FI110433B - Alfa-amidointientsyymiä koodaava DNA-sekvenssi, isäntäsolu ja menetelmä amidoidun peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

110433

Alfa-amidointientsvvmiä koodaava DNA-sekvenssi. isäntäsolu ia menetelmä amidoidun peptidin valmistamiseksi Tämä hakemus on jatko US-patenttihakemukseen n:o 655,366, joka on jätetty 27.9.1984 5 ja joka on kokonaisuudessaan tässä viitteenä.

Tämä keksintö liittyy alfa-amidointientsyymeihin, alfa-amidointientsyymien valmistukseen ja niiden käyttöön alfa-amidoitujen tuotteiden valmistuksessa entsyymien vaikuttaessa glysiinillä laajennettuihin substraatteihin. Tietyissä edullisissa suoritusmuodoissa io keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin koodamaa alfa-amidointientsyymiä voidaan käyttää valmistettaessa hyödyllisiä alfa-amidoituja hormoneja ja maanviljelys-ja lääketuot-teita, jotka sisältävät kalsitoniinia, kasvuhormonia vapauttavia tekijöitä, kalsitoniinigee-nin sukuisia peptidejä ja muita alfa-amidoituja tuotteita.

is Luonnollisten proteiinien esiastemuotojen intrasellulaarista käsittelyä (lohkaisua ja/tai funktionaalisen ryhmän muuntoa) sekä niiden translaatiota nukleiinihapon koodavista sekvensseistä on selitetty yksityiskohtaisesti.

Yleensä nisäkkäiden solut ja muut eukaryootit voivat suorittaa määrättyjä translaation 20 jälkeen tapahtuvia käsittelyjä, kun taas prokaryootit eivät. Määrättyjä prokaiyootteja, ,.: : kuten R colia käytetään laajalti isäntinä nisäkkäiden proteiinien valmistuksessa yhdis- * · •. ’! * telmä-DNA- (rDNA) tekniikan avulla, koska niitä voidaan helposti kasvattaa kerta-

• · I

• · · * käymismenetelmissä ja koska ne ovat geneettisesti hyvin luonnehdittuja. Kuitenkin ge- • · : · ’ ’ neettisellä yhdistelmätekniikalla tuotetut nisäkkäiden proteiinit vaativat jonkintyyppistä 25 translaation jälkeistä käsittelyä ja tämä täytyy suorittaa usein käyttämällä monimutkai- • siä kemiallisia in vitro-toimenpiteitä. jotka ovat kalliita suurimittaisessa valmistuksessa.

• · » · · • · ·

Eräs tapa aktiivisuuden käsittelemiseksi on käyttää proteiinin karboksyyli-terminaalisen ’ · ’ aminohapon spesifistä amidointia. Useat luonnossa esiintyvät hormonit ja peptidit sisäl- ’;'; * 30 tävät tällaisen muunnelman, joka on usein välttämätön, jos proteiinin on oltava biologi- • · * *. * sesti aktiivinen. Eräs esimerkki on kaisitoniini, jossa luonnollisen amidoidun proliinin : .’ substituutio ei-amidoidulla proliinitähteellä saa aikaan biologisen aktiivisuuden 3.000-

• I I

kertaisen vähenemisen.

2 110433

Aine, joka vaikuttaa tähän C-terminaaliseen (alfa) amidointiin, tunnistaa glysiini-tähteen, joka seuraa välittömästi amidoitavaa aminohappoa (R-X-gly, jossa R on proteiinin päärunko, X on tähde, joka on amidoitu, ja "gly" on glysiinitähde). Glysiini loh-5 kaistaan ja se itse asiassa luovuttaa amino-osan viimeistä edelliseen aminohappoon ja amidoi sen tällöin.

Ensimmäiset tutkijat, jotka ovat esittäneet alfa-amidointientsyymin likimääräisen mole-kyylipainon, olivat Bradbury A. F. et ai., Nature, Voi. 298, 1982, s. 686-88. Käyttämällä 10 Sephadex G-100:a he ehdottivat ilmeiseksi minimimolekyylimassaksi n. 60.000 dalto-nia.

Seuraavissa tutkimuksissa on ehdotettu tällaisen entsyymin molekyylimassaksi 60.000 -70.000 daltonia (mitattuna geelisuodatuskromatografialla). Ks. Husain, I. ja Tate, S. S., 15 FEBS Letters, Voi. 152 #2,1983, s. 277 - 281; Eipper, et ai, PNAS Voi. 80, 1983, s. 5144 - 5148; Gomez et ai., FEBS Letters, Voi. 167, #1, 1984, s. 160 -164 ja Kizer, J.

S., et ai., PNAS, Voi. 81,1984, s. 3228 - 3232.

Eipper et ai., PNAS, Voi. 80,1983, s. 5144-48, ovat esittäneet, että molekyylihapen 20 lisäksi tarvitaan kaksi kofaktoria maksimaalista entsyymin amidointiaktiivisuutta var- | : ten. Nämä ovat askorbiinihappo ja kupari(II)ioni.

« · · • * • t · • ’.: Kemiallinen reaktio, joka saa aikaan peptidin karboksyylipäätteen amidoinnin, tarvitsee •.: i aminoryhmän lähdettä. Bradbury, A. F., et ai.. Nature, Voi. 298,1982, s. 686 - 688, • » * i . * 25 osoittivat, että glysiini lohkaistaan ja se luovuttaa aminoosan viimeistä edelliseen ami- • · · ' ' nohappoon, jolloin se amidoi tämän. Muut tutkijat ovat vahvistaneet glysiinin tarpeen aminoryhmän donorina.

• · · • · * • · T Landymore, A. E. N., et ai·? BBRC Voi. 117, #1,1983, s. 289 - 293 osoittivat, että D- • ♦ ' ·' · ‘ 30 alaniini voisi samoin toimia aminon donorina amidointireaktiossa. Tämän jälkeen Kizer * · · et ai., PNAS, Voi. 81,1984, s. 3228 - 3232, osoittivat kaksi erillistä entsyymiaktiivi- : ’suutta rotan aivoissa, jotka pystyvät katalysoimaan alfa-amidointireaktiota. Korkeani-• · :: man molekyylimassan omaavalla tyypillä (70.000 daltonia) on erikoisuus, joka on rajoi- 3 110433 tettu glysiiniin substraatin karboksyyli-päätteessä. Alhaisemman molekyylimassan omaava entsyymi hyväksyy substraatin, jossa on β-alaniini karboksyyli-terminaalisessa aminohapossa.

5 Bradbury, A. F. ja Smythe, D. G., BBRC, Voi 112, #2,1983, s. 372 - 377, esittivät sian aivolisäkkeestä uutetun ja erityisesti puhdistetun alfa-amidointientsyymin pH-optimiksi n. 7,0. Eipper, B. A., et ai., PNAS, Voi. 80, 1983, s. 5144 - 5148, vahvistivat nämä tulokset ja esittivät, että rotan aivolisäkkeistä osittain puhdistetun alfa-amidointientsyymin pH-optimi on 7. He havaitsivat myös, että entsyymiaktiivisuus ale-10 ni nopeasti pH-arvoissa, jotka olivat alle 6,5 tai yli 7,5.

Kaikissa edellä esitetyissä julkaisuissa (jotka ovat tässä viitteenä) esitetyt uutteet ja osittain puhdistetut entsyymiseokset sisältävät ylimääräisiä proteolyyttisiä entsyymejä, jotka voivat hajottaa mahdollisia substraatteja tai tuotteita samoin kuin itse alfani amidointientsyymejä, jolloin ne hidastavat peptidien ja polypeptidien amidointia tällaisilla entsyymeillä, jotka on puhdistettu luonnollisista lähteistä tai valmistettu yhdistel-mä-DNA-tekniikalla.

Yleisesti kaikki muiden aikaisemmin mittaamat amidointiaktiivisuudet perustuivat D-20 substraattien, kuten tripeptidin, DTyr-Val-Gly-COOH:n muuntoon D-Tyr-Val-i : CONH2:ksi. Kahdesta mahdollisesta konfiguraatiosta ("D" tai "L") luonnossa esiintyvät # ’ ‘: biologisesti tärkeät aminohapot esiintyvät "L"muodossa. Kuitenkin näiden muiden tut- • I · • ‘.: kijoiden käyttämää "D"-muotoa tarvittiin vaikuttamaan asiaankuulumattomien proteo- • · *,: i lyyttisten entsyymien läsnäoloa vastaan näiden tutkijoiden käyttämissä epäpuhtaissa • * · » · * : 25 amidointientsyymivalmisteissa. Näillä asiaankuulumattomilla entsyymeillä voi olla ko- · · * · * * rostettu proteolyyttinen vaikutus L-aminohappo-substraattiin samalla, kun ne vaikutta vat vain vähän D-substraattiin. Tutkijat, joiden taakkana olivat proteolyyttiset ja muut epäpuhtaudet heidän entsyymissään, käyttivät epäluonnollista "D"-substraattia epäpuh- • t *; * tauksien joidenkin vaikutusten välttämiseksi. Tähän mennessä ei ole pystytty osoitta- :* 30 maan, että heidän entsyymivalmisteensa voivat amidoida tehokkaasti mitään fysiologi- m ‘ · · · ‘ sesti merkityksellisiä substraatteja, s.o. L-substraatteja niiden muuntamiseksi biologi- • · · ’· ' · sesti aktiivisiksi alfa-amidoiduiksi L-tuotteiksi.

• * • * > · • · < • · 4 110433

Kuten tässä on osoitettu, tässä keksinnössä kuvatut valmisteet pystyvät tehokkaasti ami-doimaan L-substraatit ja niillä on D-substraateilla aktiivisuus, joka on 60 - jopa yli 1000 kertaa suurempi kuin hakijoiden tietämällä alan tasolla havaittu korkein aktiivisuus.

5

Useissa lähteissä on esitetty entsyymivalmisteita, jotka pystyvät amidoimaan peptidien ja proteiinien karboksyylipäätteen. Esimerkiksi Bradbury. A. F., et ai., Nature, Voi. 298, 1982, s. 686 - 688 (kokonaisuudessaan tässä viitteenä) esittävät sian aivolisäkkeessä esiintyvän alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden. Entsyymiä sisältävä sian aivolisäkkeen 10 valmiste pystyy muuntamaan peptidit, jotka päättyvät glysiiniin vastaavaksi desglysii-nipeptidiamidiksi. Bradbury et ai. myöntävät kuitenkin, että valmisteet eivät amidoi peptidejä tai polypeptidejä, jotka on puhdistettu luonnollisista lähteistä: "An assay system for detecting and estimating amidating activity in pituitary was obtained by examining the ability of enzyme preparations to convert the synthetic tripeptide Dtyrosylvalyl-15 glycine to the corresponding dipeptide amide Dtyrosylvaline amide...The D-tyrosine residue conferred stability against degradation by aminopeptidases present in tissue homogenates...Control experiments showed that when synthetic...D-tyrosylvaline amide was incubated in the same conditions it was slowly degraded. Thus the formation of the dipeptide amide by the pituitary enzyme is followed by its destruction by other enzymes 20 present in the pituitary extract." (s. 686). (Analyysijäqestelmä amidointiaktiivisuuden :: ilmaisemiseksi ja arvioimiseksi aivolisäkkeessä saatiin tutkimalla entsyymivalmisteiden •, ”: kykyä muuntaa synteettinen tripeptidi D-tyrosyylivalyyliglysiini vastaavaksi dipepti- • · · • 1diamidiksi, D-tyrosyylivaliiniamidiksi...D-tyrosiinitähde antoi stabiiliuden kudoshomo- ψ · :, i i genaateissa läsnäolevien aminopeptidaasien aiheuttamaa hajottamista vastaan. Kontrol- I · · : 25 litutkimukset osoittivat, että kun synteettistä...D-tyrosyylivaliiniamidia inkuboitiin sa- I t » ·' 1 moissa olosuhteissa se hajosi hitaasti. Siten dipeptidiamidin muodostumista aivolisäke- entsyymin avulla seuraa sen hajottaminen muilla aivolisäkeuutteessa läsnäolevilla ent- • · · syymeillä).

· ‘ · ’ 30 Siten Bradbury et ai. myöntävät, että esitetyt valmisteet sisältävät muita proteolyyttisiä

t « I

‘ ’ entsyymejä, jotka hajottavat peptidit tai polypeptidit ja että luonnossa esiintymätöntä D- • 1.: tyrosiinitähdettä oli käytettävä tällaisen hajottamisen minimoimiseksi.

» 1 1 • · 5 110433

Edelleen Bradbury et ai. opettavat homogenoituiin tai subsellulaarisen fraktionnin käyttöä ja tämän jälkeen suoritettavaa geelisuodatuskromatografiaa amidointientsyymin puhdistamiseksi, joka eittämättä on edelleen epäpuhdas proteolyyttisten entsyymien johdosta.

5

Husain, I. ja Ta te. S. S., FEBS Letters, Voi. 152, #2,1983, s. 277 - 281 esittävät alfa-amidointiaktiivisuuden, joka on läsnä naudan aivolisäkkeen neurosekretorisissa jyväsissä.

io Eipper et ai., PNAS Voi. 80,1983, s. 5144 - 5148 esittävät alfa-amidointientsyymi-aktiivisuuden, joka on läsnä rotan aivolisäkkeen etu-, keski-ja takalohkossa ja naudan aivolisäkkeen keskilohkossa. Kuitenkin tässä viitejulkaisussa opetetaan ainoastaan synteettisen D-Tyr-Val-Gly-substraatin käyttöä valmistettujen tuotteiden epäpuhtauden tunnistamiseksi alfa-amidointiaktiivisuuden suhteen.

15

Gomez et ai., FEBS Letters, Voi. 167, #1,1984, s. 160 - 164, ovat määrittäneet, että rotan hypotalamus sisältää myös alfa-amidointiaktiivisuuden.

Bradbury, A. F., Smythe, D. G., julkaisussa Peptides Structure and Function: Procee-20 dings of the Eighth American Peptide Symposium, s. 249-52 (1983), julkaisijat Hruby, V. J. ja Rich, D. H., esittävät alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden läsnäolon rotan kilpi- • · . : rauhasessa.

I · · > * • · * = ' ’ Mains R. E. et al., Endocrinology, Voi. 114,1984, s. 1522- 1530, ovat esittäneet, että * · · : ·' 25 hiiren aivolisäkkeen etulohkosta johdettu solukanta (ATT-20) sisältää alfa- • · * * * ’ ’ amidointientsyymiaktiivisuuden, joka selvästi pienenee vähitellen viljelyssä.

• » · • * · ’ Rauhaset tai elimet, joiden tiedetään sisältävän amidoituja peptidejä, voivat sisältää ent- t ’! ‘ syymin, joka pystyy katalysoimaan amidointireaktiota. Esimerkiksi O'Donohue T. L., et 30 ai., Peptides 3, 1982, s. 353 -395, ovat esittäneet, että alemmat elämän muodot, kuten • · * ·; ’ koirahai fSqualus acanthi as), sisältävät amidoituja peptidejä aivolisäkeuutteissa. Schel- 1 ’.· ler, R. H. et ai., Cell, Voi. 32,1983, s. 7 - 22, ovat esittäneet amidointisignaalipeptidien

t I I

' · * · läsnäolon merietanassa, Anlvsiassa. Huolimatta tämän aktiivisuuden ilmeisestä läsnä- 6 110433 olosta kaikkialla luonnossa entsyymin fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista on julkaistu vähän informaatiota. Tämä voi johtua entsyymin hyvin alhaisista tasoista näissä neuroendokriinisissä elimissä.

5 Amidoitujen peptidien läsnäolo erityisessä kudoksessa ei ole välttämättä samanmerki-tyksinen alfa-amidointientsyymin korkeiden tasojen kanssa. Esimerkiksi rotan etuaivo-lisäkekudos sisältää korkean alfa-amidointiaktiivisuuden, mutta ei mitään tunnettuja substraatteja (Eipper et ai., PNAS 80, 5144 - 5148,1983). Rotan taka-aivolisäkekudos sisältää amidoituja peptidejä (oksitosiiniä ja vasopressiiniä), mutta sillä on hyvin pieni 10 alfa-amidointiaktiivisuus (Eipper et ai., Endo 116,2497 - 2504,1985). Tästä syystä ennen kuin kudokset on testattu alfa-amidointiaktiivisuuden suhteen, entsyymin läsnäoloa tai mahdollisia tasoja ei voida ennustaa.

Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan alfa-amidointientsyymikoostumuksia, jot-15 ka voivat tuottaa tehokkaasti alfa-amidoituja tuotteita jopa substraateista, jotka sisältävät L-aminohappoja, kuten peptidi- tai polypeptidisubstraateista, jotka on puhdistettu luonnollisista lähteistä tai valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Edelleen tehtävänä on saada aikaan tehokkaat ja kustannuksiltaan halvat menetelmät 20 entsymaattisten koostumusten valmistamiseksi.

• · • · · · .' *: Näistä saadaan edelleen aikaan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat alfa- M · • V amidointientsyymille spesifisiä, ja immobilisoituja vasta-aineita, puhdistushartseja, :. i i immunoaffiniteetti-pylväitä j a vastaavia, joissa käytetään näitä vasta-aineita alfa- • · · • · · : 25 amidointientsyymin puhdistamiseksi tehokkaasti.

• · · • · · • · ·

Edelleen tehtävänä on saada aikaan geneettisesti manipuloituja isäntäsoluja, jotka pys- tl» • * * ;,. * tyvät alfa-amidointientsyymin ilmaisuun suurella saannolla.

» · tl» ’ ·' · ’ 30 Tämän keksinnön tehtävänä on edelleen valmistaa alfa-amidoituja tuotteita substraateis- • · * ; · * ta, jotka sisältävät C-terminaalisen glysiinitähteen, saattamalla substraatti reagoimaan » » · : ’.· entsyymikoostumuksenläsnäollessa.

• I · 7 110433 I Nämä ja muut tehtävät selviävät seuraavasta yksityiskohtaisesta selityksestä. Keksinnön mukaisesti hakijat saavat aikaan riittävän puhtauden omaavia uusia alfa-amidointientsyymikoostumuksia, joiden spesifinen alfa-amidointiaktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia ja etenkin yli 50 tai yli 150 mU/mg proteiinia. Kaikki tässä 5 esitetyt spesifisen aktiivisuuden yksiköt perustuvat dansyyli-D-Try-Val-GlyCOOH:n dansyyli-D-Tyr-Val-CONH2:ksi tapahtuvaan muuntoon. Yksi mU on määritelty aktiivisuuden määräksi, joka tarvitaan dansyyli-D-TyrVal-Gly-COOH:n yhden nanomoolin (nmooli) muuntamiseksi dansyyli-D-Tyr-Val-CONH2:n yhdeksi nmooliksi/min.

37 °C:ssa ja pH-arvossa 7,0 askorbaatti-ionien läsnäollessa 3 mM konsentraatiossa (ροζ ö rustuen koko reaktioseokseen mukaanlukien entsyymi, substraatti, kofaktorit jne.), mo- lekyylihapen läsnäollessa mooliylimääränä substraatin suhteen ja kupari(II)-ionien konsentraatiossa, joka pystyy maksimoimaan aktiivisuuden (tavallisesti n. 2 μΜ riippuen entsyymin puhtaustilasta).

is Keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin koodaama alfa-amidointientsyymi, peptidyyli- glysiini-alfa-amidointimono-oksygenaasi, pystyy katalysoimaan peptidyyliyhdisteen muuntoa, jossa on glysiinitähde ainakin peptidiketjun C-päätteessä, vastaavaksi pepti- dyyliamidiyhdisteeksi, jossa on aminoryhmä C-terminaalisen glysiinin tilalla. Tässä käytettynä käsite "peptidiketju" tarkoittaa polypeptidiä, jossa on vähintään kaksi amino- 20 happoa, jotka on liitetty yhteen peptidisidoksella. Käsite "peptidyyliyhdiste" tarkoittaa . : yhdistettä, jossa on peptidiketju. Käsite "vastaava peptidyyliamidi" tarkoittaa reak- • · •. ‘ : tiotuotetta, joka substituoi aminoryhmän peptidiketjun C-terminaalisen glysiinin tilalle.

• · · • · • ♦ tl* ‘«‘ ’ Edullisesti alfa-amidointireaktio tapahtuu hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa. Sopivia « * · « · * : ; * 25 pelkistysaineita ovat esim. askorbiinihappo, askorbiinihapposuolat, dihydroksifumaraat- • I · ·* ti, metallisyanidiyhdisteet ja tetrahydropteriini. Määrättyjen kofaktoreiden on todettu . . edistävän reaktion kulkua ja/tai hidastavan entsyymin hajoamista tai inaktivoitumista.

!.. ’ Näitä kofaktoreita ovat mm. katalaasi, etanoli, kaliumj odidi ja kupari(II)-ionit. Keksin- ’ · ’ nön mukaisen menetelmän avulla saadut puhdistetut entsymaattiset koostumukset ovat » · · 30 etenkin riittävän vapaita proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan joko • · alfa-amidointientsyymin tai alfa-amidointireaktion tuotteet tai lähtöaineet, niin että ent- I I » i *. ‘ symaattiset koostumukset voivat katalysoida alfa-amidointireaktiota, vaikka substraatti • · » · * ' · ' · ja tuote koostuvat L-aminohapoista. Amidointireaktioseoksen proteolyyttinen aktiivi- 8 110433 suus ei voi heijastaa suoraan proteaasin konsentraatiota. Aktiivisuutta, jopa korkeissa proteaasikonsentraatioissa, voidaan hillitä, esimerkiksi erilaisten inhibiittoreiden vaikutuksella. Proteolyyttisen aktiivisuuden puute, joka lisää entsymaattisen koostumuksen kaupallista ja käytännön toivottavuutta L-aminohapoista koostuvien substraattien kans-5 sa tapahtuvaa käyttöä varten, ei vähennä millään tavoin koostumuksen käyttökelpoisuutta substraattien kanssa, jotka eivät sisällä L-aminohappoja.

Kuten yksityiskohtaisessa selityksessä on esitetty, hakijat ovat puhdistaneet useita spesifisiä proteiineja, joilla on olennainen alfa-amidointiaktiivisuus. Tässä käytetty käsite 10 "alfa-amidointiaktiivisuus" tarkoittaa aktiivisuutta, joka pyrkii jättämään ainoastaan aminoryhmän asemaan, joka oli aikaisemmin varattu substraattipeptidyyliyhdisteen C-terminaalisella glysiinillä. Tällainen substituutio voi vaatia glysiinin kaikkien paitsi aminoryhmän lohkaisua, niin että ainoastaan aminoryhmä jää asemaan, joka oli aikaisemmin varattu koko glysiiniosalla. Tässä käytettynä "alfa-amidointientsyymi" tarkoit-15 taa koostumusta tai yhdistettä, jolla on alfa-amidointiaktiivisuus, ja niiden aktiivisia homologeja ja fragmentteja.

Tämän keksinnön mukaisesti saadut entsymaattiset koostumukset voidaan puhdistaa homogeenisiksi. Tässä käytettynä "homogeeninen" tarkoittaa entsyymivalmisteita, joilla 20 on yksi ainoa, hyvin määritelty kaista elektroforeesin jälkeen, joka suoritetaan natrium- ,, | · dodekyylisulfaatti/polyakryyliamidigeelillä, ja joilla on yhdet ainoat aminohappose- •.' ‘: kvenssitiedot yleisten sekvenssointimenetelmien mukaisesti.

• » i.: Keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin koodaamalla alfa-amidointientsyymillä, joka on t · · » · * : ·’ 25 puhdistettu homogeeniseksi, on spesifisenä entsyymiaktiivisuutena yli n. 1500 mU/mg * · * proteiinia.

• * • · · ;.. * Tämän keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin koodaaman entsyymin sisältäviä • ♦ 11 * valmistettuja entsymaattisia koostumuksia voidaan käyttää käyttökelpoisten alfa- • · i * * ' · * · * 30 amidoitujen tuotteiden valmistamiseksi käyttämällä entsymaattisia koostumuksia i a · • * ’ ·; ·' tällaisten tuotteiden alfa-amidoinnin katalysoimiseksi. Saadaan aikaan substraatti, joka • ’. · on peptidyyliyhdiste, jossa on glysiinitähde ainakin peptidinketjun Cpäätteessä, jolloin :. ’ ·; C-terminaalisen glysiinitähteen substituutio aminoryhmällä saa aikaan halutun tuotteen.

