JPH10513049A

JPH10513049A - Ｅｐｈ様受容体リガンド

Info

Publication number: JPH10513049A
Application number: JP8523019A
Authority: JP
Inventors: バートリイ，テイモシー・デイー; フオツクス，ゲイリー・エム
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1995-01-27
Filing date: 1996-01-16
Publication date: 1998-12-15
Also published as: US6063903A; AU4904796A; WO1996023000A1; US6057124A; AU709889B2; CA2210644A1; US6169167B1; US20050106674A1; MX9705624A; EP0805820A1

Abstract

(57)【要約】１種以上のＥＰＨ様受容体、特にＨＥＫ４受容体と結合するポリペプチドを開示する。このポリペプチドをＨＥＫ４結合タンパク質と呼称する。ＨＥＫ４結合タンパク質をコードする核酸、並びにこのポリペプチドの作製に用いられる発現ベクター、宿主細胞及び方法も開示する。本発明のポリペプチドは肝臓、腎臓、肺、皮膚、消化管及び神経系を含めた様々な組織の成長及び／または分化の調節に有用であり、傷害されたかまたは消耗した組織の再生、及び癌または神経系障害の治療にも用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】ＥＰＨ様受容体リガンド本発明は、１種以上のＥＰＨ様受容体と結合するポリペプチドに係わる。本発明は特に、ＨＥＫ４受容体と結合するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、並びに該ポリペプチドの作製に用いられる発現ベクター及び宿主細胞に係わる。発明の背景細胞がその環境に対して示す応答はしばしば、可溶性タンパク質である成長及び分化因子によって媒介される。前記因子はその作用を、トランスメンブラン受容体と結合して該受容体を活性化することにより発揮する。この相互作用は、最終的に細胞の生物応答に至るカスケードの最初の事象である。重要なトランスメンブラン受容体群の一つに、受容体プロテインチロシンキナーゼ類（ｖａｎｄｅｒＧｅｅｒ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｊｏｌ．１０，ｐｐ．２５１−３３７，１９９４で検討された受容体ＰＴＫ）が有る。ＰＴＫは、この受容体の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドと特異的に相互作用する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインとから成る。受容体ＰＴＫは、リガンドが媒介するダイマー化と、続く細胞質ドメインのチロシン残基の自己リン酸化とによって活性化される。活性化された受容体ＰＴＫは、シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）経路内の基質分子をリン酸化して細胞応答を実現し得る。受容体ＰＴＫファミリーは、細胞外ドメインの一般的な構造及び触媒ドメイン内のアミノ酸配列関係に基づいて幾つかのサブファミリーに分割できる。受容体プロテインチロシンキナーゼの現在既知のサブファミリーのなかで最大のものは、少なくとも１３の受容体メンバーが属するＥＰＨ様受容体類である。このサブファミリーに属する受容体には、ＥＰＨ（Ｈｉｒａｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８，ｐｐ．１７１７−１７２５，１９８７）、ＥＣＫ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｊｏｌ．１０，ｐｐ．６３１６−６３２４，１９９０）、Ｃｅｋ４、Ｃｅｋ５、Ｃｅｋ６、Ｃｅｋ７、Ｃｅｋ８、Ｃｅｋ９、Ｃｅｋ１０（Ｐａｓｑｕａｌｅ，ＣｅｌｌＲｅｇｕｌａｔｊｏｎ２，ｐｐ．５２３−５３４，１９９１；Ｓａｊｊａｄｉ等，ＴｈｅＮｅｗＢｉｏｌｏｇｉｓｔ３，ｐｐ．７６９−７７８，１９９１；Ｓａｊｊａｄｉ及びＰａｓｑｕａｌｅ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，ｐｐ．１８０７−１８１３，１９９３）、Ｅｅｋ、Ｅｒｋ（Ｃｈａｎ及びＷａｔｔ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６，ｐｐ．１０５７−１０６１，１９９１）、Ｅｈｋ１、Ｅｈｋ２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，ｐｐ．３２７７−３２８８，１９９３）、ＨＥＫ（国際特許出願公開第９３／００４２５号；Ｗｉｃｋｓ等，ＰＮＡＳ８９，ｐｐ．１６１１−１６１５，１９９２）、ＨＥＫ２（Ｂｏｈｍｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８，ｐｐ．２８５７−２８６２，１９９３）、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８、ＨＥＫ１１（米国特許出願第０８／２２９，５０９号）、及びＨＴＫ（Ｂｅｎｎｅｔｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，ｐｐ．１４２１１−１４２１８，１９９４）が含まれる。最近まで、ＥＰＨサブファミリーに属するいずれの受容体のリガンドも同定されていなかった。ＥＣＫ受容体のリガンドは国際特許出願公開第９４／１１０２０号及びＢａｒｔｌｅｙ等，Ｎａｔｕｒｅ３６８，ｐｐ．５５８ −５６０，１９９４に開示され、かつそれ以前に、機能が未知であるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのＢ６１として同定された（Ｈｏｌｚｍａｎ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，ｐｐ．５８３０−５８３８，１９９０）。Ｅｌｋ及びＥｈｋ１受容体のリガンドも報告されている（国際特許出願公開第９４／１１３８４号；Ｄａｖｉｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，ｐｐ．８１６−８１９，１９９４）。ごく最近、マウス胚中脳及び後脳ｃＤＮＡライブラリーから同定されたポリペプチド（ＥＬＦ−１）がＭｅｋ４及びＳｅｋのリガンドであることが報告された（Ｃｈｅｎｇ及びＦｌａｎａｇａｎ，Ｃｅｌｌ７９，ｐｐ．１５７−１６８，１９９４）。複雑な生物流体から可溶性因子を精製する試みのほとんどは、刺激に対する当該因子の応答を細胞ベースでバイオアッセイすることに依拠していた。上記応答には、細胞の増殖率または生存率の上昇、ＤＮＡ合成の亢進、走化性応答、または他の幾つかの、下流に現われる受容体活性化の結果が含まれる。受容体の自己リン酸化も、細胞の刺激を検出するアッセイとして用いられている。本発明者は最近、受容体／リガンド結合の直接検出と、受容体親和性クロマトグラフィーを用いる精製とに基づくリガンド単離方法について述べた（Ｂａｒｔｌｅｙ等，上掲誌）。ここに本発明者は、受容体チロシンキナーゼのＥＰＨサブファミリーに対応する一群のリガンドのうちの一つを精製し、配列決定し、かつその分子をクローン化することへの上記方法の適用を報告する。ＥＰＨサブファミリーは受容体ＰＴＫの既知のサブファミリーのなかで最大ではあるが、ＥＰＨサブファミリーの受容体と結合してこれを活性化するリガンドは僅かしか同定されていない。従って本発明は、ＥＰＨサブファミリーに属する受容体ＰＴＫのリガンドでこれまで同定されていないものを同定することを目的とする。そのようなリガンドは、ＥＰＨサブファミリーの受容体を有する細胞の応答を調節するのに有用である。発明の概要本発明は、１種以上のＥＰＨ様受容体ＰＴＫと結合し得るポリペプチドに係わる。本発明は特に、ＨＥＫ４受容体と結合するが、ＥＰＨ様受容体ＰＴＫサブファミリーに属する他の受容体とも結合し得るポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドをＨＥＫ４結合タンパク質（ＨＥＫ４ＢＰ）と呼称する。一具体例において、本発明のポリペプチドはＨＥＫ４及びＥＣＫ受容体と結合してこれらを活性化する。本発明は、ＨＥＫ４ＢＰをコードする核酸、及びＨＥＫ４ＢＰ核酸とハイブリダイズする、ＨＥＫ４ＢＰの少なくとも一つの生物学的特性を具えたポリペプチドをコードする核酸も包含する。生物学的に活性なＨＥＫ４ＢＰフラグメント及び類似体とこれらをコードする核酸、並びにＨＥＫ４ＢＰを含む融合タンパク質も本発明に包含される。生物学的に活性なＨＥＫ４ＢＰの作製に用いられる発現ベクター及び宿主細胞、並びに前記発現ベクター及び宿主細胞を用いてＨＥＫ４ＢＰを作製する方法も本発明の範囲内である。本発明は、ＨＥＫ４ＢＰと特異的に結合する抗体も提供する。本発明のポリペプチドは、ＥＰＨサブファミリーの受容体を有する細胞、特にＨＥＫ４またはＥＣＫ受容体を発現させる細胞の成長及び／または分化を調節する（即ち促進または抑制する）のに有用である。様々な組織のＨＥＫ４、ＥＣＫ及びＨＥＫ４ＢＰ発現レベルから、ＨＥＫ４ＢＰは例えば肝臓、腎臓、肺、皮膚または神経組織の成長及び／または分化の調節に有用であると考えられる。哺乳動物へのＨＥＫ４ＢＰの投与は、神経系障害の治療、及び傷害されたかまたは消耗した組織の再生に有用である。ＨＥＫ４ＢＰ拮抗物質は癌の治療にも有用である。図面の説明図１はＨＥＫ４−Ｘ面上の馴らし培地のＢＩＡｃｏｒｅスクリーニングの結果を示す。濃縮した細胞−馴らし培地試料を、実施例２に述べたＨＥＫ４−Ｘ面上でスクリーニングした。各共鳴単位（ＲＵ）範囲内のシグナルを与える馴らし培地試料の数をヒストグラムに示す。２００ＲＵより多く結合した試料を表１に纏める。