JPH10179170A - ヒト軟骨ｇｐ−３９様遺伝子 - Google Patents

ヒト軟骨ｇｐ−３９様遺伝子

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JPH10179170A
JPH10179170A JP9247446A JP24744697A JPH10179170A JP H10179170 A JPH10179170 A JP H10179170A JP 9247446 A JP9247446 A JP 9247446A JP 24744697 A JP24744697 A JP 24744697A JP H10179170 A JPH10179170 A JP H10179170A
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polynucleotide
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dna
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ジュリー・アダモー
Robert B Kirkpatrick
ロバート・ビー・カークパトリック
Martin Rosenberg
マーティン・ローゼンバーグ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 リューマチおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテ
ローム性動脈硬化症、転移性癌、歯周病、慢性腎疾患な
どのごとき組織改造作用障害の治療および診断に有用な
タンパク質の同定が望まれている。 【解決手段】 哺乳動物細胞における組織改造作用に関
係していると考えられるＨＣｇｐ−３９Ｌポリペプチ
ド、および、かかるＨＣｇｐ３９−ＬをコードするＤＮ
Ａ（ＲＮＡ）、および、組換え法によってかかるポリペ
プチドを製造する方法、加えて、リューマチ、および骨
関節炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、転移性腫
瘍、歯周病、慢性腎疾患などの治療および診断のため
の、かかるＨＣｇｐ３９−Ｌを用いる方法、ならびにか
かる治療および診断のための薬物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一部分、新規同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；そのポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
そのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、および、そ
の変種および誘導体の製造方法；そのポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニスト；および、そのポリヌク
レオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストお
よびアンタゴニストの使用に関する。詳細には、これら
および他の点において、本発明は、ヒト・軟骨糖タンパ
ク質３９様遺伝子（以下、「ＨＣｇｐ３９−Ｌ」と称す
る）のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】組織
の合成または分解は、細胞間コラーゲン、基底膜コラー
ゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アグレカン、およ
び種々のプロテオグリカンを包含する細胞外マトリック
ス（ＥＣＭ）成分の絶え間ない再組織化および再構成化
を必要とする（HeinegardおよびOlsberg、FASEB J. 198
9, 3, 2042-2051; Woessner、FASEBJ. 1991, 5,214-215
4を参照のこと）。正常型の改造作用プロセスは、胚発
生、子宮の分娩後の混乱、排卵、傷の修復、および、骨
および成長板改造作用を包含する（Woessnerら、Steroi
ds 1989, 54, 491-499; Weeksら、Biochim Biophs Acta
1976, 445, 205-214; LepageおよびGache、EMBO J. 19
90, 9, 3003-3012; WrideおよびSanders、Dev-Dyn. 199
3, 198(3) 225-39を参照のこと）。類似のプロセスが、
リューマチおよび骨関節炎のごとき連結部崩壊、歯周病
および腫瘍細胞の転移のごとき疾病状態においてもおこ
る（ThompsonおよびOegema、J Bone joint Surg. 1979,
61, 407-16; Reynoldsら、Adv-Dent-Res. 1994, 8(2)
312-9を参照のこと）。これらのプロセスの一例は、リ
ューマチ性関節炎における滑液組織の場合のごとく、炎
症部位へのマクロファージの移動である（Cutoloら、Cl
in. and Exper. Rheum. 1993, 11, 331-339を参照のこ
と）。ＥＣＭ成分は、正常および病態の両方において種
々の外来性および内在性因子によって調節されている。
例えば、腫瘍形成において、細胞の分化状態がＥＣＭの
分解速度を増加しうる（Benya、Pathol.Immunopathol.R
es. 1988, 7, 51-54を参照のこと）。同様に、金属プロ
テアーゼまたはその阻害剤の存在が、ＥＣＭの組成を変
化させうる。金属プロテアーゼおよびマトリックス金属
プロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）の不均衡が骨関
節炎の発病に寄与しているように見える（Deanら、J. C
lin. Invest. 1989, 84: 678-685を参照のこと）。サイ
トカイン、成長因子、および細胞外環境のすべてがＥＣ
Ｍの変化に寄与しうる（Tyler、Biochem J. 1985, 227,
869-878; Dinarello、Sem Immunol. 1992, 4, 133-145;
McConnellら、J. Cell. Biol. 1987, 105, 1087-98を
参照のこと）。
【０００３】軟骨および骨の成長は、関節の軟骨細胞お
よび骨芽細胞のごとき細胞によって活性化される。未成
熟の組織におけるこれらの細胞の主な機能は、軟骨また
は骨マトリックスの貯蔵および改造である。大人の組織
においては、これらの細胞は、それの適切な機能を確実
にするためにこのマトリックスを維持する。どちらの場
合においても、これは、ＥＣＭのターンオーバーに関係
したタンパク質の分泌と同様、細胞外組成物の分泌を包
含する。
【０００４】これらの細胞によって分泌され、ＥＣＭの
ターンオーバーに関係している主なタンパク質は金属プ
ロテアーゼである（Woessner、FASEB J. 1991, 5, 214-
2154を参照のこと）。新型の分泌糖タンパク質も、ヒト
・軟骨、骨芽細胞、滑液細胞、ヒツジおよびウシの卵管
および乳房細胞、およびマクロファージにおいて同定さ
れている（NyrikosおよびGolds、Biochem J. 1990, 26
8, 265-268; Hakalaら、J. Biol. Chem. 1993, 268(34)
25803-25810; Johansenら、J. Bone and Min.Res. 199
2, 7(5) 501-511; Rejman and Hurley、Biochem. Bioph
ys. Res. Commun. 1988, 150, 329-334; DeSouzaおよび
Murray、Endocrinology 1995, 136(6)2485-2496; Holla
kら、J. Clin. Invest. 1994, 93, 1288-92; Ariasら、
Biol of Reproduction 1994, 51, 685-694を参照のこ
と）。これらの新規哺乳動物タンパク質すべてが、細菌
および心筋のキチナーゼに有為な相同性領域を共有し、
従って、本明細書中「キチナーゼ様」タンパク質とい
う。キチナーゼはグリコシド結合を加水分解する酵素で
ある。それらは哺乳動物由来のリゾチームにわずかに類
似しており、Ｎアセチルグルコサミン結合に特異性を持
つエンドグリコシダーゼとしての機能を有する。しかし
ながら、これらのタイプのキチン様構造の、Ｎアセチル
グルコサミンのホモポリマーは、正常な哺乳動物組織に
おいては遭遇しない。
【０００５】ヒト・軟骨糖タンパク質、ＨＣｇｐ−３９
は、関節の軟骨細胞および滑液線維芽細胞の両方によっ
て分泌される、見かけ分子量約３９ｋＤａを有するタン
パク質である（NyrikosおよびGolds、Biochem J. 1990,
268, 265-268; Hakalaら、J. Biol. Chem. 1993, 268
(34) 25803-25810を参照のこと）。このタンパク質は、
リューマチ性関節炎と診断された患者の血液中および滑
液中に現れる関節傷害のマーカーとして記載されている
（Johansenら、British J. of Rheumatology 1993, 32,
949-955を参照のこと）。このタンパク質をコードする
遺伝子がクローン化され、リューマチの関節の軟骨およ
び滑液細胞において特異的に発現された（Hakalaら、J.
Biol. Chem. 1993, 268(34) 25803-25810を参照のこ
と）。タンパク質ＹＫＬ−４０も、１,２５-ジヒドロキ
シビタミンＤ３刺激に応答して発現する、培養ヒト骨芽
細胞（骨腫瘍細胞系ＭＧ−６３）の主な分泌産物の一つ
として同定されている（Johansenら、J. Bone and Min.
Res. 1992, 7(5) 501-511;Johansenら、British J. of
Rheumatology 1993, 32, 949-955を参照のこと）。Ｙ
ＫＬ−４０のＮ末端部分が配列決定され、ＨＣｐｇ−３
９と同じであることが見いだされた。さらに配列が決定
され、ＹＫＬ−４０およびＨＣｇｐ−３９は同一である
ことが見いだされた。
【０００６】キトトリオシダーゼは、この「キチナーゼ
様」ファミリーのメンバーとして同定された酵素である
（Renkemaら、J. Biol. Chem. 1995, 27C, 2198-2202;
Hollakら、J. Clin. Invest. 1994, 93, 1288-92を参照
のこと）。このタンパク質も見かけ分子量３９ｋＤａ
で、ＨＣｇｐ−３９、ウシ・乳房タンパク質およびいく
つかの細菌キチナーゼとＮ末端の相同性を共有してい
る。この酵素の活性は元々、ゴーシェ病（ＧＤ）に苦し
んでいる患者の細胞から検出された。ゴーシェ病は、グ
ルコセレブロシダーゼというリソソームの加水分解酵素
の活性における遺伝的欠損である。この欠損により、マ
クロファージのリソソームにグルコシルセラミド（グル
コセレブロシド）の蓄積がおこる。脂質豊富なマクロフ
ァージの蓄積により、肝臓脾臓肥大、骨傷害、および神
経学的異型がおこる。培養において単球のマクロファー
ジへの形態学的分化の後で、細胞は増量したキトトリオ
シダーゼの製造および分泌を始める。ＧＤ患者における
この増加は、平均で、他の病的状態にある患者の６００
倍である。しかしながら、キトトリオシダーゼ活性の増
加は、酵素補填療法の開始により効果的に減少しうる。
他のメンバーのキチナーゼ様ファミリーとは異なり、キ
トトリオシダーゼはキチン分解活性を有する。細菌酵素
のように、それはキチン青、ベータ-１,４-結合Ｎアセ
チルグルコサミン部分のポリマーを分解することができ
る。
【０００７】ＨＣｇｐ−３９Ｌと称されるキチナーゼ様
ファミリーの新規リンパ球付随タンパク質が同定され
た。ＨＣｇｐ−３９Ｌタンパク質は、哺乳動物細胞にお
ける組織改造作用に関係していると考えられており、か
くして、リューマチおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテロ
ーム性動脈硬化症、転移性癌、歯周病、慢性腎疾患など
のごとき組織改造作用障害の治療および診断の発達にお
ける有用な道具として供する。さらに本発明者らは、ス
プライス変種であると考えられる、配列番号：［２］お
よび［３］に列挙したＨＣｇｐ−３９Ｌの２つの形態を
見出した。かくして、本明細書中で使用する場合は、Ｈ
Ｃｇｐ−３９Ｌはスプライス変種のどちらかをいう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】これらおよび他の目的の
ために、特に、図１および２または図３および４（配列
番号：［２］または［４］）に示したアミノ酸配列とＨ
Ｃｇｐ−３９の既知のアミノ酸配列の間の相同性によっ
て、新規ＨＣｇｐ３９−Ｌとして同定されたポリペプチ
ドを提供することが本発明の目的である。
【０００９】さらに、ＨＣｇｐ３９−Ｌをコードするポ
リヌクレオチド、特に、本願中ＨＣｇｐ３９−Ｌとして
示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明
のこの態様の特に好ましい具体例において、ポリヌクレ
オチドは、図１ないし４に示した配列中ＨＣｇｐ３９−
Ｌをコードする領域を含んでなる。
【００１０】本発明のこの態様に従って、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例において、生物学的、診断学的、臨床的、ま
たは治療的に有用なそれの変種、アナログまたは誘導
体、または、変種、アナログおよび誘導体の断片を包含
するそれの断片を包含する、ＨＣｇｐ３９−Ｌをコード
する単離された核酸分子を提供する。本発明のこの態様
の特に好ましい具体例には、天然のＨＣｇｐ３９−Ｌの
対立遺伝子変種がある。
【００１１】治療目的、例えば、これらに限定されない
が、リューマチおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテローム
性動脈硬化症、転移性癌、歯周病、慢性腎疾患などを治
療するために用いてもよい、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプ
チド、特にＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドを提供するこ
とも本発明の目的である。本発明のこの態様に従って、
生物学的、診断学的、臨床的、または治療的に有用なそ
れの断片、変種、アナログまたは誘導体、断片の変種お
よび誘導体、および前述のアナログと同様、本願中、Ｈ
Ｃｇｐ３９−Ｌといわれるヒト由来の新規ポリペプチド
を提供する。
【００１２】本発明のこの態様の特に好ましい具体例に
は、天然のＨＣｇｐ３９−Ｌ遺伝子の対立遺伝子によっ
てコードされるＨＣｇｐ３９−Ｌの変種がある。本発明
のもう一つの態様に従って、本発明ポリペプチドに結合
し、活性化または活性化を阻害する化合物のスクリーニ
ング方法を提供する。前述したポリペプチド、ポリペプ
チド断片、変種および誘導体、変種および誘導体の断
片、および、これらのアナログの製造方法を提供するこ
とが本発明のもう一つの目的である。
【００１３】本発明のこの態様の特に好ましい具体例に
おいて、宿主においてＨＣｇｐ３９−Ｌの発現のための
条件下で、そこに発現的に取り込まれている外来性ＨＣ
ｇｐ３９−Ｌをコードするポリヌクレオチドを有する宿
主細胞を培養すること、および、次いで、発現したポリ
ペプチドを回収することを含んでなる前述のＨＣｇｐ３
９−Ｌポリペプチドを製造する方法を提供する。本発明
のもう一つの目的に従って、産物、組成物、プロセス、
および、特に、研究、生物学的、臨床的、診断、または
治療目的に前述のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
を使用する方法を提供する。
【００１４】本発明のこの態様のある好ましい具体例に
従って、特に、他のこと：ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチ
ド、またはＨＣｇｐ３９−ＬをコードするｍＲＮＡを測
定することによって細胞における発現を評価するため；
これらに限定されないが、リューマチおよび骨関節炎、
骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、転移性癌、歯周
病、慢性腎疾患などを、本願中に開示されるごとく、細
胞をＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドに曝露することによってインビトロ、エクスビボま
たはインビボで治療するために；ＨＣｇｐ３９−Ｌ遺伝
子における欠失のごとき遺伝的変種および変型をアッセ
イするため；および、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドま
たはポリヌクレオチドをＨＣｇｐ３９−Ｌの機能が増大
している、または、ＨＣｇｐ３９−Ｌ機能不全を治療し
ている生物に投与するための、産物、組成物および方法
を提供する。
【００１５】本発明のさらにもう一つの具体例に従っ
て、ＨＣｇｐ３９−Ｌの低下した発現に関係した状態の
治療のために、本発明ポリペプチドを刺激するためのか
かる活性化化合物を使用する方法を提供する。本発明の
もう一つの態様に従って、ＨＣｇｐ３９−Ｌの増大した
発現に関係した状態を治療するためのかかる阻害化合物
を使用する方法を提供する。
【００１６】本発明のさらにもう一つの態様に従って、
本発明のＨＣｇｐ３９−Ｌの少なくとも一つのドメイン
の断片、コンセンサス断片および／または保存的アミノ
酸置換を有する配列であり、結合分子がＨＣｇｐ３９−
Ｌに結合してもよい、または、さらに定量的または定性
的にＨＣｇｐ３９−Ｌ結合を修飾してもよい、非天然合
成の単離されたおよび／または組換えＨＣｇｐ３９−Ｌ
ポリペプチドを提供する。
【００１７】本発明のさらにもう一つの態様に従って、
診断、治療および／または研究への適用において使用さ
れてもよい、ＨＣｇｐ３９−Ｌ機能の潜在的モデュレー
ターとして有用であるかもしれない、合成または組換え
ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチド、それの保存的置換およ
び誘導体、それに対する抗体、抗イディオタイプ抗体、
組成物および方法を提供する。
【００１８】種々のＨＣｇｐ３９−Ｌまたはそれの断片
を阻害または模倣するようにデザインされた合成、単離
または組換えポリペプチドを提供することは、本発明の
さらにもう一つの目的である。本発明のこのおよび別の
態様のある好ましい具体例に従って、ＨＣｇｐ３９−Ｌ
配列にハイブリダイゼーションするプローブを提供す
る。本発明のこの態様のさらに好ましいある具体例にお
いて、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドに対する抗体を提
供する。この点において特に好ましいある具体例におい
て、抗体はＨＣｇｐ３９−Ｌに高度に選択的である。
【００１９】本発明のもう一つの態様に従って、ＨＣｇ
ｐ３９−Ｌアゴニストを提供する。好ましいアゴニスト
の中には、ＨＣｇｐ３９−Ｌを模倣した分子、ＨＣｇｐ
３９−Ｌ結合分子に結合する分子、および、ＨＣｇｐ３
９−Ｌが引き起こす応答を促進または増大させる分子が
ある。好ましいアゴニストの中には、ＨＣｇｐ３９−Ｌ
遺伝子またはＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドと相互作用
する分子、または、ＨＣｇｐ３９−Ｌ活性の別のモデュ
レーターと相互作用する分子もあり、それによってＨＣ
ｇｐ３９−Ｌの効果またはＨＣｇｐ３９−Ｌの１つ以上
の効果を増強または増大させる。
【００２０】本発明のさらにもう一つの態様に従って、
ＨＣｇｐ３９−Ｌアンタゴニスト（阻害剤）を提供す
る。好ましいアンタゴニストの中には、ＨＣｇｐ３９−
Ｌ結合分子に結合するがＨＣｇｐ３９−Ｌが引き起こす
応答またはＨＣｇｐ３９−Ｌが引き起こす一つ以上の応
答を促進しないようにＨＣｇｐ３９−Ｌを模倣した分子
がある。好ましいアンタゴニストの中には、ＨＣｇｐ３
９−Ｌの効果またはＨＣｇｐ３９−Ｌの一つ以上の効果
を阻害するように、または、ＨＣｇｐ３９−Ｌの発現を
妨害するように、ＨＣｇｐ３９−Ｌと結合または相互作
用する分子もある。
【００２１】本発明のさらなる態様において、ＨＣｇｐ
３９−Ｌポリペプチドを含んでなる組成物、または、イ
ンビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞に投与、ま
たは多細胞生物に投与するためのＨＣｇｐ３９−Ｌポリ
ペプチドを提供する。本発明のこの態様の特に好ましい
ある具体例において、組成物は、疾病を治療するための
宿主生物におけるＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドの発現
のためのＨＣｇｐ３９−Ｌポリヌクレオチドを含んでな
る。この点において特に好ましくは、ＨＣｇｐ３９−Ｌ
の通常でない内在活性に伴う機能障害を治療するため
の、ヒト患者における発現である。
【００２２】本発明の他の目的、特徴、利点および態様
は、以下の記載から当業者には明白になるであろう。し
かしながら、以下の記載および特殊な実施例は本発明の
好ましい具体例を示すものであって、単に説明している
にすぎないことを理解すべきである。開示された発明の
精神および観点内の様々な変化および修飾は、以下の記
載を読むこと、および、本開示物の他の部分を読むこと
から、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００２３】用語説明 以下に示す説明を、本明細書、特に実施例においてしば
しば用いられるある単語の理解を促進するために提供す
る。説明は簡便性のために提供するのであって、本発明
を限定しない。
【００２４】ＤＮＡの「消化」は、これに限定されない
が、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素のごとき
酵素でのＤＮＡの触媒分解をいう。本明細書中の様々な
制限酵素は市販されており、それらの制限条件、補酵
素、および、使用のための他の必要物は知られており、
当業者にとっては日常的である。
【００２５】解析目的には、典型的には、約２０μｌの
反応緩衝液中で１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を
約２ユニットの酵素で消化する。プラスミド構築のため
にＤＮＡ断片を単離する目的には、典型的には５ないし
５０μｇのＤＮＡをそれに比例した大きな体積中で２０
ないし２５０ユニットの酵素で消化する。特殊な制限酵
素のための適当な緩衝液および基質量は、以下に述べる
ごとき標準的な研究室マニュアルに記載されており、そ
れらはメーカーによって特定されている。
【００２６】３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、メーカー
のマニュアルおよび反応の詳細に従って多様であっても
よい。消化後、当業者にとって日常的なよく知られた方
法を用いて反応物を解析し、断片をアガロースまたはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製してもよ
い。
【００２７】「ジェネティックエレメント」は、一般
に、ポリペプチドをコードする領域、または、転写また
は翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重
要な他のプロセスを調節する領域を含んでなるポリヌク
レオチド、または、ポリペプチドをコードする領域、お
よび、それに作動可能に連結された発現を調節する領域
の両方を含んでなるポリヌクレオチドを意味する。
【００２８】ジェネティックエレメントは、エピソーム
・エレメント、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メソトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のごときものの中に取り込まれて
いてもよい。ジェネティックエレメントは、宿主細胞ゲ
ノム内に取り込まれていてもよいが、それは天然の状態
ではなく、むしろ以下の、単離、クローニングおよび、
とりわけ精製ＤＮＡの形態で、または、ベクターでの宿
主細胞への導入といった操作を受けている。
【００２９】単離とは、「人工的」によって天然状態か
ら変化させられていること、すなわち、天然において単
離される場合には、本来の環境から変化させられ、ある
いは本来の環境から除去されること、あるいはその両方
を意味する。例えば、天然状態の生きた動物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、天然状態における共存物質から分
離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、その語が本明細書で用いられる場合、「単離」され
ている。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離と
いう語は、それが天然に存在している染色体および細胞
から分離されていることを意味する。
【００３０】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、融合タンパク質を形成するための突然変異のため
に、および、宿主中での増殖または発現のために、かか
るポリヌクレオチドをＤＮＡのごとき他のポリヌクレオ
チドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチド
は、単独またはベクターのごとき他のポリヌクレオチド
と結合して、培養細胞または生物全体における宿主細胞
に導入されうる。培養または生物全体における宿主細胞
へ導入される場合、その語が本明細書において用いられ
る場合、かかるＤＮＡはやはり単離されており、なぜな
ら、それらは天然に存在する形態でなく、あるいは天然
環境に存在するものでないからである。同様に、ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、培地処方、ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入の
ための溶液、化学反応または酵素反応のための組成物ま
たは溶液のごとき組成物の中に存在してもよく、例え
ば、それらは天然には存在しない組成のものであり、そ
の中で単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは本明
細書にいう単離された状態のままである。
【００３１】「連結」とは、もっともしばしば２本鎖Ｄ
ＮＡである２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間の
ホスホジエステル結合形成プロセスをいう。連結方法は
当該分野においてよく知られており、連結方法は標準的
な研究室のマニュアル、および、例えば、以下に挙げる
Sambrookら、MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,
2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Sp
ring Harbor,New York(1989)およびManiatisら、pg.146
のごとき文献に記載されている。
【００３２】「オリゴヌクレオチド」とは比較的短いポ
