JPH022351A - インターロイキン―１受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）′１：Ｉ束のｔｌ　ｉ４；ｉ　）本発明は、す（
ｌ・カイン受容体、更に詳細には、インターロイキン−
１受容体に関するものである。

インターロイ；Ｖノー１α及びインターロイキン１β（
以下ｒＬ−Ｌα及びＩＬ−１βという）は、免疫及び炎
症応答において中心的役割を果たす遠縁のポリペプチド
ホルモンである。これら二つのタンパク質は、その共通
した白血球活性化因子（ＬＡＩ”）活性に基づいて本来
ｒＬ−１として分類されており、また主に共通した細胞
、即ち活性化された大食細胞（マクロファージ）を起源
としている。精製された天然の及び組換えＩＬ−１分子
を用いた研究から得られる情報が蓄積するにつれて、Ｉ
Ｌ−１α及びＩＬ−１βが各々全てではないにしろ、こ
れまでＩＬ−１が有していると考えられていた広い範囲
にわたる活性の大部分を担っていることが明らかとなっ
てきた。生物学的活性が殆ど同一のスベクｌ〜ルを持つ
理由は、ＩＬ−１α及びｒＬ−１β両者に結合する細胞
膜の受容体がただ一つのクラスしかないためであると考
えられている。

ＩＬ−１の細胞膜上の受容体の存在に関する、いくつか
の予備的報告がこれまで発表されている。

今日まで、インターロイキン−１受容体の構造的分析は
、ゲルＰ３ａ、あるいは受容体と１２５ＩＩＬ−１分子
との間に化学的架橋を施すことにより生じた共有結合複
り体のＳ　Ｄ　５−１）　Ａ　Ｇ　Ｅによる分析、及び
標識された表層タンパク質の免疫沈澱によって、本タン
パク質の分子量を推定することだけに限られてきた。

ドウニー　（［）　ｏｖｅｒ）ら（史ユヱ五しヨＡｅｄ
、　１６２：５０１゜１９８５）　、並びにドウニーら
（Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１ｌ。Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：１０６０，１９８Ｂ）は、化
学的架橋法について述べ、ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５ネズ
ミＴリンパ腫細胞には、１２５■−標識したヒトのイン
ターロイキン−１βに結きするような、明らかな７９．
５キロドルトン（ＫＤａ）の細胞膜タンパク質があり、
ネズミ４Ｊ！維芽細胞系列にも７８ＫＤａの表層タンパ
ク質があることを示している。キリアン（１（ｉｌｉａ
ｎ）ら（Ｊ　、　ｌｎｍｕｎｏｌ、　１３６：４５０９
，１９８６）は、ネズミ胸腺腫細胞Ｉ＼のネズミ１２５
１−　Ｉ　Ｌ−１αの結合が、ヒトｒｔ−−ｔα及びｒ
＋−−ｉβにより妨害されることを報告した。ドウニー
（Ｎ　ａｔｕｒｅ３２４：２Ｇ８．１９８６）は、結合
競合実験はＩＬ−１αとＩし一１βがＫＩ３ＲＭ−３３
−ＩＡ５細胞、ヒト皮ＩＮ繊維芽細胞、オ・ズミＤ　Ａ
　Ｌ　Ｂ　−３Ｔ３細胞、及びヒトリンパ芽細胞系列で
＋Ｐ）るＡ　Ｒ＋−１７７上にある同じ細胞表層受容体
に結りすることを示していることを報告した。異なる細
胞系統にある受容体は、似てはいるが同一ではない結合
特性を示した。

ブタ滑液繊維芽細胞（バード（Ｂ　１ｒｄ）ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　　３２４：２６３．１９８６）及びヒト皮膚繊
維芽細胞（チソ（ＣＩ＋ｉ＋＋）ら、　Ｊ　、　Ｅ　ｘ
Ｌ］ム夛、　／６５ニア０，１９８７）にあるＩＬ−１
受容体、標識されたＩＬ−１と架橋されたとき、Ｍ　ｒ
　９７，０００−１００，０００の範囲のサイズの主要
分子種を生ずることが示されており、このことは、Ｍｒ
８０，０００のタンパク質がＩＬ−１に結合しているこ
とを示唆している。それとは対照的に、ヒトＢ４［胞で
同様にして同定されたＴＬ−１受容体（マリシマ（Ｍ　
ａＬｓｕＳｌ＋ｉ＋ｓａ）ら、Ｊ　、　ｌｎｍｕｎｏｌ
、奥：４４９６，１９８Ｂ）は、６０，０００の見掛上
の分子量を示している。プロン（Ｂｒｏｎ）とマツクド
ナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）、Ｄ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ　２１９：３６５（１９８７）は、ＩＬ−１
に対するウサギポリクローナル抗血清を用いて、表面を
標識したＥＬ−４細胞からのネズミｌｌ−１受容体が免
疫沈澱することを明らかにした。この研究から、ネズミ
の受容体は約８２．０００ドルトンのｒｌｌ上上分子量
を持つ糖タンパクττであることが示された。

放射性標識されたＩＬ−１は、化学的架橋法による研究
及び界面活性剤による細胞抽出物中の受容体の検出に用
いられてきた。上に述べたこれらの実験の結果は、Ｍｒ
　６０，０００、あるいはｓｏ、ｏｏｏのタンパク質が
ＩＬ−１との結合を担っていることを示している。また
、細胞に放射性標識したＩＬ−１を架橋することにより
、Ｍｒ８０，０００の主要分子種とは異なる分子が時々
検出され、これはｊＬ−１結合分子がマルチサブユニッ
トの受容体複合体の一部分として膜に存在する可能性を
示唆している。

ＩＬ−１受容体の構造、生物学的特性及びＩＬ−１刺激
に対する種々の細胞集団の応答においてＩＬ−１受容体
が果たす役割を研究し、またＩＬ１受容体を治療、診断
あるいはアッセイにおいて効果的に利用するなめに、均
一な組成をもつＩＬ−１受容体が必要である。そうした
組成物は、培養された細胞により発現された、あるいは
受容体をコードする遺伝子をクローニングし発現させた
可溶性受容体の精製により理論的には得ることが可能で
ある。しかし１本発明以前には、いくつかの障害がこれ
らの最終目標の実現を阻んでいた。

検出可能なレベルでＩＬ−１受容体を発現していること
が知られている細胞系列においても、ＩＬ−１受容体は
細胞の化タンパク質の極めて微量な構成成分としてしか
存在していない。更に、ＩＬ−１受容体を構成的かつ連
続的に高いレベルで発現している細胞系列は全く知られ
ていない。

例えば、ネズミＥＬ〜４６．１細胞系列は検出可能なレ
ベルでＩＬ−１受容体を発現しているが、しかしＩＬ−
１受容体の発現レベルは時間とともに減少していく傾向
があり、このことが精製に有用な開始物質を供給するの
に充分な址の受容体を？ｊ）ろ過程を大いに複雑にして
いる。従って、蛍光活性化細胞選別装置（ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃＣ−ａｃｔｉｌ＋ａｔｅｄｅｅｌ　１ｓｏｒ
ＬｉＢ；　Ｆ　Ａ　ＣＳ　）を用いることによりＴＬ１
受容体を、目的にかなったレベルで発現している細胞と
連続的に選別する方法が考案された。

ＩＬ−１受容体をコードするＡｎ乳動物のｊｎ伝転子ク
ローニングしようという試みに１＋を随する問題は、本
質的なものである。もしタンパクのＮ末端配列を決定す
るのに充分な純度のタンパク組成物が得られたとしても
、遺伝コードの縮重により許通はかなりの量の付加的な
実験作業なしに、適当なプローブを規定することは不可
能である。

ｃＤＮＡライブラリー中にあるハイブリダイズする配列
を同定するために必要な特異性を有するプローブを限定
するには、多くの試みが繰り返し行なわれる必要がある
。この問題を解決するため、受容体を発現するものを直
接クローニングする新たな方法が、未知の特異性を存す
る異った１０−ブを用いて繰り返しスクリーニングする
必要性を避けるために考案された。本方法はこれまで全
く用いられたことがないものであり、受容体をコードす
るｅＤＮＡクローンを含む高発現ベクターによ哺乳細胞
系列に形質移入した結果得られる受容体の発現を直接視
覚化することが可能である。

Ｍ賀された？Ｌ−１受容ｆ本組成物はＩＬ−１あるいは
ＩＬ−１受容体の診断のためのアッセイに有用であり、
また診断、治療で用いるＩＬ−１受容体に対する抗体を
調製する上でも有用である。

それに加え、精製したＩＬ−１受容体組成物はＩＬ−１
を結合あるいは排除する療法に直接用いることが可能な
ため、本すイト力インの免疫あるいは炎症性活性を調節
する手段を提供する。

（発明の構成） 本発明は哺乳類インターロイキンー１受容体（Ｉ　Ｌ−
Ｉ　Ｒ）あるいはそのサブユニットをコードする咽−の
オープンリーディングフレーム（転写解読枠）の核酸配
列からなるＤＮＡ配列を提供する。これらのＤＮＡ配列
は（ａ）　　天然のＩＬ１Ｒ遺伝子のコード領域由来の
核酸配列を持−）ｃＤＮＡクローン、（ｂ）　　適度に
ストリンジェットな条件下で（、）のｃＤＮＡクローン
にハイブリダイズすることが可能で、かつ生物学的に活
性なＩＬ１Ｒ分子をコードするようなりＮＡ配列、及び
（ｃ）　　（、）と（ｂ）において定義されるＤＮＡ配
列に対する遺伝コードの縮重の結果得られ、生物７的に
活性なＩＬ−１Ｒ分子をコードするようなりＮＡ配列か
らなる群から選択される０本発明はまた、上記で定義さ
れるＤＮＡ配列を含む組ＩＱえ発現ベクターと、該発現
ベクターを用いて生産される組換えＩＬ１Ｒ分子、及び
発現ベクターを用いた組換えＩＬ−１１２５）子の生産
方法を提供ずるものである。

本発明はまた、ネズミあるいはヒトＩＬ−１受容体から
なる実買的に均一なタンパク組成物を提供する。ネズミ
のその分子は５ＤＳ−１？ＡＧＥにおいて約８２，００
０ドルトンの分子量を持つ糖タンパクであり、ヒトＩＬ
−１αに対する結き親和性（Ｋ　ａ）は３−６　Ｘ　１
０″Ｍ−’、であり、そしてＮ−末端アミノ酸配列はＬ
ＥＩＤＶＣＴＥＹＰＮＱＩＶＬＦＬＳＶＮＥＩＤ１ＲＫ
である。

もう一つのｒ「様において、本発明は、ＩＬ−１受容体
を含む試事゛ｌを不溶性の支持体に結合したＩＬ、−１
分子を含むアフィニティーマトリックスに通すこと、及
びこのアフィニティーマトリックスから結きしたＩＬ−
１受容体を溶出することからなるＩＬ−１受容体の精製
方法を提供する。部分精製されたＩＬ−１受容体はレク
チンアフィニティーカラムにかけ、続いてＩＬ−１受容
体をレクチンカラムから溶出することにより更に精製す
ることが可能である０次いで、この部分精製ＩＬ１受容
体を逆相系高速液体クロマトグラフィーにかけ、２８０
ｎ−における単一の吸収ピークとして溶出することがで
き、これを５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により分析しな
ところ、単一のバンドであることが明かとなった。上述
の通り、天然のネズミＩＬ−１受容体は、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥによりＩｆｌ定されたように約８２．０００ドルト
ンの見掛上の分子量を持っていた。

本発明はまた、治療、詮所、ＩＬ−１受容体のアッセイ
、あるいはＩＬ−１受容体に対する抗体調製に使用する
ための上述の方法にしたがって調製された有効量の天然
の可溶性受容体あるいは■換え受容体タンパク質からな
る組成物を提供するものである。こうした可溶性組換え
受容体分子は、ＩＬ−１結合に必要でない受容体分子領
域を削除したような、短縮されたタンパク質を含んでい
る。

本発明のこれら、あるいはその他の態様は、以下の詳細
な説明及び添ｆ１の図面に参照することにより明かとな
るだろう。

（図面の簡単な説明） 第１図はネズミ及びヒトＩＬ−１Ｒ遺伝子のコード領域
を含んだｃＤＮＡ構成物の制限酵素地図である。ＥＬ−
４６，１Ｃ１０細胞から単離され、クローンＧＥＭＢＬ
７８中の挿入断片として存在するネズミの断片は、アメ
リカン・タイプ・カルチャー　コレクション（Ａ　ｍｅ
ｒｉｃａｎ　　Ｔ　ｖｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１
ｅｃｔ１０ｎ）に、寄託番号ＡＴＣＣ６７５６３で寄託
されている。

第２図はクローンＧＥＭＢＬ７８のｃＤＮＡ配列を表わ
している。ヌクレオチドには断片の始めから番号が付け
られている。Ｎ−末端をなすロイシン残基を特定するｃ
　−ｒ　ｃコドンは２８２番目の位置に下線で示されて
おり、オーブンリーディングフレームの終わりにある”
ｒＡＧ終止コドンは１９５３番日の位置に下線で示され
ている。

第３Ａ図−第３Ｃ図は、第２図に示されたｃＤＮＡ配列
とそのコード領域から由来するアミノ酸配列を表わして
いる。第３Ａ図−第３Ｂ図において、ヌクレオチド及び
アミノ酸には、成熟タンパク質のＮ−末端を示すロイシ
ン残基から番号が付けられている。第３Ａ図−第３Ｂ図
において、それに代わるネズミＩＬ−１受容体の開始メ
チオニン及びＮ−末端、推定される膜貫通領域に下線が
施されている。

第４図はヒトＩ　Ｌ　−ｌ　Ｒ遺伝子のコード領域を完
全に含むｃＤＮＡ配列を表わしている。ヌクレオチドに
は、Ｒ３Ａと称される断片の始めから番号が（＝ｔけら
れ、これには、Ｎ−末端及び５゛側の短い非翻訳ＤＮＡ
配列が含まれている。Ｎ−末端をなすロイシン残基を特
定するＣＴＧコドンは１３５＃目の位置に下線で示され
ており、オーブンリーディングフレームの終わりにある
ＴＡＧ終止コドンは１７９１番日の位置に下線で示され
ている。

第５Ａ図−第５Ｃ図はヒトＩＬ−１受容体をコードする
ｃＤＮＡ配列と、それに由来するｃＤＮＡのコード領域
のアミノ酸配列を表わしている。第５Ａ［Ｎ−第５Ｂ図
において、ヌクレオチド及びアミノ酸には、成熟タンパ
ク質のＮ−末端を示すロイシン残基（下線）から番号が
付けられている。

２０残基のアミノ酸からなる膜貫通領域もまた下線で示
されている。

第６図は哺乳類の高発現プラスミドｐＤｃ２０１を模式
的に描いたものである。

第６図は実施例６でより詳しく説明されている。

第７図は天然及び組換えＴＬ−１受容体のＩＬ−１結合
特性をグラフで比較したものである。

第７Ａ図は天然のＩＬ−１受容体を発現している細胞（
ＥＬ４６．Ｉ　　Ｃｌ０）あるいは組換えの受容体を発
現している細胞（ＣＯ８−Ｔ　Ｌ−Ｉ　Ｒ＞に対する１
２Ｊ　−Ｉ　Ｌ−１αの直接の結合を比較したものであ
る。

第７Ｂ図は第７Ａ［ｉからのデータをスキャッチャード
座標系に再プロットしたものを示している。

第７Ｃ図は標識されていないＩＬ−１α及びＩＬ−１β
による”’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１αの結合に対する競合反応
を示している。

第７図において、Ｃは結合反応系に加えられたＩＬ−１
濃度（モル濃度）を示し、ｒは細胞膜たりのＩＬ−１分
子の結合数を表している。

第８図は、ネズミおよびヒトのＩＬ−１受容体１１来の
アミノ酸配列の比較である。各々のタンパク質の膜貫通
領域は下線が施されており、保存されたシスティン残基
はアスタリスクで示されている。Ｎ−結合型のグリコジ
ル化を受けうる部位はアスパラギン酸残基に隣接した三
角で示されている。

ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは、明らかに細胞膜にある共
通の受容体タンパク質を介して細胞の代謝を制御してい
る。ＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯ細胞の界面活性剤抽出溶液
から得たＩＬ−１受容体は、ＩＬ−１結合活性を充分に
残したままニトロセルロースに安定に吸着された０本ア
ッセイ系は、ＩＬ−１受容体の精製程度を監視し、受容
体結合活性に対する種々の化学的修飾の効果を調べるた
めに用いられた。ＥＬ−４８，１Ｃ１０４１１１胞から
抽出されたＩＬ−１受容体は、セファロースあるいはそ
の他の適当なアフィニティークロマトグラフィー担体に
結合したＩＬ−１αに結合し、特異的に溶出され得る。

