JP2004089190A - ヒト・myt−1キナーゼクローン - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト・Myt−1キナーゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。
【解決手段】(a)特定の配列のアミノ酸を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド;(b)遺伝コードの縮重により、特定の配列のアミノ酸と同じアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド;(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド;および(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続した塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。
【選択図】 なし
【解決手段】(a)特定の配列のアミノ酸を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド;(b)遺伝コードの縮重により、特定の配列のアミノ酸と同じアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド;(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド;および(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続した塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。
【選択図】 なし
Description
本発明は、一部には、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド;該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体;該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドおよびそれらの変種および誘導体の製造方法、該ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニスト;ならびにポリヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。詳細には、これらの点および他の点において、本発明は、Cdc−調節キナーゼ(以下、ヒト・Myt−1キナーゼという)のファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
サイクリン依存性キナーゼ(CDKs)は、細胞周期の進行に必須のセリン/スレオニンキナーゼのファミリーである。それゆえ、これらのキナーゼの活性は堅固に調節されている。哺乳動物において、今日まで少なくとも7種の異なるCDKsが説明されており、CDK1〜7として特徴づけられている。それらは十分に保存されており、40ないし75%の同一性を有している。さらに、高度な類似性が、触媒ドメイン内に関して他のセリン/スレオニン蛋白キナーゼとの間にも示されている。Pines,J.,Semin.Cell Biol.1994,5:399-408;Morgan,D.O.,Nature,1995,374:131-134;およびNigg,N.A.,Bioessays,1995,17:471-480参照。
CDK活性を調節するための種々の機構が用いられて、細胞の正常な周期が堅固に制御されているが、環境の変化に非常に敏感である。Lees,E.,Curr.Opin.Cell Biol.1995,7:773-780。
CDK活性を調節するための種々の機構が用いられて、細胞の正常な周期が堅固に制御されているが、環境の変化に非常に敏感である。Lees,E.,Curr.Opin.Cell Biol.1995,7:773-780。
例えば、細胞の有糸分裂は、M期促進因子(MPF)、Cdc−2蛋白キナーゼ複合体およびサイクリンBにより開始される。MPFの正しい調節により、細胞周期の初期フェーズが完了した後にのみ有糸分裂が起こることが保証される。Tyr15およびThr14におけるCdc2のリン酸化は、間期におけるMPF活性を抑制する。G2期からM期への移行において、Cdc2はTyr15およびT
hr14において脱リン酸化されて、MPFがその有糸分裂基質をリン酸化することが可能になる。
hr14において脱リン酸化されて、MPFがその有糸分裂基質をリン酸化することが可能になる。
Cdc−調節キナーゼの明確なファミリー(Wee−1と呼ばれる)が同定され、特徴づけられた。最初にWee−1は分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)中の重要な有糸分裂レギュレーターとして同定
された(Russell,P.およびNuese,P.,Cell,1987,49:559)。Wee−1相同体は
これまで少なくとも6種の他の生物において同定されている。ヒトおよびアフリカツメガエルにおいて、Wee−1は可溶性酵素であり、Cdc2をTyr15においてリン酸化するがThr14においてはリン酸化しない酵素である(Mueller et al.,Mol.Biol.Cell,1995,6:119;McGowan,C.H.and Russell,P.,EMBO J.,1993,12:75;Parker,L.L.and Piwnica-Worms,H.,Science,1992,257:1995;McGowan,C.H.and Russell,P.EMBO J.,1995,14:2166;Watanabe et al.,ibid.,p.1878)。
された(Russell,P.およびNuese,P.,Cell,1987,49:559)。Wee−1相同体は
これまで少なくとも6種の他の生物において同定されている。ヒトおよびアフリカツメガエルにおいて、Wee−1は可溶性酵素であり、Cdc2をTyr15においてリン酸化するがThr14においてはリン酸化しない酵素である(Mueller et al.,Mol.Biol.Cell,1995,6:119;McGowan,C.H.and Russell,P.,EMBO J.,1993,12:75;Parker,L.L.and Piwnica-Worms,H.,Science,1992,257:1995;McGowan,C.H.and Russell,P.EMBO J.,1995,14:2166;Watanabe et al.,ibid.,p.1878)。
Thr14特異的キナーゼ活性はアフリカツメガエルの卵抽出物の膜フラクションにおいて検出された(Atherton-Fessler et al.Mol.Cell Biol.1994 5:989;Kornbluth et al.,ibid.,p.273)。このThr14特異的キナーゼは固く膜に結合していることも、アフリカツメガエルの卵を用いて示された(Kornbluth et al.,Mol.Biol Cell 1994 5:273-282)。さらに、Thr14特異的Cdcキナーゼ(ア
フリカツメガエル・Myt−1膜結合阻害的キナーゼと呼ばれる)は、最近になって、Cdc2/サイクリンBキナーゼ活性の重要なレギュレーターであることが示された(Mueller et al.,Science,1995,270:86-90)。Myt−1をコード
しているアフリカツメガエル遺伝子の概念的な翻訳により、Myt−1がWee−1ファミリーのキナーゼに最も類似していることが明らかとなった。
フリカツメガエル・Myt−1膜結合阻害的キナーゼと呼ばれる)は、最近になって、Cdc2/サイクリンBキナーゼ活性の重要なレギュレーターであることが示された(Mueller et al.,Science,1995,270:86-90)。Myt−1をコード
しているアフリカツメガエル遺伝子の概念的な翻訳により、Myt−1がWee−1ファミリーのキナーゼに最も類似していることが明らかとなった。
Myt−1キナーゼの調節により、細胞周期における重要な出来事の制御手段が提供される。Myt−1キナーゼの阻害は、細胞の有糸分裂への移行時期を脱調節することになると考えられる。一般的には、このことは、カタストロフィー的有糸分裂を生じ、すべての必須蛋白および/またはDNAが生成される前に細胞が有糸分裂を開始することにより細胞死を引き起こす。よって、Myt−1活性の阻害は、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患の治療において有用であると考えられる。
Myt−1キナーゼのヒト・相同体の同定および特徴づけに対する必要性が明確に存在する。
上記事情に鑑み、本発明は、ポリペプチド、詳細には、図3に示すアミノ酸配列と他の蛋白(例えば、アフリカツメガエル・Myt−1キナーゼ)の既知アミノ酸配列との間の相同性により新規ヒト・Myt−1であると同定されるポリペプチドを提供することを1の目的とする。
さらに、ヒト・Myt−1キナーゼをコードするポリヌクレオチド、詳細には、本明細書で配列番号:2として示されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。
本発明の特に好ましい具体例において、該ポリヌクレオチドは、図1および図2に示す配列中のヒト・ヒト・Myt−1キナーゼをコードする領域を含む。
本発明の態様によれば、mRNA、cDNA、ゲノムDNAを包含するヒト・ヒト・Myt−1キナーゼをコードする単離核酸分子が提供され、さらに本発明態様の具体例において、その生物学的に、診断上、臨床的にまたは治療的に有用な変種、アナログ、あるいは上記変種、アナログおよび誘導体のフラグメントを包含するそれらの誘導体が提供される。
ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼの天然に存在する対立遺伝子変種は本発明の特に好ましい具体例に含まれる。
治療目的、例えば、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患の治療に用いられる、ヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチド、詳細にはヒト・ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドを提供することも本発明の目的である。
本発明の態様によれば、本明細書においてヒト・Myt−1キナーゼと呼ばれるヒト由来の新規ポリペプチド、ならびにその生物学的、診断上または治療上有用なフラグメント、変種およびその誘導体、フラグメントの変種および誘導体、および上記のもののアナログが提供される。
ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子の天然に存在する対立遺伝子によりコードされるヒト・ヒト・Myt−1キナーゼの変種が本発明のこの態様の特に好ましい具体例に含まれる。
本発明のもう1つの態様によれば、本発明キナーゼを活性化する、あるいはその活性化を阻害する化合物のスクリーニング方法も提供される。
上記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変種および誘導体、変種および誘導体のフラグメント、ならびにそれらのアナログの製造方法を提供することが本発明のもう1つの目的である。本発明のこの態様の好ましい具体例において、発現可能に導入された外来のヒト・ヒト・Myt−1キナーゼをコードしているポリヌクレオチドを有する宿主細胞を、宿主中でのヒト・ヒト・Myt−1キナーゼの発現のための条件下で培養し、次いで、発現したポリペプチドを回収することを特徴とする、上記ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドの製造方法が提供される。
本発明のもう1つの目的によれば、特に、研究、生物学、臨床および治療目的に、上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる製品、組成物、手順および方法が提供される。
本発明の特定の好ましい具体例によれば、特に、他の事に使用する製品、組成物および方法も提供され、他の事とは:ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドまたはヒト・Myt−1キナーゼをコードしているmRNAを調べることによる細胞中のヒト・Myt−1キナーゼ発現の評価;本明細書開示のヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに細胞を曝露することによるインビトロ、エクスビボまたはインビボでの、とりわけ白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患の治療;ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子における欠失のごとき遺伝学的変種および変状のアッセイ;およびヒト・Myt−1キナーゼ機能の増大またはヒト・Myt−1キナーゼ機能不全の治癒のための器官へのヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドまたはその活性フラグメントまたはポリヌクレオチドの投与である。
本発明のもう1つの具体例によれば、ヒト・Myt−1キナーゼの発現低下に関連する症状の治療のために本発明受容体ポリペプチドを刺激するかかる活性化化合物の使用方法が提供される。
本発明のもう1つの態様によれば、ヒト・Myt−1キナーゼの過剰発現に関連する症状の治療のためにかかる阻害化合物を使用する方法も提供される。
本発明のもう1つの態様によれば、本発明ヒト・Myt−1キナーゼの少なくとも1個のドメインについて保存的アミノ酸置換を有するフラグメント、コンセンサスフラグメントおよび/または配列である、非天然合成、単離および/または組み換えヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドが提供され、かかるポリペプチドは、ヒト・Myt−1キナーゼの受容体またはリガンドへの結合を定量的または定性的に転調させることができる。
本発明のさらにもう1つの態様によれば、予想される生物学的特性のため、リガンドに結合することまたはリガンド結合を転調させることによりヒト・Myt−1キナーゼ機能に対する潜在的モジュレーターとして有用でありうる合成または組み換えヒト・Myt−1キナーゼポリペプチド、その保存的置換物および誘導体、それらに対する抗体、抗−イディオタイプ抗体、ならびに組成物および方法が提供され、それらを診断、治療および/または研究用に用いることができる。
種々のヒト・Myt−1キナーゼまたはそのフラグメントを阻害または模倣するように設計された、合成、単離または組み換えポリペプチドを提供することが本発明のさらにもう1つの目的である。
本発明のこの態様および他の態様の特定の好ましい具体例において、ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼ配列とハイブリダイゼーションするプローブが提供される。
本発明のこの態様のさらなる好ましい具体例において、ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドに対する抗体が提供される。この点において特定の好ましい具体例において、抗体はヒト・Myt−1キナーゼに対して非常に選択的である。
本発明のさらなる態様において、ヒト・Myt−1キナーゼのアゴニストが提供される。ヒト・Myt−1キナーゼを模倣し、ヒト・Myt−1キナーゼが結合する分子または受容体分子に結合し、ヒト・Myt−1キナーゼにより誘導される応答を誘発または増大させる分子は好ましいアゴニストに含まれる。ヒト・Myt−1キナーゼまたはヒト・Myt−1キナーゼポリペプチド、あるいはヒト・Myt−1キナーゼ活性を有する他のモジュレーターと相互作用し、そのことによりヒト・Myt−1キナーゼの1つの効果またはヒト・Myt−1キナーゼの1つよりも多い効果を有効ならしめ、あるいは増大させる分子も好ましいアゴニストに含まれる。
本発明のさらなる態様によれば、ヒト・Myt−1キナーゼアンタゴニストが提供される。ヒト・Myt−1キナーゼを模倣してヒト・Myt−1キナーゼ受容体または結合分子に結合するがヒト・Myt−1キナーゼにより誘導される1つの応答またはヒト・Myt−1キナーゼにより誘導される1つよりも多い応答を誘発しないものは好ましいアンタゴニストに含まれる。ヒト・Myt−1キナーゼと結合または相互作用してヒト・Myt−1キナーゼの1つの効果またはヒト・Myt−1キナーゼの1つよりも多い効果を阻害し、あるいはヒト・Myt−1キナーゼの発現を妨げる分子も好ましいアンタゴニストに含まれる。
本発明のさらなる態様において、インビトロで細胞に、エクスビボで細胞に、さらにはインビボで細胞に投与される、あるいは多細胞器官に投与されるヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチドまたはヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドを含んでなる組成物が提供される。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例において、組成物は、疾病の治療のための宿主生物中でのヒト・Myt−1キナーゼポリペプチド発現のためのヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチドを含んでなる。この点に関して、変化した内在ヒト・Myt−1キナーゼ活性に関連した機能不全の治療のためのヒト患者における発現が特に好ましい。
本発明の他の態様、特徴、利点および態様は下記説明から当業者に明らかとなろう。しかしながら、下記説明および特定の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すものであるが、説明のためだけのものであることを理解すべきである。本発明の精神の範囲内での種々の変更および修飾は、下記説明を読み、本開示の他の部分を読めば当業者に容易に明らかとなろう。
用語集
下記の説明は本明細書、特に実施例における特定の用語の理解を容易にするためのものである。
下記の説明は本明細書、特に実施例における特定の用語の理解を容易にするためのものである。
「DNAの消化」とは、DNA中の特定配列にのみ作用する制限酵素でのDNAの触媒的開裂をいう。本明細書の種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、コファクターおよび使用される他の必要物は知られており、当業者にとり日常的である。
分析目的には、典型的には、20μlの反応バッファー中で1μgのDNAフラグメントを約2ユニットの酵素で消化する。プラスミド構築用のDNAフラグメントの単離目的には、典型的には、反応規模に応じて反応体積を増加させて5ないし50μlのDNAを20ないし250ユニットの酵素で消化する。
個々の制限酵素に適するバッファーおよび基質量は標準的な研究室用マニュアル、例えば、後に引用する文献に記載されており、それらは市販業者により詳述されている。
37℃で1時間のインキュベーション時間を通常使用するが、標準的手順、販売者の指示および個々の反応に応じて条件を変化させてもよい。消化後、反応物を分析することができ、当業者にとり日常的な既知方法を用いてアガロースまたはポリアクリルアミドゲルゲルによりフラグメントを精製することができる。
「遺伝学的エレメント」とは、一般的には、ポリペプチドをコードしている領域、あるいは転写または翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現にとり重要な他のプロセスを調節する領域を含んでなるポリヌクレオチドを意味し、あるいはポリペプチドをコードしている領域および発現調節領域に作動可能に連結された領域の両方を含んでなるポリヌクレオチドを意味する。
遺伝学的エレメントはベクター中に含まれていてもよく、ベクターはエピソームエレメントとして複製するものであり、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立した分子として複製するものである。遺伝学的エレメントは、真核細胞におけるメトトレキセート選択によりトランスフェクションされたDNAの増幅期間中に生じるようなミニ染色体に含まれていてもよい。遺伝学的エレメントは宿主細胞ゲノムに含まれていてもよく、それらは天然の状態でなないが、特に、精製DNAまたはベクター中の形態で単離、クローニングおよび宿主細胞中へ導入される。