リヌクレオチドをいう。しばしば、その用語は１本鎖デ
オキシリボヌクレオチドをいうが、よく１本鎖または２
本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドお
よびとりわけ２本鎖ＤＮＡをいうことがある。１本鎖Ｄ
ＮＡプローブオリゴヌクレオチドのごときオリゴヌクレ
オチドは、しばしば、自動オリゴヌクレオチド合成機の
使用のごとき、化学的方法により合成される。しかしな
がら、オリゴヌクレオチドは他の様々な方法により製造
することができ、それらはインビトロ組換えＤＮＡによ
る方法、および、細胞および生物におけるＤＮＡ発現に
よる方法を包含する。
【００３３】最初に、化学合成されたＤＮＡは典型的に
は５'リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリゴヌク
レオチドの５'末端は、組換えＤＮＡ分子を得るために
典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反応
によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。かか
るオリゴヌクレオチドの連結が所望の場合には、キナー
ゼおよびＡＴＰを用いるごとき標準的方法によりリン酸
を付加することができる。
【００３４】化学合成されたオリゴヌクレオチドの３'
末端は、一般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼのごときリガーゼの存在下、もう一つのオ
リゴヌクレオチドのごとき、もう一つのポリヌクレオチ
ドの５'リン酸とホスホジエステル結合を容易に形成す
るであろう。よく知られているごとく、所望により連結
の前に他のポリヌクレオチドの５'リン酸を除去するこ
とによって、この反応を選択的に阻害できる。
【００３５】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではない安定に存在するジェネティックエレメントで
ある。それらはＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなり、直鎖
または環状であってもよい。プラスミドは細胞の複製時
にそれの複製および安定な存在を確実にする分子をコー
ドしており、医学的、農学的、および環境学的に非常に
重要な産物をコードしているかもしれない。例えば、そ
れらは病原菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードす
る。それらはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子
をコードすることができる。プラスミドは、組換え遺伝
子をクローン化および発現するために用いられるベクタ
ーとして分子生物学において広く使用されている。プラ
スミドは、本明細書中一般に、当業者によく知られた慣
用的命名法により、大文字および／または数字が前およ
び／または後に続く小文字のｐにより命名される。本明
細書に開示の開始プラスミドは市販のもの、制限なく公
的に利用可能なものであるか、または、よく知られた公
表された方法を用いて利用可能なプラスミドから日常的
に構築可能なもののいずれかである。本発明により使用
可能な多くのプラスミドならびに他のクローニングおよ
び発現ベクターはよく知られており、当業者が容易に入
手できるものである。さらに、当業者は、本発明におけ
る使用に適する数多くのプラスミドを容易に構築するこ
とができる。本発明におけるかかるプラスミド同様他の
ベクターの性質、構築および使用は、本開示から当業者
に容易に明らかとなろう。
【００３６】一般に、「ポリヌクレオチド」とはポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
いい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡま
たはＤＮＡであってもよい。かくして、例えば、本明細
書の用語ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本
鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、
１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖
領域の混ざったＲＮＡ、１本鎖であるＤＮＡおよびＲＮ
Ａを含んでなるハイブリッド分子をいい、より典型的に
は、２本鎖のものまたは１本鎖および２本鎖領域の混ざ
ったものをいう。
【００３７】加えて、本明細書の用語ポリヌクレオチド
は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの
両方を含んでなる３本鎖領域をいう。かかる領域中の鎖
は同じ分子由来であってもよく、また異なる分子由来で
あってもよい。その領域は１つまたはそれ以上の分子の
全体を含んでいてもよいが、より典型的には、分子のい
くつかの領域のみを含む。３本鎖らせん領域の分子の１
つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。
【００３８】本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド
なる語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを包含する。かくして、安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡは、本明細書にいう「ポリヌクレオチド」であ
る。さらに、例えば２つの例を挙げるとイノシンまたは
トリチウム化されたような修飾塩基のごとき、異常塩基
を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡも本明細書にいうポリ
ヌクレオチドである。
【００３９】多種な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡについて
行われており、当業者に知られた多くの有用な目的を果
たしていることは明らかである。本明細書で用いるポリ
ヌクレオチドなる用語は、かかる化学的、酵素的、また
は代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、同様
に、特に、ウイルスおよび、単一および複合細胞を包含
する細胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を
包含する。
【００４０】本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以
下に説明するごときすべてのポリペプチドを包含する。
ポリペプチドの基本的構造はよく知られており、当該分
野の多数の教科書および他の刊行物に記載されている。
この点からすると、この用語は、ペプチド結合により互
いに直鎖状に結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を
含んでなるペプチドまたはタンパク質をいう。本明細書
において該用語は、例えば、当該分野において通常ペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともいわれる短
い鎖、および、当該分野において一般に、多くのタイプ
が存在するタンパク質といわれる長い鎖の両方をいう。
【００４１】ポリペプチドは、しばしば、一般に２０個
の天然アミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含んで
いること、および、プロセッシングおよび他の翻訳後修
飾のごとき天然プロセスのみならず当該分野でよく知ら
れた化学的修飾法によっても、末端アミノ酸を包含する
多くのアミノ酸を一定のポリペプチド中で修飾してもよ
いことが理解されよう。ポリペプチドにおいて自然に起
こる普通の修飾でさえも膨大すぎてここに列挙できない
が、それらは基本的な教科書およびさらに詳細な研究論
文、同様に、膨大な研究文献にも記載されており、それ
らは当業者によく知られている。
【００４２】本発明ポリペプチド中に存在してもよい既
知の修飾のうち少し例を挙げると、アセチル化、アシル
化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環
化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合に
よる架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの
形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシ
レーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質
分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移
−ＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付
加、および、ユビキチン化がある。
【００４３】かかる修飾は当業者によく知られており、
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
によく行われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質
付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシ
ル化、ヒドロキシル化、および、ＡＤＰ−リボシル化
は、例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPE
RTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Compan
y,New York(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載さ
れている。多くの詳細な総説がこの問題について利用で
き、例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEINS,B.C.Johnson,編,Academic Press,New Yo
rk(1983)中、Wold,F.、PosttranslationalProtein Modi
fications:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Sei
fterら、Analysis for protein modifications and non
protein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)お
よびRattmanら、Protein Synthesis: Posttranslationa
l Modifications and Aging. Ann. N.Y. Acad. Sci. 66
3:48-62(1992)によって提供されるものである。
【００４４】よく知られ、上記したごとく、ポリペプチ
ドは常に全体が直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果分
枝し、および、一般に、天然に起こるプロセッシングお
よび自然には起こらないヒトによる操作を包含する翻訳
後の出来事の結果として、それらは分枝ありまたはなし
で環状であってもよい。同様に非翻訳的天然プロセスお
よび全くの合成法によっても、環状、分枝および分枝環
状のポリペプチドが合成されてもよい。
【００４５】ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ
末端またはカルボキシル末端を包含する、ポリペプチド
のいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、ポ
リペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるいは
それら両方の共有結合の修飾によるブロックは、天然お
よび合成ポリペプチドにおいて共通であり、同様にかか
る修飾が本発明ポリペプチド中に存在してもよい。例え
ば、プロセッシングの前にE.coliにおいて作られるポリ
ペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なくＮ−ホ
ルミルメチオニンである。
【００４６】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、それがいかにして作られるのかということに関係
しているであろう。例えば、宿主中でクローン化された
遺伝子を発現することにより作られるポリペプチドに関
して、修飾の性質および程度の大部分は、宿主細胞での
翻訳後修飾能およびポリペプチドのアミノ酸配列に存在
する修飾シグナルによって決定されるであろう。例え
ば、よく知られているように、グリコシレーションはし
ばしばE.coliのごとき細菌宿主では起こらない。従っ
て、グリコシレーションが所望される場合には、ポリペ
プチドをグリコシレーションする宿主、一般には真核細
胞中で発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば哺
乳動物と同じ翻訳後グリコシレーションを行うので、昆
虫細胞発現系は、特に元来のグリコシレーションパター
ンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するため
に開発された。類似の考慮が他の修飾にも適用される。
【００４７】同じタイプの修飾が、一定のポリペプチド
においていくつかの部位において同じまたは様々な程度
に存在してもよいことが理解されよう。また、一定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
一般に、本明細書の用語ポリペプチドはかかる修飾すべ
てを包含し、詳細には、宿主細胞中でポリヌクレオチド
を発現させることにより合成されるポリペプチド中に存
在する修飾を包含する。
【００４８】ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
「変種」を、本明細書にて用いる場合、それは、各々、
もと（reference）のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは異なる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
をいう。この意味における変種は、本開示の以下の部分
およびいずれかの部分においてより詳細に説明される。
【００４９】（１）もう一つのもの、即ち、もとのポリ
ヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレ
オチド。一般に、相違はもとのヌクレオチド配列と変種
ヌクレオチド配列が全体的に極めて類似し、多くの領域
において同一であるようなものに限られる。
【００５０】下記のごとく、変種におけるヌクレオチド
配列の変化がサイレントであってもよい。すなわち、そ
れらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
を変化させなくてもよい。変化がこのタイプのサイレン
ト変化に限定される場合、変種はもとのポリペプチドと
同じアミノ酸配列をコードしているであろう。また、下
記のごとく、変種のヌクレオチド配列における変化が、
もとのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列を変化させたものであってもよい。下
記のごとく、かかるヌクレオチド変化は、結果としても
との配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸
置換、付加、欠失、融合および切断を引き起こしてもよ
い。
【００５１】（２）もう一つのもの、即ち、もとのポリ
ペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般
に、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が
全体的に極めて類似し、多くの領域において同一である
ようなものに限られる。変種およびもとのポリペプチド
とは、１個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合お
よび切断によりアミノ酸配列が異なっていてもよく、そ
れらはいずれの組み合わせにおいて存在してもよい。
【００５２】「融合タンパク質」：ＥＰ-Ａ-Ｏ ４６４
５３３（Canadian counterpart 2045869）は、もう一つ
のヒトタンパク質またはそれの一部と共に免疫グロブリ
ン分子の不変領域の種々の部分を含んでなる融合タンパ
ク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質における
Ｆｃ部分は、治療および診断における使用について非常
に有利であり、かくして、例えば、薬物動態学的性質が
改良される（ＥＰ-Ａ０２３２ ２６２）。一方、いくつ
かの使用においては、記載された有利な方法で融合タン
パク質が発現され、検出され、次いで精製された後、Ｆ
ｃ部分を検出できることが所望されるであろう。これ
は、治療および診断においての使用に対して妨害となる
ようにＦｃ部分を改良する場合であり、例えば、融合タ
ンパク質が免疫化のための抗原として使用されるべきで
ある場合である。例えば、薬物の発見において、ｓｈＩ
Ｌ５-αのごときヒトタンパク質は、ｈＩＬ-５のアンタ
ゴニストを同定するための高処理量のスクリーニングア
ッセイの目的でＦｃ部分と融合されている（D.Bennett
ら、Journal of Molecular Recognition, 8:52-58(199
5) およびK.Johansonら、The Journal of Biological C
hemistry, 270:16, pp9459-9471（1995）を参照のこ
と）。
【００５３】かくして、本発明は、ＨＣｇｐ３９−Ｌ、
またはその部分、および、種々のサブクラスの免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖また
は軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺伝子操作
された可溶性融合タンパク質にも関する。免疫グロブリ
ンとして好ましいのは、融合がヒンジ領域でおこったヒ
トのＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部分である。詳
細な具体例において、取り込まれ、Ｘａ因子で開裂でき
る開裂配列によってＦｃ部分が簡単な方法で除去されう
る。さらに、本発明は遺伝子操作によるこれらの融合の
製造方法、および、診断および治療に対するそれの使用
に関する。本発明のさらなる態様は、かかる融合タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００５４】融合タンパク質技術の他の例は、ＷＯ９４
／２９４５８およびＷＯ９４／２２９１４に見いだすこ
とができる。「結合分子」（そうでなければ「相互作用
分子」と称される）は、本発明ポリペプチドに特異的に
結合または相互作用する受容体または基質のごとき分子
をいう。アポトーシスを増強または阻害する他の因子、
補酵素、本発明アポトーシスポリペプチド内のユニット
またはサブユニットが結合分子の定義内に包含される。
かかる結合分子は本発明の一部である。結合分子は、本
発明ポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体由
来試薬のごとき非天然物であってもよい。
【００５５】ポリヌクレオチド配列中の「Ｎ」は、その
ヌクレオチドでのアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グ
アニン（Ｇ）またはチミジン（Ｔ）のいずれをも意味す
る。
【００５６】
【発明の実施の形態】本発明は、新規ＨＣｇｐ３９−Ｌ
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、特に以下に詳細
に記載するものに関する。詳細には、本発明は、新規Ｈ
Ｃｇｐ３９−Ｌのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
に関し、それはＨＣｇｐ３９ポリペプチドに相同的アミ
ノ酸配列により関係している。本発明は、特に、図１な
いし４に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有
するＨＣｇｐ３９−Ｌに関し、それらはお互いのスプラ
イス変種である。図１ないし４に示すヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列は、寄託クローンのｃＤＮＡを配列
決定することにより得られた。これゆえ、寄託クローン
の配列は、図１ないし４に開示された配列間の矛盾に関
して制御しており、図１ないし４の配列との照合は、寄
託クローンのヒトｃＤＮＡの配列との照合を包含する。
【００５７】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図１および２または図３
および４の推定アミノ酸配列を有するＨＣｇｐ３９−Ｌ
ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供
する。図１および２または図３および４に示すポリヌク
レオチド配列のごとき本明細書開示の情報を用いて、ヒ
ト胸腺からの細胞を出発物質として得られるｍＲＮＡを
用いるｃＤＮＡクローニングのための方法のごとき、標
準的クローニングおよびスクリーニング法を用いて、Ｈ
Ｃｇｐ３９−Ｌポリペプチドをコードしている本発明ポ
リヌクレオチドを得ることができる。本発明の説明とし
て、図１および２または図３および４に示すポリヌクレ
オチドは、発現配列タグ（ＥＳＴ）解析を用いたヒト胸
腺の細胞由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて見いださ
れる（Adams, M. D.ら、(1991), Science 252:1651-165
6; Adams, M. D.、(1992), Nature 355:632-634; Adam
s, M. D.ら、 (1995), Nature 377 Supp，3-174を参照
のこと）。
【００５８】ＨＣｇｐ３９−ＬのｃＤＮＡ配列は図１な
いし４（配列番号：１および３）に示される。それらは
推定分子量約３９および４０ｋＤａの３８５および４１
６アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを含有する。そのタンパク質は既知の
タンパク質の中でＨＣｇｐ３９タンパク質に非常に高い
相同性を示す。図１および２のＨＣｇｐ３９−Ｌは、ｋ
ＨＣＧＰ３９ＤＮＡおよびタンパク質配列に対して各々
約５５％および５１％同一性を有する。
【００５９】本発明ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのご
ときＲＮＡの形態であってもよく、または、例えばクロ
ーニングまたは化学合成法またはそれらの組み合わせに
より得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤ
ＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは２本鎖または１本
鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても知
られるコーディング鎖であってもよく、または、アンチ
−センス鎖としてもいわれる非コーディング鎖であって
もよい。
【００６０】ポリペプチドをコードしているコーディン
グ配列は、図１および２または図３および４（配列番
号：１または３）に示すポリヌクレオチドのコーディン
グ配列と同じであってもよい。それは、別の配列を有す
るポリヌクレオチドであってもよく、それは、遺伝コー
ドの重複（縮重）の結果として図１および２または図３
および４（配列番号：２または４）のポリペプチドをコ
ードしているものであってもよい。
【００６１】図１および２または図３および４のポリペ
プチドをコードしている本発明ポリヌクレオチドは、成
熟ポリペプチドそれ自体に関するコーディング配列；成
熟ポリペプチドのコーディング配列、および、プレ−ま
たはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列のごとき、
リーダー配列または分泌配列をコードするごとき、付加
的コーディング配列；転写、例えば、スプライシングお
よびポリアデニル化シグナルを包含するｍＲＮＡプロセ
ッシング、例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡ安定
性において役割を果たす、転写されるが翻訳されない配
列のごとき、イントロンおよび非コーディング５’およ
び３’配列を包含するがこれに限定されない付加的非コ
ーディング配列を有する、前述の付加的コーディング配
列ありまたはなしの成熟ポリペプチドのコーディング配
列；付加的官能基を提供するごとき付加的アミノ酸をコ
ードしている付加的コーディング配列を包含してもよい
が、これに限定されない。かくして、例えば、ポリペプ
チドが、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドの
ごときマーカー配列に融合していてもよい。本発明のこ
の態様のある好ましい具体例において、マーカー配列
は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,Inc）中のタグのごと
きヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くが市
販されている。例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA 86,821-824(1989)に記載のごとく、ヘキサヒス
チジンは融合タンパク質の精製を便利にする。ＨＡタグ
はインフルエンザ・赤血球凝集素タンパク質由来のエピ
トープに対応するものであり、例えば、Wilsonら、Cell
37:767(1984)に記載されている。かくして、図５およ
び６の配列番号：５に示すごときＨＣｇｐ３９−Ｌのゲ
ノムポリヌクレオチド配列を提供することが本発明の目
的である。
【００６２】前記によれば、本明細書にて用いる場合の
「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」な
る語は、本発明のポリペプチド、詳細には、図１および
２または図３および４に示すアミノ酸配列を有するＨＣ
ｇｐ３９−Ｌをコードしている配列を含むポリヌクレオ
チドを包含する。該用語は、コーディングおよび／また
は非コーディング配列を含んでいてもよい、さらなる領
域を伴ったポリペプチド（例えば、イントロンにより分
断されている）をコードしている単一の連続領域または
不連続領域を含むポリヌクレオチドも包含する。
【００６３】さらに本発明は、図１および２または図３
