KR20200110362A - Pac1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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nos
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니라즈 자그디쉬 아그라왈
어윈 첸
수 총
브리나 푸치스로체르
케빈 그라함
아그네스 에바 함부르
마크 레오 마이클스
크리스토퍼 모어
데렉 이. 파이퍼
케네스 윌리엄 워커
줄룬 왕
센 수
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암젠 인크
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Abstract

본 발명은 인간 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩타이드 I형 수용체(PAC1)의 중화 항체 및 이러한 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 중화 항체를 이용하는 편두통 및 군발 두통과 같은 두통 병태의 치료 또는 예방 방법 또한 기술된다.

Description

PAC1 항체 및 이의 용도
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 2018년 1월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/617,157의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[전자 제출된 텍스트 파일의 설명]
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2018년 12월 20일에 생성된 서열 목록의 컴퓨터로 읽을 수 있는 포맷의 사본은 A-2189-WO-PCT_SeqList_ST25로 명명되며 490킬로바이트 크기이다.
[기술분야]
본 발명은 바이오의약품 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩타이드 I형 수용체(PAC1)에 특이적으로 결합하고 이의 생물학적 활성을 강력하게 억제하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 이러한 항체의 생산 및 사용 방법에 관한 것이다.
편두통은 상당한 통증을 수반할 수 있는 일시적인 두통으로, 종종 구역, 구토 및 빛과 소리에 대한 극도의 민감성(광선 공포증, 소리 공포증)을 동반하며, 때로는 감각적 경고 증상 또는 징후(전조)가 선행된다. 편두통은 전 세계적으로 널리 퍼진 질환으로, 유럽 인구의 대략 12%, 그리고 미국의 여성의 18%와 남성의 6%가 편두통 발작으로 고통 받는다. (Lipton et al, Neurology, Vol. 68:343-349, 2007; Lipton et al,, Headache, Vol. 41:646-657, 2001). 미국의 편두통 유병률을 평가하는 한 연구는 편두통 환자 인구의 거의 절반이 한 달에 3회 이상의 편두통을 앓았다고 보고하였다(Lipton et al, Neurology, Vol. 68:343-349, 2007). 또한, 편두통은 우울증 및 혈관 장애와 같은 다수의 정신 및 의학적 동반질환과 관련이 있다(Buse et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, Vol. 81:428-432, 2010; Bigal et al., Neurology, Vol. 72:1864-1871, 2009). 현재 편두통 요법의 대부분은 내약성이 우수하지 않거나 효과적이지 않다(Loder et al., Headache, Vol. 52:930-945, 2012; Lipton et al, 2001). 따라서, 편두통은 충족되지 않은 의학적 요구로 남아 있다.
편두통 발병의 주요 구성요소는 삼차신경혈관계의 활성화와 관련이 있다. 혈관 주위 신경 섬유로부터 삼차 신경 및 부교감 신경전달물질의 방출(S
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nchez-del-Rio and Reuter, Curr. Opin. Neurol., Vol. 17(3):289-93, 2004)은 두개 혈관의 확장을 초래하며, 편두통 발병과 관련이 있다고 제안되었다(Edvinsson, Cephalagia, Vol. 33(13): 1070-1072, 2013; Goadsby et al., New Engl J Med., Vol. 346(4):257-270, 2002).
뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩타이드(PACAP)는 뇌하수체 전엽 세포에서 고리형 AMP(cAMP) 형성을 자극하는 능력에 기초하여 양의 시상하부 추출물로부터 최초로 단리된 38개 아미노산(PACAP38) 또는 27개 아미노산(PACAP27) 펩타이드이다(Miyata et al., Biochem Biophys Res Commun., Vol. 164:567-574, 1989; Miyata et al., Biochem Biophys Res Commun., Vol.170:643-648, 1990). PACAP는 VIP/세크레틴/글루카곤 슈퍼패밀리에 속한다. PACAP27의 서열은 PACAP38의 27개의 N 말단 아미노산에 해당하고, 혈관 활성 장 폴리펩타이드(VIP)와 68%의 동일성을 공유한다(Pantaloni et al., J. Biol. Chem., Vol. 271: 22146-22151, 1996; Pisegna and Wank, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90: 6345-49, 1993; Campbell and Scanes, Growth Regul., Vol. 2:175-191, 1992). 인체에서 PACAP 펩타이드의 주요 형태는 PACAP38이며, PACAP38의 약리학은 PACAP27의 약리학과 다르지 않은 것으로 밝혀졌다. 3개의 PACAP 수용체, 즉 PACAP와 고친화도로 결합하고 VIP에 대해 훨씬 낮은 친화도를 갖는 1개의 수용체(PAC1 수용체)와 PACAP와 VIP를 동등하게 잘 인식하는 2개의 수용체(VPAC1 및 VPAC2 수용체)가 보고되었다(Vaudry et al., Pharmacol Rev., Vol. 61:283-357, 2009).
편두통 유사 두통을 유도하는 유발제로서 PACAP를 사용하는 인간 실험 편두통 모델은 편두통 예방을 위한 처치로서 PACAP/PAC1 신호전달 경로의 길항작용에 대한 접근법을 지지한다. PACAP38은 편두통 환자의 자발적 편두통 발작 중에 혈장에서 상승되며, 이러한 상승된 PACAP38 수준은 급성 편두통 요법인 수마트립탄으로 정상화될 수 있다(Tuka et al., Cephalalgia, Vol. 33: 1085-1095, 2013; Zagami et al., Ann. Clin. Transl. Neurol., Vol.1: 1036-1040, 2014). PACAP38의 주입은 건강한 대상체에서 두통을, 편두통 환자에서 편두통 유사 두통을 유발한다(Schytz et al., Brain, Vol. 132:16-25, 2009; Amin et al., Brain, Vol. 137: 779-794, 2014; Guo et al., Cephalalgia, Vol. 37:125-135, 2017). 그러나 동일한 모델에서, VIP는 편두통 환자에서 편두통 유사 두통을 유발하지 않는다(Rahmann et al., Cephalalgia, Vol. 28:226-236, 2008). VIP 주입으로 인한 편두통 유사 두통 유도의 결여는 PACAP38 펩타이드의 효과가 VPAC1 또는 VPAC2 수용체보다는 PAC1 수용체를 통해 매개됨을 시사한다. VIP는 전자의 두 수용체에서 훨씬 높은 친화도를 갖기 때문이다. 이 개념은 PAC1 수용체 길항제가 편두통의 생체 내 모델에서 삼차신경경부 복합체에서 통각 뉴런 활성을 억제하는 동물 연구에 의해 더욱 뒷받침된다(Akerman et al., Sci. Transl. Med., Vol. 7: 308ra157, 2015; Hoffmann et al., Cephalalgia, Vol. 37 (1S): 3, Abstract OC-BA-004, 2017). 종합하면, 이러한 데이터는 PAC1 수용체의 PACAP 활성화를 억제하는 약리학적 제제가 편두통을 치료할 가능성이 있음을 시사한다.
본 발명은 부분적으로, 인간 PAC1에 특이적으로 결합하고 강력하게 억제하는 고친화도 항체의 설계 및 생성을 기초로 한다. 본 발명의 항체는 피코몰 범위의 IC50 값을 갖는, 이전에 기술된 항-PAC1 항체와 비교하여 인간 PAC1에 대해 증진된 억제 효능을 갖는다. 단리된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 PAC1의 PACAP 유도성 활성화 억제 또는 감소, 혈관 확장의 억제 또는 감소, 및 편두통 및 기타 혈관성 두통 증상의 개선 또는 치료를 비롯하여 인간 PAC1의 생물학적 활성을 억제, 방해, 또는 조절하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 Asp59, Asn60, Ile61, Arg116, Asn117, Thr119, Glu120, Asp121, Gly122, Trp123, Ser124, Glu125, Pro126, Phe127, Pro128, His129, Tyr130, Phe131, Asp132, 및 Gly135로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에서 인간 PAC1에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 에피토프는 인간 PAC1의 적어도 아미노산 Asn60, Ile61, Glu120, 및 Asp121을 포함한다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 이들 에피토프 잔기와 상호작용하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내의 특정 위치의 특정 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 AHo 넘버링에 따른 위치 29의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Glu120 또는 Asp121과 상호작용하는 염기성 아미노산(예를 들어, 아르기닌 또는 리신)인 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Asn60 또는 Ile61과 상호작용하는 소수성, 염기성, 또는 중성 친수성 아미노산(예를 들어, 이소류신, 발린, 류신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신)인 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 AHo 넘버링에 따른 위치 66의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Asn60 또는 Ile61과 상호작용하는 염기성 또는 중성 친수성 아미노산(예를 들어, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신)인 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 PAC1 수용체의 리간드 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 500 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 300 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 50 pM 내지 약 500 pM의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 다른 종의 PAC1 수용체와 교차 반응한다. 일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체에 특이적으로 결합하고, 이의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 이러한 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM 또는 약 50 pM 내지 약 500 pM의 IC50으로 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 랫트 PAC1 수용체에 특이적으로 결합하고, 이의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 10 nM 미만의 IC50, 예를 들어 약 0.1 nM 내지 약 10 nM 또는 약 100 pM 내지 약 2 nM의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역 또는 CDR은 본 명세서에서 기술된 임의의 항-PAC1 항체로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 5 내지 16으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL1; 서열번호 26의 서열을 포함하는 CDRL2; 서열번호 36 내지 38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL3; 서열번호 88 내지 96으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH1; 서열번호 106 내지 166으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 171 내지 177로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH3을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 25로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL1; 서열번호 27 내지 35로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL2; 서열번호 39 내지 51로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL3; 서열번호 97 내지 105로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH1; 서열번호 167 내지 170으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 178 내지 190으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH3을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 54 내지 66 및 서열번호 68 내지 87로부터 선택되는 서열과 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 191 내지 312로부터 선택되는 서열과 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 54 내지 66으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 191 내지 295로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 68 내지 87로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 296 내지 312로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
위에서 기술된 구현예를 포함한, 본 명세서에서 기술된 임의의 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 또 다른 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 완전 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 단일클론 항체는 임의의 이소형, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 단일클론 항체일 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 IgG1 항체이다. 또 다른 특정 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 IgG2 항체이다. 단일클론 항체는 인간 카파 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 카파 불변 영역은 서열번호 318 또는 서열번호 319의 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 318 또는 서열번호 319의 서열을 포함하는 인간 카파 불변 영역에 융합된 표 1A에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 람다 불변 영역은 서열번호 315의 서열을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 315의 서열을 포함하는 인간 람다 불변 영역에 융합된 표 1A에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편의 글리코실화에 영향을 미치는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 글리코실화를 감소시키거나 제거하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 구현예에서, 비글리코실화 항체는 이의 중쇄 내에 아미노산 위치 N297(EU 넘버링 체계에 따름)에서의 돌연변이, 예컨대 N297G 돌연변이를 포함할 수 있다. 비글리코실화 항체는 항체 구조를 안정화시키기 위한 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 시스테인 치환 쌍, 예컨대 A287C 및 L306C, V259C 및 L306C, R292C 및 V302C, 및 V323C 및 I332C(EU 넘버링 체계에 따른 아미노산 위치)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 비글리코실화 항체는 이의 중쇄 내에 R292C 및 V302C 돌연변이(EU 넘버링 체계에 따름)를 포함한다. 특정 구현예에서, 비글리코실화 항-PAC1 항체는 서열번호 324 또는 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터뿐만 아니라, 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편의 생산 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양 배지 또는 숙주 세포로부터 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 PAC1 생물 활성과 관련된 병태, 예컨대 두통, 편두통, 군발 두통, 및 혈관운동 증상의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물 또는 의약의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 임의의 방법에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 유효량의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법으로 치료 또는 예방되는 두통 병태는 편두통이다. 편두통은 삽화 편두통 또는 만성 편두통일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법으로 치료 또는 예방되는 두통 병태는 군발 두통이다. 특정 구현예에서, 방법은 이들 병태에 대한 예방적 처치를 제공한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 제2 두통 치료제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 제2 두통 치료제는 급성 두통 치료제, 예컨대 세로토닌 수용체 효능제(예를 들어, 5HT1B, 5HT1D, 및/또는 5HT1F 세로토닌 수용체의 효능제)일 수 있다. 일부 구현예에서, 급성 두통 치료제는 트립탄, 에르고타민, 비 스테로이드 항염증제, 또는 오피오이드이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 제2 두통 치료제는 예방적 두통 치료제, 예컨대 항간질제, 베타 차단제, 항우울제, 또는 오나보툴리눔 독소 A이다. 제2 두통 치료제는 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편 전, 후, 또는 동시에 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 방법은 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 CGRP 경로 길항제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. CGRP 경로 길항제는 인간 CGRP 수용체의 길항제, 예컨대 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 CGRP 경로 길항제는 에레누맙이다. 다른 구현예에서, CGRP 경로 길항제는 CGRP 리간드의 길항제, 예컨대 인간 α-CGRP 및/또는 β-CGRP에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 이러한 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 CGRP 경로 길항제는 프레마네주맙이다. 이러한 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 CGRP 경로 길항제는 갈카네주맙이다. 이러한 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 CGRP 경로 길항제는 엡티네주맙이다.
본 발명은 또한 혈관확장 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장의 억제 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 본 명세서에서 기술된 유효량의 임의의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료를 필요로 하는 환자는 두통 병태, 예컨대 편두통 또는 군발 두통을 앓는다. 다른 구현예에서, 치료를 필요로 하는 환자는 혈관운동 증상(예를 들어, 일과성 열감, 안면 홍조, 발한, 및 야간 발한), 예컨대 폐경과 관련된 증상을 앓는다.
본 명세서에서 개시된 임의의 방법에서 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 방법에 따른 투여를 위한 의약의 제조를 위한 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 두통 병태는 편두통(예를 들어, 삽화 및 만성 편두통) 및 군발 두통을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 혈관확장 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장 억제 방법에 사용하기 위한 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 이러한 구현예에서, 환자는 두통 병태로 진단될 수 있거나 두통 병태를 앓을 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 두통 병태를 앓는 환자의 인간 PAC1 수용체의 활성화 억제 방법에 사용하기 위한 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 두통 병태는 편두통(예를 들어, 삽화 또는 만성 편두통) 또는 군발 두통일 수 있다.
본 발명은 또한 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 두통 병태는 편두통(예를 들어, 삽화 및 만성 편두통) 및 군발 두통을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 혈관확장 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장 억제를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 이러한 구현예에서, 환자는 두통 병태로 진단될 수 있거나 두통 병태를 앓을 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 두통 병태를 앓는 환자의 인간 PAC1 수용체의 활성화 억제를 위한 의약의 제조에 있어서 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 두통 병태는 편두통(예를 들어, 삽화 또는 만성 편두통) 또는 군발 두통일 수 있다.
도 1a는 29G4v9 항체의 인간 PAC1 세포 외 도메인(ECD) 및 Fab 단편 사이의 복합체의 결정 구조의 정면도이다. VL = 경쇄 가변 영역; CL = 경쇄 불변 영역; VH = 중쇄 가변 영역; 및 CH1 = 중쇄 CH1 불변 영역.
도 1b는 29G4v9 항체의 인간 PAC1 ECD 및 Fab 단편 사이의 복합체의 결정 구조의 측면도이다. 이 측면도는 왼쪽으로 90˚ 회전한 도 1a에 제시된 구조를 도시한 것이다. 이 측면도에서, 경쇄 가변 영역(VL)은 중쇄 가변 영역(VH) 뒤에 위치하고, 경쇄 불변 영역(CL)은 중쇄 CH1 불변 영역 뒤에 위치한다.
도 2a는 인간 PAC1 ECD와 29G4v9 Fab의 경쇄 CDR1(서열번호 3의 아미노산 24 내지 34) 사이의 계면의 확대도이다. 구역 1은 인간 PAC1 ECD(서열번호 1)의 Glu120 및 Asp121 잔기를 함유하는 한편, 구역 3은 인간 PAC1 ECD의 Phe127 잔기를 함유한다.
도 2b는 인간 PAC1 ECD와 29G4v9 Fab의 경쇄 CDR3의 Arg93 잔기 사이의 계면의 확대도이다.
도 3a는 인간 PAC1 ECD와 29G4v9 Fab의 중쇄 CDR1의 아미노산 Arg31 및 Phe32 사이의 계면의 확대도이다. 두 개의 중쇄 CDR1 아미노산은 인간 PAC1 ECD의 Phe131 잔기의 양쪽에 있다.
도 3b는 (서열번호 1에 대해) 아미노산 잔기 Asn60 및 Ile61을 함유하는 인간 PAC1 ECD의 영역 및 29G4v9 Fab의 중쇄 CDR2 아미노산 Tyr53, Asp54, 및 Gly56 사이의 계면의 확대도이다.
도 3c는 인간 PAC1 ECD와 29G4v9 Fab의 중쇄 CDR3의 아미노산 Val102, Leu103, 및 Thr104 사이의 계면의 확대도이다.
도 4는 효모 디스플레이 항체 Fab 돌연변이체 라이브러리로부터 개선된 결합 돌연변이체의 선택 과정의 개략도이다.
도 5는 효모 디스플레이 라이브러리로부터 고친화도 결합 돌연변이체의 결합 해리 속도에 의해 유도된 선택 과정의 개략도이다.
도 6은 랫트에서 피부 혈류의 막사딜란(maxadilan) 유도성 증가에 미치는 항-PAC1 항체의 억제 효과를 보여준다. 7개의 항체(420653, 420845, 420943, 421873, 420889(PL-50347), 421091(PL-50350), 및 421051(PL-50351)) 중 하나를 10 ng의 막사딜란으로의 유발(피내 주사) 24시간 전에 0.1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg의 용량으로 정맥 내로 랫트에게 투여하였다. 막사딜란 유발 30분 후에 피부 혈류를 레이저 도플러 영상화로 평가하였다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 MCT를 이용, 비히클군 대비 *p<0.05, **p<0.01.
도 7a는 랫트에서 피부 혈류의 막사딜란 유도성 증가에 미치는 항-PAC1 항체 420653의 용량 의존적 효과를 보여준다. 10 ng의 막사딜란으로의 유발(피내 주사) 24시간 전에 0.01 mg/kg 내지 3 mg/kg 범위의 7가지 용량 중 하나로 항체를 정맥 내로 랫트에게 투여하였다. 막사딜란 유발 30분 후에 피부 혈류를 레이저 도플러 영상화로 평가하였다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 MCT를 이용, 비히클군 대비 *p<0.05, ****p<0.0001.
도 7b는 랫트에서 피부 혈류의 막사딜란 유도성 증가에 미치는 항-PAC1 항체 420845의 용량 의존적 효과를 보여준다. 10 ng의 막사딜란으로의 유발(피내 주사) 24시간 전에 0.01 mg/kg 내지 3 mg/kg 범위의 5가지 용량 중 하나로 항체를 정맥 내로 랫트에게 투여하였다. 막사딜란 유발 30분 후에 피부 혈류를 레이저 도플러 영상화로 평가하였다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 MCT를 이용, 비히클군 대비 ****p<0.0001.
도 7c는 랫트에서 피부 혈류의 막사딜란 유도성 증가에 미치는 항-PAC1 항체 420943의 용량 의존적 효과를 보여준다. 10 ng의 막사딜란으로의 유발(피내 주사) 24시간 전에 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg 범위의 6가지 용량 중 하나로 항체를 정맥 내로 랫트에게 투여하였다. 막사딜란 유발 30분 후에 피부 혈류를 레이저 도플러 영상화로 평가하였다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 MCT를 이용, 비히클군 대비 ****p<0.0001.
도 7d는 랫트에서 피부 혈류의 막사딜란 유도성 증가에 미치는 항-PAC1 항체 421873의 용량 의존적 효과를 보여준다. 10 ng의 막사딜란으로의 유발(피내 주사) 24시간 전에 0.3 mg/kg 내지 30 mg/kg 범위의 5가지 용량 중 하나로 항체를 정맥 내로 랫트에게 투여하였다. 막사딜란 유발 30분 후에 피부 혈류를 레이저 도플러 영상화로 평가하였다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 MCT를 이용, 비히클군 대비 *p<0.05, ****p<0.0001.
도 8a는 랫트에서 1 mg/kg의 단일 정맥 내 용량 후의 항-PAC1 항체 420653, 420845, 420943, 및 421873에 대한 혈청 농도-시간 프로파일이다.
도 8b는 랫트에서 5 mg/kg의 단일 정맥 내 용량 후의 항-PAC1 항체 420653, 420845, 420943, 및 421873에 대한 혈청 농도-시간 프로파일이다.
도 8c는 랫트에서 25 mg/kg의 단일 정맥 내 용량 후의 항-PAC1 항체 420653, 420845, 420943, 및 421873에 대한 혈청 농도-시간 프로파일이다.
도 9는 시노몰구스 원숭이에서 10 mg/kg의 단일 정맥 내 용량 후의 항-PAC1 항체 420653, 420845, 420943, 421873, 및 29G4v22에 대한 혈청 농도-시간 프로파일이다.
도 10a 및 도 10b는 시노몰구스 원숭이에서 피부 혈류의 막사딜란 유도성 증가에 미치는 항-PAC1 항체 420653 및 29G4v22의 억제적 효과의 시간 경과를 보여준다. 24마리의 시노몰구스 원숭이에게 제0일에 0.1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 항체 420653 또는 10 mg/kg의 항체 29G4v22의 단일 i.v. 볼루스 주사를 제공하였다. 항체 투여 후 제2일, 제4일, 제7일, 제10일, 제14일, 제21일, 제28일, 및 제36일에, 막사딜란 사후 반응을 측정하였다. 각각의 경우에, 1 ng의 막사딜란 피내 주사 30분 후 피부 혈류를 레이저 도플러 영상화에 의해 측정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시하였다. 도 10a는 항체 처리 후 지시된 일자에서의 막사딜란의 피내 주사에 의해 유도된 피부 혈류의 기준선으로부터의 변화(%)를 보여준다. 일원 ANOVA에 이은 본페로니 다중 비교 검정에 의한 동일한 처리군 내에서의 제0일과 비교한 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 군당 8마리의 동물, 단 ^ 부호로 표시한 제36일의 경우, 4마리의 동물을 3 mg/kg의 항체 420653으로 시험하였다. 도 10b는 억제(%)로 표시한 피부 혈류의 막사딜란 유도성 증가에 미치는 항체 처리의 억제 효과를 보여준다. 양측 비 쌍체 t 검정에 의한 각 시점에서의 3 mg/kg의 항체 420653와 10 mg/kg의 항체 29G4v22 사이의 비교, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001
본 발명은 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩타이드 I형 수용체(PAC1), 특히 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 이전에 기술된 항-PAC1 길항제 항체와 비교하여 인간 PAC1에 대해 증진된 억제 효능을 갖는다. 본 발명의 항체는 또한 랫트 PAC1 수용체 및 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체와 교차 반응하여, 이들 종에서 항체의 전임상 생체 내 평가를 허용한다.
인간 PAC1은 염색체 7의 ADCYAP1R1 유전자에 의해 암호화된 468개 아미노산 단백질(NCBI 기준 서열 NP_001109.2)이다. 인간 PAC1 수용체는 아데닐산 고리화효소에 양으로 결합된 G 단백질 결합 수용체이다. 인간 PAC1 수용체의 이의 내인성 리간드(예를 들어, PACAP38 또는 PACAP27)에 의한 활성화는 세포 내 고리형 AMP(cAMP)의 증가를 초래한다. 인간 PAC1의 아미노산 서열은 아래에서 서열번호 1로 제공된다.
1 MAGVVHVSLA ALLLLPMAPA MHSDCIFKKE QAMCLEKIQR ANELMGFNDS SPGCPGMWDN
61 ITCWKPAHVG EMVLVSCPEL FRIFNPDQVW ETETIGESDF GDSNSLDLSD MGVVSRNCTE
121 DGWSEPFPHY FDACGFDEYE SETGDQDYYY LSVKALYTVG YSTSLVTLTT AMVILCRFRK
181 LHCTRNFIHM NLFVSFMLRA ISVFIKDWIL YAEQDSNHCF ISTVECKAVM VFFHYCVVSN
241 YFWLFIEGLY LFTLLVETFF PERRYFYWYT IIGWGTPTVC VTVWATLRLY FDDTGCWDMN
301 DSTALWWVIK GPVVGSIMVN FVLFIGIIVI LVQKLQSPDM GGNESSIYLR LARSTLLLIP
361 LFGIHYTVFA FSPENVSKRE RLVFELGLGS FQGFVVAVLY CFLNGEVQAE IKRKWRSWKV
421 NRYFAVDFKH RHPSLASSGV NGGTQLSILS KSSSQIRMSG LPADNLAT
인간 PAC1 단백질(서열번호 1)의 아미노산 1 내지 23은 신호 펩타이드를 구성하며, 이는 일반적으로 성숙 단백질로부터 제거된다. 성숙한 인간 PAC1 단백질은 7-막관통 도메인, N 말단 영역 및 3개의 세포 외 루프, 3개의 세포 내 루프로 구성된 세포 외 도메인, 및 C 말단 세포질 도메인으로 구성된 G 단백질 결합 수용체의 기본 구조를 갖는다. N 말단의 세포 외 도메인은 대략 서열번호 1의 아미노산 24 내지 153에 있고, 7개의 막관통 도메인 중 첫 번째는 서열번호 1의 아미노산 154에서 시작한다. C 말단의 세포질 도메인은 대략 서열번호 1의 아미노산 397 내지 468에 위치한다. 아미노산 서열 내의 도메인의 위치는 문헌[Blechman and Levkowitz, Front. Endocrinol., Vol. 4 (55): 1-19, 2013] 참고. 용어 "인간 PAC1", "인간 PAC1 수용체", "hPAC1" 및 "hPAC1 수용체"는 상호 교환가능하게 사용되며, 서열번호 1의 폴리펩타이드, 서열번호 1의 폴리펩타이드 마이너스 신호 펩타이드(아미노산 1 내지 23), 인간 PAC1의 대립유전자 변이체, 또는 인간 PAC1의 스플라이스 변이체를 지칭할 수 있다.
본 발명은 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편, 및 항원 결합 단편이 항원에 대한 항체의 결합을 촉진하는 입체 형태를 채택하게 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분을 포함하는 단백질이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 일반적으로 2개의 경쇄 폴리펩타이드(각각 약 25 kDa) 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드(각각 약 50~70 kDa)를 포함하는 사량체 면역글로불린 단백질을 나타낸다. 용어 "경쇄" 또는 "면역글로불린 경쇄"는 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, 단일 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 및 단일 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)은 인간 카파(κ) 또는 인간 람다(λ) 불변 도메인일 수 있다. 용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지, 단일 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2), 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3), 및 선택적으로 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 4(CH4)를 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 중쇄는 뮤(μ), 델타(Δ), 감마(γ), 알파(α), 및 엡실론(ε)으로서 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG-클래스 및 IgA-클래스 항체는 하위클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2로 각각 추가 구분된다. IgG, IgA, 및 IgD 항체에서의 중쇄는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는 반면, IgM 및 IgE 항체에서의 중쇄는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3, 및 CH4)을 갖는다. 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 서브타입을 포함하는 임의의 면역글로불린 이소형에서 유래될 수 있다. 항체 쇄는 CL 도메인과 CH1 도메인 사이(즉 경쇄와 중쇄 사이) 및 2개의 항체 중쇄의 힌지 영역들 사이의 폴리펩타이드간 이황화 결합을 통해 함께 연결된다.
본 발명은 또한 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 명세서에서 "결합 단편" 또는 "단편"과 상호 교환가능하게 사용되는 "항원 결합 단편"은 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 존재하는 아미노산 중 적어도 일부가 결여된 항체의 일부이지만 여전히 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 항원 결합 단편은 단일 쇄 가변 단편(scFv), 나노바디(예를 들어, 카멜리드 중쇄 항체의 VH 도메인; VHH 단편, 문헌[Cortez-Retamozo et al., Cancer Research, Vol. 64:2853-57, 2004] 참고), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, Fd 단편, 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 임의의 포유동물 공급원, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 토끼 또는 카멜리드로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단편은 온전한 항체와 표적 항원의 결합을 위해 경쟁할 수 있고, 단편은 온전한 항체의 변형(예를 들어, 효소적 또는 화학적 절단)에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술 또는 펩타이드 합성을 사용하여 드 노보 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원과 결합하는 항체로부터의 적어도 하나의 CDR, 예를 들어, 항원에 결합하는 항체로부터의 중쇄 CDR3을 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 항체의 중쇄로부터의 3개의 모든 CDR 또는 항원에 결합하는 항체의 경쇄로부터의 3개의 모든 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 단편은 항원에 결합하는 항체로부터의 6개의 CDR(중쇄로부터 3개 및 경쇄로부터 3개)을 모두 포함한다.
용어 "단리된 분자"(분자가 예를 들어, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항체, 또는 항원 결합 단편인 경우)는 이의 유도 기원 또는 공급원에 의해, (1) 이의 원래 상태로 동반되는 자연적 관련 성분들과 결합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 존재하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성된 분자 또는 자연적으로 생성된 세포와 다른 세포 시스템에서 발현되는 분자는 자연적 관련 성분으로부터 "단리"될 것이다. 분자는 또한 당 업계에 공지된 정제 기술을 사용하여 단리에 의해 자연적 관련 성분이 실질적으로 없게 될 수 있다. 분자 순도 또는 균질성은 당 업계에 공지된 다수의 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 샘플의 순도는 당 업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 폴리펩타이드를 가시화하기 위하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 염색을 사용하여 분석할 수 있다. 특정 목적을 위해, 정제를 위해 당 업계에 널리 공지된 다른 수단 또는 HPLC를 사용함으로써 더 높은 해상도를 제공할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PAC1에 특이적으로 결합한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유사한 결합 분석 조건 하에, 다른 관련되지 않은 단백질에 대한 이의 친화도와 비교하여 표적 항원에 대해 상당히 높은 결합 친화도를 가지며, 결과적으로 구별될 수 있을 때 그 표적 항원에 "특이적으로 결합"한다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 항체 또는 결합 단편은 KD가 1 x 10-8 M 이하일때 "높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 1 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 5 x 10-10 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 1 x 10-10 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 5 x 10-11 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 1 x 10-11 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 5 x 10-12 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 1 x 10-12 M 이하의 KD로 인간 PAC1에 결합한다.
