이즈는 폴리트론 호모제나이저(Brinkman)를 사용하여 7의 세팅에서 각각 20초의 4버어스트(burst)에 의해 달성되었다. 호모제네이트를 JA-20 회전자(Beckman)에서 9,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하고 상징액 (상징액 1)을 따랐다. 펠릿을 호모제나이즈 완충액 60ml 에 7의 세팅에서 각각 20초의 3버어스트 동안 제호모제나이즈 시켰다. 이 제2의 호모제네이트를 9,000 x g 에서 15분간 마찬가지로 원심분리하였다. 이 원심분리로 부터의 상징액(상징액2) 을 상징액 1과 합하였다. 합한 상징액 1과 2를 다음에 4℃ 에서 SW 28 회전자(Beckman)에서 100,000 x g 에서 30분간 원심분리하였다. 투명해진 호모제네이트 (상징액 3) 에 충분한 황산암모늄 결정을 첨가하여 황산암모늄 중의 25퍼센트 용액을 만들었다. 결정의 첨가는 4℃ 에서 호모제네이트의 일정한 교반하에 15분의 기간에 걸쳐 점차적으로 행해졌다. 4℃ 에서 30분 더 교반후, 혼합물을 4℃ 에서 JA-20회전자(Beckman)에서 27,000 x g 에서 15분간 원심분리하였다. 상징액을 따르고 상징액에 황산암모늄을 더 첨가하여 황산암모늄중의 40퍼센트 용액을 만들었다. 30분 더 교반후, 혼합물을 다시 상기와 같이 27,000 x g 에서 15분 원심분리하였다. 이 원심분리로 부터의 상징액을 버리고 호모제네이트에 적어도 50퍼센트의 총 효소활성을 함유한 펠릿을 50mM트리스 HCl pH 7.0에 재현탁시켜 시료를 형성시켰다. 활성은 8.2 mU/mg 단백질이었다.
세파크릴 S-300 겔 여과 크기 배타 크로마토그라피
세파크릴 S-300(파마시아)을 제조업자의 지시에 따라 50mM 트리스 HCl pH 7.0 에 평형화시키고 K 50/100 컬럼 (파마시아)에 부었다. 컬럼의 베드 부피는 대략 1.3 리터이었다. 시료를 컬럼의 베드부피의 대략 3 퍼센트를 나타내는 부피로 컬럼상에 적하시켰다. 단백질을 분당 대략 2ml의 유속으로 50mM 트리스 HCl pH 7.0 에서 컬럼으로 부터 용리시켰다. 10ml 의 분율을 수집하고 댄실-D-Tyr-Val-Gly 기질을 사용하여 알파-아미드화 효소활성에 대하여 검정하였다. 효소를 제 1도에 나타낸 바와같이 60,000 내지 65,000 달톤의 분자질량을 가진 단일 피이크로 컬럼으로 부터 용리하였다. 활성은 적어도 50mU/mg 단백질이었다.
pH 6.0 에서 모노 Q 크로마토그라피-강력 음이온 교환 크로마토그라피
최대 효소활성을 함유하는 세파크릴 S-300 컬럼으로 부터의 분율을 모으고 20mM 비스-트리스 pH 6.0 완충액 4 리터에 대해 투석하였다. 다음에 모은 것을 제조업자의 지시에 따라 전처리하고 20mM 비스-트리스 pH 6.0 에서 평형화시킨 모노 Q HR 5/5 컬럼 (파마시아)상에 적하 시켰다. 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 컬럼 용출액 (통과된 것) 에 수집한후, 결합된 단백질을 20mM 비스-트리스 pH 6.0 에서 0 내지 300mM NaCl 의 선형염구배로 용리하였다. 컬럼을 분당 0.5ml 의 유속으로 흘리고 각각 2ml 의 분율을 수집 하였다. pH 6.0에서 모노 Q 컬럼으로부터 용리하는 단백질의 용액을 즉시 1.0M 트리스 pH 7.0의 각각 200 l를 함유하는 관에 수집함으로써 중화시켰다. 분율을 전과 같이 알파-아미드화 효소활성에 대해 검정하고 대략 160mM NaCl 에서 컬럼으로 부터 용리된 활성의 피이크를 관찰하였다 (제 2도). 활성은 161mU/mg 단백질이었다.
pH 8에서 모노 Q 크로마토그라피
pH 6.0에서의 모노 Q 크로마토그피로 부터의 피이크 알파-아미드화 효소활성을 함유하는 분율을 50mM 트리스 HCl pH 8.0 의 각각 4리터의 두가지 변화에 대해 투석시켰다. 다음에 효소를 50mM 트리스 HCl pH 8.0으로 평형화시킨 모노 Q HR 5/5 컬럼(파마시아)상에 적하시켰다. 단백질을 50mM 트리스 HCl pH 8.0 에서 0-300mM NaCl 의 염구배로 용리시켰다. 분당 0.5ml 의 유속을 사용하고 2ml 분율을 수집하였다. 각 분율을 각각의 수집관에서 1.0 M 트리스 pH 7.0 200 l의 첨가에 의해 중화시켰다. 각각 190mM NaCl 과 220mM NaCl 로 용리하면서 두개의 두드러진 피이크의 효소활성이 나타났다 (제 3도).