「単離」とは、「人の手」によって天然状態から変化させられていることを意味し、すなわち、天然において単離される場合には、本来の環境から変化させられ、あるいは本来の環境から除去されること、あるいはその両方を意味する。例えば、天然状態の生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、天然状態における共存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書の用語によれば「単離」されたものである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、用語「単離」は、それが天然において存在している染色体および細胞から分離されていることを意味する。
単離の一部として、あるいは単離後に、例えば、突然変異により融合蛋白を得るために、そして宿主中での増殖または発現のために、かかるポリヌクレオチドをDNAのごとき他のポリヌクレオチドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチドは、単独またはベクターのごとき他のポリヌクレオチドと結合されて、培養細胞または生物そのものに導入されうる。培養宿主細胞または生物そのものへ導入された場合、本明細書の用語によれば、かかるDNAはやはり単離されるものである。なぜなら、それらは天然に存在する形態でなく、あるいは天然環境に存在するものでないからである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、培地処方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの例えば細胞中への導入のための溶液、化学反応または酵素反応のための組成物または溶液(それらは天然には存在しない組成のものであり、その中で単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは本明細書にいう単離された状態となっている)の中に存在していてもよい。
「連結」とは、しばしば2本鎖DNAである2個またはそれ以上のポリヌクレオチド間のホスホジエステル結合形成プロセスをいう。連結方法は当該分野においてよく知られており、連結プロトコールは標準的な研究室用マニュアルおよび文献に記載されており、例えば、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)(「Sambrook」という)および下で引用するManiatis et al.,の146頁に記載されている。
「オリゴヌクレオチド」とは比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばしば、該用語は1本鎖デオキシリボヌクレオチドをいうが、1本鎖または2本鎖リボヌクレオチド、RNA:DNAハイブリッドおよびとりわけ2本鎖DNAも指すことがある。
1本鎖DNAプローブオリゴヌクレオチドのごときオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴヌクレオチド合成のごとき化学的方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドを種々の方法により製造することができ、それらはインビトロ組み換えDNAによる方法ならびに細胞および生物におけるDNA発現による方法を包含する。
化学合成されたDNAは、典型的には最初に5’リン酸を欠く形で得られる。かかるオリゴヌクレオチドの5’末端は、典型的には組み換えDNA分子を得るためにDNAリガーゼを用いる連結反応によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドの連結が所望の場合には、キナーゼおよびATPを用いるような標準的方法によりリン酸を付加することができる。
一般的には、化学合成されたオリゴヌクレオチドの3’末端は遊離ヒドロキシル基を有し、T4 DNAリガーゼのごときリガーゼの存在下で、他のオリゴヌ
クレオチドのごとき他のポリヌクレオチドの5’ホスフェートとの間にホスホジエステル結合を容易に形成する。よく知られているように、所望ならば、連結の前に他のポリヌクレオチドの5’ホスフェートを除去することによりこの反応を選択的に防止することができる。
クレオチドのごとき他のポリヌクレオチドの5’ホスフェートとの間にホスホジエステル結合を容易に形成する。よく知られているように、所望ならば、連結の前に他のポリヌクレオチドの5’ホスフェートを除去することによりこの反応を選択的に防止することができる。
「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一部とはならずに安定に遺伝する遺伝学的エレメントである。プラスミドは、細胞複製中におけるその複製および安定な遺伝を保証し、医学、農学および環境的に重要な生成物をコードしていてもよい分子をコードしている。例えば、プラスミドは、病原性細菌の毒性をおおいに増大させるトキシンをコードしていてもよい。またプラスミドは、抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードしていてもよい。プラスミドは、組み換え遺伝子をクローン化し発現するのに使用するベクターとして分子生物学において広く用いられている。一般的には本明細書において「プラスミド」は、当業者によく知られた慣用的命名法により、大文字および/または数字が前および/または後に続く小文字の「p」により命名される。本明細書開示の出発プラスミドは市販のもの、制限なく公的に利用可能なものであるか、あるいはよく知られた公表された方法を用いて利用可能なプラスミドから日常的に構築可能なものである。本発明により使用可能な多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターはよく知られており、当業者が容易に入手できるものである。そのうえ、当業者は、本発明における使用に適するどのような数のプラスミドであっても容易に構築することができる。本発明におけるかかるプラスミドならびに他のベクターの特性、構築および使用は、本開示から当業者に容易に明らかとなろう。
一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、未修飾RNAまたはDNAあるいは修飾RNAまたはDNAであってよい。よって、本明細書の用語ポリヌクレオチドは、特に、1本鎖および2本鎖DNA、1本鎖および2本鎖領域の混ざったDNA、1本鎖および2本鎖RNA、および1本鎖および2本鎖領域の混ざったRNAをいい、より典型的には、2本鎖のものまたは1本鎖および2本鎖領域の混ざったものをいう。さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAあるいはRNAおよびDNAの両方を含んでなる3本鎖をいう。かかる領域中の鎖は同じ分子由来であってもよく、また異なる分子由来であってもよい。その領域は1つまたはそれ以上の分子の全体を含みうるが、典型的には、いくつかの分子の1の領域を含む。3本鎖らせん領域の分子の1つは、しばしば、1のオリゴヌクレオチドである。さらに本明細書の用語ポリヌクレオチドは、1個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記DNAまたはRNAを包含する。よって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAは、本明細書にいう「ポリヌクレオチド」である。そのうえ、例えばイノシンまたはトリチウム化された修飾塩基のごとき普通でない塩基を含んでなるDNAまたはRNAも本明細書にいうポリヌクレオチドである。当業者に知られた多くの有用な目的の非常に多くの修飾がDNAおよびRNAについて行われていることが認識されよう。本明細書の用語ポリヌクレオチドは、かかる化学的に、酵素的、あるいは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特にウイルスの特徴および単一・複合細胞を包含する細胞の特徴を示すDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。
本明細書の用語「ポリペプチド」を以下に説明する。ポリペプチドの基本的構造はよく知られており、当該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載されている。この点からすると、用語ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに直鎖状に結合した2個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたは蛋白をいうために用いられる。本明細書において該用語は短鎖(当該分野において通常にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーという)および長鎖(当該分野において一般的には蛋白といい、種々のタイプがある)の両方をいう。
ポリペプチドは、しばしば20個の天然アミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含み、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスのみならず当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を一定のポリペプチド中で修飾できることが理解されよう。ポリペプチドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも、ここに挙げるには膨大すぎるが、それらは基本的な教科書およびさらに詳細な研究論文に記載されており、さらには膨大な研究文献にも記載されており、それらは当業者によく知られている。本発明ポリペプチド中に存在してもよい知られている修飾のうち、少しの例を挙げると、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシレーション、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニレーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、アルギニン化のごとき転移−RNAにより媒介される蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがある。かかる修飾は当業者によく知られており、科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特によく行われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質付加は、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,New York(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されている。多くの詳細なレビューがこの問題について利用でき、例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(1983)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Prespectives and Prospects,pgs.1-12;Seifter et al.,Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)およびRattman et al.,Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging.Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992)にある。
よく知られたことであるが、上記したように、ポリペプチドは常に完全に直鎖状であるとは限らないことが理解されよう。例えば、一般的には、天然に起こるプロセッシングおよび自然には起こらない人間による操作を包含する翻訳後の出来事の結果として、ポリペプチドは至る所で分枝しており、また、分枝ありまたはなしで環状であったりする。非翻訳的天然プロセスおよび全くの合成法によっても、環状、分枝、および分枝つき環状のポリペプチドが合成されうる。
ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端およびカルボキシル末端を包含するポリペプチドのいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、ポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら両方の共有結合によるブロックは、天然および合成ポリペプチドにおいてよく起こるものであり、かかる修飾が本発明ポリペプチド中に存在してもよい。例えば、蛋白分解プロセッシングの前にイー・コリ(E.coli)において作られるポリペプチドのアミノ末端残基はほとんど例外なくN−ホルミルメチオニンである。
ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しばしば、それがいかにして作られるのかという機能であろう。例えば、宿主中でクローンされた遺伝子を発現することにより作られるポリペプチドは、宿主細胞翻訳後修飾能およびポリペプチドのアミノ末端に存在する修飾シグナルによって、修飾の性質および程度の大部分が決定される。例えば、よく知られているように、グリコシレーションは、しばしば、E.coliのごとき細菌細胞においては起こらない。したがって、グリコシレーションが望まれる場合には、ポリペプチドをグリコシレーションする宿主中、一般的には真核細胞中で発現すべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後グリコシレーションを行うので、昆虫細胞発現系は、特に無傷のグリコシレーションパターンを有する哺乳動物蛋白を効率よく発現するために開発されてきた。
同じタイプの修飾が一定のポリペプチドにおいて同じ部位またはいくぶん異なった部位においていくつか存在しうることが理解されよう。また、一定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含みうる。
一般的には本明細書の用語「ポリペプチド」は、かかる修飾すべてを含み、詳細には、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることにより合成されるポリペプチド中に存在する修飾物を含む。
本明細書の用語ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「変種」とは、もとのポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。この意味において変種は本開示の以下の部分およびいずれかの部分においてより詳細に説明される。
変種は、もとのポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドを包含する。一般的には、相違は、もとのヌクレオチド配列と変種ヌクレオチド配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同一であるようなものに限られる。
下記のごとく、変種におけるヌクレオチド配列の変化がサイレントであってもよい。すなわち、それらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させなくてもよい。変化がこのタイプのサイレント変化に限定される場合、変種はもとのポリペプチドと同じアミノ酸配列をコードしているであろう。また、下記のごとく、変種におけるヌクレオチド配列の変化が、もとのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させたものであってもよい。下記のごとく、かかるヌクレオチド変化は、もとの配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を引き起こし得る。
また変種は、もとのポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチドも包含する。一般的には、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同一であるようなものに限られる。
変種ともとのポリペプチドとは、1個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合および切断によりアミノ酸配列が異なっていてもよく、それらはいずれの組み合わせにおいて存在してもよい。
本明細書の用語「融合蛋白」は、2種の、しばしば無関係な融合遺伝子またはそれらのフラグメントによりコードされている蛋白である。EP−A−O464533(カナダ対応2045869)には、別のヒト・蛋白またはその一部分と結合した免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を含む融合蛋白が開示されている。いくつかの場合において、融合蛋白の一部として免疫グロブリンFc領域を用いることは、例えば、改善された薬物動態特性を得る治療および診断において有用である(EP−A0232262)。一方、ある種の使用については、融合蛋白が発現され、検出され、精製された後にFc部分を欠失できることが好ましい。したがって、融合蛋白の構成成分を開裂可能な連結領域に化学的または酵素的に結合させることが望ましい。このような場合とは、Fc部分は治療および診断における使用を妨げることがわかっているような場合であり、例えば、融合蛋白を免疫のための抗原として用いる場合である。薬剤の発見において、例えば、shIL−5−αのごときヒト・蛋白をFc部分と融合させて、hIL−5のアンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニングに用いる。D.Bennett et al.,Journal of Molecular Recognition,1995,8:52-58;およびK.Johanson et al.,The Journal of Biological Chemistry,1995,270(16):9459-9471参照。
よって、本発明は、ヒト・Myt−1キナーゼまたはその一部分、および種々のサブクラス(IgG、IgM、IgA、IgE)の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含む、遺伝子操作による可溶性融合蛋白にも関する。ヒト・IgG、詳細にはIgG1の重鎖の不変領域が免疫グロブリンとして好ましい(ヒンジ領域で融合が起こる)。1の具体例において、血液凝固因子Xaで開裂されうる開裂配列を含ませることのみにより、Fc部分を除去することができる。さらに本発明は、遺伝子操作によるこれらの融合蛋白の製造方法、ならびに診断および治療における融合蛋白の使用に関する。本発明のさらなる態様は、かかる融合蛋白をコードしているポリヌクレオチドに関する。
膜結合受容体は融合蛋白の形成において特に有用である。一般的には、かかる受容体は、3つの異なる構造領域(細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン)を有することにより特徴づけられる。本発明は、これらの領域の1つまたはそれ以上を融合蛋白の構成成分として使用することを企図する。かかる融合蛋白法の例はWO94/29458およびWO94/22914に見いだされる。
「結合分子」(あるいは「相互作用分子」または「受容体構成成分因子」とも呼ばれる)は、本発明受容体ポリペプチドに特異的に結合またはこれと相互作用するリガンドを包含する分子をいう。かかる結合分子は本発明の一部分をなす。結合分子は、本発明ポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体由来の試薬のごとき天然に存在しないものであってもよい。