Substraatti saatetaan reagoimaan, etenkin hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa, tämän 9 110433 tetaan reagoimaan, etenkin hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa, tämän keksinnön mukaisesti valmistetun entsymaattisen koostumuksen läsnäollessa riittävän pitkäksi ajaksi peptidyyliyhdisteen muuntamiseksi vastaavaksi peptidyyliamidiksi. Muuntuminen alkaa olennaisesti substraatin ja entsyymin ensikosketuksessa, mutta reaktionopeus vaihtelee 5 huomattavasti pH-arvon, lämpötilan, substraatin identtisyyden, kofaktoreiden konsent-raation ja muiden parametrien mukaisesti, jotka voidaan säätää tunnetulla tavalla reaktion optimoimiseksi. Reaktion annetaan edetä tavallisesti aikajakson ajan, joka on valittu halutun muuntoprosentin (substraatin mummon tuotteeksi) mukaisesti. Edullisissa suoritusmuodoissa kofaktoreita, kuten edellä mainittuja, käytetään reaktion edistämiseksi ίο ja/tai entsyymin aktiivisuuden parantamiseksi tai vahvistamiseksi.

Voidaan valmistaa useita käyttökelpoisia tuotteita, mukaanlukien luonnollisia hormoneja ja vastaavia, joille alfa-amidointi on edullista tai välttämätöntä, saattamalla glysiinillä pidennetyt peptidyyliyhdisteet reagoimaan tämän keksinnön mukaisesti saatujen alfa-15 amidointientsyymikoostumusten läsnäollessa. Näitä tuotteita, joita voidaan käyttää esimerkiksi maanviljelyksessä tai hoidettaessa sairauksia, joille on luonteenomaista hormonaaliset vajaukset, ovat mm. erilaiset kalsitoniinit, kasvuhormonia vapauttavat tekijät, kalsitoniinigeenin sukuiset peptidit ja vastaavat. Hormonit, joihin tässä viitataan, kuten edellä mainitut kalsitoniinit, kasvuhormonia vapauttavat tekijät ja kalsitoniinigee-20 nin sukuiset peptidit, sisältävät C-terminaalisia amidiproteiineja, jotka ilmaisevat maini-,, · · tun hormonin luonteenomaisen aktiivisuuden, kuten alan ammattihenkilölle on selvää.

Esimerkiksi kalsitoniini sisältää kaikki lajit, jotka ilmaisevat kalsiumin oton säädön * ' .* luuhun, mikä on luonteenomaista tunnetuille kalsitoniineille. Tässä esitettyjen eri prote- i *

I t I

! *! * iinilajien homologit sisältyvät lajien määritelmiin ja tässä esitetyt nukleotidisekvenssit I « I » * » • ' ’ 25 tai aminohapposekvenssit sisältävät homologiset sekvenssit, joissa substituutiot, additiot > 1 9 ‘ ‘ ' tai deleetiot eivät vaikuta aineellisesti esitetyn sekvenssin tuottamaan toimintaan. Edul- , , lisesti vähintään 40 % ja etenkin 50 % peptidin aminohapoista vastaavat esitettyjä. Nuk- » I » » » » i..' leotidisekvenssien suhteen kodonit voi olla tietenkin substituoitu ekvivalenttisilla kodo- > · * I ’ neilla, jotka koodaavat samoja aminohappoja.

I · I * » I I * * * 30 I 1 * t * ' ·; * ’ Keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin koodaaman entsyymin sisältävien entsyymikoos- i · · i ’. · tumusten kyky katalysoida alfa-amidointireaktiota jopa L-aminohappoja sisältävillä * » I > I t ‘. * ‘ substraateilla mahdollistaa näiden tuotteiden tehokkaan ja kustannuksiltaan edullisen 10 110433 valmistuksen käyttämällä substraatteja, jotka on puhdistettu luonnollisista lähteistä tai valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Määrätyissä edullisissa suoritusmuodoissa alfa-amidointireaktiota voidaan helpottaa 5 immobilisoimalla entsyymi kiinteällä kantoaineella, joka ei liukene vesipitoisiin väliaineisiin ja vastustaa hajoamista reaktio-olosuhteissa, ja ohjaamalla substraatti immobili-soidun entsyymin kautta, etenkin sopivien kofaktoreiden läsnäollessa. Tässä "immobili-sointi" tarkoittaa entsyymin sitomista substraattiin. Tähän tarkoitukseen sopivia kanto-aineita ovat esim. säätöhuokoslasi tai aktivoitu absorbantti, kuten syaanibromidilla aktiko voitu sefaroosi. Tällä tavalla immobilisoituja entsyymejä voidaan käyttää uudelleen poistamalla reaktioseos kiinteästä kantoaineesta, joka säilyttää entsyymin tulevaa käyttöä varten.

Hakijat ovat havainneet, että edellä mainitut entsymaattiset koostumukset voidaan saada 15 ja puhdistaa useilla menetelmillä. On todettu, että medullaarinen kilpirauhaskarsinoo-makudos, joka on johdettu rotasta, sen solulinjoista ja/tai näistä solulinjoista johdetuista soluviljelyalustoista ovat etenkin haluttuja raa'an alfa-amidointientsyymin lähteitä. Epäpuhdas alfa-amidointientsyymi voidaan puhdistaa alistamalla raaka koostumus sekä kokoekskluusiokromatografiaan että anioninvaihtokromatografiaan, etenkin vahvaan . 20 anioninvaihtokromatografiaan. Tässä "vahva" anioninvaihtokromatografia tarkoittaa • * • t anioninvaihtokromatografiaa, joka suoritetaan hartsilla, joka säilyttää vakion positiivi- • · sen kokonaisvarauksen pH-alueella 2 -12. Määrätyissä edullisissa keksinnön suoritus- : muodoissa kokoekskluusiokromatografia on ennen vahvaa anioninvaihtokromatografiaa • · · • » « · :·,·. ja kokoekskluusiokromatografiavaihetta voi edeltää vielä toinen anioninvaihtokromato- • · • · . ·: ·. 25 grafiavaihe. Voi olla toivottavaa suorittaa toinen anioninvaihtokromatografiavaihe en- • · · simmäisen vaiheen jälkeen ja eräässä edullisessa suoritusmuodossa joko ensimmäinen ; | vahva anioninvaihtokromatografia tai toinen vahva anioninvaihtokromatografia suorite- • · • * *': taan emäksisessä pH-arvossa, kun taas toinen suoritetaan happamassa pH-arvossa.

I I t • t • · · • · · • · . · · ·. 30 Käyttämällä entsyymilajeja, jotka on olennaisesti puhdistettu homogeenisiksi, on val- .. *. mistettu entsyymille spesifisiä monoklonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita käyttä- • » \ ’. mällä puhdistettua entsyymiä antigeeninä immuunireaktion esiintuomiseksi hiirissä ja vast, kanoissa. Tällä tavalla jostakin lajista johdetut vasta-aineet voidaan puhdistaa ja π 110433 immobilisoida kiinteälle kantoaineelle entsyymille spesifisen immunoaffiniteettipylvään valmistamiseksi. Tätä pylvästä voidaan käyttää raa'an entsymaattisen aineen puhdistamiseksi, jolloin tuloksena saadaan entsyymin lisääntynyt tehokkuus ja uudelleenkäytettävyys.

5

Alfa-amidointientsyymiä yhdessä sen tryptisten fragmenttien kanssa on sekvenssoitu tunnetuilla menetelmillä ja sekvenssitietoja on käytetty oligo- nukleotidikoetinten valmistamiseksi. Käyttämällä tällä tavalla valmistettuja leimattuja oligonukleotidikoettimia hakijat ovat eristäneet alfa-amidointientsyymin koodaavan geenin cDNA-kiqastosta, 10 joka on syntetisoitu polyA RNArsta, joka on johdettu rotan medullaarisesta kilpirauhas-karsinoomakudoksesta. Geeni, jota luonnehditaan yksityiskohtaisemmin tämän hakemuksen yksityiskohtaisessa selitysosassa, voidaan yhdistää sopivaan ilmaisuvektoriin ja siirtää isäntäsoluun, joka pystyy ilmaisemaan geenin. Sopivia isäntiä ovat mm. E. coli. hiivakannat, kuten S. cerevisiae tai korkeammat eukaroyyttiset solut, kuten solulinja, is josta entsyymi alunperin on puhdistettu. Kaupallista massatuotantoa voidaan helpottaa mikro-organismilla, joka on geneettisesti muodostettu yllä esitetyllä tavalla alfa-amidointientsyymin suurten määrien ilmaisemiseksi.

Entsyymien kaupallista massatuotantoa luonnollisista lähteistä voidaan helpottaa puh- . 20 distusmenetelmillä, jotka käsittävät sekä kokoekskluusiokromatografian että anionin- • · • · . ’ vaihtokromatografian, j olioin anioninvaihtokromatografialla pidätetyt laj it eluoidaan • · . ‘ ’·. käyttämällä suolaliuosta, jonka konsentraatio on yli n. 250 mM ja etenkin 350 mM tai ; , ·. 500 mM. Korkeissa suolaliuoskonsentraatioissa eluoidaan useimmat pidätetyt entsyymi- • · · I · I · : ·. ·. lajit. Kokoekskluusiokromatografia tulisi suunnitella siten, että eristetään lajit, joiden . ’:·. 25 ilmeinen molekyylipaino on n. 58.000 - 67.000 daltonia ja etenkin n. 60.000 - 65.000 daltonia. Puhdistettu valmiste pystyy amidoimaan peptidyyliyhdisteen, joka on puhdis- : ’ ·, · tettu luonnollisista lähteistä tai valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, s.o. L- • · • ’ “: aminohapoista koostuvat peptidit.

• · * * · * • · . · · ·. 30 Kuvioissa • · * · · . Λ kuv. I - V koskevat esimerkkiä 1 ja niitä selitetään myöhemmin lähemmin, • · ’. ’. kuv. VI - XII koskevat esimerkkiä 2 ja niitä selitetään myöhemmin lähemmin, • · · kuv. XIII - XVI koskevat esimerkkiä 2 ja niitä selitetään myöhemmin lähemmin, 12 110433 kuv. XVII - XXI koskevat esimerkkiä 4 ja niitä selitetään myöhemmin lähemmin, kuv. XXII koskee esimerkkiä 10 ja sitä selitetään tässä lähemmin, ja kuv. XXIII koskee esimerkkiä 6 ja sitä selitetään tässä lähemmin.

5 Nyt on havaittu, että homogeeninen alfa-amidointientsyymi voidaan saada monivaihe-menetelmällä käyttämällä kokoekskluusio- ja ioninvaihtokromatografiaa kiinteistä tuu-morikudosuutteista, tuumorisolulinjoista ja tällaisista solulinjoista peräisin olevista ku-dosvilj elyväliaineesta.

io Entsyymi on uutettu rotan medullaarisista kilpirauhaskarsinoomeista ("MTCs"), jotka on kehitetty WAG/Rij Wistar-rotissa, kuten ovat esittäneet Roos, B. A., et ai., Endocrinology, 1979, Voi. 150, #1, s. 27 - 32. Tämä kudos on talletettu nimikkeellä IVI-10028 (sittemmin ATCC 75168). Entsyymi on uutettu myös muista lähteistä, etenkin ihmisen ja rotan medullaarisista kilpirauhaskarsinoomasolulinjoista. Rotan solulinja 15 ("CA-77") johdettiin rotan medullaarisista kilpirauhaskarsinoomatuumoreista sarjatuo tannossa, kuten ovat esittäneet Muszynski, M. et ai., JBC 1983, Voi. 258, s. 11678-83. Tämä solulinja on talletettu nimikkeellä IVI-10029 (sittemmin ATCC CRL 10919).

Ihmisen solulinjan ("HTT 54(34)") kehitti B. A. Roos, VA Medical Center, Cleveland, Ohio, käyttämällä ihmisen medullaarisia kilpirauhaskarsinoomasoluja primaarista vilje-20 lyä varten. Ihmisen solulinja HTT 54(34) on talletettu nimikkeellä IVI-10031 (sittem- • « "V min ATCC CRL 10918). (ks. "Recognition of the Deposit of Micro-Organisms for the • ·. ·. Purpose of Patent Procedure", j osta ilmenee nämä talletukset, ja "Budapest Notificati- : .·, on" No. 34, 3.11.1983, jotka ovat kokonaisuudessaan tässä viitteenä).

• # · * · · • · ;‘: 25 Sekä ihmisen että rotan solulinjoista peräisin olevien määriteltyjen kudosviljelyväliai- neiden on todettu sisältävän huomattavia alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden tasoja, : ‘ 1.! mikä osoittaa, että osa entsyymistä eritetään soluista. Entsyymi voidaan valmistaa ja • 1 ‘ ' I puhdistaa etenkin alistamalla ensin raaka materiaali (joka sisältää kulutettuja viljelyvä- .'. 1. liaineita, entsyymiä ja epäpuhtauksia) anioninvaihtokromatografiaan. Näyte voidaan : “ ‘; 30 esimerkiksi irtolastata preparatiiviseen anioninvaihtimeen, kuten dietyyliaminoetyyli- : · 1 >. ("DEAE") patruunaan, kuten CUNO 250, jota valmistaa CUNO Corp.

· · 13 110433

Patruunasta eluoitu alfa-amidointiaktiivisuuden sisältävä koostumus alistetaan sitten kokoekskluusiokromatografiaan hartsilla, jolla on sopiva erotuskyky, esimerkiksi erittäin hieno Sephacryl S-200, jota valmistaa Pharmacia Fine Chemicals.

5 Aktiivisuuden sisältävä eluenttifraktio alistetaan sitten ioninvaihtokromatografiaan käyttämällä vahvaa anioninvaihtomatriisia. Hartsi, jota voidaan käyttää, on vahva Mono Q HR5/5-anioninvaihtohartsi, jota valmistaa Pharmacia Fine Chemicals, ja voidaan tarvita yksi tai useampi läpikulku pylväällä entsyymin puhdistamiseksi homogeeniseksi. Mono Q HR5/5-pylvään hiukkaskoko on 10 pm, sen ontelotilavuus on 40 % ja siinä on ίο geeli, jonka varattu ryhmä on CH2-N*-(0¾^ ja jonka ionikapasiteetti on 0,28 - 0,36 mmoles/ml.

Jokaista puhdistusvaihetta voidaan valvoa sekä proteiinipitoisuuden että alfa-amidointiaktiivisuuden tason suhteen. Tätä informaatiota käytetään entsyymin spesifi-15 sen aktiivisuuden laskemiseksi, joka toimii entsyymin suhteellisen puhtauden indikaattorina.

Tämän keksinnön mukaisesti puhdistetun peptidyyli-glysiinialfa-amidointimono- oksygenaasin (talletettu rotasta johdettu entsyymi, IVI-10032, sittemmin ATCC 75145; . 20 talletettu ihmisestä johdettu entsyymi, IVI-10033, sittemmin ATCC 75146) ilmeinen • · ‘ V. * molekyylimassa on n. 60.000 - 65.000 daltonia geelisuodatuksella määritettynä.

• · • · · • · ; . ·, Entsyymi on puhdistettu siten, että sen spesifinen entsyymiaktiivisuus on vähintään n.

• · · • · · · : ·. ·. 25 mU/mg proteiinia ja etenkin vähintään n. 50 mU/mg proteiinia. Etenkin spesifinen . ·:'. 25 aktiivisuus on yli n. 150 mU/mg proteiinia. Alfa-amidointientsyymi on puhdistettu myös siten, että sillä on yksi ainoa homogeeninen hyvin määritelty kaista elektroforee-: * ·.: sin jälkeen, joka suoritetaan natriumdodekyylisulfaatti/polyakryyliamidigeeleillä (SDS- PAGE).

. ·". 30 Puhdistettua peptidyyli-glysiini-alfa-amidointimono-oksygenaasia käytetään terminaali- ,. ’. sen glysiinitähteen sisältävän polypeptidin alfa-karboksyyliryhmän amidoimiseksi, joi- | · * /; loin glysiini toimii aminoryhmä-donorina. Substraattipeptidi tai -polypeptidi voidaan • · » • · puhdistaa luonnollisista lähteistä, syntetisoida sen aminohappokomponenteista tai vai- 14 110433 mistaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Glysiiniin päättyvä polypeptidi yhdistetään hapen kanssa entsyymin tehokkaan määrän läsnäollessa. Vaadittava entsyymin määrä riippuu useista tällä alalla hyvin tunnetuista muuttujista, mukaanlukien etenkin mm. seuraavat: määrätyn entsyymivalmisteen spesifinen aktiivisuus, muunnettavan substraatin määrä ja 5 kemiallinen luonne, aika, jona muunto tapahtuu, ja reaktioseoksen lämpötila ja pH.

Alan ammattihenkilöt tuntevat muita muuttujia, jotka voivat vaikuttaa entsyymin määrätyssä tilanteessa tarvittavaan tarkkaan määrään. Happi on tavallisesti läsnä mooliylimääränä reaktiossa substraatin konsentraation suhteen. Kupari(II)-ionien haluttu konsentraatio voidaan järjestää jollakin kuparisuolalla, jonka anioni ei vaikuta jo haitallisesti reaktioon. Entsyymillä, jonka spesifinen entsymaattinen aktiivisuus on ainoastaan n. 1 mU/mg proteiinia, maksimaalinen alfa-amidointi tapahtuu kupari(II)-ionien suhteellisen korkealla konsentraatiolla, joka on n. 4 μΜ. Koska entsyymin puhtaus kasvaa, eksogeenisen kupari(II)-ionin konsentraatiovaatimukset pienenevät. Entsymaattista aktiivisuutta voidaan lisätä myös askorbaatti-ionien läsnäololla, jotka is voidaan järjestää jollakin askorbiinihapposuolalla, niin kauan kuin suolan kationi ei vaikuta haitallisesti reaktioon. Puhdistetun entsyymin kohdalla, jonka spesifinen entsymaattinen aktiivisuus on n. 50 mU/mg proteiinia, maksimaalinen alfa-amidointiaktiivisuus tapahtuu n. 5 mM askorbaatissa. Alfa-amidointiaktiivisuutta voidaan lisätä lisäämällä katalaasia. Optimaalinen pH biologisesti relevantin substraatin 20 muuntamiseksi amidoiduiksi tuotteiksi on 6,5 - 7,5.

.Entsyymiä vastaan suunnattuja monoklonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita on saa-. '•t tu käyttämällä homogeenista entsyymiä antigeeninä immuunireaktion tuottamiseksi

I « I

• · ’ · hiirissä j a vast, kanoissa. Hakij at ovat valmistaneet sekä monoklonaalisia että polyklo- . ·: \ 25 naalisia vasta-aineita esimerkissä 8 esitetyllä tavalla. Alfa-amidointientsyymille spesi fisten vastaaineiden varastoja säilytetään hakijoiden laboratorioissa.

i a • · •' ‘1: Vasta-aineet voidaan immobilisoida kiinteälle matriisille, joka ei liukene väliaineisiin, • » a jossa sitä käytetään. Etenkin matriisi on sellainen, joka on kestävä hajoamisen suhteen.

. · ·. 30 Matriisi varustetaan funktionaalisella ryhmällä, joka pystyy sitomaan proteiinit, jolloin ,. ‘. funktionaaliset ryhmät sidotaan sitten kovalenttisesti vasta-aineisiin. Tällainen vasta- ' · t ’: aineiden immobilisointi helpottaa α-amidointientsyymin eristämistä luonnollisista ja/tai rekombinanttilähteistä. Tämä suoritetaan sekoittamalla immobilisoidut vasta-aineet ent- 15 110433 syymin raakojen valmisteiden kanssa. Vasta-aineet sitovat spesifisesti a-amidointi-entsyymimolekyylit. Saastuttavat proteiinit eivät sitoudu vasta-aineisiin ja ne poistetaan helposti eluoimalla tai linkoamalla kevyesti. Epäpuhtauksien poistamisen jälkeen a-amidointientsyymi voidaan poistaa immobilisoiduista vasta-aineista ionisen vahvuuden 5 tai pH:n muutoksilla tai lisäämällä kaotrooppisia ioneja ("Affinity Chromatography: Principles and Methods, Manual, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja ottaa talteen erittäin puhtaassa muodossa.

Entsyymi on myös puhdistettu riittävästi sen aminohapposekvenssin määrittämiseksi. io Tätä informaatiota käytettiin entsyymin nukleiinihappokoodauksen eristämiseksi.

Tämän jälkeen liittäminen sopivaan yksisoluiseen organismiin tai isäntäsoluun, joka oli eristetty monisoluisesta organismista, suoritetaan vakioilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä (ks. Maniatis, et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold 15 Spring Harbor, 1982, tai Wu, R., julk., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, 1979, jotka ovat tässä viitteenä). Saatavat solut, jotka sisältävät alfa-amidointientsyymin heterologisen DNA-koodauksen, mahdollistavat entsyymin riittävän määrän valmistuksen in vitro translaation jälkeisen alfa-amidoinnin suorittamiseksi ja teoreettisesti nämä solut mahdollistavat peptidin tai polypeptidin tämän muunnon 20 suorittamisen in vivo.

• ·. ·. Vaikkakin tätä keksintöä on selitetty sen edullisten suoritusmuotojen yhteydessä, alan : . *. ammattihenkilölle selviää useita muunnelmia ja modifikaatioita. Keksinnön edullisia • M t suoritusmuotoja selitetään edelleen seuraavien esimerkkien avulla.

• · :T: 25

Esimerkki 1 • t • · • il MTC-tuumoreista valmistetun alfa-amidomtientsvvmivalmisteen puhdistusmenetelmä • · · ;''': 30 Jäädytetyt rotan MTC-tuumorit jauhettiin hyvin pieniksi fragmenteiksi ja homogenoitiin 150 mM Tris:ssä pH 7,5, joka sisälsi 250 mM sakkaroosia, 0,25 % N-asetyyli- • · : glukopyranosidiä, 0,1 mM PMSF:ä, 20 pg/ml pepstatiinia ja 100 pg/ml soijapaputryp- • · siini-inhibiittoria. Tavanomaisesti 25 g tuumorikudosta homogenoitiin 200 mkaan yllä 16 110433 esitettyä puskuria jäässä. Homogenointi saatiin aikaan neljällä 20 sekunnin murskauksella, joissa käytettiin kulloinkin Polytron-homogenointilaitetta (Brinkman) säädössä 7. Homogenaattia lingottiin 15 minuutin ajan 9.000 g:ssä JA-20-roottorissa (Beckman) ja supematantti (Sup. 1) dekantoitiin. Pelletti homogenoitiin uudestaan 60 ml:ssa homo-5 genointipuskuria kolmen 20 sekuntia kestävän murskauksen ajan kulloinkin säädöllä 7. Tätä toista homogenaattia lingottiin samoin 15 minuutin ajan 9.000 g:ssä. Tämän linko-uksen supematantti (Sup.2) yhdistettiin Sup.l:n kanssa. Yhdistettyjä Sup.l:täja Sup.2:ta lingottiin sitten 30 minuutin ajan 100.000 g:ssä SW28-roottorissa (Beckman) 4 °C:ssa. Selkeytettyyn homogenaattiin (Sup.3) lisättiin riittävä määrä ammoniumsul-10 faattikiteitä 25 %:isen liuoksen muodostamiseksi ammoniumsulfaatissa. Kiteitä lisättiin asteittain 15 minuutin ajan sekoittaen tasaisesti homogenaattia 4 °C:ssa. Sekoitettiin edelleen 30 minuutin ajan 4 °C:ssa, sitten seosta lingottiin 15 minuutin ajan 27.000 g:ssä JA-20-roottorissa (Beckman) 4 °C:ssa. Supematantti dekantoitiin ja supematant-tiin lisättiin lisää ammoniumsulfaattia liuoksen tekemiseksi 40%:iseksi ammoniumsul-15 faatissa. Sekoitettiin edelleen 30 minuutin ajan, sitten seosta lingottiin edelleen 15 minuutin ajan 27.000 g:ssä yllä esitetyllä tavalla. Tämän linkouksen supematantti heitettiin pois ja pelletti, joka sisälsi vähintään 50 % homogenaatin koko entsyymiaktiivisuudesta, suspendoitiin uudelleen 50 mM Tris HCltään, pH 7,0, näytteen muodostamiseksi. Aktiivisuus oli 8,2 mU/mg proteiinia.