활성은 각각 적어도 80mU/mg 단백질과 400mU/mg 단백질이었다.
pH 8.0 에서의 모노 Q 크로마토그라피로 부터의 효소 피이크 분율의 겔 전기 영동
408mU/mg 단백질의 활성을 갖는 220mM NaCl 에서 용리하는 효소 피이크 분율의 알리큇을 SDS와 B-메르캅토에탄올을 함유하는 완충액에서 열변성 시킨후 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 적하시켰다 (제4 도). 220mM NaCl 에서 용리하는 분율로부터 단일띠가 관찰되었다. 이 띠의 겉보기 분자질량은 대략 73,000-75,000 달톤이다.
알파-아미드화 효소로서 73,000-75,000 달톤 띠의 확인 입증
상기한 것들에 동일한 평가기준을 사용하여 정제된 추가의 알파-아미드화효소 제제로부터, 알리큇을 비-변성 10% 아크릴 아미드 겔 상에서 전기영도에 사용하였다. 50㎕ 알리큇을 두 통로 각각에 적하시켰다. 전기영동 후, 한 통로상의 단백질을 은 염색법을 사용하여 시각화하였다. 각각 3mm의 제 2통로 스트립을 자르고 각 스트립을 마이크로타이터 판의 한 웰에서 배양시켰다. 각 웰에 댄실 기질, 카탈라제, 아스크로브산 및 150mM 트리스 pH 7.0을 함유하는 혼합물 100㎕ 를 첨가하였다. 일정하게 흔들면서 37℃ 에서 16시간동안 배양을 행하였다. 각 웰로 부터의 알리큇을 다음에 기질의 아미드화 생성물로의 전환에 대해 분석하였다. 효소활성은 두 겔 스라이스에서 발견되었다. 활성은 해당 염색된 겔에서의 강하게 염색된 단백질 띠와 함께 이동하였다. (제5도)
실시예 2
재결합 사람 캄시토닌의 제조방법
사람 칼시토닌은 그의 카르복실 말단에 아미드화된 프롤릴 잔기를 지니는 32-아미노산 펩티드 호르몬이다.
미생물은 사람 칼시토닌에 해당하는 아미노산 서열을 함유한 재결합 융합 단백질을 제조하기 위해 유전공학 처리되었다. 융합 단백질 유전자는 사람 칼시토닌 서열을 그의 아미노말단 상의 알기닐 잔기에 의해 묶고 그의 카르복실 말단을 또한 재결합융합 단백질의 말단에 있는 글리실 잔기에 의해 묶도록 설계되었다. (제 7도 참조). 적당한 융합 플라스미드를 형성하기 위한 사람 칼시토닌 유전자의 플라스미드로의 연결반응에 따라, 미생물은 이 플라스미드로 형질전환되고 융합의 발현이 얻어졌다 (제 6도 참조). 이 사람 캄시토닌-함유 단백질을 침전에 의해 재결합 미생물의 용해물로 부터 분리하였다. 시스테이닐 잔기를 다음에 S-술포네이트로 전환시키고 리실 잔기를 시트라콘산 무수물과의 반응에 의해 역 차단시켰다. 사람 칼시토닌은 알기닌을 함유하지 않기 때문에 재결합융합 단백질의 트립신 소화느 카르복실 말단 글리신 익스텐션을 가진 사람 칼시토닌 서열을 함유하는 펩티드를 가져왔다. 이 펩티드는 역상 HPLC(제8도 참조), 또는 이온 교환 크로마토그라피에 의해 분리되었고 그의 구조는 아미노산 및 마이크로 시퀸스 분석에 의해 확립되었다.