上述の処理による精製の結果、ポリアクリルアミドゲル
を銀染色することによりＭｒ８２，０００ドルトンのタ
ンパク質が同定され、これはＩＬ−１結合活性を示す両
分に存在していた。ＥＬ−４細胞の細胞表面タンパク質
を放射性標識し１２ｓｊ標識された受容体をアフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製した実験により、Ｍｒ８
２，０００のタンパク質が細胞膜上で発現していること
が示された。この試料をＮ−グリカナーゼで処理するこ
とにより、受容体のＭｒ（８２，０００）全体のうち２
１−５３％がＮ−結合型炭水化物であることが示された
。

ＩＬ−４受容体の化学的性質を明らかにするため、界面
活性剤溶液中でのＩＬ−１受容体検出のための、簡素で
再現性のある定量的アッセイ系が考案された。該アッセ
イ系を用いて、受容体の精製過程を追跡することが可能
であり、また受容体の化学的修飾に応じた受容体の結合
活性における変化を容易にモニターすることもできる。

ｒＬ−１に　　る　４アッセイ ヒト組換えＩＬ−１β及びＩＬ−１αは、クロンヘイム
（Ｋ　ｒｏＩ＋Ｉ＋ｅｉ＋ｓ）ら（Ｂ　１０　　Ｅ　ｅ
ｃｈｎｏｌｏ　　　４　：１０７８．１９８６）によっ
て述べられているように、大腸菌（Ｅ　、　ｅｏｌｉ）
で発現させ、均一に精製することにより調製することが
できる。ヒト組換えＩＬ−１αは、むしろＩＬ−１αの
Ｃ−末端１５７残基からなるポリペプチドとして発現さ
れ、これは活性化されたマクロファージによって放出さ
れるＭ「１７．５００の型のタンパク質に対応するもの
である。

この精製されたタンパク質は、３す／ｒ＊１の保存溶液
としてＰＢＳ（リン酸榎街液で緩衝された生理食塩水）
中−７０°Ｃで保存される。保存溶液のうち、小分けし
た１０μｍ（３０μｙ）ｆ！ニドウェーら（Ｎ　ａｚｕ
ｒｅ　３２４：２Ｂ６．１９８６）、及びセガル（Ｓｅ
ｇａｌ）ら（Ｊ　、　１ｍｍｕｎｏ１．１１８：１３３
８，１９７７＞によって述べられた修飾クロラミン−Ｔ
法を用いて（１２’Ｉ）ヨウ化ナトリウムで標識する。

この方法では、リン酸（０，０５Ｍ）緩衝生理食塩水（
０，１５Ｍ）　、ｐＨ７，２（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）ｌＯｔｔ
ｌにン容解したｔｏμｙのｒＩ　Ｌ−１α（０，５７ｎ
ｍｏｌ）に、２５１ｔ１の０　、０５８リン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，０）に溶解した２、５＋ａＣｉ（１，Ｏｎ
ｍｏｌ）のヨウ化ナトリウムを加える６反応は、１．４
×１０−’ＨのクロラミンＴ　（４，２ｎＩＩＩｏｌ　
；シグマ化学株式会社、セントルイス。

ＭＯ，米国）３０μｒ添加することによって開始する。

氷上に３０分分間−た後、反応液をゲル容量１社のバイ
オゲル（Ｂ　１０ｇｅｌ）Ｐ　６　（バイオ−ラッド。

リッチモンド、カリフォルニア州、米国）カラムでゲル
Ｐ遇することにより分画すいる０通常、４０５０％の１
２５１がタンパク質中に取り込まれる。

２Ｊ−ＩＬ−１αはゲルｒ過あるいはその他の適当な方
法によって精製し、放射線による分解を避けるために１
％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１＄
（ｔｗ／Ｖ）アジ化ナトリウム、２０ｍＭ　Ｉ−Ｉ　ｅ
ｐｅｓ　　ｐＨ７，４（結合溶液）から成るロスウェル
・ハーク・、メモリアル研究所（Ｒｏｓｅｌｌ　　Ｐａ
ｒｋＭｅｍｏｒｉａｌ　　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭ
Ｉ））１６４０培地で直ちに希釈して３　Ｘ　１０−”
Ｍの使用可能保存／８液とすることができる。このよう
な希釈液は、−ケガ間まで保存することが可能で、受容
体結合活性の損失は殆ど検出できない。比活性は通常１
−３×１０　”　ｃｐｓ／　ｍｍｏｌｅ（Ｉ　Ｌ　−１
ａ分子当り約１原子のヨウ素に相当）の範囲である。標
識されたタンパク質は、初め（希釈以前）はＥ　Ｌ　−
４６，１Ｃ１０細胞からのＩＬ−２産土を誘起する能力
について測定した場な１００％活性である。更に、１２
５Ｉのｃｐ論の１００％がトリクロロ酢酸によって沈澱
し、９５％以上がＩＬ−１受容体を持つ細胞によって吸
収された。

ＥＬ−４６，１Ｃ１０細胞は、マツクドナルド（Ｍ　ａ
ｃ　Ｄ　ｏｎａｌｄ）ら、Ｊ　、　１ｗｍｕｎｏ１．１
３５：３９６４（１９８５）によって述べられているよ
うに、浮遊培養で増殖する。ＩＬ−１受容体陰性である
変種、のＥＬ−４細胞系、即ちＥＬ−４（Ｍ）（ＡＴＣ
ＣＴＩＢ３９）は、同様な様式で増殖する。細胞は週−
回を基本として１２’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１α結合により、
ＩＬ−１受容体の発現について監視される。

比軸的高いレベルの受容体発現を維持するために、蛍光
活性化細胞選別装置（ＦＡＣ８）と蛍光標識した組換え
体ＩＬ−１αを用いて選別される。

蛍光標識した組換え体ｒＩＬ−１α（ＦＩＴＣＩＬ−１
α）は、総容量７０μｌのホウ酸（０，０２１４）［ｆ
ｉ生理食塩水（０，１５Ｍ＞　、ｐＨ８，５中で、２．
９ｎｍｏｌのタンパク質を１００ｒｖ＋ｏｌのフルオレ
ッセイン＝イソチオシアネート（リサーチオーガニック
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　ｏｒｇａｎｉｃｓ）、クリーブ
ランド、オハイオ州）と３７℃で２時間反応させること
により調製される。ドウニーら（Ｊ　、　　Ｅｘ　、　
Ｍｅｄ、　１６２：５０１゜１９８５）が述べているよ
うに、タンパク質は、ｌｓ１容量のＰ６カラムでゲルＰ
遇することにより、結合していない色素と分離すること
ができる。

ＥＰＩＣ３Ｃ流動細胞計数装置（フロー　サイトメータ
ー）（コウルター計器；４８８ｎＭアルゴンレーザー線
、３００ＭＷ、ゲイン２０．ＰＭＴ電圧１７００）を用
い、最も高い蛍光信号を与える細胞（例えば、要求に応
じて上から１．０＄あるいは０．１％）が集められ、受
容体発現のための細胞培養を確立するために用いられる
。

抽出のために、遠心により培養液から集められた細胞を
結合溶液で一度洗浄し、２０００ｘ、で１０分間沈降さ
せ固まったペレットを得る（約８Ｘ１０”細胞／ｍｌ）
、　１％トリトンＸ−１００とプロテアーゼ阻害剤混合
液（：）ｎＭフェニルメチルスルフォニル＝フルオライ
ド、１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチン、２ｍＭ
０−フェナンスロリン）を含む等容量のＰＢＳをこのペ
レットに対して加える。

ポルテックスで激しく撹拌することにより、細胞を抽出
用Ｍ街液と混合し、この混合液を氷上で１５分間インキ
ュベーションする；インキュベーション後、本混合液を
８℃、３０分間、１１，０ＯＯＸ。

で遠心することにより、核とその他の破片を除く。

上清に０．０２１（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリ
ウムを添加し、８℃あるいは一７０℃で保存するが、ど
ちらの温度でも６ケ月間までＩＬ−１受容体結合活性の
損失は検出されない。

特に示されていない場合、固相結合アッセイには、抽出
液のうちの１μｌ（４ｘ　１０ａＨ胞に相当）を乾燥し
たＢＡ８５／２１ニトロセルロース膜（シュライヒャー
アンドシェル（Ｓｃｂｌｅｌｅｂｅｒ　　＆５ｏｈｕｅ
ｌｌ）、キーン、ニューハンプシャー州）上に置き、乾
燥するまでこの膜を室温に放置する。＋３２燥した膜は
使用するまで室温で保存することができる。この条件下
では、受容体結合活性は２ケ月の間安定に残存している
。使用する前に、膜を非特異的な結合部位をブロックす
るために、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むトリス（０，０
５Ｍ）緩衝生理食塩水（０，１５８）ｐＨ７，５中に３
０分間インキュベーションして戻し、ＰＢＳ（フィルタ
ー当り２０ｍｆ）で２回洗浄し、結合溶液で１度洗浄し
、湿っているうちにＩＬ−１受容体抽出物が中心となる
ように０．９ｃｍ平方に切断する。この正方形の膜を２
４穴のトレイ（コースタ−（Ｃｏｓｔｏｒ）　、ケンブ
リッジ、マサチューセッツ州）に置き、”Ｉ　−Ｉ　Ｌ
−１αあるいは１２’ｌ　−Ｉ　Ｌ−１α及び標識して
いない阻害物質を含む２００μｌの結合溶液で覆う０次
にトレイをニューティター（ｎｕｔａｔｏｒ）上に置き
、冷蔵庫（８℃）中で２時間インキュベーションする。

インキュベーション後、結合しなかった１２５）−ＩＬ
−１αを測定するために各々の穴から６０μｌの試料を
分取する。それい続いて、残った溶液を吸引して除き、
各々の穴に１ｍＺの結合溶液を添加、吸引することによ
りニトロセルロースフィルターを洗浄し、また１ｍｌの
ＰＢＳで３回洗浄する。この正方形のニトロセルロース
フィルターを取り出し、ｒ紙上で乾燥させる。続いて、
この膜をコダ・ンクＸ−ｏｍａｔＡＲフィルム上に一７
０℃で２０時間置くか、あるいは１２Ｘ７５ｃｍのガラ
ス管に入れガンマカウンターで計数する。

「インターロイキン−１受容体」及びｒＩ　Ｌ−１ＲＪ
はインターロイキン−１（ＩＬ−１）分子に結合するこ
とができるタンパク質を示し、哺乳類の細胞膜タンパク
質と同様な本来の立体配置をとる際に、おそら＜：ＩＬ
−１によって与えられる信号を細胞に伝達する役割を持
っていると考えられる。ここで用いられる場合、この用
語はＩＬ−１に結合するかあるいは信号伝達活性を有す
る天然タンパク質の類似物を含んでいる。詳細には、細
胞質及び膜貫通領域を持たない、短縮されたあるいは可
溶型の７Ｌ−１受容体タンパク質も含まれている。第３
Ａ図−第３Ｂ図に描かれている成熟したタンパク質の配
列に対応するネズミのタンパク質の推定分子量は６４．
５９７ドルトンで、一方その前駆体の推定分子量は６６
．６９７ドルトンである。どちらの推定値も一切のグリ
コジル化を計算に入れていない、第５Ａ図−第５Ｃ図に
描かれた成熟タンパク質の配列に対応するヒトのタンパ
ク質の推定分子量は６３，４８６ドルトンであり、その
前駆体の推定分子量は６５，４０２ドルトンである。

［実質的に同一である」及び「実質的に類似している」
は、アミノ酸配列を定義するために用いる場合、特定の
対象となる配列、例えば変異配列が参照配列と一つ以上
の置換、欠失あるいは付加によって変化し、その全体と
しての効果が参照及び対象配列の間に不利な機能的相違
をもたらさないことを意味する０本発明の目的から、３
０パ一セント以上相似性のあるアミノ酸配列を実質的に
類似しているとし、８０パ一セント以上相似性のあるア
ミノ酸配列を実質的に同一であるとしている。

核酸の配列を定義する場合、実質的に類似したアミノ酸
配列をコードする対象核酸配列を全て、参照核酸配列に
対し実質的に類似しているとし、実質的に同一であるア
ミノ酸配列をコードする対象核酸配列を全て、参照核酸
配列に対し実質的に同一であるとしている０Ｍ似性を決
定する目的においては、参照配列の短縮あるいは内在的
欠失は無視している。より低い相似性であるが、同程度
の生物学的活性を有し、同等の発現特性を有する配列は
同等物であるとみなす０本発明で用いる場合、ＩＬ−１
Ｒの「サブユニット」は少なくとも２０アミノ酸からな
るアミノ酸配列を構成するとみなされている。

ここで用いる［組換え体」という用語は、あるタンパク
質が組換え体く例えば微生物のあるいは哺乳類の）発現
系に由来することを意味している。

「微生物の」とは、細菌あるいは真菌（例えば酵母）の
発現系でつくられた組換え体タンパク質を示している。

生産物としての、１組換え体微生物の」という用語は根
本的には、本来の内在性物質ではなく、また本来のグリ
コジル化を受けていないようなタンパク質を定義してい
る。多くの細菌の培養、例えば大腸菌の培養で発現され
るタンパク質にはグリカンが付いておらず；酵母で発現
されるタンパク質は、哺乳動物細胞で発現されるものと
は異なる様式のグリコジル化を受けている。

［生物学的に活性である」という用語は、発明の詳細な
説明におけるＩＬ−１受容体の特性として用いられる場
合、特定の分子がここでｌｎｍｏｌのＩＬ−１受容体あ
るいはＩＬ−１受容体類似体当り少なくとも０．０１ｎ
ｍｏｌのＩＬ−１を結合可能であることが明らかにされ
ている本発明の態様と充分°なアミノ酸配列の類似性を
有するか、あるいはそれに代わるものとしては、特定の
分子が、例えば混成受容体構成物の構成要素として、細
胞にＩＬ−１の刺激を伝達できる充分なアミノ酸配列の
類似性を有することを意味している。好ましくは、本発
明の範囲内で生物学的に活性なＩＬ−１受容体は、ｌｒ
＋＋ｓｏｌの受容体当り０．１ｎ輪ｏ１以上のＩＬ−１
を結合することが可能で、最も好ましいのは、ｌｎｍｏ
ｌの受容体当り０．５ｎｎｏ１以上のＩＬ−１を結合す
るものである。

ｒＤＮＡ配列」は、大きなりＮＡｔ１！成和から分離し
た断片あるいは構成要素として存在するＤＮＡポリマー
を示しており、それらは少なくとも一度は実質的に純粋
な形に単離されたＤＮＡを起源としており、即ち、内在
性物質の混入がない形で単離され、かつ同定、操作、及
び標準的な生化学的方法、例えばクローニングベクター
を用いて、配列及びその構成要素である塩基配列が回収
可能な程度の量あるいは濃度で存在する。こうした配列
は、真核細胞遺伝子に典型的な内在性非翻訳配列あるい
はイントロンによって中断されていないオープンリーデ
ィングフレームを持つ形で供給されることが好ましい、
しかし、関連した配列を含んだ染色体ＤＮＡも用いられ
ることは明らかである。

非翻訳ＤＮＡはオープンリーディングフレームの５′あ
るいは３′にあり、その場合非翻訳配列はコード領域の
操作あるいは発現の妨げとはならない。

「フクレオチド配列」はデオキシリボヌクレオチドのへ
テロ重合体を示している０本発明で供給されるタンパク
質をコードするＤＮＡ配列は、組換え体転写単位中で発
現され得る合成遺伝子を与えるために、ｃＤＮＡｉ片と
短いオリゴヌクレオチドリンカー、あるいは一連のオリ
ゴヌクレオチドから組み立てられたものである。

［組換え発現ベクター」は（１）遺伝子発現において調
節の役割を持つ要素、例えばプロモーターあるいはエン
ハンサ−のような単独又は複数の遺伝的要素、（２）　
＠ＲＮ　Ａに転写され、タンパク質に翻訳される構造あ
るいはコード配列、及び（３）＊当な転写及び翻訳１ｍ
始及び終結配列の集合を含む転写単位からなるプラスミ
ドを示す、酵母の発現系で用いるための構造要素は、翻
訳されたタンパク質が宿主細胞によって細胞外に分泌さ
れるためのリーダー配列を含んでいることが好ましい、
それに代わるものとして、組換え体タンパク質がリーダ
ーあるいは輸送配列を持たずに発現された場合、そのタ
ンパク質はＮ−末端にメチオニン残基を含んでいる可能
性がある。続いて、その残基は発現された組換えタンパ
ク質から随急に切断され、最終産物を与える。

