JPH10234385A - 新規ヒトｅｔｓ科メンバーのｅｌｆ３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 機能不全または疾患の診断、予防、改善また
は修正において役割を果たしうる、ＥＴＳファミリーの
メンバーの同定および特徴付けが望まれている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ
酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して５０％よりも大きな同一性を有するポリヌクレ
オチド；（ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と
同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補性
のポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも連続した１５
塩基からなるポリヌクレオチドからなる群より選択され
るメンバーからなる単離ポリヌクレオチドを提供するも
のである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一部には、新規同
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体、お
よびポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれ
らの変種および誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴ
ニストおよびアンタゴニスト；ならびにポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関する。詳細には、これらおよび
他の点において本発明は、以下、本明細書で「ＥＬＦ
３」と称するＥＴＳファミリーメンバーのポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明は、新規同定されたポリヌクレオ
チド、かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの製造に関する。より詳細には、本発明のポリペ
プチドはＥＴＳファミリーのものである。本発明は、か
かるポリペプチドの作用の阻害または活性化にも関す
る。v−ｅｔｓ癌遺伝子は、最初、トリ・レトロウイル
スＥ２６により産生されるｇａｇ−ｍｙｂ−ｅｔｓ融合
タンパク質の一部として記載された。Nunnら、Nature，
1983，306：391−395。v−ｅｔｓの細胞性相同物はＥｔ
ｓ1であり、それは種々の遺伝子およびウイルスのプロ
モーターおよびエンハンサー中のＧＧＡ（Ａ／Ｔ）コア
配列に結合する転写因子である。Waslykら、Ｅur.Ｊ.Ｂ
iochem.，1983，211：7−18；Ｔymms，M.Ｊ.and Kola，
I，Ｍol.Ｒep.Ｄev.，1994，39：208−214。ＥＴＳタン
パク質は、造血（Ｓcottら、Ｓcience、1994、265：157
3−1577）、リンパ細胞機能の調節（Muthusamyら、Natu
re、1995、37：639−642）、血管形成（Wernertら、Ａ
m.Ｊ.Ｐathol.，1992，140：119−127；Vandenbunder
ら、Ｉnvasion Metastasis，1994，14：198−209）、器
官形成、分枝形態形成のごとき種々の発生プロセス（Ｋ
olaら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. USA，1993，90：7588
−7592）および骨格筋発達（Sumarsonoら、Ｎature，19
96，379：534−537）を包含する広範囲の生物学的プロ
セスにおいて役割を果たしていると考えられている。

【０００３】多くのＥＴＳファミリータンパク質は、核
の癌タンパク質であることが示されており、腫瘍抑制活
性についての証拠もある。Suzukiら、Ｐroc.Ｎatl.Ａca
d.Ｓci.ＵＳＡ，1995，92：4442−4446。v-ＥＴＳはニ
ワトリにおける赤芽球症を誘導し（Metz, T.およびＧra
f,Ｔ.，Ｇenes Ｄev.，1991，5：369−380）、細胞性Ｅ
ＴＳファミリータンパク質は、マウスにおいてプロウイ
ルス挿入により活性化される可能性があり（Ballacosa
ら、Ｊ.Ｖirol.，1994，68：2320−2330）、そしてもっ
とも重大なことに、ヒトにおいては染色体転座により活
性化される可能性がある。ＥＴＳ１、ＥＴＳ２およびＥ
ＲＧは前癌遺伝子であり、それらはＮＩＨ３Ｔ３細胞に
おいてトランスフォーメーションおよび分裂誘発特性を
有する。Sethら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，198
9，86：7833−7837；Ｓeth，Ａ.およびＰapas，Ｔ.
Ｓ.、Ｏncogene，1990，5：1761−1768；Ｈartら、Ｏnc
ogene，1995，10：1423−1430。生物学的特性の変化し
た融合タンパク質をもたらす、ＥＴＳ−ファミリーのメ
ンバーを含む転座は、ヒトにおいて癌を生じさせ得る。
ＥＲＧおよびそれに密接に関連した相同物ＥＲＧＢ／Ｆ
ＬＩ−１は、ｔ(11；22)またはｔ(21；22)染色体転座に
おいて破壊されることが示されており、それらはEwings
肉腫および他の初期の神経外胚葉の腫瘍の診断薬であ
る。Delattreら、Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed.，1994，331：294
−299；Ｓorrensonら、Ｎat.Ｇenet.，1994，6：146−1
51。また、ＥＲＧは、急性骨髄性白血病に関連している
ｔ(16；21)転座にも関与している。Ｓhimizuら、Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，1993，90：10280−10284。
ＥＴＳファミリーのメンバーであるＴＥＬは、慢性骨髄
性単球白血病におけるｔ(5；12)転座（Ｇolubら、Ｃel
l，1994，77：307−316)および急性リンパ芽球性白血病
におけるｔ(12；21)転座（Ｇolub ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａc
ad.Ｓci.ＵＳＡ，1995，92：4917−4921）に関与してい
る。

【０００４】かくして、これらのタンパク質は、種々の
型の癌の診断薬として確立され、証明された歴史を有す
る。とりわけ癌を包含するが、これに限定されるもので
はない、機能不全または疾患の診断、予防、改善または
修正において役割を果たしうる、さらなるＥＴＳファミ
リーのメンバーの同定および特徴付けに関する必要性が
あるのは明らかである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】これらの目的および他
の目的に対して、とりわけ、図１および２に示すアミノ
酸配列とＥＬＦ１およびＥＬＦ２ならびにDrosophila
Ｅ74ＡのＤＮＡ結合ドメインなどの他のタンパク質の既
知アミノ酸配列との間の相同性により、新規ＥＬＦ３と
して同定されたポリペプチドを提供することが本発明の
目的である。さらにＥＬＦ３をコードするポリヌクレオ
チド、特に配列番号２のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供することも本発明の目的である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明のこの態様の特に
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、図１お
よび２に示すヒトＥＬＦ３配列をコードしている領域を
含んでなる。本発明のこの態様によれば、ＡＴＣＣ受託
番号９８２３８中に含まれるヒトｃＤＮＡから発現され
うる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供
される。本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡおよびフラグメントを包含するヒトＥ
ＬＦ３をコードする単離核酸分子が提供され、本発明の
この態様のさらなる具体例において、生物学的、診断
上、臨床上または治療上有用な、変種、アナログおよび
誘導体のフラグメントを含め、それらの変種、アナログ
または誘導体が提供される。本発明のこの態様の特に好
ましい具体例には、天然のヒトＥＬＦ３の対立遺伝子変
種がある。

【０００７】ＥＬＦ３ポリペプチド、特にヒトＥＬＦ３
ポリペプチドを提供することも本発明の目的であり、そ
れらを診断目的、例えば、癌の早期診断、詳細には特に
乳癌および前立腺癌のごとき表皮癌の早期診断において
使用してもよい。本発明のこの態様によれば、本明細書
でＥＬＦ３と称するヒト起源の新規ポリペプチド、同様
に生物学的、診断上、または治療上有用なそのフラグメ
ント、変種および誘導体、該フラグメントの変種および
誘導体、および上記のアナログが提供される。本発明の
この態様の特に好ましい具体例には、ヒトＥＬＦ３遺伝
子の天然の対立遺伝子によりコードされるヒトＥＬＦ３
の変種がある。本発明のもう一つの態様によれば、本発
明のポリペプチドに結合してその活性を活性化または阻
害する化合物についてスクリーニングする方法が提供さ
れる。

【０００８】本発明のもう一つの目的は、上記したポリ
ペプチド、ポリペプチドフラグメント、変種、および誘
導体、該変種および誘導体のフラグメント、ならびに上
記のアナログの製造方法を提供することである。本発明
のこの態様の好ましい具体例において、宿主でのヒトＥ
ＬＦ３の発現のための条件下で、外来性のヒトＥＬＦ３
をコードするポリヌクレオチドを細胞中に発現可能な状
態で組み込んだ宿主細胞を培養し；ＥＬＦ３ポリペプチ
ドを発現させ；ついで、発現したポリペプチドを回収す
ることからなる上記のＥＬＦ３ポリペプチドの製造方法
が提供される。本発明のもう一つ別の目的によれば、と
りわけ、研究的、生物学的、臨床的および治療的な目的
に、前記したポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利
用する生成物、組成物、プロセスおよび方法が提供され
る。

【０００９】本発明のこの態様のある好ましい具体例に
よれば、とりわけ、ＥＬＦ３ポリペプチドまたはＥＬＦ
３をコードするｍＲＮＡを測定することにより、細胞で
のＥＬＦ３発現を評価し；細胞を本明細書に開示のＥＬ
Ｆ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに曝露するこ
とにより、インビトロ、エクスビボまたはインビボで
癌、特に前立腺癌および乳癌などの上皮癌を診断し；Ｅ
ＬＦ３遺伝子における欠失などの遺伝的変異および異常
を分析し；および、 ＥＬＦ３ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドを生体に投与し、ＥＬＦ３機能を改善し、
あるいはＥＬＦ３機能不全を治療する、生成物、組成物
および方法が提供される。本発明のさらにもう一つ別の
具体例によれば、ＥＬＦ３の発現不足に関連した症状の
治療のために本発明のポリペプチドを刺激するためのか
かる活性化化合物の使用方法が提供される。本発明のも
う一つ別の態様によれば、ＥＬＦ３の過剰発現に関連し
た症状の治療のためのかかる阻害化合物の使用方法が提
供される。

【００１０】本発明のさらにもう一つ別の態様によれ
ば、本発明のＥＬＦ３ポリペプチドの少なくとも一つの
ドメインの同種アミノ酸置換を有する、フラグメント、
共通フラグメントおよび／または配列である、非天然の
合成、単離および／または組換えＥＬＦ３ポリペプチド
が提供され、該ポリペプチドはＥＬＦ３リガンドを結合
するか、あるいはまた、それらはＥＬＦ３リガンド結合
を定性的または定量的に変調することもできる。本発明
のさらにもう一つ別の態様によれば、リガンドに結合す
ること、またはリガンド結合を変調させることによっ
て、ＥＬＦ３機能の潜在的モジュレーターとして有用で
ありうる合成または組換えＥＬＦ３ポリペピチド、その
同種置換および誘導体、それに対する抗体、抗イディオ
タイプ抗体、組成物ならびに方法が提供され、その考え
られる生物学的特性のため、それらは診断、治療および
／または研究用途に使用することができる。本発明のさ
らにもう一つ別の目的は、種々のＥＬＦ３またはそれら
のフラグメントを阻害または模倣するように設計され
た、合成、単離または組換えポリペプチドを提供するこ
とである。本発明のこの態様または他の態様の好ましい
具体例によれば、ヒトＥＬＦ３配列にハイブリダイズす
るプローブが提供される。

【００１１】本発明のこの態様のさらなる好ましい具体
例において、ＥＬＦ３ポリペプチドに対する抗体が提供
される。この点における特に好ましい具体例において、
抗体はヒトＥＬＦ３に対して高度に選択的である。本発
明のもう一つ別の態様によれば、ＥＬＦ３アゴニストが
提供される。好ましいアゴニストには、ＥＬＦ３を模倣
し、ＥＬＦ３結合分子またはレセプター分子に結合し、
ＥＬＦ３誘発応答を惹起または増大させる分子がある。
また、好ましいアゴニストには、ＥＬＦ３またはＥＬＦ
３ポリペプチドと、あるいはＥＬＦ３活性の他のモジュ
レーターと相互作用し、そのことによりＥＬＦ３の一つ
の効果またはＥＬＦ３の１つよりも多い効果を亢進する
か、または増強する分子もある。

【００１２】本発明のさらにもう一つ別の態様によれ
ば、ＥＬＦ３アンタゴニストが提供される。好ましいア
ンタゴニストには、ＥＬＦ３を模倣してＥＬＦ３レセプ
ターまたは結合分子に結合するが、一のＥＬＦ３誘発応
答または一より多いＥＬＦ３誘発応答を惹起しないもの
がある。また、好ましいアンタゴニストには、ＥＬＦ３
に結合するか、あるいはＥＬＦ３と相互作用して、ＥＬ
Ｆ３の一つの効果またはＥＬＦ３の一より多い効果を阻
害する分子、あるいはＥＬＦ３の発現を阻害する分子が
ある。

【００１３】本発明のさらなる態様において、インビト
ロで細胞に、エクスビボで細胞に、そしてインビボで細
胞に、あるいは多細胞生物に投与するための、ＥＬＦ３
ポリヌクレオチドまたはＥＬＦ３ポリペプチドからなる
組成物が提供される。本発明のこの態様の特に好ましい
具体例において、組成物は、疾患の治療に関する宿主生
物中でＥＬＦ３ポリペプチドを発現させるためのＥＬＦ
３ポリヌクレオチドを含んでなる。この点において、Ｅ
ＬＦ３の異常内因性活性に付随する機能不全の治療に関
するヒト患者における発現が特に好ましい。

【００１４】本発明の他の目的、特徴、利点および態様
は、以下の説明から当業者に明らかとなるであろう。し
かしながら、以下の説明および特定の実施例は、本発明
の好ましい具体例を示すものであり、単なる説明にすぎ
ないことが理解されるであろう。開示された本発明の精
神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の説
明を読むこと、本開示の他の部分を読むことにより、当
業者に容易に明らかとなるであろう。

【００１５】

【発明の実施の形態】

定義 以下に例示する説明は、本明細書、特に実施例において
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補因子および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。

【００１６】個々の制限酵素についての適当な緩衝液お
よび基質の量は、以下に述べるような標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって詳説
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細な条件に従って変えることができ
る。消化後、当業者に慣用的な周知方法を用いて、反応
物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポリアク
リルアミドゲルを介する電気泳動によって精製してもよ
い。「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチドをコード
する領域あるいは複製、転写もしくは翻訳または宿主細
胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを
調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、あるいは
ポリペプチドをコードする領域、およびそれに作動可能
に連結された、発現を調節する領域の両方を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、エピソー
ム因子として、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メトトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のようなものの中に取り込まれて
いてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込
まれていてもよいが、それは天然の状態ではなく、むし
ろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの
形態の、またはベクターでの宿主細胞への導入などの操
作の後のものである。

