PT2621519T - Polipéptido de fusão de leptina-abd com duração de ação melhorada - Google Patents

Description

ιο i»D i

DESCRIÇÃO

POLIPEPTIDO DE FUSÃO DE LEPTINA-ABD COM DURAÇÃO DE AÇÃO

MELHORADA

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido n- US 61/387.402 depositado em 28 de setembro de 2010 e do Pedido

n2 US 61/422.091 depositado em 10 de dezembro de 2010. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O presente pedido refere-se a compostos que têm boa duração de ação, alta potência e/ou regimes de dosagem convenientes, incluindo administração oral, e a métodos de utilização dos mesmos. São fornecidos no presente documento polipéptidos manipulados que incorporam um domínio de ligação à albumina em combinação com um péptido biologicamente ativo. Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria, acredita-se que, devido aos polipéptidos manipulados descritos no presente documento poderem ligar-se à albumina, os compostos podem ser sequestrados (por exemplo, ligados à albumina) enquanto na circulação, o que leva ao aumento da duração de ação devido, por exemplo, à diminuição de depuração e/ou degradação renal. As doenças alteráveis para tal tratamento incluem lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, excesso de peso, Gbesidade, amenorreia liipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes (incluindo tipo I e tipo II) , esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAE'LD) , síndrome metabólica X e doença de Huntington ou combinações das mesmas.

Permanece uma necessidade de desenvolver polipéptidos úteis nas doenças, afeções e distúrbios metabólicos descritos acima. Consequentemente, é um objetivo da presente invenção fornecer polipéptidos manipulados com ιο i»D i meias-vidas prolongadas úteis para tratar as afeções acima e métodos para produzir e utilizar os mesmos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO São fornecidos compostos de polipéptido manipulado que têm afinidade de ligação para albumina e uma utilidade terapêutica adicional. Os compostos são polipéptidos manipulados que incluem um polipéptido de domínio de ligação à albumina (ABD) com capacidade para se ligar à albumina e um polipéptido de domínio de hormona (HD), cujos polipéptidos de HD podem ser biologicamente ativos e podem produzir uma resposta biológica benéfica, em ligação covalente com o ABD. Qualquer um de entre os polipéptidos de ABD ou HD descritos no presente documento pode ser ligado de modo opcionalmente covalente ao polipéptido manipulado através e um ligante L, por exemplo, Ll, conforme descrito no presente documento. Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria, acredita-se que, devido aos polipéptidos manipulados descritos no presente documento poderem ligar-se à albumina, os compostos podem ser sequestrados num sujeito, o que leva ao aumento de duração de ação no sujeito. A invenção é definida nas reivindicações.

Num primeiro aspeto, é fornecido um polipéptido manipulado conforme descrito no presente documento. 0 polipéptido manipulado inclui um polipéptido de domínio de ligação à albumina (ABD) e um domínio de hormona (HD1). 0 domínio de hormona inclui um polipéptido que é uma leptina, um análogo de uma leptina ou um fragmento ativo da mesma. NGutrG aspeto, é fornecido um método para tratar uma doença ou distúrbio num sujeito que precisa de tratamento. 0 método inclui administrar um polipéptido manipulado, conforme descrito no presente documento, ao sujeito.

Ainda noutro aspeto, é fGrnecida uma composição farmacêutica que inclui um composto de polipéptido manipulado descrito no presente documento em combinação com ιο i»D i um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Ainda noutro aspeto, são polinucleótidos que codificara o polipêptido manipulado e seus intermediários, 'vetor de expressão que contém tais polinucleótidos, células hospedeiras que expressam tais polinucleótidos e meios para sua expressão, síntese, modificação pós-translacional e isolamento, £/ΐν£ΐ V £1 v K..X. j-J 3¾yj!^

As Figuras IA e 1B retratam os efeitos de uma administração única de polipéptidos manipulados, conforme descritos no presente documento, na ingestão de alimentos e no peso corporal mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 3. Figura IA: ingestão de alimentos. Figura 1 B: alteração no peso corporal (% de veículo corrigido). Legenda: Veículo (caixa); Composto 1 em 2,6 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Composto 2 em 2,7 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Composto 4 em 2,7 mg/kg (diamante); Composto C2 em 10 mg/kg (círculo)

As Figuras 2A a 2B retratam os efeitos de uma administração única de polipéptidos manipulados, conforme descritos no presente documento, na ingestão de alimentos e no peso corporal mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 4. Figura 2A: ingestão de alimentos. Figura 2B: alteração no peso corporal (% de veículo corrigido). Legenda: Veículo (caixa); Composto 2 em 0,3 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Composto 2 em 1,0 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Composto 2 em 3,0 mg/kg (diamante)

As Figuras 3A e 3B retratam os efeitos de uma administração única de polipéptidos manipulados, conforme descritos no presente documento, na ingestão de alimentos e no peso corporal mediante a administraçâG a ratGS magros conforme descrito no Exemplo 5. Figura 3A: ingestão de alimentos. Figura 3B: alteração no peso ιο i»D i corporal (% de veículo corrigido). Legenda: Veículo (caixa); Composto C2 em 1,1 mg/kg (círculo); Composto C2 em 3,3 mg/kg (caixa); Composto C2 em 11,1 mg/kg (triângulo cora a ponta para cima) .

As Figuras 4A e 4B retratam os efeitos de uma administração única de polipêptidos manipulados descritos no presente documento, e de um composto de controlo, na ingestão de alimentos e no peso corporal mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 6. Figura 4Ά: ingestão de alimentos. Figura 4B: alteração no peso corporal (% de veículo corrigido). Legenda: Veículo (caixa); Composto C6 em 2,2 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo). A Figura 5 retrata os efeitos de administração semanal de SEQ ID NO: 54 no peso corporal (% de linha de base) mediante a administração a ratos DIO conforme descrito no Exemplo 7. Legenda: Veículo (caixa); Composto 2 em 1,3 mg/kg por injeção (triângulo com a ponta para cima).

As Figuras 6A e 6B retratam a deteção e quantificação de níveis de plasma de SEQ ID NO: 33 (Figura 6A) e SEQ ID NO: 54 (Figura 6B) mediante a administração a ratGS DIO conforme descrito no Exemplo 8. A Figura 7 retrata os efeitos de uma administração única dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento na alteração no peso corporal (% de veículo corrigido) mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 9. A Figura 8 retrata os efeitos de uma administração única dos polipéptídGS manipulados indicados descritos no presente documento na alteração no peso corporal (% de veículo corrigido) mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 10.

As Figuras 9A e 9B retratam os efeitos de uma administração única dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento na ingestão de ιο i»D i alimentos e na alteração no pesG corporal (% de veículo corrigido) mediante a administração a ratos conforme descrito no Exemplo 11. Figura 9A: ingestão de alimentos. Figura 4B: alteração no peso corporal (% de veículo corrigido). A Figura 10 retrata os efeitos de uma administração única dos polipéptidos manipulados indicados descritos no presente documento na ingestão de alimentos e na alteração no peso corporal (% de veículo corrigido) mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 12.