「組換え微生物発現系」は適当な宿主微生物、例えば大
腸菌といった細菌あるいはす」〜が！」辷欠り。

・セレビシェ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの
酵母の、実質的に均一な純粋培養を意味し、これらの宿
主は、組換え体転写単位を染色体ＤＮＡに安定に挿入し
ているか、あるいはその組換え体転写単位を内在のプラ
スミドの構成要素として持っている。一般に、この系を
構成している細胞は単一の祖先形質転換体の子孫である
。ここで定義されている組換え体発現系は、発現させる
ＤＮＡ配列あるいは合成遺伝子に連結した調節要素を誘
導した際に、不均一なタンパク質を発現する。

ＩＬ−１をコード　るｃＤＮＡの ネズミのコード配列を獲得するために、ネズミ細胞系列
ＥＬ−４６，１Ｃ１０から単離したポリアデニル化ＲＮ
Ａの逆転写によって調製されたｃＤＮＡライブラリーか
ら、ネズミＩＬ−１Ｒ（＋ｎＩＬ　　１Ｒ）ｆ！：コー
ドするＤＮＡ配列が単離された。このライブラリーは、
ＳＶ４０とアデノウィルス２由来の調節配列を使った哺
乳類発現ベクター（ｐＤｃ２０１）を用いて、サルのＣ
０９−７細胞に蓄精されたｃＤＮＡ断片を直接発現させ
ることによってスクリーニングした。生物学的に活性な
ＩＬ−１Ｒを発現している形質導入体は形質導入された
ＣＯ３−７細胞を１’Ｉ−ＩＬ−１αを含む培地ととも
にインキュベートし、結合しなかった標識ＩＬ−１αを
除くために洗浄し、そしてその細胞単層をＩＬ−１α結
合の濃度を検出するためにＸ−線フィルムと接触させる
ことによって同定された。このようにして検出された形
質導入体は、比較的明るい背景に対して暗い焦点として
現れる。

この方法を用いることにより、一つの形質導入体のプー
ルについてのアッセイがＩＬ−１α結合の陽性の焦点を
示すまでに、約１５０，０００個のｃＤＮＡが約３５０
個のｅＤＮＡブール中でスクリニングされた。この陽性
のプール由来の細菌の凍結保存品を培養液中で増殖させ
、寒天培地上で単コロニーを作らせ、これについて、検
出可能なＩＬ−１結合活性を持った表面タンパク質を合
成させることができる一つのクローン（クローン７８）
が同定されるまでスクリーニングを行なった。このクロ
ーンは単離され、第２図に示されたネズミのｅＤＮＡの
配列を決定するために挿入断片の配列が調べられた。天
然のネズミ遺伝子の全長の翻訳産物の開始メチオニンは
、第３Ａ図の−１９と−１６の位置にある二つのメチオ
ニン残基の一つである。成熟受容体タンパク質の始めの
アミノ酸残基は、ＥＬ−４６，１Ｃ１０細胞由来の高度
に精製されたＩＬ−１Ｒから得られたＮ−末端アミノ酸
配列との比較によって推定された。この残基は第３Ａ図
の１の位置に示されているロイシン残基である。成熟タ
ンパク質に対応する１６７１核酸をコードする領域は５
７６アミノ酸をコードし、１５個のシスティン残基及び
２１−アミノ酸に渡る膜貫通領域と推定されるものを含
んでいる。膜貫通領域のＮ−末端にＮ−グリコジル化を
受ける部位が７カ所ある。ＧＥＭＢＬ７８と呼ばれるネ
ズミｃＤＮＡ全長を含むクロークローニングベクターは
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロ
ックビル、メリーランド州５米国（＾ＴＣＣ）に、寄託
番号６７５６３で寄託されている。寄託はブダペスト条
約の条件下で行なわれている。

プローブはオ・ズミ配列から栴築され、０ＫＴ３抗体と
Ｉし一２存在下で増殖したしトＴ細胞の培に物から調製
されたヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ために用いられた０次に、ネズミブローブにハイブリダ
イズするｃＤＮＡクローンが単離され、配列決定された
。ヒトｃＤＮＡクローン由来の断片を用いて、１７０７
核酸のヒ゛トのコード配列が得られ、配列決定された。

５゛及び３″非翻訳配列を含む、ヒトｅＤＮＡ核酸配列
は第４図に示されている。ヒトのオーブンリーディング
フレームの配列及びそれに由来するヒトタンパク質のア
ミノ酸配列は、第５Ａ図−第５Ｃ図に示されている０本
配列は、（１７アミノ酸のシグナルペプチドを含む）５
６９アミノ酸を含み、１６個のシスティン残基を含み、
うち１３個はネズミとヒトの間で保存されている。加え
て、このヒト配列は６カ所のＮ−グリコジル化を受は得
る部位を含み、うち５個はネズミとヒトに保存されてい
る。第５Ａ図−第５Ｃ図のアミノ酸配列は、ネズミタン
パク質との比較に基づいてＮ−末端であると考えられる
ロイシン残基がら番号が付けられている。ヒト遺伝子の
推定上のＩＢ！貫通領域は２０アミノ酸の長さである。

ネズミ及びヒト遺伝子の推定上の細胞内領域は高度に（
８７％）保存されており；細胞外（７８％）及びＢ貫通
領域（６３％）は、細胞内ジスルフィド結合及び特定の
Ｎ−グリコシル化部位に含まれると考えられているシス
ティンの位置を除いて、いくぶん低く保存されている。

ヒト及びネズミ逍１云子由来のアミノ酸配列は第８図で
比較されている。

ネズミ及びヒトの遺伝子は、既知のタンパク配列と全く
相同性を持たない細胞内領域を含必須の膜タンパク質及
び免疫グロブリン族の遺伝子群に類似していると推定さ
れる細胞外領域をコードしている。免疫グロブリン様ド
メインは、最小限のアミノ酸の類似性しか示さないが、
ジスルフィド結合によって保持される２つのβ−シー１
へから成る共通した三次横道を有しているのが独特な点
である。いくつかのその池の決定的な影響を持つ残基と
同様、このジスルフィド結合の形成にかかわるシスティ
ン残基は高度に保持されており、同族の殆ど全てのもの
で同一の相対的位置に存在している。免疫グロブリン族
に居する遺伝子は、免疫グロブリンの定常及び可変領域
のみならず、多くが細胞と細胞の間の相互作用にかかわ
っているような、その他の多くの細胞表面分子を含んで
いる。

はとんどの哺乳類の遺伝子と同様に、おそらく哺乳類の
ＩＬ−Ｉｎ、は多エクソン遺伝子によってコードされて
いるのだろう。異なるＭＲＮＡスプライシングにより生
じる別のｍＲＮＡ１ｉ造は、ここで特許請求されている
ｃＤＮＡと広い範囲で同一あるいは類似した領域を共通
に有しており、本発明の範囲に含まれるものとする。

その核酸の態様において、本発明は哺乳類ＩＬ１Ｒをコ
ードするＤＮＡ配列を与える。１甫乳類ＩＬ−１Ｒの実
施例は、霊長類のＩＬ　　１Ｒ、ヒトのＩＬ−１Ｒ、ネ
ズミ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ及びブタのＩＬ
１Ｒを含んでいる。

Ｉ　Ｌ−１ＲＤＮＡは、＋４１ｉ乳類、微生物による調
節を受ける組換え体転写単位、またはウィルスの転写あ
るいは翻訳調節要素内で発現され得る形で提供されるの
が好ましい０例えば、微生物内で発現される配列は、イ
ントロンを含まないものである。

好ましい態様では、本ＤＮＡ配列は少なくとも一つ、し
かし随意に一つ以上のｃＤＮＡ配列あるいはそれについ
ての複製由来の配列成分からなる。

このような配列は、合成オリゴヌクレオチドを組み上げ
ることにより調製されたＤＮＡ配列に連結されているか
、あるいは隣接しているだろう、しかし、もっばらオリ
ゴヌクレオチドから組み上げられた合成遺伝子は、ここ
で与えられた配列情報を用いることによって構築され得
るだろう、典型的な配列は、第３Ａ図−第３Ｃ図に描か
れているヌクレオチドに実質的に同一な配列を含んでい
る。

その代わりとして、コード配列はＮ−末端に位置する、
例えばヌクレオチド配股上で翻訳枠と連結したメチオニ
ンを特定するＮ−末端のＡＴＧコドンのような、一つ以
上のけ前約アミノ酸をコードするコドンを含むだろう。

遺伝子コードの縮重のため、同じアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列にも相当の多様性がある；典型的
なりＮＡの態様は第３Ａ図−第３Ｃ図のヌクレオチド１
−１６７１　、及び第５Ａ図−第５Ｃ図のヌクレオチド
１−１６５６の配列に対応する配列である。その他の態
様は、適度にストリンシュドな条件（５０℃、２×ＳＳ
Ｃ＞の下で、第３Ａ図−第３Ｃ図あるいは第５Ａ図−第
５Ｃ図の配列にハイブリダイズすることができる配列を
含み、その他の配列は生物学的に活性なＩＬ−１Ｒポリ
ペプチドをコードする上述の配列に縮重している。

本発明はまた、有用な量の精製されたＩＬ−１Ｒを生産
するための発現ベクターを提供する。本ベクターは、哺
乳類、微生物、酵母、バクテリオファージあるいはウィ
ルス遺伝子由来の調節要素に使用可能な状態に連結され
た哺乳類のＩ　Ｌ、　１Ｒあるいは生物学的に等価な類
似物をコードする合成あるいはｃＤＮＡ由来のＤＮＡＩ
ＩＪｉ片からなることができる。使用できる調節要素は
以下に更に詳細に述べられる。適当な細胞系列への形質
転換、形質導入あるいは感染によって、このようなベク
ターは組換え体タンパク質の発現ｆ！：誘導することが
できる。

哺乳類ＩＬ−１Ｒは適当なプロモーターの調節の下、哺
乳類細胞、酵母、細菌、あるいはその他の細胞中で発現
され得る。無細胞翻訳系によっても、本発明のＤＮＡ１
成物由来のＲＮＡを用いて哺乳類ＩＬ−１Ｒを産生する
ことができるだろう。

細菌、真菌、酵母及び哺乳類細胞宿主に用いるための適
当なりローニング及び発現ベクターは、ボウエル（Ｐｏ
ｕｗｅｌ）ら（Ｃ１ｏｎｉｎ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ、エルスピユー社、
ニューヨーク州、１９８５）によって述べられており、
ここではそのうちで関連した説明を参照として加えてい
る。

種々の哺乳類細胞培養系が組換え体タンパク質の発現に
用いられ得る。適したｌＪｉ乳類宿主細胞系列の実施例
には、グルラマン（Ｇ　Ｉｕｚｍａｎ）（ＣＣ１２３：
１７５，１９８１）によって述べられたサル腎臓細胞の
Ｃ０９−７系列及び、例えばＣ１２７，３Ｔ３゜ＣＨＯ
、ＨｅｔａおよびＢ　ＨＫ　ａｌ胞系列などの適当なベ
クターを発現可能なその他の細胞系列が含まれている。

哺乳類発現ベクターは複製開始点、適当なプロモーター
およびエンハンサ−のような非転写要素、５°あるいは
３′に隣接する非転写配列、また必須のリポソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー（ｓｐｌ
ｉｃｅ　　ｄｏｎｏｒ）及びアクセプタ一部位のような
５°あるいは３°の非翻訳配列、及び終止配列などを含
んでいる。例えばＳＶ４０複製開始点、初期プロモータ
ー、エンハンサ−、スプライス及びポリアデニル化部位
などのＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列は、異
種ＤＮＡ配列の発現に必要とされるその他の遺伝的要素
を与えるために用いられるだろう。哺乳類高発現ベクタ
ーの組換え体曲乳類ＩＬ−１Ｒの産生への利用に関して
の更に詳細な点については実施ｒＩＡ４．実施例６に与
えられている。典型的なベクターは、岡山とバーブ（Ｂ
ｅｒｇ）（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂ　１０ｌ、　３：２８０，１９８３）によって明らか
にされた通りに構築され得る。

Ｃ１２７ネズミ乳腺表皮細胞で哺乳類受容体ｃＤＮＡを
安定に高レベルに発現させるための有用な系は、コスマ
ン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　２３：９３５，１９８６）によって述べられる
ことに大体において従って構築することができる。

酵母の系もまた、　ツ　ロミセス・セレビシェのような
　−＝　　Ｏ”＋２種を用いるのが好ましいが、本発明
の組換え体タンパク質の発現に用いることが可能である
。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）あるいはフリユベロミセス（
Ｋ　ｌｕ　ｖｅｒ＋＊　ｃｅｓ）などの、その他の属の
酵母もまた組換え体タンパク質の産生株として用いられ
ている。

一般に、有用な酵母ベクターは複製開始点と、例えば大
腸菌のアンピシリン耐性遺伝子と去ＬＬロミセス・セレ
ビシェのＴＲＰ１遺伝子のような、酵母と大腸閉の両方
で形質転換に用いることが可能な選択マーカー及び、下
流のｔ１４造遺伝子の転写を誘導する酵母の高発現遺伝
子由来のプロモーターを含んでいる。このようなプロモ
ーターは３ホスホグリセリン酸リン酸化酵素で（ＰＧＫ
）、α因子、酸性ホスファターゼ及び熱シヨツクタンパ
ク質など高率で発現される遺伝子をコードする酵母の転
写単位由来である。この異種ｔＩｉ造配列配列翻訳開始
及び終止配列並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質
を細胞外の培地中へ分泌することを可能にするリーダー
配列とともに適当な読み枠に組み上げられる０本異質配
列はＮ−末端の同定可能なペプチド（例えば、Ａ　５ｐ
−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｙｓ（Ａ　ｓｐ）　ａ　　Ｌ　ｙｓ
）または、例えば発現された組換え体産物の安定化を行
なうあるいは精製が単純になるような望みの特徴を与え
るその他の配列と含む融合タンパク質をコードする事も
任意にできる。

有用な酵母ベクターは、大腸菌内での選択及び複製のた
めにｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａ　ｍｐゝ遺伝子
と複製開始点）及びグルコースによって抑制されるアル
コール脱水素酵素２（ＡＤＨ２＞プロモーターを含む酵
母のＤＮＡ配列を用いることにより組み上げることがで
きる。

ＡＤＨ２プロモーターはルッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら
（Ｊ　、　　Ｂ１０ｌ、　　Ｃｂｅ＋＋、　２５８：２
６７４，１９８２）とベイヤー（Ｂ　ｅｉｅｒ）ら（Ｎ
　ａｔｕｒｅ　　３００ニア２４，１９８２）によって
開示されている。こうしたベクターはまた、酵ｆ＋Ｔ１
１１１１遺伝子を選択マーカーとして持ち、酵母２μ複
製開始点を含んでいる。酵母リーダー配列、例えば酵母
宿主からの異種タンパク質の分泌を導くα因子のリーダ
ーは、プロモーターと発現される構造遺伝子との間に挿
入されることができる。（りルジャン（Ｋｕｒｉａｎ）
ら、米国特許下４．５４６．０８２号明Ｉｔａ書；クル
ジャンラ、Ｃｅｌ　ｌ　３０：９３３（１９８２）　；
ビッタ−（Ｂ　１ｔｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８１：１９８４＄照されたい）、リーダー配列
はその３゛末端側付近に、外来の遺伝子とそのリーダー
配列の融合を促進するための、一つ以上の有用な制限酵
素切断部位を含むように修飾することが可能性である。

適当な酵母の形質転換法は当業者にはよく知られている
；典型的な技法は、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら（Ｐｒｏ
ｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　
７５：１９７８）によって述べられており、トリプトン
ファン陽性となった形質転換体を、０．６７に酵母窒素
源、０．５ｚカザアミノ酸、２％ブドウ糖、１０μｇ／
ｍｌアデニン、２０μｙ／＋ａｌウラシルから成る選択
培地上で選択する。

