DE3856446T2

DE3856446T2 - Alpha-amidierende Enzymzusammensetzungen und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE3856446T2
Application number: DE3856446T
Authority: DE
Inventors: Arthur H.# Bertelsen; James P.# Gilligan; Barry N.# Jones; Nozer M.# Mehta
Original assignee: Unigene Laboratories Inc
Current assignee: Unigene Laboratories Inc
Priority date: 1987-08-14
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 2001-07-12
Anticipated expiration: 2008-08-13
Also published as: HU00552A9; DE3856446D1; AU2057688A; ATE198355T1; NO883592L; LT4029B; NO883592D0; FI883722A; AU629795B2; EP0529742B1; DK448988A; JPH02104281A; KR890003947A; DK448988D0; HU213227B; LTIP1656A; EP0529742A1; DK175538B1; RU2080385C1; HU212071A9

Description

Diese Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, welche für alpha-amidierende Enzyme codieren, die alpha-amidierenden Enzyme selbst, die Herstellung von alpha-amidierenden Enzymen und ihre Verwendung bei der Herstellung von alphaamidierten Produkten durch Wirkung der Enzyme auf Glycinverlängerte Substrate. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können die alpha-amidierenden Enzyme der Erfindung bei der Herstellung von nützlichen alphaamidierten Hormonen und Produkten für den landwirtschaftlichen oder medizinischen Gebrauch, einschließlich Calcitonine, Wachstumshormon freisetzende Faktoren, Calcitonin-Gen verwandte Peptide und andere alpha-amidierte Produkte, verwendet werden.
Die intrazelluläre Bearbeitung (Spaltung und/oder Modifikation funktioneller Gruppen) von Vorstufenformen natürlicher Proteine auf ihre Translation von für Nukleinsäuren codierenden Sequenzen folgend wurde klar dokumentiert.
Im allgemeinen können Säugerzellen und andere Eurkaryoten gewisse post-translationale Bearbeitungsverfahren durchführen, während Prokaryoten dies nicht können. Bestimmte Prokaryoten, wie E. coli, werden oft als Wirte für die Herstellung von Säugerproteinen über rekombinante DNA (rDNA)- Technologie angewendet, da sie schnell in Batch-Fermentationsverfahren gezüchtet werden können und da sie genetisch gut charakterisiert sind. Jedoch benötigen viele Säuger-Proteine, welche durch Gentechnologie hergestellt wurden, eine Art von post-translationaler Bearbeitung, und dies muss oft durch die Verwendung komplexer, chemischer in vitro-Verfahren durchgeführt werden, welche für Produktionsanwendungen im großen Maßstab unerschwinglich sind.
Ein Typ einer Bearbeitungesaktivität schließt die speziffische Amidierung der Carboxyl-terminalen Aminosäure eines Proteins ein. Viele natürlich vorkommende Hormone und Peptide enthalten solch eine Modifikation, welche oft wesentlich ist, wenn das Protein biologisch aktiv sein soll. Ein Beispiel ist Calcitonin, wo die Substitution des amidierten Prolins der natürlichen Form durch einen nichtamidierten Prolin-Rest zu einer 3000-fachen Reduktion der biologischen Aktivität führt.
Ein Mittel, welches diese C-terminale (alpha) Amidierung bewirkt, erkennt einen Glycin-Rest, welcher der zu amidierenden Aminosäure unmittelbar folgt (R-X-gly, wobei R der Hauptkörper des Proteins, X der Rest, welcher amidiert wird, und "gly" der Glycin-Rest ist). Das Glycin wird gespalten und gibt den Aminoanteil an die vorletzte Aminosäure und amidiert sie dadurch.
Die ersten Autoren, welche ein ungefähres Molekulargewicht für ein alpha-amidierendes Enzym berichteten, waren Bradbury A. F., u. a.. Nature, Band 298, 1982, S. 686-88. Unter der Verwendung von Sephadex G-100 schlugen sie eine minimale scheinbare Molekularmasse von ungefähr 60 000 Dalton vor.
Nachfolgende Studien haben vorgeschlagen, daß die Molekularmasse solch eines Enzyms zwischen 60 000 und 70000 Dalton liegen soll (wie durch Gelfiltrationschromatographie gemessen). Diese schließen Husain, I. und Tate S. S., FEBS Letters, Band 152 #2, 1983, S. 277-281; Eipper, u. a.. PNAS, Band 80, 1983, S. 5144- 5148; Gomez u. a.. FEBS Letters, Band 167, #1, 1984, S. 160- 164 und Kizer, J. S. u. a., PNAS, Band 81, 1984, S. 3228- 3232 ein.
Eipper u. a.,, PNAS, Band 80, 1983, S. 5144-48 haben berichtet, daß zusätzlich zu molekularem Sauerstoff zwei Co-Faktoren erforderlich sind für maximale Enzym- Amidierungsaktivität; diese sind Ascorbinsäure und Kupfer(II)ionen.
Die chemische Reaktion, welche zur Amidierung des Carboxylendes eines Peptides führt, benötigt eine Quelle für die Aminogruppe. Bradbury, A. F. u. a.. Nature, Band 298, 1982, S. 686-688 zeigte, daß Glycin gespalten wird und den Aminoanteil an die vorletzte Aminosäure abgibt, was zu der Amidierung der letzteren führt. Der Bedarf an Glycin als Amionogruppen-Donator wurde durch andere Autoren untermauert.
Landymore, A.E.N. u. a.. BBRC, Band 117, #1, 1983, S. 289- 293 zeigte, daß D-Alanin auch als Amino-Donator bei der Amidierungsreaktion dienen könnte. Die nachfolgende Arbeit von Kizer u. a., PNAS, Band 81, 1984, S. 3228-3232 zeigte zwei verschiedene Enzymaktivitäten im Rattengehirn, welche in der Lage waren, die alpha-Amidierungsreaktion zu katalysieren. Die Spezies mit höherer Molekularmasse (70000 Dalton) hat eine Spezifität, welche auf Glycin am Carboxylende des Substrates beschränkt ist. Das Enzyme mit niedrigerer Molekularmasse akzeptiert ein Substrat mit β- Alanin als die Carboxyl- terminale Aminosäure.
WO 86/02099 offenbart eine von Ratten gewonnene Peptidylglycin alpha-amidierende Monooxygenase mit einer Molekularmasse von ungefähr 60 000 bis 65 000 Dalton.
Das pH-Optimum für das alpha-amidierende Enzym, welches aus der Schweine-Hirnanhangdrüse extrahiert und teilweise gereinigt wurde, wurde von Bradbury, A. F. und Smythe, D. G., BBRC, Band 112, #2, 1983, S. 372-377 als ungefähr 7,0 angegeben. Eipper, B. A. u. a.. PNAS, Band 80, 1983, S. 5144- 5148, bestätigten diese Ergebnisse durch Angabe eines pH- Optimums von 7 für ein alpha-amidierendes Enzym, welches teilweise aus Ratten-Hirnanhangdrüsen gereinigt wurde. Sie stellten auch fest, daß die Enzymaktivität bei pH-Niveaus unter 6,5 oder über 7,5 rasch abnahm.
In allen zuvorgenannten Publikationen (welche hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden) enthalten die beschriebenen Extrakte und teilweise gereinigten Enzymmischungen zusätzliche proteolytische Enzyme, welche in der Lage sind, potentielle Substrate und Produkte sowie alpha-amidierende Enzyme selbst abzubauen, und verzögern so die Amidierung von Peptiden und Polypetiden, welche aus natürlichen Quellen gereinigt oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugt wurden, durch solche Enzyme.
Allgemein gesagt basierten alle Amidierungsaktiviäten, welche früher von anderen gemessen wurden, auf der Umwandlung von D-Substraten wie einem Tripeptid, D-Tyr-Val- Gly-COOH zu D-Tyr-Val-CONH&sub2;. Von den zwei möglichen Konfigurationen ("D" oder "L"), welche natürlich vorkommen, treten biologisch wichtige Aminosäuren in der "L"-Form auf. Jedoch wurde die Verwendung der "D"-Form durch diese anderen Forscher erforderlich, um dem Vorhandensein von fremden proteolytischen Enzymen in den unreinen Amidierungsenzym-Präparationen, welche von diesen Forschern verwendet wurden, entgegenzuwirken. Diese fremden Enzyme können eine ausgesprochen proteolytische Wirkung auf ein L-Aminosäurensubstrat haben, während sie nur eine geringe Wirkung auf ein D-Substrat haben. Die Forscher, welche proteolytische und andere Verunreinigungen in ihren Enzymen hatten, verwendeten unnatürliche "D"-Substrate, um einige der Wirkungen der Verunreinigungen zu vermeiden. Niemand war bisher in der Lage zu zeigen, daß seine Enzym- Präparationen irgendwelche physiologisch relevanten Substrate, d. h. L-Substrate für die Konversion zu biologisch aktiven alpha-amidierten L-Produkten, wirkungsvoll amdidieren können.
Wie hier gezeigt, sind die Präparationen dieser Erfindung in der Lage, L-Substrate wirkungsvoll zu amidieren und bei D-Substraten eine 60- bis 1000-mal höhere Aktivität zu haben als die höchste Aktivität, welche in irgendeinem der Anmelderin bekannten Stand der Technik angegeben ist.
Enzymatische Präparationen, welche in der Lage sind die Carboxylenden von Peptiden und Proteinen zu amidieren, wurden in einer Vielzahl von Quellen beschrieben. Z. B. Bradbury, A. F. u. a., Nature, Band 298, 1982, S. 686-688 (die gesamte Offenbarung wird hier durch Bezugnahme eingeschlossen) berichtet, daß eine alpha-amidierende Enzymaktivität in Schweine-Hirnanhangdrüsen vorhanden ist. Die Präparation einer Schweine-Hirnanhangdrüse, welche das Enzym enthält, hat die Fähigkeit, Peptide, welche mit einem Glycin enden, in das entsprechende Desglycin- Peptidamid umzuwandeln. Bradbury u. a. bestätigen jedoch, daß die Präparationen keine Peptide oder Polypeptide, welche aus natürlichen Quellen gereinigt wurden, amidieren:
"Ein Testsystem zur Feststellung und Einschätzung der Amidierungsaktiviät in Hirnanhangdrüsen wurde erhalten durch Untersuchung der Fähigkeit von Enzympräparationen, um das synthetische Tripeptid D- Tyrosylvalylglycin in das entsprechende Dipeptidamid D- Tyrosylvalinamid umzuwandeln... Der D-Tyrosin-Rest verlieh Stabilität gegen den Abbau von Aminopeptidasen, welche in Gewebehomogenaten vorhanden sind ... Kntrollexperimente zeigten, daß wenn synthetisches ... D-Tyrosylvalinamid unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurde, es langsam abgebaut wurde. Daher folgt der Bildung des Dipeptidamids durch das Hirnanhangdrüsen-Enzym seine Zerstörung durch andere Enzyme, welche in dem Hirnanhangdrüsen-Extrakt vorhanden sind." (Seite 686)
Daher bestätigen Bradbury u. a., daß die beschriebenen Präparationen andere proteolytische Enzyme enthalten, welche die Peptide oder Polypeptide abbauen, und daß der nicht-natürlich auftretende D-Tyrosinrest dazu verwendet wurde, solch einen Abbau zu minimieren.
Ferner lehrt Bradbury u. a. die Verwendung von Homogenisierung oder subzellulärer Fraktionierung, welche von einer Gelfiltrations-Chromatographie gefolgt wird, um ein amidierendes Enzym zu reinigen, welches zugegebenermaßen mit proteolytischen Enzymen verunreinigt bleibt. WO86/02099 beschreibt die Reinigung eines amidierenden Enzyms aus medullären Thyroidkarzinom- Zellinien und -Gewebeproben auf eine Reinheit von 50 mU/mg Protein.
Husain, I. und Tate, S. S., FEBS Letters, Band 152, #2, 1983, S. 277-281 beschreiben eine alpha-amidierende Aktivität, welche in neurosekretorischem Granulat von Schweinehirnanhangdrüsen vorhanden ist.
Eipper u. a.. PNAS, Band 80, 1983, S. 5144-5148 berichtete, daß in den Vorder-, Zwischen- und Hinterlappen der Rattenhirnanhangdrüse und der Rinder-Zwischen- Hirnanhangdrüse eine alpha-amidierende Enzymaktivität vorhanden ist. Diese Druckschrift lehrt jedoch nur die Verwendung synthetischer D-Tyr-Val-Gly-Substrate, um eine alpha-Amidierungsaktivität zu suchen, eine Anerkennung der Verunreinigung der erzeugten Präparationen.
Gomez u. a., FEBS Letters, Band 167, #1, 1984, S. 160-164 stellte fest, daß der Ratten-Hypothalamus auch eine alphaamidierende Enzymaktivität enthält.
Bradbury, A. F., Smythe, D. G., in Peptides Structure and Function: Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, S. 249-52 (1983), Herausgeber Hruby, V. J. und Rich, D. H. beschreiben das Vorhandensein einer alphaamidierenden Enzymaktivität in Rattenschilddrüsen.
Mains R. E. u. a., Endocrinology, Band 114, 1984, S. 1522- 1530, berichtete, daß eine Maus-Zellinie, welche aus dem vorderen Hirnanhangdrüsenlappen (ATT-20) gewonnen wurde, eine alpha-amidierende Enzymaktivität enthielt, welche offensichtlich mit der sich in Kultur befindlichen Zeit abnahm.
Drüsen oder Organe, von welchen bekannt ist, daß sie amidierte Peptide enthalten, können ein Enzym enthalten, welches in der Lage ist, die Amdierungsreaktion zu katalysieren. Zum Beispiel wurde von niedrigeren Lebensformen wie dem Dornhai (Squalus acanthias) von O'Donohue, T. L. u. a., Peptides 3, 1982, S. 353-395 berichtet, daß sie amidierte Peptide in Hirnanhangdrüsenextrakten enthalten. Scheller, R. H. u. a., Cell, Band 32, 1983, S. 7-22 berichtete das Vorhandensein von Amidierungssignalpeptiden in der Meeresschnecke Aplysia. Trotz der offensichtlich allgegenwärtigen Verteilung dieser Aktivität in der Natur, wurde wenig Information über die physicochemischen Eigenschaften der Enzyme veröffentlicht. Dies kann den sehr niedrigen Enzymniveaus zugeschrieben werden, welche in diesen neuroendokrinen Organen vorhanden sind.
Das Vorhandensein von amidierten Peptiden in einem besonderen Gewebe ist nicht notwendigerweise gleichbedeutend mit hohen Niveaus alpha-amidierender Enzyme. Zum Beispiel enthält vorderes Hirnanhangdrüsengewebe von Ratten hohe alpha-amidierende Aktivität, aber keine bekannten Substrate [Eipper ua., PNAS 80, 5144-5148 (1983)]. Hinteres Hirnanhangdrüsengewebe von Ratten enthält amidierte Peptide (Oxytocin und Vasopressin), hat aber sehr wenig alpha-amidierende Aktivität [Eipper u. a., Endo 116, 2497-2504 (1985)]. Deshalb kann, bis individuelle Gewebe auf alpha-amidierende Aktivität getestet werden, das Vorhandensein oder potentielle Niveaus des Enzyms nicht erwartet werden.

