TWI831762B - Pac1抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及人垂體腺苷酸環化酶激活多肽I型受體(PAC1)之中和抗體，以及包含此類抗體之藥物組成物。還描述了使用該等中和抗體治療或預防頭痛病況如偏頭痛和叢集性頭痛之方法。

Description

PAC1抗體及其用途 相關申請的交叉引用
本申請要求2018年1月12日提交的美國臨時申請案號62/617,157的權益，將其藉由引用以其全部內容併入本文。
以電子形式遞交的文字檔案的說明書
本申請含有一份已經以ASCII格式電子遞交的序列表並且將該序列表藉由引用以其全文特此結合。於2018年12月20創建的序列表的電腦可讀格式的拷貝，被命名為A-2189-WO-PCT_SeqList_ST25，大小為490千位元組。
本發明涉及生物製藥領域。特別地，本發明涉及特異性地結合人垂體腺苷酸環化酶激活多肽I型受體(PAC1)並有效抑制其生物活性的抗體。本發明還涉及包含該等抗體的藥物組成物，以及生產和使用該等抗體的方法。
偏頭痛係可涉及明顯疼痛的發作性頭痛，常伴有噁心、嘔吐、以及對光(畏光)和聲音(懼音症)極度敏感，並且有時會有事先感覺告警症狀或體征(先兆)。偏頭痛係世界範圍內非常普遍的疾病，其中約12% 的歐洲人口，並且美國18%的女性，6%的男性患有偏頭痛發作(Lipton等人，Neurology[神經病學]，第68卷：343-349,2007；Lipton等人，Headache[頭痛]，第41卷：646-657,2001)。一項評估美國偏頭痛患病率的研究報告稱，近一半的偏頭痛患者群體每月有三次或更多次偏頭痛(Lipton等人，Neurology[神經病學]，第68卷：343-349,2007)。此外，偏頭痛與許多精神病和醫學合併症(如抑鬱症和血管疾病)有關(Buse等人，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry[神經病學神經外科和精神病學雜誌]，第81卷：428-432,2010；Bigal等人，Neurology[神經病學]，第72卷：1864-1871,2009)。目前大多數偏頭痛治療要麼耐受不良要麼無效(Loder等人，Headache[頭痛]，第52卷：930-945,2012；Lipton等人，2001)；因此偏頭痛仍然存在未得到滿足的醫療需求。
偏頭痛發病機理的一個主要組成部分涉及三叉神經血管系統的活化。從血管周圍神經纖維釋放的三叉神經和副交感神經遞質(Sánchez-del-Rio和Reuter,Curr.Opin.Neurol.[神經病學新見]，第17卷(3)：289-93,2004)導致顱血管的血管舒張，並且已被認為與偏頭痛的發作有關(Edvinsson,Cephalagia[頭痛雜誌]，第33卷(13)：1070-1072,2013；Goadsby等人，New Engl J Med.[新英格蘭醫學雜誌]，第346卷(4)：257-270,2002)。
因在垂體前葉細胞中刺激環AMP(環腺苷酸，cAMP)形成的能力而得名的垂體腺苷酸環化酶激活多肽(PACAP)係首先分離自綿羊下丘腦提取物的38-胺基酸(PACAP38)或27-胺基酸(PACAP27)肽(Miyata等人，Biochem Biophys Res Commun.[生物化學與生物物理研究通訊]，第164卷：567-574,1989；Miyata等人，Biochem Biophys Res Commun.[生物化學與生物物理研究通訊]，第170卷：643-648,1990)。PACAP屬於VIP/促胰液 素/胰高血糖素超家族。PACAP27的序列對應於PACAP38的27N末端胺基酸並與血管活性腸多肽(VIP)共用68%的同一性(Pantaloni等人，J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]，第271卷：22146-22151,1996；Pisegna和Wank,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，第90卷：6345-49,1993；Campbell和Scanes,Growth Regul.[生長調節雜誌]，第2卷：175-191,1992)。人體中PACAP肽的主要形式係PACAP38，並且PACAP38的藥理學尚未顯示出與PACAP27的藥理學不同。已經報導了三種PACAP受體：以高親和力結合PACAP並對VIP(PAC1受體)具有低得多的親和力的一種受體，以及同樣好地識別PACAP和VIP的兩種受體(VPAC1和VPAC2受體)(Vaudry等人，Pharmacol Rev.[藥理學評論]，第61卷：283-357,2009)。
使用PACAP作為激發劑(challenge agent)誘導偏頭痛樣頭痛的人類實驗性偏頭痛模型支持用於拮抗PACAP/PAC1訊號傳導途徑作為偏頭痛預防的治療方法。在偏頭痛患者的自發性偏頭痛發作期間，PACAP38在血漿中升高，並且用舒馬曲坦(sumatriptan)(急性偏頭痛療法)可以使該等升高的PACAP38水平正常化(Tuka等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第33卷：1085-1095,2013；Zagami等人，Ann.Clin.Transl.Neurol.[臨床和轉化神經病學年鑒]，第1卷：1036-1040,2014)。PACAP38的輸注導致健康受試者的頭痛和偏頭痛患者的偏頭痛樣頭痛(Schytz等人，Brain[腦]，第132卷：16-25,2009；Amin等人，Brain[腦]，第137卷：779-794,2014；Guo等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第37卷：125-135,2017)。然而，在相同的模型中，在偏頭痛患者中VIP不引起偏頭痛樣頭痛(Rahmann等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第28卷：226-236,2008)。VIP輸注不誘導偏頭痛樣頭痛表明，PACAP38肽的作用係藉由PAC1受體而不是VPAC1或VPAC2受體介導的，因為VIP在後兩種受體處具有高得多的親和力。這一概念得到動物研究的進一步支 持，其中PAC1受體拮抗劑在偏頭痛的體內模型中抑制三叉神經頸複合體中的傷害感受性神經元活性(Akerman等人，Sci.Transl.Med.[科學轉化醫學期刊]，第7卷：308ra157,2015；Hoffmann等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第37卷(1S)：3，摘要OC-BA-004,2017)。總之，該等數據表明抑制PAC1受體的PACAP激活的藥理學試劑具有治療偏頭痛的潛力。
本發明部分地基於特異性地結合人PAC1並有效地抑制人PAC1的高親和力抗體的設計和產生。與先前所描述的抗PAC1抗體相比，本發明的該等抗體對人PAC1具有增強的抑制效力，其中IC50值在皮莫耳範圍內。分離的抗體及其抗原結合片段可用於抑制、干擾或調節人PAC1的生物活性，包括抑制或減少PACAP誘導的PAC1激活、抑制或減少血管舒張、以及改善或治療偏頭痛和其他血管性頭痛的症狀。
在一些實施方式中，該等分離的抗體及其抗原結合片段在表位處特異性地結合人PAC1，該表位包括選自以下的一個或多個胺基酸：SEQ ID NO：1的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Glu120、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。在某些實施方式中，該表位至少包含人PAC1的胺基酸Asn60、Ile61、Glu120和Asp121。在該等和其他實施方式中，本發明的該等抗體和抗原結合片段包含位於輕鏈和重鏈可變區內特定位置處、與該等表位殘基相互作用的特定胺基酸。例如，在一個實施方式中，該等抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其中根據AHo編號在位置29處的胺基酸係與人PAC1的胺基酸Glu120或Asp121相互作用的鹼性胺基酸(例如，精胺酸或賴胺酸)。在另一個實施方式中，該等抗體或抗原結合片段 包含重鏈可變區，其中根據AHo編號在位置61處的胺基酸係與人PAC1的胺基酸Asn60或Ile61相互作用的疏水、鹼性、或中性親水胺基酸(例如，異亮胺酸、纈胺酸、亮胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸)。在又另一個實施方式中，該等抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，其中根據AHo編號在位置66處的胺基酸係與人PAC1的胺基酸Asn60或Ile61相互作用的鹼性或中性親水胺基酸(例如，穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸)。
本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可以抑制配位基誘導的PAC1受體的激活。例如，在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體和抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於500pM。在其他實施方式中，該等抗PAC1抗體和抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於300pM。在某些實施方式中，該等抗PAC1抗體和抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約50pM和約500pM之間。
在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段與來自其他物種的PAC1受體交叉反應。在一個實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段特異性地結合並抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活。在這樣的實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約0.1nM和約1nM之間或在約50pM和約500pM之間。在另一個實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段特異性地結合並抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活。該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP 測定測量的IC50小於10nM，例如其中IC50在約0.1nM和約10nM之間或在約100pM和約2nM之間。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區和重鏈可變區，輕鏈可變區包含互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3，重鏈可變區包含互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3。該等輕鏈可變區和重鏈可變區或CDR可以來自任何本文所描述的抗PAC1抗體。例如，在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：CDRL1，其包含選自SEQ ID NO：5-16的序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO：26的序列；CDRL3，其包含選自SEQ ID NO：36-38的序列；CDRH1，其包含選自SEQ ID NO：88-96的序列；CDRH2，其包含選自SEQ ID NO：106-166的序列；和CDRH3，其包含選自SEQ ID NO：171-177的序列。在其他實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：CDRL1，其包含選自SEQ ID NO：17-25的序列；CDRL2，其包含選自SEQ ID NO：27-35的序列；CDRL3，其包含選自SEQ ID NO：39-51的序列；CDRH1，其包含選自SEQ ID NO：97-105的序列；CDRH2，其包含選自SEQ ID NO：167-170的序列；和CDRH3，其包含選自SEQ ID NO：178-190的序列。
在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：54-66和SEQ ID NO：68-87的序列具有至少90%同一性或至少95%同一性的序列。在該等和其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：191-312的序列具有至少90%同一性或至少95%同一性的序列。在一個實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區和重鏈可變區，輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：54-66的序列，重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：191-295的序列。在另一個 實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區和重鏈可變區，輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：68-87的序列，重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：296-312的序列。
在本文所述的任一實施方式中(包括以上所描述的實施方式)，本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段係單株抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段係嵌合的抗體或其抗原結合片段。在其他實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段係人源化抗體或其抗原結合片段。在又其他的實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段係全人源抗體或其抗原結合片段。該單株抗體可以是任何同種型的，例如人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在一個具體的實施方式中，該單株抗體係人IgG1抗體。在另一個具體係實施方式中，該單株抗體係人IgG2抗體。該單株抗體可以包括含有人κ恒定區的輕鏈。在一些實施方式中，該人κ恒定區包含SEQ ID NO：318或SEQ ID NO：319的序列。因此，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以包含輕鏈，該輕鏈包含在表1A中列出的融合至人κ恒定區的任何輕鏈可變區序列，該人κ恒定區包含SEQ ID NO：318或SEQ ID NO：319的序列。在其他實施方式中，該單株抗體可以包括含有人λ恒定區的輕鏈。在某些實施方式中，該人λ恒定區包含SEQ ID NO：315的序列。因此，在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以包含輕鏈，該輕鏈包含在表1A中列出的融合至人λ恒定區的任何輕鏈可變區序列，該人λ恒定區包含SEQ ID NO：315的序列。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以包含影響抗體或抗原結合片段醣苷化的一個或多個修飾。在一些實施方式中，該抗體或抗原結合片段包含一個或多個突變以減少或消除醣苷化。在這樣的實施方式中，該未醣苷化的抗體可以包含在其重鏈中胺基酸 位置N297(根據EU編號方案)處的突變，例如N297G突變。該未醣苷化的抗體可以包含另外的突變從而使抗體結構穩定。這樣的突變可以包括半胱胺酸取代對，例如A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、以及V323C和I332C(根據EU編號方案的胺基酸位置)。在一個實施方式中，該未醣苷化的抗體在其重鏈上包含R292C和V302C突變(根據EU編號方案)。在某些實施方式中，該未醣苷化的抗PAC1抗體包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含SEQ ID NO：324或SEQ ID NO：325的胺基酸序列。
本發明還包括分離的多核苷酸，和編碼本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段的表現載體，以及包含編碼多核苷酸和表現載體的宿主細胞(例如CHO細胞)。在某些實施方式中，本發明包括用於產生本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段之方法。在一個實施方式中，該方法包括在允許抗體或抗原結合片段表現的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼抗PAC1抗體或抗原結合片段的表現載體；以及從培養基或宿主細胞中回收該抗體或抗原結合片段。
本文所述的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以在用於治療或預防與PAC1生物活性相關的病情(例如頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛和血管舒張症狀)的藥物組成物或藥物的生產中使用。因此，本發明還提供了包含本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段以及藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。該藥物組成物可用於本文所述的任何方法中。
在某些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中治療或預防頭痛病況之方法，該等方法包括向該患者給予有效量的本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段。在一些實施方式中，用本發明的方法待治療或預防的頭痛病況係偏頭痛。該偏頭痛可以是發作性偏頭痛或慢性偏頭痛。 在其他實施方式中，用本發明的方法待治療或預防的頭痛病況係叢集性頭痛。在某些實施方式中，該等方法提供了針對該等病情的預防性治療。
在本發明的該等方法的一些實施方式中，該等方法包括將第二頭痛治療劑與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予患者。第二頭痛治療劑可以是急性頭痛治療劑，例如血清素受體激動劑(例如，5HT1B 、5HT1D 和/或5HT1F 血清素受體的激動劑)。在一些實施方式中，該急性頭痛治療劑係曲坦(triptan)、麥角胺(ergotamine)、非甾體抗炎藥或類鴉片物質。在其他實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的該第二頭痛治療劑係預防性頭痛治療劑(例如，抗癲癇藥、β-受體阻滯劑、抗抑鬱劑或肉毒桿菌素A(onabotulinum toxin A))。該第二頭痛治療劑可以在本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段之前、之後或同時給予患者。
在本發明的方法的某些實施方式中，該等方法包括將CGRP途徑拮抗劑與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予患者。該CGRP途徑拮抗劑可以是人CGRP受體拮抗劑，例如特異性地結合人CGRP受體的抗體。在一個實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的CGRP途徑拮抗劑係厄瑞奴單抗(erenumab)。在其他實施方式中，該CGRP途徑拮抗劑可以是CGRP配位基的拮抗劑，例如特異性地結合人α-CGRP和/或β-CGRP的抗體。在一個這樣的實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的CGRP途徑拮抗劑係瑞瑪奈珠單抗(fremanezumab)。在另一個這樣的實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的CGRP途徑拮抗劑係伽奈珠單抗(galcanezumab)。在又另一個這樣的實施方式中，與本發明的抗PAC1抗 體或抗原結合片段組合給予的CGRP途徑拮抗劑係依普奈珠單抗(eptinezumab)。
本發明還包括在有需要的患者中抑制血管舒張之方法。在一個實施方式中，該方法包括向患者給予有效量的本文所述的任何該等抗PAC1抗體或抗原結合片段。在一些實施方式中，對治療有需要的患者患有頭痛病況(例如，偏頭痛或叢集性頭痛)。在其他實施方式中，該對治療有需要的患者患有例如與更年期相關的那些血管舒張症狀(例如，熱潮紅、面部潮紅、出汗和盜汗)。
特別考慮了在本文揭露的任何方法中或根據本文揭露的任何方法用於藥物製備的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段之用途。例如，本發明包括用於在有需要的患者中治療或預防頭痛病況的方法中使用的抗PAC1抗體或抗原結合片段。該頭痛病況包括偏頭痛(例如，發作性和慢性偏頭痛)和叢集性頭痛(cluster headache)。在一些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中抑制血管舒張的方法中使用的抗PAC1抗體或抗原結合片段。在這樣的實施方式中，該患者可以被診斷為具有或患有頭痛病況。在其他實施方式中，本發明提供了用於在患有頭痛病況的患者中抑制人PAC1受體激活的方法中使用的抗PAC1抗體或抗原結合片段。該頭痛病況可以是偏頭痛(例如，發作性或慢性偏頭痛)或叢集性頭痛。
本發明還包括抗PAC1抗體或抗原結合片段在製備用於治療或預防有需要的患者的頭痛病況的藥物中之用途。該頭痛病況包括偏頭痛(例如，發作性和慢性偏頭痛)和叢集性頭痛。在某些實施方式中，本發明涵蓋抗PAC1抗體或抗原結合片段在製備用於在有需要的患者中抑制血管舒張的藥物中之用途。在這樣的實施方式中，該患者可以被診斷為具有或患有頭痛病況。在其他實施方式中，本發明包括抗PAC1抗體或抗原結合片段 在製備用於在患有頭痛病況的患者中抑制人PAC1受體激活的藥物中之用途。該頭痛病況可以是偏頭痛(例如，發作性或慢性偏頭痛)或叢集性頭痛。
[圖1A]係人PAC1胞外結構域(ECD)和29G4v9抗體的Fab片段之間的複合物的晶體結構之前視圖。VL=輕鏈可變區；CL=輕鏈恒定區；VH=重鏈可變區；並且CH1=重鏈CH1恒定區。
[圖1B]係人PAC1 ECD和29G4v9抗體的Fab片段之間的複合物的晶體結構之側視圖。該圖描繪了圖1A所示結構向左側旋轉90°。在該圖中，輕鏈可變區(VL)位於重鏈可變區(VH)的後面，並且輕鏈恒定區(CL)位於重鏈CH1恒定區的後面。
[圖2A]係人PAC1 ECD與29G4v9 Fab的輕鏈CDR1(SEQ ID NO：3的胺基酸24至34)之間介面之展開圖。區1包含人PAC1 ECD(SEQ ID NO：1)的Glu120和Asp121殘基，而區域3包含人PAC1 ECD的Phe127殘基。
[圖2B]係人PAC1 ECD與29G4v9 Fab的輕鏈CDR3中的Arg93殘基之間介面之展開圖。
[圖3A]係人PAC1 ECD與29G4v9 Fab的重鏈CDR1胺基酸Arg31和Phe32之間介面之展開圖。這兩個重鏈CDR1胺基酸位於人PAC1 ECD的Phe131殘基的任意側。
[圖3B]係包含胺基酸殘基Asn60和Ile61的人PAC1 ECD的區(相對於SEQ ID NO：1)與29G4v9 Fab的重鏈CDR2胺基酸Tyr53、Asp54和Gly56之間介面之展開圖。
[圖3C]係人PAC1 ECD與29G4v9 Fab的重鏈CDR3胺基酸Val102、Leu103和Thr104之間介面之展開圖。
[圖4]係針對來自酵母展示抗體Fab突變體文庫的改進的結合突變體的選擇方法之示意圖。
[圖5]係針對來自酵母展示文庫的高親和力結合突變體的結合解離速率驅動選擇過程之示意圖。
[圖6]顯示了抗PAC1抗體對maxadilan誘導的大鼠皮膚血流增加的抑制作用。在用10ng maxadilan(皮內注射)激發之前二十四小時，將七種抗體(420653、420845、420943、421873、420889(PL-50347)、421091(PL-50350)和421051(PL-50351))中的一種按0.1mg/kg或0.3mg/kg的劑量經靜脈內給予大鼠。用雷射都卜勒成像進行maxadilan激發30分鐘後評估皮膚血流。用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，隨後用鄧奈特多重比較檢驗(Dunnett's MCT)與媒介物組相比較，*p<0.05，**p<0.01。
[圖7A]顯示了抗PAC1抗體420653對maxadilan誘導的大鼠皮膚血流的劑量依賴性效應。在用10ng maxadilan(皮內注射)激發之前二十四小時，將抗體按從0.01mg/kg至3mg/kg範圍的七種劑量之一經靜脈內給予大鼠。用雷射都卜勒成像進行maxadilan激發30分鐘後評估皮膚血流。用單因素方差分析，隨後用鄧奈特多重比較檢驗與媒介物組相比較，*p<0.05，****p<0.0001。
[圖7B]顯示了抗PAC1抗體420845對maxadilan誘導的大鼠皮膚血流的劑量依賴性效應。在用10ng maxadilan(皮內注射)激發之前二十四小時，將抗體按從0.01mg/kg至3mg/kg範圍的五種劑量之一經靜脈內給予大鼠。用雷射都卜勒成像進行maxadilan激發30分鐘後評估皮膚血流。用單因 素方差分析，隨後用鄧奈特多重比較檢驗與媒介物組相比較，****p<0.0001。
[圖7C]顯示在大鼠中抗PAC1抗體的420943對maxadilan誘導的皮膚血流增加的劑量依賴性效應。在用10ng maxadilan(皮內注射)激發之前二十四小時，將抗體按從0.1mg/kg至30mg/kg範圍的六種劑量之一經靜脈內給予大鼠。用雷射都卜勒成像進行maxadilan激發30分鐘後評估皮膚血流。用單因素方差分析，隨後用鄧奈特多重比較檢驗與媒介物組相比較，****p<0.0001。
[圖7D]顯示在大鼠中抗PAC1抗體的421873對maxadilan誘導的皮膚血流增加的劑量依賴性效應。在用10ng maxadilan(皮內注射)激發之前二十四小時，將抗體按從0.3mg/kg至30mg/kg範圍的五種劑量之一經靜脈內給予大鼠。用雷射都卜勒成像進行maxadilan激發30分鐘後評估皮膚血流。用單因素方差分析，隨後用鄧奈特多重比較檢驗與媒介物組相比較，*p<0.05，****p<0.0001。
[圖8A]係在大鼠中單劑量靜脈內給予1mg/kg後，抗PAC1抗體420653、420845、420943和421873之血清濃度-時間曲線。
[圖8B]係在大鼠中單劑量靜脈內給予5mg/kg後，抗PAC1抗體420653、420845、420943和421873之血清濃度-時間曲線。
[圖8C]係在大鼠中單劑量靜脈內給予25mg/kg後，抗PAC1抗體420653、420845、420943和421873之血清濃度-時間曲線。
[圖9]係在食蟹猴中單劑量靜脈內給予10mg/kg後，抗PAC1抗體420653、420845、420943、421873和29G4v22之血清濃度-時間曲線。
[圖10A和10B]顯示抗PAC1抗體420653和29G4v22對maxadilan誘導的食蟹猴中皮膚血流增加的抑制效果的時程。在第0天，按0.1mg/kg或3 mg/kg的抗體420653或按10mg/kg的抗體29G4v22以單次靜脈內推注注射給予24隻食蟹猴。在給予抗體後第2、4、7、10、14、21、28和36天，測量給予maxadilan後的反應。在每種情況下，在1ng maxadilan皮內注射後，藉由雷射都卜勒成像30分鐘測量皮膚血流所有的數據被表示為平均值±平均值的標準差。圖10A 顯示在抗體處理後指定的天數由皮內注射maxadilan誘導的皮膚血流中%自基線的變化。藉由單因素方差分析，之後使用鄧奈特多重比較檢驗，在相同的處理中與第0天相比，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。除第36天外，每組8隻動物，其中用3mg/kg的抗體420653測試4隻動物，如^符號所示。圖10B 顯示抗體處理對maxadilan誘導的皮膚血流的增加的抑制效果(表示為%抑制)。藉由雙尾未配對t檢驗，在每個時間點進行3mg/kg的抗體420653與10mg/kg的抗體29G4v22之間的#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001比較。
本發明涉及分離的抗體和其抗原結合片段，該抗體和其抗原結合片段特異性地結合垂體腺苷酸環化酶激活多肽I型受體(PAC1)，特別是人PAC1。與先前所描述的抗PAC1拮抗劑抗體相比，本發明的該等抗體對人PAC1具有增強的抑制效力。本發明的抗體還與大鼠PAC1受體和食蟹猴PAC1受體交叉反應，從而允許對該等物種中的抗體進行臨床先質內評估。
人PAC1係由染色體7上的ADCYAP1R1 基因編碼的468胺基酸蛋白質(NCBI參考序列NP_001109.2)。人PAC1受體係與腺苷酸環化酶正偶聯的G蛋白偶聯受體。由其內源性配位基(例如，PACAP38或PACAP27)引起的人PAC1受體的激活導致胞內環AMP(環腺苷酸，cAMP)的增加。人PAC1的胺基酸序列提供為如下SEQ ID NO：1。
Figure 108101085-A0202-12-0015-1
人PAC1蛋白質的胺基酸1至23(SEQ ID NO：1)構成訊息肽，該訊息肽通常從成熟蛋白質中去除。成熟人PAC1蛋白具有G蛋白偶聯受體的基本結構，該受體由七個跨膜結構域，由一個N末端區和三個胞外環組成的一個胞外結構域，三個胞內環和C末端細胞質結構域構成。N末端胞外結構域大約在SEQ ID NO：1的胺基酸24-153處，並且七個跨膜結構域中的第一個在SEQ ID NO：1的胺基酸154處開始。C末端細胞質結構域大約位於SEQ ID NO：1的胺基酸397-468處。參見Blechman和Levkowitz,Front.Endocrinol.[內分泌學前沿]，第4卷(55)：1-19,2013針對胺基酸序列內結構域的位置。術語“人PAC1”、“人PAC1受體”、“hPAC1”和“hPAC1受體”可互換地使用，並且可以指SEQ ID NO：1的多肽、SEQ ID NO：1的多肽減去訊息肽(胺基酸1至23)、人PAC1的等位基因變體、或人PAC1的剪接變體。
本發明提供了特異性地結合人PAC1的抗體。“抗體”係包含特異性結合抗原的抗原結合片段的蛋白質，以及允許抗原結合片段採用促進抗體與抗原結合的構象的支架或框架部分。如本文使用的，術語“抗體”通常是指包含兩個輕鏈多肽(每個約25kDa)和兩個重鏈多肽(每個約50-70 kDa)的四聚免疫球蛋白蛋白質。術語“輕鏈”或“免疫球蛋白輕鏈”係指從胺基端至羧基端包含單個免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)和單個免疫球蛋白輕鏈恒定結構區(CL)的多肽。該免疫球蛋白輕鏈恒定結構區(CL)可以是人kappa(κ)或人lambda(λ)恒定結構區。術語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”係指從胺基端至羧基端包含以下的多肽：單個免疫球蛋白重鏈可變區(VH)、免疫球蛋白重鏈恒定結構區1(CH1)、免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白重鏈恒定結構區2(CH2)、免疫球蛋白重鏈恒定結構區3(CH3)、和視需要免疫球蛋白重鏈恒定結構區4(CH4)。重鏈被分類為mu(μ)、delta(△)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，並且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。該等IgG類和IgA類抗體分別被進一步分成亞類，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗體中的該等重鏈具有三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3)然而IgM和IgE抗體中的該等重鏈具有四個恒定結構域(CH1、CH2、CH3和CH4)。該等免疫球蛋白重鏈恒定結構區可以來自任何免疫球蛋白同種型(包括亞型)。抗體鏈藉由CL結構域和CH1結構域之間(即，輕鏈和重鏈之間)和兩個抗體重鏈的鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起。
本發明還包括本文所描述的該等抗PAC1抗體的抗原結合片段。本文中與“結合片段”或“片段”可互換使用的“抗原結合片段”係缺少至少一些全長重鏈和/或輕鏈中存在的胺基酸的抗體的一部分，但它仍然能夠特異性結合抗原。抗原結合片段包含但不限於單鏈可變區片段(scFv)、奈米抗體(例如，駱駝科動物重鏈抗體的VH結構域；VHH片段，參見Cortez-Retamozo等人，Cancer Research[癌症研究]，第64卷：2853-57,2004)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fv片段、Fd片段、和互補決定區(CDR) 片段，並且可以來源於任何哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、兔、或駱駝科動物)來源。抗原結合片段可以競爭靶抗原與完整抗體的結合，並且片段可以藉由修飾完整抗體(例如酶促或化學切割)或使用重組DNA技術或肽合成從頭合成來產生。在一些實施方式中，該抗原結合片段包含來自抗體的與抗原結合的至少一個CDR，例如來自抗體的與抗原結合的重鏈CDR3。在其他實施方式中，抗原結合片段包含來自結合抗原的抗體重鏈的所有三個CDR，或來自結合抗原的抗體輕鏈的所有三個CDR。抗原結合片段包含來自結合抗原(三個來自重鏈，並且三個來自輕鏈)的抗體的所有六個CDR。
術語“分離的分子”(其中分子係例如多肽、多核苷酸、抗體或抗原結合片段)係由於其來源或衍生源的以下分子：(1)與其天然狀態下伴隨的自然相關組件無關，(2)基本上不含來自相同物種的其他分子，(3)由來自不同物種的細胞表現，或(4)在自然界中不存在。因此，化學合成的或在與其天然來源的細胞不同的細胞系統中表現的分子將與其天然相關的組分“分離”。使用本領域熟知的純化技術藉由分離還可以使分子基本上不含天然相關的組分。可以藉由本領域熟知的許多方法測定分子純度或均勻性。例如，可以使用本領域熟知的技術，使用聚丙烯醯胺凝膠電泳和凝膠染色使多肽視覺化來測定多肽樣品的純度。出於某些目的，可以藉由使用HPLC或本領域熟知的其他方法進行純化來提供更高的解析度。
在本發明的某些實施方式中，該等抗體或其抗原結合片段特異性地結合人PAC1。當抗體或其抗原結合片段在相似的結合測定條件下，與其他無關蛋白的親和力相比具有顯著更高的結合親和力並因此能夠區分該抗原時，該抗體或其抗原結合片段“特異性地結合”靶抗原。特異性地結合抗原的抗體或抗原結合片段可以具有平衡解離常數(KD )
Figure 108101085-A0202-12-0017-76
1 x 10-6 M。當 KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-77
1 x 10-8 M時，抗體或結合片段以“高親和力”與抗原特異性地結合。在一個實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-78
5 x 10-9 M。在另一個實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-79
1 x 10-9 M。在又另一個實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-80
5 x 10-10 M。在另一個實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-81
1 x 10-10 M。在某些實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-82
5 x 10-11 M。在其他實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-83
1 x 10-11 M。在一個具體的實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-84
5 x 10-12 M。在另一個具體係實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段與人PAC1結合，其中KD
Figure 108101085-A0202-12-0018-85
1 x 10-12 M。
使用各種技術測定親和力，該等技術的一個實例係親和力ELISA測定。在各種實施方式中，藉由表面電漿共振測定(例如，基於BIAcore®的測定)來確定親和力。使用該方法學，可以測量結合速率常數(以M-1 s-1 表示ka )和解離速率常數(以s-1 表示kd )。然後可以由動力學速率常數(kd /ka )的比率計算平衡解離常數(以M表示的KD )。在一些實施方式中，藉由動力學方法測定親和力，例如在Rathanaswami等人.Analytical Biochemistry[分析生物化學]，第373卷：52-60,2008中描述的動力學排除測定(KinExA)。使用KinExA測定，可以測量平衡解離常數(以M表示的KD )和結合速率常數(以M-1 s-1 表示的ka )。可以由該等值(KD x ka )計算解離速率常數(以s-1 表示kd )。在其他實施方式中，藉由生物層干涉法測定親和力，例如在Kumaraswamy等人，Methods Mol.Biol.[分子生物學方法]，第1278卷：165-82,2015中的描述，並用於Octet® 系統(頗爾福特生物有限公司(Pall ForteBio))。可以使用生物層干涉法按即時計算動力學(ka 和kd )和親和力(KD )常數。在一些實施方式中，本文所述的該等抗體或結合片段展示出所希望的特徵，例如由人PAC1的kd (解離速率常數)測量的結合親合力為約10-2 、10-3 、10-4 、10-5 、10-6 、10-7 、10-8 、10-9 、10-10 s-1 或更低(值越低表明結合親合力越高)，和/或如由人PAC1的KD (平衡解離常數)測量的結合親和力為約10-8 、10-9 、10-10 、10-11 、10-12 M或更低(值越低表明結合親和力越高)。
較佳的是，本發明的該等抗體或結合片段未顯著地與促胰液素/胰高血糖素受體家族的其他成員結合或與其交叉反應，該等成員係例如人VPAC1受體(NCBI參考序列NP_004615.2)和人VPAC2受體(NCBI參考序列NP_003373.2)。如本文所用，在相似的結合測定條件下，當抗體或結合片段對抗原具有與其對其他無關蛋白的親和力相當的結合親和力時，該抗體或結合片段與靶抗原“不顯著結合”。不顯著結合靶抗原的抗體或結合片段還可包括那些在親和力測定中不產生與陰性對照相比統計學上不同訊號的蛋白質，例如本文描述針對靶抗原的那些抗體或結合片段。舉例來說，抗體在基於ELISA或基於BIAcore®的測定中產生訊號值，用於測定與人VPAC1的結合，該訊號值與用陰性對照(例如，不含抗體的緩衝溶液)產生的訊號值沒有統計學差異被認為不與人VPAC1顯著地結合。不與抗原顯著結合的抗體或結合片段對抗原可以具有平衡解離常數(KD )高於1 x 10-6 M、高於1 x 10-5 M、高於1 x 10-4 M、或高於1 x 10-3 M。因此，在某些實施方式中，相對於人VPAC1和人VPAC2，本發明的該等抗體和結合片段選擇性地與人PAC1結合。換言之，本發明的該等抗體和結合片段不顯著地與人VPAC1或人VPAC2結合。
本發明的該等抗體和抗原結合片段可以抑制、干擾或調節人PAC1受體的一種或多種生物活性。人PAC1受體的生物活性包括但不限於，誘導PACAP介導的受體訊號轉導途徑、誘導血管舒張、和抑制血管收縮。在一些實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段抑制PACAP(例如，PACAP38或PACAP27)與人PAC1受體的結合。例如藉由測量體外競爭性結合測定中的結合，當過量的抗體或結合片段減少與PACAP結合的人PAC1受體的量時，會發生“結合抑制”，反之亦然，例如，減少至少約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約99%或更多。抑制常數(Ki)指示本發明的該等抗體或抗原結合片段在預防PACAP與人PAC1受體結合方面的效力，可以從這種競爭性結合測定中計算。舉例來說，將放射性同位素(例如，125 I)附接至受體配位基(例如，PACAP38)，並且該測定法測量在增加濃度的抗PAC1抗體或其結合片段中放射性標記的配位基與人PAC1受體的結合。使用等式Ki=IC50/(1+([L]/Kd))可以計算Ki值，其中[L]係使用的放射性配位基的濃度(例如，125 I標記的PACAP38)，並且Kd係放射性配位基的解離常數。參見，例如Keen M,MacDermot J(1993)Analysis of receptors by radioligand binding[由放射性配位基結合分析受體].在：Wharton J,Polak JM(編輯)Receptor autoradiography,principles and practice[受體放射自顯影的原理和實踐].牛津大學出版社，牛津(Oxford University Press,Oxford)中。拮抗劑的Ki值越低，拮抗劑越有效。在一些實施方式中，本發明的該等抗體或其抗原結合片段競爭結合具有放射性標記的PACAP配位基的人PAC1受體，其中Ki
Figure 108101085-A0202-12-0020-86
1nM。在其他實施方式中，本發明的該等抗體或其抗原結合片段競爭結合具有放射性標記的PACAP配位基的人PAC1受體，其中Ki
Figure 108101085-A0202-12-0020-87
500pM。在又其他的實施方式中，本發明的該等抗體或其抗原結合片段競爭結合具有 放射性標記的PACAP配位基的人PAC1受體，其中Ki
Figure 108101085-A0202-12-0021-88
200pM。在某些其他的實施方式中，本發明的該等抗體或其抗原結合片段競爭結合具有放射性標記的PACAP配位基的人PAC1受體，其中Ki
Figure 108101085-A0202-12-0021-89
100pM。
在某些實施方式中，本發明的該等抗體和抗原結合片段抑制配位基誘導的人PAC1受體的激活。該配位基可以是受體的內源性配位基，例如PACAP38或PACAP27，或該配位基可以是受體的另一種已知的激動劑，例如maxadilan。Maxadilan係65個胺基酸的肽，最初從沙蠅中分離出來，與VPAC1或VPAC2相比，對PAC1具有極佳的選擇性，並因此可用作PAC1選擇性激動劑(Lerner等人，J Biol Chem.[生物化學雜誌]，第266卷(17)：11234-11236,1991；Lerner等人，Peptides[肽]，第28卷(9)：1651-1654,2007)。用於評估PAC1受體激活的各種測定法係本領域已知的，包括測量配位基誘導的鈣動員和cAMP產生的基於細胞的測定法。示例性基於細胞的cAMP測定描述於實例3中。其它適合的PAC1受體激活測定描述於Dickson等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.[紐約科學院年報]，第1070卷：239-42,2006；Bourgault等人，J.Med.Chem.[醫藥化學雜誌]，第52卷：3308-3316,2009；以及美國專利申請案號2011/0229423中，其全部均藉由引用以其全部內容併入本文。
該等抗體或抗原結合片段對PAC1受體激活的抑制性活性可以藉由計算受體的任何功能測定中IC50來定量，例如以上描述的那些。“IC50”係實現50%生物學或生物化學功能抑制所需的劑量/濃度。對於放射性配位基，IC50係競爭配位基的濃度，該競爭配位基取代放射性配位基的50%的特異性結合。任何特定物質或拮抗劑的IC50可以藉由構建劑量-反應曲線並檢查不同濃度的藥物或拮抗劑對特定功能測定中逆轉激動劑活性的影響來確定。藉由測定抑制激動劑的最大生物反應的一半所需的濃度，可以計算 給定拮抗劑或藥物的IC50值。因此，在任何功能測定(例如在實例中描述的cAMP測定)激活人PAC1受體中，本發明的任何抗PAC1抗體或其結合片段的IC50值可以藉由測定抑制配位基(例如，PACAP27、PACAP38或maxadilan)的最大生物反應的一半所需的抗體或結合片段的濃度來測定。抑制配位基誘導的(例如，PACAP誘導的)PAC1受體的激活的抗PAC1抗體或其結合片段被理解為係PAC1受體的中和或拮抗劑抗體或結合片段。
在某些實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的(PACAP38誘導的或PACAP27誘導的)人PAC1受體的激活。例如，該等抗體或抗原結合片段可以抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的鈣動員測定或cAMP測定測量的IC50小於約10nM、小於約8nM、小於約5nM、小於約3nM、小於約1nM、小於約800pM、小於約500pM、小於約400pM、小於約300pM、小於約200pM、或小於約100pM。在一個具體的實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約5nM。在另一個具體的實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約1nM。在仍另一個具體的實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約500pM。在另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約300pM。在一些實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約0.1nM和約1nM之間。在其他實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段 抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約50pM和約500pM之間。
在一些實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段結合並抑制來自其他物種的PAC1受體。例如，該等抗體或抗原結合片段結合並抑制食蟹猴PAC1受體(NCBI參考序列XP_015303041.1)。在這樣的實施方式中，該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的鈣動員測定或cAMP測定測量的IC50小於約10nM、小於約8nM、小於約5nM、小於約3nM、小於約1nM、小於約800pM、小於約500pM、小於約400pM、小於約300pM、小於約200pM、或小於約100pM。在一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約1nM。在另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約500pM。在又另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約0.1nM和約1nM之間。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的食蟹猴PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約50pM和約500pM之間。
在某些實施方式中，該等抗體或抗原結合片段結合並抑制大鼠PAC1受體(NCBI參考序列NP_598195.1)。在該等實施方式中，該等抗體或抗原結合片段可以抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的鈣動員測定或cAMP測定測量的IC50小於約10nM、小於約8nM、小於約5nM、小於約3nM、小於約1nM、小於約800pM、小於約500 pM、小於約400pM、小於約300pM、小於約200pM、或小於約100pM。在一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約10nM。在另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約5nM。在又另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約500pM。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於約300pM。在一些實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約0.1nM和約10nM之間。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1受體的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50在約100pM和約2nM之間。在一些實施方式中，其中本發明的該等抗體或結合片段與來自其他物種的PAC1受體交叉反應，該等抗體或結合片段可以用當的效力抑制PACAP誘導的PAC1受體的激活。例如，本發明的抗體或結合片段可以抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，其中IC50類似於抗體或結合片段抑制PACAP誘導的食蟹猴或大鼠PAC1受體的激活的IC50。與本發明的該等抗體或結合片段的其他種類的PAC1受體的交叉反應性可以是有利的，因為可以在另外的臨床前動物模型中評估該等抗體或結合片段的治療功效。
通常，本發明的該等抗體或抗原結合片段不顯著地抑制配位基誘導的人VPAC1受體或VPAC2受體的激活(例如，PACAP38、PACAP27或 VIP誘導的)。如本文使用的，在抗體或抗原結合片段存在或缺失的情況下，如果配位基誘導的受體激活或配位基與受體的結合之間不存在統計學差異，抗體或抗原結合片段將“不顯著地抑制”受體的激活或配位基與其受體的結合。例如，如果在抗體或結合片段的存在下，由表現人VPAC1受體的細胞中PACAP或VIP誘導的cAMP的產生的量與在抗體或結合片段缺失的情況下產生的量顯著不同，那麼該抗體或結合片段將被認為不顯著地抑制PACAP/VIP誘導的人VPAC1受體的激活。類似地，如果在過量的抗體或結合片段的存在下與人VPAC1受體結合的PACAP或VIP的量與在抗體或結合片段缺失的情況下與受體結合的PACAP或VIP的量顯著不同，那麼該抗體或結合片段將被認為不顯著地抑制PACAP或VIP與人VPAC1受體的結合。在某些實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段抑制PACAP誘導的人PAC1受體的激活，但不顯著地抑制PACAP誘導的人VPAC1受體或人VPAC2受體的激活。因此，相對於人VPAC1受體和人VPAC2受體，本發明的該等抗體和結合片段選擇性地抑制人PAC1受體。
在一些實施方式中，本發明的該等抗體和結合片段可與人PAC1的特定區或表位結合。如本文使用的，“表位”係指能夠被抗體或其片段特異性結合的任何決定簇。表位係抗原的區域，該表位與靶向該抗原的抗體或結合片段結合或相互作用，並且當該抗原係蛋白質時，包括與抗體或結合片段直接接觸或相互作用的特定胺基酸。表位可以由連續胺基酸形成，或者由蛋白質的三級折疊並列的非連續胺基酸形成。“線性表位”係其中胺基酸一級序列包含識別表位的表位。在單一序列中線性表位典型地包括至少3個或4個胺基酸，並更通常至少5個、至少6個、或至少7個胺基酸，例如，約8個至約10個胺基酸。與線性表位相反，“構象(conformational)表位”係一組不連續的胺基酸(例如，在多肽中，係在多肽的一級序列中 不連續的胺基酸殘基，但是在多肽的第三和第四結構的背景下，彼此足夠接近以被抗體或其結合片段結合)。表位決定簇可以包括化學活性表面分子群，如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基基團，並且可以具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。通常，對特定靶分子特異的抗體或結合片段將優先識別蛋白質和/或大分子的複雜混合物中靶分子上的表位。
在某些實施方式中，本發明的該等抗體或抗原結合片段與在人PAC1(SEQ ID NO：4)的N末端胞外結構域(ECD)內的表位處的人PAC1結合。在相關的實施方式中，該等抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO：1的胺基酸24-153內的表位處的人PAC1結合。在其他相關的實施方式中，該等抗體或抗原結合片段與SEQ ID NO：1的胺基酸50-140內的表位處的人PAC1結合。如實例1中所述，人PAC1 N末端ECD和抗PAC1中和抗體的Fab區的複合物的晶體結構揭示了人PAC1 ECD內的關鍵胺基酸，該等胺基酸包含與抗PAC1 Fab的結合介面。該等核心介面胺基酸，所有該等胺基酸在Fab中在離非氫原子5Å或更小的距離處包含至少一個非氫原子，包括Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135(相對於SEQ ID NO：1的胺基酸位置號)。因此，在一些實施方式中，本發明的該等抗體或結合片段在表位處與人PAC1結合，該表位包含選自以下的一個或多個胺基酸：SEQ ID NO：1的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Glu120、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132、和Gly135。在其他實施方式中，該等抗體或結合片段在表位處與人PAC1結合，該表位至少包含SEQ ID NO：1的胺基酸Asn60、Ile61、Glu120、和Asp121。在又其他的實施方式中，該等抗體或結合片段在表位處與人PAC1結合，該表位 至少包含胺基酸SEQ ID NO：1的Asn60、Ile61、Glu120、Asp121、Phe127和Phe131。在某些其他的實施方式中，該等抗體或結合片段在表位處與人PAC1結合，該表位包含選自以下的所有胺基酸：SEQ ID NO：1的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Glu120、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。
實例1中描述的人PAC1 ECD-Fab複合物的晶體結構還揭示了Fab的重鏈和輕鏈的CDR中與人PAC1 ECD中的胺基酸相互作用的重要殘基，從而鑒定了抗體的互補位中的關鍵胺基酸。“互補位”係識別並結合靶抗原的抗體區。互補位殘基包括輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)中的Gln27、Gly30、Arg31和Ser32以及重鏈可變區(SEQ ID NO：2)中的Arg31、Phe32、Tyr53、Asp54、Gly56。互補位中若干個該等殘基的特定突變被設計為改善與人PAC1 ECD中核心介面殘基(即表位中的殘基)的相互作用，與親本抗體相比導致結合親和力和抑制效力增強(參見實例1-3)。SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：52的輕鏈可變區中的Gln27、Gly30、Arg31和Ser32分別對應於AHo編號中的胺基酸位置29、32、39和40，並且SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：191的重鏈可變區中的Arg31、Phe32、Tyr53、Asp54、Gly56分別對應於AHo編號中的胺基酸位置33、39、60、61和66。AHo編號方案係基於結構的編號方案，該方案在CDR區中引入空位使得與經比對的結構域的平均結構的偏差最小化(Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]309(3)：657-670；2001)。在AHo編號方案中，不同抗體中結構相當的位置將具有相同的殘基號。