および４の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの断
片、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書中の
上記ポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチ
ドの変種は、天然に存在する対立遺伝子変種のごとき天
然に存在する変種であってもよく、あるいは、天然に存
在することが知られていない変種であってもよい。かか
るポリヌクレオチドの非天然変種を、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に適用される突然変異法を包含する
突然変異法により製造してもよい。
【００６４】この点における変種の中には、ヌクレオチ
ド置換、欠失または付加による前述のポリヌクレオチド
と異なる変種がある。置換、欠失または付加には１個ま
たはそれ以上のヌクレオチドが関与しているかもしれな
い。変種は、コーディング配列または非コーディング配
列あるいはそれらの両方において変化していてもよい。
コーディング配列の変化により、保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠失または付加を生じてもよい。
【００６５】この点において本発明の特に好ましい具体
例は、図１および２または図３および４に示すＨＣｇｐ
３９−Ｌのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチド；その変種、アナログ、誘導
体および断片、および、その変種、アナログおよび誘導
体の断片である。
【００６６】さらに、この点において、図１および２ま
たは図３および４のＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドのア
ミノ酸配列を有する、ＨＣｇｐ３９−Ｌ変種、アナロ
グ、誘導体および断片、ならびに、その断片の変種、ア
ナログおよび誘導体をコードしているポリヌクレオチド
が特に好ましく、該アミノ酸中、いくつかの、少数の、
５ないし１０個、１ないし５個、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加され
ており、あるいはそれらが組み合わされている。これら
のうち特に好ましいのは、ＨＣｇｐ３９−Ｌの特性およ
び活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失
である。またこの点において、保存的置換が特に好まし
い。置換を有しない図１および２または図３および４の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドが最も好ましい。
【００６７】本発明のさらに好ましい具体例は、図１お
よび２または図３および４に示すアミノ酸配列を有する
ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレ
オチド、および、かかるポリヌクレオチドに相補的なポ
リヌクレオチドである。あるいはまた、寄託クローンの
ヒト・ｃＤＮＡのＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一
である領域を含んでなるポリヌクレオチド、および、そ
れに相補的なポリヌクレオチドがもっとも高度に好まし
い。この点において、同じポリペプチドに対して少なく
とも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好まし
く、これらのうちでも特に好ましいのは、少なくとも９
５％同一のものである。さらに、少なくとも９５％同一
のものの中でも少なくとも９７％同一のものが非常に好
ましく、その中でも少なくとも９８％同一のものおよび
少なくとも９９％同一のものが特に非常に好ましく、少
なくとも９９％のものがより好ましい。
【００６８】さらに、この点において特に好ましい具体
例は、図１および２または図３および４のｃＤＮＡによ
りコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学
的機能または活性を保持しているポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドである。
【００６９】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てさらに本明細書で議論するように、例えば、上記本発
明ポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＨＣｇ
ｐ３９−Ｌをコードしている完全長のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離、および、ＨＣｇｐ３９−Ｌ遺伝子
に対して高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離してもよい。一般的に
は、かかるプローブは少なくとも１５個のヌクレオチド
を含んでなるであろう。好ましくは、かかるプローブは
少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、５
０個またはそれ以下のヌクレオチドを有するであろう。
【００７０】例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合
成するための既知ＤＮＡ配列を用いたスクリーニングに
よって、ＨＣｇｐ３９−Ｌ遺伝子のコーディング領域を
単離してもよい。次いで、本発明遺伝子配列に相補的な
配列を有するラベルされたオリゴヌクレオチドを用い
て、ヒト・ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライ
ブラリーをスクリーニングして、ライブラリーのどのメ
ンバーがそのプローブにハイブリダイゼーションするの
かを決定する。
【００７１】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを、ポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書でさ
らに議論するごとく、ヒトの疾病の治療および診断の発
見のための研究試薬および材料として用いてもよい。
【００７２】ポリヌクレオチドは、当該成熟タンパク質
およびさらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ
酸、あるいは成熟ポリペプチドに対する内部アミノ酸
（例えば、成熟形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を
有する場合）であるポリペプチドをコードしていてもよ
い。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質の
プロセッシングにおいて役割を果たしており、タンパク
質輸送を促進し、タンパク質半減期を延長または短縮
し、あるいは特に、アッセイまたは製造のためのタンパ
ク質の取り扱いを容易にするかもしれない。in situに
おける一般的な場合には、細胞酵素によりさらなるアミ
ノ酸がプロセッシングにより成熟タンパク質から除去さ
れてもよい。
【００７３】１つまたはそれ以上のプロ配列に融合した
成熟形態のポリペプチドを有する前駆体タンパク質は、
そのポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配
列が除去されると、一般的にはかかる不活性前駆体が活
性化される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化
前に除去されるかもしれない。一般に、かかる前駆体は
プロタンパク質と呼ばれる。
【００７４】要約すれば、本発明のポリヌクレオチド
は、成熟タンパク質、成熟タンパク質＋リーダー配列
（プレタンパク質と呼んでもよい）、プレタンパク質の
リーダー配列でない１個またはそれ以上のプロ配列を有
する成熟タンパク質の前駆体、あるいは、一般にポリペ
プチドの活性および成熟形態を生じるプロセッシング工
程の間に除去されるリーダー配列および１個またはそれ
以上のプロ配列を有する、プロタンパク質に対する前駆
体であるプレプロタンパク質をコードしていてもよい。
【００７５】ポリペプチド 本発明は、さらに図１および２または図３および４（配
列番号：２または４）の推定アミノ酸配列を有するＨＣ
ｇｐ３９−Ｌポリペプチドに関する。
【００７６】本発明は、これらのポリペプチドの断片、
アナログおよび誘導体にも関する。「断片」、「誘導
体」および「アナログ」なる用語は、図１および２また
は図３および４のポリペプチドについて言う場合、かか
るポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性
を保持しているポリペプチド、即ち、ＨＣｇｐ３９−Ｌ
のごとく機能する、または、たとえそのポリペプチドが
ＨＣｇｐ３９−Ｌのごとく機能しなくても結合分子に結
合する能力を保持しているポリペプチドを意味する。か
くして、アナログは、プロタンパク質部分の開裂により
活性化されて活性成熟ポリペプチドを生じうるプロタン
パク質を包含する。
【００７７】本発明ポリペプチドは、組換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペ
プチドは組換えポリペプチドである。
【００７８】図１および２または図３および４のポリペ
プチドの断片、誘導体またはアナログは、（ｉ）１個ま
たはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的ア
ミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換
されており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによ
りコードされているものであっても、なくてもよいも
の、あるいは（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残
基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）ポリペプチ
ドの半減期を延長させる化合物（例えばポリエチレング
リコール）のごときもう一つの化合物に成熟ポリペプチ
ドが融合しているもの、あるいは（ｉｖ）リーダーまた
は分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に用いられ
る配列、またはプロタンパク質配列のごとき、さらなる
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであっ
てもよい。かかる断片、誘導体およびアナログは、本明
細書の教示から当業者の観点の範囲内であると考えられ
る。
【００７９】この点において、図１および２または図３
および４に示すＨＣｇｐ３９−Ｌのアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体および断
片、ならびに該断片の変種、アナログおよび誘導体は、
本発明の特に好ましい具体例に属する。さらに、この点
において本発明の特に好ましい具体例は、ＨＣｇｐ３９
−Ｌの活性／機能を保持している、ＨＣｇｐ３９−Ｌの
アミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナロ
グ、誘導体および断片、ならびに該断片の変種、アナロ
グおよび誘導体である。
【００８０】保存的アミノ酸置換によって元のものから
変化した変種も好ましい変種に属する。かかる置換は、
ポリペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミ
ノ酸で置換したものである。保存的置換として典型的に
見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
およびＩｌｅ間での相互置換；水酸基を有するＳｅｒお
よびＴｈｒの相互置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの
相互置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩
基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの相互置換、ならびに芳香
族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換である。
【００８１】さらにこの点において特に好ましいのは、
いくつかの、少数の、５ないし１０個の、１ないし５個
の、１ないし３、２、１個の、または０個のアミノ酸残
基が置換、欠失または付加されているか、それらのいず
れかの組み合わせを有する、図１および２または図３お
よび４のＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列
を有する変種、アナログ、誘導体および断片、ならびに
該断片の変種、アナログおよび誘導体である。これらの
うち特に好ましいのは、ＨＣｇｐ３９−Ｌの性質および
活性を変化させない置換、付加および欠失である。また
この点において、保存的置換が特に好ましい。もっとも
高度に好ましいのは、置換のない図１および２または図
３および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。
【００８２】好ましくは、本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均
一に精製されている。本発明のポリペプチドは、配列番
号：２または４のポリペプチド（詳細には成熟ポリペプ
チド）同様に、配列番号：２または４のポリペプチドに
対して少なくとも８０％同一性を有し、より好ましくは
配列番号：２または４のポリペプチドに対して少なくと
も９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の
同一性）を有し、さらにより好ましくは配列番号：２ま
たは４のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似
性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有す
るポリペプチドを包含し、また、一般に少なくとも３０
個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個のアミ
ノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を有するかかるポ
リペプチドの部分も包含する。
【００８３】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列およびある
ポリペプチドの２番目のポリペプチドの配列に対する保
存的アミノ酸置換を比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２つの鎖の間の一致の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合いを意味す
る「同一性」も当該分野において知られている。同一性
および類似性は共に容易に計算できる（Computational
Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford Universit
y Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics
and Genome Projects, Smith,D. W.編,Academic Pres
s, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence D
ata, Part I, Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編,
Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis
in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Pr
ess, 1987; およびSequence Analysis Primer, Gribsko
v, M. and Devereux, J.編, M Stockton Press, New Yo
rk, 1991）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド配列間の同一性および類似性を測定するための多くの
方法が存在する一方、「同一性」および「類似性」なる
用語は当業者によく知られている（Carillo,H.およびLi
pman, D.、SIAM J. Applied Math. 48:1073(1988)）。
一般に２つの配列間の同一性または類似性を決定するた
めに用いられる方法は、これに限定されないが、Guide
to Huge Computers, Martin j. Bishop編, Academic Pr
ess, San Diego, 1994, およびCarillo,H.および Lipma
n, D.、SIAM J. Applied Math.48:1073（1988）に開示
されている。同一性を決定する好ましい方法は、試験す
る２つの配列間に最大の一致を与えるようにデザインさ
れている。同一性および類似性を決定する方法はコンピ
ュータープログラムに書き込まれている。２つの配列間
の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータ
ープログラムの方法は、これに限定されないが、GCG pr
ogram package（Devereux, J.ら、NucleicAcids Resear
ch 12（1）：387（1984）, BLASTP, BLASTN, FASTA（At
schul, S.f.ら、J. Molec. Biol. 215:403（1990））を
包含する。
【００８４】本発明ポリペプチドの断片または部分を、
ペプチド合成による対応する完全長のポリペプチドの合
成に使用してもよく；従って、断片を完全長のポリペプ
チドの製造のための中間体として使用してもよい。本発
明ポリヌクレオチドの断片または部分を用いて本発明の
完全長のポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００８５】断片は、「フリー−スタンディング（free
-standing）」、すなわち、他のアミノ酸またはポリペ
プチドの一部でなく、または、それらに融合しておら
ず、あるいは、かかる断片が大きなポリペプチド中に含
まれていてその一部分または領域となっていてもよい。
大きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中
の断片は、最も好ましくは単一の連続した領域を形成す
る。しかしながら、いくつかの断片が、単一のより大き
なポリペプチド中に含まれていてもよい。例えば、特定
の好ましい具体例は、宿主中での発現のためにデザイン
された前駆体ポリペプチド中に含まれていて、ＨＣｇｐ
３９−Ｌ断片のアミノ末端に融合した異種プレおよびプ
ロ−ポリペプチド領域、および、該断片のカルボキシル
末端に融合したさらなる領域を有している、本発明ＨＣ
ｇｐ３９−Ｌポリペプチド断片に関する。従って、本明
細書における意味の１つの態様において、断片は、ＨＣ
ｇｐ３９−Ｌ由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパ
ク質の一部または部分をいう。
【００８６】本発明ポリペプチド断片の典型例として、
長さが約５ないし１５個、１０ないし２０個、１５ない
し４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５個、４１
ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし１００
個、７５ないし１００個、９０ないし１１５個、１００
ないし１２５個、および１１０ないし１１３個のアミノ
酸のものを挙げることができる。
【００８７】この文脈において、約とは、特に列挙した
範囲、ならびに数個、少数、５、４、３、２、１個のア
ミノ酸の分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限
または下限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。
例えば、この文脈において、約４０ないし９０個のアミ
ノ酸は、４０プラスマイナス数個、少数、５、４、３、
２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスマイナス数
個、少数、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基までの
ポリペプチド断片を意味し、すなわち、広くは４０マイ
ナス数個のアミノ酸から９０プラス数個のアミノ酸、狭
くは４０プラス数個のアミノ酸から９０マイナス数個の
アミノ酸の範囲である。
【００８８】この点において好ましくは、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲において、列挙した範
囲プラスまたはマイナス５個程度のアミノ酸である。上
限または下限、あるいはそれらの両方の範囲において、
列挙した範囲プラスまたはマイナス３個程度のアミノ酸
が特に非常に好ましい。上限または下限、あるいはそれ
らの両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマ
イナス１個程度のアミノ酸、または列挙した範囲に付加
または欠失のないものが特に非常に好ましい。この点に
おいて、約５ないし１５個、１０ないし２０個、１５な
いし４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５個、４
１ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし１００
個、７５ないし１００個、９０ないし１１５個、１００
ないし１２５個、および１１０ないし１１３個のアミノ
酸の長さの断片が、すべてのうちで最も好ましい。
【００８９】ＨＣｇｐ３９−Ｌの切断された変異種は本
発明の特に好ましい断片に含まれる。切断された変異種
は、図１および２または図３および４のアミノ酸配列を
有するＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチド、または、その変
種または誘導体を包含するが、アミノ末端を含む連続し
た一連の残基（すなわち、連続した領域、部分または一
部分）の欠失、または、カルボキシル末端を含む連続し
た一連の残基の欠失、あるいは、１つはアミノ末端を含
み、もう１つはカルボキシル末端を含む、二重切断変異
種中にあるような２つの連続した残基の欠失は除く。概
略した大きさの断片も切断された断片の好ましい具体例
であり、一般に、それらは断片のなかでも特に好ましい
ものである。
【００９０】本発明のこの態様において、ＨＣｇｐ３９
−Ｌの構造的または機能的属性によって特徴づけられる
断片も好ましい。この点において本発明の好ましい具体
例は、ＨＣｇｐ３９−Ｌのアルファ−ヘリックスおよび
アルファ−ヘリックス形成領域（「アルファ−領
域」）、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域
（「ベータ−領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、アル
ファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可動性領域、
表面形成領域および高抗原性インデックス領域を含んで
なる断片を包含する。
【００９１】これらの点において、前記するいくつかの
特徴のごとき、いくつかの構造的特徴を組み合わせたＨ
Ｃｇｐ３９−Ｌの領域を含んでなる断片が大変好まし
い。この点において、図１および２または図３および４
の約１０ないし約２０個、約４０ないし約５０個、約７
０ないし約９０個、および約１１０ないし約１１３個の
残基によって定義される領域が特に好ましい領域であ
り、それらはすべて、ターン領域、親水性領域、可動性
領域、表面形成領域および高抗原性インデックス領域の
高度に特徴的なアミノ酸組成物によって特徴づけられ
る。かかる領域はより大きなポリペプチド中に含まれて
いてもよく、あるいは前記のごとくそれら自体本発明の
好ましい断片でありうる。この段落の「約」なる語は、
一般的な断片に関して前記した意味を有することが理解
されよう。
【００９２】さらに好ましい領域はＨＣｇｐ３９−Ｌの
活性を媒介する領域である。この点において、ＨＣｇｐ
３９−Ｌの化学的、生物学的活性または他の活性を有
し、類似活性または改善された活性を包含、望ましくな
い活性は減じられている断片が最も好ましい。この点に
おいて、Ｈｃｇｐ３９の関連ポリペプチドのごとき、関
連ポリペプチドの活性領域に対して配列または位置、あ
るいは両方が相同的である領域を含む断片が非常に好ま
しい。これらの点において、前記の切断された変異体が
特に好ましい断片である。
【００９３】本発明は、特に、前記した断片をコードし
ているポリヌクレオチド、該断片をコードしているポリ
ヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレ
オチド、詳細には厳密な条件下でハイブリダイゼーショ
ンするもの、および該断片をコードしているポリヌクレ
オチドを増幅するためのＰＣＲプライマーのごときポリ
ヌクレオチドにも関することが理解されよう。これらの
点において、好ましいポリヌクレオチドは、前記のよう
な好ましい断片に対応するポリヌクレオチドである。
【００９４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本
発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞および
組換え法による本発明ポリペプチドの製造にも関する。
【００９５】宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチ
ドを取り込ませ、本発明ポリペプチドを発現させること
ができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェクシ
ョン、トランスベクションおよび形質転換といったよく
知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主細胞中
に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他の
ポリヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他の
ポリヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個
に、同時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合さ
せて導入してもよい。
【００９６】かくして、例えば、哺乳動物細胞において
同時トランスフェクションおよび選択のための標準的方
法を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを選択可