Ziele und Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel dieser Erfindung, alpha-amidierende enzymatische Zusammensetzungen zu liefern, welche in wirkungsvoller Weise nützliche alpha-amidierende Produkte erzeugen, selbst aus Substraten, welche L-Aminosäuren enthalten, wie Peptide oder Polypeptidsubstrate, welche aus natürlichen Quellen gewonnen wurden oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt wurden.
Es ist ein weiteres Ziel, wirkungsvolle und kostengünstige Verfahren zu Herstellung der enzymatischen Zusammensetzung zu liefern.
Es ist ein weiteres Ziel, monoklonale Antikörper zu liefern, welche für alpha-amidierende Enzyme spezifisch sind, und immobilisierte Antikörper, Reinigungsharze, Immunoaffinitätssäulen und ähnliches, welche unter Verwendung dieser Antikörper alpha-amidierende Enzyme wirkungsvoll reinigen.
Es ist ein weiteres Ziel, gentechnisch Wirtszellen zu schaffen, welche zur Expression alpha-amidierender Enzyme mit hoher Ausbeute fähig sind.
Es ist ferner ein Ziel dieser Erfindung, alpha-amidierende Produkte aus Substraten herzustellen, welche einen C- terminalen Glycinrest enthalten, durch Reaktion des Substrates in Gegenwart der Enzymzusammensetzung.
Diese und andere Ziele werden beim gründlichen Lesen der vorliegenden Offenbarung offensichtlich. Gemäß der Erfindung schafft die Anmelderin neue rekombinante alphaamidierende Enzymzusammensetzungen mit ausreichender Reinheit, um eine spezifische alpha-amidierende Aktivität von mindestens ungefähr 25mU pro mg Protein, welches in der enzymatischen Zusammensetzung vorhanden ist, zu zeigen, und vorzugsweise über 50 oder über 150 mU/mg Protein. Alle spezifischen Aktivitätseinheiten, welche hier dargelegt sind, basieren auf der Konversion von Dansyl-D-Tyr-Val-Gly- COOH zu Dansyl-D-Tyr-Val-CONH&sub2;. Ein mU wird definiert als die Menge an Aktivität, welche benötigt wird, um ein Nanomol (nmol) Dansyl-D-Tyr-Val-Gly-COOH in ein nmol Dansyl-D-Tyr-Val-CONH&sub2; pro Minute bei 37ºC und pH 7,0 umzuwandeln in der Gegenwart von Ascorbationen bei einer Konzentration von 3 mM (basierend auf der Gesamtreaktionsmischung einschließlich Enzym, Substrat, Co- Faktoren, etc.), molekularem Sauerstoff in einem molaren Überschuß über das Substrat und einer Konzentration von Kupferionen, welche so wirkungsvoll ist, daß sie die Aktivität maximiert (normalerweise ungefähr 2 uM, abhängig vom Zustand der Reinheit des Enzyms).
Alpha-amidierende Enzyme, wie Peptidylglycin alphaamidierende Monooxygenase, sind in der Lage, die Konversion einer Peptidylverbindung, welche einen Glycinrest mindestens am C-Ende einer Peptidekette hat, zu katalysieren zu einer entsprechenden Peptidylamid- Verbindung, welche eine Aminogruppe anstelle des C- terminalen Glycins hat. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Peptidkette" jedes Polypeptid, welches mindestens zwei Aminosäuren aufweist, welche durch eine Peptidbindung miteinander verbunden sind. Der Begriff "Peptidylverbindung" enthält jede Verbindung, welche eine Peptidkette enthält. Der Begriff "entsprechendes Peptidylamid" bezieht sich auf jedes Produkt einer Reaktion, welches eine Aminogruppe an die Stelle eines Glycins am C-terminalen Glycin einer Peptidkette setzt.
Es wird bevorzugt, daß die alpha-Amidierungsreaktion in der Gegenwart von Sauerstoff und einem Reduktionsmittel stattfindet. Nützliche Reduktionsmittel enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Ascorbinsäure, Ascorbinsäuresalze, Dihydroxyfumarat, metallische Cyanidverbindungen und tetrahydropterin. Es wurden gewisse Co-Faktoren gefunden, um den Fortschritt der Reaktion zu unterstützen und/oder um den Abbau oder die Inaktivierung des Enzyms zu verzögern. Diese Co-Faktoren enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Katalase, Ethanol, Kaliumjodid und Kupferionen. Die gereinigten enzymatischen Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise ausreichend frei von proteolytischer Aktivität, welche in der Lage ist, entweder das alpha-amidierende Enzym oder die Produkte oder Reaktanten der alpha-Amidierungsreaktion abzubauen, so daß die enzymatischen Zusammensetzungen die alpha-Amidierungsreaktion katalysieren können, selbst wenn das Substrat und Produkt aus L-Aminosäuren besteht. Proteolytische Aktivität in der Amidierungsreaktionsmischung kann nicht direkt die Konzentration der Protease wiederspiegeln. Aktivität, selbst bei hohen Protease-Konzentrationen, kann unterdrückt werden, z. B. durch Wirkung von verschiedenen Inhibitoren. Der Mangel an proteolytischer Aktivität, welcher die wirtschaftliche und praktische Erwünschtheit der enzymatischen Zusammensetzung für den Gebrauch bei Substraten aus L-Aminosäuren erhöht, verringert in keiner Weise die Attraktivität der Zusammensetzung für den Gebrauch bei Substraten, welche keine L-Aminosäuren enthalten.
Wie in der detaillierten Beschreibung weiter angegeben ist, hat die Anmelderin zahlreiche spezifische Proteinspezies gereinigt, welche eine wesentliche alpha-amidierende Aktivität besitzen. "Alpha-amdidierende Aktivität" wie hier verwendet, bedeutet jede Aktivität, welche dazu neigt, nur eine Aminogruppe an einer Position zu lassen, welche vorher durch ein C-terminales Glycin einer Substrat- Peptidylverbindung besetzt war. Solch eine Substitution kann die Spaltung von allen außer der Aminogruppe von Glycin einschließen, so daß nur eine Aminogruppe in der Position bleibt, welche vorher durch den gesamten Glycinanteil besetzt war. "Alpha-amidierendes Enzym", wie hier verwendet, betrifft jede Zusammensetzung oder Verbindung, welche eine alpha-amidierende Aktivität zeigt und aktive Homologe und Fragmente davon.
Enzymatische Zusammensetzungen, welche unter Verwendung von Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können gereinigt werden, bis sie homogen sind. "Homogen" wie hier verwendet, bezieht sich auf Enzympräparationen, welche ein einziges, genau definiertes Band auf die Elektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gel zeigen und Sequenzdaten einer einzigen Aminosäure als Anwort auf allgemeine Sequenzierungsverfahren zeigen.
Bestimmte alpha-amidierende Enzyme, welche hergestellt wurden unter Verwendung von Verfahren der Erfindung und bis zur Homogenität gereinigt wurden, haben spezifische Enzymaktivitäten über ungefähr 1500 mU/mg Protein gezeigt.
Enzymatische Zusammensetzungen, welche hergestellt wurden, unter Verwendung von Enzymen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können bei der Herstellung von nützlichen alpha-amdidierten Peptidyl-Produkten verwendet werden, indem die enzymatischen Zusammensetzungen dazu verwendet werden, die alpha-Amidierung von solchen Produkten zu katalysieren. Ein Substrat wird geschaffen, welches eine Peptidylverbindung ist, welche einen Glycinrest mindestens am C-Ende einer Peptidkette hat, wobei die Substitution des C-terminalen Glycins durch eine Aminogruppe zu dem gewünschten Produkt führt. Das Substrat läßt man reagieren, vorzugsweise in der Gegenwart von Sauerstoff und einem Reduktionsmittel, in der Gegenwart einer enzymatischen Zusammensetzung, welche hergestellt wurde unter Verwendung von Enzymen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden über einen Zeitraum, welcher ausreichend ist, um die Peptidylverbindung in ein entsprechendes Pepidylamid umzuwandeln. Die Konversion beginnt im wesentlichen beim ersten Kontakt des Substrates und Enzyms, aber die Reaktionsgeschwindigkeit variiert beträchtlich mit dem pH, der Temperatur, der Identität des Substrates, der Konzentration von Co-Faktoren und anderen Parametern, welche in bekannter Weise eingestellt werden können, um die Reaktion zu optimieren. Die Reaktion läßt man gewöhnlicherweise für eine Zeit fortschreiben, welche im Hinblick auf den gewünschten Konversionsprozentsatz (des Substrats zum Produkt) gewählt wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden Co-Faktoren, wie die zuvor erörterten, verwendet, um den Fortschritt der Reaktion zu unterstützen und/oder verstärken oder die Aktivität des Enzyms zu unterstützen.
Zahlreiche nützliche Produkte einschließlich natürlicher Hormone und ähnliches, für welche die alpha-Amidierung bevorzugt oder erforderlich ist, können gemacht werden, indem man Glycin-verlängerte Peptidylverbindungen in Gegenwart von alpha-amidierenden Enzymzusammensetzungen reagieren läßt, welche unter Verwendung von Enzymen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, hergestellt wurden. Diese Produkte, welche zum Beispiel in der Landwirtschaft oder bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden können, welche durch hormonelle Mängel gekennzeichnet sind, enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt, verschiedene Calcitonine, Wachstumshormon freisetzende Faktoren, mit Calcitoningen verwandte Peptide und ähnliches. Hormone, auf welche hier Bezug genommen wird, wie die zuvorgenannten Calcitonine, Wachstumshormon freisetzende Faktoren und Calcitoningenverwandte Peptide, enthalten C-terminale Amidproteinspezies, welche die charakteristische Aktivität des genannten Hormons zeigen, wie von Fachleuten verstanden. Calcitonin enthält z. B. alle Spezies, welche die Regulierung der Calciumaufnahme in die Knochen zeigen, was für die bekannten Calcitonine charakteristisch ist. Homologe der verschiedenen Proteinarten, welche hier erörtert werden, sind durch die Definitionen der Spezies hier eingeschlossen, und alle Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen, welche hier angegeben sind, sollen homologe Sequenzen einschließen, wobei Substitutionen, Additionen oder Streichungen die Wirkung, welche durch die genannte Sequenz verliehen wird, nicht materiell beeinflussen. Vorzugsweise entsprechen mindestens über 40% und am bevorzugtestens 50% der Aminosäuren in einem Peptid solchen genannten. Mit Bezug auf die Nukleotidsequenzen können Codons natürlich durch äquivalente Codons, welche für die gleichen Aminosäuren kodieren, ersetzt werden.
Die Fähigkeit der Enzymzusammensetzungen, welche unter Verwendung von Enzymen, welche gemäß der Erfindung erzeugt wurden, hergestellt wurden, um die alpha- Amidierungsreaktion selbst von Substraten, welche L- Aminosäuren enthalten, zu katalysieren, ermöglicht die wirkungsvolle und kostengünstige Produktion von diesen Produkten, welche Substrate verwenden, welche aus natürlichen Quellen gereinigt wurden oder durch rekominante DNA-Techniken erzeugt wurden.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die alpha-Amidierungsreaktion erleichtert werden, indem das Enzym auf einem festen Träger immobilisiert wird, welcher in einem wässrigen Medium unlöslich ist und gegen Abbau unter Reaktionsbedingungen beständig ist, und das Substrat über das immobilisierte Enzym geleitet wird, vorzugsweise in der Gegenwart von geeigneten Co-Faktoren. Wie hier verwendet, betrifft "Immobilisieren" das Binden des Enzyms auf den Träger. Träger, welche für diesen Zweck nützlich sein können, enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Glas mit kontrollierten Poren oder ein aktiviertes Absorbens, wie Cyanbromidaktivierte Sepharose. Enzyme, welche auf diese Weise immobilisiert sind, können durch Entfernen der Reaktionsmischung vom festen Träger wieder verwendet werden, was das Enzym für zukünftigen Gebrauch weiter bewahrt.
Die Erfinder haben entdeckt, daß enzymatische Zusammensetzungen, welche ein alpha-amidierendes Enzym enthalten, durch eine Anzahl von Verfahren erhalten und gereinigt werden können. Es wurde herausgefunden, daß medulläres Thyroidkarzinomgewebe, vorzugsweise von einer Ratte stammend, Zellinien davon und/oder Zellkulturmedium von diesen Zellinien, besonders wünschenswerte Quellen von rohem alpha-amidierendem Enzym sind. Ungereinigtes alphaamidierendes Enzym kann gereinigt werden, indem die rohe Zusammensetzung einer Größenausschluß-Chromatographie und einer Anionenaustausch-Chromatographie unterworfen wird, vorzugsweise einer starken Anionenaustausch- Chromatographie. Wie hier verwendet, betrifft "starke" Anionenaustausch-Chromatographie eine Anionenaustausch- Chromatographie, welche auf jedem Harz durchgeführt wird, welches eine konstante positive Nettobeladung im Bereich von pH 2-12 aufrechterhält. Die Größenausschluß- Chromatographie geht der starken Anionenaustausch- Chromatographie voraus, und dem Größenausschluß- Chromatographieschritt kann sogar noch ein anderer Anionenaustauschh-Chromatographieschritt vorausgehen. Ein zweiter starker Anionenaustauschschritt nach dem ersten Schritt kann wünschenswert sein, und vorzugweise wird entweder die erste starke Anionenaüstausch-Chromatographie oder die zweite starke Anionenaustausch-Chromatographie bei einem basischen pH durchgeführt, während die andere bei einem sauren pH durchgeführt wird.
Unter Verwendung der Enzymspezien, welche im wesentlichen bis zur Homogenität gemäß obigen Ausführungen gereinigt wurden, wurden monoklonale und polyklonale Antikörper, welche für die Enzyme spezifisch sind, erzeugt, indem ein gereinigtes Enzym als ein Antigen verwendet wurde, um in Mäusen bzw. Hühnern Immunreaktionen hervorzurufen.
Antikörper, welche auf diese Weise von einer Spezies gewonnen wurden, können gereinigt und auf einem festen Träger zum Zwecke des Erzeugens einer Immunoaffinitätssäule, welche für das Enzym spezifisch ist, immobilisiert werden. Diese Säule kann für die Reinigung von rohem enzymatischem Material verwendet werden, was zu einem erhöhten Wirkungsgrad und Wiederverwendbarkeit von Enzymen führt.
Ein Enzym, welches wie oben beschrieben zusammen mit kryptischen Fragmenten davon gereinigt wurde, wurde durch bekannte Verfahren sequenziert und die Sequenzdaten wurden für die Herstellung von Oligonukleotid-Sonden verwendet. Unter Verwendung markierter Oligonukleotid-Sonden, welche auf diese Weise erzeugt wurden, hat die Anmelderin ein Gen isoliert, welches für ein alpha-amidierendes Enzym aus einer cDNA-Bibliothek codiert, welches aus PolyA RNA synthetisiert wurde, welche aus medullärem Ratten- Thyroidkarzinomgewebe gewonnen wurde. Das Gen, welches genauer in dem detaillierten Beschreibungsabschnitt dieser Anmeldung charakterisiert ist, kann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden und in jede Wirtszelle transformiert werden, welche in der Lage ist, das Gen zu exprimieren. Geeignete Wirte enthalten, aber sind nicht beschränkt auf, E. coli, Hefestämme wie S. cerevisiae oder höhere eurkaryotische Zellen, wie die Zellinie aus welcher das Enzym ursprünglich gereinigt wurde. Es kann angenommen werden, daß kommerzielle Massenproduktion durch einen Mikroorganismus vereinfacht werden kann, welcher wie oben dargelegt gentechnisch hergestellt wurde, um große Mengen an alpha-amidierendem Enzym herzustellen.
Von einem ersten Aspekt aus gesehen, liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines alpha-amidierenden Enzyms, umfassend die Schritte des Bereitstellens einer DNA-Sequenz, die für ein alphaamidierendes Enzym codieren kann, Ligieren der DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, Induzieren einer Transformation einer Wirtszelle, die die DNA-Sequenz mit dem Expressionsverktor exprimieren kann, und präferentielles Auswählen von Wirtszellen, die die DNA-Sequenz aufweisen und exprimieren, worin die DNA-Sequenz mit mindestens einer der Sequenzen von mindestens zwei Sonden hybridisiert:
AE1 = 3'-TTACTCACGG ACCCGTGGTA ACCGGGA/TCAC/G TGGGGGGACC TACG-5',
AE8 = 3'-AC/ICCG/ITGG/ITA A/ICCG/IGGA/ICAC/I TG-5',
AE4 = 3'-TTA/GCCG/TGTC/TA CCTG-5',
AE5 = 3'-TTA/GCCG/AGTC/TA CCTG-5',
AE6 = 3'-TACGTC/TGGIC CIAGICTG/AGT C/TTT-5',
AE7 = 3'-TACGTC/TGGIC CITCA/GCTG/AGT C/TTT-5',
AE10 = 3'-CTG/AGTCTTG/AG TG/AAA-5',
AE11 = 3'-CTG/AGTTTTG/AG TG/AAA-5',
AE9 = 3'-AAA/GCAC/ITGC/IG TC/TACCCCC/ICT-5',
welche zur Identifizierung der Sequenz verwendet werden kann, worin jede Sonde ein Gemisch von Sequenzen umfaßt, und exprimieren des Enzyms. Die Sonden werden vorzugsweise aus AE8, AE9, AE4 und AE5 ausgewählt. Wirtszellen, welche gemäß der Erfindung hergestellt werden und Mikroorganismen, welche diese enthalten, bilden weitere Merkmale der Erfindung. Insbesondere Wirtszellen, welche eine DNA- Sequenz enthalten, welche i) im wesentlichen identisch ist mit der eines Rattengens, welches für Peptidyl-Glycin α- amidierende Monooxygenase codiert, ii) für ein α-amidierendes Enzym codiert, welches ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 60 000 und 65 000 Dalton hat, gemessen durch Gelfiltrationschromatographie, und zwischen 73 000 und 75 000 Dalton, gemessen durch Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamidgel, iii) im wesentlichen identisch ist mit einem Säugergen, welches für Peptidylglycin α-amidierende Monooxygenase codiert, iv) im wesentlich identisch ist mit einem medullären Rattenthyroidkarzinomgen, das für eine Peptidylglycin α- amidierende Monooxygenase codiert, v) für ein alphaamidierendes Enzym mit einem sauren pH-Optimum codiert, vi) für eine Aminosäurensequenz codiert, welche mindestens ein Fragment enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(a) -Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro- Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe-Ala-Leu-Asp- Ile-Arg-Met-Pro-;
(b) -Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser- Gln-Pro-Thr-;
(c) -Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg-; und
(d) -Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-,
vii) mindestens ein Fragement enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a)
und (b)
oder viii) identisch ist mit medullärem Rattenthyroidkarzinomgen, das für eine Peptidylglycin α- amidierende Monooxygenase codiert, welche ein saures pH- Optimum und ein Molekulargewicht zwischen 60 000 und 65 000 Dalton, gemessen durch Gelfiltrationschromatographie, aufweist, sind bevorzugt. Rekombinante DNA-Moleküle, welche eine Nukleotidsequenz enthalten, wie hier definiert, bilden weitere Merkmale der Erfindung.
Ferner bilden Enzyme, welche durch Durchführung des Verfahrens der Erfindung, gebildet wurden, einen weiteren Aspekt der Erfindung. Verfahren zur Herstellung α- amidierter Produkte, welche solche Enzyme verwenden, enthalten noch einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Kommerzielle Massenproduktion der Enzyme aus natürlichen Quellen kann durch Reinigungsverfahren erleichtert werden, enthaltend Größenausschluß-Chromatographie und Anionenaustausch-Chromatographie, wobei enzymatische Spezien, welche durch die Anionenaustausch- Chromatographiesäule zurückgehalten wurden, unter Verwendung einer Salzlösung, mit einer Konzentration über ungefähr 250 mM und vorzugsweise von 350 mM oder 500 mM; eluiert werden. Bei hohen Salzkonzentrationen werden die meisten zurückgehaltenen Enzymarten eluiert. Die Größenausschluß-Chromatographie sollte so ausgelegt werden, daß sie Spezien mit einem scheinbaren Molekulargewicht zwischen ungefähr 58 000 und 67 000 Dalton isoliert, und vorzugsweise zwischen ungefähr 60 000 und 65 000 Dalton.
Die gereinigte Präparation ist in der Lage, eine Peptidylverbindung, welche aus natürlichen Quellen gereinigt wurde, oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt wurde, zu amidieren, d. h. Peptide aus L- Aminosäuren.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. I - Fig. V betreffen Beispiel 1 und sind dort erklärt.
Fig. VI - XII betreffen Beispiel 2 und sind dort erklärt.
Fig. XIII -XVI betreffen Beispiel 3 und sind dort erklärt.
Fig. XVTI - XXI betreffen Beispiel 4 und sind dort erklärt.
Fig. XXII betrifft Beispiel 10 und ist dort erklärt.
Fig. XXIII betrifft Beispiel 6 und ist dort erklärt.