친화도는 다양한 기술을 사용하여 측정되며, 이의 예는 친화도 ELISA 분석법이다. 다양한 구현예에서, 친화도는 표면 플라즈몬 공명 분석(예를 들어, BIAcore® 기반 분석)에 의해 측정된다. 이 방법을 사용하여, 결합 속도 상수(ka, 단위: M-1s-1) 및 해리 속도 상수(kd: s-1)를 측정할 수 있다. 그 후, 평형 해리 상수(KD, 단위: M)를 운동 속도 상수의 비율(kd/ka)로부터 계산할 수 있다. 일부 구현예에서, 문헌[Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008]에 기술된 바와 같이, 친화도는 동역학적 방법, 예컨대 역학적 배제 분석법(KinExA)에 의해 측정된다. KinExA 분석법을 사용하여, 평형 해리 상수(KD, 단위: M) 및 결합 속도 상수(ka, 단위: M-1s-1)를 측정할 수 있다. 해리 속도 상수(kd, 단위: s-1)를 이들 값(KD x ka)으로부터 계산할 수 있다. 다른 구현예에서, 친화도는 문헌[Kumaraswamy et al., Methods Mol. Biol., Vol. 1278:165-82, 2015]에서 기술되고 Octet® 시스템(Pall ForteBio)에 활용된 것과 같은 바이오층 간섭측정법에 의해 결정된다. 동역학(ka 및 kd) 및 친화도(KD) 상수는 바이오층 간섭측정법을 사용하여 실시간으로 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항체 또는 결합 단편은 약 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 s-1 또는 그 이하의 인간 PAC1에 대한 Kd(해리 속도 상수)에 의해 측정한 결합도(더 낮은 값은 더 높은 결합도를 나타냄), 및/또는 약 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 M 또는 그 이하의 인간 PAC1에 대한 KD(평형 해리 상수)에 의해 측정한 결합 친화도(더 낮은 값은 더 높은 결합 친화도를 나타냄)와 같은 원하는 특성을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 인간 VPAC1 수용체(NCBI 기준 서열 NP_004615.2) 및 인간 VPAC2 수용체(NCBI 기준 서열 NP_003373.2)와 같은, 세크레틴/글루카곤 수용체 패밀리의 다른 구성원에 현저하게 결합하지 않거나 이들과 교차 반응하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 결합 단편이 비슷한 결합 분석 조건 하에서 표적 항원에 대해 다른 관계 없는 단백질에 대한 친화도와 비슷한 결합 친화도를 가질 때, 항체 또는 결합 단편은 그 항원에 "현저하게 결합하지 않는다". 표적 항원에 현저하게 결합하지 않는 항체 또는 결합 단편은 또한 표적 항원에 대한 본 명세서에서 기술된 것들과 같은 친화도 분석에서 음성 대조군과 통계적으로 상이한 신호를 생성하지 않는 단백질을 포함할 수 있다. 예로서, 음성 대조군(예를 들어, 항체가 없는 완충액)으로 생성된 신호 값과 통계적으로 상이하지 않은 인간 VPAC1에 대한 결합을 결정하는 ELISA 또는 BIAcore® 기반 분석에서의 신호 값을 생성하는 항체는 인간 VPAC1에 현저하게 결합하지 않는 것으로 간주될 것이다. 항원과 현저하게 결합하지 않는 항체 또는 결합 단편은 그 항원에 대해 1 x 10-6 M 초과, 1 x 10-5 M 초과, 1 x 10-4 M 초과, 또는 1 x 10-3 M 초과의 평형 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 인간 VPAC1 및 인간 VPAC2에 비해 인간 PAC1에 선택적으로 결합한다. 즉, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 인간 VPAC1 또는 인간 VPAC2에 현저하게 결합하지 않는다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인간 PAC1 수용체의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나, 방해하거나 조절할 수 있다. 인간 PAC1 수용체의 생물학적 활성은 PACAP 매개성 수용체 신호전달 경로의 유도, 혈관확장의 유도, 및 혈관수축의 억제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 인간 PAC1 수용체에 대한 PACAP(예를 들어 PACAP38 또는 PACAP27)의 결합을 억제한다. "결합의 억제"는 과량의 항체 또는 결합 단편이 PACAP에 결합된 인간 PAC1 수용체의 양을, 예를 들어, 시험관 내 경쟁적 결합 분석에서 결합을 측정하여, 예를 들어, 적어도 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99% 이상 감소시키거나 또는 그 역일 때, 일어난다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 PAC1 수용체에 대한 PACAP의 결합을 얼마나 강력하게 방지하는지를 나타내는 억제 상수(Ki)는 이러한 경쟁적 결합 분석으로부터 계산할 수 있다. 예로서, 방사성 동위원소(예를 들어 125I)를 수용체 리간드(예를 들어 PACAP38)에 부착시키고, 이 분석법은 증가하는 농도의 항-PAC1 항체 또는 이의 결합 단편 중에서 인간 PAC1 수용체에 대한 방사성 표지된 리간드의 결합을 측정한다. Ki 값은 식 Ki=IC50/(1+([L]/Kd))을 사용하여 계산할 수 있으며, 식에서 [L]은 사용된 방사성 리간드(예를 들어, 125I 표지된 PACAP38)의 농도이고, Kd는 방사성 리간드의 해리 상수이다. 예를 들어, 문헌[Keen M, MacDermot J (1993) Analysis of receptors by radioligand binding. In: Wharton J, Polak JM (eds) Receptor autoradiography, principles and practice. Oxford University Press, Oxford] 참고. 길항제에 대한 Ki의 값이 작을수록, 길항제는 더욱 강력하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 nM 이하의 Ki로 방사성 표지된 PACAP 리간드와 인간 PAC1 수용체에 대한 결합을 위해 경쟁한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 500 pM 이하의 Ki로 방사성 표지된 PACAP 리간드와 인간 PAC1 수용체에 대한 결합을 위해 경쟁한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 200 pM 이하의 Ki로 방사성 표지된 PACAP 리간드와 인간 PAC1 수용체에 대한 결합을 위해 경쟁한다. 특정한 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 100 pM 이하의 Ki로 방사성 표지된 PACAP 리간드와 인간 PAC1 수용체에 대한 결합을 위해 경쟁한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인간 PAC1 수용체의 리간드 유도성 활성화를 억제한다. 리간드는 수용체의 내인성 리간드, 예컨대 PACAP38 또는 PACAP27일 수 있거나, 또는 리간드는 수용체의 또 다른 공지된 효능제, 예컨대, 막사딜란일 수 있다. 막사딜란은 본래 VPAC1 또는 VPAC2와 비교하여 PAC1에 대해 절묘하게 선택적인 모래파리로부터 단리된 65개 아미노산의 펩타이드이며, 따라서 PAC1 선택적 효능제로서 사용될 수 있다(Lerner et al., J Biol Chem., Vol. 266(17):11234-11236, 1991; Lerner et al., Peptides, Vol. 28(9): 1651-1654, 2007). PAC1 수용체의 활성화 평가를 위한 다양한 분석법이 당 업계에 공지되어 있으며, 리간드 유도성 칼슘 동원 및 cAMP 생산을 측정하는 세포 기반의 분석법을 포함한다. 예시적인 세포 기반의 cAMP 분석법은 실시예 3에서 기술되어 있다. 기타 적합한 PAC1 수용체 활성화 분석법은 문헌[Dickson et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol. 1070:239-42, 2006]; 문헌[Bourgault et al., J. Med. Chem., Vol. 52: 3308-3316, 2009]; 및 미국 특허 공개 제2011/0229423호에 기술되어 있으며, 이들 전부는 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
PAC1 수용체 활성화에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 억제 활성은 위에 기술된 것들과 같은, 수용체에 대한 임의의 기능적 분석법에서 IC50을 계산하여 정량화할 수 있다. "IC50"은 생물학적 또는 생화학적 기능의 50% 저해를 달성하는 데 필요한 용량/농도이다. 방사성 리간드를 이용할 때, IC50은 방사성 리간드의 특이적 결합의 50%를 대체하는 경쟁 리간드의 농도이다. 임의의 특정 물질 또는 길항제의 IC50은 용량 반응 곡선을 구성함으로써 그리고 특정 기능성 분석에서 효능제 활성을 반전시키는 데 있어서 상이한 농도의 약물 또는 길항제의 효과를 조사함으로써 결정할 수 있다. IC50 값은 효능제의 최대 생물학적 반응의 절반을 억제하는 데 필요한 농도를 결정함으로써 주어진 길항제 또는 약물에 대해 계산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 항-PAC1 항체 또는 이의 결합 단편에 대한 IC50 값은 실시예에서 기술된 cAMP 분석법과 같은 임의의 기능성 분석에서 인간 PAC1 수용체를 활성화시키는 데 있어서 리간드(예를 들어 PACAP27, PACAP38, 또는 막사딜란)의 최대 생물학적 반응의 절반을 억제하는 데 필요한 항체 또는 결합 단편의 농도를 결정함으로써 계산할 수 있다. PAC1 수용체의 리간드 유도성(예를 들어 PACAP 유도성) 활성화를 억제하는 항-PAC1 항체 또는 이의 결합 단편은 PAC1 수용체의 중화 또는 길항제 항체 또는 결합 단편으로 이해된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성(PACAP38 또는 PACAP27 유도성) 활성화를 억제한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반의 칼슘 동원 분석 또는 cAMP 분석에 의해 측정 시 약 10 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 5 nM, 약 3 nM, 약 1 nM 미만, 약 800 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 일 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 5 nM 미만의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 1 nM 미만의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 500 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 300 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 50 pM 내지 약 500 pM의 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 다른 종으로부터의 PAC1 수용체에 결합하고 이를 억제한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체(NCBI 기준 서열 XP_015303041.1)에 결합하고, 이를 억제한다. 이러한 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 칼슘 동원 분석 또는 cAMP 분석으로 측정 시 약 10 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 800 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만의 IC50으로 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 1 nM 미만의 IC50으로 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 500 pM 미만의 IC50으로 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM의 IC50으로 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 50 pM 내지 약 500 pM의 IC50으로 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 랫트 PAC1 수용체(NCBI 기준 서열 NP_598195.1)에 결합하고, 이를 억제한다. 이러한 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 칼슘 동원 분석 또는 cAMP 분석으로 측정 시, 약 10 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 800 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 10 nM 미만의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 5 nM 미만의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 500 pM 미만의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 300 pM 미만의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시, 약 100 pM 내지 약 2 nM의 IC50으로 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제한다. 본 발명의 항체 또는 결합 단편이 다른 종으로부터의 PAC1 수용체와 교차 반응하는 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 단편은 비슷한 효능으로 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 시노몰구스 원숭이 또는 랫트 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제하는 항체 또는 결합 단편에 대한 IC50과 비슷한 IC50으로 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 다른 종의 본 발명의 항체 또는 결합 단편의 PAC1 수용체에 대한 교차 반응성은, 이 항체 또는 결합 단편을 치료 효능에 대한 추가의 전임상 동물 모델에서 평가할 수 있으므로 유리할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 VPAC1 수용체 또는 VPAC2 수용체의 리간드 유도성(예를 들어, PACAP38-, PACAP27-, 또는 VIP 유도성) 활성화를 현저하게 억제하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 또는 부재 하에 리간드 유도성 수용체 활성화 또는 수용체에 대한 리간드 결합 사이에 통계적 차이가 없는 경우, 항체 또는 항체 또는 항원 결합 단편은 수용체의 활성화 또는 리간드의 이의 수용체에 대한 결합을 "현저하게 억제하지 않을" 것이다. 예를 들어, 항체 또는 결합 단편의 존재 하에 인간 VPAC1 수용체를 발현하는 세포에서 PACAP 또는 VIP에 의해 유도된 cAMP 생산량이 항체 또는 결합 단편의 부재 하에 생산된 양과 통계적으로 상이하지 않다면, 항체 또는 결합 단편은 인간 VPAC1 수용체의 PACAP/VIP 유도성 활성화를 현저하게 억제하지 않는다고 간주될 것이다. 마찬가지로, 과량의 항체 또는 결합 단편의 존재 하에 인간 VPAC1 수용체에 결합된 PACAP 또는 VIP의 양이 항체 또는 결합 단편의 부재 하에 수용체에 결합된 PACAP 또는 VIP의 양과 통계적으로 상이하지 않다면, 항체 또는 결합 단편은 인간 VPAC1 수용체에 대한 PACAP 또는 VIP의 결합을 현저하게 억제하지 않는다고 간주될 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 인간 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 억제하지만, 인간 VPAC1 수용체 또는 인간 VPAC2 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 현저하게 억제하지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 인간 VPAC1 수용체 및 인간 VPAC2 수용체와 비교하여 인간 PAC1 수용체를 선택적으로 억제한다.
본 발명의 항체 및 결합 단편은, 일부 구현예에서, 인간 PAC1의 특정 영역 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 항체 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정소를 지칭한다. 에피토프는 항원을 표적으로 하는 항체 또는 결합 단편에 의해 결합되거나 항체 또는 결합 단편과 상호작용하는 항원의 영역이고, 항원이 단백질일 때 항체 또는 결합 단편과 직접적으로 접촉하거나 항체 또는 결합 단편과 상호작용하는 특이적 아미노산을 포함한다. 에피토프는 인접 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 나란히 놓이는 비 인접 아미노산 둘 다에 의해 형성될 수 있다. "선형 에피토프"는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 선형 에피토프는 독특한 서열에서 전형적으로 적어도 3 또는 4개의 아미노산, 그리고 보통 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7개의 아미노산, 예를 들어, 약 8 내지 약 10개의 아미노산을 포함한다. "구조적 에피토프"는 선형 에피토프와 대조적으로, 불연속 아미노산 그룹(예를 들어, 폴리펩타이드에서, 폴리펩타이드의 1차 서열에 인접하지 않지만 폴리펩타이드의 3차 및 4차 구조의 맥락에서는 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 결합될 수 있을 정도로 서로 충분히 가까운 아미노산 잔기)이다. 에피토프 결정소는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화를 포함할 수 있고, 특정한 3차원의 구조적 특징 및/또는 특정한 하전 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 분자에 특이적인 항체 또는 결합 단편은 단백질 및/또는 거대분자의 복잡한 혼합물에서 표적 분자 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 PAC1의 N 말단의 세포 외 도메인(ECD)(서열번호 4) 내의 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다. 관련 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 24 내지 153 내의 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다. 다른 관련 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 50 내지 140 내의 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다. 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 인간 PAC1 N 말단 ECD 및 항-PAC1 중화 항체의 Fab 영역의 복합체의 결정 구조는 항-PAC1 Fab와의 결합 계면을 포함한 인간 PAC1 ECD 내의 핵심 아미노산을 밝혀냈다. 이들 코어 계면 아미노산(이들 모두는 Fab의 비 수소 원자로부터 5 Å 이하의 거리에서 적어도 1개의 비 수소 원자를 함유함)은 Asp59, Asn60, Ile61, Arg116, Asn117, Thr119, Asp121, Gly122, Trp123, Ser124, Glu125, Pro126, Phe127, Pro128, His129, Tyr130, Phe131, Asp132, 및 Gly135(서열번호 1에 대한 아미노산 위치 번호)를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 결합 단편은 서열번호 1의 Asp59, Asn60, Ile61, Arg116, Asn117, Thr119, Glu120, Asp121, Gly122, Trp123, Ser124, Glu125, Pro126, Phe127, Pro128, His129, Tyr130, Phe131, Asp132, 및 Gly135로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 결합 단편은 서열번호 1의 적어도 아미노산 Asn60, Ile61, Glu120, 및 Asp121을 포함하는 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 결합 단편은 서열번호 1의 적어도 아미노산 Asn60, Ile61, Glu120, Asp121, Phe127, 및 Phe131을 포함하는 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다. 특정한 기타 구현예에서, 항체 또는 결합 단편은 서열번호 1의 Asp59, Asn60, Ile61, Arg116, Asn117, Thr119, Glu120, Asp121, Gly122, Trp123, Ser124, Glu125, Pro126, Phe127, Pro128, His129, Tyr130, Phe131, Asp132, 및 Gly135로부터 선택된 아미노산 전부를 포함하는 에피토프에서 인간 PAC1에 결합한다.
실시예 1에서 기술된 인간 PAC1 ECD-Fab 복합체의 결정 구조는 또한 인간 PAC1 ECD 내의 아미노산과 상호작용한 Fab의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 중요한 잔기들을 밝혀, 항체의 파라토프의 핵심 아미노산을 확인하였다. "파라토프"는 표적 항원을 인식하고 이에 결합하는 항체의 영역이다. 파라토프 잔기는 경쇄 가변 영역(서열번호 3)의 Gln27, Gly30, Arg31, 및 Ser32, 및 중쇄 가변 영역(서열번호 2)의 Arg31, Phe32, Tyr53, Asp54, Gly56을 포함한다. 인간 PAC1 ECD의 코어 계면 잔기(즉, 에피토프의 잔기)와의 상호작용을 개선하여 모 항체와 비교하여 증진된 결합 친화도 및 억제 효능을 초래하기 위하여, 파라토프의 이러한 잔기들 중 몇몇의 특정 돌연변이를 설계하였다(실시예 1 내지 3 참고). 서열번호 3 또는 서열번호 52의 경쇄 가변 영역의 Gln27, Gly30, Arg31, 및 Ser32는 각각 AHo 넘버링에서 아미노산 위치 29, 32, 39, 및 40에 해당하고, 서열번호 2 또는 서열번호 191의 중쇄 가변 영역의 Arg31, Phe32, Tyr53, Asp54, Gly56은 각각 AHo 넘버링에서 아미노산 위치 33, 39, 60, 61, 및 66에 해당한다. AHo 넘버링 체계는 구조 기반의 넘버링 체계이며, 이는 정렬된 도메인의 평균 구조로부터의 편차를 최소화하기 위하여 CDR 영역에 공백을 도입한다(Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001). AHo 넘버링 체계에서, 상이한 항체에서 구조적으로 동일한 위치는 동일한 잔기 번호를 가질 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 PAC1(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: (i) AHo 넘버링에 따른 위치 29의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Glu120 또는 Asp121과 상호작용하는 염기성 아미노산인 경쇄 가변 영역, 및 (ii) AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Asn60 또는 Ile61과 상호작용하는 소수성, 염기성, 또는 중성 친수성 아미노산인 중쇄 가변 영역. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하나의 아미노산은 하나의 아미노산 내의 1개 이상의 원자가 다른 아미노산 내의 1개 이상의 원자와 예를 들어, 반데르발스, 소수성, 또는 정전기력을 통해 비 공유 결합을 형성할 때 또 다른 아미노산과 "상호작용"한다고 한다. 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하는 반면, 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 알라닌, 이소류신, 류신, 및 발린을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 29의 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다. 일 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 29의 아미노산은 리신이다. 관련 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산은 이소류신, 류신, 발린, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신이다. 일 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산은 이소류신이다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산은 글루타민 또는 아스파라긴이다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산은 아르기닌이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 66의 아미노산은 인간 PAC1(서열번호 1)의 아미노산 Asn60 또는 Ile61과 상호작용하는 염기성 또는 중성 친수성 아미노산이다. 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 66의 아미노산은 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신일 수 있다. 일 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 66의 아미노산은 아르기닌이다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 66의 아미노산은 아스파라긴이다.
위에 기술된 파라토프-에피토프 상호작용은 피코몰 범위의 IC50 값의 억제 효능의 개선과 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 실시예 3 참고. 따라서, AHo 넘버링에 따른 경쇄 가변 영역의 위치 29 및 중쇄 가변 영역의 위치 61 및/또는 66에서 위에 명시된 아미노산을 가지며, 인간 PAC1 수용체의 명시된 잔기(서열번호 1의 Glu120, Asp121, Asn60, 및/또는 Ile61)와 상호작용하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 증진된 억제 효능을 가질 것으로, 예를 들어, 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시 500 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시 300 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제할 수 있다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 52의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 191의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역("최소 인식 단위" 또는 "초가변 영역"으로도 지칭됨)을 지칭한다. 3개의 중쇄 가변 영역 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 영역 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR 영역"은 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 그룹(즉, 3개의 경쇄 CDR 또는 3개의 중쇄 CDR)을 지칭한다. 2개의 쇄 각각의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역(FR)에 의해 정렬되어 표적 단백질(예를 들어, 인간 PAC1) 상의 특정 에피토프 또는 도메인과 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N 말단으로부터 C 말단까지, 자연발생 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 둘 다 전형적으로 이들 구성요소의 다음의 순서에 따른다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 넘버링 시스템은 각각의 이들 도메인 내 위치를 점유하는 아미노산에 번호를 부여하도록 고안되었다. 이 넘버링 시스템은 문헌[Kabat Sequences of Protein of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD)], 또는 문헌[Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]; 문헌[Chothia et al.,1989, Nature 342:878-883]에 정의되어 있다. 주어진 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)은 이 시스템을 사용하여 확인될 수 있다. 면역글로불린 쇄의 아미노산에 대한 기타 넘버링 시스템은 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) 및 AHo(Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001)를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 명세서에서 기술된 임의의 항-PAC1 항체로부터의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예시적인 인간 항-PAC1 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 관련 CDR은 각각 하기 표 1A 및 1B에 제시되어 있다.
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본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 표 1A 및 표 1B에 제시된 경쇄 CDR(즉, CDRL) 및/또는 중쇄 CDR(즉, CDRH) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 결합 단편은 항체 29G4v9, 29G4v10, 또는 29G4v22로부터 유래된다(즉, 29G4v9, 29G4v10, 또는 29G4v22 항체의 CDRL 및/또는 CDRH 중 하나 이상에서 하나 이상의 치환을 갖는다). 예를 들어, 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 5 내지 16으로부터 선택된 CDRL1, (ii) 서열번호 26의 CDRL2, 및 (iii) 서열번호 36 내지 38로부터 선택된 CDRL3, 및 (iv) 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 88 내지 96으로부터 선택된 CDRH1, (ii) 서열번호 106 내지 166으로부터 선택된 CDRH2, 및 (iii) 서열번호 171 내지 177로부터 선택된 CDRH3, 및 (iv) 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 결합 단편은 항체 19H8로부터 유래된다(즉, 19H8 항체의 CDRL 및/또는 CDRH 중 하나 이상에서 하나 이상의 치환을 갖는다). 이러한 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 17 내지 25로부터 선택된 CDRL1, (ii) 서열번호 27 내지 35로부터 선택된 CDRL2, 및 (iii) 서열번호 39 내지 51로부터 선택된 CDRL3, 및 (iv) 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRL으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 97 내지 105로부터 선택된 CDRH1, (ii) 서열번호 167 내지 170으로부터 선택된 CDRH2, 및 (iii) 서열번호 178 내지 190으로부터 선택된 CDRH3, 및 (iv) 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii) 및 (iii)의 CDRH로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1A 및 표 1B에 열거된 CDR의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 변이체 형태를 포함할 수 있으며, 각각은 표 1A 및 표 1B에 열거된 CDR 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 가진다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1A 및 표 1B에 열거된 CDR 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하며, 이 표에 열거된 CDR과 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산만큼 각각 상이하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 5 내지 16으로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRL1; 서열번호 26의 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRL2; 서열번호 36 내지 38로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRL3; 서열번호 88 내지 96으로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRH1; 서열번호 106 내지 166으로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 171 내지 177로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRH3을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 5 내지 16으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL1; 서열번호 26의 서열을 포함하는 CDRL2; 서열번호 36 내지 38로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL3; 서열번호 88 내지 96으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH1; 서열번호 106 내지 166으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 171 내지 177로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH3을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 25로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRL1; 서열번호 27 내지 35로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRL2; 서열번호 39 내지 51로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRL3; 서열번호 97 내지 105로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRH1; 서열번호 167 내지 170으로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 178 내지 190으로부터 선택된 서열 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 CDRH3을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 25로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL1; 서열번호 27 내지 35로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL2; 서열번호 39 내지 51로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRL3; 서열번호 97 내지 105로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH1; 서열번호 167 내지 170으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH2; 및 서열번호 178 내지 190으로부터 선택되는 서열을 포함하는 CDRH3을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서: (a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖거나; (b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖거나; (c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 12, 26, 및 36의 서열을 갖거나; (d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 13, 26, 및 36의 서열을 갖는다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서: (a) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 171의 서열을 갖거나; (b) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 116, 및 171의 서열을 갖거나; (c) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 134, 및 171의 서열을 갖거나; (d) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 92, 145, 및 174의 서열을 갖거나; (e) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 172의 서열을 갖거나; (f) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 128, 및 172의 서열을 갖거나; (g) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 153, 및 171의 서열을 갖거나; (i) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 154, 및 171의 서열을 갖거나; (j) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 155, 및 171의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서:
(a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 171의 서열을 갖거나;
(b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 116, 및 171의 서열을 갖거나;
(c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 134, 및 171의 서열을 갖거나;
(d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 92, 145, 및 174의 서열을 갖거나;
(e) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 172의 서열을 갖거나;
(f) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 128, 및 172의 서열을 갖거나;
(g) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 134, 및 171의 서열을 갖거나;
(h) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 12, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 153, 및 171의 서열을 갖거나;
(i) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 12, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 154, 및 171의 서열을 갖거나;
(j) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 13, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 155, 및 171의 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 171의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 116, 및 171의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 134, 및 171의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 92, 145, 및 174의 서열을 갖는다. 일 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 172의 서열을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 12, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 153, 및 171의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서: (a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 31, 및 42의 서열을 갖거나; (b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 20, 30, 및 44의 서열을 갖거나; (c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 33, 및 42의 서열을 갖거나; (d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31, 및 50의 서열을 갖거나; (e) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 31, 및 44의 서열을 갖거나; (f) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 27, 및 39의 서열을 갖거나; (g) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 31, 및 46의 서열을 갖거나; (h) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 28, 및 40의 서열을 갖거나; (i) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 30, 및 43의 서열을 갖거나; (j) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 22, 28, 및 49의 서열을 갖는다.
특정한 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서: (a) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 190의 서열을 갖거나; (b) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나; (c) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 99, 168, 및 187의 서열을 갖거나; (d) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 97, 167, 및 178의 서열을 갖거나; (e) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 189의 서열을 갖거나; (f) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 179의 서열을 갖거나; (g) CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 102, 169, 및 182의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서:
(a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 31, 및 42의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 190의 서열을 갖거나;
(b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 20, 30, 및 44의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나;
(c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 33, 및 42의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 99, 168, 및 187의 서열을 갖거나;
(d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31, 및 50의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 97, 167, 및 178의 서열을 갖거나;
(e) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 31, 및 44의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 189의 서열을 갖거나;
(f) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 27, 및 39의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나;
(g) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 31, 및 46의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 179의 서열을 갖거나;
(h) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 28, 및 40의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 179의 서열을 갖거나;
(i) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 30, 및 43의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나;
(j) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 22, 28, 및 49의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 102, 169, 및 182의 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 31, 및 42의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 190의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 20, 30, 및 44의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 33, 및 42의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 99, 168, 및 187의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31, 및 50의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 97, 167, 및 178의 서열을 갖는다. 일 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 31, 및 44의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 189의 서열을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 27, 및 39의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 본 명세서에서 기술된 항체로부터의 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. "가변 도메인"과 본 명세서에서 상호 교환가능하게 사용되는 "가변 영역"(경쇄의 가변 영역(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))은, 항체를 항원에 결합시키는 데 직접 관여하는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 각각의 영역을 지칭한다. 상기 논의된 바와 같이, 가변 경쇄 및 중쇄의 영역은 동일한 일반적인 구조를 가지며, 각각의 영역은 서열이 광범위하게 보존되고, 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 프레임워크 영역은 베타-시트 구조를 채택하고, CDR은 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 3차원 구조로 유지되고 다른 쇄의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 표 1A에 제시된 바와 같이 LV-01 내지 LV-15로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 및/또는 표 1B에 제시된 바와 같이 HV-01 내지 HV-105로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 이들 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 결합 단편, 유도체, 및 변이체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 표 1A에 제시된 바와 같이 LV-16 내지 LV-36으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 및/또는 표 1B에 제시된 바와 같이 HV-106 내지 HV-122로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 이들 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 결합 단편, 유도체, 및 변이체를 포함할 수 있다.
표 1A에 열거된 각각의 경쇄 가변 영역은 표 1B에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역과 조합되어 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 형성할 수 있다. 상기 조합의 예는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: (i) LV-03 및 HV-03 내지 HV-26, HV-32 내지 HV-47, 및 HV-57 내지 HV-62 중 임의의 하나; (ii) LV-04 및 HV-11 내지 HV-91 중 임의의 하나; (iii) LV-05 및 HV-01, HV-03, HV-07, HV-09, 및 HV-10 중 임의의 하나; (iv) LV-06 및 HV-01, HV-03, HV-07, HV-09, 및 HV-10 중 임의의 하나; (v) LV-07 및 HV-01, HV-03, HV-07, HV-09, 및 HV-10 중 임의의 하나; (vi) LV-08 및 HV-01; (vii) LV-09 및 HV-01; (viii) LV-10 및 HV-01; (ix) LV-11 및 HV-92, HV-93, HV-95 내지 HV-97, 및 HV-99 내지 HV-101 중 임의의 하나; (x) LV-12 및 HV-94; (xi) LV-13 및 HV-98; (xii) LV-14 및 HV-102 내지 HV-104 중 임의의 하나; (xiii) LV-15 및 HV-105; (xiv) LV-17 및 HV-107; (xv) LV-18 및 HV-108; (xvi) LV-19 및 HV-109; (xvii) LV-20 및 HV-110; (xviii) LV-21 및 HV-110; (xix) LV-22 및 HV-111; (xx) LV-23 및 HV-107; (xxi) LV-24 및 HV-112; (xxii) LV-25 및 HV-113; (xxiii) LV-26 및 HV-114; (xxiv) LV-27 및 HV-106 또는 HV-110; (xxv) LV-28 및 HV-115 또는 HV-118; (xxvi) LV-29 및 HV-116; (xxvii) LV-30 및 HV-117; (xxviii) LV-31 및 HV-119; (xxix) LV-32 및 HV-120; (xxx) LV-33 및 HV-121; (xxxi) LV-34 및 HV-122; (xxxii) LV-35 및 HV-110; 및 (xxxiii) LV-36 및 HV-110.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-03의 서열(서열번호 54)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-04의 서열(서열번호 194)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-03의 서열(서열번호 54)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-13의 서열(서열번호 203)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-04의 서열(서열번호 55)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-38의 서열(서열번호 228)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-04의 서열(서열번호 55)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-84의 서열(서열번호 274)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-03의 서열(서열번호 54)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-24의 서열(서열번호 214)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-04의 서열(서열번호 55)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-50의 서열(서열번호 240)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-03의 서열(서열번호 54)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-38의 서열(서열번호 228)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-11의 서열(서열번호 62)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-92의 서열(서열번호 282)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-11의 서열(서열번호 62)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-93의 서열(서열번호 283)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-12의 서열(서열번호 63)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-94의 서열(서열번호 284)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-34의 서열(서열번호 85)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-122의 서열(서열번호 312)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-21의 서열(서열번호 72)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-110의 서열(서열번호 300)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-30의 서열(서열번호 81)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-117의 서열(서열번호 307)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-27의 서열(서열번호 78)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-106의 서열(서열번호 296)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-32의 서열(서열번호 83)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-120의 서열(서열번호 310)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-36의 서열(서열번호 87)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-110의 서열(서열번호 300)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-23의 서열(서열번호 74)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-107의 서열(서열번호 297)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-17의 서열(서열번호 68)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-107의 서열(서열번호 297)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-20의 서열(서열번호 71)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-110의 서열(서열번호 300)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 LV-26의 서열(서열번호 77)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 HV-114의 서열(서열번호 304)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1A의 경쇄 가변 영역의 서열과 상이한 인접한 아미노산의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 즉, 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기에서의 LV-01 내지 LV-36로부터 선택되는 VL을 포함하며, 여기서 각각의 상기 서열 차이는 독립적으로 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이고, 결실, 삽입 및/또는 치환은 전술한 가변 도메인 서열에 비해 15개 이하의 아미노산 변화를 초래한다. 일부 항-PAC1 항체 및 결합 단편에서 경쇄 가변 영역은 서열번호 52 내지 87(즉, 표 1A의 경쇄 가변 영역)의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 54 내지 66으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 54 내지 66으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 54 내지 66으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 54의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 55의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 62의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 63의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68 내지 87로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68 내지 87로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68 내지 87로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 72의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 77의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 78의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 81의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 83의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 85의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 87의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체 및 이의 항원 결합 단편은 표 1B의 중쇄 가변 영역의 서열과 상이한 인접한 아미노산의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 즉, 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기에서의 HV-01 내지 HV-122로부터 선택되는 VH를 포함하며, 여기서 각각의 상기 서열 차이는 독립적으로 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이고, 결실, 삽입 및/또는 치환은 전술한 가변 도메인 서열에 비해 15개 이하의 아미노산 변화를 초래한다. 일부 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편에서 중쇄 가변 영역은 서열번호 191 내지 312(즉, 표 1B의 중쇄 가변 영역)의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 191 내지 295로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 191 내지 295로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 191 내지 295로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 194의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 203의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 214의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 228의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 240의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 274의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 282의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 283의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 284의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 296 내지 312로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 296 내지 312로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 296 내지 312로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 296의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 297의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 300의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 304의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 307의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 310의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 312의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성"은 서열의 정렬 및 비교에 의해 결정되는, 둘 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "동일성 백분율"은 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 간에 동일한 잔기의 백분율을 의미하고, 비교되는 분자의 최소의 크기를 기준으로 계산된다. 이들 계산을 위해, 정렬에서 갭은 (만약에 있다면) 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 처리되어야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press]; 문헌[Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press]; 문헌[von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press]; 문헌[Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press]; 및 문헌[Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 기재된 방법들을 포함한다. 예를 들어, 서열 동일성은 2개의 폴리펩타이드의 아미노산 위치에서의 유사성을 비교하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열은 (하나 또는 두 서열의 전체 길이를 따라, 또는 하나 또는 두 서열의 예정된 부분을 따라) 이들 각각의 잔기의 최적의 매칭을 위해 정렬된다. 이 프로그램은 기본 오프닝 페널티와 기본 갭 페널티를 제공하며, 스코어링 매트릭스, 예컨대 PAM 250(Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3, 1978) 또는 BLOSUM62(Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)가 컴퓨터 프로그램과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일성 백분율은 다음과 같이 계산될 수 있다: 동일한 매치의 총 수에 100을 곱한 다음, 매칭된 범위 내에서 더 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 더 긴 서열에 도입된 갭 수의 합으로 나눈다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 비교 중인 서열은 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하는 방식으로 정렬된다.