図２はＡ４９８馴らし培地からのＨＥＫ４結合タンパク質の精製を示す。ａ）はＨＥＫ４ＢＰのＣ４逆相ＨＰＬＣカラムプロフィールであり、ｂ）はＣ４カラム上で観察された、指示したピークのプールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図３はＨＥＫ４結合タンパク質ｃＤＮＡの配列である。全コーディング配列を含むヒトＨＥＫ４結合タンパク質ｃＤＮＡクローンの核酸配列を、予想されるアミノ酸配列と共に示す。上記ｃＤＮＡクローンからは、三つの潜在的開始コドンのうちのいずれが用いられるかに依存して２１３〜２２８アミノ酸から成るタンパク質が予想される。図示した配列には、予想される成熟Ｎ末端アミノ酸を残基１として番号が付してあり、推定シグナルペプチド（下線部）は残基− １９から−１までである。図４は組み換え体ＨＥＫ４結合タンパク質の精製を示す。ａ）は組み換え体ＨＥＫ４ＢＰのＣ４逆相ＨＰＬＣカラムプロフィールであり、ｂ）はＡ₂₁₄ピーク近傍のＣ４画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。画分はＣ４カラムからの溶出時間で同定する。図５はヒト組織におけるＨＥＫ４結合タンパク質の発現を示す。ヒト組織におけるＨＥＫ４結合タンパク質ｍＲＮＡの発現を、実施例６に述べたノザンブロット分析によって調べた。数種の組織それぞれから単離された２μｇのポリＡ⁺ ｍＲＮＡを含有するブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から購入し、³²Ｐで標識したＨＥＫ４結合タンパク質ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。図６は膜結合ＨＥＫ４ＢＰによるＥＰＨ様受容体のチロシンリン酸化の刺激を示す。組み換え体ＨＥＫ４受容体及び内在ＥＣＫを発現させるＣＨＯ細胞を、ＨＥＫ４ＢＰｃＤＮＡを含む発現ベクターまたはｃＤＮＡを含まないベクターでトランスフェクトした細胞で処理した。溶解後、ＨＥＫ４受容体（ａ）またはＥＣＫ受容体（ｂ）を免疫沈降させた。免疫沈降物をＰＡＧＥで分画し、これにエレクトロブロッティングを施し、抗ホスホチロシン抗体プローブでスクリーニングした。図７は可溶性ＨＥＫ４ＢＰによるチロシンリン酸化の刺激を示す。細胞を、抗体クラスター化（ａｎｔｉｂｏｄｙｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）した（＋）かまたはしない（−）馴らし培地（ＣＭ）または組み換え体ＨＥＫ４ＢＰで処理し、ＨＥＫ４受容体活性についてアッセイした。ａ）では１２倍濃縮培地が２μｇ／ｍｌのＨＥＫ４ＢＰに匹敵した。ｂ）は、クラスター化ＨＥＫ４ＢＰと非クラスター化ＨＥＫ４ＢＰとで比較した用量応答である。図８はＨＥＫ４ＢＰのＨＥＫ４、ＥＣＫ及びＨＥＫ８受容体に対する相対親和性を示す。可溶性ＨＥＫ４、ＥＣＫ及びＨＥＫ８受容体存在下での、不動化したＨＥＫ４受容体へのＨＥＫ４ＢＰの結合を、前記３種の受容体の濃度を漸次高めながら測定するコンペティティブ（競合）アッセイを実施例８に述べたように実施した。「ＩＣ５０」と記した線は、対照（競合体不在）のＲＵ値の５０％であるＨＥＫ４ＢＰ濃度に対応するＲＵ値の高さに引いてある。発明の詳細な説明本発明は、１種以上のＥＰＨ様受容体ＰＴＫと結合し得、特にＥＰＨ様受容体ＰＴＫのヒト相同体と結合し得るポリペプチドに係わる。ＥＰＨ様受容体のヒト相同体はこれまでに、ＥＰＨ、ＥＣＫ、ＨＴＫ、ＨＥＫ２、ＨＥＫ４、ＨＥＫ５、ＨＥＫ７、ＨＥＫ８及びＨＥＫ１１の８種が同定されている。本明細書に参考として含まれる、本出願と同じ出願人による同時係属米国特許出願第０８／２２９，５０９号には、幾つかのＨＥＫ受容体の特徴が開示されている。本発明のポリペプチドはＨＥＫ４受容体と優先的に結合し、このポリペプチドを本明細書中ではＨＥＫ４結合タンパク質（ＮＥＫ４ＢＰ）と呼称する。ＨＥＫ４受容体は、先にＷｉｌｋｓ等，上掲誌によってＨＥＫ受容体として同定されたグリコシル化１３５ｋＤａプロテインチロシンキナーゼであり、ニワトリ及びマウスにおいてそれぞれ同定されたＣｅｋ４及びＭｅｋ４受容体のヒト相同体である。ＨＥＫ４受容体と結合し得るポリペプチドは、細胞表面から核へのシグナル伝達を開始する事象である受容体の自己リン酸化を誘導することにより、受容体の活性化も行ない得る。ＨＥＫ４受容体が活性化されると、ＨＥＫ４受容体を有する細胞の成長及び／または分化が調節される。ＨＥＫ４ＢＰは、後述する他のＥＰＨ様受容体とも結合し、かつ当該受容体を活性化する。ＨＥＫ４結合タンパク質はＡ４９８細胞系馴らし培地から、米国特許出願第０８／１４５，６１６号にその概要が開示されている操作によって同定及び単離した。前記特許出願の当該箇所は本明細書に参考として含まれ、かつ実施例２に詳述してある。手短に言えば、ＨＥＫ４の細胞外ドメインをコードする遺伝子を構築し、実施例１に述べるようにして発現させた。精製したＨＥＫ４細胞外ドメインをＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に固定化し、１０２の異なる細胞系に由来する濃縮馴らし培地をＨＥＫ４受容体細胞外ドメインとの結合に関して表面プラスモン共鳴によりスクリーニングした。この操作によって表１に示した、ＨＥＫ４と相互作用する因子を１種以上有する、幾つかの細胞系に由来する馴らし培地を同定した。ＨＥＫ４リガンドのソースとしてＡ４９８細胞系を選択し、ＨＥＫ４と結合するタンパク質を実施例２に述べたようにして精製した。Ａ４９８細胞−馴らし培地から精製単離したＨＥＫ４結合タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で２１、２５及び２７ｋＤａという三つの主要な分子量形態を有する。これらの形態はグリコシル化変異体及びＣ末端プロセシング変異体を表わしている。ＨＥＫ４ＢＰは、臭化シアン分解またはトリプシン分解によって生じるペプチドに関して表２に示したようなアミノ酸配列を有する。ＨＥＫ４結合タンパク質のｃＤＮＡクローンをヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、実施例３に述べたようにして得た。ヒトＨＥＫ４結合タンパク質ｃＤＮＡの配列を図３に示す。Ａ４９８細胞由来タンパク質のｃＤＮＡ配列決定及びカルボキシ末端ペプチドマッピングによれば、ＨＥＫ４結合タンパク質の主要な分泌形態の一つは図３に示したようにアミノ末端セリン残基を有し、かつ１７９位にカルボキシ末端プロリン残基を有した。１７７位にカルボキシ末端アラニン残基を有する別の分泌形態も検出した。膜結合形態を含めた他の形態のＨＥＫ４ＢＰを合成することも可能である。図３に示した、ＨＥＫ４ＢＰをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において組み換え体ＨＥＫ４結合タンパク質を発現させた。可溶性ＨＥＫ４ＢＰを実施例４に述べたようにして精製し、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によってＨＥＫ４受容体と結合することを確認した。精製した可溶性ＨＥＫ４ＢＰはＨＥＫ４受容体を活性化し、この活性化はリガンドの抗体クラスター化によって促進された（図７）。ＨＥＫ４受容体の活性化は、ＨＥＫ４ＢＰを発現させるＣＨＯ細胞とＨＥＫ４受容体を発現させるＣＨＯ細胞との接触時にも観察された（図６）。従って、組み換え体ＨＥＫ４結合タンパク質はＥＰＨ様受容体ＰＴＫ類と結合し、かつ当該受容体を活性化する。本発明は、少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得る、ＨＥＫ４結合タンパク質と呼称される精製単離ポリペプチドを提供する。一具体例において、本発明のポリペプチドはＨＥＫ４受容体と結合し得る。本発明のＨＥＫ４結合タンパク質は哺乳動物、好ましくはヒトに由来する。本発明の精製ＨＥＫ４結合タンパク質は他のヒトタンパク質を実質的に伴わず、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約２１〜２７ｋＤａの分子量を示す。ＨＥＫ４ＢＰは図３（配列番号１）に示したアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の相同性を有し、少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得る。好ましくは、ＨＥＫ４ＢＰは図３（配列番号１）に示したアミノ酸配列を有する。ＨＥＫ４ＢＰがＥＰＨ様受容体と結合することによって前記受容体が活性化される場合とされない場合とが有る。ＥＰＨ様受容体との結合とその活性化は、ＨＥＫ４ＢＰの可溶形態もしくは膜結合形態、またはこれら両方の形態によって実現し得る。更に、ＨＥＫ４ＢＰによる受容体との結合とその活性化はＨＥＫ４受容体に限定されず、ＨＥＫ４ＢＰはＥＰＨ様受容体ファミリーに属する他の受容体とも結合して当該受容体を活性化し得ると理解される。実施例７に述べるように、ＨＥＫ４結合タンパク質はＨＥＫ４受容体とＥＣＫ受容体との両方を活性化することが判明している。本発明のＨＥＫ４結合タンパク質は好ましくは、外来ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物発現産物である、即ち組み換え体タンパク質であることを特徴とする。外来ＤＮＡはＨＥＫ４結合タンパク質をコードするＤＮＡであり、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成（人工）ＤＮＡを包含する。ＨＥＫ４結合タンパク質は、培養した細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、または培養したか、もしくはトランスジェニック動物の細胞である哺乳動物細胞において、当該宿主細胞に適したＤＮＡ発現ベクターを用いて発現させ得る。ＣＨＯ細胞における組み換え体ＨＥＫ４結合タンパク質の発現を、本明細書の実施例３に説明する。