在一些實施方式中，本發明提供了與人PAC1(SEQ ID NO：1)特異性地結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包 含：(i)輕鏈可變區，其中根據AHo編號在位置29處的胺基酸係與人PAC1的胺基酸Glu120或Asp121相互作用的鹼性胺基酸，和(ii)重鏈可變區，其中根據AHo編號在位置61處的胺基酸係與人PAC1的胺基酸Asn60或Ile61相互作用的疏水、鹼性或中性親水胺基酸。如本文使用的，當一個胺基酸中的一個或多個原子與其他胺基酸中的一個或多個原子藉由例如，凡得瓦氏力、疏水或靜電力形成非共價鍵時，一個胺基酸被稱為與另一個胺基酸相互作用。鹼性胺基酸包括精胺酸、賴胺酸和組胺酸，然而中性親水胺基酸包括天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸和蘇胺酸。疏水胺基酸包括苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸和纈胺酸。在某些實施方式中，在輕鏈可變區中根據AHo編號在位置29處的胺基酸係賴胺酸或精胺酸。在一個具體的實施方式中，在輕鏈可變區中根據AHo編號在位置29處的胺基酸係賴胺酸。在相關的實施方式中，在重鏈可變區中根據AHo編號在位置61處的胺基酸係異亮胺酸、亮胺酸、纈胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸。在一個實施方式中，在重鏈可變區中根據AHo編號在位置61處的胺基酸係異亮胺酸。在另一個實施方式中，在重鏈可變區中根據AHo編號在位置61處的胺基酸係穀胺醯胺或天冬醯胺。在又另一個實施方式中，在重鏈可變區中根據AHo編號在位置61處的胺基酸係精胺酸。
在一些實施方式中，在抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區中根據AHo編號在位置66處的胺基酸係鹼性或中性親水胺基酸，該胺基酸與人PAC1(SEQ ID NO：1)的胺基酸Asn60或Ile61相互作用。在重鏈可變區中根據AHo編號在位置66處的胺基酸可以是穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸。在一個實施方式中，在重鏈可變區中根據AHo編號在位置66處的胺基酸係精胺酸。在另一個實施方式中，在重鏈可變區中根據AHo編號在位置66處的胺基酸係天冬醯胺。
發現以上描述的互補位-表位相互作用與抑制效力的改進相關，其中IC50值在皮莫耳範圍內。參見實例3。因此，具有根據AHo編號在輕鏈可變區中位置29處和重鏈可變區中位置61和/或66處的以上指定的胺基酸並且與人PAC1受體中的特定殘基(SEQ ID NO：1的Glu120、Asp121、Asn60、和/或Ile61)相互作用的抗體或其抗原結合片段將被期望具有改進的抑制效力，例如，抑制PACAP誘導的人PAC1的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於500pM。在一些實施方式中，這樣的抗體或抗原結合片段可以抑制PACAP誘導的人PAC1的激活，其中如藉由基於細胞的cAMP測定測量的IC50小於300pM。在該等和其他實施方式中，該等抗體或其抗原結合片段可以具有：包含與SEQ ID NO：52的序列具有至少90%同一性的序列的輕鏈可變區以及包含與SEQ ID NO：191的序列具有至少90%同一性的序列的重鏈可變區。
本發明的該等抗體或抗原結合片段可以包含來自特異性地結合如本文所述的人PAC1的抗體的輕鏈和重鏈可變區的一個或多個互補決定區(CDR)。術語“CDR”係指抗體可變序列內的互補決定區(還稱為“最小識別單位”或“超變區”)。存在三個重鏈可變區CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三個輕鏈可變區CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。如本文使用的，術語“CDR區”係指在單個可變區(即，三個輕鏈CDR或三個重鏈CDR)中出現的三個CDR的組。兩條鏈的每條鏈中的CDR典型地藉由框架區(FR)對齊以形成與靶蛋白(例如，人PAC1)上的特定表位或結構域特異性結合的結構。從N-末端至C-末端，天然存在的輕鏈和重鏈可變區二者典型地與以下該等元件的順序一致：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已經設計了一種編號系統，用於將數字分配給胺基酸，該胺基酸佔據該等結構域的每一個中的位置。在免疫學目的蛋白的Kabat序列中 (1987和1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol. [分子生物學雜誌]196：901-917；Chothia等人，1989,Nature[自然]342：878-883中定義該編號系統。使用該系統可以鑒定給定抗體的互補決定區(CDR)和框架區(FR)。免疫球蛋白鏈中胺基酸的其他編號系統包括IMGT® (international ImMunoGeneTics information system[國際免疫遺傳學資訊系統]；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.[發育與比較免疫學]29：185-203；2005)和AHo(Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]309(3)：657-670；2001)。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的至少一個輕鏈可變區以及來自本文所描述的該等抗PAC1抗體中任一者的包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的至少一個重鏈可變區。輕鏈和重鏈可變區以及示例性人抗PAC1抗體的相關的CDR分別列出在以下表1A和1B中。
Figure 108101085-A0202-12-0030-2
Figure 108101085-A0202-12-0031-3
Figure 108101085-A0202-12-0032-4
Figure 108101085-A0202-12-0033-5
Figure 108101085-A0202-12-0034-6
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Figure 108101085-A0202-12-0038-10
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Figure 108101085-A0202-12-0040-12
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Figure 108101085-A0202-12-0042-14
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Figure 108101085-A0202-12-0059-32
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本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以包含分別顯示在表1A和1B中的一個或多個輕鏈CDR(即，CDRL)和/或重鏈CDR(即，CDRH)。在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體或其結合片段衍生自抗體29G4v9、29G4v10或29G4v22(即，具有29G4v9、29G4v10或29G4v22抗體的一個或多個CDRL和/或CDRH中的一個或多個取代)。例如，在某些實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含一個或多個輕鏈CDR，該輕鏈CDR選自以下：(i)選自SEQ ID NO：5至16的CDRL1，(ii)SEQ ID NO：26的CDRL2，和(iii)選自SEQ ID NO：36至38的CDRL3，和(iv)包含一個或多個，例如一個、兩個、三個、四個或更多個胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)，不超過五個、四個、三個、兩個、或一個胺基酸的缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。在該等和其他實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含一個或多個重鏈CDR，該重鏈CDR選自：(i)選自SEQ ID NO：88至96的CDRH1,(ii)選自SEQ ID NO：106至166的CDRH2，和(iii) 選自SEQ ID NO：171至177的CDRH3，和(iv)包含一個或多個，例如一個、兩個、三個、四個或更多個胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)，不超過五個、四個、三個、兩個、或一個胺基酸的缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH。
在其他實施方式中，抗PAC1抗體或其結合片段衍生自抗體19H8(即，具有在19H8抗體的一個或多個CDRL和/或CDRH中的一個或多個取代)。在這樣的實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含一個或多個輕鏈CDR，該CDRH選自(i)選自SEQ ID NO：17至25的CDRL1，(ii)選自SEQ ID NO：27至35的CDRL2，和(iii)選自SEQ ID NO：39至51的CDRL3，和(iv)包含一個或多個，例如一個、兩個、三個、四個或更多個胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)，不超過五個、四個、三個、兩個、或一個胺基酸的缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。在該等和其他實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含一個或多個重鏈CDR，該重鏈CDR選自：(i)選自SEQ ID NO：97至105的CDRH1,(ii)選自SEQ ID NO：167至170的CDRH2，和(iii)選自SEQ ID NO：178至190的CDRH3，和(iv)包含一個或多個，例如一個、兩個、三個、四個或更多個胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)，不超過五個、四個、三個、兩個、或一個胺基酸的缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH。
在某些實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以包含表1A和1B中列出的CDR的1、2、3、4、5、或6種變體形式，每種形式與表1A和1B中列出的CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性。在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包括表1A和1B中列出的CDR的1、2、3、4、5、或6種，每種與在該等表中列出的CDR相差不超過1、2、3、4或5個胺基酸。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1 抗體或抗原結合片段包含：包含選自SEQ ID NO：5至16的序列的CDRL1或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含SEQ ID NO：26的序列的CDRL2或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：36至38的序列的CDRL3或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：88至96的序列的CDRH1或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：106至166的序列的CDRH2或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；以及包含選自SEQ ID NO：171至177的序列的CDRH3或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：CDRL1，其包含選自SEQ ID NO：5至16的序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO：26的序列；CDRL3，其包含選自SEQ ID NO：36至38的序列；CDRH1，其包含選自SEQ ID NO：88至96的序列；CDRH2，其包含選自SEQ ID NO：106至166的序列；和CDRH3，其包含選自SEQ ID NO：171至177的序列。
在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含選自SEQ ID NO：17至25的序列的CDRL1或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：27至35的序列的CDRL2或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：39至51的序列的CDRL3或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：97至105的序列的CDRH1或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；包含選自SEQ ID NO：167至170的序列的CDRH2或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體；以及包含選自SEQ ID NO：178至190的序列的CDRH3或其具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代的變體。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體 或抗原結合片段包含：CDRL1，其包含選自SEQ ID NO：17至25的序列；CDRL2，其包含選自SEQ ID NO：27至35的序列；CDRL3，其包含選自SEQ ID NO：39至51的序列；CDRH1，其包含選自SEQ ID NO：97至105的序列；CDRH2，其包含選自SEQ ID NO：167至170的序列；和CDRH3，其包含選自SEQ ID NO：178至190的序列。
在具體係實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：12、26和36的序列；或(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：13、26和36的序列。
在其他具體的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中：(a)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和171的序列；(b)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、116和171的序列；(c)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、134和171的序列；(d)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：92、145和174的序列；(e)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和172的序列；(f)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、128和172的序列；(g)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、153和171的序列；(i)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、154和171的序列；或(j)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、155和171的序列。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和171的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、116和171的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、134和171的序列；(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：92、145和174的序列；(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和172的序列；(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、128和172的序列；(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、134和171的序列；(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：12、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、153和171的序列；(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：12、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、154和171的序列；或(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：13、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、155和171的序列。
在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和171的序列。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、116和171的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、134和171的序列。在仍另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：92、145和174的序列。在一個具體的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和172的序列。在另一個具體的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區和包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有 SEQ ID NO：12、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、153和171的序列。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：25、31和42的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：20、30和44的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、33和42的序列；(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：23、31和50的序列；(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、31和44的序列；(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、27和39的序列；(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：18、31和46的序列；(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、28和40的序列；(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：18、30和43的序列；或(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：22、28和49的序列。
在某些其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中：(a)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和190的序列；(b)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：100、168和182的序列；(c)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：99、168和187的序列；(d)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：97、167和178的序列；(e)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和189的序列；(f)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和179的序列；或(g)CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：102、169和182的序列。
在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：25、31和42的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和190的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：20、30和44的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：100、168和182的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、33和42的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：99、168和187的序列；(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：23、31和50的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：97、167和178的序列；(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、31和44的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和189的序列；(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、27和39的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：100、168和182的序列；(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：18、31和46的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和179的序列；(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、28和40的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和179的序列；(i)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：18、30和43的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：100、168和182的序列；或(j)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：22、28和49的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：102、169和182的序列。
在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：25、31和42的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和190的序列。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：20、30和44的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：100、168和182的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、33和42的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：99、168和187的序列。在仍另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：23、31和50的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：97、167和178的序列。在一個具體的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：17、31和44的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：98、168和189的序列。在另一個具體的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區和包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3 分別具有SEQ ID NO：17、27和39的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：100、168和182的序列。
在某些實施方式中，本發明的該等抗體和抗原結合片段包含來自特異性地結合人PAC1的抗體(例如本文所述的該等抗體)的免疫球蛋白重鏈可變區(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)。在本文中“可變區”與“可變結構域”(輕鏈的可變區(VL)，重鏈的可變區(VH))可互換地使用，係指每個輕和重免疫球蛋白鏈中的區域，該輕和重免疫球蛋白鏈直接參與抗體與抗原的結合。如上所述，可變輕鏈和重鏈的區域具有相同的一般結構，並且每個區域包含四個框架區(FR)，該等框架區序列係廣泛保守的，由三個CDR連接。框架區採用β-折疊構象，並且該等CDR可形成連接β-折疊結構的環。每條鏈中的該等CDR藉由框架區保持其三維結構，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗原結合位點。
因此，在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可以包含如表1A所示的選自LV-01至LV-15的輕鏈可變區，和/或如表1B所示的選自HV-01至HV-105的重鏈可變區，以及該等輕鏈和重鏈可變區的結合片段、衍生物和變體。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可以包含如表1A所示的選自LV-16至LV-36的輕鏈可變區，和/或如表1B所示的選自HV-106至HV-122的重鏈可變區，以及該等輕鏈和重鏈可變區的結合片段、衍生物和變體。
可以將表1A中列出的每一個輕鏈可變區與表1B中列出的任意重鏈可變區組合以形成本發明的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。這樣的組合的實例包括但不限於：(i)LV-03與HV-03至HV-26、HV-32至HV-47、和HV-57至HV-62中的任一者；(ii)LV-04與HV-11至HV-91中的任一者；(iii)LV-05與HV-01、HV-03、HV-07、HV-09和HV-10中的任一者；(iv)LV-06 與HV-01、HV-03、HV-07、HV-09和HV-10中的任一者；(v)LV-07與HV-01、HV-03、HV-07、HV-09和HV-10中的任一者；(vi)LV-08與HV-01；(vii)LV-09與HV-01；(viii)LV-10與HV-01；(ix)LV-11與HV-92、HV-93、HV-95至HV-97、和HV-99至HV-101中的任一者；(x)LV-12與HV-94；(xi)LV-13與HV-98；(xii)LV-14與HV-102至HV-104中的任一者；(xiii)LV-15與HV-105；(xiv)LV-17與HV-107；(xv)LV-18與HV-108；(xvi)LV-19與HV-109；(xvii)LV-20與HV-110；(xviii)LV-21與HV-110；(xix)LV-22與HV-111；(xx)LV-23與HV-107；(xxi)LV-24與HV-112；(xxii)LV-25與HV-113；(xxiii)LV-26與HV-114；(xxiv)LV-27與HV-106或HV-110；(xxv)LV-28與HV-115或HV-118；(xxvi)LV-29與HV-116；(xxvii)LV-30與HV-117；(xxviii)LV-31與HV-119；(xxix)LV-32與HV-120；(xxx)LV-33與HV-121；(xxxi)LV-34與HV-122；(xxxii)LV-35與HV-110；以及(xxxiii)LV-36與HV-110。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO：54)的輕鏈可變區和包含HV-04的序列(SEQ ID NO：194)的重鏈可變區。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO：54)的輕鏈可變區和包含HV-13的序列(SEQ ID NO：203)的重鏈可變區。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-04的序列(SEQ ID NO：55)的輕鏈可變區和包含HV-38的序列(SEQ ID NO：228)的重鏈可變區。在仍其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-04的序列(SEQ ID NO：55)的輕鏈可變區和包含HV-84的序列(SEQ ID NO：274)的重鏈可變區。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO：54)的輕鏈可變區和包含HV-24的序列(SEQ ID NO：214) 的重鏈可變區。在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-04的序列(SEQ ID NO：55)的輕鏈可變區和包含HV-50的序列(SEQ ID NO：240)的重鏈可變區。在一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-03的序列(SEQ ID NO：54)的輕鏈可變區和包含HV-38的序列(SEQ ID NO：228)的重鏈可變區。在另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-11的序列(SEQ ID NO：62)的輕鏈可變區和包含HV-92的序列(SEQ ID NO：282)的重鏈可變區。在又另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-11的序列(SEQ ID NO：62)的輕鏈可變區和包含HV-93的序列(SEQ ID NO：283)的重鏈可變區。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-12的序列(SEQ ID NO：63)的輕鏈可變區和包含HV-94的序列(SEQ ID NO：284)的重鏈可變區。
在某些其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-34的序列(SEQ ID NO：85)的輕鏈可變區和包含HV-122的序列(SEQ ID NO：312)的重鏈可變區。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-21的序列(SEQ ID NO：72)的輕鏈可變區和包含HV-110的序列(SEQ ID NO：300)的重鏈可變區。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-30的序列(SEQ ID NO：81)的輕鏈可變區和包含HV-117的序列(SEQ ID NO：307)的重鏈可變區。在仍其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-27的序列(SEQ ID NO：78)的輕鏈可變區和包含HV-106的序列(SEQ ID NO：296)的重鏈可變區。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含 LV-32的序列(SEQ ID NO：83)的輕鏈可變區和包含HV-120的序列(SEQ ID NO：310)的重鏈可變區。在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-36的序列(SEQ ID NO：87)的輕鏈可變區和包含HV-110的序列(SEQ ID NO：300)的重鏈可變區。在一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-23的序列(SEQ ID NO：74)的輕鏈可變區和包含HV-107的序列(SEQ ID NO：297)的重鏈可變區。在另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-17的序列(SEQ ID NO：68)的輕鏈可變區和包含HV-107的序列(SEQ ID NO：297)的重鏈可變區。在又另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-20的序列(SEQ ID NO：71)的輕鏈可變區和包含HV-110的序列(SEQ ID NO：300)的重鏈可變區。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段包含：包含LV-26的序列(SEQ ID NO：77)的輕鏈可變區和包含HV-114的序列(SEQ ID NO：304)的重鏈可變區。
在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與表1A中輕鏈可變區(即，VL選自LV-01至LV-36)的序列不同的連續胺基酸序列，僅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基，其中每個這樣的序列差異獨立地是一個胺基酸的缺失、插入或取代，其中該等缺失、插入和/或取代導致相對於前述可變結構域序列不超過15個胺基酸變化。在一些抗PAC1抗體和結合片段中的輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：52至87的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列(即，在表1A中的輕鏈可變區)。
在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區含有與選自SEQ ID NO：54-66的序列具有至少90%同一性的序列。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：54-66的序列具有至少95%同一性的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：54-66的序列。在一些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：54的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55的序列。在又其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：62的序列。在仍其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：63的序列。
在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：68-87的序列具有至少90%同一性的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：68-87的序列具有至少95%同一性的序列。在仍另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：68-87的序列。在某些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：68的序列。在一些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：72的序列。在又其他的實施方 式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：74的序列。在仍其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：77的序列。在某些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：78的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：81的序列。在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：83的序列。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：85的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：87的序列。
在該等和其他實施方式中，該等抗PAC1抗體和其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與表1B中重鏈可變區(即，VH選自HV-01至HV-122)的序列不同的連續胺基酸序列，僅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15胺基酸殘基，其中每個這樣的序列差異獨立地是一個胺基酸的缺失、插入或取代，其中該等缺失、插入和/或取代導致相對於前述可變結構域序列不超過15個胺基酸變化。在一些抗PAC1抗體和抗原結合片段中的重鏈可變區包含與SEQ ID NO：191至312的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列(即，表1B中的重鏈可變區)。
在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：191-295的序列具有至少90%同一性的序列。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：191-295的序列具有 至少95%同一性的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：191-295的序列。在一些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：194的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：203的序列。在又其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：214的序列。在仍其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：228的序列。在某些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：240的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：274的序列。在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：282的序列。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：283的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：284的序列。
在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：296-312的序列具有至少90%同一性的序列。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：296-312的序列具有至少95%同一性的序列。在仍另一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：296-312的序列。在一些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包 含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：296的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：297的序列。在又其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：300的序列。在仍其他的實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：304的序列。在某些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：307的序列。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：310的序列。在一個實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：312的序列。
如本文使用的，術語“同一性”係指兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子的序列之間的關係，如藉由比對和比較序列所確定的。如本文使用的，“百分比同一性”係指在比較的分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並且基於所比較的最小分子的大小來計算。對於該等計算，比對中的空位(如果有的話)必須藉由特定的數學模型或電腦程式(即，“演算法”)來解決。可用於計算比對的核酸或多肽的同一性的方法包括Computational Molecular Biology[計算分子生物學]中描述的那些(Lesk,A.M.，編輯)，1988，紐約：牛津出版社(New York：Oxford University Press)；Biocomputing Informatics and Genome Projects[生物計算：資訊學和基因組項目]，(Smith,D.W.，編輯)，1993，紐約：學術出版社(New York：Academic Press)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列數據的電腦分析，第I部分]，(Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.，編輯)，1994,New Jersey：Humana Press(新澤西州，胡瑪納出版社)；von Heinje,G.,1987, Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物學中的序列分析]，紐約：學術出版社；Sequence Analysis Primer[序列分析引物]，(Gribskov,M.和Devereux,J.，編輯)，1991，紐約：斯托克頓出版社(New York：M.Stockton Press)；和Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math.[工業與應用數學學會應用數學雜誌]48：1073。例如，序列同一性可以藉由標準方法來確定，該等標準方法通常用於比較兩種多肽的胺基酸位置的相似性。使用例如BLAST或FASTA的電腦程式，比對兩個多肽或兩個多核苷酸序列用於最佳匹配它們各自的殘基(沿著一個或兩個序列的全長，或沿著一個或兩個序列的預定部分)。該等程式提供預設開放罰分和默認空位罰分，並且例如PAM 250(Dayhoff等人，在Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白序列和結構圖譜]，第5卷，增刊第3期，1978)或BLOSUM62(Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]89：10915-10919)的評分矩陣可以與電腦程式一起使用。例如，然後可以將百分比同一性計算為：相同匹配的總數乘以100，然後除以匹配範圍內較長序列的長度和引入較長序列的空位數之和，以便比對這兩個序列。在計算百分比同一性時，以給出序列之間最大匹配的方式來比對比較的序列。
GCG套裝程式係一個可用於確定百分比同一性的電腦程式，該套裝程式包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.[核酸研究]12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI[遺傳學電腦組，威斯康辛大學，麥迪森，威斯康辛州])。電腦演算法GAP用於比對要測定的百分比序列同一性的兩個多肽或兩個多核苷酸。比對序列以使它們各自的胺基酸或核苷酸達到最佳匹配(如藉由演算法來確定“匹配範圍”)。空位開放罰分(被計算為3x平均對角線，其中該“平均對角線”係所使用的比較矩陣的對角線的平均值；該“對角線”係由特定 的比較矩陣分配給每個完全胺基酸匹配的分數或數字)和空位延伸罰分(通常是空位開放罰分的1/10倍)以及比較矩陣(例如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些實施方式中，藉由該演算法還使用了標準比較矩陣(參見，用於PAM 250比較矩陣的Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白質序列和結構的圖譜]5：345-352；用於BLOSUM 62比較矩陣的Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]89：10915-10919)。
使用GAP程式用於確定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推薦的參數包括：演算法：Needleman等人.1970,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]48：443-453；比較矩陣：來自Henikoff等人，1992，同上的BLOSUM 62；空位罰分：12(但末端空位不存在罰分)空位長度罰分：4閾值的相似性：0
用於比對兩個胺基酸序列的某些比對方案可以導致僅兩個序列的短區域的匹配，並且即使在這兩個全長序列之間沒有顯著關係，該小的比對區域也可以具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，所選比對方法(GAP程式)可以被調整以產生跨越靶多肽的至少50個連續胺基酸的比對。
本發明的該等抗PAC1抗體可以包含任何免疫球蛋白恒定區。本文中術語“恒定區”與“恒定結構域”可互換地使用，係指除了可變區之外抗體的所有結構域。恒定區不直接參與抗原的結合，但表現出各種效應子功能。如上所述，取決於抗體的重鏈恒定區的胺基酸序列，抗體被分成特定的同種型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和亞型(IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1、IgA2)。該輕鏈恒定區可以是例如，κ或λ型輕鏈恒定區，例如人κ或λ型輕鏈恒定區，該輕鏈恒定區處於所有的五種抗體同種型。人免疫球蛋白輕鏈恒定區序列的實例示出在以下表中。
Figure 108101085-A0202-12-0086-42
本發明的該等抗PAC1抗體的重鏈恒定區可以是例如，α、δ、ε、γ或μ型重鏈恒定區，例如人α、δ、ε、γ或μ型重鏈恒定區。在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體包含來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的重鏈恒定區。在一個實施方式中，該抗PAC1抗體包含來自人IgG1免疫球蛋白的重鏈恒定區。在這樣的實施方式中，如本文更詳細描述的，該人IgG1免疫球蛋白恒定區可以包含一個或多個突變以防止抗體的醣苷化。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體包含來自人IgG2免疫球蛋白的重鏈恒定區。在又另一個實施方式中，該抗PAC1 抗體包含來自人IgG4免疫球蛋白的重鏈恒定區。人IgG1、IgG2和IgG4重鏈恒定區序列的實例示出在以下表3中。
Figure 108101085-A0202-12-0087-43
Figure 108101085-A0202-12-0088-44
表1A中揭露的每個輕鏈可變區和表1B中揭露的每個重鏈可變區可以附接至以上輕鏈恒定區(表2)和重鏈恒定區(表3)以分別形成完全抗體輕鏈和重鏈。此外，可以組合如此產生的重鏈和輕鏈序列中的每一個以形成完整的抗體結構。應當理解，本文提供的重鏈和輕鏈可變區還可以附接到具有與上文列出的示例性序列不同的序列的其他恒定結構區。
本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以是本文揭露的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段的任一者。例如，在某些實施方式中，該抗PAC1抗體係選自表9、10、12、13、14、19和20中列出的抗體中的任一者的抗PAC1抗體。在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區，該輕鏈可變區和/或重鏈可變區具有在表9、10、12、13、19或20中列出的一個或多個胺基酸取代。例如，在一個實施方式中，該抗PAC1抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含在一個或多個胺基酸位置27、28、30、31、32和/或93處具有突變的SEQ ID NO：52的序列。在某些 實施方式中，該突變選自Q27K、Q27R、Q27H、S28A、G30M、G30W、R31Q、R31L、R31H、R31W、R31Y、S32A、S32N、S32L、R93F、R93M、R93Y或其組合。在該等和其他實施方式中，該抗PAC1抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含在一個或多個胺基酸位置31、32、49、52、53、54、56、57、62、70、102、103和/或104處具有突變的SEQ ID NO：191的序列。在一些實施方式中，該突變選自R31F、R31H、R31Y、R31M、R31K、F32Y、A49G、S52N、S52T、Y53F、Y53H、Y53S、D54I、D54L、D54N、D54R、D54Q、D54Y、D54F、D54M、D54S、D54T、G56Q、G56N、G56R、G56H、G56A、G56S、G56T、G56D、N57A、N57F、N57G、N57S、N57Q、N57L、N57T、E62R、I70V、I70L、I70M、V102P、V102L、V102I、V102F、V102M、L103M、T104S、或其組合。
在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含在一個或多個胺基酸位置28、30、31、34、49、50、51、52、53、91、92、93、94和/或96處具有突變的SEQ ID NO：67的序列。該突變可以選自S28Y、S28T、S28K、S28P、S28Q、S28R、S28M、S30A、S30V、R31Q、N34V、N34S、Y49F、A50V、A50G、A51G、A51S、S52Q、S52H、S52N、S52Y、S52R、S52L、S53I、S53Y、S53N、S53M、S53H、S53R、S91A、Y92I、S93G、S93Q、S93I、S93N、S93M、P94E、P94M、P94N、P94Q、P94A、P94T、P94I、F96Y、或其組合。在該等和其他實施方式中，該抗PAC1抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含在一個或多個胺基酸位置31、32、33、57、58、60、103、105、106、107，和/或110處具有突變的SEQ ID NO：296的序列。在一些實施方式中，該突變選自S31N、N32R、N32K、N32H、S33L、S33Q、S33Y、S33V、S33D、S57G、K58Q、S60K、T103M、T103Q、T103R、T103V、K105N、K105E、K105D、K105I、K105A、 K105S、K105Q、Q106G、Q106E、L107D、L107N、L110M、L110F、或其組合。
在某些實施方式中，本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段選自抗體420653、420845、420943、421873、420889、421091、421051、480711、480706、480713、448730、448195、448788、448901、448689、448202、452128、448924、3574和3575或其抗原結合片段，該抗PAC1抗體或抗原結合片段的可變區和CDR序列在表1A和1B中列出。在一些實施方式中，該抗PAC1抗體係選自420653、420845、420943、421873、420889、421091、421051、480711、480706和480713抗體的抗體。在其他實施方式中，該抗PAC1抗體係選自448730、448195、448788、448901、448689、448202、452128、448924、3574和3575抗體的抗體。三種示例性人抗PAC1抗體的全長輕鏈序列和全長重鏈序列分別列出在以下表4A和4B中。