【００１７】「単離」とは、「人工的」にその天然状態
から変えられること、すなわち、天然物の場合、その本
来的な環境から変化または除去されること、あるいはそ
の両方を意味する。例えば、その自然状態にある生存動
物に自然に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共
存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書で用いる用語としての「単
離」である。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単
離という語は、それが天然に存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。単離の際に、
あるいは単離後に、かかるポリヌクレオチドを、例え
ば、突然変異を誘発し、融合タンパク質を形成するため
に、および宿主中での増殖または発現のために、ＤＮＡ
などの他のポリヌクレオチドに結合させることができ
る。単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチ
ドと結合した単離ポリヌクレオチドを、培養中または完
全生物における宿主細胞に導入することができる。培養
中または完全生物における宿主細胞へ導入される場合、
かかるＤＮＡは、その語を本明細書において用いる場
合、やはり単離されている。というのも、それらは天然
の形態でなく、あるいは自然環境にあるものではないか
らである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、培地などの組成物、処方、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの、例えば細胞への導入のための溶液、
例えば、天然に存在しない組成物であり、その中に本明
細書で用いる場合の用語としての意味としての単離ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを保持する、化学反応
または酵素反応のための組成物または溶液中に存在して
もよい。

【００１８】「ライゲーション」とは、ほとんどの場
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチドの間でホスホジエステル結合を形成するプロセ
スをいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよ
く知られており、ライゲーションについてのプロトコル
は標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrook
ら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL，第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri
ng Harbor，New York，(1989) （以下、Sambrookらとい
う）などの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチ
ド」とは比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばし
ば、その用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう
が、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレ
オチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮ
Ａをいうこともできる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌ
クレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、自動式オリゴ
ヌクレオチド合成機の使用のごとき、化学的方法により
合成されることがよくある。しかしながら、オリゴヌク
レオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞およ
び生物におけるＤＮＡ発現による方法を含め、他の種々
の方法により製造することができる。

【００１９】最初、化学的に合成されたＤＮＡは、典型
的には、５’リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリ
ゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成
するために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用す
るライゲーション反応によるホスホジエステル結合形成
の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲー
ションが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いる
ような標準的方法によりリン酸を付加することができ
る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端
は、一般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオ
チドなどの、別のポリヌクレオチドの５’リン酸とホス
ホジエステル結合を容易に形成するであろう。よく知ら
れているように、要すれば、ライゲーションの前に他の
ポリヌクレオチド（複数でも可）の５’リン酸を除去す
ることによって、この反応を選択的に阻害できる。

【００２０】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではなく、安定して受け継がれる遺伝的因子である。
プラスミドはＤＮＡまたはＲＮＡからなり、直鎖または
環状であってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその
複製および安定な遺伝性を確実にする分子をコードして
おり、医学的、農学的、および環境学的に非常に重要な
産物をコードするかもしれない。例えば、プラスミドは
病原菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プ
ラスミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を
コードすることもできる。プラスミドは、組換え遺伝子
をクローン化および発現するために用いられるベクター
として分子生物学において広く使用されている。プラス
ミドは、一般に、当業者が使いなれた標準的な命名操作
に従い、本明細書では、小文字「ｐ」を前置し、および
／またはつづいて大文字および／または数字で表す。本
明細書に開示されている出発プラスミドは、市販され、
公的に入手可能であるか、または周知の公開された方法
を慣用的に適用することにより利用可能なプラスミドか
ら構築され得る。本発明に従い使用され得る多くのプラ
スミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、
よく知られており、当業者に容易に利用され得る。さら
に、当業者であれば、本発明での使用に適したかなり多
数の他のプラスミドでも容易に構築し得る。本発明にお
ける、かかるプラスミドならびに他のベクターの特性、
構築および用途は、当業者であれば本明細書から容易に
理解できるはずである。

【００２１】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドを包含し、それらは非修飾ＲＮＡもしくは
ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。す
なわち、例えば、本明細書で使用されているポリヌクレ
オチドは、とりわけ、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本お
よび２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本または２本
鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖、または１
本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲ
ＮＡを含むハイブリッド分子をいう。加えて、本明細書
で使用されているポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる３本鎖領
域をいう。かかる領域の鎖は同じ分子または異なる分子
に由来していてもよい。これらの領域は１個またはそれ
以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含み得る。３重らせん領域の分子
の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばで
ある。

【００２２】本明細書で使用されている、「ポリヌクレ
オチド」の語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有
する上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。すなわち、
バックボーンが安定性またはその他の理由で修飾された
ＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で意図するところの
「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの
普通でない塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基
を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、２例しか挙げていない
が、本明細書で使用するところのポリヌクレオチドであ
る。当業者に周知の多くの有用な目的に役立つ非常に多
様な修飾がＤＮＡまたはＲＮＡに対してなされているこ
とは明らかであろう。ここで使用されているポリヌクレ
オチドの語は、ポリヌクレオチドのそうした化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルス
および特に単純型および複雑型細胞を含む細胞に特有の
ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

【００２３】本明細書で使用されている「ポリペプチ
ド」は、下記のポリペプチド全てを包含する。ポリペプ
チドの基本的構造はよく知られており、当該分野におけ
る多数のテキストブックおよび他の刊行物に既に記載さ
れている。この点からすると、この語は、本明細書中、
ペプチド結合により直鎖で互いに結合された２個または
それ以上のアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質
をいうものとして使用されている。本明細書で使用され
ている、この語はまた、一般に当該分野で、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称されている
短鎖、および一般に当該分野でタンパク質と称され、そ
の多くのタイプが存在している長鎖の両方を包含する。
ポリペプチドは、２０天然アミノ酸として一般に称され
る２０アミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多く、末端
アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、所定のポリペプチド
において、自然プロセス、例えばプロセッシングおよび
他の翻訳後修飾、または当該分野で公知の化学的修飾技
術により修飾されていてもよい。ポリペプチドにて自然
に生じる一般的修飾でさえ、多すぎるためここで余すと
ころ無く列挙することはできないが、それらは基本的な
テキストおよび詳細な研究論文ならびに多量の研究文献
に詳述されており、当業者にはよく知られている。

【００２４】本発明のポリペプチドに存在し得る既知修
飾として、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の
共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共
有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジ
ルイノシトールの共有結合、交差結合、閉環、ジスルフ
ィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、シス
チンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガ
ンマ−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形
成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ア
ルギニル化などの、転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのア
ミノ酸付加およびユビキチン化が挙げられるが、これに
限定されない。かかる修飾は、当業者に周知であり、科
学文献に非常に詳細に記載されている。糖鎖形成、脂質
結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシ
ル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化などの
幾つかの特に一般的な修飾が、PROTEINS-STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES、第２版、Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，
Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompany、ニューヨーク（１９９
３）に記載されている。この題目に関して、詳細な報文
も入手可能である。例えば、Ｗold,Ｆ.、POSTTRANSLATI
ONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS、「翻訳後タ
ンパク質修飾：展望および予想」、１−１２頁、Ｂ.Ｃ.
Ｊohnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１
９８３）；Ｓeifterら、Meth.Ｅnzymol. １８２：６２
６−６４６（１９９０）およびＲattanら、Ann.N.Y.Aca
d.Sci.，６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこ
と。

【００２５】周知かつ前記にあるとおり、ポリペプチド
は必ずしも完全に線状とは限らない。例えば、ポリペプ
チドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよ
く、一般に、自然プロセッシング事象および自然には起
こらない人的操作により得られる事象を含む、翻訳後事
象の結果として、分枝の有無にかかわらず、環状であっ
てもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、
非翻訳自然プロセスおよび、同様に完全な合成方法によ
っても合成され得る。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸
側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリ
ペプチドのあらゆる場所で起こり得る。事実、ポリペプ
チドでのアミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら
両方の共有結合の修飾による遮断は、天然および合成ポ
リペプチドに共通しており、かかる修飾が、同様に本発
明のポリペプチドにあってもよい。例えば、プロセッシ
ングの前に、エシェリキア・コリ（Ｅ.coli）で生成さ
れたポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外な
く、Ｎ−ホルミルメチオニンである。

【００２６】ポリペプチドに起こる修飾は、ポリペプチ
ドの形成の仕方と相関関係にあることがしばしばであ
る。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現させ
ることにより生成されたポリペプチドの場合、修飾の性
質および程度の大部分は、宿主細胞翻訳後修飾能力およ
びポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルに
より決定される。例えば、よく知られているように、糖
鎖形成は、多くの場合、細菌宿主、例えばエシェリキア
・コリでは起こらない。従って、糖鎖形成が望ましい場
合、ポリペプチドを糖鎖形成性宿主、一般に真核細胞で
発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動
物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。この理由のため、昆虫
細胞発現系が、とりわけ、元来の糖鎖形成のパターンを
有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するために開
発された。同様の考え方が他の修飾にも適用される。

【００２７】同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いるような、ポリペプチドなる語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用
いる場合、それは、各々、対照標準のポリヌクレオチド
またはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。この意味における変種は、下記
およびこの開示のいずれかの部分においてより詳細に記
載されている。変種は、ヌクレオチド配列にて、別の対
照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを
包含する。一般に、相違は対照と変種のヌクレオチド配
列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同一で
あるようなものに限られる。

【００２８】下記のごとく、変種のヌクレオチド配列の
変化はサイレントであってもよい。すなわち、その変化
は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変
えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化に限定
される場合、変種は対照標準と同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするであろう。また、下記のご
とく、変種のヌクレオチド配列における変化が、対照標
準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変化させてもよい。かかるヌクレオチ
ドの変化は、下記のごとく、対照標準の配列によりコー
ドされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、欠失、
融合および切断をもたらすかもしれない。

【００２９】変種はまた、アミノ酸配列にて、別の対照
標準のポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。
一般に、相違は、対照標準と変種の配列が全体的に極め
て類似し、多くの領域において同一であるようなものに
限られる。変種および対照標準のポリペプチドは、アミ
ノ酸配列にて、１個またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断により異なっていてもよく、それら
はいずれの組み合わせにて存在してもよい。

【００３０】本明細書にて用いる場合、「融合タンパク
質」は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝子または
そのフラグメントでコードされるタンパク質である。Ｅ
Ｐ-Ａ-０ ４６４ ５３３（対応カナダ国特許２０４５８
６９）は、もう一つ別のヒトタンパク質またはそれの一
部と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を
含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融
合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用
いることが、治療および診断における使用について有利
であり、例えば、改良された薬物動態学的性質が得られ
る（ＥＰ-Ａ０２３２ ２６２）。他方、ある用途には、
融合タンパク質が発現され、検出され、次いで精製され
た後、Ｆｃ部分を検出できることが望ましい。したがっ
て、融合タンパク質の成分を、化学的または酵素的切断
しうる結合領域で連結させることが望ましい。これは、
Ｆｃ部分が治療および診断における用途に対する妨害物
であると判明した場合、例えば、融合タンパク質を免疫
化のための抗原として使用すべき場合である。例えば、
薬物の発見において、ｓｈＩＬ５-αなどのヒトタンパ
ク質を、ｈＩＬ-５のアンタゴニストを同定するための
高処理量のスクリーニングアッセイにて用いるためにＦ
ｃ部分と融合させる。D.Bennettら、Journal of Molecu
lar Recognition, 8：52−58（1995）およびK.Johanson
ら、TheJournal of Biological Chemistry，270（1
6）：9459−9471（1995）を参照のこと。

【００３１】かくして、本発明はまた、ＥＬＦ３、また
はその部分、および、種々のサブクラスの免疫グロブリ
ン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽
鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺伝子操作され
た可溶性融合タンパク質にも関する。免疫グロブリンと
して好ましいのは、融合がヒンジ領域で起こる場合の、
ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部分である。個
々の具体例において、血餅形成因子Ｘａで開裂できる開
裂配列を組み込むことによってＦｃ部分は簡単に除去さ
れうる。さらに、本発明は遺伝子操作によるこれらの融
合タンパク質の製造方法、ならびに診断および治療にお
けるそれらの使用に関する。本発明のさらなる態様は、
かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに
も関する。

【００３２】転写因子は融合タンパク質の製造において
特に有用である。かかる因子は、一般に、少なくとも２
つの異なる構造領域：ＤＮＡ結合領域（複数でも可）お
よびトランスアクチベイション領域を有することで特徴
付けられる。本発明は融合タンパク質の成分として１ま
たはそれ以上のこれら領域を用いるものである。このよ
うな融合タンパク質技術の例は、ＷＯ９４／２９４５８
およびＷＯ９４／２２９１４に見つけることができる。
「結合分子」は、本発明のポリペプチドに特異的に結合
または相互作用する分子をいう。かかる結合分子は本発
明の一部である。結合分子はまた、本発明のポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体および抗体誘導試薬などの非
天然物であってもよい。

【００３３】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２本の鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press，New York（1988）；BIOCOMPUTING：INFORMATI
CS AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.編,Academic Pres
s, New York（1993）；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE
DATA，PART I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編，H
umana Press, New Jersey（1994）；SEQUENCE ANALYSIS
IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje, G.,Academic Pre
ss（1987）；およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribsk
ov,M.およびDevereux,J.編, M Stockton Press，New Yo
rk（1991））。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列の間の同一性および類似性を測定するための多
くの方法が存在する一方、「同一性」および「類似性」
なる用語は当業者によく知られている（Carillo,H.およ
びLipton,D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（198
8））。２つの配列間の同一性または類似性を決定する
ために通常用いられる方法は、これに限定されないが、
GUIDE TO HUGE COMPUTERS，Martin J.Bishop編，Academ
ic Press，San Diego（1994）およびCarillo,H.および
Lipton,D.、SIAM J.Applied Math.48：1073（1988）に
開示されている方法を包含する。同一性を測定するため
の好ましい方法は、試験する２つの配列間に最大の対合
を与えるように設計される。同一性および類似性を測定
する方法はコンピュータープログラムに書き込まれてい
る。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ま
しいコンピュータープログラムの方法は、これに限定さ
れないが、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Devereux,
J.ら、Nucleic Acids Research 12（1）：387（198
4）、BLASTP, BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.
Molec.Biol.，215：403（1990））を包含する。