펩티드의 글리실 잔기는 제거되었고 끝에서 두번째의 프롤릴 잔기는 본 발명의 알파-아미드화 효소의 작용에 의해 프롤린 아미드로 전환되었다. 이 펩티드의 준 예비규모의 알파-아미드화에 사용된 조건의 예는 다음과 같다 : 동결건조된 펩티드 (200-300나노물)(기질)는 대략 750 μU 의 알파-아미드화 효소제제를 함유하는 pH 7의 150 mM 트리스-HCl 완충액 200㎕에 용해되었다. 효소는 쥐 MTC 조직이나 아니면 쥐 MTC CA-77 세포주로 부터 산란된 조직배양매체로 부터 유도되었다. 효소는 모든 단백질 분해활성이 제거될 정도로 정제되었다. 이것은 이온교환과 크기배타 크로마토그라피의 조합에 의해 달성되었다 (전술란 방법 참조). 순수한, 호모제니어스 효소가 필요조건은 아니다. 다음에 아스코르브산과 황산구리를 대략 각각 3mM 과 2 μM의 최종농도를 산출하기에 충분한 양으로 이 혼합물에 첨가하였다. 결과 용액을 혼합하고 37℃ 에서 5-6시간동안 배양하였다. 기질의 생성물에 대한 전형적인 전환 백분율은 70-90% 이다. S-술폰산염 기의 제거에 이어서, 재결합 사람 칼시토닌(rhCT)을 역상 HPLC에 의해 정제하였다 (제 9도 참조). 최종 생성물은 역상 HPLC 상의 보유 (제10도참조), 정량적인 트립신 맵핑 (제11도 참조), 아미노산 분석 (표1참조), 및 그의 생물학적 활성 (제12도 참조) 으로 특징지어진다. 모든 경우에, 재결합 살마 칼시토닌은 합성 사람 칼시토닌과 구별 불가능하였다.
전술한 바는 본 발명의 제제가 재결합 DNA 기법에 의해 제조된, 즉, 단지 L아미노산만을 함유하는 생리학적으로 관련된 기질, 예를들면 사람 칼시토닌을 아미드화할 수 있다.
비교실시예
특허청구된 제제활성의 종래기술과의 비교
특허청구된 제제의 비활성을 결정하기위한 검정시스템의 비교
몇가지 활성 검저(assay) 시스템이 종래기술에서 사용되었다. 종래기술과 같이 인용된 대부분의 작업은 D-Tyr-Val-Gly 의 D-Tyr-Val-아미드로의 전환을 기초로한 검정을 사용하였다. 이 검정은 과량의 비 표지된 물질(D-Tyr-Val-Gly)과 혼합되는 방사표지된 트레이서 (125I-D-Tyr-Val-Gly)의 사용에 의해 정량 분석된다.
표지된 트레이서의 전환의 측정은 비표지된 물질로의 외삽을 허용하고 이것은 차례로 활성의 계산을 허용한다.
이 검정이 본원인에 의해 사용되었고, 특허청구된 제제의 활성 결정은 댄실-Try-Val-Gly의 댄실-Tyr-Val-아미드로의 전환의 직접 측정을 기초로 한다.
종래기술에서의 제제의 비활성의 본 발명의 특허청구된 제제의 비활성과의 의미있는 비교를 허용하기 위해 검정시스템을 비교하는 실험을 수행하였다. 실험 프로토콜은 다음과 같이 요약된다:
I. 모노댄실-L-Tyr-Val-Gly
쥐 수질 갑상선 암종양으로부터 및 CA-77 세포로부터 수집된 조직배양매체로부터 분리된 알파-아미드화효소 제제가 이들실험에서 효소원으로서 사용되었다. 모든 실험에서 사용된 효소의 농도를 주를 단것을 제외 하고는 일정하게 두었다.
모노댄실 치환체의 전환을 위한 반응 혼합물은 5 μl 의 효소,
5μl 의 30 mM 아스코르베이트,
5μl 의 20 M CuSO4,
5μl 의 100 g/ml 소 췌장 카탈라제
2 nmoles 을 함유하는 5 μl 의 기질,
25μl 의 150mM TES pH 7.0 을 함유하였다. 시료는 2중으로 제조하고 37℃ 에서 10, 20 및 30분의 시간
동안 배양하였다. 효소반응은 10 l 500mM EDTA의 첨가에 의해 중지시켰다. 기질과 생성물을 Hewlett Packard-1090 액체 크로마토그라피 시스템에 의해 분리하고 정량은 HP-3392 인테그레이터를 사용하여 달성되었다. 모노댄실 L-Tyr-Val-Gly 의 알파아미드화 생성물로의 전환을 시간에 대하여 선형임이 증명되었다.
II.125I-D-Tyr-Val-Gly
D-Tyr-Val-Gly 와 D-Tyr-Val-NH2 를 피어스 케미칼 컴패니로 부터의 요오도비드를 사용하여 요오드화시켰다. 방사표지된 기질과 생성물을 술필-프로필 양이온-교환컬럼을 검정하는데 사용하였다.
125I-D-Tyr-Val-Gly를 650 μM D-Tyr-Val-Gly에 첨가하고 기질로서 사용하였다. 모노댄실 기질의 전환을 위한 반응혼합물은 5 μl 의 효소,
5μl 아스코르베이트(30 mM),
5μl 의 100 g/ml 카탈라제,
5μl 의 20 M CuSO4,
5μl 의 기질, 650 M 최종농도,
25μl 의 150mM TES pH 7.0 을 함유하였다.