当該技術分野で知られた用語である、2つのポリペプチド間の「類似性」は、1のポリペプチドアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換をもう1つのポリペプチドの配列と比較することにより決定される。そのうえ、当該技術分野で知られた用語である「同一性」とは、2つのポリペプチドまたは2つのポリヌクレオチド間の配列関連性の程度を意味し、かかる2つの配列間の合致により決定される。同一性および類似性は両方とも容易に計算されうる(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing Informations and Genome Projects,Smith,D.W.,ed,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.and Griffin,H.G.,eds,Humana Press,New Jersey,1994;Srquence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.eds.,M Stockton Press,New York,1991)。2
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性および類似性の多くの測定方法が存在するが、用語「同一性」および「類似性」は当業者によく知られている(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.and Devereux,J.eds.,M Stockton Press,New York,1991;およびCarillo,H.,and Lipmn,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988))。2つの配列間の同一性または類似性の決定に広く用いられる方法は、Carillo,H.,and Lipmn,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に開示されたものを包含するが、これに限らない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される2つの配列間の合致が最大となるように設計される。同一性および類似性を決定する方法はコンピュータープログラムにおいて集成されている。2つの配列間の同一性および類似性の決定に好ましいコンピュータープログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP,BLASTAN,FASTA(Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990))を包含するが、これらに限らない。
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性および類似性の多くの測定方法が存在するが、用語「同一性」および「類似性」は当業者によく知られている(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.and Devereux,J.eds.,M Stockton Press,New York,1991;およびCarillo,H.,and Lipmn,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988))。2つの配列間の同一性または類似性の決定に広く用いられる方法は、Carillo,H.,and Lipmn,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に開示されたものを包含するが、これに限らない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される2つの配列間の合致が最大となるように設計される。同一性および類似性を決定する方法はコンピュータープログラムにおいて集成されている。2つの配列間の同一性および類似性の決定に好ましいコンピュータープログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP,BLASTAN,FASTA(Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990))を包含するが、これらに限らない。
発明の詳細な説明
本発明は、以下に詳細に説明するように、特に新規ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、アミノ酸配列の相同性により、アフリカツメガエル・Myt−1キナーゼに関連する新規ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図1、図2および図3に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するヒト・Myt−1キナーゼに関する。
本発明は、以下に詳細に説明するように、特に新規ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、アミノ酸配列の相同性により、アフリカツメガエル・Myt−1キナーゼに関連する新規ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図1、図2および図3に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するヒト・Myt−1キナーゼに関する。
ポリヌクレオチド
本発明の1の態様によれば、図3の推定アミノ酸配列を有するヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
本発明の1の態様によれば、図3の推定アミノ酸配列を有するヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
図1および図2に示すポリヌクレオチド配列のごとき本明細書の情報を用いれば、ヒト・Myt−1キナーゼをコードしている本発明ポリヌクレオチドを、標準的クローニングおよびスクリーニング法を用いて得ることができる。本発明の説明として、図1および図2に示すポリヌクレオチドは、発現配列タグ(EST)分析(Adams,M.D.et al.Science,(1991),252:1651-1656;Adams,M.D.et al.,Nature,(1992),355:632-634;Adams,M.D.,et al.,Nature,(1995),377 Supp:3-174)を用いて慢性リンパ性白血病細胞系の細胞から得られたものである。ヒト・Myt−1遺伝子がアフリカツメガエル・Myt−1と同じサイズであるという仮定に基づけば、この部分クローンは、推定の全長クローンの約87%である。他の部分長クローンは乳癌、骨髄および睾丸のライブラリーから同定されている。
図1および図2、ならびに配列番号:1に示すcDNA配列の配列決定の結果により示されるように、本発明ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼは他のWee−1ファミリーのキナーゼに構造的に関連している。それは、約479個のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠を含んでいる。ヒト・Myt−1キナーゼはアフリカツメガエル・Myt−1キナーゼに対して69.5%のアミノ酸類似性(50.5%の同一性)を有する。該クローンは、Wee−1キナーゼファミリーの特徴的なキナーゼドメインの典型的な5’側の保存されたアミノ酸をコードしている。また該クローンは、タイプIIの膜貫通蛋白であるアフリカツメガエル・Myt−1の膜局在化と矛盾しない推定上の膜貫通ドメインを含んでいる。このヒト・クローンのC末端領域は、Mytの調節に関与していると考えられる数個の潜在的リン酸化部位を有している。
本発明ポリヌクレオチドは、mRNAのごときRNA形態であってもよく、あるいは例えばクローニングまたは化学合成法またはそれらの組み合わせにより得られるcDNAおよびゲノムDNAを包含するDNA形態であってもよい。DNAは2本鎖または1本鎖であってよい。1本鎖DNAはコーディング鎖(センス鎖としても知られる)であってもよく、あるいは非コーディング鎖(アンチ−センス鎖としても知られる)であってもよい。
ポリペプチドをコードしているコーディング配列は、図1および図2、配列番号:1に示すポリヌクレオチドのコーディング鎖と同じであってもよい。コーディング鎖は別の配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、それは、遺伝コードの縮重の結果として図3、配列番号:2のポリペプチドをコードしているものであってもよい。
図3のポリペプチドをコードしている本発明ポリヌクレオチドは、それらにより示されるポリペプチドに関するコーディング配列;当該ポリペプチド配列およびリーダー配列または分泌配列(プレ−またはプロ−またはプレプロ−蛋白配列)をコードしているような付加的配列に関するコーディング配列;さらなる非コーディング配列(例えば、イントロンおよび転写されるが翻訳されない非コーディング5’および3’配列(転写、mRNAプロセッシング−スプライシングおよびポリアデニレーションシグナルを包含−リボソーム結合およびmRNA安定性において役割を果たす);さらなるコーディング配列(さらなる官能基を提供するさらなるようなアミノ酸をコードしている)を伴った上記の付加的配列を有するあるいは有していないポリペプチドに関するコーディング配列(これらに限らない)を包含してもよい。よって、例えば、ポリペプチドがペプチドのごときマーカー配列に融合していてもよく、該マーカー配列は融合ポリペプチドの精製を容易にするものであってよい。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例において、マーカー配列は、特にpQEベクター(Qiagen,Inc)中のタグのごときヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くが市販されている。例えば、Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86,821-824(1989)に記載のごとく、ヘキサ
ヒスチジンは融合蛋白の精製を便利にする。HAタグはインフルエンザ・ヘマグルチニン蛋白に対応するものであり、例えば、Wilson et al.,Cell 37:767(1984)に記載されている。
ヒスチジンは融合蛋白の精製を便利にする。HAタグはインフルエンザ・ヘマグルチニン蛋白に対応するものであり、例えば、Wilson et al.,Cell 37:767(1984)に記載されている。
上記によれば、本明細書の用語「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプチド、詳細には、図3、配列番号:2に示すアミノ酸配列を有するヒト・ヒト・Myt−1キナーゼをコードしている配列を含むポリヌクレオチドを包含する。該用語は、さらなる領域(コーディングおよび/または非コーディング配列を含んでいてもよい)を伴ったポリペプチド(例えば、イントロンにより分断されている)をコードしている単一の連続領域または不連続領域を含むポリヌクレオチドを包含する。
さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドの変種に関する。該変種は図3の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードしている。ポリヌクレオチドの変種は、天然に存在する対立遺伝子変種のごとき天然に存在する変種であってもよく、あるいは天然に存在することが知られていない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチドの非天然変種を、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される突然変異法を包含する突然変異法により作成してもよい。
この点において、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって上記ポリヌクレオチドと異なる変種も「変種」に含まれる。置換、欠失または付加には1個またはそれ以上のヌクレオチドが関与しうる。変種はコーディング配列または非コーディング配列あるいはそれらの両方において変化していてもよい。コーディング配列の変化が保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じるものであってもよい。
この点において本発明の特に好ましい具体例は、図3に示すヒト・Myt−1キナーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド;その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにその変種、アナログおよび誘導体のフラグメントである。この点において、ヒト・Myt−1キナーゼ変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコードしているポリヌクレオチドであって、図3のヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドのアミノ酸配列を有するものがさらに特に好ましく、該アミノ酸中、いくつかの、少数の、5ないし10個、1ないし5個、1ないし3、2、1個または0個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されており、あるいはそれらが組み合わされている。これらのうち特に好ましいのは、サイレント置換、付加および欠失であり、それらはヒト・Myt−1キナーゼの特性および活性を変化させない。また、この点において、保存的置換が特に好ましい。置換を有しない図3のアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが最も好ましい。
本発明のさらに好ましい具体例は、図3に示すアミノ酸配列を有するヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。あるいはまた、本明細書記載のライブラリーから得られるヒト・cDNAのヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも80%同一である領域を含むポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドが非常に好ましい。この点において、上記ポリペプチドに対して少なくとも90%同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、特に好ましいのは、少なくとも95%同一のものである。さらにそのうえ、少なくとも97%同一のものが非常に好ましく、少なくとも98ないし99%同一のものが特に非常に好ましく、少なくとも99%のものが最も好ましい。
そのうえ、この点において特に好ましい具体例は、図1および図2のcDNAによりコードされるポリペプチドのいずれかと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。
さらに本発明は、本明細書において上で述べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。この点において本発明は、特に、厳密な条件下で本明細書において上で述べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の用語「厳密な条件」とは、少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%同一である配列間においてのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してさらに本明細書で議論するように、例えば、上記本発明ポリヌクレオチドをcDNAおよびゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ヒト・Myt−1キナーゼをコードしている全長のcDNAおよびゲノムクローンを単離してもよく、また、ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子に対して高度の配列類似性を有するcDNAおよび他の遺伝子のゲノムクローンを単離してもよい。一般的には、かかるプローブは少なくとも15個の塩基を含んでなる。好ましくは、かかるプローブは少なくとも30個の塩基を有し、少なくとも50個の塩基を有していてもよい。特に好ましいプローブは少なくとも30個の塩基を有し、50個またはそれ以下の塩基を有するであろう。
例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知DNA配列を用いてヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子のコーディング領域を単離することができる。次いで、本発明遺伝子配列に対する配列相補性を有する標識オリゴヌクレオチドを用いてヒト・cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAライブラリーをスクリーニングしてライブラリーのどのメンバーがプローブにハイブリダイゼーションするのかを決定する。
本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、ヒトの疾病の治療および診断のための研究試薬および材料として用いてもよい(特に、ポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書でさらに議論する)。
ポリヌクレオチドは、当該蛋白およびさらなるアミノ末端もしくはカルボキシル末端アミノ酸、あるいはポリペプチドに対するさらなる内部アミノ酸(ペプチド形態が1種よりも多いポリペプチド鎖を有する場合)であるポリペプチドをコードしていてもよい。かかる配列は、前駆体から個々の形態への蛋白のプロセッシングにおいて役割を果たしている可能性があり、蛋白輸送を容易にする可能性があり、蛋白半減期を延長または短縮する可能性があり、あるいは特に、アッセイまたは製造のために蛋白の取り扱いを容易にする可能性もある。in situにお
ける一般的な場合には、細胞酵素により、さらなるアミノ酸がプロセッシングにより蛋白から除去されうる。
ける一般的な場合には、細胞酵素により、さらなるアミノ酸がプロセッシングにより蛋白から除去されうる。
1またはそれ以上のプロ配列に融合した特別の形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白は、そのポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去される場合、一般的にはかかる不活性前駆体が活性化される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化前に除去される。一般的にはかかる前駆体はプロ蛋白と呼ばれる。
まとめると、本発明ポリヌクレオチドは、蛋白、蛋白およびリーダー配列(プレ蛋白ともいわれる)、プレ蛋白のリーダー配列でない1個またはそれ以上のプロ配列を有する蛋白の前駆体、あるいは1個またはそれ以上のプロ配列(一般的には、活性形態または他の形態のポリペプチドを生じるプロセッシング工程の間に除去される)を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしていてもよい。
ポリペプチド
さらに本発明は、図3、配列番号:2の推定アミノ酸配列を有するヒト・ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドに関する。また本発明は、これらのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図3のポリペプチドについていう場合、かかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋白部分の開裂により活性化されて活性ポリペプチドを生じうるプロ蛋白を包含する。
さらに本発明は、図3、配列番号:2の推定アミノ酸配列を有するヒト・ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドに関する。また本発明は、これらのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図3のポリペプチドについていう場合、かかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋白部分の開裂により活性化されて活性ポリペプチドを生じうるプロ蛋白を包含する。
本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチドである。