【００３４】本発明は、とりわけ、以下にさらに詳細に
記載するような、新規ＥＬＦ３ポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ＥＬＦ１およ
びＥＬＦ２に対するアミノ酸配列相同性ならびにドロソ
フィラ（Drosophila Ｅ７４Ａ）のＤＮＡ結合領域によ
り関連付けられる、新規ヒトＥＬＦ３のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１
ないし４に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有す
るＥＬＦ３に、および本明細書中、「寄託クローン」ま
たは「寄託クローンのｃＤＮＡ」と称するＡＴＣＣ受託
番号９８２３８ののヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列お
よびそれによりコードされるアミノ酸配列に関する。図
１ないし４に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、
寄託クローンのｃＤＮＡを配列決定することにより得ら
れる。これゆえ、寄託クローンの配列は２者の間の不一
致を調整しており、図１ないし４の配列に関するものは
寄託クローンのヒトｃＤＮＡの配列に関するものを包含
する。

【００３５】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図３および４の推定アミ
ノ酸配列を有するＥＬＦ３ポリペプチドをコードする単
離ポリヌクレオチドが提供される。図１および２に示す
ポリヌクレオチド配列などの本明細書に示す情報を用い
て、ヒトＥＬＦ３をコードする本発明のポリヌクレオチ
ドを、出発物質としての前立腺組織由来の細胞からのｍ
ＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングする方法など
の、標準的クローニングおよびスクリーニング法を用い
て得ることができる。本発明の代表例である、図１およ
び２に示すポリヌクレオチドは、発現配列タグ（ＥＳ
Ｔ）分析により同定される前立腺ｃＤＮＡライブラリー
由来のプローブを用いて肺ｃＤＮＡライブラリーにて見
つけられた（Adams,M.D.ら、Science、252：1651-1656
（1991）；Adams,M.D.ら、Nature、355：632-634（199
2）；Adams,M.D.ら、Nature、377 Supp：3-174（199
5））。さらに詳しくは、肺ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーンするのに、前立腺ｃＤＮＡライブラリーから由
来の公知ＥＴＳ ＤＮＡ結合領域配列を用いた。この配
列はＥＴＳ種のメンバーの中で高度に保存されており、
この種のメンバーを分類するための診断物として役立
つ。

【００３６】本発明のヒトＥＬＦ３は、構造的に、寄託
クローン中のヒトＥＬＦ３をコードするｃＤＮＡを配列
決定した結果より明らかなように、ＥＴＳ種の他のタン
パク質に関連付けられる。ＥＬＦ３のＤＮＡ結合領域は
Ｅ７４ ＥＴＳ ＤＮＡ結合領域サブファミリーに分類さ
れる。ＥＬＦ３は、特徴的なＥＴＳ ＤＮＡ結合領域に
て他のヒトＥＴＳ種タンパク質と相同性を示し、ドロソ
フィラＥ７４ＡのＤＮＡ結合領域に対する高い同一性に
基づき、これらの遺伝子符号の帰属するＥＬＦ１および
ＥＬＦ２と最も高い相同性を示す。ＥＬＦ３は、ＥＬＦ
１と４８％の同一性、ＥＬＦ２と４９％の同一性および
Ｅ７４と５０％の同一性を有する。得られたｃＤＮＡ配
列を図１および２にて配列番号１として示す。それは推
定分子量４１４５４Ｄａの３７１アミノ酸のタンパク質
をコードするオープン・リーディング・フレームを含有
する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の推定の大き
さは４２ｋＤａである。配列番号２のアミノ酸４２ない
し１３５は、Ｎ−末端領域を示し、ＥＴＳ１およびＥＴ
Ｓ２と相同性を示す。配列番号２のアミノ酸２０９ない
し２２１はコンセンサスＰＥＳＴモチーフを示す。配列
番号２のアミノ酸２７４ないし３５３はＥＴＳ ＤＮＡ
結合領域を示す。

【００３７】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードする
コーディング配列は、図１および２（配列番号１）に示
すポリヌクレオチドのコーディング配列と同じであって
もよい。そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の重複
性（縮重性）の結果として、図３および４（配列番号
２）のポリペプチドをもコードする、別の配列を有する
ポリヌクレオチドであってもよい。

【００３８】図３および４のポリペプチドをコードする
本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコ
ーディング配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列および付加的なコーディング配列；および前記し
た付加的なコーディング配列を有するか、または有する
ことなく、付加的な非コーディング配列を有する、成熟
ポリペプチドのコーディング配列を包含するが、これに
限定されるものではない。付加的なコーディング配列と
して、例えば、プレタンパク質、プロタンパク質または
プレプロタンパク質配列などのリーダー配列または分泌
配列をコードする配列が挙げられるが、これに限定され
るものではない。付加的な非コーディング配列として、
例えば、転写およびスプライシングを含め、ｍＲＮＡプ
ロセッシングにて役割を果たす、転写され、かつ非翻訳
の配列および、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合およ
び安定性のためのポリアデニル化シグナルなどのイント
ロンおよび非コーディング５’および３’配列を包含す
るが、これに限定されない。付加的な官能性を付与する
コーディング配列をポリペプチドに組み入れてもよい。
かくして、例えば、ポリペプチドを、融合ポリペプチド
の精製を容易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融
合させてもよい。本発明のこの態様のある好ましい具体
例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiage
n,Inc.）で供給されるようなヘキサヒスチジンペプチド
である。Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、86：821-
824（1989）に記載されているように、例えば、ヘキサ
ヒスチジンは融合タンパク質を精製するのに都合がよ
い。そのＨＡタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タン
パク質由来のエピトープに対応するものであり、例え
ば、Wilsonら、Cell 37：767 (1984) に記載されてい
る。他の多くのそのようなタグが市販されている。

【００３９】前記によれば、本明細書にて用いられる
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図３および４に示すアミノ酸配列を有するヒトＥ
ＬＦ３をコードするいずれの配列をも含むポリヌクレオ
チドを包含する。該用語はまた、コーディングおよび／
または非コーディング配列を含んでいてもよい、付加的
な領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一の連続
領域または不連続領域（例えば、イントロンにより分断
されている）を含むポリヌクレオチドも包含する。さら
に本発明は、図３および４の推定アミノ酸配列を有する
ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体を
コードする、本明細書にて前記したポリヌクレオチドの
変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立
遺伝子変種などの天然に存在する変種であってもよく、
あるいは、天然に存在することが知られていない変種で
あってもよい。かかるポリヌクレオチドの天然に存在し
ない変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に用い
る方法を含め、突然変異誘発法により製造してもよい。

【００４０】この点で変種には、ヌクレオチド置換、欠
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図３および４に示すＥＬＦ３
のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド；その変種、アナログ、誘導体およびフラ
グメント、ならびにその変種、アナログおよび誘導体の
フラグメントがある。

【００４１】さらに、この点において、数個、わずか
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図３および４のＥＬ
Ｆ３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ＥＬＦ３変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそ
のフラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコード
するポリヌクレオチドが特に好ましい。これらのうち特
に好ましいのは、ＥＬＦ３の特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠失である。またこの
点において、同類置換が特に好ましい。置換されていな
い、図３および４のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。

【００４２】本発明のさらに好ましい具体例は、図３お
よび４に示すアミノ酸配列を有するＥＬＦ３ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して５０％よりも
大きな同一性を有するポリヌクレオチド、およびかかる
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
寄託クローンのヒトｃＤＮＡのＥＬＦ３ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリ
ヌクレオチドに対して少なくとも６０−８０％同一であ
る領域からなるポリヌクレオチドが非常に好ましい。こ
の点において、その同じポリペプチドに対して少なくと
も９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、
これらのうちでも特に好ましいのは、少なくとも９５％
同一のものである。さらには、少なくとも９７％同一の
ものが非常に好ましく、少なくとも９８−９９％同一の
ものがさらに好ましく、少なくとも９９％同一のものが
最も好ましい。この点において、さらに特に好ましい具
体例は、図１および２のｃＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性
を保持しているポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドである。

【００４３】本発明はさらに本明細書にて前記した配列
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いるような、「ストリンジェントな条件」なる語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイ
に関してさらに検討するように、例えば、前記した本発
明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＥＬ
Ｆ３をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離し、ヒトＥＬＦ３遺伝子に対して高度の配列類
似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離してもよい。かかるプローブは、一般に、少な
くとも１５個のヌクレオチドを有してなる。好ましく
は、かかるプローブは少なくとも３０個のヌクレオチド
を有するであろうし、少なくとも５０個のヌクレオチド
を有していてもよい。特に好ましいプローブは３０と５
０個の範囲にあるヌクレオチドを有する。

【００４４】例えば、ＥＬＦ３遺伝子のコード領域は、
既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングしてオリゴ
ヌクレオチド・プローブを合成することにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有
する標識したオリゴヌクレオチドを用いてヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスク
リーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブ
とハイブリダイズするか決定する。本発明のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドは、本明細書においてポリヌ
クレオチド・アッセイに関してさらに説明するように、
ヒト疾患に対する治療および診断の発見のための研究試
薬および研究材料として用いることができる。

【００４５】該ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質
に、付加的なアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加
わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった
（例えば、成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有す
る場合）ポリペプチドをコードすることができる。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタン
パク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパ
ク質を運ぶことを容易にし、タンパク質の半減期を長く
したり、短くしたり、あるいはアッセイまたは生産のた
めのタンパク質の操作を容易にすることができる。イン
シテューで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素
により成熟タンパク質からプロセッシングにより除かれ
る。一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチ
ドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれると、そのよ
うな不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列の幾
らかまたは全体を、活性化の前に除去できる。一般に、
そのような前駆体はプロタンパク質と称される。

【００４６】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。

【００４７】寄託材料 ヒトＥＬＦ３ｃＤＮＡを含む寄託株を、１９９６年１１
月１日に、アメリカ合衆国、メリーランド２０８５２、
ロックビル、パーク・ローン・ドライブ１２３０１のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
し、ＡＴＣＣ受託番号９８２３８が付された。そのヒト
ｃＤＮＡ寄託株を、本明細書にて「寄託クローン」また
は「寄託クローンのＤＮＡ］という。寄託材料は、完全
長ＥＬＦ３ｃＤＮＡを含有するエシェリキア・コリ・Ｄ
Ｈ１０Ｂ ｐＧＥＭＴ ＥＬＦ３である。寄託は特許手続
き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の
条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限ま
たは条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託株は当
業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１
２条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であ
ることを承認するものではない。寄託材料に含まれるポ
リヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書における配
列の記載とのいずれの不一致をも調節するものである。
寄託材料を製造、使用または販売するには、ライセンス
が必要であり、そのようなライセンスはここで付与され
るものではない。

【００４８】ポリペプチド 本発明は、さらに図３および４（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するヒトＥＬＦ３ポリペプチドに関す
る。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグメン
ト」、「誘導体」および「アナログ」なる語は、図３お
よび４のポリペプチドについて言う場合、かかるポリペ
プチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持し
ている、すなわち、ＥＬＦ３のごとく機能するポリペプ
チド、または、たとえそのポリペプチドがＥＬＦ３とし
て機能しなくてもＥＬＦ３結合分子に結合する能力を保
持している、ポリペプチドを意味する。かくして、アナ
ログは、プロタンパク質部分の開裂により活性化され、
活性成熟ポリペプチドを産生しうるプロタンパク質を包
含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。ある種の好ましい具体例において、本発明のポ
リペプチドは組換えポリペプチドである。

【００４９】図３および４のポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログは、（ｉ）１個またはそれ以
上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好
ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されており、かか
る置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされている
ものであっても、なくてもよいもの；（ｉｉ）１個また
はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；（ｉｉ
ｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプ
チドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレ
ングリコール）と融合しているもの；または（ｉｖ）付
加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているも
の、例えば、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリ
ペプチドの精製用に利用される配列またはプロタンパク
質配列であってもよい。かかるフラグメント、誘導体お
よびアナログは、本明細書の教示から当業者に自明であ
ると考えられる。この点において、本発明の特に好まし
い具体例には、図３および４に示すＥＬＦ３のアミノ酸
配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導
体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。さらに、この点にお
いて本発明の特に好ましい具体例は、ＥＬＦ３のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘
導体およびフラグメント、ならびにＥＬＦ３の活性／機
能を保持しているフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体である。

【００５０】好ましい変種には、同類アミノ酸置換によ
って対照標準から変化している変種がある。かかる置換
は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性の別
のアミノ酸で置換したものである。同類アミノ酸置換と
して認められる典型的なものは、脂肪族アミノ酸である
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互の置
換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互
置換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミ
ド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残
基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残
基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。さらに
この点において特に好ましいのは、数個、わずかな、５
ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個または
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失または付加されている、図３および４のＥＬＦ３ポ
リペプチドのアミノ酸配列を有する変種、アナログ、誘
導体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。これらのうち特に好
ましいのは、ＥＬＦ３の性質および活性を変化させない
サイレント置換、付加および欠失である。またこの点に
おいて、同類置換が特に好ましい。最も好ましいのは、
置換されていない図３および４のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。

【００５１】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離形態にて提供され、好ましく
は、等質性になるまで精製される。本発明のポリペプチ
ドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して
５０％より大きな同一性を有し、より好ましくは配列番
号２のポリペプチドに対して５０−８０％の類似性（よ
り好ましくは５０−８０％より大きな同一性）を有し、
さらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドに対し
て少なくとも９０％の類似性（さらにより好ましくは少
なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチドを包含
する。また、一般に、少なくとも３０個のアミノ酸、好
ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有するポリペ
プチドの部分を有するそのようなポリペプチドの部分を
有する。