As Figuras 11A até 11B retratam os efeitos de uma administração única dos polipéptidos manipulados indicados descritos no presente documento na ingestão de alimentos cumulativa (Figura 11A) e na alteração percentual no peso corporal (Figuras 11B e 11C) mediante a administração a ratos magros conforme descrito no Exemplo 13. A Figura 12 retrata a atividade funcional de leptina gerada pelo Composto 2 na presença de albumina, conforme descrito no Exemplo 15. A Figura 13 ilustra um perfil de concentração de plasma versus tempo prolongado do Composto 2 em ratos após uma injeção subcutânea de acordo com o Exemplo 16. A Figura 14 ilustra um perfil de concentração de plasma versus tempo prolongado do Composto 15 em ratos após uma injeção subcutânea de acordo com o Exemplo 16. A Figura 15 retrata os efeitos de uma administração única dos polipéptidos manipulados indicados descritos no presente documento na alteração no peso corporal (% de veículo corrigido) mediante a administração a ratos magros (Figura 15A) e a ratos ZDF (Figura 15B) conforme descrito no Exemplo 17, A Figura 16 retrata os efeitos de economia de dose de administração semanal do Composto 2 no peso corporal (% ιο i»D i de linha de base) mediante a administração a ratos magrGS conforme descrito no Exemplo 18, A Figura 17 é um gráfico que retrata o efeito no peso corporal de administração de leptína (125 mg/kg/dia) e amílina (1,500 mg/kg/dia), sozinhas ou em combinação, em dois grupos de ratos: um grupo de ratos muito obesos e outro grupo com restrição de calorias à faixa de obesidade moderada. A Figura 18A é um gráfico que retrata um efeito no peso corporal da administração do Composto 2 (120 nmol/kg) e amilina de rato infundida (50 mg/kg/dia), sozinhos ou em combinação ao longo de quatro semanas. A Figura 18B é um gráfico que retrata um efeito no peso corporal da administração do Composto 2 (120 nmol/kg) e amilina de rato PEG (Amilina de Rato Des-Lysl-[Lys26(mPEG40K)]) (125 nmol/kg), sozinhos ou em combinação ao longo de quatro semanas. A Figura 19 retrata um efeito na ingestão de alimentos (Figura 19A) e no peso corporal (Figura 19B) da administração do Composto 15 (120 nmol/kg) e amilina (50 mg/kg/dia), sozinhos ou em combinação ao longo de quatro semanas. A Figura 20 é um gráfico que retrata um efeito no peso corporal da administração do Composto 15 (120 nmol/kg) e amilina de rato PEG (Amilina de Rato Des-Lysl-[Lys26(mPEG40K)]) (125 nmol/kg), sozinhos ou em combinação ao longo de quatro semanas. A Figura 21A retrata um efeito no peso corporal da administração de leptina e amilina, sozinhas ou em combinação ao longo de quatro semanas, em ratos moderadamente obesos. A Figura 21B retrata a falta de um efeito no peso corporal da administração de leptina e amilina, sozinhas ou em combinação ao longo de quatro semanas, em ratos gravemente obesos. A Figura 21C retrata um efeito no peso corporal da administração do Composto 2 ιο i»D i (120 nmol/kg) e amilina de ratG PEG (Amilina de Rato Des-Lysl-[Lys26(mPEG40K)]) (125 nmol/kg), sozinhos ou em combinação ao longo de quatro semanas, em ratos gravemente obesos. A Figura 22 retrata um efeito no peso corporal da administração de: (A) Composto 15 (120 nmol/kg) ou (B) Composto 2 (120 nmol/kg) e amilina (50 mg/kg/dia), sozinhos ou em combinação ao longo de quatro semanas, em ratos gravemente obesos. A Figura 23 retrata os efeitos dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento na glicose no sangue mediante a administração a ratinhos TIDM induzidos com STZ conforme descrito no Exemplo 30. A Figura 24 retrata os efeitos dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento na Hemoglobina A1C mediante a administração a ratinhos T1DM induzidos com STZ conforme descrito no Exemplo 30. A Figura 25 retrata os efeitos dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento na ingestão de alimentos e no peso corporal mediante a administração a ratinhos T1DM induzidGS com STZ conforme descrito no Exemplo 30. A Figura 26 retrata os efeitos dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento, com e sem uma baixa dose de insulina, na glicose no sangue mediante a administração a ratinhos T1DM induzidos com STZ conforme descrito no Exemplo 30. A Figura 27 retrata os efeitos dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento, com e sem uma baixa dose de insulina, na Hemoglobina A1C mediante a administração a ratinhos T1DM induzidos com STZ conforme descrito no Exemplo 30. A Figura 28 retrata cs efeitos dos polipêptidos manipulados indicados descritos no presente documento, com e sem uma baixa dose de insulina, na ingestão de ιο i»D i alimentos (% de veículo corrigido) e na alteração no peso corporal {% de veículo corrigido) mediante a administração a ratinhos T1DM induzidos com STZ conforme descrito no Exemplo 30. DESCRIÇÃO DETALHADA DA IHVEHÇÃG I. Definições "Obesidade" e "excesso de peso" referem-se a mamíferos que têm um peso maior do que o normalmente esperado e podem ser determinados, por exemplo, pela aparência física, índice de massa corporal (BMI) conforme conhecido na técnica, razões de circunferência entre cintura e quadril, espessura da dobra de pele, circunferência da cintura e semelhantes. Os Centros para Controlo e Prevenção de Doenças (CDC) definem o excesso de peso como um ser humano adulto que tem um BMI de 25 a 29,9; e definem obeso como um ser humano adulto que tem um BMI de 30 ou mais. Métricas adicionais para a determinação de obesidade existem. Por exemplo, o CDC determina que uma pessoa com uma razão entre cintura e quadril maior do que 1,0 está com excesso de peso. "Massa corporal magra" refere-se à massa livre de gordura do corpo, isto é, o peso corporal total menos o peso da gordura corporal é a massa corporal magra. A massa corporal magra pode ser medida por métodos tais como ponderação hidrostática, câmaras computadorizadas, absortometria por raios X de dupla energia, pinças de pele, imagens por ressonância magnética (MRI) e análise de impedância bioelétrica (BIA) conforme conhecido na técnica. "Mamífero" refere-se a animais de sangue quente que têm geralmente pelugem ou pelo, que dão à luz a sua progénie e que alimentam a sua progénie com leite. Mamíferos incluem seres humanos,* animais de estimação (por exemplo, cães, gatGs); animais de quinta (por exemplo, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, cabras); animais selvagens,· e semelhantes. Numa forma de realização, o ιο i»D i mamífero é uma fêmea. Numa forma de realização, o mamífero é um ser humano do sexo feminino. Numa forma de realização, o mamífero é um gato ou cão. Numa forma de realização, o mamífero é um mamífero diabético, por exemplo, um ser humano que tem diabetes tipo 2. Numa forma de realizaçâG, o mamífero ê um mamífero diabético obeso, por exemplo, um mamífero obeso que tem diabetes tipo 2. 0 termo "sujeito" no contexto dos métodos descritos no presente documento refere-se a um mamífero. "Fragmento", no contexto dos polipéptidos, refere-se no presente documento no sentido químico habitual a uma porção de um polipéptido. Por exemplo, um fragmento pode resultar da deleçâG N-terminal ou deleçâG C-terminal de um ou mais resíduos de um polipéptido progenitor e/ou um fragmento pode resultar da deleção interna de um ou mais resíduos de um polipéptido progenitor. "Fragmento", no contexto de um anticorpo, refere-se a uma porção de um anticorpo que pode ser ligada a uma molécula biologicamente ativa para modular a solubilidade, distribuição dentro de um sujeito e semelhantes. Por exemplo, a leptina A200 descrita no presente documento é um conjugado de um fragmento de anticorpo Fc com uma leptina, conforme conhecido na técnica. Veja-se, por exemplo, os documentos n9 WO 98/28427 e n-9- US2007/002084. 0 termo "progenitor" no contexto de polipéptidos refere-se, no sentido habitual, a um polipéptido que serve como uma estrutura de referência antes da modificação, por exemplo, inserção, deleção e/ou substituição. 0 termo "conjugado" no contexto de polipéptidos manipulados descritos no presente documento refere-se à ligação covalente entre polipéptidos de componente, por exemplo, ABD, HD1 e semelhantes. 0 termo "fusão" no contexto de polipéptidos manipulados descritos no presente documento refere-se à ligação covalente entre polipéptidos de componente, por exemplo, ABD, HD1 e semelhantes, por meio de um ou ambos os grupos funcionais ιο i»D i de amino terminal ou carboxi da cadeia principal de péptido. Polipéptidos manipulados podem ser produzidos de forma sintética ou recombinante. Tipicamente, as fusões são feitas com a utilização de biotecnologia recombinante, no entanto, também pGdem ser feitas por síntese química e métodos de conjugação conhecidos na técnica. "Análogo", conforme utilizado no presente documento, no contexto de polipéptidos, refere--se a um composto que tem inserções, deleções e/ou substituições de aminoãcidos em relação a um composto progenitor. Um análogo pode ter estabilidade, solubilidade, eficácia, meia-vida e semelhantes superiores. Em algumas formas de realização, um análogo é um composto que tem pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou até mesmo mais de identidade de sequência com o composto progenitor. "Identidade", "identidade de sequência" e semelhantes, no contexto de comparação de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipéptidos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoãcido ou nucleôtidos que são iguais (isto é, cerca de 50% de identidade, de preferência, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% gu mais de identidade em relação a uma região especificada, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima numa janela de comparação ou região designada) conforme medido com a utilização de um algoritmo de comparação de sequência conforme conhecido na técnica, por exemplG, BLAST ou BLAST 2.0. Esta definição inclui as sequências que têm deleções e/ou adições, assim como aquelas que têm substituições, assim como variantes de ocorrência natural, por exemplo, polimórficas ou alêlicas e variantes artificiais. Nos algoritmos preferenciais, considera-se lacunas e semelhantes, conforme conhecido na técnica. Para ιο i»D i comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual sequências de teste são comparadas. Ao utilizar um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e referência sâG inseridas num computador, coordenadas de subsequência são designadas se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. De preferência, parâmetros de programa padrão podem ser utilizados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. 0 algoritmo de comparação de sequência calcula, então, as identidades de sequência percentuais para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa. 0 alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, 1988, Proc.