図3のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは以下のものである:(i)1個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基(好ましくは、保存的アミノ酸残基)で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされているものであっても、コードされていないものであってもよく、あるいは(ii)1個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)ポリペプチドの半減期を延長させるような別の化合物(例えば、ポリエチレングリコール)にポリペプチドが融合しているもの、あるいは(iv)リーダーまたは分泌配列、またはポリペプチドの精製に用いられる配列、またはプロ蛋白配列のごときさらなるアミノ酸がポリペプチドに融合しているもの。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
この点において、図3に配列番号:2としてに示すヒト・Myt−1キナーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体は本発明の特に好ましい具体例に属する。あるいはまた、この点において、本発明の特に好ましい具体例は、ヒト・Myt−1キナーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
保存的アミノ酸置換によって元のものとは異なる変種も好ましい変種に属する。かかる置換は、ポリペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸で置換するものである。典型的に見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIle間での相互置換;水酸基を有するSerおよびThrの相互置換、酸性残基AspおよびGluの相互置換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基性残基LysおよびArgの置換、ならびに芳香族残基Phe、Tyr間の置換である。
この点において、いくつかの、少数の、5ないし10個の、1ないし5個の、1ないし3、2、1個の、または0個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加(あるいはそれらのいずれかの組み合わせ)されている図3のヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドのアミノ酸配列を有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体がさらに特に好ましい。ヒト・Myt−1キナーゼの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失がこれらのうちで特に好ましい。また、この点において、保存的置換が特に好ましい。置換のない図3のアミノ酸配列を有するポリペプチドがもっとも非常に好ましい。
好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均一にまで精製されている。
本発明ポリペプチドは、配列番号:2のポリペプチド(詳細には成熟ポリペプチド)ならびに配列番号:2のポリペプチドに対して少なくとも70%の同一性を有し、より好ましくは配列番号:2のポリペプチドに対して少なくとも90%の類似性(より好ましくは少なくとも90%の同一性)を有し、さらにより好ましくは配列番号:2のポリペプチドに対して少なくとも95%の類似性(さらに好ましくは少なくとも95%の同一性)を有するポリペプチドを包含し、また、かかるポリペプチドの部分も包含する(ポリペプチドに対するかかる部分は一般的には少なくとも30個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも50個のアミノ酸を含む)。
本発明ポリペプチドのフラグメントまたは部分を、ペプチド合成による対応する全長のポリペプチドの合成に使用してもよい。それゆえ、フラグメントを全長のポリペプチドの製造のための中間体として使用してもよい。本発明ポリペプチドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成してもよい。フラグメントは「フリー−スタンディング(free-standing)」、す
なわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でなく、それらに融合していないものであってよく、あるいはかかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含まれていて、その一部分または領域となっていてもよい。大きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中のフラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしながら、単一のより大きなポリペプチド中にいくつかのフラグメントが含まれていてもよい。例えば、特定の好ましい具体例は、宿主における発現のために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれていて、ヒト・Myt−1キナーゼフラグメントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリペプチド領域ならびに該フラグメントのカルボキシル末端に融合したさらなる領域を有している本発明ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドのフラグメントに関する。それゆえ、本明細書における意味の1の態様において、フラグメントとは、ヒト・Myt−1キナーゼ由来の融合ポリペプチドまたは融合蛋白の一部または部分をいう。
なわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でなく、それらに融合していないものであってよく、あるいはかかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含まれていて、その一部分または領域となっていてもよい。大きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中のフラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしながら、単一のより大きなポリペプチド中にいくつかのフラグメントが含まれていてもよい。例えば、特定の好ましい具体例は、宿主における発現のために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれていて、ヒト・Myt−1キナーゼフラグメントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリペプチド領域ならびに該フラグメントのカルボキシル末端に融合したさらなる領域を有している本発明ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドのフラグメントに関する。それゆえ、本明細書における意味の1の態様において、フラグメントとは、ヒト・Myt−1キナーゼ由来の融合ポリペプチドまたは融合蛋白の一部または部分をいう。
本発明ポリペプチドフラグメントの典型例として、長さが約5ないし15個、10ないし20個、15ないし40個、30ないし55個、41ないし75個、41ないし80個、41ないし90個、50ないし100個および75ないし100個、90ないし115個、100ないし125個、および110ないし113個のアミノ酸のものを挙げることができる。
この文脈において、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数個、少数、5、4、3、2、1個のアミノ酸の分だけ大きいまたは小さい範囲(上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲において)を包含する。例えば、この文脈において、約40ないし90個のアミノ酸は、40プラスマイナス数個、少数、5、4、3、2、1個から、90プラスマイナス数個、少数、5、4、3、2、1個までのポリペプチドフラグメントを意味し、すなわち、広くは40マイナス数個から90プラス数個のアミノ酸、狭くは40プラス数個から90マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点において、列挙した範囲プラスまたはマイナス5個程度のアミノ酸(上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲において)が非常に好ましい。列挙した範囲プラスまたはマイナス3個程度のアミノ酸(上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲において)が特に非常に好ましい。列挙した範囲プラスまたはマイナス1個程度のアミノ酸(上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲において)または列挙した範囲そのものが特に非常に好ましい。この点において、約5ないし15個、10ないし20個、15ないし40個、30ないし55個、41ないし75個、41ないし80個、41ないし90個、50ないし100個および75ないし100個、90ないし115個、100ないし125個、および110ないし113個のアミノ酸の長さのフラグメントが最も好ましい。
ヒト・Myt−1キナーゼの切断された変異種は本発明の特に好ましいフラグメントに含まれる。切断された変異種は、図3のアミノ酸配列を有するヒト・Myt−1キナーゼポリペプチド、あるいはその変種または誘導体を包含するが、アミノ末端を含む連続した一連の残基(すなわち、連続した領域、部分または一部分)の欠失、あるいはカルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠失、あるいは二重切断変異種中(double truncation mutants)にあるような2つの連
続した残基の欠失(1つはアミノ末端を含み、もう1つはカルボキシル末端を含む)は除く。本発明の特に好ましい膜結合受容体のフラグメントは、細胞外ドメイン(それに付随する膜貫通および細胞質ドメインは伴わない)ならびに膜貫通領域の欠失(細胞外ドメインは細胞質ドメインに直接融合する)を含む可溶性形態の受容体を包含する。例えば、公開されたPCT出願WO94/03620参照。あるいはまた、本発明フラグメントは、膜貫通領域のみの欠失ならびに細胞質ドメインの少なくとも一部の保持を含んでいてもよく、あるいはWO96/04382に記載されたような別の細胞質ドメインの少なくとも一部が融合していてもよい。上に示したサイズ範囲のフラグメントも切断されたフラグメントの好ましい具体例であり、一般的にはそれらはフラグメントのなかでも特に好ましいものである。
続した残基の欠失(1つはアミノ末端を含み、もう1つはカルボキシル末端を含む)は除く。本発明の特に好ましい膜結合受容体のフラグメントは、細胞外ドメイン(それに付随する膜貫通および細胞質ドメインは伴わない)ならびに膜貫通領域の欠失(細胞外ドメインは細胞質ドメインに直接融合する)を含む可溶性形態の受容体を包含する。例えば、公開されたPCT出願WO94/03620参照。あるいはまた、本発明フラグメントは、膜貫通領域のみの欠失ならびに細胞質ドメインの少なくとも一部の保持を含んでいてもよく、あるいはWO96/04382に記載されたような別の細胞質ドメインの少なくとも一部が融合していてもよい。上に示したサイズ範囲のフラグメントも切断されたフラグメントの好ましい具体例であり、一般的にはそれらはフラグメントのなかでも特に好ましいものである。
本発明のこの態様において、ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドの構造的または機能的属性によって特徴づけられるフラグメントも好ましい。この点において本発明の好ましい具体例は、ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドのアルファ−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形成領域(「アルファ−領域」)、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域(「ベータ−領域」)、ターンおよびターン形成領域(「ターン領域」)、コイルおよびコイル形成領域(「コイル−領域」)、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性インデックス領域を含んでなるフラグメントを包含する。
この点において、いくつかの上記特徴のごときいくつかの構造的特徴を合わせたヒト・Myt−1キナーゼの領域を含んでなるフラグメントは、非常に好ましいフラグメントに属する。この点において、図3の、約10ないし約20個、約40ないし約50個、約70ないし約90個および約100ないし約113個の残基により決定される領域(そのすべてが、ターン領域、親水性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性インデックス領域の特徴を顕著に有するアミノ酸組成により特徴づけられる)は特に非常に好ましい領域である。かかる領域は大きなポリペプチド中に含まれていてもよく、あるいは上記のごとくそれら自体本発明の好ましいフラグメントでありうる。この段落の用語「約」は一般的なフラグメントに関して上で説明した意味を有する。
さらに好ましい領域はヒト・Myt−1キナーゼの活性を媒介する領域である。この点において、ヒト・Myt−1キナーゼの化学的、生物学的活性または他の活性(類似活性または改善された活性を包含、望ましくない活性は減じられている)を有するフラグメントが最も好ましい。この点において、ヒト・Myt−1キナーゼのごとき関連ポリペプチドに活性領域に対して、配列または位置、あるいは配列および位置の両方についての相同物である領域を含むフラグメントが非常に好ましい。
さらに本発明は、特に、上記フラグメントをコードしているポリヌクレオチド、該フラグメントをコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、詳細には厳密な条件下でハイブリダイゼーションするもの、および該フラグメントをコードしているポリペプチドを増幅するためのPCRプライマーのごときポリヌクレオチドに関することが理解されよう。これらの点において、好ましいポリヌクレオチドは上記のような好ましいフラグメントに対応するポリヌクレオチドである。
ベクター、宿主細胞、発現
また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関する。
また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関する。
宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを含むようにして、本発明ポリペプチドを発現させることができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクションおよび形質転換のよく知られた方法を用いてポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他のポリヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他のポリヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個に、同時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合して導入してもよい。
よって、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを、選択可能マーカーをコードしているもう1つの別個のポリペプチドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この場合、一般的には、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。
別法として、宿主中での増殖のための選択可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結合させてもよい。上記方法によりベクター構築物を宿主細胞中に導入してもよい。一般的には、プラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるいは荷電脂質との複合体中のDNAとして導入する。エレクトロポレーションを用いてポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それをインビトロでパッケージングし、あるいはパッケージング細胞中に導入することができ、パッケージングされたウイルスを細胞中にトランスダクションすることができる。本発明によるポリヌクレオチドの製造および細胞中へのポリヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は当業者によく知られており、日常的なものである。かかる方法は上記Sambrook et al.の
文献にようやく記載されたものであり、その文献はこれらの方法を詳述する多くの研究室マニュアルの説明である。
文献にようやく記載されたものであり、その文献はこれらの方法を詳述する多くの研究室マニュアルの説明である。
本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えばプラスミドベクター、1本鎖もしくは2本鎖のファージベクター、1本鎖もしくは2本鎖のRNAまたはDNAウイルスベクターであってよい。細胞中へのDNAおよびRNA導入のためのよく知られた方法によって、かかるベクターをポリヌクレオチドとして、好ましくはDNAとして細胞中に導入することができる。ファージおよびウイルスベクターの場合、感染および形質導入のためのよく知られた方法によって、好ましくは、パッケージングされ、あるいはカプセル封入されたウイルスとしてベクターを細胞中に導入する。ウイルスベクターは複製可能であってもよく、複製欠陥であってもよい。後者の場合、一般的にはウイルス増殖は相補的宿主細胞においてのみ起こるであろう。
特定の態様において、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現用ベクターが特に好ましい。一般的には、かかるベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された宿主中での発現に効果的なシス−作用性制御領域を含んでなる。適当なトランス−作用性因子は宿主によっても提供され、あるいは相補的ベクターによっても提供され、あるいは宿主中への導入によりベクター自身により提供される。
この点において、特定の好ましい具体例において、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は誘導可能な発現であってもよく、あるいはある種のタイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよく、あるいは誘導可能および細胞特異的の両方であってもよい。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境因子による発現に関して誘導されうるベクターが、特に好ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核細胞において使用される構成的発現ベクターおよび誘導可能発現ベクターを包含する本発明のこの態様に適した種々のベクターは当業者によく知られており、日常的に使用されている。
遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な培地で培養することができ、特にプロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に関して、適宜、培地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主細胞に関して以前使用されていた温度、pH等の培養条件は、一般的には、当業者に明らかであるように、本発明ポリペプチドの発現に適するであろう。