【００５２】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成により対応する完全長のポリペ
プチドの製造に使用してもよい；従って、フラグメント
を完全長のポリペプチドの製造のための中間体として使
用してもよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチ
ドを合成してもよい。フラグメントは、「自立してい
る」、すなわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一
部でなく、または、それらに融合しておらず、あるい
は、かかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含ま
れていてその一部分または領域となっていてもよい。大
きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中の
フラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を
形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントが、
単一のより大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
い。例えば、特定の好ましい具体例は、宿主中での発現
のために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれてい
て、ＥＬＦ３フラグメントのアミノ末端に融合した異種
プレおよびプロ−ポリペプチド領域、および、該フラグ
メントのカルボキシル末端に融合した付加的な領域を有
している、本発明のＥＬＦ３ポリペプチドのフラグメン
トに関する。従って、本明細書の意図する１つの態様に
おいて、フラグメントは、ＥＬＦ３から由来の融合ポリ
ペプチドまたは融合タンパク質の一部または部分をい
う。

【００５３】本発明のポリペプチドフラグメントの典型
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。この内容に
おいては、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数
個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の
分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、
この内容においては、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、
４、３、２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまた
はマイナス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のア
ミノ酸残基までのポリペプチドフラグメントを意味し、
すなわち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プ
ラス数個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸か
ら９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点に
おいて好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの
両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナ
ス５個程度のアミノ酸である。上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において、列挙した範囲プラスま
たはマイナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好まし
い。上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲にお
いて、列挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のア
ミノ酸、または列挙した範囲に付加または欠失のないも
のが特に非常に好ましい。この点において、約５ないし
１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０な
いし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４
１ないし９０個、５０ないし１００個、７５ないし１０
０個、９０ないし１１５個、１００ないし１２５個、お
よび１１０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメ
ントが、すべてのうちで最も好ましい。

【００５４】本発明の特に好ましい具体例には、ＥＬＦ
３の平滑末端の変異体がある。平滑末端の変異体は、ア
ミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、連続領
域、一部または部分）またはカルボキシル末端を含む連
続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑末端の変異体
のような、２つの連続した一連の残基の欠失、すなわ
ち、アミノ末端における欠失およびカルボキシル末端に
おける欠失を除く、図３および４のアミノ酸配列を有す
るＥＬＦ３ポリペプチド、またはその変種または誘導体
を包含する。本発明のこの態様において、ＥＬＦ３の構
造的または機能的属性によって特徴づけられるフラグメ
ントも好ましい。この点において本発明の好ましい具体
例は、ＥＬＦ３のアルファ−ヘリックスおよびアルファ
−ヘリックス形成領域（「アルファ−領域」）、ベータ
−シートおよびベータ−シート形成領域（「ベータ−領
域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領
域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領
域」）、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性領域、
ベータ両親媒性領域、可動性領域、界面形成領域および
高抗原性指数領域を含んでなるフラグメントを包含す
る。

【００５５】この点において、非常に好ましい具体例に
は、構造領域、すなわち、この転写因子のＤＮＡ結合領
域またはトランスアクチベイション領域を含有するＥＬ
Ｆ３の領域からなるフラグメントがある。この点におい
て、図３および４の約１０ないし約２０、約４０ないし
約５０、約７０ないし約９０および約１００ないし約１
１３の残基によって限定される領域が特に好ましい領域
であり、そのすべては、ターン領域、親水領域、可動性
領域、界面形成領域および高抗原性指数領域の高度に特
徴的なアミノ酸組成物によって特徴づけられる。かかる
領域はより大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
く、あるいは前記のごとくそれら自体本発明の好ましい
フラグメントであってもよい。このパラグラフにて用い
る「約」なる語は、一般に、フラグメントに関して前記
した意味を有することが理解されよう。

【００５６】さらに好ましい領域はＥＬＦ３の活性を媒
介する領域である。この点において、類似活性または改
善された活性または望ましくない活性の減少したものを
含め、ＥＬＦ３の化学的、生物学的活性または他の活性
を有するフラグメントが最も好ましい。この点におい
て、ＥＴＳ種の関連するポリペプチドの活性領域に対し
て配列または位置、あるいは両方が相同的である領域を
含むフラグメントが非常に好ましい。本発明はまた、と
りわけ、前記したフラグメントをコードするポリヌクレ
オチド、該フラグメントをコードするポリヌクレオチド
とハイブリッド形成するポリヌクレオチド、特にストリ
ンジェントな条件下でハイブリッド形成するもの、およ
び該フラグメントをコードするポリヌクレオチドを増幅
するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチドに
関する。これらの点において、好ましいポリヌクレオチ
ドは、前記のような好ましいフラグメントに対応するポ
リヌクレオチドである。

【００５７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換といっ
たよく知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独また
は他のポリヌクレオチドと一緒に導入してもよい。他の
ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと別個に
導入するか、同時に導入するか、あるいは結合させて導
入してもよい。

【００５８】かくして、例えば、本発明のポリヌクレオ
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。別法として、ポリヌクレ
オチドを、宿主における増殖用の選択可能マーカーを有
するベクターに結合させてもよい。前記した方法によ
り、ベクター構築物を宿主細胞中に導入してもよい。一
般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物
のごとき沈殿物中、あるいは荷電脂質との複合体中のＤ
ＮＡとして導入される。さらに、エレクトロポレーショ
ンを用いてポリヌクレオチドを宿主に導入してもよい。
ベクターがウイルスである場合、それをインビトロでパ
ッケージし、またはパッケージ細胞中に導入し、そのパ
ッケージウイルスを細胞中に形質導入してもよい。本発
明のこの態様によれば、ポリヌクレオチドを製造し、ポ
リヌクレオチドを細胞に導入するのに適当な多種の方法
は当業者によく知られた、慣用的なものである。かかる
方法は、詳細に、Sambrookらに詳細に記載されており、
これらの方法を詳述する多くの実験室マニュアルを説明
している。

【００５９】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションにつ
いての周知方法によって、ベクターはまた、パッケージ
または封入ウイルスとして細胞中に導入されていてもよ
く、好ましくは導入されている。ウイルスベクターは複
製可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者
の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿主細胞にお
いてのみ起こるであろう。ベクターには、ある態様にお
いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
発現用ベクターが好ましい。一般に、かかるベクター
は、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結
された宿主中での発現に効果的なシス−作用性制御領域
を含んでなる。適当なトランス−作用性因子は、宿主に
より供給されるか、相補的ベクターにより供給される
か、または宿主中に導入した後のベクター自身によって
供給されるかである。

【００６０】この点における好ましい具体例において、
ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は
誘導可能な発現であってもよく、またはある型の細胞に
おいてのみ起こる発現であってもよく、または誘導可能
および細胞特異的の両方であってもよい。誘導可能なベ
クターの中でも、温度および栄養添加物などの操作容易
な環境因子によって発現を誘導することのできるベクタ
ーが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞宿主にお
いて使用される構成的および誘導可能な発現ベクターを
含め、本発明のこの態様に適する種々のベクターは当業
者によく知られており、慣用的に使用されている。遺伝
子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養すること
ができ、そのような培地は、とりわけプロモーターの活
性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関し
て、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、発
現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養条
件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適してお
り、それは当業者に明らかであろう。

【００６１】多種の発現ベクターを用いて、本発明のポ
リペプチドを発現させることができる。かかるベクター
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵
母エピソーム、酵母染色体因子、バキュロウイルス、パ
ポーバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデ
ノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイ
ルス、アルファーウイルスおよびレトロウイルスから由
来のベクター、およびプラスミドおよびバクテリオファ
ージ遺伝的因子から由来のベクターなどのその組み合わ
せに由来のベクター、コスミドおよびファージミドを包
含する。この点における発現のために、一般に、宿主中
でポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを維
持、増殖または発現するのに適したベクターを用いるこ
とができる。

【００６２】種々のよく知られた慣用的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いて発現ベクターを構
築するための適当な操作も当業者によく知られており、
慣用的なものであり、Sambrookらに詳細に記載されてい
る。

【００６３】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含め、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ファージ・ラムダＰＬプロ
モーター、エシェリキア・コリのｌａｃ、ｔｒｐおよび
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー
ターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを包
含するが、それらは周知プロモーターのほんの例示に過
ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他のプロモ
ーターはよく知られており、本明細書の記載および実施
例で説明されるようにして当業者であれば慣用的に使用
することができる。一般に、発現構築物は、転写開始部
位および停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を有するであろう。構築物により発現
される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべ
きポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、およ
び終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含むであろ
う。

【００６４】加えて、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより作動するであろう。例えば、とりわけ、
レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げられ
る。一般に、増殖および発現のためのベクターは選択可
能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺伝子は形
質転換された宿主細胞を選択するための表現型特徴を提
供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養するため
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性のも
の、およびエシェリキア・コリおよび他の細菌を培養す
るためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝
子を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。

【００６５】所望のポリペプチドの宿主中での発現に適
した種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した適
当なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーター、および
他の適当な制御配列を含むベクターを、適当な宿主中に
導入してもよい。適当な宿主の代表例は、エシェリキア
・コリ、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソ
フィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodop
tera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びボウエス（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞を
包含する。多種の発現構築物の宿主が周知であり、当業
者は本開示により本発明のこの態様に従ってポリペプチ
ドの発現のための宿主を容易に選択することができる。
より詳細には、本発明はまた、発現構築物などの組換え
構築物であって、１種またはそれ以上の前記した配列を
含んでなる組換え構築物を包含する。構築物は、本発明
のかかる配列がその中に挿入されたプラスミドまたはウ
イルスベクターなどのベクターからなる。配列は順方向
または逆方向に挿入することができる。この点におい
て、ある種の好ましい具体例において、構築物はさら
に、例えば、該配列に作動可能に連結されたプロモータ
ーを含め、調節配列を含んでなる。多数の適当なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明
の使用に適した多数の市販のベクターがある。

【００６６】市販されている以下のベクターを例示とし
て提供する。細菌に使用するのに好ましいベクターに
は、Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、
ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベ
クター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されてい
る、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３
−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核
細胞ベクターには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；ならびに、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクタ
ーは、多くの市販されている、および、本発明のこの態
様により使用するために当業者によく知られたベクター
を例示するためにのみ列挙する。例えば、宿主中におけ
る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまた
はベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが
理解されよう。

【００６７】プロモーター領域は、制限部位、または、
候補プロモーターフラグメント；すなわち、プロモータ
ーを含んでいるかもしれないフラグメントを導入するた
めの部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットのごとき、
プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含む
ベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することがで
きる。周知のように、プロモーター含有フラグメントを
ベクター中にＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位で導入する
ことにより、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡ
Ｔアッセイにより検出することができる。この目的に適
するベクターはよく知られており、容易に入手できる。
かかるベクターとして、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ
７の２種類が挙げられる。かくして、本発明のポリヌク
レオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容
易に入手できるプロモーターだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。

【００６８】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターには、エ
シェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターがある。この点において適当な既知の真核細胞プ
ロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、Ｒｏｕｓサルコーマウイルス（「ＲＳ
Ｖ」）のごときレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、
ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターな
どのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞中
での発現に適するベクターおよびプロモーターの選択は
周知操作であり、発現ベクターの構築、宿主中へのベク
ターの導入および宿主における発現のための必須方法
は、当業者にとって日常的なものである。本発明は、前
記の構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、哺
乳動物細胞のごとき高等真核細胞、酵母細胞のごとき下
等真核細胞、または細菌細胞のごとき原核細胞であって
もよい。

【００６９】構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
により媒介されるトランスフェクション、陽イオン性脂
質により媒介されるトランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、形質導入、感染または他の方法により、
行うことができる。かかる方法は、多くの標準的実験室
マニュアルに記載されている。宿主中の構築物を常法で
使用して、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を
製造することができる。別法として、慣用的ペプチド合
成装置により本発明ポリペプチドを合成的に製造するこ
ともできる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中で
発現させることができる。さらに、無細胞翻訳系を利用
して、本発明のＤＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用い
て、かかるタンパク質を製造することもできる。原核宿
主および真核宿主とともに使用に適するクローニングお
よび発現ベクターは、Sambrookらにより記載されてい
る。

【００７０】一般に、組換え発現ベクターは、複製開始
点、下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来
のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクタ
ー含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含
む。適当なプロモーターには、とりわけ、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）などの糖分解酵素、
ａ−ファクター、酸ホスファターゼ、および熱ショック
タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターがあ
る。選択可能マーカーは、エシェリキア・コリのアンピ
シリン耐性遺伝子およびエス・セレビシエ（S.cerevisi
ae）のｔｒｐ１遺伝子を包含する。高等真核生物により
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エ
ンハンサー配列をベクター中に挿入することにより増大
させることができる。エンハンサーは、通常、約１０な
いし３００ｂｐのＤＮＡのシス−作用性エレメントであ
り、所定の宿主細胞型中でのプロモーターの転写活性を
増大させるように作用する。エンハンサーの例は、複製
開始点の後期側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ
４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモー
ターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオー
マエンハンサー、ならびにアデノウイルスエンハンサー
を包含する。

【００７１】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位に対して５’付近に位置するようにポリヌ
クレオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現さ
れるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’
にある。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始
まり、リボソーム結合部位と開始コドンの間に位置する
他のオープン・リーディング・フレームはないであろ
う。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドン
が存在し、転写される領域の３’末端に適宜散在するポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在す
るであろう。適当な分泌シグナルを、小胞体ルーメン、
周辺腔または細胞外環境中への翻訳タンパク質の分泌の
ために、発現されるポリペプチド中に組み込ませてもよ
い。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のもので
あってもよく、あるいは異種的であってもよい。

【００７２】ポリペプチドは、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させることができ、分泌シグナルのみな
らず付加的な異種機能領域を含んでいてもよい。かくし
て、例えば、付加的アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ−末端に付加して、宿主細胞
における精製またはその後の取り扱いおよび保存の間の
安定性および維持性を改善してもよい。また、一の領域
をポリペプチドに付加し、精製を容易にしてもよい。か
かる領域は、最終的なポリペプチドの調製の前に除去す
ることができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加
し、とりわけ、分泌または外分泌を引き起こし、安定性
を改善し、精製を容易にすることは、当業者によく知ら
れている日常的方法である。本発明に係るポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適し
た原核宿主は、エシェリキア・コリ（Escherichia col
i）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）および
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）を包含する。シュードモナス（Pseudomonas）、スト
レプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）の様々な種もまた、この点にお
いて適当な宿主である。さらに、この点において、当業
者に知られている他の多くの宿主も使用可能である。