ＡＤＨ２プロモーターからなるベクターによって形質転
換された宿主株は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１
％ブドウ糖、８０μｇ／ｍｅアデニン、８０μｇ／ｍｌ
ウラシルを含む栄！！豊富な培地で発現のために生育さ
せる。ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は培地中のブドウ
糖が消費されてしまったときに起きる。■酵母上清はｒ
過によって集められ、続いての精製の前に４℃に保つ。

細菌で使用す゛る有用な発現ベクターは、ＩＳｎ乳類Ｉ
Ｌ−１ＲをコードするＤＮＡ配列を適当な翻訳開始及び
終止信号とともに機能を持つプロモーターに読み枠を合
わせて挿入することによって構築される０本ベクターは
、一つ以上の表現型の選択マーカーと宿主内での増殖を
保証する複製開始点を含んでいる。形質転換に適した原
核生物宿主には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム
（Ｓ　ａｌ＋ｎｏｎｅｌｌａ７エｉｕｍ）、及びシュー
ドモナス（Ｐ　５ｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ）属に含まれる
様々な種ストレプトマイセス（β」コ」１１免１ム■じ
、）、スタフィロコッカス（εｍ幻四旦幻杼−）などが
含まれるが、他のものら選択の対象として取ることもで
きる。

発現ベクターは、成熟タンパク質のＮ−末端残基含コー
ドするコドンに近い部位でｃＤＮＡを切断することによ
って都合良く構築される０次いで、コード領域の欠失し
た部分を「埋め合すせる」ため、あるいは発現ベクター
中の適当な読み枠や開始メチオニンを特定するコドンと
なるようにコード断片を連結するための連結配列を提供
するために、き成オリゴヌクレオチドな用いることも随
時可能である。

制限的な例としてではなく典型的なものとしては、細菌
で用いる有用な発現ベクターは、良く知られたクローニ
ングベクターであるＤＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３）０１７
）の遺伝的要素からなる市販のプラスミド由来の選択マ
ーカー及び細菌の複製開始点を含むことができる。こう
した市販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３　３ｐ（フ
ァルマシア・ファインケミカルズ、ウプサラ、スウェー
デン）及びｐＧＥＭｌ（１０ジエマ・バイオチック、マ
ジノン。

ワイオミング州、米国）などを含んでいる。これらの９
ＢＲ３２２の「主鎖」部分は、適当なプロモーター及び
発現されるｍ造配列と結合している。

特に有用な細菌の発現系は、λファージのＰＬプロモー
ターとｃ１８５７熱不安定なリプレッサーを用いている
。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから
得られるλＰＬ由来のプロモーターを取り入れたプラス
ミドベクターには、大腸菌株ＪＭＢ９（＾ＴＣＣ３７０
９２）に内在した形のｕＨＵＢ２プラスミドと大腸菌株
ＲＲ１（Ａ　１　ＣＣ５３０８２，）に内在した形のｐ
ＰＬｃ２８がある。大腸菌内での発現に有用なその他の
プロモーターとしては、スラブｘ　−（Ｓ　Ｌｕｄｉｅ
ｒ’）ら（Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　１０ｌ、　１８９：
１１３．１９８６）によって述べられているＴ７　ＲＮ
＾ポリメラーゼのプロモーター、ラウェ−（Ｌ　ａｕｅ
ｒ）（Ｊ　、　Ａ　　１．　Ｇｅｎｅｔ、　１：１３９
−１４７．１９８１）によって記載されておりＡ　Ｔ　
ＣＣ３７１２１として得られるＩａｃＺプロモーター、
及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ＞（Ｍｏ！ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　１Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　
Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｃｌ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏａｔｏｒｙ、１９８２．ｐ４１２）によって述べら
れているＡ　Ｔ　ＣＣ３７１３８として得られる匪プロ
モーターがある。

適当な宿主株を形質転換し適当な細胞濃度までその宿主
株を増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方
法（例えば、温度シフトあるいは化学的誘導）で脱抑制
し、細胞を更に短期間培養する。細胞は昔通達心により
集め、物理的あるいは化学的方法で破砕し、その結果生
じた粗抽出液をその後の精製のために残して置く０例え
ば、細胞を最大の通気と激しい撹拌を行なう条件下で、
１０リツトルの培養器中で増殖させる。消泡剤（Ａ　ｎ
Ｌｉｆｏａｍ　　Ａ　）を用いるのが好ましい。培養は
モット（Ｍｏｔｈ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ。

Ｕ　Ｓ　Ａ　８２：８８，１９８５＞によって開示され
た超誘導培地中３０℃で行なうか、あるいはそれに代わ
るものとしては、抗生物質を含んだ培地で培養し、Ａ６
゜０が０．４−０．５に相当する細胞；震度で温度を４
２℃に上げることによって脱抑制し、次いで温度シフト
後、３−６時間が好ましいが、２−２０時間の間に細胞
を集める。細胞は、始め濾過あるいはその他の方法で濃
縮し、次に１０，０００Ｘ９で１０分間、４℃で遠心後
、直ちに細胞のベレットを凍結する。

好ましくは、精製された哺乳類ＩＬ−１Ｒあるいは生物
学的に等価な類似体は、培養液から精製される本発明の
合成遺伝子の組換え体翻訳産物を発現するために適した
宿主／ベクター系を培養することによってＪＩＪされる
。

精製されたＩＬ−１Ｒを生産する別の方法は、細胞培養
上清あるいは抽出液からの精製を含んでいる。この方法
では、有用な量のタンパク質を作る細胞系列を用いる。

そのような細胞系列からの上清は、例えばアミコン社あ
るいはミリボアファルコン社の限外濾過装置といった市
販のタンパク質濃縮ｒ紙を用いて随時濃縮することがで
きる。濃縮操作に続き、濃縮液を既に述べたような適当
な精製用マトリックスにかける。例えば、適当なアフィ
ニティーマトリックスは、適当な支持体に結きしたＩＬ
−１αあるいはレクチンまたは抗体分子などから成って
いる。それに代わるものとして、例えばジエチルアミン
エチル（Ｄ　Ａ　Ｅ　Ａ　）基を持つ担体あるいはマト
リックスのような陰イオン交換樹脂が用いられる。マト
リックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキ
ストラン、セルロースあるいはその他のタンパク質精製
に通常用いられているようなものが使用可能である。

また、その代わりとして、陽イオン交換樹脂を用いるこ
とも可能である。適当な陽イオン交換体とは、スルフオ
プロビル基あるいはカルボキシメチル基からなる種々の
不溶性マトリックスを含んでいる。スルフォプロビル基
が好ましい。

最後に、メチルあるいはその他の脂肪族基を有するシリ
カゲルなどの疎水性充填剤ＲＰ−ＩＩＰＬｃを用いた一
種以上の逆相系高速液体クロマトグラフィー　ＲＰ　−
）ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃを、ＩＬ−１Ｒ組成物を更に精製する
ために用いることが可能である。上述の精製段階のいく
つかあるいは全てを様々に組み合わせることにより、均
一な組換え体タンパク質を得ることが可能だろう。

細菌の培養で生産された組換え体タンパク質は通常細胞
ベレットからの抽出を始めとして、−工程以上の濃縮、
塩析、水相のイオン交換あるいはゲル濾過クロマトグラ
フィーの段階を経て単離される。最後に、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ’）を最終精製段階として用
いることができる。組換え体呻乳類ＩＬ−１Ｒの発現に
用いら゛れた微生物細胞は、凍結−融解の繰り返し、超
音波処理、物理的破砕、あるいは細胞溶解試薬を用いる
など、どのような都合の良い方法によっても破壊するこ
とができる。

哺乳類ＩＬ−１Ｒを分泌タンパクとして発現する酵母の
発酵は精製を大いに容易にしている。大規模な発酵の結
果得られる分泌された組換え体タンパク質はウルダル（
Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ　、　ＣＩｒｒ’ｏ＋１ＩａＦ２９
６：１７１，１９８４）によって明らかにされた方法と
類似した方法によって精製することが可能である９この
引用文献には、組換え体ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの精製のため
の調製用ＨＰＬＣカラ１４における、段階の連続した逆
相系ＨＰ　Ｌ　Ｃ処理が述べられている。

種々の態様において、本発明は内在性物質の混入無しに
、実質的に均一で、本来のグリコジル化様式を伴ったあ
るいは伴わない組換え体曲乳類ＩＬ−１Ｒポリペプチド
を提供している。天然のネズミＩＬ−１Ｒ分子は細胞培
養抽出物から、５ＤＳ−ＰＡＧＥによると約８２キロド
ルトン（ＫＤ）の見掛上の分子量金持つ糖タンパク質と
して回収されてくる。ＣＯ８−７ＭＪ胞などの哺乳類の
発現系で発現されるＩＬ−１Ｒ，は、発現系によって、
本来の分子と預似しているかあるいは僅かに異なる分子
量及びグリコジル化の様式を示す。

大腸菌などの細菌におけるＩ　Ｌ−１ＲＤＮＡの発現に
より、非還元的条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６０４（
Ｄの見掛上の分子量を持ったグリコジル化を受けていな
い分子が生ずる。

本発明の範囲内の組換え木ＩＬ−１４タンパク質はまた
、Ｎ−末端がメチオニンであるようなネズミ及びヒトＩ
Ｌ−１Ｒを含んでいる。さらに別のＲ様には、膜貫通領
域や細胞内ドメインなど特定の領域が欠失し、ＩＬ−１
Ｒ結合ドメインのみを持つ分子を与えるような可溶性の
短縮したものが含まれている。また、Ａｓｐ−Ｔｙｒ　
−Ｌｙｓ　−（Ａ　ｓｐ＞　４　　Ｌ　ｙｓという配列
をもつポリペプチドリーダーまたは微生物中での発現あ
るいは微生物によって発現されたタンパクの精製を助け
るような適当なペプチドあるいはタンパク質配列と融合
されたタンパク質として発現した哺乳類ＩＬ−１Ｒもま
た意図されているものである。

本発明のタンパク質の生物学的に等価な類似体とは、生
物学的活性に不用な末端、あるいは内側の残基または配
列が削られたＩＬ−１Ｒのような短縮された変種のよう
な種々の類似体を含んでいる。ここで意図されているそ
の他の類似物は、つ以上のシスティン残基が欠失してい
るか、中性アミノ酸などの池のアミノ酸に置換されてい
る。

変異を起こすその池の方法には、Ｋ　Ｅ　Ｘ　２タンパ
ク質分解酵素活性存在下での酵母の系での発現を増強す
るための隣接する２塩基アミノ酸の修飾、あるいは一つ
以上のＮ−結合グリコシル化部位を排除するためのタン
パク質配列の修飾が含まれている。

ここで用いられているように、「変異アミノ酸配列」と
は、天然の配列から故意に作られた変種のヌクレオチド
配列によってコードされるポリペプチドを示している。

「変異タンパク質」あるいは「類似体」は、変異アミノ
酸配列を含むタンパク質と意味している。「天然の配列
」は野生型あるいは天然の形の遺伝子またはタンパク質
と同一なアミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列を示し
ている。

ｒＫ　Ｅ　Ｘ　２タンパク質分解酵素認識部位」及び［
Ｎグリコジル化部位」は以下の通り定義されている。本
発明の特定の態様を定義する際に用いられる「不活性化
」という用語は、選択されたＫ　Ｅ　Ｘ　２タンパク質
分解酵素の認識部位にサツカロミセス・セレビシェのＫ
ＥＸ２タンパク質分解酵素による切断を妨げるように変
えるか、あるいは細胞による特定のアミノ酸残基に対す
るオリゴ糖部分の共有結合を妨げるように変えることを
意味する。

部位特異的変異導入法は、残基の欠失、付加あるいは置
換によってＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−
Ａｒｃという対を変化させて、これらの隣接した塩基性
残基が存在しないように排除し、ＫＥＸ２タンパク質分
解酵素による切断部位を不活性化するために用いること
ができる。　Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２による切１斬
をかなり受は難（、ＡｒｇＬｙｓあるいはＬｙｓ−Ａｒ
ｃのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は’Ｋ　Ｅ　Ｘ　２部位を
不活性化するためによく用いられる好ましい方法である
。その結果生ずる類似体は、分泌に際して切断されるこ
とが意図されているような酵母のα−因子のリーダー配
列以外の部位で、ＫＥＸ２による切断をより受は難くな
るのである。

多くの分泌タンパク質は翻訳後、炭水化物単位が共有結
合する必要があり、しばしばＮ−グリコシド結合によっ
てアスパラギンの側鎖にオリゴ多糖単位が連結した形を
とる。特定の分泌タンパク質に結合するオリゴ多糖単位
の構造と数は非常に変化に富み、単一の糖タンパク質に
対しても明らかに広い範囲に渡る分子の質量分布がみら
れる。

ｍＩＬ−１Ｒはこの型の糖タンパク質である０組換え体
系で糖タンパク買を発現させる試みは、この可変性のあ
る炭水化物成分のために生ずる不均一性によって複雑な
ものとなっている０例えば、ヒトあるいはネズミ顆粒球
−大食細胞のコロニ刺激因子（ＧＭ−Ｃ９Ｆ）のような
、組換え糖タンパク質の精製された混合標品は、重量に
してＯ−５０％の炭水化物を含んでいる。ミャジマ（Ｍ
　ｉｙａｊｉｍａ）ら（Ｅ　Ｍ　Ｂ　ＯＪ　ｏｕｒｎａ
ｌ　　５：１１９３１９８６）は、Ｎ−グリコジル化部
位に変異を入れることによりグリコジル化を受けなくな
り、酵母で発現した産物の不均一性が減少した組換え体
ネズミＧＭ−Ｃ３Ｆの発現について報告している。

組換え糖タンパク質に結きした炭水化物の１的変化が存
在することにより、精製法が複雑化し、従って収率も低
下する。加えて、この糖タンパク質が治療薬として用い
られると、披投与者は酵母の炭水化物部分に対する免疫
反応を増大させてしまうため、治療を中断する必要がで
てくる可能性がある。この理由から、炭水化物を減少さ
せた生物学的に活性で均一な免疫調節糖タンパク質類似
体は、治療用途に望ましいものである。

不活性化されたＮ−グリコジル化部位を有する哺乳類Ｉ
Ｌ−ＩＨの機能を有した変異類似体は、以下に述べられ
るようにして、オリゴヌクレオチド合成と連結によりま
たは部位特異的変異処理により調製し得る。これらの類
似体タンパク質は酵母発現系を用いて高収率で均一な、
炭水化物を減らした形で生産し得る。真植生物のタンパ
ク買中のＮ−グリコジル化部位は、二連アミノ酸である
Ａｓｎ−Ａ’−Ｚによって特徴（＝ｆけをなされており
、ここで、Ａ１はプロリンを除く全てのアミノ酸に、Ｚ
はセリンあるいはスレオニンである。この配列において
、アスパラギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミ
ノ基を供給している。こうした部位は、アスパラギンあ
るいはＺについて他のアミノ酸と置換すること、アスパ
ラギンまたは２を欠失させること、Ａ１とＺの間にＺ以
外のアミノ酸を挿入すること、またはアスパラギンとＡ
１との間にアスパラギン以外のアミノ酸を挿入すること
によって排除することができる。置換は、置換されたア
ミノ酸が置換されるべき残基と似た物理化学的特徴を有
しているというように、保存的であることが望ましい、
同様に、欠失あるいは挿入法を用いた場合、生物学的活
性に欠失及び挿入が及ぼす可能性のある影響を考慮に入
れるべきである。

上述の特定の類似体に加え、第３Ａ図−第３Ｃ図及び第
５Ａ図−第５Ｃ図で描かれているヌクレオチド配列の全
長あるいは一部を含む無数のＤＮ＾楕成物が、有用な制
限酵素切断部位を含んだオリゴヌクレオチド断片と合わ
せて、簡便な手段で調製され得る。天然の配列断片と連
結し得るように制限酵素切断部位を隣接させた変異配列
を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特
定の位置に変異を導入することが可能である。連結に続
いて得られる再構成された配列は、所望のアミノ酸の挿
入、置換あるいは欠失をもつ類似体をコードしている。

別法としては、オリゴヌクレオチド−標的部位特異的変
異導入法を用いて、その置換、欠失あるいは挿入を生ず
るよう変化させられた特定のコドンを持つ変異遺伝子を
得ることが可能である。その例として、ワルダー（Ｗａ
ｌｄｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ　４２：１３３゜１９８６）　
、バラｘ　−（Ｂ　ａｕｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ　３７：７
３．１９８５）。

