JP2001186889A - 良性前立腺肥大と関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 良性前立腺肥大症に特異的なポリヌクレオチ
ド及びポリペプチドの提供。 【解決手段】 （ａ）ヒト由来の１０種類の特定のアミ
ノ酸を含んでなるポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有する
ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリ
ヌクレオチド；及び （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の塩基を含んでなるポリヌクレオチドからな
る群より選択されるメンバーを含んでなる単離ポリヌク
レオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、一部には、新たに同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；該
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造方法、該ポ
リペプチドのアンタゴニストおよびアゴニスト；ならび
にポリヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、ア
ゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。詳細に
は、これらの点および他の点において、本発明は、遺伝
子（以後「ＢＰＨ１遺伝子という）遺伝子からのポリヌ
クレオチドおよびポリペプチド、ならびにヒト・良性前
立腺肥大組織においてアップレギュレートされるその発
現に関する。

【０００２】

【従来の技術】良性前立腺肥大（ＢＰＨ）は、成人男性
における最もありふれた疾病の１つである。ＢＰＨの組
織学的証拠は５０歳台の男性の４０％以上に見られ、８
０歳台の男性の約９０％において見られる。当該疾病
は、前立腺尿道の近位セグメント周囲の小さな領域に生
じる悪性でない結節の蓄積から生じる。未治療のまま放
置すると、ＢＰＨは急性および慢性の残尿、閉塞性尿路
疾患に続く腎疾患、重大な尿路感染および不可逆的膀胱
代償不全を引き起こしうる。

【０００３】年齢５０歳以上の男性の大部分はＢＰＨに
よるとされるいくらかの尿関連徴候を有していると考え
られる。米国だけでも、ＢＰＨの治療は１７０万の診療
施設で行われており、年間３０００００件以上の前立腺
切除術が行われており、年間５０億ドル以上の経費かか
かっている（Guess,Epiderm.Rev.1992,14:131-136;Holt
grewe、Urology,1995,46(Suppl 13A):23-25）。ＰＢＨ
と診断された患者に対して２つの主要な治療コースがあ
る。５０年以上にわたり、前立腺の経尿路切除が前立腺
肥大および閉塞性徴候の男性に対する標準的治療である
（Lepor,J.Urol.1990,143:533-537）。しかしながら、
これは完全にうまくいくとは限らない。外科的方法に伴
う病的状態は、血栓残留、過剰な輸血、膀胱頸部の収
縮、インポテンス、逆方向の射精および感染症および長
期的な死亡率の増加を包含する（Roos et al.,N.Engl.
J.Med,1989,320:1120-1124）。もう１つの方法は医薬に
よるものである。前立腺被膜および膀胱頸部においてア
ルファ−アドレナリン作動性アンタゴニストはアドレナ
リン作動性受容体をブロックすることが示されている
（Lepor,Urology 1993,42:483-501）。このことは、平
滑筋失調および同時に起こる尿の流れに対する抵抗性の
低下を引き起こす。このことは徴候の改善を引き起こす
が、前立腺体積には影響しない。もう１つの化合物であ
るフィナステリドは、酵素５ａ−レダクターゼに対する
有効な競争的阻害剤である（テストステロンのＤＨＴへ
の変換に包含される）。臨床的研究により、この薬剤で
治療された患者は、直腸からの超音波により測定した場
合、前立腺体積の有意な減少を示すことが示されてい
る。フィナステリドを用いる連続的療法は、患者の５０
％以上について、３年間の投与期間中、有効性の低下を
示さずに前立腺体積の２５％減少を維持し、疾病の進行
が停止したことを示した（Rittmaster,N.Eng.J.Med.199
4 330:120-125、Gormley et al.,N.Eng.J.Med.1992 32
7:1184-1191）。

【０００４】ＢＰＨの発生を開始し、進行を促進する因
子に関する情報、ＢＰＨが排尿機構を変化させる機構、
および臨床的変化におけるＢＰＨの役割を確認するため
の明確な診断基準はない。ＢＰＨの高い罹病率にもかか
わらず、臨床的診断基準は非常に特別なものではなく、
単一のＢＰＨケースの定義は疫学的研究において広く認
められるには至っていない。ＢＰＨについての三つの決
定法がRoylance et al.,Biomed. and Pharmacol.1995 4
9:332-338により示されている。第１に、増殖に関する
顕微鏡的証拠によりＢＰＨを特徴づける。第２に、徴候
に関する情報および直腸触診を包含する従来の医学的方
法に基づいてＢＰＨの臨床的決定を行う。しかしなが
ら、この情報は、泌尿器学的に確認された疾病よりもむ
しろ前立腺症を正確に定義する。第３に、臨床的にＢＰ
Ｈと診断されたすべての患者は泌尿器学的に確認された
疾病を有しているわけではなく、尿道狭窄、膀胱頸部お
よび前立腺機能不全のごとき他の症状も前立腺症の徴候
を引き起こす。前立腺サイズと生じる徴候との間には弱
い相関性しかないので、前立腺サイズのみに基づくＢＰ
Ｈの診断は誤診を招く可能性がある。よって、ＢＰＨの
病理学的診断基準が比較的特別なものであっても、臨床
的診断基準はずっと特別なものではない。

【０００５】ＢＰＨについて現在使用可能な唯一のマー
カーはＰＳＡ（前立腺特異的抗原）である（Wang et a
l.,Prostste 1996 28:10-16,Lee and Oesterling,Sem.i
n Surg.Oncol.1995 11:23-25）。多くのＢＰＨ患者にお
いてＰＳＡレベルが上昇する。しかしながら、上昇した
ＰＳＡレベルは前立腺癌のごとき他の疾病においても見
られ、よって、種々のタイプの疾病との識別は不可能で
ある。したがって、不明確でないＢＰＨ診断のための特
異的マーカーおよび方法に対する必要性が存在する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】明確には、前立腺疾
患、詳細にはＢＰＨに対する特異的マーカーである因
子、および機能不全および疾病におけるそれらの役割に
ついての必要性がある。それゆえ、前立腺疾患、詳細に
はＢＰＨに対する特異的マーカーであり、機能不全また
は疾病の予防、改善または修正において役割を果たしう
るかかる因子の同定および特徴付けに対する必要性があ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
上記事情に鑑み、本発明は、前立腺疾患細胞、特に、Ｂ
ＰＨ個体中の前立腺細胞および循環細胞における上昇し
た発現により検出されたポリペプチド、とりわけ、新規
ＢＰＨ１と同定されたポリペプチドを提供することを目
的とする。

【０００８】さらに、ＢＰＨ１をコードするポリヌクレ
オチド、詳細には、本明細書でＢＰＨ１と命名されたポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するこ
とが本発明の目的である。

【０００９】本発明の特に好ましい具体例において、該
ポリヌクレオチドは、図３に示す配列中のヒト・ＢＰＨ
１をコードする領域を含んでなる。

【００１０】本発明の態様によれば、図３および図１の
ヒト・ｃＤＮＡにより発現されるポリペプチドをコード
する単離核酸分子が提供される。

【００１１】本発明の態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡを包含するヒト・ＢＰＨ１をコードす
る単離核酸分子が提供され、さらに本発明態様の具体例
において、その生物学的に、診断上、臨床的にまたは治
療的に有用な変種、アナログまたは誘導体、あるいは上
記変種、アナログおよび誘導体のフラグメントを包含す
るそれらのフラグメントが提供される。

【００１２】ヒト・ＢＰＨ１の天然に存在する対立遺伝
子変種は本発明の特に好ましい具体例に含まれる。

【００１３】診断目的、例えば、前立腺疾患、詳細には
ＢＰＨの検出のための診断方法において対照として役立
つ、ＢＰＨ１ポリヌクレオチドの少なくとも一部分から
発現されたポリペプチド、詳細には、ヒト・ＢＰＨ１ポ
リペプチドを提供することも本発明の目的である。

【００１４】本発明の態様によれば、本明細書において
ＢＰＨ１と呼ばれるヒト由来の新規ポリペプチド、なら
びにその生物学的、診断上または治療上有用なフラグメ
ント、変種および誘導体、そのフラグメントの変種およ
び誘導体、および上記のもののアナログが提供される。

【００１５】ヒト・ＰＢＨ１遺伝子の天然に存在する対
立遺伝子によりコードされるヒト・ＢＰＨ１の変種が本
発明のこの態様の特に好ましい具体例に含まれる。

【００１６】上記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ント、変種および誘導体、変種および誘導体のフラグメ
ント、ならびに上記のもののアナログの製造方法を提供
することが本発明のもう１つの目的である。

【００１７】本発明のこの態様の好ましい具体例におい
て、発現可能に導入された外来のヒト・ＢＰＨ１をコー
ドしているポリヌクレオチドを有する宿主細胞を、宿主
中でのヒト・ＢＰＨ１の発現のための条件下で培養し、
次いで、発現したポリペプチドを回収することを特徴と
する、上記ＢＰＨ１ポリペプチドの製造方法が提供され
る。

【００１８】本発明のもう１つの目的によれば、特に、
研究、生物学、臨床および治療目的に上記ポリペプチド
およびポリヌクレオチドを用いる製品、組成物、手順お
よび方法が提供される。

【００１９】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
特に、他の事に使用する製品、組成物および方法も提供
され、他の事とは：ＢＰＨ１ポリペプチドまたはＢＰＨ
１をコードしているｍＲＮＡを調べることによる細胞中
のＢＰＨ１発現の評価；本明細書開示のＢＰＨ１ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドに細胞を曝露することに
よるインビトロ、エクスビボまたはインビボでの前立腺
疾患、詳細にはＢＰＨの治療；ＢＰＨ１遺伝子における
欠失のごとき遺伝学的変種および変状のアッセイ；およ
びＢＰＨ１機能の増大またはＢＰＨ１機能不全の治癒の
ための器官へのＢＰＨ１ポリペプチドまたはその活性フ
ラグメントまたはポリヌクレオチドの投与である。

【００２０】本発明のこの態様および他の態様の特定の
好ましい具体例において、ヒト・ＢＰＨ１配列とハイブ
リダイゼーションするプローブが提供される。

【００２１】本発明の目的は、ＢＰＨ疾患およびＢＰＨ
１配列に特異的なポリヌクレオチド配列を提供すること
である。

【００２２】本発明のもう１つの目的は、ＢＰＨおよび
ＢＰＨ１配列に特異的なポリペプチドを提供することで
ある。

【００２３】本発明のもう１つの目的は、ＢＰＨの検出
および診断におけるこれらのポリヌクレオチドおよびポ
リペプチド配列の使用方法を提供することである。

【００２４】本発明のこの態様のさらなる好ましい具体
例において、ＢＰＨ１ポリペプチドに対する抗体が提供
される。この点において特定の好ましい具体例におい
て、抗体はＢＰＨ１に対して非常に選択的である。

【００２５】本発明のこの態様のさらに好ましい具体例
において、ＢＰＨ１アゴニストが提供される。ＢＰＨ１
を模倣し、ＢＰＨ１−結合分子または受容体分子に結合
し、ＢＰＨ１により誘導される応答を誘発または増大さ
せる分子は好ましいアゴニストに含まれる。ＢＰＨ１ま
たはＢＰＨ１ポリペプチド、あるいはＢＰＨ１活性を有
する他のモジュレーターと相互作用し、そのことにより
ＢＰＨ１の１つの効果またはＢＰＨ１の１つよりも多い
効果を有効ならしめ、あるいは増大させる分子も好まし
いアゴニストに含まれる。

【００２６】本発明のさらなる態様によれば、ＢＰＨ１
アンタゴニストが提供される。ＢＰＨ１を模倣してＢＰ
Ｈ１受容体または結合分子に結合するがＢＰＨ１により
誘導される１つの応答またはＢＰＨ１により誘導される
１つよりも多い応答を誘発しないものは好ましいアンタ
ゴニストに含まれる。ＢＰＨ１と結合または相互作用し
てＢＰＨ１の１つの効果またはＢＰＨ１の１つよりも多
い効果を阻害し、あるいはＢＰＨ１の発現を妨げる分子
も好ましいアンタゴニストに含まれる。

【００２７】本発明のさらなる態様において、インビト
ロで細胞に、エクスビボで細胞に、さらにはインビボで
細胞に投与される、あるいは多細胞器官に投与されるＢ
ＰＨ１ポリヌクレオチドまたはＢＰＨ１ポリペプチドを
含んでなる組成物が提供される。本発明のこの態様の特
定の好ましい具体例において、組成物は、疾病の治療の
ための宿主生物中でのＢＰＨ１ポリペプチド発現のため
のＢＰＨ１ポリヌクレオチドを含んでなる。この点に関
して、変化した内在ＢＰＨ１活性に関連した機能不全の
治療のためのヒト患者における発現が特に好ましい。

【００２８】本発明の他の態様、特徴、利点および態様
は下記説明から当業者に明らかとなろう。しかしなが
ら、下記説明および特定の実施例は、本発明の好ましい
具体例を示すものであるが、説明のためだけのものであ
ることを理解すべきである。本発明の精神の範囲内での
種々の変更および修飾は、下記説明を読み、本開示の他
の部分を読めば当業者に容易に明らかとなろう。

【００２９】下記の説明は本明細書、特に実施例におけ
る特定の用語の理解を容易にするためのものである。

【００３０】「ＤＮＡの消化」とは、ＤＮＡ中の特定配
列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂をい
う。本明細書の種々の制限酵素は市販されており、それ
らの反応条件、コファクターおよび使用される他の必要
物は知られており、当業者にとり日常的である。

【００３１】分析目的には、典型的には、２０μｌの反
応バッファー中で１μｇのＤＮＡフラグメントを約２ユ
ニットの酵素で消化する。プラスミド構築用のＤＮＡフ
ラグメントの単離目的には、典型的には、反応規模に応
じて反応体積を増加させて５ないし５０μｌのＤＮＡを
２０ないし２５０ユニットの酵素で消化する。

【００３２】個々の制限酵素に適するバッファーおよび
基質量は標準的な研究室用マニュアル、例えば、後に引
用する文献に記載されており、それらは市販業者により
詳述されている。

【００３３】３７℃で１時間のインキュベーション時間
を通常使用するが、標準的手順、販売者の指示および個
々の反応に応じて条件を変化させてもよい。消化後、反
応物を分析することができ、当業者にとり日常的な既知
方法を用いてアガロースまたはポリアクリルアミドゲル
ゲルによりフラグメントを精製することができる。

【００３４】「遺伝学的エレメント」とは、一般的に
は、ポリペプチドをコードしている領域、あるいは転写
または翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現
にとり重要な他のプロセスを調節する領域を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味し、あるいはポリペプチドをコ
ードしている領域および発現調節領域に作動可能に連結
された領域の両方を含んでなるポリヌクレオチドを意味
する。

【００３５】遺伝学的エレメントはベクター中に含まれ
ていてもよく、ベクターはエピソームエレメントとして
複製するものであり、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物
理的に独立した分子として複製するものである。遺伝学
的エレメントは、真核細胞におけるメトトレキセート選
択によりトランスフェクションされたＤＮＡの増幅期間
中に生じるようなミニ染色体に含まれていてもよい。遺
伝学的エレメントは宿主細胞ゲノムに含まれていてもよ
く、それらは天然の状態でなないが、特に、精製ＤＮＡ
またはベクター中の形態で単離、クローニングおよび宿
主細胞中へ導入される。