GCG 프로그램 패키지는 동일성 백분율을 결정하는 데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램이고, 이 패키지는 GAP(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; 미국 위스콘신주 메디슨에 소재한 위스콘신 유니버시티의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 백분율이 결정되는 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드를 정렬하기 위해 사용된다. 서열은 그들의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 대한 최적의 매칭(알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "매칭된 범위")을 위해 정렬된다. 갭 오프닝 페널티(3x 평균 대각선으로서 계산하되, "평균 대각선"은 사용 중인 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치로 부여된 스코어 또는 수임) 및 갭 익스텐션 페널티(보통 갭 오프닝 페널티의 1/10배)뿐만 아니라 비교 매트릭스, 예컨대 PAM 250 또는 BLOSUM 62가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 구현예에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스에 대해 문헌[Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대해 문헌[Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다.
GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열에 대해 동일성 백분율을 결정하기 위한 권장된 매개변수는 다음을 포함한다:
알고리즘: 문헌[Needleman et al. 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453];
비교 매트릭스: 문헌[Henikoff et al., 1992, 상기 참조]으로부터의 BLOSUM 62;
Gap 페널티: 12(그러나 말단 갭에 대해 페널티가 없음)
갭 길이 페널티: 4
유사성에 대한 역치: 0
2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 2개 서열의 짧은 영역만의 매칭을 야기할 수 있고, 2개의 전장 서열 간에 유의미한 관계가 존재하지 않는다 하더라도 이 작은 정렬된 영역은 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 표적 폴리펩타이드의 적어도 50개의 인접한 아미노산에 걸쳐 있는 정렬을 초래하는 것이 요망된다면 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 조정될 수 있다.
본 발명의 항-PAC1 항체는 임의의 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "불변 도메인"과 상호 교환가능하게 사용되는 용어 "불변 영역"은 가변 영역 이외의 항체의 모든 도메인을 지칭한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 상기한 바와 같이, 항체는 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 특정 이소형(IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM) 및 서브타입(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)으로 분류된다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어 카파- 또는 람다-유형의 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파- 또는 람다-유형의 경쇄 불변 영역일 수 있으며, 이는 5개의 항체 이소형 모두에서 발견된다. 인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열의 예는 다음의 표에 제시되어 있다.
Figure pct00045
본 발명의 항-PAC1 항체의 중쇄 불변 영역은 예를 들어 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마- 또는 뮤-유형의 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마- 또는 뮤-유형의 중쇄 불변 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린과 같은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린으로부터의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항-PAC1 항체는 인간 IgG1 면역글로불린으로부터의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, 인간 IgG1 면역글로불린 불변 영역은 본 명세서에서 보다 상세히 기재된 바와 같이 항체의 글리코실화를 방지하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체는 인간 IgG2 면역글로불린으로부터의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체는 인간 IgG4 면역글로불린으로부터의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 인간 IgG1, IgG2, 및 IgG4 중쇄 불변 영역 서열의 예는 아래 표 3에 제시되어 있다.
Figure pct00046
Figure pct00047
표 1A에 개시된 각각의 경쇄 가변 영역 및 표 1B에 개시된 각각의 중쇄 가변 영역은 위의 경쇄 불변 영역(표 2) 및 중쇄 불변 영역(표 3)에 부착되어, 각각 완전한 항체 경쇄 및 중쇄를 형성할 수 있다. 또한, 각각의 이렇게 생성된 중쇄 및 경쇄 서열은 완전한 항체 구조를 형성하도록 조합될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 또한 위에 열거된 예시적인 서열과 상이한 서열을 갖는 다른 불변 도메인에 부착될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 개시된 임의의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체는 표 9, 10, 12, 13, 14, 19, 및 20에 열거된 임의의 항체로부터 선택되는 항-PAC1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체는 표 9, 10, 12, 13, 19, 또는 20에 기재된 아미노산 치환 중 하나 이상을 갖는 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체는 하나 이상의 아미노산 위치 27, 28, 30, 31, 32, 및/또는 93에서의 돌연변이를 갖는 서열번호 52의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 Q27K, Q27R, Q27H, S28A, G30M, G30W, R31Q, R31L, R31H, R31W, R31Y, S32A, S32N, S32L, R93F, R93M, R93Y, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체는 하나 이상의 아미노산 위치 31, 32, 49, 52, 53, 54, 56, 57, 62, 70, 102, 103, 및/또는 104에서의 돌연변이를 갖는 서열번호 191의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 R31F, R31H, R31Y, R31M, R31K, F32Y, A49G, S52N, S52T, Y53F, Y53H, Y53S, D54I, D54L, D54N, D54R, D54Q, D54Y, D54F, D54M, D54S, D54T, G56Q, G56N, G56R, G56H, G56A, G56S, G56T, G56D, N57A, N57F, N57G, N57S, N57Q, N57L, N57T, E62R, I70V, I70L, I70M, V102P, V102L, V102I, V102F, V102M, L103M, T104S, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체는 하나 이상의 아미노산 위치 28, 30, 31, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 91, 92, 93, 94, 및/또는 96에서의 돌연변이를 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 돌연변이는 S28Y, S28T, S28K, S28P, S28Q, S28R, S28M, S30A, S30V, R31Q, N34V, N34S, Y49F, A50V, A50G, A51G, A51S, S52Q, S52H, S52N, S52Y, S52R, S52L, S53I, S53Y, S53N, S53M, S53H, S53R, S91A, Y92I, S93G, S93Q, S93I, S93N, S93M, P94E, P94M, P94N, P94Q, P94A, P94T, P94I, F96Y, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체는 하나 이상의 아미노산 위치 31, 32, 33, 57, 58, 60, 103, 105, 106, 107, 및/또는 110에서의 돌연변이를 갖는 서열번호 296의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 S31N, N32R, N32K, N32H, S33L, S33Q, S33Y, S33V, S33D, S57G, K58Q, S60K, T103M, T103Q, T103R, T103V, K105N, K105E, K105D, K105I, K105A, K105S, K105Q, Q106G, Q106E, L107D, L107N, L110M, L110F, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 420653, 420845, 420943, 421873, 420889, 421091, 421051, 480711, 480706, 480713, 448730, 448195, 448788, 448901, 448689, 448202, 452128, 448924, 3574, 및 3575 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되며, 이의 가변 영역 및 CDR 서열은 표 1A 및 표 1B에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체는 420653, 420845, 420943, 421873, 420889, 421091, 421051, 480711, 480706, 및 480713 항체로부터 선택되는 항체이다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체는 448730, 448195, 448788, 448901, 448689, 448202, 452128, 448924, 3574, 및 3575 항체로부터 선택되는 항체이다. 이러한 예시적인 인간 항-PAC1 항체의 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열은 각각 표 4A 및 표 4B에 기재되어 있다.
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특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 표 4A에 제시된 바와 같이 LC-01 내지 LC-05로부터 선택되는 경쇄, 및/또는 표 4B에 제시된 바와 같이 HC-01 내지 HC-11로부터 선택되는 중쇄, 및 이들 경쇄 및 중쇄의 결합 단편, 유도체, 및 변이체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 표 4A에 제시된 바와 같이 LC-06 내지 LC-15로부터 선택되는 경쇄, 및/또는 표 4B에 제시된 바와 같이 HC-12 내지 HC-18로부터 선택되는 중쇄, 및 이들 경쇄 및 중쇄의 결합 단편, 유도체, 및 변이체를 포함할 수 있다.
표 4A에 열거된 각각의 경쇄는 표 4B에 열거된 임의의 중쇄와 조합되어 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 형성할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-03의 서열(서열번호 506)을 포함하는 경쇄 및 HC-03의 서열(서열번호 521)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-03의 서열(서열번호 506)을 포함하는 경쇄 및 HC-04의 서열(서열번호 522)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-01의 서열(서열번호 504)을 포함하는 경쇄 및 HC-05의 서열(서열번호 523)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-01의 서열(서열번호 504)을 포함하는 경쇄 및 HC-06의 서열(서열번호 524)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-03의 서열(서열번호 506)을 포함하는 경쇄 및 HC-07의 서열(서열번호 525)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-01의 서열(서열번호 504)을 포함하는 경쇄 및 HC-08의 서열(서열번호 526)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-03의 서열(서열번호 506)을 포함하는 경쇄 및 HC-05의 서열(서열번호 523)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-04의 서열(서열번호 507)을 포함하는 경쇄 및 HC-09의 서열(서열번호 527)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-04의 서열(서열번호 507)을 포함하는 경쇄 및 HC-10의 서열(서열번호 528)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-05의 서열(서열번호 508)을 포함하는 경쇄 및 HC-11의 서열(서열번호 529)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-07의 서열(서열번호 510)을 포함하는 경쇄 및 HC-13의 서열(서열번호 531)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-08의 서열(서열번호 511)을 포함하는 경쇄 및 HC-14의 서열(서열번호 532)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-09의 서열(서열번호 512)을 포함하는 경쇄 및 HC-15의 서열(서열번호 533)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-10의 서열(서열번호 513)을 포함하는 경쇄 및 HC-16의 서열(서열번호 534)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-11의 서열(서열번호 514)을 포함하는 경쇄 및 HC-17의 서열(서열번호 535)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-12의 서열(서열번호 515)을 포함하는 경쇄 및 HC-17의 서열(서열번호 535)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-13의 서열(서열번호 516)을 포함하는 경쇄 및 HC-14의 서열(서열번호 532)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-14의 서열(서열번호 517)을 포함하는 경쇄 및 HC-18의 서열(서열번호 536)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-06의 서열(서열번호 509)을 포함하는 경쇄 및 HC-14의 서열(서열번호 532)을 포함하는 중쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 LC-15의 서열(서열번호 518)을 포함하는 경쇄 및 HC-12의 서열(서열번호 530)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-PAC1 항체는 표 4A의 경쇄의 서열과 상이한 인접한 아미노산의 서열을 포함하는 경쇄, 즉, 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기에서의 LC-01 내지 LC-15로부터 선택되는 경쇄를 포함하며, 여기서 각각의 상기 서열 차이는 독립적으로 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이고, 결실, 삽입 및/또는 치환은 전술한 경쇄 서열에 비해 15개 이하의 아미노산 변화를 초래한다. 일부 항-PAC1 항체에서 경쇄는 서열번호 504 내지 518(즉, 표 4A의 경쇄)의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체는 표 4B의 중쇄의 서열과 상이한 인접한 아미노산의 서열을 포함하는 중쇄, 즉, 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 잔기에서의 HC-01 내지 HC-18로부터 선택되는 중쇄를 포함하며, 여기서 각각의 상기 서열 차이는 독립적으로 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환이고, 결실, 삽입 및/또는 치환은 전술한 중쇄 서열에 비해 15개 이하의 아미노산 변화를 초래한다. 일부 항-PAC1 항체에서 중쇄는 서열번호 519 내지 536(즉, 표 4B의 중쇄)의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체는 단일클론 항체이다. 이러한 구현예에서, 항-PAC1 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 면역글로불린 불변 도메인을 갖는 완전 인간 항체일 수 있다. 이러한 구현예 및 기타 구현예에서, 항-PAC1 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 따라서, 항-PAC1 항체는, 일부 구현예에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 불변 도메인을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 항-PAC1 항체는 단일클론 인간 IgG1 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체는 단일클론 인간 IgG2 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체는 단일클론 인간 IgG4 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"(또는 "mAb")는 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 수득된 항체를 나타낸다(즉, 집단을 이루는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 자연발생 가능한 돌연변이를 제외하고 동일하다). 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 개별 항원 부위 또는 에피토프에 대해 유도된다. 단일클론 항체는, 예컨대, 면역화 일정의 완료 후 동물로부터 수확된 비장 세포를 불멸화함으로써, 당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 비장 세포는, 예컨대 이들을 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산함으로써, 당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 불멸화할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Antibodies; Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 예를 들어, 1988년의 제1판 또는 2014년의 제2판] 참고. 하이브리도마-생산 융합 절차에서 사용하기 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비 항체 생산성이며, 높은 융합 효율을 가지고, 이들이 요망되는 융합된 세포(하이브리도마)만의 성장을 뒷받침하는 소정의 선택 배지에서 성장할 수 없도록 하는 효소 결핍을 갖는다. 마우스 세포와의 융합에 사용하기에 적합한 세포주의 예는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 랫트 세포와의 융합에 사용되는 적합한 세포주의 예는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 세포 융합에 유용한 기타 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.
일부 예에서, 하이브리도마 세포주는 PAC1 면역원(예컨대, WO 2014/144632 참고)을 이용하여 동물(예를 들어, 토끼, 랫트, 마우스, 또는 인간 면역글로불린 서열을 갖는 유전자이식 동물)을 면역화시키고; 면역화된 동물로부터 비장 세포를 채취하며; 골수종 세포주에 채취된 비장 세포를 융합시킴으로써, 하이브리도마 세포를 생성하고; 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립하며, PAC1에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정함으로써 생성된다. 단일클론 항체를 생산하는 또 다른 유용한 방법은 문헌[Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93: 7843-7848, 1996]에 기재된 SLAM 방법이다.
하이브리도마 세포주에 의해 분비된 단일클론 항체는 당 업계에 공지된 임의의 기술, 예컨대 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 cAMP 분석을 이용하여, 하이브리도마 상청액 또는 mAb를 추가로 스크리닝하여 특정 성질, 예를 들어 PAC1(예를 들어 인간 PAC1, 시노몰구스 원숭이 PAC1, 또는 랫트 PAC1)에 결합하는 능력; 다른 PAC1 패밀리 구성원(예를 들어, 인간 VPAC1 또는 인간 VPAC2)과의 교차 반응성); PAC1에 대한 PACAP 리간드의 결합을 차단하거나 방해하는 능력, 또는 PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화를 기능적으로 차단하는 능력을 갖는 mAb를 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 본 명세서에서 기술된 항체의 CDR 및 가변 영역 서열에 기초한 키메라 또는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 키메라 항체는 기능성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 또는 이의 결합 단편을 생성하기 위해 공유 결합된 상이한 항체로부터의 단백질 세그먼트로 구성된 항체이다. 일반적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 대해 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. 키메라 항체와 관련된 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌[Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]을 참고하며, 이들은 둘 다 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
일반적으로, 키메라 항체의 제조 목적은 의도된 종으로부터의 아미노산 수가 최대화되는 키메라를 생성하는 것이다. 일 예는 "CDR-접합" 항체이며, 이때 항체는 특정 종으로부터의 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 한편, 항체 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. CDR 접합은, 예를 들어, 미국 특허 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호 및 제5,530,101호에 기재되어 있다. 인간에서 사용하기 위해, 설치류 또는 토끼 항체로부터의 가변 영역 또는 선택된 CDR은 종종 인간 항체로 접합되어, 인간 항체의 자연발생 가변 영역 또는 CDR을 대체한다.
하나의 유용한 유형의 키메라 항체는 "인간화" 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 비 인간 동물, 예컨대 설치류 또는 토끼에서 초기에 상승된 단일클론 항체로부터 생성된다. 전형적으로 항체의 비 항원 인식 부분으로부터의, 이 단일클론 항체에서의 소정 아미노산 잔기는 대응하는 이소형의 인간 항체에서의 대응하는 잔기와 상동성으로 변형된다. 인간화는, 예를 들어, 설치류 또는 토끼 가변 영역의 적어도 일부를 인간 항체의 대응하는 영역으로 치환함으로써 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호 및 제5,693,762호; 문헌[Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; 및 Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536] 참고).
일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR(표 1A 및 표 1B 참고)은 동일하거나 상이한 계통 발생론적 종으로부터의 항체로부터의 프레임워크 영역(FR)에 접합된다. 예를 들어, 표 1A 및 1B에 열거된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR은 공통 인간 FR에 접합될 수 있다. 공통 인간 FR을 생성하기 위해, 몇몇 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR은 공통 아미노산 서열을 확인하기 위해 정렬될 수 있다. 대안적으로, 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터의 접합된 가변 영역은 본 명세서에서 개시된 바와 같은 해당되는 특정 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역과 상이한 불변 영역과 함께 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 접합된 가변 영역은 단일 쇄 Fv 항체의 부분이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 완전 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체는 WO 2014/144632에서 개시된 면역원 또는 이의 단편, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 4의 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 사용하여 생성될 수 있다. "완전 인간 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유도되거나 이를 나타내는 가변 및 불변 영역을 포함하는 항체이다. 완전 인간 항체의 생성을 구현하기 위하여 제공되는 하나의 구체적인 수단은 마우스 체액성 면역계의 "인간화"이다. 내인성 Ig 유전자가 비활성화된 마우스 내로의 인간 면역글로불린(Ig) 유전자위의 도입은 임의의 바람직한 항원에 의해 면역화될 수 있는 동물인 마우스에서 완전 인간 단일클론 항체(mAb)를 생성하는 하나의 수단이다. 완전 인간 항체를 이용하는 것은 치료제로서 마우스 또는 마우스-유래 mAb를 인간에게 투여함으로써 때때로 야기될 수 있는 면역원성 및 알레르기 반응을 최소화할 수 있다.
완전 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자이식 동물(보통 마우스)을 면역화함으로써 생산될 수 있다. 상기 목적을 위한 항원은 전형적으로 6개 이상의 인접 아미노산을 가지며, 선택적으로 담체, 예컨대 합텐에 콘주게이션된다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555]; 문헌[Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258]; 및 문헌[Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33] 참고. 이러한 방법의 한 예에서, 유전자이식 동물은 내부에 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자위를 불능화하는 단계, 및 마우스 게놈 내로 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 암호화하는 인간 게놈 DNA 함유 유전자위의 대형 단편을 삽입하는 단계에 의해 생산된다. 이어서 모든 요망되는 면역계 변형을 갖는 동물을 수득하기 위해 인간 면역글로불린 유전자위의 완전 상보체보다 적은 부분을 갖는 부분적으로 변형된 동물이 교배된다. 면역원이 투여되면, 이들 유전자이식 동물은 면역원에 대해 면역특이적이지만 가변 영역을 포함하여, 쥣과가 아닌 인간 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다. 이러한 방법의 추가 상세사항에 대해서는, 예를 들어, WO96/33735 및 WO94/02602를 참고한다. 인간 항체를 제조하기 위한 유전자이식 마우스에 관한 추가 방법은 미국 특허 제5,545,807호; 제6,713,610호; 제6,673,986호; 제6,162,963호; 제5,939,598호; 제5,545,807호; 제6,300,129호; 제6,255,458호; 제5,877,397호; 제5,874,299호 및 제5,545,806호; PCT 공보 WO 91/10741, WO 90/04036, WO 94/02602, WO 96/30498, WO 98/24893 및 EP 546073B1 및 EP 546073A1에 기재되어 있다.
"HuMab" 마우스로서 지칭되는 위에 기술된 유전자이식 마우스는 내인성 뮤 및 카파 쇄 좌위를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 비 재배열 인간 중쇄(뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위를 포함한다(Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 및 카파 단백질의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 고친화도 인간 IgG 카파 단일클론 항체를 생성하기 위한 분류 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다(Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). HuMab 마우스의 제조는 문헌[Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; 문헌[Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656]; 문헌[Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920]; 문헌[Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859]; 문헌[Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101]; 문헌[Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591]; 문헌[Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93]; 문헌[Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546]; 문헌[Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851]에 상세히 기재되어 있으며; 전술한 참고문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 추가로 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호뿐만 아니라 미국 특허 제5,545,807호; 국제 특허 공개 WO 93/1227; WO 92/22646; 및 WO 92/03918을 참고하며, 이들 모두의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 이들 유전자이식 마우스에서 인간 항체를 생성하기 위해 이용되는 기술은 또한 WO 98/24893에, 그리고 문헌[Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156]에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, HCo7 및 HCo12 유전자이식 마우스 계통은 완전 인간 항-PAC1 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 완전 인간 항-PAC1 항체의 생성에 적합한 하나의 특정 유전자이식 마우스 계통은 미국 특허 제6,114,598호; 제6,162,963호; 제6,833,268호; 제7,049,426호; 제7,064,244호; 문헌[Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21]; 문헌[Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156]; 문헌[Green 및 Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med, 188:483-495]; 문헌[Green, 1999, Journal of Immunological Methods 231:11-23]; 문헌[Kellerman and Green, 2002, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597]에 기술된 제노마우스(XenoMouse®) 유전자이식 마우스 계통이며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간-유래 항체는 또한 파지 디스플레이 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이는 예를 들어, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, 및 문헌[Caton and Koprowski, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454]에 기재되어 있으며, 이들은 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 보통 박테리아에서 항원 결합 단편, 예컨대 Fv 또는 Fab 단편으로서 생산되며, 이에 따라 효과기 기능이 없다. 효과기 기능은 2개의 전략 중 하나에 의해 도입될 수 있다: 단편이 포유류 세포 내 발현을 위해 전체 항체 내로, 또는 요망되는 경우, 효과기 기능을 유발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편 내로 조작될 수 있다. 전형적으로, 항체의 Fd 단편(VH-CH1) 및 경쇄(VL-CL)는 PCR에 의해 개별적으로 클로닝되고 조합 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이어서 특정 항원으로의 결합에 대해 선택될 수 있다. 항체 단편은 파지 표면 상에서 발현되며, 항원 결합에 의한 Fv 또는 Fab(및 이에 따라 항체 단편을 암호화하는 DNA를 함유하는 파지)의 선택은 패닝으로 명명된 절차인, 수 회의 항원 결합 및 재-증폭을 통해 달성된다. 항원에 대해 특이적인 항체 단편이 농축되고 최종 단리된다. 파지 디스플레이 기술은 또한 "가이드된 선택"으로 불리는, 설치류 단일클론 항체의 인간화를 위한 접근에서 사용될 수 있다(문헌[Jespers, L. S. et al., 1994, Bio/Technology 12, 899-903] 참고). 이를 위해, 마우스 단일클론 항체의 Fd 단편은 인간 경쇄 라이브러리와 조합되어 디스플레이될 수 있고, 이어서 생성된 하이브리드 Fab 라이브러리가 항원으로 선택될 수 있다. 이에 의해, 마우스 Fd 단편이 주형을 제공하여 선택을 가이드한다. 이후, 선택된 인간 경쇄는 인간 Fd 단편 라이브러리와 조합된다. 생성된 라이브러리의 선택은 전적으로 인간 Fab를 산출한다.
본 발명에 따른 항-PAC1 항체를 생산하는 세포가 위에 기재된 면역화 및 기타 기술 중 임의의 것을 사용하여 수득되면, 본 명세서에서 기술된 표준 절차에 따라 DNA 또는 mRNA를 단리 및 증폭시킴으로써 특정 항체 유전자가 클로닝될 수 있다. 이로부터 생산된 항체는 서열 분석될 수 있고, 동정된 CDR 및 이 CDR을 암호화하는 DNA는 본 발명에 따른 다른 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하기 위해 본 명세서에서 기술된 바와 같이 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 불변 영역으로의 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PAC1 항체의 중쇄 불변 영역 또는 Fc 영역은 항체의 글리코실화, 효과기 기능, 및/또는 Fcγ 수용체 결합에 영향을 미치는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 나타내며, 이는 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린으로부터의 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 면역글로불린으로부터의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. Fc 영역은 C1q 결합, 보체-의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 및 식균 작용과 같은 효과기 기능을 보유할 수 있다. 다른 구현예에서, Fc 영역은 아래에 더 상세히 설명되는 바와 같이 효과기 기능을 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 특정 서열을 지칭하여 달리 지시되지 않는 한, 면역글로불린 중쇄 또는 중쇄의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670, 2001]에 기술된 AHo 넘버링 또는 문헌[Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, Vol. 63: 78-85 (1969)]에 기술된 EU 넘버링에 따른다. 본 명세서에서 사용되는 AHo 넘버링 체계는 가변 영역 내에서 아미노산의 위치를 언급할 때 전형적으로 사용되는 반면, EU 넘버링 체계는 일반적으로 면역글로불린 불변 영역을 갖는 아미노산의 위치를 지칭할 때 사용된다.
아미노산 서열 내 아미노산 치환은 전형적으로 본 명세서에서 특정 위치에서의 아미노산 잔기에 대해 한 글자 약어로 표기된 다음, 관심 대상의 본래 서열에 대한 수치적 아미노산 위치가 표기되고, 이어서, 치환되는 아미노산 잔기에 대한 한 글자 약어가 표기된다. 예를 들어, "T30D"는 관심 대상의 본래 서열에 대한 아미노산 위치 30에서 아스파르트산 잔기에 의한 트레오닌 잔기의 치환을 기호화한다. 다른 예에서, "S218G"는 관심 대상의 본래 아미노산 서열에 대해 아미노산 위치 218에서 글리신 잔기에 의한 세린 잔기의 치환을 기호화한다.
면역글로불린의 Fc 영역의 기능 중 하나는 면역글로불린이 그의 표적에 결합할 때, 면역계와 상호 연락하는 것이다. 이는 통상적으로 "효과기 기능"으로서 지칭된다. 상호 연락은 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포의 식세포작용(ADCP), 및/또는 상보체 의존적 세포독성(CDC)을 야기한다. ADCC 및 ADCP는 면역계의 세포 표면 상에서 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합을 통해 매개된다. CDC는 상보체 시스템, 예를 들어, C1q의 단백질과 Fc 영역의 결합을 통해 매개된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 항체의 ADCC 활성, CDC 활성, ADCP 활성 및/또는 클리어런스 또는 반감기를 포함하는 효과기 기능을 향상시키기 위해 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 효과기 기능을 향상시킬 수 있는 예시적인 아미노산 치환(EU 넘버링 체계에 따름)은 E233L, L234I, L234Y, L235S, G236A, S239D, F243L, F243V, P247I, D280H, K290S, K290E, K290N, K290Y, R292P, E294L, Y296W, S298A, S298D, S298V, S298G, S298T, T299A, Y300L, V305I, Q311M, K326A, K326E, K326W, A330S, A330L, A330M, A330F, I332E, D333A, E333S, E333A, K334A, K334V, A339D, A339Q, P396L 또는 임의의 앞서 언급한 것들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 효과기 기능을 감소시킬 수 있는 예시적인 아미노산 치환(EU 넘버링 체계에 따름)은 C220S, C226S, C229S, E233P, L234A, L234V, V234A, L234F, L235A, L235E, G237A, P238S, S267E, H268Q, N297A, N297G, V309L, E318A, L328F, A330S, A331S, P331S 또는 임의의 앞서 언급한 것의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
글리코실화는 항체, 특히 IgG1 항체의 효과기 기능에 기여할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 항체의 글리코실화의 수준 또는 유형에 영향을 미치는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리-펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 트리-펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당류인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체의 글리코실화는 하나 이상의 글리코실화 부위를, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 첨가함으로써 증가된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는, 그것이 위에 기술된 트리-펩타이드 서열 중 하나 이상을 포함하도록, 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다(N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다(O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 용이함을 위해, 항체 아미노산 서열은 DNA 수준의 변화를 통해, 특히 목적으로 하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 사전선택된 염기에서 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 변경될 수 있다.
본 발명은 또한 개선된 ADCC 활성을 나타내는 푸코실화가 없거나 또는 감소된 항체를 포함하는, 변경된 효과기 활성을 초래하는 변경된 탄수화물 구조를 갖는 항체 분자의 생성을 포함한다. 푸코실화를 감소시키거나 제거하는 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, ADCC 효과기 활성은 FcγRIII 수용체에 대한 항체 분자의 결합에 의해 매개되는데, 이는 CH2 도메인의 N297 잔기에서 N-연결된 글리코실화의 탄수화물 구조에 의존하는 것으로 나타났다. 비 푸코실화된 항체는 증가된 친화도로 이 수용체에 결합하고, 천연 푸코실화 항체보다 더 효율적으로 FcγRIII-매개 효과기 기능을 촉발한다. 예를 들어, 알파-1,6-푸코실 트랜스퍼라제 효소가 넉아웃된 CHO 세포에서 비 푸코실화된 항체의 재조합체 생성은 100배 증가된 ADCC 활성을 갖는 항체를 초래한다(문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 87(5):614-22, 2004] 참고). 푸코실화 경로에서 알파-1,6-푸코실 트랜스퍼라제 효소 또는 다른 효소의 활성 감소를 통해, 예를 들어 siRNA 또는 안티센스 RNA 처리, 효소(들)를 넉아웃시키도록 세포주를 조작, 또는 선택적 글리코실화 억제제와 함께 배양하는 것을 통해 유사한 효과가 달성될 수 있다(문헌[Rothman et al., Mol Immunol. 26(12):1113-23, 1989] 참고). 일부 숙주 세포주, 예를 들어 Lec13 또는 랫트 하이브리도마 YB2/0 세포주는 낮은 푸코실화 수준을 갖는 항체를 자연적으로 생산한다(문헌[Shields et al., J Biol Chem. 277(30):26733-40, 2002] 및 문헌[Shinkawa et al., J Biol Chem. 278(5):3466-73, 2003] 참고). 예를 들어, GnTIII 효소를 과발현시키는 세포에서 항체를 재조합 생성하는 것을 통한 이등분된 탄수화물 수준의 증가는 또한 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 결정되었다(문헌[Umana et al., Nat Biotechnol. 17(2):176-80, 1999] 참고).