Detaillierte Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen

Es wurde nun entdeckt, daß ein homogenes alpha-amidierendes Enzym durch ein Mehrstufenverfahren erhalten werden kann, welches eine Kombination von Größenausschluß- und Ionenaustausch-Chromatographie von festen Tumorgewebeextrakten, Tumor-Zellinien und dem Gewebekulturmedium von solchen Zellinien anwendet.
Das Enzym wurde aus medullären Rattenthyroidkarzinomen ("MTCs") extrahiert, welche in WAG/RiJ Wistar Ratten, wie von Roos, B. A., u. a., Endocrinology, 1979, Band 150, #1, S. 27-32 beschrieben, entwickelt wurden. Diese Gewebe wurde als IVI-10028 hinterlegt. Das Enzym wurde auch aus anderen Quellen extrahiert, bemerkenswerterweise aus medullären menschlichen und Rattenthyroidkarzinom-Zellinien. Die Ratten-Zellinie ("CA-77") wurde aus medullären Rattenthyroidkarzinomtumoren durch Reihenpassagen, gewonnen, wie von Muszynski, M. u. a., JBC 1983, Band 258, Seiten 11678-83 beschrieben. Diese Zellinie wurde als IVI- 10029 hinterlegt. Eine menschliche Zellinie ("HTT 54(34)") wurde von B. A. Roos im VA Medical Center in Cleveland, Ohio entwickelt unter Verwendung von medullären menschlichen Thyroidkarzinomzellen für die Primärkultur. Die menschliche Zellinie HTT 54(34) wurde als IVI-10031 hinterlegt (Siehe "Recognition of the Deposit of Micro-Organisms for the Purposes of Patent Procedure", welches diese Hinterlegungen beweist, und "Budapest Notification" Nr. 34, vom 3. November 1983, deren gesamte Offenbarungen hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden).
Von definierten Gewebekulturenmedien von menschlichen und Rattenzellinien wurde gezeigt, daß sie bedeutende Niveaus alpha-amidierender Enzymaktivität enthalten, was zeigt, daß ein Teil des Enzyms aus den Zellen abgeschieden wird. Das Enzym kann erhalten und gereinigt werden, indem vorzugsweise zuerst das Rohmaterial (einschließlich verbrauchtem Kulturmedium, Enzym und Verunreinigungen) einer Anionenaustausch-Chromatographie unterworfen werden. Die Probe kann z. B. in großer Menge auf einen Anionenaustauscher im präparativen Ausmaß, wie eine Diethylaminoethyl ("DEAE")-Patrone wie CUNO 250, erhältlich von CUNO Corp., geladen werden.
Die alpha-amidierende Aktivität enthaltende Zusammensetzung, welche aus der Patrone eluiert wurde, wird dann einer Größenausschluß-Chromatographie auf einem Harz mit geeigneten Auflösungskapazitäten unterworfen, z. B. einer sehr feinen Sephacryl S-200 Säule, welche von Pharmacia Fine Chemicals erhältlich ist.
Die Aktivität enthaltende Eluentfraktion wird dann einer Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen, unter Verwendung einer starken Anionenaustauschmatrix. Ein Harz, welches verwendet werden kann, ist Mono Q HR5/5 starkes Anionenaustauschharz von Pharmacia Fine Chemicals und ein oder mehrere Durchgänge auf der Säule können nötig sein zur homogenen Reinigung des Enzyms. Die Mono Q HR5/5-Säule hat eine Teilchengröße von 10 um, ein Hohlraumvolumen von 40% und ein Gel, dessen geladene Gruppe CH&sub2;-N&spplus;-(CH&sub3;)&sub3; und dessen ionische Kapazität 0,28 bis 0,36 mMol/ml ist.
Jeder Reinigungsschritt kann auf Proteingehalt und das Niveau an alpha-Amidierungsaktivität überwacht werden. Diese Information wird verwendet, um die spezifische Aktivität der Enzyme zu berechnen, welche als ein Indikator der relativen Reinheit des Enzyms dient.
Peptidylglycin alpha-amidierende Monooxygenase, welche gemäß den hier beschriebenen Verfahren gereinigt wurde (hinterlegtes, aus Ratten gewonnenes Enzym, IVI-10032; hinterlegtes von Menschen gewonnenes Enzym, IVI-10033), hat eine scheinbare Molekularmasse von ungefähr 60 000 bis 65000 Dalton, wie durch Gelfiltration bestimmt.
Das Enzym wurde gereinigt, so daß es eine spezifische enzymatische Aktivität von mindestens ungefähr 25 mU pro mg Protein und vorzugsweise von mindestens ungefähr 50 mU/mg Protein zeigt. Spezifische Aktivität über ungefähr 150 mU pro mg Protein wird besonders bevorzugt. Das alphaamidierende Enzym wurde auch so gereinigt, daß es ein einziges, homogenes, genau definiertes Band auf die Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gele (SDS-PAGE) zeigt.
Die gereinigte Peptidylglycin alpha-amidierende Monooxygenase wird verwendet, um die alpha-Carboxylgruppe eines Polypeptides mit einem terminalen Glycinrest zu amidieren, wobei das Glycin als ein Aminogruppen-Donator wirkt. Das Peptid- oder Polypeptid-Substrat kann aus natürlichen Quellen gereinigt werden, aus seinen Aminosäurenbestandteilen synthetisiert oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Das mit Glycin endende Polypeptid wird mit Sauerstoff in Gegenwart einer wirkungsvollen Menge des Enzyms kombiniert. Die benötigte Enzymmenge hängt von einigen Variablen ab, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, einschließlich insbesondere den folgenden, aber nicht auf sie beschränkt: die spezifische Aktivität einer gegebenen Enzympräparation, die Menge und chemische Natur des umzuwandelnden Substrats, die Zeit, innerhalb welcher die Umwandlung stattfinden soll, und die Temperatur und der pH der Reaktionsmischung. Fachleute erkennen andere Variablen, welche die genaue Enzymmenge in einer gegebenen Situation beeinflussen können. Der Sauerstoff ist gewöhnlicherweise in einem molaren Überschuß in der Reaktion relativ zur Substratkonzentration vorhanden. Eine gewünschte Konzentration von Kupferionen kann durch ein Kupfersalz bereitgestellt werden, dessen Anion die Reaktion nicht ungünstig beeinflußt. Bei einem Enzym, welches eine spezifische enzymatische Aktivität von nur ungefähr 1 mU/mg Protein hat, tritt eine maximale alpha-Amidierung bei einer relativ hohen Konzentration von ungefähr 4 pH Kupferionen auf. Wenn die Reinheit des Enzyms erhöht wird, verringern sich die Konzentrationserfordernisse für das exogene Kupferion. Die enzymatische Aktivität kann auch durch die Gegenwart von Ascorbationen verstärkt werden, welche durch jedes Ascorbinsäuresalz bereitgestellt werden können, solange das Kation des Salzes die Reaktion nicht ungünstig beeinflusst. Bei einem gereinigten Enzym mit einer spezifischen enzymatischen Aktivität von ungefähr 50mU/mg Protein, tritt eine maximale Aktivität der Alpha-Amidierung bei ungefähr 5 mM Ascorbat auf. Die Alpha- Amidierungsaktivität kann durch die Zugabe von Katalase erhöht werden. Der optimale pH für die Umwandlung von biologisch relevanten Substraten in amidierte Produkte liegt zwischen 6,5 und 7,5.
Monoklonale und polyklonale Antikörper, welche gegen das Enzym gerichtet wurden, wurden erhalten unter Verwendung eines homogenen Enzyms als ein Antigen, um eine Immunreaktion in Mäusen bzw. Hühnern zu erzeugen. Monoklonale und polyklonale Antikörper wurden durch den Anmelder hergestellt und gereinigt, wie in Beispiel 8 dargelegt. Verzeichnisse von Antikörpern, welche für das alpha-amidierend Enzym spezifisch sind, werden in den Laboratorien der Anmelderin bereitgehalten.
Antikörper können auf einer festen Matrix immobilisiert werden, welche nicht in dem Medium löslich ist, in welchem sie verwendet werden soll. Die Matrix ist vorzugsweise gegen Abbau beständig. Die Matrix ist mit einer funktionellen Gruppe versehen, welche in der Lage ist, Proteine zu binden, wobei die funktionellen Gruppen dann kovalent mit Antikörpern gebunden sind. Eine solche Immobilisierung von Antikörpern erleichtert die Isolation des α-amidierenden Enzyms aus natürlichen und/oder rekombinanten Quellen. Dies wird durch die Mischung der immobilisierten Antikörper mit rohen Präparationen des Enzyms erreicht. Die Antikörper binden die α-amidierenden Enzymmoleküle. Kontaminierende Proteine binden die Antikörper nicht und werden leicht durch Elution oder leichte Zentrifugation entfernt. Nach Entfernung der Verunreinigungen kann das α-amidierende Enzyme von den immobilisierten Antikörpern durch Änderung der Ionenstärke oder des pHs oder durch Zugabe von chaotropen Ionen ("Affinity Chromatography: Principles and Methods, Manual, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) entfernt werden und in einer hochgereinigten Form zurückgewonnen werden.
Das Enzym wurde auch ausreichend gereinigt, um es zu ermöglichen, seine Aminosäurensequenz zu bestimmen. Diese Information wurde benutzt, um Nukleinsäuren zu isolieren, welche für das Enzym codieren.
Die nachfolgende Inkorporation in einen geeigneten unizellulären Organismus oder Wirtszelle, welche von einem multizellulären Organismus isoliert wurde, wird durch rekombinante Standard-DNA-Verfahren durchgeführt, wie in Maniatis, u. a., Molecular Clonic: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, oder Wu, R. ed. Methods in Enzymology Band 68, Academic Press, 1979, welche hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden, gefunden wurde. Die resultierenden Zellen, welche die heterologe DNA, welche für das alphaamidierende Enzym codiert, enthalten, ermöglichen die Produktion von ausreichenden Mengen des Enzyms, um eine in vitro post-translationale alpha-Amidierung durchzuführen und diese Zellen erlauben es theoretisch, diese Modifikation eines Peptids oder Polypeptids in vivo durchzuführen.
Obwohl die vorliegende Erfindung in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben wird, werden einem Fachmann viele Variationen und Abwandlungen offensichtlich. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden ferner durch die folgenden Beispiel dargestellt.

BEISPIEL 1

Verfahren zur Reinigung einer alpha- amidierende Enzym-Präparation aus MTC-Tumoren

Gefrorene Ratten-MTC-Tumore wurden in dünne Fragmente pulverisiert und in 150 mM Tris pH 7,5, welches 250 mM Saccharose, 0,25% N-Acetylglucopyranosid, 0,1 mM PMSF, 20 ug/ml Pepstatin und 100 ug/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor enthielt, homogenisiert. Typischerweise wurden 25 g Tumorgewebe in 200 ml des obigen Puffers auf Eis homogenisiert. Die Homogenisierung wurde durch vier Bursts von je 20 Sekunden homogenisiert, wobei jeweils ein Polytron-Homogenisator (Brinkman) bei einer Einstellung von 7 verwendet wurde. Das Homogenat wurde 15 Minuten bei 9000 · g in einem JA-20 Rotor (Beckman) zentrifugiert und der Überstand (Sup.1) (Supernatant) wurde dekantiert. Das Pellet wurde re-homogenisiert in 60 ml des Homogenisationspuffers mit 3 Bursts von je 20 Sekunden je bei einer Einstellung von 7. Dieses zweite Homogenat wurde in gleicher Weise 15 Minuten bei 9000 · g zentrifugiert. Der Überstand (Sup. 2) dieser Zentrifugation wurde mit Sup. 1 kombiniert. Die kombinierten Sup. 1 und Sup. 2 wurden dann 30 Minuten bei 100 000 · g in einem SW28 Rotor (Beckman) bei 4ºC zentrifugiert. Zum geklärten Homogenat (Sup. 3) wurden ausreichend Ammoniumsulfat-Kristalle hinzugefügt, um eine 25-prozentige Lösung in Ammoniumsulfat herzustellen. Die Zugabe der Kristalle erfolgte allmählich über einen Zeitraum von 15 Minuten bei konstantem Rühren des Homogenats bei 4ºC. Nach weiteren 30 Minuten Rühren bei 4ºC wurde die Mischung 15 Minuten bei 27 000 · g in einem JA-20 Rotor (Beckman) bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und weiteres Ammoniumsulfat wurde zum Überstand hinzugefügt, um eine 40-prozentige Lösung in Ammoniumsulfat herzustellen. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wurde die Mischung wieder 15 Minuten bei 27 000 · g wie oben zentrifugiert. Der Überstand von dieser Zentrifugation wurde verworfen und das Pellet, welches mindestens 50 Prozent der gesamten Enyzmaktivität in dem Homogenat enthielt, wurde in 50 mM Tris HCl pH 7,0 wieder suspendiert, um die Probe zu ergeben. Die Aktivität betrug 8,2 mU/mg Protein.

Sephacryl S-300 Gelfiltrations- Größenausschluß-Chromatographie

Sephacryl S-300 (Pharmacia) wurde in 50 mM Tris HCl pH 7,0 equilibriert und in eine K50/100-Säule (Pharmacia) gemäß den Herstellerangaben gegossen. Das Bettvolumen der Säule betrug ungefähr 1,3 Liter. Die Probe wurde in einem Volumen, welches ungefähr 3 Prozent des Bettvolumens der Säule darstellte, auf die Säule geladen. Proteine wurden aus der Säule in 50 mM Tris HCl pH 7,0 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ungefähr 2 ml pro Minute eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden aufgefangen und auf alpha-amidierende Enzymaktivität getestet unter Verwendung des Dansyl-D-Tyr-Val-Gly-Substrats. Das Enzym eluierte aus der Säule in einem einzigen Aktivitätspeak, wie in Fig. 1 dargestellt, mit einer Molekularmasse von 60 000 bis 65 000 Dalton. Die Aktivität betrug mindestens 50 mU/mg Protein.

Mono Q Chromatographie bei pH 6,0 - Starke Anionenaustausch-Chromatographie

Fraktionen der Sephacryl-S-300-Säule, welche die maximale Enzymaktivität enthalten, wurden zusammengefaßt und gegen 4 Liter 20 mM bis-Tris pH 6,0-Puffer dialysiert. Der Pool wurde dann auf eine Mono Q HR 5/5 Säule (Pharmacia) geladen, welche gemäß Herstellerangaben vorbehandelt wurde und in 20 mN bis-Tris pH 6,0 equilibriert wurde. Nachdem die Proteine, welche nicht an der Säule gebunden werden, in dem Säuleneluent (Durchfluß) gesammelt wurden, wurden die gebundenen Proteine mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 300 mM NaCl in 20 mM bis-Tris-pH 6,0 eluiert. Die Säule ließ man mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute laufen und Fraktionen von je 2 ml wurden gesammelt. Die Lösung der Proteine, welche aus der Mono-Q-Säule bei pH 6,0 eluiert wurden, wurde sofort durch Sammeln in Röhrchen, welche je 200 ul 1,0 M Tris pH 7,0 enthielten, neutralisiert. Die Fraktionen wurden auf alpha-amidierende Enzymaktivität wie zuvor getestet, und es wurde ein Aktivitätspeak beobachtet, welcher aus der Säule bei ungefähr 160 mM NaCl (Fig. II) eluiert wurde. Die Aktivität betrug 161 mU/mg Protein.

Mono-O-Chromatographie bei pH 8,0

Fraktionen, welche den Peak alpha-amidierender Enzymaktivität von der Mono-Q-Chromatographie bei pH 6,0 enthielten, wurden gegen zwei Beladungen von je 4 Litern 50 mM Tris HCl pH 8,0 dialysiert. Das Enzym wurde dann auf eine Mono Q HR 5/5-Säule (Pharmacia), welche mit 50 mM Tris HCl pH 8,0 equilibriert wurde, geladen. Die Proteine wurden mit einem Salzgradienten von 0-300 mM NaCl in 50 mM Tris Ed pH 8,0 eluiert. Eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute wurde verwendet, und es wurden 2 ml- Fraktionen gesammelt. Jede Fraktion wurde durch Zugabe von 200 ul 1,0M Tris pH 7,0 in jedem der Sammelröhrchen neutralisiert. Es wurden zwei getrennte Enzymaktivitäts- Peaks gesehen, welche bei 190 mM NaCl bzw. 220 mM NaCl eluieren (Fig. III). Die Aktivitäten betrugen mindestens 80mU/mg Protein bzw. 400 mU/mg Protein.

Gel-Elektrophorese der Enzympeakfraktion der Mono-O-Chromatographie bei pH 8,0

Ein aliquoter Teil der Enzympeak-Fraktion, welche bei 220 mM NaCl eluiert und eine Aktivität von 408 mU/mg Protein hat, wurde auf ein 10%iges SDS-Polyacrylamid-Gel geladen nach Wärmedenaturierung in einem Puffer, welcher SDS und B- Mercaptoethanol (Fig. IV) enthält. Es wurde ein einziges Band von der Fraktion, welche bei 220 mM NaCl eluiert, beobachtet. Die scheinbare Molekularmasse dieses Bands beträgt ungefähr 73 000-75 000 Dalton.

Verifikation der Identität des 73 000-75 000 Dalton Bands als das alpha-amidierende Enzym

Von einer zusätzlichen alpha-amidierenden Enzympräparation, welche gereinigt wurde unter Verwendung von Kriterien, welche mit den oben beschriebenen identisch sind, wurden aliquote Teile verwendet zur Elektrophorese auf einem nicht-denaturierenden 10%igen Acrylamid-Gel. 50 ul aliquoter Teile wurden auf je zwei Bahnen aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Protein in einer der Bahnen unter Verwendung der Silberfärbetechnik visualisiert. Aus der zweiten Bahn wurden Streifen von je 3 mm geschnitten und jeder Streifen in einer Vertiefung einer Mikrotitrierplatte inkubiert. Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul einer Mischung hinzugefügt, welche das Dansylsubstrat, Katalase, Ascorbinsäure und 150 mM Tris pH 7,0 enthielt. Die Inkubation erfolgte 16 Stunden lang bei 37ºC unter konstantem Schütteln. Proben aus jeder Vertiefung wurden dann auf die Umwandlung des Substrats zum amidierten Produkt analysiert. In zwei Gelscheiben wurde Enzymaktivität gefunden. Die Aktivität wanderte zusammen mit einem intensiv gefärbten Proteinband in der entsprechend gefärbten Gelbahn (Fig. V).