非常に多種にわたる発現ベクターを用いて本発明ポリペプチドを発現させることができる。かかるベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バクイロウイルスのごときウイルス、類人猿ウイルス40(「SV40」)のごときパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のもの、ならびにコスミドおよびファージミドのごときプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来のベクターのごときそれらの組み合わせ由来のベクターを包含し、それらすべてを本発明のこの態様による発現に使用できる。この点において、一般的には、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適したベクターを発現に用いることができる。
種々のよく知られた日常的方法のいずれによっても適当なDNA配列をベクター中に挿入することができる。一般的には、発現させるDNA配列および発現ベクターを1種またはそれ以上の制限酵素で開裂し、次いで、T4 DNAリガー
ゼを用いて制限フラグメントを結合させることにより、発現させるDNA配列を発現ベクターに結合させる。この目的に用いることのできる制限的開裂および連結の手順は当業者によく知られており、日常的なものである。この点において、別法を用いる発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者によく知られており、本明細書の他の場所で引用しているSambrook et al.の文献に非常に詳細に
説明されている。
ゼを用いて制限フラグメントを結合させることにより、発現させるDNA配列を発現ベクターに結合させる。この目的に用いることのできる制限的開裂および連結の手順は当業者によく知られており、日常的なものである。この点において、別法を用いる発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者によく知られており、本明細書の他の場所で引用しているSambrook et al.の文献に非常に詳細に
説明されている。
発現ベクター中のDNA配列を適当な発現制御配列(例えば、mRNA転写を指令するプロモーターを包含)に作動可能に連結する。かかるプロモーターの典型例は、ファージラムダPLプロモーター、イー・コリ(E.coli)のlac、trpおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターならびにレトロウ
イルスLTRプロモーターを包含するが、それらは当業者によく知られているもののほんの例示に過ぎない。ここで述べなかった多くのプロモーターも本発明のこの態様に適し、それらは当業者によく知られており、本明細書で説明され、実施例に示されたようにして容易に使用されうることが理解されるであろう。
イルスLTRプロモーターを包含するが、それらは当業者によく知られているもののほんの例示に過ぎない。ここで述べなかった多くのプロモーターも本発明のこの態様に適し、それらは当業者によく知られており、本明細書で説明され、実施例に示されたようにして容易に使用されうることが理解されるであろう。
一般的には、発現構築物は、転写される領域に転写開始部位および終止部位を有し、さらに翻訳のためのリボソーム結合部位を含むであろう。構築物により発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始AUGを、さらに終わりの部分に適当に位置している終止コドンを含むであろう。
さらに、構築物は、発現を調節ならびに発生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的には、多くの通常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、リプレッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写調節により作動するものであろう。
一般的には、増殖および発現のためのベクターは選択可能マーカーを含むであろう。選択可能マーカー遺伝子は、形質転換宿主細胞の選択のための表現型上の特徴を与える。好ましいマーカーは、真核細胞用のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、E.coliおよび他の細菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を包含するがこれらに限らない。
所望ポリペプチドの宿主中での発現に適した種々の既知方法を用いて、上記のような適当なDNA配列ならびに適当なプロモーター、さらに他の適当な制御配列を含むベクターを適当な宿主中に導入することができる。適当な宿主の典型例は、E.coli、ストレプトミセス(Streptomyces)およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)細胞のごとき細菌細胞;酵母細胞のごとき真菌細胞;ショウジョウバエ S2およびスポドプテラ(Spodoptera) Sf9細胞のごと
き昆虫細胞;CHO、COSおよびボウズ(Bowes)メラノーマ細胞のごとき動
物細胞;ならびに植物細胞を包含する。多種の発現構築物用宿主がよく知られており、当業者は本開示により本発明のこの態様におけるポリペプチドの発現のための宿主を容易に選択することができよう。
き昆虫細胞;CHO、COSおよびボウズ(Bowes)メラノーマ細胞のごとき動
物細胞;ならびに植物細胞を包含する。多種の発現構築物用宿主がよく知られており、当業者は本開示により本発明のこの態様におけるポリペプチドの発現のための宿主を容易に選択することができよう。
より詳細には、本発明は、発現構築物のごとき組み換え構築物も包含し、それらは1種またはそれ以上の上記配列を含んでなる。構築物は、本発明のかかる配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターのごときベクターを含む。配列を順方向または逆方向に挿入することができる。この点において、特定の好ましい具体例において、構築物はさらに、例えば該配列に作動可能に連結されたプロモーターを包含する調節配列を含んでなる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明における使用に適した多くのベクターが市販されている。
市販されている下記ベクターを例示する。それらのうち、細菌での使用に適するのはpQE70、pQE60およびpQE−9(Qiagenから市販);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16
a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから市販);ならびにptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmaciaから市販)である。それらのうち、好ましい真核細胞ベクターはpWLN
EO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG(Stratageneから市販);ならびにpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL(Pharmaciaか
ら市販)である。これらのベクターは多くの市販ベクターの例示のためにのみ挙げたのであり、それらは本発明のこの態様により使用するために当業者によく知られたものである。例えば、宿主中における本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまたはベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが理解されよう。
a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから市販);ならびにptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmaciaから市販)である。それらのうち、好ましい真核細胞ベクターはpWLN
EO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG(Stratageneから市販);ならびにpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL(Pharmaciaか
ら市販)である。これらのベクターは多くの市販ベクターの例示のためにのみ挙げたのであり、それらは本発明のこの態様により使用するために当業者によく知られたものである。例えば、宿主中における本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまたはベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが理解されよう。
制限部位または候補プロモーターフラグメント(すなわち、プロモーターを含み得るフラグメント)導入部位の下流のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)転写ユニットのごとき、プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベクターを用いてプロモーター領域をいずれの所望遺伝子からも選択できる。よく知られているように、ベクター中のcat遺伝子上流の制限部位中へのプロモーター含有フラグメントの導入はCAT活性の発生を引き起こし、それを標準的CATアッセイにより検出することができる。この目的に適するベクターはよく知られており、容易に入手できる。2種のかかるベクターはpKK232−8およびpCM7である。よって、本発明ポリヌクレオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容易に入手できるものを包含するだけでなく、レポーター遺伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプロモーターも包含する。
E.coli lacIおよびlacZおよびT3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーターならびにtrpプロモーターは、本発明によるポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターに属する。
オチドおよびポリペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターに属する。
サイトメガロウイルス(CMV)即時初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、例えばラウス(Rous)サルコーマウイルス(RSV)のごときレトロウイルスLTRsのプロモーター、ならびにマウス・メタロチオネイン−Iプロモーターのごときメタロチオネインプロモーターは、この点において適する知られている真核細胞プロモーターに含まれる。
宿主細胞中での発現に適するベクターおよびプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主における発現に関する精妙な方法は当業者にとり日常的なものである。
また本発明は、上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核細胞であってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞であってもよい。
リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染または他の方法により宿主細胞中への構築物の導入を行うことができる。かかる方法は多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ることができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により本発明ポリペプチドを合成的に得ることもできる。
適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において成熟蛋白を発現させることができる。本発明DNA構築物由来のRNAを用いる無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を得ることもできる。原核宿主および真核宿主についての使用に適するクローニングベクターおよび発現ベクターは上で引用したSambrook et al.により記載されている。
一般的には、組み換え発現ベクターは、複製開始点、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーター、およびベクターに細胞を曝露した後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含むであろう。特に、3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)のごとき糖分解酵素、a−ファクター、ホスファターゼ、および熱ショック蛋白をコードしている遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーターである。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシエ(S.cerevisiae)のtrp1遺伝子を包含する。
ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより、本発明ポリペプチドをコードしているDNAの高等真核細胞による転写を増大させることができる。エンハンサーはDNAのシス−作用性エレメントであり、通常には、約10ないし300bpであり、特定の宿主細胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増大するように作用する。エンハンサーの例は、複製開始点の後期側100ないし270bpに位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。
一般的には、本発明ポリペプチドの異種構造配列をコードしている本発明ポリヌクレオチドを標準的方法を用いてベクター中に挿入してそれが発現用プロモーターに作動可能に連結されるようにする。転写開始部位がリボソーム結合部位の5’付近に位置するようにポリヌクレオチドを置く。リボソーム結合部位は、発現されるポリペプチドの翻訳を開始するAUGの5’である。一般的には、開始コドン(通常にはAUG)から始まる他の読み枠は存在せず、他の読み枠はリボソーム結合部位と開始AUGとの間には存在しないであろう。また、一般的には、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが存在し、転写される領域の3’末端に適当に分散して存在するポリアデニレーションシグナルおよび転写終止シグナルが存在するであろう。
翻訳された蛋白の小胞体ルーメン中、ペリプラスム空間中または細胞外環境中への分泌のために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド中に含ませることができる。シグナルはポリペプチドに対する内在性のものであってもよく、あるいは異種シグナルであってもよい。
ポリペプチドを、融合蛋白のごとき修飾形態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみならずさらなる異種機能領域を含んでいてもよい。よって、例えば、さらなるアミノ酸の領域、詳細には荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのN末端に付加して宿主細胞中、精製中またはさらなる取り扱いおよび保存中の安定性および維持を改善してもよい。また、精製を容易にする領域をポリペプチドに付加してもよい。最終的なポリペプチドの調製の前にかかる領域を除去することができる。特に、分泌または外分泌を引き起こすための、安定性を改善するための、そして精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知られている日常的方法である。
本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)を包含する。シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトミセス(Streptomyces)およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)の種々の種はこの点において適当な宿主である。そのうえ、この点において当業者に知られている他の多くの宿主も使用可能である。
典型的であるが限定的でない例として、細菌用途の有用発現ベクターは、選択可能マーカーおよび市販プラスミド(よく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝学的エレメントを含んでなる)由来の細菌の複製開始点を含んでなる。かかる市販ベクターは、例えば、pKK223−3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)およびGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と結合する。
適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが誘導可能である場合には、適当な手段(例えば、温度シフトまたは化学誘導剤への曝露)によりそれを誘導し、適当時間細胞を培養する。典型的には、次いで、細胞を遠心分離により集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製に供する。
凍結−融解繰り返し、ソニケーション、機械的破壊を包含する慣用的方法、あるいは当業者によく知られた細胞溶解剤の使用により、蛋白発現に使用する微生物細胞を破壊することができる。かかる方法は 当業者によく知られている。
同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman et al.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓線維芽細胞COS−7細胞系を包含する。適合するベクターを発現させうる他の細胞系は、例えば、C127、3T3、CHO、Hela、ヒト・腎臓293およびBHK細胞を包含する。
哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および発現に必要とされる5’隣接非転写配列を含んでなる。この点において、特定の好ましい具体例において、SV40スプライス部位由来のDNA配列、およびSV40ポリアデニレーション部位が、これらのタイプの所望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られた方法により、ヒト・Myt−1キナーゼポリペプチドを組み換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、高品質液体クロマトグラフィー(HPLC)を精製に用いる。単離または精製中にポリペプチドが変性している場合には、蛋白の再生のためのよく知られた方法を用いて活性コンホーメーションを再生することができる。
本発明ポリペプチドは、天然の精製ポリペプチド、化学合成法により得られるポリペプチド、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する原核細胞または真核細胞から組み換え法により得られるポリペプチドを包含する。組み換え法に使用する宿主によっては、本発明ポリペプチドはグリコシレーションされていてもよく、されていなくてもよい。さらに、いくつかの場合、宿主によるプロセスの結果として本発明ポリペプチドは最初の修飾されたメチオニン残基を含みうる。
本発明に従って、ヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細にはヒト・Myt−1キナーゼの化学的および生物学的特性を用いる適用例に使用することができる。さらなる適用例は、細胞、組織および器官の疾病の診断および治療に関する。本発明のこれらの態様を以下の議論によってさらに説明する。
ポリヌクレオチドアッセイ