20 ’". ’ Seohacrvl S-300-geelisuodatusekskluusiokromatografia « « · · • _ ; , ·. Sephacryl S-300 (Pharmacia) tasapainotettiin 50 mM Tris HCliään pH 7,0 ja kaadettiin < i · f * · t : *. ·. K 50/100-pylvääseen (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pylvään kerrostila- » · . * ]'; 25 vuus oli n. 1,3 litraa. Näyte kuormattiin pylväälle määränä, joka oli n. 3 % pylvään ker- rostilavuudesta. Proteiinit eluoitiin pylväästä 50 mM Tris HCl:ssä pH 7,0 virtausnopeu-: * *.: den ollessa n. 2 ml/min. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne analysoitiin alfa- ‘ : amidointientsyymiaktiivisuuden suhteen käyttämällä dansyyli-D-Tyr-Val-Gly- . y. substraattia. Entsyymi eluoitui pylväästä aktiivisuuden yhtenä ainoana huippuna, kuten .'": 30 on esitetty kuviossa I molekyylimassan ollessa 60.000 - 65.000 daltonia. Aktiivisuus oli ; · ‘ · t vähintään 50 mU/mg proteiinia.

» * I

i k I

• · 17 110433

Mono O-kromatografia pH-arvossa 6.0 - vahva anioninvaihtokromatografia

Sephacryl S-300-pylvään fraktiot Jotka sisälsivät maksimaalisen entsyymiaktiivisuuden, yhdistettiin ja dialysoitiin 20 mM bis-Tris-puskuria, pH 6,0,4 litraa vastaan. Neste 5 lastattiin sitten Mono Q HR 5/5-pylväälle (Pharmacia), joka oli esikäsitelty valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tasapainotettu 20 mM bis-Tris:ssä pH 6,0. Proteiinit, jotka eivät sitoutuneet pylvääseen, kerättiin pylväseluenttiin (läpivirtaus), ja sitten sitoutuneet proteiinit eluoitiin lineaarisella suolagradientilla 0 - 300 mM NaClrä 20 mM bisTris.ssä, pH 6,0. Pylväs ajettiin virtausnopeudella 0,5 ml/ min. ja kulloinkin 2 ml:n fraktiot kerätyt? tiin. Proteiinien liuos, joka eluoitiin Mono Q-pylväästä pH-arvossa 6,0, neutraloitiin välittömästi keräämällä putkiin, jotka sisälsivät kukin 200 μΐ 1,0 M Tris:iä, pH 7,0. Fraktiot analysoitiin alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden suhteen kuten edellä ja havaittiin aktiivisuuden huippu, joka eluoitiin pylväästä n. 160 mM NaCkssä (kuv. II). Aktiivisuus oli 161 mU/mg proteiinia.

15

Mono O-kromatografia pH-arvossa 8.0

Fraktiot, jotka sisälsivät alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden huipun Mono Q- kromatografiasta pH-arvossa 6,0, dialysoitiin kahta 4 litran vaihtoa vastaan, joista kum- . 20 pikin sisälsi 50 mM Tris HCl:ä pH 8,0. Entsyymi laitettiin sitten Mono Q HR 5/5- • · " ’. * pylväälle (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 50 mM Tris HCkllä pH 8,0. Proteiinit . 1 /. t eluoitiin suolagradientilla 0 - 300 mM HCl:ä 50 mM Tris HCkssä pH 8,0. Virtausno- • · : . ·, peutena käytettiin 0,5 ml/min. ja kerättiin 2 ml:n fraktioita. Jokainen fraktio neutraloi- « · • · · · : v, tiin lisäämällä 200 μΐ 1,0 M Tris:iä pH 7,0 jokaiseen koontiputkeen. Nähtiin kaksi eril- • ·

. ·: ·; 25 listä entsyymiaktiivisuuden huippua eluoimalla 190 mM NaCkssä ja vast. 220 mM

NaCkssä (kuv. III). Aktiivisuudet olivat vähintään 80 mU/mg proteiinia ja vast. 400 : ‘ ·.: mU/mg proteiinia.

• · t t » • · ·

Mono O-kromatografian. pH 8.0. entsyymin huippufraktion geelielektroforeesi .‘· 30 % · « k

Entsyymin huippufraktion määräosa, joka eluoitiin 220 mM NaCkssä ja jonka aktiivi- I · suus oli 408 mU/mg proteiinia, laitettiin 10%:iselle SDS-polyakryyliamidigeelille sen • · · • · jälkeen, kun se oli lämpödenaturoitu puskurissa, joka sisälsi SDS:ä ja B- 18 110433 merkaptoetanolia (kuv. IV). Yksi ainoa kaista havaittiin fraktiosta, joka eluoitiin 220 mM NaClrssä. Tämän kaistan ilmeinen molekyylimassa on n. 73.000 - 75.000 daltonia.

73.000 - 75.000 daltonin kaistan identiteetin vahvistaminen alfa-amidointientsvvminä 5

Ylimääräisestä alfa-amidointientsyymivalmisteesta, joka oli puhdistettu käyttämällä yllä esitettyjä kriteerejä, käytetiin määräosia elektroforeesia varten ei-denaturoidulla 10%:isella akryyliamidigeelillä. 50 μ!:η määräosia laitettiin kummallekin kaistalle. Elektroforeesin jälkeen toisen kaistan proteiini visualisoitiin käyttämällä hopeavärjäys-10 menetelmää. Toisesta kaistasta leikattiin 3 mm:n suikaleita ja jokaista suikaletta inku-boitiin mikrotiitterilevyn yhdessä syvennyksessä. Jokaiseen syvennykseen lisättiin 100 μΐ seosta, joka sisälsi dansyylisubstraattia, katalaasia, askorbiinihappoa ja 150 mM Trisiä pH 7,0. Inkuboitiin 16 tunnin ajan 37 °C:ssa ravistellen jatkuvasti. Määräosat jokaisesta syvennyksestä analysoitiin sitten substraatin amidoiduksi tuotteeksi tapahtu-15 neen muunnon suhteen. Entsymaattista aktiivisuutta todettiin kahdessa geeliviipaleessa. Aktiivisuus vaelsi voimakkaasti värjäytyvän proteiinikaistan mukana vastaavassa värjätyssä geelikaistassa (kuv. V).

Esimerkki 2 20 "V Menetelmät ihmisperäisen rekombinoidun kalsitoniinin valmistamiseksi • · · • ♦ · ; t · t Ihmisen kalsitoniini on 32-aminohappopeptidihormoni, jossa on amidoitu prolyylitähde • · · • · · · : ·. ·. sen karboksyylipäätteessä. Mikroorganismi manipuloitiin geneettisesti rekombinantti- • · « · ,··.·. 25 fuusioproteiinin muodostamiseksi, joka sisälsi aminohapposekvenssin, joka vastasi ih misen kalsitoniiniä. Fuusioproteiinigeeni suunniteltiin siten, että ihmisen kalsitoniinise- : 1 ·,: kvenssi tuettiin arginyylitähteellä sen aminopäätteessä ja sen karboksyylipäätteessä gly- • 1 ’' ’: syylitähteellä, joka myös päätti rekombinanttifuusioproteiinin (ks. kuv. VII). Ihmisen t«» . ·, ·, kalsitoniinigeenin yhdistämisen jälkeen plasmidiin sopivan fuusioplasmidin muodosta- . 1 1. 30 miseksi mikro-organismi transformoitiin tämän plasmidin kanssa ja saatiin fuusion il- .. 1. maisu (ks. kuv. VI). Tämä ihmisen kalsitoniinia sisältävä proteiini eristettiin rekombi-

» I

‘. t 1; nanttimikro-organismien lysaateista saostamalla. Kysteinyylitähteet muunnettiin S- • · sulfonaateiksi ja lysyylitähteet lukittiin palautuvasti reaktiolla sitrakonihappoanhydridin 19 110433 kanssa. Koska ihmisen kalsitoniini ei sisällä arginiinia, rekombinanttifuusioproteiinin tryptinen hajottaminen tuotti peptidin, joka sisälsi ihmisen kalsitoniinisekvenssin, jossa oli karboksyyliterminaalinen glysiinipidennys. Tämä peptidi eristettiin joko käänteis-faasi-HPLC:llä (ks. kuv. VIII) tai ioninvaihtokromatografialla ja sen rakenne vahvistet-5 tiin aminohappo- ja mikrosekvenssianalyy sillä.

Peptidin glysyylitähde poistettiin ja viimeistä edellinen prolyyli muunnettiin prolii-niamidiksi tämän keksinnön mukaisella alfa-amidointientsyymillä. Tämän peptidin puo-lipreparatiivisen alfa-amidoinnin olosuhteiden esimerkki on seuraava: Lyofilisoitu pep-10 tidi (200 - 300 nanomoolia) (substraatti) liuotettiin 200 pl:aan 150 mM Tris-HCl- puskuria, pH 7, joka sisälsi n. 750 uU alfa-amidointientsyymivalmistetta. Entsyymi johdettiin joko rotan MTC-kudoksesta tai rotan MTC CA-77-solulinjasta peräisin olevasta käytetystä kudosviljelyväliaineesta. Entsyymi puhdistettiin siinä määrin, että koko pro-teolyyttinen aktiivisuus oli poistettu. Tämä suoritettiin ioninvaihto-ja ekskluusiokroma-15 tografian yhdistelmällä (ks. edellä esitettyä menetelmää). Puhdas, homogeeninen entsyymi ei ollut vaatimuksena. Sitten tähän seokseen lisättiin askorbiinihappoa ja kupari-sulfaattia riittävinä määrinä, niin että lopullisiksi konsentraatioiksi saatiin n. 3 mM ja vast. 2 uM. Saatua liuosta sekoitettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5-6 tunnin ajan. Tavanomaisesti substraatin tuotteeksi tapahtuvan muunnon prosenttimäärä on 70 - 90 %. S- . 20 sulfonaattiryhmien poistamisen jälkeen ihmisperäinen rekombinoitu kalsitoniini (rhCT) « · " V puhdistettiin käänteisfaasiHPLC:llä (ks. kuv. IX). Lopullinen tuote luonnehdittiin sen . I 1. retentiolla käänteisfaasi-HPLC:llä (ks. kuv. X), kvantitatiivisellä tryptisellä kartoituk- ; , ·, sella (ks. kuv. XI), aminohappoanalyysillä (ks. taulukko I) ja sen biologisella aktiivi- • 1 » • i · 1 : ·. ·. suudella (ks. kuv. XII). Kaikissa tapauksissa ihmisperäistä rekombinoitua kalsitoniiniä • · . 1: ·; 25 ei voitu erottaa ihmisen synteettisestä kalsitoniinistä.

: 1 ·, I Edellä esitetty osoittaa, että tämän keksinnön mukaisesti saadut valmisteet pystyvät • · • ’ “: amidoimaan fysiologisesti relevantin substraatin, esim. ihmisen kalsitoniinin, joka on • · · , ·. ·, valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, s.o. sisältää ainoastaan L-aminohappoja.

• · .’'1. 30 > · • » a I > ·

> » I

• · · t > I • »I • 4 20 110433

Vertailuesimerkit

Esitetyn valmisteen aktiivisuuden vertailu tunnettuun alan tasoon Analvvsiiäriestelmien vertailu esitettyjen valmisteiden spesifisen aktiivisuuden määrit-5 tämiseksi

Tunnetulla alan tasolla on käytetty useita aktiivisuuden analysointijärjestelmiä. Useimmat tunnettuna alan tasona esitetyt työt ovat käyttäneet analyysiä, joka perustuu DTyr-Val-Gly:n muuntoon D-Tyr-Val-amidiksi. Tässä analyysissä käytetään radioaktiivisesti ίο leimattua merkkiainetta ( I-DTyr-Val-Gly), joka sekoitetaan ei-leimatun materiaalin (DTyr-Val-Gly) ylimäärän kanssa. Leimatun merkkiaineen muunnon mittaus mahdollistaa ekstrapoloinnin leimaamattomaan materiaaliin ja tämä puolestaan mahdollistaa aktiivisuuden laskemisen.

15 Vaikka hakijat ovat käyttäneet tätä analyysiä, esitettyjen valmisteiden aktiivisuuden määritykset perustuvat siihen, että mitataan suoraan dansyyli-Tyr-Val-Gly:n muunto dansyyli-T yr-Vai-amidiksi.

Tunnettujen valmisteiden spesifisen aktiivisuuden mielekkään vertailun mahdollistami- . 20 seksi tämän keksinnön mukaisiin valmisteisiin on suoritettu kokeita analyysijäqestelmi- • · • · ” V en vertaamiseksi.

• · · • · * I · • · ♦ · ; Koekäytännöt olivat seuraavat: » · · »«« · • · · t · · • · .*.·. 25 I. Monodanswli-L-Tvr-Val-Glv • · · - -• ;| Näissä kokeissa käytettiin entsyymilähteenä alfa-amidointientsyymivalmistetta, joka oli • ” ’: eristetty rotan medullaarisista kilpirauhaskarsinoomatuumoreista j a kudosvilj elyväliai- . v, neista, jotka oli kerätty CA-77-soluista. Käytetyn entsyymin konsentraatio oli kaikissa . · · ·. 30 kokeissa vakio, mikäli toisin ei ole mainittu.

» · » *» » » » t • * » * · 21 110433

Reaktioseos monodansyylisubstituutin muuntamiseksi sisälsi: 5 μΐ entsyymiä 5 μΐ 30 mM askorbaattia 5 5 μΐ 20 μΜ CuS04:ä 5 μΐ 100 pg/ml naudan haimakatalaasia 5 μΐ sisältäen 2 nmoolia substraattia 25 μΐ 150 mM TEStiä pH 7,0 10 Näytteet valmistettiin kahtena kappaleena ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 10,20 ja 30 minuutin ajan. Entsymaattinen reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 μΐ 500 mM EDTAtta. Substraatti ja tuote erotettiin käänteisfaasi-HPLCrllä käyttämällä Hewlett Packard-1090-nestekromatografiajäqestelmää ja määritys saatiin aikaan käyttämällä HP-3392-integraattoria. Monodansyyli-L-Tyr-Val-Gly:n muunnon alfa-amidoiduksi tuotteeksi is osoitettiin olevan lineaarinen ajan suhteen.

II. 125I-D-Tvr-Val-Glv D-Tyr-Val-Gly ja D-Tyr-Val-NH2 jodattiin Pierce Chemical Companyn jodipalloilla.

. 20 Radioaktiivisesti leimattua substraattia ja tuotetta käytettiin sulfyyli-propyyli- *!V kationinvaihtopylväänkalibroimiseksi. 125I-D-Tyr-Val-Gly:tä lisättiin 650 pMD-Tyr- .! _ i t Val-Gly:hyn ja käytettiin substraattina. Reaktioseos monodansyylisubstraatin muunta- k · ; miseksi sisälsi: • · · 14· · » * · I · • · ,' j1. 25 5 μΐ entsyymiä 5 μΐ askorbaattia (30 mM) : ’ ·,: 5 μΐ 100 pg/ml katalaasia 5 μΐ20 pMCuSO^ä , ·, *, 5 μΐ substraattia, 650 μΜ lopullinen kons.

."1. 30 25 μΐ 150 mM TES:iä pH 7,0 »*k i » · » k Näytteitä inkuboitiin 10,20 ja 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisää- • k » • k mällä 500 mM EDTA:ta. Koko näyte laimennettiin 10 mM natriumfosfaattipuskurilla, 22 110433 pH 5,2, ja laitettiin sulfyyli-propyyli-kationinvaihtopylvääseen. Substraatti ei sitoudu pylvääseen. Amidoitu tuote eluoitiin 500 mM NaCl:llä. Radioaktiivisesti leimatun substraatin muunto tuotteeksi oli lineaarinen ajan suhteen.

5 III. D-Tvr-Val-Glv D-Tyr-Val-Gly:n amidointiin käytetyt reaktio-olosuhteet olivat samat kuin dansyylin ja jodattujen substraattien kohdalla. Reaktioseoksen substraattikonsentraatio oli 650 uM. Substaatin ja tuotteen erotus saadaan aikaan gradienttieluoinnilla käänteisfaasi-HPLC:llä käyttämällä HP-1090-nestekromatografiajärjestelmää. Pylvään effluentteja io valvottiin 280 nm.ssä. Tämän analyysin herkkyystaso on paljon alhaisempi kuin dansyylin tai jodattujen substraattien. Tämän alhaisemman herkkyystason sovittamiseksi alfa-amidointireaktiot suoritettiin pitempinä aikajaksoina ja/tai alfa-amidointientsyymin suuremmilla määrillä.

is 125I-D-Tyr-Val-Gly:n 125I-D-Tyr-Val-amidiksi ja dansyyliTyr-Val-Gly:n dansyyli-Tyr-Val-amidiksi tapahtuvan jakomuunnon arvojen analyysi osoittaa, että jokaisena ajankohtana muunnetaan n. 1,55 kertaa enemmän jodattua substraattia kuin dansyylisubst-raattia. Siten verrattaessa tunnetun alan tason analyysijäqestelmää hakijoiden käyttämään analyysijärjestelmään on käytettävä muuntotekijää, joka on 1,5 kertaa dansyy-, 20 lisubstraattimenetelmällä (hakijoiden) määritetty aktiivisuus.

• i • i I » · · • · ι i · ,! * Edelleen jonkin verran ankarampaa kineettistä analyysiä on myös käytetty (hakijoiden) » » . dansyyli-Tyr-Val-Gly-analyysin vertaamiseksi (tunnetun alan tason) D-Tyr-Val-Gly- • » · ; ·. ·, analyysiin. Tämä analyysi osoittaa: » · • · • ·» jc * · · I I I i

Substraatti Km Vmax D-Tyr-Val-Gly 37 31 • * (tekniikan taso) i · » dansyyli-Tyr-Val-Gly 1,7 21 • 1 I • · ,·**, 30 (hakijoiden) • · II» I > » * * *

I I

\ \ Kuten voidaan nähdä vertaamalla näiden kahden substraatin maksimaalista nopeutta • i * (Vmax = pmol tuotetta/min/μΐ) D-TyrVal-Gly (tekniikan taso) tuottaa n. 1,48 niin pal- 23 110433 jon aktiivisuutta kuin dansyyli-Tyr-Val-Gly (hakijat). Tämä on yhtäpitävä yllä esitettyjen havaintojen kanssa ja vahvistaa ne.

Aktiivisuuden vertailu 5

Eipper et ai. (PNAS) esittävät sivulla 5147, kuv. 4, että Vmax on 39 pikomoo-lia/mikrogramma/tunti. Tämä vastaa spesifistä aktiivisuutta, joka on 0,65 mU/mg prote-iinia/min. Tämä on korkein aktiivisuus, mitä on tähän asti alalla esitetty. Jakamalla tämä edellä mainitulla muuntotekijällä 1,5 johdetaan spesifinen aktiivisuus, joka on 0,4 10 mU/mg proteiinia/ min. Tätä arvoa voidaan nyt verrata suoraan hakijoiden saavuttamiin edellä mainittuihin spesifisiin aktiivisuuksiin. Hakijat, kuten edellä esitettiin, ovat saavuttaneet aktiivisuuksia, jotka ovat vähintään 25 mU/mg proteiinia ja suurempia kuin 1500 mU/mg proteiinia. Hakijat ovat siten saavuttaneet aktiivisuuden, joka on 60 - yli 3.750 kertaa Eipperin (PNAS) esittämä aktiivisuus.

15

Esimerkki 3

Rotan MTC-tuumorista peräisin olevien alfa-amidointientsvvmien puhdistus ia karakterisointi 20 . ’ * *: Jäädytetty rotan MTC-kudos jauhettiin hyvin pieniksi fragmenteiksi ja homogenoitiin . ' · vesipitoisessa puskurissa käyttämällä Polytron-homogenisaattoria. Alhaisella nopeudel- •. · ; la suoritetun linkoamisen jälkeen supematantti säästettiin ja pelletti uutettiin uudelleen : *. · tuoreella puskurilla. Tämä toinen homogenaatti alistettiin jälleen alhaisella nopeudella :.: * 25 tapahtuvaan linkoukseen ja tämä supematantti yhdistettiin ensimmäisen kanssa. Nämä kaksi yhdistettyä supematanttia selkeytettiin sitten linkoamalla suurella nopeudella ja • # · tämän linkouksen supematanttia käytettiin lähtöaineena entsyymin puhdistamiseksi.

• » • · · :;: Suoritettiin korkealla nopeudella lingotun supematantin ammoniumsulfaattijakotislaus.

' ·. · * 30 Suurimman osan entsyymiaktiivisuudesta todettiin saostuvan 26 - 40 %:n ammonium- | sulfaattifraktiossa ja tämän fraktion pelletti puhdistettiin edelleen alla esitetyllä tavalla.

• · · » · 24 110433

Ekskluusiokromatografia suoritetiin Sephacryl S-300-pylväällä. Esimerkissä 1 koko entsyymi eluoitiin pois tästä pylväästä aktiivisuuden yhdessä ainoassa huipussa. Tässä esimerkissä pylvään pituutta lisättiin ja pylvään virtausnopeutta vähennettiin. Näissä uusissa eluointiolosuhteissa nähtiin aktiivisuuden suurehko huippu (kuten esimerkissä 5 1), jota seurasi pienempi jäljessä tuleva huippu, joka voi vastata entsyymin alhaisem man molekyylipainon omaavaa muotoa. Tässä kohdassa on epäselvää, esiintyykö entsyymin alhaisen molekyylipainon omaava muoto in vivo vai tuotetaanko se osittaisella proteolyyttisellä sulatuksella uuttamisen ja puhdistuksen aikana.

ίο S-300-pylvään aktiivisuuden suurempi huippu yhdistettiin ja kromatografoitiin Mono Q-pylväällä pH-arvossa 6,0. Tässä esimerkissä käytettiin suurempaa, preparatiivista pylvästä kuin esimerkissä 1 (Mono Q HR 10/10), joka eluoitiin käyttämällä vähemmän jyrkkää lineaarista suolagradienttia. Näiden muutosten tuloksena tässä vaiheessa havaittiin neljä alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden huippua, jotka eluoitiin 160 mM, 200 15 mM, 220 mM ja 240 mM NaClrssä (kuvion XIII huiput I, H, III ja vast. IV). Tämä osoittaa, että on olemassa entsyymin monenlaisia muotoja ja että näillä muodoilla on varausheterogeenisyys. Edelleen proteiinien polyakryyliamidigeelianalyysi entsyymiak-tiivisuushuipuissa osoittaa, että huiput II, III ja IV sisältävät suunnilleen saman molekyylipainon omaavan alfa-amidointientsyymin (s.o. 73.000 75.000), kun taas huippu I : *: 20 sisältää erilaisen, mahdollisesti pienemmän molekyylipainon omaavan entsyymin. Hui- IM · . * · ·: pun III aktiivisuus puhdistettiin homogeeniseksi seuraavasti: • · »· · • · t · • · __ • t · · Huipun III entsyymi yhdistettiin j a kromatografoitiin Mono Q HR 10/10-pylväällä pH- • *. ’ arvossa 8,0 (kuv. XIV). Entsyymi eluoitiin tästä pylväästä yhtenä ainoana huippuna 250 • · · •.· * 25 mM NaCl:ssä ja geelianalyysi vahvisti, että entsyymi oli puhdistettu homogeeniseksi (kuv. XVa, kaista 6). Seuraavat karakterisointikokeet suoritettiin huipun III puhdistetul- « ·

• I I

' · * · la entsyymillä: • · · • · · • · :: 1. Huipun III entsyymin molekyylipaino määritettiin 7 %:n polyakryyliamidigeeli- •...: 30 analyysillä n. 75.000 daltoniksi (kuv. XVb).

: *. 2. Entsyymin aktiivisuuden pH-optimi määritettiin arvoksi 5,0-5,5 käyttämällä sub straattina N-dansyyli-Tyr-ValGly:tä (kuv. XVI). Kuitenkin entsyymin lisääntyneen sta- 25 110433 biiliuden johdosta neutraalissa pH-arvossa voi olla edullista suorittaa amidointireaktio tällaisessa pH-arvossa.

3. Määritettiin, että entsyymiaktiivisuuden kofaktoriksi vaaditun kuparin määrä oli 5 kääntäen verrannollinen entsyymin puhtauden suhteen. Homogeeniseksi puhdistettu entsyymi vaati 0,1 μΜ tai vähemmän Cu^-ioneja maksimaalista aktiivisuutta varten, kun taas entsyymin raa'at valmisteet tarvitsivat 2 μΜ Cu^-ioneja.