【００３６】当該技術分野で知られた用語である、２つ
のポリペプチド間の「同一性」または「類似性」は、１
のポリペプチドアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸
置換をもう１つのポリペプチドの配列と比較することに
より決定される。そのうえ、当該技術分野で知られた用
語である「同一性」とは、２つのポリペプチドまたは２
つのポリヌクレオチド間の配列関連性の程度を意味し、
かかる２つの配列間の合致により決定される。同一性お
よび類似性は両方とも容易に計算されうる（Computatio
nal Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford Univers
ity Press,NewYork,1988;Biocomputing Informations a
nd Genome Projects,Smith,D.W.,ed,Academic Press,Ne
w York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Par
t I,Griffin,A.M.and Griffin,H.G.,eds,Humana Press,
New Jersey,1994;Srquence Analysis in Molecular Bio
logy,von Heinje,G.,Academic Press,1987；およびSequ
ence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.ed
s.,M Stockton Press,NewYork,1991）。２つのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド間の同一性および類似性の
多くの測定方法が存在するが、用語「同一性」および
「類似性」は当業者によく知られている（Sequence Ana
lysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic
Press,1987;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.an
d Devereux,J.eds.,M Stockton Press,New York,1991；
およびCarillo,H.,and Lipmn,D.,SIAMJ.Applied Math.,
48:1073(1988)）。２つの配列間の同一性または類似性
の決定に広く用いられる方法は、Carillo,H.,and Lipm
n,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に開示され
たものを包含するが、これに限らない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験される２つの配列間の合
致が最大となるように設計される。同一性および類似性
を決定する方法はコンピュータープログラムにおいて集
成されている。２つの配列間の同一性および類似性の決
定に好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプ
ログラムパッケージ（Devereux,J.,et al.,Nucleic Aci
ds Research 12(1):387(1984)）、BLASTP,BLASTAN,FAST
A（Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990)）
を包含するが、これらに限らない。

【００３７】「単離」とは、「人の手」によって天然状
態から変化させられていることを意味し、すなわち、天
然において単離される場合には、本来の環境から変化さ
せられ、あるいは本来の環境から除去されること、ある
いはその両方を意味する。

【００３８】例えば、天然状態の生きた動物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、天然状態における共存物質から分
離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書の用語によれば「単離」されたものであ
る。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、用語「単
離」は、それが天然において存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。

【００３９】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、突然変異により融合蛋白を得るために、そして宿
主中での増殖または発現のために、かかるポリヌクレオ
チドをＤＮＡのごとき他のポリヌクレオチドに結合させ
ることができる。単離ポリヌクレオチドは、単独または
ベクターのごとき他のポリヌクレオチドと結合されて、
培養細胞または生物そのものに導入されうる。培養宿主
細胞または生物そのものへ導入された場合、本明細書の
用語によれば、かかるＤＮＡはやはり単離されるもので
ある。なぜなら、それらは天然に存在する形態でなく、
あるいは天然環境に存在するものでないからである。同
様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例え
ば、培地処方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
例えば細胞中への導入のための溶液、化学反応または酵
素反応のための組成物または溶液（それらは天然には存
在しない組成のものであり、その中で単離ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは本明細書にいう単離された状
態となっている）の中に存在しうる。

【００４０】「連結」とは、しばしば２本鎖ＤＮＡであ
る２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間のホスホジ
エステル結合形成プロセスをいう。連結方法は当該分野
においてよく知られており、連結プロトコールは標準的
な研究室用マニュアルおよび文献に記載されており、例
えば、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATO
RY MANUAL,2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor,New York(1989)（「Sambrook」
という）および下で引用するManiatis et al.,の１４６
頁に記載されている。

【００４１】「オリゴヌクレオチド」とは比較的短いポ
リヌクレオチドをいう。しばしば、該用語は１本鎖デオ
キシリボヌクレオチドをいうが、１本鎖または２本鎖リ
ボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびと
りわけ２本鎖ＤＮＡも指すことがある。

【００４２】１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド
のごときオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴ
ヌクレオチド合成のごとき化学的方法により合成され
る。しかしながら、オリゴヌクレオチドを種々の方法に
より製造することができ、それらはインビトロ組み換え
ＤＮＡによる方法ならびに細胞および生物におけるＤＮ
Ａ発現による方法を包含する。

【００４３】化学合成されたＤＮＡは、典型的には最初
に５’リン酸を欠く形で得られる。かかるオリゴヌクレ
オチドの５’末端は、典型的には組み換えＤＮＡ分子を
得るためにＤＮＡリガーゼを用いる連結反応によるホス
ホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌ
クレオチドの連結が所望の場合には、キナーゼおよびＡ
ＴＰを用いるような標準的方法によりリン酸を付加する
ことができる。

【００４４】一般的には本明細書において「プラスミ
ド」は、当業者によく知られた慣用的命名法により、大
文字および／または数字が前および／または後に続く小
文字のｐにより命名される。

【００４５】本明細書開示の出発プラスミドは市販のも
の、制限なく公的に利用可能なものであるか、あるいは
よく知られた公表された方法を用いて利用可能なプラス
ミドから日常的に構築可能なものである。本発明により
使用可能な多くのプラスミドならびに他のクローニング
および発現ベクターはよく知られており、当業者が容易
に入手できるものである。そのうえ、当業者は、本発明
における使用に適するどのような数のプラスミドであっ
ても容易に構築することができる。本発明におけるかか
るプラスミドならびに他のベクターの特性、構築および
使用は、本開示から当業者に容易に明らかとなろう。

【００４６】一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポ
リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチ
ドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮ
ＡまたはＤＮＡであってよい。よって、本明細書の用語
ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本鎖ＤＮ
Ａ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、１本鎖
および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の
混ざったＲＮＡをいい、より典型的には、２本鎖のもの
または１本鎖および２本鎖領域の混ざったものをいう。

【００４７】さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチド
は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの
両方を含んでなる３本鎖をいう。かかる領域中の鎖は同
じ分子由来であってもよく、また異なる分子由来であっ
てもよい。その領域は１つまたはそれ以上の分子の全体
を含みうるが、典型的には、いくつかの分子の１の領域
を含む。３本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、
１のオリゴヌクレオチドである。

【００４８】本明細書の用語ポリヌクレオチドは、１個
またはそれ以上の修飾塩基を含む上記ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを包含する。よって、安定性または他の理由のために
修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細
書にいう「ポリヌクレオチド」である。そのうえ、例え
ばイノシンまたはトリチウム化されたような修飾塩基の
ごとき普通でない塩基を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ
も本明細書にいうポリヌクレオチドである。

【００４９】当業者に知られた多くの有用な目的の非常
に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡについて行われてい
ることが認識されよう。本明細書の用語ポリヌクレオチ
ドは、かかる化学的に、酵素的、あるいは代謝的に修飾
された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特にウイル
スの特徴および単一・複合細胞を包含する細胞の特徴を
示すＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

【００５０】本明細書の用語「ポリペプチド」を以下に
説明する。ポリペプチドの基本的構造はよく知られてお
り、当該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載さ
れている。この点からすると、用語ポリペプチドは、ペ
プチド結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそ
れ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたは蛋白をい
うために用いられる。本明細書において該用語は短鎖
（当該分野において通常にはペプチド、オリゴペプチド
およびオリゴマーという）および長鎖（当該分野におい
て一般的には蛋白といい、種々のタイプがある）の両方
をいう。

【００５１】ポリペプチドは、しばしば２０個の天然ア
ミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含み、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスのみ
ならず当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても
末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を一定のポリペ
プチド中で修飾できることが理解されよう。ポリペプチ
ドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも、ここに挙
げるには膨大すぎるが、それらは基本的な教科書および
さらに詳細な研究論文に記載されており、さらには膨大
な研究文献にも記載されており、それらは当業者によく
知られている。

【００５２】本発明ポリペプチド中に存在してもよい知
られている修飾のうち、少しの例を挙げると、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共
有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタ
ミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、
グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニ
レーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、
アルギニン化のごとき転移−ＲＮＡにより媒介される蛋
白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがあ
る。

【００５３】かかる修飾は当業者によく知られており、
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
によく行われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質
付加は、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIE
S,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,Ne
w York(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されて
いる。多くの詳細なレビューがこの問題について利用で
き、例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New Y
ork(1983)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Mod
ifications:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Se
ifter et al.,Analysis for protein modifications an
d nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(19
90)およびRattman et al.,Protein Synthesis:Posttran
slational Modifications and Aging.Ann.N.Y.Acad.Sc
i.663:48-62(1992)にある。

【００５４】よく知られ、上記したように、ポリペプチ
ドは常に完全に直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、一般的には、天然に起こるプロセッシ
ングおよび自然には起こらない人間による操作を包含す
る翻訳後の出来事の結果として、ポリペプチドは至る所
で分枝しており、また、分枝ありまたはなしで環状であ
ったりする。非翻訳的天然プロセスおよび全くの合成法
によっても、環状、分枝および分枝つき環状のポリペプ
チドが合成されうる。

【００５５】ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびア
ミノ末端およびカルボキシル末端を包含するポリペプチ
ドのいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、
ポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるい
はそれら両方の共有結合によるブロックは、天然および
合成ポリペプチドにおいてよく起こるものであり、かか
る修飾が本発明ポリペプチド中に存在してもよい。例え
ば、蛋白分解プロセッシングの前にE.coliにおいて作ら
れるポリペプチドのアミノ末端残基はほとんど例外なく
Ｎ−ホルミルメチオニンである。

【００５６】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、それがいかにして作られるのかという機能であろ
う。例えば、宿主中でクローンされた遺伝子を発現する
ことにより作られるポリペプチドは、宿主細胞翻訳後修
飾能およびポリペプチドのアミノ末端に存在する修飾シ
グナルによって、修飾の性質および程度の大部分が決定
される。例えば、よく知られているように、グリコシレ
ーションは、しばしば、E.coliのごとき細菌細胞におい
ては起こらない。したがって、グリコシレーションが望
まれる場合には、ポリペプチドをグリコシレーションす
る宿主中、一般的には真核細胞中で発現すべきである。
昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後グリコシ
レーションを行うので、昆虫細胞発現系は、特に無傷の
グリコシレーションパターンを有する哺乳動物蛋白を効
率よく発現するために開発されてきた。

【００５７】同じタイプの修飾が一定のポリペプチドに
おいて同じ部位またはいくぶん異なった部位においてい
くつか存在しうることが理解されよう。また、一定のポ
リペプチドは多くのタイプの修飾を含みうる。

【００５８】一般的には本明細書の用語「ポリペプチ
ド」は、かかる修飾すべてを含み、詳細には、宿主細胞
中でポリヌクレオチドを発現させることにより合成され
るポリペプチド中に存在する修飾物を含む。

【００５９】本明細書の用語ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの「変種」とは、もとのポリヌクレオチドま
たはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドをいう。この意味において変種は本開示の以
下の部分およびいずれかの部分においてより詳細に説明
される。

【００６０】（１）他のもの、すなわちもとのポリヌク
レオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチ
ド。一般的には、相違は、もとのヌクレオチド配列と変
種ヌクレオチド配列が全体的に極めて類似し、多くの領
域において同一であるようなものに限られる。下記のご
とく、変種におけるヌクレオチド配列の変化がサイレン
トであってもよい。すなわち、それらは、ポリヌクレオ
チドによりコードされるアミノ酸を変化させなくてもよ
い。変化がこのタイプのサイレント変化に限定される場
合、変種はもとのポリペプチドと同じアミノ酸配列をコ
ードしているであろう。また、下記のごとく、変種にお
けるヌクレオチド配列の変化が、もとのポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変
化させたものであってもよい。下記のごとく、かかるヌ
クレオチド変化は、もとの配列によりコードされるポリ
ペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切
断を引き起こし得る。

【００６１】（２）他のもの、すなわちもとのポリペプ
チドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般的に
は、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が
全体的に極めて類似し、多くの領域において同一である
ようなものに限られる。変種ともとのポリペプチドと
は、１個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およ
び切断によりアミノ酸配列が異なっていてもよく、それ
らはいずれの組み合わせにおいて存在してもよい。

【００６２】本明細書の用語「受容体分子」とは、本発
明のＢＰＨ１ポリペプチドと特異的に結合または相互作
用する分子をいい、古典的受容体のみを包含するのでは
なく、好ましくは、本発明ポリペプチドと特異的に結合
または相互作用する他の分子も包含する（それらをそれ
ぞれ「結合分子」および「相互作用分子」、「ＢＰＨ１
結合分子」および「ＢＰＨ１相互作用分子」という）。
本発明ポリペプチドとかかる分子（受容体または結合も
しくは相互作用分子を包含）との間の結合は本発明ポリ
ペプチドにもに生じるものであってもよく、あるいは非
常に好ましくは本発明ポリペプチドに対して非常に特異
的であってもよく、あるいは非常に好ましくは本発明ポ
リペプチドを包含する蛋白のグループに非常に特異的で
あってもよく、あるいは好ましくは、本発明ポリペプチ
ドがその蛋白グループの少なくとも１つであるいくつか
の蛋白グループに対して特異的であってもよい。また、
受容体は、本発明ポリペプチドに特異的に結合する抗体
および抗体により誘導される物質のごとき非天然のもの
であってもよい。

【００６３】発明の説明 本発明は、新規ＢＰＨ１ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチド、特に以下に詳細に説明されるものに関する。詳
細には、本発明は、新規ヒト・ＢＰＨ１のポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関し、ヒト・ＢＰＨ１は前立
腺疾患組織において発現され、ＢＰＨ組織においてアッ
プレギュレーションされる。特に本発明は、実施例に説
明するようにして得られる、図１から図３までに示すヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列を有するＢＰＨ１に
関する。

【００６４】ポリヌクレオチド 本発明の１の態様によれば、図２の推定アミノ酸配列
（読み枠）を有するＢＰＨ１ポリペプチドをコードする
単離ポリヌクレオチドが提供される。ある種の読み枠は
末端メチオニン残基を有していない。

【００６５】図３または１に示すポリヌクレオチド配列
のごとき本明細書の情報を用いれば、毛細血管内皮組織
由来の細胞を出発物質として得られるｍＲＮＡを用いる
ｃＤＮＡクローニングのための方法のごとき標準的クロ
ーニングおよびスクリーニング法を用いてヒト・ＢＰＨ
１ポリペプチドをコードしている本発明ポリヌクレオチ
ドを得ることができる。本発明の説明として、図１およ
び図３に示すポリヌクレオチドは、ＢＰＨと診断された
ドナー由来のヒト・前立腺組織細胞から得られたｃＤＮ
Ａライブラリーにおいて見いだされたものである。

【００６６】本発明ヒト・ＢＰＨ１は前立腺疾患組織に
おいて発現され、特に、ＢＰＨ組織においてアップレギ
ュレーションされる。かくして得られるｃＤＮＡ配列を
図１および図３に示す。それぞれの鎖は、図２に示す一
連の蛋白をコードしている読み枠を含んでいる。最も好
ましい蛋白を配列番号：５のアミノ酸配列として示す。

【００６７】本発明ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのご
ときＲＮＡ形態であってもよく、あるいは例えばクロー
ニングまたは化学合成法またはそれらの組み合わせによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮ
Ａ形態であってもよい。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖で
あってよい。１本鎖ＤＮＡはコーディング鎖（センス鎖
としても知られる）であってもよく、あるいは非コーデ
ィング鎖（アンチ−センス鎖としても知られる）であっ
てもよい。