能マーカーをコードしているもう１つの別個のポリペプ
チドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしても
よい。この場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞
ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。
【００９７】別法として、宿主中での増殖についての選
択可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結
合させてもよい。前記した方法により、ベクター構築物
を宿主細胞中に導入してもよい。一般にプラスミドベク
ターは、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるい
は荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入される。エ
レクトロポレーションを用いてポリヌクレオチドを宿主
に導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、そ
れをインビトロでパッケージングし、または、パッケー
ジング細胞中に導入することができ、パッケージングさ
れたウイルスを細胞中に形質導入してもよい。本発明の
この態様によるポリヌクレオチドの製造および細胞中へ
のポリヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は当業
者によく知られており、日常的なものである。かかる方
法は、前記したSambrookらにおいて総説されており、そ
の文献はこれらの方法を詳述する多くの研究室マニュア
ルを説明している。
【００９８】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、細胞中へのＤＮＡおよびＲＮＡ導入のためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチドとして、好まし
くはＤＮＡとして細胞中に導入してもよい。ファージお
よびウイルスベクターの場合、感染および形質導入のた
めのよく知られた方法によって、ベクターを、好ましく
はパッケージングされ、または、封入されたウイルスと
して細胞中に導入してもよい。ウイルスベクターは複製
可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者の
場合、一般にウイルス増殖は相補的宿主細胞においての
み起こるであろう。
【００９９】特定の態様において、本発明のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの発現用ベクターがベクター
の中でも好ましい。一般に、かかるベクターは、発現さ
れるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された宿主
中での発現に効果的なシス−作用性制御領域を含んでな
る。適当なトランス−作用性因子は、宿主、または、相
補的ベクター、または、宿主中への導入によりベクター
自身のいずれかによって提供される。
【０１００】この点における特定の好ましい具体例にお
いて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的
発現は誘導可能な発現であってもよく、またはある種の
タイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよく、
または誘導可能および細胞特異的の両方であってもよ
い。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境因子
によって発現のために誘導されうるベクターが、特に好
ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核細
胞宿主において使用される構成的発現ベクターおよび誘
導可能発現ベクターを包含する、本発明のこの態様に適
した種々のベクターは当業者によく知られており、日常
的に使用されている。
【０１０１】遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な栄養
培地で培養することができ、特にプロモーターの活性
化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関して、
適宜、培地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主
細胞と共にあらかじめ使用される温度、ｐＨ等の培養条
件は、当業者に明らかであるように、一般に本発明のポ
リペプチドの発現に適するであろう。
【０１０２】非常に多種にわたる発現ベクターを用い
て、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
かかるベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス
由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテ
リオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エ
レメント由来のベクター、バキュロウイルスのごときウ
イルス、ＳＶ４０のごときパポーバウイルス、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイル
ス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス、ならび
に、コスミドおよびファージミドのごときプラスミドお
よびバクテリオファージの遺伝エレメント由来のベクタ
ーのごときそれらの組み合わせ由来のベクターを包含
し、それらすべてを本発明のこの態様による発現に使用
してもよい。この点において、一般に、宿主中でポリペ
プチドを発現するためのポリヌクレオチドを維持、増殖
または発現するのに適したベクターを発現に用いること
ができる。
【０１０３】種々のよく知られた日常的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入するこ
とができる。一般に、ＤＮＡ配列および発現ベクターを
１種またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで開裂さ
せ、次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限断片を
結合させることにより、発現させるＤＮＡ配列を発現ベ
クターに結合させる。この目的に用いることのできる制
限的開裂および連結の手順は当業者によく知られてお
り、日常的なものである。この点において、別法を用い
る発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者によ
く知られており、日常的なものであり、本明細書の他の
場所で引用しているSambrook et al.の文献に非常に詳
細に説明されている。
【０１０４】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを包含する、適当
な発現制御配列に作動可能に連結する。かかるプロモー
ターの典型例は、ファージラムダＰＬプロモーター、E.
coli lac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期お
よび後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲｓ
のプロモーターを包含するが、それらはよく知られてい
るプロモーターのほんの例示に過ぎない。ここで述べな
かった多くのプロモーターも本発明のこの態様における
使用に適し、それらは当業者によく知られており、本明
細書の議論および実施例によって説明されるようにして
容易に使用されうることが理解されるであろう。
【０１０５】一般に、発現構築物は、転写開始部位およ
び停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリボソー
ム結合部位を含むであろう。構築物により発現される成
熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべきポリペ
プチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、および終わり
の部分に適当に位置している終止コドンを含むであろ
う。
【０１０６】さらに構築物は、発現を調節ならびに発生
させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの通
常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、リプレ
ッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写調節に
より作動するであろう。
【０１０７】一般に、増殖および発現のためのベクター
は選択可能マーカーを含むであろう。かかるマーカーは
増幅に適していてもよく、または、そのベクターはこの
目的のためにさらなるマーカーを含んでいてもよい。こ
の点において、好ましくは、発現ベクターは１個または
それ以上の選択可能マーカー遺伝子を有しており、形質
転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供
するものである。好ましいマーカーは、真核培養細胞用
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、E.co
liおよび他の細菌培養用のテトラサイクリンまたはアン
ピシリン耐性遺伝子を包含する。
【０１０８】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、本明細書のいずれかで記載
したように、適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモー
ター、さらに他の適当な制御配列を含むベクターを適当
な宿主中に導入してもよい。適当な宿主の代表例は、E.
coli、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞
のごとき細菌細胞；酵母細胞のごとき真菌細胞；Drosop
hila S2およびSpodoptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；
ＣＨＯ、ＣＯＳおよびBowesメラノーマ細胞のごとき動
物細胞；ならびに植物細胞を包含する。多種の発現構築
物用宿主がよく知られており、当業者は本開示により本
発明のこの態様によるポリペプチドの発現のための宿主
を容易に選択することができよう。
【０１０９】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の前記した配列を含んでなる。構築物は、本発明の
かかる配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベク
ターのごときベクターを含んでなる。その配列を順方向
または逆方向に挿入することができる。この点におい
て、特定の好ましい具体例において、構築物はさらに、
例えば、該配列に作動可能に連結されたプロモーターを
包含する調節配列を含んでなる。多数の適当なベクター
およびプロモーターが当業者に知られており、本発明に
おける使用に適した多くのベクターが市販されている。
【０１１０】市販されている後記のベクターを例示す
る。それらのうち、細菌での使用に適するベクターは、
Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０お
よびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、ｐＢ
Ｓベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されている、ｐ
ｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５である。好ましい真核細胞ベ
クターには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥＯ、ｐＳ
Ｖ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；なら
びに、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐ
ＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクターは、多
くの市販ベクター、および、本発明のこの態様により使
用するために当業者によく知られたベクターを例示する
ためにのみ列挙する。例えば、宿主中における本発明ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖
または発現に適する他のプラスミドまたはベクターを本
発明のこの態様に使用してもよいことが理解されよう。
【０１１１】制限部位、または、候補プロモーター断
片；すなわち、プロモーターを含んでいるかもしれない
断片を導入するための部位の下流の、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニッ
トのごとき、プロモーター領域を欠くレポーター転写ユ
ニットを含むベクターを用いて、プロモーター領域をい
ずれの所望遺伝子からも選択できる。よく知られている
ごとく、プロモーター含有断片をベクター中のｃａｔ遺
伝子上流の制限部位へ導入することにより、ＣＡＴ活性
を生じさせ、それを標準的ＣＡＴアッセイにより検出す
ることができる。この目的に適するベクターはよく知ら
れており、容易に入手できる。２種のかかるベクターは
ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。かくして、本
発明ポリヌクレオチドの発現用のプロモーターはよく知
られていて容易に入手できるプロモーターだけでなく、
レポーター遺伝子を用いて上記方法により容易に得るこ
とのできるプロモーターも包含する。
【０１１２】E.coli lacIおよびlacZプロモーターおよ
びT3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダP
R、PLプロモーター、ならびにtrpプロモーターは、本発
明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に
適した既知細菌プロモーターに属する。
【０１１３】この点において適する知られている真核細
胞プロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、Ｈ
ＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期Ｓ
Ｖ４０プロモーター、Rousサルコーマウイルス（ＲＳ
Ｖ）のごときレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーター、
ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターの
ごときメタロチオネインプロモーターがある。
【０１１４】宿主細胞中での発現に適するベクターおよ
びプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現
ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主
における発現に関する精妙な方法は、当業者にとって日
常的なものである。本発明は、前記の構築物を含む宿主
細胞にも関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のごとき高
等真核細胞、または、酵母細胞のごとき下等真核細胞で
あってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごとき原核
細胞であってもよい。
【０１１５】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、陽イオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染
または他の方法により、宿主細胞中への構築物の導入を
行うことができる。かかる方法は、Davisら、BASIC MET
HODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)のごとき多くの標準
的研究室マニュアルに記載されている。
【０１１６】宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、
組換え配列によりコードされた遺伝子産物を製造するこ
とができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置によ
り本発明ポリペプチドを合成的に製造することもでき
る。
【０１１７】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において成熟蛋白を
発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物由来の
ＲＮＡを用いて、かかるタンパク質を製造するために無
細胞翻訳系を用いることもできる。原核宿主および真核
宿主とともに使用に適するクローニングおよび発現ベク
ターは、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATOR
Y MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989)により記載さ
れている。
【０１１８】一般に、組換え発現ベクターは、複製開始
点、下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来
のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクタ
ー含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含む
であろう。特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクター、酸ホスフ
ァターゼ、および熱ショックタンパク質をコードしてい
る遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーターであ
る。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐性遺
伝子およびS.cerevisiaeのｔｒｐ１遺伝子を包含する。
【０１１９】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、高等真核細胞による本発明のポリペプチド
をコードしているＤＮＡの転写を増大させることができ
る。エンハンサーは、普通、約１０ないし３００ｂｐの
ＤＮＡのシス−作用性エレメントであり、特定の宿主細
胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増大するよ
うに作用する。エンハンサーの例は、複製開始点の後期
側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハン
サー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【０１２０】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードしている本発明のポリヌクレオチドを、発
現用プロモーターに作動可能に連結されるように標準的
方法を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリ
ボソーム結合部位の５'付近に位置するようにポリヌク
レオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現され
るポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５'にある。
一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始まる他の
読み枠、および、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの
間に位置する読み枠は存在しないであろう。また、一般
に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが存在し、転写
される領域の３'末端に適当に散在するポリアデニル化
シグナルおよび転写終止シグナルが存在するであろう。
【０１２１】翻訳されたタンパク質の小胞体ルーメン
中、ペリプラスム空間中または細胞外環境中への分泌の
ために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド
中に取り込ませてもよい。シグナルは、ポリペプチドに
対して内在性のものであってもよく、あるいは異種シグ
ナルであってもよい。
【０１２２】ポリペプチドを、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみ
ならずさらなる異種機能領域を含んでいてもよい。かく
して、例えば、付加的アミノ酸の領域、詳細には荷電ア
ミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、宿主
細胞における精製中またはさらなる取り扱いおよび保存
中の安定性および維持性を改善してもよい。また、精製
を容易にする領域をポリペプチド付加してもよい。最終
的なポリペプチドの調製の前にかかる領域を除去しても
よい。特に、分泌または外分泌を引き起こすための、安
定性を改善するための、そして精製を容易にするための
ペプチド部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知
られている日常的方法である。
【０１２３】本発明によるポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、
Escherichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonell
a typhimuriumを包含する。Pseudomonas、Streptomyces
およびStaphylococcusの種々の種は、この点において適
当な宿主である。さらに、この点において、当業者に知
られている他の多くの宿主も使用可能である。
【０１２４】典型的であるが限定的でないものとして、
例えば、細菌用途の有用な発現ベクターは、選択可能マ
ーカー、および、よく知られたクローニングベクターｐ
ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝学的エレメン
トを含んでなる市販プラスミド由来の細菌の複製開始点
を含んでなる。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ
２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Swed
en）およびＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison,WI,US
A）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を
適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と組み合
わせる。
【０１２５】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤に曝露）によりそれを誘導し、さ
らに適当時間細胞を培養する。次いで、典型的には、細
胞を遠心分離により集め、物理的または化学的手段によ
り破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製に供する。
【０１２６】凍結−融解の繰り返し、超音波処理、機械
的破壊、または細胞溶解剤の使用を包含する慣用的方法
により、タンパク質発現に使用する微生物細胞を破壊す
ることができ、かかる方法は当業者によく知られてい
る。同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用す
ることができる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman et a
l.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓線維芽細
胞ＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合するベクターを発
現させうる他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、
ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢＨＫ細胞
系を包含する。
【０１２７】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、および、必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、およ
び、発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んでな
るであろう。この点における特定の好ましい具体例にお
いて、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位が、これらのタイプの所
望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。
【０１２８】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドを組換え
細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好
ましくは、高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を精製に用いる。単離または精製中にポリペプチドが変
性している場合には、タンパク質の再折り畳みのための
よく知られた方法を用いて活性コンフォメーションを再
生することができる。
【０１２９】本発明ポリペプチドは、天然の精製産物、
化学合成法による産物、および、例えば細菌、酵母、高
等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する原核細胞ま
たは真核細胞宿主から組換え技術により得られた産物を
包含する。組換え体製造法に使用する宿主によっては、
本発明ポリペプチドはグリコシレーションされているか
もしれないし、されていないかもしれない。さらに、本
発明ポリペプチドは、いくつかの場合、宿主によるプロ
セスの結果として最初の修飾されたメチオニン残基を含
