JPH10201487A - 哺乳動物のｆｉｎ−１核酸および蛋白質配列およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗ウイルス剤、抗腫瘍剤としての目的のた
め、胚成長および組織恒常性を調節するための、アポト
シスを誘発するのに有用なファクターの望まれている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ
酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
オチド；（ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と
同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）
（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補性
のポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも連続した１５
塩基からなるポリヌクレオチドからなる群より選択され
るメンバーからなる単離ポリヌクレオチドを提供するも
のである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
−１β変換酵素のファミリー（以下、ＩＣＥと称する）
の新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関し、ま
たタンパク質の致死エフェクター・ドメイン・ファミリ
ーにも関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】プロ
グラムされた細胞死（アポトシス）は実質的に全ての複
雑型多細胞生物における非常に多様な生理学的環境にお
いて、重要な役割を果たす（Ellisら、Cell Biology 7:
663-668（1991））。これは正常な動物の成長の通常的
な様相であり、ほとんどの動物において生成される細胞
の大部分のフラクションの宿命である。例えば脊椎動物
では、これにより非常に多くの、排泄された望ましくな
い型のリンパ球を調整し、役割を終えた細胞を処分し
（例えばオタマジャクシの場合、変態時に尾を喪失す
る）、成長する器官の形状を整えるのを助ける（例えば
肢芽において指の原基痕跡に存在する細胞を除去して指
を形成する）。増殖が非常に盛んであるため、多細胞生
物健康を脅かすような細胞死があまりに少なく、ｂｃｌ
−２（後記参照）の過剰発現を誘起することにより細胞
死を阻止する突然変異が、癌の進行に関係している。

【０００３】カエノルハブディティス・エレガンス（Ca
enorhabditis elegans）線虫において、プログラムされ
た細胞死の遺伝的経路が同定された。シー・エレガンス
（C． elegans）において、2個の遺伝子ｃｅｄ−３およ
びｃｅｄ−４が細胞をプログラムされた細胞死に至らせ
るに必須である（Ellis,H.M.およびHorvits,H.R.、Cell
44:817-829（1986））。これらの2個の遺伝子の機能を
排除する劣性突然変異により、シー・エレガンス（C．
elegans）の成長中の正常にプログラムされた細胞死が
妨害される。ｃｅｄ−３タンパク質に対する一つの既知
の脊椎動物カウンターパートはＩＣＥである。ｃｅｄ−
３およびＩＣＥ間の全アミノ酸同一性は２８％であり、
１１５アミノ酸領域（ｃｅｄ−３の２４６−３６０残基
およびＩＣＥの１６４−２７８残基）では最も高い同一
性（４３％）を示す。この領域はＩＣＥ機能に必須であ
るとして知られているシステインを含有する保存ペンタ
ペプチド、ＱＡＣＲＧ（ｃｅｄ−３の３５６−３６０残
基）を含有する。ｃｅｄ−３およびＩＣＥ間の類似性に
より、ｃｅｄ−３がシステインプロテアーゼとして機能
するのみならず、ＩＣＥは脊椎動物のプログラムされた
細胞死遺伝子として作用し、プロＩＬ−１βを切断し、
成熟および活性ＩＬ−１βにする機能を有することが示
唆される。

【０００４】ＩＣＥおよびｃｅｄ−３間に類似性が見出
された後、今日では、システイン・プロテアーゼのＩＣ
Ｅ／ｃｅｄ−３ファミリーの一部である、その他の相同
性遺伝子がいくつかクローン化された。これらはＩｃｈ
−１、ＣＰＰ３２、ＴＸ、ＩＣＥｒｅｌＩＩＩ、および
ＬＡＰ３を包含する（Yuanら、Cell 75:641-652（199
3）、Miuraら、Cell 75:653-660（1993）、Wangら、Cel
l 78:739-750（1994）、Fernades-Alnemriら、J.Biol.C
hem.270:15870-15876（1995）およびDuanら、J.Biol.Ch
em.271:35013-35035（1996））。システイン・プロテア
ーゼのＩＣＥ／ｃｅｄ−３ファミリーはいくつかの重要
な細胞恒常性タンパク質を切断し、それによりアポトシ
スを促進すると考えられている。ＩＣＥｍＲＮＡは、末
梢血単球、末梢血リンパ球、末梢血好中球、休止および
活性化末梢血Ｔリンパ球、胎盤、Ｂリンパ芽球系ＣＢ２
３、および単球性白血病細胞系ＴＨＰ−１細胞を包含す
る多様な組織で検出されており（Cerretti,D.P.ら、Sci
ence 256:97-100（1992））、ＩＣＥがプロＩＬ−１β
に加えて別の基質を有することが示唆された。ＩＣＥが
作用し、細胞死を誘起する基質は、まだ知られていな
い。シー・エレガンス（C． elegans）細胞死遺伝子ｃ
ｅｄ−４の脊椎動物相同体がその基質であるかもしれな
いという可能性もある。また別に、ＩＣＥは細胞の生存
に必須のタンパク質をタンパク質溶解により切断するこ
とにより直接的に細胞死を誘起し得る。

【０００５】ＩＣＥ−ＬＡＰ７（ＦＬＩＣＥ）について
最近、Muzio,M.ら、「FLICE：新規ＦＡＤＤ相同性ＩＣ
Ｅ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼがＣＤ９５（Ｆａｓ／Ａ
ＰＯ−１）致死信号複合体に補給される」Cell 85:817-
827（1996）に記載されている。最近、ＦＬＩＣＥがい
くつかの細胞系でアポトシスを誘起することが示され
た。グランザイムＢで切断することにより活性化した場
合、ＦＬＩＣＥは、アポトシス中に特徴的に切断する酵
素であるポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲ
Ｐ）を切断できる。さらに、トランケーションされたま
たは不活性プロテアーゼドメインを有するＦＬＩＣＥ突
然変異体は、ＦＬＩＣＥ−、Ｆａｓ−、およびＴＮＦＲ
１−に媒介されるアポトシスを阻害する。ＦＬＩＣＥお
よびそれに関連する遺伝子Ｍｃｈ−４（Fernandes-Alne
mriら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7464-7469（199
6））は、システインプロテアーゼのＩＣＥ／ｃｅｄ−
３ファミリーに対して相同性を有するのみならず、ＦＡ
ＤＤのごときＴＮＦ−関連遺伝子の致死エフェクタード
メインに対しても相同性を有する（Chinnaiyanら、Cell
81:505-512（1995））。これにより、細胞表面でＴＮ
ＦのＴＮＦＲ−１への、またはＦａｓＬのＦａｓへの結
合のシグナルおよび細胞死プログラムを実行するプロテ
アーゼ間でのギャップを埋めるアダプター分子として機
能できる。哺乳動物遺伝子ｂｃｌ−２はリンパ球と称す
る免疫細胞を、細胞自殺から防御することが見出されて
いる。また、ｃｒｍＡ牛痘ウイルス遺伝子タンパク質生
成物はＩＣＥのプロテアーゼ活性を阻害する。

【０００６】明らかに、治療目的でアポトシスを誘起す
るのに有用な因子、例えば抗ウイルス剤、抗腫瘍剤とし
て、ならびに胚の成長および組織恒常性を調節するため
の因子が必要とされている。また、治療目的でアポトシ
スを阻止するのに有用な因子、例えば発作、心筋梗塞お
よび再灌流損傷のごとき虚血性損傷の処置のため、アル
ツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側策硬化
症のごとき神経退化障害；骨粗鬆症および変形性関節
症、腎多嚢胞病、慢性変性肝臓病、ＡＩＤＳおよび無形
成貧血の処置に有用な因子も必要とされている。従っ
て、ＩＣＥ／ｃｅｄ−３プロテアーゼに関与し、機能障
害または疾患の防御、改善または抑制に役割を果たし得
るかかる因子の同定および特徴づけが必要とされてい
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明はＦＬＩＣＥ阻害
物質−１（ＦＩＮ−１）と称する新規に同定されたタン
パク質に関する。従って、本発明は、新規ＦＩＮ−１ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリヌクレオチド
およびポリペプチドの変種および誘導体；ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドおよびその変種および誘導体の
製造方法；ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニ
スト；ならびにポリヌクレオチド、ポリペプチド、変
種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用を
提供する。本発明のその他の目的、様相、優越点および
態様は、以下の記載により当業者に明らかになるであろ
う。しかしながら以下の記載および具体的な実施例は本
発明の好ましい態様を示すものであり、例示のためにの
み提供することを理解されたい。本発明に開示した精神
および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載
および本明細書のその他の部分を読むことにより当業者
に容易に明白になるであろう。

【０００８】

【発明の実施の形態】

定義 以下に例示する説明は、本明細書、特に実施例において
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補因子および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。

【０００９】個々の制限酵素についての適当な緩衝液お
よび基質の量は、以下に述べるような標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって詳説
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細な条件に従って変えることができ
る。消化後、当業者に慣用的な周知方法を用いて、反応
物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポリアク
リルアミドゲルを介する電気泳動によって精製してもよ
い。「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチドをコード
する領域あるいは複製、転写、翻訳または宿主細胞にお
けるポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを調節す
る領域を含んでなるポリヌクレオチド、あるいはポリペ
プチドをコードする領域、およびそれに作動可能に連結
された、発現を調節する領域の両方を含んでなるポリヌ
クレオチドを意味する。遺伝的因子は、エピソーム因子
として、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立した分
子として複製されるベクター内に取り込まれていてもよ
い。それらは、真核細胞において、メトトレキセート選
択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の間に生
じるミニ染色体のようなものの中に取り込まれていても
よい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込まれて
いてもよいが、それは天然の状態ではなく、むしろ、単
離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの形態
の、またはベクターでの宿主細胞への導入などの操作の
後のものである。

【００１０】「単離」とは、「人工的」にその天然状態
から変えられること、すなわち、天然物の場合、その本
来的な環境から変化または除去されること、あるいはそ
の両方を意味する。例えば、その自然状態にある生存動
物に自然に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共
存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書で用いる用語としての「単
離」である。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単
離という語は、それが天然に存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。

【００１１】単離の際に、あるいは単離後に、かかるポ
リヌクレオチドを、例えば、突然変異を誘発し、融合タ
ンパク質を形成するために、および宿主中での増殖また
は発現のために、ＤＮＡなどの他のポリヌクレオチドに
結合させることができる。単独で、またはベクターなど
の他のポリヌクレオチドと結合した単離ポリヌクレオチ
ドを、培養中または完全生物における宿主細胞に導入す
ることができる。培養中または完全生物における宿主細
胞へ導入される場合、かかるＤＮＡは、その語を本明細
書において用いる場合、やはり単離されている。という
のも、それらは天然の形態でなく、あるいは自然環境に
あるものではないからである。同様に、ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドは、培地などの組成物、処方、ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への
導入のための溶液、例えば、天然に存在しない組成物で
あり、その中に本明細書で用いる場合の用語としての意
味としての単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
保持する、化学反応または酵素反応のための組成物また
は溶液中に存在してもよい。

【００１２】「ライゲーション」とは、ほとんどの場
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチドの間でホスホジエステル結合を形成するプロセ
スをいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよ
く知られており、ライゲーションについてのプロトコル
は標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrook
ら、Molecular cloning, A Laboratory Manual，第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri
ng Harbor，New York，(1989) （以下、Sambrookらとい
う）などの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチ
ド」とは比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばし
ば、その用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう
が、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレ
オチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮ
Ａをいうこともできる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌ
クレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、自動式オリゴ
ヌクレオチド合成機の使用のごとき、化学的方法により
合成されることがよくある。しかしながら、オリゴヌク
レオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞およ
び生物におけるＤＮＡ発現による方法を含め、他の種々
の方法により製造することができる。

【００１３】最初、化学的に合成されたＤＮＡは、典型
的には、５’リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリ
ゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成
するために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用す
るライゲーション反応によるホスホジエステル結合形成
の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲー
ションが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いる
ような標準的方法によりリン酸を付加することができ
る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端
は、一般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオ
チドなどの、別のポリヌクレオチドの５’リン酸とホス
ホジエステル結合を容易に形成するであろう。よく知ら
れているように、要すれば、ライゲーションの前に他の
ポリヌクレオチド（複数でも可）の５’リン酸を除去す
ることによって、この反応を選択的に阻害できる。

【００１４】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではなく、安定して受け継がれる遺伝的因子である。
プラスミドはＤＮＡまたはＲＮＡからなり、直鎖または
環状であってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその
複製および安定な遺伝性を確実にする分子をコードして
おり、医学的、農学的、および環境学的に非常に重要な
産物をコードするかもしれない。例えば、プラスミドは
病原菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プ
ラスミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を
コードすることもできる。プラスミドは、組換え遺伝子
をクローン化および発現するために用いられるベクター
として分子生物学において広く使用されている。プラス
ミドは、一般に、当業者が使いなれた標準的な命名操作
に従い、本明細書では、小文字「ｐ」を前置し、および
／またはつづいて大文字および／または数字で表す。本
明細書に開示されている出発プラスミドは、市販され、
公的に入手可能であるか、または周知の公開された方法
を慣用的に適用することにより利用可能なプラスミドか
ら構築され得る。本発明に従い使用され得る多くのプラ
スミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、
よく知られており、当業者に容易に利用され得る。さら
に、当業者であれば、本発明での使用に適したかなり多
数の他のプラスミドでも容易に構築し得る。本発明にお
ける、かかるプラスミドならびに他のベクターの特性、
構築および用途は、当業者であれば本明細書から容易に
理解できるはずである。

【００１５】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドを包含し、それらは非修飾ＲＮＡもしくは
ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。す
なわち、例えば、本明細書で使用されているポリヌクレ
オチドは、とりわけ、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本お
よび２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本または２本
鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖、または１
本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲ
ＮＡを含むハイブリッド分子をいう。加えて、本明細書
で使用されているポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる３本鎖領
域をいう。かかる領域の鎖は同じ分子または異なる分子
に由来していてもよい。これらの領域は１個またはそれ
以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含み得る。３重らせん領域の分子
の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばで
ある。本明細書で使用されている、「ポリヌクレオチ
ド」の語はまた、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有
する上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。すなわち、
バックボーンが安定性またはその他の理由で修飾された
ＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で意図するところの
「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの
普通でない塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基
を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、２例しか挙げていない
が、本明細書で使用するところのポリヌクレオチドであ
る。当業者に周知の多くの有用な目的に役立つ非常に多
様な修飾がＤＮＡまたはＲＮＡに対してなされているこ
とは明らかであろう。ここで使用されているポリヌクレ
オチドの語は、ポリヌクレオチドのそうした化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルス
および特に単純型および複雑型細胞を含む細胞に特有の
ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

【００１６】本明細書で使用されている「ポリペプチ
ド」は、下記のポリペプチド全てを包含する。ポリペプ
チドの基本的構造はよく知られており、当該分野におけ
る多数のテキストブックおよび他の刊行物に既に記載さ
れている。この点からすると、この語は、本明細書中、
ペプチド結合により直鎖で互いに結合された２個または
それ以上のアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質
をいうものとして使用されている。本明細書で使用され
ている、この語はまた、一般に当該分野で、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称されている
短鎖、および一般に当該分野でタンパク質と称され、そ
の多くのタイプが存在している長鎖の両方を包含する。