本発明は、ダイマー以上のオリゴマーの状態のＨＥＫ４ＢＰも提供し、このマルチマーＨＥＫ４ＢＰはＥＰＨ様受容体と結合し得、及び／または前記受容体を活性化し得る。可溶性ＨＥＫ４ＢＰマルチマーは、ＨＥＫ４ＢＰ／免疫グロブリンキメラ、抗ＨＥＫ４ＢＰ抗体での処理によりクラスター化したＨＥＫ４ＢＰ、並びに共有結合した、及び共有結合以外で結合したＨＥＫ４ＢＰモノマーの中から選択する。クラスター化ＨＥＫ４ＢＰは実施例７Ｂに説明してあり、ＨＥＫ４ＢＰキメラは標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて構築する。共有結合した、及び共有結合以外で結合したＨＥＫ４ＢＰモノマーは、当業者には容易に使用可能なタンパク質架橋試薬及び操作を用いて製造する。本発明のポリペプチドには、ＨＥＫ４ＢＰの生物学的に活性なフラグメント及び類似体が含まれる。ＨＥＫ４ＢＰフラグメントは、図３もしくは配列番号１に示した配列から１個以上のアミノ酸が切除（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたアミノ酸配列を包含し、その際切除はアミノ末端、カルボキシ末端、またはタンパク質内部において生起し得る。本発明の類似体には、図３もしくは配列番号１に示した配列に１個以上のアミノ酸を挿入するか、または前記配列の１個以上のアミノ酸を置換して得られる配列が含まれる。本発明のフラグメント及び類似体はＨＥＫ４結合タンパク質の生物学的特性を少なくとも一つ具え、典型的には少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合する能力を有する。本発明は、異種アミノ酸配列と融合したＨＥＫ４ＢＰアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドも包含する。前記異種配列には、ＨＥＫ４ＢＰとのキメラとした時ＨＥＫ４ＢＰの一つ以上の生物学的または免疫学的特性を保つ配列が含まれる。一具体例ではＨＥＫ４ＢＰ／免疫グロブリンキメラタンパク質が包含され、このキメラの分子は凝集して、受容体との結合とその活性化を行なうＨＥＫ４ＢＰのマルチマー形態をもたらし得る。一例として、ＨＥＫ４ＢＰとＩｇＧのＦｃフラグメントとのキメラが挙げられる。本発明は、ＨＥＫ４結合タンパク質をコードする、単離された核酸も提供する。この核酸は、ａ）図３（配列番号１）に示した核酸、ｂ）図３（配列番号１）に示したコーディング領域と６×ＳＳＣ及び６５℃の条件下にハイブリダイズする核酸、ｃ）（ａ）及び（ｂ）の核酸に対して縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）である核酸の中から選択される。本発明の核酸はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成（人工）ＤＮＡであり得る。上記のように特定したハイブリダイゼーション条件は、当業者が所与の核酸と図３（配列番号１）に示したコーディング領域を含む核酸との不適正度を推定することを可能にすると理解され、また前記条件は塩、インキュベーションの温度及び／または時間を変更し、または洗浄もしくはハイブリダイゼーションステップにおいて有機溶媒を添加すると変化し得るが、それでもなおハイブリダイゼーションの間同じ不適正レベルが得られることを可能にすると理解される。従って、本発明の核酸は６×ＳＳＣ及び６５℃という条件と同等の条件下に図３のコーディング領域とハイブリダイズする核酸を包含すると想定される。ＨＥＫ４結合タンパク質をコードする核酸配列は、アミノ末端リーダー配列及びカルボキシ末端膜固定（ａｎｃｈｏｒ）配列を有し得、あるいはまたこれらの配列の一方もしくは両方を除去されていてもよい。コードされたポリペプチドは、ＨＥＫ４ＢＰの生物学的特性を少なくとも一つ具える。本発明の核酸は、ＨＥＫ４結合タンパク質を発現させるための核酸配列と作動可能に連結する。発現に必要な配列は当業者には知られており、その中には転写開始のためのプロモーター及びエンハンサー配列、転写終結部位、リボソーム結合部位、並びにポリペプチドの分泌を導く配列が含まれる。外来遺伝子の発現を導くべく機能する核酸配列については、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．編，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９０に概説されている。ＨＥＫ４結合タンパク質の発現を導く配列は同種であっても異種であってもよい。培養原核細胞または真核細胞におけるＨＥＫ４結合タンパク質の発現には様々な発現ベクターを用い得る。そのようなベクターの一つに国際特許出願公開第９０／１４３６３号に開示されたｐＤＳＲαが有り、このベクターを用いてＨＥＫ４ＢＰをＣＨＯ細胞において発現させた（実施例３参照）。加えて、トランスジェニック動物におけるＨＥＫ４結合タンパク質の組織特異的発現のためのベクター、及びｉｎｖｉｖｏでのヒト細胞におけるＨＥＫ４結合タンパク質発現のためのウイルス起源（ｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ）遺伝子移送ベクターも使用可能である。ＨＥＫ４結合タンパク質の領域をコードする核酸は、当業者に使用可能な操作を用いて、適当な宿主細胞における最適の発現のために好ましいコドンの置換により修飾し得る。図３に示したＨＥＫ４ＢＰをコードする核酸配列を挿入したプラスミドｐＤＳＲαは１９９５年１月２０日付でＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに、ＡＴＣＣ受託番号第９７０２８号の下に寄託した。本発明は、ＨＥＫ４結合タンパク質をコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞も包含する。宿主細胞としては、ＨＥＫ４ＢＰの生物学的特性を少なくとも一つ具えたポリペプチドを産生する任意の細胞を用い得る。特定例には細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が含まれる。加えて、ＨＥＫ４結合タンパク質はトランスジェニック動物においても産生され得る。形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞及びトランスジェニック動物は、当業者にとって通常使用可能な物質及び方法を用いて取得する。宿主細胞は、（図３に示した）リーダー配列及びＣ末端膜固定配列を具えた完全長のＨＥＫ４結合タンパク質遺伝子を含む核酸配列を有し得、あるいはまたリーダー配列及びＣ末端膜固定配列の一方または両方を欠く核酸配列を有し得る。加えて、ＨＥＫ４受容体と結合し得るポリペプチドをコードする核酸断片、変異体及び類似体も宿主発現系内に存在し得る。本発明のポリペプチドは、形質転換またはトランスフューズ（ｔｒａｎｓｆｕｓｅ）した宿主細胞を適当な栄養条件下に増殖させてＨＥＫ４ＢＰを発現させ、得られたポリペプチドを単離することによって作製する。本発明は、本発明のＨＥＫ４結合タンパク質と特異的に結合する抗体も包含する。本発明の抗体は、完全長の（プロセシングを受けていない）ＨＥＫ４結合タンパク質もしくはその成熟形態またはこれらのフラグメントでの免疫感作によって産生させ得る。この抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、またヒト由来であってもマウス由来であってもよい。本発明の抗体はまた、マウスのＬ鎖及びＨ鎖上の不変部がヒトの不変部配列で置換されたキメラ抗体、または相補的抗原決定領域（ＣＤＲ）のみがマウス由来で、抗体鎖の残りの部分はヒト配列で置換されているＣＤＲ移植抗体といった組み換え体であってもよい。本発明は、治療有効量のＨＥＫ４結合タンパク質と、医薬に許容可能な佐剤（アジュバント）とを含有する医薬組成物も提供する。医薬に許容可能な佐剤の例に、稀釈剤（トリス、酢酸またはリン酸緩衝液）、キャリヤー（ヒト血清アルブミン）、可溶化剤（Ｔｗｅｅｎ、ポリソルベート）、防腐剤（チメロゾル、ベンジルアルコール）及び酸化防止剤（アスコルビン酸）が含まれる。医薬組成物の典型的な成分については、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，” １８ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に比較的広範な概説が有る。本明細書中に用いた「治療有効量」という語はＨＥＫ４結合タンパク質の、所与の条件及び投与方式の下で治療効果をもたらす量を意味する。このような治療有効量は体重１ｋｇにつき０．０１μｇから１０ｍｇまで変化し得るが、当業者には決定可能である。ＨＥＫ４結合タンパク質は皮下注射、静脈内注射もしくは筋肉内注射によって投与し得、または経口もしくは鼻腔内投与可能である。選択するべき投与経路は、治療する状態の性質及び重篤度、並びにＨＥＫ４結合タンパク質製剤の薬理動態を含めた幾つかのパラメーターに依存する。ＨＥＫ４結合タンパク質は特定様式での送達用に製剤化し得、例えば該タンパク質をポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーで改質して鼻腔内送達のための特性や注射後の血清中半減期を改善すること、または該タンパク質をポリマー化合物の粒状調製物（例えばリポソーム）に収容し、それによって送達を長期にわたるように制御することが可能である。様々な組織におけるＨＥＫ４受容体及びＨＥＫ４ＢＰの発現を実施例６Ａ及び６Ｂにそれぞれ報告する。ＨＥＫ４受容体ｍＲＮＡはヒト胎盤にきわめて多量に存在し、心臓、脳、肺、肝臓、筋肉、腎臓組織でも検出された。ＨＥＫ４ＢＰｍＲＮＡは成人の脳、腎臓及び胎盤にきわめて多量に存在し、より低いレベルでは心臓、肺、肝臓、脾臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、筋肉、膵臓及び結腸でも検出された。