Figure 108101085-A0202-12-0090-45
Figure 108101085-A0202-12-0091-46
Figure 108101085-A0202-12-0092-47
Figure 108101085-A0202-12-0093-48
Figure 108101085-A0202-12-0094-49
Figure 108101085-A0202-12-0095-50
Figure 108101085-A0202-12-0096-51
Figure 108101085-A0202-12-0097-52
Figure 108101085-A0202-12-0098-53
Figure 108101085-A0202-12-0099-54
Figure 108101085-A0202-12-0099-56
Figure 108101085-A0202-12-0100-57
Figure 108101085-A0202-12-0101-58
Figure 108101085-A0202-12-0102-59
Figure 108101085-A0202-12-0103-60
Figure 108101085-A0202-12-0104-61
Figure 108101085-A0202-12-0105-62
Figure 108101085-A0202-12-0106-63
Figure 108101085-A0202-12-0107-64
Figure 108101085-A0202-12-0108-65
Figure 108101085-A0202-12-0109-66
Figure 108101085-A0202-12-0110-67
Figure 108101085-A0202-12-0111-68
Figure 108101085-A0202-12-0112-69
Figure 108101085-A0202-12-0113-70
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體可以包含如表4A所示的選自LC-01至LC-05的輕鏈，和/或如表4B所示的選自HC-01至HC-11的重鏈，以及該等輕鏈和重鏈的結合片段、衍生物和變體。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體可以包含如表4A所示的選自LC-06至LC-15的抗PAC1抗體，和/或如表4B所示的選自HC-12至HC-18的重鏈，以及該等輕鏈和重鏈的結合片段、衍生物和變體。
可以將表4A中列出的每一個輕鏈與表4B中列出的任意重鏈組合以形成本發明的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。例如，在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-03(SEQ ID NO：506)的序列的輕鏈和包含HC-03(SEQ ID NO：521)的序列的重鏈在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-03(SEQ ID NO：506)的序列的輕鏈和包含HC-04(SEQ ID NO：522)的序列的重鏈。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-01(SEQ ID NO：504)的序列的輕鏈和包含HC-05(SEQ ID NO：523)的序列的重鏈。在仍其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-01(SEQ ID NO：504)的序列的輕鏈和包含HC-06(SEQ ID NO：524)的序列的重鏈。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-03(SEQ ID NO：506)的序列的輕鏈和包含HC-07(SEQ ID NO：525)的序列的重鏈。在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-01(SEQ ID NO：504)的序列的輕鏈和包含HC-08(SEQ ID NO：526)的序列的重鏈。在一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-03(SEQ ID NO：506)的序列的輕鏈和包含HC-05(SEQ ID NO：523)的序列的重鏈。在另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-04(SEQ ID NO：507)的序列的輕鏈和包含HC-09(SEQ ID NO：527)的序列的重鏈。在又另一個 實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-04(SEQ ID NO：507)的序列的輕鏈和包含HC-10(SEQ ID NO：528)的序列的重鏈。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-05(SEQ ID NO：508)的序列的輕鏈和包含HC-11(SEQ ID NO：529)的序列的重鏈。
在某些其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-07(SEQ ID NO：510)的序列的輕鏈和包含HC-13(SEQ ID NO：531)的序列的重鏈。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-08(SEQ ID NO：511)的序列的輕鏈和包含HC-14(SEQ ID NO：532)的序列的重鏈。在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-09(SEQ ID NO：512)的序列的輕鏈和包含HC-15(SEQ ID NO：533)的序列的重鏈。在仍其他的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-10(SEQ ID NO：513)的序列的輕鏈和包含HC-16(SEQ ID NO：534)的序列的重鏈。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-11(SEQ ID NO：514)的序列的輕鏈和包含HC-17(SEQ ID NO：535)的序列的重鏈。在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-12(SEQ ID NO：515)的序列的輕鏈和包含HC-17(SEQ ID NO：535)的序列的重鏈。在一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-13(SEQ ID NO：516)的序列的輕鏈和包含HC-14(SEQ ID NO：532)的序列的重鏈。在另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-14(SEQ ID NO：517)的序列的輕鏈和包含HC-18(SEQ ID NO：536)的序列的重鏈。在又另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含：包含LC-06(SEQ ID NO：509)的序列的輕鏈和包含HC-14(SEQ ID NO：532)的序列的重鏈。在仍另一個實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含： 包含LC-15(SEQ ID NO：518)的序列的輕鏈和包含HC-12(SEQ ID NO：530)的序列的重鏈。
在一些實施方式中，該等抗PAC1抗體包含輕鏈，該輕鏈包含與表4A中輕鏈(即，輕鏈選自LC-01至LC-15)的序列不同的連續胺基酸序列，僅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基，其中每個這樣的序列差異獨立地是一個胺基酸的缺失、插入或取代，其中該等缺失、插入和/或取代導致相對於前述輕鏈序列不超過15個胺基酸變化。在一些抗PAC1抗體中的輕鏈包含與SEQ ID NO：504至518的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列(即，在表4A中的輕鏈)。
在該等和其他實施方式中，該等抗PAC1抗體包含重鏈，該重鏈包含與表4B中重鏈(即，重鏈選自HC-01至HC-18)的序列不同的連續胺基酸序列，僅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基，其中每個這樣的序列差異獨立地是一個胺基酸的缺失、插入或取代，其中該等缺失、插入和/或取代導致相對於前述重鏈序列不超過15個胺基酸變化。在一些抗PAC1抗體中的重鏈包含與SEQ ID NO：519至536的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列同一性的胺基酸序列(即，表4B中的重鏈)。
本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以是單株抗體、多株抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合的抗體、或多特異性的抗體或其抗原結合片段。在某些實施方式中，該抗PAC1抗體係單株抗體。在這樣的實施方式中，該抗PAC1抗體可以是具有人免疫球蛋白恒定結構區的嵌合的抗體、人源化抗體、或全人源抗體。在該等和其他的實施方式中，該抗PAC1抗體係人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。因此，該抗PAC1抗體 在一些實施方式中可以具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定結構區。在一個實施方式中，該抗PAC1抗體係單株人IgG1抗體。在另一個實施方式中，該抗PAC1抗體係單株人IgG2抗體。在又另一個實施方式中，該抗PAC1抗體係單株人IgG4抗體。
如本文使用的，術語“單株抗體”(或“mAb”)係指從基本上均質抗體群體中獲得的抗體，即構成群體的單獨抗體係相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突變。單株抗體係高度特異性的，針對單獨抗原位點或表位，與通常包括針對不同表位的不同抗體的多株抗體製劑相反。單株抗體可以使用本領域已知的任何技術產生，例如，藉由在免疫程式完成後使從動物收穫的脾細胞永生化。使用本領域已知的任何技術，例如藉由用脾細胞與骨髓瘤細胞融合來產生雜交瘤可以使該等脾細胞永生化。參見，例如，Antibodies[抗體]；Harlow和Lane，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第1版(例如1988年)，或第2版(例如2014年)。用於在產生雜交瘤的融合程序中使用的骨髓瘤細胞較佳的是非抗體產生的，具有高融合效率和酶缺陷，使得它們不能在某些選擇性培養基中生長，該培養基僅支持所需融合細胞(雜交瘤)的生長。在與小鼠細胞融合中使用的適合的細胞系的實例包括但不限於，Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul。用於與大鼠細胞融合的適合的細胞系的實例包括但不限於R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。用於細胞融合的其他細胞系係U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情況下，藉由以下產生雜交瘤細胞系：藉由使用PAC1免疫原(參見，例如WO 2014/144632)對動物(例如，具有人免疫球蛋白序 列的兔、大鼠、小鼠或轉基因動物)進行免疫；從該等免疫動物中收穫脾細胞；將收穫的脾細胞與骨髓瘤細胞系融合，從而產生雜交瘤細胞；從雜交瘤細胞建立雜交瘤細胞系，並鑒定產生與PAC1結合的抗體的雜交瘤細胞系。另一種用於產生單株抗體的有用的方法係在Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，第93卷：7843-7848,1996中描述的SLAM方法。
由雜交瘤細胞系分泌的單株抗體可以使用本領域已知的任何技術(例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)進行純化。可以進一步篩選雜交瘤上清液或mAb以鑒定具有特定性質的mAb，例如結合PAC1(例如，人PAC1、食蟹猴PAC1或大鼠PAC1)的能力；對其他PAC1家族成員的交叉反應性(例如，人VPAC1或人VPAC2)；阻斷或干擾PACAP配位基與PAC1結合的能力，或功能性地阻斷PACAP誘導的PAC1受體的激活的能力，例如如本文所述的cAMP測定。
在一些實施方式中，基於本文所述的該等抗體的CDR和可變區序列，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段係嵌合的或人源化抗體或其抗原結合片段。嵌合抗體係由來自不同抗體的蛋白質區段組成的抗體，該等抗體共價連接以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其結合片段。通常，重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，而該(該等)鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源。對於涉及嵌合抗體的方法，參見，例如，美國專利案號4,816,567和Morrison等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]81：6851-6855，這二者藉由引用以其全部內容併入本文。
通常，製備嵌合抗體的目的是產生嵌合體，其中來自預期物種的胺基酸數量最大化。一個實例係“CDR移植”的抗體，其中該抗體包含來自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的一個或多個CDR，而該(該等)抗體鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源。例如，在美國專利案號6,180,370、號5,693,762、號5,693,761、號5,585,089和號5,530,101中描述了CDR移植。為了在人類中使用，來自齧齒動物或兔抗體的可變區或所選的CDR通常被移植到人抗體中，代替人抗體的天然存在的可變區或CDR。
嵌合抗體的一種有用的類型係“人源化的”抗體。通常，人源化抗體係由最初在非人動物(例如齧齒動物或兔)中得到的單株抗體而產生。該單株抗體中的某些胺基酸殘基，通常來自抗體的非抗原識別部分，被修飾為與相應同種型的人抗體中的相應殘基同源。例如，可以例如使用各種方法藉由用齧齒動物或兔的可變區的至少一部分取代人抗體的相應區域來進行人源化(參見，例如，美國專利案號5,585,089和號5,693,762；Jones等人，1986,Nature[自然]321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature[自然]332：323-27；和Verhoeyen等人，1988,Science[科學]239：1534-1536)。
在一方面，本文提供的該等抗體的輕鏈和重鏈可變區的CDR(參見，表1A和1B)從來自相同或不同系統發育物種的抗體移植到框架區(FR)。例如，表1A和1B中列出的重鏈和輕鏈可變區的CDR可以移植到共有人FR上。為產生共有人FR，可以比對來自若干種人重鏈或輕鏈胺基酸序列的FR以鑒定共有胺基酸序列。可替代地，來自一條重鏈或輕鏈的移植可變區可以與恒定區一起使用，該恒定區不同於本文揭露的特定重鏈或輕鏈的恒定區。在其他實施方式中，該等移植的可變區係單鏈Fv抗體的一部分。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段係完全人抗體或其抗原結合片段。在WO 2014/144632中描述的免疫原或其片段可以產生特異性地結合人PAC1的完全人抗體，例如由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的序列組成的多肽。“全人源抗體”係包含衍生自或指示人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。提供用於實施完全人抗體的一種特定手段係小鼠體液免疫系統的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中內源Ig基因已經失活的小鼠中是在小鼠中產生完全人單株抗體(mAb)之方法，小鼠係可以用任何所需抗原進行免疫的動物。使用完全人抗體可以最小化免疫原性和過敏反應，該免疫原性和過敏反應有時可以藉由將小鼠mAb或小鼠衍生的mAb作為治療劑給予人而引起。
可以藉由免疫轉基因動物(通常是小鼠)來產生完全人抗體，該等轉基因動物能夠在內源性免疫球蛋白產生缺失的情況下產生人抗體庫。用於此目的的抗原典型地具有六個或更多個連續胺基酸，並且視需要與載體綴合，例如半抗原。參見，例如，Jakobovits等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA [美國國家科學院院刊]90：2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature[自然]362：255-258；和Bruggermann等人，1993,Year in Immunol.[免疫學之年]7：33。在這種方法的一個實例中，藉由以下方法產生轉基因動物：使編碼其中的小鼠重和輕免疫球蛋白鏈的內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，並將包含編碼人重鏈和輕鏈蛋白質的基因座的人基因組DNA的大片段插入小鼠基因組中。然後將具有少於人免疫球蛋白基因座的全部補體的部分經修飾的動物雜交以獲得具有全部所需免疫系統修飾的動物。當給予免疫原時，該等轉基因動物產生對免疫原具有免疫特異性但具有人胺基酸序列而不是鼠胺基酸序列的抗體(包括可變區)。有關此類方法的更多詳細資訊，參見，例如，WO 96/33735和WO 94/02602。用於生成人抗體涉及轉基因小 鼠的另外的方法描述於美國專利案號5,545,807；美國專利案號6,713,610；號6,673,986；號6,162,963；美國專利案號5,939,598；號5,545,807；號6,300,129；號6,255,458；號5,877,397；號5,874,299和號5,545,806；PCT公開案號WO 91/10741、WO 90/04036、WO 94/02602、WO 96/30498、WO 98/24893和EP 546073 B1和EP 546073 A1中。
上述轉基因小鼠，被稱為“HuMab”小鼠，包含編碼未經重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使內源性μ和κ鏈基因座失活的靶向突變(Lonberg等人，1994,Nature[自然]368：856-859)。因此，小鼠表現出小鼠IgM和κ蛋白的表現降低，並且響應於免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人IgGκ單株抗體(Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.[國際免疫學綜述]13：65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.[紐約科學院年報]764：536-546)。HuMab小鼠製備的細節描述如下：在Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research[核酸研究]20：6287-6295；Chen等人，1993,International Immunology[國際免疫學]5：647-656；Tuaillon等人，1994,J.Immunol.[免疫學雜誌]152：2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature[自然]368：856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology[實驗藥理學手冊]113：49-101；Taylor等人，1994,International Immunology[國際免疫學]6：579-591；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.[國際免疫學綜述]13：65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.[紐約科學院年報]764：536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology[自然生物技術]14：845-851；前述參考文件藉由引用以其全部內容併入本文。參見，另外的美國專利案號5,545,806；美國專利案號5,569,825；美國專利案號5,625,126；美國專利案號5,633,425；美國專利案號5,789,650；美國專利案 號5,877,397；美國專利案號5,661,016；美國專利案號5,814,318；美國專利案號5,874,299；和美國專利案號5,770,429；以及美國專利案號5,545,807；國際公開案號WO 93/1227；WO 92/22646；和WO 92/03918，其全部揭露均藉由引用以其全部內容併入本文。在該等轉基因小鼠中用於產生人抗體利用的技術還在WO 98/24893，和Mendez等人，1997,Nature Genetics[自然遺傳學]15：146-156中進行了揭露，其藉由引用併入本文。例如，HCo7和HCo12轉基因小鼠株可用於產生完全人抗PAC1抗體。適合於產生完全人抗PAC1抗體的一個特定的轉基因小鼠系係在以下中描述的XenoMouse® 轉基因小鼠系：美國專利案號6,114,598；6,162,963；6,833,268；7,049,426；7,064,244；Green等人，1994,Nature Genetics[自然遺傳學]7：13-21；Mendez等人，1997,Nature Genetics[自然遺傳學]15：146-156；Green和Jakobovitis,1998,J.Ex.Med[實驗醫學雜誌]，188：483-495；Green,1999,Journal of Immunological Methods[免疫學方法雜誌]231：11-23；Kellerman和Green,2002,Current Opinion in Biotechnology[生物技術的新見]13,593-597，其全部均藉由引用以其全部內容併入本文。
還可以使用噬菌體展示技術產生人源抗體。噬菌體展示描述於，例如，Dower等人，WO 91/17271,McCafferty等人，WO 92/01047，以及Caton和Koprowski,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，87：6450-6454中，將其各自藉由引用以其全部內容併入本文。由噬菌體技術產生的抗體通常作為抗原結合片段產生，例如，在細菌中的Fv或Fab片段，因此缺乏效應子功能。效應子功能可以藉由以下兩種策略之一引入：如果需要，可以將片段工程化為用於在哺乳動物細胞中表現的完整抗體，或工程化為具有能夠觸發效應子功能的第二結合位點的雙特異性抗體片段。典型地，抗體的Fd片段(VH-CH1)和輕鏈(VL-CL)藉由PCR分別選殖並在 組合噬菌體展示文庫中隨機重組，然後可以選擇其與特定抗原結合。抗體片段在噬菌體表面上表現，並且藉由抗原結合對Fv或Fab(因此含有編碼抗體片段的DNA的噬菌體)的選擇藉由若干輪抗原結合和再擴增來完成，該過程稱為淘選。對抗原具有特異性的抗體片段被富集並最終分離。噬菌體展示技術還可在用於齧齒動物單株抗體的人源化方法中使用，稱為“引導選擇”(參見Jespers,L.S.等人，1994,Bio/Technology[生物/技術]12,899-903)。為此，可以將小鼠單株抗體的Fd片段與人輕鏈文庫組合展示，並然後可以用抗原選擇所得雜合Fab文庫。因此，小鼠Fd片段提供了指導選擇的模板。隨後，將所選的人輕鏈與人Fd片段文庫組合。選擇所得文庫完全產生人Fab。
一旦使用任何以上描述的免疫和其他技術已經獲得了根據本發明產生抗PAC1抗體的細胞，可以藉由根據本文所述的標準程序從中分離和擴增DNA或mRNA來選殖特異性抗體基因。可以對由其產生的抗體進行定序並鑒定CDR，並且可以如本文所述操縱編碼CDR的DNA以產生根據本發明的其他抗PAC1抗體或抗原結合片段。
在某些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可以包含對恒定區的一個或多個突變或修飾。例如，該等抗PAC1抗體的重鏈恒定區或Fc區可以包含影響抗體的醣苷化、效應子功能、和/或Fcγ受體結合的一個或多個胺基酸取代。術語“Fc區”係指免疫球蛋白重鏈的C末端區域，該區域可以藉由木瓜蛋白酶消化完整抗體而產生。免疫球蛋白的Fc區通常包含兩個恒定結構區(CH2結構域和CH3結構域)，並視需要包含CH4結構域。在某些實施方式中，該Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc區。在一些實施方式中，該Fc區包含來自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3結構域。Fc區可以保留效應子功能，例如C1q結 合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和吞噬作用。在其他實施方式中，如下文進一步詳細描述的，可以修飾Fc區以減少或消除效應子功能。
除非藉由參考特定序列另有說明，否則在整個說明書和申請專利範圍中，免疫球蛋白重鏈或輕鏈中胺基酸殘基的編號係根據如Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]309(3)：657-670；2001中描述的AHo編號；或如Edelman等人，Proc.Natl.Acad.USA[美國國家科學院院刊]，第63卷：78-85(1969)中描述的EU編號。如本文使用的，當提及可變區內胺基酸的位置時典型地使用AHo編號方案，然而當提及具有免疫球蛋白恒定區的胺基酸的位置時通常使用EU編號方案。
胺基酸序列中的胺基酸取代在本文中典型地用特定位置中的胺基酸殘基的單字母縮寫表示，然後是相對於原始目的序列的數字胺基酸位置，然後是其中取代的胺基酸殘基的單字母縮寫。例如，“T30D”表示相對於原始目的序列，在胺基酸位置30處由天冬胺酸殘基取代蘇胺酸殘基。另一個實例，“S218G”表示相對於原始目的胺基酸序列，在胺基酸位置218處由甘胺酸殘基取代絲胺酸殘基。
免疫球蛋白Fc區的功能之一係當免疫球蛋白結合其靶標時與免疫系統進行通訊。這通常被稱為“效應子功能”。通訊導致抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP藉由Fc區與免疫系統細胞表面上的Fc受體的結合來介導。CDC藉由Fc區與補體系統的蛋白質(例如C1q)的結合來介導。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體在Fc區中包含一個或多個胺基酸取代以增強效應子功能，包括ADCC活性、CDC活性、ADCP活性、和/或抗體的清除或半衰期。可以增強效應子功能的示例性胺基酸取 代(根據EU編號方案)包括但不限於E233L、L234I、L234Y、L235S、G236A、S239D、F243L、F243V、P247I、D280H、K290S、K290E、K290N、K290Y、R292P、E294L、Y296W、S298A、S298D、S298V、S298G、S298T、T299A、Y300L、V305I、Q311M、K326A、K326E、K326W、A330S、A330L、A330M、A330F、I332E、D333A、E333S、E333A、K334A、K334V、A339D、A339Q、P396L，或任何前述的組合。
在其他實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含Fc區中的一個或多個胺基酸取代以降低效應子功能。可以降低效應子功能的示例性胺基酸取代(根據EU編號方案)包括但不限於、C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S，或任何前述的組合。
醣苷化可以有助於抗體的效應子功能，特別是IgG1抗體。因此，在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體可包含影響抗體的醣苷化水平或類型的一個或多個胺基酸取代。多肽的醣苷化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基的側鏈的附接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外的任何胺基酸)係碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此，多肽中該等三肽序列中任一個的存在產生了潛在的醣苷化位點。O-連接醣苷化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種與羥基胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸附接，儘管還可以使用5-羥基脯胺酸或5-羥基賴胺酸。
在某些實施方式中，藉由添加一個或多個醣苷化位點，例如向抗體的Fc區中添加，本文所描述的該等抗PAC1抗體的醣苷化。藉由改變胺基酸序列使其含有一個或多個以上描述的三肽序列(針對N-連接的醣苷化位 點)，可以方便地完成向抗體中添加醣苷化位點。還可以藉由將一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至或取代起始序列(針對O-連接的醣苷化位點)來進行改變。方便起見，可以藉由在DNA水平上的變化來改變抗體胺基酸序列，特別是藉由在預選的鹼基處使編碼靶多肽的DNA發生突變，從而產生將轉化成所需胺基酸的密碼子。
本發明還涵蓋產生具有導致效應子活性變化的改變的碳水化合物結構的抗體分子，包括表現出改進的ADCC活性的具有缺失的或降低的岩藻醣苷化的抗體。在本領域中已知各種方法來降低或消除岩藻醣苷化。例如，ADCC效應子活性係藉由抗體分子與FcγRIII受體的結合介導的，已顯示該活性依賴於CH2結構域的N297殘基處N-連接的醣苷化的碳水化合物結構。非岩藻醣苷化的抗體以增加的親和力與該受體結合並且比天然的岩藻醣苷化抗體更有效地觸發FcγRIII介導的效應子功能。例如，在已經敲除α-1,6-岩藻糖基轉移酶的CHO細胞中非岩藻醣苷化抗體的重組產生導致抗體具有100倍增加的ADCC活性(參見Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng.[生物技術與生物工程]87(5)：614-22,2004)。類似的效果可以藉由以下來實現：藉由降低岩藻醣苷化途徑中α-1,6-岩藻糖基轉移酶或其他酶的活性，例如藉由siRNA或反義RNA處理，使細胞系工程化以敲除一種或多種酶或與選擇性醣苷化抑制劑培養(參見Rothman等人，Mol Immunol.[分子免疫學]26(12)：1113-23,1989)。一些宿主細胞株(例如Lec13或大鼠雜交瘤YB2/0細胞系)天然產生具有較低岩藻醣苷化水平的抗體(參見Shields等人，J Biol Chem.[生物化學雜誌]277(30)：26733-40,2002和Shinkawa等人，J Biol Chem.[生物化學雜誌]278(5)：3466-73,2003)。等分碳水化合物水平的增加，例如藉由在過表現GnTIII酶的細胞中重組產生抗體，也已經確定增 加ADCC活性(參見Umana等人，Nat Biotechnol.[自然生物技術]17(2)：176-80,1999)。
在其他實施方式中，藉由去除一個或多個醣苷化位點(例如從抗體的Fc區)降低或消除本文所描述的該等抗PAC1抗體的醣苷化。在一些實施方式中，該抗PAC1抗體係未醣苷化的人單株抗體，例如未醣苷化的人IgG1單株抗體。消除或改變N-連接的醣苷化位點的胺基酸取代可以減少或消除抗體N-連接的醣苷化。在某些實施方式中，本文所描述的該等抗PAC1抗體包含位置N297處(根據EU編號方案)的重鏈突變，例如N297Q、N297A或N297G。在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含來自人IgG1抗體的Fc區，該人IgG1抗體具有位置N297處的突變。在一個具體的實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含來自人IgG1抗體的Fc區，該人IgG1抗體具有N297G突變。例如，在一些實施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含SEQ ID NO：324的序列。
為改善包含N297突變的分子的穩定性，可以進一步使抗PAC1抗體的Fc區工程化。例如，在一些實施方式中，Fc區中的一個或多個胺基酸被半胱胺酸取代以促進二聚體狀態中的二硫鍵形成。對應於IgG1 Fc區中的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332(根據EU編號方案)的殘基可以因此被半胱胺酸取代。較佳的是，特定殘基對被半胱胺酸取代，使得它們優先彼此形成二硫鍵，因此限制或防止二硫鍵雜亂。較佳的殘基對包括但不限於，A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、以及V323C和I332C。在某些實施方式中，本文所描述的該等抗PAC1抗體包含來自人IgG1抗體的Fc區，該人IgG1抗體具有突變R292C和V302C。在這樣的實施方式中，該Fc區還可以包含N297突變，例如N297G突變。在一些實 施方式中，本發明的該等抗PAC1抗體包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含SEQ ID NO：325的序列。
以下對本發明的該等抗PAC1抗體進行修飾來增加血清半衰期還可能是所希望的：例如，藉由摻入或添加補救受體結合表位(例如，藉由使適當的區域發生突變或藉由將表位摻入肽標籤中，然後在任一端或在中間與抗體融合，例如藉由DNA或肽合成；參見，例如WO 96/32478)或添加如PEG或其他水溶性聚合物(包括多糖聚合物)的分子。該補救受體結合表位較佳的是構成其中來自Fc區的一個或兩個環的任何一個或多個胺基酸殘基被轉移至抗體中類似位置的區域。甚至更較佳的是，轉移來自Fc區的一個或兩個環的三個或更多個殘基。仍更較佳的是，表位取自Fc區(例如，IgG Fc區)的CH2結構域並轉移至抗體的CH1、CH3或VH區，或多於一個這樣的區。可替代地，該表位取自Fc區的CH2結構域並轉移至抗體的CL區或VL區或兩者。參見國際申請WO 97/34631和WO 96/32478針對Fc變體及其與補救受體的相互作用的描述。
本發明包括一個或多個分離的多核苷酸或編碼本文所述的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段的分離的核酸。另外，本發明涵蓋包含該等核酸的載體、包含該等核酸的宿主細胞或細胞系，以及製備本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段的方法。該等核酸包含：例如，編碼抗體或抗原結合片段的全部或部分的多核苷酸；例如，本發明的抗體的單鏈或雙鏈，或其片段、衍生物或變體；足夠用作雜交探針的多核苷酸；用於鑒定、分析、突變或擴增編碼多肽的多核苷酸的PCR引物或定序引物；用於抑制多核苷酸表現的反義寡核苷酸，以及前述互補序列。核酸可以是適合於所需用途或功能的任何長度，並且可以包含一種或多種另外的序列，例如調節序列，和/或較大核酸的一部分(例如載體)。本發明的核酸分子包括處於 單鏈和雙鏈形式的DNA和RNA，以及相應的互補序列。DNA包括，例如cDNA、基因組DNA、化學合成的DNA、由PCR擴增的DNA、及其組合。本發明的該等核酸分子包括全長基因或cDNA分子以及其片段的組合。本發明的該等核酸可以源自人來源以及非人物種。
可以藉由直接蛋白質定序確定來自免疫球蛋白或其區域(例如可變區，Fc區等)或目的多肽的相關胺基酸序列，並且可以根據通用密碼子表設計適合的編碼核苷酸序列。可替代地，可以使用常規的程序(例如，藉由使用能夠與編碼單株抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)從產生該等抗體的細胞中分離和定序編碼本發明的單株抗體或其結合片段的基因組或cDNA。
本文中與“分離的多核苷酸”可互換地使用的“分離的核酸”係在核酸從天然存在的來源分離的情況下，已經從生物的基因組中存在的相鄰遺傳序列分離的核酸，該生物的核酸係分離的。在從模板或化學上酶促合成核酸的情況下，如PCR產物、cDNA分子或寡核苷酸，例如應理解由該等過程產生的核酸係分離的核酸。分離的核酸分子係指處於單獨片段形式的核酸分子或作為較大核酸構建體的組分。在一個較佳的實施方式中，該等核酸基本上不含污染的內源物質。核酸分子較佳的是衍生自以基本上純的形式和按能夠藉由標準生物化學方法(例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]，第2版，冷泉港實驗室，紐約冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1989)中概述的那些)鑒定、操作和回收其組分核苷酸序列的數量或濃度分離至少一次的DNA或RNA。此類序列較佳的是以不受內部非翻譯序列或內含子中斷的開放閱讀框的形式提供和/或構建，該等內部非翻譯序列或內含子典型地存在於真核基因中。非翻譯DNA的序列可以存在於開放閱讀框的 5'或3'，其中開放閱讀框不會干擾編碼區的操縱或表現。除非另有說明，否則本文討論的任何單鏈多核苷酸序列的左手端係5’；雙鏈多核苷酸序列的左手方向被稱為5’方向。新生RNA轉錄物的5'至3'產生方向被稱為轉錄方向；DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同的序列，該序列係RNA轉錄物的5'到5'端的序列區被稱為“上游序列”；DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同的序列，該序列係RNA轉錄物的3’到3'端的序列區被稱為“下游序列”。
本發明還包括在中等嚴格條件下，和更較佳的是高嚴格條件下與編碼如本文所述的多肽的核酸雜交的核酸。影響雜交條件的選擇的基本參數以及有關設計適合條件的指導由以下陳述：Sambrook,Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖實驗指南]，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，紐約，第9和11章；及Current Protocols in Molecular Biology[現代分子生物學實驗技術]，1995,Ausubel等人編，約翰&威利父子公司(John Wiley & Sons,Inc.)，第2.10和6.3-6.4節)，並且可以由熟悉該項技術者基於例如該DNA的長度和/或鹼基組成容易地確定。實現中等嚴格條件的一種方式涉及使用含有5 x SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的預洗滌溶液，約50%甲醯胺、6 x SSC的雜交緩衝液以及約55℃的雜交溫度(或其他類似的雜交溶液，如含有約50%甲醯胺的雜交溶液，其中雜交溫度為約42℃)以及約60℃、在0.5 x SSC、0.1% SDS中的洗滌條件。通常，高嚴格條件被定義為如上的雜交條件，但其中在大約68℃、0.2 x SSC、0.1% SDS中進行洗滌。在雜交和洗滌緩衝液中SSPE(1 x SSPE係0.15M NaCl、10mM NaH2 PO4 、和1.25mM EDTA、pH 7.4)可以代替SSC(1 x SSC係0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成後，將洗滌進行15分鐘。應當理解，藉由應用控制雜交反應和雙鏈體穩定性的基本原理，可以根據需要調節洗滌溫度和洗滌鹽濃度以達到 所需的嚴格程度，如熟悉該項技術者已知的並進一步描述如下(參見，例如Sambrook等人，1989)。
當將核酸與未知序列的靶核酸雜交時，假定雜交長度係雜交核酸的長度。當已知序列的核酸雜交時，可以藉由比對該等核酸的序列並鑒定最佳序列互補性的一個或多個區域來確定雜交體長度。預期長度小於50個鹼基對的雜交體的雜交溫度應比雜交體的解鏈溫度(Tm)低5℃至10℃，其中Tm根據下列等式確定。對於長度小於18個鹼基對的雜交體，Tm(℃)=2(# A+T鹼基)+4(# G+C鹼基)。對於長度大於18個鹼基對的雜交體，Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)，其中N係雜交體中的鹼基數，並且[Na+]係雜交緩衝液中鈉離子的濃度([Na+]對於1 x SSC=0.165M)。較佳的是，每個這樣的雜交核酸具有的長度為至少15個核苷酸(或更較佳的是至少18個核苷酸、或至少20個核苷酸、或至少25個核苷酸、或至少30個核苷酸、或至少40個核苷酸、或最較佳的是至少50個核苷酸)，或與其雜交的本發明的核酸長度的至少25%(更較佳的是至少50%、或至少60%、或至少70%，和最較佳的是至少80%)，並且具有與其雜交的本發明的核酸的至少60%序列同一性(更較佳的是至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、和最較佳的是至少99.5%)，其中如上文更詳細描述的藉由在比對時比較雜交核酸的序列來確定序列同一性，以便最大化重疊和同一性，同時最小化序列空位。
本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段的變體可以按如下來製備：使用盒或PCR誘變或本領域熟知的其他技術，例如在實例3中描述的那些，藉由編碼多肽的DNA中核苷酸的定點誘變，以產生編碼變體的 DNA，並在此之後如本文所概述在細胞培養物中表現重組DNA。然而，可以使用已建立的技術藉由體外合成製備包含具有多達約100-150個殘基的變體CDR的抗體或抗原結合片段。該等變體通常表現出與天然存在的類似物相同的定性生物活性，例如與抗原結合。這樣的變體包括，例如抗體的胺基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或取代。可以進行缺失、插入和取代的任何組合以達到最終構建體，條件係最終的構建體具有所希望的特徵。胺基酸變化還可以改變抗體的翻譯後過程，例如改變醣苷化位點的數量或位置。在某些實施方式中，製備抗體變體以意圖修飾直接參與表位結合的那些胺基酸殘基。在其他實施方案中，出於本文討論的目的，不直接參與表位結合的殘基或以任何方式不參與表位結合的殘基的修飾係所希望的。任何CDR區和/或框架區內的誘變被預期。熟悉該項技術者可以採用協方差分析技術來設計抗體的胺基酸序列中有用的修飾。參見，例如， Choulier，等人，Proteins[蛋白質]41：475-484,2000；Demarest等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]335：41-48,2004；Hugo等人，Protein Engineering[蛋白質工程]16(5)：381-86,2003；Aurora等人，美國專利公開案號2008/0318207 A1；Glaser等人，美國專利公開案號2009/0048122 A1；Urech等人，WO 2008/110348 A1；Borras等人，WO 2009/000099 A2。藉由協方差分析確定的這種修飾可以改進抗體的效力、藥物動力學、藥效學和/或可製造性特徵。
表4A和4B分別顯示本文所述的抗PAC1抗體的編碼全長輕鏈和重鏈的示例性核酸序列。表5A和5B顯示本文所述的抗PAC1抗體的分別編碼輕鏈和重鏈可變區的示例性核酸序列。可以使用編碼抗PAC1可變區的多核苷酸，與視需要分別編碼表2和3中列出的輕鏈和重鏈恒定區的核酸以構建本發明的該等抗體和抗原結合片段。
[表5A].示例性抗PAC1抗體輕鏈可變區核酸序列
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編碼本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段的分離的核酸可以包含與表4A、4B、5A和5B中列出的任何核苷酸序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈可變區的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：328至342的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在其他實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈可變區的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：343至363的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在某些實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈可變區的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：328至342的序列。在某些其他的實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈可變區的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：343至363的序列。在相關的實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈可變區的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：364至468的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在其他相關的實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈可變區的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：469至485的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈可變區的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：364至468的序列。在其他實施方式中，編 碼抗PAC1抗體重鏈可變區的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：469至485的序列。
在一些實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：537至541的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在其他實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：542至551的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在某些實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：537至541的序列。在某些其他的實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：542至551的序列。在相關的實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：552至562的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在其他相關的實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈的分離的核酸包含與選自SEQ ID NO：563至569的序列具有至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或至少98%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：552至562的序列。在其他實施方式中，編碼抗PAC1抗體重鏈的分離的核酸包含選自SEQ ID NO：563至569的序列。
表4A、4B、5A和5B中提供的核酸序列僅是示例性的。如熟悉該項技術者將理解的，由於遺傳密碼的簡並性，可以製備極大量的核酸，所有該等核酸都編碼本文所述的該等抗體和抗原結合片段的CDR、可變區、以及重鏈和輕鏈或其他組分。因此，在鑒定了特定的胺基酸序列後，熟悉該項技術者可以藉由簡單地以不改變編碼蛋白質的胺基酸序列的方式修飾一個或多個密碼子的序列來製備任何數量的不同核酸。
本發明還包括載體，該等載體包含編碼本發明的該等抗體或抗原結合片段(例如，可變區、輕鏈和重鏈)的一個或多個組分的一個或多個核酸。術語“載體”係指用於將蛋白質編碼資訊轉移到宿主細胞中的任何分子或實體(例如，核酸、質粒、細菌噬菌體或病毒)。載體的實例包括但不限於質粒、病毒載體、非游離基因的哺乳動物載體和表現載體(例如重組表現載體)。如本文使用的術語“表現載體”或“表現構建體”係指含有所需編碼序列的重組DNA分子和用於在特定宿主細胞中表現可操作連接的編碼序列所必需的適合的核酸控制序列。表現載體可包括但不限於影響或控制轉錄、翻譯的序列，並且如果存在內含子，則影響與其可操作連接的編碼區的RNA剪接。用於在原核生物中表現所必需的核酸序列包括啟動子，視需要操縱序列、核糖體結合位點和可能的其他序列。已知真核細胞利用啟動子、增強子、和終止子以及多腺苷酸化訊號。
分泌訊息肽序列還可以視需要由表現載體編碼，與目的編碼序列可操作地連接，使得表現的多肽可以由重組宿主細胞分泌，如果需要，以便更容易地從細胞中分離目的多肽。例如，在一些實施方式中，訊息肽序列可以附加/融合至表1A和1B中列出的任何可變區多肽序列或表4A和4B中列出的任何全鏈多肽序列的胺基端。在某些實施方式中，具有MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO：486)的胺基酸序列的訊息肽與表1A和1B中的任何可變區多肽序列或表4A和4B中的全鏈多肽序列的胺基端融合。在其他實施方式中，具有MAWALLLLTLLTQGTGSWA(SEQ ID NO：487)的胺基酸序列的訊息肽與表1A和1B中的任何可變區多肽序列或表4A和4B中的全鏈多肽序列的胺基端融合。在仍其他的實施方式中，具有MTCSPLLLTLLIHCTGSWA(SEQ ID NO：488)的胺基酸序列的訊息肽與表1A和1B中的任何可變區多肽序列或表4A和4B中的全鏈多肽序 列的胺基端融合。可以與本文所述的可變區多肽序列或全鏈多肽序列的胺基端融合的其他適合的訊息肽序列包括：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：489)、MEWTWRVLFLVAAATGAHS(SEQ ID NO：490)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：491)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：492)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：493)、MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO：494)、MDIRAPTQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO：495)、MDIRAPTQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：496)、MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF(SEQ ID NO：497)、MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：498)、METGLRWLLLVAVLKGVQC(SEQ ID NO：499)、METGLRWLLLVAVLKGVQCQE(SEQ ID NO：500)、以及MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：501)。其他訊號或分泌肽係熟悉該項技術者已知的，並且可以與表1A和1B中列出的任何可變區多肽鏈或表4A和4B中的全鏈多肽序列融合，例如，以促進或優化特定宿主細胞中的表現。
通常，在宿主細胞中用於產生本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段的表現載體將含有用於質粒維持和用於選殖和表現編碼抗體和抗原結合片段的組分的外源核苷酸序列的序列。在某些實施方式中，該等序列(統稱為“側翼(flanking)序列”)將通常包括一個或多個以下的核苷酸序列：啟動子、一個或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整的內含子序列、編碼用於多肽分泌的前導序 列的序列、核糖體結合位點、多腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現多肽的核酸的多接頭區，以及選擇標記元件。該等序列中的每一個討論如下。
視需要，載體可含有“標籤”-編碼序列，即，位於多肽編碼序列的5'或3'端的寡核苷酸分子；寡核苷酸標籤序列編碼polyHis(例如hexaHis)、FLAG、HA(血凝素流感病毒)、myc或另一種存在的可商購的抗體的“標籤”分子。該標籤通常在多肽表現時與多肽融合，並且可以用作用於親和純化或從宿主細胞檢測多肽的手段。可以例如藉由使用針對標籤的抗體作為親和基質的柱層析法來完成親和純化。視需要，隨後可以藉由各種方法從純化的多肽中去除標籤，例如使用某些肽酶進行切割。
側翼序列可以是同源的(即，來自與宿主細胞相同的物種和/或菌株)；異源的(即，來自宿主細胞物種或菌株以外的物種)；雜交體(即來自不止一種側翼序列的組合)；合成的或原生的。因此，側翼序列的來源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎動物或無脊椎動物、或任何植物，條件係側翼序列在宿主細胞機器中起作用並且可以被宿主細胞機器激活。
在本發明載體中有用的側翼序列可藉由本領域熟知的若干種方法中的任何一種獲得。通常，先前藉由作圖和/或藉由限制性內切核酸酶消化鑒定本文中有用的側翼序列，並可以因此可使用適當的限制性內切核酸酶從合適的組織來源分離。在一些情況下，側翼序列的完整核苷酸序列可能是已知的。在此，可以使用用於核酸合成或選殖的常規方法合成側翼序列。
無論是全部還是僅部分側翼序列係已知的，可以使用聚合酶鏈式反應(PCR)和/或藉由用適合的探針(例如寡核苷酸和/或來自相同或另外物種的側翼序列片段)篩選基因組文庫來獲得。在側翼序列未知的情況下，含有側翼序列的DNA片段可以從較大的DNA片段中分離，該片段可以包含 例如編碼序列或甚至另一個或多個基因。可以藉由限制性內切核酸酶消化以產生合適的DNA片段，然後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®柱層析(查茨沃思(Chatsworth)，加利福尼亞州)或熟悉該項技術者已知的其他方法進行分離來完成分離。為了實現該目的，選擇合適的酶對於熟悉該項技術者來說是顯而易見的。