【００１７】ポリペプチドは、２０天然アミノ酸として
一般に称される２０アミノ酸以外のアミノ酸を含むこと
が多く、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、所定の
ポリペプチドにおいて、自然プロセス、例えばプロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾、または当該分野で公知の
化学的修飾技術により修飾されていてもよい。ポリペプ
チドにて自然に生じる一般的修飾でさえ、多すぎるため
ここで余すところ無く列挙することはできないが、それ
らは基本的なテキストおよび詳細な研究論文ならびに多
量の研究文献に詳述されており、当業者にはよく知られ
ている。本発明のポリペプチドに存在し得る既知修飾と
して、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシ
ル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有
結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、交差結合、閉環、ジスルフィド
結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、シスチン
の形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ
−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒ
ドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、
酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレ
ニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル
化などの、転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ酸付
加およびユビキチン化が挙げられるが、これに限定され
ない。かかる修飾は、当業者に周知であり、科学文献に
非常に詳細に記載されている。糖鎖形成、脂質結合、硫
酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒ
ドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化などの幾つかの
特に一般的な修飾が、Proteins−Structure and Molecu
lar Properties、第２版、Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆ
reeman and Ｃompany、ニューヨーク（１９９３）など
の最も基本的なテキストに記載されている。この題目に
関して、詳細な報文も入手可能である。例えば、Ｗold,
Ｆ.、Posttranslational Covalent Modification of Pr
oteins、「翻訳後のタンパク質修飾：展望と予想」、１
−１２頁、Ｂ.Ｃ.Ｊohnson編、アカデミック・プレス、
ニューヨーク（１９８３）；Ｓeifterら、Meth.Ｅnzymo
l. 「タンパク質修飾および非タンパク質コファクター
についての分析」、１８２：６２６−６４６（１９９
０）およびＲattanら、Ann.N.Y.Acad.Sci.，「タンパク
質合成：翻訳後修飾およびエージング」、６６３：４８
−６２（１９９２）を参照のこと。

【００１８】周知かつ前記にあるとおり、ポリペプチド
は必ずしも完全に線状とは限らない。例えば、ポリペプ
チドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよ
く、一般に、自然プロセッシング事象および自然には起
こらない人的操作により得られる事象を含む、翻訳後事
象の結果として、分枝の有無にかかわらず、環状であっ
てもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、
非翻訳自然プロセスおよび、同様に完全な合成方法によ
っても合成され得る。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸
側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリ
ペプチドのあらゆる場所で起こり得る。事実、ポリペプ
チドでのアミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら
両方の共有結合の修飾による遮断は、天然および合成ポ
リペプチドに共通しており、かかる修飾が、同様に本発
明のポリペプチドにあってもよい。例えば、プロセッシ
ングの前に、エシェリキア・コリ（Ｅ.coli）で生成さ
れたポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外な
く、Ｎ−ホルミルメチオニンである。

【００１９】ポリペプチドに起こる修飾は、ポリペプチ
ドの形成の仕方と相関関係にあることがしばしばであ
る。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現させ
ることにより生成されたポリペプチドの場合、修飾の性
質および程度の大部分は、宿主細胞翻訳後修飾能力およ
びポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルに
より決定される。例えば、よく知られているように、糖
鎖形成は、多くの場合、細菌宿主、例えばエシェリキア
・コリでは起こらない。従って、糖鎖形成が望ましい場
合、ポリペプチドを糖鎖形成性宿主、一般に真核細胞で
発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動
物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。この理由のため、昆虫
細胞発現系が、とりわけ、元来の糖鎖形成のパターンを
有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するために開
発された。同様の考え方が他の修飾にも適用される。

【００２０】同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いるような、ポリペプチドなる語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用
いる場合、それは、各々、対照標準のポリヌクレオチド
またはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。この意味における変種は、下記
およびこの開示のいずれかの部分においてより詳細に記
載されている。変種は、ヌクレオチド配列にて、別の対
照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを
包含する。一般に、相違は対照と変種のヌクレオチド配
列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同一で
あるようなものに限られる。

【００２１】下記のごとく、変種のヌクレオチド配列の
変化はサイレントであってもよい。すなわち、その変化
は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変
えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化に限定
される場合、変種は対照標準と同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするであろう。また、下記のご
とく、変種のヌクレオチド配列における変化が、対照標
準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変化させてもよい。かかるヌクレオチ
ドの変化は、下記のごとく、対照標準の配列によりコー
ドされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、欠失、
融合および切断をもたらすかもしれない。

【００２２】変種はまた、アミノ酸配列にて、別の対照
標準のポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。
一般に、相違は、対照標準と変種の配列が全体的に極め
て類似し、多くの領域において同一であるようなものに
限られる。変種および対照標準のポリペプチドは、アミ
ノ酸配列にて、１個またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断により異なっていてもよく、それら
はいずれの組み合わせにて存在してもよい。

【００２３】本明細書にて用いる場合、「融合タンパク
質」は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝子または
そのフラグメントでコードされるタンパク質である。Ｅ
Ｐ-Ａ-０ ４６４ ５３３（対応カナダ国特許２０４５８
６９）は、もう一つ別のヒトタンパク質またはそれの一
部と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を
含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融
合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用
いることが、治療および診断における使用について有利
であり、例えば、改良された薬物動態学的性質が得られ
る（ＥＰ-Ａ０２３２ ２６２）。他方、ある用途には、
融合タンパク質が発現され、検出され、次いで精製され
た後、Ｆｃ部分を検出できることが望ましい。したがっ
て、融合タンパク質の成分を、化学的または酵素的切断
しうる結合領域で連結させることが望ましい。これは、
Ｆｃ部分が治療および診断における用途に対する妨害物
であると判明した場合、例えば、融合タンパク質を免疫
化のための抗原として使用すべき場合である。例えば、
薬物の発見において、ｓｈＩＬ５-αなどのヒトタンパ
ク質を、ｈＩＬ-５のアンタゴニストを同定するための
高処理量のスクリーニングアッセイにて用いるためにＦ
ｃ部分と融合させる。D.Bennettら、Journal of Molecu
lar Recognition, 8：52−58（1995）およびK.Johanson
ら、Journal of Biological Chemistry，270（16）：94
59−9471（1995）を参照のこと。

【００２４】かくして、本発明はまた、ヒトＦＩＮ−
１、またはその部分、および、種々のサブクラスの免疫
グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖
または軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺伝子
操作された可溶性融合タンパク質にも関する。免疫グロ
ブリンとして好ましいのは、融合がヒンジ領域で起こる
場合の、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部分で
ある。個々の具体例において、血餅形成因子Ｘａで開裂
できる開裂配列を組み込むことによってＦｃ部分は簡単
に除去されうる。さらに、本発明は遺伝子操作によるこ
れらの融合タンパク質の製造方法、ならびに診断および
治療におけるそれらの使用に関する。本発明のさらなる
態様は、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドにも関する。

【００２５】膜結合タンパク質は融合タンパク質の製造
において特に有用である。かかるタンパク質は、一般
に、３種の異なる構造領域：細胞外ドメイン、膜ドメイ
ンおよび細胞質ドメインを有することで特徴付けられ
る。本発明は融合タンパク質の成分として１またはそれ
以上のこれら領域を用いるものである。このような融合
タンパク質技術の例は、ＷＯ９４／２９４５８およびＷ
Ｏ９４／２２９１４に見つけることができる。「結合分
子」（あるいは「相互作用分子」または「レセプター成
分ファクター」とも称される）は、レセプターを含め、
本発明のポリペプチドに特異的に結合または相互作用す
る分子をいう。かかる結合分子は本発明の一部である。
結合分子はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合
する抗体および抗体誘導試薬などの非天然物であっても
よい。

【００２６】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２本の鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（Computationa
l Molecular Biology，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press，New York（1988）；Biocomputing：Informati
cs and Genome Projects, Smith,D.W.編,Academic Pres
s, New York（1993）；Computer Analysis of Sequence
Date，Part I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編，H
umana Press, New Jersey（1994）；Sequence Analysis
in Molecular Biology ，von Heinje, G.,Academic Pr
ess（1987）；およびSequence Analysis Primer，Gribs
kov,M.およびDevereux,J.編, M Stockton Press，New Y
ork（1991））。２つのポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド配列の間の同一性および類似性を測定するための
多くの方法が存在する一方、「同一性」および「類似
性」なる用語は当業者によく知られている（Carillo,H.
およびLipton,D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（19
88））。２つの配列間の同一性または類似性を決定する
ために通常用いられる方法は、これに限定されないが、
Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop編，Acade
mic Press，San Diego（1994）およびCarillo,H.および
Lipton,D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988）
に開示されている方法を包含する。同一性を測定するた
めの好ましい方法は、試験する２つの配列間に最大の対
合を与えるように設計される。同一性および類似性を測
定する方法はコンピュータープログラムに書き込まれて
いる。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好
ましいコンピュータープログラムの方法は、これに限定
されないが、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Devereu
x,J.ら、Nucleic Acids Research 12（1）：387（198
4）、BLAST、FAST（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.，2
15：403（1990））を包含する。

【００２７】本発明は、とりわけ、以下にさらに詳細に
記載するような、新規ヒトＦＩＮ−１ポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ICE LA
Pタンパク質およびＦＡＤＤ、ＦＬＩＣＥおよびＭｃｈ
−４などのエフェクタードメインを有するタンパク質に
対するアミノ酸配列相同性により関連付けられる、新規
ヒトＦＩＮ−１のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
に関する。本発明は、特に、図１ないし４に示すヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列（配列番号１および２）を有
するヒトＦＩＮ−１に関する。

【００２８】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図１ないし４の推定アミ
ノ酸配列を有するＦＩＮ−１ポリペプチドをコードする
単離ポリヌクレオチドが提供される。図１ないし４に示
すポリヌクレオチド配列などの本明細書に示す情報を用
いて、ヒトＦＩＮ−１をコードする本発明のポリヌクレ
オチドを、標準的クローニングおよびスクリーニング法
を用いて得ることができる。本発明の代表例である、図
１ないし４に示すポリヌクレオチドは、骨髄細胞より由
来のｃＤＮＡライブラリー中で見つかった。発現配列タ
グ（ＥＳＴ）分析［Adams,M.D.ら、Science、252：1651
-1656（1991）；Adams,M.D.ら、Nature、355：632-634
（1992）；Adams,M.D.ら、Nature、377 Supp：3-174（1
995）］を用いて、部分長のクローンを、小脳、破骨細
胞、ＰＭＡ処理のＨＬ６０、Ｔ細胞リンパ腫、誘発上
皮、ＨＯＳ骨芽細胞および大網より同定した。本発明の
ヒトＦＩＮ−１は、構造的に、図１ないし４（配列番号
１）に示されるｃＤＮＡ配列を配列決定した結果より明
らかなように、ＩＣＥ ＬＡＰ種の他のタンパク質に関
連付けられる。ＦＩＮ−１は、約４８０個のアミノ酸部
分をコードする、図１ないし４（配列番号１）のヌクレ
オチド４２２で始まるオープン・リーディング・フレー
ムを含有する。ヒトＦＩＮ−１のオープン・リーディン
グ・フレームは２種のＤＥＤをコードする。これらの新
規なＤＥＤとＦＡＤＤ、ＦＬＩＣＥ、Ｍｃｈ４およびＰ
ｅａ−１５を整合させることで、ＦＩＮ−１の第１およ
び第２ＤＥＤが、各々、１７残基の１４および１５でＤ
ＥＤコンセンサス配列との類似性を示すことがわかる。
これは該種の他のメンバーが該コンセンサスと類似のレ
ベルで略等価である（図５参照）。ＦＩＮ−１はいくつ
かの潜在的リン酸化部位と、１個の潜在的Ｎ−連結糖鎖
形成部位を有する。

【００２９】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードする
コーディング配列は、図１ないし４（配列番号１）に示
すポリヌクレオチドのコーディング配列と同じであって
もよい。そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の重複
性（縮重性）の結果として、図１ないし４（配列番号
２）のポリペプチドをもコードする、別の配列を有する
ポリヌクレオチドであってもよい。

【００３０】図１ないし４のポリペプチドをコードする
本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコ
ーディング配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列および付加的なコーディング配列；および前記し
た付加的なコーディング配列を有するか、または有する
ことなく、付加的な非コーディング配列を有する、成熟
ポリペプチドのコーディング配列を包含するが、これに
限定されるものではない。付加的なコーディング配列と
して、例えば、プレ、プロまたはプレプロタンパク質配
列などのリーダー配列または分泌配列をコードするよう
な配列が挙げられるが、これに限定されるものではな
い。付加的な非コーディング配列として、例えば、転写
およびスプライシングを含め、ｍＲＮＡプロセッシング
にて役割を果たす、転写され、かつ非翻訳の配列およ
び、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性の
ためのポリアデニル化シグナルなどのイントロンおよび
非コーディング５’および３’配列を包含するが、これ
に限定されない。付加的な官能性を付与するコーディン
グ配列をポリペプチドに組み入れてもよい。かくして、
例えば、ポリペプチドを、融合ポリペプチドの精製を容
易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融合させても
よい。本発明のこの態様のある好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）
で供給されるようなヘキサヒスチジンペプチドである。
Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、86：821-824（198
9）に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジ
ンは融合タンパク質を精製するのに都合がよい。そのＨ
Ａタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タンパク質由来
のエピトープに対応するものであり、例えば、Wilson
ら、Cell37：767 (1984) に記載されている。他の多く
のそのようなタグが市販されている。

【００３１】前記によれば、本明細書にて用いられる
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図１ないし４（配列番号２）に示すアミノ酸配列
を有するヒトＦＩＮ−１をコードするいずれの配列をも
含むポリヌクレオチドを包含する。該用語はまた、コー
ディングおよび／または非コーディング配列を含んでい
てもよい、付加的な領域と共に、該ポリペプチドをコー
ドする単一の連続領域または不連続領域（例えば、イン
トロンにより分断されている）を含むポリヌクレオチド
も包含する。さらに本発明は、図１ないし４の推定アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナロ
グおよび誘導体をコードする、本明細書にて前記したポ
リヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変
種は、天然の対立遺伝子変種などの天然に存在する変種
であってもよく、あるいは、天然に存在することが知ら
れていない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチ
ドの天然に存在しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞
または生物に用いる方法を含め、突然変異誘発法により
製造してもよい。

【００３２】この点で変種には、ヌクレオチド置換、欠
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図１ないし４に示すヒトＦＩ
Ｎ−１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド；その変種、アナログ、誘導体およ
びフラグメント、ならびにその変種、アナログおよび誘
導体のフラグメントがある。

【００３３】さらに、この点において、数個、わずか
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図１ないし４のヒト
ＦＩＮ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ヒト
ＦＩＮ−１変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
これらのうち特に好ましいのは、ヒトＦＩＮ−１の特性
および活性を変化させないサイレント置換、付加および
欠失である。またこの点において、同類置換が特に好ま
しい。置換されていない、図１ないし４のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
最も好ましい。