本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオチドの検出のためのヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連した変異形態のヒト・Myt−1キナーゼの検出は、ヒト・Myt−1キナーゼの発現低下、発現過剰または変化した発現から生じる疾病の診断またはかかる疾病に対する感受性に関する診断に付加しうる、あるいはかかる診断を明確化しうる診断道具を提供するであろう。ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子における変異を有する個体を、種々の方法により、DNAレベルにおいて検出することができる。診断のための核酸を、患者の細胞、体液(例えば、血液、尿、唾液)、生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムDNAを検出用に直接使用してもよく、あるいは分析前にPCR(Saiki et al.,Nature,324:163-166(1986))
を用いることにより酵素的に増幅してもよい。RNAまたはcDNAを同じように使用してもよい。一例として、ヒト・Myt−1キナーゼをコードしている核酸に相補的なPCRプライマーを用いてヒト・Myt−1キナーゼの発現および変異を同定および分析することができる。例えば、正常遺伝子型との比較における増幅生成物のサイズの変化により、欠失および挿入を検出することができる。増幅したDNAを標識ヒト・Myt−1キナーゼ RNAとハイブリダイゼーシ
ョンさせることにより、あるいは別法として放射性標識ヒト・Myt−1キナーゼアンチセンスDNA配列とハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。好ましくは、RNase A消化または融点温度の
相違により、マッチした配列とミスマッチ2本鎖とを識別することができる。
本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオチドの検出のためのヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連した変異形態のヒト・Myt−1キナーゼの検出は、ヒト・Myt−1キナーゼの発現低下、発現過剰または変化した発現から生じる疾病の診断またはかかる疾病に対する感受性に関する診断に付加しうる、あるいはかかる診断を明確化しうる診断道具を提供するであろう。ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子における変異を有する個体を、種々の方法により、DNAレベルにおいて検出することができる。診断のための核酸を、患者の細胞、体液(例えば、血液、尿、唾液)、生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムDNAを検出用に直接使用してもよく、あるいは分析前にPCR(Saiki et al.,Nature,324:163-166(1986))
を用いることにより酵素的に増幅してもよい。RNAまたはcDNAを同じように使用してもよい。一例として、ヒト・Myt−1キナーゼをコードしている核酸に相補的なPCRプライマーを用いてヒト・Myt−1キナーゼの発現および変異を同定および分析することができる。例えば、正常遺伝子型との比較における増幅生成物のサイズの変化により、欠失および挿入を検出することができる。増幅したDNAを標識ヒト・Myt−1キナーゼ RNAとハイブリダイゼーシ
ョンさせることにより、あるいは別法として放射性標識ヒト・Myt−1キナーゼアンチセンスDNA配列とハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。好ましくは、RNase A消化または融点温度の
相違により、マッチした配列とミスマッチ2本鎖とを識別することができる。
直接DNA配列決定により、もとの遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとなりうる。さらに、クローンされたDNAセグメントをプローブとして用いて特定のDNA配列を検出してもよい。PCRまたは他の増幅方法を適当に用いることにより、かかる方法の感度をおおいに向上させることができる。例えば、配列決定プライマーを、2本鎖PCR生成物またはPCR変法により得られた1本鎖鋳型分子とともに使用する。放射性標識を用いる慣用的方法により、あるいは蛍光タグを用いる自動配列決定法により配列決定を行う。
変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のDNAの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、DNA配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠失および挿入を可視化することができる。個々の融点または部分的に融解する温度によってDNAフラグメントがゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のDNAフラグメントを識別することができる(例えば、Myers et al.,Science,230:1242(1985)参照)。
RNaseおよびS1保護のごときヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の位置における配列の変化も明らかとなる(例えば、Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(1985))。
よって、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的開裂、直接DNA配列決定または制限酵素の使用(例えば、制限フラグメント長多型性(RFLP))およびゲノムDNAのサザンブロッティングのごとき方法により、特定のDNA配列の検出を行うことができる。
より慣用的なゲル電気泳動およびDNA配列決定以外にも、in situ分析によ
って突然変異を検出することができる。
って突然変異を検出することができる。
本発明のさらなる態様によれば、とりわけ、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患、またはこれらの疾病に対する感受性の決定方法が提供される。ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子中の変異は、とりわけ、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患に対する感受性を示しうるものであり、上記核酸配列をかかる感受性の確認のためのアッセイ用いてもよい。よって、例えば、該アッセイを用いて上記ヒト・ヒト・Myt−1キナーゼ遺伝子における変異、例えば、欠失、切断、挿入、フレームシフト等(かかる変異は、とりわけ、増殖過剰疾患に対する感受性を示すものである)を決定してもよい。
本発明は、疾病、詳細にはとりわけ白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患の診断方法であって、患者から得た試料から、図1および図2、配列番号:1の配列を有するポリヌクレオチドの異常に増大または低下した発現を決定することを特徴とする方法を提供する。ポリヌクレオチドの増大または低下した発現を、ポリヌクレオチドの定量のための当該分野でよく知られた方法(例えば、PCR、RT−PCR、RNase保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法)を用いて測定することができる。
in situ分析により変異を検出することもできる。
in situ分析により変異を検出することもできる。
染色体アッセイ
本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々のヒト・染色体上の特定位置に特別に標的化されており、これとハイブリダイゼーションしうる。そのうえ、染色体上の特定部位を同定する必要性が現在ある。実際の配列データ(繰り返し多型性)に基づいて染色体をマーキングする少数の試薬が染色体のマーキングに現在利用できる。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、配列を疾病関連遺伝子と関連づけることにおいて重要な最初の工程である。
本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々のヒト・染色体上の特定位置に特別に標的化されており、これとハイブリダイゼーションしうる。そのうえ、染色体上の特定部位を同定する必要性が現在ある。実際の配列データ(繰り返し多型性)に基づいて染色体をマーキングする少数の試薬が染色体のマーキングに現在利用できる。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、配列を疾病関連遺伝子と関連づけることにおいて重要な最初の工程である。
簡単に説明すると、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15ないし25bp)を調製することにより、配列を染色体にマッピングすることができる。遺伝子の3’非翻訳領域のコンピューター分析を用いてゲノムDNA中の1つよりも多いエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、かくして、増幅を複雑化する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに用いる。プライマーに対応したヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、個々のDNAを個々の染色体に帰属するための迅速な手順である。類似の方法で同じオリゴヌクレオチドプライマーに関して本発明を用いて、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールに関して下位の位置決めを行うことができる。染色体へのマッピングに同様に用いることのできる他のマッピング法は、in situハ
イブリダイゼーション、標識フロー−ストアド(flow-stored)染色体に関する
プレスクリーニングおよび染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを包含する。
イブリダイゼーション、標識フロー−ストアド(flow-stored)染色体に関する
プレスクリーニングおよび染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを包含する。
中期染色体スプレッドに対するcDNAクローンの蛍光in situハイブリダイ
ゼーション(FISH)を用いて、正確な染色体位置を一工程で知ることができる。この方法を50または60bp程度の短いcDNAとともに用いることができる。この方法に関するレビューについては、Verma et al.,HUMAN CHROMOSOME:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York(1988)参照。
ゼーション(FISH)を用いて、正確な染色体位置を一工程で知ることができる。この方法を50または60bp程度の短いcDNAとともに用いることができる。この方法に関するレビューについては、Verma et al.,HUMAN CHROMOSOME:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York(1988)参照。
この方法をいかにして行うかについての例として、ヒト・Myt−1キナーゼ DNAを消化し、QIAEX II DNA精製キット(Qiagen,Inc,Chastworth,CA)を用いて精製し、Super Cos1コスミドベクター(Stratagene,La Jolla,CA)に連結する。Qiagenプラスミド精製キット(Qiagen Inc.,Chastworth,CA)を用いてD
NAを精製し、ビオチン−dATP存在下でBioNick Labellingキット(GibcoBRL,Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)を用いるニックトランスレーションにより1mgを標識する。ONCOR Light Hybridizationキット(Oncor,Gaithersburg,MD)を用いてスライドグラス上でin situハイブリダイゼーションを行っ
て、中期染色体上の単一コピー配列を検出する。20% FCS、3% PHAおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI 1640中で正常ド
ナー末梢血を3日間培養し、10-7Mメトトレキセートとともに17時間同調させ、次いで、補足物なしのRPMIで2回洗浄する。次いで、細胞を10-3Mチミジンとともに7時間インキュベーションする。20分インキュベーション後、コルセミド(0.5μg/ml)を用いて細胞を中期に分裂停止させ、次いで、37℃において75mM KCl中で15分低張溶解させる。次いで、遠心分離
により細胞ペレット集め、Carnoyの固定液(3:1 メタノール/酢酸)で固定
する。
NAを精製し、ビオチン−dATP存在下でBioNick Labellingキット(GibcoBRL,Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)を用いるニックトランスレーションにより1mgを標識する。ONCOR Light Hybridizationキット(Oncor,Gaithersburg,MD)を用いてスライドグラス上でin situハイブリダイゼーションを行っ
て、中期染色体上の単一コピー配列を検出する。20% FCS、3% PHAおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI 1640中で正常ド
ナー末梢血を3日間培養し、10-7Mメトトレキセートとともに17時間同調させ、次いで、補足物なしのRPMIで2回洗浄する。次いで、細胞を10-3Mチミジンとともに7時間インキュベーションする。20分インキュベーション後、コルセミド(0.5μg/ml)を用いて細胞を中期に分裂停止させ、次いで、37℃において75mM KCl中で15分低張溶解させる。次いで、遠心分離
により細胞ペレット集め、Carnoyの固定液(3:1 メタノール/酢酸)で固定
する。
1滴の細胞懸濁液をスライドグラスに滴下し、懸濁液を風乾することにより中期細胞塗布試料を調製する。ヒト・胎盤DNA(1μg/ml)でブロッキングしつつ、100ngのプローブ(ハイブリダイゼーションミックス(50%ホルムアミド、2xSSC、1%デキストラン硫酸)10ml中に懸濁)を添加することによりハイブリダイゼーションを行う。70℃の水浴中で10分間プローブ混合物を変性させ、37℃で1時間インキュベーションし、次いで、あらかじめ37℃に暖めておいたスライドグラス試料上に置き(スライドグラス試料は、前以て70℃で70%ホルムアミド/2xSSC中で変性させておく)、エタノールシリーズで脱水し、次いで、4℃に冷却する。
スライドグラス試料を加湿チャンバ中37℃で16時間インキュベーションし、41℃で10分間50%ホルムアミド/2xSSC中、次いで、37℃で7分間2xSSC中で洗浄する。製造者のプロトコールに従ってスライドグラス試料をFITC−アビジン(Oncor,Gaithersburg,MD)とともにインキュベーション
することによりハイブリダイゼーションプローブを検出する。マウンティング培地(mounting medium)中に懸濁されたヨウ化プロプリジウムを用いて染色体を
対比染色する。Leitz ORTHOPLAN 2-エピ蛍光顕微鏡を用いてスライドグラス試料を可視化する。ImageneticsコンピューターおよびMacIntoshプリンターを用いて5つのコンピューター画像を得る。
することによりハイブリダイゼーションプローブを検出する。マウンティング培地(mounting medium)中に懸濁されたヨウ化プロプリジウムを用いて染色体を
対比染色する。Leitz ORTHOPLAN 2-エピ蛍光顕微鏡を用いてスライドグラス試料を可視化する。ImageneticsコンピューターおよびMacIntoshプリンターを用いて5つのコンピューター画像を得る。
配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体上の配列の物理的位置を修正することができる。かかるデータは、例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryよりオンラインで利用可能)に見いだされる。次いで、連
関分析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により、同じ染色体にマッピングされた遺伝子と疾病との関連を確認する。
関分析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により、同じ染色体にマッピングされた遺伝子と疾病との関連を確認する。
次に、疾病にかかっている個体および疾病にかかっていない個体間のcDNAまたはゲノム配列の相違を決定することが必要である。疾病にかかっている個体の一部または全部において変異が観察されるが正常個体においては変異が観察されない場合には、その変異は疾病の病因である可能性がある。
物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング法の現在の分離能によれば、疾病に関連した染色体領域に正確に位置決めされるcDNAは50ないし500個の潜在的病因遺伝子のうち1つでありうる(1メガベースのマッピング分離能とし、20kbにつき1個の遺伝子と仮定)。
ポリペプチドアッセイ
本発明は、細胞および組織中のヒト・Myt−1キナーゼ蛋白レベルの検出のための定量および診断アッセイのごとき診断アッセイにも関する。かかるアッセイは定量的であっても、定性的であってもよい。よって、例えば、正常対照組織試料と比較して本発明ヒト・Myt−1キナーゼ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診断アッセイを用いて、例えば、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患を包含する過剰増殖疾患の存在を検出してもよい。宿主由来の試料中の本発明ヒト・Myt−1キナーゼ蛋白のごとき蛋白のレベルを決定するのに用いることのできるアッセイ法は当業者によく知られている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイを包含する。これらのうち、ELISAがしばしば好ましい。主にELISAアッセイは、ヒト・Myt−1キナーゼに対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを特徴とする。さらに、一般的には、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または酵素試薬検のごとき検出可能試薬に結合しているが、この実施例ではセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ酵素に結合している。
本発明は、細胞および組織中のヒト・Myt−1キナーゼ蛋白レベルの検出のための定量および診断アッセイのごとき診断アッセイにも関する。かかるアッセイは定量的であっても、定性的であってもよい。よって、例えば、正常対照組織試料と比較して本発明ヒト・Myt−1キナーゼ蛋白の過剰発現を検出するための本発明診断アッセイを用いて、例えば、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患を包含する過剰増殖疾患の存在を検出してもよい。宿主由来の試料中の本発明ヒト・Myt−1キナーゼ蛋白のごとき蛋白のレベルを決定するのに用いることのできるアッセイ法は当業者によく知られている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイを包含する。これらのうち、ELISAがしばしば好ましい。主にELISAアッセイは、ヒト・Myt−1キナーゼに対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを特徴とする。さらに、一般的には、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または酵素試薬検のごとき検出可能試薬に結合しているが、この実施例ではセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ酵素に結合している。