このような発現パターンは、ＨＥＫ４ＢＰによるＨＥＫ４受容体の活性化によって様々な標的細胞、特に受容体とリガンドとの両方の発現が検出される脳、心臓、肺、肝臓、筋肉及び膵臓の細胞の成長及び／または分化が調節されることを示唆している。加えて、Ｗｉｃｋｓ等，上掲誌は前Ｂ細胞系及びＴ細胞系に存在するＨＥＫ４受容体ｍＲＮＡについて報告し、造血におけるＨＥＫ４ＢＰの役割を示唆している。実施例７に述べるように、ＨＥＫ４ＢＰは細胞−細胞自己リン酸化アッセイにおいてＥＣＫ受容体も活性化する。ＥＣＫ受容体ｍＲＮＡはラット成体の肺、小腸、腎臓、卵巣及び皮膚にきわめて多量に存在し、より低いレベルでは脳、脾臓及び顎下腺でも検出される（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＨｕｎｔｅｒ，上掲誌）。最近、ＥＣＫがマウス早期胚の神経系で発現されることが判明した（Ｂｅｃｋｅｒ等，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４７，ｐｐ．３−１７，１９９４；Ｇａｎｊｕ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ９，ｐｐ．１６１３−１６２４，１９９４）。これらの観察は、ＨＥＫ４ＢＰによるＥＣＫ受容体の活性化によって肺、腸、腎臓、皮膚及び神経系細胞などのＥＣＫ発現細胞の成長及び／または分化が調節され得ることを示唆している。従って、ＨＥＫ４ＢＰは様々な組織の標的細胞の成長及び／または分化の程度を調節する（即ち促進または抑制する）のに有用である。標的細胞はＨＥＫ４ＢＰが活性化する受容体を少なくとも１種有し、その際前記受容体は好ましくは受容体ＰＴＫのＥＰＨサブファミリーに属する。次に、ＨＥＫ４ＢＰの潜在的治療用途について述べる。本発明の一態様によれば、ＨＥＫ４ＢＰは神経系細胞の成長及び分化の調節に用いられる。ＨＥＫ４ＢＰは、疾患もしくは創傷によって低下したかもしくは排除された、またはその恐れの有る哺乳動物の神経系の細胞機能を維持または回復するのに用い得る。標的細胞にはニューロン及び神経膠細胞が含まれる。ＨＥＫ４ＢＰで治療できる状態には、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、卒中及びハンチントン病などの中枢神経系障害、並びに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び末梢性ニューロパシーなどの末梢神経系障害が含まれる。脊髄及び末梢性ニューロンの物理的創傷もＨＥＫ４ＢＰで治療し得る。本発明の別の態様では、ＨＥＫ４ＢＰによって消化管（大腸及び小腸を含む）、肝臓、肺、膵臓及び筋肉の組織並びに造血組織の成長及び分化を調節する。ＨＥＫ４ＢＰのこの活性は特に、疾患または創傷によって傷害されたかもしくは消耗した、上記その他の起源を有する組織を再生させるのに有用であり得る。ＥＰＨ様受容体のサブファミリーとこれに対応するリガンドは或る種の癌細胞系において多量に発現されることが観察されている（例えば、ヒト癌細胞系におけるＥＣＫ受容体及びＥＣＫ結合タンパク質の発現に関して国際特許出願公開第９４／１１０２０号参照）。即ち本発明の別の態様では、ＨＥＫ４ＢＰ拮抗物質を用いて細胞増殖を阻止することにより癌を治療する。このようにして治療する癌は、ＨＥＫ４受容体及び／またはＥＣＫ受容体を発現させる臓器に関連する癌と考えられる。ＨＥＫ４ＢＰ拮抗物質はＨＥＫ４ＢＰの生物活性を抑制する任意の化合物であり得、ＨＥＫ４ＢＰと、またはＨＥＫ４ＢＰによって活性化されるＥＰＨサブファミリー受容体と結合して受容体とリガンドとの相互作用を妨げる抗体；ＥＰＨ様受容体と結合するが該受容体を活性化しないＨＥＫ４ＢＰ；及びＨＥＫ４ＢＰと結合する可溶性ＥＰＨ様受容体を非限定的に含み得る。上述の拮抗物質の小分子模擬体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）も本発明に包含されると考えられる。ｉｎｖｉｖｏ用途に加え、ＨＥＫ４ＢＰをｅｘｖｉｖｏで用いて細胞集団を移植前に増幅（ａｍｐｌｉｆｙ）することも可能である。ＨＥＫ４ＢＰは消化管、肝臓、肺、骨髄、腎臓、または中枢及び末梢神経系ニューロン（並びに神経膠細胞）由来の細胞の培養増殖を、増幅した細胞集団を再導入する療法を必要とする患者に再導入できる増幅細胞集団が得られるように促進し得ると考えられる。上記のようないわゆる「細胞療法」は、傷害されたかまたは消耗した細胞の復元に有用であり、またＨＥＫ４ＢＰの全身投与が好ましくない条件下で適当であり得る。ＨＥＫ４ＢＰは、癌、神経障害、消化管、肝臓または肺の障害の治療、及び細胞集団のｅｘｖｉｖｏ増殖に単独で、または他の治療薬と組み合わせて用い得る。ＨＥＫ４ＢＰは、他の化学療法薬；癌治療のための放射線療法；神経障害治療のための脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）といった他の神経栄養因子；または傷害されたかもしくは消耗した組織の修復のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）もしくは表皮ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）といった組織成長因子と併用し得る。本発明の単離核酸は、ＨＥＫ４ＢＰをコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋ等， “ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，” ２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されているような標準的なハイブリダイゼーション操作で検出及び定量するのに有用な試薬である。この試薬によって様々な種類の細胞の、ＨＥＫ４ＢＰ及び関連ポリペプチドを発現させる潜在能力を確認することが可能となり、またこの試薬は、ＨＥＫ４ＢＰをコードする遺伝子やＨＥＫ４ＢＰの発現を制御する配列の異常を検出するのにも有用である。本発明の核酸は、ＨＥＫ４ＢＰの発現レベルを制御するのにも有用である。いわゆる「アンチセンス」核酸はＨＥＫ４ＢＰをコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡ鎖と、ＨＥＫ４ＢＰ核酸配列の転写または翻訳を阻止するようにハイブリダイズする。ＨＥＫ４ＢＰの過剰発現によって過剰な細胞増殖などの望ましくない生理作用が起こる場合は、ＨＥＫ４ＢＰを過剰発現させる細胞にＨＥＫ４ＢＰアンチセンス核酸を導入することが適当である。ＨＥＫ４ＢＰと特異的に結合する抗体は、当業者に普及しているイムノアッセイ（ウェスタンブロッティング、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ）を用いて生物試料中のＨＥＫ４ＢＰを検出及び定量するのに有用な試薬である。ＨＥＫ４ＢＰの存在は細胞増殖、または細胞増殖の潜在的可能性を指示し得、また高レベルでの存在は、典型的には癌に関連する異常な細胞成長を知らせ得る。加えて、本発明の抗体はＨＥＫ４ＢＰ活性の作動物質または拮抗物質として機能する有用な治療用試薬でもあり得る。この抗体はＨＥＫ４ＢＰと、ＨＥＫ４ＢＰがＥＰＨ受容体（ＨＥＫ４またはＥＣＫ）と結合するのを直接または間接に阻止するように結合し得る。あるいは他の場合には、本発明の抗体はＨＥＫ４ＢＰと、受容体との結合とその活性化を促進するように結合し得、その際前記促進は、例えばＨＥＫ４ＢＰを「クラスター化」してダイマー以上のマルチマー形態とし、それによってより効率的な受容体との結合とその活性化を可能にすることで実現される。本発明の抗体はモノクローナル、ポリクローナル、または組み換え体であり得る。本発明を、本発明の範囲を限定するとは解釈されない以下の実施例によって更に詳述する。実施例１ＨＥＫ４受容体細胞外ドメイン（ＨＥＫ４−Ｘ）の作製ＨＥＫ４受容体プロテインチロシンキナーゼをコードするｃＤＮＡクローンをヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から、本出願と同じ出願人による同時係属米国特許出願第０８／２２９，５０９号に開示されているようにして単離した。このクローンの配列はＷｉｃｋｓ等，上掲誌の図１の配列と、次の点以外は同等であった。Ｗｉｃｋｓはヌクレオチド１６１８〜１６２０に配列ＴＴＡが位置することを報告しているが、上述のように単離したＨＥＫ４受容体クローンは前記位置に配列ＴＴＣを有した。しかし、Ｗｉｃｋｓ等が椎定したタンパク質配列では上記位置にはフェニルアラニン残基が特定されており、このことはヌクレオチド１６２０に「Ａ」が位置することと矛盾する（ＴＴＡはロイシンをコードし、一方ＴＴＣはフェニルアラニンをコードする）。また、ここで得られた配列にはＷｉｃｋｓ等の配列のヌクレオチド１５２９〜１５３１が存在しない。この変化は、翻訳の読み取り枠には影響しないものの、Ｗｉｃｋｓ配列の４７８位の推定グルタミン残基を排除する。これらの相違点が受容体の生物活性やリガンドとの結合能力に及ぼす影響は未知である。上記ＨＥＫ４受容体ｃＤＮＡクローンを、ＨＥＫ４受容体のリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ断片を増幅するべく設計したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において鋳型として用いた。用いたプライマーは、であった。これらのプライマーは、５４０アミノ酸から成るタンパク質をコードする、長さ１６５６ヌクレオチドの断片を生成させる。推定されるタンパク質は、ＨＥＫ４受容体のアミノ末端からトランスメンブラン領域まで伸長するが前記領域は含まない全細胞外ドメインから成る。上記１６５６ヌクレオチド断片を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩで消化し、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＤＳＲα中に連結した。