複製起點通常是可商購的那些原核表現載體的一部分，並且起點有助於在宿主細胞中載體的擴增。如果選擇的載體不含複製起點位點，可以基於已知序列化學合成複製起點位點，並連接到載體中。例如，來自質粒pBR322(新英格蘭生物實驗室公司(New England Biolabs)，貝芙麗，麻塞諸塞州)的複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌和各種病毒來源(如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水皰性口腔病毒(VSV)、或乳頭瘤病毒(如HPV或BPV))可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(例如，通常僅使用SV40起源因為它還含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區的3'端，並用於終止轉錄。通常，原核細胞中的轉錄終止序列係富含G-C的片段，其後是聚T序列。雖然序列易於從文庫中選殖或甚至作為載體的一部分可商購，但它還可以使用已知的核酸合成方法容易地合成。
選擇性標記基因編碼在選擇性培養基中生長的對於宿主細胞的存活和生長所必需的蛋白質。典型的選擇性標記基因編碼的蛋白質(a)賦予抗生素或其他毒素，例如胺苄青黴素、四環素或康黴素對原核宿主細胞的抗性；(b)補充細胞的營養缺陷型缺陷；或(c)提供複雜或特定介質無法獲得的關鍵營養素。特異的選擇性標記係康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性 基因和四環素抗性基因。有利地，新黴素抗性基因還可同時用於在原核和真核宿主細胞中進行選擇。
其他可選擇的基因可用於擴增將表現的基因。擴增係這樣的過程，其中產生對生長或細胞存活至關重要的蛋白質所需的基因在重組細胞的連續世代的染色體內串聯重複。用於哺乳動物細胞的適合的選擇性標記的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉化體置於選擇壓力下，其中由於載體中存在的可選擇基因僅使轉化體獨特地適應存活。藉由在培養基中選擇劑濃度連續增加的條件下培養轉化細胞來施加選擇壓力，從而導致可選擇基因和編碼另一種基因(例如本文所述的該等抗體或抗原結合片段的一個或多個組分)的DNA的擴增。因此，從擴增的DNA合成增加量的多肽。
核糖體結合位點通常是mRNA翻譯起始所必需的，並且其特徵在於Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件典型地位於啟動子的3’端和待表現多肽的編碼序列的5’端。在某些實施方式中，一個或多個編碼區可以與內部核糖體結合位點(IRES)可操作地連接，允許從單個RNA轉錄物翻譯兩個開放閱讀框。
在某些情況下，例如其中在真核宿主細胞表現系統中醣苷化係所希望的情況下，可以操縱各種前序列或原序列(prosequence)以改進醣苷化或產量。例如，可以改變特定訊息肽的肽酶切割位點，或添加原序列，這還可以影響醣苷化。最終的蛋白質產物可以在-1位置(相對於成熟蛋白質的第一個胺基酸)具有一個或多個偶然表現的另外的胺基酸，該胺基酸可能尚未被完全去除。例如，最終的蛋白質產物可以在肽酶切割位點中發現具有一個或兩個胺基酸殘基，與胺基端附接。可替代地，如果酶在成熟 多肽內的這樣的區域切割，那麼使用一些酶切割位點可導致所需多肽的略微截短形式。
本發明的表現和選殖載體將通常含有被宿主生物識別並與編碼多肽的分子可操作連接的啟動子。如本文使用的，術語“可操作地連接”係指兩個或更多個核酸序列按如下方式的連接：這樣的方式使得產生能夠指導給定基因的轉錄和/或合成所需蛋白質分子的核酸分子。例如，將與蛋白質編碼序列“可操作地連接”的載體中的控制序列連接到其上，以便在與控制序列的轉錄活性相容的條件下實現蛋白質編碼序列的表現。更具體地，如果啟動子和/或增強子序列(包括順式作用轉錄控制元件的任何組合)在合適的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則該啟動子和/或增強子序列與編碼序列可操作地連接。
啟動子係位於結構基因起始密碼子上游(即5')的非轉錄序列(通常在約100-1000bp內)，控制結構基因的轉錄。常規地將啟動子分為兩類(誘導型啟動子和組成型啟動子)之一。響應於培養條件的某些變化(例如營養物的存在或缺失或溫度的變化)，在誘導型啟動子控制下啟動來自DNA的轉錄水平增加。另一方面，組成型啟動子均勻地轉錄它們可操作地連接的基因，其中對基因表現控制很少或沒有控制。由各種潛在宿主細胞識別的大量啟動子係熟知的。藉由由限制酶消化從源DNA中去除啟動子並將所需啟動子序列插入到載體中，將合適的啟動子與編碼例如重鏈、輕鏈或本發明的該等抗體和抗原結合片段的其他組分的DNA可操作地連接。
適用於酵母宿主的啟動子也是本領域熟知的。酵母增強劑有利地與酵母啟動子一起使用。用於哺乳動物宿主細胞的適合的啟動子係熟知的，並且包括但不限於從病毒基因組獲得的那些，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒血清型2、8或9)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、 巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。其他合適的哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如，熱休克啟動子和肌動蛋白啟動子。
可能是目的啟動子的其他特定啟動子包括但不限於：SV40早期啟動子(Benoist和Chambon,1981,Nature[自然]290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.[美國國家科學院院刊]81：659-663)；勞斯氏肉瘤病毒的3'長末端重複序列中含有的啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell[細胞]22：787-797)；皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]78：1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因的啟動子和調節序列(Prinster等人，1982,Nature[自然]296：39-42)；和原核生物啟動子，例如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]75：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]80：21-25)。同樣令人感興趣的是以下動物轉錄控制區，該等控制區展示出組織特異性並已用於轉基因動物：在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984,Cell[細胞]38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物學研討會]50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology[肝臟學]7：425-515)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature[自然]315：115-122)；在淋巴細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell[細胞]38：647-658；Adames等人，1985,Nature[自然]318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.[分子細胞生物學]7：1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell[細胞]45：485-495)；在肝中有活性的 清蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.[基因與發育]1：268-276)；在肝臟中有活性的α-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.[分子細胞生物學]5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science [科學]253：53-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.[基因與發育]1：161-171)；在骨髓細胞中有活性的β-珠蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature[自然]315：338-340；Kollias等人，1986,Cell[細胞]46：89-94)；在大腦中少突膠質細胞中有活性的髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987,Cell[細胞]48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature[自然]314：283-286)；以及在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,Science[科學]234：1372-1378)。
可以將增強子序列插入載體中以增加由高等真核生物對編碼該等抗體或抗原結合片段(例如，輕鏈、重鏈或可變區)的組分的DNA的轉錄。增強子係DNA的順式作用元件，通常長度為約10-300bp，作用於啟動子以增加轉錄。增強子相對於方向和位置無關，已經在轉錄單元的5'和3'位置發現。可從哺乳動物基因中獲得的若干增強子序列係已知的(例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)。然而，通常使用來自病毒的增強子。本領域已知的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子和腺病毒增強子係用於激活真核生物啟動子的示例性增強元件。雖然增強子可以位於編碼序列的5'或3'的載體中，但它通常位於啟動子的5'位點。可以將編碼合適的天然或異源訊號序列(前導序列或訊息肽)的序列摻入表現載體中，以促進如上所述的抗體或抗原結合片段的細胞外分泌。訊息肽或前導序列的選擇取決於其中待產生的抗體或抗原結合片段的宿主細胞的類型，並且異源訊號序列可以代替天然訊號序列。如上 描述了訊息肽的實例。在哺乳動物宿主細胞中有功能的其他訊息肽包括：在美國專利案號4,965,195中描述的白細胞介素-7(IL-7)的訊號序列；在Cosman等人，1984,Nature[自然]312：768中描述的白細胞介素-2受體的訊號序列；在EP專利案號0367 566中描述的白細胞介素-4受體訊息肽；在美國專利案號4,968,607中描述的I型白細胞介素-1受體訊息肽；以及EP專利案號0 460 846中描述的II型白細胞介素-1受體訊息肽。
提供的表現載體可以由起始載體構建，例如可商購的載體。該等載體可以包含或不包含所有所需的側翼序列。當本文所述的一個或多個側翼序列尚未存在於載體中時，它們可以單獨獲得並連接到載體中。用於獲得每個側翼序列的方法係熟悉該項技術者熟知的。可以將表現載體引入宿主細胞中，從而產生蛋白質，包括如本文所述的由核酸編碼的抗體和抗原結合片段。
在某些實施方式中，可以將編碼本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段的不同組分的核酸插入相同的表現載體中。例如，可以將編碼抗PAC1抗體輕鏈或可變區的核酸選殖到與編碼抗PAC1抗體重鏈或可變區的核酸相同的載體中。在這樣的實施方式中，兩個核酸可以由內部核糖體進入位點(IRES)分離並且在單個啟動子的控制下，使得輕鏈和重鏈從相同的mRNA轉錄物表現。可替代地，兩種核酸可以在兩個單獨的啟動子的控制下，使得輕鏈和重鏈從兩個單獨的mRNA轉錄物表現。在一些實施方式中，編碼抗PAC1抗體輕鏈或可變區的核酸被選殖到一種表現載體中，並且編碼抗PAC1抗體重鏈或可變區的核酸被選殖到第二表現載體中。在這樣的實施方式中，可以將宿主細胞與兩種表現載體共轉染以產生本發明的完整抗體或抗原結合片段。
在載體已經被構建並且編碼本文所述的該等抗體和抗原結合片段的組分的一個或多個核酸分子已經被插入一個或多個載體中的一個或多個合適的位點後，可以將完成的一個或多個載體插入適合的宿主細胞中以進行擴增和/或多肽表現。因此，本發明涵蓋分離的宿主細胞或細胞系，該宿主細胞或細胞系包含編碼本文所述的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段的組分的一個或多個表現載體。如本文使用的，術語“宿主細胞”係指已經用核酸轉化或係能夠轉化的細胞，從而表現目的基因。該術語包括親本細胞的後代，無論該後代在形態上或在遺傳構成上是否與原始親本細胞相同，只要存在目的基因即可。包含本發明的分離的核酸，較佳的是與至少一個表現控制序列(例如，啟動子或增強子)可操作地連接的宿主細胞係“重組宿主細胞”。
可以藉由以下熟知的方法完成將抗PAC1抗體或抗原結合片段的表現載體轉化到所選的宿主細胞中，該等方法包括：轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或其他已知的技術。所選擇的方法將是待使用的宿主細胞類型的部分功能。該等方法和其他適合的方法對於熟悉該項技術者是熟知的，並且列出在例如，在Sambrook等人，2001中。
當在適當條件下培養時，宿主細胞合成抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段隨後可從培養基(如果宿主細胞將其分泌到培養基中)中收集或直接從產生它的宿主細胞中收集(如果係未分泌的)。合適的宿主細胞的選擇將取決於各種因素，例如所需的表現水平、活性所需或必需的多肽修飾(例如醣苷化或磷酸化)以及易於折疊成生物活性分子。
示例性宿主細胞包括原核生物細胞、酵母或高等真核細胞。原核生物宿主細胞包括真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿 菌科(Enterobacteriaceae )，如埃希氏桿菌屬(Escherichia )(例如大腸桿菌(E.coli ))、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia )、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏菌屬(Salmonella )(例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium ))、沙雷氏菌屬(Serratia )(例如，黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans ))、志賀氏菌屬(Shigella )以及芽孢桿菌屬(Bacillus )(如枯草芽孢桿菌(B.subtilis )和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis ))，假單胞菌屬(Pseudomonas )和鏈黴菌屬(Streptomyces )。真核微生物(如絲狀真菌或酵母)係用於重組多肽的合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通麵包酵母係在低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其他屬、種和菌株在本文中通常可獲得且是有用的，例如畢赤酵母屬(Pichia )(例如，畢赤酵母(P.pastoris ))粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces )、亞羅酵母屬(Yarrowia )；假絲酵母屬(Candida )；裡氏木黴(Trichoderma reesia )；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyces) ，例如許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；和絲狀真菌，例如像脈孢菌屬(Neurospora) 、青黴屬(Penicillium )、彎頸黴屬(Tolypocladium )以及麯黴屬(Aspergillus )宿主(例如，構巢麯黴(A.nidulans )和黑麯黴(A.niger ))。
用於表現醣苷化抗體和抗原結合片段的宿主細胞可以來源於多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體以及來自以下宿主的相應的許可性昆蟲宿主細胞，例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)，埃及伊蚊(Aedes aegypti )(蚊子)，白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)和家蠶(Bombyx mori )。用於轉染此類細胞的多 種病毒株係公開可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株。
脊椎動物宿主細胞還可以是合適的宿主，並且來自該等細胞的抗體和抗原結合片段的重組產生已成為常規程序。可用作表現的宿主的哺乳動物細胞系係本領域熟知的，並且包括但不限於可從美國種質保存中心(ATCC)獲得的永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括CHOK1細胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]77：4216,1980)；由SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系(亞殖株293或293細胞用於在懸浮培養中生長(Graham等人，J.Gen Virol.[普通病毒學雜誌]36：59，1977)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物學]23：243-251,1980)；猴腎細胞(CV1、ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.[紐約科學院年報]383：44-68,1982)；MRC 5細胞或FS4細胞；哺乳動物骨髓瘤細胞，以及許多其他的細胞系。在某些實施方式中，可以藉由確定哪些細胞系具有高表現水平並組成性地產生具有PAC1結合特性的抗體和抗原結合片段來選擇細胞系。在另一個實施方式中，可以選擇來自B細胞譜系的細胞系，該細胞系不產生其自身抗體但具有產生和分泌異源抗體的能力。在一些實施方式中，CHO細胞係較佳的宿主細胞，用於表現本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段。
用上述核酸或載體轉化或轉染宿主細胞以產生抗PAC1抗體或抗原結合片段，並在適當改進的常規營養介質中培養用於誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼所需的序列的基因。此外，具有由選擇性標記分離的轉錄單位的多拷貝的新穎的載體和經轉染的細胞系對抗體和抗原結合片段的表現特別有用。因此，本發明還提供了用於產生本文所述抗PAC1抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括在允許由一個或多個表現載體編碼的抗體或抗原結合片段表現的條件下，在培養基中培養包含本文所述的一個或多個表現載體的宿主細胞；以及從培養基或宿主細胞中回收抗體或抗原結合片段。
可以將用於產生本發明的該等抗體或抗原結合片段的宿主細胞在各種介質中進行培養。以下可商購的介質適用於培養宿主細胞：Ham's F10(西格瑪公司(Sigma))、極限必需培養基(MEM，西格瑪公司)、RPMI-1640(西格瑪公司)和達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM，西格瑪公司)。另外，在Ham等人，Meth.Enz.[酶學方法]58：44,1979；Barnes等人，Anal.Biochem.[分析生物化學]102：255,1980；美國專利案號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90103430；WO 87/00195；或美國專利登記號30,985中描述的可以用作宿主細胞的培養基的任何介質。任何該等介質都可以根據需要補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)；鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)；緩衝液(如HEPES)；核苷酸(如腺苷和胸苷)；抗生素(如建它黴素TM 藥物)；微量元素(被定義為通常以微莫耳範圍內的最終濃度存在的無機化合物)，以及葡萄糖或等效能源。還可以按熟悉該項技術者已知的適當濃度包含任何其他必需的補充劑。培養條件(例如溫度，pH等)係 先前與選擇用於表現的宿主細胞一起使用的那些條件，並且對於普通技術人員將是顯而易見的。
在培養宿主細胞後，抗體或抗原結合片段可以在細胞內、周質間隙中產生，或直接分泌到介質中。如果在細胞內產生抗體或抗原結合片段，作為第一步驟，例如藉由離心或超濾去除宿主細胞或裂解的片段的顆粒狀碎片。使用以下來純化抗體或抗原結合片段：例如，羥磷灰石層析、陽離子或陰離子交換層析法、或較佳的是親和層析，使用一種或多種目的抗原或蛋白A或蛋白G作為親和力配位基。可以將蛋白A用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈的包含多肽的蛋白質(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.[免疫學方法雜誌]62：1-13,1983)。蛋白G被推薦用於所有小鼠同種型和人γ3(Guss等人，EMBO J.[歐洲分子生物學學會雜誌]5：1567-1575,1986)。親和配位基所附接的基質通常是瓊脂糖，但也可以使用其他基質。機械穩定的基質，例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，與用瓊脂糖相比，可以實現更快的流速和更短的加工時間。當蛋白質包含CH3結構域時，Bakerbond ABX樹脂(J.T.Baker，菲力浦斯堡，新澤西州)可用於純化。用於蛋白質純化的其他技術如乙醇沈澱、反相HPLC、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沈澱也是可能的，這取決於待回收的特定抗體或抗原結合片段。
在某些實施方式中，本發明提供了組成物(例如，藥物組成物)，該組成物包含一種或多種本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段(例如，抗PAC1單株抗體或其結合片段)以及藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。該藥物組成物可用於本文所述的任何方法中。本發明的藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾的組成物。“藥學上可接受的”係指在給予人的劑量和濃度下對人類接受者無毒和/或在給予人時不產生過敏或不良反應的分子、化合物和組成物。在 一些實施方式中，藥物組成物可含有用於改變、維持或保存組成物的以下特性的配製物材料：例如pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透。在這樣的實施方式中，適合的配製物材料包括但不限於胺基酸(如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝液(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；填充劑(如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單糖；二糖；和其他糖類(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽抗衡離子(如鈉)；防腐劑(如羥基氯苯胺、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(如普朗尼克類(pluronic)、PEG、去水山梨醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、氚核、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(如鹼金屬鹵化物、較佳的是氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨糖醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或藥用物佐劑。用於配製用於治療用途之分子的方法和適合的材料在製藥領域中是已知的，並進行了描述，例如，在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明頓的藥物科學]，第18版，(A.R.Genrmo，編輯),1990，馬克出版公司(Mack Publishing Company)。
在一些實施方式中，本發明的藥物組成物包含標準藥物載體，例如無菌磷酸鹽緩衝鹽水溶液，抑菌水等。可以使用多種水性載體，例如水、緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸等，並且可以包括用於增強穩定性的經受溫和的化學修飾等的其他蛋白質，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。
在配製物中該等抗體或抗原結合片段的示例性濃度可以在從約0.1mg/ml至約200mg/ml、或從約0.1mg/mL至約50mg/mL、或從約0.5mg/mL至約25mg/mL、或可替代地從約2mg/mL至約10mg/mL的範圍中。抗體或抗原結合片段的水性配製物可以在pH-緩衝溶液中製備，例如，在從約4.5至約6.5、或從約4.8至約5.5、或可替代地約5.0的pH範圍內。適合於該範圍內的pH的緩衝劑的實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽和其他有機酸緩衝劑。緩衝液濃度可以是約1mM至約200mM，或約10mM至約60mM，這取決於例如緩衝液和配製物的所需等滲性。
張度劑也可以包含在配製物中，可穩定抗體或抗原結合片段。示例性張度劑包括多元醇，例如甘露醇、蔗糖或海藻糖。較佳的是水性配製物係等滲的，儘管高滲或低滲溶液可能是合適的。配製物中多元醇的示例性濃度可以在從約1%至約15% w/v的範圍內。
還可以將表面活性劑添加到配製物中以減少配製的抗體或抗原結合片段的聚集和/或使製劑中顆粒的形成最小化和/或減少吸附。示例性表面活性劑包括非離子表面活性劑，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。表面活性劑的示例性濃度可以在從約0.001%至約0.5%、或從約0.005%至約0.2%、或可替代地從約0.004%至約0.01% w/v的範圍。
在一個實施方式中，配製物含有上述試劑(即，抗體或抗原結合片段、緩衝劑、多元醇和表面活性劑)，並且基本上不含一種或多種防腐劑(例如苯甲醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇和氯化本索寧)。在另一個實施方式中，防腐劑可以包含在配製物中，例如按從約0.1%至約2%、或可替代地從約0.5%至約1%的範圍內的濃度。一個或多個其他藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(如在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明頓的藥物科學]，第18版(A.R.Genrmo，編輯),1990，馬克出版公司(Mack Publishing Company)中描述的那些)可包括在配製物中，條件係它們不會不利地影響配製物的所需特性。
藉由將具有所需純度的抗體或抗原結合片段與視需要的生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明頓的藥物科學]，第18版，(A.R.Genrmo，編輯),1990，馬克出版公司(Mack Publishing Company))以凍乾配製物或水溶液的形式混合，製備抗體或抗原結合片段的治療配製物用於儲存。在所用的劑量和濃度下，可接受的載體、賦形劑或穩定劑對接受者無毒，並且包括以上描述的那些，如緩衝劑(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸)；抗氧化劑(例如抗壞血酸和甲硫胺酸)；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨、六甲基氯化銨、羥基氯苯胺、氯化本索寧、苯酚、丁醇或苄醇、對羥基苯甲酸烷基酯(如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)；兒茶酚；間苯二酚，環己醇，3-戊醇和間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)的多肽；蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮)；胺基酸(例如，甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸)；單糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或糊精)；螯合劑，如EDTA；糖類(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖 醇)；成鹽抗衡離子(如鈉)；金屬錯合物(例如，鋅-蛋白質配合物)；和/或非離子型表面活性劑，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆188)；或聚乙二醇(PEG)。
在一個實施方式中，本發明的適合的配製物含有等滲緩衝劑(如磷酸鹽、乙酸鹽或TRIS緩衝劑)，與張力劑(例如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化鈉)組合，該配製物具有張力和穩定作用。這樣的張度劑的一個實例係5%山梨糖醇或蔗糖。此外，該配製物可視需要包含例如按0.01%至0.02% wt/vol的表面活性劑，以防止聚集或改進穩定性。該配製物的pH可以在從4.5至6.5或4.5至5.5的範圍內。針對抗體和抗原結合片段的藥物配製物的其他示例性描述可以在美國專利公開案號2003/0113316和美國專利案號6,171,586中發現，該等申請各自藉由引用以其全部內容併入本文。
用於體內給予的配製物必須是無菌的。本發明的組成物可以藉由常規的，眾所周知的滅菌技術滅菌。例如，藉由無菌過濾膜過濾可以容易地完成滅菌。所得溶液可以被包裝使用或在無菌條件下過濾並凍乾，凍乾製劑在給予前與無菌溶液組合。
冷凍乾燥的過程通常用於穩定多肽以長期儲存，特別是當多肽在液體組成物中相對不穩定時。凍乾循環通常由三個步驟組成：冷凍、初步乾燥和二次乾燥(參見Williams和Polli,Journal of Parenteral Science and Technology[腸外科學與技術雜誌]，第38卷，第2期，第48-59頁，1984)。在冷凍步驟中，將溶液冷卻直至其充分冷凍。溶液中的大量水在此階段形成冰。冰在初級乾燥階段昇華，其藉由使用真空將腔室壓力降低至低於冰的蒸氣壓來進行。最後，在減壓室壓力和升高的擱板溫度下，在二次乾燥階段除去吸附水或結合水。該過程產生被稱為凍乾餅的材料。此後，該凍乾餅可 在使用前重構。凍乾材料的標準重構操作係反加一定體積的純水(通常相當於凍乾過程中去除的體積)，儘管抗菌劑的稀釋溶液有時被用於製備用於腸胃外給予的藥物(參見Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy[藥品開發與工業製藥]，第18卷：1311-1354,1992)。
在某些情況下，已經注意到賦形劑可作為冷凍乾燥產品的穩定劑(參見Carpenter等，第74卷：225-239,1991)。例如，已知的賦形劑包括多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)；糖類(包括葡萄糖和蔗糖)和胺基酸(包括丙胺酸、甘胺酸和穀胺酸)。此外，多元醇和糖也經常用於保護多肽免受冷凍和乾燥誘導的損傷，並增強在乾燥狀態下儲存期間的穩定性。通常，糖(特別是二糖)在冷凍乾燥過程和儲存期間都是有效的。其他分子的類別，包括單糖和二糖以及聚合物(如PVP)，也已被報導為凍乾產品的穩定劑。
對於注射，藥物配製物和/或藥物可以是適合用如上所述的適當溶液重構的粉末。該等的實例包括但不限於冷凍乾燥、旋轉乾燥或噴霧乾燥的粉末；無定形粉末；顆粒；沈澱物或顆粒。對於注射，配製物可視需要包含穩定劑、pH調節劑、表面活性劑、生物利用度調節劑和該等的組合。
可以製備持續釋放的製劑。持續釋放的製劑的適合的實例包括含有抗體或抗原結合片段的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質處於成型製品的形式(例如薄膜或微膠囊)。持續釋放的基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利案號3,773,919)、L-穀胺酸和乙基-L-穀胺酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如Lupron DepotTM (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球))以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物(如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的)能夠釋放分子超 過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質的時間更短。當封裝的多肽長時間保留在體內時，它們可能由於暴露於37℃的水分而變性或聚集，導致生物活性的喪失和免疫原性可能的變化。可以根據所涉及的機理設計合理的策略以實現穩定。例如，如果發現聚集機理係藉由硫代-二硫化物交換的分子間S-S鍵形成，則可以藉由改變巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制水分含量、使用適當的添加劑以及開發特定聚合物基質組成物來實現穩定化。
如本文所述，本發明的配製物可以被設計為短效、快速釋放、長效或持續釋放。因此，藥物配製物也可以配製用於控釋或緩釋。
具體的劑量可根據待治療的疾病、病症或病狀(例如發作性偏頭痛、慢性偏頭痛或叢集性頭痛)；受試者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；劑量間隔；給藥途徑；排泄率和藥物組合進行調整。
本發明的該等抗PAC1抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式給予，包括腸胃外、皮下、靜脈內、腹膜內、肺內和鼻內，並且如果需要用於局部治療，病灶內給藥。腸胃外給藥包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或皮下給藥。另外，抗體或抗原結合片段適合藉由脈衝輸注給藥，特別是用遞減劑量的抗體或抗原結合片段給藥。較佳的是，藉由注射給予給藥，最較佳的是靜脈內或皮下注射，部分取決於給藥係短暫的還是慢性的。考慮了其他給藥方法，包括局部給藥，特別是透皮給藥、經黏膜給藥、直腸給藥、口服給藥或所在地給藥(例如藉由放置在靠近所需部位的導管)。本發明的抗體或抗原結合片段可以在生理溶液中以0.01mg/kg至100mg/kg之間的劑量範圍，按從每日至每週至每月的頻率範圍給予。
本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段用於在有需要的患者中治療或緩解與PAC1受體的生物活性相關的病情中是有用的。因此，本 文揭露了用於在治療方法中使用的本發明的抗PAC1抗體和抗原結合片段。術語“患者”包括人類患者，並且可與術語“受試者”互換地使用。如本文使用的，術語“治療(treating或treatment)”係為了預防疾病的發展或改變疾病的病理而進行的干預。因此，“治療”係指治療性治療和預防性或防禦性措施。需要治療的患者包括已經診斷患有或患有病症或病狀的患者以及需要預防病症或病狀的患者。“治療”包括改善損傷、病理或病狀的任何成功的標誌，包括任何客觀或主觀的參數，例如減少、緩解、減輕症狀，或使損傷、病理或病症對患者更可忍受，減緩退化或衰退的速度，使退化的終點更弱，或改善患者的身心健康。症狀的治療或改善可以基於客觀或主觀參數，包括身體檢查的結果、患者的自我報告、神經精神檢查、和/或精神病學評估。
因此，在一些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中治療或預防與PAC1受體的生物活性相關的病情(例如，與PACAP誘導的PAC1受體的激活相關的病情)的方法，該方法包括向該患者給予有效量的本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。PACAP/PAC1訊號傳導途徑已經涉及各種生理過程，包括心血管功能、代謝和內分泌功能、炎症、應激反應、血管舒縮張力的調節和自主神經系統的調節，特別是交感神經系統和副交感神經系統之間的平衡。參見，例如，Tanida等人，Regulatory Peptides[調節肽]，第161卷：73-80,2010；Moody等人，Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.[內分泌學、糖尿病和肥胖症的新見]，第18卷：61-67,2011；和Hashimoto等人，Current Pharmaceutical Design[當代藥物設計]，第17卷：985-989,2011。與PACAP/PAC1訊號傳導途徑的異常或過度激活相關的病情包括但不限於，頭痛病況，如偏頭痛、叢集性頭痛、緊張型頭痛、偏癱性偏頭痛、和視網膜性偏頭痛；炎性皮膚病症；慢性疼痛，如神經性疼痛； 焦慮障礙腸道易激綜合症；以及血管舒張症狀，如熱潮紅、面部潮紅、出汗和盜汗。因此，可以將本發明的該等抗PAC1抗體及其抗原結合片段給予患者以預防、改善或治療任何與異常或過量的PAC1受體生物活性相關的該等病症或障礙或其他病症。在某些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中治療或預防頭痛病況(例如，發作性偏頭痛、慢性偏頭痛、叢集性頭痛、緊張型頭痛、偏癱性偏頭痛和視網膜性偏頭痛)之方法，該方法包括向該患者給予本文所述的有效量的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，本發明提供了在患有頭痛病況的患者中用於抑制人PAC1受體的激活之方法，該方法包括向患者給予有效量的本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。在一個實施方式中，該患者患有偏頭痛的頭痛病況(如發作性偏頭痛或慢性偏頭痛)。在另一個實施方式中，該患者患有叢集性頭痛病況。
“有效量”通常是由特定條件產生或與特定條件相關的足以降低症狀的嚴重性和/或頻率、消除症狀和/或潛在原因、預防症狀和/或其潛在原因的發生、和/或改善或補救損害的量。在一些實施方式中，有效量係治療有效量或預防有效量。“治療有效量”係足以治療疾病狀態或一種或多種症狀的量，特別是與疾病狀態相關的狀態或一種或多種症狀，或以其他方式預防、阻礙、延緩或逆轉疾病狀態或以任何方式與疾病相關的任何其他不良症狀(即提供“治療功效”)的進展。“預防有效量”係當給予受試者時將具有預期的預防效果的抗體或抗原結合片段的量，例如，預防或延遲病症的發作(或復發)，或減少病症發作(或復發)的可能性。完整的治療或預防效果不一定藉由一個劑量的給藥而出現，而是可以僅在一系列劑量的給藥之後出現。因此，可按一次或多次給藥的形式給予治療或預防的有效量。
在某些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中抑制血管舒張的方法，該方法包括向患者給予有效量的本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。PAC1受體的配位基(如PACAP38和VIP)，係有效的血管擴張劑，並阻斷該等配位基與PAC1受體的結合可以抑制血管舒張，並且改善與異常或過度血管舒張相關的病況(如頭痛病況、熱潮紅和潮紅)。在一個實施方式中，該患者患有頭痛病況(如偏頭痛或叢集性頭痛)。在另一個實施方式中，該患者患有血管舒張症狀(例如，熱潮紅、面部潮紅、出汗或盜汗)。在相關的實施方式中，該患者患有與更年期相關的血管舒張症狀。
在本發明的方法的一些實施方式中，待治療、預防或改善的頭痛病況係偏頭痛。因此，本發明包括用於在有需要的患者中治療、預防或緩解偏頭痛的方法，該方法包括向該患者給予有效量的本文所述抗PAC1抗體或其抗原結合片段。偏頭痛係持續約4至約72小時的復發性頭痛，其特徵在於單側、搏動、和/或中度至重度疼痛、和/或由身體活動加劇的疼痛。偏頭痛常伴有噁心、嘔吐、和/或對光(畏光)、聲音(懼音症)或氣味敏感。在一些患者中，先兆在偏頭痛發作之前。先兆通常是表明頭痛很快就會發生的視覺、感覺、語言或運動障礙。本文所述的方法預防、治療或改善人患者中存在和不存在先兆的偏頭痛的一種或多種症狀。
PACAP38，藉由其受體的激活誘導血管舒張，尤其是硬腦膜血管系統的血管舒張(Schytz等人，Neurotherapeutics[神經治療學]，第7卷(2)：191-196,2010)。特別地，PACAP38/PAC1受體訊號級聯放大與偏頭痛病理生理學有關(Amin等人，Brain[腦]，第137卷：779-794,2014)。PACAP38(相比VPAC1和VPAC2受體，對PAC1受體具有更高的親和力)的輸注引起偏頭痛患者的偏頭痛樣頭痛(Schytz等人，Brain[腦]，132：16-25,2009； Amin等人，Brain[腦]，第137卷：779-794,2014；Guo等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第37卷：125-135,2017)。此外，在患有偏頭痛發作的患者的顱內循環中PACAP38水平升高，並且在使用曲坦類治療偏頭痛症狀後PACAP38水平降低(Tuka等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第33卷，1085-1095,2013；Zagami等人，Ann.Clin.Transl.Neurol.[臨床和轉化神經病學年鑒]，第1卷：1036-1040,2014)。該等報告表明，PACAP38的內源性釋放係偏頭痛的重要觸發因素，並且其作用主要藉由PAC1受體的激活介導。
在一些實施方式中，根據本發明的方法治療的患者具有、患有或被診斷患有發作性偏頭痛。當具有偏頭痛病史(例如，至少五次偏頭痛的終生發作)的患者每月有14個或更少個偏頭痛日時，診斷出發作性偏頭痛。“偏頭痛日”包括患者經歷“偏頭痛”的發作、持續或復發的任何日曆天數，其中有或沒有持續超過30分鐘的先兆。“偏頭痛”係與噁心或嘔吐或對光或聲音有關的頭痛，和/或特徵在於以下的疼痛特徵中至少兩種的頭痛：單側疼痛、搏動性疼痛、中度至重度疼痛強度，或因身體活動而加劇的疼痛。在某些實施方式中，具有、患有或被診斷患有發作性偏頭痛的患者每月有至少4個，但小於15個偏頭痛日。在相關的實施方式中，具有、患有或被診斷患有發作性偏頭痛的患者平均每月有少於15個頭痛日。如本文使用的，“頭痛日”係患者經歷如本文所定義的偏頭痛或任何持續超過30分鐘或需要急性頭痛治療的頭痛的任何日曆天數。
在某些實施方式中，根據本發明的方法治療的患者具有、患有或被診斷患有慢性偏頭痛。當偏頭痛患者(即至少五次終生發作偏頭痛的患者)每月有15個或更多個頭痛日且至少有8個頭痛日係偏頭痛日時，就診斷出慢性偏頭痛。在一些實施方式中，具有、患有或被診斷患有慢性偏頭痛的患者平均每月有15或更多偏頭痛日。在本文所述方法的某些實施方式 中，給予本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段預防、減少或延遲患者中發作性偏頭痛向慢性偏頭痛的進展。
在一些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中治療、預防或緩解叢集性頭痛之方法，該方法包括向該患者給予有效量的本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段。叢集性頭痛係一種病症，其最重要的特徵係頭部一側復發的嚴重性頭痛，通常在眼睛周圍(參見Nesbitt等人，BMJ[英國醫學雜誌]，第344卷：e2407,2012)。叢集性頭痛經常週期性地發生：疼痛的自發性緩解中斷活躍期。叢集性頭痛通常伴有顱內自主神經症狀，例如流淚、鼻塞、眼瞼下垂、瞳孔收縮、面部發白、出汗和眼周腫脹，通常局限於具有疼痛的頭部一側。叢集性頭痛發作的平均年齡係約30-50歲。叢集性頭痛在男性中更為普遍，其中男性與女性比例為約2.5：1至約3.5：1。蝶齶神經節(SPG)刺激已被用於治療叢集性頭痛。神經刺激系統向SPG提供低水平(但高頻率，生理阻斷)電刺激，已證明在最近的臨床試驗中有效緩解叢集性頭痛的急性衰弱性疼痛(參見Schoenen J,等人，Cephalalgia[頭痛雜誌]，第33卷(10)：816-30,2013)。鑒於該證據並且因為PACAP係SPG中的主要神經遞質之一，預期用本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段抑制PACAP/PAC1訊號傳導具有在治療人叢集性頭痛中具有功效。
與PACAP/PAC1訊號傳導途徑相關的可以根據本發明的方法治療的其他病症包括但不限於，炎性皮膚病症(如酒糟鼻(參見美國專利公開案號20110229423))、慢性疼痛綜合症(如神經性疼痛(參見Jongsma等人，Neuroreport[神經學報告]，第12卷：2215-2219,2001；Hashimoto等人，Annals of the New York Academy of Sciences[紐約科學院年報]，第1070卷：75-89,2006))、緊張型頭痛、偏癱性偏頭痛、視網膜性偏頭痛、焦慮障礙(如創傷後壓力疾患(參見Hammack和May,Biol.Psychiatry[生物精神病 學]，第78卷(3)：167-177,2015))、腸道易激綜合症，以及血管舒張症狀(例如，熱潮紅、面部潮紅、出汗和盜汗)，如與更年期相關的那些症狀。在一個實施方式中，藉由給予本發明的抗PAC1抗體或其抗原結合片段治療的病狀係慢性疼痛。在另一個實施方式中，藉由給予本發明的抗PAC1抗體或其抗原結合片段治療的病狀係神經性疼痛。
在本文所述的任何方法中，治療可以包括預防性治療。預防性治療係指在病症發作或發作之前(例如在偏頭痛發作或叢集性頭痛偶發之前)進行的治療，以減少患者中的症狀(例如偏頭痛或叢集性頭痛)的頻率、嚴重性和/或長度。
在一些實施方式中，用於治療或預防患者中頭痛病況的本發明的方法包括向患者給予本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段與適合用於急性或預防性治療本文所述的偏頭痛或其他頭痛障礙的一個或多個試劑的組合。如本文使用的，術語“組合療法”涵蓋以順序方式(即，每種化合物以任何順序在不同時間給予)給予兩種化合物(例如，抗PAC1抗體和另外的藥劑)以及以基本上同時的方式給予兩種化合物。基本上同時給予包括同時給予並且可以藉由給予包含兩種化合物的單個配製物(例如包含兩種化合物的固定比例的單個配製物或具有每種化合物的固定比例的預填充注射器)或同時給予包含每種化合物的單獨配製物來實現。因此，在某些實施方式中，本發明的該等方法包括將本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段與第二頭痛治療劑一起給予。
在某些實施方式中，該第二頭痛治療劑可以是用於頭痛或偏頭痛的急性治療的急性頭痛治療劑。在一些實施方式中，該急性頭痛治療劑係血清素(5-羥色胺；5-HT)受體激動劑，例如5HT1受體激動劑。該急性頭痛治療劑可以是5HT1B 、5HT1D 和/或5HT1F 血清素受體的激動劑。這樣的血 清素受體激動劑包括但不限於，曲坦類(例如，阿莫曲坦)(almotriptan)、夫羅曲坦(frovatriptan)、利紮曲坦(rizatriptan)、舒馬曲坦(sumatriptan)、那拉曲坦(naratriptan)、依立曲坦(eletriptan)和佐米曲坦(zolmitriptan))；麥角胺(例如，雙氫麥角胺和酒石酸麥角胺)，和5HT1F -選擇性血清素受體激動劑(如拉司米地坦(lasmiditan))。其他合適的急性頭痛治療劑包括非甾體抗炎藥(例如乙醯水楊酸、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)和雙氯芬酸(diclofenac))和類鴉片物質(例如可待因、嗎啡、氫可酮(hydrocodone)、太尼(fentanyl)、哌替啶(meperidine)和羥考酮(oxycodone))。在一個實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的急性頭痛治療劑係曲坦。在另一個實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的急性頭痛治療劑係麥角胺。在又另一個實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的急性頭痛治療劑係非甾體抗炎藥。在仍另一個實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予的急性頭痛治療劑係類鴉片物質。
在一些實施方式中，第二頭痛治療劑係用於頭痛或偏頭痛的預防性治療的預防性頭痛治療劑。在一個實施方式中，該預防性頭痛治療劑三抗癲癇藥，如雙丙戊酸鈉、丙戊酸鈉、丙戊酸、托吡酯(topiramate)或加巴噴丁(gabapentin)。在另一個實施方式中，該預防性頭痛治療劑係β-受體阻滯劑，如普萘洛爾(propranolol)、噻嗎洛爾(timolol)、阿替洛爾(atenolol)、美托洛爾(metoprolol)或納多洛爾(nadolol)。在又另一個實施方式中，該預防性頭痛治療劑係抗抑鬱劑，如三環抗憂鬱藥(例如，阿米替林(amitriptyline)、去甲替林(nortriptyline)、多塞平(doxepin) 和氟西汀(fluoxetine))。在仍另一個實施方式中，該預防性頭痛治療劑係肉毒桿菌素A。
在某些實施方式中，本發明的方法包括給予本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段與降鈣素基因相關肽(CGRP)訊號傳導途徑(即，由CGRP配位基抑制CGRP受體的激活或訊號傳導)的拮抗劑。例如，在有需要的患者中可以將本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段與CGRP途徑拮抗劑組合給予來治療或預防頭痛病況(例如，偏頭痛或叢集性頭痛)。在一些實施方式中，該CGRP途徑拮抗劑係人CGRP受體的拮抗劑。CGRP受體拮抗劑包括CGRP受體的小分子抑制劑，例如在以下描述的那些：美國專利申請案號20060142273和美國專利案號7,842,808；7,772,244；7,754,732；7,569,578；8,685,965；8,569,291；8,377,955；8,372,859；8,143,266；7,947,677；和7,625,901，其全部藉由引用以其全部內容併入本文中。CGRP受體拮抗劑還可以包括受體的肽拮抗劑，如在美國專利案號8,168,592中描述的那些，其藉由引用以其全部內容併入本文。在某些實施方式中，與本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段一起給予的CGRP受體拮抗劑係特異性地結合人CGRP受體的單株抗體，如在美國專利案號9,102,731和美國專利公開案號20160311913中描述的抗體，這二者藉由引用以其全部內容併入本文。在本發明的方法的一個具體的實施方式中，本文所述的抗PAC1抗體或其抗原結合片段與抗CGRP受體單株抗體組合給予來治療或預防患者的頭痛病況(例如，偏頭痛或叢集性頭痛)，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO：502的序列(以下提供的序列)的輕鏈可變區以及包含SEQ ID NO：503的序列(以下提供的序列)的重鏈可變區。在本發明的方法的另一個具體的實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段組合給予以 治療或預防的頭痛病況(例如，偏頭痛或叢集性頭痛)的抗CGRP受體單株抗體係厄瑞奴單抗。
示例性抗CGRP受體單株抗體的輕鏈可變區序列：
Figure 108101085-A0202-12-0188-98
Figure 108101085-A0202-12-0188-99
(SEQ ID NO：502)
示例性抗CGRP受體單株抗體的重鏈可變區序列：
Figure 108101085-A0202-12-0188-100
Figure 108101085-A0202-12-0188-101
(SEQ ID NO：503)
在一些實施方式中，與本發明的抗PAC1抗體或抗原結合片段一起給予的以治療或預防患者的頭痛病況(例如，偏頭痛或叢集性頭痛)的CGRP途徑拮抗劑係CGRP配位基的拮抗劑。CGRP配位基拮抗劑可以是誘餌或可溶性CGRP受體或與CGRP配位基結合的其他蛋白質(如抗CGRP配位基抗體)。抗CGRP配位基抗體係本領域已知的，並且描述於例如，在WO 2007/054809；WO 2007/076336；WO 2011/156324；和WO 2012/162243中，其全部均藉由引用以其全部內容併入本文。在某些實施方式中，與本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段一起給予的CGRP配位基拮抗劑係特異性地結合人α-CGRP和/或人β-CGRP的單株抗體。在一個實施方式中，該抗CGRP配位基抗體係瑞瑪奈珠單抗。在另一個實施方式中，該抗CGRP配位基抗體係伽奈珠單抗。在又另一個實施方式中，該抗CGRP配位基抗體係依普奈珠單抗。
本發明還包括抗PAC1抗體和抗原結合片段在本文揭露的任何方法中的用途。例如，在某些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患 者中治療或預防頭痛病況的方法中使用的本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段。在一些這樣的實施方式中，該頭痛病況係偏頭痛。該偏頭痛可以是發作性偏頭痛或慢性偏頭痛。在其他實施方式中，該頭痛病況係叢集性頭痛。在一些實施方式中，用於治療或預防頭痛病況的方法包括將第二頭痛治療劑與抗PAC1抗體或其抗原結合片段組合給予。在一個實施方式中，該第二頭痛治療劑係急性頭痛治療劑，如5HT1B 、5HT1D 和/或5HT1F 血清素受體拮抗劑(例如，曲坦或麥角胺)、非甾體抗炎藥或類鴉片物質。在另一個實施方式中，該第二頭痛治療劑係預防性頭痛治療劑，如抗癲癇藥、β-受體阻滯劑、抗抑鬱劑、肉毒桿菌素A、或CGRP途徑拮抗劑。在一些實施方式中，該CGRP途徑拮抗劑係人CGRP受體拮抗劑。在一個具體的實施方式中，該人CGRP受體拮抗劑係特異性地結合人CGRP受體的單株抗體，如厄瑞奴單抗(erenumab)。在其他實施方式中，該CGRP途徑拮抗劑係CGRP配位基的拮抗劑，如特異性地結合人α-CGRP和/或人β-CGRP的單株抗體。在某些實施方式中，該抗CGRP配位基抗體係瑞瑪奈珠單抗、伽奈珠單抗或依普奈珠單抗。
在一些實施方式中，本發明提供了用於在有需要的患者中抑制血管舒張的方法中使用的本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段。在這樣的實施方式中，該患者可以被診斷為具有或患有頭痛病況，如偏頭痛(例如，發作性或慢性偏頭痛)或叢集性頭痛。在其他實施方式中，本發明提供了用於在患有頭痛病況的患者中抑制人PAC1受體激活之方法中使用的本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段。該頭痛病況可以是偏頭痛(例如，發作性或慢性偏頭痛)或叢集性頭痛。