【００７３】限定するものではないが、一の代表例とし
て、細菌についての有用な発現ベクターは、選択可能な
マーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントを有してな
る市販プラスミドから由来の細菌の複製開始点とからな
り得る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３
−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Sweden）お
よびＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison,WI,USA）を包
含する。これらベクターにおいて、ｐＢＲ３２２「骨
格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配
列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換した後、そ
の宿主株を適当な細胞密度まで増殖させる。選択したプ
ロモーターが誘導可能である場合には、適当な手段（例
えば、温度シフトまたは化学誘導剤に曝露）によりそれ
を誘導し、細胞をさらなる期間培養する。次いで、典型
的には、細胞を遠心分離により集め、物理的または化学
的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさらに精製に
供する。

【００７４】凍結−融解のサイクリング、超音波処理、
機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、慣用的方
法により、タンパク質発現に使用する微生物細胞を破壊
することができる。かかる方法は当業者によく知られて
いる。同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用
することができる。哺乳動物発現系の例は、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨ
Ｋ細胞系ならびにGluzmanら、Cell，23：175（1981）に
記載されたサル・腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を
包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボ
ソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および発現
に必要とされる５’隣接非転写配列からなる。好ましい
具体例において、ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４
０ポリアデニル化部位から由来のＤＮＡ配列が、必須の
非転写遺伝的エレメントとして用いられる。

【００７５】ＥＬＦ３ポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィ
ーを含むよく知られた方法により、組換え細胞培養物か
ら回収し、精製することができる。最も好ましくは、高
性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に
用いる。単離または精製の間にポリペプチドが変性する
場合、タンパク質の再生するためのよく知られた方法を
用いて活性コンフォメーションを再生することができ
る。本発明のポリペプチドは、自然に精製されるポリペ
プチド、化学合成法による産生されるポリペプチド、お
よび例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動
物細胞を含め、原核細胞または真核細胞宿主から組換え
技術により得られるポリペプチドを包含する。組換え体
産生法に用いる宿主によっては、本発明のポリペプチド
は糖鎖形成されていても、糖鎖形成されていなくてもよ
い。加えて、本発明のポリペプチドは、ある場合には、
宿主が介在する工程の結果として、最初の修飾されたメ
チオニン残基を含みうる。ＥＬＦ３ポリヌクレオチドお
よびポリペプチドを、本発明に従って、種々の用途、特
にＥＬＦ３の化学的および生物学的特性を用いる用途に
使用することができる。さらなる用途は、細胞、組織お
よび器官の障害の診断および治療に関する。本発明のこ
れらの態様を以下の議論によってさらに説明する。

【００７６】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断試薬として用いるための相補
的ポリヌクレオチドの検出のためのＥＬＦ３ポリヌクレ
オチドの使用に関する。機能不全に伴う変異形のＥＬＦ
３の検出は、ＥＬＦ３の過小発現、過剰発現または発現
の変化から生じる疾患の診断、または疾患に対する感受
性に付加および定義することができる診断用装置を提供
することである。ヒトＥＬＦ３遺伝子に変異を有する個
体は、種々の方法により、ＤＮＡレベルで検出すること
ができる。診断のための核酸を、血液、尿、唾液、生検
および剖検材料などの患者の細胞から得てもよい。ゲノ
ムＤＮＡを検出用に直接使用してもよく、または分析前
にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅してもよい
（Saikiら、Nature，324：163−166（1986））。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡを同じように使用してもよい。一例とし
て、ＥＬＦ３をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーを用いて、ＥＬＦ３の発現および変異を同定および
分析することができる。例えば、正常な遺伝子型との比
較にて増幅産物の大きさが変化することにより、欠失お
よび挿入を検出することができる。増幅したＤＮＡを放
射性標識したＥＬＦ３ ＲＮＡまたは放射性標識したＥ
ＬＦ３アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーショ
ンさせることにより、点突然変異を同定することができ
る。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の
相違により、対合した配列と誤対合の２本鎖を識別する
ことができる。

【００７７】直接的ＤＮＡ配列決定により、対照標準の
遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明ら
かとなりうる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをプローブとして用い、特定のＤＮＡセグメントを
検出してもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適宜用い
ることにより、かかる方法の感度を非常に向上させるこ
とができる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖
ＰＣＲ産物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型
分子とともに使用する。放射性標識されたヌクレオチド
を用いる慣用的操作により、または蛍光タグを用いる自
動式配列決定法により配列決定を行う。変性剤と共にま
たは無しで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度
の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の相違に基づ
く遺伝的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳
動により、小規模な配列の欠失および挿入を可視化する
ことができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、そ
の特異的融点または部分的融解温度によって、異なるＤ
ＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅延す
る、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別することができ
る（例えば、Myersら、Science，230：1242（1985）を
参照のこと）。

【００７８】特定位置での配列の変化はまた、ＲＮase
およびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは
化学的開裂法により明らかとなる（例えば、Cottonら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397−4401（1985））。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限フラグメント長多型性（「ＲＦＬ
Ｐ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングな
どの方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことが
できる。本発明のさらなる態様によれば、とりわけ、
癌、特に前立腺腫瘍、乳癌、肺癌および他の上皮腫瘍に
対する感受性を診断または測定する方法が提供される。
ＥＬＦ３の特定の染色体トランスロケーションまたは異
常型の転写物もまた、とりわけ、これらの腫瘍の診断に
て用いてもよく；上記の核酸配列をかかる感受性を確認
するためのアッセイにて用いてもよい。かくして、例え
ば、該アッセイを用いて、ヒトＥＬＦ３遺伝子の存在、
または前記したような、とりわけ、癌、特に前立腺腫
瘍、乳癌、肺癌および他の上皮腫瘍に対する感受性の指
標である、染色体トランスロケーションまたは異常型転
写物を測定してもよい。

【００７９】本発明は、疾患、特に、とりわけ、前立腺
腫瘍、乳癌、肺癌および他の上皮腫瘍などの癌の診断方
法であって、図１および２（配列番号１）の配列を有す
るポリヌクレオチドの発現レベルが異常に減少または増
加している患者から由来の試料から決定することからな
る方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現の減少また
は増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保
護、ノザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼー
ション法などのポリヌクレオチド定量のための当該分野
でよく知られた方法を用いて測定できる。より慣用的な
ゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加えて、突然
変異をインシテュ分析により検出することもできる。

【００８０】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定についても価値があ
る。該配列を特異的に標的とし、個々のヒト染色体上の
特定の位置でハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらには、染色体上の特定の部位を同定することに
対する要求がある。染色体位置をマーキングするため
の、実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体
マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本発明
によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、その配列を疾
患に関係した遺伝子と相関付ける重要な第一工程であ
る。簡単には、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好まし
くは１５−２５ｂｐ）を調製することによって、配列を
染色体に対してマッピングできる。一つ以上のエクソン
に広がるプライマーは増幅工程を混乱させ得るため、
３’非翻訳領域のコンピューター解析を用いて、ゲノム
ＤＮＡ中に一つ以上のエクソンが広がっていないプライ
マーを迅速に選択する。ついで、これらのプライマーを
個々のヒト染色体を含有する体細胞雑種のＰＣＲスクリ
ーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを有するで
あろう。

【００８１】体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、個々の
ＤＮＡを個々の染色体に帰属させるための迅速な方法で
ある。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーに用
いると、サブローカリゼーションは特定の染色体からの
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールで同様の方法にて達成することができる。同様に、
染色体への地図作成に用いることができる他のマッピン
グ法は、in situハイブリダイゼーション、標識された
フロー−ソーティド（flow-sorted）染色体でのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
選択を包含する。ｃＤＮＡクローンを中期染色体スプレ
ッドに対して蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｆ
ＩＳＨ）に付し、正確な染色体位置を１工程で知ること
ができる。この方法は、５０ないし６０塩基の短いｃＤ
ＮＡを用いることができる。この方法の報文として、Ve
rmaら、HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OF BASIC TECHNI
QUES，Pergamon press，New York （1988）を参照のこ
と。

【００８２】この方法をいかにして行うのかという一例
として、ＥＬＦ３ ＤＮＡを消化し、QIAEX II ＤＮＡ精
製キット（Qiagen，Inc.，Chatsworth，ＣＡ）を用いて
精製し、Super Cos１ コスミドベクター（Stratagene，
La Jolla，ＣＡ）に連結する。Qiagen Plasmid Purific
ation Kit（Qiagen，Inc，Chatsworth，ＣＡ）を用いて
ＤＮＡを精製し、BioNick Labeling Kit（GibcoBRL，Li
fe Technologies Inc.，Gaithersburg，ＭＤ）を用いて
ビオチン−ｄＡＴＰの存在下でニックトランスレーショ
ンにより１ｍｇを標識する。GENE-TECT Detection Syst
em（ClontechLaboratories，Inc. Palo Alto，ＣＡ）を
用いてビオチン化を検出する。ONCORLight Hybridizati
on Kit（Oncor，Gaithersburg，ＭＤ）を用いてin situ
ハイブリダイゼーションをスライド上で行って、中期染
色体上の単一コピー配列を検出する。２０％ＦＣＳ、３
％ ＰＨＡおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補
足したＲＰＭＩ １６４０中で正常ドナーの末梢血を３
日間培養し、１０ −⁷Ｍメトトレキセートで１７時間同
調させ、補足物不含ＲＰＭＩで２回洗浄する。細胞を１
０ −³Ｍチミジンとともに７時間インキュベーションす
る。コルセミド（０.５μｇ／ｍｌ）とともに２０分の
インキュベーション後、細胞を中期で捕捉し、つづいて
７５ｍＭ ＫＣｌ中３７℃で１５分間、低張溶解を行
う。ついで、細胞ペレットを遠心分離し、Carnoy’sの
固定液（メタノール：酢酸（３：１））中で固定する。

【００８３】１滴の懸濁液をスライドに添加し、その懸
濁液を風乾することにより中期スプレッドを調製する。
ブロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を含
む１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％ホ
ルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）に懸
濁させた１００ｎｇのプローブを添加することによりハ
イブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７０℃
の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキュベ
ーションし、予備加温した（３７℃）スライド上に置
く。それは予め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０
℃で変性させ、エタノール種で脱水し、４℃に冷却して
おいたものである。スライドを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドを５０％ホ
ルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄し、２
ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロトコ
ルに従って、スライドをＦＩＴＣ−アビジン（Oncor，G
aithersburg，ＭＤ）とともにインキュベーションする
ことによりハイブリダイゼーションプローブを検出す
る。マウンティング培地に懸濁させたヨウ化プロプリデ
ィウムで染色体を対比染色する。スライドをLeitz ORTH
OPLAN ２−エピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、Imagenet
ics ComputerおよびMacIntoshプリンターを用いて５つ
のコンピューター映像を得る。

【００８４】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
ると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデ
ータと相関させることができる。かかるデータは、例え
ば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Joh
ns Hopkins University Welch Medical Libraryからオ
ンラインで利用可能）に見られる。ついで、同じ染色体
領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関連を連関分
析（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）を介して同定
する。感染した個体と感染していない個体間のｃＤＮＡ
またはゲノム配列の相違を決定することが必要である。
感染した個体の一部または全部において変異が観察され
るが、正常な個体においては変異が観察されない場合に
は、その変異がその疾患の病因である可能性がある。現
在の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング法の分
解では、疾患に関連した染色体領域と正確に位置決めさ
れるｃＤＮＡは、１メガ塩基のマッピング分解および２
０ｋｂ当たり１遺伝子と仮定して５０ないし５００個の
潜在的病因遺伝子のうちの１つとすることができる。

【００８５】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、細胞および組織中のＥＬＦ３タンパク質
レベルを検出するための診断アッセイに関する。かかる
アッセイは定量的または定性的であってもよい。かくし
て、例えば、正常対照組織試料と比較してＥＬＦ３タン
パク質の過剰発現を検出するための本発明の診断アッセ
イを用いて、癌、とりわけ、特に前立腺癌、乳癌、肺癌
または他の上皮腫瘍などの疾患または障害の存在を検出
することができる。宿主由来の試料中の本発明のＥＬＦ
３タンパク質のごときタンパク質のレベルを決定するの
に用いることのできるアッセイ法は当業者によく知られ
ている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、
競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および酵素
結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を包含す
る。これらのうち、ＥＬＩＳＡが好ましいことが多い。
ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にＥＬＦ３に特異的な抗
体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することから
なる。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合する
レポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性
試薬、蛍光試薬または酵素試薬のごとき検出可能試薬に
結合する。本明細書の実施例では、ホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼ酵素に結合している。

【００８６】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
取り出し、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、
例えば、ポリスチレン皿上でインキュベーションする。
ついで、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質
とともにインキュベーションすることにより、皿上の遊
離タンパク質結合部位を被覆する。ついで、モノクロー
ナル抗体を皿中でインキュベーションし、その間にモノ
クローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合しているＥＬ
Ｆ３タンパク質に結合する。未結合モノクローナル抗体
をバッファーで洗い流す。ホースラディッシュ・ペルオ
キシダーゼに連結したレポーター抗体を皿中に入れ、レ
ポーター抗体とＥＬＦ３に結合しているモノクローナル
抗体との結合を生じさせる。ついで、未結合レポーター
抗体を洗い流す。ついで、発色基質を含め、ペルオキシ
ダーゼ活性のための試薬を皿に添加する。１次抗体およ
び２次抗体を介してＥＬＦ３に結合し、固定されている
ペルオキシダーゼは、着色反応生成物を生成する。所定
の時間に発色した量は試料中のＥＬＦ３タンパク質量を
示す。典型的には、標準曲線と比較することにより定量
的結果が得られる。競合アッセイはまた、固体支持体に
結合するＥＬＦ３に特異的な抗体、標識したＥＬＦ３お
よび宿主由来の試料を、固体支持体上を通すことで用い
られる。固体支持体に結合した標識の検出量を試料中の
ＥＬＦ３量と相関させることができる。