【００３４】本発明のさらに好ましい具体例は、図１な
いし４に示すアミノ酸配列を有するヒトＦＩＮ−１ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および
かかるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドで
ある。ヒトＦＩＮ−１ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドに対
して少なくとも８０％同一である領域からなるポリヌク
レオチドが非常に好ましい。その同じポリペプチドに対
して少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特
に好ましく、これらのうちでも特に好ましいのは、少な
くとも９５％同一のものである。さらには、少なくとも
９７％同一のものが非常に好ましく、少なくとも９８−
９９％同一のものがさらに好ましく、少なくとも９９％
同一のものが最も好ましい。この点において、さらに特
に好ましい具体例は、図１ないし４のｃＤＮＡによりコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機
能または活性を保持しているポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチドである。

【００３５】本発明はさらに本明細書にて前記した配列
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いるような、「ストリンジェントな条件」なる語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイ
に関してさらに検討するように、例えば、前記した本発
明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ヒト
ＦＩＮ−１をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離し、ヒトＦＩＮ−１遺伝子に対して高度
の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノ
ムクローンを単離してもよい。かかるプローブは、一般
に、少なくとも１５個のヌクレオチドを有してなる。好
ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個のヌクレ
オチドを有するであろうし、少なくとも５０個のヌクレ
オチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３
０と５０個の範囲にあるヌクレオチドを有する。

【００３６】例えば、ヒトＦＩＮ−１遺伝子のコード領
域は、既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングして
オリゴヌクレオチド・プローブを合成することにより単
離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配
列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用いてヒトｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーを
スクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプロ
ーブとハイブリダイズするか決定する。本発明のポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、本明細書においてポ
リヌクレオチド・アッセイに関してさらに説明するよう
に、ヒト疾患に対する治療および診断の発見のための研
究試薬および研究材料として用いることができる。

【００３７】該ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質
に、付加的なアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加
わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった
（例えば、成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有す
る場合）ポリペプチドをコードすることができる。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタン
パク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパ
ク質を運ぶことを容易にし、タンパク質の半減期を長く
したり、短くしたり、あるいはアッセイまたは生産のた
めのタンパク質の操作を容易にすることができる。イン
シテューで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素
により成熟タンパク質からプロセッシングにより除かれ
る。一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチ
ドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれると、そのよ
うな不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列の幾
らかまたは全体を、活性化の前に除去できる。一般に、
そのような前駆体はプロタンパク質と称される。

【００３８】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。

【００３９】ポリペプチド 本発明は、さらに図１ないし４（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するヒトＦＩＮ−１ポリペプチドに関す
る。本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体にも関する。「フラグメン
ト」、「誘導体」および「アナログ」なる語は、図１な
いし４のポリペプチドについて言う場合、かかるポリペ
プチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持し
ている、すなわち、ＦＩＮ−１のごとく機能するポリペ
プチドを意味する。かくして、アナログは、プロタンパ
ク質部分の開裂により活性化され、活性成熟ポリペプチ
ドを産生しうるプロタンパク質を包含する。本発明のポ
リペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド
または合成ポリペプチドであってもよい。ある種の好ま
しい具体例において、本発明のポリペプチドは組換えポ
リペプチドである。

【００４０】図１ないし４のポリぺプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログは、（ｉ）１個またはそれ以
上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好
ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されており、かか
る置換アミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされている
ものであっても、なくてもよいもの；（ｉｉ）１個また
はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；（ｉｉ
ｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプ
チドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレ
ングリコール）と融合しているもの；または（ｉｖ）付
加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているも
の、例えば、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリ
ペプチドの精製用に利用される配列またはプロタンパク
質配列であってもよい。かかるフラグメント、誘導体お
よびアナログは、本明細書の教示から当業者に自明であ
ると考えられる。この点において、本発明の特に好まし
い具体例には、図１ないし４（配列番号２）に示すヒト
ＦＩＮ−１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その
変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに
該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
さらに、この点において本発明の特に好ましい具体例
は、ヒトＦＩＮ−１のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、
ならびにこのタンパク質の活性／機能を保持しているフ
ラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。

【００４１】好ましい変種には、同類アミノ酸置換によ
って対照標準から変化している変種がある。かかる置換
は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性の別
のアミノ酸で置換したものである。同類アミノ酸置換と
して認められる典型的なものは、脂肪族アミノ酸である
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互の置
換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互
置換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミ
ド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残
基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残
基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。さらに
この点において特に好ましいのは、数個、わずかな、５
ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個または
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失または付加されている、図１ないし４のヒトＦＩＮ
−１ポリペプチドのアミノ酸配列を有する変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメン
トの変種、アナログおよび誘導体である。これらのうち
特に好ましいのは、このタンパク質の性質および活性を
変化させないサイレント置換、付加および欠失である。
またこの点において、同類置換が特に好ましい。最も好
ましいのは、置換されていない図１ないし４のアミノ酸
配列を有するポリペプチドである。

【００４２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離形態にて提供され、好ましく
は、等質性になるまで精製される。本発明のポリペプチ
ドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して
少なくとも７０％の同一性を有し、より好ましくは配列
番号２のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有
し、さらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドに
対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましく
は少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを
包含する。また、一般に、少なくとも３０個のアミノ
酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有する
ポリペプチドの部分を有するそのようなポリペプチドの
部分を有する。

【００４３】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成により対応する完全長のポリペ
プチドの製造に使用してもよい；従って、フラグメント
を完全長のポリペプチドの製造のための中間体として使
用してもよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチ
ドを合成してもよい。フラグメントは、「自立してい
る」、すなわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一
部でなく、または、それらに融合しておらず、あるい
は、かかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含ま
れていてその一部分または領域となっていてもよい。大
きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中の
フラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を
形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントが、
単一のより大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
い。例えば、特定の好ましい具体例は、宿主中での発現
のために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれてい
て、ヒトＦＩＮ−１フラグメントのアミノ末端に融合し
た異種プレおよびプロ−ポリペプチド領域、および、該
フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加的な領
域を有している、本発明のヒトＦＩＮ−１ポリペプチド
のフラグメントに関する。従って、本明細書の意図する
１つの態様において、フラグメントは、ヒトＦＩＮ−１
から由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の一
部または部分をいう。

【００４４】本発明のポリペプチドフラグメントの典型
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。この内容に
おいては、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数
個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の
分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、
この内容においては、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、
４、３、２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまた
はマイナス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のア
ミノ酸残基までのポリペプチドフラグメントを意味し、
すなわち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プ
ラス数個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸か
ら９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点に
おいて好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの
両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナ
ス５個程度のアミノ酸である。上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において、列挙した範囲プラスま
たはマイナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好まし
い。上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲にお
いて、列挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のア
ミノ酸、または列挙した範囲に付加または欠失のないも
のが特に非常に好ましい。この点において、約５ないし
１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０な
いし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４
１ないし９０個、５０ないし１００個、７５ないし１０
０個、９０ないし１１５個、１００ないし１２５個、お
よび１１０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメ
ントが、すべてのうちで最も好ましい。

【００４５】本発明の特に好ましい具体例には、ヒトＦ
ＩＮ−１の平滑末端の変異体がある。平滑末端の変異体
は、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、
連続領域、一部または部分）またはカルボキシル末端を
含む連続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑末端の
変異体のような、２つの連続した一連の残基の欠失、す
なわち、アミノ末端における欠失およびカルボキシル末
端における欠失を除く、図１ないし４のアミノ酸配列を
有するヒトＦＩＮ−１ポリペプチド、またはその変種ま
たは誘導体を包含する。前記した大きさのフラグメント
もまた、平滑末端フラグメントの好ましい具体例であ
り、一般に、フラグメントの中でも特に好ましいフラグ
メントである。本発明のこの態様において、ヒトＦＩＮ
−１の構造的または機能的属性によって特徴づけられる
フラグメントも好ましい。この点において本発明の好ま
しい具体例は、ヒトＦＩＮ−１のアルファ−ヘリックス
およびアルファ−ヘリックス形成領域（「アルファ−領
域」）、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領域
（「ベータ−領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル−領域」）、親水領域、疎水領域、アルファ
両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可動性領域、界面
形成領域および高抗原性指数領域を含んでなるフラグメ
ントを包含する。

【００４６】この点において、非常に好ましい具体例に
は、前記したいくつかの特徴などの、構造的特徴をいく
つか組み合わせた、ヒトＦＩＮ−１の領域からなるフラ
グメントがある。かかる領域はより大きなポリペプチド
中に含まれていてもよく、あるいは前記のごとくそれら
自体本発明の好ましいフラグメントであってもよい。こ
のパラグラフにて用いる「約」なる語は、一般に、フラ
グメントに関して前記した意味を有することが理解され
よう。

【００４７】さらに好ましい領域はＦＩＮ−１タンパク
質の活性を媒介する領域である。この点において、類似
活性または改善された活性または望ましくない活性の減
少したものを含め、ヒトＦＩＮ−１の化学的、生物学的
活性または他の活性を有するフラグメントが最も好まし
い。この点において、ヒトＦＩＮ−１などの、関連する
ポリペプチドの活性領域に対して配列または位置、ある
いは両方が相同的である領域を含むフラグメントが非常
に好ましい。この点において、特に好ましいフラグメン
トには、前記したような平滑末端変異体、または細胞
質、トランスメンブランまたは細胞外ドメインからなる
フラグメントがある。本発明はまた、とりわけ、前記し
たフラグメントをコードするポリヌクレオチド、該フラ
グメントをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド
形成するポリヌクレオチド、特にストリンジェントな条
件下でハイブリッド形成するもの、および該フラグメン
トをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣ
Ｒプライマーなどのポリヌクレオチドに関する。これら
の点において、好ましいポリヌクレオチドは、前記のよ
うな好ましいフラグメントに対応するポリヌクレオチド
である。

【００４８】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換といっ
たよく知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独また
は他のポリヌクレオチドと一緒に導入してもよい。他の
ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと別個に
導入するか、同時に導入するか、あるいは結合させて導
入してもよい。

【００４９】かくして、例えば、本発明のポリヌクレオ
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。別法として、ポリヌクレ
オチドを、宿主における増殖用の選択可能マーカーを有
するベクターに結合させてもよい。前記した方法によ
り、ベクター構築物を宿主細胞中に導入してもよい。一
般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物
のごとき沈殿物中、あるいは荷電脂質との複合体中のＤ
ＮＡとして導入される。さらに、エレクトロポレーショ
ンを用いてポリヌクレオチドを宿主に導入してもよい。
ベクターがウイルスである場合、それをインビトロでパ
ッケージし、またはパッケージ細胞中に導入し、そのパ
ッケージウイルスを細胞中に形質導入してもよい。本発
明のこの態様によれば、ポリヌクレオチドを製造し、ポ
リヌクレオチドを細胞に導入するのに適当な多種の方法
は当業者によく知られた、慣用的なものである。かかる
方法は、Sambrookらに詳細に記載されており、これはこ
れらの方法を詳述する多くの実験室マニュアルの例示に
すぎない。

【００５０】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションにつ
いての周知方法によって、ベクターはまた、パッケージ
または封入ウイルスとして細胞中に導入されていてもよ
く、好ましくは導入されている。ウイルスベクターは複
製可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者
の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿主細胞にお
いてのみ起こるであろう。ベクターには、ある態様にお
いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
発現用ベクターが好ましい。一般に、かかるベクター
は、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結
された宿主中での発現に効果的なシス−作用性制御領域
を含んでなる。適当なトランス−作用性因子は、宿主に
より供給されるか、相補的ベクターにより供給される
か、または宿主中に導入した後のベクター自身によって
供給されるかである。

【００５１】この点における好ましい具体例において、
ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は
誘導可能な発現であってもよく、またはある型の細胞に
おいてのみ起こる発現であってもよく、または誘導可能
および細胞特異的の両方であってもよい。誘導可能なベ
クターの中でも、温度および栄養添加物などの操作容易
な環境因子によってタンパク質を発現するように誘導す
ることのできるベクターが、特に好ましい。原核細胞お
よび真核細胞宿主において使用される構成的および誘導
可能な発現ベクターを含め、本発明のこの態様に適する
種々のベクターは当業者によく知られており、慣用的に
使用されている。遺伝子操作された宿主細胞は通常の栄
養培地で培養することができ、そのような培地は、とり
わけプロモーターの活性化、形質転換体の選択、または
遺伝子の増幅に関して、適宜修飾されていてもよい。温
度、ｐＨなどの、発現のために選択される宿主細胞で予
め使用された培養条件は、一般に、本発明のポリペプチ
ドの発現に適しており、それは当業者に明らかであろ
う。

【００５２】多種の発現ベクターを用いて、本発明のポ
リペプチドを発現させることができる。かかるベクター
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵
母エピソーム、酵母染色体因子、バキュロウイルス、パ
ポーバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデ
ノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイ
ルス、アルファーウイルスおよびレトロウイルスから由
来のベクター、およびプラスミドおよびバクテリオファ
ージ遺伝的因子から由来のベクターなどのその組み合わ
せに由来のベクター、コスミドおよびファージミドを包
含する。この点における発現のために、一般に、宿主中
でポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを維
持、増殖または発現するのに適したベクターを用いるこ
とができる。

【００５３】種々のよく知られた慣用的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いて発現ベクターを構
築するための適当な操作も当業者によく知られており、
慣用的なものであり、Sambrookらに詳細に記載されてい
る。

【００５４】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含め、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ファージ・ラムダＰＬプロ
モーター、エシェリキア・コリのｌａｃ、ｔｒｐおよび
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー
ターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを包
含するが、それらは周知プロモーターのほんの例示に過
ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他のプロモ
ーターはよく知られており、本明細書の記載および実施
例で説明されるようにして当業者であれば慣用的に使用
することができる。一般に、発現構築物は、転写開始部
位および停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を有するであろう。構築物により発現
される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべ
きポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、およ
び終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含むであろ
う。

【００５５】加えて、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより作動するであろう。例えば、とりわけ、
レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げられ
る。一般に、増殖および発現のためのベクターは選択可
能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺伝子は形
質転換された宿主細胞を選択するための表現型特徴を提
供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養するため
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性のも
の、およびエシェリキア・コリおよび他の細菌を培養す
るためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝
子を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。

【００５６】所望のポリペプチドの宿主中での発現に適
した種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した選
択されたポリヌクレオチド配列、ならびに適当なプロモ
ーターおよび他の適当な制御配列を含むベクターを、適
当な宿主中に導入してもよい。適当な宿主の代表例は、
エシェリキア・コリ、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella t
yphimurium）細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌
細胞；ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプ
テラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳおよびボウエス（Bowes）メラノーマ細胞な
どの動物細胞を包含する。多種の発現構築物の宿主が周
知であり、当業者は本開示により本発明のこの態様に従
ってポリペプチドの発現のための宿主を容易に選択する
ことができる。より詳細には、本発明はまた、発現構築
物などの組換え構築物であって、１種またはそれ以上の
前記した配列を含んでなる組換え構築物を包含する。構
築物は、本発明のかかる配列がその中に挿入されたプラ
スミドまたはウイルスベクターなどのベクターからな
る。配列は順方向または逆方向に挿入することができ
る。この点において、ある種の好ましい具体例におい
て、構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に連結
されたプロモーターを含め、調節配列を含んでなる。多
数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知ら
れており、本発明の使用に適した多数の市販のベクター
がある。