Nat'1. Acad. Sei. EUA 85:2.444, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis.) ou pelo alinhamento manual e pela inspeção visual. Veja-se, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)). Os exemplos preferenciais de algoritmos que são adequados para determinar a identidade de sequência percentual e a semelhança de sequência incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 que são descritos em Altschul et al., 1977, Nuci. Acids Res. 25:3.389 a 3.402 e Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403 a 410. BLAST e BLAST 2.0 são utilizados, conforme conhecido na técnica, para determinar a identidade de sequência percentual para gs ácidos nucleicos e prGteínas da invenção. Software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível através do sítio da Web do Centro Nacional para Informações ιο i»D i de Biotecnologia. Este algoritmo envolve, primeiramente, identificar pares de sequência de alta pontuação (HSPs) identi ficando-se palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta que se correlacionam ou satisfazem alguma pontuação limite com valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência de banco de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et al., Id.). Estes acertos de palavra de vizinhança iniciais atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que contêm os mesmos. Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência até ao ponto em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas com a utilização, por exemplo, para sequências de nucleõtidos, dos parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre <0) . Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é utilizada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou o final de cada sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleõtidos) utiliza como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expetativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação entre ambas as estirpes. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como padrões um comprimento de palavra de 3 e expetativa (E) de 10 e os alinhamentos de matriz de pontuação BLOSUM62 (veja-se Henikoff &amp;. Henikoff, ιο i»D i 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915) (B) de 50, expetativa (E) de 10, M:=5, N=-4 e uma comparação entre arnbas as estirpes. O termo "cerca de" no contexto de urn valor numérico refere-se a + /- 10% do valor numérico, a não ser que expressamente indicado de outro modo.

Os termos "péptido" e "polipéptido" no contexto de componentes dos polipéptidos manipulados descritos no presente documento são sinónimos. II. Compostos

Num primeiro aspeto, são fornecidos compostos de polipéptido manipulado que incluem um polipéptido de domíniG de ligação â albumina (ABD) e pelo menos um domínio de hormona de polipéptido (HD1). Os termos "domínio de ligação à albumina”, "ABD" e semelhantes referem-se a polipéptidos com capacidade para se ligarem à albumina conforme descrito no presente documento. Os termos "domínio de hormona", "polipéptido de domínio de hormona" e semelhantes referem-se ao polipéptido com capacidade para produzir uma resposta biológica num sujeito. Domínios de hormona exemplificativos incluem, porém, sem limitação, uma leptina, um análogo de uma leptina ou um fragmento ativo da mesma, mas poderia ser um derivado de leptina, tal como um derívado PEGui1ado.

Verificou-se, surpreendentemente, que uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento de leptina ativo ou um derivado de leptina do mesmo pode ser fundido num domínio de ligação à albumina de afinidade muito alta (ABD) derivado dos domínios de ligação à albumina de proteínas bacterianas conforme descrito no presente documento, enquanto retém atividade biológica de leptina suficiente e tem uma duração de ação prolongada, por exemplo, de pelo menos 3 dias e até 5 dias num roedor, o que se traduz em pelo menos uma duração de uma semana ou mais num sujeito humano. Isto foi surpreendente em parte devido a tais ιο i»D i péptidos de ABD não terem sido extensivamente demonstrados como sendo uma plataforma robusta como um veículo de proteína terapêutico, serem relativamente hidrofóbicos, o que poderia interagir adversamente com um péptido terapêuticG fixado e não terem capacidade para atuar como um veículo para pelo menos uma família de hormonas peptídicas. Por exemplo, compostos de amilina de rato (por exemplo, SEQ ID NO :108), quando conjugados ou f undidos aos ABDs descritos no presente documento, nâo exibiram qualquer atividade in vivo significativa ou de longa atuação nos modelos de roedor nos quais se verificou-· que vários construtos de polipéptido manipulado com leptina da invenção eram atívGS e com longa duração de ação.

Componentes biologicamente ativos. Componentes de composto biologicamente ativo contemplados para utilização nos compostos e métodos descritos no presente documento incluem leptinas. Os termos "composto biologicamente ativo" e semelhantes referem-se, no sentido habitual, a compostos, por exemplo, polipéptidos e semelhantes, que podem produzir uma resposta biológica.

Leptinas. "Leptinas" e "uma leptina" significam: leptinas, fragmentos ativos de leptina, análogos de leptina e derivados de leptina; e uma leptina, um fragmento ativo de leptina, um análogo de leptina e um derivado de leptina; respeitosamente. Consequentemente, a nâG ser que notado de outro modo, a referência a "leptinas" destina-se a leptinas, fragmentos ativos de leptina, análogos de leptina e derivados de leptina, conforme divulgado no presente documento. De mGdo semelhante, a não ser que notado de outro modo, a referência a "uma leptina" destina-se a abranger uma leptina, um fragmento ativo de leptina, um análogo de leptina e um derivado de leptina, conforme divulgado no presente documento. Tais leptinas exemplificativas que podem ser empregadas no projeto, na preparação e na utilização dos polipéptidos manipulados ιο i»D i

divulgados no presente documento incluem aquelas que produzem uma ou mais respostas biológicas conhecidas na técnica por serem produzidas quando as leptinas são administradas a sujeito (veja-se, por exemplo, os Pedidos de Patente publicados n2 US 2007/0020284 e n2 US 2008/0207512, as Patentes n2 U.S. 6.309.853 e n£ US 7.183.254 e os Pedidos Publicados PCT n- WO 96/005309, n- WO 98/28427 e n2· WO 2009/064298 ), tais como: redução da

ingestão de alimentos, redução do peso corporal, redução de ganho de peso corporal, indução de saciedade, redução da disponibilidade calórica, redução da eficácia calórica, redução do platô metabólico, aumento na sensibilidade à insulina, redução da hiperlipidemia, correção da dislipidemia, redução da hipertrigliceridemia, atenuação da obesidade, atenuação do excesso de peso, atenuação da diabetes mellitus (incluindo diabetes tipo I, diabetes tipo II e diabetes gestacional), atenuação da resistência à insulina, atenuação das afeções de lipodistrofia associadas às mesmas, assim como outras respostas biológicas conhecidas na técnica por serem produzidas mediante a administração de uma leptina (veja-se, pGr exemplo, os Pedidos de Patente publicados n2 US 2007/0020284 e n2 US 2008/0207512, as Patentes n- U.S. 6.309.853 e n- US 7.183.254 e os Pedidos Publicados PCT n2 WO 96/005309, n2 WO 98/28427 e n2 WO 2009/064298}.