【００８７】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、ま
たはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、そ
れらに対する抗体を製造するための免疫原として使用す
ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体であってよい。本発明
は、キメラ、単鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂフラ
グメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包
含する。当該分野で知られた種々の操作をかかる抗体お
よびフラグメントの製造に用いてもよい。本発明の配列
に対応するポリペプチドに拮抗して生成される抗体は、
ポリペプチドを動物に直接注射することにより、あるい
はポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物に投
与することにより得ることができる。そのようにして得
られた抗体はポリペプチド自体と結合する。このよう
に、ポリペプチドのフラグメントだけをコードする配列
であっても、完全に無傷のポリペプチドに結合する抗体
を得るのに用いることができる。ついで、かかる抗体を
用いて、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプ
チドを単離することができる。

【００８８】モノクローナル抗体を調製する場合、連続
細胞培養系により産生される抗体を提供するいずれの方
法も用いることができる。例えば、ハイブリドーマ法
（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature，256：495-497
（1975））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら、Immunology Today，4：72（1983））
およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，７７-９６頁、Alan
R.Liss,Inc,（1985））が挙げられる。さらに、単鎖抗
体の製造について記載されている方法（米国特許第４,
９４６,７７８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド生成物に対する単鎖抗体を製造することができ
る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳
動物を含む他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。

【００８９】アフィニティークロマトグラフィーにより
単離および／または精製する場合、前記した抗体を用い
て、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定
してもよく、あるいは抗体を固体支持体に結合させるこ
とにより本発明のポリペプチドを精製してもよい。ま
た、ＥＬＦ３に対する抗体を用いて、とりわけ、腫瘍形
成、特に前立腺癌、乳癌、肺癌または他の上皮腫瘍を阻
害することができる。ＥＬＦ３抗体をまた、病変組織の
核ライゼートに対して用い、ＥＬＦ３の結合能が正常な
組織と比較して調節されているかいないかどうかを測定
することができる。加えて、ＥＬＦ３抗体をゲノムＤＮ
Ａと一緒に用いてＥＬＦ３が結合する遺伝子のプロモー
ターを同定することができる。

【００９０】ＥＬＦ３結合分子およびアッセイ ＥＬＦ３をこれに相互作用するタンパク質を単離するた
めに使用することができる；この相互作用は阻害のため
の標的となり得る。ＥＬＦ３と他の因子の間のタンパク
質−タンパク質相互作用の阻害剤は、ＥＬＦ３活性の調
節のための医薬品の開発に用いることができる。かくし
て、本発明は、ＥＬＦ３に結合する分子の同定方法も提
供する。分子をＥＬＦ３に結合させるタンパク質をコー
ドする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例え
ば、リガンドパニング（panning）およびＦＡＣＳソー
ティングにより、同定することができる。かかる方法は
多くの実験室用マニュアル、例えば、Coliganら、CURRE
NT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY １，第５章（１９９１）
に記載されている。

【００９１】例えば、酵母２ハイブリッドシステムが、
転写活性化因子の活性を復元するのに用いる、インビボ
での第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との
間の相互作用を検出するための方法を提供する。この方
法は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されてお
り；試薬はClontechおよびStratageneから市販されてい
る。簡単には、ＥＬＦ３ ｃＤＮＡをＧａｌ４転写因子
ＤＮＡ結合領域に融合させ、酵母細胞中で発現させる。
問題の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーメンバー
をＧａｌ４のトランス活性化領域に融合させる。ＥＬＦ
３と相互作用可能なタンパク質を発現するｃＤＮＡクロ
ーンは、Ｇａｌ４活性の復元およびＧａｌ４−ｌａｃＺ
などのレポーター遺伝子の発現のトランス活性化をもた
らす。

【００９２】別法は、組換えＥＬＦ３を用いてλgt１
１、λＺＡＰ（Stratagene）または同等のｃＤＮＡ発現
ライブラリーをスクリーニングすることからなる。組換
えＥＬＦ３タンパク質またはそのフラグメントをＦＬＡ
Ｇ、ＨＳＶまたはＧＳＴなどの小さなペプチドタグに融
合させる。ペプチドタグは心筋クレアチンキナーゼなど
のキナーゼについての都合のよいリン酸化部位を有して
おり、あるいはそれらをビオチン化できる。組換えＥＬ
Ｆ３を³²［Ｐ］または標識されていないＰを用いてリン
酸化し、ストレプトアビジンまたはそのタグに対する抗
体で検出することができる。λgt１１ｃＤＮＡ発現ライ
ブラリーを問題の細胞から作成し、組換えＥＬＦ３とと
もにインキュベートし、洗浄し、次いで、ＥＬＦ３と相
互作用するｃＤＮＡクローンを単離する。かかる方法は
当業者に慣用的なものである。例えば、Sambrookらを参
照のこと。

【００９３】もう一つの方法は、哺乳動物発現ライブラ
リーをスクリーニングすることである。この方法におい
ては、ｃＤＮＡを哺乳動物プロモーターとポリアデニル
化部位の間のベクターにクローンし、ＣＯＳまたは２９
３細胞にて一時的にトランスフェクションされる。４８
時間後、結合タンパク質を、固定かつ洗浄した細胞を標
識したＥＬＦ３と一緒にインキュベーションすることで
検出する。好ましい具体例においては、ＥＬＦ３をヨウ
素化し、結合ＥＬＦ３の検出をオートラジオグラフィー
を介して検出する。Simsら、Science，241：585-589（1
988）およびMcMahanら、EMBO J.，10：2821-2832（199
1）を参照のこと。このように、問題の結合タンパク質
をコードするｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプールを選択し、
各プールをさらに分割し、つづいて一時的なトランスフ
ェクション、結合およびオートラジオグラフィーのサイ
クルにより問題のｃＤＮＡを単離することができる。別
法として、完全なｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物細胞
にトランスフェクションし、プレートに結合したＥＬＦ
３を含む皿上で細胞をパニングすることによって問題の
ｃＤＮＡを単離できる。洗浄後に結合している細胞を溶
解させ、プラスミドＤＮＡを単離し、細菌中で増幅し、
単一のｃＤＮＡクローンが得られるまでトランスフェク
ションおよびパニングのサイクルを繰り返す。Seedら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84：3365（1987） およ
びAruffoら、EMBO J.，6：3313（1987）を参照のこと。
結合タンパク質が分泌される場合、結合または中和アッ
セイが一時的にトランスフェクションされた細胞からの
上清をアッセイするために確立されると、類似するプー
ル方法によりそのｃＤＮＡを得ることができる。上清を
スクリーニングする一般的方法は、Wongら、Science，2
28：810-815（1985）に開示されている。

【００９４】もう一つの別法は、細胞からのＥＬＦ３と
直接相互作用するタンパク質を単離することである。Ｅ
ＬＦ３のＧＳＴまたは小さいペプチドタグとの融合タン
パク質を製造し、ビーズ上に固定化する。問題の細胞か
らの生合成的に標識された、または標識されていないタ
ンパク質抽出物を調製し、ビーズとインキュベートし、
バッファーで洗浄する。ＥＬＦ３と相互作用するタンパ
ク質はビーズから特異的に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって解析する。結合相手の一次アミノ酸配列データを
マイクロシークエンシングによって得る。所望により、
細胞性タンパク質のチロシンリン酸化などの機能的応答
を誘発する物質で細胞を処理できる。かかる物質の一例
は、成長因子またはインターロイキン−２などのサイト
カインである。もう一つの別の方法はイムノアフィニテ
ィー精製法である。組換えＥＬＦ３を標識または標識し
ていない細胞抽出物とインキュベートし、抗ＥＬＦ３抗
体で免疫沈降させる。その免疫沈降物をプロテインＡ−
セファロースで回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。
標識されていないタンパク質をビオチン化により標識化
し、ストレプトアビジンを含むＳＤＳゲル上で検出す
る。結合相手のタンパク質をマイクロシークエンシング
により解析する。さらに、当業者に知られている標準的
生化学的精製工程をマイクロシークエンシングの前に使
用してもよい。

【００９５】さらにもう一つの別法は、ペプチドライブ
ラリーを結合相手についてスクリーニングすることに関
する。組換えタグ付きまたは標識されたＥＬＦ３を用い
て、ＥＬＦ３と相互作用するペプチドまたはホスホペプ
チドライブラリーからペプチドを選択する。そのペプチ
ドを配列決定し、相互作用するタンパク質にて見いださ
れるコンセンサスペプチド配列を同定する。当業者に知
られているこれらの方法または他の方法によって同定さ
れたＥＬＦ３の結合相手、ならびに前記した推定結合相
手を、本発明のアッセイ方法において用いることができ
る。ＥＬＦ３／結合相手の複合体の存在についてのアッ
セイは、例えば、酵母２ハイブリッドシステム、ＥＬＩ
ＳＡまたはその複合体に特異的な抗体を用いるイムノア
ッセイによってなされる。ＥＬＦ３／結合相手の相互作
用の形成を妨害または阻害する試験物質の存在下、複合
体の減少量をその試験物質を欠いている対照と比較して
測定する。

【００９６】遊離ＥＬＦ３または結合相手に関するアッ
セイは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異的抗体を用いる
イムノアッセイによって、または放射性標識されたＥＬ
Ｆ３を細胞または細胞膜とインキュベーションし、つづ
いて遠心またはフィルター分離工程を行うことによって
なされる。ＥＬＦ３／結合相手の相互作用の形成を妨害
または阻害する試験物質の存在下、遊離のＥＬＦ３また
は遊離の結合相手の増加量をその試験物質を欠いている
対照と比較して測定する。本発明のポリペプチドを用い
て、細胞中または無細胞調製物中のＥＬＦ３結合分子の
ＥＬＦ３結合許容量を評価することもできる。

【００９７】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 ＥＬＦ３などの転写因子は、それらが調節する遺伝子を
活性化または抑制することにより、その生物学的および
病理学的応答を惹起する。これらの転写因子は、例え
ば、その分子を介してリガンド／レセプターの相互作用
のシグナルを発するリガンドから、活性化されるレセプ
ターまで、活性化される第２メッセンジャーまで、転写
因子の翻訳後修飾体まで、それと相互反応する化合物ま
で、またはその活性に直接影響する化合物までの、経路
のいくつかの工程で活性化または阻害される。本発明の
ＥＬＦ３は、この転写因子および／またはそれが調節す
る遺伝子の活性化を亢進（アゴニスト）または阻害（ア
ンタゴニスト）する化合物をスクリーニングする方法に
て用いてもよい。一般に、かかるスクリーニング法は、
本発明のポリペプチドを発現する適当な細胞を得ること
からなる。かかる細胞は、哺乳動物、酵母、ドロソフィ
ラまたはエシェリキア・コリからの細胞を包含する。特
に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを用いて細胞をトランスフェクションし、それにより
ＥＬＦ３を発現させる。ついで、そのポリエプチドを発
現する細胞を試験化合物と接触させ、結合、機能応答の
刺激または阻害を観察する。

【００９８】かかるスクリーニング法は、トランスフェ
クションされる黒色素胞を用いて、本発明のＥＬＦ３を
発現させることからなる。かかるスクリーニング法はＰ
ＣＴＷＯ９２／０１８１０に記載されている。一の具体
例においては、この方法を、ポリペプチドをコードする
黒色素胞細胞をＥＬＦ３結合分子およびスクリーニング
すべき化合物の両方と接触させることにより、本発明の
ポリペプチドの活性化を阻害する化合物についてスクリ
ーニングするのに用いる。ＥＬＦ３結合分子により得ら
れるシグナルが阻害されるということは、化合物がＥＬ
Ｆ３についての潜在的アンタゴニストであり、すなわ
ち、該ポリペプチドの活性化を阻害することを示す。そ
の方法はまた、かかる細胞をスクリーニングすべき化合
物と接触させ、そのような化合物がシグナルを発するか
どうかどうか、すなわち、該ポリペプチドを活性化する
かどうかを測定することにより、ポリペプチドを活性化
する化合物をスクリーニングするのに用いることができ
る。

【００９９】他のスクリーニング法は、ポリペプチドの
活性化により誘起される細胞外ｐＨ変化を測定するシス
テムにて、ＥＬＦ３を発現する細胞（例えば、トランス
フェクションされたＣＨＯ細胞）を使用することからな
る。（例えば、Science，246：181-296（１９８９）を
参照のこと）。この方法においては、化合物を本発明の
ポリペプチドを発現する細胞と接触させてもよい。つい
で、別のメッセンジャー応答、例えば、シグナル・トラ
ンスダクションまたはｐＨ変化を測定し、その潜在的化
合物が該ポリペプチドを活性化するか、または阻害する
かを測定する。もう一つ別のスクリーニング法は、ＥＬ
Ｆ３をコードするＲＮＡをXenopus 卵母細胞に導入し、
そのレセプターを一時的に発現させることからなる。つ
いで、その卵母細胞をＥＬＦ３結合分子およびスクリー
ニングすべき化合物と接触させる。ついで、該ポリペプ
チドの活性化を阻害すると思われる化合物についてスク
リーニングする場合には、該ポリペプチドの活性化の阻
害を、カルシウム、プロトンまたは他のイオンなどのシ
グナルを検出することによって測定する。

【０１００】別のスクリーニング法は、ホスホリパーゼ
ＣまたはＤに結合しているＥＬＦ３を発現させることか
らなる。そのような細胞の代表例として、内皮細胞、平
滑筋細胞および胚腎細胞が挙げられるが、これに限定さ
れるものではない。スクリーニングは、前記したよう
に、ＥＬＦ３の活性化またはＥＬＦ３の活性化の阻害を
ホスホリパーゼ第２シグナルから検出することによりな
される。別法は、標識されたリガンドの、その細胞表面
にポリペプチドを有する細胞への結合の阻害を測定する
ことにより、アンタゴニストである、すなわち本発明の
ポリペプチドの活性化を阻害する化合物についてスクリ
ーニングすることからなる。そのような方法は、細胞が
その細胞表面でポリペプチドを発現するように、真核細
胞をＥＬＦ３をコードするＤＮＡでトランスフェクショ
ンすることからなる。ついで、その細胞を、標識された
形態の既知リガンドの存在下で化合物と接触させる。リ
ガンドは、例えば、放射活性により標識化することがで
きる。ポリペプチドに結合した標識化リガンドの量を、
例えば、これらの細胞からの細胞または膜のトランスフ
ェクションに付随する放射活性を測定することにより決
定する。化合物がＥＬＦ３に結合する場合、標識化リガ
ンドの該ポリペプチドへの結合は、結合した標識化リガ
ンドの減少により測定されるように阻害される。