みうる。
【０１３０】本発明に従って、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細に
はＨＣｇｐ３９−Ｌの化学的および生物学的特性を用い
る適用例に使用することができる。さらなる適用例は、
細胞、組織および器官の疾病の診断および治療に関す
る。本発明のこれらの態様を以下の議論によってさらに
説明する。
【０１３１】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としてのごとき相補的ポリヌ
クレオチドの検出のためのＨＣｇｐ３９−Ｌポリヌクレ
オチドの使用にも関する。機能不全に関連した変異形態
のＨＣｇｐ３９−Ｌの検出は、ＨＣｇｐ３９−Ｌの発現
低下、発現過剰または変化した発現から生じる疾病の診
断、または疾病に対する感受性を付加および定義するこ
とができる診断道具を提供するであろう。ＨＣｇｐ３９
−Ｌ遺伝子に変異を有する個体を、種々の方法により、
ＤＮＡレベルにおいて検出することができる。診断のた
めの核酸を、血液、尿、唾液、生検および剖検材料のご
とき患者の細胞から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出用
に直接使用してもよく、または、分析前にＰＣＲを用い
ることにより酵素的に増幅してもよい。ＰＣＲ（Saiki
ら、Nature,324:163-166(1986)）。ＲＮＡまたはｃＤＮ
Ａを同じように使用してもよい。一例として、ＨＣｇｐ
３９−Ｌをコードしている核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーを用いて、ＨＣｇｐ３９−Ｌの発現および変異を同
定および分析するために使用することができる。例え
ば、正常遺伝子型との比較における増幅生成物のサイズ
の変化により、欠失および挿入を検出することができ
る。増幅したＤＮＡを放射性ラベルされたＨＣｇｐ３９
−Ｌ ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせることによ
り、あるいは別法として放射性ラベルされたＨＣｇｐ３
９−ＬアンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーショ
ンさせることにより、点突然変異を同定することができ
る。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の
相違により、マッチした配列とミスマッチ２本鎖とを識
別することができる。
【０１３２】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメントを
プローブとして用いて特定のＤＮＡセグメントを検出し
てもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いるこ
とにより、かかる方法の感度を非常に向上させることが
できる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖ＰＣ
Ｒ生成物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分
子とともに使用する。放射性ラベルヌクレオチドを用い
る慣用的手順により、または、蛍光タグを用いる自動配
列決定法により配列決定を行う。
【０１３３】変性剤と共にまたは無しでゲル中のＤＮＡ
断片の電気泳動度の変化を検出することにより、ＤＮＡ
配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことができる。
高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠失およ
び挿入を可視化することができる。特異的融点または部
分的に融解する温度によって、異なるＤＮＡ断片の移動
がゲル中の異なる位置において遅延される、変性ホルム
アミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡ断片を
識別することができる（例えば、Myers et al.,Scienc
e,230:1242(1985)参照）。
【０１３４】ＲＮaseおよびＳ１保護のごときヌクレア
ーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の位
置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cotton
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-44-1(1985)）。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限断片長多型性（ＲＦＬＰ））およびゲノ
ムＤＮＡのサザンブロッティングのごとき方法により、
特定のＤＮＡ配列の検出を行うことができる。
【０１３５】本発明のさらなる態様によれば、リューマ
チおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化
症、転移性腫瘍、歯周病、慢性腎疾患など、またはかか
る疾病／疾患に対する感受性の診断方法が提供される。
かくして、ＨＣｇｐ３９−Ｌにおける変異は、リューマ
チおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化
症、転移性腫瘍、歯周病、慢性腎疾患などに対する感受
性を示し、上記核酸配列をかかる感受性を確認するため
のアッセイにおいて使用してもよい。かくして、例え
ば、本明細書中記載のＨＣｇｐ３９−Ｌにおける、欠
失、切断、挿入、フレームシフト等のごとき変異を検出
するために該アッセイを使用してもよく、かかる変異
は、前記した疾病／疾患に対する感受性の指標となる。
【０１３６】本発明は、図１および２または図３および
４（配列番号：１または３）の配列を有するポリヌクレ
オチドの発現レベルが異常に減少または増加している患
者由来の試料から決定することを含んでなる、特にリュ
ーマチおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬
化症、転移性腫瘍、歯周病、慢性腎疾患などを診断する
方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現の減少または
増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保
護、ノザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼー
ション法のごときポリヌクレオチド定量のための当該分
野でよく知られた方法のいくつかを用いて測定できる。
より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定以外に
も、in situ分析により変異を検出することができる。
【０１３７】染色体アッセイ 本発明配列は染色体同定についても価値がある。該配列
を、個々のヒト染色体上の特別な位置に対して特異的に
標的化し、ハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらに、染色体上の特別な部位を同定するために、
現在必要とされている、染色体位置をマーキングするた
めの実際の配列データ（繰り返し多型性）に基づいた染
色体マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本
発明による染色体へのＤＮＡマッピングは、疾患に関係
した遺伝子とその配列との関連付けにおいて重要な最初
の工程である。
【０１３８】簡単にいえば、ｃＤＮＡからＰＣＲプライ
マー（好ましくは１５−２５ｂｐ）を調製することによ
って配列を染色体に対してマッピングできる。一つ以上
のエクソンをスパンするプライマーは増幅工程を混乱さ
せる可能性があるので、３'非翻訳領域のコンピュータ
ー解析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の一つ以上のエクソン
をスパンしないプライマーを迅速に選択する。次いで、
これらのプライマーを個々のヒト染色体を含む体細胞雑
種のＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対
応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅断片を
有するであろう。
【０１３９】体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、特定の
ＤＮＡを特定の染色体に振り分けるための迅速な方法で
ある。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに本発
明を用いて、特定の染色体からの断片のパネル、または
同様の様式での大きなゲノムクローンのプールで、大体
の位置づけをすることができる。同様に染色体へのマッ
ピングに用いることができる他のマッピング法は、in s
ituハイブリダイゼーション、ラベルされたフロー−ソ
ーティド（flow-sorted）染色体でのプレスクリーニン
グ、および、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築
するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包
含する。
【０１４０】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて正確な染色体位置を１工程で知ることがで
きる。この方法は、５０または６０塩基の短いｃＤＮＡ
とともに用いられる。この方法の総説として、Verma
ら、Human Chromosomes: A Manual of Basic Technique
s, Pergamon Press, New York (1988)を参照のこと。
【０１４１】これをいかにして行うのかという一例とし
て、QIAEX II ＤＮＡ精製キット（QIAGEN,Inc.,Chastwo
rth,CA）を用いてＨＣｇｐ３９−Ｌ ＤＮＡを消化し、
精製し、Super CosI コスミドベクター（STRATAGENE,La
Jolla,CA）に連結する。Qiagen Plasmid Purification
Kit（QIAGEN,Inc.,Chastworth,CA）を用いてＤＮＡを精
製し、BioNick Labeling Kit（GibcoBRL,Life Technolo
gies Inc.,Gauthersburg,MD）を用いてビオチン−ｄＡ
ＴＰの存在下でニックトランスレーションにより１ｍｇ
を標識する。GENE-TECT Detection System（CLONTECH L
aboratories,Inc.Palo Alto,CA）を用いてビオチン化を
検出する。ONCOR Light HybridizationKit（ONCOR,Gait
hersburg,MD）を用いてin situハイブリダイゼーション
をスライドガラス上で行って、中期染色体上の単一コピ
ー配列を検出する。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよび
ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ
１６４０中で正常ドナーの末梢血を３日間培養し、１０
-7Ｍメトトレキセートで１７時間同調させ、補足物不含
ＲＰＭＩで２回洗浄する。細胞を１０-3Ｍチミジンとと
もに７時間インキュベーションする。コルセミド（０.
５μｇ／ｍｌ）とともに２０分のインキュベーション
後、細胞を中期で捕捉し、次いで、７５ｍＭＫＣｌ中３
７℃で１５分低張溶解を行う。次いで、細胞ペレットを
遠心分離し、Carnoy'sの固定液（３：１ メタノール／
酢酸）中で固定する。
【０１４２】１滴の懸濁液をスライドガラス上に滴下
し、風乾することにより中期スプレッドを調製する。ブ
ロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を添加
した１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％
ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）中
に懸濁された１００ｎｇのプローブを添加することによ
りハイブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７
０℃の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキ
ュベーションし、次いで、あらかじめ暖めておいた（３
７℃）スライドガラス上に置き、それは、あらかじめ７
０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０℃で変性させ、エ
タノールシリーズ中で脱水し、４℃に冷却しておいたも
のである。
【０１４３】スライドガラスを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドガラスを５
０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄
し、次いで、２ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製
造者のプロトコールに従ってスライドガラスをＦＩＴＣ
−アビジン（ONCOR,Gaithersburg,MD）とともにインキ
ュベーションすることによりハイブリダイゼーションプ
ローブを検出する。マウンティングメディウム中に懸濁
されたヨウ化プロプリディウムで染色体を対照染色す
る。Leitz ORTHOPLAN 2エピ蛍光顕微鏡を用いてスライ
ドガラスを可視化し、Imagenetics ComputerおよびMacI
ntoshプリンターを用いて５つのコンピューター映像を
得る。
【０１４４】いったん、配列が正確な染色体位置にマッ
ピングされたら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体
上の配列の物理的位置を修正することができる。かかる
データは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritan
ce in Man（Johns Hopkins University Welch Medical
Libraryからオンラインで利用可能）に見いだされる。
次いで、連関分析（物理的に近接した遺伝子の同時遺
伝）により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子
と疾病との関連を同定する。
【０１４５】次に、疾病にかかっている個体および疾病
にかかっていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の
相違を決定することが必要である。疾病にかかっている
個体の一部または全部において変異が観察されるが、正
常個体においては変異が観察されない場合には、その変
異がその疾病の病因である可能性がある。
【０１４６】物理的マッピングおよび遺伝学的マッピン
グ法の現在の分離能によれば、疾病に関連した染色体領
域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは５０ないし５００
個の潜在的病因遺伝子につき１つであろう（これは１メ
ガベースのマッピング分離能、および、２０ｋｂあたり
１個の遺伝子と仮定している）。
【０１４７】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中のＨＣｇｐ３９−Ｌタンパ
ク質レベルの検出のための定量および診断アッセイのご
とき診断アッセイにも関し、正常および異常なレベルの
決定を包含する。かくして、例えば、正常対照組織試料
と比較してＨＣｇｐ３９−Ｌタンパク質の過剰発現を検
出するための本発明診断アッセイを用いて、例えばリュ
ーマチおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬
化症、転移性腫瘍、歯周病、慢性腎疾患などの存在を検
出してもよい。宿主由来の試料中の本発明ＨＣｇｐ３９
−Ｌタンパク質のごときタンパク質のレベルを決定する
のに用いることのできるアッセイ法は当業者によく知ら
れている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセ
イ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および
ＥＬＩＳＡアッセイを包含する。これらのうち、ＥＬＩ
ＳＡがしばしば好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初
にＨＣｇｐ３９−Ｌに対して特異的な抗体、好ましくは
モノクローナル抗体を調製することを含んでなる。さら
に、一般に、モノクローナル抗体に結合するレポーター
抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光
試薬または酵素試薬のごとき検出可能試薬に結合してい
るが、この実施例ではセイヨウワサビ・ペルオキシダー
ゼ酵素に結合している。
【０１４８】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
取り、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、例え
ば、ポリスチレンディッシュ上でインキュベーションす
る。次いで、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的タ
ンパク質とともにインキュベーションすることにより、
ディッシュ上の遊離タンパク質結合部位を被覆する。次
に、モノクローナル抗体をディッシュ中でインキュベー
ションし、その間にモノクローナル抗体は、ポリスチレ
ンディッシュに結合しているＨＣｇｐ３９−Ｌタンパク
質に結合する。未結合モノクローナル抗体をバッファー
で洗浄除去する。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに
連結されたレポーター抗体をディッシュ中に入れ、レポ
ーター抗体とＨＣｇｐ３９−Ｌに結合しているモノクロ
ーナル抗体との結合を生じさせる。次いで、未結合レポ
ーター抗体を洗浄除去する。次いで、発色基質を包含す
るペルオキシダーゼ活性のための試薬をディッシュに添
加する。１次抗体および２次抗体でＨＣｇｐ３９−Ｌに
結合し、固定化されているペルオキシダーゼは着色反応
生成物を生じる。一定時間の発色量は試料中のＨＣｇｐ
３９−Ｌタンパク質量を示す。典型的には、標準曲線に
対して参照することにより定量的結果が得られる。
【０１４９】固体支持体に結合したＨＣｇｐ３９−Ｌ特
異的抗体および標識ＨＣｇｐ３９−Ｌおよび宿主由来の
試料が固体支持体上に通され、固体支持体に結合した検
出標識量と試料中のＨＣｇｐ３９−Ｌ量とが相関関係を
有するものである、競合アッセイを用いてもよい。
【０１５０】抗体 ポリペプチド、それの断片または他の誘導体、またはそ
れのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、それら
に対する抗体を製造するための免疫原として使用するこ
とができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル
またはモノクローナル抗体であってよい。本発明は、キ
メラ、１本鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片、ま
たはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包含する。当該
分野で知られた種々の手順をかかる抗体および断片の製
造に用いてもよい。
【０１５１】ポリペプチドを動物中に直接注射すること
により、あるいはポリペプチドを動物、好ましくは非ヒ
ト動物に投与することにより、本発明配列に対応したポ
リペプチドに対して生成した抗体を得ることができる。
次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自
体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチド
の断片のみをコードする配列を用いて、無傷のポリペプ
チド全体に結合する抗体を得ることさえできる。次い
で、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織
からそのポリペプチドを単離することができる。
【０１５２】モノクローナル抗体の調製のために、連続
細胞培養系により製造される抗体を提供する方法を用い
ることができる。例えば、ハイブリドーマ法（Kohler,
G.およびMilstein,C.、Nature 256:495-497(1975)）、
トリオーマ法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor
et al.,Immunology Today 4:72(1983)）およびヒト・
モノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Cole et al., pg.77-96 in Monoclonal Anti
bodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss,Inc,(1985)）
が挙げられる。
【０１５３】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明
の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を製
造することができる。また、トランスジェニックマウ
ス、または他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本
発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体
を発現させてもよい。
【０１５４】前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発
現するクローンを単離または同定してもよく、あるいは
アフィニティークロマトグラフィーによる単離および／
または精製のための固体支持体への抗体の結合により、
本発明ポリペプチドを精製してもよい。かくして、特に
ＨＣｇｐ３９−Ｌに対する抗体は、リューマチおよび骨
関節炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、転移性腫
瘍、歯周病、慢性腎疾患などを治療／阻害するために使
用されてもよい。
【０１５５】ＨＣｇｐ３９−Ｌ結合分子およびアッセイ ＨＣｇｐ３９−Ｌをこれに相互作用するタンパク質を単
離するために使用することができ、この相互作用は阻害
のための標的となり得る。ＨＣｇｐ３９−Ｌおよび他の
因子の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害によ
り、ＨＣｇｐ３９−Ｌ活性の修飾のための医薬品が開発
できるであろう。
【０１５６】かくして、本発明は、ＨＣｇｐ３９−Ｌに
結合する分子の同定方法も提供する。当業者に知られた
多くの方法、例えば、リガンドパニング（panning）お
よびＦＡＣＳソーティングにより、ＨＣｇｐ３９−Ｌに
結合するタンパク質をコードしている遺伝子を同定する
ことができる。かかる方法は多くの研究室用マニュア
ル、例えば、Coligan et al.,Current Protocoles in I
mmunology 1（Rivett, A.、J.Biochem.J. 291, 1-10 81
993)）：第５章（１９９１年）に記載されている。
【０１５７】例えば、転写活性化因子の活性の再構成を
用いた、酵母２ハイブリッドシステムがin vivoでの最
初の試験タンパク質および２番目の試験タンパク質の間
の相互作用を検出するための方法を提供する。この方法
は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されており、
試薬はClontechおよびStratageneから市販されている。
簡潔にいえば、ＨＣｇｐ３９−ＬｃＤＮＡをＧａｌ４転
写因子ＤＮＡ結合ドメインに融合し、酵母細胞中で発現
させる。目的の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリー
メンバーをＧａｌ４のトランス活性化ドメインに融合す
る。ＨＣｇｐ３９−Ｌと相互作用できるタンパク質を発
現するｃＤＮＡクローンを用いて、Ｇａｌ４活性の再構
成およびＧａｌ１−ｌａｃＺのごときレポーター遺伝子
発現のトランス活性化を行う。
【０１５８】組換えＨｃｇｐ３９−Ｌでλgt１１、λＺ
ＡＰ（Stratagene）または同等のｃＤＮＡ発現ライブラ
リーをスクリーニングする別法がある。組換えＨＣｇｐ
３９−Ｌタンパク質またはそれの断片をＦＬＡＧ、ＨＳ
ＶまたはＧＳＴのごとき小さなペプチドタグに融合す
る。ペプチドタグは心筋クレアチンキナーゼのごときキ
ナーゼの簡便なリン酸化部位を有しており、あるいはそ
れらをビオチン化できる。組換えＨＣｇｐ３９−Ｌを32
［Ｐ］でリン酸化、またはラベルされていないＰでリン
酸化し、次いで、ストレプトアビジンまたはそのタグに
対する抗体で検出することができる。λgt１１ｃＤＮＡ
発現ライブラリーを目的の細胞から作成し、組換えＨＣ
ｇｐ３９−Ｌとともにインキュベートし、洗浄し、次い
で、ＨＣｇｐ３９−Ｌと相互作用するｃＤＮＡクローン
を単離する。例えば、T. Maniatisら、前掲参照。
【０１５９】もう一つの方法は、ベクターの哺乳動物プ
ロモーターおよびポリアデニル化部位の間にｃＤＮＡを
クローン化した哺乳動物発現ライブラリーをスクリーニ
ングし、次いで、ＣＯＳまたは２９３細胞に一時的にト
ランスフェクションし、その後、固定し洗浄した細胞を
ラベルしたＨＣｇｐ３９−Ｌで、好ましくはヨウ素化さ
れたＨＣｇｐ３９−Ｌでインキュベーションし、オート
ラジオグラフィーによって結合ＨＣｇｐ３９−Ｌを検出
することによって、４８時間後に結合タンパク質を検出
する。Simsら、Science 241,585-589(1988)およびMcMah
anら、EMBO J.10, 2821-2832（1991）を参照のこと。こ
のようにして、目的の結合タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを含むｃＤＮＡプールを選択し、各プールをさらに
分割し、その後、一時的なトランスフェクション、結合
およびオートラジオグラフィーの繰り返しにより目的の
ｃＤＮＡを単離することができる。別法として、ｃＤＮ
Ａライブラリー全体を哺乳動物細胞にトランスフェクシ
ョンし、プレートに結合したＨＣｇｐ３９−Ｌを含むデ
イッシュ上で細胞をパニングすることによって目的のｃ
ＤＮＡを単離できる。洗浄後、結合している細胞を溶解
し、プラスミドＤＮＡを単離し、細菌中で増幅し、単一
のｃＤＮＡクローンが得られるまでトランスフェクショ
ンおよびパニングを繰り返す。Seedら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 84, 3365(1987) およびAruffoら、EMBOJ.