4. Entsyymin isoelektrinen piste (pl) oli 4,8.

10 5. Huipun III homogeenisen entsyymin spesifinen aktiivisuus oli 2.100 mU/mg proteiinia.

Huipun II entsyymi puhdistettiin myös homogeeniseksi. Kuitenkin tämän entsyymin is kanssa todettiin, että Mono Q-kromatografia pH-arvossa 8,0 oli riittämätön homogeenisen valmisteen valmistamiseksi. Tästä syystä Mono Q-pylvään, pH 6,0, huipun II koko entsyymi (kuv. XIII) dialysoitiin 1 M Trisiä, pH 7,0, vastaan ja täytettiin fenyylisefa-roosipylvääseen, joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Suvuin osa saastuttavista proteiinilajeista otettiin talteen pylvään läpivirtauksessa ja amidointientsyymi, joka elu-: : 20 oitiin myöhemmässä vaiheessa, oli olennaisesti puhdistettu. Fenyylisefaroosipylvään •, ’" yhdistetyn entsyymin edelleenpuhdistus Mono Q HR 10/10-pylväällä, pH 8,0, tuotti * « ♦

• *.: huipun II entsyymin homogeenisen valmisteen, joka eluoitiin pylväästä 220 mM

• · :.: : NaClissä tai sen yli.

• » · • · • · · "·’ ’ 25 Huipun II entsyymin karakterisointi vahvisti, että *; * · 1. Huipun II entsyymin molekyylipaino 7 %:n polyakryyliamidigeelielektroforeesilla oli n. 73.000 - 75.000 daltonia. Siten huipun Ilja huipun III entsyymejä ei voitu erottaa • » v. * vertaamalla niiden molekyylimassaa.

’···* 30

| ’ m‘· 2. Huipun II entsyymin aktiivisuuden pH-optimi oli 5,0-5,5. Jälleen tämä huipun II

:: entsyymin ominaisuus on sama kuin huipun III entsyymin.

26 110433 f ! 3. Huipun II entsyymin isoelektrinen piste (pi) oli n. 5,8.

Esimerkki 4 5 CA-77-solukudosvilielwäliaineista johdetun alfa-amidointientswmin puhdistus ia karakterisointi

Rotan medullaarista kilpirauhaskarsinoomasolulinjaa, CA-77, kasvatettiin yksikerroksisena viljelynä 150 cm3:n T-pulloissa (Corning) 8 %:ssa C02.’a. Viljely pidettiin määrä-10 tyssä väliaineessa, joka sisälsi Dulbecco's Modified Eagle Mediumia: F-10 (1:1), 3,7 g!\ NaHCC^.a, 5 pg/ml transferriiniä, 10 pg/ml insuliinia, 30 nM seleeniä ja 4 pg/ml gen-tamysiinisulfaattia. Tällä tavalla kasvatettuja viljelyjä voitiin säilyttää loputtomiin, jos väliaine vaihdettiin joka 48. tunti. Solujen kannan lisäämiseksi niitä aliviljeltiin ja kasvatettiin kolmen päivän ajan väliaineessa, joka sisälsi seerumia (5 % hevosen ja 2,5 % 15 fetaalisen vasikan seerumia). Solut pestiin sitten kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja täydennettiin määrätyllä väliaineella.

Kudosviljelyväliaineet kerättiin aseptisesti 48 tunnin aikataululla ja varastoitiin -20 °C:ssa siihen asti, kun ne puhdistettiin. Kudosviljelyväliaineet (tavanomaisesti 6 :*: 20 litraa) laimennettiin 2 litralla deionoitua vettä (3:1) ja laitettiin 50 ml/min.:n virtausno- • ‘" peudessa heikkoon DEAE-anioninvaihtopatruunaan (Cuno =f=250), joka oli edellä tasa- • painotettu 1,0 litralla 20 mM bis Tris:HCl:ä, pH 6,0,4 °C. Alfa-amidointientsyymi ("al-

:.· : fa-AE") eluoitiin patruunasta asteittain virtausnopeuden ollessa n. 50 ml/min. 50 mM

: . ‘ Tris HCkllä, pH 7,0, joka sisälsi 500 mM NaCl:ä. Kahden anioninvaihtovalmisteen * · · *·' 25 fraktiot, jotka sisälsivät alfa-AE-aktiivisuuden (spesifinen aktiivisuus 10-15 mU/mg), yhdistettiin ja konsentroitiin 4-...5-kertaiseksi alennetussa paineessa käyttämällä Savant t · * RH-100 prep. roottoria.

« · *. v Tämä materiaali laitettiin suoraan 5 x 50 cm:n pylvääseen, joka sisälsi Sephacryl 300- » · ‘ · · · * 30 SF.ä (Pharmacia). Liikkuva faasi oli 100 mM Tris:HCl, pH 7,0,1,0 ml/min. :n virtaus- j ‘nopeudessa. Koko geelisuodatuskromatografia suoritettiin myös 4 °C:ssa (kuv. XVII).

• · 27 110433

Amidointientsyymivalmiste on tässä puhdistusvaiheessa vapaa ei-spesifisestä proteo-lyyttisestä aktiivisuudesta ja sen aktiivisuus on vähintään 50 mU/mg proteiinia. Tämän vaiheen amidointientsyymivalmistetta on käytetty onnistuneesti rekombinoidun gly-laajennetun ihmisen kalsitoniinin ja kasvuhormonia vapauttavan tekijän amidoimiseksi.

5 Lähtemällä solutiheydestä 1 -1,5 x 106 solua/ml (T-pulloista) olemme tavanomaisesti saaneet saantona 200 - 350 mU amidointientsyymiaktiivisuutta/1 käytettyä väliainetta näiden kahden puhdistusvaiheen jälkeen. Entsyymi on stabiili ja sopiva käytettäväksi liuoksena tai kiinteään kantoaineeseen suoritetun immobilisoinnin jälkeen.

io Pylväsfraktiot, jotka sisältävät alfa-AE-aktiivisuuden, yhdistettiin ja dialysoitiin sitten 20 mM bis Tris:HCl:n, pH 6,0,6 litraa vastaan. Entsyymi laitettiin Mono Q HR 10/10 vahvaan anioninvaihtopylvääseen (Pharmacia), joka oli edellä tasapainotettu 20 mM bis Tris:HCl:llä, pH 6,0. Entsyymi eluoitiin pylväästä käyttämällä lineaarista 0 - 300 mM NaCl:n gradienttia kolmen tunnin kuluessa virtausnopeuden ollessa 2,5 ml/min. Neljä 15 alfa-amidointientsyymiaktiivisuuden kromatografisesti erilaista muotoa erotettiin tässä puhdistusvaiheessa. Huiput numeroitiin pylvään eluointijäqestyksessä (kuv. XVIII). Huiput III ja IV merkitsevät entsyymin korkeamman molekyylipainon omaavia muotoja ja vastaavat MTC-tuumorista johdettuja huippuja Ilja III. Huiput I ja II merkitsevät entsyymin alhaisemman molekyylipainon omaavia muotoja, jotka voivat olla huipun III : ’: 20 j a IV proteolyyttisiä fragmenttej a.

• '.: Laboratoriossamme tunnistetut neljä erilaista alfa-amidointientsyymin muotoa poikkea- • · :. · : vat toisistaan kokonaispintavarauksensa suhteen, kuten osoitetaan erilaisilla retentio- i '.: ajoilla vahvan anioninvaihtokromatografian aikana (kuv. XVIII). Näiden entsyymin • · t

V * 25 nelj än kromatografisesti erilaisen muodon pH-optimi on myös erilainen. Kuvion XIX

tulokset osoittavat, että huipuilla lilja IV on samanlainen pH-optimi 5,0 - 5,5. Nämä • · · ‘ · tulokset ovat yhtäpitäviä pH-optimin kanssa, joka määritettiin MTC-tuumorista puhdis- • · tetuille huipuille II ja III. Huipuilla I ja II on paljon laajempi pH-aktiivisuusalue, joka :.:. * on 5 - 8,5 (kuv. XIX). Nämä tulokset ovat tarkoin yhtäpitäviä pH-optimien kanssa, joita ‘ · · · * 30 ovat esittäneet Eipper et ai., Peptides, Voi. 4, s. 921 -28 (1983) ja Murthy et ai., J. Biol.

Chem., Voi. 261, s. 1815-22 (1986).

• » , » · • · · • · 28 110433 ΙΛί

Huipuista II ja IV peräisin olevan entsyymin radioaktiivinen merkintä Na I:llä ja SDS-PAGE:lla vahvistivat, että huipun IV entsyymiaktiivisuuden likimääräinen mole-kyylimassa oli 73 - 75 kDal, kun taas huipun II entsyymiaktiivisuus oli alle 55 kD. Tarkka molekyylipaino on tuntematon huipun II entsyymille, koska sitä ei puhdistettu 5 homogeeniseksi (useat proteiinikaistat ovat ilmeisiä 45 - 55 kDal:n alueella).

Huipun III ja IV entsyymi voidaan puhdistaa homogeeniseksi käyttämällä hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian ja vahvan anioninvaihtokromatografian yhdistelmää pH-arvossa 8,0. Huipun IV entsyymin (kuv. XVIII) aktiivisuus yhdistettiin, konsentroitiin 10 n. 2 ml:aan tyhjiössä ja laitettiin suoraan 1,3 x 8 cm:n pylvääseen, jossa oli fenyylisefa-roosia (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 500 mM Tris:HCl:llä, pH 7,0. Alfa-AE-aktiivisuuden sisältävät fraktiot eluoitiin tasapainotuspuskurilla virtausnopeudella 0,5 ml/min. (kuv. XX). Alfa-amidointiaktiivisuuden sisältävät huippufraktiot yhdistettiin, dialysoitiin 50 mM Tris:HCl:ä, pH 8,0, vastaan, minkä jälkeen ne laitettiin Mono Q HR is 10/10-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 50 mM Tris:HCl:llä, pH 8,0. Entsyymi eluoitiin pylväästä käyttämällä lineaarista 0 - 300 mM NaCl:n gradienttia kolmen tunnin kuluessa virtausnopeuden ollessa 2,0 ml/min. (kuv. XXI). Alfa-AE-aktiivisuuden sisältävät fraktiot, jotka oli eluoitu 240 mM:ssä tai yli n. 240 mM:ssä, yhdistettiin, säädettiin 0,001 %:iin (v/v) Triton X-100:ssa ja varastoiotiin 4 °C:ssa. Puhdistetun entsyymin : ’: 20 spesifiseksi aktiivisuudeksi määritettiin n. 1500 mU/mg proteiinia pH-arvossa 7,0. Hui- .' · ·: pun III alfa-AE-aktiivisuus puhdistettiin homogeeniseksi käyttämällä huipun IV yhtey- . "/· dessä esitettyjä menetelmiä.

• I

• · · • · · * • · · : *. · Tuumorin huipun (esim. 3) ja kudosviljelyn huipun (esim. 4) fysikaalis-kemialliset omi- • t · :* 25 naisuudet mukaanlukien molekyylimassa (73.000 - 75.000 daltonia), pH-optimi (5,0 - 5,5), aminoterminaalisekvenssi ja eluointiasema (suurempi kuin n. 240 mM natrium- • ·

t t I

’ · ' · kloridi vahvasta anioninvaihtokromatografiasta, joka suoritettiin pH-arvossa 8,0) osoit- • · ;* tavat, että nämä kaksi huippua voivat merkitä samaa entsyymiä.

• ·

• « I

• · · • · * • t * I * I » ·

Esimerkki 5 29 110433

Biologisesti relevanttien peptidihormonien alfa-amidointi käyttämällä alfa-amidointientsvvmiä 5

Useita rekombinoituja peptidihormonisubstraatteja, mukaanlukien lohen ja ihmisen kalsitoniinin, ihmisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän ja ihmisen kalsitoniini-geenin sukuisen peptidin substraatit, on valmistettuja alfa-amidoitu onnistuneesti tämän keksinnön mukaisella alfa-amidointientsyymivalmisteella. Alla on esitetty esimerkkinä ίο menetelmät, joita käytettiin rekombinoidun lohen kalsitoniinin, ihmisen kalsitoniini-geenin sukuisen peptidin ja ihmisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän valmistamiseksi. Samantyyppisiä menetelmiä voidaan käyttää muiden rekombinoitujen peptidien kohdalla.

15 Lohen kalsitoniini on 32-jäseninen peptidihormoni, jolla on alfa-amidoitu prolyylitähde sen karboksyylipäätteessä. Mikro-organismia manipuloitiin geneettisesti rekombinoidun fuusioproteiinin valmistamiseksi, joka sisälsi lohen kalsitoniinia vastaavan aminohapposekvenssin. Fuusioproteiinigeeni muodostettiin siten, että lohen kalsitoniinisekvenssi yhdistettiin metionyylitähteellä sen aminopäätteessä ja sen karboksyylipäätteessä gly- : : 20 syylitähteellä, joka myös päätti rekombinoidun fuusioproteiinin. Kun lohen kalsitoniini- • · /' ·* geeni oli liitetty plasmidiin, mikro-organismi transformoitiin tällä plasmidilla ja saatiin • *.: aikaan fuusioproteiinin ilmaisu. Tämä kalsitoniiniä sisältävä proteiini eristettiin rekom- *.: i binoidun mikro-organismin lysaateista saostamalla ja sen kysteinyylitähteet muunnettiin i .: S-sulfonaateiksi. Koska lohen kalsitoniini ei sisällä metioniiniä, rekombinoidun fuusio- • · · » ♦ · ‘ ‘ 25 proteiinin syaanibromidi-lohkaisu tuotti peptidin, joka sisälsi lohen kalsitoniini- sekvenssin, joka oli laajennettu karboksyyli-terminaalisella glysiinillä. Tämä peptidi • » · '·.,*· eristettiin joko käänteisfaasi-HPLC:llä tai ioninvaihtokromatografialla ja sen rakenne • · '; ’ vahvistettiin aminohappokoostumuksella ja mikrosekvenssianalyysillä.

• · ‘ · * ·' 30 Viimeistä edellinen prolyylitähde muunnettiin proliiniamidiksi alfa-amidointientsyymin • ’.: vaikutuksella. Tämän peptidin alfa-amidoinnissa käytettyjen olosuhteiden esimerkki on \ ‘ · i seuraava: Lyofilisoitu peptidisubstraatti (glysiinillä laajennettu lohen kalsitoniinin esi aste, 200 - 300 nanomoolia) liuotettiin 200 pl:aan 150 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,0, 30 110433 joka sisälsi n. 750 uU alfa-amidointientsyymiä. Entsyymi voidaan johtaa joko MTC-tuumorista tai rotan MTC CA-77-solulinjasta peräisin olevista kudosviljelyväliaineista. Entsyymi on puhdistettava sellaisessa määrin, että koko vieras proteolyyttinen entsyymiaktiivisuus on poistettu. Tämä suoritetaan tavallisesti ioninvaihto- ja 5 ekskluusiokromatografian yhdistelmällä (ks. esimerkki 4). Puhdas, homogeeninen entsyymi ei ole vaatimuksena. Sitten tähän seokseen lisättiin askorbiinihappoa ja kuparisulfaattia riittävinä määrinä, niin että lopullisiksi konsentraatioiksi tuli n. 3 mM ja vast. 2 μΜ. Katalaasia (7,5 pg/ml), etanolia (1 %, v/v) ja kaliumjodidia (50 mM) voidaan myös lisätä reaktioseokseen alfa-amidoidun lohen kalsitoniinin saannon ίο parantamiseksi. Saatua liuosta sekoitettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5-6 tunnin ajan.

Sitten poistettiin S-sulfonaatti-ryhmät beta-merkaptoetanoli-käsittelyllä, minkä jälkeen rekombinoitu lohen kalsitoniini puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:llä. Lopullinen tuote luonnehdittiin sen retentiolla käänteisfaasi-HPLC:llä, kvantitatiivisellä tryptisellä kar-15 toituksella ja aminohappoanalyysillä. Kaikissa tapauksissa rekombinoitua lohen kalsito-niiniä ei voitu erottaa synteettisestä lohen kalsitoniinistä.

Ihmisen kalsitoniini-geenin sukuinen peptidi on 37-jäseninen peptidihormoni, jonka karboksyylipäätteessä on alfa-amidoitu fenyylialanyyli-tähde. Fuusioproteiinigeeni :': 20 muodostettiin samalla tavalla kuin lohen kalsitoniini (ks. yllä) siten, että ihmisen kalsi- . toniini-geenin sukuinen peptidisekvenssi yhdistettiin metionyylitähteellä sen amino- > · · • "/· päätteessä ja sen karboksyylipäätteessä glysyyli-tähteellä, joka myös päätti rekom- • · •. · · binoidun fuusioproteiinin. Rekombinoidun ihmisen kalsitoniini-geenin sukuisen pepti- • t · i *.: diesiasteen vapautus, puhdistus, alfa-amidointi ja karakterisointi suoritettiin myös edellä t · · :* 25 rekombinoidun lohen kalsitoniinin yhteydessä esitetyllä tavalla.

• ·

I i I

* · '’ Ihmisen kasvuhormonia vapauttava tekijä (hGHRF) on 44-jäseninen peptidihormoni, · *; * * jonka karboksyylipäätteessä on alfa-amidoitu leusyylitähde. hGHRF:n fuusioprote- :: iinigeeni muodostettiin siten, että peptidihormonin aminohapposekvenssi yhdistettiin ’ · · · ‘ 30 tryptofanyyli-tähteellä sen amino-päättessä ja sen karboksyyli-päätteessä glysyyli- » \> tähteellä, joka myös päätti rekombinoidun fuusioproteiinin. hGHRF:n sisältävä fuusio- » » :. ‘ · j proteiini eristettiin rekombinoidun mikro-organismin lysaateista saostamalla. Fuusio- proteiinin ei-hGHRF-osa denaturoitiin muuntamalla kysteinyyli-tähteet S-sulfonaatti- 31 110433 johdannaisiksi. Koska hGHRF ei sisällä tryptofaania, rekombinoidun fuusioproteiinin kemiallinen sulatus BNPS-skatolireagenssilla lohkaisi oksidatiivisesti fuusioproteiinin, jolloin muodostui amidoimaton hGHRF, joka oli laajennettu karboksyyli-terminaalisella glysiinillä. Samanaikaisesti hGHRF-molekyylin aseman 27 metionyyli-tähde hapetettiin 5 metioniinisulfoksidiksi. Tämä glysiinillä laajennettu peptidi eristettiin käyttämällä gee-lisuodatusta ja käänteisfaasiHPLC:tä. Sen rakenne vahvistettiin trypsiini-sulatuksella tuotettujen fragmenttipeptidien aminohappoanalyysillä.

Viimeistä edellinen leusyylitähde muunnettiin leusiiniamidiksi tämän keksinnön mukai-10 sella alfa-amidointientsyymillä. Esimerkki alfa-amidoidun hGHRF:n valmistusolosuh-teista on seuraava: Lyofilisoitu peptidisubstraatti (20 - 40 nanomoolia) liuotettiin 150 pliaan deionoitua vettä ja siihen sekoitettiin 90 pl (500 pU) (pH 7,0) alfa-amidointientsyymivalmistetta, joka oli johdettu joko rotan MTC-tuumorista tai rotan CA-77-solulinjasta peräisin olevista kudosviljelyväliaineista. Entsyymi oli puhdistettava 15 koko vieraan proteolyyttisen entsyymiaktiivisuuden poistamiseksi kokoekskluusio- ja ioninvaihtokromatografian yhdistelmällä. Sitten entsyymin ja substraatin seokseen lisättiin askorbiinihappoa ja kuparisulfaattia riittävinä määrinä, niin että konsentraatioiksi tuli 3 mM ja vast. 2 pM. Saatua liuosta sekoitettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 4-6 tunnin ajan. Substraatin tavallinen muuntoprosentti tuotteeksi on 95 % perustuen trypsiini-: 20 sulatuksella vapautuneiden fragmenttien aminohappoanalyysiin. Lopuksi metioniini- • / ” sulfoksidi-tähde pelkistettiin metioniiniksi 4 M beta-merkaptoetanolilla, joka oli pusku- • '.: roitu pH-arvossa 4 10 mM natriumasetaatilla, 80 °C:ssa tunnin kuluessa. Lopullinen • · i.: : tuote puhdistettiin käänteisfaasiHPLC:llä ja luonnehdittiin sen retentioajalla, tryptisellä • · * : . * sulatusanalyysillä ja aminohappoanalyysillä. Rekombinoitua alfa-amidoitua tuotetta • » · ' · ‘ ' 25 testattiin myös biologisen aktiivisuuden suhteen. Kaikissa tapauksissa rekombinoitua hGHRF :ä ei voitu erottaa synteettisestä hGHRF :stä.

» * · I · · • · • I k

Yllä olevien tutkimusten lisäksi kahta kaupallisesti saatavaa glysiinillä laajennettua ' · * · * peptidihormonia arvioitiin niiden kyvyn suhteen toimia substraatteina alfa- ’ *; · * 30 amidointientsyymille. Nämä ovat alfa-melanosyyttiä stimuloivan hormonin esiasteet ja ’.: substanssi P. Molemmissa tapauksissa tulokset osoittavat, että molemmat peptidit ovat » · *. ’ ‘: sopivia substraattej a alfa-amidointientsyymille.

32 1 10433

Esimerkki 6

Rotan puhdistetun alfa-amidointientsvvmin sekvenssianalyysi 5 Puhdistettua alfa-amidointientsyymiä sisältävät fraktiot yhdistettiin joko rotan MTC- tuumorikudoksesta tai CA-77-soluviljelyn supematanteista ja entsyymin sulfhydryyli- ryhmät alistettiin pelkistykseen ja tämän jälkeen karboksimetylointiin. Saadut reak- tioseokset laitettiin sitten Vydac C4-käänteisfaasi-HPLC-pylvääseen (5 μΜ hiukkasko- ko, 33 nm huokoskoko), joka oli tasapainotettu 0,l%:sella vesipitoisella trifluorietikka- 10 hapolla. Pylväs pestiin tällä liuoksella ylimääräisten puskurisuolojen poistamiseksi.