得られた発現プラスミドを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｃｅｌｌｐｈｅｃｔ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によってＣＨＯ細胞に導入した。個々のコロニーを、発現プラスミド中に存在するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子の発現に基づき選択した。ＨＥＫ４遺伝子の発現はＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション（Ｈｕｎｔ等，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９，ｐｐ．７７９−７８４，１９９１）によって、及び／またはＨＥＫ４細胞外ドメインのアミノ酸２２〜１４８に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングによって監視した。ＨＥＫ４発現は、選択したクローンの１００ｎＭメトトレキセート中での増殖によって促進された。大量作製用に１個のｐＤＳＲα／ＨＥＫ４−Ｘクローンを選択した。２４個の回転瓶に、非必須アミノ酸（１×ＮＥＡＡ；Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎＭメトトレキセート、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（１×ＰＳＧ；Ｇｉｂｃｏ）及び１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）を２００ｍｌずつ入れ、これに１瓶当たり約２×１０⁷細胞の密度で播種した。細胞は３〜４日で集密状態に達し、この時点で培地を、血清を添加しないＤＭＥＭ／ＮＥＡＡ／ＰＳＧに変えた。７日後に細胞−馴らし培地を回収して濃縮し、これにｐＨ８．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌに対するダイアフィルトレーションを施した。濃縮培地をＱ−セファロースＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオン交換カラムに添加し、結合物質をｐＨ８．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の線形濃度勾配０→０．５ＭのＮａＣｌで溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＨＥＫ４細胞外ドメインの残基２２〜１４８に対するウサキポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングで分析した。ＨＥＫ４−Ｘタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、Ｓ−２００（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加した。前記カラムから得られた画分を上記と同様に分析し、ＨＥＫ４−Ｘ含有画分をプールした。実施例２Ａ．ＨＥＫ４−Ｘ結合活性の精製本発明者は以前、濃縮細胞−馴らし培地において受容体結合活性を検出するのにＢＩＡｃｏｒｅ^TM装置（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いることを述べた（Ｂａｒｔｌｅｙ等，上掲誌）。本発明者は同様の方法を用いて、ＨＥＫ４受容体結合活性を後述のようにスクリーニングした。０．２Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド −ＨＣｌ及び０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスタシンイミドを流量５μｌ／分で注入することによってＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップの表面を活性化した。活性化した表面に濃度２５０μｇ／ｍｌの精製ＨＥＫ４−Ｘを、５０μｌの注入を上記と同じ流量で２回行なうことにより適用した。反応しない結合部位をｐＨ８．５の１Ｍエタノールアミンの注入によってブロックした。センサーチップ表面を１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３．４ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４で、基線量が安定するまで一晩洗浄した。典型的には、固定化の結果６，０００〜８，０００共鳴単位（ＲＵ）のＨＥＫ４−Ｘがセンサーチップと結合した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いずに、または０．５％ＦＢＳの存在下に増殖させた１０８の細胞系から馴らし培地試料を回収した。無血清条件下に作製した馴らし培地は、更に処理する前にＦＢＳ濃度０．５％に調節した。培地を濾過し、２５倍に濃縮し、アリコートとして−８０℃で保存した。各培地の３０μｌ試料をＨＥＫ４−Ｘ表面に流量５μｌ／分で注入し、各注入終了後に２０秒間結合応答を測定した。各試料毎に、上記表面をｐＨ１０．４の２５ｍＭ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸で再生させた。２００共鳴単位以上の結合を示した濃縮馴らし培地試料を表１に掲げる。多くの結合を示した方から五つの馴らし培地を選択し、更に調べた。非特異的結合を低減するべく注入前の試料に可溶性デキストランを添加したところ、ＨＣＴ１１６及びＬＳ１７４Ｔ馴らし培地からのシグナルは大幅に減少した。Ａ１７２細胞は増殖させにくいことが判明し、馴らし培地の大量作製には不適当であった。これらの実験、及びパイロット規模の受容体アフィニティークロマトグラフィーに基づき、ＨＥＫ４結合タンパク質精製用馴らし培地の最良ソースとしてＡ４９８細胞系（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＴＢ４４号）を選択した。ＨＥＫ４−ＸをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定化して、ＨＥＫ４受容体アフィニティーカラムを調製した。精製ＨＥＫ４−Ｘを０．１ＭＮａＨＣＯ₃、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３に対して透析して、最終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。ＨＥＫ４−Ｘの固定化は、Ｋｅｎｎｙ等の方法（ＮｅｗＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ編，ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９８８）に従いリガンド密度１ｍｇ／ｍｌで行なった。０．５％血清含有培地を用いて作製した４０１のＡ４９８馴らし培地を４０倍に濃縮し、これにＰＢＳ及び０．０２％ＮａＮ₃に対するダイアフィルトレーションを施し、ＨＥＫ４ −ＣＮＢｒセファロースカラムに添加した。カラムをＰＢＳで洗浄し、結合物質を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０で溶離した。画分を１ｍＭＣＨＡＰＳ中に集め、これをポリアクリルアミドゲルに直接添加した。ゲルを分析のために銀で染色し、またはＮ末端アミノ酸配列決定（Ｆａｕｓｓｅｔ及びＬｕ，１９９１）に備えてＰＶＤＦ膜（Ｐｒｏｂｌｏｔ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）上へブロットした。ＨＥＫ４−ＣＮＢｒセファロースカラムから得られたｐＨ４．０の溶離画分は２１、２５及び２７ｋＤａの分子量を有する三つの主要なタンパク質種を含有したが、前記分子量は供給試料や洗浄画分では判然としなかった。上記３種のタンパク質を含有する画分をプールし、ＣＨＡＰＳの存在下に濃縮し、ＶｙｄａｃＣ４逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×１５０ｍｍ）に適用した。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル（濃度勾配２６→３５％）で溶離した。画分を集め、真空下に体積を減少させ、ＨＥＫ４結合タンパク質について分析した。２１４ｎｍでの吸光により検出した三つの主要なピークをプールし、ＳＤＳ− ＰＡＧＥによって分析した（図２参照）。ＨＥＫ４ＢＰの三つのアイソフォームを、同じＣ４カラムへの再適用によって更に精製した。Ｂ．ペプチドの配列決定Ａ４９８細胞−馴らし培地の最初の精製から得られた試料に対してタンパク質配列決定を行なった。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、かつＰＶＤＦ膜上へブロットした。ＨＥＫ４結合タンパク質と同定されたゲルバンドを切り取り、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７７Ａタンパク質配列決定装置で５サイクル分析した。この分析では配列が得られず、即ち上記タンパク質のＮ末端がブロックされていることが判明した。そこで、試料を臭化シアンで処理してから再度配列決定装置に適用した。分解試料から、各サイクルにおいて最も高率で得られた配列が同じペプチドのものであると仮定して仮の配列を得た。前記のように仮定してさえ回復度は小さかったので、１０サイクル経過後も配列は信頼できなかった。このようにして得られた配列を表２に、ペプチド＃１として示す。次に、臭化シアンで分解し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した試料を分析したところ、ペプチド＃１の９位はシステイン残基であり、ペプチド＃２の６位はアスパラギン酸であることが判明した。