As leptinas exemplificativas adequadas para o projeto, a preparação e a utilização dos polipéptidos manipulados descritos no presente documento incluem, porém, sem limitação, os compostos descritos nas Patentes n2 US

5.594.101, n2 US 5.851.995, n2 US 5.691.309, n- US

5.580.954, n2 US 5.554.727, n2 US 5.552.523, n2 US

5.559.208, n2 US 5.756.461, n2 US 6.309.8 5 3, no Pedi do de patente publicado n2 US 2007/0020284 e nos Pedidos Publicados PCT n2 WO 96/23517, n2 WO 96/005309, n2 WO 98/28427, n- WO 2004/039832, n2 WO 98/55139, n2 WO 98/12224 ιο i»D i e n~ WO 97/02004. Os métodos para testar as atividades de leptina e respostas biológicas in vitro e in vivo, que incluem saciedade, atividade de inibição de ingestão de alimentos e atividade de perda de peso, são conhecidos na técnica e são descritos no presente documento e também nas referências acima e noutras referências citadas no presente documento.

Qualquer leptina, análogo de leptina, fragmento ativo de leptina ou derivado de leptina conhecido na técnica pode ser empregue a fim de preparar e utilizar polipêptidos manipulados conforme divulgado em todo o presente documento. Leptinas representativas, análogos de leptina, fragmentos ativos de leptina e derivados de leptina contemplados para utilização nos polipêptidos manipulados e métodos descritos no presente documento também incluem os seguintes:

Leptinas murmas ^isdures« VPSQKVQODTK:ÍL5KI?VTRfNOSSHT-Xsa-SVSSKQKVTGtOF[PGL.HP:iLTLSKMOQTLA V¥qQ{L?S^PSRHV'ÍQSSMDLE^LROLU«LAFSKISCHLPQASGtEn.ESU3GV'LEASGY STi:WM.SRLQdSLQDW.QQLD!.SPeC , em que Xaa na posição 28 é 0 ou ausente (SEQ » NO:1>

Forma 1 de leptina murina madura: OVSW-nsrO ID SO no,,,.

Forma 2 de leptina murina madura: WíQKVQDDFI01,liaiXlKFSTíBifr5VSAKQR\TeLDHmLf.MULSIÍMlKptAWQ (iSEQ ID SO: 144), T.jSâní* 1 rs s e n ^ « a « w s^iivae t** auís to a Ή ι “> «« y> v»e« *t irt a Ί · M Ví Ja k? AUv&amp;JLi nlJljiM· k? Um k? WWlw* *HÍi>r5 >JL VU wiv JULCd. All V ^ w Jw 41 .AV¥CKlll-1'SM^aSVIÇF5S^Diil\LRÍ.>Í.L.HYLAI'mSCefK/AS(5:LBTLl;SI.,Ci<iVLEAEG ¥BTtV VÁLSE.{-Í^líSlf|l5MLQQI-iM^SI^Kl s em que Xn na posição 2$ é Q ou ausente (SEQ ID NO:2)

Forma 1 de leptina murina madura com metionina n~ terminal:

MVPíQIIVQI>IJr01JrriV'rRI¥DISffi'QSVSAKí|:RVKil.J>et«Le^tSI,:SK:MIX?'f'LAV ^/QVLl'StFSQNVLQlANOilJNLROLLDLLA^DSCBLFQTSCsLQlCFESUKlVLIiAStYS TEVVALSRt;qÇlÍl.^R.QQtO¥RFtp |RRQ IDMtlASA

Forma 2 de leptina murina madura com metionina n~ ιο i»D i terminal; qQVLTSU^QN¥tQláNBLlNLRI3iLtMttMmWLfQtSaL^CetíXW:LlASLYST IWAlSEtQOSLQDrm(|{J>VKC (S£Q © Υ€ΐΑ4ίΑ Leptina porcina madura;

WiWSVQODl £ ruk rr^l‘®MHM^VMK<p.t^2L»IFG£líFVLS.lM;MI>QfiAiy QQfim^SRK VitySKDLL NLtDlLeiLAIilCSCPirClARAiJTLISn Of»V L ÍÍÁSLYSIW VAtSgJjQCíAlAJDMLtQLDIJ^aC £SEQ IP AO:3>.

Leptina porcina madura com metionina n--terminal: MVFmiSVQMSTOliraVmBDISHMQSX-S-SKClRWCLDFlKiiiHWIJLS^MDQI^Al Y^iO'SiPS^AVIQISAi'M^Al.RDttliil.ASgKSCFLI^i^RALETLESLCAWtEASiYS'r.B YVALYEi.í^íALQOAILkCILPtSPGíI (SBQ IP ΧΟ;4γ Leptinas bovinas maduras : VPfôKVQDDTfCTtíKTiiVTRINiDÍSiHT-X^SrSVSSKQRVTíSlOFÍRSLíIPLLSieK^IDQlLál YQQlLlBLPSeHV¥QiaNDLENLRDLlHLLAASKaCPy3«VKALBBLÉBLeWÍ£ÃSL¥ST EVVALSRLQGSLQOyLRQLOLSPGC , em que Xaa na posição 28 é Q ou ausente (SEQ ID N0:5)

Leptinas bovinas maduras com metionina N-terminal; MVPOÍVQDDTKTLIKTIVTRIMDISHT-Xss-SVSSKQRVTGIDFPGLHPLLSLS^DQTL AIYQQiLISLPS:RNV¥QISKDLEMLR:DLLHLLAASKSCPLPQVRALESLE8LG¥VLEASLY STEWALSRLQ6SLQDMLRQLDLSPGC t em que Xaa na posição 29 é Q ou ausente (SEQ ID N0:6)

Leptina Humana de Comprimento Completo não Processada (isto éf inclui a sequência de sinal N~terminal com 21 resíduos); MIIWBlYC'GFLWLW^Yi:Y¥QAVPIQKV<I»^rrfLIOIVmiARI$ífFt|BVB$kÇp:Vltí tDflFCILBFIOLIkMD^rLAVYCXIILJSMFSRXVIQISAOLEXLlDLLeYtAESKBCIiLF WÁS«,mi^LCÍC)VLEABCIY SYEYVAtmiQGB^yMLWQiBLSiAjÇ pEQID AO; 1)

Leptinas humanas maduras (com a sequência de sinal com 21 aminoãcidos E~terminal removida); VP|Q|<VODOTKn,ÍKTIVTRS«OieH^sAasB¥SSKQKVTGlDFSPaiIP!LTieiíYOOT LAWQQÍLTSypSRNVlQiSMDLEiNLRDELHViAFSKSCÍCPWASGLETLDSLGCftAEAS OVeT^WALS^LOG'SL^D^LWQLDLSPGC em que: Xaa na posição 27 é T ou A: e Xaa na posição 28 é 0 ou ausente (SEQ 30 MQ:8),

Leptinas humanas maduras com metionina N-terminal: iiWPiaiiVQDOrS'i'i.iKiSYi'RF&amp;ilSH-Xaa-'Sm-SVSSKQK'/fGlD^Si-’GtHPilJiSItMDQ TLAVYQQATSMPSRMVIQiSWDLEftLttDLLÍftílArSKSCHLPWASGLErLDSLGGVLEA SGY5TEWALSR-Í.tXsSL QOMÍ.WQÍ.fA SFGC, em que: Xm na posição 28 é T ou A; e Xm im posição 23 é Q eu ausente (SEQ IS N0:9).

Leptina de Reso Madura: 'VÍ»iqE%fQSS’l^1XÍETIVTtlNI>ISílTQSV«Cp.VtI6mriKÍ:LlirV'LTLBQ^DC?TLA3:¥;Q QILSRLPSRNVIQISNDLEALASLy-MlAFSKSCRtFtASOI-ETmSIijRVLEASIASTEVY ALSRtQGSLQ»yLWQiC«<BPO€ fSFQ IO XCYíAl.

Leptina de Reso Madura com metionina N~terminal; crzoz is i ¥WyN'LFMN¥IQiS^PLg^LRfâ!Jjry.APEMCHLFLASÚLETLESLÍIO¥LEASLYSTg ¥¥Aim^m4P^|,WQiM,^PC^ m®. PTO ih Leptina de rato madura:

wiii^QiiOTTimmimiMis^wMWRWcitwwtíí^mmMSQmAVT

QQiSLTFLM(|^VLCílAMOiAFíLRBLLffilÁFS^SCSLPÇIMiLQ»MilKíVLEÃlL.YtFE WAmyKBiQ«^t»»K {Ssici m m>< m

Leptina de rato madura com metionina N-terminal:

MVPfHKVQDD-lICTOKTjVTMNÍií^ífrQSSÃASQRYlCiLOj^FCiyjH^LSKMOQtiAV

YQQILmFSQHVLQUmJvEMLRDLtm I AFAKSBIL^FMItOKIMStiXIVLEAftYIT

EvvAmi:.qm.cpiii:WsM.s.^c $bq ip m-.B}..