다른 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체의 글리코실화는, 예를 들어, 항체의 Fc 영역으로부터 하나 이상의 글리코실화 부위를 제거함으로써 감소 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체는 비글리코실화된 인간 단일클론 항체, 예를 들어, 비글리코실화된 인간 IgG1 단일클론 항체이다. N-연결된 글리코실화 부위를 제거하거나 또는 변경시키는 아미노산 치환은 항체의 N-연결된 글리코실화를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체는 위치 N297(EU 넘버링 체계에 따름)에서의 중쇄 돌연변이, 예컨대, N297Q, N297A, 또는 N297G를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 위치 N297에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 항체로부터의 Fc 영역을 포함한다. 일 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 N297G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 항체로부터의 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 서열번호 324의 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
N297 돌연변이를 포함하는 분자의 안정성을 개선하기 위해, 항-PAC1 항체의 Fc 영역은 추가로 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Fc 영역 내 하나 이상의 아미노산은 이량체 상태로 이황화 결합 형성을 촉진하기 위해 시스테인으로 치환된다. 따라서, IgG1 Fc 영역의 V259, A287, R292, V302, L306, V323 또는 I332(EU 넘버링 체계에 따름)에 대응하는 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 잔기의 특정 쌍은 우선적으로 서로 이황화 결합을 형성하여, 이황화 결합 스크램블링을 제한하거나 또는 방지하도록 시스테인으로 치환된다. 바람직한 쌍은 A287C 및 L306C, V259C 및 L306C, R292C 및 V302C, 및 V323C 및 I332C를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체는 R292C 및 V302C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 항체로부터의 Fc 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, Fc 영역은 또한 N297 돌연변이, 예컨대 N297G 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체는 서열번호 325의 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
혈청 반감기를 증가시키기 위한 본 발명의 항-PAC1 항체의 변형은 또한 예를 들어, 구조 수용체 결합 에피토프의 혼입 또는 첨가에 의해(예를 들어, 적절한 영역의 돌연변이에 의해 또는 에피토프를 펩타이드 태그 내로 혼입시키고, 이어서, 말단 또는 중간에서 항체에 융합시킴으로써, 예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해; 예를 들어, WO96/32478 참고) 또는 PEG 또는 다당류 중합체를 포함하는 다른 수용성 중합체와 같은 분자를 첨가함으로써, 바람직하게 될 수 있다. 구조 수용체 결합 에피토프는 바람직하게는 Fc 영역의 1 또는 2개의 루프로부터의 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 내 유사한 위치로 전달되는 영역을 구성한다. 더욱 더 바람직하게는, Fc 영역의 1 또는 2개의 루프로부터의 3개 이상의 잔기가 전달된다. 더욱 바람직하게는, 에피토프는 Fc 영역(예를 들어, IgG Fc 영역)의 CH2 도메인으로부터 취해지며, 항체의 CH1, CH3 또는 VH 영역, 또는 하나 초과의 이러한 영역에 전달된다. 대안적으로, 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 취해지고, 항체의 CL 영역 또는 VL 영역, 또는 둘 다에 전달된다. Fc 변이체 및 그들의 구조 수용체와의 상호작용의 설명에 대해 국제 특허 출원 WO 97/34631 및 WO 96/32478을 참고한다.
본 발명은 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 단리된 핵산을 포함한다. 또한, 본 발명은 핵산을 포함하는 벡터, 핵산을 포함하는 숙주 세포 또는 세포주, 및 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 제조 방법을 포함한다. 핵산은 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편의 전부 또는 일부, 예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 또는 둘 다의 쇄, 또는 이의 단편, 유도체, 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 혼성화 프로브로 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 확인, 분석, 돌연변이 또는 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 또는 시퀀싱 프라이머, 폴리뉴클레오타이드의 발현을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 상기의 상보적 서열을 포함한다. 핵산은 원하는 용도 또는 기능에 적절한 임의의 길이일 수 있으며, 하나 이상의 추가 서열, 예를 들어 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 더 큰 핵산, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 상응하는 상보적 서열을 포함한다. DNA는 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 전장 유전자 또는 cDNA 분자뿐만 아니라 이들의 단편의 조합을 포함한다. 본 발명의 핵산은 인간 기원 및 비 인간 종으로부터 유래될 수 있다.
면역글로불린 또는 이의 영역(예를 들어, 가변 영역, Fc 영역, 등) 또는 관심 폴리펩타이드로부터의 관련 아미노산 서열은 직접 단백질 시퀀싱에 의해 결정될 수 있고, 적합한 암호화 뉴클레오타이드 서열은 범용 코돈 표에 따라 설계될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 게놈 또는 cDNA가 종래의 절차를 이용하여(예를 들어, 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 이러한 항체를 생성하는 세포로부터 단리 및 시퀀싱될 수 있다.
본 명세서에서 "단리된 폴리뉴클레오타이드"와 상호 교환가능하게 사용되는 "단리된 핵산"은, 자연 발생원으로부터 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 유기체의 게놈에 존재하는 인접한 유전자 서열로부터 분리된 핵산이다. 예를 들어 PCR 산물, cDNA 분자 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산의 경우, 이러한 과정에서 생성된 핵산이 단리된 핵산인 것으로 이해된다. 단리된 핵산 분자는 별개의 단편 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 일 구현예에서, 핵산은 실질적으로 내인성 오염 물질이 없다. 핵산 분자는 바람직하게는 표준 생화학적 방법에 의해 그의 성분 뉴클레오타이드 서열의 확인, 조작 및 회수를 가능하게 하는 실질적으로 순수한 형태 및 양 또는 농도로 적어도 1회 단리된 DNA 또는 RNA로부터 유래된다(예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)]에 요약된 것들). 이러한 서열은 바람직하게는 진핵생물 유전자에 전형적으로 존재하는 내부 비 번역 서열, 또는 인트론에 의해 중단되지 않은 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공 및/또는 구축된다. 번역되지 않은 DNA의 서열은 오픈 리딩 프레임으로부터 5' 또는 3'로 존재할 수 있으며, 이는 암호화 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 논의되는 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌선성 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌선성 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 발생기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 생산 방향은 전사 방향으로 지칭되며; RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고; RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
본 발명은 또한 중간 정도 엄격한 조건, 보다 바람직하게는 매우 엄격한 조건 하에 본 명세서에서 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 혼성화하는 핵산을 포함한다. 적합한 조건을 고안하기 위한 혼성화 조건 및 가이드의 선택에 영향을 미치는 기본적 매개변수는 문헌[Sambrook,, Fritsch, and Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4]에 의해 제시되고, 예를 들어, DNA의 길이 및/또는 염기 조성에 기반하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 적당히 엄격한 조건을 달성하는 한 가지 방법은 5 x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6 x SSC 및 약 55℃의 혼성화 온도를 포함하는 사전 세척 용액(또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예컨대 약 50%의 포름아미드를 함유하는 것, 혼성화 온도는 약 42℃), 및 0.5 x SSC, 0.1% SDS 중의 약 60℃의 세척 조건을 사용하는 것을 포함한다. 일반적으로, 매우 엄격한 조건은 위와 같은 혼성화 조건으로 정의되지만, 대략 68℃, 0.2 x SSC, 0.1% SDS에서 세척하는 것으로 정의된다. SSPE(l x SSPE는 0.15M NaCl, 10 mM NaH2PO4, 및 1.25 mM EDTA임, pH 7.4)는 혼성화 및 세척 완충액에서 SSC(l x SSC는 0.15M NaCl 및 15 mM 시트르산 나트륨임)로 대체될 수 있으며; 혼성화가 완료된 후 15분 동안 세척이 수행된다. 세척 온도 및 세척 염 농도가 당업자에게 공지되어 있고 아래에 추가로 기술된 바와 같이 혼성화 반응 및 이중 안정성을 지배하는 기본 원리를 적용함으로써 원하는 정도의 엄격성을 달성하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있음을 이해해야 한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989] 참고).
핵산을 미지의 서열의 표적 핵산에 혼성화할 때, 하이브리드 길이는 혼성화 핵산의 길이인 것으로 가정된다. 공지된 서열의 핵산이 혼성화될 때, 하이브리드 길이는 핵산의 서열을 정렬시키고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 확인함으로써 결정될 수 있다. 길이가 50개 염기쌍 미만일 것으로 예상되는 하이브리드의 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도(Tm)보다 5 내지 10℃ 낮아야 하며, 여기서 Tm은 다음 식에 따라 결정된다. 길이가 18개 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우, Tm(℃) = 2(A + T 염기의 #) + 4(G + C 염기의 #). 길이가 18개의 염기쌍을 초과하는 하이브리드의 경우, Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10 [Na+]) + 0.41(% G + C) -(600/N), 여기서 N은 하이브리드의 염기 수이며, [Na+]는 혼성화 완충액 중의 나트륨 이온의 농도이다(l x SSC의 경우 [Na+]= 0.165M). 바람직하게는, 각각의 이러한 혼성화 핵산은 적어도 15개 뉴클레오타이드(또는 더욱 바람직하게는 적어도 18개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 20개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 25개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 30개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 40개 뉴클레오타이드, 또는 가장 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오타이드)인 길이를 가지거나, 또는 혼성화하는 본 발명의 핵산 길이의 적어도 25%(더욱 바람직하게는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%)인 길이를 가지며, 혼성화하는 본 발명의 핵산과 적어도 60%(더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99.5%)의 서열 동일성을 가지며, 위에서 상세히 설명된 바와 같이 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 혼성화 핵산의 서열을 비교함으로써 서열 동일성이 결정된다.
본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편의 변이체는 카세트 또는 PCR 돌연변이 유발 또는 당 업계에 공지된 다른 기술, 예컨대, 실시예 3에서 기술된 것들을 사용하여 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에서 뉴클레오타이드의 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 변이체를 암호화하는 DNA를 생성한 후, 본 명세서에서 요약된 바와 같이 세포 배양에서 재조합 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 그러나 약 100~150개 이하의 잔기를 갖는 변이체 CDR을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 확립된 기술을 사용하여 시험관 내 합성에 의해 제조될 수 있다. 변이체는 전형적으로 예를 들어 항원에 결합하는 자연발생 유사체와 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타낸다. 이러한 변이체는 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 구축물이 요망되는 특성을 갖는 경우에만, 최종 구축물에 도달하도록 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 개수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 변이체는 에피토프 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기를 변형시키려는 의도로 제조된다. 다른 구현예에서, 에피토프 결합에 직접 관여하지 않는 잔기 또는 임의의 방식으로 에피토프 결합에 관여하지 않는 잔기의 변형이 본 명세서에서 논의된 목적을 위해 바람직하다. 임의의 CDR 영역 및/또는 프레임워크 영역 내에서의 돌연변이 유발이 고려된다. 공분산 분석 기술은 항체의 아미노산 서열에서 유용한 변형을 설계하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Choulier, et al., 단백질 41:475-484, 2000]; 문헌[Demarest et al., J. Mol. Biol. 335:41-48, 2004]; 문헌[Hugo et al., Protein Engineering 16(5):381-86, 2003]; Aurora et al., 미국 특허 공개 제2008/0318207 A1호; Glaser et al., 미국 특허 공개 제2009/0048122 A1호; Urech et al., WO 2008/110348 A1; Borras et al., WO 2009/000099 A2 참고. 공분산 분석에 의해 결정된 이러한 변형은 항체의 효능, 약동학적, 약력학적 및/또는 제조가능성 특성을 개선할 수 있다.
표 4A 및 표 4B는 각각 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체의 전체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 예시적인 핵산 서열을 보여준다. 표 5A 및 표 5B는 각각 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 예시적인 핵산 서열을 보여준다. 항-PAC1 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로, 각각 표 2 및 표 3에 열거된 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산과 함께 사용되어, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편을 구축한다.
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본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산은 표 4A, 4B, 5A, 및 5B에 열거된 임의의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 328 내지 342로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 343 내지 363으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 328 내지 342로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 343 내지 363으로부터 선택된 서열을 포함한다. 관련 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 364 내지 468로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 469 내지 485로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 364 내지 468로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 469 내지 485으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 537 내지 541로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 542 내지 551로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 537 내지 541로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 542 내지 551로부터 선택된 서열을 포함한다. 관련 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 552 내지 562로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 563 내지 569로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 552 내지 562로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-PAC1 항체 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산은 서열번호 563 내지 569로부터 선택된 서열을 포함한다.
표 4A, 4B, 5A, 및 5B에 제공된 핵산 서열은 단지 예시일 뿐이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 매우 많은 수의 핵산이 제조될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편의 CDR, 가변 영역, 및 중쇄 및 경쇄 또는 다른 성분을 암호화한다. 따라서, 특정 아미노산 서열을 확인한 후, 당업자는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 간단히 변형시킴으로써 임의의 수의 상이한 핵산을 만들 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 하나 이상의 성분(예를 들어, 가변 영역, 경쇄, 및 중쇄)을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 숙주 세포 내로 단백질 암호화 정보를 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 또는 독립체(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 지칭한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비 에피솜 포유류 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 목적하는 암호화 서열 및 적절한 핵산 제어 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 발현 벡터는 전사, 번역에 영향을 미치거나 또는 제어하고, 인트론이 존재한다면, 그에 작동 가능하게 연결된 암호화 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 원핵생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 선택적으로 조작자 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능하게는 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
분비 신호 펩타이드 서열은 또한 선택적으로, 발현된 폴리펩타이드가 원한다면 세포로부터의 관심 대상의 폴리펩타이드의 더 손쉬운 단리를 위해 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있도록, 관심 대상의 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 신호 펩타이드 서열은 표 1A 및 1B에 열거된 임의의 가변 영역 폴리펩타이드 서열 또는 표 4A 및 4B에 열거된 임의의 전체 쇄 폴리펩타이드 서열의 아미노 말단에 현수/융합될 수 있다. 특정 구현예에서, MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(서열번호 486)의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩타이드가 표 1A 및 1B의 임의의 가변 영역 폴리펩타이드 서열 또는 표 4A 및 4B의 전체 쇄 폴리펩타이드 서열의 아미노 말단에 융합된다. 다른 구현예에서, MAWALLLLTLLTQGTGSWA(서열번호 487)의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩타이드가 표 1A 및 1B의 임의의 가변 영역 폴리펩타이드 서열 또는 표 4A 및 4B의 전체 쇄 폴리펩타이드 서열의 아미노 말단에 융합된다. 또 다른 구현예에서, MTCSPLLLTLLIHCTGSWA(서열번호 488)의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩타이드가 표 1A 및 1B의 임의의 가변 영역 폴리펩타이드 서열 또는 표 4A 및 4B의 전체 쇄 폴리펩타이드 서열의 아미노 말단에 융합된다. 본 명세서에서 기술된 가변 영역 폴리펩타이드 서열 또는 전체 쇄 폴리펩타이드 서열의 아미노 말단에 융합될 수 있는 다른 적합한 신호 펩타이드 서열은 다음을 포함한다: MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(서열번호 489), MEWTWRVLFLVAAATGAHS(서열번호 490), METPAQLLFLLLLWLPDTTG(서열번호 491), METPAQLLFLLLLWLPDTTG(서열번호 492), MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(서열번호 493), MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(서열번호 494), MDIRAPTQLLGLLLLWLPGAKC(서열번호 495), MDIRAPTQLLGLLLLWLPGARC(서열번호 496), MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF(서열번호 497), MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC(서열번호 498), METGLRWLLLVAVLKGVQC(서열번호 499), METGLRWLLLVAVLKGVQCQE(서열번호 500), 및 MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARC(서열번호 501). 다른 신호 또는 분비 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 특정 숙주 세포에서의 발현을 용이하게 하거나 또는 최적화하기 위해 표 1A 및 1B에 열거된 임의의 가변 영역 폴리펩타이드 쇄 또는 표 4A 및 4B의 전체 쇄 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편을 생성하기 위해 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지 및 항체 및 항원 결합 단편의 성분을 암호화하는 외인성 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유할 것이다. 총괄적으로 "측접 서열"로서 지칭되는 이러한 서열은 특정 구현예에서 전형적으로 다음의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여자 및 수용자 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩타이드 분비를 위한 리더 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택 가능한 마커 구성요소. 각각의 이들 서열은 이하에 논의된다.
선택적으로, 벡터는 "태그"-암호화 서열, 즉, 폴리펩타이드 암호화 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치된 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함할 수 있고; 올리고뉴클레오타이드 태그 서열은 폴리His(예컨대, 헥사His), FLAG, HA(혈구응집소 인플루엔자 바이러스), myc, 또는 또 다른 "태그"분자를 암호화하되, 이를 위해 상업적으로 입수 가능한 항체가 존재한다. 이 태그는 전형적으로 폴리펩타이드의 발현 시 폴리펩타이드에 융합되고, 숙주 세포로부터의 폴리펩타이드의 친화도 정제 또는 검출을 위한 수단으로서 작용할 수 있다. 친화도 정제는 친화도 기질로서 태그에 대한 항체를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 선택적으로, 태그는 후속적으로 절단을 위해 특정 펩티다제를 이용하는 것과 같은 다양한 수단에 의해 정제된 폴리펩타이드로부터 제거될 수 있다.
측접 서열은 상동성(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터 유래), 이종성(즉, 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터 유래), 혼성체(즉, 하나 초과의 공급원으로부터의 측접 서열의 조합), 합성 또는 자연발생 서열일 수 있다. 이렇게 해서, 측접 서열의 공급원은 임의의 원핵 또는 진핵 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있고, 단, 측접 서열은 숙주 세포 기작에서 기능성이고 숙주 세포 기작에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명의 벡터에서 유용한 측접 서열은 당 업계에 잘 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 얻을 수 있다. 전형적으로, 본 명세서에서 유용한 측접 서열은 맵핑에 의해 그리고/또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 이전에 동정되었을 것이고, 따라서 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 적절한 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 일부 경우에, 측접 서열의 완전 뉴클레오타이드 서열은 알려져 있을 수 있다. 본 명세서에서, 측접 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위해 일상적인 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
측접 서열의 모두가 알려져 있든 단지 일부가 알려져 있든, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 그리고/또는 동일 또는 다른 종으로부터의 적합한 프로브, 예컨대 올리고뉴클레오타이드 및/또는 측접 서열 단편을 이용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 측접 서열이 알려져 있지 않은 경우, 측접 서열을 포함하는 DNA의 단편은, 예를 들어, 암호화 서열 또는 심지어 다른 유전자 또는 유전자들을 포함할 수 있는 더 큰 조각의 DNA로부터 단리될 수 있다. 단리는 적절한 DNA 단편을 생성하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 분해 다음에 아가로스 겔 정제, 퀴아젠(Qiagen®) 칼럼 크로마토그래피(미국 캘리포니아주 채츠워스에 소재), 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하는 단리에 의해 수행될 수 있다. 이 목적을 수행하기 위한 적합한 효소의 선택은 당업자가 쉽게 알 수 있을 것이다.
복제 기점은 전형적으로 상업적으로 구입한 해당 원핵생물 발현 벡터의 부분이고, 기점은 숙주 세포 내 벡터의 증폭을 돕는다. 선택 벡터가 복제 기점 부위를 포함하지 않는다면, 공지된 서열에 기반하여 화학적으로 합성되고, 벡터 내로 결찰될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322(미국 매사추세츠주 비버리에 소재한 New England Biolabs)로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하며, 다양한 바이러스 기점(예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 또는 유두종바이러스, 예컨대 HPV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 벡터를 클로닝시키는 데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(예를 들어, SV40 기점은 단지 그것이 또한 바이러스 초기 프로모터를 포함하기 때문에 종종 사용된다).
전사 종결 서열은 전형적으로 폴리펩타이드 암호화 영역 말단의 3'에 위치되고, 전사를 종결시키는 작용을 한다. 보통, 원핵 세포 내 전사 종결 서열은 G-C 농축 단편 다음에 폴리-T 서열이다. 이 서열은 라이브러리로부터 용이하게 클로닝되거나 또는 심지어 벡터의 부분으로서 상업적으로 구입되지만, 또한 핵산 합성을 위한 공지된 방법을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다.
선택 가능한 마커 유전자는 선택 배양 배지에서 성장한 숙주 세포의 생존 및 성장에 필수적인 단백질을 암호화한다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵생물 숙주 세포에 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하거나; (b) 세포의 영양 요구성 결핍을 보완하거나; 또는 (c) 복합 또는 한정 배지로부터 이용 가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 구체적인 선택 가능한 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유리하게는, 네오마이신 내성 유전자는 또한 원핵 숙주 세포와 진핵 숙주 세포 둘 다에서 선택을 위해 사용될 수 있다.
다른 선택 가능한 유전자가 발현될 유전자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질의 생성에 필요한 유전자들이 재조합 세포의 연속 세대의 염색체 내에서 동시에 반복되는 과정이다. 포유류 세포에 적합한 선택 가능한 마커의 예는 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR) 및 무 프로모터 티미딘 키나제 유전자를 포함한다. 포유류 세포 형질전환체는 선택 압력 하에 위치되고, 여기서 형질전환체만이 벡터 내에 존재하는 선택 가능한 유전자 때문에 생존하도록 독특하게 적합화된다. 배지 내 선택 제제의 농도가 연속적으로 증가되는 조건 하에 형질전환된 세포를 배양시킴으로써 선택 압력이 부과되고, 이에 의해 선택 가능한 유전자와, 다른 유전자, 예컨대 본 명세서에서 기술된 항체 또는 항원 결합 단편의 하나 이상의 성분을 암호화하는 DNA 둘 다의 증폭을 야기한다. 그 결과, 증가된 양의 폴리펩타이드가 증폭된 DNA로부터 합성된다.
리보솜-결합 부위는 보통 mRNA의 번역 개시에 필요하며, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵생물) 또는 코작(Kozak) 서열(진핵생물)에 의해 특성화된다. 구성요소는 전형적으로 프로모터에 대해 3'에 그리고 발현될 폴리펩타이드의 암호화 서열에 대해 5'에 위치된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 암호화 영역은 내부 리보솜 결합 부위(IRES)에 작동 가능하게 연결되어 단일 RNA 전사체로부터 2개의 오픈 리딩 프레임의 번역을 가능하게 할 수 있다.
일부 경우에, 예컨대 글리코실화가 진핵생물 숙주 세포 발현 시스템에서 요망되는 경우, 글리코실화 또는 수율을 개선하기 위해 다양한 프리(pre-) 또는 프로서열(prosequence)을 조작할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 펩타이드의 펩티다제 절단 부위를 변경시키거나, 또는 글리코실화에 영향을 미칠 수도 있는 프로서열을 첨가할 수 있다. 최종 단백질 산물은 (성숙 단백질의 제1 아미노산에 대해) -1 위치에서, 발현에 부수적인 하나 이상의 추가적인 아미노산을 가질 수 있는데, 이는 완전히 제거되지 않을 수 있다. 예를 들어, 최종 단백질 산물은 아미노-말단에 부착된 펩티다제 절단 부위에서 발견되는 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안적으로, 효소가 성숙 폴리펩타이드 내의 이러한 영역에서 절단하는 경우, 일부 효소 절단 부위의 사용은 목적으로 하는 폴리펩타이드의 약간 절단된 형태를 초래할 수 있다.
본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 폴리펩타이드를 암호화하는 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생성되는 방식으로 2개 이상의 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 암호화 서열에 "작동 가능하게 연결된" 벡터 내 제어 서열은 단백질 암호화 서열에 결찰되어, 단백질 암호화 서열의 발현이 제어 서열의 전사 활성과 양립 가능한 조건 하에서 달성된다. 보다 구체적으로, 시스-작용 전사 제어 요소의 임의의 조합을 포함하는 프로모터 및/또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 암호화 서열의 전사를 자극 또는 조절하는 경우 이 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
프로모터는 (일반적으로 약 100 내지 1000bp 내에서) 구조적 유전자의 전사를 제어하는 구조적 유전자의 개시 코돈에 대해 상류(즉, 5')에 위치된 비 전사 서열이다. 프로모터는 두 가지 부류, 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터 중 하나로 관례적으로 그룹화된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예컨대 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 반면에, 구성적 프로모터는 그들이 작동 가능하게 연결된, 즉, 유전자 발현에 대한 제어가 거의 없거나 전혀 없는 유전자를 균일하게 전사시킨다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터는 잘 공지되어 있다. 적합한 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거함으로써 그리고 목적으로 하는 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 예를 들어, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편의 중쇄, 경쇄 또는 다른 성분을 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터는 또한 당 업계에 잘 공지되어 있다. 효모 인핸서는 유리하게는 효모 프로모터와 함께 사용된다. 포유류 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터는 잘 공지되어 있고, 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 혈청형 2, 8 또는 9), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터 얻은 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 적합한 포유류 프로모터는 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어, 열충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
관심을 가질 수 있는 추가의 구체적인 프로모터는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: SV40 초기 프로모터(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터(Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); Rous 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 함유된 프로모터(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-1445); 메탈로티오닌 유전자로부터의 프로모터 및 조절 서열(Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 및 원핵생물 프로모터, 예컨대 베타-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); 또는 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). 다음의 동물 전사 제어 영역 또한 관심의 대상인데, 이들은 조직 특이성을 나타내며 유전자이식 동물에서 이용된다: 췌장 샘꽈리세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역(Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); 림프양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 1436-1444); 고환, 유방, 림프양 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역(Pinkert et al., 1987, Genes 및 Devel. 1:268-276); 간에서 활성인 알파-페토-단백질 유전자 제어 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역(Kelsey et al., 1987, Genes 및 Devel. 1: 161-171); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al, 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al, 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역(Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).
고등 진핵생물에 의해 항체 또는 항원 결합 단편의 성분(예를 들어, 경쇄, 중쇄 또는 가변 영역)을 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 인핸서 서열이 벡터에 삽입될 수 있다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에서 작용하는 길이가 보통 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용성 구성요소이다. 전사 단위에 대해 5'과 3' 위치 둘 다에서 발견되는 인핸서는 상대적으로 배향 및 위치 독립적이다. 포유류 유전자로부터 입수 가능한 몇몇 인핸서 서열(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린)이 공지되어 있다. 그러나 전형적으로, 바이러스로부터의 인핸서가 사용된다. 당 업계에 공지된 SV40 인핸서, 거대세포 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 향상 구성요소이다. 인핸서는 암호화 서열에 대해 벡터에서 5' 또는 3' 중 하나에 위치될 수 있지만, 전형적으로 프로모터로부터의 5' 부위에 위치된다. 적절한 천연 또는 이종성 신호 서열을 암호화하는 서열(리더 서열 또는 신호 펩타이드)은 위에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편의 세포 외 분비를 촉진시키기 위해 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 신호 펩타이드 또는 리더의 선택은 항체 또는 항원 결합 단편이 생성될 숙주 세포 유형에 의존하며, 이종성 신호 서열은 천연 신호 서열을 대체할 수 있다. 신호 펩타이드의 예는 위에 기술되어 있다. 포유류 숙주 세포에서 기능성인 다른 신호 펩타이드는 미국 특허 제4,965,195호에 기재된 인터류킨-7(IL-7)에 대한 신호 서열; 문헌[Cosman et al.,1984, Nature 312:768]에 기재된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; 유럽 특허 제0367 566호에 기재된 인터류킨-4 수용체 신호 펩타이드; 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 I형 인터류킨-1 수용체 신호 펩타이드; 유럽 특허 제0 460 846호에 기재된 II형 인터류킨-1 수용체 신호 펩타이드를 포함한다.
제공되는 발현 벡터는 시작 벡터, 예컨대 상업적으로 입수 가능한 벡터로부터 구축될 수 있다. 이러한 벡터는 모든 목적으로 하는 측접 서열을 포함할 수도 있고 또는 포함하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 기술된 측접 서열 중 하나 이상이 벡터에 이미 존재하지 않는 경우, 그들은 개개로 얻어지고 벡터 내로 결찰될 수 있다. 각각의 측접 서열을 얻기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입됨으로써 본 명세서에서 기술된 핵산에 의해 암호화된 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 단백질을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 상이한 성분들을 암호화하는 핵산이 동일한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 항-PAC1 항체 경쇄 또는 가변 영역을 암호화하는 핵산은 항-PAC1 항체 중쇄 또는 가변 영역을 암호화하는 핵산과 동일한 벡터로 클로닝될 수 있다. 이러한 구현예에서, 2개의 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 그리고 단일 프로모터의 제어 하에 분리되어, 경쇄 및 중쇄가 동일한 mRNA 전사체로부터 발현될 수 있다. 대안적으로, 2개의 핵산은 경쇄 및 중쇄가 2개의 개별 mRNA 전사체로부터 발현되도록 2개의 개별 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 항-PAC1 항체 경쇄 또는 가변 영역을 암호화하는 핵산은 하나의 발현 벡터로 클로닝되고, 항-PAC1 항체 중쇄 또는 가변 영역을 암호화하는 핵산은 제2 발현 벡터로 클로닝된다. 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 본 발명의 완전한 항체 또는 항원 결합 단편을 생성하기 위해 두 발현 벡터로 공동 형질감염될 수 있다.
벡터가 구축되고 본 명세서에서 기술된 항체 및 항원 결합 단편의 성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자가 벡터 또는 벡터들의 적절한 부위(들)에 삽입된 후, 완성된 벡터(들)는 증폭 및/또는 폴리펩타이드 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 성분을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포 또는 세포주를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 핵산으로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있고, 이로써 관심 대상의 유전자를 발현시키는 세포를 지칭한다. 상기 용어는, 관심 대상의 유전자가 존재한다면, 자손이 본래 모 세포와 형태, 또는 유전적 구성이 동일하든 아니든 모 세포의 자손을 포함한다. 바람직하게는 적어도 하나의 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"이다.
선택된 숙주 세포 내로 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 발현 벡터의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공동침전, 전기천공법, 미량주사법, 리포펙션, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 또는 다른 공지된 기술을 포함하는 잘 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포 유형에 따를 것이다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001]에 제시되어 있다.
적절한 조건 하에 배양될 때 숙주 세포는 항체 또는 항원 결합 단편을 합성하고, 이는 후속적으로 (숙주 세포가 그것을 배지 내로 분비한다면) 배양 배지로부터 또는 (그것이 분비되지 않는다면) 그것을 생성하는 숙주 세포로부터 직접적으로 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예컨대 목적으로 하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 또는 필수적인 폴리펩타이드 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적으로 활성인 분자로의 접힘의 용이함에 의존할 것이다.
예시적인 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 원핵생물 숙주 세포에는 유박테리아, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리치아(Escherichia), 예컨대, 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella)뿐만 아니라 바실러스(Bacillus), 예컨대 B. 서브틸리스(subtilis) 및 B. 리케니포르미스(licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 재조합 폴리펩타이드에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나 여러 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 피치아(Pichia), 예컨대 P. 파스토리스(pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia); 칸디다(Candida); 트리코더마 리이시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(nidulans) 및 A. 나이거(niger)가 일반적으로 이용 가능하며 본 명세서에서 유용하다.
글리코실화된 항체 및 항원 결합 단편의 발현을 위한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 이집트 숲모기(Aedes aegypti)(모기), 흰줄숲모기(Aedes albopictus)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 누에나방(Bombyx mori)과 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 이러한 세포의 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 누에나방 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용 가능하다.