6, 3313（1987）を参照のこと。結合タンパク質が分泌
される場合、いったん、一時的にトランスフェクション
された細胞からの上清をアッセイするために結合アッセ
イまたは中和アッセイが確立されたならば、類似のプー
ル方法によりｃＤＮＡを得ることができる。上清をスク
リーニングする一般的方法は、Wongら、Science 228, 8
10-815(1985)に開示されている。
【０１６０】もう一つの別法は、細胞から直接ＨＣｇｐ
３９−Ｌと相互作用するタンパク質を単離することであ
る。ＨＣｇｐ３９−ＬのＧＳＴまたは小さいペプチドタ
グとの融合タンパク質を製造し、ビーズ上に固定化す
る。目的の細胞からの生合成的にラベルされた、または
されていないタンパク質抽出物を調製し、ビーズとイン
キュベートし、緩衝液で洗浄する。ＨＣｇｐ３９−Ｌと
相互作用するタンパク質をビーズから特異的に溶出し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析する。結合相手のアミノ
酸の一次配列データをマイクロシークエンシングによっ
て得る。所望により、細胞性タンパク質のチロシンリン
酸化のごとき機能的応答を引き起こす因子で細胞を処理
できる。かかる因子の例は、成長因子またはインターロ
イキン−２のごときサイトカインであろう。
【０１６１】もう一つの別の方法はイムノアフィニティ
ー精製である。組換えＨＣｇｐ３９−Ｌをラベルまたは
ラベルされていない細胞抽出物とインキュベートし、抗
ＨＣｇｐ３９−Ｌ抗体で免疫沈降する。その免疫沈降物
をプロテインＡセファロースで回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで解析する。ラベルされていないタンパク質をビオチ
ン化によりラベルし、ストレプトアビジンを含むＳＤＳ
ゲル上で検出する。結合相手のタンパク質をマイクロシ
ークエンシングにより解析する。さらに、当業者に知ら
れている標準的生化学的精製法をマイクロシークエンシ
ングの前に使用してもよい。
【０１６２】さらにもう一つの別法は、結合相手につい
てのペプチドライブラリーのスクリーニングである。組
換えタグ付きまたはラベルされたＨＣｇｐ３９−Ｌを用
いて、ＨＣｇｐ３９−Ｌと相互作用するペプチドまたは
リン酸化ペプチドライブラリーからペプチドを選択す
る。そのペプチドの配列決定から、相互作用するタンパ
ク質において見いだされるコンセンサスペプチド配列を
同定する。
【０１６３】前記の推定結合相手と同様、当業者に知ら
れているこれらの方法または他の方法のいくつかによっ
て同定されたＨＣｇｐ３９−Ｌの結合相手を、本発明の
アッセイ方法において用いることができる。ＨＣｇｐ３
９−Ｌ／結合相手の複合体の存在を、例えば、酵母２ハ
イブリッドシステム、ＥＬＩＳＡ、またはその複合体に
特異的な抗体を用いたイムノアッセイによってアッセイ
する。ＨＣｇｐ３９−Ｌ／結合相手の相互作用の形成を
妨害または阻害する試験物質の存在下、複合体の量の減
少を試験物質を欠いている対照と比較して測定する。
【０１６４】遊離ＨＣｇｐ３９−Ｌまたは結合相手に関
するアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異的抗体
を用いたイムノアッセイによって、または、放射性ラベ
ルされたＨＣｇｐ３９−Ｌを細胞または細胞膜とインキ
ュベーションし、その後遠心またはフィルター分離工程
を行うことによって行われる。ＨＣｇｐ３９−Ｌ／結合
相手相互作用の形成を妨害または阻害する試験物質の存
在下、遊離のＨＣｇｐ３９−Ｌまたは遊離の結合相手の
量の増加を、試験物質を欠いている対照と比較して測定
する。本発明ポリペプチドを用いて、細胞中または無細
胞調製物中のＨＣｇｐ３９−Ｌ結合分子のＨＣｇｐ３９
−Ｌ結合許容量を評価することもできる。
【０１６５】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明ポリペプチドの活性化を作用を促進（アゴニス
ト）または阻害（阻害剤／アンタゴニスト）する化合物
のスクリーニングに本発明ＨＣｇｐ３９−Ｌを使用して
もよい。潜在的アンタゴニストは、ＨＣｇｐ３９−Ｌの
（基質のごとき）結合分子、即ち、生物学的機能を失っ
た結合分子の断片に深く関係したタンパク質も包含し、
ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドに結合したとき、その活
性を阻害する。
【０１６６】潜在的アンタゴニストはアンチセンス法を
用いて調製されたアンチセンス構築物も包含する。アン
チセンス法を用いて、３重ヘリックス形成により、また
はアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を
制御することができ、どちらの方法もポリヌクレオチド
のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例え
ば、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部分は本
発明成熟ポリペプチドをコードしており、それを用いて
約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドをデザインする。ＤＮＡオリゴヌクレ
オチドは、転写に関する遺伝子の領域に相補的であるよ
うにデザインされ（３重ヘリックス形成は、Leeら、Nuc
leic Acids Research 6:3073(1979)；Cooneyら、Scienc
e 241:456(1988)；およびDervanら、Science 251:1360
（1991）参照）、それによりＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプ
チドの転写および製造を阻害する。アンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡにハ
イブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のＨＣｇｐ３９
−Ｌポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンスに
ついて、Okano、J.Neurochem.56:560(1991)；OLIGONUCL
EOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORS OF GENE EXPRESSION,
CRC Press,Boca Raton,FL(1988)）。上記オリゴヌクレ
オチドを細胞に送達して、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡがインビボにおいて発現されてＨＣｇｐ３９−Ｌポ
リペプチドの生成を阻害するようにすることもできる。
【０１６７】もう一つの潜在的アンタゴニストは、ＨＣ
ｇｐ３９−Ｌ受容体に結合する小分子であり、結合分子
（例えば基質）に近づきにくくして正常な生物学的活性
を阻害する。小分子の例は、これに限定されないが、小
ペプチドまたはペプチド様分子を包含する。
【０１６８】ＨＣｇｐ３９−Ｌは哺乳動物宿主において
普遍的に存在しており、多くの病原体を包含する多くの
生物学的機能に応答する。従って、一方でＨＣｇｐ３９
−Ｌを刺激し、また一方でＨＣｇｐ３９−Ｌの機能を阻
害する化合物および薬剤を見いだすことが所望される。
【０１６９】一般に、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドに
ついてのアゴニストは、リューマチおよび骨関節炎、骨
粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、転移性腫瘍、歯周
病、慢性腎疾患などの治療および予防のために使用され
る。ＨＣｇｐ３９−Ｌについてのアンタゴニスト／阻害
剤は、リューマチおよび骨関節炎、骨粗鬆症、アテロー
ム性動脈硬化症、転移性腫瘍、歯周病、慢性腎疾患など
の種々の治療および予防のために使用されてもよい。
【０１７０】本発明はさらに、上記のごとく、ＨＣｇｐ
３９−Ｌポリペプチドに結合分子が結合するのを阻害す
ることによってその活性を阻害するために、医薬上許容
される担体と共に有効量の阻害化合物（アンタゴニス
ト）を対象に投与することを含んでなる過剰なＨＣｇｐ
３９−Ｌ活性に関係した異常状態を治療する方法を提供
する。
【０１７１】本発明は、上記のごとく本発明ポリペプチ
ド（アゴニスト）を活性化する治療上有効量の化合物
を、医薬上許容される担体と共に対象に投与して異常状
態を軽減することを含んでなる、ＨＣｇｐ３９−Ｌ活性
の低発現に関係した異常状態を治療する方法も提供す
る。
【０１７２】組成物およびキットＨＣｇｐ３９−Ｌび可
溶性形態およびかかるポリペプチドを活性化または阻害
する化合物を適切な医薬担体と共に使用してもよい。か
かる組成物は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合
物、および医薬上許容される担体または賦形剤を含んで
なる。かかる担体は、セライン、緩衝化セライン、デキ
ストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれ
らの混合物を包含するが、これらに制限されない。処方
は投与モードに適合すべきである。
【０１７３】本発明は、前記のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを含んでなる組成物にも関する。かくし
て、本発明ポリペプチドを、対象への投与に適した医薬
担体のごとき未滅菌または滅菌担体、または細胞、組織
または生物との使用のための担体とともに使用してもよ
い。かかる組成物は、例えば、メディア添加物または治
療上有効量の本発明ポリペプチドおよび医薬上許容され
る担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体は、セイ
ライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリ
セロール、エタノールおよびそれらの混合物を包含する
が、これらに制限されない。処方は投与モードに適合す
るべきである。さらに本発明は、上記本発明組成物の１
種またはそれ以上の成分を充填した１個またはそれ以上
の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。
【０１７４】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。効果的で便利な方法、例えば、特に、局所、
経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医薬組
成物を投与してもよい。
【０１７５】一般に、医薬組成物を、個々の徴候または
徴候（複数）の治療または予防のための有効な量で投与
する。一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の
量で組成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８
ｍｇ／ｋｇ体重をこえない量で組成物が投与されるであ
ろう。好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約
１０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
症状、重症度、投与経路、合併症等を考慮して、各治療
様式についての標準的方法および症状により最適用量が
決定されることが理解されよう。
【０１７６】遺伝子治療 インビボにおいて、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる
治療様式において、かかるポリペプチドを発現させるこ
とにより、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴ
ニストを本発明に従って使用することができる。
【０１７７】かくして、例えば、患者からの細胞をポリ
ペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡのごとき
ポリヌクレオチドでエクスビボで操作し、次いで、ポリ
ペプチドで治療すべき患者にその操作された細胞を与え
てもよい。例えば、本発明ポリペプチドをコードしてい
るＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使
用により細胞をエクスビボで操作してもよい。かかる方
法は当該分野においてよく知られており、本発明におけ
るそれらの使用は本明細書の教示から明らかである。
【０１７８】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のようにレプ
リコン欠損レトロウイルスベクター中での発現のために
本発明ポリヌクレオチドを操作してもよい。次いで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞
中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染
性ウイルス粒子を産生するようにすることができる。イ
ンビボでの細胞の操作およびインビボでのポリペプチド
の発現のためにこれらの産生細胞を患者に投与してもよ
い。かかる方法により本発明ポリペプチドを投与するた
めのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から
当業者に明らかであるはずである。
【０１７９】本明細書において前記したレトロウイルス
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニー・マウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラ
ウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ・白血
病ウイルス、ギボンサル・白血病ウイルス、ヒト・免疫
不全ウイルスのごときレトロウイルス、アデノウイル
ス、ミエロプロリファレイティブ肉腫ウイルス（Myelop
roliferative Sarcomavirus）、および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。１つの具
体例において、レトロウイルスプラスミドベクターはモ
ロニー・マウス・白血病ウイルス由来のものである。
【０１８０】かかるベクターは、ポリペプチド発現のた
めの１個またはそれ以上のプロモーターを十分に含む。
使用可能な適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴ
Ｒ；ＳＶ４０プロモーター；およびMillerら、Biotechn
iques 7:980-990(1989)に記載されたヒト・サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または他のいずれ
かのプロモーター（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを包含す
るが、これに限定されない真核細胞プロモーターのごと
き細胞プロモーター）を包含するが、これらに限定され
ない。使用できる他のウイルスのプロモーターは、アデ
ノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プ
ロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター
を包含するが、これらに限定されない。適当なプロモー
ターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明
らかであろう。
【０１８１】本発明のポリペプチドをコードしている核
酸配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
主要後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモー
ター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモー
ターのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒト・グロビンプロモー
ター；単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモ
ーターのごときウイルスのチミジンキナーゼプロモータ
ー；レトロウイルスのＬＴＲｓ（本明細書で前記した修
飾レトロウイルスＬＴＲｓを包含）；β−アクチンプロ
モーター；およびヒト・成長ホルモンプロモーターを包
含するが、これらに限定されない。プロモーターは、ポ
リペプチドをコードしている遺伝子を制御する元来のプ
ロモーターであってもよい。
【０１８２】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入して産生細胞系を得
る。トランスフェクションされうるパッケージング細胞
の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、
ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、
ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖ
Ａｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Therapy 1:5-
14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、こ
れらに限定されない。当該分野で知られているいずれか
の手段によりベクターをパッケージング細胞中に形質導
入してもよい。かかる手段は、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈殿を包含するが、
これらに限定されない。１つの別法において、レトロウ
イルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、あ
るいは脂質と結合させ、次いで、宿主に投与してもよ
い。
【０１８３】産生細胞系は感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を産生するであろうし、該粒子はポリペプチドを
コードする核酸配列を含んでいる。次いで、かかるレト
ロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはイ
ンビボのいずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよ
い。形質導入された真核細胞はポリペプチドをコードし
ている核酸配列を発現するであろう。形質導入されうる
真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならびに
造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノ
サイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。
【０１８４】トランスジェニック動物 本発明は、ＨＣｇｐ３９−Ｌ誘発の疾患に罹患している
動物を製造するために、変性ＨＣｇｐ３９−Ｌでのトラ
ンスジェニック動物の製造方法も提供する。宿主の適切
な受精卵または胎児を、本明細書中に開示したＨＣｇｐ
３９−Ｌをコードしている核酸でトランスフェクション
することによってトランスジェニック非ヒト動物を得て
もよい。例えば、米国特許第４,７３６,８６６号、５,
１７５,３８５号５,１７５,３８４号および５,１７５,
３８６号を参照のこと。変性ＨＣｇｐ３９−Ｌの研究の
ためのモデルとして得られたトランスジェニック動物を
用いてもよい。詳細には、有用なトランスジェニック動
物は、ＨＣｇｐ３９−Ｌポリペプチドの変化した発現と
関係した検出可能な表現型を表すものである。次いで、
適切な表現型を逆転させるかまたは悪化させる能力で薬
剤をスクリーニングしてもよい。
【０１８５】
【実施例】本発明をさらに以下の実施例を用いて説明す
る。実施例は、ある種の具体例によって本発明を説明す
るのに提供されるにすぎない。これらの例は、本発明の
ある種の態様を説明するが、開示された発明の範囲を限
定または制限するものではない。本明細書にて使用され
るある用語は、前記した用語説明において説明する。
【０１８６】すべての実施例は標準的方法を使用して行
われ、その方法はよく知られていて、当業者にとっては
日常的であり、そうでない場合は詳細に記載した。以下
の実施例の日常的な分子生物学的方法は、本明細書中
「Sambrook」という、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:
A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring HarborL
aboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)
のごとき標準的な研究室マニュアルに記載されているご
とく行うことができる。以下の実施例に記載する部また
は量はすべて、特記しない限り、重量によるものであ
る。
【０１８７】以下の実施例において、特記しない限り、
断片の大きさによる分離を、Sambrookおよび、例えば、
Goeddelら、Nucleic Acids Res. 8:4057（1980）による
ごとき多くの他の文献のアガロースおよびポリアクリル
アミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）という標準的方法
を用いて行う。特記しない限り、連結は、標準緩衝液、
インキュベーション温度および時間、略等量の連結され
るべきＤＮＡ断片、およびＤＮＡ０.５μｇ当たり約１
０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用
いてなされる。
【０１８８】実施例１ 胸腺ｃＤＮＡからのｇｐ３９様
のＰＣＲによる増幅方法 胸腺ｃＤＮＡからＨＣｇｐ３９Ｌを増幅するＰＣＲ手順