Leptina de ornitorrinco madura: A sequência de leptinas de ornitorrinco madura segue: JS«WOTmTTO?TOlQi^^<#¥$TO«¥mW»lNqOr^?«liAÍ>W|UAWQ pILSMFMFPETpypOMMXItFMlAlIXBCFFmilXItlMyEIWBílIViMLYSTEV WIBM Rk^t\\FiMlLOPrCp ÇMC| 10 MM4>.

Leptina de Ornitorrinco de Comprimento Completo não

Processada (isto ê, inclui a sequência de sinal N- terminal com 21 resíduos): Uma sequência de comprimento completo de leptina de ornitorrinco, incluindo uma sequência de sinal N-terminal com 21 resíduos, segue: MROLÍ¥m€¥W<P'L%TSH«M^A»Trn.:m.'Bfm«QÍJl^NOVSTOQRVmef IFOPCiQIAiXlÀIMPCIftAVTQOi^y^MimiW^LEPMSlAAltATlAXePFníS !3dLOTMlJW«IV®SiAílT£VVTtmLSfâl^l£^mm^f:< (SFQ ID ao I ')

Forma 1 de leptina humana madura:

W\*«S<>?HHKSUkUv \KÈMSirrQSVSSIIIffrOIJl'jRiLHVJLi 12ΆΛΧ*0Ί 1 AW CKJ * fc.wwjn FM RPIÍ,B:VtóFSEBCX:tFWASCíLE'{llJStOÍiVtEâSOVgT K\ V M AVI l)CAS pA\F 5Λ pj ntAKCIMCFIP MIICí),

Forma 2 de leptina humana madura:

VriQkXQPDIMfLIK'riV’lllAPISIIAQSVMAQSXrCLPFlFClUIHLTIAICMIXll’LAXV 0C|!!;iAXimAV|ir|lfAPLEXtF:PtAíFVLAFSPACmFWàA0?^EILDS:FÊ90VLEAFòyÍT BV¥AL$FLCKsSt<|BAB.M<|í,OL$F(sC IO MII1%

Forma 3 de leptina humana madura: vrMgK.VODDTKTOkTiVmjNDfôHrSVSSKQKVTOm^WWltll^KMPgJt.AWQ QIOm^RHVíQiS^^LliNI.R^ltHVlAVSK^ILFWAiGMUmiCIOVyiAlOTSTB V¥ALSM.QOSy|)MLWQmi:SF€€ (SBQII MAP,

Forma 4 de leptina humana madura:

WI^K.¥QPOmtlJra¥mf?WSHAAVS^iC:VKIL»«l.»{LTLSkMÍ^TlAVYQ I|fIAiyFSF:¥V1{|I?AOLEALIOLOWLAFIIM:i;II..FmiOLETLOSLCOVtEAfO¥STl ¥i^:LSItQOiypMLWCpXAMIi{iy| 10 M):1M ιο i»D i

Forma 1 de leptina humana madura com metionina N-terminal (também conhecida como Metreleptina ou A10Q) ι

YÍM|5Í:íSWÍÍíN¥lQi <\í !ΠΜ IthLLIIVLArSívSfihL^ÂSOtinYDSiYKSVLlíASOYS mwALm^GSio^LWQmts^cpEQ m yoyíy

Forma 2 de leptina humana madura com metionina N~ terminalt uyim&amp;mMKKiLmi$vmmmmiAQmmmK\nx}LOFmtimnLTL$KMnqn^v YÍ|QíLlgMPS8.Y¥IQIÍ^>L¥YLgDL:L!J¥tAS^:SCi:«i,WAS€LK'í'tDS!-.Cí«YLEA§0YS TE¥¥ÂOM,QQStOMi;WQy>LSPGC<SEO S>

Forma 3 de leptina humana madura com metionina íí- terminal: M¥riQ^YQDDTIÍTy:rrrvmfNÍ>ISIITSVSSIí:Q^VTGL:DFIF0tHFIÍTLSKMI5QTÍA¥Y QQIlIiMMRN¥lQ!SN:DtEYit»Íi!W:tóimS€HLPWASGLírrLKt:O0VtEAMsYYr BWALm^BL^DMLw^minw (seq m múii

Forma 4 de leptina humana madura com metionina E~ terminal: MYFÍQ^QÔDI^fUKTIVTUNiaSHASVSaC^WOi^limOTlYtmiliQTtAVY <X^LTSMFSR^QiSNr>{.ENt#MXHVLAMKSCeiPWASaLBIl<MLGGV^.EÂm'ST EvvALmc^mopm WQUH.mr cs$ o mj> mj ay Leptina de foca:

MlUIlYI ITRINDISRKXfVí •SRMVÁaLíriMY^Wth^M^LATV^ ÍLTStQSRSVVQl ANDJ..S\t R At t.Rf.ΐ.ASARSCRVPR i'R<gvmníí.>tG\-vi..RAS¥®m¥ V Λ LS R LK Λ A í. Q! >\-H RQ L D íi Y PGC í P ΥΒΥΥ

Leptina de foca com os aminoãcidos 71 a 92 substituídos pelos aminoãcidos 73 a 94 (hélice 3} da metreleptina, τά^Ήάί* ι tfâwiíaM í* a · JL «SS £9 jjnr »S» U JL v (S&amp;JLblCSÍ JLi «ϋί * M^v^DomiyrarmíMm^^^â^RVAOLP^mvQSWTi^tAiwiíLAWC^ IL:lYUpí^'lQIS¥DLBYLEOIJYTO\^SKm7PYFiASCiSOTfS;CAAÍ\S7 t»ARVB$TE¥V ALSELKAAtQOA^LRQLDKYFGC (SGQíPNÕYSl

Leptina de foca com os aminoãcidos 30 e 71 a 92 substituídos pelos aminoãcidos 32 e 73 a 94 (hélice 3} da w<sjάϊ°ϊί“ i fia τά^Ήάί* i tfâwiaM ha» JLl&amp;dS ti JL. CH> JL ϊν< «JL a&amp;wI f JL ÇJS £9 U ÇJS L JL V SUli.«w>i»> L» «ϋί *

FjQRYQODrKI'LSKHn'RlYDISPFpOVSSRP^AGLOFIPRVQSVRTLSCiMDQrtAIYQQi L1ISlC^RNV.ipSNfâU^LRPIXB\XAFSR8CPAímA8QSPTIK.eL6MVXaAS¥MfTEV¥ ALiãR.LKAA.LQDMLR;.Q:LDRYPOC (SEQ ÍB YOGA),

Leptina de foca com metionina N-terminal: ιο i»D i

QlimQPtSWQíANDlANI.RMlMlASàKiC^VmAE^CrmCíl^VLlíASVHSiT^: VmLMLEAALQDSctlâ.QLI^NWC $BQ ΙΌ> Mfct?).