척추동물 숙주 세포가 또한 적합한 숙주이고, 이러한 세포로부터 항체 및 항원 결합 단편의 재조합 생산이 일상적인 절차가 되었다. 발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유동물 세포주는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, CHOK1 세포(ATCC CCL61)를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, DXB-11, DG-44, 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR를 포함하지만 이에 제한되지 않는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 이용 가능한 불멸화 세포주(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 포유동물 골수종 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 세포주는 어떤 세포주가 고발현 수준을 갖고 PAC1 결합 특성을 갖는 항체 및 항원 결합 단편을 구성적으로 생성하는지의 결정을 통해 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 그 자체의 항체를 생성하지는 않지만, 이종성 항체를 생성하고 분비하는 능력을 갖는 B 세포 계통으로부터의 세포주가 선택될 수 있다. CHO 세포는 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편을 발현시키기 위한 일부 구현예에서 바람직한 숙주 세포이다.
숙주 세포는 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 생성을 위해 위에 기술된 핵산 또는 벡터로 형질전환 또는 형질감염되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 또한, 선택적 마커에 의해 분리된 전사 단위의 다중 복제본을 갖는 신규한 벡터 및 형질감염된 세포주는 항체 및 항원 결합 단편의 발현에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산 방법을 제공하며, 방법은 하나 이상의 발현 벡터에 의해 암호화된 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양 배지에서 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지 또는 숙주로부터 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 생성하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58: 44, 1979]; 문헌[Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255, 1980]; 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO90103430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. No. 30,985에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 겐타마이신TM 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 보통 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포를 배양할 때, 항체 또는 항원 결합 단편은 세포 내, 주변세포질 공간에서 생성되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편이 제1 단계로서 세포 내 생산되는 경우, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는 친화성 리간드로서 관심 항원(들) 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575, 1986). 친화도 리간드가 부착되는 기질은 가장 흔하게는 아가로오스이지만, 다른 기질도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 기질, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 단백질이 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 에탄올 침전, 역상 HPLC, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산 암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 회수될 특정 항체 또는 항원 결합 단편에 따라 가능하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 부형제, 가용화제, 유화제, 보존제, 및/또는 보조제와 함께 본 발명의 하나 또는 다수의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 항-PAC1 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다. 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기술된 임의의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 액체, 동결 및 동결건조 조성물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "약제학적으로 허용 가능한"은 사용된 투여량 및 농도에서 인간 수혜자에게 비독성이고/이거나 인간에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 부작용을 일으키지 않는 분자, 화합물 및 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투도, 점도, 선명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 속도 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다. 이러한 구현예에서, 적합한 제형 물질은 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예컨대, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산); 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염 형성 반대이온(예컨대 나트륨); 보존제(예컨대 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉스(pluronics), PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제(예컨대, 수크로스 또는 소르비톨); 등장성 향상제(예컨대, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨, 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 보조제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료 용도로 분자를 제형화하기 위한 방법 및 적합한 물질은 약학 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 표준 약제학적 담체, 예컨대 멸균 인산염 완충 식염수 용액, 정균수 등을 포함한다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4%의 식염수, 0.3%의 글리신 등이 사용될 수 있으며, 온화한 화학적 변형 등을 시킨 알부민, 리포단백질, 글로불린 등과 같은 안정성을 향상시키기 위한 다른 단백질을 포함할 수 있다.
제형 중 항체 또는 항원 결합 단편의 예시적인 농도는 약 0.1 mg/ml 내지 약 200 mg/ml 또는 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 또는 대안적으로 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 범위일 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편의 수성 제형은 예를 들어, 약 4.5 내지 약 6.5, 또는 약 4.8 내지 약 5.5, 또는 대안적으로 약 5.0의 pH 범위의 pH-완충된 용액에서 제조될 수 있다. 이 범위 내의 pH에 적합한 완충제의 예는 아세트산염(예를 들어, 아세트산 나트륨), 숙신산염(예컨대, 숙신산 나트륨), 글루콘산염, 히스티딘, 시트르산염 및 기타 유기산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는 예를 들면, 완충제 및 제형의 원하는 등장성에 따라서, 약 1 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 60 mM일 수 있다.
또한, 항체 또는 항원 결합 단편을 안정화시킬 수 있는 등장화제가 제형에 포함될 수 있다. 예시적인 등장화제는 만니톨, 수크로스 또는 트레할로스와 같은 폴리올을 포함한다. 바람직하게는 수성 제형은 등장성이지만, 고장성 또는 저장성 용액이 적합할 수 있다. 제형 중 폴리올의 예시적인 농도는 약 1% 내지 약 15% w/v의 범위일 수 있다.
계면활성제가 또한 제형에 첨가되어 제형화된 항체 또는 항원 결합 단편의 응집을 감소시키고/시키거나 제형 중의 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡착을 감소시킬 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비 이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80) 또는 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함한다. 계면활성제의 예시적인 농도는 약 0.001% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.005% 내지 약 0.2%, 또는 대안적으로, 약 0.004% 내지 약 0.01% w/v의 범위일 수 있다.
일 구현예에서, 제형은 위에서 확인된 작용제(즉, 항체 또는 항원 결합 단편, 완충제, 폴리올 및 계면활성제)를 함유하고, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 염화벤제토늄 과 같은 하나 이상의 보존제를 본질적으로 함유하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 보존제는 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 2%, 또는 대안적으로 약 0.5% 내지 약 1%의 범위의 농도로 제형에 포함될 수 있다. 하나 이상의 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제, 예컨대 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company]에 기재된 것들은 이들이 제형의 원하는 특성에 악영향을 미치지 않는 경우에 제형에 포함될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편의 치료용 제형은 원하는 순도를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 선택적인 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company)와 혼합함으로써 저장을 위해 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조된다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이며, 위에 기술된 것들, 예컨대, 완충제(예를 들어, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산); 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌); 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜; 레조르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저 분자량(예를 들어, 약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 친수성 중합체(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신); 단당류, 이당류 및, 글루코스, 만노스, 말토오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비 이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80) 또는 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 적합한 제형은 등장화하고 안정화하는, 등장화제, 예컨대 폴리올, 소르비톨, 수크로스 또는 염화나트륨과 조합하여, 등장성 완충제, 예컨대 인산염, 아세트산염, 또는 TRIS 완충제를 함유한다. 이러한 등장화제의 한 예는 5% 소르비톨 또는 수크로스이다. 또한, 제형은 예를 들어 응집을 방지하거나 안정성을 향상시키기 위해, 0.01% 내지 0.02% wt/vol의 계면활성제를 선택적으로 포함할 수 있다. 제형의 pH는 4.5 내지 6.5 또는 4.5 내지 5.5의 범위일 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편을 위한 약제학적 제형의 다른 예시적인 설명은 미국 특허 공개 제2003/0113316호 및 미국 특허 제6,171,586호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 본 발명의 조성물은 공지된 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들어, 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 생성된 용액은 무균 조건 하에서 사용하기 위해 포장되거나 여과될 수 있고, 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다.
특히 폴리펩타이드가 액체 조성물에서 비교적 불안정한 경우, 장기간 저장을 위해 폴리펩타이드를 안정화시키기 위해 동결-건조 공정이 종종 사용된다. 동결건조 주기는 일반적으로 동결, 1차 건조 및 2차 건조의 3단계로 구성된다(문헌[Williams and Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volume 38, Number 2, pages 48-59, 1984] 참고). 동결 단계에서, 용액은 충분히 동결될 때까지 냉각된다. 이 단계에서 용액 중의 다량의 물이 얼음을 형성한다. 얼음은 진공을 사용하여 얼음의 증기압 이하로 챔버 압력을 감소시킴으로써 수행되는 1차 건조 단계에서 승화된다. 마지막으로, 흡수된 또는 결합된 물은 감소된 챔버 압력 및 상승된 선반 온도 하에 2차 건조 단계에서 제거된다. 이 공정은 동결건조 케이크로 알려진 물질을 생산한다. 그 후, 케이크는 사용 전에 재구성될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제의 제조에 항균제의 희석 용액이 때때로 사용되기는 하지만, 동결건조된 물질에 대한 표준적인 재구성 관행은 순수한 물의 부피(보통 동결건조 중에 제거된 부피와 동일함)를 다시 첨가하는 것이다(문헌[Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 18: 1311-1354, 1992] 참고).
일부 경우에 동결 건조된 제품에 대한 안정화제로서 작용하는 부형제가 주목되었다(문헌[Carpenter et al., Volume 74:225-239, 1991] 참고). 예를 들어, 공지된 부형제는 폴리올(만니톨, 소르비톨 및 글리세롤 포함); 당(글루코스 및 수크로스 포함); 및 아미노산(알라닌, 글리신 및 글루탐산 포함)을 포함한다. 또한, 폴리올 및 당은 또한 폴리펩타이드를 동결 및 건조로 인한 손상으로부터 보호하고 건조된 상태로 저장하는 동안 안정성을 향상시키기 위해 종종 사용된다. 일반적으로, 당, 특히 이당류는 동결-건조 공정 및 저장 중에 모두 효과적이다. 단당류 및 이당류 및 PVP와 같은 중합체를 포함한 다른 부류의 분자는 또한 동결건조된 생성물의 안정화제로 보고되어 있다.
주사를 위해, 약제학적 제형 및/또는 의약은 위에 기술된 바와 같은 적절한 용액으로 재구성하기에 적합한 분말일 수 있다. 이들의 예로는 동결건조, 회전 건조 또는 분무 건조된 분말, 비정질 분말, 과립, 침전물 또는 미립자가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 주사를 위해, 제형은 선택적으로 안정화제, pH 조절제, 계면활성제, 생체이용률 조절제 및 이들의 조합을 함유할 수 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하며, 이 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 기질의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 y 에틸-L-글루탐산의 공중합체, 비 분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 Lupron Depot™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 폴리펩타이드가 체내에 오랫동안 남아 있는 경우, 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성이 변화될 수 있다. 관련된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-이황화물 교환을 통한 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프하이드릴 잔기를 개질하고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 기질 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성할 수 있다.
본 발명의 제형은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 단기 작용, 빠른 방출, 장기 작용 또는 지연 방출되도록 설계될 수 있다. 따라서, 약제학적 제형은 또한 제어 방출 또는 지연 방출을 위해 제형화될 수 있다.
특정 투여량은 치료될 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 삽화 편두통, 만성 편두통, 또는 군발 두통), 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 및 식이, 용량 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 약물의 조합에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 비경구, 피하, 정맥내, 복강내, 폐내, 및 비강내, 및, 국소 치료를 위해 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함하는, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체 또는 항원 결합 단편은 펄스 주입에 의해, 특히 항체 또는 항원 결합 단편의 용량을 감소시키면서, 적절히 투여된다. 바람직하게는, 투여는 부분적으로 투여가 단기적인지 만성적인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 국부, 특히 경피, 경점막, 직장, 경구 또는 원하는 부위에 가까운 카테터를 통한 국소 투여를 포함하는 다른 투여 방법이 고려된다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 매일에서 매주에서 매월까지의 빈도로 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 범위의 용량으로 생리학적 용액으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 치료 또는 개선을 필요로 하는 환자의 PAC1 수용체의 생물학적 활성과 관련된 병태의 치료 또는 개선에 유용하다. 따라서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편이 본 명세서에서 개시된다. 용어 "환자"는 인간 환자를 포함하고, 용어 "대상체"와 상호 교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 장애의 발병을 예방하거나 병리를 변화시키려는 의도로 수행된 중재이다. 따라서, "치료"는 치료적 처치와 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 이들은 장애 또는 병태로 이미 진단되었거나 고통 받는 이들뿐만 아니라, 장애 또는 병태가 예방되어야 하는 이들을 포함한다. "치료"는 증상의 경감, 완화, 약화; 손상, 병리 또는 병태를 환자가 더 견딜만하게 만들거나, 퇴행 또는 위축 속도를 늦추거나, 퇴행의 최종 지점을 덜 쇠약하게 만들거나, 환자의 신체적 또는 정신적 웰빙을 개선시키는 것과 같은 임의의 주관적 또는 객관적 매개변수를 포함하는 손상, 병리 또는 병태의 개선에서 임의의 성공 징후를 포함한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 환자에 의한 자가 보고, 신경정신병적 검사 및/또는 정신의학적 평가의 결과를 포함하는 객관적 또는 주관적 매개변수를 기반으로 할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 PAC1 수용체의 생물학적 활성과 관련된 병태(예를 들어, PAC1 수용체의 PACAP 유도성 활성화와 관련된 병태)의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. PACAP/PAC1 신호전달 경로는 심혈관 기능, 대사 및 내분비 기능, 염증, 스트레스 반응, 혈관운동성 긴장의 조절 및 자율 신경계 조절, 특히 교감 신경계와 부교감 신경계 간의 균형을 포함하는 다양한 생리학적 과정과 연관지어져 왔다. 예를 들어, 문헌[Tanida et al., Regulatory Peptides, Vol. 161: 73-80, 2010]; 문헌[Moody et al., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., Vol. 18: 61-67, 2011]; 및 문헌[Hashimoto et al., Current Pharmaceutical Design, Vol. 17: 985-989, 2011] 참조. PACAP/PAC1 신호전달 경로의 이상 또는 과활성화와 관련된 병태는 두통 병태, 예컨대 편두통, 군발 두통, 긴장성 두통, 편마비 편두통, 및 망막 편두통; 염증성 피부 병태; 신경병증 통증과 같은 만성 통증; 불안 장애; 과민성 대장 증후군; 및 일과성 열감, 안면 홍조, 발한, 및 야간 발한과 같은 혈관운동 증상을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 이의 항원 결합 단편은 이러한 병태 또는 장애 또는 이상 또는 과도한 PAC1 수용체 생물학적 활성과 관련된 기타 병태 중 임의의 것을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 환자에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 유효량의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태(예를 들어, 삽화 편두통, 만성 편두통, 군발 두통, 긴장성 두통, 편마비 편두통, 및 망막 편두통)의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 유효량의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 두통 병태를 앓는 환자의 인간 PAC1 수용체의 활성화 억제 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 환자는 편두통의 두통 병태, 예컨대, 삽화 편두통 또는 만성 편두통을 앓는다. 또 다른 구현예에서, 환자는 군발 두통 병태를 앓는다.
"유효량"은 일반적으로 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키고/시키거나, 증상 및/또는 근본적인 원인을 제거하고/하거나 증상의 발생 및/또는 그들의 근본적인 원인을 예방하고/하거나, 특정 병태로부터 초래되거나 또는 이와 관련된 손상을 개선시키거나 또는 교정하는 데 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량"은 질환 상태 또는 증상(들), 특히 질환 상태와 관련된 상태 또는 증상(들)을 교정하거나, 또는 질환 상태 또는 어떠한 방법으로든 질환과 관련된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 달리 예방하거나, 방해하거나, 지연시키거나 또는 반전시키는(즉, "치료 효능"을 제공하는) 데 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때, 의도된 예방적 효과, 예를 들어, 병태의 개시(또는 재발)의 예방 또는 지연, 또는 병태의 개시(또는 재발) 가능성 감소 효과를 가질 항체 또는 항원 결합 단편의 양이다. 전체 치료적 또는 예방적 효과는 반드시 1회 용량의 투여에 의해 생기는 것은 아니고, 일련의 용량의 투여 후에만 생길 수 있다. 따라서, 치료적 또는 예방적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 유효량의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관확장의 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장의 억제 방법을 제공한다. PAC1 수용체의 리간드, 예컨대 PACAP38 및 VIP는 강력한 혈관확장제이며, PAC1 수용체에 대한 이들 리간드의 결합을 차단하는 것은 혈관확장을 억제하고, 이상 또는 과도한 혈관확장과 관련된 병태, 예컨대, 두통 병태, 일과성 열감, 및 홍조를 개선할 수 있다. 일 구현예에서, 환자는 두통 병태, 예컨대 편두통 또는 군발 두통을 앓는다. 또 다른 구현예에서, 환자는 혈관운동 증상(예를 들어, 일과성 열감, 안면 홍조, 발한, 또는 야간 발한)을 앓는다. 관련 구현예에서, 환자는 폐경과 관련된 혈관운동 증상을 앓는다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 치료, 예방 또는 개선되는 두통 병태는 편두통이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 유효량의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료, 예방, 또는 개선을 필요로 하는 환자의 편두통의 치료, 예방, 또는 개선 방법을 포함한다. 편두통은 일회성, 맥동성, 및/또는 중등도 내지 중증의 통증 및/또는 신체 활동에 의해 악화되는 통증을 특징으로 하는, 약 4 내지 약 72시간 지속되는 재발성 두통이다. 편두통은 종종 구역, 구토, 및/또는 빛(백주 공포증), 소리(소리 공포증), 또는 냄새에 대한 민감성을 동반한다. 일부 환자에서는, 전조가 편두통의 발병에 선행된다. 전조는 전형적으로 두통이 곧 발생한다는 신호를 보내는 시각적, 감각적, 언어, 또는 운동 장애이다. 본 명세서에서 기술된 방법은 인간 환자의 전조를 수반하거나 전조가 없는 편두통의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선한다.
PACAP38은 이의 수용체의 활성화를 통해 혈관확장, 특히, 경막 혈관구조의 혈관확장을 유도한다(Schytz et al., Neurotherapeutics, Vol. 7(2):191-196, 2010). 특히, PACAP38/PAC1 수용체 신호전달 캐스캐이드는 편두통 병리학과 관련지어졌다(Amin et al., Brain, Vol. 137: 779-794, 2014). VPAC1 및 VPAC2 수용체보다 PAC1 수용체에 대해 더 큰 친화도를 갖는 PACAP38의 주입은 편두통 환자에서 편두통 유사 두통을 유발한다(Schytz et al., Brain 132:16-25, 2009; Amin et al., Brain, Vol. 137: 779-794, 2014; Guo et al., Cephalalgia, Vol. 37:125-135, 2017). 또한, PACAP38 수준은 편두통 발작을 경험하는 환자의 두개 순환에서 상승되며, PACAP38 수준은 트립탄을 이용한 편두통 증상의 치료 후에 감소된다(Tuka et al., Cephalalgia, Vol. 33, 1085-1095, 2013; Zagami et al., Ann. Clin. Transl. Neurol., Vol. 1: 1036-1040, 2014). 이러한 보고서는 PACAP38의 내인성 방출이 편두통의 중요한 도화선이며, 이의 효과는 주로 PAC1 수용체의 활성화를 통해 매개된다는 점을 시사한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료되는 환자는 삽화 편두통을 앓거나, 이로 고통을 받거나, 삽화 편두통으로 진단을 받는다. 삽화 편두통은 편두통의 병력(예를 들어, 적어도 5회의 평생 편두통 발작)이 있는 환자가 1개월당 14일 이하의 편두통일을 가질 때 진단된다. "편두통일(migraine headache day)"은 환자가 30분을 초과하여 지속되는 전조가 있거나 없는 "편두통"의 발병, 지속, 또는 재발을 경험하는 임의의 달력일을 포함한다. "편두통"은 구역 또는 구토 또는 빛 또는 소리에 대한 민감성과 관련이 있는 두통 및/또는 다음의 통증 특징 중 적어도 2개를 특징으로 하는 두통이다: 일회성 통증, 지끈거리는 통증, 중등도 내지 중증의 통증 강도, 또는 신체 활동에 의해 악화되는 통증. 특정 구현예에서, 삽화 편두통을 앓거나, 이로 고통 받거나, 삽화 편두통으로 진단된 환자는 평균적으로 1개월당 4일 이상 15일 미만의 편두통일을 갖는다. 관련 구현예에서, 삽화 편두통을 앓거나, 이로 고통 받거나, 삽화 편두통으로 진단된 환자는 평균적으로 1개월당 15일 미만의 편두통일을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 "두통일"은 환자가 본 명세서에서 정의된 편두통 또는 30분을 초과하여 지속되거나 급성 두통 치료를 필요로 하는 임의의 두통을 경험하는 임의의 달력일이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 치료되는 환자는 만성 편두통을 앓거나, 이로 고통을 받거나, 만성 편두통으로 진단을 받는다. 만성 편두통은 편두통 환자(즉, 적어도 5회의 평생 편두통 발작이 있는 환자)가 1개월당 15일 이상의 두통일을 갖고, 적어도 8일의 두통일이 편두통일일 때 진단된다. 일부 구현예에서, 만성 편두통을 앓거나, 이로 고통 받거나, 만성 편두통으로 진단된 환자는 평균적으로 1개월당 15일 이상의 편두통일을 갖는다. 본 명세서에서 기술된 방법의 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 투여는 환자의 삽화 편두통의 만성 편두통으로의 진행을 예방, 감소, 또는 지연시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 유효량의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료, 예방, 또는 개선을 필요로 하는 환자의 군발 두통의 치료, 예방, 또는 개선 방법을 제공한다. 군발 두통은 가장 두드러진 특징으로 한쪽 머리에, 일반적으로 눈 주위에 중증의 재발성 두통을 수반하는 병태이다(문헌[Nesbitt et al., BMJ, Vol. 344:e2407, 2012] 참고). 군발 두통은 종종 주기적으로 발생한다: 자발적인 완화가 활동적인 통증 기간을 방해한다. 군발 두통에는 종종 눈물, 코막힘, 안검 하수증, 동공 수축, 안면 홍조, 발한 및 눈 주위의 부종과 같은 두개 자율 증상이 동반되며, 종종 통증이 있는 한쪽 머리에 국한된다. 군발 두통 발병의 평균 연령은 약 30 내지 50세이다. 남성 대 여성 비율이 약 2.5:1 내지 약 3.5:1로 남성에서 더 일반적이다. 나비입천장신경절(SPG) 자극이 군발 두통의 치료에 사용되어 왔다. SPG에 저수준(그러나 고주파수, 생리적 차단) 전기 자극을 전달하는 신경자극 시스템이 최근 임상 시험에서 군발 두통의 급성 쇠약성 두통을 경감시키는 데 효능을 나타내었다(문헌[Schoenen J, et al., Cephalalgia, Vol. 33(10):816-30, 2013] 참고). 이러한 증거를 고려하여, 그리고 PACAP가 SPG의 주요 신경전달물질 중 하나이므로, PACAP/PAC1 신호전달을 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 억제하면 인간의 군발 두통을 치료하는 데 효과가 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 PACAP/PAC1 신호전달 경로와 관련된 기타 병태는 염증성 피부 병태, 예컨대, 장미증(미국 특허 공개 제20110229423호 참고), 만성 통증 증후군, 예컨대 신경병증성 통증(문헌[Jongsma et al., Neuroreport, Vol. 12: 2215-2219, 2001; Hashimoto et al., Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 1070: 75-89, 2006] 참고), 긴장성 두통, 편마비 편두통, 망막 편두통, 불안 장애, 예컨대, 외상 후 스트레스 장애(문헌[Hammack and May, Biol. Psychiatry, Vol.78(3):167-177, 2015] 참고), 과민성 대장 증후군, 및 혈관운동 증상(예를 들어, 일과성 열감, 안면 홍조, 발한, 및 야간 발한), 예컨대, 폐경과 관련된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하여 치료되는 병태는 만성 통증이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하여 치료되는 병태는 신경병증성 통증이다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법에서, 치료는 예방적 처치를 포함할 수 있다. 예방적 처치는 환자의 증상(예를 들어, 편두통 또는 군발 두통)의 빈도, 중증도, 및/또는 길이를 감소시키기 위해 병태 또는 발작의 발병 전(예를 들어, 편두통 발작 또는 군발 두통 에피소드의 발병 전)에 취해지도록 설계된 처치를 지칭한다.
일부 구현예에서, 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 방법은 본 명세서에서 기술된 편두통 또는 기타 두통 장애의 급성 또는 예방적 처치에 적합한 하나 이상의 작용제와 조합한 본 발명에 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "병용요법"은 순차적인 방식(즉, 각각의 화합물이 임의의 순서로 상이한 시간에 투여됨)의 2개 화합물(예를 들어, 항-PAC1 항체 및 추가 작용제)의 투여 및 실질적으로 동시적인 방식의 2개 화합물의 투여를 포함한다. 실질적 동시 투여는 동시 투여를 포함하며, 화합물 둘 다를 포함하는 단일 제형(예를 들어, 고정된 비율의 두 화합물을 포함하는 단일 제형 또는 고정된 비율의 각 화합물을 갖는 사전 충전된 시린지)을 투여하거나 각각의 화합물을 함유하는 개별 제형을 동시에 투여하여 달성할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제2 두통 치료제와 함께 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 두통 치료제는 두통 또는 편두통의 급성 치료에 사용되는 급성 두통 치료제일 수 있다. 일부 구현예에서, 급성 두통 치료제는 세로토닌(5-하이드록시트립타민; 5-HT) 수용체 효능제, 예를 들어 5HT1 수용체 효능제이다. 급성 두통 치료제는 5HT1B, 5HT1D 및/또는 5HT1F 세로토닌 수용체의 효능제일 수 있다. 이러한 세로토닌 수용체 효능제는 트립탄(예를 들어, 알모트립탄, 프로바트립탄, 리자트립탄, 수마트립탄, 나라트립탄, 엘레트립탄, 및 졸미트립탄), 에르고타민(예를 들어, 다이하이드로에르고타민 및 에르고타민 타르트레이트), 및 5HT1F-선택적 세로토닌 수용체 효능제, 예컨대 라스미디탄을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 기타 적합한 급성 두통 치료제는 비 스테로이드 항염증제(예를 들어, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 나프록센, 인도메타신, 및 디클로페낙), 및 오피오이드(예를 들어, 코데인, 모르핀, 하이드로코돈, 펜타닐, 메페리딘, 및 옥시코돈)를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 급성 두통 치료제는 트립탄이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 급성 두통 치료제는 에르고타민이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 급성 두통 치료제는 비 스테로이드 항염증제이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 급성 두통 치료제는 오피오이드이다.
일부 구현예에서, 제2 두통 치료제는 두통 또는 편두통의 예방적 처치에 사용되는 예방적 두통 치료제이다. 일 구현예에서, 예방적 두통 치료제는 항간질제, 예컨대, 디발프로엑스, 발프로산 나트륨, 발프로산, 토피라메이트, 또는 가바펜틴이다. 또 다른 구현예에서, 예방적 두통 치료제는 베타 차단제, 예컨대, 프로프라놀롤, 티몰롤, 아테놀롤, 메토프롤롤, 또는 나돌롤이다. 또 다른 구현예에서, 예방적 두통 치료제는 항우울제, 예컨대, 삼환계 항우울제(예를 들어, 아미트립틸린, 노르트립틸린, 독세핀, 및 플루옥세틴)이다. 또 다른 구현예에서, 예방적 두통 치료제는 오나보툴리눔 독소 A이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 신호전달 경로 길항제(즉, CGRP 리간드에 의해 CGRP 수용체의 활성화 또는 신호전달을 억제함)와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태(예를 들어 편두통 또는 군발 두통)를 치료 또는 예방하기 위하여 CGRP 경로 길항제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, CGRP 경로 길항제는 인간 CGRP 수용체의 길항제이다. CGRP 수용체 길항제는 CGRP 수용체의 소분자 억제제, 예컨대, 미국 특허 공개 제20060142273호 및 미국 특허 제7,842,808호; 제7,772,244호; 제7,754,732호; 제7,569,578호; 제8,685,965호; 제8,569,291호; 제8,377,955호; 제8,372,859호; 제8,143,266호; 제7,947,677호; 및 제7,625,901호(이들 모두는 그 전체가 참고로서 본 명세서에 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. CGRP 수용체 길항제는 또한 수용체의 펩타이드 길항제, 예컨대, 미국 특허 제8,168,592호(이는 그 전체가 참고로서 본 명세서에 포함됨)에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편과 함께 투여되는 CGRP 수용체 길항제는 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 예컨대, 미국 특허 제9,102,731호 및 미국 특허 공개 제20160311913호(이들 둘 다는 그 전체가 참고로서 본 명세서에 포함됨)에 기술된 항체이다. 본 발명의 방법의 일 특정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 환자의 두통 병태(예를 들어 편두통 또는 군발 두통)를 치료 또는 예방하기 위하여 서열번호 502의 서열(아래에 제공된 서열)을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 503의 서열(아래에 제공된 서열)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CGRP 수용체 단일클론 항체와 조합하여 투여된다. 본 발명의 방법의 또 다른 특정 구현예에서, 환자의 두통 병태(예를 들어 편두통 또는 군발 두통)를 치료 또는 예방하기 위하여 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여되는 항-CGRP 수용체 단일클론 항체는 에레누맙이다.
예시적인 항-CGRP 수용체 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역 서열:
QSVLTQPPSV SAAPGQKVTI SCSGSSSNIG NNYVSWYQQL PGTAPKLLIY DNNKRPSGIP DRFSGSKSGT STTLGITGLQ TGDEADYYCG TWDSRLSAVV FGGGTKLTVL (서열번호 502)
예시적인 항-CGRP 수용체 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역 서열:
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAV ISFDGSIKYS VDSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCARDR LNYYDSSGYY HYKYYGMAVW GQGTTVTVSS (서열번호 503)
일부 구현예에서, 환자의 두통 병태(예를 들어 편두통 또는 군발 두통)를 치료 또는 예방하기 위하여 본 발명의 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편과 함께 투여되는 CGRP 경로 길항제는 CGRP 리간드의 길항제이다. CGRP 리간드 길항제는 유인(decoy) 또는 가용성 CGRP 수용체 또는 CGRP 리간드에 결합하는 기타 단백질, 예컨대 항-CGRP 리간드 항체일 수 있다. 항-CGRP 리간드 항체는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 2007/054809; WO 2007/076336; WO 2011/156324; 및 WO 2012/162243(이들 전부는 그 전체가 참고로서 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편과 함께 투여되는 CGRP 리간드 길항제는 인간 α-CGRP 및/또는 인간 β-CGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, 항-CGRP 리간드 항체는 프레마네주맙이다. 또 다른 구현예에서, 항-CGRP 리간드 항체는 갈카네주맙이다. 또 다른 구현예에서, 항-CGRP 리간드 항체는 엡티네주맙이다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 개시된 임의의 방법에서의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 이러한 구현예에서, 두통 병태는 편두통이다. 편두통은 삽화 편두통 또는 만성 편두통일 수 있다. 다른 구현예에서, 두통 병태는 군발 두통이다. 일부 구현예에서, 두통 병태의 치료 또는 예방 방법은 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 조합한 제2 두통 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 제2 두통 치료제는 급성 두통 치료제, 예컨대, 5HT1B, 5HT1D 및/또는 5HT1F 세로토닌 수용체 효능제(예를 들어 트립탄 또는 에르고타민), 비 스테로이드 항염증제, 또는 오피오이드이다. 또 다른 구현예에서, 제2 두통 치료제는 예방적 두통 치료제, 예컨대, 항간질제, 베타 차단제, 항우울제, 오나보툴리눔 독소 A, 또는 CGRP 경로 길항제이다. 일부 구현예에서, CGRP 경로 길항제는 인간 CGRP 수용체 길항제이다. 일 특정 구현예에서, 인간 CGRP 수용체 길항제는 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 예컨대, 에레누맙이다. 다른 구현예에서, CGRP 경로 길항제는 CGRP 리간드의 길항제, 예컨대 인간 α-CGRP 및/또는 인간 β-CGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CGRP 리간드 항체는 프레마네주맙, 갈카네주맙, 또는 엡티네주맙이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 혈관확장 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장 억제 방법에 사용하기 위한 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 이러한 구현예에서, 환자는 두통 병태, 예컨대, 편두통(예를 들어, 삽화 또는 만성 편두통) 또는 군발 두통으로 진단될 수 있거나 두통 병태를 앓을 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 두통 병태를 앓는 환자의 인간 PAC1 수용체의 활성화 억제 방법에 사용하기 위한 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 두통 병태는 편두통(예를 들어, 삽화 또는 만성 편두통) 또는 군발 두통일 수 있다.