特別考慮了抗PAC1抗體或其抗原結合片段用於製備根據本文揭露的任何方法進行給予的藥物的用途。例如，在一些實施方式中，本發明 涵蓋本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段在製備用於治療或預防有需要的患者的頭痛病況的藥物中的用途。在一些這樣的實施方式中，該頭痛病況係偏頭痛。該偏頭痛可以是發作性偏頭痛或慢性偏頭痛。在其他實施方式中，該頭痛病況係叢集性頭痛。在某些實施方式中，該抗PAC1抗體或其抗原結合片段被配製為與第二頭痛治療劑一起給予。在一個實施方式中，該第二頭痛治療劑係急性頭痛治療劑，如5HT1B 、5HT1D 和/或5HT1F 血清素受體拮抗劑(例如，曲坦或麥角胺)、非甾體抗炎藥或類鴉片物質。在另一個實施方式中，該第二頭痛治療劑係預防性頭痛治療劑，如抗癲癇藥、β-受體阻滯劑、抗抑鬱劑、肉毒桿菌素A、或CGRP途徑拮抗劑。在一些實施方式中，該CGRP途徑拮抗劑係人CGRP受體拮抗劑。在一個具體的實施方式中，該人CGRP受體拮抗劑係特異性地結合人CGRP受體的單株抗體，如厄瑞奴單抗。在其他實施方式中，該CGRP途徑拮抗劑係CGRP配位基的拮抗劑，如特異性地結合人α-CGRP和/或人β-CGRP的單株抗體。在某些實施方式中，該抗CGRP配位基抗體係瑞瑪奈珠單抗(fremanezumab)、伽奈珠單抗(galcanezumab)或依普奈珠單抗(eptinezumab)。
在一些實施方式中，本發明包括本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段在製備用於在有需要的患者中抑制血管舒張的藥物中的用途。在這樣的實施方式中，該患者可以被診斷為具有或患有頭痛病況，如偏頭痛(例如，發作性或慢性偏頭痛)或叢集性頭痛。在其他實施方式中，本發明包括本文所述的抗PAC1抗體或抗原結合片段在製備用於在患有頭痛病況的患者中抑制人PAC1受體激活的藥物中的用途。該頭痛病況可以是偏頭痛(例如，發作性或慢性偏頭痛)或叢集性頭痛。
本發明的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段也可用於檢測生物樣品中人PAC1和鑒定表現人PAC1的細胞或組織。例如，該等抗PAC1抗體和 抗原結合片段可用於診斷測定，例如檢測和/或定量組織或細胞中表現的PAC1的免疫測定。此外，本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可用於抑制PAC1與PACAP形成複合物，從而調節細胞或組織中PAC1的生物活性。這種生物活性包括細胞內cAMP的升高和血管舒張。
本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可用於診斷目的，以檢測、診斷或監測與PAC1相關的疾病和/或病症，包括偏頭痛、叢集性頭痛和焦慮障礙(如創傷後壓力疾患)。還提供了使用熟悉該項技術者已知的經典免疫組織學方法檢測樣品中PAC1的存在的方法(例如，Tijssen,1993,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays[酶免疫測定的實踐與理論]，第15卷(R.H.Burdon和P.H.van Knippenberg編，愛思唯爾，阿姆斯特丹(Elsevier,Amsterdam))；Zola,1987,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques[單株抗體：技術手冊]，第147-158頁(CRC出版社公司)；Jalkanen等人，1985,J.Cell.Biol.[細胞生物學雜誌]101：976-985；Jalkanen等人，1987,J.Cell Biol.[細胞生物學雜誌]105：3087-3096)。可用於檢測PAC1存在的方法的實例包括使用本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段進行的免疫測定，如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和放射性免疫測定(RIA)。PAC1的檢測可以在體內或體外進行。
對於診斷應用，可以用可檢測的標記基團標記抗PAC1抗體或抗原結合片段。適合的標記基團包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)；螢光基團(例如，FITC、羅丹明、鑭系元素磷光體)；酶組(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光基團；生物素基基團；或由二級報告基因識別的預定多肽表位(例如，亮胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)。在一些實施方式中， 標記基團藉由各種長度的間隔臂與抗體或抗原結合片段偶聯，以減少潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法係本領域已知的並且可以使用。
在另一個實施方式中，本文所述的該等抗PAC1抗體和抗原結合片段可用於鑒定表現PAC1的一種或多種細胞。在一個具體的實施方式中，用標記基團標記抗體或抗原結合片段，並檢測標記的抗體或抗原結合片段與PAC1的結合。該等抗體或抗原結合片段還可以在生物樣品中用於免疫沈澱測定。在另外具體的實施方式中，抗體或抗原結合片段與PAC1的結合在體內檢測。在另外具體的實施方式中，該抗體或抗原結合片段係分離的並使用本領域已知的技術來測定。參見，例如，Harlow和Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual[抗體：實驗手冊]，紐約：冷泉港(New York：Cold Spring Harbor)(1991編和定期增刊)；John E.Coligan，編輯，1993,Current Protocols In Immunology[免疫學現代方法]紐約：約翰．威利父子出版公司(New York：John Wiley & Sons)。
以下實例，包括進行的實驗和實現的結果，僅用於說明目的，並不應解釋為限制所附申請專利範圍的範圍。
實例
實例1.人PAC1抗體的晶體結構-指導設計
確定了人PAC1的胞外結構域(ECD)與人抗PAC1中和抗體(29G4v9)的Fab片段之間複合物的晶體結構。將人PAC1 ECD和抗PAC1 Fab分開純化，並然後以1：1莫耳比複合在一起。該樣品隨後經凝膠過濾柱跑膠，在20mM TRIS(pH 7.5)、50mM NaCl、5mM EDTA中平衡，並濃縮至35mg/ml並過濾。
以下列出了Fab片段的重鏈(包含可變區(VH)、CH1恒定區、上鉸鏈和半胱天冬酶III切割位點)以及輕鏈(包含可變區(VL)和CL恒定區)的序列。以下提供了人PAC1 ECD構建體的序列，並且包含人PAC1(SEQ ID NO：1)的胺基酸26至143減去胺基酸89-109之間的區域。
29G4v9 Fab的重鏈的胺基酸序列(由以下構成：VH區(胺基酸：1-120)；CH1區(胺基酸：121-218)；上鉸鏈區(胺基酸219-221)，和半胱天冬酶III切割位點(222-226)：
Figure 108101085-A0202-12-0193-102
Figure 108101085-A0202-12-0193-103
(SEQ ID NO：2)
29G4v9 Fab的輕鏈的胺基酸序列(由以下構成：VL區(胺基酸：1-108)和CL區(胺基酸：109-214)：
Figure 108101085-A0202-12-0193-104
Figure 108101085-A0202-12-0193-105
(SEQ ID NO：3)
人PAC1 ECD構建體的胺基酸序列：
Figure 108101085-A0202-12-0193-106
Figure 108101085-A0202-12-0193-107
(SEQ ID NO：4)
經純化的人PAC1 ECD和抗PAC1 Fab最初使用坐滴式蒸汽擴散(sitting drop vapor diffusion)方法與可商購的篩共結晶。使用懸滴式蒸汽擴散法進一步擴展結晶條件(Qiagen MPD Suite Screen #61(134561))。在4℃下，將蛋白質和結晶緩衝液(0.1M檸檬酸、pH 4.0，40% MPD)按1：1以1μl懸滴於結晶緩衝液的儲器溶液中。棒狀晶體在幾周內形成。
晶體在作為低溫保護劑的結晶緩衝液中平衡，並在液氮中冷凍，運往勞倫斯伯克利國家實驗室(Lawrence Berkeley National Laboratories)進行數據收集。在ADSC-Q315r CCD檢測器(λ=1.000Å)在高級光源同步加速器波束線(Advanced Light Source Synchrotron Beamline)5.0.2上收集數據集。使用HKL2000(Otwinowski和Minor,Methods Enzymology[酶學方法]，第276卷，307-326,1997)整合數據並度量，並且99.8%完成至2.00Å，其中R合併 為0.081(98.0%完成最後的殼2.07-2.00Å，其中I/σ=2.35)。晶體屬於正交空間群P21 21 2，其中晶胞尺寸為a =65.2Å、b =177.9Å、c =53.8Å、α=90°、β=90°、γ=90°。使用PhaserMR藉由分子置換可以解析晶體結構(Winn等人，Acta Crystallogr.,Sect.D：Biol.Crystallogr.[晶體學報D輯：生物晶體學]，第67卷：235-242,2011)。使用專有的Fab結構作為解決抗PAC1 Fab組分的第一研究模型。隨後的分子置換使用PDBID：2JOD(Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]，第104卷：7875,2007)、人PAC1 ECD NMR結構作為初始模型來解決人PAC1 ECD組分。在不對稱的單元中存在一個ECD分子和一個Fab分子。使用Refmac5(Winn等人，Acta Crystallogr.,Sect.D：Biol.Crystallogr.[晶體學報D輯：生物晶體學]，第67卷：235-242,2011；Murshudov等人，Acta Crystallogr.,Sect.D：Biol.Crystallogr.[晶體學報D輯：生物晶體學]，第67卷：355-367,2011)和Phenix.refine(Adams等人，Acta Crystallogr.,Sect.D：Biol.Crystallogr.[晶體學報D輯：生物晶體學]， 第66卷：213-221,2010)將結構精製，並且使用製圖程式Coot進行模型建立(Emsley和Cowtan,Acta Crystallogr.,Sect.D：Biol.Crystallogr.[晶體學報D輯：生物晶體學],2004，第60卷：2126-2132,2004)。
人PAC1 ECD：抗PAC1 Fab複合物的結構被精製為2.00Å，其中R-因數為20%並且R自由 為23%。複合物的結構的前視圖和側視圖分別示出在圖1A和1B中。29G4v9 Fab和PAC1 ECD之間的相互作用由疏水、靜電和氫鍵相互作用組成。29G4v9 Fab和PAC1 ECD之間的相互作用具有對於抗體-抗原相互作用典型的隱藏表面積(1613Å2 )和形狀互補性值(0.695)。在29G4v9 Fab中在離非氫原子5Å或更小的距離處包含至少一個非氫原子的PAC1 ECD中的所有胺基酸被確定為係PAC1 ECD中的核心介面胺基酸。用PyMOL程式計算原子的距離(DeLano,W.L.The PyMOL Molecular Graphics System.[PyMOL分子製圖系統](帕洛阿爾托(Palo Alto),2002))。PAC1 ECD中的核心介面胺基酸包括：具有相對於SEQ ID NO：1的胺基酸位置號的Asp59、Asn60、Ile61、Arg116、Asn117、Thr119、Asp121、Gly122、Trp123、Ser124、Glu125、Pro126、Phe127、Pro128、His129、Tyr130、Phe131、Asp132和Gly135。
分析晶體結構中29G4v9 Fab和PAC1 ECD之間的介面以鑒定兩個分子之間的相互作用次優的區域。基於結構分析，設計輕鏈和重鏈可變區中胺基酸的突變以增強Fab和PAC1 ECD之間的該等區域中的相互作用來改進抗體的結合親和力和/或抑制效力。特別地，對Fab輕鏈和PAC1 ECD之間的相互作用的分析揭示了四個區域，其中Fab輕鏈中的突變可能改進與PAC1相互作用。在區1(含有PAC1 ECD胺基酸Glu120和Asp121的區域)中，提出了輕鏈CDR1(SEQ ID NO：3)中Gln27突變為賴胺酸、酪胺酸或精胺酸以提供更好的電荷互補性或與Glu120和Asp121 PAC1胺基酸的氫鍵 潛力(圖2A)。區2係具有正靜電勢的區域，並且提出了輕鏈CDR1(SEQ ID NO：3)中Ser28突變為穀胺酸以提供更好的電荷互補性(圖2A)。區3係含有PAC1 ECD Phe127殘基並具有氫鍵潛力的疏水區。輕鏈CDR1中的Gly30、Arg31和Ser32位於遠離區3的位置(圖2A)。因此，如下表6中總結的，在這三個位點處提出了多個突變，以改進這三個殘基與PAC1 ECD的該區之間的疏水或氫鍵相互作用。輕鏈CDR3中的Arg93坐落在具有負靜電勢的PAC1殘基的口袋中(區4；圖2B)。然而，由於幾何結構，Arg93與PAC1殘基不形成任何直接的氫鍵。提出了輕鏈CDR3中Arg93突變為穀胺醯胺、賴胺酸、組胺酸或天冬醯胺以提供與PAC1 ECD中的殘基的可替代的電荷互補性或氫鍵電勢(圖2B)。
對29G4v9 Fab重鏈和PAC1 ECD之間相互作用的分析揭示了三個主要的區域，其中Fab重鏈中的突變可以改進與PAC1 ECD的相互作用。如圖3A中所示，區5涵蓋PAC1胺基酸Phe131，並且可以被分成位於Phe131任一側的兩個亞區。重鏈CDR1中的Arg31和Phe32位於該等亞區中，並且提出該等位點處的突變以改進與PAC1 Phe131殘基的疏水相互作用或提供可替代的電荷互補性相互作用。參見表6突變的列表。在區6中，該區包括PAC1 ECD殘基Asn60和Ile61(相對於SEQ ID NO：1)，提出了重鏈CDR2殘基Tyr53、Asp54和Gly56的突變改進疏水相互作用或提供與Asn60和Ile61 PAC1殘基的可替代的氫鍵(圖3B)。在區7(具有疏水殘基和一些負靜電勢的區域)中，提出了如在表6中列出的重鏈CDR3殘基Val102、Leu103和Thr104的突變以改進疏水相互作用或提供可替代的氫鍵相互作用(圖3C)。
基於對Fab/PAC1 ECD複合物的晶體結構的分析，將提出改進抗PAC1抗體和人PAC1受體之間相互作用的特定突變的匯總提供在以下表6中。
Figure 108101085-A0202-12-0197-108
 1 相對於SEQ ID NO：3的輕鏈的胺基酸位置和相對於SEQ ID NO：2的重鏈的胺基酸位置。
除了藉由對如上所述的抗PAC1 Fab和人PAC1 ECD之間相互作用的胺基酸的分析而設計的突變之外，使用晶體結構還進行了電腦模拟親和力成熟分析以鑒定另外的突變來改進抗PAC1抗體的結合親和力和/或抑制效力。藉由目測上述複合物的晶體結構鑒定涉及與人PAC1 ECD的結合的29G4v9 Fab中的胺基酸殘基。選擇抗體的該等介面殘基用於除半胱胺酸之外的所有其他胺基酸的實質突變。藉由使用來自Biovia的Discovery Studio分子建模軟體計算特定殘基突變後結合自由能(△△G結合 )中的變化來評估突變對抗體/PAC1 ECD結合相互作用的影響。與親本分子相比，△△G結合的負值表明突變導致與PAC1 ECD的更強結合。該等計算確定了大約65個導致△△G結合負值的突變。基於用PAC1 ECD對該等變體的“建模”結構進行目測和分析，將這65個突變進一步縮小至50個(輕鏈18個和重鏈32 個)。基於結合自由能計算，預測增加抗體對PAC1的結合親和力的這50個突變匯總在下表7中。
Figure 108101085-A0202-12-0198-110
 1 相對於SEQ ID NO：3的輕鏈的胺基酸位置和相對於SEQ ID NO：2的重鏈的胺基酸位置。
與基於結構的分析相比，電腦模拟方法導致在根據不同的胺基酸以及輕鏈和/或重鏈內不同位置方面鑒定另外的突變。
藉由重組生產將該實例中描述的突變摻入抗PAC1抗體中，並在如本文實例3中所述的體外基於細胞的測定中測試抑制PACAP誘導的人PAC1激活的能力。
實例2. 29G4v10人PAC1抗體的酵母展示親和力成熟
親和力成熟的一種有效方法涉及構建酵母展示抗體Fab突變體文庫，並藉由螢光輔助細胞分選(FACS)選擇改進的結合物(圖4)。為產生具有改進的抑制效力的抗PAC1抗體，藉由酵母展示Fab文庫的FACS將29G4v10抗體(SEQ ID NO：191的VH區；SEQ ID NO：52的VL區)進行親和力成熟化。文庫設計由人PAC1 ECD和29G4v9 Fab之間的複合物的實例1中描述的經解析的共晶結構引導，其該複合物的CDR與29G4v10的CDR幾乎相同。結構分析最初分別在輕鏈(LC)和重鏈(HC)內鑒定了六個和七個CDR位置用於誘變，並且提出了用於親和力增強的策略。突變體被設計為以改善疏水相互作用和電荷互補性，並在介面上提供交替的氫鍵相互作用。參見實例1。該等點突變體發起了一種工程方法，該方法涉及生產的反覆運算輪次、表徵和有益突變的合理組合。酵母文庫設計試圖藉由更全面地探索13個位置中的突變組合並在每個所選位置處增加多樣化策略來補充實例1中描述的線性方法。
藉由製作單獨的LC和HC文庫，理論上的多樣性被保持在可掌控的<107 的大小。設計LC文庫以在六個選定位置中的五個(SEQ ID NO：52的Gln27、Gly30、Arg31、Ser32和Arg93)處利用MIX19飽和誘變。MIX19代表編碼除半胱胺酸外的所有胺基酸的三聚體亞磷醯胺(密碼子)混合物。在剩餘的輕鏈位置(SEQ ID NO：52的Ser28)處，使用針對絲胺酸、穀胺酸、丙胺酸或終止密碼子的突變。為探索在一個文庫中的所有七個HC位置(SEQ ID NO：191的Arg31、Phe32、Tyr53、Gly56、Val102、Leu103和Thr104)，我們設計了九個密碼子的常規混合物(MIX9)用於在七個重鏈CDR的五個位置處(SEQ ID NO：191的Arg31、Phe32、Tyr53、Val102和Leu103)多樣化。常規的MIX9包含疏水胺基酸、鹼性胺基酸、和氫鍵供體 和受體(例如，F、L、Y、M、Q、H、K、R和S)。重要的是，常規的MIX9排除了半胱胺酸、天冬醯胺和色胺酸，以減少可能造成下游可製造性風險的序列傾向性的引入。對剩餘的兩個重鏈位置(SEQ ID NO：191的Gly56和Thr104)進行甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸和蘇胺酸的突變。總之，對於第一次活動，設計了理論多樣性為8.5x106 的mutHC文庫和理論多樣性為9.9 x 106 的mutLC文庫，並且所構建的文庫對理論多樣性過採樣>9倍。
使用FACS富集兩個構建的mutHC和mutLC Fab文庫用於與人PAC1 ECD結合，藉由降低用於結合的ECD的濃度來增加每個連續輪次的嚴格性(第1輪：30nM PAC1 ECD；第2輪：0.67nM PAC1 ECD；和第3輪：0.2nM PAC1 ECD)。常規使用經相同處理的29G4v10 Fab-酵母樣品來特異性地閘控相對於親本Fab表現出改進的結合的酵母殖株。藉由將每個殖株的中值螢光結合訊號除以每個殖株的中值螢光顯示訊號來計算每個殖株的標準化結合/顯示比率。藉由第3輪，從mutHC文庫而不是mutLC文庫富集改進的結合物。來自mutHC第3輪庫的約200個酵母殖株的簡單篩選產生11個適當改進的結合物(表8)。如實例3中所述，重組產生改進的親和力變體並評估體外功能活性。幸運地是，29G4v10親本Fab中的天冬胺酸異構化位點係可製造性的潛在傾向性，在所有這11種獨特的突變體中得到了修復。
Figure 108101085-A0202-12-0200-111
Figure 108101085-A0202-12-0201-112
 1 對於任何該等變體，相對於29G4v10抗體輕鏈序列沒有變化。
為產生進一步的親和力改進，還構建了鏈改組的文庫，該文庫組合來自mutHC和mutLC分選的庫的富集的突變。為改進最佳結合殖株之間的區分，實施了結合解離速率驅動的選擇和篩選策略(圖5)。首先將展示突變體Fab的酵母細胞用生物素化的人PAC1 ECD浸透，並充分洗滌，然後在含有過量未標記的人PAC1 ECD的緩衝液中長時間孵育(長達24小時)。與未標記的人PAC1 ECD一起孵育，該孵育發生在25℃至37℃的溫度範圍內，使得細胞的解離事件不可逆。在用螢光鏈黴抗生物素蛋白綴合物染色後，藉由FACS對保留與生物素化的PAC1結合最多的細胞進行分離，從而表現出最慢的解離速率(圖5)。顯示出最慢解離速率的Fab的酵母殖株係高度螢光的。
在解離速率驅動的鏈改組文庫分選中，在與未標記的PAC1競爭過夜後，使用經相同處理的29G4v10 Fab-酵母樣品來特異性地分離具有更高生物素化的PAC1結合的細胞。從在不同閘控嚴格條件下收集的兩個池中，使用結合解離速率測定篩選約600個單獨的酵母殖株，並鑒定了相比親本29G4v10 Fab具有更高的剩餘PAC1結合的190個殖株。藉由證實殖株與無關受體(程式性細胞死亡蛋白1(PD1)和胃抑制性多肽受體(GIPR))的ECD不存在結合來評估該等有希望的殖株的結合特異性。在篩選過程中相對於起始29G4v10序列還去除了含有另外的半胱胺酸異常、N-連接的醣苷化、天冬胺酸異構化、天冬醯胺脫醯胺和色胺酸氧化位點的突變體。表9中顯示了最佳的30個結合突變體，具有來自親本29G4v10抗體的CDR中的序列變化和解離速率測定後人PAC1 ECD結合的百分比。PAC1 ECD結合的較高百分比結合表明突變體Fab具有較慢的解離速率。
Figure 108101085-A0202-12-0202-113
Figure 108101085-A0202-12-0203-114
Figure 108101085-A0202-12-0204-115
Figure 108101085-A0202-12-0205-116
 1 相對於29G4v10輕鏈可變區序列(SEQ ID NO：52)的位置34處的組胺酸殘基在該等突變體中缺失。
設計了一組第二代文庫以產生進一步的親和力改進。上述第一代文庫聚焦於晶體結構中PAC1 ECD的4.5Å內的29G4v10親本抗體CDR位置的子集處的多樣化(實例1)。對於第二代文庫，探索了在第一代文庫中基本未觸及的區域中的誘變，例如輕鏈的CDR2和CDR3。對於已在第一代文庫中探索過的若干個位置，定序趨勢被用於多樣化到三輪分選後出現的有限的中性/有益突變組。最後，一些可能影響CDR構象的隱藏框架殘基被靶向用於有限的多樣化，其中突變策略有利於經常在其他人VH3和VK3種系中的相同位置處發現的胺基酸。
總計四個第二代Fab文庫被設計為靶向24個重鏈CDR殘基(SEQ ID NO：191的胺基酸27、29、31-34、49、52-57、70、72、77、79、98、100-104、和106)和17個輕鏈CDR殘基(SEQ ID NO：52的胺基酸27、28、30-32、34、46、49-54、92-94、和96)用於多樣化。許多靶向位置處的受限多樣性使得能夠在一個文庫內詢問更多CDR位置，以及HCDR1與HCDR3和LCDR1與LCDR3的共同優化。構建的四個庫提供了從7 x 106 至1 x 107 的範圍的理論多樣性的8-24x的覆蓋範圍。
如上所述，使用FACS富集四個構建的Fab文庫以與人PAC1 ECD結合。到第3輪，僅mutHCDR2和mutLCDR1-LCDR3文庫產生了與親本29G4v10抗體具有相同或更高結合的庫。因此，這兩個庫被接下來用於製 備mutH2/mutL1L3鏈改組的文庫用於進一步改進親和力。為了富集最高親和力的突變體，使用來自第一代文庫(表9)的表現最佳的酵母殖株2B10來設置更嚴格的分選門。在30℃或37℃下與未標記的PAC1進行過夜的解離速率競爭後，可以分選出與2B10殖株相比具有顯著降低的解離速率的酵母殖株。約200個殖株的受限篩選揭示了約100個殖株比2B10具有更慢的解離速率，但是大多數有希望的結合物在HCDR2內含有潛在的天冬醯胺脫醯胺傾向。對於篩選的所有殖株，對PD1或GIPR的ECD的非特異性結合係最小的。應用嚴格的結合和序列過濾器產生10個最佳突變體，該等突變體具有相比2B10殖株顯著改進的PAC1結合(在37℃過夜競爭後>2x高的百分比結合)並且沒有任何潛在的序列傾向(表10)。在30℃和37℃下解離速率測定後，對於該等最佳的十個突變體的來自親本29G4v10抗體的序列變化和人PAC1 ECD結合百分比顯示在表10中。百分比結合被計算為解離速率測定後的標準化結合除以未解離速率測定的標準化結合。PAC1 ECD結合的較高百分比結合表明突變體Fab具有較慢的解離速率。
Figure 108101085-A0202-12-0206-117
Figure 108101085-A0202-12-0207-118
如在表10中所示，所有該等最佳的十個結合突變體含有在CDRL1中的Q27K突變，並且除了一個之外的全部含有在CDRL1中的R31W突變。所有突變體在CDRH2中的胺基酸位置D54和N57處具有突變，並且大多數突變體還在CDRH2中的胺基酸位置G56處具有突變。在這十個突變體中的許多中還分別觀察到在重鏈框架2(FR2)和框架3(FR3)區中胺基酸位置49和70處的保守突變。
總之，在與29G4v9 Fab(29G4v22和29G4v10抗PAC1中和抗體的密切相關的變體)複合的PAC1 ECD的結構的指導下，設計並分選29G4v10突變體的組合文庫用於改進與PAC1 ECD的結合。為了分離最改進的結合物，藉由構建CDR改組的和/或鏈改組文庫來組合富集的突變，用於在更嚴格的條件下進行選擇。分選後單個酵母Fab殖株的篩選產生改進的人PAC1 ECD結合物，與29G4v10親本抗體相比具有顯著更慢的結合解離速率和最小的非特異性結合。如實例3所述，將改進的親和力變體的亞組經重組生產並評估體外功能活性。
實例3.人PAC1抗體變體的體外功能活性
為評估藉由共晶結構(實例1)或酵母展示文庫(實例2)的分析鑒定的重鏈和輕鏈可變區中突變對抗PAC1抗體的抑制效力的影響，藉由重組表現方法產生變體作為完整的二價體單株抗體和/或作為單價體Fab-Fc融合物(例如與二聚體IgG Fc區融合的Fab區)，並如下文更詳細描述的在基於細胞的cAMP測定中進行評估。單株抗體和Fab片段的輕鏈包含來自指定抗體變體的輕鏈可變區，該抗體變體與具有SEQ ID NO：318或SEQ ID NO：319的序列的人κ輕鏈恒定區融合。單株抗體和Fab-Fc融合物的重鏈包含來自指定抗體變體的重鏈可變區，該抗體變體與未醣苷化的、二硫化物穩定的、具有SEQ ID NO：325的序列的人IgG1z恒定區融合。
在SDM不成功的情況下，藉由定點誘變(SDM)或藉由金閘組裝(GGA)產生PAC1抗體變體序列。定點誘變利用側翼突變位點的成對誘變引物。使用雙鏈質粒DNA模板進行全載體PCR反應。將特定殖株中所有所需突變的引物組合成主引物混合物，其中將一至若干個突變摻入單獨反應中。擴增後，藉由用DpnI消化去除模板質粒DNA，DpnI係一種優先切割甲基化DNA的核酸內切酶。然後將SDM產物轉化到感受態細胞中用於生長和藉由定序篩選。遵循製造商的說明，使用QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(QuikChange Lightning多定點誘變試劑盒)(安捷倫公司(Agilent))進行SDM反應。
在SDM不成功的地方，使用了可替代的選殖策略。簡言之，GGA依靠II型限制酶和T4 DNA連接酶來切割並將多個DNA片段無縫連接在一 起。(Engler等人，PLOS One[公共科學圖書館綜合]，第3卷(11)：e3647,2008)。在該實例中，多個DNA片段由以下組成：(i)編碼Kozak共有序列、訊息肽序列和抗體可變區序列的合成核酸序列(gBlock，整合的DNA技術公司(Integrated DNA Technologies)，柯拉爾維爾，愛荷華州)；(ii)從部分載體(Parts vector)釋放的抗體恒定結構域片段；和(iii)表現載體骨架。GGA反應由以下組成：10ng的gBlock、10ng的部分載體(Part vector)、10ng的表現載體、1μl 10x Fast Digest Reaction Buffer(快速消化反應緩衝液)+0.5mM ATP(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher)，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、0.5μl FastDigest(快速消化)Esp3I(賽默飛世爾科技公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、1μl T4 DNA連接酶(5U/μl，賽默飛世爾科技公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)並添加水至10μl。反應經15個循環進行，包括在37℃下2分鐘的消化步驟和在16℃下3分鐘的連接步驟。在15個循環之後進行最後5分鐘37℃消化步驟和在80℃下5分鐘酶滅活步驟。
選殖後，藉由用相應的cDNA暫態轉染293個HEK細胞，產生其前22個胺基酸係VK1訊息肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC；SEQ ID NO：486)的PAC1抗體多肽。用0.5mg/L DNA(在pTT5載體中0.5mg/L PAC1)或(在pTT5載體中0.1mg/L PAC1，其中0.4mg/L空白pTT5載體)(Durocher等人，NRCC,Nucleic Acids.Res.[核酸研究]，第30卷：e9,2002)與4ml PEI/mg DNA在F17介質(賽默飛世爾科技公司)中轉染處於1.5 x 106 個細胞/ml的細胞。轉染後1小時，將酵母提取物(Yeastolate)和葡萄糖添加到培養物中，然後使用補充有0.1% Kolliphor、6mM L-穀胺醯胺和50μg/ml遺傳黴素的F17表現介質使細胞在懸浮液中生長6天，之後收穫條件培養基用於淨化。
使用蛋白質A親和層析(MabSelect SuRe，GE醫療集團生命科學公司(GE Healthcare Life Sciences)，Little Chalfont，白金漢郡，英國)從條件培養基中純化PAC1抗體變體，隨後藉由陽離子交換層析(SP交聯瓊脂糖高效柱(SP HP)(GE醫療集團生命科學公司)。使用NanoDrop 2000(賽默飛世爾科技公司，羅克福德，伊利諾州，美國)，藉由在280nm處的UV吸光度(A280)測定的每個經純化的庫中的蛋白質濃度。在4℃下，使用20kDa MWCO Slide-A-Lyzer透析燒瓶(賽默飛世爾科技公司)將經純化的庫用2L的10mM乙酸鈉、9%蔗糖、pH 5.2(A52Su)透析2小時，在攪拌板上伴隨溫和攪拌。傾析掉用過的透析液，添加新鮮的2L的A52Su並透析過夜。透析後，使用30kDa MWCO超濾濃縮器(賽默飛世爾科技公司)在浮桶式轉子中以2,000 x g離心濃縮樣品，直至每個樣品基於A280大約為40mg/mL。使用Caliper LabChip GXII微細管電泳(珀金埃爾默公司(PerkinElmer)，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州，美國)和尺寸排阻層析，用ACQUITY UPLC蛋白質BEH SEC柱，200Å，4.6 x 300mm(沃特斯公司(Waters Corporation)，米爾福德，麻塞諸塞州，美國)分析終產物的主峰純度。使用Endosafe-MCS(查理斯河實驗室(Charles River)，威明頓市，麻塞諸塞州，美國)和0.05EU/mL PTS柱(查理斯河實驗室)測量內毒素含量。
使用基於細胞的PAC1受體cAMP活性測定評估經純化的單株抗體或Fab-Fc融合蛋白的功能活性。PACAP38和PACAP27二者都是PAC1受體的激動劑，其激活導致細胞內cAMP的增加。該測定使用獲得自ATCC(ATCC號CRL-2266；“CRL-2266細胞”)的人神經母細胞瘤衍生的細胞系(SH-SY5Y；Biedler JL等人，Cancer Res.[癌症研究]，第38卷：3751-3757,1978)。CRL-2266細胞內源性地表現人PAC1受體(Monaghan等人，J Neurochem.[神經化學雜誌]，第104卷(1)：74-88,2008)。另外，穩定表現大鼠PAC1受體(GenBank登錄號NM_133511.2)或食蟹猴PAC1受體(NCBI參考序列XP_015303041.1)的CHO細胞系代替CRL2266細胞用於測定來評估在大鼠和食蟹猴PAC1受體上的抗PAC1抗體或Fab-Fc融合物的物種交叉反應性。將LANCE Ultra cAMP測定試劑盒(珀金埃爾默公司，波士頓，麻塞諸塞州)用於測量cAMP濃度。
在測定的當天，在37℃下將冷凍的CRL-2266細胞解凍，並且用測定緩衝液洗滌一次。將10μL含有2,000個細胞的細胞懸浮液添加進96孔半區白板。添加5μL的抗PAC1變體單株抗體或Fab-Fc融合蛋白(10個點的劑量反應曲線：從1μM至0.5fM的濃度範圍)後，將該混合物在室溫下孵育30分鐘。然後，添加5μL的人PACAP38(10pM終濃度)作為激動劑，並且將該混合物在室溫下進一步孵育15分鐘。人PACAP38刺激後，添加20μL的檢測混合物並且在室溫下孵育45分鐘。在發射波長665nm下，將該等板在EnVision儀(珀金埃爾默公司，波士頓，麻塞諸塞州)上讀數。數據由Prizm(圖形軟體公司(GraphPad Software Inc.))處理和分析，以顯示POC(對照的百分比，其中對照被定義為測定中使用的激動劑的活性)作為測試的拮抗劑(例如，抗PAC1變體抗體或Fab-Fc融合蛋白)濃度的函數，並用標準非線性回歸曲線擬合以產生IC50值。POC被計算如下：
Figure 108101085-A0202-12-0211-119
產生具有表6和7中匯總的突變的單價體Fab-Fc融合蛋白，並在上述基於細胞的cAMP測定中測試功能活性。將突變體Fab-Fc融合蛋白分成兩個獨立的組：與親本分子相比，改進對人PAC1受體的抑制效力的突變和表徵為中性的突變(表11)。如果突變具有的平均效力相比親本分子係小於 1.5x弱的，則突變被表徵為中性，並且在相同的運行中至少一種效力測量比親本分子更緊密。
Figure 108101085-A0202-12-0212-120
 1 相對於SEQ ID NO：52的輕鏈(LC)的胺基酸位置和相對於SEQ ID NO：191的重鏈(HC)的胺基酸位置。
提供針對人PAC1受體的抑制效力增加的突變位於抗體表面上三維空間的三個不同區域。藉由組合這三個區域中的突變產生第二輪的變體抗體和Fab-Fc融合蛋白，以潛在地提供效力上的額外增加。此外，摻入了一些中性突變，因為它們可能對結合沒有顯著影響，但可能提供修飾抗體生物物理特徵的機制。將含有所需突變的可變區摻入具有人未醣苷化的IgG1 Fc區和/或單價體Fab-Fc融合蛋白的二價體單株抗體中。未醣苷化的人 IgG1抗體Fc區包含根據EU編號具有N297G、R292C和V302C突變的人IgG1zFc區的序列(SEQ ID NO：325)。在基於細胞的cAMP測定中評估具有突變組合的該等變體抗體和Fab-Fc融合蛋白的功能活性。該等結果顯示在以下表12中。
Figure 108101085-A0202-12-0213-121
Figure 108101085-A0202-12-0214-122
Figure 108101085-A0202-12-0215-123
Figure 108101085-A0202-12-0216-124
Figure 108101085-A0202-12-0217-125
 1 該值代表如與格式化為mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10親本分子的IC50值相比IC50的倍數增加，該親本分子與每個變體分子平行運行。2 該值代表如與格式化為mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10親本分子的平均IC50值相比IC50的倍數增加ND=未確定
當抗體具有輕鏈可變區中位置Q27(Q27K)處的突變和重鏈可變區中位置D54(D54I、D54Q或D54N)和/或位置G56(G56R或G56N)處的突變時，觀察到效力的最大改進。SEQ ID NO：52的輕鏈可變區中的Q27對應於AHo編號中的胺基酸位置29。SEQ ID NO：191的重鏈可變區中的D54和G56分別對應於AHo編號中的胺基酸位置61和66。假定輕鏈可變區中位置Q27處的鹼性胺基酸(如賴胺酸或精胺酸)提供與PAC1 ECD中的酸性胺基酸Glu120和Asp121的改進的電荷互補性(參見圖2A中的區1)。重鏈可變區中位置D54處的疏水殘基(例如，異亮胺酸)或中性親水殘基(例如，穀胺醯胺或天冬醯胺)以及重鏈可變區中位置G56處的鹼性殘基s(例如，精胺酸)或中性親水殘基(例如，天冬醯胺)似乎改進與PAC1 ECD中的胺基酸殘基Asn60和Ile61的疏水相互作用或氫鍵(參見圖3B中的區6)。
來自MutHC文庫篩選的最佳的十一個突變體(表8)被格式化為如上所述的未醣苷化的IgG1單株抗體和單價體Fab-Fc分子，用於在cAMP測定中產生和功能測試(表13)。對於這組變體，適度改進的酵母結合轉化為針對11種mAb中的4種和11種Fab-Fcs中的7種的改進的PAC1受體阻斷功能。然而，作為抗體，與親本29G4v10抗體相比，iPS：421873突變體顯示出PAC1阻斷功能的約4倍的改進。該等突變體的活性排行在兩種形式中大致一致，其中Fab-Fcs始終顯示出比mAb更弱的功能(更高的IC50值)，可能是由於親合力的喪失。
Figure 108101085-A0202-12-0219-126
 1 該值代表如與格式化為mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10親本分子的IC50值相比IC50的倍數增加，該親本分子與每個變體分子平行運行。2 該值代表如與格式化為mAb或Fab-Fc融合蛋白的29G4v10親本分子的平均IC50值相比IC50的倍數增加
將來自鏈改組的文庫(表9和10)的29G4v10突變體亞組轉化為未醣苷化的IgG1單株抗體並在基於細胞的cAMP測定中測試功能活性。該等結果顯示在以下表14中。
Figure 108101085-A0202-12-0219-127
Figure 108101085-A0202-12-0220-128
 1 29G4v22係另一種抗PAC1中和抗體，該抗體與29G4v10共用顯著的結構相似性。29G4v22的VL和VH序列分別提供於SEQ ID NO：53和192。2 從先前測定獲得的歷史值並且包括用於比較目的。
當格式化為單株抗體(mAb)時，與來自第一代鏈改組的文庫的突變體(表9)相比，來自第二代鏈改組的文庫(表10)的29G4v10突變體係PAC1的更有效的拮抗劑，表明增強的PAC1阻斷功能與改進的結合相關，並且特別減緩結合解離速率。然而，令人驚奇地，大多數突變體作為mAb相比抗體iPS：421873(來自mutHC文庫篩選的最有效的突變體)(表13)活性更弱，儘管假定它們與人PAC1 ECD具有增強的結合。然而，如分別與29G4v10親本抗體和29G4v22對照抗體相比，30_D05突變體展示出在功能上約10倍和67倍的改進。由高效力S8_30_D05和iPS：421873 mAb共用的一個共同的特徵係HCDR2中的D54R突變，該突變在所有其他效力較低的mAb突變體中不存在。有趣地是，與29G4v10親本抗體和29G4v22對照抗體相比，所有親和力成熟的變體顯示出與大鼠PAC1受體的交叉反應性(表14)。
實例4.人PAC1抗體變體的體內功能活性
Maxadilan係一種血管舒張肽和PAC1受體的激動劑。當皮內給藥時，maxadilan引起可藉由雷射都卜勒成像測量的局部皮膚血流增加。PAC1拮抗劑(例如抗PAC1抗體)對這種作用的抑制可以作為PAC1生物活性拮抗作用的翻譯藥效學模型。當格式化為來自實例3的單株抗體時，藉由使用大鼠皮膚血流模型測試在體內抑制PAC1受體激活的PAC1變體的子集的功效，該PAC1變體展示出改進的體外抑制效力。
體內藥效學模型
處於8-12周齡的幼年雄性Sprague Dawley大鼠購買自查理斯河實驗室(Charles River Laboratories)。本實例中的所有程序均遵照動物福利法(Animal Welfare Act)、實驗動物護理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)以及實驗動物福利辦公室(Office of Laboratory Animal Welfare)進行。在安進公司的實驗動物評估和認可委員會(AAALAC)認可的設施中，將動物分組飼養在非無菌、通風的微隔離住所中。藉由自動供水系統動物可隨意獲得顆粒飼料(Harlan Teklad 2020X，印第安那州印弟安納波里斯(Indianapolis，IN))和水(現場反滲透產生)。
使用雷射都卜勒成像在大鼠maxadilan誘導的皮膚血流增加(MIIBF)藥效學(PD)模型中測試抗PAC1抗體的亞組。藉由在1X磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋maxadilan儲備溶液(0.5mg/mL)至終濃度為0.5μg/mL來每天新鮮製備maxadilan(巴亨公司(Bachem)，H6734.0500)的給藥溶液。取決於實驗所需的劑量，按不同濃度在10mM乙酸鈉、9%蔗糖、pH 5.2(A52Su)中製備所有的抗PAC1抗體(Ab)，並在藉由雷射都卜勒成像測量皮膚血流(DBF)前一天，經單次靜脈快速注射給藥。
使用雷射都卜勒成像儀(LDI-2，莫爾儀器公司(Moor Instruments,Ltd)，威明頓市，德拉瓦州)，用由633nm氦-氖燈泡產生的低功率雷射束測量大鼠腹部的剃光斑塊上的DBF。測量解析度為0.2mm至2mm，其中儀器孔與組織表面之間的掃描距離為30cm。測量DBF並表示為%自基線的變化[100 x(單獨maxadilan後通量-單獨基線通量)/單獨基線通量]或%DBF抑制[媒介物%自基線的變化的平均值-單獨抗體處理的大鼠的%自基線的變化)/媒介物%自基線的變化的平均值]以量化抗體效應的大小。
在測試當天，在用丙泊酚麻醉後，將大鼠的腹部區域剃毛並且將每隻動物以仰臥位置放置在溫度受控的循環溫水墊上以在研究期間維持穩定的體溫。在10至15分鐘的穩定期後，將橡膠O形環(內徑0.925cm，O-Rings West，雅圖，華盛頓州)置於大鼠腹部(不直接將其定位在可見血管上)。在所選區域上放置O形環後，進行基線(BL)DBF測量。在BL掃描後，藉由皮內注射(20μL的0.5μg/mL)在O形環的中心施用PAC1激動劑maxadilan。在maxadilan注射後30分鐘或在抗體處理後24±1.5小時測量DBF。O形環限定了進行DBF分析的目的區域。
所有的DBF結果均表示為平均值±SEM。使用單因素方差分析，之後使用鄧奈特多重比較檢驗(MCT)來評估PAC1 Ab相對於媒介物處理的統計學顯著性。p值<0.05，用於確定兩組之間的顯著性。
單劑量靜脈內(i.v.)篩選評估
用7種不同抗PAC1抗體(420653、420845、420943、421873、420889(PL-50347)、421091(PL-50350)和421051(PL-50351))中的一種對大鼠預處理24小時，然後maxadilan按0.1mg/kg或0.3mg/kg的劑量激發(20μl的0.5μg/mL)，與媒介物(A52Su)處理組相比導致MIIBF的降低。在maxadilan治療後30分鐘，對於測試的七種抗體中的五種，與媒介物組相比， 處於0.3mg/kg的MIIBF具有統計學顯著的抑制作用(圖6)。在24±1.5小時，針對七種抗體中六種的終末的血清濃度列出在以下表15中。
Figure 108101085-A0202-12-0223-129
劑量-反應評估
用4種不同的抗PAC1抗體(420653、420845、420943和421873)對大鼠預處理24小時，然後按從0.01mg/kg至30mg/kg的劑量範圍進行maxadilan激發(20μl的0.5μg/mL)。對於四種抗體中的每一種，與媒介物處理組相比，觀察到MIIBF的劑量依賴性減少(圖7A-7D)。按低至0.06mg/kg的劑量，Ab 420653產生了顯著的效果，其中在0.06mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg下抑制作用分別為44%、68%、86%、95%和101%(圖7A)。按0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的劑量，Ab 420845產生了顯著的效果，其中在抑制分別為79%、102%和107%(圖7B)。與Ab 420845和Ab 420653相比，Ab 420943和421873略微更不有效，但仍在1mg/kg產生顯著的抑制作用。在DBF中Ab 420943的%抑制在1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg分別是56%、46%、52%和81%(圖7C)。在DBF中Ab 421873的%抑制在1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg下分別是34%、55%、72%和100%(圖7D)。
如藉由皮膚血流測定(PAC1-介導的血管舒張模型)的評估，在該實例中所述的實驗結果顯示有效抑制配位基誘導的PAC1受體體外激活的抗體還抑制體內PAC1受體的激活。
實例5.人PAC1抗體變體的藥物動力學特徵
用幼年雄性史-道二氏大鼠和幼年雄性食蟹猴進行四種抗PAC1抗體(420653、420845、420943和421873)的初步藥物動力學(PK)研究。評估29G4v10親本抗體或結構上相關的29G4v22抗體(包含SEQ ID NO：53的VL和包含SEQ ID NO：192的VH)作為對照。藉由靜脈推注給藥將測試抗體給藥以研究動物。在給藥後的指定時間點收集血液樣品並加工成血清。將所有血清樣品儲存在約-70℃(±10℃)直至轉移用於後續分析。
為測量給藥後來自大鼠和食蟹猴的血清樣品中測試抗體的量，使用針對人IgG Fc(安進公司(Amgen,Inc.)，加利福尼亞州，美國)的鼠單株抗體(mAb)開發比色酶聯免疫吸附測定(ELISA)。用2μg/mL的鼠抗人Fc mAb包被微量滴定板。用I-block(應用生物系統公司(Applied Biosystems)，加利福尼亞州，美國)封閉包被的微量滴定板。藉由將測試抗體摻入來自研究物種的100%血清中來製備測定標準品(STD)和品質控制品(QC)。將STD、QC、空白和研究樣品在測定緩衝液(具有1M NaCl的1X PBS、1% BSA和0.5% Tween 20)中按1：30稀釋。將稀釋的STD、QC、空白和研究樣品在包被的微量滴定板上在25℃下孵育1小時而不攪拌。在洗滌步驟後，將測定緩衝液中30ng/mL的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的鼠抗人Fc mAb添加至微量滴定板中，並在25℃下孵育1小時而不攪拌。在最後的洗滌步驟後，將四甲基聯苯胺(TMB)過氧化物底物溶液(KPL公司，馬里蘭州(MD)，美國)加入微量滴定板中。在HRP的存在下，TMB產生比色訊號，該訊號與在STD、QC和研究樣品中存在的結合人Fc的量成比 例。顯色時間依賴於分析物，並藉由添加2N硫酸終止。使用SpectraMax 340PC微量滴定板讀數器(分子器械公司(Molecular Devices)，加利福尼亞州，美國)和SoftMax Pro軟體，參照650nm在450nm下測量光密度(OD)。使用邏輯(自動估計)回歸模型(其中加權因子為1/y)對測定數據進行回歸。測定動態範圍係從20ng/mL至2000ng/mL。
對於大鼠和食蟹猴PK研究，使用Phoenix® WinNonlin®(6.4版；切爾塔拉，新澤西州，美國)對單獨血清濃度-標稱時間數據進行非房室分析。單個濃度值小於定量下限(LLOQ，20ng/mL)報告為低於定量限(BQL)，並設置為零用於計算匯總統計。平均濃度值低於LLOQ時不報告或繪製。從非房室分析中排除了低於LLOQ的所有濃度值。標稱劑量和標稱採樣時間用於PK分析。估算以下PK參數：
●靜脈內施用後的初始濃度(C0 )值藉由使用前2個觀察到的下降濃度值的反向外推至時間零來估計。
●藉由線性梯形法計算從時間零到無窮大(AUCinf)的濃度-時間曲線下面積。
●終末相半衰期(t1/2,z )被計算為ln2/λz ，λz 係與曲線的末端部分相關的藥物的一級速率常數。
●按如下計算系統清除率(CL)：CL=靜脈給藥後劑量/AUCinf
●按如下估算穩態分佈容積(Vss)：Vss=CL x MRTinf(從時間零到無窮大的平均停留時間)
四種抗體以及29G4v10親本抗體和29G4v22對照抗體針對人PAC1、大鼠PAC1和犬PAC1的體外抑制效力的匯總提供在以下表16中。使用實例3所述的cAMP測定，評估抗體抑制配位基誘導的(PACAP38或maxadilan)來自不同物種的PAC1受體的激活的能力。
Figure 108101085-A0202-12-0226-130
大鼠被靜脈內給予按1mg/kg、5mg/kg和25mg/kg劑量的四種抗體中的一種。在給藥後的不同時間點收集血液樣品，並使用上述ELISA測定在每個時間點測量血清樣品中的抗體濃度。大鼠研究的PK參數匯總在下表17中，並且每種劑量的血清濃度-時間曲線顯示在圖8A-8C中。
Figure 108101085-A0202-12-0226-131
食蟹猴被靜脈內給予按10mg/kg的劑量的四種抗體中的一種。在給藥後的不同時間點收集血液樣品，並使用上述ELISA測定在每個時間點測量血清樣品中的抗體濃度。食蟹猴研究的PK參數匯總在以下表18中，並且將血清濃度-時間曲線示出在圖9中。示出29G4v22抗體的PK曲線用於比較。
[表18].食蟹猴中PAC1變體抗體的PK參數的匯總
Figure 108101085-A0202-12-0227-132
在該劑量下，所有四種PAC1變體抗體具有相比29G4v22對照抗體更長的血清半衰期。有趣地是，儘管與29G4v22對照抗體相比，所有四種PAC1變體抗體對PAC1受體展現出更高的體外抑制效力(表16)，但一些變體的PK曲線在食蟹猴中不太有利。例如，與29G4v22對照抗體相比，Ab 420845具有更快的清除率和更低的總暴露。然而，Ab 420653具有與29G4v22對照抗體相當的PK曲線(圖9)，表明Ab 420653可以在相同給藥頻率下以較低劑量施用以實現類似的藥理學效果。
實例6.19H8人PAC1抗體的酵母展示親和力成熟
為產生具有改進的抑制效力的抗PAC1抗體，使用實例2所述的方法，藉由酵母展示Fab文庫的FACS將19H8抗體(SEQ ID NO：296的VH區；SEQ ID NO：67的VL區)進行親和力成熟化。19H8抗體在結構上與29G4v9、29G4v10和29G4v22抗體不同，但還表現出對人PAC1受體的非常有效的中和活性。
因為最初沒有可用於PAC1 ECD-19H8 Fab複合物的晶體結構資訊，所以產生同源模型以鑒定每個CDR環內的表面暴露的殘基。因為預期PAC1 ECD將與表面暴露的CDR殘基直接接觸，所以假設藉由全面誘變改變該等接觸的性質或產生新的接觸可以引起抗體與PAC1 ECD的改進的結合。為將每個文庫的理論多樣性限制在可掌控的106 -107 ，針對MIX19飽和誘變鑒定了每個CDR多達五個位置，並為每個CDR構建了一個單獨的文庫。由於考慮到建模的CDRH3環構象的準確性，無法可靠地鑒定該環內最 多的溶劑暴露的殘基。因此，考慮了CDRH3內11個CDR殘基中8個處的多樣化，排除了環的開始和結束時的殘基。為了將飽和誘變的位置數縮小到5，避免了CDRH3中的兩個色胺酸和一個苯丙胺酸，因為芳香族殘基通常是蛋白質-蛋白質相互作用的關鍵介質。總計，六個單獨的CDR Fab文庫被設計以靶向16個重鏈和15個輕鏈CDR殘基用於多樣化，並且所構建的文庫對理論多樣性過採樣4.5至46倍。如下提供了對每個CDR文庫的靶向位置的匯總：
重鏈CDR文庫(相對於SEQ ID NO：296的胺基酸位置)：
●CDRH1文庫：Asp27(在FR1中位於CDRH1的附近)、Ser31、Asn32、Ser33和Thr35
●CDRH2文庫：Tyr54、Tyr55、Ser57、Lys58、Ser60和His62
●CDRH3文庫：Thr103、Lys105、Gln106、Leu107和Leu110
輕鏈CDR文庫(相對於SEQ ID NO：67的胺基酸位置)：
●CDRL1文庫：Ser28、Ser30、Arg31、Tyr32和Asn34
●CDRL2文庫：Tyr49(在FR2中位於CDRL2的附近)、Ala50、Ala51、Ser52和Ser53
●CDRL3文庫：Ser91、Tyr92、Ser93、Pro94和Phe96
使用FACS富集6個單獨的CDR Fab文庫用於與人PAC1 ECD結合，藉由降低用於結合的PAC1 ECD的濃度來增加每個連續輪次的嚴格性(第1輪：30nM PAC1 ECD；第2輪：0.67nM PAC1 ECD；和第3輪：0.2nM PAC1 ECD)。為進一步改進親和力，還構建了組合了來自單個CDR文庫(一個用於重鏈，一個用於輕鏈)的富集突變的兩個CDR改組的Fab文庫以及組合了來自每個CDR改組文庫的富集突變的最終的鏈改組的文庫。使用實例2中描述的和圖5中描繪的解離速率結合選擇方法，在更嚴格的條件下 對CDR改組和鏈改組的文庫進行PAC1 ECD結合的選擇。鏈改組文庫的最終解離速率分選表明，與親本19H8抗體相比，該庫中的大多數酵母殖株在PAC1 ECD結合中顯著改進。
篩選了大約800個單獨的酵母殖株用於改進與人PAC1 ECD的結合。去除具有序列傾向的突變序列(例如半胱胺酸異常、N-連接的醣苷化位點、天冬胺酸異構化、天冬醯胺脫醯胺和色胺酸氧化位點)。頂部約200個獨特的黏合劑被推進到二次篩選，其中它們藉由結合解離速率進行排序並評估非特異性結合。在30℃下，用未標記的PAC1 ECD過夜競爭後，在二次篩選中，相比親本19H8抗體，如由生物素化的人PAC1 ECD的更高百分比結合測量的，>80%的殖株具有更慢的結合解離速率。測量值代表解離速率改進的下限，因為生物素化的PAC1 ECD在30℃競爭僅1小時後完全與親本19H8解離。因為沒有經篩選的殖株表現出與不相關的PD1和GIPR受體的ECD結合，為了進一步縮小殖株庫，應用額外的序列過濾器去除突變體，該等突變體的CDR包含弗林蛋白酶(furin)切割位點、另外的色胺酸殘基以及比親本19H8抗體更多的協方差違規(covariance violation)。用生物素化的人VPAC2 ECD進行另外的結合測定以確定與人VPAC2(與人PAC1受體的結構相關受體)的非特異性結合程度，用於對殖株進行排序。表現出對人PAC1 ECD的最慢結合解離速率的前20種突變體和進入二次篩選的酵母殖株中最少量的人VPAC2結合列於下表19中。PAC1 ECD結合的較高百分比結合表明突變體Fab具有較慢的解離速率。
Figure 108101085-A0202-12-0229-133
Figure 108101085-A0202-12-0230-134
Figure 108101085-A0202-12-0231-135
Figure 108101085-A0202-12-0232-136
由重組表現方法產生的改進的親和力變體作為完整的二價體單株抗體和/或作為單價體Fab-Fc融合物(例如，與二聚體IgG Fc區融合的Fab區)並在實例3中描述的基於細胞的cAMP測定中評估體外功能活性。功能測定的結果示出在以下表20中。
Figure 108101085-A0202-12-0232-137
Figure 108101085-A0202-12-0233-138
Figure 108101085-A0202-12-0234-139
 1 從先前測定獲得的歷史值並且包括用於比較目的。
當格式化為Fab-Fc融合蛋白時，如與親本19H8 Fab-Fc融合蛋白相比，19H8變體展示出抑制效力的2倍至58倍增加。當格式化為Fab-Fc融合蛋白時，20H8變體中的許多比29G4v10變體更有效(針對Fab-Fc融合蛋白，將表19中的結果與表12中的結果進行比較)。當格式化為二價體單株抗體時，19H8變體還展現出有效的人PAC1中和活性，其中IC50值在個位數納莫耳或皮莫耳範圍內。
實例7.食蟹猴中人PAC1抗體變體的體內功能活性