ペプチド＃３の２５位は、後にＤＮＡ配列決定によってアスパラギン酸であることが判明した。表２に示したペプチド＃２及び＃３の配列データは、タンパク質のトリプシン消化物を分析し、その後得られたペプチドを微小孔Ｃ４カラムで分離することによって得た。この実験はより大量の出発物質を用いて行ない、従ってより確かな配列が得られ、配列決定作業は２０〜３０サイクル行なうことが可能であった。表２のペプチド配列をＢ６１と比較すれば、これらのペプチドが関連タンパク質のフラグメントであることが判る。このことから、ＨＥＫ４結合タンパク質もヒトＥＰＨ様キナーゼサブファミリーのリガンドの一つであると結論される。実施例３Ａ．ＨＥＫ４結合タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング及び配列決定表２に示した、ＨＥＫ４ＢＰペプチドから得られたアミノ酸配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。プライマー７０２−３及び６３３−１１を、ランダムプライミングを受けるＡ４９８ｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ反応に用いた。これらのプライマーによって増幅した１７５塩基対断片を配列決定したところ、Ｂ６１に対して近い関連性を有することが判明した。次に、上記断片をランダムプライミングにより³²Ｐで放射性標識し、これをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリーを、完全長ＨＥＫ４ＢＰｃＤＮＡを有するクローンに関してスクリーニングした。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した、オリゴ−ｄＴプライミングを施されたヒト胎盤ＣＤＮＡライブラリーを１５０ｍｍプレート１個当たり３０，０００プラークの密度で平板培養した。プレート上に並んだプラークのレプリカを、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ^TMハイブリダイゼーション転移膜（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上に製造元の指示に従い製造した。各プレート毎に２個のレプリカフィルターを製造した。フィルターを６×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ緩衝液、５０μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡ、１％ＳＤＳ中で６５℃ で４時間プレハイブリダイズし、その後同じ条件下に１２時間、³²Ｐ標識プローブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを６５℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回、各１時間ずつ洗浄し、このフィルターを、増感スタリーンを具備したＫｏｄａｋＸＡＲフィルムに対し一晩露光した。各プレートから製造した２個のフィルターを比較することにより、五つのプラークが両方のレプリカで陽性であることが判明した。各陽性プラークの周囲のファージを取り出し、緩衝液中に再懸濁させ、かつより小さい密度で再度平板培養して、十分に分離されたプラークを二次スクリーニング用に得た。（一次スクリーニングと同じ方法を用いた）再スクリーニングで陽性であった個々のプラークを採取した。これらのファージから得た挿入部分をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに、製造元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示どおりのｉｎｖｉｖｏ切断によって移入した。五つの挿入部分のうち三つは同等であり、ＨＥＫ４ＢＰコーディング領域の全体を含んでいたが、他の二つは重複クローンであった。コーディング領域の全体を含む三つの挿入部分から得たデータを用いてコンセンサス配列を組み立てた。この配列を図３に示す。ＨＥＫ４ＢＰｃＤＮＡ配列からは、三つの可能な開始コドンのうちのいずれが用いられるかに依存して２１３〜２２８アミノ酸から成るタンパク質が推定される。脊椎動物のｍＲＮＡの翻訳に関する規則（Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ４４，ｐｐ．２８３−２９２，１９８６）からすると、第三の枠内ＡＴＧは開始コドンとは考えにくく、一方最上流に位置する第一のＡＴＧは主要な開始コドンである可能性が最も大きい。Ｂ６１の場合同様、ＨＥＫ４ＢＰはアミノ末端とカルボキシ末端との両方に疎水性アミノ酸を有する。これらの疎水性アミノ酸はおそらく、分泌シグナル配列及び膜固定配列としてそれぞれ機能する。Ｂ６１と同じく、ＨＥＫ４ＢＰも明らかに可溶形態と膜結合形態との両方を有する。Ｎ末端タンパク質配列データは得られなかったが、シグナルペプチドの切断によって１位にセリンを有する成熟タンパク質が得られると推測される（図３）。ペプチドマッピング及び質量分析法に基づき、１７９位のプロリン（図３）はＡ４９８細胞−馴らし培地中に見出される主要な可溶形態のＣ末端アミノ酸であると考えられる。Ｃ末端に１７７位のアラニン（図３）を有する別の形態も検出した。Ｂ．組み換え体ＨＥＫ４ＢＰの発現図３に示したＨＥＫ４ＢＰｃＤＮＡクローンを、哺乳動物細胞発現用のプラスミドベクターｐＤＳＲαに挿入した。リン酸カルシウム沈澱法により組み換え体プラスミドでチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトし、前記プラスミドを保有する細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は含有するがＨＴ補足成分（即ち１０ｍＭナトリウムヒポキサンチン、１．６ｍＭチミジン）は含有しないＤＭＥＭ（高グルコース含量；Ｇｉｂｃｏ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（ＰＳＧ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）中での増殖によって選択した。幾つかのクローンでのＨＥＫ４ＢＰ発現を、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で測定した各クローンの細胞−馴らし培地のＨＥＫ４受容体結合活性のレベルによって評価した。結果は、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより測定したクローンのＨＥＫ４ＢＰｍＲＮＡレベルと十分に相関した。或るクローン即ちＣＨＯ／ＨＬ６は、他のクローンより有意に優れた組み換え体ＨＥＫ４ＢＰ産生体であった。このクローンを選択して更に実験を続けた。ＣＨＯ／ＨＬ６におけるＨＥＫ４ＢＰ発現は、数週間にわたって１００ｎＭまで逐次増量したメトトレキセートでの処理により２〜４倍に促進できた。増幅後、ＨＥＫ４ＢＰ発現細胞を増殖させ、組み換え体タンパク質精製用ソースとして用いる馴らし培地作製のために回転瓶に移した。全部で１００個の回転瓶にＣＨＯ／ＨＬ６細胞を、１瓶当たり１０⁷細胞の密度で播種した。細胞をＤＭＥＭ（高グルコース含量；Ｇｉｂｃｏ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、１×ＰＳＧ、１×ＮＥＡＡ及び１０％ＦＢＳ中で、集密状態となるまで（約４日間）増殖させた。増殖期後、培地を、１０％ＦＢＳではなく０．５％ＦＢＳを含有する以外は同じである培地と交換した。３日後、培地を集め、濾過して細胞破片を除去し、−８０℃で凍結保存した。実施例４組み換え体ＨＥＫ４ＢＰの精製ＣＨＯ／ＨＬ６細胞を用いて得られた馴らし培地約２０〜２５１を室温で解凍し、濾過した。培地を濃縮し、分子量１０，０００をカットオフ値とする膜を用いてｐＨ８．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（４℃）に対するダイアフィルトレーションを行なった。ダイアフィルトレーション濾液を高性能Ｑ−セファロースカラムに添加し、その後ｐＨ８．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ中のＮａＣｌ（線形濃度勾配０→０．３Ｍ）で溶離した。画分を、大腸菌で産生された折り畳まれていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）ＨＥＫ４ＢＰに対する抗体を用いるイムノブロッティングによって、またはＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップに固定化したＨＥＫ４受容体との結合によってＨＥＫ４ＢＰの存在に関し分析した。ＨＥＫ４ＢＰを含有する画分をプールし、濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５；５×８５ｃｍ；ＰＢＳ３ｍｌ／分）に添加した。ＨＥＫ４ＢＰ含有画分を、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル（濃度勾配２２→４４％）を用いるＣ４逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ；４．６×２５０ｍｍ；２．９ｍｌ／分）によって更に精製した。ピーク画分のカラムプロフィール及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図４に示す。画分は真空下に蒸発させ、０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ、２ｍＭＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５に添加した。実施例５Ａ．