Suolasta vapautettu entsyymi poistettiin HPLC-pylväästä eluoimalla 80%:sella asetonit- riilillä, joka sisälsi 0,08 % trifluorietikkahappoa. Pylväseffluenttia valvottiin UV:llä 220 nm:ssä. Saadut proteiinifraktiot koottiin, yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Tämä materiaali liuotettiin sitten uudelleen 100 phään 0,l%:ista SDS:ä ja laitettiin sitten Applied Bio- 15 systems'in mallin 470 A proteiinisekvenssointilaitteeseen. Mikrosekvenssianalyysissä käytetyt menetelmät olivat Applied Biosystems'in antamien ohjeiden mukaiset. Saadut fenyylitiohydantoiiniaminohapot analysoitiin HPLCrllä Hypersil C18-pylväällä (hiuk- kaskoko 5 M, huokoskoko 10 nm) absorbanssilla, jota valvottiin 269 ja 313 nm:ssä

Hewlett-Packard 1090-nestekromatografiajäijestelmällä. Tuumorikudoksesta peräisin : 20 olevan pääentsyymikomponentin huipun (huippu III) amino-terminaalinen sekvenssi oli • · ·/" seuraava: »· · • · 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ·,· · NI^-Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro- \\i 13 14 IS 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe-Ala-Leu-Asp-Ile- 25 26 27 28

Arg-Met-Pro • · • · · • · · • · •»· • · CA-77-solukudosviljelyn supematanteista peräisin olevan entsyymin (huippu IV) pää-:.:. * komponentin amino-terminaalisen sekvenssin tiedot osoittavat, että se on identtinen * · * *' 30 tuumorikudosentsyymin (huippu III) kanssa. Kuitenkin pienempi komponentti havaittiin »· * • ‘ / myös tämän entsyymin mikrosekvenssianalyysissä, joka näyttää sisältävän amino- • · :. * · · terminaalisen laaj ennuksen verrattuna alfa-amidointientsyymin päämuotoon. Tämän komponentin läsnäolo johtuu luultavasti entsyymin erilaisesta post-translationaalisesta 33 110433 käsittelystä. Tämän komponentin amino-terminaalinen aminohapposekvenssi oli seu-raava: 123 4 56789 10 11 12 NH^-Phe-Lys-Glu-Thr-Thr-Arg-Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys 5 13 14

Leu-Gly-

Ylimääräisen aminohapposekvenssin arvot saatiin rotan MTC-tuumorikudoksesta peräisin olevalle α-amidointientsyymille seuraavalla menetelmällä: N. 400 pg puhdistettua entsyymiä pelkistettiin ja karboksimetyloitiin. Tämän jälkeen entsyymiliuos siirrettiin ίο dialyysiputkistoon ja sitä dialysoitiin 18 tunnin ajan 25 mM Tris-HCl:ä pH 8,0/0,5 M ureaa vasten. Retentaatti siirrettiin sitten 1,5 ml:n linkoputkeen ja konsentroitiin 600 pl:n tilavuuteen alennetussa paineessa. Entsyymiliuokseen lisättiin 2 μΐ (2 pg) trypsiiniä ja seosta inkuboitiin tunnin ajan 37 °C:ssa. Tässä kohdassa lisättiin toinen määräosa trypsiiniä (2 pg) ja inkubointia jatkettiin 2 tunnin ajan 37 °C:ssa. Digerointi is päätettiin lisäämällä 200 pl 4 M ureaa/10 % etikkahappoa. Uute laitettiin Vydac C18käänteisfaasi-HPLC-pylvääseen (hiukkaskoko 5 pm, huokoskoko 33 nm), joka oli tasapainotettu 0,l%:sella vesipitoisella trifluorietikkahapolla. Pylväs eluoitiin sitten lineaarisella asetonitriilin gradientilla 50 %:n konsentraatioon 4 tunnin kuluessa ja fraktioita kerättiin kahden minuutin jaksoissa. Entsyymin tryptisen uutteen saadut luonteen- : : 20 omaiset käänteisfaasi-HPLC-eluointihuiput on esitetty kuviossa XXIII. Kolme saatua • · • * ” tryptistä peptidiä alistettiin automatisoituun sekvenssianalyysiin, kuten yllä on esitetty, • ‘: ja tulokset on esitetty seuraavassa. (Peptidit on merkitty niiden fraktionumerolla.) • > · t « t : .* Trvptinen peptidi n:o 65 * « · '·* * 25 -Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser-Gln-Pro-

Thr- I « «

* I I

• · · t · '!* Trvptinen peptidi n:o 58 » * :‘ - Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg- * · ’···' 30 t • Trvptinen peptidi n:o 86 :: -Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-

Esimerkki 7 34 110433

Geenin tai DNA-sekvenssien molekvvlikloonaus. jotka koodaavat rotan MTC.n tai CA-77-solulinian alfa-amidointientsvvmin 5

Kyky kloonata alfa-amidointientsyymin koodaava geeni tai DNA-sekvenssi johtuu useista kriittisistä informaatio-osista ja reagensseistä. On löydettävä entsyymiproteiinin luotettava lähde, joka puolestaan toimii entsyymin lähetti-RNA:n (mRNA) lähteenä ja lopuksi sen komplementaarisena DNA.na (cDNA). Entsyymin geenin tai cDNArn eris-10 tys vaatii myös kyseessä olevan entsyymin molekyylikoetinta. Yleensä tämä molekyyli-koetin omaa toisen kahdesta muodosta. Se on joko oligonukleotidi, jonka sekvenssi on komplementaarinen entsyymigeenin osan suhteen, tai se on vasta-ainemolekyyli (tai vasta-ainemolekyylien kokoelma), joka tunnistaa spesifisesti entsyymiproteiinin. Näiden molekyylikoetinten johtaminen tarvitsee menetelmää entsyymin puhdistamiseksi 15 siten, että voidaan valmistaa joko entsyymille spesifisiä vasta-aineita tai voidaan määrittää entsyymin aminohapposekvenssit oligonukleotidikoetinten muodostamiseksi. Nämä edellytykset on tyydytetty tämän hakemuksen mukaiselle alfa-amidointientsyymille.

Alfa-amidointientsyymi puhdistettiin rotan MTC-kudoksesta ja rotan CA-77-soluilla 20 käsitellyistä väliaineista. Tämä vahvisti, että nämä solulähteet sisältäisivät entsyymipro- ’ · *: teiinin koodaavan mRNA:n. Menetelmät, joita olemme käyttäneet alfa- »· * • amidointientsyymin cDNA:n valmistamiseksi, ovat molekyylibiologian alalla hyvin i,: i tunnettuja.

• * » t * • » f I < • t f ’. ' 25 Näiden menetelmien erityisiä selityksiä voidaan löytää laboratoriokäsikiq öistä, kuten

Molecular Cloning (1982), DNA Cloning, (osa 1) a Practical Approach (1985) tai pri- ’; * · maarisesta viitekiqallisuudesta, kuten Gubler, V. & Hoffman, B. J., Gene, Voi. 25, s.

» » 262-69 (1983), tai Young, R. A. ja Davis, R. W., PNAS, Voi. 80, s. 1194-98 (1983).

•. *. * Nämä menetelmät ovat yleisesti sovellettavissa, jolloin kriittinen muuttuja on ainoas- « «· ’* 30 taan käytetty mRNAtn lähde. cDNA:lle spesifisen alfa-amidointientsyymin valmistami- : ‘ (· seksi olemme käyttäneet sekä rotan MTC-kudoksen mRNA:ta että CA-77-solun :, ’ · · mRNA:ta. Kaksisäikeisiä cDNA-näytteitä, jotka syntetisoitiin, käytettiin puolestaan erillisten geenikirjastojen valmistamiseksi hyvin tunnetuilla menetelmillä.

35 110433

Kuten yllä esitettiin, alfa-amidointientsyymin mRNA:n erityisten cDNA:n tunnistaminen vaatii molekyylikoettimia, jotka voivat erottaa nämä yhdistelmät muista yhdistelmistä erityisessä kirjastossa. Esimerkit 3 ja 4 esittävät yksityiskohtaisesti puhdistusme-5 netelmiä, joita käytettiin molekyylikoetinten johtamiseksi tarvittavan entsyymin valmistamiseksi. Esimerkki 6 selittää tämän proteiinin käyttöä aminohapposekvenssien määrittämiseksi, kun taas esimerkki 8 selittää puhdistetun proteiinin käyttöä entsyymille spesifisten vasta-aineiden valmistamiseksi.

ίο Esimerkin 6 aminohapposekvenssit ovat riittäviä spesifisten selektiivisten oligonukle-otidikoetinten valmistamiseksi. Oligonukleotidikoetinten valmistuksessa useat tekijät ovat tärkeitä koettimien tekemiseksi selektiiviseksi. Näiden täydellinen esitys voidaan löytää julkaisusta Lathe, R. J., J. Mol. Biol., Voi. 183, s. 1 - 12 (1985). Koska yleensä useampi kuin yksi nukleotidisekvenssi voi koodata saman aminohapposekvenssin (tämä is periaate tunnetaan geneettisen koodin degeneraatioasteena), yksittäinen nukleotidisekvenssi merkitsee ainoastaan yhtä useista mahdollisista geenisekvensseistä. Sen takaamiseksi, että oligonukleotidikoetin tunnistaa kyseessä olevan geenin, voidaan valmistaa ekvimolaarinen seos kaikista mahdollisista nukleotidisekvensseistä, jotka voisivat koodata amidointientsyymille spesifisen aminohapposekvenssin. Tällaisten seosten moni-: ’: 20 mutkaisuus tekee niistä usein vähemmän kuin absoluuttisesti selektiivisiä ja siten on käytettävä yleensä useampaa kuin yhtä proteiinin aminohapposekvenssin aluetta vastaa- i · · • ', · via oligonukleotidiseoksia, jotta saadaan aikaan absoluuttisesti spesifinen selektiivisyys • » ·.* · määrätyn entsyymin suhteen.

I I · * * * • · • » I I # V * 25 Vaihtoehtoisesti kyseessä olevan geenin suhteen selektiivinen oligonukleotidi voidaan valmistaa valmistamalla riittävän pituinen ainutlaatuinen nukleotidisekvenssi, niin että « · • » i * · ' · jopa hieman epätäydellinen komplementaarisuus haluttuun geeniin tuottaa stabiilin hyb- i · •; · ’ ridin. Tällä ainutlaatuisella sekvenssillä voi olla hyvin pieni mahdollisuus (pituudesta • · *. *. * riippuvainen) muodostaa stabiili hybridi muiden geenisekvenssien kanssa. Ainutlaatui- m *... * 30 nen sekvenssi muodostuu useimmiten proteiinisekvenssin j okaiselle aminohapolle käy- » : * ί tetystä kodonista. Kodonin käytön toistuvuus määrättyjen lajien kohdalla voidaan mää- » t •. ’ · j rittää tunnettujen geenisekvenssien ja tämän lajin proteiinien vastaavien aminohappose- 36 110433 kvenssien ryhmityksestä. Nämä menetelmät ovat hyvin tunnettuja molekyylibiologian asiantuntijoille.

Eräs toinen tapa, jota voidaan käyttää spesifisten oligonukleotidikoetinten valmistami-5 seksi, on liittää deoksi-inosiinitähteitä oligonukleotideihin maksimaalisen degeneraa-tioasteen omaaviin asemiin. Tämä nukleotidisubstituutio toimii koetinnäytteen degene-raatioasteen vähentämiseksi ja siten sillä voi olla edullisia vaikutuksia valintaprosessiin. (Deoksi-inosiinin käyttöä oligonukleotidikoettimessa on selitetty julkaisussa Ohtsuka et M., J. Biol. Chem., Voi. 260, s. 2605-08 (1985)).

10

Olemme käyttäneet alfa-amidointientsyymin proteiinisekvenssejä useiden oligonukleotidikoetinten suunnittelemiseksi, joita voidaan käyttää amidointientsyymin cDNA:n eristämiseksi. Käytetyt sekvenssit ja koettimet, joita olemme valmistaneet, on esitetty taulukossa II. On huomattava, että jos molekyylibiologistilla olisi käytössään amino-15 happosekvenssit, hän voisi kehittää vaihtoehtoisia menetelmiä geenin eristämiseksi koe-tinhybridisaatiolla.

Näin tuotettuja oligonukleotidikoettimia on käytetty hyvin vakiintuneilla menetelmillä (ks. Molecular Cloning 1982) sekä plasmidi- että bakteriofagi-cDNA-kiijastojen seulo-20 miseksi ja alfa-amidointientsyymin cDNA:n eristämiseksi.

Taulukko II

• · ' • · • · ♦ • · • · • :1: Tässä taulukossa on esitetty kaikki mahdolliset geenisekvenssit, jotka vastaavat alfa- • · · · : 1 · 1: 25 amidointientsyymiproteiinin valittuja alueita. Esitettyjen sekvenssien alapuolella on • · · : : : esitettyä muutamia geenin suhteen komplementaarisia oligonukleotidikoettimia, joita voidaan käyttään cDNA:n tunnistamiseksi ja eristämiseksi.

• · * · · • · · • · I I I « · • I 1 • · I · · • · • · · • · * · » • · · • « « · • 0 · • » · 110433 37 *6.1 > o >0 w V} > M 2?> Hm 0H 0> fl> oi ®> mm® £· cd £ m h- o 2 i; ^ _ 3ΦΗ· 2#| 5 lQ ω 3 ft < =** ΙΟ 3 rt < „ ! o o 01ΜΦ ©·' tnH-fD 2i a tj t^ffl rt 3 m ω rt 2 . a e rt ® *< rt (1)¾ ω { 6 £ ** rt w X rt » S p. 1 H- I o O 471 l rt rt on “μ* & P* O n ® >-*

OoQ £ S? ° ^ g ui to ^ S S '1 3.0 * s -s o { *1 a ·* ° ^ * i 3 3 s a oi n n _ S- I *1 > > S cl K·» 1 ^ > tn tP* O M TO , >* Λ 5 3 O > *3 O » M i 0"3 , _ ,_ i Q n ci •"3 G m κι I rl > M tn •-3 ® ^ I O ä»C1C»w O > H3 O C u> | g? ^ i > ^ n p.

G jr ... i Q O »< σ* 3

*8 £ ! w Ω w P

> -M! > ' g * 3 £<. % >^n £«! MO ° o > hj o c «

>Π>* ί n Π O M 03 M

^ o > o fS m J ~ Ώ ° *Gi> n ·< Φ

3 KM ! g g S· 3vo -S

g coto, O O 0>^0 »n 3 ·.:· cin>3 3 S 1 "> ? »-η h ®o *. ·* 1 Q Q no

... I Q 0 O M M

. * : i t-. o n h o > o ‘c·-· : .·. 1 S £ o ό ... 1 o „ o n m ·—*

*··/ I '-'> *-3 > O O > *-3 O W

: Y* ' G G o < ;;; 1 *-* o on > ^ n o m u> I H 2! >* <-3 I Ω O n 3Ή 1 en O o > n 3 »p· ; '.: 1 2 n *o • · I O O a m .··*. 1 ° o > *-3 n o en 1 S e n r . . 1 > H ro h : : : 1 n n > *-3 o e en 1 Q O >

. I e > W M

··/ 1 >* n ►a ό -o :*·*: ' n o > . . 1 o n mm . . 1 171 o > *-3 n tu 03 38 110433

Ο ί° Λ » SS

£ 85 I- o o h- ro g

2 w. a tn rt S

> g. >g ro ^ “ «f g1 5“ rt » o m ro

It o 3 & rt “ £ £ "

s ί S

f f 3 3 m j to tn Ό - - - _ rt □ h| > w i—1 3 ci> o > n -3 3 ro Ο π Λ Λ n n Ci (-1 tt> tr >o >-3 o ^o>n 1< c λ o n ci o 2 to ό

1-3Π 1-3 0 !>0 3 C

>b, >» >-3 1"3 n n g £ o π Ώ 73 2 : : α ώ n ^ tn ® ·;1.· noi tn Ci>HO 2 \".: ‘ " 1-3 0 tr1 H ra σι *·': q 1-3 n en c . ! > 1-· : : : _3 i— ··· · > O >-3 ro : 1 : n ci • · Ci H- 03 .’.·. -3 o >n 1< ‘ > n >

Ci n to -3 o > Ci ta . . to # 2 • · 39 110433 _ S' β *· o r o ω> ft O Q cl (D en <D > li ¢1 si »s g·- 5-¾ 51 S-g Sg ETU S" h £ S g « ξ 5* ^ 2 t—>c\ i—12. ό i—i σ»ι-ι < H- °H- ro ro ro g o* o o o O H- rt rt m rt l μ. ui. tn a. o. & £ k V T « i 11 > H w ci > h n »i e >-3 >3: j> *-3 n> to

On Cl er

Cl Cl O Cl >-3 1-9 > f-· to j HO 1-30 > Cl 3

Cl Cl Q Ό m

Cl Cl O *-s ^ Ή.

i-ii-«C10>*-äO[X

on ci ci 3 n O Cl t— UI ™ »-· *-t H Cl > O *< ** «-3 > > H oi g* O ci ci n ro σ> £.

ω ω ci > Cl >* O H »n o o o n ci > 2

G 14 h3 H > w -O C

>3 > Cl >ci >C1 HO *Ö

Cl Cl Cl Cl O Cl n OHOHO >C13 ^ ··· '· ^ -3 H H > > tn

·· 3 H Η,-Η,η > »VO

• ,· >C1 > Cl _ u HO 3 *'·’· Cl Cl G ® u_.

• · “4 H >1—1-'

> O > O HOMO

> ^ H 5 M

... ·** en tn o Π) i-1 • · ... > *-9 01 : : : ci o ro m ci > h o <-* ro o ci

> 1—' M

. . '· > Cl 3 ω ...

O >ϋ ’ : n n h* ci > h o O if*

.·.·. > H

·.·.’ Cl 3* I—1

Cl n > H w n en I 40 110433 i f

? 2 |g SJ

si s ? si 15 :

“tr ? S

η φ 9 3 ΓΤ 03 ►*· 01

& p. HS

h* ,+ <1 Ό ^ ui £

£ 3 ’ I

Λ> «3 gr- * > o < 5.

M n >^no » M -o

pi TS

ο η ^ β ^ n o i> y-3 n % °° Ο λ ^ Go >Ώ :': S g * 5

*:·.· Λ . § £ <·" S

• *: n n O S Ω :*·': -° nn^5? £*<» . ; n a '

' - · >-3 gO

··.*·* οι > o tr ^ :·.’: ~ OJ c • · · » · · * * ·» • · ·

I I

• · # » · » · * 41 1 10433

Esimerkki 8 A. Alfa-amidointientswmille spesifisten monoklonaaiisten vasta-aineiden tuottaminen hiirissä 5 11 Balb/cJ-hiirtä immunisoitiin ja immunisaatiota tehostettiin amidointientsyymin puhdistetuilla valmisteilla. Näiltä hiiriltä otettiin verta ja seerumi käsiteltiin ja titrattiin puskuroitua entsyymiä vastaan ELIS A-analyysillä. Analyysi (käytetyt tekniikat ovat hyvin vakiintuneita) suoritettiin absorboimalla puhdistettu entsyymi polystyreenilevyyn, joka 10 pestiin sitten ja salvattiin (vasta-aineiden epäolennaisen sitoutumisen estämiseksi levyyn) naudan seerumialbumiinilla (BSA). Laimennettuja hiiren seerumeja (jotka sisälsivät oletettuja vasta-aineita amidointientsyymin suhteen) inkuboitiin sitten amidoin-tientsyymillä päällystetyllä levyllä ja pestiin. Toista vasta-ainetta (merkitty merkintäai-neella, alkalisella fosfataasilla, joka helpottaa ensimmäisen vastaaineen levyyn sidotti tuun entsyymiin tapahtuvan sitoutumisen vahvistusta) inkuboitiin sitten syvennyksissä. Pesemisen ja substraattiliuoksen lisäyksen jälkeen signaalia valvottiin kolorimetrisesti spektrofotomerisellä rekisteröintilaitteella. "Positiivisten" seerumeiden signaali-kohinasuhde oli vähintään 2:1.

20 7 hiirtä, joilla oli korkeampi tiitteri ELISAssa, tapettiin neljän päivän kuluttua lopulli- . ·. sen immunisaation vahvistuksen jälkeen. Perna poistettiin aseptisesti ja möyhennettiin • · • · · · 6 •.:, (murskattiin mekaanisesti), jolloin saatiin kaikkiaan 132,6 x 10 splenosyyttiä, jotka • · [·.1. yhdistettiin 122,8 x 106 NS-1 myeloomasoluun käyttämällä 1,28 ml PEG:tä (polyety- | leeniglykoli) 4000. Solut jaettiin määräosina viiteen 24 syvennyksen levyyn, jotka oli «»» · 1 · 1: 25 edellä päällystetty Balb/cJ-tymosyyteillä ja splenosyyteillä, jotka toimivat syöttösolui- • · ::: na. Solut säilytettiin selektiivisissä HAT-väliaineissa, jotka mahdollistavat ainoastaan hybridisolujen eloonjäännin.

» · » · · • ·» "...: Supematantit 116 syvennyksestä, joissa esiintyi klonaalista kasvua, analysoitiin radi- : V: 30 oimmuno-analyysi- j a ELISA-menetelmillä vasta-ainetuotannon suhteen. Radioimmu- • · : ’ ’ ’: no-analyysi oli samanlainen kuin edellä esitetty ELISA sillä erotuksella, että toinen vas- : 1. ·. ta-aine oli merkitty I:llä ja radioaktiiviset laskut suoritettiin gammalaskimella.

• · · • · 110433 42 116 syvennyksestä 56 oli positiivisia vasta-ainetuotannon suhteen ja ne analysoitiin tämän jälkeen reaktiivisuuden suhteen alfa-amidointientsyymien suhteen. 25 kloonia, jotka näyttivät olevan positiivisia alfa-amidointientsyymien suhteen, kloonattiin sarja-laimennusprosessilla. Primaariset kloonit analysoitiin sekä alfa-amidointientsyymien 5 että BSA:n suhteen (koska polystyreenilevyt oli salvattu BSA:lla, vasta-aineet, jotka oli sidottu levyyn, olivat voineet sitoutua pelkästään BSA:han tai ne oli absorboitu tällä epäspesifisesti) sen määrittämiseksi, olivatko ne todella spesifisiä amidointientsyymin suhteen. Kloonit, jotka omasivat signaalin alfa-amidointientsyymin suhteen, joka oli vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin BSA:lle osoitettu signaali, kloonattiin jakosuh-lo teessä 1 solu/2 syvennystä.

Tertiaarisessa kloonausvaiheessa tehtiin 21 positiivista hybridomaa (ks. taulukko III) ja 20 niistä luonnehdittiin vasta-aineluokan suhteen sekä Ouchterlonyn että ELISAmene-telmällä. Seitsemällätoista klooneista oli IgG2a:n ras- kaita ketjuja ja kolmella oli 15 IgGl :n raskaita ketjuja. Kaikkien kahdenkymmen kloonin määritettiin erittävän vasta-aineita, joissa on kappa-kevytketjuja.

Jokaista linjaa kasvatetaan yksilöllisesti irto viljelyssä ja solujen määräosat jäädytetään nestemäisessä typessä. Pristaani-esikäsitellyt Balb/cJ-hiiret injektoitiin intraperitoneaa- 20 lisesti 5 x 106 hybridooma-solulla. Viikkoa myöhemmin hiirille, joissa ei esiintynyt .·. askiitistuumoria, annettiin solujen tehosteinjektio. Askiitisneste ja veri poistettiin 1 - 2 • » viikon kuluttua. Käsittelyn jälkeen askiitis ja seerumit analysoitiin ja tiirattiin alfa-amidointientsyymin suhteen samoin kuin negatiivisten antigeenien suhteen (esimerkiksi • :': naudan seerumialbumiini, valkuainen, hiilianhydraasi j a kasvuhormonia vapauttava a · · · i' · 1: 25 tekijä) vasta-ainespesifisyyden varmistamiseksi.

0 0

• M

• · · • · · 0 0 0 01 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 01 0 0 0 0 0 0 t 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ♦ 0 0 0 0 0

Taulukko III

43 110433

Balb/c-alfa-amidointientsyymin monoklonaaliset solulinjat 5

SoluIinja Raskasketju Tiitteri1 4-1-4-20-3 IgG2a -1:5,000 4-1-4-18-1 1gG2a 1° 4-5-7-3 19G2a -1:5,000 4-2-3-17-7 igG2a 3- 7-1-20-24 19G2a -1:10,000 4- 8-15-2-6 IgG2a 4-7-21-14-9 ig^a 4-10-45-1-16 igG2a 15 54-2-1-39-2 IgG2a -1:10,000 4-6-12-3-17 19G2a 52-1-31-24-2 IgG2a 4-3-11-46-1 IgG2a 3- 7-9-9-3 IgG2a 86-1-38-15 IgG, 1:1.000 20 ^ 4- 5-6-1 IgG^^ 1:1,000 4-4-24-3-5 IgG2a -1:5,000 ;v 4-H-3-1-8 IgG1 '8-9-94-4-2 IgG2a :2 4-10-30-3-1 IgG2a : 75-10-17-14-4 IgG- 25 y 2a ’ · 92-10-26-32-39 Ei luokiteltu * 2 · • · · * · · * 2 » 2 • » » · · 30 t » » · · , ·. : 1 Askiitisnesteet tiirattiin 100 ng:llä puhdasta entsyymiä kiinteäfaasisessa ELISAssa.

44 110433 B. Hiirissä valmistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistusmenetelmä

Yllä olevilla menetelmillä valmistetut α-amidointientsyymille spesifiset monoklonaali-5 set vasta-aineet puhdistetaan seuraavasti. Useista samalla kloonilla inokuloiduista hiiristä kerättyjä askiitis-nesteitä käytettiin vasta-ainelähteenä. Askiitisneste laimennettiin (5-kertaiseksi) 10 mM MES:illä, pH 5,6. Laimennettu askiitis-neste laitettiin 1,5 x 20 cm:n pylvääseen, joka sisälsi 40 pm ABX sekasilikahartsia (J. T. Baker), joka oli edellä tasapainotettu 10 mM MES-puskurilla, pH 5,6. Monoklonaaliset vasta-aineet eluoitiin pyl-io väästä käyttämällä 0 - 500 mM natriumasetaattigradienttia, pH 7,0. Puhdistettuja vasta-aineita sisältävät fraktiot yhdistettiin, testattiin spesifisen aktiivisuuden suhteen ja varastoitiin 4 °C:ssa myöhempää käyttöä varten.