본 명세서에서 개시된 임의의 방법에 따른 투여를 위한 의약의 제조를 위한 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 두통 병태는 편두통이다. 편두통은 삽화 편두통 또는 만성 편두통일 수 있다. 다른 구현예에서, 두통 병태는 군발 두통이다. 특정 구현예에서, 항-PAC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제2 두통 치료제와의 투여를 위하여 제형화된다. 일 구현예에서, 제2 두통 치료제는 급성 두통 치료제, 예컨대, 5HT1B, 5HT1D 및/또는 5HT1F 세로토닌 수용체 효능제(예를 들어 트립탄 또는 에르고타민), 비 스테로이드 항염증제, 또는 오피오이드이다. 또 다른 구현예에서, 제2 두통 치료제는 예방적 두통 치료제, 예컨대, 항간질제, 베타 차단제, 항우울제, 오나보툴리눔 독소 A, 또는 CGRP 경로 길항제이다. 일부 구현예에서, CGRP 경로 길항제는 인간 CGRP 수용체 길항제이다. 일 특정 구현예에서, 인간 CGRP 수용체 길항제는 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 예컨대, 에레누맙이다. 다른 구현예에서, CGRP 경로 길항제는 CGRP 리간드의 길항제, 예컨대 인간 α-CGRP 및/또는 인간 β-CGRP에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CGRP 리간드 항체는 프레마네주맙, 갈카네주맙, 또는 엡티네주맙이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 혈관확장 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장 억제를 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 이러한 구현예에서, 환자는 두통 병태, 예컨대, 편두통(예를 들어, 삽화 또는 만성 편두통) 또는 군발 두통으로 진단될 수 있거나 두통 병태를 앓을 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 두통 병태를 앓는 환자의 인간 PAC1 수용체의 활성화 억제를 위한 의약의 제조에 있어서 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 포함한다. 두통 병태는 편두통(예를 들어, 삽화 또는 만성 편두통) 또는 군발 두통일 수 있다.
본 발명의 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 또한 생물학적 샘플에서 인간 PAC1의 검출 및 인간 PAC1을 발현하는 세포 또는 조직의 동정에 유용하다. 예를 들어, 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 진단 분석, 예를 들어, 조직 또는 세포에서 발현된 PAC1을 검출 및/또는 정량화하기 위한 면역분석에서 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 PAC1가 PACAP와 복합체를 형성하는 것을 억제하여 세포 또는 조직에서 PAC1의 생물학적 활성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 활성은 세포 내 cAMP의 상승 및 혈관확장을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 진단 목적으로 사용되어 편두통, 군발 두통, 및 불안 장애, 예컨대, 외상 후 스트레스 장애를 포함한 PAC1과 관련된 질환 및/또는 병태를 검출, 진단, 또는 모니터링할 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 사용하여 샘플 내 PAC1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다(예를 들어, 문헌[Tijssen, 1993, Practice 및 Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam)]; 문헌[Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press, Inc.)]; 문헌[Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985]; 문헌[Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096]). PAC1의 존재를 검출하는 데 유용한 방법의 예는 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편을 사용하는 면역분석, 예컨대 효소 결합 면역 흡착 측정법(ELISA) 및 방사면역측정법(RIA)을 포함한다. PAC1의 검출은 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
진단 용도를 위하여, 항-PAC1 항체 또는 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지기로 표지될 수 있다. 적합한 표지기는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광기(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 효소기(예를 들어, 겨자무 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광기, 비오티닐기, 또는 2차 리포터(예를 들어, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 사전결정된 폴리펩타이드 에피토프. 일부 구현예에서, 표지기는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위한 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 항체 또는 항원 결합 단편에 결합된다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 항-PAC1 항체 및 항원 결합 단편은 PAC1을 발현하는 세포 또는 세포들을 동정하는 데 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 표지기로 표지되고, PAC1에 대한 표지된 항체 또는 항원 결합 단편의 결합이 검출된다. 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 생물학적 샘플에서 면역침전 분석에 사용될 수 있다. 추가의 구체적인 구현예에서, PAC1에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합이 생체 내에서 검출된다. 추가의 구체적 구현예에서, 이중 특이성 항체 또는 항원 결합 단편은 단리되고, 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 측정된다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements)]; 문헌[John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons] 참고.
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 다음의 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. 인간 PAC1 항체의 결정 구조 가이드된 설계
인간 PAC1의 세포 외 도메인(ECD)와 인간 항-PAC1 중화 항체(29G4v9)의 Fab 단편 사이의 복합체의 결정 구조를 결정하였다. 인간 PAC1 ECD 및 항-PAC1 Fab를 개별적으로 정제한 다음, 1:1 몰 비율로 함께 복합체화하였다. 이후에 샘플을 20 mM TRIS pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA에서 평형화시킨 겔 여과 칼럼으로 흘려주고, 35 mg/ml로 농축시키고, 여과하였다.
Fab 단편의 중쇄(가변 영역(VH), CH1 불변 영역, 상부 힌지, 및 카스파제 III 절단 부위 포함) 및 경쇄(가변 영역(VL) 및 CL 불변 영역 포함)의 서열을 아래에 열거하였다. 인간 PAC1 ECD 구축물의 서열을 아래에 제시하였으며, 이는 아미노산 89 내지 109 사이의 영역을 뺀 인간 PAC1(서열번호 1)의 아미노산 26 내지 143을 함유하였다.
29G4v9 Fab의 중쇄의 아미노산 서열(VH 영역(아미노산: 1 내지 120); CH1 영역(아미노산: 121 내지 218); 상부 힌지 영역(아미노산 219 내지 221), 및 카스파제 III 절단 부위(222 내지 226)로 구성됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS RFAMHWVRQA PGKGLEWVAV ISYDGGNKYY AESVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TALFYCARGY DVLTGYPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KGDEVD (서열번호 2)
29G4v9 Fab의 경쇄의 아미노산 서열(VL 영역(아미노산: 1 내지 108) 및 CL 영역(아미노산: 109 내지 214)으로 구성됨):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQSIG RSLHWYQQKP GKAPKLLIKY ASQSLSGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP EDFATYYCHQ SSRLPFTFGP GTKVDIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (서열번호 3)
인간 PAC1 ECD 구축물의 아미노산 서열:
GSMAHSDGIF KKEQAMCLEK IQRANELMGF NDSSPGCPGM WDNITCWKPA HVGEMVLVSC PELFRIFNPD QDMGVVSRNC TEDGWSEPFP HYFDACGFDE YESET (서열번호 4)
정제된 인간 PAC1 ECD 및 항-PAC1 Fab를 처음에는 상업적으로 이용 가능한 스크린을 이용한 시팅 드롭 증기 확산(sitting drop vapor diffusion) 방법을 이용하여 공동 결정화하였다. 결정화 조건(Qiagen MPD Suite Screen #61 (134561))을 행잉 드롭 증기 확산(hanging drop vapor diffusion) 방법을 이용하여 추가로 확장시켰다. 단백질 및 결정화 완충제(0.1 M 시트르산 pH 4.0, 40% MPD)를 4℃에서 결정화 완충제의 저장 용액 위의 1 μl의 행잉 드롭 중에서 1:1로 혼합하였다. 몇 주 안에 막대 모양의 결정이 형성되었다.
결정을 동결방지제로서 결정화 완충제에서 평형화하였고, 데이터 수집을 위해 Lawrence Berkeley National Laboratories로 수송하기 위해 액체 질소에서 동결시켰다. ADSC-Q315r CCD 검출기(λ = 1.000 Å)의 Advanced Light Source Synchrotron Beamline 5.0.2에서 데이터 세트를 수집하였다. 데이터를 HKL2000(Otwinowski and Minor, Methods Enzymology, Vol. 276, 307-326, 1997)을 사용하여 통합 및 스케일링하였으며, 2.00 Å으로 99.8% 완성되었고, Rmerge가 0.081이었다(98.0% 완성, 마지막 쉘 2.07 내지 2.00Å, I/σ = 2.35). 결정은 사방정계 공간 그룹 P21212에 속하며, 단위 세포 치수가 a = 65.2 Å, b = 177.9 Å, c = 53.8 Å, α= 90˚, β= 90˚, γ= 90˚이다. 결정 구조를 PhaserMR을 사용하여 분자 치환에 의해 풀었다(Winn et al., Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., Vol. 67: 235-242, 2011). 항-PAC1 Fab 성분을 해결하는 첫 번째 검색 모델로 독점적인 Fab 구조를 사용하였다. 이후의 분자 치환은 인간 PAC1 ECD 성분을 해결하는 출발 모델로서, 인간 PAC1 ECD NMR 구조인 PDBID: 2JOD(Sun et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol. 104: 7875, 2007)를 사용하였다. 비대칭 단위에는 하나의 ECD 분자와 하나의 Fab 분자가 있다. 구조를 Refmac5(Winn et al., Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., Vol. 67: 235-242, 2011; Murshudov et al., Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., Vol. 67: 355-367, 2011) 및 Phenix.refine(Adams et al., Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., Vol. 66: 213-221, 2010) 둘 다를 사용하여 개량하였고, 그래픽 프로그램 Coot를 사용하여 모델 구축을 수행하였다(Emsley 및 Cowtan, Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., Vol. 2004, 60: 2126-2132, 2004).
인간 PAC1 ECD : 항-PAC1 Fab 복합체의 구조를 2.00 Å까지 개량하였고, R 인자는 20%이고, Rfree는 23%였다. 복합체의 구조의 정면도 및 측면도를 각각 도 1a 및 도 1b에 도시하였다. 29G4v9 Fab와 PAC1 ECD 사이의 상호작용은 소수성, 정전기적, 및 수소결합 상호작용으로 구성된다. 29G4v9 Fab와 PAC1 ECD 사이의 상호작용은 항체-항원 상호작용에 전형적인 매립 표면적(1613 Å2) 및 형태 상보성(0.695) 값을 갖는다. 29G4v9 Fab의 비 수소 원자로부터 5Å 이하의 거리에 적어도 하나의 비 수소 원자를 함유한 PAC1 ECD의 모든 아미노산은 PAC1 ECD의 코어 계면 아미노산인 것으로 결정되었다. 원자의 거리를 PyMOL 프로그램으로 계산하였다(DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002)). PAC1 ECD의 코어 계면 아미노산은 서열번호 1에 대한 아미노산 위치 번호로 Asp59, Asn60, Ile61, Arg116, Asn117, Thr119, Asp121, Gly122, Trp123, Ser124, Glu125, Pro126, Phe127, Pro128, His129, Tyr130, Phe131, Asp132, 및 Gly135를 포함한다.
결정 구조에서 29G4v9 Fab와 PAC1 ECD 사이의 계면을 분석하여 두 분자 사이의 상호작용이 차선적인 영역을 동정하였다. 구조적 분석에 기초하여, 항체의 결합 친화도 및/또는 억제 효능을 개선하기 위하여 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산의 돌연변이를 Fab와 PAC1 ECD 사이의 이들 영역에서의 상호작용을 개선하도록 설계하였다. 특히, Fab 경쇄와 PAC1 ECD 사이의 상호작용의 분석은 Fab 경쇄의 돌연변이가 PAC1과의 상호작용을 아마도 개선할 수 있는 4개의 영역을 밝혀냈다. PAC1 ECD 아미노산 Glu120 및 Asp121을 함유하는 영역인 구역 1에서, Glu120 및 Asp121 PAC1 아미노산과의 더 우수한 전하 상보성 또는 수소 결합 가능성을 제공하기 위하여 경쇄 CDR1(서열번호 3)의 Gln27의 리신, 티로신, 또는 아르기닌으로의 돌연변이가 제안되었다(도 2a). 구역 2는 양의 정전기적 잠재력을 갖는 영역으로, 더 우수한 전하 상보성을 제공하기 위하여 경쇄 CDR1(서열번호 3)의 Ser28의 글루탐산으로의 돌연변이가 제안되었다(도 2a). 구역 3은 PAC1 ECD Phe127 잔기를 함유하는 소수성 영역이며, 수소 결합 잠재력을 갖는다. 경쇄 CDR1의 Gly30, Arg31, 및 Ser32는 구역 3으로부터 약간 떨어져 있다(도 2a). 따라서, 이들 3개의 잔기와 PAC1 ECD의 이 구역 사이의 소수성 또는 수소 결합 상호작용을 개선하기 위하여 아래의 표 6에 요약된 바와 같이 이들 3개의 부위에서 다수의 돌연변이가 제안되었다. 경쇄 CDR3의 Arg93은 음의 정전기 잠재력를 갖는 PAC1 잔기의 포켓에 위치한다(구역 4; 도 2b). 그러나 기하학적 구조로 인해, Arg93은 PAC1 잔기와 직접적인 수소 결합을 형성하지 않는다. PAC1 ECD의 잔기와의 대안적인 전하 상보성 또는 수소 결합 잠재력을 제공하기 위하여 경쇄 CDR3의 Arg93의 글루타민, 리신, 히스티딘, 또는 아스파라긴으로의 돌연변이가 제안되었다(도 2b).
29G4v9 Fab 중쇄와 PAC1 ECD 사이의 상호작용의 분석은 Fab 중쇄의 돌연변이가 PAC1 ECD와의 상호작용을 개선할 수 있는 3개의 주요 영역을 밝혀냈다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 구역 5는 PAC1 아미노산 Phe131을 포함하고, Phe131의 양쪽에 있는 2개의 하위 구역으로 나눌 수 있다. 중쇄 CDR1의 Arg31 및 Phe32는 이들 하위 구역에 존재하고, 이들 부위에서의 돌연변이가 PAC1 Phe131 잔기와의 소수성 상호작용을 개선하거나 대안적인 전하 상보성 상호작용을 제공하기 위하여 제안되었다. 돌연변이 목록은 표 6 참고. (서열번호 1에 대해) PAC1 ECD 잔기 Asn60 및 Ile61을 포함하는 구역 6에서, 중쇄 CDR2 잔기 Tyr53, Asp54 및 Gly56의 돌연변이가 소수성 상호작용을 개선하거나 Asn60 및 Ile61 PAC1 잔기와의 대안적인 수소 결합을 제공하기 위하여 제안되었다(도 3b). 소수성 잔기 및 일부 음의 정전기적 잠재력를 갖는 영역인 구역 7에서, 표 6에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 잔기 Val102, Leu103 및 Thr104의 돌연변이가 소수성 상호작용을 개선하거나 대안적인 수소 결합 상호작용을 제공하기 위하여 제안되었다(도 3c).
Fab/PAC1 ECD 복합체의 결정 구조의 분석에 기초하여 항-PAC1 항체와 인간 PAC1 수용체 사이의 상호작용을 개선하기 위하여 제안된 특정 돌연변이에 대한 요약을 아래 표 6에 제공하였다.
Figure pct00106
위에 기술된 바와 같이, 항-PAC1 Fab와 인간 PAC1 ECD 사이의 상호작용 아미노산의 분석에 의해 설계된 돌연변이 이외에, 결정 구조를 사용하는 인실리코 친화도 성숙 분석을 또한 수행하여 항-PAC1 항체의 결합 친화도 및/또는 억제 효능을 개선하기 위한 추가의 돌연변이를 확인하였다. 인간 PAC1 ECD에 대한 결합에 관여하는 29G4v9 Fab의 아미노산 잔기를 위에 기술된 복합체의 결정 구조의 육안 검사에 의해 확인하였다. 항체의 이들 계면 잔기를 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산에 대한 가상 돌연변이를 위해 선택하였다. 항체/PAC1 ECD 결합 상호작용에 대한 돌연변이의 영향을 Biovia의 Discovery Studio 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여 특정 잔기의 돌연변이 시 결합 자유 에너지의 변화(ΔΔG결합)를 계산하여 평가하였다. 음의 ΔΔG결합 값은 돌연변이가 모 분자와 비교하여 PAC1 ECD에 대해 더 강한 결합을 초래함을 나타낸다. 이러한 계산으로 음의 ΔΔG결합 값을 초래한 대략 65개의 돌연변이를 확인하였다. 이러한 65개의 돌연변이를 이들 변이체의 PAC1 ECD와의 "모델화된" 구조의 분석 및 육안 검사에 기초하여 50개(경쇄에서 18개와 중쇄에서 32개)로 더 좁혔다. 결합 자유 에너지 계산에 기초하여 PAC1에 대한 항체의 결합 친화도를 증가시킬 것으로 예측되는 이러한 50개의 돌연변이를 아래 표 7에 요약하였다.
Figure pct00107
인실리코 접근법은 구조 기반 분석과 비교하여 상이한 아미노산뿐만 아니라 경쇄 및/또는 중쇄 내의 상이한 위치의 측면에서 추가 돌연변이의 확인을 가져왔다.
이 실시예에서 기술된 돌연변이를 재조합 생산에 의해 항-PAC1 항체로 혼입시켰고, 본 명세서의 실시예 3에 기술된 시험관 내 세포 기반 분석에서 인간 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제하는 능력을 시험하였다.
실시예 2. 29G4v10 인간 PAC1 항체의 효모 디스플레이 친화도 성숙
친화도 성숙에 대한 한 가지의 강력한 접근법은 항체 Fab 돌연변이체의 효모 디스플레이 라이브러리를 구축하고 형광 보조 유세포 분석(FACS)를 통해 개선된 결합제를 선택하는 것을 포함한다(도 4). 개선된 억제 효능을 갖는 항-PAC1 항체를 생성하기 위하여, 29G4v10 항체(서열번호 191의 VH 영역; 서열번호 52의 VL 영역)를 효모 디스플레이된 Fab 라이브러리의 FACS에 의해 친화도 성숙시켰다. 라이브러리 설계는 인간 PAC1 ECD와 29G4v9 Fab 사이의 복합체의 실시예 1에서 기술된 해결된 공결정 구조에 의해 가이드되었으며, 이의 CDR은 29G4v10과 거의 동일하다. 구조 분석은 초기에 각각 돌연변이 유발에 대한 경쇄(LC) 및 중쇄(HC) 내의 6개 및 7개의 CDR 위치를 확인하여, 친화도 증진을 위한 전략을 제안하였다. 소수성 상호작용 및 전하 상보성을 개선하고, 계면에 걸쳐 대안적인 수소 결합 상호작용을 제공하도록 점 돌연변이체를 설계하였다. 실시예 1 참고. 이들 점 돌연변이체는 반복적인 생산, 특성화 및 유리한 돌연변이의 합리적인 조합을 포함한 공학적 접근법을 개시하였다. 효모 라이브러리 설계는 13개의 위치 중 돌연변이 조합을 보다 포괄적으로 탐구하고 각각의 선택된 위치에서 다양화 전략을 증강시킴으로써 실시예 1에서 기술된 선형 접근법을 보완하고자 하였다.
개별 LC 및 HC 라이브러리를 만들어, 이론상의 다양성을 107 미만의 관리 가능한 크기로 유지하였다. LC 라이브러리는 6개의 선택된 위치 중 5개(서열번호 52의 Gln27, Gly30, Arg31, Ser32 및 Arg93)에서 MIX19 포화 돌연변이 유발을 이용하도록 설계되었다. MIX19는 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 암호화하는 삼량체 포스포라미다이트(코돈) 혼합물을 나타낸다. 나머지 경쇄 위치(서열번호 52의 Ser28)에서, 세린, 글루탐산, 알라닌 또는 정지 코돈으로의 돌연변이가 사용되었다. 하나의 라이브러리에서 모든 7개의 HC 위치(서열번호 191의 Arg31, Phe32, Tyr53, Gly56, Val102, Leu103, 및 Thr104)를 탐구하기 위해, 7개의 중쇄 CDR 위치 중 5개(서열번호 191의 Arg31, Phe32, Tyr53, Val102 및 Leu103)에서 다양화를 위하여 9개 코돈의 맞춤형 혼합물(MIX9)을 설계하였다. 맞춤형 MIX9는 소수성 아미노산, 염기성 아미노산 및 수소 결합 공여체 및 수용체(예를 들어, F, L, Y, M, Q, H, K, R 및 S)를 포함하였다. 중요하게도, 맞춤형 MIX9는 하류 제조가능성 위험을 초래할 수 있는 서열 부담의 도입을 최소화하기 위하여 시스테인, 아스파라긴 및 트립토판을 배제하였다. 나머지 2개의 중쇄 위치(서열번호 191의 Gly56 및 Thr104)에 대해 글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌으로의 돌연변이를 수행하였다. 요약하면, 이 첫 번째 캠페인의 경우, 이론적 다양성 8.5x106의 mutHC 라이브러리와 이론적 다양성 9.9x106의 mutLC 라이브러리를 설계하였으며, 구축된 라이브러리는 이론적 다양성을 9배 초과하여 오버샘플링하였다.
2개의 구축된 mutHC 및 mutLC Fab 라이브러리를 FACS를 사용하여 인간 PAC1 ECD에 대한 결합에 대해 농축시켰고, 결합에 사용되는 ECD의 농도를 낮춤으로써 각 연속 라운드의 엄격성을 증가시켰다(라운드 1: 30 nM PAC1 ECD; 라운드 2: 0.67 nM PAC1 ECD; 및 라운드 3: 0.2 nM PAC1 ECD). 동일하게 처리된 29G4v10 Fab-효모 샘플을 일상적으로 사용하여 모 Fab에 비해 개선된 결합을 나타내는 효모 클론에 대해 특이적으로 게이팅하였다. 각 클론에 대한 중간값의 형광 결합 신호를 각 클론에 대한 중간값의 형광 디스플레이 신호로 나누어 각 클론에 대한 정규화된 결합/디스플레이 비율을 계산하였다. 라운드 3에서, 개선된 결합제는 mutHC 라이브러리에서 농축되었지만, mutLC 라이브러리에서는 농축되지 않았다. mutHC 라운드 3 풀로부터 약 200개의 효모 클론의 약식 스크린은 11개의 보통 정도로 개선된 결합제를 생산하였다(표 8). 개선된 친화도 변이체를 재조합에 의해 생산하고, 실시예 3에서 기술된 바와 같이 시험관 내 기능적 활성에 대해 평가하였다. 우연히도, 제조가능성에 대한 잠재적인 부담인 29G4v10 모 Fab 내의 아스파르트산 이성질화 부위가 이들 11개의 독특한 돌연변이체 모두에서 개선되었다.
Figure pct00108
Figure pct00109
추가의 친화도 개선을 생성하기 위하여, mutHC 및 mutLC 분류 풀로부터의 농축된 돌연변이를 조합한 쇄 셔플된 라이브러리를 또한 구축하였다. 상위 결합 클론들 사이의 식별을 개선하기 위하여, 결합 해리 속도에 의해 유도된 선택 및 스크리닝 전략을 구현하였다(도 5). 돌연변이체 Fab를 디스플레이하는 효모 세포를 먼저 비오틴 부착된 인간 PAC1 ECD로 포화시키고, 과량의 비 표지 인간 PAC1 ECD를 함유하는 완충제에서 장기간 인큐베이션(최대 24시간)하기 전에 대대적으로 세척하였다. 25℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 발생하는 비 표지 인간 PAC1 ECD와의 인큐베이션은 세포에서의 해리 이벤트를 비가역적으로 만들었다. 비오틴 부착된 PAC1에 가장 많이 결합하여 가장 느린 해리 속도를 나타내는 세포를 형광 스트렙타비딘 컨쥬게이트로 염색한 후 FACS에 의해 분리하였다(도 5). 가장 느린 해리 속도를 나타내는 Fab를 디스플레이하는 효모 클론이 가장 높은 정도로 형광을 나타내었다.
해리 속도에 의해 유도된 종류의 쇄 셔플된 라이브러리에서, 동일하게 처리된 29G4v10 Fab-효모 샘플을 사용하여 비 표지 PAC1과의 밤새 경쟁 후 더 큰 비오틴 부착된 PAC1 결합을 나타내는 세포를 특이적으로 단리하였다. 상이한 게이팅 엄격성 하에 수집된 2개의 풀로부터, 결합 해리 속도 분석을 사용하여 약 600개의 개별 효모 클론을 스크리닝하고, 모 29G4v10 Fab보다 더 높은 잔류 PAC1 결합을 갖는 190개가 넘는 클론을 확인하였다. 비 관련 수용체(세포 예정사 단백질 1(PD1) 및 위 억제성 폴리펩타이드 수용체(GIPR))의 ECD에 대한 클론의 결합이 없음을 확인함으로써, 이러한 유망한 클론들의 결합 특이성을 평가하였다. 또한, 시작 29G4v10 서열에 대해, 추가의 시스테인 이상, N-연결된 글리코실화, 아스파르트산 이성질체화, 아스파라긴 탈아미드화 및 트립토판 산화 부위를 함유하는 돌연변이체를 스크린 중에 제거하였다. 상위 30개의 결합 돌연변이체를 모 29G4v10 항체로부터의 CDR의 서열 변화 및 해리 속도 분석 후의 인간 PAC1 ECD 결합의 백분율과 함께 표 9에 나타내었다. PAC1 ECD 결합의 더 높은 결합 백분율은 돌연변이체 Fab가 더 느린 해리 속도를 가짐을 나타낸다.
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Figure pct00111
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Figure pct00113
2세대 라이브러리 세트를 추가의 친화도 개선을 생성하도록 설계하였다. 위에 기술된 1세대 라이브러리는 결정 구조에서 PAC1 ECD의 4.5 Å 이내에 있는 29G4v10 모 항체 CDR 위치의 서브세트에서 다양화에 집중하였다(실시예 1). 2세대 라이브러리의 경우, 경쇄의 CDR2 및 CDR3과 같은 1세대 라이브러리에서 크게 손대지 않은 영역에서의 돌연변이 유발을 탐구하였다. 1세대 라이브러리에서 이미 탐구된 여러 위치에 대해, 시퀀싱 경향을 사용하여 3라운드의 분류 후 출현한 제한된 중성/유익 돌연변이 세트로 다양화하였다. 마지막으로, 다른 인간 VH3 및 VK3 생식계열의 동일한 위치에서 빈번하게 발견되는 아미노산을 선호하는 돌연변이 전략과 함께, 제한된 다양화를 위해, CDR 입체 형태에 영향을 줄 수 있는 일부 매립 프레임워크 잔기를 표적화하였다.
모두 합해서, 다양화를 위해 24개의 중쇄 CDR 잔기(서열번호 191의 아미노산 27, 29, 31 내지 34, 49, 52 내지 57, 70, 72, 77, 79, 98, 100 내지 104, 및 106) 및 17개의 경쇄 CDR 잔기(서열번호 52의 아미노산 27, 28, 30 내지 32, 34, 46, 49 내지 54, 92 내지 94, 및 96)를 표적화하는 네 개의 2세대 Fab 라이브러리를 설계하였다. 다수의 표적화된 위치에서의 제한된 다양성은 하나의 라이브러리 내에서 더 많은 CDR 위치를 조사할 수 있게 하였고, HCDR1과 HCDR3 및 LCDR1과 LCDR3의 공동 최적화를 가능하게 하였다. 구축된 4개의 라이브러리는 7 x 106 내지 1 x 107 범위의 이론적 다양성의 8 내지 24x의 적용 범위를 제공하였다.
위에 기술된 바와 같이, FACS를 이용하여 인간 PAC1 ECD에 대한 결합에 대해 4개의 구축된 Fab 라이브러리를 농축시켰다. 라운드 3에서, mutHCDR2 및 mutLCDR1-LCDR3 라이브러리만이 모 29G4v10 항체와 동일하거나 더 우수한 결합을 갖는 풀을 생성하였다. 따라서, 이들 2개의 풀을 추가의 친화도 개선을 위해 mutH2/mutL1L3 쇄 셔플 라이브러리 생성으로 넘겼다. 가장 높은 친화도의 돌연변이체를 농축시키고자, 1세대 라이브러리(표 9)로부터의 최고 성능의 효모 클론인 2B10을 사용하여 더욱 엄격한 분류 게이트를 설정하였다. 30℃ 또는 37℃에서 비 표지 PAC1과 밤새 해리 속도 경쟁 후, 2B10 클론과 비교하여 현저히 감소된 해리 속도의 효모 클론들을 분류할 수 있었다. 약 200개 클론의 제한된 스크린 결과, 약 100개는 2B10보다 느린 해리 속도를 가지지만, 대부분의 유망한 결합제가 HCDR2 내에 잠재적인 아스파라긴 탈아미드화 부담을 함유함이 밝혀졌다. PD1 또는 GIPR의 ECD에 대한 비 특이적 결합은 스크리닝된 모든 클론에 대해 최소였다. 엄격한 결합 및 서열 필터를 적용하자 2B10 클론보다 현저하게 개선된 PAC1 결합(37℃에서 밤새 경쟁 후 2x 초과의 더 높은 결합 백분율)을 갖고, 임의의 잠재적인 서열 부담이 없는 10개의 상위 돌연변이체가 얻어졌다(표 10). 이들 상위 10개의 돌연변이체에 대한 모 29G4v10 항체로부터의 서열 변화 및 30℃ 및 37℃에서의 해리 속도 분석 후의 인간 PAC1 ECD 결합의 백분율을 표 10에 나타내었다. 해리 속도 분석 없이 정규화된 결합으로 나눈 해리 속도 분석 후의 정규화된 결합으로 결합 백분율을 계산하였다. PAC1 ECD 결합의 더 높은 결합 백분율은 돌연변이체 Fab가 더 느린 해리 속도를 가짐을 나타낸다.
Figure pct00114
표 10에 나타난 바와 같이, 이들 상위 10개의 결합 돌연변이체는 모두 CDRL1에 Q27K 돌연변이를 함유하였고, 하나를 제외한 모두는 CDRL1에 R31W 돌연변이를 함유하였다. 모든 돌연변이체는 CDRH2의 아미노산 위치 D54 및 N57에서 돌연변이를 가졌고, 대부분은 또한 CDRH2의 아미노산 위치 G56에서 돌연변이를 가졌다. 또한, 중쇄 프레임워크 2(FR2) 및 프레임워크 3(FR3) 영역의 아미노산 위치 49 및 70에서의 보존적 돌연변이가 각각 이들 10개의 돌연변이체 중 다수에서 관찰되었다.
요약하면, 29G4v22 및 29G4v10 항-PAC1 중화 항체의 밀접하게 관련된 변이체인 29G4v9 Fab와의 복합체에서 PAC1 ECD의 구조에 의해, 29G4v10 돌연변이체의 조합 라이브러리를 PAC1 ECD에 대한 개선된 결합을 위해 설계하고 분류하였다. 가장 개선된 결합제를 분리하기 위하여, 더욱 엄격한 조건 하에서의 선택을 위한 CDR 셔플 및/또는 쇄 셔플된 라이브러리의 구축을 통해 농축된 돌연변이를 조합하였다. 분류 후 개별 효모 Fab 클론의 스크린 결과, 29G4v10 모 항체 및 최소한의 비 특이적 결합과 비교하여, 현저히 더 느린 결합 해리 속도를 갖는 인간 PAC1 ECD에 대한 개선된 결합제를 수득하였다. 개선된 친화도 변이체의 서브세트를 재조합에 의해 생산하고, 실시예 3에서 기술된 바와 같이 시험관 내 기능적 활성에 대해 평가하였다.