ＨＥＫ４受容体に対する抗体の作製ＨＥＫ４受容体細胞外ドメインに対する抗体を、標準的な方法（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，” ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）を用いて作製した。ＨＥＫ４受容体のアミノ酸２２〜１４８をコードするｃＤＮＡをｐＡＴＨベクター（Ｙａｎｓｕｒａ，１９９０）の、ＴｒｐＥ遺伝子と同じ翻訳読み取り枠内に挿入した。得られたプラスミドを大腸菌宿主株に導入し、それによってＨＥＫ４／ＴｒｐＥ融合タンパク質を発現させた。細菌細胞溶解物を分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ＨＥＫ４／ＴｒｐＥ融合タンパク質を含有するバンドを切り取った。潰したゲル切片を用いてウサギを、標準的なプロトコル（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，上掲書）に従い免疫感作した。この方法で得られた抗血清はＨＥＫ４／ＴｒｐＥ抗原と、ＣＨＯ細胞で産生された組み換え体ＨＥＫ４−Ｘとの両方を認識した。アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に化学的に連結した合成ペプチドを抗原として用いて、ＨＥＫ４受容体のＣ末端の１２個のアミノ酸（配列はＣｙｓ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ −Ｐｒｏ−Ｖａｌ）に対する抗体を同じ方法（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，上掲書）で作製した。得られた抗血清は、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてペプチド抗原を固定化したカラムに通すことにより精製した。これらの抗体は、ウェスタンブロットによってＨＥＫ４受容体を特異的に認識し得た。Ｂ．ＨＥＫ４ＢＰに対する抗体の作製図３に示したＨＥＫ４ＢＰｃＤＮＡを、プライマー８１９−３１及び８１９−２８を用いるＰＣＲのための鋳型として用いて、ＨＥＫ４ＢＰのアミノ酸１〜１７９（図３）をコードするポリペプチド断片を作製した。ＰＣＲ断片を、プライマーに含まれるＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位を用いて発現ベクターｐＣＦＭ１６５６中へクローン化した。得られた組み換え体プラスミドで大腸菌ＦＭ５（ＡＴＣＣ番号第５３９１１号）を形質転換し、切除型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＨＥＫ４ＢＰを不溶性の封入体として発現させた。封入体を可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製したＨＥＫ４ＢＰフラグメントを抗原としてウサギに用いた。抗血清が産生され、この抗血清は開示されているような特徴を有し（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，上掲書）、またウェスタンブロット分析により、ＣＨＯ細胞で発現されたＨＥＫ４ＢＰを認識した。実施例６Ａ．ＨＥＫ４受容体の発現パターンラット及びヒト組織におけるＨＥＫ４受容体ｍＲＮＡの発現は以前に、本出願と同じ出願人による同時係属米国特許出願第０８／２２９，５０９号に報告されており、この文献の当該箇所は本明細書に参考として含まれる。この試験の結果を表３にまとめる。ＨＥＫ４受容体ｍＲＮＡは、試験したヒト組織のうちでは胎盤で最も多量に発現し、より低いレベルでは心臓、脳、肺及び肝臓でも発現した。細胞系のＨＥＫ４受容体ｍＲＮＡに関して以前に行なわれた研究では、一つの前Ｂ細胞系及び二つのＴ細胞系での発現が判明した（Ｗｉｃｋｓ等，１９９２）。Ｂ．ＨＥＫ４ＢＰの発現パターンヒト組織におけるＨＥＫ４ＢＰｍＲＮＡの発現をノザンブロット分析によって調べた。先に示した各組織に由来する２μｇのポリＡ⁺を含有するノザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から購入し、これを³² Ｐ標識ＨＥＫ４ＢＰプローブとハイブリダイズした。図５に示したように、ＨＥＫ４ＢＰｍＲＮＡは成人の脳、腎臓及び胎盤で高レベルに発現する。心臓、肺、肝臓、脾臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸及び結腸においても、容易に検出可能なレベルを見出すことができる。多くの異なる組織中にＨＥＫ４ＢＰｍＲＮＡが存在することは、この因子が様々な種類の細胞の分化、発生及び／または維持にとって重要であるという考えに合致する。実施例７Ａ．細胞−細胞自己リン酸化によるＥＰＨサブファミリー受容体のＨＥＫ４ＢＰ活性化あらゆる既知の受容体プロテインチロシンキナーゼに関して、受容体活性化を特徴付けるものは自己リン酸化である（ｖａｎｄｅｒＧｅｅｒ等，上掲誌）。ＨＥＫ４ＢＰがＨＥＫ４受容体を活性化し得るかどうかを確認するべく、細胞−細胞自己リン酸化アッセイを行なった。受容細胞は、０．５％血清含有培地中で１６時間インキュベートすることにより血清欠乏状態とした、ＨＥＫ４受容体ＣＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞とした。供与細胞は、ＨＥＫ４ＢＰｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（実施例３のＢ参照）か、またはベクターのみでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞とした。供与細胞をその増殖容器の表面から掻き取ってリン酸緩衝食塩液に入れ、これを受容細胞に３７℃で３０分間添加した。洗浄後、受容細胞を改質ＲＩＰＡ緩衝液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコーレート、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン、５ｍＭＥＤＴＡ、２００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）中で溶解させた。細胞溶解物から受容体を免疫沈降させ、これを以前に述べたようにして（Ｂａｒｔｌｅｙ等，上掲誌）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動用に調製した。電気泳動及び膜へのエレクトロブロッティング後、免疫沈降物を抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０；ＵＢＩ，ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹ）でプローブした。製造元が指示するように化学ルミネセンスを用いるセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、免疫複合体を検出した。図６に示したように、ＨＥＫ４結合タンパク質発現細胞はＨＥＫ受容体とＥＣＫ受容体との両方のチロシンリン酸化を刺激し得た。対照細胞はいずれの受容体のリン酸化も刺激しなかった。このような結果は、ＨＥＫ４ＢＰがＨＥＫ４受容体とＥＣＫ受容体との両方を活性化し得ることを示している。Ｂ．可溶性ＨＥＫ４ＢＰによるＨＥＫ４受容体の活性化可溶性組み換え体ＨＥＫ４ＢＰがＨＥＫ４受容体を活性化し得るかどうか確認するべく、ＨＥＫ４受容体ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、ＨＥＫ４ＢＰ発現ＣＨＯ細胞（実施例３のＢ参照）を用いて得られた馴らし培地、または精製した組み換え体ＨＥＫ４ＢＰ（実施例４参照）で処理した。処理前に細胞を、０．５％血清含有培地中で１６時間インキュベートすることにより血清欠乏状態とした。処理は３７℃で３０分間行ない、その後細胞を改質ＮＰ４０緩衝液（ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン、５ｍＭＥＤＴＡ、２００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）中で溶解させ、ＨＥＫ４受容体を免疫沈降させ、これを以前に述べたようにして（Ｂａｒｔｌｅｙ等，上掲誌）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用に調製した。電気泳動及び膜へのエレクトロブロッティング後、免疫沈降物を抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０；ＵＢＩ，ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹ）でプローブした。製造元が指示するように化学ルミネセンスを用いるセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、免疫複合体を検出した。図７に示したように、馴らし培地中に存在する、及び精製した可溶性組み換え体ＨＥＫ４ＢＰはＨＥＫ４受容体を活性化した。この活性化は、ＨＥＫ４ＢＰカラムでアフィニティー精製した実施例５のＢの抗体で馴らし培地または精製ＨＥＫ４ＢＰを前処理することによって促進できた。ＨＥＫ４受容体発現ＣＨＯ細胞を処理する前の馴らし培地または精製ＨＥＫ４ＢＰを抗体（〜５０μｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートした。実施例８ＥＰＨ様受容体に対するＨＥＫ４ＢＰの親和性コンペティティブアッセイを用いて、ＨＥＫ４ＢＰと異なるＥＰＨ様受容体との結合の差を測定した。精製したＨＥＫ４ＢＰを様々な濃度のＨＥＫ４、ＨＥＫ８またはＥＣＫ可溶性受容体と共にインキュベートし、混合物と、固定化したＨＥＫ４受容体との結合をＢＴＡｃｏｒｅで分析した。可溶性受容体の、ＨＥＫ４ＢＰ結合を５０％抑制した濃度をＩＣ５０と呼称する。