BEISPIEL 2

Verfahren zur Herstellung von rekombinantem menschlichem Calcitonin

Menschliches Calcitonin ist ein 32-Aminosäuren- Peptidhormon, welches einen amidierten Prolylrest an seinem Carboxylende besitzt. Ein Mikroorganismus wurde gentechnisch modifiziert, um ein rekombinantes Fusionsprotein zu erzeugen, welches die Aminosäurensequenz enthält, welche menschlichem Calcitonin entspricht. Das Fusionsproteingen wurde so designed, daß die menschliche Calcitonin-Sequenz durch einen Arginylrest an seinem Aminoende und sein Caroxylende durch einen Glycylrest, welcher auch das rekombinante Fusionsprotein beendete, eingeklammert wurde (siehe Fig. VII). Der Ligation des menschlichen Calcitoningens in ein Plasmid, um das geeigenete Fusionsplasmid zu bilden, folgend, wurde ein Mikroorganismus mit diesem Plasmid transformiert und es wurde die Expression der Fusion erhalten (siehe Fig. VI). Dieses menschliche Calcitonin-enthaltende Protein wurde aus Lysaten des rekombinanten Mirkoroganismus durch Ausfällen isoliert. Die Cysteinylreste wurde dann in S-Sulfonate umgewandelt und die Lysylreste wurde reversibel blockiert durch Reaktion mit Citraconsäureanhydrid. Da menschliches Calcitonin kein Arginin enthält, erzeugte der tryptische Aufschluß des rekombinanten Fusionsproteins ein Peptid, welches die menschliche Calcitoninsequenez mit einer Carboxyl-terminalen Glycin-Verlängerung enthält. Dieses Peptid wurde entweder durch Umkehrphasen-HPLC (siehe Fig. VIII) oder durch Ionenaustausch-Chromatographie isoliert und seine Sturktur wurde durch Aminosäuren- und Mikrosequenzanalyse bestimmt.
Der Glycylrest des Peptids wurde entfernt und der vorletzte Prolylrest wurde in Prolinamide durch die Wirkung der alpha-amidierenden Enzym-Präparation dieser Erfindung umgewandelt. Ein Beispiel der Bedingungen, welche für die alpha-Amidierung dieses Peptids im halb-präparativen Maßstab angewendet wurde, ist wie folgt: Das lyophilisierte Peptid (200-300 nanoMol) (Substrat) wurde in 200 ul 150 mN Tris-HCl Puffer, pH 7, welcher ungefähr 750 uU der alphaamidierenden Enzympräparation enthielt, gelöst. Das Enzym wurde entweder aus Ratten-MTC-Gewebe gewonnen oder aus verbrauchtem Gewebekulturmedium der Ratten-MTC-CA-77- Zellinie. Das Enzym wurde gereinigt bis zu einem Ausmaß, daß die ganze proteolytische Aktivität entfernt war. Dies wurde durch eine Kombination von Ionenaustausch- und Größenausschluß-Chromatographie (siehe zuvor beschriebenes Verfahren) erreicht. Reines, homogenes Enzym ist kein Erfordernis. Ascorbinsäure und Kupfersulfat wurden dann zu dieser Mischung in ausreichenden Mengen hinzugefügt, um Endkonzentrationen von ungefähr 3mM bzw. 2 uM zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde gemischt und bei 37ºC 5-6 Stunden inkubiert. Typische Konversionsprozentsätze des Substrats zum Produkt sind 70-90%. Auf die Entfernung der S-Sulfonatgruppen wurde das rekombinante menschliche Calcitonin (rhCT) durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (siehe Fig. IX). Das Endprodukt wurde charakterisiert durch seinen Rückhalt auf der Umkehrphasen-HPLC (siehe Fig. X), quantitatives tryptisches Kartieren (siehe Fig. XI), Aminosäurenanalyse (siehe Tabelle I), und durch seine biologische Aktivität (siehe Fig. XII). In allen Fällen war das rekombinante menschliche Calcitonin vom synthetischen menschlichen Calcitonin nicht zu unterscheiden.
Das Vorhergehende zeigt, daß die Präparationen dieser Erfindung in der Lage sind, ein physiologisch relvantes Substrat, z. B. menschliches Calcitonin, welches durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt wurde, d. h. nur "L"- Aminosäuren enthält, zu amidieren.

VERGLEICHSBEISPIELE

Vergleich der Aktivität der beanspruchten Präparations mit dem Stand der Technik

Vergleich von Testsystemen zur Bestimmung der spezifischen Aktivität der beanspruchen Präparationen

Einige Aktivitäts-Testsysteme wurden im Stand der Technik angewendet. Die meisten Arbeiten, welche als Stand der Technik genannt wurden, haben einen Test basierend auf der Konversion von D-Tyr-Val-Gly in D-Tyr-Val-amid angewendet. Dieser Test wird quantifiziert durch die Verwendung eines radioaktiv markierten Tracers (¹²&sup5;I-D-Tyr-Val-Gly), welcher mit einem Überschuss an nicht-markiertem Material (D-Tyr- Val-Gly) gemischt wird. Das Messen der Umwandlung des markierten Tracers erlaubt eine Extrapolation des unmarkierten Materials, und dies wiederum erlaubt eine Berechnung der Aktivität.
Während dieser Test von der Anmelderin verwendet wurde, basierend die Aktivitätsbestimmungen der beanspruchten Präparationen auf einer direkten Messung der Umwandlung von Dansyl-Tyr-Val-Gly in Dansyl-Tyr-Val-amid.
Um einen bedeutsamen Vergleich der spezifischen Aktivität von Präparationen im Stand der Technik mit den beanspruchten Präparationen dieser Erfindung zu ermöglichen, wurden Experimente durchgeführt, um die Testssysteme zu vergleichen.
Die experimentellen Protokolle werden zusammengefaßt:

I. Monodansyl L-Tyr-Val-Gly

Eine alpha-amidierende Enzympräparation, welche aus medullären Ratten-Thyroidkarzinomtumoren und aus Gewebekulturmedium, welches von CA-77-Zellen gesammelt wurde, isoliert wurde, wurde als Enzymquelle bei diesen Experimenten benutzt. Die Enzymkonzentration, welche bei allen Experimenten benutzt wurde, wurde konstant gelassen, außer wo angegeben.
Die Reaktionsmischung für die Konversion des Monodansyl- Ersatzmittels enthielt:
5 ul Enzym
5 ul 30 mM Ascorbat
5 ul 20 uM CuSO&sub4;
5 ul 100 ug/ml Rinder-Pankreas-Katalase
5 ul enthaltend 2 nMol Substrat
25 ul 150 mM TES pH 7,0.
Die Proben wurden doppelt zubereitet und bei 37ºC für 10, 20 und 30 Minuten Zeitdauern inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe von 10 ul 500 mM EDTA gestoppt. Das Substrat und das Produkt wurden durch Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) getrennt unter Verwendung eines Hewlett Packard-1090 Flüssigkeitschromatographiesystems, und die mengenmäßige Bestimmung wurde unter Verwendung eines HP-3392 Integrators erreicht. Die Umwandlung von Monodansyl L-Tyr-VaI-GIy in das alpha-amidierte Produkt wurde als inear mit Bezug auf die Zeit angezeigt.

II. ¹²&sup5;I D-Tyr-Val-Glv

D-Tyr-Val-Gly und D-Tyr-Val-NH&sub2; wurden jodiert unter Verwendung von Jod-Kügelchen von Pierce Chemical Company. Das radioaktiv markierte Substrat und Produkt wurden verwendet, um eine Sulfylpropyl-Kationentauschersäule zu eichen. 1 D-Tyr-Val-Gly wurde zu 650 uM D-Tyr-Val-Gly hinzugefügt und als Substrat verwendet. Die Reaktionsmischung für die Konversion von Monodansylsubstrat enthielt:
5 ul Enzym
5 ul Ascorbat (30mM)
5 ul 100 ug/ml Katalase
5 ul 20 uM CuSO&sub4;
5 ul Substrat, 650 uM Endkonzentration
25 ul 150 mM TES pH 7,0.
Die Proben wurden bei 37ºC für 10, 20 und 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 500 mM EDTA gestoppt. Die gesamte Probe wurde verdünnt mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer ph 5,2 und auf eine Sulfylpropyl- Kationentauschersäule aufgetragen. Das Substrat bindet sich nicht mit der Säule; das amidierte Produkt wurde mit 500 mM NaCl eluiert. Die Konversion von radioaktiv markiertem Substrat zum Produkt war linear in Bezug auf die Zeit.

III. D-Tyr-Val-Gly

Die Reaktionsbedingungen, welche für die Amidierung von D- Tyr-Val-Gly verwendet wurden, sind identisch mit den für die Dansyl- und jodierten Substrate beschriebenen. Die Substratkonzentration in der Reaktionsmischung betrug 650 uM. Die Trennung von Substrat und Produkt wird durch Gradientenelution auf RP-HPLC erzielt unter Verwendung eines HP-1090 Flüssigkeitschromatographiesystems. Die Säulenausflüsse wurden bei 280 nm überwacht. Das Empfindlichkeitsniveau für diesen Test ist viel niedriger als das für Dansyl- oder jodierte Substrate. Zur Anpassung an dieses niedrige Empfindlichkeitsniveau wurden die alpha-Amidierungsreaktionen über längere Zeiträume durchgeführt und/oder mit erhöhten Mengen an alphaamidierenden Enzymen.
Die Analyse der Daten für fraktionierte Konversion von ¹²&sup5;I- D-Tyr-Val-Gly zu ¹²&sup5;I-D-Tyr-Val-amid und Dansyl-Tyr-Val-Gly zu Dansyl-Tyr-Val-amid zeigt, daß zu jedem Zeitpunkt ungefähr 1,55 mal mehr jodiertes Substrat als Dansylsubstrat umgewandelt wurde. Daher muß beim Vergleich des Testsystems des Standes der Technik mit dem Testsystem, welches von der Anmelderin verwendet wurde, ein Umwandlungsfaktor von ungefähr dem 1,5-fachen der Aktivität, welche durch das Dansyl-Substrat-Verfahren (Anmelderin) bestimmt wurde, angewendet werden.
Ferner wurde auch eine etwas strengere kinetische Analyse angewendet, um den Dansyl-Tyr-val-Gly- (Anmelderin) Test mit dem D-Tyr-Val-Gly- (Stand der Technik) Test zu vergleichen. Diese Analyse zeigt:
Wie durch Vergleich der maximalen Geschwindigkeit (Vmax = pmol Produkt/min/ul) für die zwei Substrate zu sehen ist, ergibt das D-Tyr-Val-Gly (Stand der Technik) ungefähr 1,48- mal mehr Aktivität als das Dansyl-Tyr-Val-Gly (Anmelderin). Dies stimmt mit den oben gemachten Feststellungen überein und bestätigt sie.

Vergleich der Aktivität

Eipper u. a. (PNAS) offenbaren auf Seite 5147, Fig. 4 ein Vmax von 39 picoMol pro Mikrogramm pro Stunde. Dies ist äquivalent mit einer spezifischen Aktivität von 0,65 mU/mg Protein pro Minute. Dies ist die höchste Aktivität, welche in einer der genannte Druckschriften des Standes der Technik angegeben wurde. Wird dies durch den zuvorgenannten Konversionsfaktor von 1,5 geteilt, erhält man eine spezifische Aktivität von 0,4 mU/mg Protein pro Minute. Dieser Wert kann nun direkt mit den zuvorgenannten spezifischen Aktivitäten, welche von der Anmelderin erreicht wurden, verglichen werden. Die Anmelderin hat, wie zuvor angegeben, Aktivitäten von mindestens 25 mU/mg Protein und mehr als 1500 mU/mg Protein erreicht. Die Anmelderin hat daher eine Aktivität von 60- bis mehr als 3750-mal der von Eipper (PNAS) berichteten Aktivität erreicht.

BEISPIEL 3

Reinigung und Charakterisierung der alpha-amidierenden Enzyme aus Ratten-MTC-Tumoren

Gefrorenes Ratten-MTC-Gewebe wurde in dünne Fragmente pulverisiert und in einem wässrigen Puffer homogenisiert unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators. Nach einer Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit wurde der Überstand aufgehoben und das Pellet wurde mit frischem Puffer wieder extrahiert. Dieses zweite Homogenat wurde wieder einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit unterworfen und dieser Überstand wurde mit dem ersten zusammengegeben. Die beiden vereinigten Überstände wurden dann durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation geklärt und der Überstand der Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation wurde als Startmaterial zur Reinigung des Enzymes verwendet.
Es wurde eine Ammoniumsulfatfraktionierung des Überstandes der Hochgeschwindigkeitszentrifugation durchgeführt. Es stellte sich heraus, daß der Hauptteil der Enzymaktivität in der 26-40%-igen Ammoniumsulfat-Fraktion ausfiel, und das Pellet dieser Fraktion wurde weiter gereinigt wie unten ausgeführt.
Es wurde auf einer Sephacryl-S-300 Säule eine Größenausschluß-Chromatographie durchgeführt. In Beispiel 1 hier eluierte das ganze Enzym aus dieser Säule in einem einzigen Aktivitätspeak. Bei diesem Beispiel wurde die Säulenlänge erhöht und die Strömungsgeschwindigkeit der Säule verringert. Unter diesen neuen Elutionsbedingungen wurde ein Hauptaktivitätspeak gesehen (wie in Beispiel 1), welchem ein kleinerer nachlaufender Peak folgte, welcher einer Form des Enzyms mit einem geringeren Molekulargewicht entsprechen kann. Es ist an dieser Stelle unklar, ob die Enzymform mit dem geringeren Molekulargewicht in vivo existiert oder durch teilweise proteolytischen Aufschluß während den Extraktions- und Reinigungsverfahren erzeugt wird.
Der Hauptpeak der Aktivität von der S-300-Säule wurde gesammelt auf einer Mono-Q-Säule bei pH 6,0 chromatographiert. Bei diesem Beispiel wurde eine größere Säule im präparative Maßstab verwendet als bei Beispiel 1 (die Mono Q HR 10/10), welche unter Verwendung eines weniger steilen linearen Salzgradienten eluiert wurde. Als ein Ergebnis dieser Änderungen wurden vier Peaks alphaamidierender Enzymaktivität in diesem Stadium erfaßt, welche bei 160 mM, 200 mM, 220 mM und 240 mM NaCl eluierten. (Peaks I, II, III bzw. IV) Fig. XIII. Dies zeigt, daß es vielfache Formen des Enzyms gibt und daß diese Formen eine Ladungsheterogenität haben. Ferner zeigt eine Polyacrylamidgel-Analyse der Proteine in den Enzymaktivitätspeaks, daß die Peaks II, III und IV alphaamidierendes Enzym von ungefähr dem gleichen Molekulargewicht (d. h. 73000-75000 Dalton) enthalten, wogegen Peak I ein Enzym mit einem unterschiedlichen, wahrscheinlich kleineren Molekulargewicht hatte. Die Aktivität in Peak III wurde bis zur Homogenität wie folgt gereinigt:
Das Enzym des Peaks III wurde gesammelt und auf einer Mono Q Hr 10/10-Säule bei pH 8,0 (Fig. XIV) chromatographiert. Das Enzym eluierte aus dieser Säule als ein einziger Peak bei 250 mM NaCl und die Gelanalyse ergab, daß das Enzym bis zur Homogenität (Fig. XVa, Bahn 6) gereinigt wurde. Die folgenden Charakterisierungsexperimente wurden mit dem gereinigten Enzym des Peaks III durchgeführt.
1. Es wurde durch 7%ige Polyacrylamidgel-Analyse bestimmt, daß das Molekulargewicht des Peaks III ungefähr 75 000 Dalton (Fig. XVb) ist.
2. Unter Verwendung von N-Dansyl-Tyr-Val-Gly als Substrat (Fig. XVI) wurde bestimmt, daß der optimale pH für die Aktivität des Enzyms pH 5,0-5,5 ist. Jedoch aufgrund der erhöhten Stabilität des Enzyms bei neutralem pH, kann es günstig sein, die Amidierungsreaktion bei solch einem pH auszuführen.
3. Es wurde bestimmt, daß die Menge an Kupfer, welche als Co-Faktor für die Enzymaktivität erforderlich ist, umgekehrt proportional zur Reinheit des Enzyms ist. Das Enzym, bis zur Homogenität gereinigt, benötigte 0,1 uM oder weniger Cu++ für maximale Aktivität, wogegen rohe Präparationen des Enzyms 2 uM Cu++ benötigen.
4. Der isoelektrische Punkt (pI) des Enzyms war 4,8.
5. Die spezifische Aktivität des homogenen Peak III-Enzyms war 2,100mU/mg Protein.
Das Enzym des Peaks II wurde auch bis zur Homogenität gereinigt. Bei diesem Enzym wurde jedoch festgestellt, daß die Mono Q-Chromatographie bei pH 8,0 unzureichend war, um eine homogene Präparation zu erhalten. Deshalb wurde der Pool des Peak II-Enzyms von der Mono Q-Säule, pH 6,0 (Fig. XIII) gegen 1M Tris pH 7,0 dialysiert und auf eine Phenylsepharose-Säule geladen, welche mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde. Der Hauptteil der verunreinigenden Proteinspezies wurde im Durchfluß der Säule aufgefangen, und das amidierende Enzym, welches in einem späteren Stadium eluierte, wurde im wesentlichen gereinigt. Eine weitere Reinigung des gesammelten Enzyms von der Phenylsepharose-Säule auf einer Mono Q HR 10/10 pH 8,0 Säule führte zu einer homogenen Präparation des Peak II-Enzyms, welches bei oder über 220 mM NaCl von der Säule eluierte.
Eine Charakterisierung des Peak II-Enzyms ergab, daß: 1. Das Molekulargewicht des Peak II-Enzyms durch 7%ige Folyacrylamidgel-Elektrophorese betrug ungefähr 73 000 - 75000 Dalton. Die Enzyme des Peaks II und Peaks III waren daher durch Vergleich ihrer Molekularmassen nicht zu unterscheiden.
2. Der optimale pH für die Aktivität des Peak II-Enzyms war pH 5,0-5, 5. Diese Charakteristik des Peak II-Enzyms ist wieder die gleiche wie für das Peak III-Enzym.
3. Der ioselektrische Punkt (pI) des Peak II-Enzyms war ungefähr 5,8.