실시예 3. 인간 PAC1 항체 변이체의 시험관 내 기능적 활성
항-PAC1 항체의 억제 효능에 대한 공결정 구조의 분석(실시예 1) 또는 효모 디스플레이 라이브러리의 분석(실시예 2)에 의해 확인된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 돌연변이의 효과를 평가하기 위하여, 변이체를 완전한 2가 단일클론 항체 및/또는 1가 Fab-Fc 융합체(예를 들어, 이량체 IgG Fc 영역에 융합된 Fab 영역)로서 재조합 발현 방법에 의해 생성하고, 아래에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이 세포 기반 cAMP 분석에서 평가하였다. 단일클론 항체 및 Fab 단편의 경쇄는 서열번호 318 또는 서열번호 319의 서열을 갖는 인간 카파 경쇄 불변 영역에 융합된 지시된 항체 변이체로부터의 경쇄 가변 영역을 포함하였다. 단일클론 항체 및 Fab-Fc 융합체의 중쇄는 서열번호 325의 서열을 갖는 비글리코실화, 이황화 안정화된 인간 IgG1z 불변 영역에 융합된 지시된 항체 변이체로부터의 중쇄 가변 영역을 포함하였다.
PAC1 항체 변이체 서열은 부위 특이적 돌연변이 유발(SDM)에 의해 또는 SDM이 실패한 경우에는 골든 게이트 어셈블리(GGA)에 의해 생성하였다. 부위 특이적 돌연변이 유발은 돌연변이 부위 옆에 있는 한 쌍의 돌연변이 유발 프라이머를 이용하였다. 이중 가닥 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 전체 벡터 PCR 반응을 수행하였다. 특정 클론에서 모든 원하는 돌연변이에 대한 프라이머를 마스터 프라이머 믹스에 조합하고, 1개 내지 몇 개의 돌연변이를 개별 반응에 포함시켰다. 증폭 후, 주형 플라스미드 DNA를 메틸화 DNA를 우선적으로 절단하는 엔도뉴클레아제인 DpnI로 소화하여 제거하였다. 이어서, SDM 생성물을 성장 및 시퀀싱에 의한 스크리닝을 위해 컴피턴트 세포로 형질전환시켰다. 제조업체의 지시에 따라 QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)를 사용하여 SDM 반응을 수행하였다.
SDM이 실패한 경우, 대안적인 클로닝 전략을 사용하였다. 간단히 말해, GGA는 유형 II 제한 효소 및 T4 DNA 리가아제에 의존하여 다수의 DNA 단편을 절단하고 매끄럽게 연결하였다. (Engler et al., PLOS One, Vol. 3(11): e3647, 2008). 이 실시예에서, 다수의 DNA 단편은 (i) 코작 컨센서스 서열, 신호 펩타이드 서열 및 항체 가변 영역 서열을 암호화하는 합성 핵산 서열(gBlock, Integrated DNA Technologies, 미국 아이오와주 코럴빌 소재); (ii) Parts 벡터로부터 방출된 항체 불변 도메인 단편; 및 (iii) 발현 벡터 골격으로 구성되었다. GGA 반응물은 10 ng의 gBlock, 10 ng의 Part 벡터, 10 ng의 발현 벡터, 1 μl의 10x Fast Digest 반응 완충액 + 0.5 mM의 ATP(Thermo Fisher, 미국 매사추세츠주 월섬), 0.5 μl의 FastDigest Esp3I(Thermo Fisher, 미국 매사추세츠주 월섬), 1 μl의 T4 DNA 리가아제(5U/μl, Thermo Fisher, 미국 매사추세츠주 월섬) 및 10 μl까지의 물로 구성되었다. 반응은 37℃에서 2분의 소화 단계 및 16℃에서 3분의 연결 단계로 이루어진 15사이클에 걸쳐 수행되었다. 15사이클 후, 최종 5분의 37℃ 소화 단계 및 80℃에서 5분의 효소 불활성화 단계가 이어졌다.
클로닝 후, 상응하는 cDNA로 293 HEK 세포를 일시적으로 형질감염시켜 처음 22개의 아미노산이 VK1 신호 펩타이드(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC; 서열번호 486)인 PAC1 항체 폴리펩타이드를 생성하였다. 1.5x106개 세포/ml의 세포를 F17 배지(Thermo Fisher) 중 4 ml PEI/mg DNA와 함께, 0.5 mg/L의 DNA(pTT5 벡터 중 0.5 mg/L PAC1) 또는 (0.4 mg/L의 빈 pTT5 벡터와 함께, pTT5 벡터 중 0.1 mg/L PAC1)로 형질감염시켰다(Durocher et al., NRCC, Nucleic Acids. Res., Vol.30: e9, 2002). 형질감염 1시간 후 이스트올레이트(Yeastolate) 및 글루코스를 배양물에 첨가하고, 이어서 세포를 6일 동안 0.1% 콜리포르(Kolliphor), 6 mM의 L-글루타민 및 50 μg/ml의 제네티신(Geneticin)이 보충된 F17 발현 배지를 사용하여 현탁액에서 성장시킨 후, 정제를 위하여 조정 배지를 수확하였다.
PAC1 항체 변이체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피(MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences, 영국 버킹엄셔 리틀 챌폰트 소재) 및 양이온 교환 크로마토그래피(SP 세파로스 고성능 칼럼)(SP HP)(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 조정 배지로부터 정제하였다. 각각의 정제된 풀의 단백질 농도를 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 280 nm에서의 UV 흡광도(A280)에 의해 결정하였다. 정제된 풀을 2 L의 10 mM의 아세트산나트륨, 9%의 수크로스, pH 5.2(A52Su)에 대해 20 kDa의 MWCO Slide-A-Lyzer 투석 플라스크(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4℃에서 2시간 동안 교반 플레이트에서 부드럽게 교반하면서 투석하였다. 사용된 투석액을 따라내고, 새로운 2 L의 A52Su를 첨가하고 투석을 밤새 진행하였다. 투석 후, 각 샘플이 A280에 기초하여 대략 40 mg/mL가 될 때까지 스윙 버킷 로터에서 2,000 x g에서 원심분리된 30 kDa MWCO 한외여과 농축기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 샘플을 농축시켰다. Caliper LabChip GXII 미세모세관 전기영동(PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬 소재) 및 ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼, 200 Å, 4.6 x 300 mm(Waters Corporation, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 최종 생성물의 주요 피크 순도를 분석하였다. Endosafe-MCS(Charles River, 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재) 및 0.05 EU/mL의 PTS 카트리지(Charles River)를 사용하여 내독소 함량을 측정하였다.
정제된 단일클론 항체 또는 Fab-Fc 융합 단백질의 기능적 활성을 세포 기반 PAC1 수용체 cAMP 활성 분석을 사용하여 평가하였다. PACAP38 및 PACAP27은 모두 PAC1 수용체의 효능제로서, 이의 활성화는 세포 내 cAMP의 증가를 초래한다. 이 분석은 ATCC(ATCC 번호 CRL-2266; "CRL-2266 세포")로부터 수득한 인간 신경모세포종 유래 세포주(SH-SY5Y; Biedler JL et al., Cancer Res., Vol. 38: 3751-3757, 1978)를 사용하였다. CRL-2266 세포는 인간 PAC1 수용체를 내생적으로 발현한다(Monaghan et al., J Neurochem., Vol. 104 (1) : 74-88, 2008). 또한, 랫트 PAC1 수용체(GenBank 등록번호 NM_133511.2) 또는 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체(NCBI 기준 서열 XP_015303041.1)를 안정적으로 발현하는 CHO 세포주를 CRL2266 세포 대신에 랫트 및 시노몰구스 원숭이 PAC1 수용체에서의 항-PAC1 항체 또는 Fab-Fc 융합체의 종 교차 반응성을 평가하는 분석에 사용하였다. LANCE Ultra cAMP 분석 키트(PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재)를 사용하여 cAMP 농도를 측정하였다.
분석 당일, 냉동된 CRL-2266 세포를 37℃에서 해동하고, 분석 완충액으로 1회 세척하였다. 2,000개의 세포를 포함하는 10 μL의 세포 현탁액을 96 반면적 흰색 플레이트에 첨가하였다. 5 μL의 항-PAC1 변이체 단일클론 항체 또는 Fab-Fc 융합 단백질(10점 용량 반응 곡선: 1 μM 내지 0.5 fM 범위의 농도)을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 5 μL의 인간 PACAP38(10 pM의 최종 농도)을 효능제로서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 인간 PACAP38 자극 후, 20 μL의 검출 혼합물을 첨가하고, 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 방출 파장 665 nm에서 EnVision 기기(PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재)에서 판독하였다. Prizm(GraphPad Software Inc.)에 의해 데이터를 처리하고 분석하여 시험한 길항제(예를 들어, 항-PAC1 변이체 항체 또는 Fab-Fc 융합 단백질) 농도의 함수로서 POC(대조군이 분석에 사용된 효능제의 활성으로 정의된 대조군의 백분율)를 보여주고, 표준 비선형 회귀 곡선으로 적합화하여 IC50 값을 산출하였다. POC를 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00115
표 6 및 표 7에 용약된 돌연변이로 1가의 Fab-Fc 융합 단백질을 생성하고, 위에 기술된 세포 기반 cAMP 분석에서의 기능적 활성에 대해 시험하였다. 돌연변이체 Fab-Fc 융합 단백질을 2개의 분리된 그룹으로 구분하였다: 모 분자와 비교하여 인간 PAC1 수용체에 대해 억제 효능을 개선하는 돌연변이 및 중성으로 특징지어진 돌연변이(표 11). 돌연변이가 모 분자의 평균 효능보다 약 1.5배 더 약한 평균 효능을 갖고, 적어도 하나의 효능 측정이 동일한 실행에서 모 분자보다 더 엄격하다면, 돌연변이는 중성으로 특징지어졌다.
Figure pct00116
인간 PAC1 수용체에 대한 억제 효능의 증가를 제공한 돌연변이는 항체 표면 상의 3차원 공간의 3개의 별개의 영역에 존재한다. 이러한 세 영역의 돌연변이를 조합하여 잠재적으로 추가의 효능 증가를 제공함으로써 제2 라운드의 변이체 항체 및 Fab-Fc 융합 단백질을 생성하였다. 또한, 중성 돌연변이 중 일부는 결합에 유의한 영향을 미치지 않을 가능성이 있기 때문에 도입하였지만, 항체 생물물리학적 특성을 변형시키는 메커니즘을 제공할 수 있다. 원하는 돌연변이를 함유하는 가변 영역을 인간 비글리코실화 IgG1 Fc 영역 및/또는 1가의 Fab-Fc 융합 단백질을 갖는 2가의 단일클론 항체에 도입하였다. 비글리코실화된 인간 IgG1 항체 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 N297G, R292C, 및 V302C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1z Fc 영역의 서열을 포함하였다(서열번호 325). 세포 기반 cAMP 분석에서 돌연변이의 조합을 갖는 변이체 항체 및 Fab-Fc 융합 단백질의 기능적 활성을 평가하였다. 결과를 아래의 표 12에 나타내었다.
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
항체가 경쇄 가변 영역의 위치 Q27의 돌연변이(Q27K) 및 위치 D54의 돌연변이(D54I, D54Q, 또는 D54N) 및/또는 중쇄 가변 영역의 위치 G56의 돌연변이(G56R 또는 G56N)를 가졌을 때 효능의 최대 개선이 관찰되었다. 서열번호 52의 경쇄 가변 영역에서 Q27은 AHo 넘버링에서 아미노산 위치 29에 해당한다. 서열번호 191의 중쇄 가변 영역에서 D54 및 G56은 각각 AHo 넘버링에서 아미노산 위치 61 및 66에 해당한다. 경쇄 가변 영역의 위치 Q27에서 염기성 아미노산, 예컨대 리신 또는 아르기닌은 아마도 PAC1 ECD에서 산성 아미노산 Glu120 및 Asp121과의 개선된 전하 상보성을 제공한다(도 2a의 구역 1 참고). 중쇄 가변 영역의 위치 D54에서 소수성 잔기(예를 들어, 이소류신) 또는 중성 친수성 잔기(예를 들어, 글루타민 또는 아스파라긴)와 중쇄 가변 영역의 위치 G56에서 염기성 잔기(예를 들어 아르기닌) 또는 중성 친수성 잔기(예를 들어 아스파라긴)는 PAC1 ECD에서 아미노산 잔기 Asn60 및 Ile61과의 소수성 상호 작용 또는 수소 결합을 개선하는 것으로 보인다(도 3b의 구역 6 참고).
MutHC 라이브러리 스크린으로부터의 상위 11개의 돌연변이체(표 8)를 cAMP 분석에서의 생산 및 기능 시험을 위해 위에 기술된 바와 같이 비글리코실화 IgG1 단일클론 항체 및 1가 Fab-Fc 분자로 구성하였다(표 13). 이 변이체 세트에 대한 효모에서의 약간 개선된 결합은 11개의 mAb 중 4개와 11개의 Fab-Fc 중 7개에 대해 개선된 PAC1 수용체 차단 기능으로 이해되었다. 그럼에도 불구하고, 항체로서, iPS:421873 돌연변이체는 모 29G4v10 항체와 비교하여 PAC1 차단 기능의 약 4배의 개선을 보여주었다. 돌연변이체의 활성 순위는 두 가지 구성에 걸쳐 거의 일관되었고, Fab-Fc는 아마도 결합도의 손실로 인해 mAb보다 약한 기능(높은 IC50 값)을 일관되게 보여주었다.
Figure pct00124
쇄 셔플된 라이브러리로부터의 29G4v10 돌연변이체 서브세트(표 9 및 10)를 비글리코실화 IgG1 단일클론 항체로 전환시키고, 세포 기반 cAMP 분석에서 기능적 활성에 대해 시험하였다. 결과를 아래의 표 14에 나타내었다.
Figure pct00125
단일클론 항체(mAb)로 구성되었을 때, 2세대 쇄 셔플 라이브러리로부터의 29G4v10 돌연변이체(표 10)는 1세대 쇄 셔플 라이브러리로부터의 돌연변이체(표 9)보다 더 강력한 PAC1의 길항제였으며, 이는 증진된 PAC1 차단 기능이 개선된 결합 및 특히, 더 느린 결합 해리 속도와 관련이 있음을 시사한다. 그러나 놀랍게도, mAb로서의 돌연변이체 대부분은 아마도 인간 PAC1 ECD에 대한 증진된 결합에도 불구하고 mutHC 라이브러리 스크린(표 13)으로부터의 가장 강력한 돌연변이체인 항체 iPS:421873보다 활성이 약했다. 그럼에도 불구하고, 30_D05 돌연변이체는 각각 29G4v10 모 항체 및 29G4v22 대조군 항체와 비교하여 기능의 약 10배 및 67배의 개선을 나타내었다. 매우 강력한 S8_30_D05 및 iPS:421873 mAb가 공유하는 한 가지의 공통된 특징은 HCDR2 내의 D54R 돌연변이로, 이는 다른 덜 강력한 mAb 돌연변이체 모두에 부재한다. 흥미롭게도, 모든 친화도 성숙 변이체는 29G4v10 모 항체 및 29G4v22 대조군 항체와 대조적으로, 랫트 PAC1 수용체와 교차 반응성을 나타낸다(표 14).
실시예 4. 인간 PAC1 항체 변이체의 생체 내 기능적 활성
막사딜란은 혈관확장 펩타이드이자 PAC1 수용체의 효능제이다. 막사딜란이 피내로 투여될 때, 레이저 도플러 영상화로 측정할 수 있는 국소 피부 혈류의 증가를 초래한다. PAC1 길항제(예를 들어, 항-PAC1 항체)에 의한 이 효과의 억제는 PAC1 생물학적 활성의 길항작용의 번역 약력학 모델로서 작용할 수 있다. 실시예 3으로부터 단일클론 항체로 구성될 때 개선된 시험관 내 억제 효능을 나타내는 PAC1 변이체의 서브세트를 랫트 피부 혈류 모델을 사용하여 생체 내 PAC1 수용체 활성화를 억제하는 효능에 대해 시험하였다.
생체 내 약력학 모델
연구 당시 8 내지 12주령의 미경험 수컷 Sprague Dawley 랫트를 Charles River Laboratories에서 구입하였다. 이 실시예의 모든 절차는 동물복지법, 실험실 동물의 관리 및 사용 지침 및 실험동물복지국 지침에 따라 수행하였다. 동물을 Amgen의 실험실 동물 평가 및 승인 위원회(Amgen's Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Committee, AAALAC) 승인 시설의 비 멸균, 환기식 미세아이솔레이터 하우징에 집단 수용하였다. 동물들은 자동 급수 시스템을 통한 물(현장 생성 역삼투) 및 펠렛 사료(Harlan Teklad 2020X, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)에 자유롭게 접근할 수 있었다.
항-PAC1 항체의 서브세트를 레이저 도플러 영상화를 이용한 랫트 막사딜란 유도성 피부 혈류 증가(MIIBF) 약력학(PD) 모델에서 시험하였다. 막사딜란의 투여 용액(Bachem, H6734.0500)을 1X 인산염 완충 식염수(PBS)에 막사딜란 모액(0.5 mg/mL)을 최종 농도 0.5 μg/mL로 희석하여 매일 신선하게 제조하였다. 모든 항-PAC1 항체(Ab)를 실험에 필요한 용량에 따라 상이한 농도로 10 mM의 아세트산나트륨, 9%의 수크로스, pH 5.2(A52Su)에 제조하고, 레이저 도플러 영상화에 의한 피부 혈류(DBF) 측정 전날 단일 볼루스 정맥 주사를 통해 투여하였다.
레이저 도플러 영상화기(LDI-2, Moor Instruments, Ltd, 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재)를 사용하여 633 nm의 헬륨-네온 전구에 의해 생성된 저전력 레이저 빔을 사용하여 랫트 복부 피부의 면도된 패치에서 DBF를 측정하였다. 측정 해상도는 0.2 내지 2 mm이고, 기기 개구와 조직 표면 사이의 스캐닝 거리는 30 cm이다. DBF를 측정하고, 항체 효과의 크기를 정량화하기 위하여 기준선으로부터의 변화(%)[100 x (개별 막사딜란 후 흐름 - 개별 기준선 흐름)/개별 기준선 흐름] 또는 DBF 억제(%)[비히클의 BL로부터의 변화(%)의 평균 - 개별 항체 처리된 랫트의 BL로부터의 변화(%)/비히클의 BL로부터의 변화(%)의 평균]으로 표현하였다.
시험 당일, 프로포폴로 마취한 후, 랫트의 복부 부위를 면도하고, 연구하는 동안 안정적인 체온을 유지하기 위하여 온도 제어 순환 온수 패드에 각 동물을 바로 누운 자세로 두었다. 10 내지 15분의 안정화 기간 후, 고무 O-링(0.925 cm 내경, O-Rings West, 미국 워싱턴주, 시애틀)을 (보이는 혈관 위에 직접 배치하지 않고) 랫트 복부에 위치시켰다. 선택한 범위에 O-링을 배치한 후 기준선(BL) DBF 측정을 수행하였다. BL 스캔 후, PAC1 효능제 막사딜란을 O-링의 중심에서 피내 주사(0.5 μg/mL, 20 μL)에 의해 투여하였다. 막사딜란 주사 30분 후, 또는 항체 처리 24 ± 1.5시간 후에 DBF를 측정하였다. O-링은 DBF가 분석되는 관심 범위를 한정한다.
모든 DBF 결과를 평균 ± SEM으로 표현하였다. 비히클 처리에 대한 PAC1 Ab 효과의 통계적 유의성을 평가하기 위해 일원 분산분석에 이어 던넷의 다중 비교 시험(MCT)을 이용하였다. 두 군 사이의 유의성을 결정하기 위해 0.05 미만의 p 값을 사용하였다.
단일 정맥 내(i.v.) 용량 스크리닝 평가
0.1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg의 용량의 막사딜란 유발(0.5 μg/mL, 20 μl) 24시간 전에 7개의 상이한 항-PAC1 항체(420653, 420845, 420943, 421873, 420889(PL-50347), 421091(PL-50350), 및 421051(PL-50351)) 중 1종으로 랫트에 사전 처리하였고, 이는 비히클(A52Su) 처리군과 비교하여 MIIBF의 감소를 초래하였다. 막시딜란 처리 후 30분에, 시험한 7개의 항체 중 5개에 대해 비히클군과 비교하여 0.3 mg/kg의 MIIBF에서 통계적으로 유의한 억제가 있었다(도 6). 7개의 항체 중 6개에 대한 24 ± 1.5시간에서의 말단 혈청 농도를 아래 표 15에 열거하였다.
Figure pct00126
용량-반응 평가
0.01 mg/kg 내지 30 mg/kg 범위 용량의 막사딜란 유발(0.5 μg/mL, 20 μl) 24시간 전에 랫트를 4개의 상이한 항-PAC1 항체(420653, 420845, 420943, 및 421873)로 사전 처리하였다. 비히클 처리군과 비교하여 MIIBF의 용량 의존적 감소가 4개의 항체 각각에 대해 관찰되었다(도 7a 내지 7d). Ab 420653은 0.06, 0.1, 0.3, 1 및 3 mg/kg에서 각각 44%, 68%, 86%, 95%, 및 101%의 억제 효과로, 0.06 mg/kg의 낮은 용량에서 유의한 효과를 나타냈다(도 7a). Ab 420845는 각각 79%, 102% 및 107%의 억제로 0.3, 1 및 3 mg/kg에서 유의한 효과를 나타냈다(도 7b). Ab 420943 및 421873은 Ab 420845 및 Ab 420653보다 약간 덜 강력하지만, 여전히 1 mg/kg에서 유의한 억제 효과를 나타냈다. Ab 420943에 대한 DBF의 억제(%)는 각각 1, 3, 10, 30 mg/kg에서 56%, 46%, 52% 및 81%였다(도 7c). Ab 421873에 대한 DBF의 억제(%)는 각각 1, 3, 10 및 30 mg/kg에서 34%, 55%, 72% 및 100%였다(도 7d).
이 실시예에서 기술된 실험 결과는 시험관 내 리간드 유도성 PAC1 수용체 활성화를 강력하게 억제하는 항체가 PAC1 매개성 혈관확장의 모델인 피부 혈류 분석에서 평가한 생체 내 PAC1 수용체 활성화도 억제함을 보여준다.
실시예 5. 인간 PAC1 항체 변이체의 약동학 특성
4개의 항-PAC1 항체(420653, 420845, 420943 및 421873)의 예비 약동학(PK) 연구를 미경험 수컷 Sprague-Dawley 랫트 및 미경험 수컷 시노몰구스 원숭이로 수행하였다. 29G4v10 모 항체 또는 구조적으로 관련된 29G4v22 항체(서열번호 53을 포함하는 VL 및 서열번호 192를 포함하는 VH)를 대조군으로 평가하였다. 정맥 내 볼루스 투여에 의해 동물을 연구하기 위하여 시험 항체를 투여하였다. 투여 후 소정의 시점에 혈액 샘플을 수집하고 혈청으로 처리하였다. 모든 혈청 표본을 후속 분석을 위해 이송될 때까지 대략 -70℃(±10℃)에서 저장하였다.
투여 후 랫트 및 시노몰구스 원숭이로부터의 혈청 샘플에서 시험 항체의 양을 측정하기 위하여, 인간 IgG Fc에 대한 쥣과의 단일클론 항체(mAb)(Amgen, Inc., 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 비색 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 개발하였다. 미세적정 플레이트를 2 μg/mL의 쥣과의 항-인간 Fc mAb로 코팅하였다. 코팅된 미세적정 플레이트를 I-블록(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 소재)으로 차단하였다. 시험 항체를 연구한 종으로부터의 100% 혈청으로 스파이킹하여 분석 표준물질(STD) 및 품질 대조군(QC)을 제조하였다. STD, QC, 블랭크 및 연구 샘플을 분석 완충액(1 M NaCl, 1% BSA 및 0.5% 트윈 20을 함유한 1X PBS)에서 1:30으로 희석하였다. 희석된 STD, QC, 블랭크 및 연구 샘플을 교반없이 25℃에서 1시간 동안 코팅된 미세적정 플레이트에서 인큐베이션하였다. 세척 단계 후, 분석 완충제 중 30 ng/mL의 겨자무 과산화효소(HRP)가 접합된 쥣과의 항-인간 Fc mAb를 미세적정 플레이트에 첨가하고, 교반없이 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 단계 후, 테트라메틸벤지딘(TMB) 과산화물 기질 용액(KPL Inc., 미국 메릴랜드주 소재)을 미세적정 플레이트에 첨가하였다. HRP의 존재 하에, TMB는 STD, QC 및 연구 샘플에 존재하는 결합된 인간 Fc의 양에 비례하는 비색 신호를 생성하였다. 발색 지속시간은 분석물에 의존적이며, 2 N의 황산의 첨가에 의해 중단되었다. SpectraMax 340PC 미세적정 플레이트 판독기(Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 소재) 및 SoftMax Pro 소프트웨어를 사용하여 650 nm를 참고로 하여 450 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 가중치가 1/y인 로지스틱(자동 추정) 회귀 모델을 사용하여 분석 데이터를 회귀 분석하였다. 분석 동적 범위는 20 ng/mL 내지 2000 ng/mL이었다.
랫트 및 시노몰구스 원숭이 PK 연구 모두에 대해, Phoenix® WinNonlin(버전 6.4; Certara, 미국 뉴저지주)을 사용하여 개별 혈청 농도-공칭 시간 데이터에 대한 비 구획 분석을 수행하였다. 정량하한(LLOQ, 20 ng/mL) 미만의 개별 농도 값은 정량 한계(BQL) 미만으로 보고되었으며, 요약 통계 계산을 위해 0으로 설정되었다. LLOQ 미만의 평균 농도 값은 보고되지 않았거나 도표화되지 않았다. LLOQ보다 작은 모든 농도 값은 비 구획 분석에서 제외하였다. 공칭 용량 및 공칭 샘플링 시간을 PK 분석에 사용하였다. 다음의 PK 매개변수를 추정하였다:
ㆍ 정맥 내 투여 후 초기 농도(C0) 값을 처음 2개의 관찰된 감소하는 농도 값을 사용하여 시간 0으로의 후외삽(back extrapolation)에 의해 추정하였다.
ㆍ 시간 0에서 무한대까지의 농도-시간 곡선 아래 면적(AUCinf)을 선형 사다리꼴 방법으로 계산하였다.
ㆍ 말기 반감기(t1/2,z)를 ln2/λz로 계산하였다. λz는 곡선의 말단 부분과 관련된 약물의 1차 속도 상수이다.
ㆍ 전신 클리어런스(CL)를 다음과 같이 계산하였다: CL = 용량 / 정맥 내 투여 후 AUCinf
ㆍ 정상 상태에서의 분포 부피(Vss)를 다음과 같이 추정하였다: Vss = CL x MRTinf(시간 0에서 무한대까지의 평균 체류 시간)
인간 PAC1, 랫트 PAC1 및 시노 PAC1에 대한 29G4v10 모 항체 및 29G4v22 대조군 항체뿐만 아니라 4개의 항체의 시험관 내 억제 효능에 대한 요약을 아래 표 16에 제공하였다. 실시예 3에서 기술된 cAMP 분석법을 사용하여 항체의 상이한 종으로부터의 PAC1 수용체의 리간드 유도성(PACAP38 또는 막사딜란) 활성화를 억제하는 능력에 대해 평가하였다.
Figure pct00127
랫트에게 1 mg/kg, 5 mg/kg, 및 25 mg/kg의 용량으로 4개의 항체 중 하나를 정맥 내 투여하였다. 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 수집하고, 위에 기술된 ELISA 분석을 사용하여 각각의 시점에서 혈청 샘플에서 항체 농도를 측정하였다. 랫트 연구에 대한 PK 매개변수를 아래의 표 17에 요약하였으며, 각각의 용량에 대한 혈청 농도-시간 프로파일을 도 8a 내지 도 8c에 나타내었다.
Figure pct00128
시노몰구스 원숭이에게 10 mg/kg의 용량으로 4개의 항체 중 하나를 정맥 내 투여하였다. 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 수집하고, 위에 기술된 ELISA 분석을 사용하여 각각의 시점에서 혈청 샘플에서 항체 농도를 측정하였다. 시노몰구스 원숭이 연구에 대한 PK 매개변수를 아래의 표 18에 요약하였으며, 혈청 농도-시간 프로파일을 도 9에 나타내었다. 29G4v22 항체의 PK 프로파일을 비교를 위해 나타내었다.
Figure pct00129
이 용량에서, 4개의 PAC1 변이체 항체는 모두 29G4v22 대조군 항체보다 더 긴 혈청 반감기를 가졌다. 흥미롭게도, 모든 4개의 PAC1 변이체 항체가 29G4v22 대조군 항체와 비교하여 PAC1 수용체에 대해 더 큰 시험관 내 억제 효능을 나타내었지만(표 16), 변이체 중 일부에 대한 PK 프로파일은 시노몰구스 원숭이에서 덜 유리하였다. 예를 들어, Ab 420845는 29G4v22 대조군 항체와 비교하여 더 빠른 클리어런스율 및 더 낮은 전체 노출을 가졌다. 그러나 Ab 420653은 29G4v22 대조군 항체와 유사한 PK 프로파일을 가져(도 9), Ab 420653이 유사한 약리학적 효과를 달성하기 위해 동일한 투여 빈도로 더 적은 용량으로 투여될 수 있음을 시사하였다.
실시예 6. 19H8 인간 PAC1 항체의 효모 디스플레이 친화도 성숙
개선된 억제 효능을 갖는 추가의 항-PAC1 항체를 생성하기 위하여, 19H8 항체(서열번호 296의 VH 영역; 서열번호 67의 VL 영역)를 실시예 2에서 기술된 방법을 사용하여 효모 디스플레이된 Fab 라이브러리의 FACS에 의해 친화도 성숙시켰다. 19H8 항체는 29G4v9, 29G4v10 및 29G4v22 항체와 구조적으로 다르지만, 또한 인간 PAC1 수용체에 대해 매우 강력한 중화 활성을 나타낸다.