ELISAを行うために試料を宿主から取り、試料中の蛋白を結合する固体支持体、例えば、ポリスチレンディッシュ上でインキュベーションする。次いで、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的蛋白とともにインキュベーションすることによりディッシュ上の遊離の蛋白結合部位を被覆する。次に、モノクローナル抗体をディッシュ中でインキュベーションし、その間にモノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合しているヒト・Myt−1キナーゼ蛋白に結合する。未結合モノクローナル抗体をバッファーで洗浄除去する。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体をディッシュ中に置き、レポーター抗体とヒト・Myt−1キナーゼに結合しているモノクローナル抗体との結合を生じさせる。次いで、未結合レポーター抗体を洗浄除去する。次いで、発色基質を包含するペルオキシダーゼ活性のための試薬をディッシュに添加する。1次抗体および2次抗体によりヒト・Myt−1キナーゼに結合し、固定化されているペルオキシダーゼは着色反応生成物を生じる。一定時間の発色量は試料中のヒト・Myt−1キナーゼ蛋白量を示す。典型的には、標準曲線を参照して定量結果を得る。
固体支持体に結合したヒト・Myt−1キナーゼ特異的抗体および標識ヒト・Myt−1キナーゼおよび宿主由来の試料が固体支持体上に通される競争アッセイを用いてもよい。固体支持体に結合した検出標識量は試料中のヒト・Myt−1キナーゼ量と相関関係を有しうる。
抗体
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を作ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。また本発明は、キメラ、1本鎖およびヒト化抗体ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーも生成物を包含する。当該分野で知られた種々の方法をかかる抗体およびフラグメントの製造に用いてもよい。
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を作ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。また本発明は、キメラ、1本鎖およびヒト化抗体ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーも生成物を包含する。当該分野で知られた種々の方法をかかる抗体およびフラグメントの製造に用いてもよい。
当業者によく知られた種々の手段により、本発明配列に対応したポリペプチドに対して生成した抗体を得ることができる。例えば、1の具体例において、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒトに直接注射する。次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列を用いて無傷のポリペプチド全体に結合する抗体を得ることさえできる。次いで、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を用いることができる。例は、ハイブリドーマ法(Kohler and Milstein Nature 1975 256:495-497)、トリオーマ法、ヒト・B細胞ハイブリ
ドーマ法(Kozbor et al.,Immunology Today 1983 4:72)およびヒト・モノクローナル抗体を製造するためのEBV−ハイブリドーマ法(Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985))を包含する。
ドーマ法(Kozbor et al.,Immunology Today 1983 4:72)およびヒト・モノクローナル抗体を製造するためのEBV−ハイブリドーマ法(Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985))を包含する。
1本鎖抗体の製造に関して記載された方法(米国特許第4,946,778号)を適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する1本鎖抗体を製造することができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによる単離および/または精製のための固体支持体への抗体の結合により本発明ポリペプチドを精製してもよい。
さらに、ヒト・Myt−1キナーゼに対する抗体を用いて、とりわけ、白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患を抑制してもよい。
ヒト・Myt−1キナーゼ結合分子およびアッセイ
ヒト・Myt−1キナーゼを用いて、それと相互作用する蛋白を単離することもできる。この相互作用は妨害の標的でありうる。ヒト・Myt−1キナーゼと他の因子との間の蛋白−蛋白相互作用の阻害剤は、ヒト・Myt−1キナーゼ活性の転調のための薬剤の開発につながる可能性がある。
ヒト・Myt−1キナーゼを用いて、それと相互作用する蛋白を単離することもできる。この相互作用は妨害の標的でありうる。ヒト・Myt−1キナーゼと他の因子との間の蛋白−蛋白相互作用の阻害剤は、ヒト・Myt−1キナーゼ活性の転調のための薬剤の開発につながる可能性がある。
よって、本発明は、ヒト・Myt−1キナーゼに対する結合分子の同定方法も提供する。当業者に知られた多くの方法、例えば、PAFを用いるパンニング(panning)およびFACSソーティングにより、受容体蛋白のごときヒト・My
t−1キナーゼに結合する蛋白をコードしている遺伝子を同定することができる。かかる方法は多くの研究室用マニュアル、例えば、Coligan et al.,Current Protocoles in Immunology 1(2):第5章(1991年)に記載されている。
t−1キナーゼに結合する蛋白をコードしている遺伝子を同定することができる。かかる方法は多くの研究室用マニュアル、例えば、Coligan et al.,Current Protocoles in Immunology 1(2):第5章(1991年)に記載されている。
例えば、酵母の2−ハイブリッド系は、転写アクチベーターの活性の再構築を用いてインビボにおける第1の試験蛋白と第2の試験蛋白との間の相互作用を検出する方法を提供する。該方法は米国特許第5283173号に開示されており、試薬はClontechおよびStratageneから市販されている。簡単に説明すると、ヒト・Myt−1キナーゼのcDNAをGal14転写因子DNA結合ドメインに融合させ、酵母細胞にいて発現させる。対象細胞から得たcDNAライブラリーのメンバーをGal14のトランスアクチベーションドメイン(transactivation domain)に融合させる。ヒト・Myt−1キナーゼと相互作用しうる蛋白を発現するcDNAクローンはGal14活性の再構成およびGal14−lacZのごときレポーター遺伝子発現のトランスアクチベーションを引き起こすであろう。
別法は、組み換えヒト・Myt−1キナーゼを用いるλgt11、λZAP(Stratagene)または同等なcDNA発現ライブラリーのスクリーニングを包含する。組み換えヒト・Myt−1キナーゼ蛋白またはそのフラグメントを、FLAG、HSVまたはGSTのごとき小型ペプチドタグに融合させる。ペプチドタグは、心筋クレアチンキナーゼのごときキナーゼのための便利なリン酸化部位を有しているか、あるいはビオチン化されうる。組み換えヒト・Myt−1キナーゼを32[P]とともにリン酸化することができ、あるいは未標識のまま使用してストレプトアビジンまたはタグに対する抗体を用いて検出することができる。λgt11cDNA発現ライブラリーを対象細胞から作成し、組み換えヒト・Myt−1キナーゼとともにインキュベーションし、洗浄を行い、ヒト・Myt−1キナーゼと相互作用するcDNAクローンを単離する。かかる方法は当業者により日常的に使用されている。例えばSambrookらの文献参照。
もう1つの方法は哺乳動物発現ライブラリーのスクリーニングである。この方法において、cDNAを、ベクター中の哺乳動物プロモーターとポリアデニレーション部位との間に組み込み、COSまたは293細胞に一時的にトランスフェクションする。48時間後、固定され洗浄された細胞を標識ヒト・Myt−1キナーゼとともにインキュベーションすることにより結合蛋白を検出する。好ましい具体例において、ヒト・Myt−1キナーゼをヨウ素化し、オートラジオグラフィーにより、結合したヒト・Myt−1キナーゼを検出する。Sims et al.,Science,1988,241:585-589およびMcMahan et al.,EMBO J.,1991,10:2821-2832参照。この方法において、対象とする結合蛋白をコードしているcDNAを含むcDNAのプールを選択し、各プールをさらに分割し、次いで、一時的トランスフェクションのサイクル、結合およびオートラジオグラフィーにより、対象cDNAを単離する。別法として、全cDNAライブラリーを哺乳動物細胞中にトランスフェクションし、プレートに結合したヒト・Myt−1キナーゼを含むディッシュ上で細胞をパンニング(panning)することにより、対象cDNAを単離する
こともできる。洗浄後付着している細胞を溶解し、プラスミドDNAを単離し、細菌中で増幅し、トランスフェクションおよびパンニングのサイクルを繰り返して単一のcDNAクローンを得る。Seed et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84:3365およびAruffo et al.,EMBO J.,1987,6:3313参照。結合蛋白が分泌される
場合には、一時的にトランスフェクションされた細胞から得た上清のアッセイのために結合または中和アッセイを確立した後、同様のプーリング法によりそのcDNAを得ることができる。上清のスクリーニングのための一般的方法はWong et al.,Science,1985,228:810-815に開示されている。
こともできる。洗浄後付着している細胞を溶解し、プラスミドDNAを単離し、細菌中で増幅し、トランスフェクションおよびパンニングのサイクルを繰り返して単一のcDNAクローンを得る。Seed et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84:3365およびAruffo et al.,EMBO J.,1987,6:3313参照。結合蛋白が分泌される
場合には、一時的にトランスフェクションされた細胞から得た上清のアッセイのために結合または中和アッセイを確立した後、同様のプーリング法によりそのcDNAを得ることができる。上清のスクリーニングのための一般的方法はWong et al.,Science,1985,228:810-815に開示されている。
もう1つの方法は、ヒト・Myt−1キナーゼと相互作用する蛋白を細胞から直接単離することを包含する。ヒト・Myt−1キナーゼとGSTもしくは小型ペプチドタグとの融合蛋白を作成し、ビーズ上に固定化する。生合成的に標識された蛋白または未標識蛋白の対象細胞からの抽出物を調製し、ビーズとともにインキュベーションし、バッファーで洗浄する。ヒト・Myt−1キナーゼと相互作用する蛋白をビーズから特異的に溶離し、SDS−PAGEにより分析する。結合パートナーの1次アミノ酸配列データを微量配列決定により得る。細胞蛋白のチロシンのリン酸化のごとき機能的応答を誘導する薬剤で細胞を処理してもよい。かかる薬剤の例は、増殖因子またはインターロイキン−2のごときサイトカインであろう。
もう1つの方法は免疫アフィニティー精製である。標識または未標識細胞抽出物とともに組み換えヒト・Myt−1キナーゼをインキュベーションし、抗−Myt−1キナーゼ抗体とともに免疫沈降させる。プロテインA−セファロースを用いて免疫沈降物を回収し、SDS−PAGEにより分析する。未標識蛋白をビオチン化により標識し、ストレプトアビジン含有SDSゲル上で検出する。微量配列決定により結合パートナー蛋白を分析する。さらに、当業者に知られた標準的な生化学的精製工程を微量配列決定の前に用いてもよい。
さらにもう1つの方法は、結合パートナーを探すペプチドライブラリーのスクリーニングを包含する。組み換えタグ付きまたは標識ヒト・Myt−1キナーゼを用いて、ヒト・Myt−1キナーゼと相互作用するペプチドまたはホスホペプチドのライブラリーからペプチドを選択する。ペプチドの配列決定は、相互作用する蛋白中に見いだされうるコンセンサスペプチド配列の同定につながる。
アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子
本発明ヒト・Myt−1キナーゼを、その活性を活性化する化合物(アゴニスト)または活性を化阻害する化合物(アンタゴニスト)を探すスクリーニングに用いてもよい。
本発明ヒト・Myt−1キナーゼを、その活性を活性化する化合物(アゴニスト)または活性を化阻害する化合物(アンタゴニスト)を探すスクリーニングに用いてもよい。
潜在的なキナーゼアンタゴニストの例は、酵素に結合するが第2のメッセンジャー応答を誘導しない抗体、またはいくつかの場合にはオリゴヌクレオチドを包含する(結果、酵素活性が阻害される)。
潜在的なアンタゴニストは、酵素活性を失っているヒト・Myt−1キナーゼに密接に関連した蛋白、すなわち、当該酵素のフラグメントも包含する。
さらに潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス法を用いることにより調製されたアンチセンス構築物を包含する。アンチセンス法を用いて三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAにより発現される遺伝子を制御することができ、両方の方法とも、DNAもしくはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づくものである。例えば、本発明ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの5’コーディング部分を用いて、長さ約10ないし40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計してもよい。転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようにDNAオリゴヌクレオチドを設計し(三重らせん−Lee et al.,Nucleic Acids Research 6:3073(1979);Dervan et al.,Science 251:1360(1991)参照)、そのことによりヒト・Myt−1キナーゼの転写および生成を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmRNAにハイブリダイゼーションし、mRNA分子の酵素への翻訳をブロックする(Okano,J.Neurochem.56:560(1991);OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。上記オリゴヌクレオチ
ドを細胞に送達して、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボにおいて発現されてヒト・Myt−1キナーゼの生成を阻害するようにすることもできる。
ドを細胞に送達して、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボにおいて発現されてヒト・Myt−1キナーゼの生成を阻害するようにすることもできる。
もう1つの潜在的なアンタゴニストは、酵素に結合する小型分子であり、リガンドへの近接を不可能にして正常な生物学的活性を妨害するものである。小型分子の例は、小型ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限らない。
さらに潜在的なアンタゴニストは、リガンドに結合する可溶性形態のヒト・Myt−1キナーゼ、例えば該酵素のフラグメントを包含し、よって、リガンドと膜結合ヒト・Myt−1キナーゼとの相互作用が妨害される。
Myt−1キナーゼは哺乳動物細胞に遍在しており、多くの発病を包含する多くの生物学的機能に関与している。したがって、酵素活性を刺激する化合物および薬剤、およびMyt−1キナーゼの機能を阻害しうる化合物および薬剤を見いだすことが望まれる。
ヒト・Myt−1キナーゼのアンタゴニストを、とりわけ白血病、固形腫瘍および転移性腫瘍のごとき癌;乾癬およびリューマチ性関節炎のごとき慢性炎症性増殖性疾患;再狭窄のごとき増殖性心臓血管疾患;糖尿病性網膜症および斑状変質のごとき増殖性の目の疾患;ならびに良性前立腺肥大および血管腫のごとき良性の増殖過剰疾患のごとき疾病の種々の治療および予防目的に用いてもよい。
本発明はさらに、Myt−1活性が関連している異常な症状の治療方法を提供する。この方法は、医薬上許容される担体とともに有効量の上記阻害剤化合物(アンタゴニスト)を対象に投与して酵素活性を阻害すること、あるいは第2のシグナルを阻害することにより異常な症状を改善することを特徴とする。例えば、過剰増殖している細胞においてアンタゴニストを用いてMyt−1活性をブロッキングすることは、細胞周期のタイミングを破壊し、かくして、準備がととのう前に細胞を分裂させ、細胞の死を引き起こす。
ヒト・Myt−1キナーゼ活性の発現不足に関連した異常な症状の治療方法であって、上記のごとく本発明酵素を活性化する治療上有効量の化合物(アゴニスト)を医薬上許容される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法を提供する。
組成物およびキット
可溶性形態のヒト・Myt−1キナーゼ、およびかかる酵素を活性化または阻害する化合物を、適当な医薬担体と混合して使用してもよい。かかる組成物は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物、および医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物を包含するが、これらに限らない。処方は投与方法に適合させるべきである。投与方法に応じて、当業者により適当な担体の選択が行われる。
さらに本発明は、本発明の上記組成物の1またはそれ以上の成分を充填した1またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットに関する。
可溶性形態のヒト・Myt−1キナーゼ、およびかかる酵素を活性化または阻害する化合物を、適当な医薬担体と混合して使用してもよい。かかる組成物は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物、および医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物を包含するが、これらに限らない。処方は投与方法に適合させるべきである。投与方法に応じて、当業者により適当な担体の選択が行われる。
さらに本発明は、本発明の上記組成物の1またはそれ以上の成分を充填した1またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットに関する。
投与
本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単独で、あるいは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用してよい。
効果的で便利な方法、例えば、特に、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医薬組成物を投与してよい。
本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単独で、あるいは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用してよい。
効果的で便利な方法、例えば、特に、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医薬組成物を投与してよい。
一般的には、医薬組成物を、個々の徴候または徴候(複数)の治療または予防の有効な量で投与する。一般的には、少なくとも約10μg/kg体重の量で組成物を投与する。大部分の場合、1日につき約8mg/kg体重を超えない量で組成物が投与されるであろう。好ましくは、大部分の場合、1日につき用量は約10μg/kg体重ないし約1mg/kg体重である。症状、その重さ、投与経路、合併症等を考慮して、各治療様式についての標準的方法および症状により最適用量が決定されることが理解されよう。