為評估抗PAC1抗體420653在體內的靶參與，評估了抗體抑制maxadilan誘導的食蟹猴中皮膚血流增加的能力。Maxadilan係PAC1受體的選擇性拮抗劑，並且可以激活齧齒動物、食蟹猴和人類的受體。如實例4中所述，maxadilan的皮內給藥引起可藉由雷射都卜勒成像測量的局部皮膚血流的增加。抗PAC1抗體對這種作用的抑制可以作為PAC1生物活性拮抗作用的翻譯藥效學模型。
將5至8歲之間的雄性食蟹猴用於該研究。藉由在1X磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋maxadilan儲備溶液(0.5mg/mL)來每天新鮮製備maxadilan(巴亨公司(Bachem)，H6734.0500)的給藥溶液。作為對照測試的抗PAC1抗體420653或29G4v22在不同濃度的10mM乙酸鈉、9%蔗糖、0.01% Tween-80、pH 5.2(A52SuT)中製備，這取決於實驗所需的劑量，並藉由靜脈內(i.v.)輸注給予。
使用雷射都卜勒成像儀(LDI2-IR，莫爾儀器公司(Moor Instruments,Ltd)，威明頓市，德拉瓦州)，用由633nm氦-氖燈泡產生的低功率雷射束測量腹側前臂或大腿內部皮膚的剃光斑塊上的皮膚血流(DBF)。將紅外波長與可見紅色瞄準光束相結合，以給出對更深的皮膚 (0.6至1mm)中的血流的更高權重。入射光被靜態組織和移動的血液散射。在微血管系統中移動的血液引起都卜勒光移位。然後將來自移動的血液的移位光和來自組織的未移位的光導向2平方律檢測器。然後處理經檢測的強度波動以給出通量(與組織血流成比例)和濃度(與移動的血細胞的濃度成比例)的參數。測量解析度為0.2mm至2mm，儀器孔與組織表面之間的掃描距離為20cm至100cm。
DBF被測量為通量(相對單元)並表示為給予maxadilan後30min%自基線的變化[100 x(單獨maxadilan後通量-單獨基線通量)/單獨基線通量]。來自兩個獨立O形環的通量單元針對每個測試期間被平均在一起。抗PAC1抗體對maxadilan誘導的個體動物的血流的增加(MIIBF)的抑制效果被表示為%抑制[100 x(第0天%自基線的變化的平均值-經單獨抗體處理的動物%自基線的變化)/第0天%自基線的變化的平均值]。
在麻醉和生命體征穩定15至20分鐘後，將橡膠O形環(內徑0.925cm，O-Rings West，西雅圖，華盛頓州)放置在腹側前臂或大腿內部的預先剃光的皮膚上，彼此間隔約0.6cm至1cm，而不是直接定位在可見血管上。用於每個測試階段的肢係預先確定的，其中在該研究的不同測試日使用不同的肢。將O形環放置在皮膚上後，進行基線測量。在基線掃描後，在O形環的中心注射1ng在20μL媒介物(PBS)中的maxadilan溶液。在數據分析期間，O形環充當目的區域。
在給予抗PAC1抗體之前，在第0天獲得MIIBF的時程。在食蟹猴中基於先前maxadilan劑量反應的結果選擇1ng的maxadilan劑量。在前maxadilan基線DBF測量之後，藉由在maxadilan施用後5、10、15、20、25和30分鐘獲得雷射都卜勒掃描來評估DBF反應對maxadilan皮內注射的時程。為了鑒定maxadilan應答者並消除包含在研究中的非應答者，實施抗體 施用前的篩選前程序。如果動物具有DBF流變化
Figure 108101085-A0202-12-0237-248
60個通量單位(在30分鐘內maxadilan後DBF的平均值-基線平均值)則被認為係maxadilan應答者並且包括在該研究中。
在第0天，被鑒定為maxadilan應答者的24隻食蟹猴接受按0.1mg/kg或3mg/kg劑量的抗體420653或按10mg/kg劑量的抗體29G4v22。經靜脈注射，藉由注射器輸注泵以1mL/min的速率輸注到隱靜脈來給予抗體。使用不同的肢，在第2、4、7、10、14、21、28和36天進行maxadilan後DBF測量。在每種情況下，在1ng maxadilan皮內注射後，藉由雷射都卜勒成像測量DBF 30分鐘。在多個時間點(包括抗體給藥前，抗體治療後30分鐘，1、2、4、7、10、14、21、28、35或36和42天)採集用於藥物動力學(PK)分析的全血樣品。
如圖10A所示，與第0天(抗體處理前)相比，在第2、第7、第14和第21天(抗體處理後)以3mg/kg而不是0.1mg/kg的抗體420653顯著抑制了MIIBF(n=8隻動物/組；經鄧奈特調整的p值=0.0087)。在第2和第7天，以10mg/kg的抗體29G4v22顯著地抑制了MIIBF(n=8隻動物/組)(圖10A)。在第2天，3mg/kg的抗體420653的最大抑制效果具有96%抑制，然而在第4天處於0.1mg/kg的抗體420653產生的最大抑制為39%，該值在統計學上不顯著(圖10B)。第7天，10mg/kg的抗體29G4v22產生的最大抑制為63%(圖10B)。在相同的時間點，抗體420653(3mg/kg)和抗體29G4v22(10mg/kg)的比較在第2、第7、第14、和第21天顯示出顯著差異(圖10B)。
在進行DBF測量的當天，將抗體420653和抗體29G4v22的抗體血清濃度顯示在下表21中。定量下限(LLOQ)或低於定量水平(BQL)針對抗體420653為10ng/mL，針對抗體29G4v22為50ng/mL。
[表21].抗體處理後，食蟹猴中抗體420653和29G4v22的血清濃度
Figure 108101085-A0202-12-0238-140
 *較小的PK數據點係由於具有LLOQ/BQL的一些樣品
總之，該等結果表明當以3mg/kg的劑量給予時，在食蟹猴中抗體420653顯著減弱MIIBF。處於3mg/kg的抗體420653對MIIBF的抑制作用比處於10mg/kg較高劑量下的抗體29G4v22更強。
本文討論和引用的所有出版物、專利和專利申請均藉由引用以其全部內容併入本文。應當理解的是，所揭露的發明不限於所描述的具體的方法學，方案和材料，因為這些係可以變化的。還應當理解的是，本文使用的術語僅是出於描述具體實施方式的目的，並且不旨在限制所附申請專利範圍的範圍。
熟悉該項技術者僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的具體實施方式的許多等同物。此類等效物旨在由以下申請專利範圍所涵蓋。
<110> 美商安進公司(AMGEN INC.)
<120> PAC1抗體及其用途
<130> A-2189-WO-PCT
<150> 62/617,157
<151> 2018-01-12
<160> 569
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人PAC1
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<223> 人PAC1 ECD
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<223> 人PAC1 ECD
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<223> 合成多肽
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Figure 108101085-A0202-12-0248-170
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Figure 108101085-A0202-12-0248-171
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Figure 108101085-A0202-12-0248-172
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Figure 108101085-A0202-12-0249-173
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Figure 108101085-A0202-12-0249-174
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Figure 108101085-A0202-12-0249-175
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Figure 108101085-A0202-12-0249-176
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Figure 108101085-A0202-12-0250-177
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Figure 108101085-A0202-12-0250-178
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Figure 108101085-A0202-12-0250-179
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Figure 108101085-A0202-12-0250-180
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Figure 108101085-A0202-12-0250-181
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Figure 108101085-A0202-12-0251-182
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Figure 108101085-A0202-12-0251-183
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Figure 108101085-A0202-12-0251-184
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Figure 108101085-A0202-12-0251-185
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Figure 108101085-A0202-12-0252-186
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Figure 108101085-A0202-12-0252-187
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Figure 108101085-A0202-12-0252-188
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Figure 108101085-A0202-12-0252-189
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Figure 108101085-A0202-12-0252-190
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Figure 108101085-A0202-12-0253-191
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
Figure 108101085-A0202-12-0253-192
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Figure 108101085-A0202-12-0253-193
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Figure 108101085-A0202-12-0253-194
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 49
Figure 108101085-A0202-12-0254-195
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Figure 108101085-A0202-12-0254-196
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Figure 108101085-A0202-12-0254-197
<210> 52
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Figure 108101085-A0202-12-0254-198
Figure 108101085-A0202-12-0255-199
<210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Figure 108101085-A0202-12-0255-200
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Figure 108101085-A0202-12-0255-201
Figure 108101085-A0202-12-0256-202
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Figure 108101085-A0202-12-0256-203
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Figure 108101085-A0202-12-0257-204
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Figure 108101085-A0202-12-0257-205
Figure 108101085-A0202-12-0258-206
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 58
Figure 108101085-A0202-12-0258-207
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Figure 108101085-A0202-12-0258-208
Figure 108101085-A0202-12-0259-209
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
Figure 108101085-A0202-12-0259-210
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Figure 108101085-A0202-12-0260-211
<210> 62
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Figure 108101085-A0202-12-0260-212
Figure 108101085-A0202-12-0261-213
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Figure 108101085-A0202-12-0261-214
<210> 64
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
Figure 108101085-A0202-12-0261-215
Figure 108101085-A0202-12-0262-216
<210> 65
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Figure 108101085-A0202-12-0262-217
<210> 66
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Figure 108101085-A0202-12-0263-218
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Figure 108101085-A0202-12-0263-219
Figure 108101085-A0202-12-0264-220
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Figure 108101085-A0202-12-0264-221
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Figure 108101085-A0202-12-0264-222
Figure 108101085-A0202-12-0265-223
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Figure 108101085-A0202-12-0265-224
<210> 71
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Figure 108101085-A0202-12-0266-225
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Figure 108101085-A0202-12-0266-226
Figure 108101085-A0202-12-0267-227
<210> 73
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Figure 108101085-A0202-12-0267-228
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Figure 108101085-A0202-12-0267-229
Figure 108101085-A0202-12-0268-230
<210> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Figure 108101085-A0202-12-0268-231
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Figure 108101085-A0202-12-0269-232
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 77
Figure 108101085-A0202-12-0269-233
Figure 108101085-A0202-12-0270-234
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Figure 108101085-A0202-12-0270-235
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 79
Figure 108101085-A0202-12-0270-236
Figure 108101085-A0202-12-0271-237
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Figure 108101085-A0202-12-0271-238
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Figure 108101085-A0202-12-0272-239
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
Figure 108101085-A0202-12-0272-240
Figure 108101085-A0202-12-0273-241
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Figure 108101085-A0202-12-0273-242
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
Figure 108101085-A0202-12-0273-243
Figure 108101085-A0202-12-0274-244
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Figure 108101085-A0202-12-0274-245
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Figure 108101085-A0202-12-0275-246
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Figure 108101085-A0202-12-0275-247
Figure 108101085-A0202-12-0276-248
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Figure 108101085-A0202-12-0276-249
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Figure 108101085-A0202-12-0276-250
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Figure 108101085-A0202-12-0276-251
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Figure 108101085-A0202-12-0277-252
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 92
Figure 108101085-A0202-12-0277-253
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 93
Figure 108101085-A0202-12-0277-254
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
Figure 108101085-A0202-12-0277-255
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
Figure 108101085-A0202-12-0277-256
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
Figure 108101085-A0202-12-0278-257
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
Figure 108101085-A0202-12-0278-258
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
Figure 108101085-A0202-12-0278-259
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Figure 108101085-A0202-12-0278-260
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 100
Figure 108101085-A0202-12-0279-261
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Figure 108101085-A0202-12-0279-262
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 102
Figure 108101085-A0202-12-0279-263
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Figure 108101085-A0202-12-0279-264
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Figure 108101085-A0202-12-0279-265
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
Figure 108101085-A0202-12-0280-266
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Figure 108101085-A0202-12-0280-267
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
Figure 108101085-A0202-12-0280-268
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
Figure 108101085-A0202-12-0280-269
Figure 108101085-A0202-12-0281-270
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 109
Figure 108101085-A0202-12-0281-271
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 110
Figure 108101085-A0202-12-0281-272
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 111
Figure 108101085-A0202-12-0281-273
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 112
Figure 108101085-A0202-12-0282-274
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 113
Figure 108101085-A0202-12-0282-275
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 114
Figure 108101085-A0202-12-0282-276
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 115
Figure 108101085-A0202-12-0282-277
Figure 108101085-A0202-12-0283-278
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 116
Figure 108101085-A0202-12-0283-279
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 117
Figure 108101085-A0202-12-0283-280
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 118
Figure 108101085-A0202-12-0283-281
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 119
Figure 108101085-A0202-12-0284-282
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 120
Figure 108101085-A0202-12-0284-283
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 121
Figure 108101085-A0202-12-0284-284
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 122
Figure 108101085-A0202-12-0284-285
Figure 108101085-A0202-12-0285-286
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 123
Figure 108101085-A0202-12-0285-287
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 124
Figure 108101085-A0202-12-0285-288
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 125
Figure 108101085-A0202-12-0285-289
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 126
Figure 108101085-A0202-12-0286-290
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 127
Figure 108101085-A0202-12-0286-291
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 128
Figure 108101085-A0202-12-0286-292
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 129
Figure 108101085-A0202-12-0286-293
Figure 108101085-A0202-12-0287-294
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 130
Figure 108101085-A0202-12-0287-295
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 131
Figure 108101085-A0202-12-0287-296
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 132
Figure 108101085-A0202-12-0287-297
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 133
Figure 108101085-A0202-12-0288-298
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 134
Figure 108101085-A0202-12-0288-299
<210> 135
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 135
Figure 108101085-A0202-12-0288-300
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 136
Figure 108101085-A0202-12-0288-301
Figure 108101085-A0202-12-0289-302
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 137
Figure 108101085-A0202-12-0289-303
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 138
Figure 108101085-A0202-12-0289-304
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 139
Figure 108101085-A0202-12-0289-305
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 140
Figure 108101085-A0202-12-0290-306
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 141
Figure 108101085-A0202-12-0290-307
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 142
Figure 108101085-A0202-12-0290-308
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 143
Figure 108101085-A0202-12-0290-309
Figure 108101085-A0202-12-0291-310
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 144
Figure 108101085-A0202-12-0291-311
<210> 145
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 145
Figure 108101085-A0202-12-0291-312
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 146
Figure 108101085-A0202-12-0291-313
<210> 147
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 147
Figure 108101085-A0202-12-0292-314
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 148
Figure 108101085-A0202-12-0292-315
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 149
Figure 108101085-A0202-12-0292-316
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 150
Figure 108101085-A0202-12-0292-317
Figure 108101085-A0202-12-0293-318
<210> 151
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 151
Figure 108101085-A0202-12-0293-319
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 152
Figure 108101085-A0202-12-0293-320
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 153
Figure 108101085-A0202-12-0293-321
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 154
Figure 108101085-A0202-12-0294-322
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 155
Figure 108101085-A0202-12-0294-323
<210> 156
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 156
Figure 108101085-A0202-12-0294-324
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 157
Figure 108101085-A0202-12-0294-325
Figure 108101085-A0202-12-0295-326
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 158
Figure 108101085-A0202-12-0295-327
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 159
Figure 108101085-A0202-12-0295-328
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 160
Figure 108101085-A0202-12-0295-329
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 161
Figure 108101085-A0202-12-0296-330
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 162
Figure 108101085-A0202-12-0296-331
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 163
Figure 108101085-A0202-12-0296-332
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 164
Figure 108101085-A0202-12-0296-333
Figure 108101085-A0202-12-0297-334
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 165
Figure 108101085-A0202-12-0297-335
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 166
Figure 108101085-A0202-12-0297-336
<210> 167
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 167
Figure 108101085-A0202-12-0297-337
<210> 168
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 168
Figure 108101085-A0202-12-0298-338
<210> 169
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 169
Figure 108101085-A0202-12-0298-339
<210> 170
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
Figure 108101085-A0202-12-0298-340
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 171
Figure 108101085-A0202-12-0298-341
<210> 172
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
Figure 108101085-A0202-12-0299-342
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 173
Figure 108101085-A0202-12-0299-343
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 174
Figure 108101085-A0202-12-0299-344
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 175
Figure 108101085-A0202-12-0299-345
<210> 176
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 176
Figure 108101085-A0202-12-0300-346
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 177
Figure 108101085-A0202-12-0300-347
<210> 178
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 178
Figure 108101085-A0202-12-0300-348
<210> 179
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 179
Figure 108101085-A0202-12-0300-349
<210> 180
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 180
Figure 108101085-A0202-12-0300-350
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 181
Figure 108101085-A0202-12-0301-351
<210> 182
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 182
Figure 108101085-A0202-12-0301-352
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 183
Figure 108101085-A0202-12-0301-353
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 184
Figure 108101085-A0202-12-0301-354
<210> 185
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 185
Figure 108101085-A0202-12-0302-355
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 186
Figure 108101085-A0202-12-0302-356
<210> 187
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 187
Figure 108101085-A0202-12-0302-357
<210> 188
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 188
Figure 108101085-A0202-12-0302-358
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 189
Figure 108101085-A0202-12-0302-359
<210> 190
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 190
Figure 108101085-A0202-12-0303-360
<210> 191
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 191
Figure 108101085-A0202-12-0303-361
<210> 192
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 192
Figure 108101085-A0202-12-0304-362
<210> 193
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 193
Figure 108101085-A0202-12-0304-363
Figure 108101085-A0202-12-0305-364
<210> 194
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 194
Figure 108101085-A0202-12-0305-365
<210> 195
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 195
Figure 108101085-A0202-12-0306-366
<210> 196
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 196
Figure 108101085-A0202-12-0306-367
Figure 108101085-A0202-12-0307-368
<210> 197
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 197
Figure 108101085-A0202-12-0307-369
<210> 198
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 198
Figure 108101085-A0202-12-0308-370
<210> 199
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 199
Figure 108101085-A0202-12-0308-371
Figure 108101085-A0202-12-0309-372
<210> 200
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 200
Figure 108101085-A0202-12-0309-373
<210> 201
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 201
Figure 108101085-A0202-12-0310-374
<210> 202
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 202
Figure 108101085-A0202-12-0310-375
Figure 108101085-A0202-12-0311-376
<210> 203
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 203
Figure 108101085-A0202-12-0311-377
<210> 204
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 204
Figure 108101085-A0202-12-0312-378
<210> 205
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 205
Figure 108101085-A0202-12-0312-379
Figure 108101085-A0202-12-0313-380
<210> 206
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
Figure 108101085-A0202-12-0313-381
<210> 207
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
Figure 108101085-A0202-12-0314-382
<210> 208
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
Figure 108101085-A0202-12-0314-383
Figure 108101085-A0202-12-0315-384
<210> 209
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 209
Figure 108101085-A0202-12-0315-385
<210> 210
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 210
Figure 108101085-A0202-12-0316-386
<210> 211
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 211
Figure 108101085-A0202-12-0316-387
Figure 108101085-A0202-12-0317-388
<210> 212
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 212
Figure 108101085-A0202-12-0317-389
<210> 213
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 213
Figure 108101085-A0202-12-0318-390
<210> 214
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 214
Figure 108101085-A0202-12-0318-391
Figure 108101085-A0202-12-0319-392
<210> 215
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 215
Figure 108101085-A0202-12-0319-393
<210> 216
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 216
Figure 108101085-A0202-12-0320-394
<210> 217
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 217
Figure 108101085-A0202-12-0320-395
Figure 108101085-A0202-12-0321-396
<210> 218
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 218
Figure 108101085-A0202-12-0321-397
<210> 219
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 219
Figure 108101085-A0202-12-0322-398
<210> 220
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 220
Figure 108101085-A0202-12-0322-399
Figure 108101085-A0202-12-0323-400
<210> 221
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 221
Figure 108101085-A0202-12-0323-401
<210> 222
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 222
Figure 108101085-A0202-12-0324-402
<210> 223
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 223
Figure 108101085-A0202-12-0324-403
Figure 108101085-A0202-12-0325-404
<210> 224
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 224
Figure 108101085-A0202-12-0325-405
<210> 225
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 225
Figure 108101085-A0202-12-0326-406
<210> 226
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 226
Figure 108101085-A0202-12-0326-407
Figure 108101085-A0202-12-0327-408
<210> 227
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 227
Figure 108101085-A0202-12-0327-409
<210> 228
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 228
Figure 108101085-A0202-12-0328-410
<210> 229
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 229
Figure 108101085-A0202-12-0328-411
Figure 108101085-A0202-12-0329-412
<210> 230
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 230
Figure 108101085-A0202-12-0329-413
<210> 231
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 231
Figure 108101085-A0202-12-0330-414
<210> 232
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 232
Figure 108101085-A0202-12-0330-415
Figure 108101085-A0202-12-0331-416
<210> 233
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 233
Figure 108101085-A0202-12-0331-417
<210> 234
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 234
Figure 108101085-A0202-12-0332-418
<210> 235
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 235
Figure 108101085-A0202-12-0332-419
Figure 108101085-A0202-12-0333-420
<210> 236
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 236
Figure 108101085-A0202-12-0333-421
<210> 237
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 237
Figure 108101085-A0202-12-0334-422
<210> 238
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 238
Figure 108101085-A0202-12-0334-423
Figure 108101085-A0202-12-0335-424
<210> 239
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 239
Figure 108101085-A0202-12-0335-425
<210> 240
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 240