PAC1 ECD-19H8 Fab 복합체에 대한 결정 구조 정보가 초기에는 이용 가능하지 않았기 때문에, 상동성 모델을 생성하여 각각의 CDR 루프 내에서 표면 노출된 잔기를 확인하였다. PAC1 ECD가 표면 노출된 CDR 잔기와 직접 접촉할 것으로 예상되기 때문에, 이러한 접촉의 속성을 변화시키거나 포괄적인 돌연변이 유발을 통해 새로운 접촉을 생성하는 것은 PAC1 ECD에 대한 항체의 개선된 결합을 가져올 수 있다는 가설을 세웠다. 각 라이브러리의 이론적 다양성을 관리 가능한 106 내지 107으로 제한하기 위하여, MIX19 포화 돌연변이 유발을 위하여 CDR당 최대 5개의 위치를 식별하고, CDR당 1개의 개별 라이브러리를 구축하였다. 모델링된 CDRH3 루프 입체 형태의 정확성에 관한 우려로 인해, 이 루프 내에서 가장 많이 용매 노출된 잔기를 확실하게 식별할 수 없었다. 따라서, 루프의 시작과 끝에 있는 잔기를 제외하고, CDRH3 내의 11개의 CDR 잔기 중 8개에서의 다양화를 고려하였다. 포화 돌연변이 유발에 대한 위치의 수를 5개로 좁히기 위해, 방향족 잔기가 종종 단백질-단백질 상호작용의 중요한 매개체이기 때문에, CDRH3 내의 2개의 트립토판 및 1개의 페닐알라닌을 피하였다. 전체적으로, 6개의 개별 CDR Fab 라이브러리를 다양화를 위해 16개의 중쇄 및 15개의 경쇄 CDR 잔기를 표적으로 하도록 설계하였으며, 구축된 라이브러리는 이론적 다양성을 4.5 내지 46배 오버샘플링하였다. 각 CDR 라이브러리에 대한 표적화된 위치의 요약을 아래에 제공하였다:
중쇄 CDR 라이브러리(서열번호 296에 대한 아미노산 위치):
ㆍ CDRH1 라이브러리: Asp27(FR1의 CDRH1에 인접하여 위치함), Ser31, Asn32, Ser33, 및 Thr35
ㆍ CDRH2 라이브러리: Tyr54, Tyr55, Ser57, Lys58, Ser60, 및 His62
ㆍ CDRH3 라이브러리: Thr103, Lys105, Gln106, Leu107, 및 Leu110
경쇄 CDR 라이브러리(서열번호 67에 대한 아미노산 위치):
ㆍ CDRL1 라이브러리: Ser28, Ser30, Arg31, Tyr32, 및 Asn34
ㆍ CDRL2 라이브러리: Tyr49(FR2의 CDRL2에 인접하여 위치함), Ala50, Ala51, Ser52, 및 Ser53
ㆍ CDRL3 라이브러리: Ser91, Tyr92, Ser93, Pro94, 및 Phe96
6개의 개별-CDR Fab 라이브러리를 FACS를 사용하여 인간 PAC1 ECD에 대한 결합에 대해 농축시켰고, 결합에 사용되는 PAC1 ECD의 농도를 낮춤으로써 각 연속 라운드의 엄격성을 증가시켰다(라운드 1: 30 nM PAC1 ECD; 라운드 2: 0.67 nM PAC1 ECD; 및 라운드 3: 0.2 nM PAC1 ECD). 추가의 친화도 개선을 위하여, 개별 CDR 라이브러리로부터의 농축된 돌연변이를 결합한 2개의 CDR 셔플 Fab 라이브러리(중쇄에 대한 것 하나와 경쇄에 대한 것 하나) 및 각각의 CDR 셔플 라이브러리로부터의 농축된 돌연변이를 조합한 최종 쇄 셔플 라이브러리를 또한 구축하였다. CDR 셔플 및 쇄 셔플 라이브러리는 실시예 2에서 기술되고 도 5에 도시된 해리 속도 결합 선택 과정을 사용하여 더욱 엄격한 조건 하에서 PAC1 ECD 결합에 대한 선택을 수행하였다. 최종 해리 속도 종류의 쇄 셔플 라이브러리는 이 풀 내의 대부분의 효모 클론이 모 19H8 항체와 비교하여 PAC1 ECD 결합에서 현저하게 개선되었음을 시사하였다.
대략 800개의 개별 효모 클론을 인간 PAC1 ECD에 대한 개선된 결합에 대해 스크리닝하였다. 서열 부담(예를 들어, 시스테인 이상, N-연결된 글리코실화 부위, 아스파르트산 이성질체화, 아스파라긴 탈아미드화, 및 트립토판 산화 부위)을 갖는 돌연변이체 서열을 제거하였다. 상위 약 200개의 고유한 결합제를 2차 스크린으로 진행시켰으며, 여기서 결합 해리 속도에 의해 순위를 매기고, 비 특이적 결합에 대해 평가하였다. 2차 스크린에서, 30℃에서 비 표지 PAC1 ECD와의 밤새 경쟁 후, 비오틴 부착된 인간 PAC1 ECD의 더 높은 결합 백분율로 측정 시, 80%를 초과하는 클론이 모 19H8 항체보다 더 느린 결합 해리 속도를 가졌다. 비오틴이 부착된 PAC1 ECD가 30℃에서 오로지 1시간만의 경쟁 후에 모 19H8로부터 완전히 해리되었으므로, 이 측정치는 해리 속도 개선의 하한을 나타낸다. 스크리닝된 클론 중 어느 것도 관련되지 않은 PD1 및 GIPR 수용체의 ECD에 대한 결합을 나타내지 않았기 때문에, 클론 풀을 더 좁히기 위하여, 추가의 서열 필터를 적용하여 모 19H8 항체보다 CDR에 퓨린 절단 부위, 추가의 트립토판 잔기 및 더 많은 공분산 위반이 포함된 돌연변이체를 제거 하였다. 인간 PAC1 수용체에 대한 구조적으로 관련된 수용체인 인간 VPAC2에 대한 비 특이적 결합 정도를 결정하기 위하여 비오틴이 부착된 인간 VPAC2 ECD를 사용하는 추가의 결합 분석을 사용하여 클론의 순위를 매겼다. 2차 스크린에 들어간 효모 클론 중에서 인간 PAC1 ECD에 대해 가장 느린 결합 해리 속도 및 가장 적은 양의 인간 VPAC2 결합을 나타내는 상위 20개의 돌연변이체를 아래의 표 19에 열거하였다. PAC1 ECD 결합의 더 높은 결합 백분율은 돌연변이체 Fab가 더 느린 해리 속도를 가짐을 나타낸다.
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
개선된 친화도 변이체를 완전한 2가 단일클론 항체 및/또는 1가 Fab-Fc 융합체(예를 들어, 이량체 IgG Fc 영역에 융합된 Fab 영역)로서 재조합 발현 방법에 의해 생성하고, 실시예 3에서 기술된 세포 기반 cAMP 분석에서 시험관 내 기능적 활성에 대해 평가하였다. 기능적 분석의 결과를 아래 표 20에 나타내었다.
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Fab-Fc 융합 단백질로 구성될 때, 19H8 변이체는 모 19H8 Fab-Fc 융합 단백질과 비교하여 억제 효능이 2배 내지 58배 증가한 것으로 나타났다. Fab-Fc 융합 단백질로 구성될 때 많은 19H8 변이체가 29G4v10 변이체보다 더 강력하였다(Fab-Fc 융합 단백질에 대한 표 12의 결과와 표 20의 결과를 비교할 것). 2가 단일클론 항체로 구성될 때, 19H8 변이체는 또한 한 자릿수의 나노몰 또는 피코몰 범위의 IC50 값의 강력한 인간 PAC1 중화 활성을 나타냈다.
실시예 7. 시노몰구스 원숭이에서 인간 PAC1 항체 변이체의 생체 내 기능적 활성
항-PAC1 항체 420653과의 생체 내 표적 관여를 평가하기 위하여, 시노몰구스 원숭이에서 막사딜란 유도성 피부 혈류 증가를 억제하는 항체의 능력을 평가하였다. 막사딜란은 PAC1 수용체의 선택적 효능제이며, 설치류, 시노몰구스 원숭이 및 인간에서 수용체를 활성화시킬 수 있다. 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 막사딜란의 피내 투여는 레이저 도플러 영상화로 측정할 수 있는 국소 피부 혈류의 증가를 초래한다. 항-PAC1 항체에 의한 이 효과의 억제는 PAC1 생물학적 활성의 길항작용의 번역 약력학 모델로서 작용할 수 있다.
5 내지 8세의 수컷 시노몰구스 원숭이를 연구에 사용하였다. 막사딜란의 투여 용액(Bachem, H6734.0500)을 1X 인산염 완충 식염수(PBS)에 막사딜란 모액(0.5 mg/mL)을 희석하여 매일 신선하게 제조하였다. 항-PAC1 항체 420653 또는 대조군으로 시험한 29G4v22를 실험에 필요한 용량에 따라 상이한 농도로 10 mM의 아세트산 나트륨, 9%의 수크로스, 0.01%의 트윈-80, pH 5.2(A52SuT)에 제조하였고, 정맥 내(i.v.) 주입을 통해 투여하였다.
레이저 도플러 영상화기(LDI2-IR, Moor Instruments, Ltd, 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재)를 사용하여 633 nm의 헬륨-네온 전구에 의해 생성된 저전력 레이저 빔을 사용하여 복측 전완 또는 내측 넓적다리의 면도된 피부 패치에서 피부 혈류(DBF)를 측정하였다. 적외선 파장을 눈에 보이는 빨간색 조준 빔과 결합하여 더 깊은 진피(0.6 내지 1 mm)의 혈류에 더 높은 가중치를 부여하였다. 고정된 조직과 움직이는 혈액에 의해 입사광이 산란되었다. 미세혈관 내의 움직이는 혈액이 도플러 광 이동을 초래하였다. 이어서, 움직이는 혈액으로부터의 이동된 광 및 조직으로부터의 이동되지 않은 광이 2개의 제곱법 검출기로 안내되었다. 이어서 검출된 강도 변동을 (조직 혈류에 비례하는) 흐름 및 (움직이는 혈액 세포의 농도에 비례하는) 농도의 매개변수를 제공하도록 처리하였다. 측정 해상도는 0.2 내지 2 mm이고, 기기 개구와 조직 표면 사이의 스캐닝 거리는 20 내지 100 cm이다.
DBF를 플럭스(상대 단위)로 측정하고, 막사딜란 투여 30분 후 기준선으로부터의 변화(%), [100 x (개별 막사딜란 후 플럭스 - 개별 기준선 플럭스)/개별 기준선 플럭스]로 표시하였다. 2개의 별도의 O-링의 플럭스 단위를 각 시험 세션에 대해 함께 평균화하였다. 개별 동물로부터의 막사딜란 유도성 혈류 증가(MIIBF)에 미치는 항-PAC1 항체의 억제 효과를 억제(%)[100 x (기준선으로부터 제0일의 변화(%)의 평균 - 기준선으로부터 개별 항체 처리된 동물의 변화(%))/기준선으로부터 제0일의 변화(%)의 평균]로 표시하였다.
마취 및 15 내지 20분 동안의 활력 징후의 안정화 후, 고무 O-링(0.925 cm의 내경, O-Rings West, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 눈에 보이는 혈관 위에 직접 위치시키지 않고 복측 전완 또는 내측 넓적다리의 미리 면도한 피부에 서로 약 0.6 내지 1 cm 떨어지게 위치시켰다. 각 시험 세션에 사용되는 사지를 미리 결정하였고, 상이한 연구 시험일에 상이한 사지를 사용하였다. 피부에 O-링을 배치한 후 기준선 측정을 수행하였다. 기준선 스캔 후, 20 μL 비히클(PBS) 중 1 ng의 막사딜란 용액을 O-링의 중심에 피내 주사하였다. O-링은 데이터 분석 중에 관심 영역으로 작용하였다.
항-PAC1 항체의 투여 전에, MIIBF의 시간 경과를 제0일에 수득하였다. 시노몰구스 원숭이에서 이전의 막사딜란 용량 반응의 결과에 기초하여 1 ng의 막사딜란 용량을 선택하였다. 막사딜란 전 기준선 DBF 측정 후, 막사딜란 피내 주사에 대한 DBF 반응의 시간 경과를 막사딜란 적용 5, 10, 15, 20, 25 및 30분 후에 레이저 도플러 스캔을 획득함으로써 평가하였다. 막사딜란 반응체를 확인하고 비 반응체가 연구에 포함되지 않도록 하기 위하여, 항체 투여 전 사전 스크린 절차를 수행하였다. 60 플럭스 단위(30분에서의 막사딜란 후 DBF의 평균 - 기준선의 평균) 이상의 DBF 흐름 변화를 갖는 경우, 동물을 막사딜란 반응체로 간주하고 연구에 포함시켰다.
막사딜란 반응체로 확인된 24마리의 시노몰구스 원숭이는 제0일에 0.1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 용량으로 항체 420653 또는 10 mg/kg의 용량으로 항체 29G4v22를 받았다. 시린지 주입 펌프에 의해 1 mL/분의 속도로 복재 정맥 내로의 i.v. 주입을 통해 항체를 투여하였다. 상이한 사지를 사용하여 제2일, 제4일, 제7일, 제10일, 제14일, 제21일, 제28일, 및 제36일에 막사딜란 후 DBF 측정을 수행하였다. 각각의 경우에, 1 ng의 막사딜란의 피내 주사 후 30분 동안 레이저 도플러 영상화에 의해 DBF를 측정하였다. 약동학(PK) 분석을 위한 전혈 샘플을 항체 투여 전, 항체 투여 후 30분, 1, 2, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35 또는 36일 및 42일 후를 포함하여 여러 시점에서 수집하였다.
도 10a에 도시된 바와 같이, 3 mg/kg의 항체 420653은 제0일(항체 처리 전)과 비교하여 제2일, 제7일, 제14일, 및 제21일(항체 처리 후)에 MIIBF를 유의하게 방지하였으나, 0.1 mg/kg은 그렇지 않았다(n=8마리/군; 본페로니 조정 p 값 = 0.0087). 10 mg/kg의 항체 29G4v22 또한 제2일 및 제7일에 MIIBF를 유의하게 방지하였다(n = 8마리/군)(도 10a). 3 mg/kg의 항체 420653의 최대 억제 효과는 제2일의 96% 억제였고, 0.1 mg/kg에서, 항체 420653은 제4일에 39%의 최대 억제를 초래하였으나, 이는 통계적으로 유의하지 않았다(도 10b). 10 mg/kg의 항체 29G4v22는 제7일에 63%의 최대 억제를 초래하였다(도 10b). 동일한 시점에서의 항체 420653(3 mg/kg)와 항체 29G4v22(10 mg/kg)의 비교는 제2일, 제7일, 제14일 및 제21일에 유의한 차이를 나타내었다(도 10b).
DBF 측정을 수행한 날의 항체 420653 및 항체 29G4v22에 대한 항체 혈청 농도를 아래 표 21에 나타내었다. 정량하한(LLOQ) 또는 정량 수준 미만(BQL)은 항체 420653의 경우 10 ng/mL이고, 항체 29G4v22의 경우 50 ng/mL이었다.
Figure pct00136
전체적으로, 이러한 결과는 항체 420653이 3 mg/kg의 용량으로 투여될 때 시노몰구스 원숭이에서 MIIBF를 유의하게 약화시켰음을 보여준다. MIIBF에 대한 3 mg/kg의 항체 420653의 억제 효과는 10 mg/kg의 더 높은 용량의 항체 29G4v22보다 더 강력했다.
본 명세서에서 논의되고 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 개시된 발명은 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 물질이 변할 수 있으므로 이들에 제한되지 않음이 이해된다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어가 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해된다.
당업자는 본 명세서에 기술된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 통상적 실험만으로도 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> PAC1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> IPA200834-US <150> US 62/617,157 <151> 2018-01-12 <160> 569 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PAC1 <400> 1 Met Ala Gly Val Val His Val Ser Leu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Met Ala Pro Ala Met His Ser Asp Cys Ile Phe Lys Lys Glu Gln Ala 20 25 30 Met Cys Leu Glu Lys Ile Gln Arg Ala Asn Glu Leu Met Gly Phe Asn 35 40 45 Asp Ser Ser Pro Gly Cys Pro Gly Met Trp Asp Asn Ile Thr Cys Trp 50 55 60 Lys Pro Ala His Val Gly Glu Met Val Leu Val Ser Cys Pro Glu Leu 65 70 75 80 Phe Arg Ile Phe Asn Pro Asp Gln Val Trp Glu Thr Glu Thr Ile Gly 85 90 95 Glu Ser Asp Phe Gly Asp Ser Asn Ser Leu Asp Leu Ser Asp Met Gly 100 105 110 Val Val Ser Arg Asn Cys Thr Glu Asp Gly Trp Ser Glu Pro Phe Pro 115 120 125 His Tyr Phe Asp Ala Cys Gly Phe Asp Glu Tyr Glu Ser Glu Thr Gly 130 135 140 Asp Gln Asp Tyr Tyr Tyr Leu Ser Val Lys Ala Leu Tyr Thr Val Gly 145 150 155 160 Tyr Ser Thr Ser Leu Val Thr Leu Thr Thr Ala Met Val Ile Leu Cys 165 170 175 Arg Phe Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Phe Ile His Met Asn Leu 180 185 190 Phe Val Ser Phe Met Leu Arg Ala Ile Ser Val Phe Ile Lys Asp Trp 195 200 205 Ile Leu Tyr Ala Glu Gln Asp Ser Asn His Cys Phe Ile Ser Thr Val 210 215 220 Glu Cys Lys Ala Val Met Val Phe Phe His Tyr Cys Val Val Ser Asn 225 230 235 240 Tyr Phe Trp Leu Phe Ile Glu Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Leu Leu Val 245 250 255 Glu Thr Phe Phe Pro Glu Arg Arg Tyr Phe Tyr Trp Tyr Thr Ile Ile 260 265 270 Gly Trp Gly Thr Pro Thr Val Cys Val Thr Val Trp Ala Thr Leu Arg 275 280 285 Leu Tyr Phe Asp Asp Thr Gly Cys Trp Asp Met Asn Asp Ser Thr Ala 290 295 300 Leu Trp Trp Val Ile Lys Gly Pro Val Val Gly Ser Ile Met Val Asn 305 310 315 320 Phe Val Leu Phe Ile Gly Ile Ile Val Ile Leu Val Gln Lys Leu Gln 325 330 335 Ser Pro Asp Met Gly Gly Asn Glu Ser Ser Ile Tyr Leu Arg Leu Ala 340 345 350 Arg Ser Thr Leu Leu Leu Ile Pro Leu Phe Gly Ile His Tyr Thr Val 355 360 365 Phe Ala Phe Ser Pro Glu Asn Val Ser Lys Arg Glu Arg Leu Val Phe 370 375 380 Glu Leu Gly Leu Gly Ser Phe Gln Gly Phe Val Val Ala Val Leu Tyr 385 390 395 400 Cys Phe Leu Asn Gly Glu Val Gln Ala Glu Ile Lys Arg Lys Trp Arg 405 410 415 Ser Trp Lys Val Asn Arg Tyr Phe Ala Val Asp Phe Lys His Arg His 420 425 430 Pro Ser Leu Ala Ser Ser Gly Val Asn Gly Gly Thr Gln Leu Ser Ile 435 440 445 Leu Ser Lys Ser Ser Ser Gln Ile Arg Met Ser Gly Leu Pro Ala Asp 450 455 460 Asn Leu Ala Thr 465 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PAC1 ECD <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Asp Val Leu Thr Gly Tyr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Gly Asp Glu 210 215 220 Val Asp 225 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PAC1 ECD <400> 3 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PAC1 ECD <400> 4 Gly Ser Met Ala His Ser Asp Gly Ile Phe Lys Lys Glu Gln Ala Met 1 5 10 15 Cys Leu Glu Lys Ile Gln Arg Ala Asn Glu Leu Met Gly Phe Asn Asp 20 25 30 Ser Ser Pro Gly Cys Pro Gly Met Trp 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 365 caagttcagt tggtggagtc tggagccgaa gtagtaaagc caggagcttc agtgaaagtc 60 tcttgtaaag caagtggatt cacgtttagc cgctttgcca tgcattgggt gcggcaagct 120 cccggtcagg ggttggagtg gatgggagtt attagctatg acgggggcaa taagtactac 180 gccgagtctg ttaagggtcg ggtcacaatg acacgggaca cctcaaccag tacactctat 240 atggaactgt ctagcctgag atccgaggac accgctgtgt attattgcgc tagggggtac 300 gatgtattga cgggttatcc tgattactgg gggcagggga cactcgtaac cgtctctagt 360 <210> 366 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 366 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatata acggaggaaa taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatgttttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac 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<400> 384 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatc agggaggaaa taaatactat 180 gcacgctccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatgttttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 360 <210> 385 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 385 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatt acggaggaaa taaatactat 180 gcacgctccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatgttttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 360 <210> 386 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 386 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatata acggaggaaa taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatatcttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 360 <210> 387 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 387 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatata tcggaggaaa taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatatcttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 360 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cgtctctagt 360 <210> 453 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 453 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt cactacgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcattca tgggaaccaa taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatttcttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 360 <210> 454 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 454 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt tactttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcacacc gcggaaccaa taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatctgttga gcggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 360 <210> 455 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 455 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgggtgtt atcaactatc gtggacatgg taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccgtg tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gagaggatac 300 gatgttttga ctggttaccc cgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtgtctagt 360 <210> 456 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 456 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgggtgtt atatcttttt ctggaggttc taaatactat 180 gcagagtccg tgaagggccg gttcaccttg tccagagaca attccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac 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180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaatgt ggaaccagaa ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 478 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 478 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct aacaaacagg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg taaatggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaatgt ggtctggtga ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 479 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 479 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct tctcatgttg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg taaatggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaatgt ggtctgaaga ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 480 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 480 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct tctcgtcagg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg taaatggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaatgt ggcagggtaa ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 481 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 481 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct aaccatcagg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg taaatggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaactt ggatccagga ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 482 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 482 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct tctcgtgacg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg taaatggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggacagt ggaacgaaga ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 483 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gtgcgaggag 900 cagtacggca gcacgtaccg ttgcgtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1359 <210> 568 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 568 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct aaccgtctgg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg taaatggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaactt ggaaccagga ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtgtcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gtgcgaggag 900 cagtacggca gcacgtaccg ttgcgtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1359 <210> 569 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 569 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct tctcgttacg ctacttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacagggg tcagtggaaa 180 aatcattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca accccgacac gtccaagagc 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggaatgt ggaaccagaa ctggttcctg gaccactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtgtcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gtgcgaggag 900 cagtacggca gcacgtaccg ttgcgtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1359

Claims (56)

  1. 인간 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩타이드 I형 수용체(PAC1)(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) AHo 넘버링에 따른 위치 29의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Glu120 또는 Asp121과 상호작용하는 염기성 아미노산인 경쇄 가변 영역, 및 (ii) AHo 넘버링에 따른 위치 61의 아미노산이 인간 PAC1의 아미노산 Asn60 또는 Ile61과 상호작용하는 소수성, 염기성, 또는 중성 친수성 아미노산인 중쇄 가변 영역을 포함하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시 500 pM 미만의 IC50으로 인간 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 위치 29의 아미노산은 리신 또는 아르기닌인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 위치 61의 아미노산은 이소류신, 발린, 류신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역의 AHo 넘버링에 따른 위치 66의 아미노산은 인간 PAC1의 아미노산 Asn60 또는 Ile61과 상호작용하는 염기성 또는 중성 친수성 아미노산인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 위치 66의 아미노산은 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 Asp59, Arg116, Asn117, Thr119, Gly122, Trp123, Ser124, Glu125, Pro126, Phe127, Pro128, His129, Tyr130, Phe131, Asp132, 및 Gly135로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 에피토프에서 인간 PAC1에 결합하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 52의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 191의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, CDRL1은 서열번호 5 내지 16으로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRL2는 서열번호 26의 서열을 포함하고; CDRL3은 서열번호 36 내지 38로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRH1은 서열번호 88 내지 96으로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRH2는 서열번호 106 내지 166으로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRH3은 서열번호 171 내지 177로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    (a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 171의 서열을 갖거나;
    (b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 116, 및 171의 서열을 갖거나;
    (c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 134, 및 171의 서열을 갖거나;
    (d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 92, 145, 및 174의 서열을 갖거나;
    (e) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 108, 및 172의 서열을 갖거나;
    (f) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 5, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 128, 및 172의 서열을 갖거나;
    (g) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 7, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 134, 및 171의 서열을 갖거나;
    (h) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 12, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 153, 및 171의 서열을 갖거나;
    (i) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 12, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 154, 및 171의 서열을 갖거나;
    (j) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 13, 26, 및 36의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 88, 155, 및 171의 서열을 갖는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 54 내지 66으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열, (ii) 서열번호 54 내지 66으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열, 또는 (iii) 서열번호 54 내지 66으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 191 내지 295로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열, (ii) 서열번호 191 내지 295로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열, 또는 (iii) 서열번호 191 내지 295로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 경쇄 가변 영역은 서열번호 54의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 194의 서열을 포함하거나;
    (b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 54의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 203의 서열을 포함하거나;
    (c) 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 228의 서열을 포함하거나;
    (d) 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 274의 서열을 포함하거나;
    (e) 경쇄 가변 영역은 서열번호 54의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 214의 서열을 포함하거나;
    (f) 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 240의 서열을 포함하거나;
    (g) 경쇄 가변 영역은 서열번호 54의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 228의 서열을 포함하거나;
    (h) 경쇄 가변 영역은 서열번호 62의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 282의 서열을 포함하거나;
    (i) 경쇄 가변 영역은 서열번호 62의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 283의 서열을 포함하거나;
    (j) 경쇄 가변 영역은 서열번호 63의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 284의 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, CDRL1은 서열번호 17 내지 25로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRL2는 서열번호 27 내지 35로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRL3은 서열번호 39 내지 51로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRH1은 서열번호 97 내지 105로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRH2는 서열번호 167 내지 170으로부터 선택되는 서열을 포함하고; CDRH3은 서열번호 178 내지 190으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    (a) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 25, 31, 및 42의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 190의 서열을 갖거나;
    (b) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 20, 30, 및 44의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나;
    (c) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 33, 및 42의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 99, 168, 및 187의 서열을 갖거나;
    (d) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 23, 31, 및 50의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 97, 167, 및 178의 서열을 갖거나;
    (e) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 31, 및 44의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 189의 서열을 갖거나;
    (f) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 27, 및 39의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나;
    (g) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 31, 및 46의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 179의 서열을 갖거나;
    (h) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 28, 및 40의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 98, 168, 및 179의 서열을 갖거나;
    (i) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 30, 및 43의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 100, 168, 및 182의 서열을 갖거나;
    (j) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 22, 28, 및 49의 서열을 갖고, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 각각 서열번호 102, 169, 및 182의 서열을 갖는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 68 내지 87로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열, (ii) 서열번호 68 내지 87로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열, 또는 (iii) 서열번호 68 내지 87로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 (i) 서열번호 296 내지 312로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열, (ii) 서열번호 296 내지 312로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열, 또는 (iii) 서열번호 296 내지 312로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 경쇄 가변 영역은 서열번호 85의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 312의 서열을 포함하거나;
    (b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 72의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 300의 서열을 포함하거나;
    (c) 경쇄 가변 영역은 서열번호 81의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 307의 서열을 포함하거나;
    (d) 경쇄 가변 영역은 서열번호 78의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 296의 서열을 포함하거나;
    (e) 경쇄 가변 영역은 서열번호 83의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 310의 서열을 포함하거나;
    (f) 경쇄 가변 영역은 서열번호 87의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 300의 서열을 포함하거나;
    (g) 경쇄 가변 영역은 서열번호 74의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 297의 서열을 포함하거나;
    (h) 경쇄 가변 영역은 서열번호 68의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 297의 서열을 포함하거나;
    (i) 경쇄 가변 영역은 서열번호 71의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 300의 서열을 포함하거나;
    (j) 경쇄 가변 영역은 서열번호 77의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 304의 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 완전 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 단일클론 항체는 인간 카파 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 인간 카파 불변 영역은 서열번호 318 또는 서열번호 319의 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서, 단일클론 항체는 인간 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제22항에 있어서, 인간 람다 불변 영역은 서열번호 315의 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제24항에 있어서, 단일클론 항체는 인간 IgG1 항체인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제25항에 있어서, 단일클론 항체는 비글리코실화 인간 IgG1 항체인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제26항에 있어서, 단일클론 항체는 이의 중쇄 내에 EU 넘버링에 따른 아미노산 위치 N297에서의 돌연변이를 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제27항에 있어서, 돌연변이는 N297G인 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 단일클론 항체는 이의 중쇄 내에 EU 넘버링에 따른 R292C 및 V302C 돌연변이를 더 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제26항에 있어서, 단일클론 항체는 서열번호 324 또는 서열번호 325의 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 기반 cAMP 분석으로 측정 시 10 nM 미만의 IC50으로 랫트 PAC1의 PACAP 유도성 활성화를 억제하는 것인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고,
    (a) 경쇄는 서열번호 506의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 521의 서열을 포함하거나;
    (b) 경쇄는 서열번호 506의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 522의 서열을 포함하거나;
    (c) 경쇄는 서열번호 504의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 523의 서열을 포함하거나;
    (d) 경쇄는 서열번호 504의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 524의 서열을 포함하거나;
    (e) 경쇄는 서열번호 506의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 525의 서열을 포함하거나;
    (f) 경쇄는 서열번호 504의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 526의 서열을 포함하거나;
    (g) 경쇄는 서열번호 506의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 523의 서열을 포함하거나;
    (h) 경쇄는 서열번호 507의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 527의 서열을 포함하거나;
    (i) 경쇄는 서열번호 507의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 528의 서열을 포함하거나;
    (j) 경쇄는 서열번호 508의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 529의 서열을 포함하거나;
    (k) 경쇄는 서열번호 510의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 531의 서열을 포함하거나;
    (l) 경쇄는 서열번호 511의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 532의 서열을 포함하거나;
    (m) 경쇄는 서열번호 512의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 533의 서열을 포함하거나;
    (n) 경쇄는 서열번호 513의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 534의 서열을 포함하거나;
    (o) 경쇄는 서열번호 514의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 535의 서열을 포함하거나;
    (p) 경쇄는 서열번호 515의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 535의 서열을 포함하거나;
    (q) 경쇄는 서열번호 516의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 532의 서열을 포함하거나;
    (r) 경쇄는 서열번호 517의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 536의 서열을 포함하거나;
    (s) 경쇄는 서열번호 509의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 532의 서열을 포함하거나;
    (t) 경쇄는 서열번호 518의 서열을 포함하고, 중쇄는 서열번호 530의 서열을 포함하는 것인, 단리된 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제34항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  36. 제35항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  37. 인간 PAC1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산 방법으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 제36항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지 또는 숙주 세포로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 혈관확장 억제를 필요로 하는 환자의 혈관확장의 억제 방법으로, 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 환자는 두통 병태를 앓는 환자인, 방법.
  40. 두통 병태를 앓는 환자의 인간 PAC1 수용체 활성화의 억제 방법으로, 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 두통 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 두통 병태의 치료 또는 예방 방법으로, 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 두통 병태는 편두통인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 편두통은 삽화 편두통인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 편두통은 만성 편두통인, 방법.
  45. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 두통 병태는 군발 두통인, 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예방적 처치로서 환자에게 투여되는 것인, 방법.
  47. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 두통 치료제를 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 제2 두통 치료제는 급성 두통 치료제인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 급성 두통 치료제는 5HT1B, 5HT1D 및/또는 5HT1F 세로토닌 수용체 효능제인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 세로토닌 수용체 효능제는 트립탄 또는 에르고타민인, 방법.
  51. 제48항에 있어서, 급성 두통 치료제는 비 스테로이드 항염증제 또는 오피오이드인, 방법.
  52. 제47항에 있어서, 제2 두통 치료제는 예방적 두통 치료제인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 예방적 두통 치료제는 항간질제, 베타 차단제, 항우울제, 오나보툴리눔 독소 A, 또는 CGRP 경로 길항제인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, CGRP 경로 길항제는 인간 CGRP 수용체 길항제인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 인간 CGRP 수용체 길항제는 인간 CGRP 수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 항-CGRP 수용체 단일클론 항체는 에레누맙인, 방법.
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