クレイク（Ｃｒａｉｋ）（旦ニア、　Ｊ　ａ　ｎ　ｕ　
ａ　ｒ　ｙ１９８５．１２−１９＞、及びスミス（Ｓ＋
ｗｉｔｈ）ら（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　
：Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　　ａｎｄ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、１９８１）並びに米国特
許第４．５１８°５８４号明細書がこれに適した技術を
開示している。

ここで引用文献に取り入れる。

本発明の一つの態様においては、ＩＬ−１Ｒのアミノ酸
配列はペプチドＡｓｐ　−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ　　Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤ
Ｋ）をコードするヌクレオチドを含むＮ−末端融合構造
を介して酵母α−因子のリーダー配列に連結されている
。

後者の配列は抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗
体によって可逆的に結合を受ける抗原決定基を提供する
。これにより、発現された組換え体タンパク質の迅速な
アッセイと容易な精製が可能となる。この配列はまた、
Ａｓｐ−Ｌｙｓ対の直後に隣接した残基でウシ粘膜エン
テロキナーゼによって特異的に切断される。このペプチ
ドが末端に付いた融きタンパク買は大腸菌の細胞内での
分解に対して低抗性を示す可能性もある。それに代わる
構造物として、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇであり、これはエンテロキナーゼ部位のすぐ
下流に第Ｘ因子認識部位を提供している。

以下の実施例は、例示的に示されているものであり、限
定的なものではない。

実施例Ｉ ＩＬ−１αアフイニテイーマトリツクスの調製と表面標
識したＥＬ−６ＣＩＯ細胞からの受容体のアフィニティ
ー精製 ＥＬ〜４　６．Ｉ　ＣＩＯ細胞の細胞表面のタンパク質
をコスマン（Ｃｏｓ＋ａａｎ）らの発表したグルコース
オキシダーゼ−ラクトペルオキシダーゼ法（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｉ　ｍｔｎｎｎｏｌ、　２３：９３５，１
９８６）により２ＳＴで標識した。標識した細胞を遠心
により沈殿させ、ｐＢｓで３回ン先浄し、１ｚＴｒｉｔ
ｏｎＸ　−４００と先に詳述したアッセイプロトコール
で述べた、数種のタンパク質分解酵素阻害剤の混き物を
含むＰＢＳで抽出した。Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ１００抽出
物はエッペンドルフ（Ｅ　ｐｐｅｎｏｌｏ＋（）１Ｒ量
遠心で１０分間遠心し、上滑を一７０℃で保存した。

組換え体ＩＬ−１αは臭化シアンで活性化したセファロ
ース４Ｂ（ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐ
　ｉｓｃａＬａｗａｙ、　Ｎ　Ｊ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）
またはアフィゲル（Ａ　ｆｒｉｇｅｌ＞　　１０　（バ
イオ−ラッド（Ｂ　１０　−Ｒａｄ）　。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にその製造元が提言
する通りに結合した６例えば、ＩＬ−１α溶液（９，５
＋５ＩＰＢＳ中に１．６４＋＊９／＋ａ１）に、膨潤さ
せて酸で洗浄したＣＮＢＲで活性化したセファロースを
３ｍｌ加えた。この溶液で４℃で一夜振盪し、上清の一
部をＢＳＡを標準に用いてウデンフリエンド（Ｕ　ｄｅ
ｅｎｆｒｉｅｎｄ）らによって記載されたフルオレスカ
ミンタンパク買アッセイによりタンパク質を定量した。

９８％のタンパク質がゲルに結きしたので、カラムへは
最終的にｉゲルあたり５．１ｎｇのＩＬ−１αが結合し
た。ゲル上の未反応部位を全てブロックするために３０
０μｌの１Ｍグリシン−エチル−エステル（シグマ化学
（株）（ＳｉｇｆｆｉａＣｈｅｍｉｃａｌ　　　Ｃｏ、
　　）、ＳＬ、　　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）を懸濁
液に加えた。

ゲルは０．１ｚＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００を含む０．
１Ｍグリシン）Ｉｆｆｒ液ｐｉ（３，０，０，１１Ｔｒ
ｉｔｏｎ　　Ｘ−１００を含むＰＢＳ、ＲＩＰＡ緩街液
（０，０５Ｍ　トリス−ＨＣ１ｐＨ７，５，０，１５８
ＮａＣ４’、１’、、ｇＮＰ４０．１％デオキシコール
酸ナトリウム、０．１＄　５ＤＳ）、及びＱ、１％　Ｔ
ｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００と１０ｍＭ　　ＡＴＰを含
むＰＢＳで徹底的に洗浄°した。小さいカラム（２００
μｌ）を使い捨てのポリプロピレンホルダー（Ｂ　１０
　−Ｒａｄ、Ｒｉｃｌ＋ｍｏｎｄ、ＣＡ　、Ｕ　Ｓ　Ａ
）に作製し、１ｚＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００を含むＰ
ＢＳで洗浄した　＋２５）で標識した抽出物を１００μ
！、カラムに負荷し、次にそのカラムを１ｚＴｒｉｔｏ
ｎ　　Ｘ−１００を含むＰＢｓ、ＲＩＰＡ緩街液、０．
１ｚＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００と１０＋ｎＭ　　Ａ
ＴＰを含むＰＢＳ、及び１ｚＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１０
０を含むＰＢＳで洗浄した。

ネズミのＴａ胞のＩＬ−１受容体はＴｒｉｔｏｎＸ−１
０（１面活性剤溶液中で１ｚｓＩ−ＩＬ−１αに結合で
きる丈夫な横遺体である。上記のアフィニティーマトリ
ックスから受容体を回収するためには緩やかな溶出操作
が必要である。榎やかな酸処理により、形成されていた
ＩＬ−１α／ＩＬ−１受容体複合体の速やかな解離を引
き起こ゛すことができる。この観察に従い、ＩＬ−１α
アフイニテイーカラムから受容体を溶出するために０．
１＄　ＴｒｉＬｏｎ　　Ｘ　−１００を含む０．１ｚＴ
ｒｉｔｏｎＸ　−１００ヲ含ｔｒｐＨ３，０グリシンｖ
ＬｖＲ液を用い、溶出液は０．０５ｍ１毎の画分に集め
られた。両分中の受容体の存在は１２５■で標識したＩ
Ｌ−１αを用いて上記のドツトプロット（ｄｏｔ　　ｂ
ｌｏｔ）により検出した。

ＳＤＳ　　ＰＡＧＥによる分析は以下のように行った０
個々のカラム画分５０μｌに５０μ２の２×ＳＤＳＭｆ
：１ｗｔｆｆｉＭ（０，１２５Ｍ）！Ｊスス−Ｃｌ　　
ｐＨ６，８，４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％
２メルカプトエタノール）を加えた。この溶液を３分間
沸騰水浴中に置き、そのうち４０μ！を１０％ポリアク
リルアミドゲルの試料溝に添加したが、そのゲルはラエ
ミリ（Ｌａｅ＋＊ｍ１ｉ）の方法（Ｎ　ａｔｎｒｅ■７
，６８０．１９７０）に従い作製し、泳動した。ゲルは
０．２５＄コマジ−ブリリアントブルーを含む２５％イ
ンプロパツール、１０％酢酸を用いて固定、染色し、２
５％インプロパツール、１０％酢酸中で脱染し、エンハ
ンス（Ｅ　ｎｌ＋ａｎｃｅ）　にューイングランドヌー
クレア（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ
）。

Ｂｏｓｔｏｎ、ＮＡ、ＵＳＡ）で処理し、乾燥後−７０
℃でコダヅク（Ｋ　ｏｄａｋ）　Ｘ　−ｏｎａｔ　　Ａ
　Ｒフィルムに露光した。ＩＣで標識された分子量マー
カーはニューイングランドヌークレアから購入したもの
で以下の物を含んでいる：チトクロムＣ（Ｍ　ｒ１２，
３００＞　。

ラクトグロブリンΔ（Ｍ　ｒ１８，３６７）、カルボニ
ックアンヒドラーゼ（Ｍ　ｒ３１．０００）　、オバア
ルブミン（Ｍｒ４６．０００）ウシ血清アルブミン（Ｍ
　ｒ６９，０００）　、ホスホリラーゼＢ　（Ｍ　ｒ９
７，４００）及びミオシン（Ｍｒ２００．０００）　、
または、受容体活性を持つ両分はウルダル（Ｕｒｄａｌ
）らによって以前開示された（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ　
８１：６４８１，１９８４）ように、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動と続けて銀染色を行うことにより
分析した。

ＩＬ−１αのアフィニティーマトリックスから溶出され
た両分のドツトプロット分析によれば、ＩＬ−１結合活
性はｐＨ３，０グリシン緩衝液がカラムに添加された後
に集められた両分中に検出された。この検出法で陽性の
価を示した両分から、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合
、銀染色でゲルを現像するとＭ　ｒ８２　、０００のタ
ンパク質が検出されることが明らかになった。銀染色で
検出されるタンパク質のうちいずれが細胞表面に発現さ
れているかを決定するため、ＥＬ−４６，１Ｍ！Ａ胞を
ラクトペルオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼ法に
より１２５■で表面ｖＡ識した。放射性標識された細胞
を次に１％ＴｒｉＬｏｎ　　Ｘ　−１００を含むＰ［ｌ
Ｓで抽出し、この界面活性剤抽出物の一部をＩＬ１αア
フィニティーマトリックスに添加した。このカラムにｐ
Ｈ３，０グリシン［液を添加したｔｎにカラムから集め
られた両分は放射性標識されたＭｒ８２，０００のタン
パク質を含んでいた。

実施例２ 細胞性ＩＬ−１受容体と細胞抽出物から分離されたＩＬ
−１受容体の性質の比軟 予備的な実験で、生きているＥＬ−４６，ＩＣｌ０細胞
中における時と、細胞から抽出した後とでＩＬ−１受容
体の結合能を比較した。　３．８Ｘ１Ｇ’個のＥＬ−４
６，１’Ｃ１０細胞を等しく２つに分け、その一方を上
記の通り抽出した。残りの細胞は３．８×１０１細胞／
Ｉ１１になるよう再懸濁し、直接結合実験に用いた。抽
出物はニトロセルロースに吸着させ、非振ｍ１Ｌ−４の
存在、非存在下での種々の２ＳＩ−ＩＬ−４α濃度にお
ける固相結合実験に用いた。洗浄、乾燥後、ニトロセル
ロースフィルターはまず結合したｌ”Ｉ−Ｉ　Ｌ−１α
の放射性を計測した後、オートラジオグラフィーのため
にフィルムを重ねた。　５．７Ｘ１０−’Ｍの非標識ｒ
ＩＬ−１β存在下で非特異的バックグラウンドを測定し
た。得られたデータによると、”’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１α
はＩＬ−１の濃度依存的にニトロセルロース上の抽出物
に結合し、そして’２５１−　Ｉ　Ｌ−１αはプロット
上の抽出物の存在する領域に特異的に結合した。さらに
インキュベーション混合物に非振ＩＩＬ−１αが含まれ
ていると結合は完全にブロックされた。

さらに比較することにより、両方の場合において受容体
のレベルが同じであるばかりでなく、ニトロセルロース
に吸収された後の受容体は活性のある細胞における受容
体と区別がつかないリガンドに対する親和性を持つこと
が明らかになった。

生きた細胞上に検出される受容体と、界面活性剤抽出を
行った？炎に検出されるそれとの間に数において有意な
差異は認められなかった。このことは生細胞において受
容体の大部分が細胞質膜の外側表面に存在するという考
えと一致する。

ニトロセルロースフィルター上のＩＬ−１受容体の細胞
の特異性を測定するため、２μｌのＥＬ−４６，Ｉ　Ｃ
ＩＯ抽出物をニトロセルロースフィルターに添加、乾燥
、ブロックし、上記のようにアッセイした０次のタンパ
ク質の１２’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１α結合の阻″６ｅ、力を
試験した：即ち、ｒｌＬ−１α（７，６２×１０−７Ｍ
　＞、ヒトｒＩＬ１β（７，６２×１０−’Ｍ）、ヒト
Ｉ　Ｌ　−２（８，９，１０−’Ｍ）　、ネズミＩ　Ｌ
　−３（７，５×１０−　’Ｍ）　、ネズミＧ　Ｍ　−
ＣＳ　Ｆ　（７，５×１０−’Ｍ）　、組換え体ネズミ
Ｉ　Ｌ−４（５Ｘ１０−’Ｍ）、ヒト上皮成長因子３μ
ｇ／ｍ１．線維芽細胞成長因子１μｇ／社、ラット顎下
腺神経成長囚子（２βｇ／　ｍｌ）、ウシインシュリン
（Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ）、ヒト黄体形成ホルモン（１β
ｇ／ｍｌ”）、ヒト成長ホルモン（１，７Ｘ１０−’Ｍ
）、甲状腺刺激ホルモン（１μり／１＾１）、及び卵胞
刺激ホルモン（１βｇ／　＋ａ１）である、インキュベ
ーションは全て１．９Ｘ１０−１’Ｍ　１２５１−Ｉ　
Ｌ　−１α存在下で行った。

この実験は抽出された受容体が、以前に生細胞で示され
ていたのと同じ特異性を保持していることを示した。生
細胞を用いて明らかにされたように、ＩＬ−１αとＩＬ
−１βのみが１２５）　　ＩＬ１αの結合を有意に阻害
した。データは非標識ＩＬ−１αとＩＬ−１βが１２５
Ｉ−ＩＬ−１α結きを〕・９０％阻害するのに対し、他
のいずれのホルモンを用いた場合でも有意なブロックは
観察されなかった。

界面活性剤溶液中の受容体が細胞膜中の受容体あるいは
ニトロセルロースに吸着させた受容体と同等なアフィニ
ティーでＩＬ−１に結合するかどうかを決定するために
、ニトロセルロースドツトプロット結合アッセイを用い
て、Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ１００溶液中のＥＬ−４６，Ｉ
　ＣＩＯ抽出物の固相への１２ｓＩ　−Ｉ　Ｌ−１αの
結合の阻害能を試験する第３の実験を行った。　ＥＬ−
４６，Ｉ　ＣＩＯ抽出物をニトロセルロースに吸着させ
、屹燥、ブロックを行った後、１２’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１
αと界面活性剤溶液中に受容体を含む抽出物の混合物と
共にインキュベートした。

溶液相の受容体の濃度はニトロセルロース上にプロット
された１β２分の飽和結き１ＩＩＩ線から見漬られたが
、これにより受容体数／μ１．而って受容体濃度（Ｍ）
を計算できるのである。抽出物は界面活性剤の濃度を一
定に保つためにＰＢＳ　　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液
（０，５＄　　Ｔｒｉｔｏｎ）で希釈した。阻害曲線か
ら溶液中では受容体は固相もしくは膜上の受容体と同じ
Ｋａ（（４，５土０．５）Ｘ１０’Ｍ−１）で１２５Ｉ
ＩＬ−１αと結合することが明らかになった。さらに単
純競合阻害モデルに基づく理論曲線と実測値がよく合う
ことは、膜抽出物中に一種類のＩＬ−１結合タンパク質
が存在するという仮説と一致する。

受容体が完全であることを、ＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯ全
膜タンパク質の濃度の関数として調べるため、第４の実
験を行った。　ＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯ抽出物を１０か
ら１００％にわたる種々の比率で含む混合物を、ＩＬ−
１受容体を発現していない細胞、ＥＬ−４（Ｍ）細胞の
抽出物あるいはＰＢＳ　　ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００（
０，５％）で調製した０個々の温き物は定型的ドツトプ
ロット結合により受容体濃度と、”Ｉ−ＩＬ−１結りの
親和性について分析した。

受容体濃度は膜タンパク質濃度が一定の値に保たれてい
るか否かにかかわらずＥ　Ｌ　−４，６，Ｉ　ＣＩＯ抽
出物の含まれる割きに従って直線的に減少した。

いずれの一連の混合物においても受容体の１２％■ＩＬ
−１αに対する親和性は一定であった。これらのデータ
は二つの仮説のいずれとも一致する、すなわち受容体の
結合能は単一のポリペプチド鎖に含まれているか、ある
いは機能する受容体がＩＬ−１結合のために２つかそれ
以上のサブユニットを必要とするならこれらは界面活性
剤中での希釈では分離しないほど十分強固に結合してい
る。

実施例３ ＩＬ−１受容体の均一になるまでの精製とＮ−末端配列
の決定 上記の条件で３００−５００リツトルのＥＬ４６、Ｉ　
ＣＩＯ細胞を飽和まで培養し、集菌し、そしてＰＢＳ−
１％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００で抽出した。