遺伝子治療
インビボにおいて、すなわちしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式においてポリペプチドを発現させることにより、ヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストを本発明に従って使用することができる。
インビボにおいて、すなわちしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式においてポリペプチドを発現させることにより、ヒト・Myt−1キナーゼポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストを本発明に従って使用することができる。
よって、例えば、ポリペプチドをコードしているDNAまたはRNAのごときポリヌクレオチドで患者からの細胞をエクスビボで処理し、次いで、ポリペプチドで治療すべき患者に処理細胞を与えてもよい。例えば、本発明ポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により細胞をエクスビボで処理してもよい。かかる方法は当該分野においてよく知られており、本発明におけるそれらの使用は本明細書の教示から明らかである。
同様に、当該分野において知られた方法により、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞をインビボで処理してもよい。例えば、上記のように複製欠陥レトロウイルスベクター中での発現のために本発明ポリヌクレオチドを処理してもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するようにすることができる。インビボでの細胞の処理およびインビボでのポリペプチドの発現のためにこれらのプロデューサー細胞を患者に投与することができる。本発明ポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかなはずである。
本明細書において上で述べたレトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロニーマウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウスサルコーマウイルス、ハーベイサルコーマウイルス、トリ・白血病ウイルス、テナガザル・白血病ウイルス、ヒト・免疫不全ウイルスのごときレトロウイルス、アデノウイルス、ミエロプロリファレイティブサルコーマウイルス(Myeloproliferative Sarcomavirus)、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これら
に限らない。1の具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス・白血病ウイルス由来のものである。
に限らない。1の具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス・白血病ウイルス由来のものである。
かかるベクターは、本発明ポリペプチド発現のための1個またはそれ以上のプロモーターを含むであろう。使用できる適当なプロモーターは、レトロウイルスLTR;SV40プロモーター;およびMiller et al.,Biotechniques 7:980-990(1989)に記載されたCMVプロモーター、または他のいずれかのプロモーター
(例えば、ヒストン、RNAポリメラーゼIII、およびβ−アクチンプロモーター(これらに限らない)を包含する真核細胞プロモーターのごとき細胞プロモーター)を包含するが、これらに限らない。使用できる他のウイルスのプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限らない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明らかであろう。
(例えば、ヒストン、RNAポリメラーゼIII、およびβ−アクチンプロモーター(これらに限らない)を包含する真核細胞プロモーターのごとき細胞プロモーター)を包含するが、これらに限らない。使用できる他のウイルスのプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限らない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明らかであろう。
本発明ポリペプチドをコードしている核酸配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろう。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス大後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモーター;またはCMVプロモーターのごとき異種プロモーター;呼吸器合胞体ウイルス(RSV)プロモーター;MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモーター;熱ショックプロモーター;アルブミンプロモーター;ApoAIプロモーター;ヒト・グロビンプロモーター;単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターのごときウイルスのチミジンキナーゼプロモーター;レトロウイルスのLTR(本明細書で上で述べた修飾レトロウイルスLTRを包含);β−アクチンプロモーター;およびヒト・成長ホルモンプロモーターを包含するが、これらに限らない。プロモーターは、本発明ポリペプチドをコードしている遺伝子を制御する無傷のプロモーターであってもよい。
レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッキング細胞系に形質導入してプロデューサー細胞系を得る。トランスフェクションされうるパッキング細胞の例は、PE501、PA317、Y−2、Y−AM、PA12、T19−14X、VT−19−17−H2、YCRE、YCRIP、GP+E−86、GP+envAm12、およびMiller,A.,Human Gene Therapy 1:5-14(1990)に記載され
たDAN細胞系を包含するが、これらに限らない。当該分野で知られたいずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、CaPO4沈殿を包含する
が、これらに限らない。1の別法において、レトロウイルスベクターをリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合させ、次いで、宿主に投与してもよい。
たDAN細胞系を包含するが、これらに限らない。当該分野で知られたいずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、CaPO4沈殿を包含する
が、これらに限らない。1の別法において、レトロウイルスベクターをリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合させ、次いで、宿主に投与してもよい。
プロデューサー細胞系は感染性レトロウイルスベクター粒子を生じるであろうし、該粒子はポリペプチドをコードしている核酸配列を含んでいる。次いで、かかるレトロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよい。形質導入された真核細胞はポリペプチドをコードしている核酸配列を発現するであろう。形質導入されうる真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これらに限らない。
下記実施例により本発明をさらに説明する。実施例は、個々の具体例を参照することにより、本発明の説明のためだけに提供される。これらの例示は、本発明の特定の態様を説明するが、開示された発明の範囲を何ら限定するものでない。 本明細書に用いる特定の用語はすでに上で説明してある。
特記しない限り、すべての実施例は、当業者によく知られた日常的な標準的方法を用いて行われたものである。上で引用したSambrookらの標準的な研究室用マニュアルに記載されているようにして下記実施例の日常的な分子生物学の方法を行うことができる。
特記しない限り、すべての実施例は、当業者によく知られた日常的な標準的方法を用いて行われたものである。上で引用したSambrookらの標準的な研究室用マニュアルに記載されているようにして下記実施例の日常的な分子生物学の方法を行うことができる。
実施例1:蛋白分析
10%ポリアクリルアミドゲルによるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により試料を分離する。Myt−1キナーゼの基質であるcdc−2を分析するために、Milarski et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,1991,56:377-384により記載されたようにして、c
dc−2蛋白のC末端配列に対して得られアフィニティー精製されたウサギ・抗−ペプチド抗血清を用いて抗−cdc2免疫ブロッティングを行う。免疫ブロッティング後、ニトロセルロースフィルターを125IプロテインAで処理する。増
強スクリーンを用いて−70℃でオートラジオグラフィーを行う。
ペプチドマッピングのために、32P−標識試料をSDS−PAGEにより分離し、IMMOBILON-P(Millipore,Bedford,MA)に移し、Boyle et al.,Meth.Enzymol.,1991,201:110-149により記載された方法によりオートラジオグラフィーにより分析する。ペプチドマッピングを行う。32P−標識トリプシン消化物を100ミクロンの薄層セルロースプレート上にスポットし、pH1.9で25分間、1kVで電気泳動する。ホスホクロロバッファー中で第2次元のクロマトグラフィーを行う。Boyle et al.,Meth.Enzymol.,1991,201:110-149により記載された方法
によりホスホアミノ酸分析を行う。
10%ポリアクリルアミドゲルによるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により試料を分離する。Myt−1キナーゼの基質であるcdc−2を分析するために、Milarski et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,1991,56:377-384により記載されたようにして、c
dc−2蛋白のC末端配列に対して得られアフィニティー精製されたウサギ・抗−ペプチド抗血清を用いて抗−cdc2免疫ブロッティングを行う。免疫ブロッティング後、ニトロセルロースフィルターを125IプロテインAで処理する。増
強スクリーンを用いて−70℃でオートラジオグラフィーを行う。
ペプチドマッピングのために、32P−標識試料をSDS−PAGEにより分離し、IMMOBILON-P(Millipore,Bedford,MA)に移し、Boyle et al.,Meth.Enzymol.,1991,201:110-149により記載された方法によりオートラジオグラフィーにより分析する。ペプチドマッピングを行う。32P−標識トリプシン消化物を100ミクロンの薄層セルロースプレート上にスポットし、pH1.9で25分間、1kVで電気泳動する。ホスホクロロバッファー中で第2次元のクロマトグラフィーを行う。Boyle et al.,Meth.Enzymol.,1991,201:110-149により記載された方法
によりホスホアミノ酸分析を行う。
実施例2:シフトアッセイ、サイクリン、およびp13結合
Myt−1キナーゼの活性をアッセイするために、基質(cdc−2)の移動度シフトを測定する。cdc−2蛋白の移動度を測定するために、抽出物から80μlを取り(膜添加または無添加)、室温で30分インキュベーションする。次いで、0.5mMオルトバナジン酸ナトリウムを添加することによりホスファターゼ活性を阻害する。次いで、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−ウニ・サイクリンB(GST融合蛋白)を添加し、さらに15分間インキュベーションを継続する。インキュベーション後、試料を液体窒素ですばやく凍結し、−70℃で保存する。
加工のために、80mM β−グリセロリン酸、5mM EDTA、2mMオルチバナジン酸ナトリウム、0.1%ノニデットP−40および0.5M NaC
lを含有するバッファーに1:1で希釈することにより試料を融解する。試料をグルタチオンアガロースビーズまたはp13−セファロースのいずれかに結合させ、Smythe,C.and Newport,J.W.,Cell,1992,3:13-27により記載された方法によ
り加工する。
Myt−1キナーゼの活性をアッセイするために、基質(cdc−2)の移動度シフトを測定する。cdc−2蛋白の移動度を測定するために、抽出物から80μlを取り(膜添加または無添加)、室温で30分インキュベーションする。次いで、0.5mMオルトバナジン酸ナトリウムを添加することによりホスファターゼ活性を阻害する。次いで、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−ウニ・サイクリンB(GST融合蛋白)を添加し、さらに15分間インキュベーションを継続する。インキュベーション後、試料を液体窒素ですばやく凍結し、−70℃で保存する。
加工のために、80mM β−グリセロリン酸、5mM EDTA、2mMオルチバナジン酸ナトリウム、0.1%ノニデットP−40および0.5M NaC
lを含有するバッファーに1:1で希釈することにより試料を融解する。試料をグルタチオンアガロースビーズまたはp13−セファロースのいずれかに結合させ、Smythe,C.and Newport,J.W.,Cell,1992,3:13-27により記載された方法によ
り加工する。
実施例3:H1アッセイ
cdc−2活性をアッセイするために、ヒストンH1のリン酸化を追跡する。このアッセイにおいて、膜添加または無添加の間期抽出物および2μlのEBバッファー(20mM β−グリセロリン酸,pH7.3、20mM EGTAおよび15mM MgCl2を含有)に組み換えGST−サイクリンを添加する。試料を液体窒素で凍結し、−70℃で保存する。Kornbluth et al.,Mol.Cell.Biol.,1992,12:3216-3223により記載された方法によりヒストンキナーゼ活性をアッセ
イする。
cdc−2活性をアッセイするために、ヒストンH1のリン酸化を追跡する。このアッセイにおいて、膜添加または無添加の間期抽出物および2μlのEBバッファー(20mM β−グリセロリン酸,pH7.3、20mM EGTAおよび15mM MgCl2を含有)に組み換えGST−サイクリンを添加する。試料を液体窒素で凍結し、−70℃で保存する。Kornbluth et al.,Mol.Cell.Biol.,1992,12:3216-3223により記載された方法によりヒストンキナーゼ活性をアッセ
イする。
実施例4:塩および界面活性剤による細胞膜抽出
種々の濃度のKClを添加した溶解バッファーとともに細胞膜を氷上で30分インキュベーションする。細胞膜を超遠心によりペレット化し、次いで、溶解バッファーで5倍希釈し、0.5M蔗糖中で再ペレット化する。次いで、1/10体積の膜をバッファーおよびバナジン酸およびGSTサイクリン/cdc−2キナーゼに添加する。界面活性剤処理のために、氷上で膜を界面活性剤および溶解バッファーとともに15分インキュベーションする。次いで、30分の超遠心により膜をペレット化する。ペレットを5倍体積の溶解バッファー(2mM AT
P、20mM ホスホクレアチニンおよび50μg/mlクレアチンキナーゼを
含有)に再懸濁する。ペレットおよび上清フラクションをそれぞれGSTサイクリン/cdc−2複合体とともにインキュベーションする。該複合体は、バナジン酸不存在下で調製し、cdc蛋白キナーゼならびにTyr15およびTyr14のリン酸化を可能にする。
種々の濃度のKClを添加した溶解バッファーとともに細胞膜を氷上で30分インキュベーションする。細胞膜を超遠心によりペレット化し、次いで、溶解バッファーで5倍希釈し、0.5M蔗糖中で再ペレット化する。次いで、1/10体積の膜をバッファーおよびバナジン酸およびGSTサイクリン/cdc−2キナーゼに添加する。界面活性剤処理のために、氷上で膜を界面活性剤および溶解バッファーとともに15分インキュベーションする。次いで、30分の超遠心により膜をペレット化する。ペレットを5倍体積の溶解バッファー(2mM AT
P、20mM ホスホクレアチニンおよび50μg/mlクレアチンキナーゼを
含有)に再懸濁する。ペレットおよび上清フラクションをそれぞれGSTサイクリン/cdc−2複合体とともにインキュベーションする。該複合体は、バナジン酸不存在下で調製し、cdc蛋白キナーゼならびにTyr15およびTyr14のリン酸化を可能にする。
Claims (18)
- (a)配列番号:2のアミノ酸を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド;
(b)遺伝コードの縮重により、配列番号:2のアミノ酸と同じアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド;
(c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド;および
(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。 - ポリヌクレオチドがDNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドがRNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1に示すヌクレオチドを含む請求項2のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2のアミノ酸を含むポリペプチドをコードしている請求項2のポリヌクレオチド。
- 請求項2のDNAを含むベクター。
- 請求項6のベクターを含む宿主細胞。
- 該DNAによりコードされているポリペプチドを請求項7の宿主細胞から発現させることを特徴とするポリペプチドの製造方法。
- 請求項6のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクションして、該ベクター中に含まれるヒト・cDNAによりコードされているポリペプチドを細胞が発現するようにすることを特徴とする、ポリペプチドを発現する細胞の製造方法。
- 配列番号:2のアミノ酸配列に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 配列番号:2に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項10のポリペプチドに対する抗体。
- 治療上有効量の請求項10のポリペプチドを患者に投与することを特徴とする、Myt−1キナーゼを必要とする患者の治療方法。
- 該ポリペプチドをコードしていて該ポリペプチドをインビボで発現するDNAを患者に提供することにより該治療上有効量のポリペプチドが投与される請求項13の方法。
- 治療上有効量の配列番号:2のアミノ酸配列に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアンタゴニストを患者に投与することを特徴とする、Myt−1キナーゼポリペプチドを阻害することが必要である患者の治療方法。
- 請求項10のポリペプチドの発現に関連した疾病またはかかる疾病に対する感受性の診断方法であって、該ポリペプチドをコードしている核酸配列における変異を決定することを特徴とする診断方法。
- 宿主由来の試料中の請求項10のポリペプチドの存在につき分析することを特徴とする診断方法。
- 請求項10のMyt−1キナーゼポリペプチドおよびリン酸化を受けるMyt−1キナーゼの基質を含有する混合物を調製すること;
該混合物を試験化合物と接触させること;次いで
基質のリン酸化を測定することにより、試験化合物がMyt−1のキナーゼ活性を増大または低下させるかどうかを決定すること
を特徴とする、ヒト・Myt−1キナーゼのアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法。
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