C. a-amidointientswmille spesifisten polvklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen ka-15 noissa

Intravenoosisia, intramuskulaarisia ja subkutaanisia injektioita annettiin kahdelle munivalle kanalle käyttämällä kaikkiaan n. 50 pg puhdistettua α-amidointientsyymiä Ri-biadjuvantissa kummankin kanan kohdalla. Ribi-adjuvantti on täysin metabolisoituva 20 lipidiemulsiojäijestelmä, joka koostuu kanan lymfosyyttien mitogeenistä ja adjuvantista vastaainereaktion parantamiseksi antigeenien suhteen siipikarjassa (Ribi Immunochem t « · · ’ ·:: Research, Montana). Alkuimmunisoinnin jälkeen annettiin kaksi tehosteinjektiota kah- • · . ‘ : den viikon välein käyttämällä n. 30 pg entsyymiä kanaa kohden. Eläimistä otettiin verta : : i 21. päivänä ja 35. päivänä ja seerumit käsiteltiin ja analysoitiin spesifisten vasta- • ',· 25 aineiden läsnäolon suhteen seuraavalla menetelmällä: molempien kanojen seerumit, 0.

• i » \ ’· · päivä (esi-immuuni), 21. päivä ja 35. päivä, analysoitiin kiinteäfaasisella ELISAlla puh distetun a-amidointientsyymin 100 ng.tä vastaan. Naudan seerumialbumiinia käytettiin ’ * * ‘ negatiivisena kontrollinoa epäspesifiselle vastaainesitoutumiselle. Entsyymille spesifi- • * • · ·' set vasta-aineet osoitettiin kanin kanan IgG:n vastaisilla alkalisella fosfataasilla merki- • · '·.:. · 30 tyillä seerumeilla.

t » 1 ’ ·': Yllä esitettyjen menetelmien tulokset osoittivat, että spesifisiä vasta-aineita voitiin t t osoittaa kanan 257 seerumeissa 35. päivänä. Suhteessa 1:10.000 laimennettu seerumi 110433 45 tuotti signaalikohinasuhteeksi n. 4:1. Kanassa 258 esiintyi entsyymille spesifisiä vasta-aineita 21. ja 35. päivänä. Molemmista verenotoista suhteessa 1:10.000 laimennetut seerumit tuottivat signaalikohinasuhteeksi n. 4:1. Munien kerääminen molemmista ka-| noista käynnistettiin 5 6. päivänä. Esi-immuunien munien j a immunisoinnin j älkeisten 5 munien polyetyleeniglykoli- (PEG) saostuksella eristetyt IgY:t analysoitiin Ouchter-lonyn menetelmillä ja entsyymille spesifiset vastaaineet analysoitiin ELISAlla.

D. Kanan IgY-vasta-aineiden puhdistus io α-amidointientsyymille spesifisiä linnun polyklonaalisia vasta-aineita valmistettiin kanoissa yllä esitetyllä tavalla. Immunisoitujen kanojen munat kerättiin ja joko upotettiin parafiiniin tai jäädytettiin, kunnes ne käytettiin IgY:n puhdistamiseksi. Munanvalkuaiset erotettiin keltuaisista, jotka sisälsivät a-AE:lle spesifisiä vasta-aineita. Munankeltu-aiset laimennettiin 3-kertaisiksi käyttämällä 10 mM natriumfosfaattia, pH 7,5, joka si-15 sälsi 0,1 M NaChä ja 0,01 % natriumatsidia. PEG-saostuksen alkuvaihe suoritettiin käyttämällä PEG 8000:n 3,5:n loppukonsentraatiota. Sakan annettiin muodostua 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, sitten se lingottiin ja supematantti (sisälsi IgY:tä) säästettiin. Lisää PEG:tä lisättiin supematanttiin lopullisen konsentraation saattamiseksi 12,5 %:iin PEG:tä. IgY-vastaaineet saostettiin tässä PEG:n konsentraatiossa japelletoi-20 tiin linkoamalla. Tämän puhdistuvaiheen IgY-vasta-aineet puhdistettiin edelleen kahdel-la menetelmällä: »t » » • · * · * !'·*: 1) Saostetut IgY-vasta-aineet suspendoitiinuudelleen 10 mM MES:issä, pH 5,6, sitten • · t ί { dialysoitiin yön yli 4 °C:ssa tätä samaa puskuria vastaan. Näyte laitettiin sitten 1,5 x 20 < » · • V 25 cm:n pylvääseen, joka sisälsi 40 pm seka-ABX-silikahartsia (J. T. Baker). Seuraava •« · V · puhdistusjäijestys oli sama kuin se, joka esitettiin askiitis-nesteen yhteydessä.

• · • · * ’ * * ‘ 2) Vaihtoehtoisesti IgY:tä sisältävä pelletti suspendoitiin uudelleen alkupuskuriin ja

Ml • I

• * · ’ sitten saostettiin uudelleen käyttämällä kyllästettyä ammoniumsulfaattia (3:1 v/v).

• · V,: 30 IgY:tä sisältävä pelletti suspendoitiin uudelleen pieneen määrään tislattua H20:ta ja

Ml :... · varastoitiin 4 °C:ssa myöhempää käyttöä varten. Kanan IgY:n immobilisaatiomenetel- i I * * *: mä on esitetty esimerkissä 12.

» * t i i • I I • · « 110433

Esimerkki 9

Alfa-amidointientswmiaktiivisuuden kineettiset tutkimukset

Alfa-amidointientsyymi, joka oli puhdistettu homogeeniseksi (sekä medullaarisista kil-5 pirauhaskarsinooman CA-77-soluviljelystä että vastaavasta tuumorikudoksesta, joka oli poistettu laboratoriorotista), toimii inaktiivisten glysiinillä laajennettujen peptidipro-hormonien muunnossa bioaktiivisiksi C-terminaaliksi amideiksi. Tutkimuksiimme perustuen prohormonin C-terminaalisen aminohapon on oltava glysiinitähde, jotta entsyymi tunnistaa senja amidoi sen seuraavasti: io amidointientsyymi R-X-Gly-COOH + 02 -> R-X-CONH2 + HCO-COOH + H20 pelkistin hapetettu pelkistin is Tämän aktiivisuuden in vitro-uudelleenmuodostus vaatii ehdottomasti peptidisubstraatin lisäksi molekyylihappea ja pelkistysainetta (L-askorbiinihappoa). Olemme kuitenkin todenneet, että entsymaattista aktiivisuutta voidaan olennaisesti lisätä lisäämällä Cu+2-ioneja (kuparisulfaattia) ja katalaasia. Tämä eksogeeninen kupari sidotaan entsyymillä ja käytetään molekyylihapen sitomis-ja aktivoimispaikkana. Toisaalta katalaasi on ent-20 syymi, joka toimii vetyperoksidin huuhtelemiseksi, jota voisi muuten kerääntyä sivure- « « · · . * ·:: aktioiden johdosta, joissa tarvitaan happea, askorbaattia, kuparia, ja joka voisi hävittää « · !*·*: amidointientsyymin.

♦ · • · · • · · · \ Olemme onnistuneesti kehittäneet herkkiä ei-radiometrisiä analyysimenetelmiä alfa- • · · : 25 amidointientsyymiaktiivisuuden osoittamiseksi. Näissä analyyseissä käytetään synteetti siä tripeptidisubstraatteja. Näiden substraattien amidointia valvotaan edullisesti erotta- • · *. *: maila ja määrittämällä laadullisesti tuote (amidoitu dipeptidi ja substraattitripeptidi) • · · * käyttämällä HPLC:tä. Herkimmässä kehitetyistä analyyseistä käytetään substraattina • · v.: monodansyyli-L-Tyr-Val-Gly:tä. Tämä yhdiste voidaan osoittaa erittäin alhaisilla ta- •... · 30 soilla, koska dansyyliryhmä on fluoresoiva. Siten tämän analyysin herkkyyttä voidaan verrata muissa laboratorioissa kehitettyihin samankaltaisiin radiometrisiin analyyseihin.

• · « · · * · · 110433 47

Olemme käyttäneet tätä analyysiä alfa-amidointientsyymin kineettisten ominaisuuksien tutkimiseksi. Etenkin kineettiset parametrit Km ja Vmax on määritetty tutkimalla sub-straattikonsentraation vaihtelun vaikutusta entsyymiaktiivisuuteen. Km on affiniteetin mitta, joka entsyymillä on erityisen substraatin suhteen. Mitä pienempi Km on, sitä pie-5 nempi on affiniteetti. Vmax on maksimaalinen nopeus, jossa entsyymi muuntaa sub- i j straatin tuotteeksi ja joka havaitaan substraatin kyllästyskonsentraatioissa (s.o. sub- ! straattia on läsnä suurena ylimääränä entsyymin suhteen).

| j i

Tyypillisessä amidointientsyymianalyysissä reaktiojärjestelmä (50 ui) käsittäisi entsyy-io miä (n. 7 pg), dansyyli-L-TyrVal-Gly:tä (korkeintaan 40 μΜ), L-askorbiinihappoa (3 mM), katalaasia (0 -100 pg ml'1) ja kuparisulfaattia (0-2 uM) 60 mM TES-puskurissa, pH 7,0. Reaktio käynnistetään 37 °C:ssa lisäämällä entsyymiä ja päätetään määrätyn ajan kuluttua lisäämällä 0,1 M EDTA:ta (loppukonsentraatio), joka sitoo kuparin tekemällä se sellaiseksi, että se ei ole entsyymin käytettävissä.

15

Alfa-amidointientsyymi omaa korkean affiniteetin dansyyli-LTyr-Val-Gly:n entsymaat- tisen amidoinnin suhteen, jolloin Km on 1 - 2 pM. Tämä arvo näyttää olevan vakio entsyymin puhtausasteesta huolimatta. Siten entsyymivarastolla, joka on johdettu

Sephacryl S-300 kromatografiasta, on sama Km kuin entsyymin elektroforeettisesti ; ; 20 puhtailla valmisteilla, joka on johdettu Mono Q-kromatografiasta (pH 8,0) tai alemman • · · · /··; molekyylipainon omaavista muodoista, jotka on analysoitu Mono Q-kromatografialla, pH 6,0. Toisaalta, kuten odotettiin, Vmax-arvot (ilmaistuna proteiinin mg:a kohden) : : *: vaihtelevat olennaisesti puhdistusasteen mukaisesti. Siten kun Sephacryl S-300:sta joh- \ ‘ · detun varaston Vmax on n. 50- 100 nmoolia tuotetta/min./mg proteiinia, puhtaan tuu- ·’ 25 morientsyymin Vmax on n. 5000 nmoolia tuotetta/mg proteiinia.

• · • tl •. ·: Olemme todenneet, että askorbaatti ja substraatti voivat kilpailla keskenään entsyymistä • · · • · •. · ‘ joissakin olosuhteissa. Esimerkiksi jos substraatin konsentraatiota lisätään olennaisesti • · ί, V kyllästystason yli, entsyymiaktiivisuus laimenee entsyymin j a askorbiinihapon välisen • » · :· 30 heikentyneen vuorovaikutuksen johdosta. Siten jokaiselle erityiselle substraatille näyt- • ’ · *: tää olevan hieno tasapaino optimaalisten substraatti/askorbaattitasojen välillä riippuen • · : ’ \: entsyymin affiniteetista erityisen substraatin suhteen.

f 48 110433

Amidointientswmin affiniteetti glvsiinillä laajennettujen peptidien suhteen

Olemme käyttäneet monodansyyli-L-Tyr-Val-Gly-amidoinnin analyysiä herkkyyskoet-timena amidointientsyymin ja useiden gly-laajennettujen peptidiprohormonien väliselle 5 reaktiolle. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia entsyymin suhteellista affiniteettia määrättyjen erityyppisten peptidisubstraattien sitoutumisen suhteen. Vaikka olemme osoittaneet aikaisemmin, että entsyymi amidoi onnistuneesti ihmisperäisen kalsitoniinin ja ihmisperäisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän glysiinillä laajennettuja prekurso-risubstraatteja, tämä ei kerro mitään entsyymin kyvystä sitoa ensisijaisesti näitä tai mui-10 ta peptidejä toistensa suhteen.

Olemme osoittaneet, että glysiinillä laajennettu alfa-melanosyyttiä stimuloiva hormoni, substranssi P, vasopressiinianalogit ja kasvuhormonia vapauttava tekijä ovat keskinäisessä vuorovaikutuksessa suurella affiniteetilla amidointientsyymin kanssa estäen sitä is metabolisoimasta dansyyli-LTyr-Val-Gly:tä. Edelleen ihmisperäisen glysiinillä laajennetun kalsitoniinin, neuropeptidi Y:n, kolekystokiniinin, kortikotrofiinia vapauttavan tekijän ja kalsitoniini-geenin sukuisen peptidin viittä C-terminaalista aminohappotähdettä vastaavat pentapeptidimallit osoittavat kilpailua tässä analyysissä. Toisin sanoen entsyymi pystyy sitomaan ja oletettavasti amidoimaan kaikki nämä 20 glysiinillä laajennetut peptidisubstraatit.

t I · * • · • · · f ·

Sitä vastoin tutkittaessa näitä substraatteja vastaavia amidoituja peptidejä niiden todet-i : *: tiin olevan paljon vähemmän kykeneviä olemaan vuorovaikutuksessa entsyymin kanssa, i * : Tämän entsyymin katalyyttisen paikan kapasiteetti tunnistaa suuri määrä glysiinillä laa- v : 25 jennettuja substraatteja tekee siitä erittäin käyttökelpoisen yleisen reagenssin yhdistel- mä-DNAtekniikalla tuotetun peptidiprohormonin kaupalliselle amidoinnille.

« ·

Esimerkki 10 • · • s/· DNA-sekvenssin koodaavan huipun III α-amidointientswimn eristys 30 : * · ’: Koko RNA valmistettiin rotan MTC-kudoksesta käyttämällä guanidiinitiosyanaatti- : * \ i menetelmää. Poly-A-RNA valittiin oligodT-selluloosalla.

49 110433 cDNA-svnteesi

Kaksisäikeinen cDNA valmistettiin hyvin tunnetuilla menetelmillä. Käyttämällä rotan MTC-kudoksesta peräisin olevaa poly-A-RNA:ta mallina ja oligo-dTi2-i8:ta pohjana 5 ensimmäinen säiesynteesi suoritettiin entsymaattisessa reaktiossa käänteistransskriptaa-silla. cDNA ja RNA erotettiin ja RNA pilkottiin alkalilla. cDNArn toinen säiesynteesi itsekäynnistettiin käyttämällä E. colin DNA-polymeraasia I. Sl-nukleaasisulatusta käytettiin cDNA.n hiusneulasilmukoiden poistamiseksi ja cDNA:n yksisäikeisten alueiden hajottamiseksi. DNApolymeraasi I:n kanssa suoritetun reaktion jälkeen tasaisten päiden 10 tuottamiseksi kaksoissäikeinen cDNA käsiteltiin EcoRlmetylaasilla ja s-adenosyyli- metioniinillä EcoRl-paikkojen metyloimiseksi ja niiden suojaamiseksi myöhemmältä entsymaattiselta lohkaisulta. EcoRl-sitojat yhdistettiin cDNA:han. EcoRl-sulatuksen jälkeen ylimääräiset sitojat erotettiin cDNA:sta ja cDNA jakofraktioitiin Sepharose 4B-pylväällä. Yhtä tällaista synteesiä varten molekyylit, jotka olivat suurempia kuin 500 15 emäsparia, kerättiin, kun taas toisessa molekyylit, jotka olivat suurempia kuin 1000 emäsparia, yhdistettiin kloonausta varten.

λ gtl 1 cDNA-kiriaston muodostaminen . ·. 20 Sitojilla sovitetun kaksisäikeisen cDNA:n synteesin jälkeen molekyylejä käytettiin

'.:; cDNA-kiqastojen tuottamiseksi vektorissa Xgt 11. Tämä suoritettiin liittämällä cDNA

;*·; Xgt 11 DNA:han,joka oli lohkaistu EcoRl:llä ja käsitelty fosfataasilla vektori-DNA:n : : *: itseyhdistymisen estämiseksi. DNA:n liittämisen jälkeen rekombinoidut DNA:t pakat- : · : tiin in vitro infektioosisten bakteriofagihiukkasten tuottamiseksi. (Pakkaamisuutteet : : : 25 ovat kaupallisesti saatavia yhtiöltä Promega Biotech tai Clontech Laboratories tai ne voidaan valmistaa vakiomenetelmillä).

• · * • · ... * DN A:n pakkaamisen j älkeen määräosia pakkausseoksesta testattiin kirj astoj en rekom- : Y: binanttien määrän määrittämiseksi. Yhden kirjaston todettiin sisältävän n. 2,57x106 :,,,: 30 infektioosista hiukkasta, joista n. 78 % oli ilmeisiä rekombinantteja (muodostaen selvät \' · ’; plakit X-Gal-levyillä kasvatettaessa IPTG:n läsnäollessa). Toisen kirjaston todettiin : * ·. I sisältävän n. 2,75 x 106 kaikkiaan plakin muodostavia yksiköitä ja n. 81 % ilmeisiä re kombinantteja.

110433 50

Kirjaston analysointi

Sen tunnistamiseksi, mikä rekombinoitu bakteriofagi sisälsi alfa-amidointientsyymin 5 proteiinin cDNA:n, fagit analysoitiin radioaktiivisesti merkityillä oligonukleotidi-koettimilla, jotka oli muodostettu alfa-amidointientsyymin spesifisistä aminohapposekvensseistä. (Ks. esimerkki 7, taulukko II). Analysointi suoritettiin päällystämällä bak-teriofaginäytteet ja nostamalla fagit selluloosanitraattisuodatuskiekoille. Menetelmät fagien immobilisoimiseksi selluloosanitraattisuodattimilla ovat laajalti tunnettuja. Jo-10 kaisesta levystä saadut kaksoissuodattimet hybridisoitiin 32P-merkityllä oligonukleoti-dillä AE 9. Hybridisaatio suoritettiin 37 °C:ssa 20 - 24 tunnin kuluessa, 6 x NET, 0,5 % NP40, 5 x Denhardt'in liuosta, 100 pg/ml lohen siemenneste-DNA:ta, oligonukleotidi-koettimella 0,3 - 0,4 pmoolissa/mg. Hybridisaation jälkeen suodattimet pestiin 6 x SCC:ssä 44 45 °C:ssa useiden tuntien ajan ja röntgenfilmattiin. Positiivisesti hybridisoi-15 tuvat fagit tunnistettiin yhdenmukaisina täplinä kaksoissuodattimilla. Nämä puhdistettiin rikastamalla järjestyksessä useilla päällystys-ja hybridisointikier- roksilla. N. 4 - 5 x 104 analysoidusta fagista 18 tunnistettiin AE 9:llä.

Spesifisyyden vertaamiseksi valinnassa suoritettiin hybridisaatio toisella alfa-20 amidointientsyyminukleotidillä, AE 8:11a. Tämä koetus osoitti, että vähintään neljä kah- • » 11 · •.:. deksasta fagista sisälsivät alfa-amidointientsyymiproteiinisekvenssien cDNArn. Tämä • * • ♦ • V. vahvistettiin ylimääräisellä oligonukleotidihybridisaatiolla (AE 4:llä ja AE 5:llä) sa- : moin kuin DNAsekvenssianalyysillä.

t M · • · · • · · • · 25 α-amidointientswmin ilmaisu •, ‘ · · Huipun III a AE:lla, jolle olemme määrittäneet proteiinisekvenssit, on molekyylipaino- '... · na n. 75.000 daltonia. Jos aminohapon keskimääräiseksi molekyylipainoksi otetaan 120 : V: daltonia, silloin amidointientsyymissä on korkeintaan 625 aminohappoa. 625 aminoha- : _ 30 pon geenin täytyy sisältää vähintään 1875 emäsparia. Kaikki neljä cDNArta, jotka : v. olemme eristäneet amidointientsyymille spesifisinä, ovat riittävän suuria koodaamaan :" ·. · täysin α-amidointientsyymiproteiinin. Yksi cDNAklooneista, λ AE 1, on pituudeltaan n.

2.200 nukleotidiä. Ensimmäisillä 50 nukleotidillä toisesta päästä laskien se aloittaa 110433 51 koodaamisen aminohapposekvensseille, joka on tunnistettu huipun III entsyymin ami-nopäätteenä. Tästä syystä voidaan päätellä, että cDNA sisältää koko koodauskapasitee-tin, joka tarvitaan huipun III entsyymille. Kim tunnetaan tämä informaatio ja nukleoti-disekvenssit 2.200 emäsparin cDNA:n päissä, on suhteellisen yksinkertaista sovittaa 5 cDNA perimäkloonausta varten prokaryoottiseen isäntään, kuten E. coliin.

Eräs mahdollinen menetelmä, jota voidaan soveltaa λ ΑΕΙ cDNA:han, on esitetty kuviossa XXXII. Esimerkiksi λ ΑΕΙ :n 2.200 emäsparin cDNA-sovite eristetään rekom-binoidun bakteriofagi-DNA:n EcoRl-sulatuksen ja agaroosigeelielektroforeesin jälkeen.

10 Se kloonataan pBR322:n EcoRl-paikkaan plasmidipAE8-l:n tuottamiseksi. pAE8-l sisältää ainutlaatuisen Kpnllohkaisupaikan cDNA-sekvensseissä ja ainutlaatuisen Hind ΙΙΙ-paikan pBR322-sekvensseissä. pAE8-l:n sulatus Kpnlrllä ja Hind III:lla tuottaa n.

2,15 ke:n fragmentin, joka on menettänyt n. 62 cDNA.n emäsparia (cDNA:n aminopäät-teen koodaavan pään). Aminohappojen muodostamiseksi takaisin, jotka löydettiin hui-15 pun III amidointientsyymin amino-päätteessä ja cDNA:n sovittamiseksi kloonausta varten ilmaisuplasmidiin, Kpnl-Hind III-päätteinen fragmentti liitetään oligonukleotidi-sitomissovittajiin. Esitetyssä esimerkissä käytetään E. colin ilmaisuplasmidia pHH233-2, jota toimittaa Pharmacia. 2,15 ke:n cDNA-fragmentti liitetään kaksisäikeiseen sito-jasovittajaan, joka koostuu .·; 20 ..: : 5, 3' .··*·: AE17 (+) 3 0 CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC : s ta :’v ja ’ ·'· E ' 3 ' ::: AE18(-}2 2 CAAGGCATTCATTGGAAAATGA : at a.

• · · • · • · V : 25

Sovitettu fragmentti liitetään sitten plasmidiin pKK233-2 DNA, joka on edellä lohkaistu • · :. ’ ·: NcoLllä ja Hind 111:11a, 4,6 ke:n lineaarisen vektorin tuottamiseksi. Liitetty tuote, • · · • · • · · * pAE12, sisältää cDNA:n alfa-amidointientsyymin, jota edeltää ATG-käynnistyskodoni • · :,:: ja ribosomin sitomispaikka ja hybridin valvonnassa IPTG-indusoitava edistin, trc. Gee- :30 niä seuraa 5S-geeni ja transskription terminaatiopaikka. pAE12:n IPTGindusoitava il- •' * *: maisu saadaan aikaan plasmidi-DNA:n transformaation jälkeen E. coli-kantaan laciq- • · genotyypillä.

52 110433 λΑΕ1:η 2.2 ke:n cDNA-sovitteen osittainen DNA-sekvenssi 2,2 ke:n sovite poistetaan λ AEl:n EcoRl-sulatuksella ja sovite merkitään 32p:llä. Sekundaarisen Hinc 11:11a suoritetun sulatuksen jälkeen saatavat 1,6 ke:n ja 0,6 ke:n frag-5 mentit sekvenssoidaan Maxamin ja Gilbertin kemiallisella hajotusmenetelmällä.