界面活性剤抽出物をＩＬ−１αアフイニテイーカラムに
添加し、カラムを上記のように洗浄した。

０．１＄　ＴｒｉＬｏｎ　　Ｘ−１００を含む０．１Ｍ
グリシンＨＣＩ　　ｐＨ３，０でカラムを溶出した後、
ＩＬ−１受容体を含む両分を＋２’Ｉ−ＩＬ−１αドツ
トプロツト法により検出した。画分の一部をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析した。

Ａｆｆｉｇｅｌ　−Ｉ　Ｌ　−１ａでのアフィニティー
クロマトグラフィーで調製した、この部分精製ＩＬ−１
受容体の組成物を次の緩衝液組成を含むように調製した
：１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！、ｐＨ８，２５０ｍＭ　　
　ＮａＣ１’０．５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，０．５βＭ　
　　ＭｎＣＺ２゜０．５ｎ＋Ｍ　　ＣａＣｌ２，０．０
１＄（ｖ／ｖ）　　ＴｒｉＬｏｎ　　Ｘ１００（ＷＧＡ
緩衝液）３次にＩＬ−１受容体組成物はセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ小麦胚凝集素〈阿Ｃ＾）を結合し、ＷＧＡ桜街
液で平衡化した１社のカラムに添加した。ＩＬ−１受容
体組成物を添加後、Ｗ　Ｇ　Ａカラムを２０　１Ｒ（／
のＷＧＡ緩衝液、次に１０＋ｎＭｔ−リスｌｌＣｆ、ｐ
Ｈ８，Ｏ，Ｏ１！（ｖ／ｖ）ＴｒｉＬｏｎ　　Ｘｌ　０
０で洗浄した。ＩＬ−１受容体タンパク買はＷＧΔカラ
ムから１０随Ｍ　＋−リス−ＨＣＮ、ｐＨ８０，５８Ｎ
−アセチルグルコサミン、及び０．０１ｇ（ｖ／ｖ）Ｔ
ｒｉＬｏｎ　　Ｘ　　１００で溶出した。生物学的に活
性のあるＩＬ−１受容体の存在は＋２ＪＩＬ−１αドツ
トプロツト法により検出した０両分はまたＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動と、続けて銀染色を行うことによ
り分析した。

ＷＧＡカラ１８から溶出してきた試料を　０８ｆｌ　Ｐ
　−ＨＰ　Ｌ　Ｃカラムに適用した。Ｃ３ＲＰＨＰＬＣ
カラム（ブラウンリーラボ（Ｂ　ｒｏｗｎｌｅｅＬ　ｎ
ｂｓ）　ＲＰ　−３００，１ａｘ　Ｘ　５０＋＋ｚ）は
予め０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を
含むＨＰＬＣ級Ｈ２０で平衡化してあり、流速は５０μ
ｅ　／　ｍ　ｉ　ｎで′行った。

Ｃ８ＲＰ−ＦＰＬＣカラムを２８０ｎｍにおける吸光度
がベースラインに戻るまで０．１％（ｖ／ｖ）Ｔ　Ｆ　
Ａを含むＨ２Ｏで５０μｍ　／　＋ａ　ｉ　ｎで洗浄し
た後、ＩＬ−１受容体を含む試料を添加した。ＩＬ−１
受容体タンパク貫は、アセトニトリル中の０．１％（ｖ
／ｖ）Ｔ　Ｆ　Ａをｏ−ｔｏｏ％まで町分１％の割６で
直線匂配をかけることによりカラ１１から溶出した。両
分の一部はＳＤＳ　ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分析した。ＩＬ−１受容体タンパク質はＳＤＳ　ポリア
クリルアミドゲル上で分子１ｉｔ８２．０００の位置に
泳動される単一のバンドより成ることが明らかになった
。

精製した　ＩＬ−１受容体タンパク質をアブライドバイ
ナシステノ、ズ（Ａ　ｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｂ　１０ｓｙｓ
ｔｅｎｓ）Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａタンパク質ジークエン
サーを用いてエドマン分解二により分析した。タンパク
質（１５０ピコモル）は分析に先立ち修飾を行わなかっ
た。

ＩＬ−１受容体のタンパク質Ｎ−末端−次配列分析の結
果、次のアミノ酸残基の配列用あることが明らかになっ
た：Ｎ　Ｈ２−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ａ
ｓｐＶａｌ　−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐ
　ｒｏ−Ａｓｎ−Ｇ　１７−　　Ｉ　Ｉｅ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｉ　Ｉｅ−ＡｒｇＬｙｓ。

このタンパク質−次配列は１９８７年３月１７日発表の
国立生化学研究財団（Ｎａｔ１０ｎａｌ　ｎ１０ｅｂｅ
ｍｉｅａｌＲｅｓｅａｒｃｂ　ＦｏｕｎｔｌａＬ１０ｎ
）のタンパク質同定資源（ＰｒｏＬｃｉｎ　　Ｉｄｅｕ
ＬｉｆｉｃａＬ１０ｎＲｅｓｏｕｒｃｅ）のタンパク質
−次配列データベースと比較したところ同じ物がないこ
とが明らかになった。このデータベースの発表物は１，
０２９，０５６残基から成る４、２５３配列を含んでい
た。

実施例４ 活性のあるタンパク質をＣＯ３−７細胞で直接に発現さ
せることによるネズミ　ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮ
Ａの単離、 チャーゲイン（ＣＩ＋ｉｒｇｗｉｎ）ら（Ｂ　１ｏｅｂ
ｅｕ、１８：５２９４．１９７９）と同様の手法を用い
て、ＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯ細胞から抽出した全ＲＮＡ
から単離したポリアデニル酸の付加したーＲＮＡを逆転
写することによりｃＤＮＡライブラリーを作製した。簡
潔に述べると、細胞をイソチオシアン酸グアニジウム溶
液中で溶かし、溶解物をＣｓＣ１のパッドの上に重層し
、ＲＮＡが沈澱するまで遠心した。ＲＮＡのペレットは
再懸濁し、タンパク質分解酵素による分解、有機溶媒に
よる抽出、及びアルコール沈澱によりさらに精製した。

ポリＡ”　ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースクロマトグラ
フィーにより単離し、二本、１ｃＤＮＡはグブラー（Ｇ
ｕ旧ｅｒ）とホフマン　（ｌＩｏｆｆａｎＨＧｅｎｅ　
２５：２６３，１９８３）と同様の方法で調整した。簡
潔に述べると、ＲＮＡはオリゴｄＴまたはランダムオリ
ゴヌクレオチド３プライマーとして用いて逆転写酵素に
よりｃＤＮＡに複製された。ｃＤＮＡを影、ｃｕｌｉ　
ＤＮＡポリメラーゼＩと　ＲＮａｓｅＨと共にインキュ
ベージコンすることにより二本鎖にし、その末端はさら
にＴ、ＤＮ＾ポリメラーゼとインキュベーションするこ
とにより平滑化した。平滑末端を持っｃＤＮＡはＳｍａ
Ｉで切断し、リン酸基を除いたＩ）ＤＣ２０１ベクター
ＤＮＡに結合した。

真植生物用高発現ベクターｐＤｃ２０１は、ＳＶ４０、
アデノウィルス２、ｐＢ　Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　Ａを次の順
に結かして作製された：（１）複製起点、初期と後期プ
ロモーター、及びエンハンサ−を含む５Ｖ４０Ｉｔｌｒ
片、（２）主要後期プロモーター、三つに分節した後期
リーダー配列の第１エクソンと第１イントロンの一部を
含むアデノウィルス２の断片；（３）Ｈｉ　ｎｄ　■部
位、スプライスアクセプタ一部位、アデノウィルス２の
三つに分節したリーダー配列の第２エクソンと第３エク
ソン、Ｓｍａｒ部位を含む？！数クローニング部位から
成る合成配列；（４）初期とｌｌ期のポリアデニルｌ！
！１十加部位を含むＳＶ４０の配列；（５）ウィルス関
連ＲＮＡ遺伝子を含むアデノウィルス２の配列：及び（
６）大腸菌（Ｅ　、ｃｏｌｉ＞中での複製のためのｐ［
３Ｒ３２２の要素。

結果としてできなｐＤｃ２０１上のＥＬ−４６，１Ｃ１
０ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｌ、竺丘）の株Ｄ）
１５αを形質転換するのに用い、組み換え木はプレート
あたい約３５０コロニーになるよう、スクリーンごとに
全部で約２５　、０００コロニーになるめに十分なプレ
ートに蒔き広げた。コロニーを各々のプレートからかき
収り、プールしておき、プラスミドＤＮＡを各々のプー
ルから調整した。次にプールしたＤＮＡをルスマン（Ｌ
ｕｔｌ＋＋ａａｎ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、１１：１２９５．１９８３）とマツククタチャ
ン（ＭｃＣｕｔｃｌ＋ａｎ）ら（Ｊ　　Ｎａｔｌ　Ｃａ
ｎｃｅｒ−り立幻２．４１：３５１．１９８６）によっ
て発表されたＤＥＡＥ−デキストランと続けてクロロキ
ン処理を用いするのに用いた。次に導入された配列が過
渡的な発現をできるように細胞を３日間培養し、成長さ
せた。３日後、細胞培養上清を除き、各プレートの細胞
の単層を以下のようにＩＬ−１結合に関してアッセイし
た。各プレートに３　Ｘ　１０−ｌ０Ｍ　”５ＩＩＬ−
１αを古むＲＰＭ１倍地３洗浄を加え、プレートを８°
Ｃで２時間インキュベートした８次にこの借地を除き、
各プレートを（標識されたＩＬ１αを含まない）１０ｚ
ｆ　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　　１６４０倍地で洗浄した０次に各
プレートの縁を壊して平らな板だけにし、それを増感ス
クリーンを用いて一７０℃で７２時間Ｘ線フィルムと重
ねた。ＩＬ−１結合活性は露光したフィルム上に比較的
均一なバックグラウンドに対し黒い点として見ることが
できる。

このようにしてライブラリーから約１５０，０００の４
ｆｌみ換え体をスクリーンした後、バックブラウンドグ
）露光に対し明瞭なｌｌ−１結合点を持つ１つσ月・ラ
ンスフェクトされたプールが１０１察された。

次にこのポジティブなプールの細菌の凍結ストックを約
３５０のコロニーを持つプレートを作るのに使った。こ
れらのプレートのレプリカをニトロセルロースフィルタ
ー上に「１ミ製し、ポジティブなプレートを同定するた
めに上記のようにプレーＩ・をかき取り、プラスミドＤ
ＮＡｔ−：Ａ整し、トランスフエフｌ−した。このプレ
ートのニトロセルロースのレプリカからの個々のコロニ
ーのＭＡ菌を２ｊＩＩｌの培養液で生やし、それをプラ
スミドＤＮＡを得るのに用いて、そのＤＮＡを上記のよ
うにＣＯ５７細胞にトランスフェクトしな。このように
して、ＣＯＳ　＆（ｆｆ胞中で　ＩＬ−１Ｒの発現を誘
導することのできる単一のクローン、クローン７８が単
離された。挿入断片はｐＢＲ３２２由来のプラスミド（
ＧＥＭＢＬ＞にサブクローンし、従来の方法で配列を決
定した。配列は第２図に示されている。

実施例５ ネズミＩＬ−１受容体１０−ブＤＮＡとハイブリダイズ
するヒトｃＤＮＡクローンの単離ｃＤＮＡポリヌクレオ
ナトプローブはクローンフ８（実施例４参照）の２３５
６塩基対（ｂｐ）から、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いた
ニックトランスレーションにより：Ａ整した。用いた方
法はアニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（」距）によ
って発表されたものと大体同一である。

アクレス（Ａ　ｃｒｅｓ）ら（Ｊ　　Ｉ　ｍ＋勇ｕｎｏ
１．１３８：２１３２．１９８７）により記載されたク
ローン２２と呼ばれるヒトＴ４（１を胞ラインの培養側
１ａから抽出した全ＲＮ　Ａから単離したポリアデニル
酸の叶加したｒｅ　ＲＮ　Ａを逆転写することによりｃ
ＤＮＡライブラリーを作製した。この細胞はアクレスら
（１此）により記載すレタ、Ｊ：つ４：ｔＯ：／ｄ　Ｏ
ＫＴ　３ｆｎ体ト１ｏＨ１ｍｌＦし ヒト　ＩＬ−２存在下で、１０％ウシ胎児血清を加えた
ｎ　ｒ’　Ｍ　Ｉ　１６４０培地で培養した。ｃＤＮＡ
はＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二重鎖にし、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて平滑末端にし、ｃＤＮＡ中にあ
る　ＥｃｏＲＩ切断部位するためにＥｃｏＲＩメチラー
ゼて′メチル化しＥｃｏＲＩリンカ−３結合した。結果
としてできたしのをｃＤＮＡの両端の１コピーを残して
全てのリンカ−を除くためにＥｃｏＲＩで消化し、Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、脱リン酸化したバクテリオファージλ
ｇｔｌＯ（ヒューン（Ｈｕｙｎｌ＋）ら、ＤＮＡ　　Ｃ
Ｉｏｎｉｎ　：Ａ　　Ｐｒａｌｒｏａｃｂ　、Ｇ　トｏ
ｖｅｒ、ｅｄ、　　Ｉ　ＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ。

旧１．４９−７８）のアームと結合した。結きしたＤＮ
Ａはｊ（ｌみ換え体のライブラリー作製のため、商業的
に入手可能なキット〈ストラタゲンクローニングシステ
ム（Ｓ　ｔｒａｔａ−Ｈｅｒｅ　ＣＩｏｎｉｎｇ　Ｓ　
ｙｓｔｅｍ）、Ｓａｎ　　Ｄ＋ｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ　
９２１２１）を用いてファージ粒子中にパッケージした
８組み換え体は大腸菌（影、吐）Ｃ６００株（ｈｆｌ−
）の上に蒔き広げ、中程度のストリンジエンシー（５０
℃、５Ｘｓｓｃ）の条件下で通常のハイブリダイゼーシ
ョン技術でスクリーニングした。

スクリーニングを数回緑り返し、ｃＤＮＡプローブとハ
イブリダイズするクローンがライブラリーから９クロー
ン単離された。クローンはプラークとして単離され、バ
クテリオファージＤＮＡを調整するのに用い、そのＤＮ
Ａを　ＥｃｏＲＩで消化した。消化物をアガロースゲル
で電気泳動し、ナイロンフィルター上にプロットしてハ
イブリダイゼーションに関し再度試験した。クローンは
ＥｃｏＲＩで消化後調整用アガロースゲル電気泳動を行
い、次に唯一の［ｉ、ｃｏＲＩ部位、Ｂａ＋ｎ＋ＩＩ部
位、及び他の多くの別々の制限酵素部位を持つポリリン
カーを含んだ標準的クローニングベクターｐＢＲ３２２
をＥｃｏＲＩで切断した派生物（ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　
Ｌ　）にサブクローンした。この型のベクターの例はプ
ント（Ｄ　ｅｎｔｅ）らによって開示されている（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓｅａｒｃｌ＋　１１＋
１６４５．１９８３）。

４．８ＫｂヒトＩ　Ｌ−Ｉ　ｎクローンの制限酵素地Ｉ
２１牛製と塩基配列決定により、このクローンが細胞外
すなわち膜貫通頗域より外側のＮ末端領域で対応するネ
ズミの配列と８０％とアミノ酸配列の同一性を示し、膜
貫通領域では６３％の同一性、細胞買側すなわちＣ末端
領域では８７％の同一性を示す５１８アミノ酸をコード
している配列を含んでいることが明らかになった。その
上マウスとヒトの配列間で、いくつかのシスティン残基
とＮ−結合グリコシル化部位の大部分が保存されていた
。ヒトＩＬ−１Ｒクローンの５′部分の４４０ｈｐ　Ｅ
ｃｏＲ，ｌＮ５ｉＩ断片分上記のようにニック−１・ラ
ンスレージョンにより３２Ｐ″ｃ凛識し、上記のように
調整したクローン２２の＋ａ　ＲＮ　Ａをランダムにプ
ライミングして作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするのに用いた。このプローブにハイブリダイ
ズする２３クローンを単離し、制限酵素地図作製により
分析した。これらのクローンの一個の塩基配列を決定す
ることにより、ヒトのタンパク質の残りのＮ末端３４ア
ミノ酸に対応する塩基配列の情報が得られた。ヒトＩＬ
−１Ｒのコード領域全長の塩基配列と、それから予想さ
れるアミノ酸配列は第５Ａ−５Ｃ図に示されている。