【００５７】市販されている以下のベクターを例示とし
て提供する。細菌に使用するのに好ましいベクターに
は、Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、
ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベ
クター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されてい
る、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３
−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核
細胞ベクターには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；ならびに、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクタ
ーは、多くの市販されている、および、本発明のこの態
様により使用するために当業者によく知られたベクター
を例示するためにのみ列挙する。例えば、宿主中におけ
る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまた
はベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが
理解されよう。

【００５８】プロモーター領域は、制限部位、または、
候補プロモーターフラグメント；すなわち、プロモータ
ーを含んでいるかもしれないフラグメントを導入するた
めの部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットのごとき、
プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含む
ベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することがで
きる。周知のように、プロモーター含有フラグメントを
ベクター中にＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位で導入する
ことにより、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡ
Ｔアッセイにより検出することができる。この目的に適
するベクターはよく知られており、容易に入手できる。
かかるベクターとして、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ
７の２種類が挙げられる。かくして、本発明のポリヌク
レオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容
易に入手できるプロモーターだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。

【００５９】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターには、エ
シェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターがある。この点において適当な既知の真核細胞プ
ロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、Ｒｏｕｓサルコーマウイルス（「ＲＳ
Ｖ」）のごときレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、
ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターな
どのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞中
での発現に適するベクターおよびプロモーターの選択は
周知操作であり、発現ベクターの構築、宿主中へのベク
ターの導入および宿主における発現のための必須方法
は、当業者にとって日常的なものである。本発明は、前
記の構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、哺
乳動物細胞のごとき高等真核細胞、酵母細胞のごとき下
等真核細胞、または細菌細胞のごとき原核細胞であって
もよい。

【００６０】構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
により媒介されるトランスフェクション、陽イオン性脂
質により媒介されるトランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、形質導入、感染または他の方法により、
行うことができる。かかる方法は、多くの標準的実験室
マニュアルに記載されている。宿主中の構築物を常法で
使用して、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を
製造することができる。別法として、慣用的ペプチド合
成装置により本発明ポリペプチドを合成的に製造するこ
ともできる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中で
発現させることができる。さらに、無細胞翻訳系を利用
して、本発明のＤＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用い
て、かかるタンパク質を製造することもできる。原核宿
主および真核宿主とともに使用に適するクローニングお
よび発現ベクターは、Sambrookらにより記載されてい
る。

【００６１】一般に、組換え発現ベクターは、複製開始
点、下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来
のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクタ
ー含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含
む。適当なプロモーターには、とりわけ、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）などの糖分解酵素、
アルファ−ファクター、酸ホスファターゼ、および熱シ
ョックタンパク質をコードする遺伝子由来のプロモータ
ーがある。選択可能マーカーは、エシェリキア・コリの
アンピシリン耐性遺伝子およびスタフィロコッカス・セ
レビシエ（S.cerevisiae）のｔｒｐ１遺伝子を包含す
る。高等真核生物により本発明のポリペプチドをコード
するＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に
挿入することにより増大させることができる。エンハン
サーは、通常、約１０ないし３００ｂｐのＤＮＡのシス
−作用性エレメントであり、所定の宿主細胞型中でのプ
ロモーターの転写活性を増大させるように作用する。エ
ンハンサーの例は、複製開始点の後期側１００ないし２
７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点
の後期側にあるポリオーマエンハンサー、ならびにアデ
ノウイルスエンハンサーを包含する。

【００６２】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位に対して５’付近に位置するようにポリヌ
クレオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現さ
れるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’
にある。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始
まり、リボソーム結合部位と開始コドンの間に位置する
他のオープン・リーディング・フレームはないであろ
う。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドン
が存在し、転写される領域の３’末端に適宜散在するポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在す
るであろう。適当な分泌シグナルを、小胞体ルーメン、
周辺腔または細胞外環境中への翻訳タンパク質の分泌の
ために、発現されるポリペプチド中に組み込ませてもよ
い。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のもので
あってもよく、あるいは異種的であってもよい。

【００６３】ポリペプチドは、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させることができ、分泌シグナルのみな
らず付加的な異種機能領域を含んでいてもよい。かくし
て、例えば、付加的アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ−末端に付加して、宿主細胞
における精製またはその後の取り扱いおよび保存の間の
安定性および維持性を改善してもよい。また、一の領域
をポリペプチドに付加し、精製を容易にしてもよい。か
かる領域は、最終的なポリペプチドの調製の前に除去す
ることができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加
し、とりわけ、分泌または外分泌を引き起こし、安定性
を改善し、精製を容易にすることは、当業者によく知ら
れている日常的方法である。本発明に係るポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適し
た原核宿主は、エシェリキア・コリ（Escherichia col
i）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）および
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）を包含する。シュードモナス（Pseudomonas）、スト
レプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）の様々な種もまた、この点にお
いて適当な宿主である。さらに、この点において、当業
者に知られている他の多くの宿主も使用可能である。

【００６４】限定するものではないが、一の代表例とし
て、細菌の使用についての有用な発現ベクターは、選択
可能なマーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ
３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントを有
してなる市販プラスミドから由来の細菌の複製開始点と
からなり得る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ
２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Swed
en）およびＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison,WI,US
A）を包含する。これらベクターにおいて、ｐＢＲ３２
２「骨格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき
構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換した
後、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させる。選択
したプロモーターが誘導可能である場合には、適当な手
段（例えば、温度シフトまたは化学誘導剤に曝露）によ
りそれを誘導し、細胞をさらなる期間培養する。次い
で、典型的には、細胞を遠心分離により集め、物理的ま
たは化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさら
に精製に供する。

【００６５】凍結−融解のサイクリング、超音波処理、
機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、慣用的方
法により、タンパク質発現に使用する微生物細胞を破壊
することができる。かかる方法は当業者によく知られて
いる。同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用
することができる。哺乳動物発現系の例は、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨ
Ｋ細胞系ならびにGluzmanら、Cell，23：175（1981）に
記載されたサル・腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を
包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボ
ソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および発現
に必要とされる５’隣接非転写配列からなるであろう。
好ましい具体例において、ＳＶ４０スプライス部位およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位から由来のＤＮＡ配列
が、必須の非転写遺伝的エレメントとして用いられる。

【００６６】ヒトＦＩＮ−１ポリペプチドは、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまた
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含むよく知られた方法により、組換え細胞
培養物から回収し、精製することができる。最も好まし
くは、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
を精製に用いる。単離または精製の間にポリペプチドが
変性する場合、タンパク質の再生するためのよく知られ
た方法を用いて活性コンフォメーションを再生すること
ができる。本発明のポリペプチドは、自然に精製される
ポリペプチド、化学合成法による産生されるポリペプチ
ド、および例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および
哺乳動物細胞を含め、原核細胞または真核細胞宿主から
組換え技術により得られるポリペプチドを包含する。組
換え体産生法に用いる宿主によっては、本発明のポリペ
プチドは糖鎖形成されていても、糖鎖形成されていなく
てもよい。加えて、本発明のポリペプチドは、ある場合
には、宿主が介在する工程の結果として、最初の修飾さ
れたメチオニン残基を含みうる。ヒトＦＩＮ−１ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドを、本発明に従って、種
々の用途、特に該タンパク質の化学的および生物学的特
性を用いる用途に使用することができる。さらなる用途
は、細胞、組織および器官の障害の診断および治療に関
する。本発明のこれらの態様を以下の議論によってさら
に説明する。

【００６７】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断試薬として用いるための相補
的ポリヌクレオチドの検出のためのヒトＦＩＮ−１ポリ
ヌクレオチドの使用に関する。機能不全に伴う変異形の
ヒトＦＩＮ−１の検出は、ヒトＦＩＮ−１の過小発現、
過剰発現または発現の変化から生じる疾患の診断、また
は疾患に対する感受性に付加および定義することができ
る診断用装置を提供することである。ヒトＦＩＮ−１遺
伝子に変異を有する個体は、種々の方法により、ＤＮＡ
レベルで検出することができる。診断のための核酸を、
血液、尿、唾液、生検および剖検材料などの患者の細胞
から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使用して
もよく、または分析前にＰＣＲを用いることにより酵素
的に増幅してもよい（Saikiら、Nature，324：163−166
（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように使用し
てもよい。一例として、ヒトＦＩＮ−１をコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ヒトＦＩＮ−
１の発現および変異を同定および分析することができ
る。例えば、正常な遺伝子型との比較にて増幅産物の大
きさが変化することにより、欠失および挿入を検出する
ことができる。増幅したＤＮＡを放射性標識したＦＩＮ
−１ＲＮＡまたは放射性標識したＦＩＮ−１アンチセン
スＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせることによ
り、点突然変異を同定することができる。好ましくは、
ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の相違により、対合
した配列と誤対合の２本鎖を識別することができる。

【００６８】直接的ＤＮＡ配列決定により、対照標準の
遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明ら
かとなりうる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをプローブとして用い、特定のＤＮＡセグメントを
検出してもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適宜用い
ることにより、かかる方法の感度を非常に向上させるこ
とができる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖
ＰＣＲ産物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型
分子とともに使用する。放射性標識されたヌクレオチド
を用いる慣用的操作により、または蛍光タグを用いる自
動式配列決定法により配列決定を行う。変性剤と共にま
たは無しで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度
の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の相違に基づ
く遺伝的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳
動により、小規模な配列の欠失および挿入を可視化する
ことができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、そ
の特異的融点または部分的融解温度によって、異なるＤ
ＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅延す
る、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別することができ
る（例えば、Myersら、Science，230：1242（1985）を
参照のこと）。

【００６９】特定位置での配列の変化はまた、ＲＮase
およびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは
化学的開裂法により明らかとなる（例えば、Cottonら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397−4401（1985））。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限フラグメント長多型性（「ＲＦＬ
Ｐ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングな
どの方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことが
できる。本発明のさらなる態様によれば、とりわけ、ウ
イルス性疾患および腫瘍に対する感受性を診断または測
定するための方法が提供される。加えて、胚成長を制御
するための、および組織恒常性を提供するための方法が
提供される。ヒトＦＩＮ−１遺伝子における突然変異
は、とりわけ、ウイルス性疾患および腫瘍に対する感受
性の指標であるかもしれず、前記した核酸配列をそのよ
うな感受性を確認するためのアッセイにて用いることも
できる。かくして、例えば、該アッセイを用いて、前記
したような、欠失、末端切断、挿入、フレームシフトな
どの、ヒトＦＩＮ−１遺伝子における突然変異、すなわ
ち、とりわけ、高増殖性疾患に対する指標である突然変
異を測定することができる。

【００７０】本発明は、疾患、特にウイルス性疾患およ
び腫瘍を診断するための方法を提供する。加えて、ＦＩ
Ｎ−１配列は、発作、心筋梗塞および再灌流損傷などの
虚血性損傷の診断に、アルツハイマー病、パーキンソン
病および筋萎縮性側策硬化症などの神経退化障害；骨粗
鬆症および変形性関節炎、腎多嚢胞病、慢性変性肝臓
病、ＡＩＤＳおよび無形成貧血の診断に有用である。こ
の方法は、図１ないし４（配列番号１）の配列を有する
ポリヌクレオチドの発現レベルが異常に減少または増加
している患者から由来の試料から決定することからな
る。ポリヌクレオチドの発現の減少または増加は、例え
ば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノザンブロ
ッティングおよび他のハイブリダイゼーション法などの
ポリヌクレオチド定量のための当該分野でよく知られた
方法を用いて測定できる。より慣用的なゲル電気泳動法
およびＤＮＡ配列決定法に加えて、突然変異をインシテ
ュ分析により検出することもできる。

【００７１】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定についても価値があ
る。該配列を特異的に標的とし、個々のヒト染色体上の
特定の位置でハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらには、染色体上の特定の部位を同定することに
対する要求がある。染色体位置をマーキングするため
の、実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体
マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本発明
によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、その配列を疾
患に関係した遺伝子と相関付ける重要な第一工程であ
る。簡単には、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好まし
くは１５−２５ｂｐ）を調製することによって、配列を
染色体に対してマッピングできる。一つ以上のエクソン
に広がるプライマーは増幅工程を混乱させ得るため、
３’非翻訳領域のコンピューター解析を用いて、ゲノム
ＤＮＡ中に一つ以上のエクソンが広がっていないプライ
マーを迅速に選択する。ついで、これらのプライマーを
個々のヒト染色体を含有する体細胞雑種のＰＣＲスクリ
ーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを有するで
あろう。

【００７２】体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、個々の
ＤＮＡを個々の染色体に帰属させるための迅速な方法で
ある。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーに用
いると、サブローカリゼーションは特定の染色体からの
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールで同様の方法にて達成することができる。同様に、
染色体への地図作成に用いることができる他のマッピン
グ法は、in situハイブリダイゼーション、標識された
フロー−ソーティド（flow-sorted）染色体でのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
選択を包含する。ｃＤＮＡクローンを中期染色体スプレ
ッドに対して蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｆ
ＩＳＨ）に付し、正確な染色体位置を１工程で知ること
ができる。この方法は、５０ないし６０塩基の短いｃＤ
ＮＡを用いることができる。この方法の報文として、Ve
rmaら、Chromosomes：A Manual of Basic Techniques，
Pergamon press，New York （1988）を参照のこと。

【００７３】この方法をいかにして行うのかという一例
として、ヒトＦＩＮ−１ ＤＮＡを消化し、QIAEX II Ｄ
ＮＡ精製キット（Qiagen，Inc.，Chatsworth，ＣＡ）を
用いて精製し、Super Cos１ コスミドベクター（Strata
gene，La Jolla，ＣＡ）に連結する。Qiagen Plasmid P
urification Kit（Qiagen，Inc，Chatsworth，ＣＡ）を
用いてＤＮＡを精製し、BioNick Labeling Kit（GibcoB
RL，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，ＭＤ）を
用いてビオチン−ｄＡＴＰの存在下でニックトランスレ
ーションにより１ｍｇを標識する。GENE-TECT Detectio
n System（Clontech Laboratories，Inc. Palo Alto，
ＣＡ）を用いてビオチン化を検出する。ONCOR Light Hy
bridization Kit（Oncor，Gaithersburg，ＭＤ）を用い
てin situハイブリダイゼーションをスライド上で行っ
て、中期染色体上の単一コピー配列を検出する。２０％
ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよびペニシリン／ストレプトマ
イシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中で正常ドナーの
末梢血を３日間培養し、１０^-7Ｍメトトレキセートで１
７時間同調させ、補足物不含ＲＰＭＩで２回洗浄する。
細胞を１０^-3Ｍチミジンとともに７時間インキュベーシ
ョンする。コルセミド（０.５μｇ／ｍｌ）とともに２
０分のインキュベーション後、細胞を中期で捕捉し、つ
づいて７５ｍＭ ＫＣｌ中３７℃で１５分間、低張溶解
を行う。ついで、細胞ペレットを遠心分離し、Carnoy’
sの固定液（メタノール：酢酸（３：１））中で固定す
る。