Leptina de foca com metionina N-terminal e com os aminoãeidGS 71 a 92 substituídos pelos aminoãcidos 73 a 94 (hélice 3) da metreleptina, respetivamente;

MílORVODDl^mCflftMSiBKH^VÍ^Íí^VAOySWkVOíiVRl^iMDí^tAl^O

<|ILtSiQSK'S<VÍ<H^:DJJ^tRmi.HYLAT-'SKSfT%Tf«âtóSt>TSKfa.<*NVt8A5ÍVH<STEV VAtS&amp;titAALQDMMiQtDR^PaC fRI=0 3D M0;2§i>,

Leptina de foca com metionina M -terminal e com os aminoãcidos 30 e 71 a 92 substituídos pelos aminoãcidos

32 e 73 a 94 (hélice 3) da metrelepfcina, respetivamente; MI>K^SíQl.n)-{K1UKÍllTR3Nb3Sm,<^3VSS>RÍ»RV^U»'{PR¥QSVR-H..S<'iMUÍ^tó'3'¥Q QIimiC|iaYVrorSYOL|jM,I©L;[j:|VLAFSRSrfVPRAR<}S^ÍIR<Ít(ÍN¥LRABVS|$TI¥ VALSffi.^AAl^fòyARQLfâR^FGC <SEQ 30 Mim

Leptina A200; A leptina A200 é um produto de condensação de fragmento de anticorpo Fc com leptina, conforme conhecido na técnica. Veja-se, por exemplo, Lo et al., 2005, Protein Eng. Design &amp; Selection, 18:1 a 10. A sequência de aminoãcidos de A2QQ é da seguinte forma: \:Pk ΉΗ Pi Π4χΡΚ irM MT! ΗΤΜ'ΚΡ- LVnSRIPM h S X- \ ΟΜΗΗΜΛ Ri-VAA X AiX M SSMk ΓΜΤ t.i: OV XXO R\ X N\ L S XI PQUXX l M>R3 X ROM XSK HMMU k i \

-MMQPK !\>x> ll fpXKlH.i 3RXQX SLKl X Rb; X ΒΜΛΛ3 MXMMMXMK ΠΡ PVLDSiX.s>í I'tV AX PidXX ípíjpuuk n v i Kíwro^«QK.¥mwim»iiT»:MDQTLA% \ :MFSRNXX0^NDt£XiLII>LLIIVtAimSCi:lLPWÁSaL3iI LIMtCit^LEASdX Χ3ΓΙΛ X AS.R RUQ€SÍ OIX\5l \VfN»L3>t.«C CSPQ ÍDMMO)

Leptina A3 0 0: A leptina A300 é metreleptina com substituições W101Q e W139Q (Met N-terminal1 contada como o resíduo 1): ^VHQ^^DmTyK:riVTRI^DIStri^QSVSSKC|SiVimW3^iL3ititTtSKMDQTL4V tX3C|5:iXSMFSkAVi:Qi:SXOi;KNSADtII'3VlAPSkSCI-3L^!AS<i3.i;Tii>S3iX;\d.EASeYS 'MWALSRl M 'S| ípimQQiPIJFOC MM3),

Leptina A400: A leptina Ά400 é metreleptina com o resíduo de serina ria posição 78 substituído por um resíduo de císceína, conforme apresentado a seguir: MVPIQKVQDDTKTLiKTSVTRfNOiSHTQSVSSKQkVTÓLÕPSPnLÁtíLTLSkyDQTLAV yUQitTSy:PSkkViQiCkOl.tRl.ROll:i-MAÍ-SKSCNLPWAS«teiil)SLe(M.£MG¥S TEWALSR-LQSSLQDM:LWQLDLSPGC (SEQ ÍO HO: 32): ao qual uma porção química PEG de 2 0 quilodaltons ιο i»D i (kDa) foi ligada por meio do resíduo de cisteína na posição 78.

Leptina A500; A pesquisa por vários investigadores, incluindo os inventores, focou nos efeitos na agregação da substituição de resíduo na leptina. Veja-se, por exemplo, Ricci et al. , 2006. "Mutational approach to improve physical stability of protein therapeutics susceptible to aggregation: Role of altered conformation in irreversible precipitation", Capítulo do livro, em: MISBEHAVING PROTEINS: PROTEIN (MIS)FOLDING, AGGREGATION, AND STABILITY, Murphy RM, Tsai AM, Eds., Nova Iorque. Springer. Páginas 331 a 350. Consequentemente, a leptina A5Q0 com acompanhamento de sequência foi utilizada em determinados compostos e métodos descritos no presente documento: MVPíUkXtH3l>mTMIÍTIVTESN^HTU5ÍVSt>KOKY K*U:I· ¥QOU 5 SMi^RNVlQfSN»tE^IRhLfH'vl. 1fcASG* S Ϊ

EVVAtSRLQCíS:tQ{;íM:UXMJmEKK' sRívQ |0 NOJOS

Variantes de leptina Ά100: As variantes da leptina A100 com as seguintes substituições de resíduos seguem: D41E, H98S, W1Q1Q, D10SE, G113E, M137I, W139Q e G146E: peq m h<> ***}. h 9 8 s, W101Q, A102T, G113E, M137I, W139Q e G146E:

TS ^txpiAV ¥ÇKR!;i;SMFSRNV1QiEMDLE:NEjM>LI.:HVlAFS^CSL^lASG;i..eiI.L>SLGCA41iASCA:ET B¥VAl,$RI.QOEl.QOIl:QQLOLSm:' ÍNEQ W NO: m\ H98S, W1Q1Q, G113E, M137I, W139Q e G146E: MWKíKvooDTsa t iKi syhonosoo {.timcmix/t í.ày

¥<}QlU’SMmNYH^SNPUCNÈ,Kf>I l m * Al>kS> SIJ^ASOLETLDSt<5Γ¥1 Ϊ-.ΑΚ* YSI SSfcQ |p Np;: W101Q, G113E, M137I, W139Q e G146E: YQQIi;rSMmNVI^SNPLBHI.J&amp;PLLBVLAF$WmFQAmPr{J)SI,OtVLEA®YST EVVAi.SRLQCWD1:tQQLBLSFEC M SONO: <*>?>. H98S, W1Q1Q, M137I, W139Q e G146E: ιο i»D i MVPi:^:v^mysio;!jrr?vTR]NDíseTQSvssKQK:vTC9i,ofi^LíMi;TLSE.MDQTí..A¥ 'Y^fO’SM^ItHVIiQISKDLlHlJlDOJiVLAFSESCSLI'QASaLgrrL^LiOCiVLE^SOTSt E¥V AlSilI,QGÍlip ILQQLDiaPEC (SBQ 1ΌΝ0: m% W101Q, G113E, M137I, W139Q, L143V e G146E:

ΜVHtQKS-QDD'i'K. Ϊ UKTivfKt MifSHTpSVSSfcQkN Ϊ< >1.1»·»»*1 Hi»», iISICMDQTLvW VCi(»i;raMI»SRNViQBNDU:NLRDi.Ui\ LAi-SRS< HiJ^SÍÍLrn.USLGEVLEá^VST EVVALSâtQOSLQOlLQQLD¥*C P-EQ IP »: $m% H Q 8 S W101Q, A102T, M137I, W139Q e G146E: MYEíQlt¥Cpiyr^TIl^miTM^D1Síf!X^¥SSI£Q’0>T<3LOÍsl?»GOÍÍi,IL:rLSO>i:DQTLAVL TQQ«;w^mfw^Pii«^>u.iw.AE^m-s^'r^ofii,pp;>TOvi45Aie¥iS>T M¥VAim-QOaiJ|Dlt{>QI,DiareC {SEQ IP m én), H 9 8 s, W101Q, D109E, G113E e G146E: MVFlQllVQiOTK.TLIEf!VTRrMDISPTQiv:BEEQi:VTP:LPEIHILPIsIL;rLli:MDI|rLÂ¥ YQQIL-rSMPSRaVIQISMDLENLRPmiVLAESKSCaLEQÂBPLEfLlBLeEVtEABSYÍST EVVAiaRLQGSLQOMLWQLBiSFEC fSEQ IP M>: §?I>. W101Q, M137I, W139Q e G146E:

M\¥slClR-''pI^-Proi-JOf¥T.RINDI$HTQS¥SSK.QK\P'pLOFIM)LPFii4niaRMlKP'IAV Y<^iim??àR^¥l<^SH»í,ENLRI>tyiVi.A^S€IM<?QM’01Kril»JMíVtE«¥S TEWALiRl^BL^LJQQí·^^ <SEO ;D NO: fV;-* W!01Q M137I, W139Q, L143V e G146E:

MWIO^QDDTKTUKTJVI KiNUtSM 1'QSVSSKQKV OH DOHCH.HPU. riAKMDpTLA V YQQjmMÍ^RNVH>IE\DE{-N|.RPL{.HV{.A»;SKS<.Hy^AmETym<3aVi;MS^¥B HWA®I QGSS.QDíí QQLDVSfrEC (SEQ 1» Wl él$% Íí9 8S W101Q, A102T, M137I, W139Q, L143V e G146E: MVE^¥<pPmTMO'IVl^iND.fSffrQ$¥$$EjQOT<*y3FÍEOUJP».T{.Í>K\1{XírEA¥ T«!i7^^«HVK^i3LihiâmiwiAmRSCSiH?ma.iTy'>^ ggvi rASovsr