実施例６ 高効率ホ乳類発現系を用いた組み換え体ＩＬ−１受容体
の発現 第６図に描かれたホ乳頚発現プラスミドｐＤＣ２０１は
ホ乳類細胞にトランスフェクトされた時、そのマルチプ
ルクローニングサイト（ＭＣ３＞に挿入されたｃＤＮＡ
を発現するように設Ｊ１されている。ここで第６図分参
照すると、ｐＤｃ２０１は次の要素から成っている：複
製起点とエンハンサ−配列、初期と後期プロモーターを
倉むＦｉ５５１７１−２７０からのＳＶ４０配列を含む
５Ｖ４０（線形をつけた部分）、この断片は初期プロモ
ーターからの転写の方向が矢印で示されたようになるよ
うに向けられている。Ａｄ　　Ｍ、ＬＰ（白く抜けた部
分）は主要後期プロモーター、三つに分節したリーダー
配列の第１エクソンと第１と第２エクソンの間のイント
ロンの一部を含む、座標５７７９−６２３１からのアデ
ノウィルス２配列を含んでいる。ＴＰＬ（点彩をっけた
部分）はアデノウィルス２配列７０５６−７１７２．９
６３４−９６９３　（三つに分節したリーダー配列の第
２エクソンのアクセプターススライス部位、三つに分節
したリーダー配列の第２エクンンと第３エクソンの一部
を含んでいる）と、Ｉ＜旧＋１．Ｓ艶８１、Ｂｇｌｌの
部位を含むマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）に
対応する合成りＮＡ配列を含んでいる。ｐＡ（線形をつ
けた部分）は初期転写のポリアデニル酸付加と終結のた
めのシグナルを含む４１２７−４１００と２７７０−２
５３３からのＳＶ４０配列を含んでいる。＼７Ａ（黒く
塗った部分）はウィルス関連ＲＮ　Ａ　３Δｆ云子（Ｖ
Ａ［とＶＡＩＮ）ｆ！−含む１０２２６＋１５５５から
のアデノウィルス−２配列を含んでいる。直線部分はｐ
ＢＲ３２２山来で（ｐＡ配列の次から初めて時計回りに
進んで）Ｆｉ標２９−２３，６５１−１８５（ここにＶ
Ａ配列が挿入されている）、２９−１．４３６３２４８
６、及び１０９４−３７５に対応している。ｐＤＣ２０
１は以前コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｄｅｃ　　Ｉ
ｍｎ＋ｕｎｏｌ、２３・９３５（１９８６））によって
記述されたｐＭＬＳＶに由来する。

組み換え体ＩＬ−１受容体を発現するため、ＣＯ８細胞
を培養し、そしてコスマンら（前出）に述べたように　
ＩＬ−１ＲｃＤＮＡ挿入断片を持った１）ＤＣ２０１（
クローン７８）で形質転換した大腸菌（Ｅ　、ｃｏｌｉ
）の培養液１．５ｚ４から取ったプラスミドＤＮＡ″ｒ
ｃＯ３４佃胞にトランスフェクト７２時間培Ｗ後、１０
Ｒ１のＰＢＳで一度洗浄し、次にした後、かき取ること
により細胞をヱにめた．比軸のためにＣ　Ｏ　Ｓ　１Ｒ
胞を挿入断片を含まない対照のベクターｐＤｃ２０１で
ｌ・ランスフェクトし、ＥＬ４　６、Ｉ　ＣＩＯ細胞と
　ＥＬ−４　Ｍ　、ｔ（Ｉｌ胞（ＥＬ−１１細胞のＩｌ
−１受容体陰性の変異株）をマクドナルド（Ｍ　−　ｃ
Ｄ　ｏｈｎｌｄ）ら（こよってＪ　、Ｉ　＋ｎｍｕｎｏ
ｌ　、！３５。

３９６４　（１９８５）に記載された方法にＵＣっで培
ｎし、細胞を集めた。

飽和Ｄ　Ｎ　Ａ　濃度ではトランスフエフ１−されたＣ
ＯＳ細胞の単層は細胞あたり平均４５，０００の部位を
含んでいる。親株のＣＯＳ細胞は細胞あたり約５００の
受容体を発現しているだけなのでトランスフェクトされ
た細胞群の全ＩＬ−１受容体の９８％以上が（■み換え
体であると計算することができる。

ＦＩＴＣ−ＩＬ−１αを用いた流動細胞計数法フローサ
イトメトリーにより、５冊胞の４．２％だ（すが明るく
染められていることが明らかになった；従ってトランス
フェクトされた個々のｃｏｓａ胞は約１、ＩＸ１０’の
ＩＬ−１結す部位を持っていることになる。

ＥＴ−４　０．１　ｃｌｏ細胞とＩＬ−１受容Ｃ本分コ
ードしているｃＤＮＡ（クローン７８）を含むベクター
ＤＮＡでトランスフェクトシたＣ　Ｏ　Ｓ　ＭＨ胞の形
質膜のタンパク買と、先に実施例１で述べたように１２
５（で漂識した。次に細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１０
０と数種のタンパク質分解酵素阻害剤の混合物（２＋ｌ
ＩＭフェニルメチルスルフォニルフルオリド、１ｎ＋Ｍ
ペプスタチン、１＋ｓＭロイペプチン、２糟ＭＯーフェ
ナンスロリン）を含むＰＢＳで抽出した。

界面活性剤抽出物を実施ｒＩＡ１で述べたように組み換
え体ヒト　ＩＬ−１ａを桔なしたＡ　ｆｆ　ｉｇｅｌ　
−　１０〈バイオラッド、Ｒ；。１１□ｏｎｄ．ＣＡ）
のアフィニティークロマトグラフィーにかけた。次に１
２５Ｉ′？１″標識した受容体を試ｆｌ緩甫液（０．０
６２５Ｍ　　）−リスＨＣＩ　ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ
、７９％グリセロール、５％　２−メルカプトエタノー
ル）で溶出し、１０％ゲルを用いたＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分析した。次にゲルをオートラジ
オグラフィーにかけた。ＩＬ−１αカラムて′のアフィ
ニティークロマトグラフィーで精製した組み換え体ＩＬ
−１受容体は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約８
０，０００の相対易動度で泳動され、ＥＬ−４６、１Ｃ
　１０細胞から同様にして精製された　ＩＬ−１受容体
に匹敵する易動度を示した。

クローン７８のＤＮＡはｃｏｓｔ胞にトランスフェクト
した時、第７Ａ−７Ｃ図に示す通りＥＬ４　ｅ．ｔ　ｃ
ｔｏ　ｍ胞に現れているらのと突貫的に同じ　ＩＬ−１
結合活性の発現を引き起こす。

結合アッセイのため、担体としてＥＬ−４Ｍ（１．５ｘ
ｌＯ’４（ｂ胞＃ｔ）　、！ｌ：共ｃ：、ｃｏｓａ＋胞
を１　、７ｘ　１０’細胞７ｍｌになるように再懸濁し
た，Ｅｌ−４ＭとＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯは１．５ｘｌ
Ｏ’細胞７ｍｌになるように再懸濁した。細胞懸濁液を
全て調整し、結合アッセイをＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０／
ｌｏ％ＰＳＡ１０．１９’アジ化ナトリウム１２０ｍＭ
　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　ｐＨ７，４中で行った。１２５１
−ＩＬ−１αまたは１２’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１βとｔｆｉ
ｆｆｉしていないＩＬ−１α、ＩＬ−１βとの結合イン
キュベーションは前述したように行った。１２’Ｉ−Ｉ
Ｌ−１αはトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に３０±
０．２ｘｌＯ’Ｍ−’のＫａで結合した（第７Ｂ［Ｊ）
、ＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯ細胞上の天然の受容体のＫＪ
Ｉは４，３±３Ｘ１０’Ｍ−’であった６結合め全ては
組み換え受容体に対するものであった（第７Ａ図を見よ
）；この実験では親株のＣＯ８細胞群は検出できる程度
に＋２５１−　Ｉ　Ｌ−１αと結きしなかった。

非放射性競自実験では、結合していない１２５ＩＩＬ−
１α濃度は７．７２±０．１３Ｘ　１０−”Ｍであった
。トランスフェクトされたＣＯ８細胞では最大結合数は
２．９８±０．３Ｘ　１０’分子／ｍ胞（阻害無し）で
、バックグラウンド（非標識ＩＬ−１α　６　ｘ　１０
−’Ｍ存在下で測定した）は９２１±６０分子／側胞（
１００％阻春）であった、　ＥＬ−４６，Ｉ　ＣＩＯ細
胞では最大結合数は１．３３±ｏ、０２ｘ　１０’分子
／細胞で、バックグラウンド（上を参照）は４７±２分
子／細胞であった。

”Ｉ−ＩＬ−１αの結合は、トランスフェクトされたｃ
ｏｓＭＡ胞に対するものもＥＬ−４６，１Ｃ１０ＨＪ胞
に対するものもいずれも大過剰の非標識ＩＬ−１αまた
は非標識ＩＬ−１βで完全に競合阻害された（第７Ｃ図
）。ＩＬ−１αとＩＬ−１βに対する阻害定数は各々の
細胞の型について非常に似ていた（第７Ｃ図）。

実施例７ ＩＬ−ＩＨに対するモノクローン抗体の調整例えば米国
特許筒４，４１１，９３３号明細書で発表されたような
従来の技術を用いて、ＩＬ−ＩＨに対するモノクローン
抗ｆ本をｆｖ賀するため、ｆｔ？賀した組み換え体ＩＬ
−１Ｒ２例えばヒトＴＬ−１Ｒ１または高レベルにＩＬ
−１Ｒを発現しているトランスフェクトされたＣＯ８細
胞を用いた。そのような抗体はＩＬ−１受容体へのＩＬ
−１の結合を妨害することや、例えばＩＬ−１の毒性あ
るいは池の望ましくない効果を改善するために有効であ
るだろうと考えられる。

マウスを免疫するために、ＩＬ−１Ｒ免疫原をフロイン
トの完全なアジュバント中に乳化し、Ｂｕｌｂ／Ｃマウ
スの皮下に１０〜１００μｇにわたる量を注射した。１
０から１２日後、免疫された動物をフロイントの不完全
アジュバント中に乳化させた免疫原を追加して増強し、
その後週−度か二週−度の免疫スケジュールに従い周期
的に増強した。ドツトプロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（
酵素結合イミュノソルベント　アッセイ）またはＥＬ−
４６，Ｉ　Ｃｌ０ＩＮｌｌ胞抽出物に対する１２５１−
　Ｉ　Ｌ、−１αの結合の阻害（上記のように）により
試験するために後眼窩出血法＜ｒｅＬｒｏ−ｏｒｂｉｔ
ａｌ　　ｂｌｅｅｄｉｎｇ）または尾端切除法（ｔａｉ
ｌ−ｔｉｐ　　ｅｘｃｉｓ１０ｎ）により血清試料を周
期的に採取した。他のアッセイ法も適している。

適当な抗体価が検出された後、陽性の動物には生理食塩
水に抗原を入れたものを静脈注射した。３から４日後、
その動物を殺し、牌ｍ細胞を取り、ネズミの骨髄腫細胞
系列ＮＳＩと融合した。このような手順で作製されたハ
イブリドーマ細胞系列は融合していない細胞・骨ｆｉｌ
ｉＩＩ！Ｉ！の融合したもの、牌臓細胞の融合したもの
の増殖を妨げるためにＨＡＴ選択培地（ヒボキサンチン
、アミノプテリン。

チミジン〉中に、マルチプルマイクロタイタープレート
にプレートした。

このようにしてｆｖ−製されたハイブリドーマはＩＬ−
１Ｒに対する反応性に関し、例えばエングバル（ＥｎＨ
ｖａｌｌ）らＴ　ｍｎｎｎｏｃｌ＋ｅｎｉｓＬｒ　　８
：８７１＜１９７１）によって、また米国特許筒４，７
０３，００４号明細書に発表されている技術を適用する
ことによりＥｆｔ　Ｓ＾でスクリーニングすることがで
きる０次に高濃度（＞　１１１１１Ｆ／　１ｌｅ）の抗
−ＩＬ−１Ｒモノクローン抗体を含む腹膜水を作るため
に同系Ｂａ１ｂ／ｃマけてゲル濾過クロマトグラフィー
ならびに／あるいは黄色ブドウ球菌（Ｓ　Ｌａ　ｂ　１
ｏｃｏｃｅｕｓ　　７のプロティンＡに対する抗体の結
合によるアフィニティークロマトグラフイーにより精製
することができる。

実施例８ ＩＬ−１Ｒの酵母中での発現 ヒトあるいはネズミのＩ　Ｌ−Ｉ　Ｒを酵母中で発現す
るために、次のようにｐＩＸＹ１２０由来の酵ｒＩノ発
現ヘク９　　’：ｔＭ’Ｊシタ、　ｐＩ　ＸＹ　１２０
は、ｃＤＮＡ挿入断片を含まず、Ｎｃｏ１部位を持つポ
リリンカー、／マルチプルクローニングサイトを含んで
いることを除いてはｐＹａＨｎＧＭ（＾ＴＣＣ５３１５
７）と同一である９このベクターは次の起源からのＤＮ
Ａ配列を含んでいる　（１）プラスミドｐＢ　Ｒ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）から切り出された大きなＳｐｌ
＋１（ヌクレオチド５６２）からＥｃｏｌ’ｊｌ−（ヌ
クレオチド４３６１）の断片で、大腸菌中での複製起点
と選択のためのアンピシリン耐性マーカーを含んでいる
；（２）ＴＲＰ−１マーカー、２μの複製起点、ＡＤＨ
プロモーターを含むサツカロミセスセルビシニー（β−
，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　；（３）分泌
されるペプチドであるα−因子をコードしている遺伝子
由来の８５アミノ酸のシグナルペプチドを°コードする
ＤＮＡ（クルシャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら、米国特許第４
，５４６，０８２号参照）、異種の遺伝子との融合を容
易にするため、α因子のシグナルペプチド中の２３７の
位置にＡｓｐ７１８制限部位を導入した。

これはクラーク（Ｃｒａｒｋ）により記載された（旦■
士役ｌへμ狙：１２（１９８５））ように、オリゴヌク
レオチド標的インビトロ（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ）変異導
入法によりヌクレオチド２４１のチミジン残基をシトシ
ン残基に変えることにより成された。マルチフ。

ルクローニングサイトな含み、次の配列を持つ合成オリ
ゴヌクレオチドを、α因子シグナルペプチドの３°末端
に近いアミノ１１１２７９にあるＡ　５ｐ７１８部位か
ら２μ配列中のＳ　ｐｅ　Ｉ部位の間に挿入した。

＾５ｐ７１８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５Ｌｕｌ　　Ｎｃａｌ　　Ｂａｍ１ｌｌ（：ＴＡＣ
ＣＴＴＴ（：ＣＡＴ＾＾＾＾ＧＡＣ：ＡＣＴＡＣ＾＾Ｇ
ＧＡＣ［；ＡＣＧＡＴＧＡＣ＾＾にＡ（：（：ＣＣＴＣ
ＣＡＴＧＣＡＴ、@、　。

Ｇ＾＾＾ＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧ　Ａ　ＴＧ　Ｔ　
ＴＣＣＴ（ｎに　ＣＴＡ　ＣＴＩＩ：　ＴＴＣＴＣＣＧ
（：　Ａ　ＧＣＴＡＣＣＴ＾P．。

←−−−ボリリシ力−　− ５輸ａｌ　　　　鑵１ 、　、ＣＣＣＣＣＧＩｌ：ＣＡＣ＾ 、、、（：ＧＧににＣＣＣＴＧＴ［：ＡＴＣポリ１ルカ
ー−−一−→ ρＢＣｌ２０はまた、複製起点とインタージエとツタ領
域を含む一分子ファージｆ１由来の５１４ｂｐＤＮＡ断
片を持っている点がｐｙαｔｌｕＧＨと異なっているが
、その配列はｐＢＲ３２２配列のＮｒｕＩ部位に挿入さ
れていた。ｒｌの複製起点が存在することにより、大腸
菌の適当な株に形質転換し、バクテリオファージ「１で
重複感染すると、このベクターの一本鎖ＤＮＡの複製を
作ることが可ｆｆｆｌとなり、それによりこのベクター
のＤＮＡ塩基配列決定が容易になり、インビトロ変異導
入のための基礎が与えられる。ｃＤＮＡを挿入するため
には、α因子リーダーペプチドの３°末端に近い所（ヌ
クレオチド２３７）であるＡｓｐ７１８で切断する、例
えばポリリンカー内で切断するＮｃｏｌでｐＩＸＹ１２
０を切断する０次に大きなベクター断片を精製し、発現
させたいタンパク質をコードするＤＮＡ断片と結合する
。