【００７４】１滴の懸濁液をスライドに添加し、その懸
濁液を風乾することにより中期スプレッドを調製する。
ブロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を含
む１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％ホ
ルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）に懸
濁させた１００ｎｇのプローブを添加することによりハ
イブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７０℃
の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキュベ
ーションし、予備加温した（３７℃）スライド上に置
く。それは予め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０
℃で変性させ、エタノール種で脱水し、４℃に冷却して
おいたものである。スライドを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドを５０％ホ
ルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄し、２
ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロトコ
ルに従って、スライドをＦＩＴＣ−アビジン（Oncor，G
aithersburg，ＭＤ）とともにインキュベーションする
ことによりハイブリダイゼーションプローブを検出す
る。封入剤に懸濁させたヨウ化プロプリディウムで染色
体を対比染色する。スライドをLeitz ORTHOPLAN ２−エ
ピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、Imagenetics Computer
およびMacIntoshプリンターを用いて５つのコンピュー
ター映像を得る。

【００７５】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
ると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデ
ータと相関させることができる。かかるデータは、例え
ば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Joh
ns Hopkins University Welch Medical Libraryからオ
ンラインで利用可能）に見られる。ついで、同じ染色体
領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関連を連関分
析（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）を介して同定
する。感染した個体と感染していない個体間のｃＤＮＡ
またはゲノム配列の相違を決定することが必要である。
感染した個体の一部または全部において変異が観察され
るが、正常な個体においては変異が観察されない場合に
は、その変異がその疾患の病因である可能性がある。最
新の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング分解法
では、疾患に関連した染色体領域と正確に位置決めされ
るｃＤＮＡは、１メガ塩基のマッピング分解能および２
０ｋｂ当たり１遺伝子と仮定して５０ないし５００個の
潜在的病因遺伝子のうちの１つとすることができる。

【００７６】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、細胞および組織中のヒトＦＩＮ−１タン
パク質レベルを検出するための診断アッセイに関する。
かかるアッセイは定量的または定性的であってもよい。
かくして、例えば、正常対照組織試料と比較してヒトＦ
ＩＮ−１タンパク質の過剰発現を検出するための本発明
の診断アッセイを用いて、ウイルス性感染または腫瘍の
存在を検出することができる。宿主由来の試料中の本発
明のヒトＦＩＮ−１タンパク質のごときタンパク質のレ
ベルを決定するのに用いることのできるアッセイ法は当
業者によく知られている。かかるアッセイ法は、ラジオ
イムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロッ
ト分析および酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩ
ＳＡ）を包含する。これらのうち、ＥＬＩＳＡが好まし
いことが多い。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にヒトＦＩ
Ｎ−１に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体
を調製することからなる。加えて、一般に、モノクロー
ナル抗体に結合するレポーター抗体を調製する。レポー
ター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または酵素試薬のご
とき検出可能試薬に結合する。本明細書の実施例では、
ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ酵素に結合して
いる。

【００７７】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
取り出し、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、
例えば、ポリスチレン皿上でインキュベーションする。
ついで、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質
とともにインキュベーションすることにより、皿上の遊
離タンパク質結合部位を被覆する。ついで、モノクロー
ナル抗体を皿中でインキュベーションし、その間にモノ
クローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合しているヒト
ＦＩＮ−１タンパク質に結合する。未結合モノクローナ
ル抗体をバッファーで洗い流す。ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体を皿中に入
れ、レポーター抗体とヒトＦＩＮ−１に結合しているモ
ノクローナル抗体との結合を生じさせる。ついで、未結
合レポーター抗体を洗い流す。ついで、発色基質を含
め、ペルオキシダーゼ活性のための試薬を皿に添加す
る。１次抗体および２次抗体を介してヒトＦＩＮ−１に
結合し、固定されているペルオキシダーゼは、着色反応
生成物を生成する。所定の時間に発色した量は試料中に
あるヒトＦＩＮ−１タンパク質量を示す。典型的には、
標準曲線と比較することにより定量的結果が得られる。
競合アッセイはまた、固体支持体に結合するＦＩＮ−１
に特異的な抗体、標識したヒトＦＩＮ−１および宿主由
来の試料を、固体支持体上を通すことで用いられる。固
体支持体に結合した標識の検出量を試料中のヒトＦＩＮ
−１量と相関させることができる。

【００７８】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、ま
たはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、そ
れらに対する抗体を製造するための免疫原として使用す
ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体であってよい。本発明
は、キメラ、単鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂフラ
グメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包
含する。当該分野で知られた種々の操作をかかる抗体お
よびフラグメントの製造に用いてもよい。本発明の配列
に対応するポリペプチドに拮抗して生成される抗体は、
当業者に周知の種々の方法により得ることができる。例
えば、一の具体例において、ポリペプチドを動物、好ま
しくはヒト以外の動物に直接注射する。そのようにして
得られた抗体はポリペプチド自体と結合する。この具体
例において、ポリペプチドのフラグメントだけをコード
する配列であっても、完全に無傷のポリペプチドに結合
する抗体を得るのに用いることができる。ついで、かか
る抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織からその
ポリペプチドを単離することができる。

【００７９】モノクローナル抗体を調製する場合、連続
細胞培養系により産生される抗体を提供するいずれの方
法も用いることができる。例えば、ハイブリドーマ法
（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature，256：495-497
（1975））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら、Immunology Today，4：72（1983））
およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、Monoclonal
Antibodies and CancerTherapy，７７-９６頁、Alan
R.Liss,Inc,（1985））が挙げられる。さらに、単鎖抗
体の製造について記載されている方法（米国特許第４,
９４６,７７８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド生成物に対する単鎖抗体を製造することができ
る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳
動物を含む他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。

【００８０】アフィニティークロマトグラフィーにより
単離および／または精製する場合、前記した抗体を用い
て、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定
してもよく、あるいは抗体を固体支持体に結合させるこ
とにより本発明のポリペプチドを精製してもよい。ま
た、ヒトＦＩＮ−１に対する抗体を用いて、とりわけ、
ウイルス性感染および癌、特に充実性腫瘍に付随する癌
を阻害することができる。

【００８１】結合分子およびアッセイ また、ヒトＦＩＮ−１をこれに相互作用するタンパク質
を単離するために使用することができる；この相互作用
は阻害のための標的となり得る。ヒトＦＩＮ−１と他の
因子の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤
は、ヒトＦＩＮ−１活性の調節のための医薬品の開発に
用いることができる。かくして、本発明は、ヒトＦＩＮ
−１に結合する分子の同定方法も提供する。分子をヒト
ＦＩＮ−１に結合させるタンパク質をコードする遺伝子
は、当業者に知られた多くの方法、例えば、リガンドパ
ニング（panning）、共同免疫沈降法および酵母２−ハ
イブリッドシステムにより、同定することができる。か
かる方法は多くの実験室用マニュアル、例えば、Coliga
nら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY １，第５章
（１９９１）に記載されている。

【００８２】例えば、酵母２−ハイブリッドシステム
が、転写活性化因子の活性を復元するのに用いる、イン
ビボでの第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質
との間の相互作用を検出するための方法を提供する。こ
の方法は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されて
おり；試薬はClontechおよびStratageneから市販されて
いる。簡単には、ヒトＦＩＮ−１ ｃＤＮＡをＧａｌ４
転写因子ＤＮＡ結合領域に融合させ、酵母細胞中で発現
させる。問題の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリー
メンバーをＧａｌ４のトランス活性化領域に融合させ
る。ヒトＦＩＮ−１と相互作用可能なタンパク質を発現
するｃＤＮＡクローンは、Ｇａｌ４活性の復元およびＧ
ａｌ４−ｌａｃＺなどのレポーター遺伝子の発現のトラ
ンス活性化をもたらす。

【００８３】別法は、組換えヒトＦＩＮ−１を用いてラ
ムダgt１１、ラムダＺＡＰ（Stratagene）または同等の
ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることか
らなる。組換えヒトＦＩＮ−１タンパク質またはそのフ
ラグメントをＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴなどの小さ
なペプチドタグに融合させる。ペプチドタグは心筋クレ
アチンキナーゼなどのキナーゼについての都合のよいリ
ン酸化部位を有しており、あるいはそれらをビオチン化
できる。組換えヒトＦＩＮ−１を³²［Ｐ］または標識さ
れていないＰを用いてリン酸化し、ストレプトアビジン
またはそのタグに対する抗体で検出することができる。
ラムダgt１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーを問題の細胞か
ら作成し、組換えヒトＦＩＮ−１とともにインキュベー
トし、洗浄し、次いで、ヒトＦＩＮ−１と相互作用する
ｃＤＮＡクローンを単離する。かかる方法は当業者に慣
用的なものである。例えば、Sambrookらを参照のこと。

【００８４】もう一つの方法は、哺乳動物発現ライブラ
リーをスクリーニングすることである。この方法におい
ては、ｃＤＮＡを哺乳動物プロモーターとポリアデニル
化部位の間のベクターにクローンし、ＣＯＳまたは２９
３細胞にて一時的にトランスフェクションされる。４８
時間後、結合タンパク質を、固定かつ透析（permabiliz
ed）した細胞を標識したヒトＦＩＮ−１と一緒にインキ
ュベーションすることで検出する。好ましい具体例にお
いては、ヒトＦＩＮ−１をヨウ素化し、結合したヒトＦ
ＩＮ−１の検出をオートラジオグラフィーを介して検出
する。Simsら、Science，241：585-589（1988）およびM
cMahanら、EMBO J.，10：2821-2832（1991）を参照のこ
と。このように、問題の結合タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡを含むｃＤＮＡプールを選択し、各プールをさら
に分割し、つづいて一時的なトランスフェクション、結
合およびオートラジオグラフィーのサイクルにより問題
のｃＤＮＡを単離することができる。別法として、完全
なｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物細胞にトランスフェ
クションし、プレートに結合したヒトＦＩＮ−１を含む
皿上で細胞をパニングすることによって問題のｃＤＮＡ
を単離できる。洗浄後に結合している細胞を溶解させ、
プラスミドＤＮＡを単離し、細菌中で増幅し、単一のｃ
ＤＮＡクローンが得られるまでトランスフェクションお
よびパニングのサイクルを繰り返す。Seedら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA，84：3365（1987） およびAruffo
ら、EMBO J.，6：3313（1987）を参照のこと。結合タン
パク質が分泌される場合、結合または中和アッセイが一
時的にトランスフェクションされた細胞からの上清をア
ッセイするために確立されると、類似するプール方法に
よりそのｃＤＮＡを得ることができる。上清をスクリー
ニングする一般的方法は、Wongら、Science，228：810-
815（1985）に開示されている。

【００８５】もう一つの別法は、細胞からのヒトＦＩＮ
−１と直接相互作用するタンパク質を単離することであ
る。ヒトＦＩＮ−１のＧＳＴまたは小さいペプチドタグ
との融合タンパク質を製造し、ビーズ上に固定化する。
問題の細胞からの生合成的に標識された、または標識さ
れていないタンパク質抽出物を調製し、ビーズとインキ
ュベートし、バッファーで洗浄する。ヒトＦＩＮ−１と
相互作用するタンパク質はビーズから特異的に溶出し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析する。結合相手の一次ア
ミノ酸配列データをマイクロシークエンシングによって
得る。所望により、細胞性タンパク質のチロシンリン酸
化などの機能的応答を誘発する物質で細胞を処理でき
る。かかる物質の一例は、成長因子またはインターロイ
キン−２などのサイトカインである。もう一つの別の方
法はイムノアフィニティー精製法である。組換えヒトＦ
ＩＮ−１を標識または標識していない細胞抽出物とイン
キュベートし、抗ヒトＦＩＮ−１抗体で免疫沈降させ
る。その免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースで回
収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。標識されていない
タンパク質をビオチン化により標識化し、ストレプトア
ビジンを含むＳＤＳゲル上で検出する。結合相手のタン
パク質をマイクロシークエンシングにより解析する。さ
らに、当業者に知られている標準的生化学的精製工程を
マイクロシークエンシングの前に使用してもよい。

【００８６】さらにもう一つの別法は、ペプチドライブ
ラリーを結合相手についてスクリーニングすることに関
する。組換えタグ付きまたは標識されたヒトＦＩＮ−１
を用いて、ヒトＦＩＮ−１と相互作用するペプチドまた
はホスホペプチドライブラリーからペプチドを選択す
る。そのペプチドを配列決定し、相互作用するタンパク
質にて見いだされるコンセンサスペプチド配列を同定す
る。

【００８７】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明のヒトＦＩＮ−１は、このタンパク質の活性化を
亢進（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する
化合物をスクリーニングする方法にて用いてもよい。潜
在的キナーゼアンタゴニストとして、例えば、抗体、ま
たはある場合には、第２メッセンジャー応答を誘起しな
いが、該タンパク質に結合する、すなわち、該タンパク
質の活性を妨げる、オリゴヌクレオチドが挙げられる。
潜在的アンタゴニストはまた、ヒトＦＩＮ−１に密接に
関連付けられるタンパク質、すなわち、生物学的活性を
失っている、タンパク質のフラグメントを包含する。

【００８８】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（いずれの
方法もポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合をベ
ースとしている）により遺伝子発現を制御することがで
きる。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コーディン
グ部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしてお
り、約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（３重ヘリックス − Lee
ら、Nucl.Acids Res.，6：3073（1979）；Cooneyら、Sc
ience，241：456（1988）；およびDervanら、Science，
251：1360（1991）を参照のこと）、それによりヒトＦ
ＩＮ−１の転写および製造を阻害する。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにてｍＲＮＡとハ
イブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子のそのタンパク質への
翻訳を遮断する（アンチセンス − Okano、J.Neuroche
m.，56：560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Anti
sense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boc
a Raton，ＦＬ（1988）を参照のこと）。前記したオリ
ゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮ
Ａがインビボにて発現されてＦＩＮ−１ポリペプチドの
生成を阻害するように、細胞にデリバリーすることがで
きる。

【００８９】もう一つの潜在的アンタゴニストは、リガ
ンドに近寄り難いようにし、正常な生物学的活性が妨げ
られる、該タンパク質に結合する小さな分子である。小
さな分子の例として、小さなペプチドまたはペプチド様
分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。
潜在的アンタゴニストはまた、可溶形のヒトＦＩＮ−
１、例えばリガンドに結合し、該リガンドがヒトＦＩＮ
−１と相互作用することを妨げる、タンパク質のフラグ
メントを包含する。一方でタンパク質活性を刺激し、他
方でＦＩＮ−１の機能を阻害しうる化合物および薬剤を
見出すことが望ましい。ヒトＦＩＮ−１についてのアン
タゴニストは、とりわけ、ウイルス性感染および腫瘍に
対する種々の治療および予防目的に用いられる。