BEISPIEL 4

Reinigung und Charakterisierung des alpha-amidierenden Enzyms, welches aus CA-77-Zellgewebekulturmedium gewonnen wurde

Eine medulläre Ratten-Thyroidkarzinomzellinie, CA 77, ließ man als eine einschichtige Kultur in 150 cm² T-Kolben (Corning) bei 8% CO&sub2; wachsen. Die Kultur wurde in einem definierten Medium gehalten, welches aus Dulbeccos's modifiziertem Adlermedium bestand: F-10 (1 : 1), 3,7 g/Liter NaHCO&sub3;, 5 ug/ml Transferrin, 10 ug/ml Insulin, 30 nM Selen und 4 ug/ml Gentamycinsulfat. Die Kulturen, welche man auf diese Weise wachsen ließ, konnten unbegrenzt aufbewahrt werden, wenn das Medium alle 48 Stunden gewechselt wurde. Um den Lagervorrat an Zellen zu erhöhen, wurden sie subkultiviert und man ließ sie drei Tage in einem Medium wachsen, welches Serum enthielt (5% Pferde- und 2,5% fetales Kalbserum). Die Zellen wurden dann zweimal mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen und mit definiertem Medium wieder aufgefüllt.
Das Gewebekulturmedium wurde nach einem 48-Stunden-Zeitplan aseptisch gesammelt und bei -20ºC gelagert, bis es gereinigt wurde. Das Gewebekulturmedium (routinemäßig 6 Liter) wurde mit 2 Liter deionisiertem Wasser (3 : 1) verdünnt und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/min auf eine DEAE schwache Anionenaustausch-Patrone (Cuno #250) aufgetragen, welche zuvor mit 1,0 Liter 20 mN bis Tris: HCl pH 6,0 bei 4ºC equilibriert wurde. Das alphaamidierende Enzym ("alpha-AE") wurde schrittweise aus der Patrone eluiert mit 50 mN Tris HCL pH 7,0, welche 500 mM NaCl enthielt, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ungefähr 50 ml/min. Die Fraktionen, welche die alpha-AE- Aktivität (spezifische Aktivität 10-15 mU/mg) von zwei Anionenaustausch-Präparationen enthielten, wurden vereinigt und 4- bis 5-fach unter reduziertem Druck konzentriert unter Verwendung des Savant RH-100 prep Rotor.
Dieses Material wurde direkt auf eine 5 · 50 cm Säule aufgetragen, welche Sephacryl 300-SF (Pharmacia) enthielt. Die mobile Phase war 100 mM Tris: HCl pH 7,0 mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. Die ganze Gelfiltrations-Chromatographie wurde auch bei 4ºC durchgeführt (Fig. XVII).
Die amidierende Enzympräparation ist in diesem Stadium der Reinigung frei von nicht-spezifischer proteolytischer Aktivität und hat eine Aktivität von mindestens 50 mU/mg Protein. Die amidierende Enzympräparation aus diesem Schritt wurde erfolgreich die Amidierung des rekombinanten Gly-verlängerten menschlichen Calcitonins und Wachstumshormone freisetzenden Faktors verwendet. Ausgehend von einer Zelldichte von 1-1,5 · 10&sup6; Zellen /ml (aus T- Kolben) erhielten wir routinemäßig eine Ausbeute von 200- 350 mU amidierende Enzymaktivität/Liter verbrauchten Mediums auf diese zwei Reinigungsschritte folgend. Das Enzym ist stabil und für die Verwendung in Lösung oder nach Immobilisierung auf einem festen Träger geeignet.
Säulenfraktionen, welche alpha-AE-Aktivität enthalten, wurden vereinigt, dann gegen 6 Liter 20 mM bis Tris : HCL pH 6,0 dialysiert. Das Enzym wurde auf eine Mono Q HR 10/10 starke Anionenaustauschersäule (Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 20 mM bis Tris : HCl pH 6,0 equilibriert wurde. Das Enzym wurde von der Säule eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-300 mM NaCl über einen drei Stunden Zeitraum bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml/min. Es wurden vier chromatographisch getrennte Formen alpha-amidierender Enzymaktivität während dieses Reinigungsschrittes aufgelöst. Die Peaks wurden in der Elutionsreihenfolge von der Säule (Fig. XVIII) nummeriert. Peaks III und IV stellen Enzymformen mit höherem Molekulargewicht dar und entsprechen den Peaks II und II, welche aus MTC-Tumoren gewonnen wurden. Peaks I und II stellen Enzymformen mit niedrigerem Molekulargewicht dar, welche proteolytische Fragmente von Peak III und IV darstellen können.
Die vier Formen des alpha-amidierenden Enzyms, welche in unserem Labor identifiziert wurden, unterscheiden sich voneinander in Ihrer Netto-Oberflächenladung, wie durch ihre unterschiedlichen Rückhaltezeiten während der starken Anionenaustausch-Chromatographie (Fig. XVIII) offensichtlich wurde. Das pH-Optimum für diese vier chromatographisch getrennten Formen des Enzyms ist auch unterschiedlich. Die Ergebnisse in Fig. XIX zeigen, daß Peaks III und IV ein identisches pH-Optimum zwischen pH 5,0 und 5,5 haben. Diese Ergebnisse stimmen mit dem pH-Optimum überein, welches für die Peaks II und III bestimmt wurde, welche aus MTC-Tumoren gereinigt wurden. Peaks I und II haben einen viel breiteren pH-Aktivitätsbereich mit einem Optimum zwischen pH 5 und 8,5 (Fig. XIX). Diese Ergebnisse sind in enger Übereinstimmung mit den pH-Optima, welche von Eipper u. a., Peptides, Band 4, Seiten 921-28 (1983) und Murthy u. a., J. Biol Chem, Band 261, Seiten 1815-22 (1986) berichtet wurden.
Radioaktive Markierung von Enzym der Peaks II und IV mit Nalzsl, gefolgt von SDS-PAGE, bestätigte, daß die Peak IV- Enzymaktivität eine ungefähre Molekularmasse von 73-75 kDalton hatten, wogegen die Peak II-Enzymaktivität unter 55 kDalton lag. Das exakte Molekulargewicht des Peak II-Enzyms ist unbekannt, da es nicht bis zur Homogenität gereinigt wurde (einige Proteinbänder sind im 45-55 kDalton-Bereich sichtbar).
Peak III- und IV-Enzym kann bis zur Homogenität gereinigt werden unter Verwendung einer Kombination von hydrophober interaktiver Chromatographie und starker Anionenaustausch- Chromatographie bei pH 8,0. Peak IV-Enzymaktivität (Fig. XVIII) wurde vereinigt, im Vakuum auf ungefähr 2 ml konzentriert und direkt auf eine 1,3 · 8 cm Säule von Phenylsepharose (Pharmacia) aufgetragen, welche mit 500 mM Tris: HCl pH 7,0 equilibriert wurde. Fraktionen, welche alpha-AE-Aktivität enthielten, wurden mit Equilibrierungspuffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min (Fig. XX) eluiert. Die Peakfraktionen, welche alpha-amidierende Aktivität enthielten, wurden gesammelt, gegen 50 mM Tris : HCl pH 8,0 dialysiert, dann auf eine Mono Q HR 10/10 Säule aufgetragen, welche mit 50 mM Tris : HCl pH 8,0 equilibriert wurde. Das Enzym wurde aus der Säule eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-300 mM CaCl über einen drei Stunden Zeitraum bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,0 ml/min (Fig. XXI). Fraktionen, welche eine alpha-AE-Aktivität enthielten, wurden bei oder über ungefähr 240 mM eluiert wurden, wurden vereinigt, auf 0,001% (v/v) in Triton X-100 eingestellt und bei 4ºC gelagert. Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms wurde auf ungefähr 1500 mU/mg Protein bei pH 7,0 bestimmt. Die Peak III alpha-AE-Aktivität wurde bis zur Homogenität gereinigt, unter Verwendung identischer Verfahren wie die für Peak IV beschriebenen.
Die physiochemischen Eigenschaften des Tumor-Peaks (aus Beispiel 3) und Gewebekultur-Peak (aus Beispiel 4) einschließlich Molekularmasse (73 000-75 000 Dalton), pH- Optimum (5,0-5,5), Aminoendsequenz und Elutionsposition (größer als ungefähr 240 mM Natriumchlorid von starker Anionenaustausch-Chromatographie durchgeführt bei pH 8,0) zeigt, daß diese zwei Peaks das gleiche Enzym darstellen können.

BEISPIEL 5

Alpha-Amidierung von biologisch relevanten Peptidhormonen unter Verwendung des alpha-amidierenden Enzyms

Einige rekombinante Peptidehormonsubstrate einschließlich der für Lachs und menschliches Calcitonin, menschlichen Wachstumshormon freisetzenden Faktor und menschliches Calcitoningen verwandtes Peptid wurden erzeugt und erfolgreich durch die alpha-amidierende Enzympräparation dieser Erfindung alpha-amidiert. Zum Zwecke der Darstellung werden die Verfahren, welche für die Herstellung des rekombinanten Lachs-Calcitonins, menschlichen Calcitoningen verwandten Peptids und menschlichen Wachstumshormon freisetzenden Faktors angewendet werden, unten zusammengesfaßt. Gleiche Typen von Lösungswegen können für andere rekombinante Peptide verwendet werden.
Lachs-Calcitonin ist ein 32-gliedriges Peptidhormon, welches einen apha-amidierten Prolylrest an seinem Carboxylende besitzt. Ein Mikroorganismus wurde gentechnisch verändert, um ein rekombinantes Fusionsprotein zu erzeugen, welches die Aminosäurensequenz enthielt, welche Lachs-Calcitonin entsprach. Das Fusionsproteingen war so aufgebaut, das die Lachs-Calcitoninsequenz durch einen Methionylrest an seinem Aminoende und an seinem Carboxylende durch einen Glycylrest, welcher das rekombinante Fusionsprotein beendete, eingeklammert war. Der Ligation des Lachs-Calcitoningens in ein Plasmid folgend wurde ein Mikroorganismus mit diesem Plasmid transformiert, und die Expression des Fusionsproteins wurde erhalten. Dieses Calcitonin-enthaltende Protein wurde aus den Lysaten des rekombinanten Mikroorganismus durch Ausfällen isoliert und seine Cysteinylreste wurden in S- Sulfonate umgewandelt. Da Lachs-Calcitonin kein Methionin enthält, erzeugte die Cyanbromid-Spaltung des rekombinanten Fusionsproteins ein Peptid, welches die Lachs-Calcitonin- Sequenz mit einer Carboxyl-terminalen Glycinverlängerung enthielt. Dieses Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC oder durch Ionenaustausch-Chromatographie isoliert, und seine Struktur wurde durch die Aminosäurenzusammensetzung und Mikrosequenzanalyse festgestellt.
Der vorletzte Prolylrest wurde in Prolinamid durch Wirkung des alpha-amidierenden Enzyms umgewandelt. Ein Beispiel der Bedingungen; welche für die alpha-Amidierung dieses Peptids angewendet wurden, ist wie folgt: Das lyophilisierte Peptidsubstrat (Glycin-verlängerter Lachs-Calcitonin- Vorgänger, 200-300 nMol) wurde in 200 ul 150 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7 gelöst, welcher ungefähr 750 uU des alphaamidierenden Enzyms enthielt. Das Enzym kann entweder aus einem MTC-Tumor gewonnen werden oder aus gebrauchtem Gewebekulturmedium der Ratten-MTC CA-77-Zellinie. Das Enzym muß in so einem Ausmaß gereinigt werden, daß jede fremde proteolytische Enzymaktivität entfernt ist. Dies wird gewöhnlicherweise durch eine Kombination von Ionen- Austausch und Größenausschluß-Chromatographie (siehe Beispiel 4) erreicht. Ein reines, homogenes Enzym ist kein Erfordernis. Ascorbinsäure und Kupfersulfat wurden dann zu dieser Mischung in ausreichenden Mengen hinzugefügt, um Endkonzentrationen von ungefähr 3 mM bzw. 2 uM zu ergeben. Katalase (7,5 ug/ml), Ethanol (1%, v/v) und Kaliumjodid (50mM) können auch in die Reaktionsmischung gegeben werden, um die Ausbeute an alpha-amidiertem Lachs-Calcitonin zu verbessern. Die resultierende Lösung wurde gemischt und 5-6 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Auf die Entfernung der S-Sulfonatgruppen mit einer Beta- Mercaptoethanol-Behandlung folgend wurde das rekombinante Lachs-Calcitonin durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Das Endprodukt wurde durch seinen Rückhalt bei der Umkehrphasen-HPLC, eine quantitative tryptische Kartierung und eine Aminosäurenanalyse charakterisiert. In allen Instanzen war das rekombinante Lachs-Calcitonin von synthetischem Lachs-Calcitonin nicht unterscheidbar.
Menschlichem Calcitoningen verwandtes Peptid ist ein 37- gliedriges Peptidhormon, welches einen alpha-amidierten Phenylalanylrest an seinem Carboxylende besitzt. Das Fusionsproteingen wurde auf ähnliche Weise erzeugt wie Lachs-Calcitonin (siehe oben), so daß die menschliche Calcitoningen verwandte Peptidsequenz durch einen Methionlyrest an seinem Aminoende und an seinem Carboxylende durch einen Glycylrest, welcher auch das rekombinante Fusionsprotein beendet, eingeklammert war. Die Liberation, Reinigung, alpha-Amidierung und Charakterisierung des rekombinanten menschlichen Cacitoningen verwandten Peptid-Vorgängers wurde auch in einer Weise analog zu der für das rekombinante Lachs- Calcitonin verwendeten, durchgeführt.

Menschliches Wachstumshormon freisetzender Faktor (hGHRF)

ist ein 44-gliedriges Peptidhormon, welches einen alphaamidierten Leucylrest an seinem Carboxylende besitzt. Das Fusionsproteingen für hGHRF wurde so konstruiert, daß die Aminosäurensequenz für das Peptidhormon durch einen Tryptophanylrest an seinem Aminoende und an seinem Carboxylende durch einen Glycylrest, welcher auch das rekombinante Fusionsprotein beendete, eingeklammert war. Das hGHRF-haltige Fusionsprotein wurde aus Lysaten des rekombinanten Mikroorganismus durch Ausfällen isoliert. Der nicht-nGHRF-ANteil des Fusionsproteins wurde durch die Konversion der Cysteinylreste in S-Sulfonatderivate denaturiert. Da hGHRF kein Tryptophan enthält, spaltete der chemische Aufschluß des rekombinanten Fusionsproteins mit dem Reagens BNPS-Skatol oxidativ das Fusionsprotein und erzeugte dadurch unamidiertes hGHRF mit einer Carboxylterminalen Glycinverlängerung. Gleichzeitig wurde der Methionlyrest an Position 27 im hGHRF-Molekül zu Methioninsulfoxid oxidiert. Dieses Glycin-verlängerte Peptide wurde unter Verwendung von Gelfiltration und Umkehrphasen-HPLC isoliert. Seine Struktur wurde durch Aminosäurenanalyse der Fragmentpeptide, welche durch den Trypsin-Aufschluß erzeugt wurden, festgestellt.
Der vorletzte Leucylrest wurde in Leucinamid durch die Wirkung des alpha-amidierenden Enzyms dieser Erfindung umgewandelt. Ein Beispiel der Bedingungen, welche für die Herstellung des alpha-amidierten hGHRF verwendet wurden, ist wie folgt: Das lyophilisierte Peptidsubstrat (20-40 nMol) wurde in 150 ul deionisiertem Wasser gelöst und mit 90 ul (500 uU) (pH 7,0) der alpha-amidierenden Enzympräparation, welche entweder aus Ratten-MTC-Tumor oder aus verbrauchtem Gewebekulturmedium von der Ratten-CA-77- Zellinie, gewonnen wurde, gemischt. Das Enzym wurde gereinigt, um die ganze fremde proteolytische Enzymaktivität durch eine Kombination der Größenausschluß- und Ionenaustausch-Chromatographie zu entfernen. Ascorbinsäure und Kupfersulfat wurden dann zur Mischung von Enzym und Substrat in ausreichenden Mengen hinzugefügt, um Konzentrationen von 3 mM bzw. 2 uM zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde gemischt und und 4-6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ein typischer Konversionsprozentsatz des Substrats zum Produkt ist 95%, basierend auf der Aminosäurenanalyse der Fragmente, welche durch Aufschluß mit Trypsin freigesetzt wurden. Zum Schluß wurde der Methioninsulfoxidrest durch die Wirkung von 4M beta- Mercaptoethanol, welches bei pH 4 mit 10mM Natriumacetat eine Stunde bei 80ºC gepuffert wurde, zu Methionin reduziert. Das Endprodukt wurde durch eine Umkehrphasen- HPLC gereinigt und durch seine Retentionszeit, tryptische Aufschlußanalyse und Aminosäurenanalyse charakterisiert. Das rekombinante, alpha-amidierte Produkt wurde auch auf biologische Aktivität getestet. In allen Fällen war der rekombinante hGHRF vom synthetischen hGHRF nicht unterscheidbar.
Zusätzlich zu den obigen Studien wurden zwei im Handel erhältliche Glycin-verlängerte Peptidhormone auf ihre Fähigkeit, als Substrate für das alpha-amidierende Enzym zu wirken, ausgewertet. Diese sind die Vorgänger des alpha- Melanocyt-stimulierenden Hormons und der Substanz P. In beiden Fällen, zeigen die Ergebnisse, daß beide Peptide geeignete Substrate für das alpha-amidierende Enzym sind.

BEISPIEL 6

Sequenzanalyse des gereinigten alpha-amidierenden Enzyms von Ratten

Fraktionen, welche gereinigtes alpha-amidierendes Enzym enthalten, wurden entweder von Ratten-MTC-Tumorgewebe oder CA-77-Zellkultur-Überstand gesammelt und die Sulfhydrylgruppen des Enzyms wurden einer Reduktion und nachfolgender Carboxymethylation unterworfen. Die resultierenden Reaktionsmischungen wurden dann auf eine Vydac C4 Umkehrphasen-HPLC-Säule (5uM Teilchengröße, 33 nm Porengröße) aufgetragen, welche mit 0,1%iger wässriger Trifluoressigsäure equilibriert wurde. Die Säule wurde mit dieser Lösung gewaschen, um überschüssige Puffersalze zu entfernen. Das entsalzte Enzym wurde von der HPLC-Säule durch Eluieren mit 80%igem Acetonitril, welches 0,08% Trifluoressigsäure enthielt, entfernt. Der Säulenausfluß wurde durch UV-Detektion bei 220 nm überwacht. Die resultierenden Proteinfraktionen wurden gesammelt, vereinigt und lyophilisiert. Dieses Material wurden dann wieder in 100 ul 0,1%iger SDS gelöst und dann auf einen Proteinsequenzer von Applied Biosystems Modell 470A aufgetragen. Verfahren, welche für die Mikrosequenzanalyse verwendet wurden, waren die von Applied Biosystems spezifierten. Die resultierenden Phenylthiohydantoin- Aminosäuren wurden durch HPLC analysiert auf einer Hypersil C18 Säule (Sum Teilchengröße, 10nm Porengröße), wobei die Absorption bei 269 und 313 nm auf einem Hewlett-Packard 1090 Flüssigkeitschromatographiesystem überwacht wurde. Die Aminoendsequenz des Hauptkomponentenenzympeaks (Peak III) vom Tumorgewebe war wie folgt:
Die Aminoendsequenzdaten der Hauptkomponentenform des Enzyms (Peak IV) des Überstands der CA-77-Zellgewebekultur zeigt, daß sie mit der des Tumorgewebeenzyms (Peak III) identisch ist. Es wurde jedoch auch eine kleine Komponente bei der Mikrosequenzanalyse dieses Enzyms entdeckt, welche eine Aminoterminale Verlängerung im Vergleich zur Hauptform des alpha-amidierenden Enzyms zu enhalten scheint. Das Vorhandensein dieser Komponente liegt wahrscheinlich an der unterschiedlichen nachtranslationalen Verarbeitung des Enzyms. Die Aminoterminale Aminosäurensequenz dieser Komponente war wie folgt:
Zusätzliche Aminosäurensequenzdaten wurden für das α- amidierende Enzym aus Ratten-MTC-Tumorgewebe durch das folgende Verfahren erhalten: Ungefähr 400 ug gereinigtes Enzym wurde einer Reduktion und Carboxymethylierung unterworfen. Auf dieses Verfahren folgend wurde die Enzymlösung in ein Dialyseröhrchen überführt und 18 Stunden gegen 25 mM Tris-HCl pH 8,0/0,5 M Harnstoff dialysiert. Das Retentat wurde dann in eine 1,5 ml Zentrifugenröhre übertragen und auf ein Volumen von 600 ul unter reduziertem Druck konzentriert. Zur Enzymlösung wurden 2 ul (2 ug) Trypsin hinzugegeben und die Mischung wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein zweite aliquote Menge Trypsin (2 ug) hinzugefügt und die Inkubation zwei Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Der Aufschluß wurde durch die Zugabe von 200 ul 4M Harnstoff/10%iger Essigsäure beendet. Das Digest wurde dann auf eine Vydac C18 Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen (5 um Teilchengröße; 33 nm Porengröße), welche mit 0,1%iger wässriger Trifluoressigsäure equilibriert wurde. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten Acetonitril bis zu einer Konzentration von 50% über einen Zeitraum von vier Stunden eluiert und die Fraktionen wurden in zwei-Minuten- Intervallen gesammelt. Die resultierenden charakteristischen Umkehrphasen-HPLC-Elutionspeaks für das tryptische Digest des Enzyms ist in Fig. XXIII graphisch dargestellt. Drei der resultierenden tryptischen Peptide wurden einer automatisierten Sequenzalanlyse unterworfen, wie oben beschrieben und die Ergebnisse sind unten dargestellt. (Die Peptide sind durch ihre Fraktionsnummer bezeichnet.)