ヒトＩＬ−，１Ｒを発現するための分泌ベクターを作製
するためには、ｈｌ　Ｌ−Ｉ　Ｒをコードする完全なオ
ープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡ断片を成熟
タンパク賞のＮ末端に近い部位を適当な制限エンドヌク
レアーゼで切断する。

次に断片を単離する際に除かれたコドンを再生し、同時
にｐｌＸＹ１２０と結きして、完全なα因子リーダー配
列に対し読み枠を合わせたコード領域を作るようにｈＩ
　Ｌ−１Ｒ断片の５°及び３°末端に結合できるような
オリゴヌクレオチドを一つあるいは複数合成する。

次に結果としてできる発現ベクターを精製し、サツカロ
ミセスセルビシニー　（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）（Ｘ　Ｖ２１８１）の二倍体株をヨーロッパ特許第０
１６５８５４号で発表されたような標準的な技術で形質
転換するのに用い、トリプトファン栄畏要求性に関し遭
択する。得られた形質転換体を分泌あるいは抽出された
産物としてｌ＋ＩＬ１Ｒを発現させるために培養する。

ｈＩＬ−１Ｒ発現に関しアッセイする培養は、２０　５
０ｍ１’のＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン
、１％ブドウ糖）中で、３７℃で細胞密度が１−５Ｘ１
０”［胞／ｍｌになるまで培養させる。細胞を培地から
分離するため、細胞を遠心で除き、アッセイの前に０．
４５μ酢酸セルロースフイルターを通し培地をｒ遇する
。

形質転換した酵母が作った上清もしくは破砕した酵母細
胞から調製した抽出物は、上記のような結合アッセイを
用いてＩ＋ＩＬ−ＩＨの存在をアッセイする。

実施例９ 短縮された組換え体本ズミＩＬ−１受容体の構築。

発現、精製 ＨＥＬＡ−ＥＢＮＡ１細胞系列に適きする発現系を用い
てＩＬ−１受容体タンパク質の短縮された型のものを作
製したが、ＨＥ　Ｌ　Ａ　−Ｅ　Ｂ　Ｎ　Ａ　１細胞系
列はＣＭ　Ｖ　％初期エンハンサープロモーターから読
まれるエプスタイン−パール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒ）ウィルス核抗原を定常的に発現している。

用いた発現ベクターはＨＡＶ−ＥＯという名で、エプス
タイン−パールウィルスの複製起点を含み、且つＨＥＬ
Ａ−ＥＢＮＡ細胞系列中で高レベルのを５Ｖ−４０初期
プロモーターを用いてアデノウィルス主要後期プロモー
ターを、ウィルスのｍＲＮＡのキャップ部位から伸びる
ＨＩＶ−１由来の合成配列に置き換えることによりｐＤ
ｃ２０１から作製された。

可溶性の短縮されたＩＬ−１受容体の発現用構築は一連
の段階によって作製された。受容体の全コード領域と５
°非翻訳領域の一部は晟初のＩＬ１受容体クロりン７８
からＡｓｐ７１８とＮｄｅＩでの消化により切り出され
た。３″非翻訳配列を含まないこの断片をＨＡ　Ｖ　−
ＥＯにクローンしてＨＡ　Ｖ　−Ｅ　Ｏ−Ｆ　Ｌ　９を
１ヤ製した０次にこのプラスミドの変形でプロリン３１
６に対するコドンのすぐ後に翻訳停止コドンを含み、こ
れより３°のコード配列を全て欠くものが通常の方法で
横築されＨＡＶ−ＥＯ−ＭＥＸＴと名けけられた。

ＨＡ　Ｖ　−Ｅ　Ｏ−Ｍ　Ｅ　Ｘ　ＴベクターＤＮＡは
カワイ（Ｋａｗａｉ）とニシザワ（Ｎ　ｉｓｈｉｚａｗ
ａ）により発表された（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　　Ｂ　１
０ｌ、　４：１１）２，１９８４）ように改変したポリ
ブレントランスフェクションによりＨＥＬＡ−ＥＢＮＡ
細胞に導入された。１．５Ｘ１０’の細胞を１０ｃ−組
織培養皿中１０ｍ１０ｍＩＤ＋１０％ＦＣ８に植えた。

細胞は３７℃、１０％ＣＯ２で１６時間インキュベート
した０次に培地を除き、１０μｇ／ｍ１ＤＮＡと３０μ
ｇ／輸！ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含む血清を含まな
いＤＭＥＭ３ｍ４を加えた０次に培養皿を３７℃／１０
％ＣＯ２でさらに６時間インキュベートし、それからＤ
ＮＡ混合液を除き、３ｍｌの血清を含まないＤ　Ｍ　Ｅ
　Ｍ　＋２５％グリセロール（Ｖ／ν）を１分間加える
ことにより細胞にグリセロールショックをかけた。グリ
セロールを除き、細胞を培地で２度洗浄した。次に１０
＋ｔ’のＤＭＥＭ＋　１０％ＦＣ３を加え、細胞を３７
℃／１０％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。

次にトランスフェクトされた細胞をトリプシンで剥がし
、２５ｍ１のＤＭＥＭ＋　１％ＦＣ３を入れ現された可
溶性のネズミＩＬ−１受容体を含む上清は１０日間まで
の間２４時間ごとに集められた。

細胞（２，５×１０’細胞）を加える前に、標識したＩ
Ｌ−１α（２Ｘ　１０−”、５０μｍ）を最初に試験す
る試料（５０μｌ）と８℃で２時間インキュベーション
すること以外はモスレイ（Ｍｏｓｌｅｙ）らが開示した
（Ｊ　、　Ｂ　１０ｌ、　Ｃｈｅｓｓ、　２６２：２９
４１，１９８７＞ように、培地中のＩＬ−１ｃ結合活性
は＋２Ｓｉ　　７ＬｌαのＥ　Ｌ４　６．Ｉ　ＣＩＯ細
胞に対する阻害で測定した。各々の試験する試料は６通
りの希釈（ｘ３）でアッセイし、阻害曲線を相対阻’ｉ
！Ｆ　ＩＩＮを求めるのに用いた。

可溶性ＩＬ−１受容体はウルダル（Ｕｒｄａｌ）らが天
然の受容本について記載した（Ｊ、　Ｂ１０ｌ。

Ｃｔ＋ｅｍ、　２６３：２８０１９８８）ように培養上
清から精製した。培養上清をベツド体積１ｍ４のＩＬ−
１αカラムを通過させ、カラムをＰＢＳで洗浄し、０．
１Ｈグリシン−Ｈ（ｌで溶出した。酸溶出画分はすぐに
中和され、続いて放射性受容体阻害アッセイを用いてＩ
Ｌ−１結合活性に関し試験した。酸処理で溶出された試
料の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＭ
ｒ６０，０００と５４，０００の２つのバ°ンドが存在
することが明らかになった。この試料をＮ−グリカナー
ゼでし処理することにより、この大きな違いはこれら２
つの分子種のＮ−結合型グリコシル化の差によるもので
あることが明らかになった。可溶性Ｉｔ−１受容体は完
全なＩＬ−１結合活性を保持している。

【図面の簡単な説明】

第１図はネズミ及びヒトＩＬ−１Ｒｍ転子のコード領域
を含んだｃＤＮＡ構成物の制限酵素地図である。 第２図はクローンＧＥＭＢＬ７８のｃＤＮＡ配列を表わ
している。 第３Ａ図−第３Ｃ図は、第２（２Ｉに示された第４Ｉ２
ＩはヒトＩＬ−１Ｒ道転子のコード領域を完全に含むｅ
ＤＮＡ配列を表わしている。 第５Ａ図−第５Ｃ図はヒトＩＬ−１受容体をコードする
ｃＤＮＡ配列と、それに由来するｃＤＮＡ第６図は哺乳
類の高発現プラスミド９Ｄ　Ｃ２０１を模式的に描いた
ものである。 第７Ａ図は天然のＩＬ−１受容体を発現している細胞（
Ｅ　Ｌ　４　６．Ｉ　Ｃｌ０）あるいは組換え体の受容
体を発現している細胞（ＣＯ８−Ｉ　Ｌ−１Ｒ）に対す
る’２５Ｉ−ＩＬ−１αの直接の結合を比較しり、 たちのであ七 す■ヨシ１３コ５託ピ にａ　Ｅ５　まｄε５韮Ｆト市 藷睦ＥＡｉ託ｌ基！ αぎり６３＋５　：４ａ　Ｅａ　市詐 目王践１Ｌｓ　日５菖ミ菖５ヨ３ ３ミク５←３日拍ヨ３日 ９；５白目≦３ｓ市紹Ｅヨ 要 要 目ミ お 践ｄ ′５．ご ＆； 第７Ｃ図は標識されていないＩＬ−１α及びＩＬ−１β
による”’Ｉ　−Ｉ　Ｌ−１αの結合に対する競合反応
を示している。 第８図は、ネズミ及びヒトのＩＬ−１受容体由来のアミ
ノ酸配列の比較である。 転二日転’Ａ　　３？　Ｅ’Ｂ　　革と曇！シ＝　とよ
　８０　ご己　籾５　中３８＝１：二　冒、５ｉ〉β　
１瓢　ごシ　ごｊ　〉五＜ＨωＣ５Ｃ５ｃ　　トド　ｑ
ａ　　ｃ、ｐ＜　　ｕｕｔ！Ｉｂ。 〇＜ ！−１田 Ｕ〉 ■ Ｑ　＞ 〇− Ｑフ トΦ 〇− ＜０ ０函 図面の浄書に内容昼こ変更なし） １面のＣ」鶴（内容に変更なし） ｃＤＮＡ ヨ３託眠９ミ詰 ご包　８社　１芸　起ｙ　口３ ＵｎａＨ日！■ １５Ｉ踪市時 にだ　藁ｆ　ミ謳　ご包　ご； ヨ３同民ヨＸミ院ａ 日ヨ菖ミ１５ヨ５旧 読茨葺ａ目３日コ５ 〉：　ご粘　８テ　ご＝　〉旧 ａａ　　ｌ−１１７１ｈｈ　　←ψ　ロＯ市読ξｉ番左
Ｈ５ ＦＩＧＵＲＥ　６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳類ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）またはそのサ
   ブユニットをコードしている１つのオープンリーディン
   グフレーム核酸配列から実質的になるＤＮＡ配列。 ２、 （ａ）天然の哺乳類ＩＬ−１Ｒ遺伝子のコード領域に由
   来する核酸配列を有するｃＤＮＡクローン； （ｂ）中程度の厳しい（ストリンジェット）条件下で（
   ａ）のクローンとハイブリダイゼーションできて、且つ
   生物学的活性のあるＩＬ−１Ｒ分子をコードしているＤ
   ＮＡ配列；及び （ｃ）（ａ）と（ｂ）で定義したＤＮＡ配列と遺伝的コ
   ードの結果として縮重していて、且つ生物学的活性のあ
   るＩＬ−１Ｒ分子をコードしているＤＮＡ配列 からなる群から選択される、特許請求の範囲第１項記載
   のＤＮＡ配列。 ３、微生物もしくはウィルスのオペロン由来の誘導可能
   な制御要素を含む組み換え転写単位中で発現させること
   が可能な哺乳類ＩＬ−１Ｒまたはそのサブユニットを実
   質的にコードしている合成遺伝子から成る、特許請求の
   範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ４、ｃＤＮＡ配列もしくはそのコピー由来の少なくとも
   １つの配列要素からなる、特許請求の範囲第３項記載の
   ＤＮＡ配列。 ５、膜貫通領域と細胞質側のドメインを欠く短縮された
   ＩＬ−１受容体をコードする、特許請求の範囲第１項記
   載のＤＮＡ配列。 ６、ＩＬ−１受容体をコードする核酸配列と実質的に類
   似している、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ７、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記
   載のＤＮＡ配列からなる組み換え発現ベクター。 ８、特許請求の範囲第７項記載のベクターを含んだ適当
   な宿主細胞を発現を引き起こす条件下で培養することか
   らなる哺乳類ＩＬ−１Ｒもしくはその類似体を調製する
   方法。 ９、細胞あたり３０，０００以上の表面ＩＬ−１受容体
   を発現する真核細胞集団。 １０、細胞あたり４５，０００以上の表面ＩＬ−１受容
   体を発現する、特許請求の範囲第９項記載の真核細胞集
   団。 １１、均一な生物学的に活性のある哺乳類ＩＬ−１Ｒ組
   成物。 １２、実質的にネズミＩＬ−１Ｒより成る、特許請求の
   範囲第１１項記載の均一な生物学的に活性のある哺乳類
   ＩＬ−１Ｒ組成物。 １３、実質的にヒトＩＬ−１Ｒより成る、特許請求の範
   囲第１１項記載の均一な生物学的に活性のある哺乳類Ｉ
   Ｌ−１Ｒ組成物。 １４、組み換え細胞培養により生産され、且つ少なくと
   もＩＬ−１Ｒ１ナノモル当り約０．０１ナノモルＩＬ−
   １の特異的結合活性を有する、可溶性哺乳類ＩＬ−１Ｒ
   、ＩＬ−１Ｒサブユニットまたは実質的に類似もしくは
   同一なＩＬ−１Ｒ類似体からなるタンパク質組成物。 １５、ＩＬ−１Ｒ組成物が第３Ａ図〜第３Ｃ図に記載の
   １−５５７残基のアミノ酸配列の全体もしくは一部と実
   質的に類似したアミノ酸配列からなる、特許請求の範囲
   第１４項記載の組成物。 １６、ＩＬ−１Ｒ組成物が第４Ａ図〜第４Ｃ図中に記載
   の１−５５２残基のアミノ酸配列の全体もしくは一部と
   実質的に類似したアミノ酸配列からなる、特許請求の範
   囲第１４項記載の組成物。 １７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約８２，０００ダ
   ルトンの分子量、ヒトＩＬ−１αに対して３〜６×１０
   ＾９Ｍ以上の結合親和性（Ｋａ）、及びＮＨ＿２【遺伝
   子配列があります】のＮ末端アミノ酸配列を有する糖タ
   ンパク質の形のネズミＩＬ−１受容体からなる実質的に
   均一なタンパク質の組成物を実質的に含んでいる、特許
   請求の範囲第１４項記載の組成物。 １８、ヒトもしくは動物の治療に用いる哺乳類ＩＬ−１
   受容体。 １９、哺乳類の免疫もしくは炎症反応を調節する薬剤を
   製造するためのＩＬ−１受容体の使用。 ２０、ＩＬ−１受容体がヒトＩＬ−１受容体であり、且
   つ治療される哺乳類がヒトである、特許請求の範囲第１
   ９項記載の使用。 ２１、膜貫通領域と細胞質側ドメインが欠如している、
   特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 ２２、有効量のヒトＩＬ−１受容体または生物学的に活
   性のあるヒトＩＬ−１受容体類似物もしくはサブユニッ
   トと適当な希釈剤または担体との混合物から成る哺乳類
   における免疫もしくは炎症反応を調節するためにヒトの
   患者に非経口投与するのに適当な薬剤組成物。 ２３、 （ａ）哺乳類ＩＬ−１受容体を含む試料を、不溶性の支
   持体に結合したＩＬ−１もしくは抗体分子から成るアフ
   ィニティーマトリックスにかけること；及び （ｂ）ＩＬ−１受容体をアフィニティーマトリックスか
   ら溶出することからなる哺乳類ＩＬ−１受容体の精製方
   法。 ２４、 （ｃ）部分精製したネズミＩＬ−１受容体レクチンアフ
   ィニティーカラムにかけること、（ｄ）ネズミＩＬ−１
   受容体をレクチンカラムから溶出すること；及び （ｅ）部分精製したネズミＩＬ−１受容体を逆相系高速
   液体クロマトグラフィーで処理し、そこからネズミＩＬ
   −１受容体をＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色で分析すると一
   本のバンドとし見える２８０ナノメートルでの一本の吸
   光ピークとして溶出すること からなるステップをさらに含む、特許請求の範囲第２３
   項記載の方法。 ２５、ＩＬ−１分子が組み換えヒト ＩＬ−１αである特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６、特許請求の範囲第１５項記載のタンパク質組成物
   の使用を含む、ＩＬ−１もしくはＩＬ−１受容体分子も
   しくはその相互作用を検出する方法。 ２７、ＩＬ−１受容体と免疫反応する抗体。