Figure 108101085-A0202-12-0336-426
<210> 241
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 241
Figure 108101085-A0202-12-0336-427
Figure 108101085-A0202-12-0337-428
<210> 242
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 242
Figure 108101085-A0202-12-0337-429
<210> 243
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 243
Figure 108101085-A0202-12-0338-430
<210> 244
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 244
Figure 108101085-A0202-12-0338-431
Figure 108101085-A0202-12-0339-432
<210> 245
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 245
Figure 108101085-A0202-12-0339-433
<210> 246
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 246
Figure 108101085-A0202-12-0340-434
<210> 247
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 247
Figure 108101085-A0202-12-0340-435
Figure 108101085-A0202-12-0341-436
<210> 248
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 248
Figure 108101085-A0202-12-0341-437
<210> 249
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 249
Figure 108101085-A0202-12-0342-438
<210> 250
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 250
Figure 108101085-A0202-12-0342-439
Figure 108101085-A0202-12-0343-440
<210> 251
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 251
Figure 108101085-A0202-12-0343-441
<210> 252
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 252
Figure 108101085-A0202-12-0344-442
<210> 253
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 253
Figure 108101085-A0202-12-0344-443
Figure 108101085-A0202-12-0345-444
<210> 254
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 254
Figure 108101085-A0202-12-0345-445
<210> 255
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 255
Figure 108101085-A0202-12-0346-446
<210> 256
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 256
Figure 108101085-A0202-12-0346-447
Figure 108101085-A0202-12-0347-448
<210> 257
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 257
Figure 108101085-A0202-12-0347-449
<210> 258
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 258
Figure 108101085-A0202-12-0348-450
<210> 259
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 259
Figure 108101085-A0202-12-0348-451
Figure 108101085-A0202-12-0349-452
<210> 260
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 260
Figure 108101085-A0202-12-0349-453
<210> 261
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 261
Figure 108101085-A0202-12-0350-454
<210> 262
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 262
Figure 108101085-A0202-12-0350-455
Figure 108101085-A0202-12-0351-456
<210> 263
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 263
Figure 108101085-A0202-12-0351-457
<210> 264
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 264
Figure 108101085-A0202-12-0352-458
<210> 265
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 265
Figure 108101085-A0202-12-0352-459
Figure 108101085-A0202-12-0353-460
<210> 266
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 266
Figure 108101085-A0202-12-0353-461
<210> 267
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 267
Figure 108101085-A0202-12-0354-462
<210> 268
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 268
Figure 108101085-A0202-12-0354-463
Figure 108101085-A0202-12-0355-464
<210> 269
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 269
Figure 108101085-A0202-12-0355-465
<210> 270
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 270
Figure 108101085-A0202-12-0356-466
<210> 271
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 271
Figure 108101085-A0202-12-0356-467
Figure 108101085-A0202-12-0357-468
<210> 272
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 272
Figure 108101085-A0202-12-0357-469
<210> 273
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 273
Figure 108101085-A0202-12-0358-470
<210> 274
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 274
Figure 108101085-A0202-12-0358-471
Figure 108101085-A0202-12-0359-472
<210> 275
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 275
Figure 108101085-A0202-12-0359-473
<210> 276
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 276
Figure 108101085-A0202-12-0360-474
<210> 277
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 277
Figure 108101085-A0202-12-0360-475
Figure 108101085-A0202-12-0361-476
<210> 278
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 278
Figure 108101085-A0202-12-0361-477
<210> 279
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 279
Figure 108101085-A0202-12-0362-478
<210> 280
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 280
Figure 108101085-A0202-12-0362-479
Figure 108101085-A0202-12-0363-480
<210> 281
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 281
Figure 108101085-A0202-12-0363-481
<210> 282
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 282
Figure 108101085-A0202-12-0364-482
<210> 283
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 283
Figure 108101085-A0202-12-0364-483
Figure 108101085-A0202-12-0365-484
<210> 284
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 284
Figure 108101085-A0202-12-0365-485
<210> 285
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 285
Figure 108101085-A0202-12-0366-486
<210> 286
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 286
Figure 108101085-A0202-12-0366-487
Figure 108101085-A0202-12-0367-488
<210> 287
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 287
Figure 108101085-A0202-12-0367-489
<210> 288
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 288
Figure 108101085-A0202-12-0368-490
<210> 289
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 289
Figure 108101085-A0202-12-0368-491
Figure 108101085-A0202-12-0369-492
<210> 290
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 290
Figure 108101085-A0202-12-0369-493
<210> 291
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 291
Figure 108101085-A0202-12-0370-494
<210> 292
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 292
Figure 108101085-A0202-12-0370-495
Figure 108101085-A0202-12-0371-496
<210> 293
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 293
Figure 108101085-A0202-12-0371-497
<210> 294
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 294
Figure 108101085-A0202-12-0372-498
<210> 295
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 295
Figure 108101085-A0202-12-0372-499
Figure 108101085-A0202-12-0373-500
<210> 296
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 296
Figure 108101085-A0202-12-0373-501
<210> 297
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 297
Figure 108101085-A0202-12-0374-502
<210> 298
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 298
Figure 108101085-A0202-12-0374-503
Figure 108101085-A0202-12-0375-504
<210> 299
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 299
Figure 108101085-A0202-12-0375-505
<210> 300
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 300
Figure 108101085-A0202-12-0376-506
<210> 301
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 301
Figure 108101085-A0202-12-0376-507
Figure 108101085-A0202-12-0377-508
<210> 302
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 302
Figure 108101085-A0202-12-0377-509
<210> 303
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 303
Figure 108101085-A0202-12-0378-510
<210> 304
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 304
Figure 108101085-A0202-12-0378-511
Figure 108101085-A0202-12-0379-512
<210> 305
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 305
Figure 108101085-A0202-12-0379-513
<210> 306
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 306
Figure 108101085-A0202-12-0380-514
<210> 307
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 307
Figure 108101085-A0202-12-0380-515
Figure 108101085-A0202-12-0381-516
<210> 308
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 308
Figure 108101085-A0202-12-0381-517
<210> 309
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 309
Figure 108101085-A0202-12-0382-518
<210> 310
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 310
Figure 108101085-A0202-12-0382-519
Figure 108101085-A0202-12-0383-520
<210> 311
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 311
Figure 108101085-A0202-12-0383-521
<210> 312
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 312
Figure 108101085-A0202-12-0384-522
<210> 313
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 313
Figure 108101085-A0202-12-0384-523
Figure 108101085-A0202-12-0385-524
<210> 314
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 314
Figure 108101085-A0202-12-0385-525
<210> 315
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 315
Figure 108101085-A0202-12-0385-526
Figure 108101085-A0202-12-0386-527
<210> 316
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 316
Figure 108101085-A0202-12-0386-528
<210> 317
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 317
Figure 108101085-A0202-12-0387-529
<210> 318
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 318
Figure 108101085-A0202-12-0387-530
Figure 108101085-A0202-12-0388-531
<210> 319
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 319
Figure 108101085-A0202-12-0388-532
<210> 320
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 320
Figure 108101085-A0202-12-0388-533
Figure 108101085-A0202-12-0389-534
Figure 108101085-A0202-12-0390-535
<210> 321
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 321
Figure 108101085-A0202-12-0390-536
Figure 108101085-A0202-12-0391-537
<210> 322
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 322
Figure 108101085-A0202-12-0391-538
Figure 108101085-A0202-12-0392-539
Figure 108101085-A0202-12-0393-540
<210> 323
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 323
Figure 108101085-A0202-12-0393-541
Figure 108101085-A0202-12-0394-542
<210> 324
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 324
Figure 108101085-A0202-12-0394-543
Figure 108101085-A0202-12-0395-544
Figure 108101085-A0202-12-0396-545
<210> 325
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 325
Figure 108101085-A0202-12-0396-546
Figure 108101085-A0202-12-0397-547
<210> 326
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 326
Figure 108101085-A0202-12-0397-548
Figure 108101085-A0202-12-0398-549
Figure 108101085-A0202-12-0399-550
<210> 327
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 327
Figure 108101085-A0202-12-0399-551
Figure 108101085-A0202-12-0400-552
<210> 328
<211> 326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 328
Figure 108101085-A0202-12-0400-553
Figure 108101085-A0202-12-0401-554
<210> 329
<211> 326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 329
Figure 108101085-A0202-12-0401-555
<210> 330
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 330
Figure 108101085-A0202-12-0401-556
<210> 331
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 331
Figure 108101085-A0202-12-0401-557
Figure 108101085-A0202-12-0402-558
<210> 332
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 332
Figure 108101085-A0202-12-0402-559
<210> 333
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 333
Figure 108101085-A0202-12-0402-560
<210> 334
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 334
Figure 108101085-A0202-12-0402-561
Figure 108101085-A0202-12-0403-562
<210> 335
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 335
Figure 108101085-A0202-12-0403-563
<210> 336
<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0403-564
<210> 337
<211> 321
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Figure 108101085-A0202-12-0404-565
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<211> 325
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0404-566
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<211> 325
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0404-567
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<211> 325
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0405-568
<210> 341
<211> 325
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Figure 108101085-A0202-12-0405-569
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<211> 325
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Figure 108101085-A0202-12-0405-570
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<211> 326
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0406-572
<210> 345
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 345
Figure 108101085-A0202-12-0406-573
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<211> 321
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Figure 108101085-A0202-12-0407-574
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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Figure 108101085-A0202-12-0407-575
<210> 348
<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0407-576
Figure 108101085-A0202-12-0408-577
<210> 349
<211> 324
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0408-578
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0408-579
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0408-580
Figure 108101085-A0202-12-0409-581
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Figure 108101085-A0202-12-0409-582
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0409-583
<210> 354
<211> 321
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Figure 108101085-A0202-12-0409-584
Figure 108101085-A0202-12-0410-585
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0410-586
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<211> 321
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Figure 108101085-A0202-12-0410-587
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<211> 321
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Figure 108101085-A0202-12-0411-588
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0411-589
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<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0411-590
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0412-591
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<211> 321
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0412-592
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<211> 321
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0412-593
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0413-594
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<211> 362
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0413-595
<210> 365
<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0413-596
Figure 108101085-A0202-12-0414-597
<210> 366
<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0414-598
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0414-599
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0414-600
Figure 108101085-A0202-12-0415-601
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<211> 360
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Figure 108101085-A0202-12-0415-602
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0415-603
<210> 371
<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0415-604
Figure 108101085-A0202-12-0416-605
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<211> 360
<212> DNA
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<400> 373
Figure 108101085-A0202-12-0416-607
<210> 374
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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<400> 374
Figure 108101085-A0202-12-0416-608
Figure 108101085-A0202-12-0417-609
<210> 375
<211> 360
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<400> 375
Figure 108101085-A0202-12-0417-610
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0417-611
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0418-612
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<211> 360
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Figure 108101085-A0202-12-0418-613
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<211> 360
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Figure 108101085-A0202-12-0418-614
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<211> 360
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Figure 108101085-A0202-12-0419-615
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Figure 108101085-A0202-12-0419-616
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Figure 108101085-A0202-12-0419-617
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Figure 108101085-A0202-12-0420-618
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Figure 108101085-A0202-12-0421-623
Figure 108101085-A0202-12-0422-624
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<210> 391
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<400> 391
Figure 108101085-A0202-12-0422-627
Figure 108101085-A0202-12-0423-628
<210> 392
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<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0423-629
<210> 393
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<212> DNA
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<400> 393
Figure 108101085-A0202-12-0423-630
<210> 394
<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0423-631
Figure 108101085-A0202-12-0424-632
<210> 395
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<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0424-633
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Figure 108101085-A0202-12-0424-634
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<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0425-635
<210> 398
<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0425-636
<210> 399
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Figure 108101085-A0202-12-0426-638
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<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0426-639
<210> 402
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<400> 402
Figure 108101085-A0202-12-0426-640
<210> 403
<211> 360
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 403
Figure 108101085-A0202-12-0427-641
<210> 404
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 404
Figure 108101085-A0202-12-0427-642
<210> 405
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 405
Figure 108101085-A0202-12-0427-643
<210> 406
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 406
Figure 108101085-A0202-12-0428-644
<210> 407
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 407
Figure 108101085-A0202-12-0428-645
<210> 408
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 408
Figure 108101085-A0202-12-0428-646
Figure 108101085-A0202-12-0429-647
<210> 409
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 409
Figure 108101085-A0202-12-0429-648
<210> 410
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 410
Figure 108101085-A0202-12-0429-649
<210> 411
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 411
Figure 108101085-A0202-12-0429-650
Figure 108101085-A0202-12-0430-651
<210> 412
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 412
Figure 108101085-A0202-12-0430-652
<210> 413
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 413
Figure 108101085-A0202-12-0430-653
<210> 414
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 414
Figure 108101085-A0202-12-0430-654
Figure 108101085-A0202-12-0431-655
<210> 415
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 415
Figure 108101085-A0202-12-0431-656
<210> 416
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
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Figure 108101085-A0202-12-0431-657
<210> 417
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0432-658
<210> 418
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<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0432-659
<210> 419
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Figure 108101085-A0202-12-0432-660
<210> 420
<211> 360
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 420
Figure 108101085-A0202-12-0433-661
<210> 421
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 421
Figure 108101085-A0202-12-0433-662
<210> 422
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 422
Figure 108101085-A0202-12-0433-663
<210> 423
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0434-664
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<211> 360
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<220>
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<400> 424
Figure 108101085-A0202-12-0434-665
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<211> 360
<212> DNA
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<220>
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<400> 425
Figure 108101085-A0202-12-0434-666
<210> 426
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0435-667
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0435-668
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0435-669
Figure 108101085-A0202-12-0436-670
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0436-671
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<211> 360
<212> DNA
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Figure 108101085-A0202-12-0436-672
<210> 431
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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<400> 431
Figure 108101085-A0202-12-0436-673
Figure 108101085-A0202-12-0437-674
<210> 432
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0437-675
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<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0437-676
<210> 434
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0437-677
Figure 108101085-A0202-12-0438-678
<210> 435
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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<400> 435
Figure 108101085-A0202-12-0438-679
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<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0438-680
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<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0438-681
Figure 108101085-A0202-12-0439-682
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Figure 108101085-A0202-12-0439-683
<210> 439
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0439-684
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<211> 360
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<211> 360
<212> DNA
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0440-686
<210> 442
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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<400> 442
Figure 108101085-A0202-12-0440-687
<210> 443
<211> 360
<212> DNA
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<220>
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<400> 443
Figure 108101085-A0202-12-0441-688
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Figure 108101085-A0202-12-0441-689
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0441-690
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0442-691
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<211> 360
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Figure 108101085-A0202-12-0442-693
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Figure 108101085-A0202-12-0443-695
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<211> 360
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Figure 108101085-A0202-12-0443-696
Figure 108101085-A0202-12-0444-697
<210> 452
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Figure 108101085-A0202-12-0444-699
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Figure 108101085-A0202-12-0444-700
Figure 108101085-A0202-12-0445-701
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<220>
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Figure 108101085-A0202-12-0445-704
Figure 108101085-A0202-12-0446-705
<210> 458
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Figure 108101085-A0202-12-0446-706
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Figure 108101085-A0202-12-0446-707
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Figure 108101085-A0202-12-0447-710
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Figure 108101085-A0202-12-0448-711
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Figure 108101085-A0202-12-0449-715
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Figure 108101085-A0202-12-0449-716
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Figure 108101085-A0202-12-0450-718
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Figure 108101085-A0202-12-0450-719
Figure 108101085-A0202-12-0451-720
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Figure 108101085-A0202-12-0451-721
<210> 473
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Figure 108101085-A0202-12-0451-722
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<211> 369
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<220>
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<400> 474
Figure 108101085-A0202-12-0452-723
<210> 475
<211> 369
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<400> 475
Figure 108101085-A0202-12-0452-724
<210> 476
<211> 369
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<400> 476
Figure 108101085-A0202-12-0452-725