Tryptisches Peptid Nr. 65

-Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-Asp-Gln-Asn-His-Phe-Ser- Gln-Pro-Thr-

Tryptisches Peptid Nr. 58

-Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ile-Gly-Arg-

Tryptisches Peptid Nr. 86

-Phe-Val-Thr-Gln-Trp-Gly-Glu-

BEISPIEL 7

Molekulares Klonieren des Gens oder der DNA-Sequenzen, welche für Ratten-MTC- oder CA-77-Zellen-alpha-amidierende Enzyme codieren

Die Fähigkeit, das Gen oder die DNA-Sequenz zu klonieren, welche für das alpha-amidierende Enzym codiert, stammt von einigen kritischen Informationsteilen und Reagenzien. Man muß eine zuverlässige Quelle des Enzymproteins entdecken, welche wiederum als Quelle für die Boten-RNA (mRNA) des Enzyms dient und schließlich seine komplementäre DNA (cDNA). Die Isolierung des Enzymgens oder der cDNA erfordert auch eine molekulare Sonde spezifisch für das Enzym von Interesse. Im allgemeinen nimmt diese molekulare Sonde eine oder zwei Formen an, es ist entweder ein Oligonukleotid, dessen Sequenz komplementär zu einem Teil des Enzymgens ist, oder es ist ein Antikörpermolekül (oder eine Sammlung von Antikörpermolekülen), welche das Enzymprotein spezifisch erkennen. Eine Derivation dieser Molekülsonden erfordert die Entdeckung eines Verfahrens zur Reinigung des Enzyms, so daß entweder Enzym-spezifische Antikörper erzeugt werden können oder die Aminosäuresequenzen des Enzyms bestimmt werden können zum Designen der Oligonukleotidsonden. Diese Bedingungen der Entdeckung wurden für das alpha-amidierende Enzym dieser Anmeldung erfüllt.
Das alpha-amidierende Enzym wurde aus Ratten-MTC-Gewebe und Ratten-CA-77-zellkonditioniertem Medium gereinigt. Dies bewies, daß diese Zellquellen die mRNA enthalten würden, welche für das Enzymprotein codiert. Die Verfahren, welche wir verwendet haben, um cDNA für alpha-amidierende Enzyme herzustellen, sind im Stand der Technik der Molekularbiologie allgemein bekannt.
Spezifische Protokolle für diese verschiedenen Verfahren können in Laborhandbüchern wie Molecular Cloning (1982), DNA Cloning, (Band 1) a Practical Approach, (1985) oder Primärliteraturreferenzen wie Gubler, V. & Hoffman, B. J., Gene, Band 25, S. 262-69 (1983); oder Young, R. A. und Davis, R. W., PNAS, Band 80, Seiten 1194-98, (1983) gefunden werden. Diese Verfahren haben eine allgemeine Anwendbarkeit, wobei die kritische Variable die Quelle der verwendeten mRNA ist. Um für Amidierungsenzym spezifische cDNA herzustellen, haben wir Ratten-MTC-Gewebe-mRNA und CA- 77-Zell-mRNA verwendet. Die doppelsträngigen cDNA-Proben, welche synthetisiert wurden, wurden wiederum dazu verwendet, separate Genbibliotheken durch bekannte Verfahren herzustellen.
Wie oben erörtert, erfordert die Identifizierung der besonderen cDNAs für alpha-amidierende Enzym-mRNA molekulare Sonden, welche diese Rekombinanten von den anderen Rekombinanten in einer besonderen Bibliothek unterscheiden können. Beispiele 3 und 4 zeigen im Detail die Reinigungsverfahren, welche verwendet wurden, um die Enzyme herzustellen, welche für die Derivation der Molekularsonden erforderlich sind. Beispiel 6 beschreibt die Verwendung dieses Proteins, um die Aminosäurensequenzen zu bestimmen, während Beispiel 8 die Verwendung des gereinigten Proteins zur Herstellung enzymspezifischer Antikörper beschreibt.
Die Aminosäuresequenzen von Beispiel 6 sind ausreichend, um spezifisch selektive Oligonukleotidsonden zu erzeugen. Bei der Herstellung von Oligonukleotidsonden sind einige Faktoren wichtig, um die Sonde selektiv zu machen. Eine komplette Erörterung dieser Betrachtungen kann in Lathe, R. J., J. Mol. Biol., Band 183, Seiten 1-12, (1985) gefunden werden. Da im allgemeinen mehr als eine Nukleotidsequenz für die gleiche Aminosäurensequenz codieren kann (ein Prinzip, das als die Degenerierung des genetischen Codes bekannt ist), stellt jede einzelne Nukleotidsequenz nur eine Anzahl von potentiellen Gensequenzen dar. Um zu garantieren, daß eine Oligonukleotidsonde das Gen von Interesse identifiziert, kann man eine äquimolare Mischung aller möglicher Nukleotidsequenzen, welche für Amidierungsenzym spezifische Aminosäuresequenzen codieren könnten, herstellen. Die Komplexität solcher Mischungen macht sie oft weniger als absolut selektiv und deshalb müssen im allgemeinen Oligonukleotid-Mischungen, welche mehr als einem Bereich einer Aminosäurensequenz eines Proteins entsprechen, verwendet werden, um alsolut spezifische Selektivität für ein gegebenes Gen zu erhalten.
Alternativ kann ein Oligonukleotid, welches für das Gen von Interesse selektiv ist, durch Herstellen einer einzigartigen Nukleotidsequenz von ausreichender Länge hergestellt werden, so daß selbst geringfügig unrichtige Komplementarität mit dem gewünschten Gen ein stabiles Hybrid erzeugt. Diese einzigartige Sequenz hat eine sehr kleine (längenabhängige) Wahrscheinlichkeit, ein stablies Hybrid mit anderen Gensequenzen zu bilden. Die einzigartige Sequenz besteht aus dem am häufigsten verwendeten Codon für jede Aminosäure der Proteinsequenz. Die Häufigkeit der Codonverwendung für eine gegebene Spezies kann aus einer Kompilierung von bekannten Gensequenzen und den entsprechenden Aminosäuresequenzen für die Proteine dieser Spezies bestimmt werden. Diese Verfahren sind Fachleuten im Bereich der Molekularbiologie allgemein bekannt.
Eine noch andere Methode, welche zur Herstellung spezifischer Oligonnukleotidsonden angewendet werden kann, beeinhaltet den Einschluß von Deoxyinosinresten in das Oligonukleotid an Positionen maximaler Degeneration. Diese Nukleotidsubstitution dient zur Verringerung der Degenerierung der Sondenprobe und kann dann so günstige Wirkungen auf den Selektionsprozess haben. (Zur Erörterung der Verwendung von Deoxyinosin in einer Oligonukleotidsonde, siehe Ohtsuka u. a., J. Biol. Chem. Band 260, Seiten 2605-08 (1985)).
Wir haben die alpha-amidierenden Enzymproteinsequenzen dazu verwendet, eine Vielzahl von Oligonukleotidsonden zu entwerfen, welche für die Isolierung der amidierenden Enzym-cDNA nützlich sind. Die verwendeten Sequenzen und die Sonden, welche wir hergestellt haben, sind in Tabelle II dargestellt. Es muß erkannt werden, daß wenn die Aminosäuresequenzen bereitgestellt sind, alternative Strategien zur Genisolierung durch die Sondenhybridisierung von jemand entwickelt werden könnten, der ein Molekularbiologiefachmann ist.
Die so erzeugten Oligonukleotidsonden wurden in allgemein bekannten Verfahren (siehe Molecular Cloning 1982) verwendet, um das Plasmid und die Bakteriophagen-cDNA- Bibliotheken zu überprüfen und die alpha-amidierenden Enzym-cDNAs zu isolieren.

Tabelle II

Diese Tabelle zeigt alle der möglichen Gensequenzen, welche ausgewählten Regionen eines alpha-amidierenden Enzymproteins entsprechen. Unter den entworfenen Sequenzen sind einige der zu den Genen komplementären Oligonukleotidsequenzen gezeigt, welche zur cDNA- Identifizierung und Isolierung nützlich sind. Aminoendsequenz Tryptischer Peak #58 Tryptischer Peak #65 Tryptischer Peak #86

BEISPIEL 8

A. Erzeugung von monoklonalen Antikörpern Mäusen spezifisch für alpha-Amidierungsenzym

Elf Balb/cJ-Mäuse wurden immunisiert und mit gereinigten Präparationen von Amidierungsenzym unter Druck gesetzt (boosted). Diese Mäuse ließ man ausbluten und das Serum wurde verarbeitet und gegen das gereinigte Enzym mit einem ELISA-Test titriert. Der Test (die angewendeten Techniken sind allgemein etabliert) wurde durch Absorbieren des gereinigten Enzyms an einer Polystyrolplatte durchgeführt, welche dann mit Rinderserum-Albumin (BSA) gewaschen und blockiert wurde (um fremde Bindungen der Antikörper an die Platte zu verhindern). Das verdünnte Mausserum (welches die vermeintlichen Antikörper gegen das amidierende Enzym enthält) wurde dann auf der mit Amidierungsenzym beschichteten Platte inkubiert und gewaschen. Ein zweiter Antikörper (markiert mit einem Marker, alkalischer Phoshphatase, welche die Bestätigung der Bindung des ersten Antikörpers an das plattengebundene Enzym erleichtert) wurde dann in den Vertiefungen inkubiert. Nach dem Waschen und der Zugbe einer Substratlösung, wurde das Signal kolorimetrisch durch einen spektrophotometrischen Recorder überwacht. "Positives" Serum zeigte ein Signal-zu-Geräusch- Verhältnis von mindestens 2 : 1.
Maus 47, welche einen höheren Titer bei ELISA zeigte, wurde vier Tage nach dem letzten Boost geopfert. Die Milz wurde aseptisch entfernt und zerlegt (mechanisch zerbrochen), um eine Gesamtheit von 132,6 · 10&sup6; Splenocyten zu ergeben, welche zu 122,8 · 10&sup6; NS-1-Myelomzellen mit 1,28 ml PEG (Polyethylenglycol) 4000 fusioniert wurden. Die Zellen wurden gleichmäßig auf fünf Platten mit je 24 Vertiefungen aufgeteilt, welche zuvor mit Balb/cJ Thymocyten und Splenocyten beschichtet wurden, welche als Zellschicht- Wachstumsunterlage in der Zellkultur dienten. Diese Zellen wurden in einem selektiven HAT-Medium gehalten, welches nur ein Überleben der Hybridzellen ermöglicht.
Die Überstände von 116 Zellen, welche klonales Wachstum zeigten, wurden durch einen Radioimmuntest und ELISA- Verfahren zur Antikörper-Herstellung gescreent. Das Radioimmuntestverfahren war dem zuvorbeschriebene ELISA ähnlich mit der Ausnahme, daß der zweite Antikörper mit ¹²&sup5;I markiert wurde und die radioaktiven Zähler durch einen Gammazähler gemessen wurden.
Sechsundfünfzig der 116 Vertiefungen waren positiv auf die Antikörperherstellung und wurden anschließend auf Reaktivität auf alpha-amidierende Enzyme gescreent. Fünfundzwanzig Klone, welche auf die alpha-amidierenden Enzyme positiv erschienen, wurden durch einen seriellen Dilutionsprozess gekloniert. Die Primärklone wurden gescreent gegen alpha-amidierende Enzyme und BSA (da die Polystyrolplatten mit BSA blockiert wurden, konnten Antikörper, welche an der Platte gebunden waren, nur auf eine nicht-spezifische Art und Weise gebunden oder durch das BSA absorbiert sein), um festzustellen, ob sie wirklich für das amidierende Enzym spezifisch waren. Klone, welche ein Signal für das alpha-amidierende Enzym zeigten, welches wenigstens zweimal so stark war, wie das für BSA, wurden auskloniert bei einem Verteilungsverhältnis von 1 Zelle/2 Vertiefungen.
Einundzwanzig positive Hybridome (siehe Tabelle III) wurden zum tertiären Klonierungsstadium befördert und zwanzig von ihnen wurden mit Bezug auf die Antikörperklasse durch Ouchterlony- und ELISA-Techniken characterisiert. Siebzehn der Klone haben schwere IgG2a-Ketten und drei haben schwere IgG&sub1;-Ketten. Alle der zwanzig typisierten Klon- Typen sonderten Antikörper mit Kappa leichten Ketten ab.
Jede Linie ließ man einzeln in einer großen Kultur wachsen und aliquote Teile der Zellen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren. Pristan-präparierten Balb/cJ Mäusen wurde intraperitoneal 5 · 10&sup6; Hybridomzellen injiziert. Eine Woche später wurde Mäusen, welche nicht den Ansatz von Ascites-Tumoren zeigten, eine Boosterinjektion von Zellen gegeben. Ascitesfluid und Blut wurden 1-2 Wochen später entfernt. Nach der Bearbietung wurden Ascites und das Serum gescreent und gegen das alpha-amidierende Enzyme titriert sowie gegen negative Antigene (z. B. Rinderserumalbumin, Eieralbumin, Cabonsäureanhydrase und Wachstumshormon-freisetzender Faktor), um die Antikörperspezifität sicherzustellen. Tabelle III Balb/c- alpha-Amidierungsenzym-monoklonale Zellinien
1 Ascites-Fluids wurden mit 100 ng reinen Enzyms in Festphasen-ELISA titriert.

B. Reinigungsverfahren für monoklonale Antikörper, welche in Mäusen erzeugt wurden

Monoklonale Antikörper, welche für das α-amidierende Enzym spezifisch sind und welche durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wurden wie folgt gereinigt. Ascites-Fluid, welches von einigen Mäusen gesammelt wurde, welche mit dem gleichen Klon geeimpft wurden, wurde als Antikörperquelle verwendet. Das Ascites-Fluid wurde verdünnt (5-fach) mit 10 mM MES pH 5, 6. Das verdünnte Ascites-Fluid wurde auf eine 1,5-x 20 cm Säule auftragen, welche 40 um gemischtes ABX Siliciumdioxidharz (J. T. Baker) enthielt, welche zuvor mit 10 mM MES pH 5,6 Puffer equilibriert wurde. Monoklonale Antikörper wurden aus der Säule eluiert unter Verwendung eines 0-500 mM Natriumacetat pH 7,0 Gradienten. Die Fraktionen, welche die gereinigten Antikörper enthielten, wurden zusammengenommen, auf spezifische Aktivität getestet, und bei 4ºC bis zur weiteren Verwendung gelagert.

C. Erzeugung polyklonaler Antikörper in Hühnern spezifisch für ein αamidierendes Enzym

Intravenöse, intramuskuläre und subkutane Injektionen wurden zwei liegenden Hühnern verabreicht mit einer Gesamtheit von ungefähr 50 ug des gereinigten α-amidierenden Enzyms in Ribi-Adjuvans für jedes Huhn. Ribi-Adjuvans ist eine völlig metabolisierbares Lipidemulsionssystem, welches aus einem Mitogen für Hühner-Lymphocyten und einem Adjuvans zur Verstärkung der Antikörper-Reaktion auf Antigene in Fowl (Ribi Immunochem Research, Montana) besteht. Nach der anfänglichen Immunisierung wurden zwei Boosterinjektionen in zwei-Wochen-Intervallen gegeben mit ungefähr 30 ug des Enzyms pro Huhn. Die Tiere ließ man am Tag 21 und 35 ausbluten und die Sera wurden verarbeitet und auf die Gegenwart von spezifischen Antikörpern durch das folgende Verfahren gescreent: Sera von beiden Hühnern, Tag 0 (vor Immunosierung), Tag 21, und Tag 35, wurden gescreent durch Festphasen-ELISA gegen 100 ng gereinigtes α- Amidierungsenzym. Rinderserumalbumin wurde verwendet als eine Negativkontrolle für nichtspezifische Antikörperbindung. Die enzymspezifischen Antikörper wurden ermittelt mit Hasen-Antihuhn IgG alkalischem Phosphatasemarkiertem Serum.
Die Ergebnisse der obigen Verfahren zeigten, daß spezifische Antikörper in den Sera von Huhn 257 am Tag 35 ermittelt werden konnten. Das Serum, verdünnt 1 : 10 000 ergab ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von ungefähr 4 : 1. Huhn 258 zeigte enzymspezifische Antikörper am Tag 21 und 35. Aus beiden Blutmengen ergaben Sera 1 : 10 000 verdünnt, ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von ungefähr 4 : 1. Das Sammeln der Eier von beiden Hennen begann am Tag 56. IgY's, welche durch Polyethylenglycol (PEG)-Ausfällung von Vorimmunisierungs-Eiern und Nachimmunisierungs-Eiern isoliert wurden, wurden analysiert durch Ouchterlony- Techniken und enzymspezifische Antikörper wurden durch ELISA gescreent.