【００９０】加えて、本発明は、過剰なヒトＦＩＮ−１
活性に関係した異常な状態を治療する方法であって、前
記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容され
る担体と共に、該タンパク質の活性化を阻害するか、ま
たは第２シグナルを阻害し、それにより異常な状態を緩
和するのに効果的な量にて対象に投与することからなる
方法を提供する。一般に、ヒトＦＩＮ−１についてのア
ゴニストは、プログラムされた細胞死を妨げることが望
ましい疾患または障害に対する治療および予防目的に用
いられる。本発明はまた、ヒトＦＩＮ−１およびその活
性の過小発現に関連する異常な状態を治療する方法であ
って、該タンパク質を活性化する化合物（アゴニスト）
の治療上有効量を対象に投与し、その異常な状態を緩和
することからなる方法を提供する。

【００９１】組成物およびキット 可溶形のヒトＦＩＮ−１、およびかかるタンパク質を活
性化または阻害する化合物を、適当な医薬担体と組み合
わせて用いることができる。かかる組成物は、医薬上有
効量のポリペプチドまたは化合物と、医薬上許容される
担体または賦形剤とからなる。かかる担体は、食塩水、
緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタ
ノールおよびその組み合わせを包含するが、これに限定
されるものではない。処方は投与方法に適していなけれ
ばならない。当業者であれば、投与方法による適当な担
体を慣用的に選択することができる。本発明はさらに、
１またはそれ以上の前記した本発明の組成物を充填した
１またはそれ以上の容器からなる医薬パックおよびキッ
トに関する。

【００９２】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物などの他の化合物と組み合わせて用いて
もよい。医薬組成物は、例えば、とりわけ、局所的、経
口的、経肛門的、経膣的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮
下、経鼻内または皮内経路による投与を含め、効果的か
つ都合のよい方法で投与してもよい。一般に、組成物
を、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与する。
大抵の場合、一日に付き約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない
量で組成物が投与されるであろう。好ましくは、大抵の
場合、投与量は、一日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重ない
し約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適用量は、症状、重篤
度、投与経路、合併症などを考慮して、各治療様式につ
いての標準的方法および症状により決定されることが理
解されよう。

【００９３】遺伝子治療 ヒトＦＩＮ−１ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリ
ペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストを、し
ばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式において、か
かるポリペプチドを発現させることにより、本発明にて
使用することができる。かくして、例えば、患者からの
細胞を、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドで
操作し、ポリペプチドをエクスビボでコードしてもよ
い。次いで、その操作された細胞をそのポリペプチドで
治療すべき患者に与えてもよい。この具体例において、
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含
むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により、細
胞をエクスビボで操作してもよい。かかる方法は当該分
野においてよく知られており、本発明におけるそれらの
使用は本明細書の教示から明らかである。

【００９４】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、本発明のポリヌク
レオチドを、上記のように、複製欠損レトロウイルスベ
クター中での発現のために操作してもよい。ついで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラス
ミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導
入し、そのパッケージング細胞が問題の遺伝子を含有す
る感染性ウイルス粒子を産生するようにしてもよい。こ
れらの産生細胞を、インビボでの細胞の操作およびイン
ビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与しても
よい。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明ら
かである。

【００９５】本明細書において前記したレトロウイルス
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、ギボンサル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、ミエロ増殖性肉腫ウイルス（Myel
oproliferative Sarcoma Virus）および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。好ましい
具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは
モロニーネズミ白血病ウイルス由来のものである。かか
るベクターは、ポリペプチド発現のための１個またはそ
れ以上のプロモーターを含む。用いることのできる適当
なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プ
ロモーター；およびMillerら、Biotechniques，7：980-
990（1989）に記載されたヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーターを包含するが、これに限定され
ない。ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−
アクチンプロモーターを包含するが、これに限定されな
い真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーターもまた
用いることができる。使用できる付加的なウイルス性プ
ロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パーボウ
イルスプロモーターを包含するが、これらに限定されな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる
教示から当業者に明らかであろう。

【００９６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろう。
使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス主要
後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのごと
きウイルス性チミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルス性ＬＴＲ（本明細書で前記した修飾レトロウイル
スＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これ
らに限定されない。プロモーターは、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する元来のプロモーターであって
もよい。レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパ
ッケージング細胞系に形質導入し、産生細胞系を形成す
る。トランスフェクションされてもよいパッケージング
細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−Ａ
Ｍ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ
２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Therap
y，1：5-14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含す
るが、これらに限定されない。当該分野で知られている
いずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞中
に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポレ
ーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ₄沈殿を包含す
るが、これらに限定されない。別法において、レトロウ
イルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、あ
るいは脂質と結合させ、ついで、宿主に投与してもよ
い。

【００９７】産生細胞系は、ポリペプチドをコードする
核酸配列（複数でも可）を含む、感染性レトロウイルス
ベクター粒子を産生するであろう。かかるレトロウイル
スベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボの
いずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよい。形質
導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配
列（複数でも可）を発現するであろう。形質導入されう
る真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならび
に造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチ
ノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。

【００９８】

【実施例】本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明す
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示は本
発明の特定の態様を説明するものであるが、開示した発
明の範囲を限定または制限するものではない。本明細書
中の特定の用語は、上記の定義において説明されてい
る。すべての実施例は標準的方法を用いて行われ、特記
しないかぎり、それらの方法は当業者によく知られてお
り、通常的なものである。以下の実施例の通常的方法
は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュアルに記
載されているようにして行うことができる。

【００９９】実施例１ ＦＩＮ−１の単離および同定 ＦＩＮ−１に特異的なオリゴヌクレオチドをＥＳＴ多重
配列に由来するヌクレオチド配列コンティグ（contig）
に基づいて設計した。これらのオリゴヌクレオチドを用
いて、ＰＭＡ処理ＨＬ６０細胞のＲＮＡよりＦＩＮ−１
ＲＴ−ＰＣＲ生成物（図１ないし４、配列番号：１の
ＦＩＮ−１ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２８４−６２
０を含む）を作り、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を用いてヒト骨
髄およびアネルギー性Ｔ細胞ライブラリーをスクリーニ
ングした。

【０１００】９個の別個のクローンの配列により、いく
つかの異なるスプライス体が生成されたことが示され
た。図１ないし４はこれらのクローンの一つのｃＤＮＡ
配列（配列番号：１）を提供し、これは2個の致死エフ
ェクタードメイン（ＤＥＤ）およびＦＬＩＣＥおよびＭ
ｃｈ−４のドメインに類似のシステインプロテアーゼド
メインを有する５５ｋＤのアミノ酸４８０個のタンパク
質をコードする（図１ないし４、５および８参照）。Ｆ
ＡＤＤ、ＦＬＩＣＥ、Ｍｃｈ４（ＦＬＩＣＥ相同体）お
よびＰｅａ−１５のドメインを有するこれらの新規ＤＥ
Ｄの整列化により、ＦＩＮ−１の1番目および２番めの
ＤＥＤが１７残基のうち各々１４および１５で、ＤＥＤ
コンセンサス配列に相同性を呈することが示された。こ
れはファミリーの他のメンバーのコンセサスに対する類
似性のレベルにほぼ同等である（図５）。配列番号：２
のアミノ酸１−７３内に位置するＤＥＤ１はＦＬＩＣＥ
のＤＥＤ１（図６）に対して同一性３０％、類似性５６
％である。ＦＩＮ−１ ＤＥＤ２は配列番号：２のアミ
ノ酸９０−１６９内に位置し、ＦＬＩＣＥ ＤＥＤ２
（図７）に対して同一性２７％、類似性６０％である。
システイン・プロテアーゼ・ドメインはアミノ酸１７０
−４８０に位置する。このシステイン・プロテアーゼ・
ドメインは保存ＱＡＣ（Ｒ、Ｑ）Ｇ（配列番号：１５）
活性部位モチーフ（図８の下線部）を含有せず、これは
ＩＣＥ／ｃｅｄ−３ファミリーの優勢ネガティヴ相同体
であり得ることを示唆している。ＦＩＮ−１のシステイ
ン・プロテアーゼ・ドメインはＦＬＩＣＥのシステイン
・プロテアーゼ・ドメイン（図９）に対して同一性２８
％、類似性５１％である。

【０１０１】実施例２ リガンドまたはアンタゴニスト
の同定 本明細書に記載する技術を用いて、前記のＦＩＮ−１タ
ンパク質を望ましい組換え体に生成し、以下のリガンド
またはアンタゴニストのスクリーニングに使用する。Ｆ
ＩＮ−１タンパク質を用いて、化合物バンク、複合体液
（complex biological fluids）、コンピナトリアル有
機およびペプチドライブラリー等をスクリーニングに
し、活性化リガンドまたはアンタゴニストを同定する。
例えば、ＦＩＮ−１を用いて（ａ）ＦＩＮ−１に対する
結合タンパク質であると推定される自然発生化合物；
（ｂ）未だ未発見の哺乳動物のカウンターパートであり
得る、哺乳動物以外の生物学的に活性なペプチド；
（ｃ）天然に見出されないが、ＦＩＮ−１で未知天然リ
ガンドを活性化する、または相互作用すると考えられる
化合物等をスクリーニングする。

【０１０２】同様に、ＦＩＮ−１でヒト、およびその他
の哺乳動物、種例えばブタの組織抽出物をスクリーニン
グする。具体的には、かかる組織は、肺、肝臓、腸、心
臓、腎臓、副腎、虚血脳、血漿、尿および胎盤を包含す
る。最初の抽出工程は、酸またはエタノール沈殿による
バルクタンパク質の除去に焦点がおかれ、ＦＩＮ−１の
既知天然リガンドの高収率の原因となるペプチドおよび
小型分子の分離を指向する。続く穏やかな抽出工程で、
タンパク質を同定する。これらの組織バンクの形成にお
いて用いる抽出技術は当該分野において公知である。

【０１０３】実施例３ 遺伝子治療のためのヒトＦＩＮ
−１の発現 皮膚生検により、対象より繊維芽細胞を得る。得られた
組織を組織培養培地に置き、小片に分割する。組織小塊
を組織培養フラスコの湿った表面に置く；約１０片を各
フラスコ内に置く。フラスコを上下逆にし、きつく閉め
て室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを
逆にし；組織小塊をフラスコの底に固着したままにし；
新鮮培地(例えば１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよびスト
レプトマイシン含有Ham's Ｆ１２培地)を加える。次い
で組織を３７℃で約1週間インキュベートする。この
時、新鮮培地を加え、引き続いて数日毎に交換する。さ
らに2週間の培養の後、繊維芽細胞の単層を生じる。こ
の単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコ内に剥
ぎ落とす。

【０１０４】発現すべきフラグメントをクローニングす
るために、モロニーネズミ肉腫ウイルスの末端の長い繰
り返しに隣接する、遺伝子治療のためのベクター（例え
ばｐＭＶ−７[Kirschmeier,P.T.ら、DNA 7:219-225（19
88）]）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化す
る。消化したベクターをウシ消化管ホスファターゼで処
理し、自己ライゲーションを防ぐ。脱リン酸化した線状
ベクターを寒天ゲル上で分画化し、例えばガラスビーズ
を用いて精製する。活性ＦＩＮ−１を発現できるＦＩＮ
−１を単離し、各々５’および３’末端配列に対応する
ＰＣＲプライマーを用いて増幅する。ベクターにクロー
ニングするために、必要な場合、フラグメントの末端を
修飾する。例えば５’末端の張り出しをＤＮＡポリメラ
ーゼで処理し、平滑末端を作ることができる。３’末端
の張り出しはＳ１ヌクレアーゼを用いて除去できる。Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを用いてリンカーをライゲーション
し、平滑末端化できる。

【０１０５】モロニーネズミ白血病ウイルス線状骨格お
よびＦＩＮ−１フラグメントの同量を混合し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させる。ライゲーション用混
合物を用いてイー・コリ（E.coli）および細菌を形質転
換し、次いでカナマイシン含有寒天にプレートする。カ
ナマイシン表現型及び制限分析により、ベクターが遺伝
子を適切に挿入したことを確認する。パッケージング細
胞（amphotropicｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッ
ケージング細胞）を組織培養で成長させ、１０％ 仔ウ
シ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン
含有Dulbecco's Modified Eagles Medium（ＤＭＥＭ）
中で全面成長させる。標準法により、ＦＩＮ−１遺伝子
を含有するベクターをパッケージング細胞に導入する。
ＦＩＮ−１遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子をパッ
ケージング細胞から回収し、これを産生細胞と称する。

【０１０６】新鮮培地を産生細胞に加え、適当なインキ
ュベーション時間の後、全面成長した産生細胞のプレー
トから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含有する
培地をＭＩＬＬＩＰＯＲＥフィルター（ベッドフォー
ド、メリーランド州）を通してろ過し、剥離した産生細
胞を除去する。次いで、ろ過した培地を用いて繊維芽細
胞を感染させる。繊維芽細胞のサブ全面成長プレートか
ら培地を除去し、迅速にろ過した培地と置き換える。培
地中ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（アルドリッヒ・ケミカル・コ
ーポレーション、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）
をインキュベートし、形質導入を促す。適当にインキュ
ベーションした後、培地を除去し、新鮮な培地と置き換
える。ウイルスの力価が高い場合、実際に全ての繊維芽
細胞が感染しており、次に選別は不要である。力価が低
い場合、次にネオまたはヒズのごとき選別マーカーを有
するレトロウイルスベクターを使用してさらに実施する
ために形質導入した細胞を選別する必要がある。

【０１０７】次いで操作した繊維芽細胞を、単独でまた
はＣＹＴＯＤＥＸ３ビーズのごときマイクロキャリヤー
ビーズ上で全面成長させた後、ラットに注射する。注射
した繊維芽細胞はＦＩＮ−１生成物を生成し、該タンパ
ク質の生物学的作用を宿主に付与する。本発明は前記の
記載および実施例に記載する意外に実施できることは明
白である。前記の教示に鑑みて、非常に多くの本発明の
修飾および変更が可能であり、本明細書に添付した請求
の範囲の範囲内である。

【０１０８】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人：エメリー，ジョン・ジー キクリー，クリスティン・ケイ （ｉｉ）発明の名称： 哺乳動物のＦＩＮ−１核酸およ
び蛋白質配列およびその使用 （ｉｉｉ）配列の数：１５ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−２７９９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release ＃１．０、Ver
sion ＃１．３０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：シェリック、パトリシア・エイ （Ｂ）登録番号：３３,７７７ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００３４ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５０３１ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０ ４０９０