Figure 108101085-A0202-12-0453-726
<210> 477
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<400> 477
Figure 108101085-A0202-12-0453-727
<210> 478
<211> 369
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<400> 478
Figure 108101085-A0202-12-0453-728
<210> 479
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 479
Figure 108101085-A0202-12-0453-729
Figure 108101085-A0202-12-0454-730
<210> 480
<211> 369
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<400> 480
Figure 108101085-A0202-12-0454-731
<210> 481
<211> 369
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<223> 合成多核苷酸
<400> 481
Figure 108101085-A0202-12-0454-732
<210> 482
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 482
Figure 108101085-A0202-12-0455-733
<210> 483
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 483
Figure 108101085-A0202-12-0455-734
<210> 484
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 484
Figure 108101085-A0202-12-0455-735
Figure 108101085-A0202-12-0456-736
<210> 485
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 485
Figure 108101085-A0202-12-0456-737
<210> 486
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 486
Figure 108101085-A0202-12-0456-738
<210> 487
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 487
Figure 108101085-A0202-12-0456-739
Figure 108101085-A0202-12-0457-740
<210> 488
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 488
Figure 108101085-A0202-12-0457-741
<210> 489
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 489
Figure 108101085-A0202-12-0457-742
<210> 490
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 490
Figure 108101085-A0202-12-0457-743
<210> 491
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 491
Figure 108101085-A0202-12-0458-744
<210> 492
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 492
Figure 108101085-A0202-12-0458-745
<210> 493
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 493
Figure 108101085-A0202-12-0458-746
<210> 494
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 494
Figure 108101085-A0202-12-0458-747
Figure 108101085-A0202-12-0459-748
<210> 495
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 495
Figure 108101085-A0202-12-0459-749
<210> 496
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 496
Figure 108101085-A0202-12-0459-750
<210> 497
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 497
Figure 108101085-A0202-12-0459-751
<210> 498
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 498
Figure 108101085-A0202-12-0460-752
<210> 499
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 499
Figure 108101085-A0202-12-0460-753
<210> 500
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 500
Figure 108101085-A0202-12-0460-754
<210> 501
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 501
Figure 108101085-A0202-12-0460-755
Figure 108101085-A0202-12-0461-756
<210> 502
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 502
Figure 108101085-A0202-12-0461-757
<210> 503
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 503
Figure 108101085-A0202-12-0461-758
Figure 108101085-A0202-12-0462-759
<210> 504
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 504
Figure 108101085-A0202-12-0462-760
Figure 108101085-A0202-12-0463-761
<210> 505
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 505
Figure 108101085-A0202-12-0463-762
Figure 108101085-A0202-12-0464-763
<210> 506
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 506
Figure 108101085-A0202-12-0464-764
Figure 108101085-A0202-12-0465-765
<210> 507
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 507
Figure 108101085-A0202-12-0465-766
Figure 108101085-A0202-12-0466-767
<210> 508
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 508
Figure 108101085-A0202-12-0466-768
Figure 108101085-A0202-12-0467-769
<210> 509
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 509
Figure 108101085-A0202-12-0467-770
Figure 108101085-A0202-12-0468-771
<210> 510
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 510
Figure 108101085-A0202-12-0468-772
Figure 108101085-A0202-12-0469-773
<210> 511
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 511
Figure 108101085-A0202-12-0469-774
Figure 108101085-A0202-12-0470-775
<210> 512
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 512
Figure 108101085-A0202-12-0470-776
Figure 108101085-A0202-12-0471-777
<210> 513
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 513
Figure 108101085-A0202-12-0471-778
Figure 108101085-A0202-12-0472-779
<210> 514
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 514
Figure 108101085-A0202-12-0472-780
Figure 108101085-A0202-12-0473-781
<210> 515
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 515
Figure 108101085-A0202-12-0473-782
Figure 108101085-A0202-12-0474-783
<210> 516
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 516
Figure 108101085-A0202-12-0474-784
Figure 108101085-A0202-12-0475-785
<210> 517
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 517
Figure 108101085-A0202-12-0475-786
Figure 108101085-A0202-12-0476-787
<210> 518
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 518
Figure 108101085-A0202-12-0476-788
Figure 108101085-A0202-12-0477-789
<210> 519
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 519
Figure 108101085-A0202-12-0477-790
Figure 108101085-A0202-12-0478-791
Figure 108101085-A0202-12-0479-792
<210> 520
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 520
Figure 108101085-A0202-12-0479-793
Figure 108101085-A0202-12-0480-794
Figure 108101085-A0202-12-0481-795
<210> 521
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 521
Figure 108101085-A0202-12-0481-796
Figure 108101085-A0202-12-0482-797
Figure 108101085-A0202-12-0483-798
<210> 522
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 522
Figure 108101085-A0202-12-0483-799
Figure 108101085-A0202-12-0484-800
Figure 108101085-A0202-12-0485-801
<210> 523
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 523
Figure 108101085-A0202-12-0485-802
Figure 108101085-A0202-12-0486-803
Figure 108101085-A0202-12-0487-804
<210> 524
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 524
Figure 108101085-A0202-12-0487-805
Figure 108101085-A0202-12-0488-806
Figure 108101085-A0202-12-0489-807
<210> 525
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 525
Figure 108101085-A0202-12-0489-808
Figure 108101085-A0202-12-0490-809
Figure 108101085-A0202-12-0491-810
<210> 526
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 526
Figure 108101085-A0202-12-0491-811
Figure 108101085-A0202-12-0492-812
Figure 108101085-A0202-12-0493-813
<210> 527
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 527
Figure 108101085-A0202-12-0493-814
Figure 108101085-A0202-12-0494-815
Figure 108101085-A0202-12-0495-816
<210> 528
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 528
Figure 108101085-A0202-12-0495-817
Figure 108101085-A0202-12-0496-818
Figure 108101085-A0202-12-0497-819
<210> 529
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 529
Figure 108101085-A0202-12-0497-820
Figure 108101085-A0202-12-0498-821
Figure 108101085-A0202-12-0499-822
<210> 530
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 530
Figure 108101085-A0202-12-0499-823
Figure 108101085-A0202-12-0500-824
Figure 108101085-A0202-12-0501-825
<210> 531
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 531
Figure 108101085-A0202-12-0501-826
Figure 108101085-A0202-12-0502-827
Figure 108101085-A0202-12-0503-828
<210> 532
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 532
Figure 108101085-A0202-12-0503-829
Figure 108101085-A0202-12-0504-830
Figure 108101085-A0202-12-0505-831
<210> 533
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 533
Figure 108101085-A0202-12-0505-832
Figure 108101085-A0202-12-0506-833
Figure 108101085-A0202-12-0507-834
<210> 534
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 534
Figure 108101085-A0202-12-0507-835
Figure 108101085-A0202-12-0508-836
Figure 108101085-A0202-12-0509-837
<210> 535
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 535
Figure 108101085-A0202-12-0509-838
Figure 108101085-A0202-12-0510-839
Figure 108101085-A0202-12-0511-841
<210> 536
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 536
Figure 108101085-A0202-12-0511-842
Figure 108101085-A0202-12-0512-843
Figure 108101085-A0202-12-0513-844
<210> 537
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 537
Figure 108101085-A0202-12-0513-845
Figure 108101085-A0202-12-0514-846
<210> 538
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 538
Figure 108101085-A0202-12-0514-847
<210> 539
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 539
Figure 108101085-A0202-12-0514-848
Figure 108101085-A0202-12-0515-849
<210> 540
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 540
Figure 108101085-A0202-12-0515-850
<210> 541
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 541
Figure 108101085-A0202-12-0515-851
Figure 108101085-A0202-12-0516-852
<210> 542
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 542
Figure 108101085-A0202-12-0516-853
<210> 543
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 543
Figure 108101085-A0202-12-0516-854
Figure 108101085-A0202-12-0517-855
<210> 544
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 544
Figure 108101085-A0202-12-0517-856
<210> 545
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 545
Figure 108101085-A0202-12-0518-857
<210> 546
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 546
Figure 108101085-A0202-12-0518-858
<210> 547
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 547
Figure 108101085-A0202-12-0519-859
<210> 548
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 548
Figure 108101085-A0202-12-0519-860
<210> 549
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 549
Figure 108101085-A0202-12-0520-861
<210> 550
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 550
Figure 108101085-A0202-12-0520-862
<210> 551
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 551
Figure 108101085-A0202-12-0521-863
<210> 552
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 552
Figure 108101085-A0202-12-0521-864
Figure 108101085-A0202-12-0522-865
<210> 553
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 553
Figure 108101085-A0202-12-0522-866
Figure 108101085-A0202-12-0523-867
<210> 554
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 554
Figure 108101085-A0202-12-0523-868
Figure 108101085-A0202-12-0524-869
<210> 555
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 555
Figure 108101085-A0202-12-0524-870
<210> 556
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 556
Figure 108101085-A0202-12-0525-871
<210> 557
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 557
Figure 108101085-A0202-12-0526-872
<210> 558
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 558
Figure 108101085-A0202-12-0526-873
Figure 108101085-A0202-12-0527-874
<210> 559
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 559
Figure 108101085-A0202-12-0527-875
Figure 108101085-A0202-12-0528-876
<210> 560
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 560
Figure 108101085-A0202-12-0528-877
Figure 108101085-A0202-12-0529-878
<210> 561
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 561
Figure 108101085-A0202-12-0529-879
Figure 108101085-A0202-12-0530-880
<210> 562
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 562
Figure 108101085-A0202-12-0530-881
Figure 108101085-A0202-12-0531-882
<210> 563
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 563
Figure 108101085-A0202-12-0531-883
Figure 108101085-A0202-12-0532-884
<210> 564
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 564
Figure 108101085-A0202-12-0532-885
<210> 565
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 565
Figure 108101085-A0202-12-0533-886
<210> 566
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 566
Figure 108101085-A0202-12-0534-887
<210> 567
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 567
Figure 108101085-A0202-12-0534-888
Figure 108101085-A0202-12-0535-889
<210> 568
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 568
Figure 108101085-A0202-12-0535-890
Figure 108101085-A0202-12-0536-891
<210> 569
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 569
Figure 108101085-A0202-12-0536-892
Figure 108101085-A0202-12-0537-893

Claims (27)

  1. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，該分離的抗體或其抗原結合片段特異性地結合人垂體腺苷酸環化酶激活多肽I型受體(PAC1)，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區以及包含互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區，其中：(a)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和171的序列；(b)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、116和171的序列；(c)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、134和171的序列；(d)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：92、145和174的序列；(e)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、108和172的序列；(f)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO： 88、128和172的序列；(g)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、134和171的序列；或(h)CDRL1、CDRL2和CDRL3分別具有SEQ ID NO：12、26和36的序列，並且CDRH1、CDRH2和CDRH3分別具有SEQ ID NO：88、153和171的序列。
  2. 如請求項1之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含(i)與選自SEQ ID NO：54、55及62的序列具有至少90%同一性的序列，(ii)與選自SEQ ID NO：54、55及62的序列具有至少95%同一性的序列，或(iii)選自SEQ ID NO：54、55及62的序列。
  3. 如請求項1之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含(i)與選自SEQ ID NO：194、203、214、228、240、274及282的序列具有至少90%同一性的序列，(ii)與選自SEQ ID NO：194、203、214、228、240、274及282的序列具有至少95%同一性的序列，或(iii)選自SEQ ID NO：194、203、214、228、240、274及282的序列。
  4. 如請求項1之分離的抗體或其抗原結合片段，其中：(a)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：54的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：194的序列；(b)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：54的序列，並且該重鏈可變 區包含SEQ ID NO：203的序列；(c)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：228的序列；(d)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：274的序列；(e)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：54的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：214的序列；(f)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：240的序列；(g)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：54的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：228的序列；或(h)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：62的序列，並且該重鏈可變區包含SEQ ID NO：282的序列。
  5. 如請求項1之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係單株抗體或其抗原結合片段。
  6. 如請求項5之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段係人源化抗體或其抗原結合片段、或全人源抗體或其抗原結合片段。
  7. 如請求項5之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體係人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
  8. 如請求項7之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體係無糖基化的人IgG1抗體。
  9. 如請求項8之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含在其重鏈中根據EU編號在胺基酸位置N297處的突變。
  10. 如請求項9之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該突變係N297G。
  11. 如請求項9之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體進一步包含在其重鏈中根據EU編號的R292C和V302C突變。
  12. 如請求項1之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段抑制PACAP誘導的大鼠PAC1的激活，其中藉由基於細胞的cAMP測定所測量，IC50小於10nM。
  13. 一種特異性結合人PAC1的分離的抗體，其中該抗體包含輕鏈和重鏈，其中：(a)該輕鏈包含SEQ ID NO：506的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：521的序列；(b)該輕鏈包含SEQ ID NO：506的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：522的序列；(c)該輕鏈包含SEQ ID NO：504的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：523的序列；(d)該輕鏈包含SEQ ID NO：504的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：524的序列；(e)該輕鏈包含SEQ ID NO：506的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：525的序列；(f)該輕鏈包含SEQ ID NO：504的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：526的序列；(g)該輕鏈包含SEQ ID NO：506的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：523的序列；或(h)該輕鏈包含SEQ ID NO：507的序列，並且該重鏈包含SEQ ID NO：527的序列。
  14. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1至13中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段、以及藥學上可接受的賦形劑。
  15. 一種分離的聚核苷酸，該分離的聚核苷酸編碼如請求項1至13中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段。
  16. 一種表現載體，該表現載體包含如請求項15之聚核苷酸。
  17. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項16之表現載體。
  18. 一種產生特異性結合人PAC1的抗體或其抗原結合片段之方法，該方 法包括在允許該抗體或其抗原結合片段表現的條件下培養如請求項17之宿主細胞；以及從該培養基或宿主細胞中回收該抗體或其抗原結合片段。
  19. 一種如請求項1至13中任一項之分離的抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備在有需要的患者中治療或預防頭痛病況之醫藥品。
  20. 如請求項19之用途，其中該頭痛病況係偏頭痛或叢集性頭痛。
  21. 如請求項20之用途，其中該偏頭痛係發作性偏頭痛或慢性偏頭痛。
  22. 如請求項19至21中任一項之用途，其中該治療係預防性治療。
  23. 如請求項19至21中任一項之用途，其中該醫藥品係經調配與急性頭痛治療劑或預防性頭痛治療劑作為組合療法投與。
  24. 如請求項23之用途，其中該急性頭痛治療劑係5HT1B、5HT1D和/或5HT1F血清素受體激動劑、非類固醇抗炎藥或類鴉片物質。
  25. 如請求項24之用途，其中該血清素受體激動劑係曲坦(triptan)或麥角胺(ergotamine)。
  26. 如請求項23之用途，其中該預防性頭痛治療劑係抗癲癇藥、β-受體阻斷劑、抗抑鬱劑、肉毒桿菌素A(onabotulinum toxin A)、或CGRP途徑拮 抗劑。
  27. 如請求項26之用途，其中該CGRP途徑拮抗劑係厄瑞奴單抗(erenumab)。
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UY (1) UY38050A (zh)
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4087590A4 (en) * 2020-01-12 2024-05-15 Univ Vanderbilt HUMAN ANTIBODIES AGAINST CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS
IL296427A (en) * 2020-03-19 2022-11-01 Genentech Inc Isoform-selective anti-tgf antibodies and methods of use

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201522375A (zh) * 2013-03-15 2015-06-16 安美基公司 人類ｐａｃ１抗體

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
WO1991014786A1 (en) 1990-03-17 1991-10-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody to pituitary adenylate cyclase activating peptide-pacap, hybridoma and assay for pacap
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
AU2249592A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Dnx Corporation Production of human hemoglobin in transgenic pigs
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
EP0618291A3 (en) 1993-02-26 1997-12-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US6399316B1 (en) 1994-02-25 2002-06-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6462016B1 (en) 1995-10-06 2002-10-08 Shiseido Company, Ltd. Method for screening agonist or antagonist of the maxadilan receptor participating in vasodilating action, and compound found by the method
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6017533A (en) 1996-04-25 2000-01-25 Shiseido Company, Ltd. Peptides having specific affinity to pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type 1 receptors
DK0942968T3 (da) 1996-12-03 2008-06-23 Amgen Fremont Inc Fuldt humane antistoffer, der binder EGFR
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
HUP0104934A3 (en) 1998-07-20 2002-05-28 Sod Conseils Rech Applic Peptide analogues of pacap, pharmaceutical compositions comprising thereof and their use
US6242563B1 (en) 1998-07-20 2001-06-05 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Peptide analogues
US20020155533A1 (en) 1998-11-30 2002-10-24 Takeda Chemical PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US20020182729A1 (en) 2001-01-11 2002-12-05 Dicicco-Bloom Emanuel Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) is an anti-mitogenic signal for selected neuronal precursors in vivo
CA2454587C (en) 2001-07-25 2012-11-13 Protein Design Labs, Inc. Stable lyophilized pharmaceutical formulation of igg antibodies
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2005056606A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
US7842808B2 (en) 2002-06-05 2010-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Anti-migraine spirocycles
US7220862B2 (en) 2002-06-05 2007-05-22 Bristol-Myers Squibb Company Calcitonin gene related peptide receptor antagonists
WO2004062684A2 (en) 2003-01-16 2004-07-29 D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijs En Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven Treatment of thrombocytopenia with inhibitors of pacap
US20050129687A1 (en) 2003-11-03 2005-06-16 University Of Vermont And State Agricultural College Use of inhibitors of PACAP receptor activity for treatment of overactive bladder and pelvic floor pain syndrome
AR046787A1 (es) 2003-12-05 2005-12-21 Bristol Myers Squibb Co Agentes antimigrana heterociclicos
WO2005073164A1 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Peplin Biolipids Pty Ltd Therapeutic and carrier molecules
TW200533398A (en) 2004-03-29 2005-10-16 Bristol Myers Squibb Co Novel therapeutic agents for the treatment of migraine
DE102004063753A1 (de) 2004-12-29 2006-07-13 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verwendung ausgewählter CGRP-Antagonisten in Kombination mit anderen Arzneistoffen gegen Migräne für die Behandlung von Migräne
AR053579A1 (es) 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP2179741B1 (en) 2005-08-26 2014-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treatment of headaches by administraton of oxytocin
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
PT2380592T (pt) 2005-11-14 2018-06-06 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Anticorpos antagonistas dirigidos contra o péptido relacionado com o gene da calcitonina e métodos utilizando os mesmos
AU2006316642A1 (en) 2005-11-18 2007-05-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Spirolactam tricyclic CGRP receptor antagonists
WO2007076336A1 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
SG170750A1 (en) 2006-03-17 2011-05-30 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
BRPI0711352A2 (pt) 2006-05-09 2011-09-27 Merck & Co Inc composto, composição farmacêutica, e, métodos para o antagonismo de atividade receptora de cgrp em um mamìfero, e para, tratar, controlar, melhorar ou reduzir o risco de dor de cabeça, enxaqueca , ou cefaléia vascular
US20100112601A1 (en) 2006-08-08 2010-05-06 Kyoto University Novel monoclonal antibody and use of the same
NZ579594A (en) 2007-03-12 2012-03-30 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies
JP2010523663A (ja) 2007-04-11 2010-07-15 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 第３級アミド、スルホンアミド、カルバミン酸及び尿素末端基をもつｃｇｒｐ受容体アンタゴニスト
US8143266B2 (en) 2007-04-16 2012-03-27 Merck, Sharp & Dohme Corp Aryl heterocyclic CGRP receptor antagonists
US8793074B2 (en) 2007-06-21 2014-07-29 Saint Louis University Sequence covariance networks, methods and uses therefor
CN103435696B (zh) 2007-06-25 2016-10-12 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体
WO2009033489A2 (en) 2007-09-11 2009-03-19 Glostrup Hospital Selective pacl inhibitors for use in the treatment of migraine and headaches
EP2299813B1 (en) 2008-06-12 2015-12-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Branched 3- and 6-substituted quinolines as cgrp receptor antagonists
US20110229423A1 (en) 2008-07-18 2011-09-22 Galderma Research & Development Pacap signaling pathway modulators for treating inflammatory skin diseases having a neurogenic component, notably rosacea, and compositions comprised thereof
WO2010033421A1 (en) 2008-09-18 2010-03-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Bicyclic dihydroimidazolone cgrp receptor antagonists
US8685965B2 (en) 2008-10-03 2014-04-01 Merck Sharp & Dohme Corp. CGRP receptor antagonists
CN101434649B (zh) 2008-12-12 2012-04-25 余榕捷 一种环七肽及其制备方法和应用
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
CN102686221B (zh) 2009-07-27 2018-04-17 诺西赛普塔有限责任公司 治疗疼痛的方法
BR112012017164A2 (pt) 2009-12-22 2019-09-24 Novartis Ag proteína de fusão de região constante de anticorpo-cd47 tetravalente
AU2011239470B2 (en) * 2010-04-15 2015-09-10 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Antibodies for the treatment of Clostridium difficile-associated infection and disease
AR081434A1 (es) 2010-06-10 2012-08-29 Lilly Co Eli Anticuerpo del peptido relacionado con el gen calcitonina (cgrp), composicion farmaceutica que lo comprende, uso de dicho anticuerpo para preparar un medicamento util para tratar dolor de osteoartritis o migranas y fragmento de union a antigeno de dicho anticuerpo
BR112013000951A2 (pt) 2010-07-12 2016-05-17 Covx Technologies Ireland Ltd conjungados de anticorpo multifuncionais
WO2012125850A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Amgen Inc. Fc variants
TWI622597B (zh) * 2011-03-28 2018-05-01 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
ES2873837T3 (es) 2011-05-20 2021-11-04 H Lundbeck As Composiciones anti CGRP y uso de las mismas
CA3111357A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
EP2852618A2 (en) 2012-05-21 2015-04-01 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for improving safety of blood-brain barrier transport
US9546203B2 (en) * 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
WO2016044224A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
EP3283103A4 (en) * 2015-04-15 2018-12-05 Medimmune, LLC Methods for treating clostridium difficile infection and associated disease
WO2016168762A2 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-pacap antibodies and uses thereof
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
MA43567A (fr) 2015-12-15 2018-11-14 Amgen Inc Anticorps pacap et leurs utilisations

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201522375A (zh) * 2013-03-15 2015-06-16 安美基公司 人類ｐａｃ１抗體

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Publication number Publication date
AU2019207915A1 (en) 2020-07-16
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