【０１０１】別法は、ＥＬＦ３介在のｃＡＭＰおよび／
またはアデニレート・シクラーゼ蓄積の阻害または刺激
を測定することによりＥＬＦ３阻害剤についてスクリー
ニングすることからなる。かかる方法は、真核細胞をＥ
ＬＦ３でトランスフェクションし、その細胞表面でポリ
ペプチドを発現させることからなる。ついで、該細胞を
ＥＬＦ３の存在下で潜在的アンタゴニストに暴露する。
そして、ｃＡＭＰ蓄積の量を測定する。潜在的アンタゴ
ニストがポリペプチドに結合する場合、すなわちＥＬＦ
３結合を阻害する場合、ＥＬＦ３介在のｃＡＭＰまたは
アデニレートシクラーゼのレベル、活性は減少するか、
増加するであろう。本発明のポリペプチドについてのア
ゴニストおよびアンタゴニストを検出する他の方法は、
米国特許第５４８２８３５号に記載の酵母に基づく技法
である。

【０１０２】本発明はまた、ＥＬＦ３レセプターへの結
合能を有することが不明なリガンドが、該ポリペプチド
に結合できるかどうかを測定する方法を提供する。この
方法は、リガンドのＥＬＦ３への結合を可能とする条件
下、ＥＬＦ３を発現する哺乳動物細胞をリガンドと接触
させ、そのポリペプチドに結合するリガンドの存在を検
出し、それによりそのリガンドがＥＬＦ３に結合するか
どうかを決定することからなる。アゴニストおよび／ま
たはアンタゴニストを決定するために前記したシステム
はまた、ＥＬＦ３に結合するリガンドを決定するのにも
用いることができる。潜在的ＥＬＦ３ポリペプチドアン
タゴニストとして、例えば、抗体、またはある場合に
は、第２メッセンジャー応答を誘起しないが、該ポリペ
プチドに結合する、すなわち、該レセプターの活性を妨
げる、オリゴヌクレオチドが挙げられる。潜在的アンタ
ゴニストはまた、ＥＬＦ３に密接に関連付けられるタン
パク質、すなわち、生物学的機能を失っており、ＥＬＦ
３についてのレセプターに結合した場合に、何の応答も
惹起しない、ＥＬＦ３のフラグメントを包含する。

【０１０３】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（いずれの
方法もポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合をベ
ースとしている）により遺伝子発現を制御することがで
きる。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コーディン
グ部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしてお
り、約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（３重ヘリックス − Lee
ら、Nucl.Acids Res.，6：3073（1979）；Cooneyら、Sc
ience，241：456（1988）；およびDervanら、Science，
251：1360（1991）を参照のこと）、それによりＥＬＦ
３ポリペプチドの転写および製造を阻害する。アンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにてｍＲＮ
Ａとハイブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子のＥＬＦ３ポリ
ペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス − Okan
o、J.Neurochem.，56：560（1991）；Oligodeoxynucleo
tides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，
CRC Press，Boca Raton，ＦＬ（1988）を参照のこ
と）。前記したオリゴヌクレオチドはまた、アンチセン
スＲＮＡまたはＤＮＡがインビボにて発現されてＥＬＦ
３ポリペプチドの生成を阻害するように、細胞にデリバ
リーすることができる。

【０１０４】もう一つの潜在的アンタゴニストは、リガ
ンドに近寄り難いようにし、正常な生物学的活性が妨げ
られる、ＥＬＦ３ポリペプチドに結合する小さな分子で
ある。小さな分子の例として、小さなペプチドまたはペ
プチド様分子が挙げられるが、これに限定されるもので
はない。また、本発明のアンタゴニストまたはアゴニス
トは、この転写因子により調節される遺伝子を活性化ま
たは抑制する分子からなる。プロモーター中のＥＬＦ３
結合部位をＥＬＦ３組換えタンパク質と一緒に用いる電
気泳動移動度シフトアッセイを用いてＥＬＦ３により調
節される遺伝子を同定することができる。潜在的なアン
タゴニストおよびアゴニストを同定するための試験化合
物によるこれら遺伝子の発現の制御は、前記した方法に
従って行うことができる。ＥＬＦ３タンパク質は哺乳動
物宿主中に遍在しており、多くの病因を含め、多数の生
物学的機能に関与している。従って、ＥＬＦ３の機能を
阻害しうる化合物および薬剤またはそれにより調節され
る遺伝子を見いだすことが望まれている。ＥＬＦ３につ
いてのアゴニストは、癌、とりわけ、特に前立腺癌、乳
癌、肺癌および他の上皮腫瘍のような疾患または障害に
対する種々の治療および予防目的に用いられる。

【０１０５】加えて、本発明は、過剰なＥＬＦ３活性に
関係した異常な状態を治療する方法であって、前記した
阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容される担体
と共に、ＥＬＦ３タンパク質の発現および／または活性
化を阻害するか、または第２シグナルを阻害し、それに
より異常な状態を緩和するのに効果的な量にて対象に投
与することからなる方法を提供する。医薬上許容される
担体とは、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノールおよびその組み合わせを意味
するが、これに限定されるものではない。処方は投与方
法に適していなければならない。投与方法による適当な
担体の選択は当業者に慣用的になされる。本発明はさら
に、１またはそれ以上の前記した本発明の組成物を充填
した１またはそれ以上の容器からなる医薬パックおよび
キットに関する。

【０１０６】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物などの他の化合物と組み合わせて用いて
もよい。医薬組成物は、例えば、とりわけ、局所的、経
口的、経肛門的、経膣的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮
下、経鼻内または皮内経路による投与を含め、効果的か
つ都合のよい方法で投与してもよい。一般に、組成物
を、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与する。
大抵の場合、一日に付き約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない
量で組成物が投与されるであろう。好ましくは、大抵の
場合、投与量は、一日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重ない
し約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適用量は、症状、重篤
度、投与経路、合併症などを考慮して、各治療様式につ
いての標準的方法および症状により決定されることが理
解されよう。

【０１０７】遺伝子治療 ＥＬＦ３ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチ
ドであるアゴニストおよびアンタゴニストを、しばしば
「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式において、かかるポ
リペプチドを発現させることにより、本発明にて使用す
ることができる。かくして、例えば、患者からの細胞
を、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドで操作
し、ポリペプチドをエクスビボでコードしてもよい。次
いで、その操作された細胞をそのポリペプチドで治療す
べき患者に与えてもよい。この具体例において、例え
ば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルスプラスミドベクターの使用により、細胞を
エクスビボで操作してもよい。かかる方法は当該分野に
おいてよく知られており、本発明におけるそれらの使用
は本明細書の教示から明らかである。

【０１０８】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、本発明のポリヌク
レオチドを、上記のように、複製欠損レトロウイルスベ
クター中での発現のために操作してもよい。ついで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラス
ミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導
入し、そのパッケージング細胞が問題の遺伝子を含有す
る感染性ウイルス粒子を産生するようにしてもよい。こ
れらの産生細胞を、インビボでの細胞の操作およびイン
ビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与しても
よい。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明ら
かである。

【０１０９】本明細書において前記したレトロウイルス
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、ギボンサル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、ミエロ増殖性肉腫ウイルス（Myel
oproliferative Sarcoma Virus）および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。好ましい
具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは
モロニーネズミ白血病ウイルス由来のものである。かか
るベクターは、ポリペプチド発現のための１個またはそ
れ以上のプロモーターを含む。用いることのできる適当
なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プ
ロモーター；およびMillerら、Biotechniques，7：980-
990（1989）に記載されたヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーターを包含するが、これに限定され
ない。ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−
アクチンプロモーターを包含するが、これに限定されな
い真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーターもまた
用いることができる。使用できる付加的なウイルス性プ
ロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パーボウ
イルスプロモーターを包含するが、これらに限定されな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる
教示から当業者に明らかであろう。

【０１１０】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろう。
使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス主要
後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのごと
きウイルス性チミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルス性ＬＴＲ（本明細書で前記した修飾レトロウイル
スＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これ
らに限定されない。プロモーターは、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する元来のプロモーターであって
もよい。

【０１１１】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入し、産生細胞系を形
成する。トランスフェクションされてもよいパッケージ
ング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ
−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７
−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ
＋ｅｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Ther
apy，1：5-14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含
するが、これらに限定されない。当該分野で知られてい
るいずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞
中に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポ
レーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈殿を包含
するが、これらに限定されない。別法において、レトロ
ウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、
あるいは脂質と結合させ、ついで、宿主に投与してもよ
い。

【０１１２】産生細胞系は、ポリペプチドをコードする
核酸配列（複数でも可）を含む、感染性レトロウイルス
ベクター粒子を産生するであろう。かかるレトロウイル
スベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボの
いずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよい。形質
導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配
列（複数でも可）を発現するであろう。形質導入されう
る真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならび
に造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチ
ノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。

【０１１３】

【実施例】本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明す
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示説明
は本発明の特定の態様を説明するものであるが、開示し
た発明の範囲を限定または制限するものではない。本明
細書中の特定の用語は、上記の定義において説明されて
いる。すべての実施例は標準的方法を用いて行われ、特
記しないかぎり、それらの方法は当業者によく知られて
おり、通常的なものである。以下の実施例の通常的方法
は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュアルに記
載されているようにして行うことができる。下記の実施
例に示すすべての部分または量は、特記しないかぎり、
重量である。特記しないかぎり、下記実施例におけるフ
ラグメントのサイズ分離は、Sambrookおよび他の多くの
文献、例えば、Goeddel et al., Nucleic Acids Res.,
1980, 8:4057に記載されたようなアガロースおよびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）といった標準
的方法を用いて行う。特記しないかぎり、連結は、標準
的緩衝液、インキュベーション温度および時間、連結す
べきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡ
０.５μgあたり約１０ユニットのＴ4 ＤＮＡリガーゼ
（リガーゼ）を用いて行われる。

【０１１４】実施例１ 細菌を用いたヒトＥＬＦ３の発
現および精製 ヒトＥＬＦ３タンパク質のカルボキシル末端アミノ酸配
列および遺伝子の３'のベクター配列に特異的なＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託ポリヌク
レオチド中のヒトＥＬＦ３をコードしているＤＮＡ配列
を増幅する。クローニングを容易にする制限部位を含む
さらなるヌクレオチドを、各々５'および３'配列に付加
する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、下記配
列：５'-ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧ
ＡＧＡＴＴＡＧＣ-３'（配列番号：３）を有し、下線部
のBamHI制限部位を含んでおり、それは図１に示すヒト
ＥＬＦ３コーディング配列の２１個のヌクレオチド（コ
ドン２のヌクレオチド１１８から始まる）が後に続くコ
ドン２をコードしている。３'プライマーは、下記配
列：５'-ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＧＡＣＴＣＴ
ＧＧＡＧＡＡＣＣ-３'（配列番号：４）を有し、下線部
のBglII制限部位を含んでおり、図１に示すＥＬＦ３コ
ーディング配列の最後の２２個のヌクレオチド（停止コ
ドンを含む）に相補的な２１個のヌクレオチドが後に続
いている。

【０１１５】制限部位は、これらの実施例における細菌
での発現に用いられる細菌用発現ベクターpQE-30（Qiag
en,Inc.Chastworth,CA ）中の制限酵素部位に対して便
利である。pQE-30はアンピシリン抗生物質耐性（Amp
ｒ）をコードしており、細菌の複製開始点（ori）、IPT
G誘導可能プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位を含んでい
る。増幅されたヒトＥＬＦ３ ＤＮＡをBamHIおよびBglI
Iで消化する。ベクターpQE-30をBamHIで消化する。次い
で、消化ＤＮＡを連結する．ＥＬＦ３ ＤＮＡをBamHI部
位を有するベクター中に挿入することにより、ＥＬＦ３
コーディング領域がベクターのIPTG誘導可能プロモータ
ーの下流に制御可能に連結され、さらにＥＬＦ３の翻訳
のために適当に配置された開始ＡＵＧと読み枠を合わせ
て配置する。標準的方法を用いて、連結反応混合物でコ
ンピテント・イー・コリ細胞を形質転換する。かかる手
順はSambrookの文献に記載されている。lacリプレッサ
ーを発現し、カナマイシン耐性（Kan^r）を付与する複数
コピーのプラスミドpREP4を含有するイー・コリＭ１５
／ｒｅｐ４株を本明細書記載の実施例の実施に使用す
る。ＥＬＦ３発現に適した多くの株の１つであるこの株
は、Qiagenから市販されている。アンピシリン存在下の
ＬＢプレート上での増殖能によって形質転換体を同定す
る。耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、制限
分析によりクローン化ＤＮＡの同一性を確認する。所望
構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μg/m
l）およびカナマイシン（２５μg/ml）の両方を補足し
たＬＢ培地中で液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。