を以下に示す。 プライマー配列： ＃１ ５’GCCAAGGATATCGGAGCAACCACCATGGACC ３’ 配列番号：６ （サブクローニングのためのＥｃｏＲＶ制限部位を製造） ＃２ ５’CAGGCAGCAAGGTCATCTAGACTGCTTCTCTG ３’ 配列番号：７ （サブクローニングのためのＸｂａＩ制限部位を製造）
【０１８９】以下の反応セット：（Expand High Fideli
ty Kit-Boehringer Mannheim） 胸腺ｃＤＮＡ（ポリＡ＋ＲＮＡから作成（Clonetech）） ５０ｎｇ １０ＸＰＣＲ緩衝液＋ＭｇＣｌ2（キットに補足） プライマー＃１ １μｇ プライマー＃２ １μｇ ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ各混合物−dATP、dCTP、dTTP、dGTP） ２μｌ Expand High Fidelity Enzyme ２ユニット Ｈ2Ｏ 全量１００μｌ
【０１９０】ＰＣＲプログラム： ９４℃で５分間 （９４℃で１分間、５２℃で１分間、７２℃で１分間）
３４サイクル ７２℃で１０分間
【０１９１】実施例２ インビトロでのＨＣｇｐ３９−
Ｌの発現 ｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフ
ェクションし、安定な細胞型を選択することによって、
組換えＨＣｇｐ−３９をインビトロで製造した。完全長
のＨＣｇｐ−３９遺伝子を２部分；ＳａｃＩＩ−Ｂｃｌ
Ｌで切断されたＣＤＮベクターと連結された６６０ｂｐ
のＳａｃＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片および６７８ｂｐのＢ
ｓｔＥＩＩ−ＢｃｌＩ断片にしてＣＤＮ中にクローン化
した。標準的方法により、この構築物でＣＨＯ ＡＣＣ
３１７細胞をトランスフェクションした。詳細には、２
０μｇのＨＣｇｐ−３９プラスミド構築物を制限消化に
より直鎖状にし、１ｍｌの１.２５ｘ１０7細胞にエレク
トロポレーションした。細胞をウェルあたり２.５ｘ１
０3の密度で撒いて、ヌクレオシドの入っていない最小
培地で選択した。分泌タンパク質を慣らし培地から回収
し、Ｑセファロースの素通り、Ｓセファロース捕捉、お
よびSuprose１２でのサイズ分画を用いて精製した。得
られた物質はクマシーブルー染色で測定した場合９５％
以上純粋であった。この実施例２に記載した同様の方法
を用いて、ＨＣｇｐ３９−Ｌを発現させることもでき
る。
【０１９２】実施例３ ＨＣｇｐ−３９Ｌに対して作成
されたポリクローナル抗体の製造 ＨＣｇｐ３９−Ｌタンパク質の一部をE. coli中で発現
させ、それを用いてポリクローナル抗体を作成した。Ｈ
Ｃｇｐ−３９Ｌの１４６１ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断
片を、Pet16Bベクターシステム（Novagen）中にＮ末端
Ｈｉｓタグと融合させ、読み枠を合わせてクローン化し
た。これらの構築物で標準的方法により、E. coliを形
質転換した。細胞を増殖させ、溶解し、次いで、タンパ
ク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。精製された融合タンパク質を用いて、ポリ
クローナル抗体を製造するためにウサギを免疫した。
【０１９３】実施例４ ＨＣｇｐ−３９Ｌをリンパ球の
膜画分と関連させる ポリクローナル血清を用いて、ウエスタンブロッティン
グでＨＣｇｐ−３９Ｌタンパク質を検出した。タンパク
質をリンパ球の全細胞溶解物において検出する。それは
膜画分においても検出されるが、細胞質画分には関連せ
ず、培地にも分泌されていない。ＨＣｇｐ−３９Ｌは、
活性化されたリンパ球のサブセット（炎症または組織改
造作用疾患）のための細胞表面リンパ球マーカーとして
機能し、または、当業者に知られている２次的検出方法
であるＦＡＣＳ解析によって検出されるかもしれない。
【０１９４】実施例５ ＨＣｇｐ３９−Ｌの遺伝子治療
的発現 線維芽細胞を皮膚生検により得る。得られた組織を組織
培養液中に入れ、小さく分ける。組織の小さい塊を組織
培養フラスコの湿った表面上に置き、各フラスコに約１
０個を入れる。フラスコを逆さにして密閉し、一晩室温
で放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆転させ、
組織の塊はフラスコの底に固定されたままで、新しい培
地を添加する（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよ
びストレプトマイシンを添加したHam's F12培地）。次
いで、組織を３７℃で約１週間インキュベートする。こ
の時新しい培地を添加し、引き続き数日毎に交換する。
さらに２週間培養後、単層の線維芽細胞が現れる。その
単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコで規模を
拡大する。
【０１９５】遺伝子治療のためのベクターを、発現させ
るべき断片をクローニングするために制限酵素で消化す
る。消化したベクターを、自己連結を阻止するためにウ
シ小腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化され、直
鎖状になったベクターをアガロースゲル上で分画し精製
する。
【０１９６】活性ＨＣｇｐ３９−Ｌを発現することがで
きるＨＣｇｐ３９−Ｌ ｃＤＮＡを単離する。必要なら
ば、ベクター中にクローニングするために断片の末端を
修飾する。例えば、５'はみ出し部分をＤＮＡポリメラ
ーゼで処理して平滑末端にしてもよい。３'はみ出し末
端部分をＳ１ヌクレアーゼを用いて除去してもよい。リ
ンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼで平滑末端に連結しても
よい。
【０１９７】等量のモロニーマウス白血病ウイルスの直
鎖骨格およびＨＣｇｐ３９−Ｌ断片を混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結する。連結混合物を用いてE. c
oliを形質転換し、次いで、その細菌をカナマイシン含
有寒天培地上に塗布する。カナマシン表現型および制限
解析により、ベクターが正しい挿入遺伝子を有すること
を確認する。
【０１９８】パッケージング細胞を、１０％ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有の
Dulbecco's Modified Eagles Medium（ＤＭＥＭ）中で
集密度にまで組織培養する。ＨＣｇｐ３９−Ｌ遺伝子を
含有するベクターをパッケージング細胞に標準的方法で
導入する。ＨＣｇｐ３９−Ｌ遺伝子を含有する感染能力
のあるウイルス粒子をパッケージング細胞から集め、以
後これを産生細胞と呼ぶ。
【０１９９】新鮮な培養液を産生細胞に添加し、適当な
インキュベーション期間後、集密的産生細胞のプレート
から培養液を集める。感染能力のあるウイルス粒子を含
有する培養液をMilliporeフィルターで濾過して分離さ
れる産生細胞を除去する。次いで、濾過された培養液を
用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞の亜集密プ
レートから培養液を除去し、濾過した培養液で迅速に置
換する。形質導入を促進するためにポリブレン（Aldric
h）を培地に添加してもよい。適当なインキュベーショ
ン後、培養液を除去し、新鮮な培養液で置換する。次い
で、ウイルスの力価が高ければ実質的にすべての線維芽
細胞が感染し、選択は必要ないであろう。力価が低けれ
ば形質導入細胞を選択して増殖するために、neoまたはh
isのごとき選択マーカーを有するレトロウイルスベクタ
ーを使用する必要がある。
【０２００】次いで、操作された線維芽細胞を単独で、
または、cytodex3ビーズのごときマイクロキャリアービ
ーズ上で集密的に生育させた後、いずれかをラットに注
射してもよい。注射された線維芽細胞はＨＣｇｐ３９−
Ｌ産物を産生し、そのタンパク質の生物学的作用を宿主
に伝達する。
【０２０１】詳細に記載された前述の記述および実施例
とは異なるように、本発明を実施してもよいことは明ら
かである。本発明の多くの修飾および変形は、前記した
方法の範囲において可能であり、従って添付した請求の
範囲の範囲内である。
【０２０２】
【配列表】（１）一般的情報： （ｉ）出願人：アダモー，ジュリー カークパトリック，ロバート ローゼンバーグ，マーティン （ｉｉ）発明の名称： ヒト軟骨ＧＰ−３９様遺伝子 （ｉｉｉ）配列の数：７ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレー
ション （Ｂ）通り名：７０９ スウェードランド・ロード （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−２７９９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Fast SEQ バージョン１.５ （ｖｉ）現出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願のデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・ティー （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００１７ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【０２０３】（２） 配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： AGAGAATGTG TATCCCAGAA GAAGCTGGCC AAGGATATGG GAGCAACCAC CATGGACCAG 60 AAGTCTCTCT GGGCAGGTGT AGTGGTCTTG CTGCTTCTCC AGGGAGGATC TGCCTACAAA 120 CTGGTTTGCT ACTTTACCAA CTGGTCCCAG GACCGGCAGG AACCAGGAAA ATTCACCCCT 180 GAGAATATTG ACCCCTTCCT ATGCTCTCAT CTCATCTATT CATTCGCCAG CATCGAAAAC 240 AACAAGGTTA TCATCAAGGA CAAGAGTGAA GTGATGCTCT ACCAGACCAT CAACAGTCTC 300 AAAACCAAGA ATCCCAAACT GAAAATTCTC TTGTCCATTG GAGGGTACCT GTTTGGTTCC 360 AAAGGGTTCC ACCCTATGGT GGATTCTTCT ACATCACGCT TGGAATTCAT TAACTCCATA 420 ATCCTGTTTC TGAGGAACCA TAACTTTGAT GGACTGGATG TAAGCTGGAT CTACCCAGAT 480 CAGAAAGAAA ACACTCATTT CACTGTGCTG ATTCATGAGT TAGCAGAAGC CTTTCAGAAG 540 GACTTCACAA AATCCACCAA GGAAAGGCTT CTCTTGACTG CGGGCGTATC TGCAGGGAGG 600 CAAATGATTG ATAACAGCTA TCAAGTTGAG AAACTGGCAA AAGATCTGGA TTTCATCAAC 660 CTCCTGTCCT TTGACTTCCA TGGGTCTTGG GAAAAGCCCC TTATCACTGG CCACAACAGC 720 CCTCTGAGCA AGGGGTGGCA GGACAGAGGG CCAAGCTCCT ACTACAATGT GGAATATGCT 780 GTGGGGTACT GGATACATAA GGGAATGCCA TCAGAGAAGG TGGTCATGGG CATCCCCACA 840 TATGGGCACT CCTTCACACT GGCCTCTGCA GAAACCACCG TGGGGGCCCC TGCCTCTGGC 900 CCTGGAGCTG CTGGACCCAT CACAGAGTCT TCAGGCTTCC TGGCCTATTA TGAGATCTGC 960 CAGTTCCTGA AAGGAGCCAA GATCACGCGG CTCCAGGATC AGCAGGTTCC CTACGCAGTC 1020 AAGGGGAACC AGTGGGTGGG CTATGATGAT GTGAAGAGTA TGGAGACCAA GGTTCAGTTC 1080 TTAAAGAATT TAAACCTGGG AGGAGCCATG ATCTGGTCTA TTGACATGGA TGACTTCACT 1140 GGCAAATCCT GCAACCAGGG CCCTTACCCT CTTGTCCAAG CAGTCAAGAG AAGCCTTGGC 1200 TCCCTGTGAA GGATTAACTT ACAGAGAAGC AGGCAAGATG ACCTTGCTGC CTGGGGCCTG 1260 CTCTCTCCCA GGAATTCTCA TGTGGGATTC CCCTTGCCAG GATGGCCTTT GGATCTCTCT 1320 TCCAAGCCTT TCCTGACTTC CTCTTAGATC ATAGATTGGA CCTGGTTTTG TTTTCCTGCA 1380 GCTGTTGACT TGTTGCCCTG AAGTACAATA AAAAAAATTC ATTTTGCTCC AGT 1433
【０２０４】（２） 配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Asp Gln Lys Ser Leu Trp Ala Gly Val Val Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gln Gly Gly Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ser 20 25 30 Gln Asp Arg Gln Glu Pro Gly Lys Phe Thr Pro Glu Asn Ile Asp Pro 35 40 45 Phe Leu Cys Ser His Leu Ile Tyr Ser Phe Ala Ser Ile Glu Asn Asn 50 55 60 Lys Val Ile Ile Lys Asp Lys Ser Glu Val Met Leu Tyr Gln Thr Ile 65 70 75 80 Asn Ser Leu Lys Thr Lys Asn Pro Lys Leu Lys Ile Leu Leu Ser Ile 85 90 95 Gly Gly Tyr Leu Phe Gly Ser Lys Gly Phe His Pro Met Val Asp Ser 100 105 110 Ser Thr Ser Arg Leu Glu Phe Ile Asn Ser Ile Ile Leu Phe Leu Arg 115 120 125 Asn His Asn Phe Asp Gly Leu Asp Val Ser Trp Ile Tyr Pro Asp Gln 130 135 140 Lys Glu Asn Thr His Phe Thr Val Leu Ile His Glu Leu Ala Glu Ala 145 150 155 160 Phe Gln Lys Asp Phe Thr Lys Ser Thr Lys Glu Arg Leu Leu Leu Thr 165 170 175 Ala Gly Val Ser Ala Gly Arg Gln Met Ile Asp Asn Ser Tyr Gln Val 180 185 190 Glu Lys Leu Ala Lys Asp Leu Asp Phe Ile Asn Leu Leu Ser Phe Asp 195 200 205 Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Pro Leu Ile Thr Gly His Asn Ser Pro 210 215 220 Leu Ser Lys Gly Trp Gln Asp Arg Gly Pro Ser Ser Tyr Tyr Asn Val 225 230 235 240 Glu Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Ile His Lys Gly Met Pro Ser Glu Lys 245 250 255 Val Val Met Gly Ile Pro Thr Tyr Gly His Ser Phe Thr Leu Ala Ser 260 265 270 Ala Glu Thr Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser Gly Pro Gly Ala Ala Gly 275 280 285 Pro Ile Thr Glu Ser Ser Gly Phe Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Gln 290 295 300 Phe Leu Lys Gly Ala Lys Ile Thr Arg Leu Gln Asp Gln Gln Val Pro 305 310 315 320 Tyr Ala Val Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Val Lys Ser 325 330 335 Met Glu Thr Lys Val Gln Phe Leu Lys Asn Leu Asn Leu Gly Gly Ala 340 345 350 Met Ile Trp Ser Ile Asp Met Asp Asp Phe Thr Gly Lys Ser Cys Asn 355 360 365 Gln Gly Pro Tyr Pro Leu Val Gln Ala Val Lys Arg Ser Leu Gly Ser 370 375 380 Leu 385
【０２０５】（２） 配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： AGAGAATGTG TATCCCAGAA GAAGCTGGCC AAGGATATGG GAGCAACCAC CATGGACCAG 60 AAGTCTCTCT GGGCAGGTGT AGTGGTCTTG CTGCTTCTCC AGGGAGAGAT GGGGTTTTGC 120 TATGTTGCCA GAGCTGGTCT TGAACTCCTG GGCTCAAGAA GTCCTCCTGC CTCAGCCTCC 180 CAAAGTGCTG GGATAACAGG ATCTGCCTAC AAACTGGTTT GCTACTTTAC CAACTGGTCC 240 CAGGACCGGC AGGAACCAGG AAAATTCACC CCTGAGAATA TTGACCCCTT CCTATGCTCT 300 CATCTCATCT ATTCATTCGC CAGCATCGAA AACAACAAGG TTATCATCAA GGACAAGAGT 360 GAAGTGATGC TCTACCAGAC CATCAACAGT CTCAAAACCA AGAATCCCAA ACTGAAAATT 420 CTCTTGTCCA TTGGAGGGTA CCTGTTTGGT TCCAAAGGGT TCCACCCTAT GGTGGATTCT 480 TCTACATCAC GCTTGGAATT CATTAACTCC ATAATCCTGT TTCTGAGGAA CCATAACTTT 540 GATGGACTGG ATGTAAGCTG GATCTACCCA GATCAGAAAG AAAACACTCA TTTCACTGTG 600 CTGATTCATG AGTTAGCAGA AGCCTTTCAG AAGGACTTCA CAAAATCCAC CAAGGAAAGG 660 CTTCTCTTGA CTGCGGGCGT ATCTGCAGGG AGGCAAATGA TTGATAACAG CTATCAAGTT 720 GAGAAACTGG CAAAAGATCT GGATTTCATC AACCTCCTGT CCTTTGACTT CCATGGGTCT 780 TGGGAAAAGC CCCTTATCAC TGGCCACAAC AGCCCTCTGA GCAAGGGGTG GCAGGACAGA 840 GGGCCAAGCT CCTACTACAA TGTGGAATAT GCTGTGGGGT ACTGGATACA TAAGGGAATG 900 CCATCAGAGA AGGTGGTCAT GGGCATCCCC ACATATGGGC ACTCCTTCAC ACTGGCCTCT 960 GCAGAAACCA CCGTGGGGGC CCCTGCCTCT GGCCCTGGAG CTGCTGGACC CATCACAGAG 1020 TCTTCAGGCT TCCTGGCCTA TTATGAGATC TGCCAGTTCC TGAAAGGAGC CAAGATCACG 1080 CGGCTCCAGG ATCAGCAGGT TCCCTACGCA GTCAAGGGGA ACCAGTGGGT GGGCTATGAT 1140 GATGTGAAGA GTATGGAGAC CAAGGTTCAG TTCTTAAAGA ATTTAAACCT GGGAGGAGCC 1200 ATGATCTGGT CTATTGACAT GGATGACTTC ACTGGCAAAT CCTGCAACCA GGGCCCTTAC 1260 CCTCTTGTCC AAGCAGTCAA GAGAAGCCTT GGCTCCCTGT GAAGGATTAA CTTACAGAGA 1320 AGCAGGCAAG ATGACCTTGC TGCCTGGGGC CTGCTCTCTC CCAGGAATTC TCATGTGGGA 1380 TTCCCCTTGC CAGGATGGCC TTTGGATCTC TCTTCCAAGC CTTTCCTGAC TTCCTCTTAG 1440 ATCATAGATT GGACCTGGTT TTGTTTTCCT GCAGCTGTTG ACTTGTTGCC CTGAAGTACA 1500 ATAAAAAAAA TTCATTTTGC TCCAGT 1526