【００６８】ポリペプチドをコードしているコーディン
グ鎖は、図３または図１に示すポリヌクレオチドのコー
ディング鎖と同じであってもよい。コーディング鎖は別
の配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、それ
は、遺伝コードの縮重の結果として図３または図１のＤ
ＮＡのポリペプチドをコードしているものであってもよ
い。

【００６９】図２のポリペプチドをコードしている本発
明ポリヌクレオチドは、それらにより示されるポリペプ
チドに関するコーディング配列；当該ポリペプチド配列
およびリーダー配列または分泌配列（プレ−またはプロ
−またはプレプロ−蛋白配列）をコードしているような
付加的配列に関するコーディング配列；さらなる非コー
ディング配列（例えば、イントロンおよび転写されるが
翻訳されない非コーディング５’および３’配列（転
写、ｍＲＮＡプロセッシング−スプライシングおよびポ
リアデニレーションシグナルを包含−リボソーム結合お
よびｍＲＮＡ安定性において役割を果たす）；さらなる
コーディング配列（さらなる官能基を提供するさらなる
ようなアミノ酸をコードしている）を伴った上記の付加
的配列を有するあるいは有していないポリペプチドに関
するコーディング配列（これらに限らない）を包含して
もよい。よって、例えば、ポリペプチドがペプチドのご
ときマーカー配列に融合していてもよく、該マーカー配
列は融合ポリペプチドの精製を容易にするものであって
よい。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,In
c）中のタグのごときヘキサヒスチジンペプチドであ
り、それらの多くが市販されている。例えば、Gentz et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86,821-824(1989)に記
載のごとく、ヘキサヒスチジンは融合蛋白の精製を便利
にする。ＨＡタグはインフルエンザ・ヘマグルチニン蛋
白に対応するものであり、例えば、Wilson et al.,Cell
37:767(1984)に記載されている。

【００７０】上記によれば、本明細書の用語「ポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポ
リペプチド、詳細には、図２に示すアミノ酸配列を有す
るヒト・ＢＰＨ１をコードしている配列を含むポリヌク
レオチドを包含する。該用語は、さらなる領域（コーデ
ィングおよび／または非コーディング配列を含んでいて
もよい）を伴ったポリペプチド（例えば、イントロンに
より分断されている）をコードしている単一の連続領域
または不連続領域を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００７１】さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドの
変種に関する。該変種は図２の推定アミノ酸配列を有す
るポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
をコードしている。ポリヌクレオチドの変種は、天然に
存在する対立遺伝子変種のごとき天然に存在する変種で
あってもよく、あるいは天然に存在することが知られて
いない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチドの
非天然変種を、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適
用される突然変異法を包含する突然変異法により作成し
てもよい。

【００７２】この点において、ヌクレオチド置換、欠失
または付加によって上記ポリヌクレオチドと異なる変種
も「変種」に含まれる。置換、欠失または付加には１個
またはそれ以上のヌクレオチドが関与しうる。変種はコ
ーディング配列または非コーディング配列あるいはそれ
らの両方において変化していてもよい。コーディング配
列の変化が保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失ま
たは付加を生じるものであってもよい。

【００７３】この点において本発明の特に好ましい具体
例は、図２に示すＢＰＨ１のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチド；その変
種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそ
の変種、アナログおよび誘導体のフラグメントである。

【００７４】この点において、ＢＰＨ１変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメ
ントの変種、アナログおよび誘導体をコードしているポ
リヌクレオチドであって、図２のＢＰＨ１ポリペプチド
のアミノ酸配列を有するものがさらに特に好ましく、該
アミノ酸中、いくつかの、少数の、５ないし１０個、１
ないし５個、１ないし３、２、１個または０個のアミノ
酸残基が置換、欠失または付加されており、あるいはそ
れらが組み合わされている。これらのうち特に好ましい
のは、サイレント置換、付加および欠失であり、それら
はＢＰＨ１の特性および活性を変化させない。また、こ
の点において、保存的置換が特に好ましい。置換を有し
ない図２のアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドが最も好ましい。

【００７５】本発明のさらに好ましい具体例は、図２に
示すアミノ酸配列を有するＢＰＨ１ポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドである。あるいはま
た、本明細書記載のライブラリーから得られるヒト・ｃ
ＤＮＡのＢＰＨ１ポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドに対して少なくとも８０％同一である領域を
含んでなるポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリ
ヌクレオチドが非常に好ましい。この点において、上記
ポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリ
ヌクレオチドが特に好ましく、これらのうちでも特に好
ましいのは、少なくとも９５％同一のものである。さら
にそのうえ、少なくとも９５％同一のものの中でも少な
くとも９７％同一のものが非常に好ましく、その中でも
少なくとも９８％同一のものおよび少なくとも９９％同
一のものが特に非常に好ましく、少なくとも９９％のも
のがより好ましい。

【００７６】そのうえ、この点において特に好ましい具
体例は、図３または図１のｃＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドのいずれかと実質的に同じ生物学的機能ま
たは活性を保持しているポリペプチドをコードしている
ポリヌクレオチドである。

【００７７】さらに本発明は、本明細書において上で述
べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において本発明は、特に、厳密な条
件下で本明細書において上で述べた配列とハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の
用語「厳密な条件」とは、少なくとも９５％、好ましく
は少なくとも９７％同一である配列間においてのみハイ
ブリダイゼーションが起こることを意味する。

【００７８】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てさらに本明細書で議論するように、例えば、上記本発
明ポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＢＰＨ
１をコードしている全長のｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離してもよく、また、ヒト・ＢＰＨ１遺伝子に対
して高度の配列類似性を有するｃＤＮＡおよび他の遺伝
子のゲノムクローンを単離してもよい。一般的には、か
かるプローブは少なくとも１５個の塩基を含んでなる。
好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個の塩基
を有し、少なくとも５０個の塩基を有していてもよい。
特に好ましいプローブは少なくとも３０個の塩基を有
し、５０個またはそれ以下の塩基を有するであろう。

【００７９】例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合
成するための既知ＤＮＡ配列を用いてＢＰＨ１遺伝子の
コーディング領域を単離することができる。次いで、本
発明遺伝子配列に対する配列相補性を有する標識オリゴ
ヌクレオチドを用いてヒト・ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡま
たはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングしてライブ
ラリーのどのメンバーがプローブにハイブリダイゼーシ
ョンするのかを決定する。

【００８０】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを、ヒトの疾病の治療および診断のための研究試薬お
よび材料として用いてもよい（特に、ポリヌクレオチド
アッセイに関して本明細書でさらに議論する）。

【００８１】ポリヌクレオチドは、当該蛋白およびさら
なるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、あるい
はポリペプチドに対するさらなる内部アミノ酸（ペプチ
ド形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を有する場合）
であるポリペプチドをコードしていてもよい。かかる配
列は、前駆体から個々の形態への蛋白のプロセッシング
において役割を果たしている可能性があり、蛋白輸送を
容易にする可能性があり、蛋白半減期を延長または短縮
する可能性があり、あるいは特に、アッセイまたは製造
のために蛋白の取り扱いを容易にする可能性もある。in
situにおける一般的な場合には、細胞酵素により、さ
らなるアミノ酸がプロセッシングにより蛋白から除去さ
れうる。

【００８２】１またはそれ以上のプロ配列に融合した特
別の形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白は、そのポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去される場合、一般的にはかかる不活性前駆体が活性化
される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化前に
除去される。一般的にはかかる前駆体はプロ蛋白と呼ば
れる。

【００８３】発現が良性前立腺肥大組織中でアップレギ
ュレーションされるポリヌクレオチド配列（配列番号：
１）を、今回同定した（図３参照）。この本発明ポリヌ
クレオチドはＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態であってよ
く、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮ
Ａを包含する。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖であってよ
く、１本鎖がコーディング鎖であっても非コーディング
（アンチ−センス）鎖であってもよい。さらに本発明
は、配列間において少なくとも５０％、好ましくは７０
％同一である場合に上記配列にハイブリダイゼーション
するポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、
厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイゼ
ーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書に用
語「厳密な条件」は、少なくとも９５％、好ましくは少
なくとも９７％同一である配列間においてのみハイブリ
ダイゼーションが起こることを意味する。好ましい具体
例において上記ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチドは、図３または図１にｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコー
ドしている。

【００８４】サブトラクションハイブリダイゼーション
によりＢＰＨポリヌクレオチド配列（配列番号：１）を
同定しクローンした。罹病していない正常前立腺組織中
のメッセンジャーＲＮＡを比較することにより、疾病に
かかっている前立腺組織に存在するｍＲＮＡのみを同定
した。ＢＰＨ前立腺組織からｍＲＮＡを単離し、逆転写
酵素で処理してＢＰＨ ｃＤＮＡのプールを得た。次い
で、過剰の正常ヒト・前立腺ポリＡ＋ＲＮＡ（ドライバ
ー）を用いるフォトビオチンサブトラクションによりこ
のｃＤＮＡプールをスクリーニングしてＢＰＨ ｃＤＮ
Ａ（ドライブされる方）を差し引いた。ポリＣポリヌク
レオチドの伸長部分を差し引いたｃＤＮＡの５’末端に
付加し、その材料を増幅した。増幅した生成物をＵＤＧ
で処理してｐＡＭＰ１ベクター（Gibco-BRL）中への方
向性のあるクローニングを容易にした。

【００８５】正常前立腺およびＢＰＨ組織の両方由来の
検出可能マーカーで標識した両方のｃＤＮＡ鎖を用いて
このＢＰＨ特異的ライブラリーの複製フィルターをスク
リーニングした。このスクリーニングにより１のクロー
ンを単離し、これはＢＰＨ組織中でアップレギュレーシ
ョンを示した。このクローンのヌクレオチド配列（配列
番号：１；図３）は、ＧＥＮＥＭＢＬおよびＨＧＳデー
タベースに対して分析した場合にユニークであることも
わかった。

【００８６】このクローンに特異的な２つのプライマー
（ＳＢ６１７５：５’−ＧＣＡ−ＡＡＧ−ＴＴＴ−ＧＴ
Ｃ−ＡＣＴ−ＣＣＣ−ＡＡＴ−ＣＣ−３’／ＳＢ６１７
６（配列番号：１４）：５’−ＧＡＧ−ＡＧＡ−ＴＧＡ
−ＣＡＧ−ＧＧＡ−ＴＡＡ−ＡＧＣ−３’（配列番号：
１３））を合成し、BIOS polychromosomal Somatic Cel
l Hybrid Panelを用いてＸ染色体に対してヌクレオチド
配列をマッピングするために使用した。さらに、BIOS M
onochromosomal PanelによりＸ染色体に対する位置を決
定した。Ｘ染色体に関する不一致値は０であり、染色体
８に関して５％、染色体６および４に関して１０％であ
った（一致値＝１００−不一致値）。

【００８７】遺伝子の５’末端を決定するために、５’
−ＲＡＣＥを行った。５’−ＲＡＣＥ生成物をクローン
し、もとの配列をこえた伸長がないことがわかった。ノ
ーザンブロットおよび５’−ＲＡＣＥに基づいて、この
クローンについて得られる最初の配列が全長の遺伝子で
あることが決定された。

【００８８】ＢＰＨにかかっている組織におけるこのポ
リヌクレオチド配列のアップレギュレーションを確認し
た。正常ヒト・前立腺およびＢＰＨのヒトの前立腺由来
の同量のポリＡ＋ＲＮＡを含むノーザンブロットを作成
した。それぞれ正常およびＢＰＨのｍＲＮＡを含む２ｃ
ｍの断片にブロットを切断した。ｂ−アクチンプローブ
を断片に対して使用して全ＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡ
量を評価し、これらのレーン上のポリＡ＋ＲＮＡを定量
した。正常組織と比較すると、ＢＰＨ組織中のｂ−アク
チンのメッセージ量の大きな減少が存在した。他のノー
ザンブロットについてもこの特徴は繰り返し観察され
た。ブロットの他の部分を、ＢＰＨポリヌクレオチド配
列へのプローブのハイブリダイゼーションに使用した。
ＢＰＨ１クローン量は、正常組織と比較して、ＢＰＨ組
織においてアップレギュレーションされることがわかっ
た。ベータ−アクチンと比較した場合、この相違は劇的
であった。

【００８９】さらに本発明は、ＢＰＨにおいてアップレ
ギュレーションされるポリヌクレオチド配列によりコー
ドされるＢＰＨ特異的ポリペプチドならびにかかるポリ
ペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関す
る。

【００９０】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを、ヒトの疾病の治療および診断のための研究試薬お
よび材料として使用してもよい。

【００９１】本発明ポリヌクレオチド配列を用いて、罹
病した前立腺組織中のＢＰＨ特異的ポリヌクレオチド配
列を検出するためのプローブを調製することができる。
該プローブはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、
オリゴヌクレオチドＤＮＡ合成装置、または全配列の酵
素標識（例えば、ニックトランスレーションまたはラン
ダムヘキサマーによる）を包含する当業者に知られた種
々の方法により調製される（これらの方法に限らな
い）。標識はラジオアイソトープ、蛍光標識、化学標識
または酵素であってよい。一般的には、このタイプのプ
ローブは少なくとも２０個の塩基を有する。しかしなが
ら、好ましくは、該プローブは少なくとも３０個の塩基
を有し、一般的には５０塩基をこえないが、より多くの
塩基を有していてもよい。検出のためのアッセイは、ノ
ーザンブロット、スロットブロットおよびin situハイ
ブリダイゼーションを包含するが、これらに限らない。

【００９２】プローブを用いて、全長の転写物に対応す
るｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンまたは調節配
列およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロン
を包含するＢＰＨにおいてアップレギュレーションされ
る完全なポリヌクレオチド配列を含むクローンを同定し
てもよい。スクリーニング例は、オリゴヌクレオチドプ
ローブを合成するための既知ＤＮＡ配列を用いることに
よりＢＰＨ配列のコーディング領域を単離することを特
徴とする。本発明遺伝子配列に相補的な配列を有する標
識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒト・ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニン
グしてライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブ
リダイゼーションするかを決定する。

【００９３】まとめると、本発明ポリヌクレオチドは、
蛋白、蛋白およびリーダー配列（プレ蛋白ともいわれ
る）、プレ蛋白のリーダー配列でない１個またはそれ以
上のプロ配列を有する蛋白の前駆体、あるいは１個また
はそれ以上のプロ配列（一般的には、活性形態または他
の形態のポリペプチドを生じるプロセッシング工程の間
に除去される）を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプ
ロ蛋白をコードしていてもよい。

【００９４】ポリペプチド さらに本発明は、図２の推定アミノ酸配列を有するヒト
・ＢＰＨ１ポリペプチドに関する。

【００９５】また本発明は、これらのポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図２
のポリペプチドについていう場合、かかるポリペプチド
と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持している
ポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋
白部分の開裂により活性化されて活性ポリペプチドを生
じうるプロ蛋白を包含する。

【００９６】本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペ
プチドは組み換えポリペプチドである。

【００９７】図２のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログは以下のものである：（ｉ）１個また
はそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミ
ノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換さ
れており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードにより
コードされているものであっても、コードされていない
ものであってもよく、あるいは（ｉｉ）１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉ
ｉｉ）ポリペプチドの半減期を延長させるような別の化
合物にポリペプチドが融合しているもの、あるいは（ｉ
ｖ）リーダーまたは分泌配列、またはポリペプチドの精
製に用いられる配列、またはプロ蛋白配列のごときさら
なるアミノ酸がポリペプチドに融合しているもの。かか
るフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。