EV¥ALMtQGSt<PíL0|y>V«C 11¾ IP MO; «74> H 9 8 S W101Q, A102T, G113E e G146E:

MvpiQRV^mjiK:rLis<;:n¥i:Ria:oiEPrQSvsRR<|R¥iPLOFipPi.,Hro;o.âPMix|i:!..A¥ YQ^lTSMFSRaVIQlS^LENLRDiaHVMi^ISSCSLFQTSPilO'LPSLOEVLEASGYST EVVÃLSmLQpBLQPMLWp.PLBFgC piiQIO ME #?$). W! 01Q, C113E e W139Q:

M¥E:Í^RV0ODmiMRm^rRI^D1«^VSMi0R¥ffâLOF^tHrim^RMÍ^riAV

V^ílJEMFSRNVIQiaaOL.EatilMlJIVI.AFSKBCIM.FQABPLPOlIELplVLEA^Yfr EVVÂLSRLI^SlC|DML^LOLÍP€i€ iBECJ ÍO MO: m% W ‘i 01 Q G113E, W139Q Θ G146E: MV?IQKV<^>DTRTLtKTt¥TRI^DiSHTORVR^KQ^¥1BLO«F0L»*ÍLTI«;MOQTS^V' YQQ{LTSM.FERM¥1QlSMDLEMLRDLLHV.LA.FSOCIiLPQASOi.ETOÍSLGE¥LEAiSGYST E¥VAI.aRI.QOBLQPMI.PQi.PIMFFO ÇEMQ lP Mp: §??).. ιο i»D i

Qualquer uma das leptinas, análogos de leptina ou fragmentos ativos das mesmas acima, assim como as leptinas conforme descritas abaixo, são adequadas para utilização nos polipéptidos manipulados, com ou sem um lígante ao ABD,

Pêptidos de domínio de ligação à albumina (ABD). Pêptidos de domínio de ligação à albumina (ABD) para utilização na invenção são aqueles com alta afinidade comparável para albumina e derivam de domínio de ligação à albumina de proteína bacteriana G de estirpe de Streptococcus G148, Sendo assim, pêptidos de ABD contemplados para os polipéptidos manipulados descritos no presente documento incluem aqueles que têm os motivos de ligaçâG à albumina conforme descrito por Jonsson et al. (Protein Eng. Design &amp; Selection, 2008, 21:515 a 527), assim como os pêptidos de ABD descritos no mesmo, e aqueles •motivos e pêptidos de ABD descritos adicionalmente no Pedido de Publicado PCT n° W02009/016Q43, assim como análogos dos mesmos, particularmente aqueles que têm pelo menos 85% de identidade de aminoãcidos. Numa forma de realização, o péptido de ABD pode compreender um motivo de ligaçâG à albumina ("ABM") que consiste na sequência de aminoãcidos: GVSD X5 YK. X8 X9 I Xu X12 A Xi4 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO:34), em que, independentemente uns dos outros, X5 e selecionado de entre Y e F; X8 e selecionado de entre N, R e S; X9 é selecionado de entre V, I, L, M, F e Y;

Xn é selecionado de entre N, S, E e D; X;L2 é selecionado de entre R, K e N;

Xi4 e selecionado de entre K e R; X2o é selecionado de entre D, N, Q, E, H, S, R e K; X23 é selecionado de entre K, I e T; X24 é selecionado de entre A, S, T, G, H, L e D; e X25 é selecionado de entre H, E e D.

Em determinadas formas de realização, X5 é Y. Em ιο i»D i determinadas formas de realizaçâG, X8 ê N. Em determinadas formas de realização, X23 é T. Em determinadas formas de realização, X23 él. Em determinadas formas de realização, X24 éS. Em determinadas formas de realização, X24 é L. Em determinadas formas de realização, X25 é E. Em determinadas formas de realização, X25 é H. Em determinadas formas de realização, independentemente urn do outro, X5 é Y, e/ou Χ8 é Ν, e/ou Χ23 é Τ ou I, e/ou X24 é S ou L e/ou X25 é E. Em determinadas formas de realização, o motivo de ligação à albumina ("ABM") é GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO:114) . Em determinadas formas de realização, o motivo de ligação à albumina ("ABM") é GVS DYYKNLINKAKTVEGVEALIS EI (SEQ ID NO:115).

De preferência, o péptido de ABD liga-se à albumina com urn valor K. da interação que é no máximo 1 x lCTb M e, com ainda mais preferência, no máximo 1 x 10’9 M (afinidade ainda mais estreita) . Com mais preferência, o valor K da interação que ê no máximo 1 x ΙΟ”10 M, com ainda mais preferência, é no máximo 1 x 10‘l! M, com máxima preferência, é no máximo 1 x ΙΟ'33 M e, ainda adicionalmente, é no máximo 1 x IQ”13 M. Por exemplo, urn valor KD de 1 x 10“14 M é urn valor K da interação que é no máximo 1 x IO”*3 M. Os valores K podem ser determinados conforme descrito no Pedido Publicado PCT n9 WO 2009/016043, de preferência, para albumina sérica humana. Numa forma de realização, contempla-se o género acima com a condição de a sequência de aminoácidos não ser GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO :35) .

ConfGrme demonstradG no presente documento e nas referências citadas, a capacidade de ligação à albumina do péptido de ABD pode ser retida apesar de as alterações de aminoácidos, desde que tais alterações retenham uma estrutura terciária suficiente do péptido de ABD. Tais alterações incluem, por exemplo, uma substituição em que um resíduo de aminoâcido que pertence a um determinado ιο i»D i grupamento funcional de resíduos de aminoãcido (por exemplo, hidrofõbico, hidrofílico, polar etc.) é trocado por outro resíduo de aminoãcido do mesmo grupo funcional. Consequentemente, numa tal forma de realização do péptido de ABD, g mGtívG X5 é Y, Numa forma de realização do ABD, X8 é selecionado de entre N e R e pode, em particular, ser R. Em uma forma de realização, X9 é L. Numa forma de realização, Xn é selecionado de entre N e S e pode, em particular, ser N, Numa forma de realização, X12 é selecionado de entre R e K, tal como Xi2 ser R ou X12 ser K. Numa forma de realização, X:l4 é K. Numa forma de realização, X20 é selecionado de entre D, N, Q, E, H, S e R e pode, em particular, ser E, Numa forma de realização, X23 é selecionado de entre K e I e pode, em particular ser K. Numa forma de realização, X24 é selecionado de entre A, S, T, G, H e L. Numa forma de realização maís específica, X24 é L. Numa forma de realização ainda mais específica, "X23 X24" ê KL. Noutra forma de realização ainda mais específica, "X23 X24" é TL. Numa forma de realização, X24 é selecionado de entre A, S, T, G e H. Numa forma de realização mais específica, X24 é selecionado de entre A, S, T, Ge H e X23 é I. Em uma forma de realização, X25 é H.

As sequências de motivos de ligação à albumina individuais dentro da fórmula acima incluem aquelas apresentadas como SEQ ID NOs:1 a 257 no Pedido Publicado PCT n£ WO 2009/016043. Em determinadas formas de realização do polipéptido de ligação â albumina, o motivo de ligação à albumina consiste numa sequência de aminoãcidos selecionada de entre SEQ ID NO: 1 a 257. Numa forma de realização mais específica deste aspeto da invenção, a sequência de motivos é selecionada de entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID

NO: 9, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :27, SEQ ID

NO :46, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :54, SEQ ID

NO :55, SEQ ID NO:1 55, SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :240, SEQ ID

NO :241, SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243, SEQ ID NO :244 e SEQ ιο i»D i ID NO :24 5 do Pedido Publicado PCT n£ WO 2009/016043. Em formas de realização ainda mais específicas deste aspeto da invenção, a sequência de motivos é selecionado de entre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO :23 9 do Pedido Publicado PCT n£ WO 2009/016043. Polipéptidos de ligação à albumina que contêm motivos de ligação à albumina e, assim, adequados para conjugação ou fusão a um domínio de hormona conforme descrito no presente documento, são descritos adicionalmente no presente documento e abaixo e exemplificados na Tabela 1 e nos Exemplos. Sem estar vinculado à teoria, mas acredita-se que o motivo de ligação à albumina pode formar parte de um domínio de proteína de feixe de três hélices. Por exemplo, o motivo pode constituir essencialmente ou formar parte de duas hélices alfa com um laço de interligação, dentro do referido domínio de proteína de feixe de três hélices. Consequentemente, em formas de realização particulares da invenção, tal domínio de proteína de feixe de três hélices é selecionado a partir do grupo que consiste em domínios de três hélices de proteína recetora bacteriana G de estirpe de Streptococcus G148. Em variantes diferentes dessa fGrma de realização, o domínio de proteína de feixe de três hélices, do qual o motivo forma uma parte, é selecionado a partir do grupo que consiste em domínio GA1, domínio GA2 e domínio GA3 de proteína G de estirpe de Streptococcus G148, em particular, domínio GA3.