ＩＣ５０値によって、関連する受容体に対するＨＥＫ４ＢＰの相対親和性を比較することが可能となる。ＩＣ５０値は次のように測定した。ＨＥＫ４ＢＰと固定化したＨＥＫ４受容体との結合の分析から、６０〜５００ｎｇ／ｍｌの線形応答が判明した。様々な量の精製したＨＥＫ４、ＥＣＫまたはＨＥＫ８細胞外ドメインを実施例４に述べたように調製した０．２５０μｇ／ｍｌのＨＥＫ４ＢＰと共に、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、３．４ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍｇ／ｍｌ可溶性デキストランを含有するｐＨ７．４の溶液中でインキュベートした。これらの溶液は注入前に３℃で少なくとも３０分間インキュベートした。受容体ストック溶液のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイで確認した。各試料を二重にし、これらを２日の異なる日に標準曲線の下に並行処理した。総ての表面を２５ｍＭＣＡＰＳ及び１ＭＮａＣｌ、ｐＨ１０．４で、基線量の１０ＲＵ以内に再生させた。平均結合応答を可溶性受容体濃度に対してプロットし（図８）、ＨＥＫ４に関しては０．５５μｇ／ｍｌ、ＥＣＫに関しては５．０μｇ／ｍｌ、ＨＥＫ８に関しては１０．５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値を得た。即ち、ＨＥＫ４ＢＰはＨＥＫ４受容体と、ＥＰＨファミリーに属する他の２種の受容体ＥＣＫ及びＨＥＫ８に比較して優先的に結合する。本発明を、その好ましいと看做される具体例において説明したが、本発明はここに開示した具体例に限定されるべきでなく、逆に請求の範囲各項の思想及び範囲を逸脱しない様々な変形及び均等物を包含するものとされ、その際前記範囲はあらゆる変形及び均等物が含まれるように最も広く解釈されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/566 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ 21/08 ＡＡＡＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣＤＧ０１Ｎ 33/566 ＡＣＳ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フオツクス，ゲイリー・エムアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、ウエスト・ケリー・ロード・35

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得る、精製及び単離されたポリペプチドであって、前記受容体がＨＥＫ４受容体であるポリペプチド。２．前記結合によってＥＰＨ様受容体を活性化することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。３．ヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。４．他のヒトタンパク質を実質的に含まないことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。５．グリコシル化形態において非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの見掛けの分子量が約２１〜２７ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。６．外来ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物発現産物であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。７．外来ＤＮＡがｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡであることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。８．図３（配列番号１）に示したアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の相同性を有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。９．図３（配列番号１）のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。１０．更に−１位にメチオニン残基を有することを特徴とする請求項９に記載のポリペプチド。１１．可溶性であるか、または細胞表面と結合することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。１２．ＥＣＫ受容体とも結合し得ることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。１３．マルチマー型であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。１４．免疫グロブリンキメラ、抗体クラスター化タンパク質、並びに共有結合した、及び共有結合以外で結合したタンパク質モノマーの中から選択されることを特徴とする請求項１３に記載のポリペプチド。１５．少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得るポリペプチドをコードする、単離された核酸であって、ａ）図３（配列番号１）に示した核酸、ｂ）図３（配列番号１）のコーディング領域と６×ＳＳＣ及び６５℃の条件下にハイブリダイズする核酸、ｃ）（ａ）及び（ｂ）の核酸に対して縮重性である核酸の中から選択される核酸。１６．ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡであることを特徴とする請求項１５に記載の核酸。１７．請求項１５に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。１８．大腸菌での発現にとって好ましい１個以上のコドンを含むことを特徴とする請求項１５に記載の核酸。１９．請求項１５に記載の核酸を含む生物機能性プラスミドまたはウイルスベクター。２０．請求項１９に記載のＤＮＡベクターで安定に形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞。２１．ＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の宿主細胞。２２．大腸菌であることを特徴とする請求項２０に記載の宿主細胞。２３．少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得るポリペプチドを作製する方法であって、請求項１５に記載の核酸で形質転換またはトランスフェクトした原核または真核宿主細胞を適当な栄養条件下に増殖させること、及びベクター中の核酸の発現産物であるポリペプチドを単離することを含む方法。２４．治療有効量の請求項１に記載のポリペプチド、及び医薬に許容可能なアジュバントを含有する医薬組成物。２５．ポリペプチドがヒト由来であることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。２６．請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。２７．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２６に記載の抗体。２８．少なくとも１種のＥＰＨ様受容体を活性化する方法であって、当該受容体を請求項１に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。２９．細胞の成長または分化を調節する方法であって、前記細胞を請求項１に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。３０．細胞が腎細胞、肺細胞、肝細胞、皮膚細胞、消化管細胞、神経膠細胞、神経細胞または造血細胞であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。３１．哺乳動物の神経系の細胞機能を維持または回復する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを治療有効量で投与することを含む方法。３２．哺乳動物の傷害されたかまたは消耗した組織を再生させる方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを治療有効量で投与することを含む方法。３３．組織が肝臓、肺、消化管または神経系の組織であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。３４．生物試料において少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得るポリペプチドの存在を検出する方法であって、請求項２６に記載の抗体が前記ポリペプチドと結合することを可能にする条件下に試料を前記抗体と接触させること、及び前記抗体の結合を検出することを含む方法。３５．生物試料において少なくとも１種のＥＰＨ様受容体と結合し得るポリペプチドをコードする核酸の存在を検出する方法であって、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下に試料を請求項１５に記載の核酸と接触させること、及び請求項１５に記載の核酸のハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。３６．請求項１５に記載の核酸の転写または翻訳を阻止するようにして前記核酸とハイブリダイズするアンチセンスヌクレオチド配列。