D. Reinigung von Hühner-IGY-Antikörpern

D Reinigung von Hühner-IGY-Antikörpern

Polyklonale Vogelantikörper, welche für das α-amidierende Enzym spezifisch sind, wurden in Hühnern erzeugt, wie oben beschrieben. Eier von immuniserten Hennen wurden gesammelt und entweder in Paraffin eingebettet oder gefroren bis zur Verwendung für die Reinigung von IgY. Eiweiße wurden von den Eidottern getrennt, welche die α-amidierenden enzymspezifischen Antikörper enthalten. Eidotter wurden 3- fach verdünnt unter Verwendung von 10 mM Natriumphosphat pH 7,5, welches 0,1 M NaCl und 0,01% Natriumazid enthalten. Ein anfänglicher PEG-Ausfällungsschritt wurde durchgeführt unter Verwendung einer 3,5%igen Endkonzentration von PEG 8000. Man ließ den Niederschlag sich 30 Minuten bei Raumtemperatur bilden, dann wurde er zentrifugiert und der Überstand (enthält das IgY) wurde aufbewahrt. Zusätzliches PEG wurde zum Überstand hinzugefügt, um die Endkonzentration auf 12,5% PEG zu bringen. Die IgY- Antikörper, welche bei dieser Konzentration von PEG ausgefällt wurden, wurden durch Zentrifugation pelletiert. Die IgY-Antikörper wurden in diesem Stadium der Reinigung durch zwei Verfahren weiter gereinigt:
1) Die ausgefällten IgY-Antikörper wurden wieder in 10mM MES pH 5,6 suspendiert, dann über Nacht dialysiert bei 4ºC gegen diesen gleichen Puffer. Die Probe wurde dann auf eine 1,5 · 20 cm Säule aufgetragen, welche 40 um gemischtes ABX- Siliciumdioxidharz (J. T. Baker) enthielt. Das nachfolgende Reinigungsprotokoll war mit dem für Ascites-Fluid beschriebenen identisch.
2) Alternativ wurde das Pellet, welches IgY enthielt, wieder im Startpuffer suspendiert und dann wieder ausgefällt unter Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat (3 : 1 v/v). Das Pellet, welches IgY enthielt, wurde in einem kleinen Volumen destillierten H&sub2;O wieder suspendiert und bei 4ºC gelagert bis zur weiteren Verwendung. Das Immobilisierungsverfahren für Hühner-IgY ist in Beispiel 12 beschrieben.

BEISPIEL 9

Kinetische Studien alpha-amidierender Enzymaktivität

Das alpha-Amidierungsenzym, welches wir bis zur Homogenität gereinigt haben (aus medullären Thyroidkarzinom-CA-77- Zellen in Kultur und aus dem entsprechenden Tumorgewebe, welches von Laborratten entfernt wurde) wirkt bei der Konversion von inaktiven Glycin-verlängerten Peptidprohormonen zu bioaktiven C-terminalen Amiden. Basierend auf unseren Studien muß die C-terminale Aminosäure des Prohormons ein Glycinrest sein, damit das Enzym sie erkennt und wie folgt amidiert:
In vitro-Rekonstitution dieser Aktivität benötigt ungedingt zusätzlich zum Peptidsubstrat, molekularen Sauerstoff und ein reduzierendes Agens (L-Ascorbinsäure). Wir haben jedoch herausgefunden, daß enzymatische Aktivität im wesentlichen durch die Zugabe von Cu&spplus;²-Ionen (Kupersulfat) und Katalase erhöht werden kann. Dieses exogene Kupfer wird durch das Enzym gebunden und als ein Platz molekularer Sauerstoffbindung und Aktivierung verwendet. Andererseits ist Katalase ein Enzym, welches dazu dient, das Wasserstoffperoxid auszuspülen, welches sich sonst ansammeln würde und durch Seitenreaktionen, welche Sauerstoff, Ascorbat, Kupfer miteinbeziehen, das amidierende Enzym zerstören.
Wir haben erfolgreich sensitive nicht-radiometrische Testverfahren für die Ermittlung alpha-amidierender Enzymaktivität entwickelt. Diese Tests schließen die Verwendung von synthetischen Tripeptidsubstraten ein. Die Amidierung dieser Substrate wird bequem überwacht durch Trennung und Quantifizierung des Produkts (amidiertes Dipeptid und Substrat-Tripeptid) unter Verwendung von HPLC. Der empfindlichste dieser entwickelten Tests verwendet Monodansyl-L-Tyr-Val-Gly als Substrat. Diese Verbindung kann durch extrem niedrige Niveaus detektiert werden, da die Dansylgruppe fluoreszierend ist. Folglich ist die Sensitivität dieses Test vergleichbar mit der von ähnlichen radiometrischen Tests, welche in anderen Labors entwickelt wurden.
Wir haben diesen Test verwendet, um die kinetischen Eigenschaften des alpha-amidierenden Enzyms zu erforschen. Es wurden insbesondere die kinetischen Parameter Km und Vmax bestimmt durch Untersuchung der Wirkung der Variation der Substratkonzentration auf die enzymatische Aktivität. Km ist ein Maß der Affinität, welche das Enzym bestitzt für ein bestimmtes Substrat. Je kleiner Km ist, desto größer ist die Affinität. Vmax ist die maximale Geschwindigkeit, bei welcher das Enzym das Substrat in das Produkt umwandelt, und wird bei Sättigungskonzentrationen des Substrats beobachtet (d. h. das Substrat ist in großem Überschuß über das Enzym vorhanden).
In einem typischen Amidierungsenzymtest würde das Reaktionssystem (50ul) Enzym (ungefähr 7 ug), Dansyl-L-Tyr- Val-Gly (bis 40 uM), L-Ascorbinsäure (3mN), Katalase (0 bis 100 ug ml 1) und Kupfersulfat (0 bis 2 uM) in 60 mM TES- Puffer bei pH 7,0 enthalten. Die Reaktion wird bei 37ºC durch die Zugabe von Enzym gestartet und nach einem definierten Zeitraum durch die Zugabe von 0,1 M EDTA (Endkonzentration) beendet, welche das Kupfer bindet und es für das Enzym unverfügbar macht.
Das alpha-amidierende Enzym zeigt eine hohe Affinität für die enzymatische Amidierung von Dansyl-L-Tyr-Val-Gly mit Km zwischen 1-2 uM. Dieser Wert scheint konstant zu sein, unabhängig vom Zustand der Reinigung des Enzyms. Der Enzympool, welcher von der Sephacryl S-300-Chromatographie gewonnen wurde, zeigt den gleichen Km wie die elektrophoretisch reinen Präparationen des Enzyms, welche aus der Mono Q pH 8,0 Chromatographie oder den Formen mit niedrigerem Molekulargewicht, welche von Mono Q pH 6,0 Chromatographie aufgelöst wurden. Andererseites variieren, wie erwartet, die Vmax-Werte (ausgedrückt pro mg Protein) wesentlich mit dem Stadium der Reinigung. Daher ist, während Vmax des von der Sephacryl 5-300 gewonnenen Pools ungefähr 50 bis 100 nMol Produkt gebildet pro Minute pro mg Protein, Vmax für das reine Tumorenzym ungefähr 5000 nMol Produkt gebildet pro mg Protein.
Wir haben herausgefunden, daß das Ascorbat und das Substrat unter manchen Bedingungen miteinander um das Enzym konkurrieren. Wenn zum Beispiel die Konzentration des Substrats wesentlich über das Sättigungsniveau erhöht wird, wird die Enzymaktivität aufgrund der beeinträchtigten Wirkung zwischen Enzym und Ascorbinsäure geschwächt. Daher scheint für jedes besondere Substrat eine feines Gleichewicht zwischen optimalen Substrat-/Ascorbat-Niveaus zu sein, abhängig von der Affinität des Enzyms für das besondere Substrat.

Affinität des amidierenden Enzyms für Glycin-verlängerte Peptide

Wir haben den Test der Monodansyl L-Tyr-Val-Gly-Amidierung als eine sensitive Sonde für die Reaktion zwischen dem Amidierungsenzym und einigen Gly-verlängerten Peptidprohormonen verwendet. Der Zweck dieser Studie war, die relative Affinität des Enzyms zur Bindung bestimmter verschiedener Typen von Peptidsubstraten zu untersuchen. Obwohl wir früher gezeigt haben, daß das Enzym die Glycinverlängerten Vorgängersubstrate von menschlichem Calcitonin und einem Wachstumhormon freisetzenden Faktor erfolgreich amidiert, sagt dies nicht über die Fähigkeit des Enzyms aus, diese oder andere Peptide präferentiell relativ zueinander zu binden.
Wir haben gezeigt, daß Glycin-verlängertes alpha- Melanocyten-stimulierendes Hormon, Substanz P, Vasopressin- Analoge und der Wachstumshormon freisetzende Faktor mit hoher Affinität gegenseitig auf das amidierende Enzym wirken, und es davon abhalten, Dansy-L-Tyr-Val-Gly zu metabolisieren. Ferner zeigen Pentapeptidmodelle, welche den fünf C-terminalen Aminosäureresten des Glycinverlängerten menschlichen Calcitons, Neuropeptid Y, Cholecystokinin, Corticotrophin freisetzendem Faktor und Calcitoningen verwandtem Peptid entsprechen, Konkurrenz in diesem Test. In anderen Worten, das Enzym hat die Fähigkeit, alle diese Glycin-verlängerten Peptidsubstrate zu binden und wahrscheinlich zu amidieren.
Im Gegensatz dazu, wurde herausgefunden, daß wenn die amidierten Peptide, welche diesen Substraten entsprechen, untersucht wurden, sie viel weniger in der Lage waren, mit dem Enzym zu wirken. Die Fähigkeit dieser Enzymkatalytischen Stelle, eine große Vielzahl von Glycinverlängerten Substraten zu erkennen, sollte es zu einem extrem nützlichen Hauptreagens für die kommerzielle Amidierung von Peptidprohomonen machen, welche durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurden.

BEISPIEL 10

Isolierung einer DNA-Sequenz, welche für das α-amidierende Enzym des Peaks III codiert

RNA-Präparations

Die gesamte RNA wurd aus Ratten-MTC-Gewebe präpariert unter Verwendung des Guanidin-Thiocyanat-Verfahrens. Poly A RNA wurde mit Oligo dt Cellulose ausgewählt.

cDNA-Synthese:

Es wurde eine doppelsträngige cDNA durch allgemein bekannte Verfahren hergestellt. Unter Verwendung von Poly A RNA aus dem Ratten-MTC-Gewebe als Matrize und Oligo dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer, wurde in einer enzymatischen Reaktion mit Umkehr- Transkriptase die Synthese eines ersten Stranges durchgeführt. Die cDNA und die RNA wurden getrennt und die RNA mit Alkali abgebaut. Die Synthese des zweiten Stranges der cDNA war selbstgestartet unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase I. S1 Nuklease-Aufschluß wurde angewendet, um Haarnadelkurven in der cDNA zu entfernen und um jeden einzelnen Strangbereich der cDNA abzubauen. Nach einer Reaktion mit DNA-Polymerase I, um freie Enden an der cDNA zu erzeugen, wurden die doppelsträngige cDNA mit EcoR1- Methylase und S-Adenosylmethionin behandelt, um die EcoR1- Stelle zu methylieren und sie vor nachfolgender enzymatischer Spaltung zu schützen. EcoR1-Linker wurden zur cDNA ligiert. Auf den EcoR1-Abbau folgend wurden die überschüssigen Linker von der cDNA getrennt, und die cDNA wurde größenfraktioniert auf einer Sepharose 4B Säule. Für eine solche Synthese, wurden Moleküle größer als 500 Basenpaare gesammelt, während bei einer zweiten Moleküle größer als 1000 Basenpaare zum Klonieren zusammengefaßt wurden.
λ gt11 cDNA Bibliotheks-Konstruktion
Auf die Synthese eines Linkers folgend, welcher an die doppelstränige cDNA angepaßt ist, wurden die Moleküle dazu verwendet, im Vektor λ gt 11 cDNA Bibliotheken zu erzeugen. Dies wurde durch die Ligierung der cDNA zu λ gt 11 DNA durchgeführt, welche mit EcoR1 gespaltet wurde und mit Phosphatase behandelt wurde, um eine Selbstligierung der Vektor-DNA zu verhindern. Auf die Ligierung der DNAs folgend, wurden die rekombinanten DNAs in vitro verpackt, um infektiöse bakteriophage Partikel zu bilden (Extrakte zum Verpacken sind im Handel erhältlich von Promega Biotech oder Clontech Laboratories oder können gemäß Standardverfahren hergestellt werden).
Nachdem die DNA verpackt worden war, wurden aliquote Teile der Verpackungsmischung getestet, um die Anzahl der Rekombinanten in den Bibliotheken zu bestimmen. Es wurde herausgefunden, daß eine der Bibliotheken ungefähr 2,57 · 106 infektiöse Partikel enthielt, von welchen ungefähr 78% scheinbare Rekombinanten waren (welche deutliche Plaques auf X-Gal Platten ergaben, wenn man sie in der Gegenwart von IPTG wachsen ließ). Es wurde herausgefunden, daß die andere Bibliothek ungefähr 2,75 · 10&sup6; Gesamtplaques hat, welche Einheiten bilden und ungefähr 81% scheinbare Rekombinanten bilden.

Selektion einer Bibliothek:

Um festzustellen, welche rekombinante Bakteriophage cDNA für das alpha-amidierende Enzymprotein enthielt, wurde die Phage mit radioaktiv markierten Oligonukleotidsonden gescreent, welche aus den spezifischen Aminosäuresequenzen des alpha-amidierenden Enzyms gebildet wurden. (Siehe Beispiel 7, Tabelle II). Das Screening wurde durch Ausstreichproben der Bakteriophage und Heben der Phage auf Nitrocellulose-Filterscheiben durchgeführt. Verfahren zur Phagenimmobilisierung auf Nitrocellulose-Filtern sind allgemein bekannt. Duplikatfilter jeder Platte wurden mit ³²P-markiertem Oligonukleotid AE9 hybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 37ºC 20-24 Stunden in 6xNET, 0,5% NP40, 5xDenhardt's-Lösung, 100 ug/ml Lachssperma-DNA, mit einer Oligonukleotidsonde bei 0,3-0,4 pMol/ml durchgeführt. Auf die Hybridisierung folgend wurden die Filter in 6xSCC bei 44-45ºC einige Stunden gewaschen und einem Röntgenstrahlenfilm ausgesetzt. Positiv hybridisierte Phagen wurden als übereinstimmende Flecke auf doppelten Filtern identifiziert. Diese wurden gereinigt durch serielles Anreichern durch einige Runden des Ausstreichens und der Hybridisierung. Aus ungefähr 4-5 · 10&sup4; gescreenten Phagen wurden 18 durch AE 9 identifiziert.
Um der Selektion Spezifität zu verleihen, wurde die Hybridisierung mit einem zweiten alpha-amidierenden Enzym- Oligonukleotid, AE 8, durchgeführt. Diese Sonde ergab, daß mindestens vier der achtzehn Phagen cDNA zu den alphaamidierenden Enzymproteinsequenzen trugen. Diese Feststellung wurde durch zusätzliche spezifische Oligonukleotidhybridisierung bestätigt (mit AE 4 und AE 5) sowie durch DNA-Sequenzanalyse.

α-amidierende Enzymexpression:

Der Peak III αAE, für welchen wir die Proteinsequenzen bestimmt haben, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 75000 Dalton. Wenn das durchschnittliche Molekulargewicht einer Aminosäure als 120 Dalton angenommen wird, dann hat das amidierende Enzym höchstens 625 Aminosäuren. Das Gen für 625 Aminosäuren muß mindestens 1875 Basenpaare enthalten. Alle der vier cDNAs, welche wir als Amidierungsenzymspezifisch isoliert haben, sind ausreichend groß, um vollständig für das α-amidierende Enzymprotein zu codieren. Einer der cDNA-Klone, λAE1, ist ungefähr 2200 Nukleotide lang. Innerhalb der ersten 50 Nukleotide eines Endes, beginnt es für die Aminosäuresequenzen zu codieren, welche als das Aminoende des Peak III-Enzyms identifiziert wurden. Es kann deshalb daraus abgeleitet werden, daß diese cDNA die gesamte Codierungskapazität enthält, welche für das Peak III Enzym nötig ist. Hat man diese Information gegeben und die Nukleotidsequenzen an den Enden der 2200 bp cDNA, ist es ein relativ geradliniges Verfahren, die cDNA zur Expressionsklonierung in einen prokaryotischen Wirt, wie E. coli anzupassen.
Ein mögliches Verfahren, welches auf die λAE1-cDNA angewendet werden kann, ist in Fig. XXXII dargestellt. Zum Beispiel wird die 2200 Basenpaare Einschub-cDNA von λAE1 isoliert auf den EcoR1-Abbau der rekombinanten Bakteriophagen-DNA und Agarose-Gelelektrophorese folgend. Es wird an der EcoR1-Stelle von pBR322 kloniert, um das Plamid pAE8-1 zu erzeugen. pAE8-1 enthält eine einzige KpnI-Spaltungsstelle innerhalb der cDNA-Sequenzen und eine einzige Hind III-Stelle innerhalb der pBR 322 Sequenzen. Der Abbau von pAE8-1 mit KpnI und Hind III ergibt ein Fragment von ungefähr 2,15 Kb, welches ungefähr 62 Basenpaare der cDNA (am amino-terminalen Codierungsende der cDNA) verloren hat. Um die Aminosäuren, welche am Aminoende des Peak III-amidierenden Enzyms gefunden wurden, zurückzubauen, und um die cDNA an das Klonieren in ein Expressionsplasmid anzupassen, wird das KpnI-Hind IIIendende Fragment ligiert zu Olignukleotid-Linkeradaptern. Im dargestellten Beispiel wurd das von Pharmacia gekaufte E.coli-Expressionsplasmid pKK233-2 verwendet. Das 2,15 Kb cDNA-Fragment wird ligiert zum doppelsträngigen Linker- Adapter, welcher aus
AE17(+)305'CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC3' und
AE18(-)225'CAAGGCATTCATTGGAAAATGA3'
besteht.
Das adaptierte Fragment wird dann zum Plasmid pKK233-2 DNA ligiert, welches zuvor mit NcoI und Hind III gespalten wurde, um einen 4,6 kb linearen Vektor zu ergeben. Das ligierte Produkt, pAE12 enthält die cDNA für das alphaamiderende Enzym, welchem ein ATG Startcodon vorausgeht und eine Ribosomenbindungsstelle und unter der Steuerung des Hybrids, IPTG induzierbaren Promotor, trc. Dem Gen folgt ein 5S RNA-Gen und eine Transkriptionsendstelle. IPTG induzierbare Expression von pAE12 wird erhalten auf die Transformation der Plasmid-DNA in einen E.-coli-Strang mit einem laciq-Genotyp.
Partielle DNA-Sequenz des 2,2 kb cDNA-Einschubs von λAE1.
Der 2,2 kb Einschub wurde durch EcoR1-Abbau von λAE1 entfernt, und der Einschub wurde mit 32P markiert. Nach einem sekundären Abbau mit Hinc II, wurden die resultierenden 1,6 kb und 0,6 kb-Fragmente sequenziert durch chemische Abbauverfahren von Maxam und Gilbert.
DNA-Sequenz, welche durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung des 600bp-Fragments von λE-1 aus dem Eco R1-Ende erhalten wurde:
DNA-Sequenz, welche durch Maxam-Gilbert-Sequenzierung des 1600bp-Fragments von λAE-1 aus dem Eco R1-Ende erhalten wurde:

Recherche nach Sequenzhomologie mit der Oligonukleotidsonde AE8(-)22

Es wurde eine Computerrecherche durchgeführt nach Homologie zwischen den Aminosäuren, welche dazu verwendet wurden, die Sonde AE8 (Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Val-Thr) und die Translation der partiellen DNA-Sequenz des 600bp- Fragments von λAE1 herzustellen.
Ein Bereich perfekter Homologie wurde erhalten und dieser Bereich wurde durch Sternchen auf der DNA-Sequenz und Großbuchstaben für die Aminosäuren hervorgehoben. Die Aminosäuren, welche durch NH&sub2;-terminales Sequenzieren des gereinigten Amidierungsenzyms identifiziert wurden, wurden eingeklammert. Aminosäuren-Zuweisungen, von welchen herausgefunden wurden, daß sie sich von den durch die DNA- Sequenz vorhergesagten unterscheiden, wurd durch ein "+" angegeben:

Beispiel 11

Enzymimmobilisierung

Reinigung von α-AE:
Vor der Immobilisierung wurde das α-amidierende Enzym über eine schwache Anionenaustausch- und Gelfiltrations- Chromatographie (Beispiel 4) gereinigt. In einigen Fällen kann die Enzym-Präparation weiter gereinigt werden unter Verwendung der Immunoaffinitäts-Chromatographie oder der Phenyl-Sepharose-Chromatographie. Das nachfolgende Immobilisierungsverfahren ist unabhängig vom Reinigungsverfahren; routinemäßig sollte jedoch die spezifische Aktivität mindestens 25 mU und vorzugsweise 50 mU oder höher sein.
Immobilisierung von α-AE:
Die Immobilisierungstechnologie für das α-amidierende Enzym kann auf der gleichzeitigen Reaktion von drei Komponenten basieren, dem Enzym, einem wasserlöslichen Copolymer von Acrylamid (PAN) und einem Vernetzungsreagenz (TET) mit niedrigem Molekulargewicht. Das vorgeformte Polymer (PAN) besteht aus Acrylamid und N-Acryloxysuccinimid, welches in einer THF-Lösung polymerisiert wird unter Verwendung thermischer Initiierung mit Azobis (Isobutyronitril). Das Vernetzungsreagenz kann α,ω-Diamin, Triethylentetramin (TET), Cystamin sein. Die Reaktion des Diamins mit den aktiven Estergruppen von PAN vernetzt die Polymerketten über eine Amidverbindung und bildet ein unlösliches Gel. Die Aminofunktionen des Enzyms (vorzugsweise die &epsi;- Aminogruppe von Lysin) reagieren gleichzeitig mit restlichen aktiven Estern auf dem Gel und bilden stabile kovalente Amidbindungen. Das Immobilisierungsverfahren wird in der Gegenwart des Substrates und Cofaktoren durchgeführt. Die Gegenwart eines Substrates mit hoher Affinität und Cofaktoren mit Konzentrationen größer als Km verhindern Raktionen zwischen PAN aktiven Estern und nukleophilen Gruppen bei oder nahe der katalytischen Stelle des Enzyms und schützen so das Enzym vor chemischer Inaktivierung.

Immoblisierungsbedingungen:

Teilweise gereinigtes α-AE wird in 30 mM HEPES-Puffer pH 7,0 aufgelöst. Das Verhältnis von PAN und TET wird so eingestellt, daß 15% der aktiven Ester keine Reaktion eingehen, welche als die Bindungsstellen für das α- amidierende Enzym dienen. Die Standard-PAN-Lösung beträgt 20% (w/w). Die Reaktionsmischung des α-amidierenden Enzyms besteht aus 0,2 uM CuSO&sub4;, 40 uM Dansyl-His-Phe-Gly und 10 mM Ascorbat und 0,5-2,0 mg α-AE/Gramm PAN. Die TET- Konzentration wird so berechnet, daß sie gleich 0,85 Äquivalente primäres Amin/Äquivalent aktivem Ester ist. Um routinemäßig die optimalen Bedingungen zu bestimmen, wird eine Reaktion ohne Enzym gefahren, um die Gelierzeit einzustellen, welche die Zeitdauer ist, welche auf die Zugabe von TET folgt und welche benötigt wird, um eine Gelbildung zu erzielen. Die optimalen Ausbeuten für die Immobilisierung des α-amidierenden Enzyms werden erhalten, wenn die Zugabe des Enzyms näher zum Gelierpunkt bewegt wird. Die allgemeine Regel ist, je kürzer die Zeit ist, welche das Enzym PAN ausgesetzt wird vor der Gelbildung, desto höher ist die Ausbeute des aktiven immobilisierten Enzyms. Bei den meisten Reaktionen wird α-AE (~ 2,0 mg/Gramm PAN) 45-60 Sekunden nach TET zugegeben. Das enzymhaltige Gel läßt man ungefähr eine Stunden bei Raumtemperatur stehen, um die Kupplungsreaktion sich vervollständigen zu lassen. Nach 60 Minuten wird das Gel mit einem Mörser und Pistill zermahlen und ergibt Fragmente von durchschnittlich 100 u Größe. Diese Teilchen werden mit Ammoniumsulfat gewaschen, um ungebundene Reaktanten zu entfernen und um übrige aktive Estergruppen in Amide umzuwandeln und dadurch die reaktiven Gruppen abzudecken. Es wird erwartet, daß die Ausbeute des aktiven α- amidierenden Enzyms auf die Immobilisierung folgend weniger als 60% ist. Die auf die Immobilisierung folgenden Waschungen können 30 bis 40% der Startaktivität enthalten. Das α-amidierende Enzym kann aus den Waschungen wiedergewonnen werden durch Erhöhen der Ammoniumsulfat- Konzentration auf 45%, was zu einer Ausfällung des aktiven α-amidierende Enzyms führt.
Die immobilisierten Gelpartikel sind für eine Batch-α- Amidierungsreaktion geeignet, wo die Partikel mit einem mechanischen Rührer in Suspension gehalten werden. Nachdem die enzymatische Reaktion vollständig ist, läßt man die Partikel absetzen und der Überstand, welcher das amidierte Peptidprodukt enthält, wird dekantiert. Dieses Verfahren ist nicht optimal für Reaktionen im größeren Maßstab. Die enzymhaltigen Gelpartikel sind nicht steif genug, um sie in eine Säule zu packen und vernünftige Strömungsgeschwindigkeiten zu erhalten. Um dieses Problem zu umgehen, sind zwei alternative Ansätze möglich:
1. Man läßt das Gel in der Gegenwart von Glaskügelchen polymerisieren; typischerweise eine Minute vor dem Gelierpunkt werden Glaskügelchen zur Reaktionsmischung zugegeben und mit einem mechanischen Rührer gerührt, bis die Kügelchen mit einer Schicht PAN-Lösung überzogen sind. Die Strömungseigenschaften dieses zusammengesetzten Materials sind viel besser als die der Gelpartikel alleine.
2. Alternativ werden die PAN-Partikel mit der Filtrationshilfe Celite 545 gemischt. Typischerweise wird eine Mischung von PAN und Celite hergestellt, wobei PAN weniger als 8% w/w (Trockengewicht) der Mischung darstellt. Um diesen Säulentyp herzustellen, werden die Gelteilchen in 50 mM Tris: HCl pH 7,0 suspendiert und unter konstantem Rühren wird das Celite 545 hinzugegeben und man läßt es zwei Stunden mischen. Eine Säule wird mit dieser Aufschlämmung (3 · 40 cm) gepackt und die Säulentemperatur bei 37ºC gehalten, um die Amidierungsreaktion zu erleichtern. Unter Verwendung dieses Ansatzes wird eine Strömungsgeschwindigkeit von 8-10 Liter/Tag aufrechterhalten.
Eine attraktive Alternative zur Säulenchromatographie ist die Verwendung eines tangentialen Strömungssystems. Das PAN-Polymer vor dem Gelierpunkt wird über ein Blatt Polysulfonträger mit 0,45 um Poren gegossen. Auf die Gelbildung folgend kann das Blatt geschnitten werden, um in Millipore- oder New Brunswick-tangentiale Strömungsultrafiltrationseinheiten zu passen. Bei diesem Design werden die zusammengesetzten Blätter aus Polysulfon- PAN-immobilisiertem Enzymgel in Schichten gestapelt, was zu einem enormen Anstieg des Oberflächenbereichs führt. Dieser Ansatz kann direkt auf Strömungsgeschwindigkeiten, welche Liter pro Minute erreichen, im Maßstab vergrößert werden. Dieser Systemtyp liefert auch ein bequemes Verfahren zum Recyclen der Reaktionsmischung, um die Amidierung des Peptidsubstrates zu maximieren.
Die Vorteile, welche durch Immobilisierung des α- amidierenden Enzyms erbracht werden, schließen Wiederaufbereitung und Wiederverwendung des Enzyms ein. Zweitens erhöht die immobilisierte Matrix die Enzymstabilität und liefert eine Arbeitsform des Enzyms, welche zu Amidierungsreaktionen in gropßem Maßstab (Gramm bis Kilogramm Substratmenge) über ausgedehnte Zeiträume in der Lage ist.

BEISPIEL 12

Präparation einer Immunoaffinitätssäule zur Reinigung von unreinen alpha-Amidierungsenzymzusammensetzungen

A. Immobilisierungsverfahren:

Die verwendete Immobilisierungsmatrix war Cyanbromidaktivierte Sepharose 4B (Pharmacia). Das trockene Gel wurde zuerst mit 1 mM Hcl (200 ml/Gramm Harz) gewaschen, um zu quellen und den festen Träger zu waschen. Ungefähr 40 mg gereinige polyklonale Antikörper, aus Hühnereigelb gereinigt, wurden gegen 100 mM NaHCO&sub3; pH 8,3, enthaltend 0,5 M NaCl, dialysiert. Die Verbindung wurde unter Verwendung von 8 ml des zuvor gequollenen und gewaschenen festen Trägers durchgeführt. Die Reaktion wurde drei Stunden bei Raumtemperatur in 100 mM Natriumbicarbonat- Puffer pH 8,3 durchgeführt, welcher 500 mM NaCl enthielt, um nicht-spezifische Bindung des Proteins zum festen Träger zu verringern. Die übrigen aktiven Gruppen des Gels wurden blockiert unter Verwendung von 0,2 M Glycin. Auf den Blockierungsschritt folgend wurde das Gel vier bis fünf Mal gewaschen, unter Verwendung eines Zyklus von Puffern mit hohem und niedrigem pH (hoher pH Puffer 100 mM NaHCO&sub3; pH 8,3 + 500 mM NaCl, niedriger pH Puffer 100 mM Acetat pH 4,0 + 500 mM CaCl). Diese Waschschritte entfernten jegliches ungebundenes Protein und Blockierungsreagenz (Glycin) vom Harz. Das Immunoaffinitätsharz wurde bei 4ºC in einem basischen pH Puffer gelagert, welcher Merthiolat als ein bakteriostatisches Agens enthielt. Die ganze nachfolgende Immunoaffinitätschromatographie wird bei 4ºC durchgeführt. Ein ähnliches Verfahren kann dazu verwendet werden, gereinigte monoklonale Antikörper zu immobilisieren.

B. Immunoaffinitätschromatographie:

Die Immunoaffinitätssäule wird als ein alternativer Hochleistungsschritt in der Reinigung des α-AE verwendet. Gewebekulturmedium von CA-77 Zellen (siehe Beispiel 4) wird mit destilliertem Wasser verdünnt und durch eine DEAE- Anionenaustauschpatrone gepumpt, welche zuvor mit 20 mM Bis Tris-HCl pH 6,0 equilibriert wurde. Das α-amidierende Enzym wird aus der Patrone mit 50 mM Tris: HCl pH 7,0, welches 500 mM NaCl enthält, eluiert. Die Fraktionen, welche α-AE- Aktivität enthalten, werden entweder dialysiert gegen Tris: HCl pH 7,0 Puffer oder weiter gereinigt unter Verwendung der Gelfiltrationschromatographie (Beispiel 4) vor der Immunoaffinitätschromatographie. Proben, welche α- AE enthalten, werden über die Immunoadsorptionssäule bei neutralem pH geleitet. Die Antikörper binden spezifisch α- amidierendes Enzym, während kontaminierende Proteine nicht gebunden werden und im Eluent entfernt werden. Die α-AE- Aktivität kann aus der Säule eluiert werden unter Verwendung von 100 mM Glycin : HCl Puffer pH 3,0 (andere Desorptionsagenzien enthaltend Harnstoff, Dioxan, Ethylenglycol und NaJ können verwendet werden). Die Fraktionen werden gesammelt in 1,0 M Tris : HCl pH 7,0, um das Puffersystem zu neutralisieren und dadurch die α-AE- Aktivität zu bewahren.

ZUSAMMENFASSUNG

Alpha-amidierende Enzymzusammensetzung und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren für die Herstellung eines alpha-amidierenden Enzyms, umfassend die Schritte des Bereitstellens einer DNA-Sequenz, die für ein alpha-amidierendes Enzym codieren kann, Ligieren der DNA- Sequenz in einen Expressionsvektor, Induzieren einer Transformation des Expressionsvektors in eine Wirtszelle, die die DNA-Sequenz exprimieren kann, und präferentielles Auswählen von Wirtszellen, die die DNA-Sequenz aufweisen und exprimieren, und einen gentechnisch modifizierten Mikroorganismus, welcher mindestens eine präferentiell ausgewählte Wirtszelle durch solch ein Verfahren enhält.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines alpha-amidierenden Enzyms, umfassend die Schritte des Bereitstellens einer DNA-Sequenz, die für ein alpha-amidierendes Enzym codieren kann, Ligieren der DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, Induzieren einer Transformation einer Wirtszelle, die die DNA-Sequenz exprimieren kann, mit dem Expressionsvektor und präferentielles Auswählen von Wirtszellen, die die DNA-Sequenz aufweisen und exprimieren, worin die DNA-Sequenz mit mindestens einer der Sequenzen von mindestens zwei Sonden hybridisiert:

AE1 = 3'-TTACTCACGG ACCCGTGGTA ACCGGGA/TCAC/G TGGGGGGACC TACG-5',

AE8 = 3'-AC/ICCG/ITGG/ITA A/ICCG/IGGA/ICAC/I TG-5',

AE4 = 3'-TTA/GCCG/TGTC/TA CCTG-5',

AE5 = 3'-TTA/GCCG/AGTC/TA CCTG-5',

AE6 = 3'-TACGTC/TGGIC CIAGICTG/AGT C/TTT-5',

AE7 = 3'-TACGTC/TGGIC CITCA/GCTG/AGT C/TTT-5',

AE10 = 3'-CTG/AGTCTTG/AG TG/AAA-5',

AE11 = 3'-CTG/AGTTTTG/AG TG/AAA-5',

AE9 = 3'-AAA/GCAC/ITGC/IG TC/TACCCCC/ICT-5',

welche zur Identifizierung der Sequenz verwendet werden kann, worin jede Sonde ein Gemisch von Sequenzen umfaßt, und Exprimieren des Enzyms.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sonden ausgewählt werden aus AEB, AE9, AE4 und AE5.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Wirtszelle, die transformiert wird, eine E. coli-, Hefe- oder eukaryontische Zelle ist.

4. Genetisch manipulierter Mikroorganismus, umfassend mindestens eine präferentiell ausgewählte Wirtszelle, die entsprechend dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt wurde.

5. Wirtszelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

6. Wirtszelle nach Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz im wesentlichen identisch mit derjenigen eines Rattengens ist, das für die Peptidylglycin α-amidierende Monooxygenase codiert.

Wirtszelle nach Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz für ein α-amidierendes Enzym codiert, mit einem scheinbaren Molekulargewicht zwischen 60.000 und 65.000 Dalton, gemessen durch Gelfiltrationschromatographie und zwischen 73.000 und 75.000 Dalton, gemessen durch Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamidgel.

8. Wirtszelle nach Anspruch 5, worin die DNa-Sequenz im wesentlichen identisch mit einem Säugergen ist, das für eine Peptidylglycin α-amidierende Monooxygenase codiert.

9. Wirtszelle nach Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz im wesentlichen identisch mit einem medullären Rattenthyroidkarzinomgen ist, das für eine Peptidylglycin α- amidierende Monooxygenase codiert.

10. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin die DNA-Sequenz für ein α-amidierendes Enzym mit einem sauren pH- Optimum codiert.

11. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 5 bis 10, worin die DNA-Sequenz für eine Aminosäuresequenz codiert, die mindestens ein Fragment enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) -Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro- Val-Thr-Pro-Leu-Asp-Ala-Ser-Asp-Phe-Ala-Leu-Asp- Ile-Arg-Met-Pro-;

(b) -Ser-Met-Gln-Pro-Gly-Ser-ASp-Gln-Asn-His-Phe-Ser- Gln-Pro-Thr-;

(c) -Asn-Gly-Gln-Trp-Thr-Leu-Ils-Gly-Arg-; und

(d) -Phe-Val-Thr-Gln-Tn-Gly-Glu-.

12. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 5 bis 11, worin die DNA-Sequenz mindestens ein Fragment enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

und (b)

13. Wirtszelle nach Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz identisch mit der des medullären Rattenthyroidkarzinomgens ist, das für eine Peptidylglycin α-amidierende Monooxygenase codiert die ein saures pH-Optimum und ein Molekulargewicht zwischen 60.000 und 65.000 Dalton, gemessen durch Gelfiltrationschromatographie, aufweist.

14. Mikroorganismus nach Anspruch 4, worin die DNA-Sequenz wie in einem der Ansprüche 6 bis 13 definiert ist.

15. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein alpha-amidierendes Enzym codieren kann, wobei die Sequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 12 definiert ist.

16. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 15, umfassend die vollständige Nukleotidsequenz oder einen Teil davon, ausgewählt aus:

und

oder eine homologe Sequenz, umfassend Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die die Funktion des codierten Enzyms nicht grundlegend beeinflussen.

17. Verfahren zum Herstellen von α-amidierten Produkten, umfassend das Inkontaktbringen eines Substrats, das einen C- terminalen Glycinrest aufweist, mit einem α-amidierenden Enzym, das gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 bis 3 oder von Wirtszellen nach einem der Ansprüche 4 bis 14 hergestellt wurde, und hiernach Gewinnen des amidierten Produkts.

18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 oder 17, worin das α- amidierende Enzym eine spezifische Aktivität von mindestens 1500 mU/mg Protein aufweist.

19. Rekombinantes alpha-amidierendes Enzym, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die DNA-Sequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 6 bis 12 definiert ist.