시료를 37℃ 에서 10, 20 및 30분동안 배양시켰다. 반응은 500mM EDTA의 첨가에 의해 중지되었다. 전체 시료를 10mM 인산나트륨 완충액 pH 5.2 로 희석하고 술필-프로필 양이온 교환 컬럼에 적용시켰다. 기질은 컬럼에 결합하지 않으며 아미드화된 생성물은 500mM NaCl로 용리시켰다. 방사표지된 기질의 생성물로의 전환은 시간에 대해 선형이었다.
III. D-Tyr-Val-Gly
D-Tyr-Val-Gly의 아미드화에 사용된 반응 조건은 댄실 및 요오드화 기질에 대해 기술된 것과 동일하다.
반응혼합물에서의 기질농도는 650 M 이었다. 기질과 생성물의 분리는 HP-1090 액체 크로마토그라피 시스템을 사용하여 RP-HPLC 상에서 기을기 용리에 의해 달성된다. 컬럼 유출액을 280nm에서 모니터 하였다. 이 검정에 대한 감도의 수준은 댄실이나 아니면 요오드화 기질에 대한 것보다 훨씬 더 낮다. 이 낮은 수준의 감도를 조정하기 위해, 알파-아미드화 반응을 장기간동안 수행하고, 또는 증가된 양의 알파-아미드화 효소로 수행하였다.125I-D-Tyr-Val-Gly의125I-D-Tyr-Val-아미드로와 댄실-Tyr-Val-Gly의 댄실-Tyr-Val-아미드로의 분별 전환을 위한 데이타의 분석은 각 시간점에서 댄실 기질보다 요오드화 기질이 대략 1.55배 더 전환되었음을 증명한다. 따라서, 종래기술의 검정 시스템을 본원인에 의해 사용된 검정 시스템과 비교할때, 댄실-기질법에 의해 (본원인이) 구한 활성의 대략 1.5배의 전환인자를 사용해야 한다.
더우기, 다소 더 엄격한 동역학적 분석이 또한 댄실-Tyr-Val-Gly(본원인의) 검정을 D-Tyr-Val-Gly(종래기술의) 검정과 비교하는데 사용되었다. 이분석은 다음을 가리킨다.
기질 km Vmax
D-Tyr-Val-Gly 37 31

Claims (12)

  1. 펩티딜 글리신 알파-아미드화 모노옥시제나제를 코드하는 분리된 DNA서열로서, 상기 DNA 서열은 하기의 프로브들로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드화할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 서열:
    Figure kpo00011
  2. 제1항의 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환 또는 트랜스젝트된 원핵 또는 진핵 숙주세포.
  3. 펩티딜 글리신 알파-아미드화 모노옥시게나제(PAM)의 제조합체 발현 방법으로서, 제2항의 숙주세포를 상기 PAM의 발현을 허용하기에 충분한 시간동안 배양하는 단계, 및 상기 PAM을 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 발현 방법.
  4. 아미드화된 펩티드를 제조하는 방법으로서, C-터미날 글리신을 갖는 펩티드를 제3항의 방법에 따라서 제조함으로 생성된 펩티딜 글리신 알파-아미드화 모노옥시게나제의 존재하에서 산소 및 환원제와 접촉시키는 것으로 이루어지는 아미드화된 펩티드 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 DNA가 프로브 AE8 및 AE9와 하이브리드화할 수 있는 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 DNA 서열이 펩티딜 글리신 알파-아미드화 모노옥시게나제를 코드화하는 래트 유전자의 것과 동일한 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 DNA 서열은 겔 여과 크로마토그래피에 의해 측정시 60,000과 65,000달톤 사이, 그리고 황산도데실나트륨/폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정시 73,000과 75,000달톤 사이의 겉보기 분자량을 갖는 알파-아미드화 효소를 코드화하는 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 DNA 서열이 펩티딜 글리신 알파-아미드화 모노옥시게나제를 코드화하는 포유동물 유전자와 동일한 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 DNA 서열은 산성 최적 pH를 갖는 알파- 아미드화 효소를 코드화하는 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 DNA 서열은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 단편을 포함하는 아미노산 서열을 코드화하는 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법:
    (a) -Ser-phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp- Phe-Ala-Leu-AspIlc-Arg-Met-Pro-i
    (b) -Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg-i 및
    (c) -Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-.
  11. 제4항에 있어서, 상기 DNA 서열은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 단편을포함하는 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
    Figure kpo00012
    및
    Figure kpo00013
  12. 제4항에 있어서, 상기 알파-아미드화 효소는 적어도 1500 mU/mg 단백질의 비활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아미드화된 펩티드 제조방법.
KR1019880010344A 1987-08-14 1988-08-13 알파-아미드화 효소를 코드하는 dna서열 및 아미드화된 펩티드 제조방법 KR0136611B1 (ko)

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