【０１０９】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１８８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）ネーム／キー：ＣＤＳ （Ｂ）ロケーション：４２２．．１８６１ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： CCTCACCGAC GAGTCTCAAC TAAAAGGGAC TCCCGGAGCT AGGGGTGGGG ACTCGGCCTC 60 ACACAGTGAG TGCCGGCTAT TGGACTTTTG TCCAGTGACA GCTGAGACAA CAAGGACCAC 120 GGGAGGAGGT GTAGGAGAGA AGCGCCGCGA ACAGCGATCG CCCAGCACCA AGTCCGCTTC 180 CAGGCTTTCG GTTTCTTTGC CTCCATCTTG GGTGCGCCTT CCCGGCGTCT AGGGGAGCGA 240 AGGCTGAGGT GGCAGCGGCA GGAGAGTCCG GCCGCGACAG GACGAACTCC CCCACTGGAA 300 AGGATTCTGA AAGAAATGAA GTCAGCCCTC AGAAATGAAG TTGACTGCCT GCTGGCTTTC 360 TGTTGACTGG CCCGGAGCTG TACTGCAAGA CCCTTGTGAG CTTCCCTAGT CTAAGAGTAG 420 G ATG TCT GCT GAA GTC ATC CAT CAG GTT GAA GAA GCA CTT GAT ACA 466 Met Ser Ala Glu Val Ile His Gln Val Glu Glu Ala Leu Asp Thr 1 5 10 15 GAT GAG AAG GAG ATG CTG CTC TTT TTG TGC CGG GAT GTT GCT ATA GAT 514 Asp Glu Lys Glu Met Leu Leu Phe Leu Cys Arg Asp Val Ala Ile Asp 20 25 30 GTG GTT CCA CCT AAT GTC AGG GAC CTT CTG GAT ATT TTA CGG GAA AGA 562 Val Val Pro Pro Asn Val Arg Asp Leu Leu Asp Ile Leu Arg Glu Arg 35 40 45 GGT AAG CTG TCT GTC GGG GAC TTG GCT GAA CTG CTC TAC AGA GTG AGG 610 Gly Lys Leu Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Leu Leu Tyr Arg Val Arg 50 55 60 CGA TTT GAC CTG CTC AAA CGT ATC TTG AAG ATG GAC AGA AAA GCT GTG 658 Arg Phe Asp Leu Leu Lys Arg Ile Leu Lys Met Asp Arg Lys Ala Val 65 70 75 GAG ACC CAC CTG CTC AGG AAC CCT CAC CTT GTT TCG GAC TAT AGA GTG 706 Glu Thr His Leu Leu Arg Asn Pro His Leu Val Ser Asp Tyr Arg Val 80 85 90 95 CTG ATG GCA GAG ATT GGT GAG GAT TTG GAT AAA TCT GAT GTG TCC TCA 754 Leu Met Ala Glu Ile Gly Glu Asp Leu Asp Lys Ser Asp Val Ser Ser 100 105 110 TTA ATT TTC CTC ATG AAG GAT TAC ATG GGC CGA GGC AAG ATA AGC AAG 802 Leu Ile Phe Leu Met Lys Asp Tyr Met Gly Arg Gly Lys Ile Ser Lys 115 120 125 GAG AAG AGT TTC TTG GAC CTT GTG GTT GAG TTG GAG AAA CTA AAT CTG 850 Glu Lys Ser Phe Leu Asp Leu Val Val Glu Leu Glu Lys Leu Asn Leu 130 135 140 GTT GCC CCA GAT CAA CTG GAT TTA TTA GAA AAA TGC CTA AAG AAC ATC 898 Val Ala Pro Asp Gln Leu Asp Leu Leu Glu Lys Cys Leu Lys Asn Ile 145 150 155 CAC AGA ATA GAC CTG AAG ACA AAA ATC CAG AAG TAC AAG CAG TCT GTT 946 His Arg Ile Asp Leu Lys Thr Lys Ile Gln Lys Tyr Lys Gln Ser Val 160 165 170 175 CAA GGA GCA GGG ACA AGT TAC AGG AAT GTT CTC CAA GCA GCA ATC CAA 994 Gln Gly Ala Gly Thr Ser Tyr Arg Asn Val Leu Gln Ala Ala Ile Gln 180 185 190 AAG AGT CTC AAG GAT CCT TCA AAT AAC TTC AGG CTC CAT AAT GGG AGA 1042 Lys Ser Leu Lys Asp Pro Ser Asn Asn Phe Arg Leu His Asn Gly Arg 195 200 205 AGT AAA GAA CAA AGA CTT AAG GAA CAG CTT GGC GCT CAA CAA GAA CCA 1090 Ser Lys Glu Gln Arg Leu Lys Glu Gln Leu Gly Ala Gln Gln Glu Pro 210 215 220 GTG AAG AAA TCC ATT CAG GAA TCA GAA GCT TTT TTG CCT CAG AGC ATA 1138 Val Lys Lys Ser Ile Gln Glu Ser Glu Ala Phe Leu Pro Gln Ser Ile 225 230 235 CCT GAA GAG AGA TAC AAG ATG AAG AGC AAG CCC CTA GGA ATC TGC CTG 1186 Pro Glu Glu Arg Tyr Lys Met Lys Ser Lys Pro Leu Gly Ile Cys Leu 240 245 250 255 ATA ATC GAT TGC ATT GGC AAT GAG ACA GAG CTT CTT CGA GAC ACC TTC 1234 Ile Ile Asp Cys Ile Gly Asn Glu Thr Glu Leu Leu Arg Asp Thr Phe 260 265 270 ACT TCC CTG GGC TAT GAA GTC CAG AAA TTC TTG CAT CTC AGT ATG CAT 1282 Thr Ser Leu Gly Tyr Glu Val Gln Lys Phe Leu His Leu Ser Met His 275 280 285 GGT ATA TCC CAG ATT CTT GGC CAA TTT GCC TGT ATG CCC GAG CAC CGA 1330 Gly Ile Ser Gln Ile Leu Gly Gln Phe Ala Cys Met Pro Glu His Arg 290 295 300 GAC TAC GAC AGC TTT GTG TGT GTC CTG GTG AGC CGA GGA GGC TCC CAG 1378 Asp Tyr Asp Ser Phe Val Cys Val Leu Val Ser Arg Gly Gly Ser Gln 305 310 315 AGT GTG TAT GGT GTG GAT CAG ACT CAC TCA GGG CTC CCC CTG CAT CAC 1426 Ser Val Tyr Gly Val Asp Gln Thr His Ser Gly Leu Pro Leu His His 320 325 330 335 ATC AGG AGG ATG TTC ATG GGA GAT TCA TGC CCT TAT CTA GCA GGG AAG 1474 Ile Arg Arg Met Phe Met Gly Asp Ser Cys Pro Tyr Leu Ala Gly Lys 340 345 350 CCA AAG ATG TTT TTT ATT CAG AAC TAT GTG GTG TCA GAG GGC CAG CTG 1522 Pro Lys Met Phe Phe Ile Gln Asn Tyr Val Val Ser Glu Gly Gln Leu 355 360 365 GAG GAC AGC AGC CTC TTG GAG GTG GAT GGG CCA GCG ATG AAG AAT GTG 1570 Glu Asp Ser Ser Leu Leu Glu Val Asp Gly Pro Ala Met Lys Asn Val 370 375 380 GAA TTC AAG GCT CAG AAG CGA GGG CTG TGC ACA GTT CAC CGA GAA GCT 1618 Glu Phe Lys Ala Gln Lys Arg Gly Leu Cys Thr Val His Arg Glu Ala 385 390 395 GAC TTC TTC TGG AGC CTG TGT ACT GCG GAC ATG TCC CTG CTG GAG CAG 1666 Asp Phe Phe Trp Ser Leu Cys Thr Ala Asp Met Ser Leu Leu Glu Gln 400 405 410 415 TCT CAC AGC TCA CCG TCC CTG TAC CTG CAG TGC CTC TCC CAG AAA CTG 1714 Ser His Ser Ser Pro Ser Leu Tyr Leu Gln Cys Leu Ser Gln Lys Leu 420 425 430 AGA CAA GAA AGA AAA CGC CCA CTC CTG GAT CTT CAC ATT GAA CTC AAT 1762 Arg Gln Glu Arg Lys Arg Pro Leu Leu Asp Leu His Ile Glu Leu Asn 435 440 445 GGC TAC ATG TAT GAT TGG AAC AGC AGA GTT TCT GCC AAG GAG AAA TAT 1810 Gly Tyr Met Tyr Asp Trp Asn Ser Arg Val Ser Ala Lys Glu Lys Tyr 450 455 460 TAT GTC TGG CTG CAG CAC ACT CTG AGA AAG AAA CTT ATC CTC TCC TAC 1858 Tyr Val Trp Leu Gln His Thr Leu Arg Lys Lys Leu Ile Leu Ser Tyr 465 470 475 ACA TAAGAAACCA AAAGGCTGGG CGTAGTGGCT CACACCTGTA ATCCCAGCAC 1911 Thr 480 TTTGGGAGGC CAAGGAGGGC AGATCACTTC AGGTCAGGAG TTCGAGACCA GCCTGGCCAA 1971 CATGGTAAAC GCTGTCCCTA GTAAAAATAC AAAAATTAGC TGGGTGTGGG TGTGGGTACC 2031 TGTATTCCCA GTTACTTGGG AGGCTGAGGT GGGAGGATCT TTTGAACCCA GGAGTTCAGG 2091 GTCATAGCAT GCTGTGATTG TGCCTACGAA TAGCCACTGC ATACCAACCT GGGCAATATA 2151 GCAAGATCCC ATCTCTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 2188

【０１１０】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Ser Ala Glu Val Ile His Gln Val Glu Glu Ala Leu Asp Thr Asp 1 5 10 15 Glu Lys Glu Met Leu Leu Phe Leu Cys Arg Asp Val Ala Ile Asp Val 20 25 30 Val Pro Pro Asn Val Arg Asp Leu Leu Asp Ile Leu Arg Glu Arg Gly 35 40 45 Lys Leu Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Leu Leu Tyr Arg Val Arg Arg 50 55 60 Phe Asp Leu Leu Lys Arg Ile Leu Lys Met Asp Arg Lys Ala Val Glu 65 70 75 80 Thr His Leu Leu Arg Asn Pro His Leu Val Ser Asp Tyr Arg Val Leu 85 90 95 Met Ala Glu Ile Gly Glu Asp Leu Asp Lys Ser Asp Val Ser Ser Leu 100 105 110 Ile Phe Leu Met Lys Asp Tyr Met Gly Arg Gly Lys Ile Ser Lys Glu 115 120 125 Lys Ser Phe Leu Asp Leu Val Val Glu Leu Glu Lys Leu Asn Leu Val 130 135 140 Ala Pro Asp Gln Leu Asp Leu Leu Glu Lys Cys Leu Lys Asn Ile His 145 150 155 160 Arg Ile Asp Leu Lys Thr Lys Ile Gln Lys Tyr Lys Gln Ser Val Gln 165 170 175 Gly Ala Gly Thr Ser Tyr Arg Asn Val Leu Gln Ala Ala Ile Gln Lys 180 185 190 Ser Leu Lys Asp Pro Ser Asn Asn Phe Arg Leu His Asn Gly Arg Ser 195 200 205 Lys Glu Gln Arg Leu Lys Glu Gln Leu Gly Ala Gln Gln Glu Pro Val 210 215 220 Lys Lys Ser Ile Gln Glu Ser Glu Ala Phe Leu Pro Gln Ser Ile Pro 225 230 235 240 Glu Glu Arg Tyr Lys Met Lys Ser Lys Pro Leu Gly Ile Cys Leu Ile 245 250 255 Ile Asp Cys Ile Gly Asn Glu Thr Glu Leu Leu Arg Asp Thr Phe Thr 260 265 270 Ser Leu Gly Tyr Glu Val Gln Lys Phe Leu His Leu Ser Met His Gly 275 280 285 Ile Ser Gln Ile Leu Gly Gln Phe Ala Cys Met Pro Glu His Arg Asp 290 295 300 Tyr Asp Ser Phe Val Cys Val Leu Val Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ser 305 310 315 320 Val Tyr Gly Val Asp Gln Thr His Ser Gly Leu Pro Leu His His Ile 325 330 335 Arg Arg Met Phe Met Gly Asp Ser Cys Pro Tyr Leu Ala Gly Lys Pro 340 345 350 Lys Met Phe Phe Ile Gln Asn Tyr Val Val Ser Glu Gly Gln Leu Glu 355 360 365 Asp Ser Ser Leu Leu Glu Val Asp Gly Pro Ala Met Lys Asn Val Glu 370 375 380 Phe Lys Ala Gln Lys Arg Gly Leu Cys Thr Val His Arg Glu Ala Asp 385 390 395 400 Phe Phe Trp Ser Leu Cys Thr Ala Asp Met Ser Leu Leu Glu Gln Ser 405 410 415 His Ser Ser Pro Ser Leu Tyr Leu Gln Cys Leu Ser Gln Lys Leu Arg 420 425 430 Gln Glu Arg Lys Arg Pro Leu Leu Asp Leu His Ile Glu Leu Asn Gly 435 440 445 Tyr Met Tyr Asp Trp Asn Ser Arg Val Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Tyr 450 455 460 Val Trp Leu Gln His Thr Leu Arg Lys Lys Leu Ile Leu Ser Tyr Thr 465 470 475 480

【０１１１】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： Met Glu Asn Asn Glu Thr Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Phe 1 5 10 15 Glu Val Lys Thr Ile His Gly Ser Lys Ser Met Asp Ser Gly Ile Tyr 20 25 30 Leu Asp Ser Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Val Cys Ile 35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Pro Arg 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Lys Leu Arg Glu Thr Phe Met Ala 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile 85 90 95 Val Glu Leu Met Lys Asn Ala Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser 100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Ile Leu Ser His Gly Asp Glu Gly Val Ile Phe 115 120 125 Gly Thr Asp Gly Pro Ile Asp Leu Lys Lys Leu Thr Ser Tyr Phe Arg 130 135 140 Gly Asp Tyr Cys Arg Ser Leu Ile Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Asp Ser 165 170 175 Gly Thr Glu Asp Asp Met Thr Cys Gln Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp 180 185 190 Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn 195 200 205 Pro Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ser Met Leu Lys 210 215 220 Leu Tyr Ala His Lys Leu Glu Phe Met His Ile Leu Thr Arg Val Asn 225 230 235 240 Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser Leu Asp Ser Thr Phe 245 250 255 His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu 260 265 270 Leu Tyr Phe Tyr His 275

【０１１２】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： Met Ala Asp Asp Gln Gly Cys Ile Glu Glu Gln Gly Val Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Asn Glu Asp Ser Val Asp Ala Lys Pro Asp Arg Ser Ser Phe Val 20 25 30 Pro Ser Leu Phe Ser Lys Lys Lys Lys Asn Val Thr Met Arg Ser Ile 35 40 45 Lys Thr Thr Arg Asp Arg Val Pro Thr Tyr Gln Tyr Asn Met Asn Phe 50 55 60 Glu Lys Leu Gly Lys Cys Ile Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys 65 70 75 80 Val Thr Gly Met Gly Val Arg Asn Gly Thr Asp Lys Asp Ala Glu Ala 85 90 95 Leu Phe Lys Cys Phe Arg Ser Leu Gly Phe Asp Val Ile Val Tyr Asn 100 105 110 Asp Cys Ser Cys Ala Lys Met Gln Asp Leu Leu Lys Lys Ala Ser Glu 115 120 125 Glu Asp His Thr Asn Ala Ala Cys Phe Ala Cys Ile Leu Leu Ser His 130 135 140 Gly Glu Glu Asn Val Ile Tyr Gly Lys Asp Gly Val Thr Pro Ile Lys 145 150 155 160 Asp Leu Thr Ala His Phe Arg Gly Asp Arg Cys Lys Thr Leu Leu Glu 165 170 175 Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp 180 185 190 Asp Ala Ile Gln Ala Asp Ser Gly Pro Ile Asn Asp Thr Asp Ala Asn 195 200 205 Pro Arg Tyr Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Phe Ala Tyr Ser 210 215 220 Thr Val Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Ser Pro Gly Arg Gly Ser Trp 225 230 235 240 Phe Val Gln Ala Leu Cys Ser Ile Leu Glu Glu His Gly Lys Asp Leu 245 250 255 Glu Ile Met Gln Ile Leu Thr Arg Val Asn Asp Arg Val Ala Arg His 260 265 270 Phe Glu Ser Gln Ser Asp Asp Pro His Phe His Glu Lys Lys Gln Ile 275 280 285 Pro Cys Val Val Ser Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Ser Gln 290 295 300