【０１１６】Ｏ／Ｎ培養物を用いて、希釈倍率約１：１
００ないし１：２５０になるように大規模培養に接種す
る。６００ｎｍ（ＯＤ⁶⁰⁰）における光学密度が０.４な
いし０.６となるまで細胞を増殖させる。次いで、イソ
プロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を
最終濃度１ｍＭとなるように添加して、lacIリプレッサ
ーを不活性化させることにより、lacリプレッサー感受
性プロモーターからの転写を誘導する。その後、細胞を
さらに３ないし４時間インキュベーションする。次い
で、遠心分離により細胞を集め、標準的方法により破壊
する。通常の収集法を用いて封入体を破壊細胞から精製
し、６Ｍグアニジン中でタンパク質を封入体から可溶化
する。ヒスチジンタグを介してタンパク質のＮ末端でＥ
ＬＦ３と結合するＴＡＬＯＮマトリックス（Clontech,
Palo Alto, CA）に、６Ｍグアニジン溶液を添加する。
８Ｍ尿素および２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液
でＴＡＬＯＮマトリックスを洗浄し、８Ｍ尿素および５
０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液で溶出する。溶出
タンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液および２０
％グリセロールを含有する緩衝液に対して透析し、それ
により尿素を除去し、タンパク質を再生させる。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動といった標準的方法による調
製物の分析により、調製物が予想分子量約４２ｋＤａを
有する、約９０％モノマーのＥＬＦ３を含有することが
明らかとなった。

【０１１７】実施例２ 我々は、ＥＬＦ３が癌、特に乳癌および前立腺癌のごと
き上皮癌の診断マーカーおよび／または治療標的となり
うるという考えを支持する根拠を示す。第１に、ＥＬＦ
３は哺乳動物腫瘍組織中で対照よりもアップレギュレー
ションされている。第２に、我々は、この遺伝子を染色
体ｌｑ３２.２にマッピングした。この領域はしばしば
乳癌において増幅されている。第３に、ＨＥＲ＋ｖｅ細
胞および高レベルのＥＬＦ３との間には相関関係があ
る。ＨＥＲはneu受容体を通じてシグナルを伝達する。n
eu受容体は乳癌中で増幅されている（そして、それを介
して機能するシグナル伝達経路が活性化される）。第４
に、ＥＬＦ３は転写においてneuプロモーターを活性化
することができる。第５に、我々は、ＥＬＦ３発現が前
立腺癌の数人の患者において高まっていること−すなわ
ち腫瘍細胞は同じ標本の対応する上皮細胞よりも高レベ
ルのＥＬＦ３を有することを示した。

【０１１８】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人：イスメイル・コーラ、マーティン・ジェ
イ・ティムズ、クリスティーヌ・デブウク （ｉｉ）発明の名称： 新規ＥＴＳ種メンバー、ＥＬＦ
３ （ｉｉｉ）配列の数：４ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェード・ランド７０９番、ピー・
オー・ボックス１５３９ （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット、３.５インチ、１.４４
Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウ・フォー
・ワークグループ （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウィリアム，ティー・ハン （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２４ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０ ４０２６

【０１１９】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： GCCGGGTAGG GGAGCGCAGC GGCCAGATAC CTCAGCGCTA CCTGGCGGAA CTGGATTTCT 60 CTCCCGCCTG CCGGCCTGCC TGCCACAGCC GGACTCCGCC ACCCCGGTAG CCTCATGGCT 120 GCAACCTGTG AGATTAGCAA CATTTTTAGC AACTACTTCA GTGCGATGTA CAGCTCGGAG 180 GACTCCACCT TGGCCTCTGT TCCCCCTGCT GCCACCTTTG GGGCCGATGA CTTGGTACTG 240 ACCCTGAGCA ACCCCCAGAT GTCATTGGAG GGTACAGAGA AGGCTAGCTG GTTGGGGGAA 300 CAGCCCCAGT TCTGGTCGAA GACGCAGGTT CTGGACTGGA TCAGCTACCA AGTGGAGAAG 360 AACAAGTACG ACGCAAGCGC CATTGACTTC TCACGATGTG ACATGGATGG GGCCACCCTC 420 TGCAATTGTG CCCTTGAGGA GCTGCGTCTG GTCTTTGGGC CTCTGGGGGA CCAACTCCAT 480 GCCCAGCTGC GAGACCTCAC TTCCAGCTCT TCTGATGAGC TCAGTTGGAT CATTGAGCTG 540 CTGGAGAAGG ATGGCATGGC CTTCCAGGAG GCCCTAGACC CAGGGCCCTT TGACCAGGGC 600 AGCCCCTTTG CCCAGGAGCT GCTGGACGAC GGTCAGCAAG CCAGCCCCTA CCACCCCGGC 660 AGCTGTGGCG CAGGAGCCCC CTCCCCTGGC AGCTCTGACG TCTCCACCGC AGGGACTGGT 720 GCTTCTCGGA GCTCCCACTC CTCAGACTCC GGTGGAAGTG ACGTGGACCT GGATCCCACT 780 GATGGCAAGC TCTTCCCCAG CGATGGTTTT CGTGACTGCA AGAAGGGGGA TCCCAAGCAC 840 GGGAAGCGGA AACGAGGCCG GCCCCGAAAG CTGAGCAAAG AGTACTGGGA CTGTCTCGAG 900 GGCAAGAAGA GCAAGCACGC GCCCAGAGGC ACCCACCTGT GGGAGTTCAT CCGGGACATC 960 CTCATCCACC CGGAGCTCAA CGAGGGCCTC ATGAAGTGGG AGAATCGGCA TGAAGGCGTC 1020 TTCAAGTTCC TGCGCTCCGA GGCTGTGGCC CAACTATGGG GGCAAAAGAA AAAGAACAGC 1080 AACATGACCT ACGAGAAGCT GAGCCGGGCC ATGAGGTACT ACTACAAACG GGAGATCCTG 1140 GAACGGGTGG ATGGCCGGCG ACTCGTCTAC AAGTTTGGCA AAAACTCAAG CGGCTGGAAG 1200 GAGGAAGAGG TTCTCCAGAG TCGGAACTGA GGGTTGGAAC TATACCCGGG ACCAAACTCA 1260 CGGACCACTC GAGGCCTGCA AACCTTCCTG GGAGGACAGG CAGGCCAGAT GGCCCCTCCA 1320 CTGGGGAATG CTCCCAGCTG TGCTGTGGAG AGAAGCTGAT GTTTTGGTGT ATTGTCAGCC 1380 ATCGTCCTGG GACTCGGAGA CTATGGCCTC GCCTCCCCAC CCTCCTCTTG GAATTACAAG 1440 CCCTGGGGTT TGAAGCTGAC TTTATAGCTG CAAGTGTATC TCCTTTTATC TGGTGCCTCC 1500 TCAAACCCAG TCTCAGACAC TAAATGCAGA CAACACCTTC CTCCTGCAGA CACCTGGACT 1560 GAGCCAAGGA GGCCTGGGGA GGGCCTAGGG GAGCACCGTG ATGGAGAGGA CAGAGCAGGG 1620 GCTCCAGCAC CTTCTTTCTG GACTGGCGTT CACCTCCCTG CTCAGTGCTT GGGCTCCACG 1680 GGCAGGGGTC AGAGCACTCC CTAATTTATG TGCTATATAA ATATGTCAGA TGTACATAGA 1740 GATCTATTTT TTCTAAAACA TTCCCCTCCC CACTCCTCTC CCACAGAGTG CTGGACTGTT 1800 CCAGGCCCTC CAGTGGGCTG ATGCTGGGAC CCTTAGGATG GGGCTCCCAG CTCCTTTCTC 1860 CTGTGAATGG AGGCAGAGAC CTCCAATAAA GTGCCTTCTG GGCTTTTTCT AAAAAAAAAA 1920

【０１２０】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３７１ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Ala Ala Thr Cys Glu Ile Ser Asn Ile Phe Ser Asn Tyr Phe Ser 1 5 10 15 Ala Met Tyr Ser Ser Glu Asp Ser Tyr Leu Ala Ser Val Pro Pro Ala 20 25 30 Ala Thr Phe Glu Ala Asp Asp Leu Val Leu Thr Leu Ser Asn Pro Gln 35 40 45 Met Ser Leu Glu Gly Thr Glu Lys Ala Ser Trp Leu Gly Glu Gln Pro 50 55 60 Gln Phe Trp Ser Lys Thr Gln Val Leu Asp Trp Ile Ser Tyr Gln Val 65 70 75 80 Glu Lys Asn Lys Tyr Asp Ala Ser Ala Ile Asp Phe Ser Arg Cys Asp 85 90 95 Met Asp Gly Ala Thr Leu Cys Asn Cys Ala Leu Glu Glu Leu Arg Leu 100 105 110 Val Phe Gly Pro Leu Gly Asp Gln Leu His Ala Gln Leu Arg Asp Leu 115 120 125 Thr Ser Ser Ser Ser Asp Glu Leu Ser Trp Ile Ile Glu Leu Leu Glu 130 135 140 Lys Asp Gly Met Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp Pro Gly Pro Phe Asp 145 150 155 160 Gln Gly Ser Pro Phe Ala Gln Glu Leu Leu Asp Asp Gly Gln Gln Ala 165 170 175 Ser Pro Tyr His Pro Gly Ser Cys Gly Ala Gly Ala Pro Ser Pro Gly 180 185 190 Ser Ser Asp Val Ser Thr Ala Gly Thr Gly Ala Ser Arg Ser Ser His 195 200 205 Ser Ser Asp Ser Gly Gly Ser Asp Val Asp Leu Asp Pro Thr Asp Gly 210 215 220 Lys Leu Phe Pro Ser Asp Gly Phe Arg Asp Cys Lys Lys Gly Asp Pro 225 230 235 240 Lys His Gly Lys Arg Lys Arg Gly Arg Pro Arg Lys Leu Ser Lys Glu 245 250 255 Tyr Trp Asp Cys Leu Glu Gly Lys Lys Ser Lys His Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Thr His Leu Trp Glu Phe Ile Arg Asp Ile Leu Ile His Pro Glu Leu 275 280 285 Asn Glu Gly Leu Met Lys Trp Glu Asn Arg His Glu Gly Val Phe Lys 290 295 300 Phe Leu Arg Ser Glu Ala Val Ala Gln Leu Trp Gly Gln Lys Lys Lys 305 310 315 320 Asn Ser Asn Met Thr Tyr Glu Lys Leu Ser Arg Ala Met Arg Tyr Tyr 325 330 335 Tyr Lys Arg Glu Ile Leu Glu Arg Val Asp Gly Arg Arg Leu Val Tyr 340 345 350 Lys Phe Gly Lys Asn Ser Ser Gly Trp Lys Glu Glu Glu Val Leu Gln 355 360 365 Ser Arg Asn 370

【０１２１】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： CGGGATCCGC TGCAACCTGT GAGATTAGC 29

【０１２２】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： GCAGATCTCA GTTCCGACTC TGGAGAACC 29

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＥＬＦ３のヌクレオチド配列（配列番号
１）を示す。核酸配列の開始および終止コドンを太文字
で示す。

【図２】 ヒトＥＬＦ３のヌクレオチド配列（配列番号
１）を示す。核酸配列の開始および終止コドンを太文字
で示す。

【図３】 ヒトＥＬＦ３の推定アミノ酸配列（配列番号
２）を示す。アミノ酸配列のＥＴＳ結合領域を太文字で
示す。ＰＥＳＴ領域のアミノ酸に下線を付して示す。

【図４】 ヒトＥＬＦ３の推定アミノ酸配列（配列番号
２）を示す。アミノ酸配列のＥＴＳ結合領域を太文字で
示す。ＰＥＳＴ領域のアミノ酸に下線を付して示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/32 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 597171099 モナッシュ・ユニバーシティ ＭＯＮＡＳＨ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ オーストラリア、ビクトリア州クレイト ン、クレイトン・ロード246番 モナッシ ュ・メディカル・センター、レベル５ (72)発明者 クリスティーヌ・デブウク アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、ピュフ・ロード667番 (72)発明者 イスメイル・コーラ オーストラリア3181ビクトリア州プラーラ ン、オロング・ロード593番 (72)発明者 マーティン・ジェイ・ティムズ オーストラリア3168ビクトリア州ノッティ ング・ヒル、チューリップ・コート５番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して５０％
   よりも大きな同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と同じアミ
   ノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補性のポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチ
   ドからなる群より選択されるメンバーからなる単離ポリ
   ヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチドからなる
   請求項２記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
   チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 （ａ）ＡＴＣＣ受託番号９８２３８に含
   まれるヒトｃＤＮＡにより発現されるのと同じ成熟ポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
   とも５０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）遺伝暗号の重複性により、ＡＴＣＣ受託番号９８
   ２３８に含まれるヒトｃＤＮＡにより発現されるのと同
   じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補性のポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチ
   ドからなる群より選択されるメンバーからなる単離ポリ
   ヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項２記載のＤＮＡからなるベクタ
   ー。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターからなる宿主細
   胞。
9. 【請求項９】 請求項８記載の宿主細胞からそのＤＮＡ
   によってコードされるポリペプチドを発現させることを
   特徴とするポリペプチドの製造法。
10. 【請求項１０】 ポリペプチドを発現する細胞の製造法
    であって、細胞がベクター中に含まれるヒトｃＤＮＡに
    よりコードされるポリペプチドを発現するように、該細
    胞を請求項７に記載のベクターで形質転換またはトラン
    スフェクションすることからなる方法。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列に対して５
    ０％よりも大きなの同一性を有するアミノ酸配列からな
    るポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号２に示すアミノ酸配列からな
    るポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
    るアゴニスト。
14. 【請求項１４】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１１記載のポリペプチドに対す
    るアンタゴニスト。
16. 【請求項１６】 ＥＬＦ３の必要な患者の治療方法であ
    って、請求項１０記載のポリペプチドの治療上有効量を
    該患者に投与することからなる治療方法。
17. 【請求項１７】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを患
    者に付与し、インビボにて該ポリペプチドを発現させる
    ことにより、該ポリペプチドの治療上有効量を投与する
    ことからなる請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 ＥＬＦ３ポリペプチドの阻害を必要と
    する患者の治療方法であって、請求項１５記載のアンタ
    ゴニストの治療上有効量を該患者に投与することからな
    る方法。
19. 【請求項１９】 請求項１１に記載のポリペプチドの発
    現に関与する疾患または該疾患に対する感受性の診断方
    法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列にお
    ける突然変異を測定することからなる方法。
20. 【請求項２０】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
    １記載のポリペプチドの存在について分析することから
    なる診断方法。