【００９８】この点において、図２に示すＢＰＨ１のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメン
トの変種、アナログおよび誘導体は本発明の特に好まし
い具体例に属する。あるいはまた、この点において、本
発明の特に好ましい具体例は、ＢＰＨ１のアミノ酸配列
を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体お
よびフラグメント、ならびに該フラグメントの変種、ア
ナログおよび誘導体である。

【００９９】保存的アミノ酸置換によって元のものとは
異なる変種も好ましい変種に属する。かかる置換は、ポ
リペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換するものである。典型的に見られるのは、脂肪
族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での
相互置換；水酸基を有するＳｅｒおよびＴｈｒの相互置
換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの相互置換、アミド残
基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基Ｌｙｓおよ
びＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間
の置換である。

【０１００】この点において、いくつかの、少数の、５
ないし１０個の、１ないし５個の、１ないし３、２、１
個の、または０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付
加されている（あるいはそれらのいずれかの組み合わ
せ）図２のＢＰＨ１ポリペプチドのアミノ酸配列を有す
る変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならび
に該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体がさら
に特に好ましい。ＢＰＨ１の特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠失がこれらのうちで
特に好ましい。また、この点において、保存的置換が特
に好ましい。置換のない図２のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドがもっとも非常に好ましい。

【０１０１】好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均一
にまで精製されている。

【０１０２】本発明ポリペプチドは、配列番号：３から
１２のポリペプチドならびに配列番号：３から１２のポ
リペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有し、よ
り好ましくは配列番号：３から１２のポリペプチドに対
して少なくとも９０％の類似性を有し、さらにより好ま
しくは配列番号：３から１２のポリペプチドに対して少
なくとも９５％の類似性を有するポリペプチド（さらに
より好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有す）を
包含し、また、かかるポリペプチドの部分も包含する
（ポリペプチドに対するかかる部分は一般的には少なく
とも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０
個のアミノ酸を含む）。

【０１０３】本発明ポリペプチドのフラグメントまたは
部分を、ペプチド合成による対応する全長のポリペプチ
ドの合成に使用してもよい。それゆえ、フラグメントを
全長のポリペプチドの製造のための中間体として使用し
てもよい。本発明ポリペプチドのフラグメントまたは部
分を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成して
もよい。

【０１０４】フラグメント ＢＰＨ１ポリペプチドのフラグメント、最も詳細には図
２に示すアミノ酸配列を有するＢＰＨ１ポリペプチドの
フラグメントを含んでなるポリペプチド、および図２の
ＢＰＨ１ポリペプチドの変種および誘導体のフラグメン
トを含んでなるポリペプチドも、本発明のこの態様の好
ましい具体例に含まれる。

【０１０５】この点において、フラグメントは、上記Ｂ
ＰＨ１ポリペプチドおよびその変種または誘導体のアミ
ノ酸配列の一部（全部ではない）と完全に同じアミノ酸
配列を有するポリペプチドである。

【０１０６】かかるフラグメントは「フリー−スタンデ
ィング（free-standing）」、すなわち、他のアミノ酸
またはポリペプチドの一部でなく、それらに融合してい
ないものであってよく、あるいはかかるフラグメントが
大きなポリペプチド中に含まれていて、その一部分また
は領域となっていてもよい。大きなポリペプチド中に含
まれている場合、現在議論中のフラグメントは、最も好
ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしなが
ら、いくつかのフラグメントが単一のより大きなポリペ
プチド中に含まれていてもよい。例えば、特定の好まし
い具体例は、宿主における発現のために設計された前駆
体ポリペプチド中に含まれていて、ＢＰＨ１フラグメン
トのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリペ
プチド領域ならびに該フラグメントのカルボキシル末端
に融合したさらなる領域を有している本発明ＢＰＨ１ポ
リペプチドのフラグメントに関する。それゆえ、本明細
書における意味の１の態様において、フラグメントは、
ＢＰＨ１由来の融合ポリペプチドまたは融合蛋白の一部
または部分をいう。

【０１０７】本発明ポリペプチドフラグメントの典型例
として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０個、
１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５
個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし
１００個および７５ないし１００個のアミノ酸のものを
挙げることができる。

【０１０８】この文脈において、特に列挙した範囲、な
らびに数個、少数、５、４、３、２、１個のアミノ酸の
分だけ大きいまたは小さい範囲（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）を包含する。例え
ば、この文脈において、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスマイナス数個、少数、５、４、３、２、
１個から、９０プラスマイナス数個、少数、５、４、
３、２、１個までのポリペプチドフラグメントを意味
し、すなわち、広くは４０マイナス数個から９０プラス
数個のアミノ酸、狭くは４０プラス数個から９０マイナ
ス数個のアミノ酸の範囲である。

【０１０９】この点において、列挙した範囲プラスまた
はマイナス５個程度のアミノ酸（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）が非常に好ましい。
列挙した範囲プラスまたはマイナス３個程度のアミノ酸
（上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲におい
て）が特に非常に好ましい。列挙した範囲プラスまたは
マイナス１個程度のアミノ酸（上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において）または列挙した範囲そ
のものが特に非常に好ましい。この点において、約５な
いし１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３
０ないし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０
個、４１ないし９０個、５０ないし１００個および７５
ないし１００個のアミノ酸の長さのフラグメントが最も
好ましい。

【０１１０】ＢＰＨ１の切断された変異種は本発明の特
に好ましいフラグメントに含まれる。切断された変異種
は、図２のアミノ酸配列を有するＢＰＨ１ポリペプチ
ド、あるいはその変種または誘導体を包含するが、アミ
ノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、連続した
領域、部分または一部分）の欠失、あるいはカルボキシ
ル末端を含む連続した一連の残基の欠失、あるいは二重
切断変異種中にあるような２つの連続した残基の欠失
（１つはアミノ末端を含み、もう１つはカルボキシル末
端を含む）は除く。上に示したサイズ範囲のフラグメン
トも切断されたフラグメントの好ましい具体例であり、
一般的にはそれらはフラグメントのなかでも特に好まし
いものである。

【０１１１】本発明のこの態様において、ＢＰＨ１ポリ
ペプチドの構造的または機能的属性によって特徴づけら
れるフラグメントも好ましい。この点において本発明の
好ましい具体例は、ＢＰＨ１ポリペプチドのアルファ−
ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形成領域（「ア
ルファ−領域」）、ベータ−シートおよびベータ−シー
ト形成領域（「ベータ−領域」）、ターンおよびターン
形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、
アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシ
ブル領域、表面形成領域および高抗原性インデックス領
域を含んでなるフラグメントを包含する。

【０１１２】この点において、いくつかの上記特徴のご
ときいくつかの構造的特徴を合わせたＢＰＨ１の領域を
含んでなるフラグメントは、非常に好ましいフラグメン
トに属する。この点において、図２の、約１０ないし約
２０個、約４０ないし約５０個、約７０ないし約９０個
および約１００ないし約１１３個の残基により決定され
る領域（そのすべてが、ターン領域、親水性領域、フレ
キシブル領域、表面形成領域および高抗原性インデック
ス領域の特徴を顕著に有するアミノ酸組成により特徴づ
けられる）は特に非常に好ましい領域である。かかる領
域は大きなポリペプチド中に含まれていてもよく、ある
いは上記のごとくそれら自体本発明の好ましいフラグメ
ントでありうる。この段落の用語「約」は一般的なフラ
グメントに関して上で説明した意味を有する。

【０１１３】さらに好ましい領域はＢＰＨ１の活性を媒
介する領域である。この点において、ＢＰＨ１の化学
的、生物学的活性または他の活性（類似活性または改善
された活性を包含、望ましくない活性は減じられてい
る）を有するフラグメントが最も好ましい。この点にお
いて、図２に示す関連ポリペプチドのごとき関連ポリペ
プチドの活性領域に対して配列または位置、あるいは両
方が相同的である領域を含むフラグメントは非常に好ま
しい。これらの点において、上記の切断された変異種は
特に好ましいフラグメントに含まれる。

【０１１４】さらに本発明は、特に、上記フラグメント
をコードしているポリヌクレオチド、該フラグメントを
コードしているポリヌクレオチドにハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチド、詳細には厳密な条件下でハ
イブリダイゼーションするもの、および該フラグメント
をコードしているポリペプチドを増幅するためのＰＣＲ
プライマーのごときポリヌクレオチドに関することが理
解されよう。これらの点において、好ましいポリヌクレ
オチドは上記のような好ましいフラグメントに対応する
ポリヌクレオチドである。

【０１１５】ベクター、宿主細胞、発現 また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞
および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関
する。

【０１１６】宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチ
ドを含むようにして、本発明ポリペプチドを発現させる
ことができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェ
クション、トランスベクションおよび形質転換のよく知
られた方法を用いてポリヌクレオチドを宿主細胞中に導
入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他のポリ
ヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他のポリ
ヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個に、同
時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合して導入
してもよい。

【０１１７】よって、例えば、哺乳動物細胞において同
時トランスフェクションおよび選択のための標準的方法
を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを選択可能
マーカーをコードしているもう１つの別個のポリペプチ
ドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしてもよ
い。この場合、一般的には、ポリヌクレオチドは宿主細
胞ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。

【０１１８】別法として、宿主中での増殖のための選択
可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結合
させてもよい。上記方法によりベクター構築物を宿主細
胞中に導入してもよい。一般的には、プラスミドベクタ
ーを、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるいは
荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入する。エレク
トロポレーションを用いてポリヌクレオチドを細胞中に
導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それ
をインビトロでパッケージングし、あるいはパッケージ
ング細胞中に導入することができ、パッケージングされ
たウイルスを細胞中にトランスダクションすることがで
きる。本発明によるポリヌクレオチドの製造および細胞
中へのポリヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は
当業者によく知られており、日常的なものである。かか
る方法は上記Sambrook et al.の文献にようやく記載さ
れたものであり、その文献はこれらの方法を詳述する多
くの研究室マニュアルの説明である。

【０１１９】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖もしくは２本鎖のフ
ァージベクター、１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡまたは
ＤＮＡウイルスベクターであってよい。細胞中へのＤＮ
ＡおよびＲＮＡ導入のためのよく知られた方法によっ
て、かかるベクターをポリヌクレオチドとして、好まし
くはＤＮＡとして細胞中に導入することができる。ファ
ージおよびウイルスベクターの場合、感染および形質導
入のためのよく知られた方法によって、好ましくは、パ
ッケージングされ、あるいはカプセル封入されたウイル
スとしてベクターを細胞中に導入する。ウイルスベクタ
ーは複製可能であってもよく、複製欠損であってもよ
い。後者の場合、一般的にはウイルス増殖は相補的宿主
細胞においてのみ起こるであろう。

【０１２０】特定の態様において、本発明ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの発現用ベクターが特に好まし
い。一般的には、かかるベクターは、発現されるべきポ
リヌクレオチドに作動可能に連結された宿主中での発現
に効果的なシス−作用性制御領域を含んでなる。適当な
トランス−作用性因子は宿主によっても提供され、ある
いは相補的ベクターによっても提供され、あるいは宿主
中への導入によりベクター自身により提供される。

【０１２１】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、あるいはある
種のタイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよ
く、あるいは誘導可能および細胞特異的の両方であって
もよい。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境
因子による発現に関して誘導されうるベクターが、特に
好ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核
細胞において使用される構成的発現ベクターおよび誘導
可能発現ベクターを包含する本発明のこの態様に適した
種々のベクターは当業者によく知られており、日常的に
使用されている。

【０１２２】遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な培地
で培養することができ、特にプロモーターの活性化、形
質転換体の選択または遺伝子の増幅に関して、適宜、培
地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主細胞に関
して以前使用されていた温度、ｐＨ等の培養条件は、一
般的には、当業者に明らかであるように、本発明ポリペ
プチドの発現に適するであろう。

【０１２３】非常に多種にわたる発現ベクターを用いて
本発明ポリペプチドを発現させることができる。かかる
ベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バ
クテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来
のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バ
クイロウイルスのごときウイルス、類人猿ウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のごときパポーバウイルス、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイル
ス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のも
の、ならびにコスミドおよびファージミドのごときプラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来
のベクターのごときそれらの組み合わせ由来のベクター
を包含し、それらすべてを本発明のこの態様による発現
に使用できる。この点において、一般的には、宿主細胞
中でのポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適し
たベクターを発現に用いることができる。

【０１２４】種々のよく知られた日常的方法のいずれに
よっても適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入すること
ができる。一般的には、発現させるＤＮＡ配列および発
現ベクターを１種またはそれ以上の制限酵素で開裂し、
次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限フラグメン
トを結合させることにより、発現させるＤＮＡ配列を発
現ベクターに結合させる。この目的に用いることのでき
る制限的開裂および連結の手順は当業者によく知られて
おり、日常的なものである。この点において、別法を用
いる発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者に
よく知られており、本明細書の他の場所で引用している
Sambrook et al.の文献に非常に詳細に説明されてい
る。

【０１２５】発現ベクター中のＤＮＡ配列を適当な発現
制御配列（例えば、ｍＲＮＡ転写を指令するプロモータ
ーを包含）に作動可能に連結する。かかるプロモーター
の典型例は、ファージラムダＰＬプロモーター、E.coli
lac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および
後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲｓのプ
ロモーターを包含するが、それらは当業者によく知られ
ているもののほんの例示に過ぎない。ここで述べなかっ
た多くのプロモーターも本発明のこの態様に適し、それ
らは当業者によく知られており、本明細書で説明され、
実施例に示されたようにして容易に使用されうることが
理解されるであろう。

【０１２６】一般的には、発現構築物は、転写される領
域に転写開始部位および終止部位を有し、さらに翻訳の
ためのリボソーム結合部位を含むであろう。構築物によ
り発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳さ
れるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧ
を、さらに終わりの部分に適当に位置している終止コド
ンを含むであろう。

【０１２７】さらに、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的には、多
くの通常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、
リプレッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写
調節により作動するものであろう。

【０１２８】一般的には、増殖および発現のためのベク
ターは選択可能マーカーを含むであろう。かかるマーカ
ーも増殖に適するものであってよく、あるいはベクター
がこの目的のためにさらなるマーカーを含んでいてもよ
い。この点において、好ましくは、発現ベクターは１個
またはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子を有しており
形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を
提供するものである。好ましいマーカーは、真核細胞用
のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、
E.coliおよび他の細菌用のテトラサイクリンまたはアン
ピシリン耐性遺伝子を包含する。

【０１２９】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、上記のような適当なＤＮＡ
配列ならびに適当なプロモーター、さらに他の適当な制
御配列を含むベクターを適当な宿主中に導入することが
できる。適当な宿主の典型例は、E.coli、Streptomyces
およびSalmonella typhimurium細胞のごとき細菌細胞；
酵母細胞のごとき真菌細胞；Drosophila S2およびSpodo
ptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びBowesメラノーマ細胞のごとき動物細胞；ならびに植
物細胞を包含する。多種の発現構築物用宿主がよく知ら
れており、当業者は本開示により本発明のこの態様にお
けるポリペプチドの発現のための宿主を容易に選択する
ことができよう。