【０１１３】（２） 配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： Tyr Glu Glu Phe Ser Lys Glu Arg Ser Ser Ser Leu Glu Gly Ser Pro 1 5 10 15 Asp Glu Phe Ser Asn Gly Glu Glu Leu Cys Gly Val Met Thr Ile Ser 20 25 30 Asp Ser Pro Arg Glu Gln Asp Ser Glu Ser Gln Thr Leu Asp Lys Val 35 40 45 Tyr Gln Met Lys Ser Lys Pro Arg Gly Tyr Cys Leu Ile Ile Asn Asn 50 55 60 His Asn Phe Ala Lys Ala Arg Glu Lys Val Pro Lys Leu His Ser Ile 65 70 75 80 Arg Asp Arg Asn Gly Thr His Leu Asp Ala Gly Ala Leu Thr Thr Thr 85 90 95 Phe Glu Glu Leu His Phe Glu Ile Lys Pro His Asp Asp Cys Thr Val 100 105 110 Glu Gln Ile Tyr Glu Ile Trp Lys Ile Tyr Gln Leu Met Asp His Ser 115 120 125 Asn Met Asp Cys Phe Ile Cys Cys Ile Leu Ser His Gly Asp Lys Gly 130 135 140 Ile Ile Tyr Gly Thr Asp Gly Gln Glu Gly Pro Ile Tyr Glu Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gln Phe Thr Gly Leu Lys Cys Pro Ser Leu Ala Gly Lys Pro Lys 165 170 175 Val Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gln Gly Asp Asn Tyr Gln Lys Gly Ile 180 185 190 Pro Val Glu Thr Asp Ser Glu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu Met Asp Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Gln Thr Arg Tyr Ile Pro Asp Glu Ala Asp Phe Leu Leu 210 215 220 Gly Met Ala Thr Val Asn Asn Cys Val Ser Tyr Arg Asn Pro Ala Glu 225 230 235 240 Gly Thr Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Cys Gln Ser Leu Arg Glu Arg Cys 245 250 255 Pro Arg Gly Asp Asp Ile Leu Thr Ile Leu Thr Glu Val Asn Tyr Glu 260 265 270 Val Ser Asn Lys Asp Asp Lys Lys Asn Met Gly Lys Gln Met Pro Gln 275 280 285 Pro Thr Phe Thr Leu Arg Lys Lys Leu Val Phe Pro Ser Asp 290 295 300

【０１１４】（２） 配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号６： Tyr Lys Arg Glu Lys Ala Ile Gln Ile Val Thr Pro Pro Val Asp Lys 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ser Tyr Gln Gly Glu Glu Glu Leu Val Ser Gln Thr Asp 20 25 30 Val Lys Thr Phe Leu Glu Ala Leu Pro Arg Ala Ala Val Tyr Arg Met 35 40 45 Asn Arg Asn His Arg Gly Leu Cys Val Ile Val Asn Asn His Ser Phe 50 55 60 Thr Ser Leu Lys Asp Arg Gln Gly Thr His Lys Asp Ala Glu Ile Leu 65 70 75 80 Ser His Val Phe Gln Trp Leu Gly Phe Thr Val His Ile His Asn Asn 85 90 95 Val Thr Lys Val Glu Met Glu Met Val Leu Gln Lys Gln Lys Cys Asn 100 105 110 Pro Ala His Ala Asp Gly Asp Cys Phe Val Phe Cys Ile Leu Thr His 115 120 125 Gly Arg Phe Gly Ala Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Leu Ile Pro Ile 130 135 140 Arg Glu Ile Met Ser His Phe Thr Ala Leu Gln Cys Pro Arg Leu Ala 145 150 155 160 Glu Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gln Gly Glu Glu Ile 165 170 175 Gln Pro Ser Val Ser Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asn Pro Glu Gln Ala 180 185 190 Pro Thr Ser Leu Gln Asp Ser Ile Pro Ala Glu Ala Asp Phe Leu Leu 195 200 205 Gly Leu Ala Thr Val Pro Gly Tyr Val Ser Phe Arg His Val Glu Glu 210 215 220 Gly Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Cys Asn His Leu Lys Lys Leu Val 225 230 235 240 Pro Arg His Glu Asp Ile Leu Ser Ile Leu Thr Ala Val Asn Asp Asp 245 250 255 Val Ser Arg Arg Val Asp Lys Gln Gly Thr Lys Lys Gln Met Pro Gln 260 265 270 Pro Ala Phe Thr Leu Arg Lys Lys Leu Val Phe Pro Val Pro Leu Asp 275 280 285 Ala Leu Ser Ile 290

【０１１５】（２） 配列番号７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号７： Met Asp Pro Phe Leu Val Leu Leu His Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ser Ser Glu Leu Thr Glu Leu Lys Phe Leu Cys Leu Gly Arg Val Gly 20 25 30 Lys Arg Lys Leu Glu Arg Val Gln Ser Gly Leu Asp Leu Phe Ser Met 35 40 45 Leu Leu Glu Gln Asn Asp Leu Glu Pro Gly His Thr Glu Leu Leu Arg 50 55 60 Glu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg His Asp Leu Leu Arg Arg Val Asp 65 70 75 80 Asp

【０１１６】（２） 配列番号８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号８： Met Asp Phe Ser Arg Asn Leu Tyr Asp Ile Gly Glu Gln Leu Asp Ser 1 5 10 15 Glu Asp Leu Ala Ser Leu Lys Phe Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Pro Gln 20 25 30 Arg Lys Gln Glu Pro Ile Lys Asp Ala Leu Met Leu Phe Gln Arg Leu 35 40 45 Gln Glu Lys Arg Met Leu Glu Glu Ser Asn Leu Ser Phe Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Leu Phe Arg Ile Asn Arg Leu Asp Leu Leu Ile Thr Tyr Leu Asn 65 70 75 80

【０１１７】（２） 配列番号９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号９： Tyr Arg Val Met Leu Tyr Gln Ile Ser Glu Glu Val Ser Arg Ser Glu 1 5 10 15 Leu Arg Ser Phe Lys Phe Leu Leu Gln Glu Glu Ile Ser Lys Cys Lys 20 25 30 Leu Asp Asp Asp Met Asn Leu Leu Asp Ile Phe Ile Glu Met Glu Lys 35 40 45 Arg Val Ile Leu Gly Glu Gly Lys Leu Asp Ile Leu Lys Arg Val Cys 50 55 60 Ala Gln Ile Asn Lys Ser Leu Leu Lys Ile Ile Asn Asp 65 70 75

【０１１８】（２） 配列番号１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１０： Val Ser Phe Arg Glu Lys Leu Leu Ile Ile Asp Ser Asn Leu Gly Val 1 5 10 15 Gln Asp Val Glu Asn Leu Lys Phe Leu Cys Ile Gly Leu Val Pro Asn 20 25 30 Lys Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ser Asp Val Phe Glu His Leu 35 40 45 Leu Ala Glu Asp Leu Leu Ser Glu Glu Asp Pro Phe Phe Leu Ala Glu 50 55 60 Leu Leu Tyr Ile Ile Arg Gln Lys Lys Leu Leu Gln His Leu 65 70 75

【０１１９】（２） 配列番号１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１１： Val Ser Leu Phe Arg Asn Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Glu Gly Ile Asp 1 5 10 15 Ser Glu Asn Leu Lys Asp Met Ile Phe Leu Leu Lys Asp Ser Leu Pro 20 25 30 Lys Thr Glu Met Thr Ser Leu Ser Phe Leu Ala Phe Leu Glu Lys Gln 35 40 45 Gly Lys Ile Asp Glu Asp Asn Leu Thr Cys Leu Glu Asp Leu Cys Lys 50 55 60 Thr Val Val Pro Lys Leu Leu Arg Asn Ile Glu Lys Tyr Lys 65 70 75

【０１２０】（２） 配列番号１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１２： Met Val Glu Tyr Gly Thr Leu Phe Gln Asp Leu Thr Asn Asn Ile Thr 1 5 10 15 Leu Glu Asp Leu Glu Gln Leu Lys Ser Ala Cys Lys Glu Asp Ile Pro 20 25 30 Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Thr Thr Gly Ser Ala Trp Phe Ser Phe 35 40 45 Leu Glu Ser His Asn Lys Leu Asp Lys Asp Asn Leu Ser Ile Ile Glu 50 55 60 His Ile Phe Glu Ile Ser Arg Arg Pro Asp Leu Leu Thr Met Val Val 65 70 75 80 Asp

【０１２１】（２） 配列番号１３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１３： Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Phe Leu Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Phe Xaa Xaa 35 40 45 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa

【０１２２】（２） 配列番号１４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１４： Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Gly Xaa Cys Xaa Ile Ile Asn Asn Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Gly Thr 100 105 110 Xaa Xaa Asp Ala Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Leu Xaa Phe 115 120 125 Glu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Leu Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 145 150 155 160 Val Cys Xaa Xaa Leu Ser His Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Tyr Gly Xaa 165 170 175 Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 180 185 190 Xaa Gly Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Lys Pro Lys Leu Phe Phe 195 200 205 Ile Gln Ala Cys Xaa Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Pro Xaa Glu Ala Asp Phe Leu Leu Xaa 245 250 255 Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Ser Trp Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 260 265 270 Ser Trp Tyr Ile Gln Xaa Leu Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ile Leu Thr Xaa Val Asn Xaa Xaa Val 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Lys Gln Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Lys Xaa Leu Xaa Phe 325 330 335 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345

【０１２３】（２） 配列番号１５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｘ）特徴： （Ａ）ネーム／キー：修飾部位 （Ｂ）ロケーション：４ （Ｄ）他の情報： ４位のアミノ酸はＡｒｇまたはＧｌ
ｎのいずれであってもよい。 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１５： Gln Ala Cys Xaa Gly 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＦＩＮ−１のｃＤＮＡ配列（配列番号：
１）および推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

【図２】 ヒトＦＩＮ−１のｃＤＮＡ配列（配列番号：
１）および推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

【図３】 ヒトＦＩＮ−１のｃＤＮＡ配列（配列番号：
１）および推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

【図４】 ヒトＦＩＮ−１のｃＤＮＡ配列（配列番号：
１）および推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

【図５】 ＦＩＮ−１のＤＥＤ（各々、配列番号：２の
アミノ酸１−７３およびアミノ酸９０−１６９）ならび
にＦＡＤＤ（配列番号：７）、ＦＬＩＣＥ（各々、配列
番号：８および９）、Ｍｃｈ−４（各々、配列番号：１
０および１１）およびＰｅａ−１５（配列番号：１２）
のＤＥＤ間の類似性を示す。コンセンサス配列をも示す
（配列番号：１３）。

【図６】 ＦＩＮ−１ ＤＥＤ１（配列番号：２のアミ
ノ酸３−７３）およびＦＬＩＣＥ ＤＥＤ１（配列番
号：８のアミノ酸４−８１）間の相同性を示す。

【図７】 ＦＩＮ−１ ＤＥＤ２（配列番号：２のアミ
ノ酸９３−１６９）およびＦＬＩＣＥ ＤＥＤ２（配列
番号：９）間の相同性を示す。

【図８】 ＣＰＰ−３２（配列番号：３）、ＩＣＥ−Ｌ
ＡＰ３（配列番号：４）、ＦＬＩＣＥ（配列番号：
５）、Ｍｃｈ−４（配列番号：６）、およびＦＩＮ−１
（配列番号：２のアミノ酸１７０−４８０）のシステイ
ン・プロテアーゼ・ドメインならびにコンセンサス配列
（配列番号：１４）間の類似性を示す。配列番号：１５
はＩＣＥ−ｃｅｄ−３ファミリーの活性部位のコンセン
サス配列である。

【図９】 ＦＩＮ−１（配列番号：２のアミノ酸１８４
−４７８）およびＦＬＩＣＥ（配列番号：５のアミノ酸
２−３００）システイン・プロテアーゼ・ドメイン間の
相同性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/00 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 9/00 Ｙ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/15 Ｚ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ // Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ジョン・ジー・エメリー アメリカ合衆国19096ペンシルベニア州ウ ィンウッド、ハロゲイト・ロード243番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
   とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と同じアミ
   ノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補性のポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチ
   ドからなる群より選択されるメンバーからなる単離ポリ
   ヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチドからなる
   請求項２記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
   チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項２記載のＤＮＡからなるベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターからなる宿主細
   胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載の宿主細胞からそのＤＮＡ
   によってコードされるポリペプチドを発現させることを
   特徴とするポリペプチドの製造法。
9. 【請求項９】 ポリペプチドを発現する細胞の製造法で
   あって、細胞がベクター中に含まれるヒトｃＤＮＡによ
   りコードされるポリペプチドを発現するように、該細胞
   を請求項６に記載のベクターで形質転換またはトランス
   フェクションすることからなる方法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列に対して少
    なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる
    ポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２に示すアミノ酸配列からな
    るポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るアゴニスト。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 ＦＩＮ−１を必要とする患者の治療方
    法であって、請求項１０記載のポリペプチドの治療上有
    効量を該患者に投与することからなる治療方法。
16. 【請求項１６】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを患
    者に付与し、インビボにて該ポリペプチドを発現させる
    ことにより、該ポリペプチドの治療上有効量を投与する
    ことからなる請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 ＦＩＮ−１ポリペプチドの阻害を必要
    とする患者の治療方法であって、請求項１４記載のアン
    タゴニストの治療上有効量を該患者に投与することから
    なる方法。
18. 【請求項１８】 請求項１０に記載のポリペプチドの発
    現に関与する疾患または該疾患に対する感受性の診断方
    法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列にお
    ける突然変異を測定することからなる方法。
19. 【請求項１９】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
    ０記載のポリペプチドの存在について分析することから
    なる診断方法。
20. 【請求項２０】 請求項１０記載のポリペプチドについ
    てのレセプターと結合し、そのレセプターを活性化また
    は阻害する化合物の同定方法であって、 細胞表面にそのポリペプチドについてのレセプターを発
    現する細胞を、レセプターと結合可能な条件下、スクリ
    ーニングすべき化合物と接触させ（そのレセプターは該
    化合物の該レセプターへの結合に応答して検出可能なシ
    グナルを提供することのできる第２成分に関連付けられ
    る）；および該化合物と該レセプターとの相互作用より
    生じるシグナルの有無を検出することにより、該化合物
    が該レセプターに結合し、そのレセプターを活性化する
    かまたは阻害するかどうかを測定することからなる方
    法。