DNA-sekvenssi, joka saadaan EcoRl -pään λ AE-1 :n 600 ke:n fragmentin Maxam-Gilbert-sekvenssoinnilla: 10 v v v v 50v aattccggtctttaagaggtttaaagaaactaccagatcattttccaatg v v v v lOOv

AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT

v v v v 150v

GCGCTGGATATTCGCATGCGTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA

v v v v 200v

CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT

20 DNA-sekvenssi, joka saadaan EcoRl -pään λ AE-1 :n 1600 ke:n fragmentista Maxam- .’·*·: Gilbert-sekvenssoinnilla: • · • » • · * I i » • · · t • · · i « » v v v v 50v

25 AATTCCGTCTCAGTTTCTGTTTCTCTTGCATCTTCTGCAATTCTGAGGAG

v v v v lOOv

:' ·. · GTGGGTTTGTTCTCCACTTTGGGTTCGACAACTGCCTCGGCTTCTTTG AT

’...· v v v v 150v

TTCGTGGACTTCGATGCCAGCCTTTTTAACTGACGCATGCTCCATTTTTT

• # · ,···. v v v v 200v

30 CGGTCAGGGTGAACTTCCACACGGTGTTGTGTGTGCGCTCGAAGACCG

110433 53 i j

Sekvenssihomologian tutkiminen olieonukleotidikoettimen AE8(-)22 suhteen

Tietokonetutkimus suoritettiin homologian tutkimiseksi aminohappojen, joita käytettiin koettimen AE8 (Leu-Gly-Thr-IleGly-Pro-Val-Thr) tuottamiseksi, ja λΑΕ1:η 600 ke:n 5 fragmentin DNA-osasekvenssin translaation välillä.

Saatiin täydellisen homologian alue ja tätä aluetta on tähdennetty tähdillä DNA-sekvenssissä ja isoilla kirjaimilla aminohappojen kohdalla. Aminohapot, jotka on identifioitu puhdistetun amidointientsyymin NH2-terminaalisella sekvenssoinnilla, on io esitetty sulkumerkeissä. Aminohappoesitykset, joiden havaitaan poikkeavan niistä, jotka ennustettiin DNAsekvenssillä, on merkitty merkillä

AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG

----·----+----·----+----·----+----·----+----1----+ so ipvfkrfkettr(sfsne 15 + **********************

AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT

----·----+—-—·----+----1----+----1----+----·----+ JOO

C LGT IGPVTpl dasdf + +

GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA

—---1----+----1----+----1----+----1——+----1----+ 150 20 aldirm.p)gvtpke sdty *'· · +

CTTTCTGCACGTCCATGCGTCTACCT

----·----+----1----+----·- 176 .1 flhvhast.

• · 1 t t 1 • · · · • · · * 1 · • · • · : : ·1 25 Esimerkki 11 • " -

Entsyymin immobilisointi • 1 1 • < · • · t · »

• I

.. · ’ a-AE:n puhdistus: 1 » • · · • · :.,. 1 30 Ennen immobilisointia α-amidointientsyymi puhdistettiin heikon anioninvaihto- ja gee- V ’': lisuodatuskromatografian (esimerkki 4) avulla. Joissakin tapauksissa entsyymivalmiste t # ’ · · voidaan puhdistaa edelleen käyttämällä joko immunoaffiniteettikromatografiaa tai fe- nyylisefaroosikromatografiaa. Tämän jälkeen suoritettava immobilisointimenetelmä on 110433 54 riippumaton puhdistusmenetelmästä, mutta tavallisesti spesifisen aktiivisuuden tulisi olla vähintään 25 mU ja etenkin 50 mU tai korkeampi.

a-AE:n immobilisointi: 5 α-amidointientsyymin immobilisointitekniikka perustuu kolmen komponentin, entsyymin, akryyliamidin (PAN) vesiliukoisen kopolymeerin ja alhaisen molekyylipainon omaavan silloitusreagenssin (TET) samanaikaiseen reaktioon. Esivalmistettu polymeeri (PAN) koostuu akryyliamidista ja N-akrylosukkinimidistä, joka on polymeroitu THF-io liuoksessa käyttämällä termistä aloitusta atsobisillä (isobutyronitriili). Silloitusreagenssi voi olla α, ω -diamiini, trietyleenitetramiini, (TET) kystamiini. Diamiinin reaktio PAN:in aktiiviesteriryhmien kanssa silloittaa polymeeriketjut amidisidosten kautta ja muodostaa liukenemattoman geelin. Entsyymin aminofunktiot (mieluummin lysiinin ε-aminoryhmä) reagoivat samanaikaisesti jäljellä olevien aktiiviestereiden kanssa geelissä 15 ja muodostavat stabiileja kovalenttisia amidisidoksia. Immobilisointi suoritetaan substraatin ja kofaktoreiden läsnäollessa. Korkean affiniteetin omaavan substraatin ja ko-faktoreiden läsnäolo konsentraatioissa, jotka ovat suurempia kuin Km, inhiboivat PAN-aktiiviestereiden ja nukleofiilisten ryhmien väliset reaktiot entsyymin katalyyttisessä paikassa tai sen lähellä suojaten näin entsyymiä kemialliselta inaktivoitumiselta.

20 t · · ·

Immobilisaatio-olosuhteet • · · · t | Osittain puhdistettu a-AE tehdään liukenevaksi 30 mM HEPESpuskurissa, pH 7,0.

• · I

• PANin ja TETin suhde muodostetaan siten, että 15 % aktiiviestereistä jäävät reagoimat- ·.* : 25 ta ja toimivat siten α-amidointientsyymin sitomispaikkoina. Vakio PAN-liuos on 20%:nen (w/w). α-amidointientsyymin reaktioseos koostuu 0,2 μΜ CuS04:stä, 40 μΜ dansyyli-His-Phe-GIy:stä ja 10 mM askorbaatistaja 0,5 - 2,0 mg:sta α-ΑΕ/g PANia.

• · « ’", ’ TET-konsentraatio lasketaan siten, että se on yhtä suuri kuin 0,85 ekvivalenttia primaa- * * · ‘ ’ rista amiinia/ekvivalentti aktiiviesteriä. Tavallisesti optimiolosuhteiden määrittämiseksi ‘ · · ·' 30 reaktio ilman entsyymiä suoritetaan geeliytymisajan vahvistamiseksi, s.o. aika, joka t I · * ‘· vaaditaan TET.n lisäyksen jälkeen geelin muodostuksen aikaansaamiseksi, <x- * · "· amidointientsyymin immobilisoinnin optimisaannot saadaan silloin, kun entsyymin li säys siirretään lähemmäksi geeliytymispistettä. Yleisenä sääntönä on, että mitä lyhy- 110433 55 emmän aikaa entsyymi on alttiina PANin vaikutukselle ennen geelinmuodostumista, sitä korkeampi on aktiivisen immobilisoidun entsyymin saanto. Useimpien reaktioiden kohdalla a-AE (n. 2,0 mg/g PANia) lisätään 45 60 sekuntia TET:n jälkeen. Entsyymiä sisältävän geelin annetaan seistä huoneen lämpötilassa n. tunnin ajan kytkentäreaktion s päättymisen mahdollistamiseksi. 60 minuutin kuluttua geeli jauhetaan huhmarella ja petkeleellä, jolloin saadaan fragmentteja, joiden koko on keskimäärin 100 μ. Nämä hiukkaset pestään ammoniumsulfaatilla sitoutumattomien lähtöaineiden poistamiseksi ja jäljellä olevien aktiivisesteriryhmien muuntamiseksi amideiksi peittämällä näin reaktiiviset ryhmät. Aktiivisen α-amidointientsyymin saannon oletetaan olevan immobilisaa-10 tion jälkeen vähemmän kuin 60 %. Immobilisaation jälkeiset pesuvedet voivat sisältää 30-40 % alkuaktiivisuudesta. α-amidointientsyymi voidaan ottaa talteen pesuvesistä lisäämällä ammoniumsulfaattikonsentraatiota 45 %:iin, mikä saa aikaan sen, että aktiivinen α-amidointientsyymi saostuu.

15 Immobilisoidut geelihiukkaset ovat sopivia jaksottaiseen amidointireaktioon, jossa hiukkaset pidetään suspensiossa mekaanisella sekoittimella. Kun entsymaattinen reaktio on päättynyt, hiukkasten annetaan laskeutua ja amidoidun peptidituotteen sisältävä su-pematantti dekantoidaan. Tämä menetelmä ei ole optimaalinen suurimittaisiin reaktioihin. Entsyymiä sisältävät geelihiukkaset eivät ole tarpeeksi jäykkiä niiden pakkaamisek- || 20 si pylvääseen ja järkevien virtausnopeuksien aikaansaamiseksi. Tämän ongelman eli- « · minoimiseksi on mahdollista käyttää kahta vaihtoehtoista tapaa: • · · • · * · :: 1. Geelin annetaanpolymeroitua lasihelmien läsnäollessa. Tavallisesti minuuttia ennen • · · * * · . ‘ geeliytymispistettä lasihelmet lisätään reaktioseokseen j a sekoitetaan mekaanisella se- I M # · * ‘ ’ 25 koittimella, kunnes helmet on peitetty PAN-liuoksen kerroksella. Tämän sekamateriaa lin virtausominaisuudet ovat paljon paremmat kuin pelkkien geelihiukkasten vir- » · » • I · I,. * tausominaisuudet.

• · I I · 1 · * ·' 2. Vaihtoehtoisesti PAN-hiukkaset sekoitetaan suodatusapuaineen, Celite 545:n kanssa.

> · · # * ’ ·; · ‘ 30 Tavallisesti PAN:in ja Celiten seos valmistetaan PAN:in kanssa, joka muodostaa alle 8 »· » • ‘· % w/w (kuivapaino) seoksesta. Tämän tyyppisen pylvään muodostamiseksi geelihiuk- I · ’. ’ *: kaset suspendoidaan 50 mM Tris:HCl:ään, pH 7,0, ja Celite 545 lisätään sekoittaen jat kuvasti ja sekoitetaan vielä 2 tunnin ajan. Pylväs pakataan tällä lietteellä (3 x 40 cm) ja 110433 56 pylvään lämpötila pidetään 37 °C:ssa amidointireaktion helpottamiseksi. Käyttämällä tätä menetelmää pidetään virtausnopeutena 8-101/päivä.

Eräs mielenkiintoinen vaihtoehto pylväskromatografialle on käyttää tangentiaalista vir-5 tausjärjestelmää. PAN-polymeeri kaadetaan ennen geeliytymispistettä 0,45 pm.n poly-sulfonihuokostukilevylle. Geeliytymisen jälkeen levyt voidaan leikata sellaisiksi, että ne sopivat tangentiaalisen virtauksen Millipore- tai New Brunswick-ultrasuodatusyksikköihin. Tässä mallissa polysulfoni-PAN-immobilisoitu entsyymi-geeli-sekalevyt pinotaan kerroksiksi, jolloin saadaan valtava pintaalan lisäys. Tämä me-io netelmä voidaan korottaa suoraan virtausnopeuksiin, jotka ovat litroja minuutissa. Tämän tyyppinen järjestelmä saa aikaan myös mukavan menetelmän reaktioseoksen kierrättämiseksi peptidisubstraatin amidoinnin maksimoimiseksi.

Etuihin, jotka saavutetaan immobilisoimalla α-amidointientsyymi, kuuluvat entsyymin is talteenotto ja uudelleenkäyttö. Toiseksi immobilisoitu matriisi lisää entsyymin stabiiliutta ja saa aikaan entsyymin käsittelymuodon, jota voidaan käyttää suurimittaisissa amidointireaktioissa (substraatin määrien ollessa grammoista kiloihin) pidennettyjen aikajaksojen kuluessa.

20 Esimerkki 12 ft· « ' * : Immunoaffiniteettipvlvään valmistus epäpuhtaiden alfa- Γ**: amidointientsvvmikoostumusten puhdistamiseksi • * • i « • · · • ta i « · · ’ ’ ί A. Immobilisaatio: • · " ' " i t « * » · 25 Käytetty immobilisaatiomatriisi oli syaanibromidi-aktivoitu Sepharose 4B (Pharmacia).

• « ’ 1 Kuiva geeli pestiin ensin 1 mM HCl:llä (200 mg/g hartsia) kiinteän tuen paisuttamiseksi • · ' t » «· * ja pesemiseksi. N. 40 mg puhdistettua polyklonaalista vasta-ainetta, joka oli puhdistettu

• I

V, · kanan munankeltuaisista, dialysoitiin 100 mM HaHCC^a vastaan, pH 8,3, joka sisälsi

Ml 1,,.: 30 0,5 M NaCkä. Kytkentä suoritettiin käyttämällä 8 ml edellä paisutettua ja pestyä kiinte-

;' *': ää tukea. Reaktio suoritettiin kolmen tunnin kuluessa huoneen lämpötilassa 100 mM

:* *. i natriumbikarbonaattipuskurissa, pH 8,3, joka sisälsi 500 mM NaCkä, jota käytettiin proteiinin epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi kiinteään tukeen. Geelin jäljellä olevat 110433 57 aktiiviset ryhmät salvattiin käyttämällä 0,2 M glysiiniä. Salpausvaiheen jälkeen geeli pestiin 4-5 kertaa käyttämällä korkean ja alhaisen pH-arvon omaavien puskureiden sykliä (korkean pH-arvon omaava puskuri 100 mM NaHCCb pH 8,3 + 500 mM NaCl, alhaisen pH-arvon omaava puskuri 100 mM asetaatti pH 4,0 + 500 mM NaCl). Nämä 5 pesuvaiheet poistivat sitoutumattoman proteiinin ja salpausreagenssin (glysiini) hartsista. Immunoaffiniteettihartsi varastoitiin 4 °C:ssa emäksisen pH:n omaavassa puskurissa, joka sisälsi mertiolaattia bakteriostaattisena aineena. Koko seuraava immunoaffiniteet-tikromatografia suoritetaan 4 °C:ssa. Samanlaista menetelmää voidaan käyttää puhdistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden immobilisoimiseksi.

10 B. Immunoaffiniteettikromatografia

Immunoaffiniteettipylvästä käytettiin vaihtoehtoisena erittäin tehokkaana vaiheena a- AE:n puhdistuksessa. CA-77-soluista peräisin oleva kudosviljelyväliaine (ks. esimerkki 15 4) laimennetaan tislatulla vedellä j a pumpataan DEAE-anioninvaihtopatruunan läpi, joka on edellä tasapainotettu 20 mM Bis Tris-HCl:llä pH 6,0. α-amidointientsyymi elu- oidaan patruunasta 50 mM Tris:HCl:llä pH 7,0, joka sisältää 500 mM NaCl.ä. a-AE- aktiivisuuden sisältävät fraktiot joko dialysoidaan Tris-HCl-puskuria, pH 7,0, vastaan, tai puhdistetaan edelleen käyttämällä geelisuodatuskromatografiaa (esimerkki 4) ennen . ·. 20 immunoaffiniteettikromatografiaa. a-AE:tä sisältävät näytteet ohjataan immunoadsorp- •.:. tiopylvään läpi neutraalissa pH-arvossa. Vasta-aineet sitovat spesifisesti a-amidointi- entsyymin, kun taas epäpuhtaat proteiinit eivät sitoudu ja ne poistetaan eluentissa. a- : : 1: AE-aktiivisuus voidaan eluoida pylväästä käyttämällä 100 mM glysiini :HCl-puskuria • · · pH 3,0 (voidaan käyttää muita desorptioaineita, mukaanlukien ureaa, dioksaania, ety- • · » :: 1 25 leeniglykolia ja Nalrtä). Fraktiot kerätään 1,0 M Tris:HCl:ään pH 7,0 puskurijäqestel- män puhdistamiseksi säilyttäen samalla a-AE-aktiivisuus.

• · · • · • · 1 • 1 • 1 • · · • t # · • · · 58 110433

Yhteenveto keksinnön hyödyntämismahdollisuuksista 1. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin peptidiketjunsa C-5 päätteessä glysiinitähteen sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyy-liamidiyhdisteeksi, jossa on aminoiyhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, ja joka entsymaattinen koostumus on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia, ja että entsymaattinen koostumus on riittävän vapaa proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka 10 pystyy haj ottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, joita ovat peptidyyliyhdiste, vastaava peptidyyliamidi ja alfa-amidointientsyymit, niin että mainittu koostumus voi katalysoida muuntoa, kun peptidyy liyhdiste sisältää L-aminohappoja.

Entsymaattinen koostumus sisältää edullisesti vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, 15 joka voidaan saada medullaarisista kilpirauhaskarsinoomatuumoreista, esimerkiksi rotan medullaarisista kilpirauhaskarsinoomatuumoreista.

Entsymaattinen koostumus sisältää edullisesti vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka voidaan saada IVI-10029:stä (sittemmin ATCC CRL 10919) peräisin olevasta soluvil-20 jelyväliaineesta.

» · » ♦ . ’ · ·: 2. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka . ' : pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysii- • · •. · · nitähteen sisältävän peptidyylisubstraatin muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on • ‘: 25 aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, jossa alfa-amidointientsyymin

• M

:: ilmeinen molekyylipaino on n. 60.000 - n. 65.000 daltonia mitattuna geelisuodatuskroma- tografialla ja n. 73.000 - n. 75.000 daltonia mitattuna elektroforeesilla natriumdodekyyli- • · sulfaatti/polyakryyliamidigeelillä, ettäalfa-amidointientsyymi eluoidaanpH-arvon6 omaa- ♦ · · ·;·' valla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapainotettu pH-arvossa 6, hiuk- • · , v. · 30 kaskoko 10 pm, ontelotilavuus 40 % ja geeli, jonka varattu ryhmä on -CHh-hT-(0¾¾ ja :... · jonka ionikapasiteetti on 0,28 - 0,36 mmoolia/ml), jolloin pH 6-eluointi tapahtuu ensin • * ·’: natriumkloridikonsentraatiossa, joka on n. 220 mM tai sen yli, että alfa-amidointientsyymi • · : eluoidaan pH-arvon 8 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapai notettu pH-arvossa 8), jolloin pH 8-eluointi tapahtuu ensin natriumkloridikonsentraatiossa, 110433 59 joka on n. 250 mM tai sen yli, ja että alfa-amidointientsyymin optimaalinen aktiivisuus on pH-arvossa 4,5 - 5,5 (mitattuna dansyyli-L-Try-Val-Gly:n fraktiolla, joka on muunnettu dansyyli-L-Try-Val-CONH2:ksi 16 minuutissa), että alfa-amidointientsyymi on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen spesifinen ak-5 tiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia.

Edellä mainitun entsymaattisen koostumuksen alfa-amidointientsyymin isoelektrinen piste on n. pH 4,8 määritettynä ei-denaturoidulla isoelektrisellä tarkennusakryyliamidigeelillä, ja alfa-amidointientsyymin N-terminaalinen aminohapposekvenssi on 10 12 3 4 NH2-Ser-Phe-Ser-Asn tai sen homologi.

15 3. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä tai sen aktiivista fragmenttia tai homologia, joka sisältää peptidiketjun, joka on olennaisesti homologinen vähintään yhden seuraavan aminohapposekvenssin suhteen: ! i 20 ! .·. (a) *;V -Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-

Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe-Ala-Leu-Asp-Ile- ' ·1 Arg-Met-Pro • 1 • · · ::v (b) : 1 ! 25 -Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser-’ Gln-Pro-Thr- V-i (c) • · · -Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg- 30 '!1 -Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-, t 1 »

• I

• · · · • · · • · 110433 60 ja joka koostumus on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymissä, niin että koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia ja että koostumus on riittävän vapaa proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan vähintään yhden kokonai-i suuden, joita ovat substraattipeptidyyliyhdiste, vastaava peptidyyliamidituote ja al- 5 fa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi katalysoida alfa-amidointireaktiota, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja.

4. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysii-10 nitähteen sisältävän peptidyylisubstraatin muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, ja jossa alfa-amidointientsyymin ilmeinen molekyylipaino on n. 60.000 - n. 65.000 daltonia mitattuna geelisuodatuskroma-tografialla ja vähemmän kuin n. 55.000 daltonia mitattuna elektroforeesilla natriumdode-kyylisulfaatti/polyakryyliamidigeelillä, että alfa-amidointientsyymi eluoidaan pH-arvon 6 15 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapainotettu pH-arvossa 6, hiukkaskoko 10 pm, ontelotilavuus 40 % ja geeli, jonka varattu ryhmä on -CH2-N*-(CH3)3 ja jonka ionikapasiteetti on 0,28 - 0,36 mmoolia/ml), jolloin eluointi tapahtuu ensin natri-umkloridikonsentraatiossa, joka on n. 160 mM tai sen yli, ja että alfa-amidointientsyymin optimaalinen aktiivisuus on pH-arvossa 7,0 - 8,5 (mitattuna dansyyli-L-Tiy-Val-Gly:n 20 fraktiolla, joka on muunnettu dansyyli-L-Try-Val-CONH2:ksi 16 minuutissa), että entsy-: *: maattinen koostumus on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaat-

f · · I

. ’ · ’: tisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia.

t » · • · • · •. j i 5. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka : *. · 25 pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysii- * · · :. * * nitähteen sisältävän peptidyylisubstraatin muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, ja jossa alfa-amidointientsyymin '. *: ilmeinen molekyylipaino on n. 60.000 - n. 65.000 daltonia mitattuna geelisuodatuskroma- • · ♦ • · • · · * tografialla ja alle n. 55.000 daltonia mitattuna elektroforeesilla natriumdodekyyli- . ·.: 30 sulfaatti/polyakryyliamidigeelillä, että alfa-amidointientsyymi eluoidaan pH-arvon 6 :... · omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapainotettu pH-arvossa 6, • ‘ · ’: hiukkaskoko 10 pm, ontelotilavuus 40 % ja geeli, jonka varattu ryhmä on -CH2-N+-(CH3)3 :' ·.: ja jonka ionikapasiteetti on 0,28 - 0,36 mmoolia/ml), jolloin pH 6-eluointi tapahtuu ensin » * natriumkloridikonsentraatiossa, joka on n. 160 mM tai sen yli, ja että alfa-amidointientsyy- 61 110433 ( mi eluoidaan pH-arvon 8 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasa- painotettu pH-arvossa 8), jolloin pH 8-eluointi tapahtuu ensin natriumkloridikonsentraa-tiossa, joka on n. 185 mM tai sen yli, ja että alfa-amidointientsyymin optimaalinen aktiivi-j suus on pH-arvossa 5,0 - 8,5 (mitattuna dansyyli-L-Try-Val-Gly:n fraktiolla, joka on j 5 muunnettu dansyyli-L-Try-Val-CONHf.ksi 16 minuutissa), että alfa-amidointientsyymi on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia.

6. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka 10 pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysii- nitähteen sisältävän peptidyylisubstraatin muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, ja jossa alfa-amidointientsyymin ilmeinen molekyylipaino on n. 60.000 - n. 65.000 daltonia mitattuna geelisuodatuskroma-tografialla ja n. 73.000 - n. 75.000 daltonia mitattuna elektroforeesilla natriumdodekyyli-15 sulfaatti/polyakryyliamidigeelillä, että alfa-amidointientsyymi eluoidaan pH-arvon 6 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapainotettu pH-arvossa 6, hiukkaskoko 10 pm, ontelotilavuus 40 % ja geeli, jonka varattu ryhmä on -CHi-bT-(CH3)3 ja jonka ionikapasiteetti on 0,28 - 0,36 mmoolia/ml), jolloin pH 6-eluointi tapahtuu ensin [ natriumkloridikonsentraatiossa, joka on n. 200 mM tai sen yli, ja että alfa-amidointientsyy- 20 mi eluoidaan pH-arvon 8 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasa-j : painotettu pH-arvossa 8), jolloin pH 8-eluointi tapahtuu ensin natriumkloridikonsentraa- ,' ” tiossa, joka on n. 220 mM tai sen yli, ja että alfa-amidointientsyymin optimaalinen aktiivi- • ‘: suus on pH-arvossa 4,5 - 5,5 (mitattuna dansyyli-L-Try-Val-Gly:n fraktiolla, joka on • · : muunnettu dansyyli-L-Try-Val-CONH2:ksi 16 minuutissa), että entsymaattinen koostumus : 25 on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen • · · '. ’ 1 spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia.

• »» t • 1 1 ‘ : Edellä mainitussa entsymaattisessa koostumuksessa mainitun vähintään yhden al- *; · 1 fa-amidointientsyymin isoelektrinen piste on n. pH 5,8, ja alfa-amidointientsyymin N- :.:. · 30 terminaalinen aminohapposekvenssi on • » • · 110433 62 NH2-Phe-Lys-Glu-Thr-Thr-Arg tai sen homologi.