【０１３０】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の上記配列を含んでなる。構築物は、本発明のかか
る配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベクター
のごときベクターを含む。配列を順方向または逆方向に
挿入することができる。この点において、特定の好まし
い具体例において、構築物はさらに、例えば該配列に作
動可能に連結されたプロモーターを包含する調節配列を
含んでなる。多数の適当なベクターおよびプロモーター
が当業者に知られており、本発明における使用に適した
多くのベクターが市販されている。

【０１３１】市販されている下記ベクターを例示する。
それらのうち、細菌での使用に適するのはｐＱＥ７０、
ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Qiagenから市販）；ｐＢ
Ｓベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ（Stratageneから市販）；ならびにｐｔｒｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５（Pharmaciaから市販）である。それら
のうち、好ましい真核細胞ベクターはｐＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（St
ratageneから市販）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmaciaから市販）であ
る。これらのベクターは多くの市販ベクターの例示のた
めにのみ挙げたのであり、それらは本発明のこの態様に
より使用するために当業者によく知られたものである。
例えば、宿主中における本発明ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適する他
のプラスミドまたはベクターを本発明のこの態様に使用
してもよいことが理解されよう。

【０１３２】制限部位または候補プロモーターフラグメ
ント（すなわち、プロモーターを含み得るフラグメン
ト）導入部位の下流のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのごとき、プ
ロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベ
クターを用いてプロモーター領域をいずれの所望遺伝子
からも選択できる。よく知られているように、プロモー
ター含有フラグメントのベクター中のｃａｔ遺伝子上流
の制限部位への導入はＣＡＴ活性の発生を引き起こし、
それを標準的ＣＡＴアッセイにより検出することができ
る。この目的に適するベクターはよく知られており、容
易に入手できる。２種のかかるベクターはｐＫＫ２３２
−８およびｐＣＭ７である。よって、本発明ポリヌクレ
オチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容易
に入手できるものを包含するだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。

【０１３３】E.coli lacIおよびlacZおよびT3およびT7
プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモ
ーターならびにtrpプロモーターは、本発明によるポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知細
菌プロモーターに属する。

【０１３４】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期
プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、
初期および後期ＳＶ４０プロモーター、例えばRousサル
コーマウイルス（ＲＳＶ）のごときレトロウイルスＬＴ
Ｒｓのプロモーター、ならびにマウス・メタロチオネイ
ン−Ｉプロモーターのごときメタロチオネインプロモー
ターは、この点において適する知られている真核細胞プ
ロモーターに含まれる。

【０１３５】宿主細胞中での発現に適するベクターおよ
びプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現
ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主
における発現に関する精妙な方法は当業者にとり日常的
なものである。

【０１３６】また本発明は、上記構築物を含む宿主細胞
に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細
胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核
細胞であってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごと
き原核細胞であってもよい。

【０１３７】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、トランスダクシ
ョン、感染または他の方法により宿主細胞中への構築物
の導入を行うことができる。かかる方法は多くの標準的
研究室マニュアル、例えばDavis et al.BASIC METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)に記載されている。

【０１３８】宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、
組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ること
ができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により
本発明ポリペプチドを合成的に得ることもできる。

【０１３９】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において蛋白を発現
させることができる。本発明ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡ
を用いる無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を得ることも
できる。原核宿主および真核宿主についての使用に適す
るクローニングおよび発現ベクターは上で引用したSamb
rook et al.により記載されている。

【０１４０】一般的には、組み換え発現ベクターは、複
製開始点、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子
由来のプロモーター、およびベクターに細胞を曝露した
後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マー
カーを含むであろう。特に、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクタ
ー、ホスファターゼ、および熱ショック蛋白をコードし
ている遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーター
である。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐
性遺伝子およびS.cerevisiaeのｔｒｐ１遺伝子を包含す
る。ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによ
り、本発明ポリペプチドをコードしているＤＮＡの高等
真核細胞による転写を増大させることができる。エンハ
ンサーはＤＮＡのシス−作用性エレメントであり、通常
には、約１０ないし３００ｂｐであり、特定の宿主細胞
タイプにおけるプロモーターの転写活性を増大するよう
に作用する。エンハンサーの例は、複製開始点の後期側
１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハンサ
ー、サイトメガロウイルス初期プロモーター、複製開始
点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、ならびにア
デノウイルスエンハンサーを包含する。

【０１４１】一般的には、本発明ポリペプチドの異種構
造配列をコードしている本発明ポリヌクレオチドを標準
的方法を用いてベクター中に挿入してそれが発現用プロ
モーターに作動可能に連結されるようにする。転写開始
部位がリボソーム結合部位の５’付近に位置するように
ポリヌクレオチドを置く。リボソーム結合部位は、発現
されるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’であ
る。一般的には、開始コドン（通常にはＡＵＧ）から始
まる他の読み枠は存在せず、他の読み枠はリボソーム結
合部位と開始ＡＵＧとの間には存在しないであろう。ま
た、一般的には、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが
存在し、転写される領域の３’末端に適当に分散して存
在するポリアデニレーションシグナルおよび転写終止シ
グナルが存在するであろう。

【０１４２】翻訳された蛋白の小胞体ルーメン中、ペリ
プラスム空間中または細胞外環境中への分泌のために、
適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド中に含ま
せることができる。シグナルはポリペプチドに対する内
在性のものであってもよく、あるいは異種シグナルであ
ってもよい。

【０１４３】ポリペプチドを、融合蛋白のごとき修飾形
態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみならず
さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。よって、例
えば、さらなるアミノ酸の領域、詳細には荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して宿主細胞中、
精製中またはさらなる取り扱いおよび保存中の安定性お
よび維持を改善してもよい。また、精製を容易にする領
域をポリペプチド付加してもよい。最終的なポリペプチ
ドの調製の前にかかる領域を除去することができる。特
に、分泌または外分泌を引き起こすための、安定性を改
善するための、そして精製を容易にするためのペプチド
部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知られてい
る日常的方法である。

【０１４４】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、Escher
ichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonella typh
imuriumを包含する。Pseudomonas、Streptomycesおよび
Staphylococcusの種々の種はこの点において適当な宿主
である。そのうえ、この点において当業者に知られてい
る他の多くの宿主も使用可能である。

【０１４５】典型的であるが限定的でない例として、細
菌用途の有用発現ベクターは、選択可能マーカーおよび
市販プラスミド（よく知られたクローニングベクターｐ
ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝学的エレメン
トを含んでなる）由来の細菌の複製開始点を含んでな
る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３
（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）および
ＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）を包含す
る。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現すべき構造配列と結合する。

【０１４６】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤への曝露）によりそれを誘導し、
適当時間細胞を培養する。

【０１４７】典型的には、次いで、細胞を遠心分離によ
り集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られ
た粗抽出物をさらなる精製に供する。

【０１４８】凍結−融解繰り返し、ソニケーション、機
械的破壊を包含する慣用的方法、あるいは当業者によく
知られた細胞溶解剤の使用により、蛋白発現に使用する
微生物細胞を破壊することができる。

【０１４９】同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現
に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluz
man et al.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓
線維芽細胞ＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合するベク
ターを発現させうる他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢ
ＨＫ細胞を包含する。

【０１５０】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプ
ライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、
および発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んで
なる。この点において、特定の好ましい具体例におい
て、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、および
ＳＶ４０ポリアデニレーション部位が、これらのタイプ
の所望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。

【０１５１】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、ＢＰＨ１ポリペプチドを組み換え細胞培
養物から回収し、精製することができる。単離または精
製中にポリペプチドが変性している場合には、蛋白の再
生のためのよく知られた方法を用いて活性コンホーメー
ションを再生することができる。

【０１５２】本発明ポリペプチドは、天然の精製産物、
化学合成法による産物、細菌、酵母、高等植物、昆虫お
よび哺乳動物細胞を包含する原核細胞または真核細胞か
ら組み換え法により得られた産物を包含する。組み換え
法に使用する宿主によっては、本発明ポリペプチドはグ
リコシレーションされていてもよく、されていなくても
よい。さらに、いくつかの場合、宿主によるプロセスの
結果として本発明ポリペプチドは最初の修飾されたメチ
オニン残基を含みうる。

【０１５３】本発明に従って、ＢＰＨ１ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細にはＢＰＨ
１の化学的および生物学的特性を用いる適用例に使用す
ることができる。さらなる適用例は、細胞、組織および
器官の疾病の診断および治療に関する。本発明のこれら
の態様を以下の議論によってさらに説明する。

【０１５４】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオ
チドの検出のためのＢＰＨ１ポリヌクレオチドの使用に
関する。機能不全に関連した変異形態のＢＰＨ１の検出
は、ＢＰＨ１の発現低下、発現過剰または変化した発現
から生じる疾病の診断またはかかる疾病に対する感受性
に関する診断を付加し、あるいは明確化しうる診断道具
を提供するであろう。ヒト・ＢＰＨ１遺伝子における変
異を有する個体を、種々の方法により、ＤＮＡレベルに
おいて検出することができる。診断のための核酸を、患
者の細胞、体液（例えば、血液、尿、唾液）、生検およ
び剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出
用に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲ（Sa
iki et al.,Nature,324:163-166(1986)）を用いること
により酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡ
を同じように使用してもよい。一例として、ＢＰＨ１を
コードしている核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用い
てＢＰＨ１の発現および変異を同定および分析すること
ができる。例えば、正常遺伝子型との比較における増幅
生成物のサイズの変化により、欠失および挿入を検出す
ることができる。増幅したＤＮＡを標識ＢＰＨ１ ＲＮ
Ａとハイブリダイゼーションさせることにより、あるい
は別法として放射性標識ＢＰＨ１アンチセンスＤＮＡ配
列とハイブリダイゼーションさせることにより点突然変
異を同定することができる。好ましくは、ＲＮａｓｅ
Ａ消化または融点温度の相違により、マッチした配列と
ミスマッチ２本鎖とを識別することができる。

【０１５５】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローンされたＤＮＡセグメントをプ
ローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出してもよ
い。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いることによ
り、かかる方法の感度をおおいに向上させることができ
る。例えば、配列決定プライマーを、２本鎖ＰＣＲ生成
物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分子とと
もに使用する。放射性標識を用いる慣用的手順により、
あるいは蛍光タグを用いる自動配列決定法により配列決
定を行う。

【０１５６】変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のＤ
ＮＡの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことがで
きる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠
失および挿入を可視化することができる。個々の融点ま
たは部分的に融解する温度によってＤＮＡフラグメント
がゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフ
ラグメントを識別することができる（例えば、Myers et
al.,Science,230:1242(1985)参照）。

【０１５７】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(198
5)）。

【０１５８】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うこと
ができる。

【０１５９】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析によって突然変異を検出
することができる。

【０１６０】本発明のさらなる態様によれば、前立腺疾
患、詳細にはＢＰＨの決定または前立腺疾患、詳細には
ＢＰＨに対する感受性の決定のための方法が提供され
る。よって、ＢＰＨ１における変異またはＢＰＨ１の発
現は前立腺疾患、詳細にはＢＰＨに対する感受性を示す
ものであり、かかる感受性を確認するためのアッセイに
上記核酸配列を用いることができる。よって、例えば、
該アッセイを用いて本明細書記載のヒト・ＢＰＨ１蛋白
の変異、例えば欠失、切断、挿入、フレームシフト等を
検出することができ、かかる変異は前立腺疾患、詳細に
はＢＰＨに対する感受性を示すものである。

【０１６１】例えば、ＤＮＡ配列決定アッセイを用いて
変異を確認することができる。血液試料および前立腺試
料（これらに限らない）を包含する組織試料をヒト患者
から得る。当該分野で知られた方法により試料を処理し
てＲＮＡを捕捉する。ｍＲＮＡに存在するポリアデノシ
ン伸長部分にハイブリダイゼーションするポリチミジン
残基からなるオリゴヌクレオチドプライマーを添加する
ことにより、第１鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から合成す
る。逆転写酵素およびデオキシリボヌクレオチドを添加
して第１鎖ｃＤＮＡを合成する。本発明ＤＮＡ修復蛋白
のＤＮＡ配列に基づいてプライマー配列を合成する。一
般的には、プライマー配列は少なくとも１５個の連続し
た塩基を含んでなり、少なくとも３０個またはちょうど
５０個の連続した塩基を含んでいてもよい。

【０１６２】本発明遺伝子における変異を有する個体
を、種々の方法によって、ＤＮＡレベルで検出すること
もできる。患者の細胞、体液（血液、尿、唾液を包含す
るが、これらに限らない）、生検および剖検材料から診
断用核酸を得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出用に
直接用いてもよく、あるいは分析前にＰＣＲ（Saiki et
al.,Nature,324:163-166(1986)）を用いることにより酵
素的に増幅してもよい。ＲＴ−ＰＣＲを用いて変異を検
出することもできる。ＲＴ−ＰＣＲを、自動検出システ
ム、例えば、GeneScanのごときシステムと組み合わせて
用いることが特に好ましい。一例として、ＢＰＨ１をコ
ードしている核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて
変異を同定し分析することができる。典型的なプライマ
ーの例を下表１に示す。例えば、正常遺伝子型との比較
における増幅生成物のサイズの変化により、欠失および
挿入を検出することができる。増幅したＤＮＡを放射性
標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせることによ
り、あるいは別法として放射性標識アンセンスＤＮＡと
ハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を
同定することができる。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消
化または融解温度の相違によりミスマッチした２本鎖と
完全にマッチした配列とを識別することができる。

【０１６３】 表１ ＢＰＨ１遺伝子における変異の検出に使用するプライマー ５’−ＧＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＡＴＡＡＡＧＣ−３’ （ＳＢ６１７６プライマー；配列番号：１３） ５’−ＧＧＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＡＡＣＴＴＴＧＣ−３’ （ＳＢ６１７５プライマーの逆相補物；配列番号：１４）

【０１６４】上記プライマーを、患者からの試料より単
離したＢＰＨ１ ｃＤＮＡの増幅に用いることができ
る。また本発明は、５’および／または３’末端から
１、２、３または４個のヌクレオチドが除去された表１
のプライマーを提供する。プライマーを用いて患者から
単離した遺伝子を増幅して、次いで、遺伝子を種々の方
法に供してＤＮＡ配列を調べることができる。このよう
にして、ＤＮＡ配列における変異を診断することができ
る。

【０１６５】もとの遺伝子と変異を有する遺伝子との間
の配列の相違を、ＤＮＡ配列決定法により明らかにする
ことができる。さらに、クローンされたＤＮＡセグメン
トをプローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出する
こともできる。ＰＣＲ法と組み合わせた場合にこの方法
の感度はおおいに上昇する。例えば、配列決定プライマ
ーを２本鎖ＰＣＲ生成物またはＰＣＲ変法により得られ
た１本鎖鋳型分子とともに用いる。放射性標識を用いる
慣用的手順または蛍光タグを用いる自動配列決定法によ
り配列決定を行う。

【０１６６】変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のＤ
ＮＡの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことがで
きる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠
失および挿入を可視化することができる。個々の融点ま
たは部分的に融解する温度によってＤＮＡフラグメント
がゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフ
ラグメントを識別することができる（例えば、Myers et
al.,Science,230:1242(1985)参照）。