【０２０６】（２） 配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ：Ｎ末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： Met Asp Gln Lys Ser Leu Trp Ala Gly Val Val Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gln Gly Glu Met Gly Phe Cys Tyr Val Ala Arg Ala Gly Leu Glu Leu 20 25 30 Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile 35 40 45 Thr Gly Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ser Gln 50 55 60 Asp Arg Gln Glu Pro Gly Lys Phe Thr Pro Glu Asn Ile Asp Pro Phe 65 70 75 80 Leu Cys Ser His Leu Ile Tyr Ser Phe Ala Ser Ile Glu Asn Asn Lys 85 90 95 Val Ile Ile Lys Asp Lys Ser Glu Val Met Leu Tyr Gln Thr Ile Asn 100 105 110 Ser Leu Lys Thr Lys Asn Pro Lys Leu Lys Ile Leu Leu Ser Ile Gly 115 120 125 Gly Tyr Leu Phe Gly Ser Lys Gly Phe His Pro Met Val Asp Ser Ser 130 135 140 Thr Ser Arg Leu Glu Phe Ile Asn Ser Ile Ile Leu Phe Leu Arg Asn 145 150 155 160 His Asn Phe Asp Gly Leu Asp Val Ser Trp Ile Tyr Pro Asp Gln Lys 165 170 175 Glu Asn Thr His Phe Thr Val Leu Ile His Glu Leu Ala Glu Ala Phe 180 185 190 Gln Lys Asp Phe Thr Lys Ser Thr Lys Glu Arg Leu Leu Leu Thr Ala 195 200 205 Gly Val Ser Ala Gly Arg Gln Met Ile Asp Asn Ser Tyr Gln Val Glu 210 215 220 Lys Leu Ala Lys Asp Leu Asp Phe Ile Asn Leu Leu Ser Phe Asp Phe 225 230 235 240 His Gly Ser Trp Glu Lys Pro Leu Ile Thr Gly His Asn Ser Pro Leu 245 250 255 Ser Lys Gly Trp Gln Asp Arg Gly Pro Ser Ser Tyr Tyr Asn Val Glu 260 265 270 Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Ile His Lys Gly Met Pro Ser Glu Lys Val 275 280 285 Val Met Gly Ile Pro Thr Tyr Gly His Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ala 290 295 300 Glu Thr Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro 305 310 315 320 Ile Thr Glu Ser Ser Gly Phe Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Gln Phe 325 330 335 Leu Lys Gly Ala Lys Ile Thr Arg Leu Gln Asp Gln Gln Val Pro Tyr 340 345 350 Ala Val Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Val Lys Ser Met 355 360 365 Glu Thr Lys Val Gln Phe Leu Lys Asn Leu Asn Leu Gly Gly Ala Met 370 375 380 Ile Trp Ser Ile Asp Met Asp Asp Phe Thr Gly Lys Ser Cys Asn Gln 385 390 395 400 Gly Pro Tyr Pro Leu Val Gln Ala Val Lys Arg Ser Leu Gly Ser Leu 405 410 415
【０２０７】（２） 配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３７４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： GCCAAGGCAG GAGGGGCGCT TGAGCCCAGG AATTCAAGAC CAGCCTGGGT AATGTAGTGA 60 GACCCTGTNT NNACAAATTT TTTTTTTTTT TTTTAATTAG CAAGGTGTAA GGTGCATGCC 120 TGTGGNTCCA GCTACTCTGG AGGCCAAGCT GGGAAGATCC TTTGAGCCCG GGAGGTTGAG 180 GNTGCAGTGA GCCATGATGG TGCCATTGCA CTCCAATTGG GGTGATACAG CAAGAGCAAG 240 ATCCTGTTTC TAAAAAAATT AAGCAAGCCA GAGGTGGCTG TGAACACAGA GAGAGGTCGG 300 GGGCATAGAA GAAGGAGACA GATTGGGATG ATGAGGAAGG AGATTCAGGG CCGAGGGTGA 360 TACCAGGAGG CAGAGCCTGA GTATCACCTC CTTCCCTTCT CCAGGACCGG GTCCCTTTTA 420 GGTGAGACTA GATGAAAAGG GCTCTTCAGC AGCTGACTTC ACAGCAACTA ATTTCTGACA 480 GGTCAGAGTT GGCATTGCTC AAATCTGGGC TTCATTTCCA AGAAGTTTCA CAAGTACTGC 540 CAGGGGAAGT ACCCTGGACT TCTTGCTTCT TTCGTGTAGG ACAGGCTGTC GAAACCTCAG 600 TGGATAAAAG ACCTAGAGAA TGTGTATCCC AGAAGAAGCT GGCCAAGGAT ATGGGAGCAA 660 CCACCATGGA CCAGAAGTCT CTCTGGGCAG GTGAGCATGG GGTTGATAAT TCAGCAGGAA 720 AGTTGGTGAG GAAGGAAGAG GTAACAGGTC TGTAGAAGAA GTAATCTTCC TCCTTTCCTG 780 GGACTTCAGT CTTTCCGTTG ACCTTAGTGT CAAAAAATTT CAAGCCAATG CAACTGTTGT 840 AGGGGAACCA CCTGATCTTT CCTGAATGGA CAAAAATGCA GCAGTAGCCA GAACCCTTTG 900 CACTGGCAGG ATGTTCTCAG TTTGTGCAGA GGTCCTTCTT GTCCACATTA GAACTGGAGC 960 TAAGACAGGA AAGAGGCCAA GCTTTCTTAG TCTCTTGGTG TATGAGCGTT GTATTGCGAG 020 TCACATCTTT CTTGGGCTCT GCTGTGGTTA TATTTTACAA CTTTTGGAGA GCCCCACATT 1080 TCTCATCTGC AGAATGGTTT ATTGAATTTA ATGTTTTTTA AACTCTCCCT TTCAACTCTA 1140 AAGTTCTGAT CCAAAACTCT GGCTTTTGTG GTGGCTGGGA ATTGGGATGA GAGTGGGGAT 1200 GAGGCTAAAT AAACAAGGCT ATGAGTGAAC GGGGGACGTT TACCAGGAGG GGAGGGGAGG 1260 GAATATGTCT GCTGGAGGAA AGAAATCATT TATTTGTGTC CATACCTCTT TCACCCTTGT 1320 CTTACCCTCT CAAGCCATGA AGCCCCCACT TGGCAAGAGC CTTTTGGGTT CCTGTTGAAC 1380 TTAGCTGAGC CCTGGACTGA CCCTTGACAG GGTAGAGCCC GTAGGGAGGC CACACTTTGG 1440 AGAAGGGCCT GGAGGCTGAC CTGACAGTGG ATGTGCCACA GAGAATTTCT CTGACCATTT 1500 ACTTAGTGAG TGTGTGGAGA ACCAGGGCCT AACCTCCCTG CCTAAAAAAA CATGTGAGTC 1560 ATCAAGAGAG AACAGTAGAG CCCTGTTTTC CAGCCCTAAG CTCTGCAGGG GAGGAATCAG 1620 CTCCAGCAGC TGTGTCATTG AAAGTTTTCT CTCCTTTTTG GCTGCCCCTT TCTTCACTTT 1680 TGGACCCGTA AAGGTTTCAG AGTGAACAAT ATCCCCAGGC TGGGGGGATT GCAGTTCCAG 1740 GAGTCTTGTC CATTGGGCAA AGTTTCTAGG ATCCAGGGGT CTGCTCTTTT TTTCCTTTAG 1800 GAGGATGTGT TAAGTATAGA ATAATCTCAC CAGTCTTCCT AGGGTAGATG TCCTATGGAG 1860 AAGAGACTGG GCATAATTTC AAACATATAA GTTTAAAGCA CTACCAGGGC CAGCTCACAC 1920 TGCTTATCTT GTTCTAAGAG TTAATTGTTT ATACATAGTG GGACCATCTC AATTTGCCTG 1980 AGATAGTTCT GGTTCAAGCT ATCGTCCTAG GGAAATTATT AATAATGTTC CTTTTTACTC 2040 TTTGAAGGGT CTCATTGGAC AATAAACTAT ATGGTCACCC TACCTATATT CAACTCCAGA 2100 CTGGACTATG AGCTCCTTGA GTGCAGGGAA GGCATTAACT GCATTATAAT TTCCCCAGTG 2160 TCCTGAGCAA TGCTTAGCAC AGAGCATATG ATTCAATAAA ACTTTGTTGG ATAAATGAAT 2220 GAAAAAATAA ATTCCCAGCT TGGAACATGT TTCTGCCTAG GAATGTAGAG ACACAAGGCA 2280 CCCCAGGGCT GGGGACCTCA AGGTCCTATA AAGAAACCAC AGGCCGGGCG CGGTGGCTCA 2340 CGCCTGTAAT CCCAGCACTT TGGGAGGCCG AGGCGGGCGG ATCACGAGGT CAGGAGATCG 2400 AGACCATCCC GGCTAAAACG GTGAAACCCC GTCTCTACTA AAAATACAAA AAATTAGCCG 2460 GGCGTAGTGG CGGGCGCCTG TAGTCCCAGC TACTTGGGAG GCTGAGGCAG GAGAATGGCG 2520 TGAACCCGGG AGGCGGAGCT TGCAGTGAGC CGAGATCACA CCACTGCACT CCAGCCTGGG 2580 CGACAGAGCG AGACTCCGTC TCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AGAAACCACA GCAGCTGTGG 2640 CTGGGGAGCC CAGATGAAGT GTGGCTCTAT CTTGTATGTG AGCACACCCA CATTTTCACT 2700 GCCATTATCT GGGACAGCAG AACCAGGTTT GGCTCAACAG ATTTCTCTTT CCACCCATCT 2760 ATTGCAGGAG TAGTGGTCTT GCTGCTTCTC CAGGGAGGTA AGTAGTCAAT AAGTCACTAC 2820 CGCCTGGATC TCCTGGCTTG GGTGCTTTCA TTTTTGATGT ACAGTTTCTT TTTCTGCTAC 2880 ATGCTTTTTC TCTTGATTAC TCTCTCCGGT TCTGCCACTG ACATATTTAT GACACTGAGT 2940 TTTTATTCTA TCTTTTTGTG TATCCCTTGT TCTAGTTCTT TTTGAGCCAC TCTCTCTCTC 3000 ACCCCTCCCC CATAGCTGGC CTCAATATGT GTGTGTGAAT ACAAACATAC ACAATGTTTG 3060 TATTATCTGT TTCTCTACTG ATCTGTGTCA TCCATCCATA CATACATACT GAATCTTAGT 3120 GCTCCATGGG TGTTTCATAT GTTGGTGGTA TCTCTGTCTC TCAATGTATT TTTTTTTTAA 3180 TTTTTTTGAG ACAGGGTCTC ACTGTAAGGT CCAGGCTGTA GTGCAGTGGT GTGACCNTGG 3240 CTCANTGCAG CCTTGACCTC CCAGGCTCAA ACAATCCCCC AACTTCAGCC TCCTTAGTAG 3300 CTGAGANTAC AGGCATGAAC CACTACACCT GGCTAATTNT TAAATTTTTT GTAGAGATGG 3360 GGTTTTGCTA TGTTGCCACA GCTGGTCTTG AACTCCTGGG CTCAAGAAGT CNTCNNGCNT 3420 CAGCCTCCCA AAGTGCNGGG ATAACAGGTN TGAGGCCACT GTGCCCAGCC TCAGCGTATT 3480 TCTTAACTGG GGTCTGGGTA CTCAAGAGCC AGCACTAAAG GCCCAGGCAG AATGACCCTC 3540 AGAGGCTCTG GCAGAATGAG CAAATGATGC AATGGCTGTA CTTGGGGAGA AAATTGTGAC 3600 TTTCTGGACT CTAAGGCAAC AGCCGTGAGA TCTCACTGGC TCTCTTCATT CTACTCCAGG 3660 GATCTGCCTA CAAACTGGTT TGCTACTTTA CCAACTGGTC CCAGGACCGG CAGGAACCAG 3720 GAAAATTCAC CCCTGAGAAT AT 3742
【０２０８】（２） 配列番号：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：６： GCCAAGGATA TCGGAGCAAC CACCATGGAC C 31
【０２０９】（２） 配列番号：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：無し （ｉｖ）アンチセンス：無し （ｖ）断片のタイプ： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：７： CAGGCAGCAA GGTCATCTAG ACTGCTTCTC TG 32
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＣｇｐ３９−Ｌの一つのスプライス変形の
核酸および推定アミノ酸配列を示す。
【図２】 ＨＣｇｐ３９−Ｌの一つのスプライス変形の
核酸および推定アミノ酸配列を示す。
【図３】 ＨＣｇｐ３９−Ｌの２番目のスプライス変形
の核酸および推定アミノ酸配列を示す。
【図４】 ＨＣｇｐ３９−Ｌの２番目のスプライス変形
の核酸および推定アミノ酸配列を示す。
【図５】 スプライス変形の領域をカバーするＨＣｇｐ
３９−Ｌのゲノムヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
の一部を示す。
【図６】 スプライス変形の領域をカバーするＨＣｇｐ
３９−Ｌのゲノムヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
の一部を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ロバート・ビー・カークパトリック アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ハンターズ・ラン 103番 (72)発明者 マーティン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、ミンゴ・ロード241番

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）配列番号：２または４のアミノ酸を
    含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの連続した少なくとも
    １５塩基を含んでなるポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的
    なポリヌクレオチド；および （ｄ）遺伝コードの縮重によるコドン配列における
    （ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸分子とは異なるポリ
    ヌクレオチドからなる群から選択されるメンバーを含ん
    でなる単離されたポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求
    項１記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
    項１記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチド１ない
    し１４３３、または配列番号：３に示す１ないし１５２
    ６を含んでなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド５２な
    いし１２０６、または配列番号：３に示す５２ないし１
    ２９９を含んでなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 配列番号：２または４のアミノ酸を含ん
    でなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌ
    クレオチド。
  7. 【請求項７】 請求項２に記載のＤＮＡを含んでなるベ
    クター。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターを含んでなる
    宿主細胞。
  9. 【請求項９】 前記したＤＮＡによってコードされるポ
    リペプチドを請求項８の宿主細胞から発現させることか
    らなるポリペプチドの製造方法。
  10. 【請求項１０】 細胞を請求項７に記載のベクターで形
    質転換またはトランスフェクションし、その細胞がベク
    ター中に含まれるヒト・ｃＤＮＡによってコードされる
    ポリペプチドを発現することからなる、ポリペプチドを
    発現する細胞の製造方法。
  11. 【請求項１１】 配列番号：２または４のアミノ酸と少
    なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポ
    リペプチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号：２または４に示すアミノ酸
    配列を含んでなるポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のポリペプチドに対
    するアゴニスト。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のポリペプチドに対
    する抗体。
  15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のポリペプチドの活
    性を阻害するアンタゴニスト。
  16. 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１１に記載のポ
    リペプチドを患者に投与することからなる、ＨＣｇｐ３
    ９−Ｌを必要としている患者の治療方法。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを患
    者に提供し、該ポリペプチドをインビボで発現させるこ
    とによって、治療上有効量の該ポリペプチドを投与す
    る、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 治療上有効量の請求項１５に記載のア
    ンタゴニストを患者に投与することからなる、ＨＣｇｐ
    ３９−Ｌポリペプチドを阻害することを必要としている
    患者の治療方法。
  19. 【請求項１９】 ポリペプチドをコードする核酸配列に
    おける変異を決定することからなる、請求項１１に記載
    のポリペプチドの発現に関係した疾患または疾患に対す
    る感受性を診断する方法。
  20. 【請求項２０】 宿主由来の試料中の請求項１１に記載
    のポリペプチドの存在を解析することからなる診断方
    法。
  21. 【請求項２１】（ａ）配列番号：５のポリヌクレオチド
    と少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの連続した少なくとも
    １５塩基を含んでなるポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的
    なポリヌクレオチド；および （ｄ）遺伝コードの縮重によるコドン配列における
    （ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸分子とは異なるポリ
    ヌクレオチドからなる群から選択されるメンバーを含ん
    でなる単離されたポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求
    項２１記載のポリヌクレオチド。
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