5 7. Entsymaattinen koostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysii-nitähteen sisältävän peptidyylisubstraatin muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, ja jossa alfa-amidointientsyymin 10 ilmeinen molekyylipaino on n. 60.000 - n. 65.000 daltonia mitattuna geelisuodatuskroma-tografialla ja n. 73.000 - n. 75.000 daltonia mitattuna elektroforeesilla natriumdodekyyli-sulfaatti/polyakryyliamidigeelillä, että alfa-amidointientsyymi eluoidaan pH-arvon 6 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapainotettu pH-arvossa 6, hiukkaskoko 10 pm, ontelotilavuus 40 % ja geeli, jonka varattu ryhmä on -CH2-N*-(CH3)3 15 ja jonka ionikapasiteetti on 0,28 - 0,36 mmoolia/ml), jolloin pH 6-eluointi tapahtuu ensin natriumkloridikonsentraatiossa, joka on n. 240 mM tai sen yli, että alfa-amidointientsyymi eluoidaan pH-arvon 8 omaavalla natriumkloridiliuoksella anioninvaihtopylväästä (tasapainotettu pH-arvossa 8), jolloin pH 8-eluointi tapahtuu ainoastaan natriumkloridikonsentraatiossa, joka on n. 250 mM tai sen yli, että entsymaattinen koostumus on riittävän 20 puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen spesifinen ak-; *: tiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia.

• ·

Edellä mainitut entsymaattiset koostumukset ovat riittävän puhtaita alfa-amidointient- • · ;.: syymeissä, niin että niiden spesifinen aktiivisuus on edullisesti vähintään n. 50 mU/mg * * · • *,: 25 proteiinia, tai vähintään n. 150 mU/mg proteiinia, tai joissakin tapauksissa vähintään n.

M» · 1500 mU/mg proteiinia.

• · « *. *: Edellä mainitut entsymaattiset koostumukset ovat riittävän vapaita proteolyyttisestä aktii- a · · s · »·. * visuudesta, j oka pystyy haj ottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, j oita ovat peptidyy- ::: 30 liyhdiste, vastaava peptidyyliamidi ja alfa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi •,,,: katalysoida alfa-amidointireaktiota, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja.

| I

• · : * ·, | 8. Homogeeninen puhdistettu entsyymivalmiste, joka sisältää peptidyyli-glysiini-alfa- amidointimono-oksygenaasia ja pystyy katalysoimaan ainakin peptidiketjun C-päätteessä 110433 63 glysiinitähteen sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, joka peptidyyliyhdiste on puhdistettu luonnollisista lähteistä tai valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, ja valmisteen spesifinen entsyymiaktiivisuus on vähintään 25 mU/mg proteiinia, ja puhdistettu 5 entsyymituote on riittävän vapaa proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, joita ovat peptidyyliyhdiste, vastaava peptidyyliamidi ja alfa-amidointientsyymit, niin että mainittu koostumus voi katalysoida muuntoa, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja.

10 Homogeenisen puhdistetun entsyymivalmisteen spesifinen entsyymiaktiivisuus voi olla yli 1500 mU/mg proteiinia.

9. Puhdistettu entsyymivalmiste, joka on johdettu medullaarisista kilpirauhasarsinooma-kudoksista, niiden solulinjoista tai tällaisista solulinjoista peräisin olevista kudosviljely-15 väliaineista, ja joka valmiste sisältää peptidyyli-glysiini-alfa-amidointimono-oksygenaasia ja pystyy katalysoimaan ainakin peptidiketjun C-päätteessä glysiinitähteen sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, jolloin peptidyyliyhdiste tai polypeptidi on puhdistettu luonnollisista lähteistä tai valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla, että valmisteen spe-20 sifinen entsyymaattinen aktiivisuus on vähintään 1500 mU/mg proteiinia ja se on riittävän : *: vapaa proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan peptidyyliyhdisteen, vas- .' ·:: taavan peptidyyliamidin tai alfa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi katalysoida I’·': muuntoa, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja.

* · · · : 25 Medullaariset kilpirauhaskarsinoomakudokset on mieluiten johdettu rotan kudoksista ja -.· ’ spesifinen entsymaattinen aktiivisuus on vähintään n. 150 mU/mg proteiinia.

·.*·’: Medullaarisena kilpirauhaskarsinoomana voi olla esimerkiksi IVI 10028 (sittemmin ATCC

• * · *75168) ja solulinjana IVI 10029 (sittemmin ATCC CRL 10919).

:Y: 30 • · · : 10. Menetelmä vähintään yhden alfa-amidointientsyymin puhdistamiseksi, joka pystyy : *.'. katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysiinitähteen ,·',· sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on amino ryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, jossa menetelmässä alfa-ami- 64 110433 dointientsyymin sisältävä koostumus alistetaan sekä kokoekskluusiokromatografiaan, joka pystyy erottamaan proteiinityypit, joiden ilmeinen molekyylipaino on n. 58.000 - n. 67.000 daltonia, että vahvaan anioninvaihtokromatografiaan käyttämällä anioninvaihtohartsia, joka pystyy sitomaan alfa-amidointientsyymin, ja eluoidaan alfa-amidointientsyymi suola-5 liuoksella.

Vahva anioninvaihtokromatografia suoritetaan edullisesti kokoekskluusiokromatografian jälkeen ja se suoritetaan kokoekskluusiokromatografian eluentin osalla, joka omaa alfa-amidointientsyymin tunnusomaisen aktiivisuuden.

! 10 I Menetelmä voi käsittää edelleen ylimääräisen anioninvaihtokromatografiavaiheen ennen kokoekskluusiokromatografiavaihetta, sekä toisen anioninvaihtokromatografiavaiheen vah-I van anioninvaihtokromatografiavaiheen jälkeen.

15 Joko vahva anioninvaihtokromatografiavaihe tai toinen anioninvaihtokromatografiavaihe voidaan suorittaa emäksisessä pH-arvossa ja toinen happamassa pH-arvossa.

Menetelmässä alfa-amidointientsyymi voidaan johtaa anioninvaihtokromatografialla vilje- lyväliaineesta, jota on käytetty medullaarisen kilpirauhaskarsinoomasolulinjan kasvattami- 20 seksi. Menetelmässä medullaarinen kilpirauhaskarsinoomakudos homogenoidaan vesipi- : ’: toisessa väliaineessa, homogenaatti lingotaan ja linkouksen supematantti alistetaan ammo- *«* * .***: niumsulfaattisaostukseen.

• · * 11. Menetelmä alfa-amidointientsyymikoostumuksen tehokasta valmistusta varten, jossa : * · · : '.: 25 menetelmässä kerätään vähintään yksi epäpuhdas alfa-amidointientsyymi luonnollisesta tai ! v · rekombinoidusta lähteestä, alistetaan epäpuhdas entsyymi sekä kokoekskluusio kromatografiaan, joka pystyy erottamaan proteiinityypit, joiden ilmeinen molekyylipaino » * » *. on n. 58.000 - n. 67.000 daltonia, että anioninvaihtokromatografiaan käyttämällä anionin- • · • · · * vaihtohartsia, joka pystyy sitomaan entsyymin, että alfa-amidointientsyymi eluoidaan •, ·* #: 30 anioninvaihtohartsista suolaliuoksella, jonka konsentraatio on yli 250 mM, että eluoitu I I t :: entsyymi on riittävän puhdas, niin että koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään • ’ * ‘: n. 25 mU/mg proteiinia.

I I I

110433 65

Mainittu vähintään yksi alfa-amidointientsyymi kerätään mieluummin valitsemalla solulin-ja, joka pystyy ilmaisemaan vähintään yhden alfa-amidointientsyymin, keräämällä solulin-jan kasvuun käytettyä soluviljelyväliainetta.

5 12. Menetelmä alfa-amidoidun peptidyylituotteen valmistamiseksi, jossa menetelmässä saadaan aikaan jokin edellä kuvattu entsymaattinen koostumus ja peptidyyliyhdiste, jossa on ainakin peptidiketjun C-päätteessä glysiinitähde, saatetaan reagoimaan koostumuksen entsymaattisesti tehokkaan määrän läsnäollessa riittäväksi aikaa peptidyyliyhdisteen muuntamiseksi vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä C-terminaalisen glysiinin 10 paikalla. Entsyymi johdetaan mieluiten eläimen kudosuutteesta, jona käytetään medullaa-rista kilpirauhaskarsinoomakudosta, medullaarisia kilpirauhaskarsinoomasolulinjoja, näistä solulinjoista peräisin olevaa kudosviljelyväliainetta tai näiden yhdistelmää. Reaktio tapahtuu edullisesti kupari-ionien läsnäollessa, tai hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa.

15 Pelkistysaineena voidaan käyttää askorbiinihappoa, askorbiinihapposuoloja, dihydroksifu-j maraattia, metallisia syanidiyhdisteitä ja tetrahydropteriiniä, edullisesti askorbaattia.

Reaktio tapahtuu edullisesti vähintään yhden yhdisteen läsnäollessa, jona on katalaasi, etanoli, kaliumjodidi tai niiden seos, vielä edullisemmin askorbaatin, katalaasin ja kupa-20 ri-ionien läsnäollessa.

• · • · · * · ’ · · · Peptidyyliyhdiste voi olla esimerkiksi peptidi, joka sisältää kalsitoniinisekvenssin, joka • « i * · * · sisältää karboksyyli-terminaalisen glysiinitähteen.

• f * * * • · · • t · ♦ i * * : 25 13. Menetelmä kalsitoniinin valmistamiseksi, j ossa menetelmässä saadaan aikaan sub- • i * : t > » straatti, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka vastaa vähintään yhden kalsito- niinityypin aminohapposekvenssiä, että substraattisekvenssissä on glysiinitähde sen kar- • · *. ’ · i boksyylipäätteessä, ja sitten substraatti saatetaan reagoimaan alfa-amidointientsyymikoos- ’... · tumuksen läsnäollessa, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka pystyy : *: ’: 30 katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysiinitähteen : : sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on amino- l1. *. ryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, että alfa-amidointientsyymi on riittävän » · .‘• j puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen spesifinen ak- • · tiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia, edullisesti vähintään n. 50 mU/mg proteii- 66 110433 nia ja se on riittävän vapaa proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, joita ovat peptidyyliyhdiste, vastaava peptidyyliamidi ja alfa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi katalysoida muuntoa, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja. Vielä edullisemmin entsymaattisen koostumuksen aktiivi-5 suus on vähintään n. 150 mU/mg proteiinia.

Substraatti voidaan saada aikaan yhdistelmätekniikalla, jossa eristetään tai valmistetaan DNA-sekvenssi, joka pystyy ilmaisemaan kalsitoniiniaminohapposekvenssin, liitetään DNA-sekvenssi plasmidiin ja indusoidaan plasmidin transformaatio isäntäsoluun, 10 joka pystyy ilmaisemaan tämän DNA-sekvenssin.

Ennen substraatin saattamista reagoimaan entsymaattisen koostumuksen läsnäollessa substraatti voidaan muuntaa siten, että sen rakenteella C-terminaalisen glysiinin N-terminaalisella sivulla on molekyylirakenne, joka on identtinen vähintään yhden luon-15 nossa esiintyvän kalsitoniinisekvenssin vastaavan osan kanssa.

Kalsitoniini on edullisesti ihmisperäistä tai lohen kalsitoniinia tai niiden analogeja. 1 » «

Menetelmä kasvuhormonia vapauttavan tekijän valmistamiseksi, jossa menetelmässä 20 saadaan aikaan substraatti, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka vastaa vähintään yhden kasvuhormonia vapauttavan tekijän aminohapposekvenssiä, jolloin substraattisekvens- t f j | sissä on ainakin sen karboksyylipäätteessä glysiinitähde, ja sitten substraatti saatetaan rea- • « goimaan alfa-amidointientsyymikoostumuksen läsnäollessa, joka sisältää vähintään yhtä

• · I

• *,: alfa-amidointientsyymiä, j oka pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa • 9 :. · : 25 ainakin C-päätteessään glysiinitähteen sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi • · » ! ’. · peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, että ’. * · entsymaattinen koostumus on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että ent symaattisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia, ' · ': edullisesti vähintään n. 50 mU/mg proteiinia ja se on riittävän vapaa proteolyyttisestä ak- • * •; · ’ 30 tiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, joita ovat pepti- v.: dyyliyhdiste, vastaava peptidyyliamidi ja alfa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi ·’...· katalysoida muuntoa, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja. Vielä edullisemmin ’ · *: entsymaattisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 150 mU/mg proteii- nia.

110433 67

Substraatti voidaan saada aikaan yhdistelmätekniikalla, jossa eristetään tai valmistetaan DNA-sekvenssi, joka pystyy ilmaisemaan kasvuhormonia vapauttavan tekijän aminohapposekvenssin, liitetään DNA-sekvenssi sopivaan plasmidiin ja indusoidaan plasmidin 5 transformaatio sopivaan isäntäsoluun, joka pystyy ilmaisemaan tämän DNA-sekvenssin.

Ennen substraatin saattamista reagoimaan entsymaattisen koostumuksen läsnäollessa substraatti voidaan muuntaa siten, että sen rakenteella C-terminaalisen glysiinin N-terminaalisella sivulla on molekyylirakenne, joka on identtinen vähintän yhden kasvu-10 hormonia vapauttavan tekijän vastaavan osan kanssa.

15. Menetelmä kalsitoniini-geenin sukuisen peptidin valmistamiseksi, jossa menetelmässä saadaan aikaan substraatti, joka sisältää aminonapposekvenssin, joka vastaa vähintään yhden kalsitoniini-geenin sukuisen peptidityypin aminohapposekvenssiä, jolloin substraat-15 tisekvenssissä on sen karboksyylipäätteessä glysiinitähde, ja sitten substraatti saatetaan reagoimaan alfa-amidointientsyymikoostumuksen läsnäollessa, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin C-päätteessään glysiinitähteen sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin paikalla, että 20 entsymaattinen koostumus on riittävän puhdas alfa-amidointientsyymeissä, niin että entsymaattisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 mU/mg proteiinia, : : edullisesti vähintään n. 50 mU/mg proteiinia ja se on riittävän vapaa proteolyyttisestä ak- ·/“ tiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, joita ovat pepti- » 1 · • V dyyliyhdiste, vastaava peptidyyliamidi ja alfa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi • » :.: : 25 katalysoida muuntoa, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja. Vielä edullisemmin : V entsymaattisen koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 150 mU/mg proteii- * nia.

• 1 *; ’: Substraatti voidaan saada aikaan yhdistelmätekniikalla, jossa eristetään tai valmistetaan •; · 1 30 DNA-sekvenssi, joka pystyy ilmaisemaan kalsitoniini-geenin sukuisen peptidin aminohap-::: posekvenssin, liitetään DNA-sekvenssi sopivaan plasmidiin ja indusoidaan plasmidin :: transformaatio sopivaan isäntäsoluun, joka pystyy ilmaisemaan tämän DNA-sekvenssin.

» · · * · · · 110433 68

Ennen substraatin saattamista reagoimaan entsymaattisen koostumuksen läsnäollessa substraatti voidaan muuntaa siten, että sen rakenteella C-terminaalisen glysiinin N-terminaalisella sivulla on molekyylirakenne, joka on identtinen vähintään yhden kalsito-niini-geenin sukuisen peptidin vastaavan osan kanssa.

5 16. Menetelmä alfa-amidointientsyymikoostumusten valmistamiseksi, jossa menetelmässä saadaan aikaan DNA-sekvenssi, joka pystyy koodaamaan alfa-amidointientsyymin, liitetään DNA-sekvenssi ilmaisuvektoriin, indusoidaan ilmaisuvektorin transformaatio isän-täsoluun, joka pystyy ilmaisemaan DNA-sekvenssin ja valitaan edullisesti isäntäsolut, 10 joissa on tämä DNA-sekvenssi ja jotka ilmaisevat sen.

Menetelmässä vähintään osa mainitusta DNA-sekvenssistä on cDNA, joka on johdettu polyadenyloiduista RNArsta solun koko RNA:sta, jonka tiedetään ilmaisevan alfa-amidointientsyymin, ja jossa cDNA on eristetty selektiivisesti sen jälkeen, kun se on 15 tunnistettu oligonukleotidikoettimilla, jotka ovat spesifisesti komplementaarisia emässe-kvenssien suhteen, jotka pystyvät koodaamaan aminohapposekvenssit, joita on läsnä al-fa-amidointientsyymissä. DNA-sekvenssissä on vähintään yksi seuraavista fragmenteista (a) v v v v 50v

20 AATTCCGGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATG

V v v v lOOv

AATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTT

• * » · · · v v v v 150v

GCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATA

• ,·, v v v v 200v : 25 ctttctgcacgtccatgcgtctacct • · · (b) v v v v 50v aattccgtctcagtttctgtttctcttgcatcttctgcaattctgaggag • * * v v v v lOOv 30 gtgggtttgttctccactttgggttcgacaactgcctcggcttctttgat v v v v 150v . · · ·. ttcgtggacttcgatgccagcctttttaactgaccgatgctccatttttt • » v v v v 200v • ·* cggtcagggtgaacttccacacggtgttgtgtgtgcgctcgaagacgg • · | · ( • · · • · 110433 69 17. Immobilisoitu alfa-amidointientsyymikoostumus, joka sisältää vähintään yhtä alfa-amidointientsyymiä, joka pystyy katalysoimaan hapen ja pelkistysaineen läsnäollessa ainakin peptidiketjun C-päätteessä glysiinitähteen sisältävän peptidyyliyhdisteen muuntoa vastaavaksi peptidyyliamidiksi, jossa on aminoryhmä mainitun C-terminaalisen glysiinin pai- 5 kalla, jolloin entsyymi on sidottu kovalenttisella sidoksella suoraan tai epäsuorasti tukeen, joka on riittävän jäykkä joko yksinään tai yhdessä muiden materiaalien kanssa kestämään glysiinillä laajennetun peptidyylisubstraatin yhtäjaksoista virtausta yli 24 tunnin ajan menettämättä olennaisesti alfa-amidointiaktiivisuutta, että koostumus on riittävän puhdas al-fa-amidointientsyymeissä, niin että koostumuksen spesifinen aktiivisuus on vähintään n. 25 10 mU/mg proteiinia ja että koostumus on riittävän vapaa proteolyyttisestä aktiivisuudesta, joka pystyy hajottamaan vähintään yhden kokonaisuuden, joita ovat substraattiyhdiste, vastaava peptidyyliamidituote ja alfa-amidointientsyymit, niin että koostumus voi katalysoida alfa-amidointireaktiota, kun peptidyyliyhdiste sisältää L-aminohappoja.

15 Edullisesti entsyymi on kovalenttisesti sidottu geeliin, joka on muodostettu α,ω -di-amiinisilloitusaineella silloitetun akryyliamidin vesiliukoisesta kopolymeeristä.

18. Immunoaffmiteettipylväs alfa-amidointientsyymin epäpuhtaiden näytteiden puhdistamiseksi, jossa pylväässä on immunoaffmiteettihartsia, joka sisältää immobilisoidun matrii- 20 sin, joka ei liukene vesiliuokseen eikä hajoa alfa-amidointientsyymin, glysiinillä laajennettujen peptidyyliyhdisteiden tai vastaavien peptidyyliamidien vaikutuksessa, jolloin matrii-: ’; sissa on funktionaalisia ryhmiä, jotka pystyvät sitomaan proteiineja, ja jossa ryhmät on / j: sidottu kovalenttisesti monoklonaalista tai polyklonaalista alkuperää oleviin vas- . 1 t: ta-aineisiin, jotka sitovat selektiivisesti alfa-amidointientsyymin. Edullisesti hartsin funk- •, · 1 25 tionaalinen ryhmä on aktivoitu syaanibromidilla.

• · · • · • 1 1 • · • · • » · • · · » · * · » · · • · · · • » » > >

Claims (4)

70 110433

1. En isolerad DNA-sekvens, kännetecknad därav, att : A. DNA-sekvensen kodar för peptidyl-glycin-alfa-amiderande • · monooxygenas; och • V 25 :.· * B. DNA-sekvensen kan hybridiseras med ätminstone tvä av • följande oligonukleotidsonder: 3' 5 Oligo- TTA CTC ACG GAC CCG TGG TAA CCG GGA CAC CAC TGG GGG GAC CTA CG nukleotid- T G • · sond

30 AE1 Iti 3' 5' Oligo- TTA CCG GTC ACC TG :Y: nukleotid- G T T .*,! sond A*14 :v. 3' 5' : .· 35 Oligo- TTA CCG GTC ACC TG : nukleotid- G A T sond AE5 v2 110433 3' 5' Oligo- TAC GTC GGI CCI AG I CTG GTC TT nukleotid- T AT sond AE6 3' 5'

5 Oligo- TAC GTC GGI CCI TCA CTG GTC TT nukleotid- T GAT sond AE7 Oligo- 3' 5' nukleotid- AC CCG TGG TAA CCG GGA CAC TG sond IIIIII II AE8 10 3' 5' Oligo- AAA CAC TGC GTC ACC CCC CT nukleotid- G I I T I sond AE9 3' 5' Oligo- CTG GTC TTG GTG AA nukleotid- A A A sond AE10 3' 5' Oligo- CTG GTT TTG GTG AA nukleotid- AAA sond AE11

1. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä että

5 A. DNA-sekvenssi koodaa peptidyyli-glysiini-alfa-amidointimono-oksygenaasin; ja B. DNA-sekvenssi on hybridisoitavissa ainakin kahden seuraavassa esitettävän oligonukleotidikoettimen kanssa: 10 3' 5 Oligo- TTA CTC ACG GAC CCG TGG TAA CCG GGA CAC CAC TGG GGG GAC CTA CG nukleoti- T G dikoetin ΆΕ1 3' 5' Oligo- TTA CCG GTC ACC TG nukleoti- G T T dikoetin AE4 3' 5' Oligo- TTA CCG GTC ACC TG nukleoti- G A T dikoetin AE5 3' 5' Oligo- TAC GTC GGI CCI AGI CTG GTC TT nukleoti- T AT dikoetin AE6 3' 5' : Oligo- TAC GTC GGI CCI TCA CTG GTC TT nukleoti- T G A T ·.’.*· dikoetin ··,·, AE7 : Oligo- 3' 5» : nukleoti- AC CCG TGG TAA CCG GGA CAC TG dikoetin IIIIIIII • ·’ AE8 • · · * * * 3' 5' Oligo- AAA CAC TGC GTC ACC CCC CT nukleoti- G I I T I ;'· I dikoetin *· " AE9 .··' 3' 5' Oligo- CTG GTC TTG GTG AA nukleoti- A AA ,···, dikoetin AE10 !’·*: 3' 5' \ Oligo- CTG GTT TTG GTG AA : nukleoti- A AA dikoetin AE11 110433

2. Prokaryoottinen tai eukaryoottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu tai transfektoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin. 5

3. Menetelmä peptidyyli-glysiini-alfa-amidointimono-oksygenaasi (PAM) rekombinanttiekspressioon, tunnettu siitä että viljellään patenttivaatimuksen 2 mukaisia isäntäsoluja riittävän kauan PAM:n ekspression aikaansaamiseksi ja sen 10 jälkeen otetaan talteen PAM.

4. Menetelmä amidoidun peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä että saatetaan C-terminaalisen glysiinin omaava peptidi kosketukseen hapen sekä pelkistimen kanssa 15 patenttivaatimuksen 3 mukaisella rekombinanttimenetelmällä valmistetun peptidyyli-glysiini-alfa-amidointimono-oksygenaasin läsnäollessa. 20

2. En prokariotisk eller eukariotisk värdcell, kännetecknad därav, att den är transformerad eller transfekterad med en expressionsvektor, som innehäller DNA-sekvensen enligt :*: patentkravet 1. • · · · t · * 25

3. Förfarande för rekombinantexpression av peptidyl-glycin- j alfa-amiderande monooxygenas (PAM) , kännetecknat därav, att I t t · jV. man odlar värdceller enligt patentkravet 2 tillräckligt < · länge för att ästadkomma expression av PAM och därefter ätervinner PAM. 30

» * * • · ,···, 4. Förfarande för framställning av en amiderad peptid, * · · .·, kännetecknat därav, att man bringar en peptid, som • · » i * · innehäller C-terminal glycin, i kontakt med syre samt ett reduktionsmedel i närvaro av en peptidyl-glycin-alfa-i ",· 35 amiderande monooxygenas, som framställts enligt *,*·: rekombinantförfarandet enligt patentkravet 3.