【０１６７】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(198
5)）。

【０１６８】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出および配列
レベルの定量を行うことができる。本発明は、患者由来
の試料から、図３（配列番号：１）の配列を有するポリ
ヌクレオチドの低下した発現レベルを決定することを特
徴とする、疾患、詳細には前立腺疾患、最も詳細にはＢ
ＰＨの診断方法を提供する。ポリヌクレオチド定量につ
いて当該分野でよく知られた方法、例えば、ＰＣＲ、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティング
および他のハイブリダイゼーション法を用いて、低下し
たポリヌクレオチドの発現を測定することができる。

【０１６９】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析により変異を検出するこ
とができる。

【０１７０】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて正確な染色体位置を知ることができる。こ
れをいかにして行うのかという一例として、QIAEX II
ＤＮＡ精製キット（QIAGEN,Inc.,Chastworth,CA）を用
いてＢＰＨ１ ＤＮＡを消化し、精製し、SuperCosI コ
スミドベクター（STRATAGENE,LaJolla,CA）に連結す
る。Qiagen Plasmid Purification Kit（QIAGEN,Inc.,C
hastworth,CA）を用いてＤＮＡを精製し、BioNick Labe
ling Kit（GibcoBRL,Life Technologies Inc.,Gaithers
burg,MD）を用いてビオチン−ｄＡＴＰの存在下におけ
るニックトランスレーションにより１ｍｇを標識する。
GENE-TECT Detection System（CLONTECH Laboratories,
Inc.Palo Alto,CA）を用いてビオチン化を検出する／し
た。ONCOR Light Hybridization Kit（ONCOR,Gaithersb
urg,MD）を用いてin situハイブリダイゼーションをス
ライドガラス上で行って中期染色体上の単一コピー配列
を検出する。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよびペニシ
リン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４
０中で正常ドナーの末梢血を３日間培養し、１０−７Ｍ
メトトレキセートで１７時間同調させ、補足物不含ＲＰ
ＭＩで２回洗浄する。細胞を１０−３Ｍチミジンととも
に７日間インキュベーションする。コルセミド（０．５
ｍｇ／ｍｌ）共存下２０分のインキュベーション後、細
胞を中期に捕捉し、次いで、７５ｍＭＫＣｌ中３７℃で
１５分低張溶解を行う。次いで、細胞ペレットを遠心分
離し、Carnoyの固定液（３：１ メタノール／酢酸）中
で固定する。

【０１７１】１滴の懸濁液をスライドガラス上に滴下
し、風乾することにより中期スプレッドを調製する。ブ
ロックするヒト・胎盤ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し
た１０ｍｌのハイブリダイゼーションミックス（５０％
ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）中
に懸濁された１００ｎｇのプローブを添加することによ
りハイブリダイゼーションを行う。プローブミックスを
７０℃の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間イン
キュベーションし、次いで、前以て暖めておいた（３７
℃）スライドガラス上に置く。前以てプローブミックス
を７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０℃で変性さ
せ、エタノールシリーズ中で脱水し、４℃に冷却してお
く。

【０１７２】スライドガラスを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドガラスを５
０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄
し、次いで、３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロト
コールに従ってスライドガラスをＦＩＴＣ−アビジン
（ONCOR,Gaithersburg,MD）とともにインキュベーショ
ンすることによりハイブリダイゼーションプローブを検
出する。Leitz ORTHOPLAN 2エピ蛍光顕微鏡を用いてス
ライドガラスを可視化し、Imagenetics Computerおよび
MacIntoshプリンターを用いて５つのコンピューター映
像を得る。

【０１７３】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
たら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体上の配列の
物理的位置を修正することができる。かかるデータは、
例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man
（コンピューターによりオンラインで利用可能）に見い
だされる。次いで、連関分析（物理的に隣接した遺伝子
の同時遺伝）により、同じ染色体にマッピングされた遺
伝子と疾病との関連を確認する。

【０１７４】特記しない限り、Graham,F. and Van der
Eb,A.Virology,52:456-457(1973)の方法に記載されたよ
うにして形質転換を行った。

【０１７５】染色体アッセイ 本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々
のヒト・染色体上の特定位置に特別に標的化されてお
り、これとハイブリダイゼーションしうる。そのうえ、
染色体上の特定部位を同定する必要性が現在ある。実際
の配列データ（繰り返し多型性）に基づいて染色体をマ
ーキングする少数の試薬が染色体のマーキングに現在利
用できる。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピング
は、配列を疾病関連遺伝子と関連づけることにおいて重
要な最初の工程である。

【０１７６】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、本明細書開示のｃＤＮＡを用いてＢＰＨ１遺伝
子のゲノムＤＮＡをクローンする。種々のよく知られた
方法および一般的に市販されているライブラリーを用い
てこれを行うことができる。この目的のためによく知ら
れた方法を用いてゲノムＤＮＡをin situ染色体マッピ
ングに使用する。典型的には、染色体マッピングのため
の日常的手順に従う場合には、良好なin situハイブリ
ダイゼーションシグナルを生じるゲノムプローブを同定
するためにはいくつかの試行錯誤が必要であるかもしれ
ない。

【０１７７】いくつかの場合、さらに、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５ないし２５ｂｐ）を調
製することにより、配列を染色体にマッピングすること
ができる。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分
析を用いてゲノムＤＮＡ中の１つよりも多いエキソンに
またがらないプライマーを迅速に選択し、かくして、増
幅を複雑化する。次いで、これらのプライマーを、個々
のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲス
クリーニングに用いる。プライマーに対応したヒト遺伝
子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生
じるであろう。

【０１７８】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、個々のＤＮＡを個々の染色体に帰属するための迅速
な手順である。類似の方法で同じオリゴヌクレオチドプ
ライマーに関して本発明を用いて、特定の染色体由来の
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールに関して下位の位置決めを行うことができる。染色
体へのマッピングに同様に用いることのできる他のマッ
ピング法は、in situハイブリダイゼーション、標識フ
ロー−ストアド（flow-stored）染色体に関するプレス
クリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリー
を構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセ
レクションを包含する。

【０１７９】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて、正確な染色体位置を１工程で知ることが
できる。この方法を５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤ
ＮＡとともに用いることができる。この方法に関するレ
ビューについては、Verma et al.,HUMAN CHROMOSOME:A
MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York
(1988)参照。

【０１８０】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
たら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体上の配列の
物理的位置を修正することができる。かかるデータは、
例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man
（コンピューターによりオンラインで利用可能）に見い
だされる。次いで、連関分析（物理的に隣接した遺伝子
の同時遺伝）により、同じ染色体にマッピングされた遺
伝子と疾病との関連を確認する。

【０１８１】次に、疾病にかかっている個体および疾病
にかかっていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の
相違を決定することが必要である。疾病にかかっている
個体の一部または全部において変異が観察されるが正常
個体においては変異が観察されない場合には、その変異
は疾病の病因である可能性がある。

【０１８２】物理的マッピングおよび遺伝学的マッピン
グ法の現在の分離能によれば、疾病に関連した染色体領
域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは５０ないし５００
個の潜在的病因遺伝子につき１つでありうる（１メガベ
ースのマッピング分離能とし、２０ｋｂにつき１個の遺
伝子と仮定）。

【０１８３】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中のＢＰＨ１蛋白レベルの検
出のための定量および診断アッセイのごとき診断アッセ
イにも関し、正常および異常なレベルの決定を包含す
る。よって、例えば、正常対照組織試料と比較して本発
明ＢＰＨ１蛋白の過剰発現を検出するための本発明診断
アッセイを用いて、例えば腫瘍の存在を検出してもよ
い。宿主由来の試料中の本発明ＢＰＨ１蛋白のごとき蛋
白のレベルを決定するのに用いることのできるアッセイ
法は当業者によく知られている。かかるアッセイ法は、
ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタン
ブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。こ
れらのうち、ＥＬＩＳＡがしばしば好ましい。主にＥＬ
ＩＳＡアッセイは、ＢＰＨ１に対して特異的な抗体、好
ましくはモノクローナル抗体を調製することを特徴とす
る。さらに、一般的には、モノクローナル抗体に結合す
るレポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射
性試薬、蛍光試薬または酵素試薬検のごとき検出可能試
薬に結合しているが、この実施例ではセイヨウワサビ・
ペルオキシダーゼ酵素に結合している。

【０１８４】診断に有用なポリペプチドを、患者細胞お
よび体液（血液、尿、唾液を包含するが、これらに限ら
ない）、生検および剖検材料から得ることができる。Ｅ
ＬＩＳＡを行うために試料を宿主から取り、試料中の蛋
白を結合する固体支持体、例えば、ポリスチレンディッ
シュ上でインキュベーションする。次いで、ウシ・血清
アルブミンのごとき非特異的蛋白とともにインキュベー
ションすることによりディッシュ上の遊離の蛋白結合部
位を被覆する。次に、モノクローナル抗体をディッシュ
中でインキュベーションし、その間にモノクローナル抗
体は、ポリスチレンディッシュに結合しているＢＰＨ１
蛋白に結合する。未結合モノクローナル抗体をバッファ
ーで洗浄除去する。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ
に連結されたレポーター抗体をディッシュ中に置き、レ
ポーター抗体とＢＰＨ１に結合しているモノクローナル
抗体との結合を生じさせる。次いで、未結合レポーター
抗体を洗浄除去する。次いで、発色基質を包含するペル
オキシダーゼ活性のための試薬をディッシュに添加す
る。１次抗体および２次抗体によりＢＰＨ１に結合し、
固定化されているペルオキシダーゼは着色反応生成物を
生じる。一定時間の発色量は試料中のＢＰＨ１蛋白量を
示す。典型的には、標準曲線に対する参照により定量結
果を得る。

【０１８５】固体支持体に結合したＢＰＨ１特異的抗体
および標識ＢＰＨ１および宿主由来の試料が固体支持体
上に通され、固体支持体に結合した検出標識量と試料中
のＢＰＨ１量とが相関関係を有するものである競争アッ
セイを用いてもよい。

【０１８６】抗体 本発明ポリペプチドを用いてポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を製造してもよい。これらの抗体をいく
つかのタイプのイムノアッセイ（サンドイッチ、ＥＬＩ
ＳＡ等）に用いてＢＰＨ特異的抗体の上昇したレベルを
検出することができよう。宿主から得た試料中のＢＰＨ
特異的ポリペプチドレベルを検出するために用いられる
アッセイは当業者によく知られており、競争結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳ
Ａアッセイを包含する。ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、
ＢＰＨ特異的ポリペプチドに特異的な抗体、好ましくは
モノクローナル抗体を調製することを特徴とする。さら
に、モノクローナル抗体に対する受容体抗体を調製す
る。放射活性、蛍光、あるいは本願実施例においてはセ
イヨウワサビ・ペルオキシダーゼ酵素のごとき検出可能
試薬を受容体抗体に結合する。次いで、試料を宿主から
取り、試料中の蛋白を結合する固体支持体上、例えば、
ポリスチレンディッシュ上でインキュベーションする。
次いで、ＢＳＡのような非特異的蛋白とともにインキュ
ベーションすることによりディッシュ上の遊離蛋白結合
部位を被覆する。次に、モノクローナル抗体をディッシ
ュ中でインキュベーションし、その間にモノクローナル
抗体は、ポリスチレンディッシュに結合しているＢＰＨ
特異的ポリペプチドに結合する。すべての未結合抗体を
バッファーで洗浄する。セイヨウワサビ・ペルオキシダ
ーゼに結合したレポーター抗体をディッシュに添加し、
ＢＰＨ特異的ポリペプチドに結合したモノクローナル抗
体ヘのレポーター抗体の結合を生じさせる。次いで、未
結合レポーター抗体を洗浄する。次いで、ペルオキシダ
ーゼ基質をディッシュに添加し、標準曲線と比較した場
合、一定時間の発色量が一定体積の患者試料中に存在す
るＢＰＨ特異的ポリペプチド量となる。

【０１８７】競争アッセイを用いてもよく、競争アッセ
イにおいてはＢＰＨ特異的ポリペプチドに特異的な抗体
が固体支持体に結合され、標識ＢＰＨ特異的ポリペプチ
ドおよび宿主由来の試料が固体支持体上にに通され、固
体支持体に結合している検出された標識量が試料中のＢ
ＰＨ特異的ポリペプチド量と相関関係を有しうる。

【０１８８】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、またはそれらのアナログ、またはそれ
らを発現する細胞を免疫原として用いてそれらに対する
抗体を作ることができる。これらの抗体は、例えば、ポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。
また本発明は、キメラ、１本鎖およびヒト化抗体ならび
にＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリー
も生成物を包含する。当該分野で知られた種々の手順を
かかる抗体およびフラグメントの製造に用いてもよい。

【０１８９】ポリペプチドを動物中に直接注射すること
により、あるいはポリペプチドを動物、好ましくは非ヒ
ト動物に投与することにより、本発明配列に対応したポ
リペプチドに対して生成した抗体を得ることができる。
次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自
体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチド
のフラグメントのみをコードする配列を用いて無傷のポ
リペプチド全体に結合する抗体を得ることさえできる。
次いで、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する
組織からそのポリペプチドを単離することができる。

【０１９０】ポリペプチドを動物中に直接注射すること
により、あるいはポリペプチドを動物、好ましくは非ヒ
ト動物に投与することにより、本発明ポリペプチドに対
して生成した抗体を得ることができる。次いで、そのよ
うにして得られた抗体はポリペプチド自体に結合するで
あろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメント
のみをコードする配列を用いて無傷のポリペプチド全体
に結合する抗体を得ることさえできる。次いで、かかる
抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織からそのポ
リペプチドを単離することができる。

【０１９１】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を
用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler
andMilstein Nature 1975 256:495-497）、トリオーマ
法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.,Im
munology Today 1983 4:72）およびヒト・モノクローナ
ル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co
le et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.
Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を包含する。

【０１９２】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を
製造することができる。また、トランスジェニックマウ
スを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対
するヒト化抗体を発現させてもよい。

【０１９３】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を
用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler
andMilstein Nature 1975 256:495-497）、トリオーマ
法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.,Im
munology Today 1983 4:72）およびヒト・モノクローナ
ル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co
le et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.
Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を包含する。

【０１９４】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を
製造することができる。また、トランスジェニックマウ
スまたは他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を
発現させてもよい。

【０１９５】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフ
ィニティークロマトグラフィーによる単離および／また
は精製のための固体支持体への抗体の結合により本発明
ポリペプチドを精製してもよい。

【０１９６】よって、特に、ＢＰＨ１に対する抗体を用
いて前立腺疾患、詳細にはＢＰＨを抑制してもよい。

【０１９７】ＢＰＨ１結合分子およびアッセイ さらに本発明は、ＢＰＨ１に結合する受容体分子のごと
き分子の同定方法も提供する。当業者に知られた多くの
方法、例えば、パンニング（panning）およびＦＡＣＳ
ソーティングにより、受容体蛋白のごときＢＰＨ１に結
合する蛋白をコードしている遺伝子を同定することがで
きる。かかる方法は多くの研究室用マニュアル、例え
ば、Coligan et al.,Current Protocoles in Immunolog
y 1(2)：第５章（１９９１年）に記載されている。

【０１９８】例えば、発現クローニングをこの目的に用
いてもよい。この目的のために、ＢＰＨ１に応答する細
胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブ
ラリーをこのＲＮＡから作成し、ライブラリーをプール
に分割し、ＢＰＨ１に応答しない細胞中に各プールをト
ランスフェクションする。次いで、形質転換細胞を標識
ＢＰＨ１に曝露する（放射性ヨウ素化または部位特異的
プロテインキナーゼ認識部位を含めることといった標準
的方法を包含する種々のよく知られた方法によりＢＰＨ
１を標識することができる）。曝露後、細胞を固定し、
ＢＰＨ１の結合を測定する。便利には、これらの手順を
スライドガラス上で行う。

【０１９９】ＢＰＨ１結合細胞を生じるｃＤＮＡについ
てプールを同定する。これらの陽性物からサブ−プール
（sub-pool）を調製し、宿主細胞中にトランスフェクシ
ョンし、上記のごとくスクリーニングする。反復サブ−
プーリングおよび再スクリーニングプロセスを用いて、
推定上受容体分子のごとき結合分子をコードしている１
種またはそれ以上のクローンを単離することができる。

【０２００】別法として、受容体分子のごとき結合分子
を発現する細胞から調製された膜または膜抽出物のごと
き細胞抽出物に標識リガンドを光アフィニティー結合さ
せることもできる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により架橋材料を分離し、Ｘ線フィルムに
曝露する。リガンド−受容体を含む標識複合体を切断
し、ペプチドフラグメントにまで分解し、蛋白微小配列
決定に供することができる。微小配列決定から得られた
アミノ酸配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングして受容体分子をコードしている遺伝子を同定
するためのユニークまたは縮重したオリゴヌクレオチド
プローブを設計することができる。

【０２０１】本発明ポリペプチドを用いて、細胞中また
は無細胞調製物中において、受容体分子のごときＢＰＨ
１結合分子の結合能を評価することもできる。

【０２０２】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 また本発明は、受容体分子のごときＢＰＨ１結合分子と
の相互作用のような、細胞に対するＢＰＨ１ポリペプチ
ドの作用を促進またはブロックする化合物をスクリーニ
ング法を提供する。アゴニストは、ＢＰＨ１の本来の生
物学的機能を増大させる化合物であるか、またはＢＰＨ
１と同様の様式で機能する化合物であるが、アンタゴニ
ストはかかる機能を低下または除去する。

【０２０３】例えば、膜標品のごとき膜またはその調製
物のような細胞コンパートメントを、ＢＰＨ１により転
調されたシグナリングもしくは調節経路に関する分子で
あってＢＰＨ１に結合する分子を発現する細胞から調製
してもよい。ＢＰＨ１アゴニストまたはアンタゴニスト
候補分子の存在下または不存在下において調製物を標識
ＢＰＨ１とともにインキュベーションする。結合分子に
結合する候補分子の能力は、標識リガンドの結合低下に
反映される。不必要に、すなわちＢＰＨ１結合分子への
結合に対するＢＰＨ１の効果を誘導せずに結合する分子
は、良好なアンタゴニストである可能性が最も高い。よ
く結合し、ＢＰＨ１と同じ効果またはＢＰＨ１に密接に
関連した効果を誘導する分子はアゴニストである。

【０２０４】例えば、候補分子と細胞または適当な細胞
調製物との相互作用後に第２の伝達系の活性を測定し、
ＢＰＨ１およびＢＰＨ１と同じ効果を誘導する分子の効
果と比較することにより、潜在的にアゴニストおよびア
ンタゴニストである物質のＢＰＨ１様効果を測定するこ
とができる。この点において有用でありうる第２の伝達
系は、ＡＭＰグアニレートシクラーゼ、イオンチャンネ
ルまたはホスホイノシチド加水分解第２伝達系を包含す
るが、これらに限らない。

【０２０５】ＢＰＨ１アンタゴニストを探すアッセイの
もう１つの例は、競争的阻害アッセイに適した条件下で
ＢＰＨ１と潜在的アゴニストを膜結合ＢＰＨ１受容体分
子または組み換えＢＰＨ１受容体分子と結合させる競争
アッセイである。受容体分子に結合しているＢＰＨ１分
子数を正確に決定して潜在的アンタゴニストに有効性を
評価できるように、例えば放射活性によりＢＰＨ１を標
識することができる。

【０２０６】潜在的アンタゴニストは、本発明ポリペプ
チドに結合し、そのことによりその活性を消失させる小
型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含
する。また潜在的アンタゴニストは、小型有機分子、ペ
プチド、密接に関連した蛋白のごときポリペプチド、ま
たは受容体分子のごとき結合分子と同じ部位に結合し、
そのことによりＢＰＨ１を結合から排除してＢＰＨ１の
作用を防止する抗体であってもよい。

【０２０７】潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合し、これを占領し、そのことにより受容
体分子のごとき細胞性結合分子の結合を防止して正常な
生物学的活性を妨げる小型分子を包含する。小型分子の
例は、小型有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子を
包含するが、これらに限らない。

【０２０８】他の潜在的アンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する。アンチセンス法を用いて、アンチセン
スＤＮＡまたはＲＮＡにより、あるいは３重ヘリックス
形成により遺伝子発現を制御することができる。アンチ
センス法は、例えば、Okano,J.Neurochem.56:560(199
1)；OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GE
NE EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)におい
て議論されている。３重ヘリックス形成は、例えば、Le
e et al.,Nucleic Acids Research 6:3073(1979)；Coon
ey et al., Science 241:456(1988)；およびDervan et
al.,Science 251:1360(1991)において議論されている。
該方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオ
チドの結合に基づく。例えば、本発明ポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドの５’コーディング部分
を用いて、長さ約１０ないし４０塩基対のアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計してもよい。転写に関
与する遺伝子の領域に相補的であるようにＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドを設計し、そのことによりＢＰＨ１の転写
および生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡにハイブリダイ
ゼーションし、ｍＲＮＡ分子のＰＢＨ１ポリペプチドへ
の翻訳をブロックする。上記オリゴヌクレオチドを細胞
に送達して、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビ
ボにおいて発現されてＢＰＨ１の生成を阻害するように
することもできる。

【０２０９】アンタゴニストを、例えば下記のような医
薬上許容される担体を伴った組成物中に用いてもよい。

【０２１０】アンタゴニストを用いて、例えば、前立腺
疾患、詳細にはＢＰＨを抑制してもよい。

【０２１１】アンタゴニストを、例えば下記のような医
薬上許容される担体を伴った組成物中に用いてもよい。

【０２１２】組成物 また本発明は、上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを含んで
なる組成物に関する。よって、細胞、組織または生物に
ついて使用される未滅菌または滅菌担体、例えば、対象
への投与に適した医薬担体と組み合わせて本発明ポリペ
プチドを用いてもよい。かかる組成物は、例えば、媒
体、添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチドお
よび医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。
かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキス
トロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれら
の混合物を包含するが、これらに限らない。処方は投与
モードに適合すべきである。

【０２１３】キット さらに本発明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以
上の成分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んで
なる医薬パックおよびキットに関する。かかる容器につ
いては、医薬または生物学的製品の製造、使用または販
売を規制している政府当局により指示された形態であ
り、ヒトへの投与のための製品の製造、使用または販売
に対する当局による認可を反映したものである。

【０２１４】本明細書記載のアッセイまたは方法の試薬
も診断キットの成分として含まれてもよい。例えば、１
の具体例において、キットは、ＢＰＨ特異的ＲＮＡまた
はＤＮＡを検出しうるプローブを含んでなるものであっ
てもよい。もう１つの具体例において、キットは、ＢＰ
Ｈ特異的ポリペプチドを標的とする抗体を含んでなるも
のであってもよい。

【０２１５】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。

【０２１６】効果的で便利な方法、例えば、特に、局
所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医
薬組成物を投与してよい。

【０２１７】一般的には、医薬組成物を、個々の徴候ま
たは徴候（複数）の治療または予防の有効な量で投与す
る。一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量
で組成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８ｍ
ｇ／ｋｇ体重をこえない量で組成物が投与されるであろ
う。好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約１
０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。症
状、その重さ、投与経路、合併症等を考慮して、各治療
様式についての標準的方法および症状により最適用量が
決定されることが理解されよう。

【０２１８】遺伝子治療 インビボにおいて、すなわちしばしば「遺伝子治療」と
呼ばれる治療様式においてポリペプチドを発現させるこ
とにより、ＢＰＨ１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、
ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストを
本発明に従って使用することができる。

【０２１９】よって、例えば、ポリペプチドをコードし
ているＤＮＡまたはＲＮＡのごときポリヌクレオチドで
患者からの細胞をエクスビボで処理し、次いで、ポリペ
プチドで治療すべき患者に処理細胞を与えてもよい。例
えば、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含
むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により細胞
をエクスビボで処理してもよい。かかる方法は当該分野
においてよく知られており、本発明におけるそれらの使
用は本明細書の教示から明らかである。

【０２２０】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のようにレプ
リコン欠損レトロウイルスベクター中での発現のために
本発明ポリヌクレオチドを処理してもよい。次いで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞
中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染
性ウイルス粒子を産生するようにすることができる。イ
ンビボでの細胞の処理およびインビボでのポリペプチド
の発現のためにこれらのプロデューサー細胞を患者に投
与することができる。かかる方法により本発明ポリペプ
チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、
本発明の教示から当業者に明らかなはずである。

【０２２１】本明細書において上で述べたレトロウイル
スプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モ
ロニーマウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラ
ウスサルコーマウイルス、ハーベイサルコーマウイル
ス、トリ・白血病ウイルス、ギボンサル・白血病ウイル
ス、ヒト・免疫不全ウイルスのごときレトロウイルス、
アデノウイルス、ミエロプロリファレイティブサルコー
マウイルス（Myeloproliferative Sarcomavirus）、お
よび哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限ら
ない。１の具体例において、レトロウイルスプラスミド
ベクターはモロニーマウス・白血病ウイルス由来のもの
である。

【０２２２】かかるベクターは、本発明ポリペプチド発
現のための１個またはそれ以上のプロモーターを含むで
あろう。使用できる適当なプロモーターは、レトロウイ
ルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMiller et
al.,Biotechniques 7:980-990(1989)に記載されたＣＭ
Ｖプロモーター、または他のいずれかのプロモーター
（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およ
びβ−アクチンプロモーター（これらに限らない）を包
含する真核細胞プロモーターのごとき細胞プロモータ
ー）を包含するが、これらに限らない。使用できる他の
ウイルスのプロモーターは、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これら
に限らない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に
含まれる教示から当業者に明らかであろう。

【０２２３】本発明ポリペプチドをコードしている核酸
配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
大後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはＣＭＶプロモーターのごとき異種プロモータ
ー；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのご
とき誘導可能プロモーター；熱ショックプロモーター；
アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒ
ト・グロビンプロモーター；単純ヘルペスウイルスのチ
ミジンキナーゼプロモーターのごときウイルスのチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスのＬＴＲｓ
（本明細書で上で述べた修飾レトロウイルスＬＴＲｓを
包含）；β−アクチンプロモーター；およびヒト・成長
ホルモンプロモーターを包含するが、これらに限らな
い。プロモーターは、本発明ポリペプチドをコードして
いる遺伝子を制御する無傷のプロモーターであってもよ
い。

【０２２４】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッキング細胞系に形質導入してプロデューサー細胞
系を得る。トランスフェクションされうるパッキング細
胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−Ａ
Ｍ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ
２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.,Human Gene Therapy
1:5-14(1990)に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、
これらに限らない。当該分野で知られたいずれかの手段
によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入して
もよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポ
ソームの使用、ＣａＰＯ４沈殿を包含するが、これらに
限らない。１の別法において、レトロウイルスベクター
をリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合させ、次
いで、宿主に投与してもよい。

【０２２５】プロデューサー細胞系は感染性レトロウイ
ルスベクター粒子を生じるであろうし、該粒子はポリペ
プチドをコードしている核酸配列を含んでいる。次い
で、かかるレトロウイルスベクター粒子を用いて、イン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて真核細胞に形
質導入してもよい。形質導入された真核細胞はポリペプ
チドをコードしている核酸配列を発現するであろう。形
質導入されうる真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ
細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細
胞を包含するが、これらに限らない。

【０２２６】

【実施例】下記実施例により本発明をさらに説明する。
実施例は、個々の具体例を参照することにより、本発明
の説明のためだけに提供される。これらの例示は、本発
明の特定の態様を説明するが、開示された発明の範囲を
何ら限定するものでない。本明細書に用いる特定の用語
はすでに上で説明してある。特記しない限り、すべての
実施例は、当業者によく知られた日常的な標準的方法を
用いて行われたものである。上で引用したSambrookらの
標準的な研究室用マニュアルに記載されているようにし
て下記実施例の日常的な分子生物学の方法を行うことが
できる。特記しないかぎり、下記実施例に示すすべての
部または量は重量によるものである。特記しないかぎ
り、Sambrookおよび多くの他の文献、例えば、Goeddel
et al.,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)による文献に
記載のアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＰＡＧＥ）の標準的方法を用いて下記実施例におけ
るフラグメントのサイズによる分離を行った。特記しな
い限り、標準的バッファー、インキュベーション温度お
よび時間、ほぼ等モル量の連結すべきＤＮＡフラグメン
ト、ならびに０．５μｇのＤＮＡにつき約１０ユニット
のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて連結
反応を行った。

【０２２７】実施例１：ＢＰＨ ｃＤＮＡの単離 正常ヒト・前立腺由来のポリＡ＋ＲＮＡをClontech（Pa
lo Alto,CA）から得た。ＢＰＨの前立腺組織をIIAM（In
ternational Institute for the Advancemantof Medici
ne−ドナーＲＡ９４−１２−２７９）から得た。

【０２２８】Invitrogen（San Diego,CA）により提供さ
れた試薬を用いて、標準的プロトコールに従ってｃＤＮ
Ａのフォトビオチンサブトラクションを行った。サブト
ラクションの間、正常前立腺ポリＡ＋ ＲＮＡを過剰
（ドライバー）に保ってＢＰＨｃＤＮＡ（ドライブされ
るほう）を差し引いた。ｃＤＮＡの５’末端にポリＣを
付加後、差し引かれた材料を、プライマー（5’RACE An
chor Primer(Gibco-BRL)）：５’（ＣＵＡ）₄−ＧＧＣ
−ＣＡＣ−ＧＣＧ−ＴＣＧ−ＡＣＴ−ＡＧＴ−ＡＣＧ−
ＧＧＩ−ＩＧＧ−ＧＩＩ−ＧＧＧ−ＩＩＧ−３’（注
Ｉ＝イノシトール）、オリゴｄＴ（ＣＡＵ）₄（独自に
調製）を用いて増幅した。増幅生成物をｐＡＭＰ１ベク
ター（Gibco-BRL）中にクローンした。正常およびＢＰ
Ｈ組織由来の標識ｃＤＮＡ（両方の鎖）を用いてこのラ
イブラリーの複製フィルターをスクリーニングした。Ｂ
ＰＨにおいてアップレギュレーションされることがわか
った１のクローンを得た。

【０２２９】BIOS Polychromosomal Somatic Cell Hybr
idization Panel中のＳＢ６１７５およびＳＢ６１７６
プライマー（ＳＢ６１７５：５’ＧＣＡ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｔ−ＧＴＣ−ＡＣＴ−ＣＣＣ−ＡＡＴ−ＣＣ−３’／Ｓ
Ｂ６１７６：５’ＧＡＧ−ＡＧＡ−ＴＧＡ−ＣＡＧ−Ｇ
ＧＡ−ＴＡＡ−ＡＧＣ−３’）を用いて遺伝子をＸ染色
体にマッピングした。Ｘ染色体に対する不一致値は０で
あり、染色体８に対して５％、染色体６および４に対し
て１０％であった。BIOSからのMonochromosomal Panel
によりＸ染色体への局在化が確認された。

【０２３０】実施例２：疾病組織中のＢＰＨ ｍＲＮＡ
の検出 小腸、肺、肝臓、乳腺、リンパ節、前立腺、およびＢＰ
Ｈからの各ポリＡ＋ＲＮＡ２μｇを用いてノーザンブロ
ットを調製した。標準的手順（Sambrook,Fritsch,and M
aniatis;Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）
に従って複数の組織のポリＡ＋ＲＮＡを変性ホルムアル
デヒドアガロースゲル（１．５％）中で電気泳動した。
ランダムヘキサヌクレオチドプライミングにより、すべ
てのプローブを３２Ｐ取り込みにより標識した。クロー
ン特異的プローブは、クローンされたＤＮＡを鋳型とし
て用いてプライマーペアーＳＢ６１７５／ＳＢ６１７６
により得られたアンプリコンであった。ＢＰＨ、前立
腺、肺、肝臓および小腸において２８５−３０５ｂｐの
バンドが観察された。

【０２３１】実施例３：ヒト・ＢＰＨ１の遺伝子治療発
現 皮膚生検により線維芽細胞を対象から得る。得られた組
織を組織培養培地中に置き、小片に分離する。小さな組
織塊を組織培養フラスコの濡れた表面に置き、各フラス
コに１０片を置く。フラスコの蓋をかたく閉めてフラス
コを転置し、室温で一晩置く。室温で２４時間後、フラ
スコを転置すると組織塊はフラスコの底に固定されたま
まであり、新鮮培地を添加する（例えば、１０％ ＦＢ
Ｓ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するHa
m’s F12培地）。次いで、組織を適当には１週間３７℃
でインキュベーションする。次いで、新鮮培地を添加
し、引き続き数日おきに培地を交換する。さらに２週間
培養後、線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン
処理し、大きなフラスコに移す。

【０２３２】発現すべきフラグメントをクローンするた
めに制限酵素を用いて遺伝子治療用ベクターを設計す
る。消化されたベクターを子ウシ・小腸ホスファターゼ
で処理して自己連結を防止する。デホスホリレーション
された直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、精
製する。

【０２３３】ＢＰＨ１ ｃＤＮＡ、または本発明の活性
ポリペプチドを発現しうるそのいずれかの部分を単離す
る。必要ならば、ベクター中へのクロニングのためにフ
ラグメントの末端を修飾する。例えば、５’オーバーハ
ング末端をＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作
成してもよい。３’オーバーハング末端をＳ１ヌクレア
ーゼを用いて除去してもよい。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いてリンカーを平滑末端に連結してもよい。連結反応
混合物を用いてE.coliを形質転換し、次いで、そのE.co
liをカナマイシン含有寒天上にプレーティングする。カ
ナマイシン表現型および制限分析により、ベクターが正
しく挿入された遺伝子を有することが確認される。

【０２３４】１０％ウシ・血清（ＣＳ）、ペニシリンお
よびストレプトマイシンを含有するDulbecco’s Modifi
ed Eagles Medium（ＤＭＥＭ）中でパッケージング細胞
を組織培養において増殖させて集密とする。標準的方法
によりＢＰＨ１遺伝子を含有するベクターをパッケージ
ング細胞中に導入する。ＢＰＨ１遺伝子を含んでいる感
染性ウイルス粒子をパッケージング細胞（今度はプロデ
ューサー細胞という）から集める。

【０２３５】新鮮培地をプロデューサー細胞に添加し、
適当なインキュベーション時間後、集密プロデューサー
細胞のプレートから培地を集める。感染性ウイルス粒子
を含んでいる培地をMilliporeフィルイターで濾過して
浮遊プロデューサー細胞を除去する。次いで、濾過した
培地を用いて線維芽細胞に感染させる。線維芽細胞の亜
集密（sub-confluent）プレートから培地を除去し、濾
過した培地にすばやく置き換える。Polybrene（Aldric
h）を培地に含ませて形質導入を容易にする。適当なイ
ンキュベーション後、培地を除去し、新鮮培地に置き換
える。ウイルス力価が高い場合には、実質的にすべての
線維芽細胞が感染しており、選択は不要であろう。力価
が低い場合には、neoまたはhisのごとき選択可能マーカ
ーを有するレトロウイルスベクターを用いてエクスパン
ジョン用の形質導入された細胞を選択する必要がある。

【０２３６】次いで、処理された線維芽細胞を、そのま
ま、あるいはサイトデックス３ビーズのごとき微小担体
ビーズ上で集密となるまで増殖した後、ラットに注射す
ることができる。注射された線維芽細胞はＢＰＨ１を産
生し、その蛋白の生物学的作用は宿主にまで伝達されて
いる。

【０２３７】上記説明および実施例で詳細に説明した以
外のやり方で本発明を実施してもよいことは明らかであ
ろう。

【０２３８】上記教示から本発明の多くの修飾および変
更が可能であり、それらは添付した請求の範囲に含まれ
る。

【０２３９】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> SmithKline Beecham Corporation <120> （１）一般的情報 （ｉ）出願人：Rood,Julie （ｉｉ）発明の名称：良性前立腺肥大と関連するポリヌ
クレオチドおよびポリペプチド （ｉｉｉ）配列の数：１４ （ｉｖ）連絡先： （POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH
BENIGN PROSTATICHYPERTROPHY <130> P50487-1 <140> <141> <150> 60/018617 ＜１５１＞ １９９６−５−２１ ＜１６０＞ １４ ＜１７０＞ ＦａｓｔＳＥＱ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ
（登録商標） Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ３５６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ＜４００＞ １ ｇｇｇｔｇａｃａａｇ ｇａｇａｇａｔｇａｃ ａｇｇｇａｔａａａｇ ｃａ
ｇａａｇａｃｃａ ａｇａａｇａｇｔｔｔ ａｔｔｇｃｃｃａａａ ６０ ｇａａａａａｔｇｔａ ｇａｔｔｔｃａｃｔｔ ａａａｇａｃｇｃｃａ ｃｔ
ｔａａａａｇｔｔ ｃａｃｃａｃｔｔａａ ａｔｃｇｇａｔｇｇａ １２０ ｔｔｔｔｔｔｔｃａｔ ｇａｔｇｔａａａａａ ｃａｇｔｔｔａｔａａ ｔｔ
ａａｔａｔｔａｔ ｇｃｃｔｃｃｃｔｃｇ ａｇｃａａｃｔａａａ １８０ ｃｃｃｃｔｔｃａａｔ ｔｔａａａｇｃｔｔｃ ａａａｃｔｔａａｃｔ ｔｃ
ａａａｔｔｔｇａ ｃｔａａｔａｔａａｇ ｃａａａｇｔｇｔｔｃ ２４０ ｔｇｃｃｃｔｔｔｔｔ ａｔｔｃｃｃｇｔｇｃ ｔｇｇｇａｔｔｇｇｇ ａｇ
ｔｇａｃａａａｃ ｔｔｔｇｃｔｔｇａａ ｇａｔｇａｇｃｇｃａ ３００ ｇａｃａｃｃｔｇｇａ ｇａａａｔｇｃｇａｇ ａｇａａｃａｃｃｃｔ ａｇ
ａａａｔｇａｃｔ ｃｃａｃａｃｃａａｔ ｃｃｃｇａａ ３５６ ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ３５６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ＜４００＞ ２ ｔｔｃｇｇｇａｔｔｇ ｇｔｇｔｇｇａｇｔｃ ａｔｔｔｃｔａｇｇｇ ｔｇ
ｔｔｃｔｃｔｃｇ ｃａｔｔｔｃｔｃｃａ ｇｇｔｇｔｃｔｇｃｇ ６０ ｃｔｃａｔｃｔｔｃａ ａｇｃａａａｇｔｔｔ ｇｔｃａｃｔｃｃｃａ ａｔ
ｃｃｃａｇｃａｃ ｇｇｇａａｔａａａａ ａｇｇｇｃａｇａａｃ １２０ ａｃｔｔｔｇｃｔｔａ ｔａｔｔａｇｔｃａａ ａｔｔｔｇａａｇｔｔ ａａ
ｇｔｔｔｇａａｇ ｃｔｔｔａａａｔｔｇ ａａｇｇｇｇｔｔｔａ １８０ ｇｔｔｇｃｔｃｇａｇ ｇｇａｇｇｃａｔａａ ｔａｔｔａａｔｔａｔ ａａ
ａｃｔｇｔｔｔｔ ｔａｃａｔｃａｔｇａ ａａａａａａｔｃｃａ ２４０ tccgatttaa gtggtgaact tttaagtggc gtctttaagt gaaatctaca tttttctttg 300 ggcaataaac tcttcttggt cttctgcttt atccctgtca tctctccttg tcaccc 356 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> <400> 3 Val Thr Arg Arg Asp Asp Arg Asp Lys Ala Glu Asp Gln Glu Glu Phe 1 5 10 15 Ile Ala Gln Arg Lys Met 20 <210> 4 <211> 48 <212> PRT <213> <400> 4 Phe Gly Ile Gly Cys Gly Val Ile Ser Arg Val Phe Ser Arg Ile Ser 1 5 10 15 Pro Gly Val Cys Ala His Leu Gln Ala Lys Phe Val Thr Pro Asn Pro 20 25 30 Ser Thr Ala Ile Lys Arg Ala Glu His Phe Ala Tyr Ile Ser Gln Ile 35 40 45 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> <400> 5 Met Thr Gly Ile Lys Gln Lys Thr Lys Lys Ser Leu Leu Pro Lys Glu 1 5 10 15 Lys Cys Arg Phe His Leu Lys Thr Pro Leu Lys Ser Ser Pro Leu Lys 20 25 30 Ser Asp Gly Phe Phe Ser 35 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> <400> 6 Met Asp Phe Phe His Asp Val Lys Thr Val Tyr Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> <400> 7 Met Lys Lys Ile His Pro Ile 1 5 Arg Asp Trp Val Trp Ser His Phe 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> <400> 9 Met Pro Pro Ser Ser Asn 1 5 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> <400> 10 Met Ser Ala Asp Thr Trp Arg Asn Ala Arg Glu His Pro Arg Asn Asp 1 5 10 15 Ser Thr Pro Asn Pro Glu 20 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> <400> 11 Met Arg Glu Asn Thr Leu Glu Met Thr Pro His Pro Ile Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 35 <212> PRT <213> <400> 12 Ser Gly Leu Gly Val Glu Ser Phe Leu Gly Cys Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 Gln Val Ser Ala Leu Ile Phe Lys Gln Ser Leu Ser Leu Pro Ile Pro 20 25 30 Ala Arg Gln 35 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> <400> 13 GAGAGATGAC AGGGATAAAG C 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> <400> 14 GGATTGGGAG TGACAAACTT TGC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は本発明ＢＰＨ１ポリヌクレオチドの
３’から５’へのヌクレオチド配列（配列番号：２）を
示す。

【図２】 図２は５’から３’へのヌクレオチド配列お
よびコードされると推定されるポリペプチド（配列番
号：３から１２まで）を並置したものである。

【図３】 本発明ＢＰＨ１ポリヌクレオチドの５’から
３’へのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/566 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：３から１２までのアミ
   ノ酸を含んでなるポリペプチドをコードしているポリヌ
   クレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有する
   ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリ
   ヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
   とも１５個の塩基を含んでなるポリヌクレオチドからな
   る群より選択されるメンバーを含んでなる単離ポリヌク
   レオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示す１から３５７までの
   ヌクレオチドを含んでなる請求項２のポリヌクレオチ
   ド。
5. 【請求項５】 配列番号：１に示す読み枠のヌクレオチ
   ドを含んでなる請求項２のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号：３から１２までに示すアミノ
   酸配列を含んでなるポリペプチドをコードしている請求
   項２のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 （ａ）配列番号：１に示すヒト・ＤＮＡ
   により発現されるのと同じポリペプチドをコードしてい
   るポリヌクレオチドに対して少なくとも８５％の同一性
   を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリ
   ヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
   とも１５個の塩基を含んでなるポリヌクレオチドからな
   る群より選択されるメンバーを含んでなる単離ポリヌク
   レオチド。
8. 【請求項８】 請求項２のＤＮＡを含んでなるベクタ
   ー。
9. 【請求項９】 請求項８のベクターを含む宿主細胞。
10. 【請求項１０】 上記ＤＮＡによりコードされるポリペ
    プチドを請求項９の宿主細胞から発現させることを特徴
    とするポリペプチドの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項８のベクターで細胞を形質転換
    または細胞に形質導入して、ベクター中に含まれるヒト
    ・ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを細胞が発
    現するようにすることを特徴とする、ポリペプチドを発
    現する細胞の製造方法。
12. 【請求項１２】 配列番号：３から１２までのアミノ酸
    に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含
    んでなるポリペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号：３から１５までに示すアミ
    ノ酸配列を含んでなるポリペプチド。
14. 【請求項１４】 治療上有効量の請求項１２のポリペプ
    チドを患者に投与することを特徴とする、ＢＰＨ１を必
    要とする患者の治療方法。
15. 【請求項１５】 ポリペプチドをコードしておりポリペ
    プチドをインビボで発現するＤＮＡを患者に提供するこ
    とにより治療上有効量のポリペプチドが投与される請求
    項１４の方法。
16. 【請求項１６】 治療上有効量の、請求項１２のポリペ
    プチドに対するアンタゴニストを患者に投与することを
    特徴とする、ＢＰＨ１ポリペプチドの阻害を必要とする
    患者の治療方法。
17. 【請求項１７】 ポリペプチドをコードしている核酸配
    列中の変異を決定することを特徴とする、請求項１２の
    ポリペプチドの発現に関連した疾病または該疾病に対す
    る感受性の診断方法。
18. 【請求項１８】 宿主由来の試料中の請求項１２のポリ
    ペプチドの存在について分析を行うことを特徴とする診
    断方法。
19. 【請求項１９】 受容体への化合物の結合に応答して検
    出可能シグナルを発することのできる第２の成分に結合
    したポリペプチドに対する受容体を細胞表面に発現する
    細胞を、受容体への結合を可能にする条件下でスクリー
    ニングすべき化合物と接触させ；次いで化合物と受容体
    との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在
    を検出することにより、化合物が受容体に結合するかど
    うか、そして受容体を活性化または阻害するかどうかを
    決定することを特徴とする、請求項１２のポリペプチド
    に対する受容体に結合し、これを活性化または阻害する
    化合物の同定方法。
20. 【請求項２０】 少なくとも配列番号：１の一部を含ん
    でなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
    ド。
21. 【請求項２１】 請求項１２のポリペプチドを標的とす
    る抗体。
22. 【請求項２２】 （ａ）ＢＰＨ１特異的ポリヌクレオチ
    ド配列を検出するためのプローブを調製し； （ｂ）患者からＤＮＡ試料を得て； （ｃ）プローブがＤＮＡ試料中のいずれかのＢＰＨ１特
    異的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションできる
    条件下でＤＮＡ試料をプローブと接触させ；次いで （ｄ）ＤＮＡ試料へのプローブのハイブリダイゼーショ
    ンを決定することを特徴とする、患者における良性前立
    腺肥大の診断方法。