Em formas de realização da presente invenção, em que o motivo "forma parte de um domínio de proteína de feixe de três hélices", compreende-se que isso significa que a sequência do motivo de ligação à albumina é "inserida" em ou "enxertada" em ou "fundida" â sequência do domínio de feixe de três hélices de ocorrência natural (ou, de outra forma, original), de modo que o motivo substitua um motivo estrutural semelhante no domínio original. Por exemplo, e sem o desejo de se vincular a qualquer teoria, pensa-se que ιο i»D i g motivo constitui duas das três hélices de um feixe de três hélices, e pode substituir tal motivo de duas hélices dentro de qualquer feixe de três hélices. A substituição de duas hélices do domínio de feixe de três hélices pelas duas hélices dG mGtívo divulgadas no presente documentG é realizada de modo a não afetar a estrutura básica do polipéptido. Ou seja, a dobra total da cadeia principal do polípéptido de acordo com essa forma de realização da invenção será substancialmente a mesma que a do domínio de proteína de feixe de três hélices do qual a mesma forma uma parte, por exemplo, tendo os mesmos elementos de estrutura secundária na mesma ordem, etc. Assim, um motivo útil para os polipéptidos manipulados no presente dGcumento pode formar parte de um domínio de feixe de três hélices caso o polipéptido de acordo com essa forma de realização tenha a mesma dobra que o domínio original, o que implica que as propriedades estruturais básicas são compartilhadas, sendo que essas propriedades, por exemplo, resultam em espetros CD semelhantes.

Consequentemente, numa forma de realização, o polipéptidG de domíniG de ligaçâG à albumina é um domínio de proteína de feixe de três hélices, que compreende o motivo de ligação à albumina conforme definido acima e sequências adicionais que compõem o restante da configuração de três hélices. Para tal, um polipéptido de domínio de ligação à albumina pode ser fundido a uma leptina, a um análogo de leptina, a um fragmento ativo de leptina ou a um derivado de leptina do mesmo para criar os polipéptidGS manipulados conforme descritos no presente documento. Um polipéptido de domínio de ligação à albumina adequado para conjugação ou fusão a uma leptina, a um análogo de leptina, a um fragmento ativo de leptina ou a um derivado de leptina do mesmo pode compreender a sequência de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO :36) ιο i»D i em que [ABM] é um motivo de ligação à albumina conforme definido acima e independentemente uns dos outros,

Xa é selecionado de entre V e E;

Xb é selecionado de entre L, E e D;

Xc é selecionado de entre N, Lei;

Xd é selecionado de entre R e K; e

Xe é selecionado de entre D e K.

Em determinadas formas de realização, Xa é E, Em determinadas formas de realização Xb é D. Em determinadas formas de realização, Xc é I. Em determinadas formas de realização, Xd é K. Em determinadas formas de realização, Xa é independentemente E, e/ou, independentemente, Xb é D, e/ou, independentemente, Xc é I e/ou, independentemente, Xd é K, Em determinadas formas de realização, a leucina na posição 45 está presente ou ausente. Em determinadas formas de realização, a prolina na posição 46 está ausente. Em determinadas formas de realização, o polipéptido de domínio de ligação à albumina é LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50). Em determinadas formas de realização, o polipéptido de domínio de ligação à albumina é LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO:51).

Numa forma de realização adicional, o ABD compreende um ou mais aminoãcidos de encapsulação de hélice Ν'-terminal, e numa forma de realização adicional, o aminoãcido de encapsulação de hélice pode ser serina ou pode ser glicina-serina. Consequentemente, para cada sequência de domínios de ligação à albumina divulgada no presente documento, incluindo aquelas nas Figuras e na listagem sequenciada, também especificamente contempladas para todos os aspetos conforme divulgados no presente documento no polipéptido manipulado, são domínios de ιο i»D i ligação à albumina, seus ABD de Ser, ABDe de Gly-Ser, ABD de Gly, ABD de Ala e suas sequências de prolina des-C-terminal,

Devido à presença de um motivo de ligação à albumina, o péptido de ABD liga-se à albumina com um valor K da interação que é no máximo 1 x 10"° M e, com ainda mais preferência, no máximo 1 x 1CT9 M (afinidade ainda mais estreita). Com mais preferência, o valor K da interação que é no máximo 1 x IO”10 M, com ainda mais preferência, é no máximo 1 x 10“11 M, com máxima preferência, é no máximo 1 x 1Q~1Z M e, ainda adicionalmente, é no máximo 1 x. 10M.

Numa forma de realização desse polipéptído de ligação à albumina, Xa é V. Numa forma de realização desse polipéptído Xb é L. Numa forma de realização desse polipéptído Xc é N, Numa forma de realização desse polipéptído Xd é R. Numa forma de realização desse polipéptído Xe é D.

As sequências de polipéptidos de domínios de ligação à albumina individuais adequadas para fusão com os péptidos de domínio de hormona ativos conforme descrito no presente documento são apresentadas em Jonsson et al. (Id.) e como as SEQ ID NOs: 258 a 514 no Pedido Publicado PCT n9 WO 2009/016043. Os compostos selecionados são divulgados na Tabela 1 abaixo. Também é abrangido pela presente invenção um polipéptído de ligação à albumina que tem uma sequência de aminoácidos com 85% ou mais de identidade com uma sequência selecionada de entre SEQ ID NOs:258 a 514. Em formas de realização particulares, a sequência do polipéptídG de ligação à albumina é selecionada de entre SEQ ID NO :259, SEQ ID MO :260, SEQ ID NO :266, SEQ ID NO :272, SEQ ID NO :282, SEQ ID NO :284, SEQ ID NO :303, SEQ ID NO :306, SEQ ID NO :310, SEQ ID NO :311, SEQ ID NO :312, SEQ ID NO :412, SEQ ID NO :496, SEQ ID NO :497, SEQ ID NO :498, SEQ ID NO :499, SEQ ID NO :500, SEQ ID NO :501 e SEQ ID MO :502 no Pedido Publicado PCT n9 WO 2 00 9/016 043, e as sequências que têm ιο i»D i 85% ou mais de identidade com as mesmas. Ainda iiGutras formas de realização, a sequência do polipéptido de ligação à albumina é selecionada de entre SEQ ID NO :260, SEQ ID NO :270, SEQ ID NO :272, SEQ ID NO :291, SEQ ID NO :294, SEQ ID NO :298, SEQ ID NO :299, SEQ ID NO :300, SEQ ID NO :400, SEQ ID NO :484, SEQ ID NO :485, SEQ ID NO :486, SEQ ID NO :487, SEQ ID NO :488, SEQ ID NO :489 e SEQ ID NO :490 no Pedido Publicado PCT n-9- WO 2009/016043, e as sequências que têm 85% ou maís de identidade com as mesmas. Ainda noutras formas de realização, a sequência do polipéptido de ligação à albumina é selecionada de entre SEQ ID NO :260, SEQ ID IMO :310, SEQ ID NO :496 e SEQ ID NO :511 no Pedido Publicado PCT n9 WO 2009/016043 e as sequências que têm 85% ou mais de identidade com as mesmas.

Numa forma de realização, o polipéptido de ligação à albumina compreende, ainda, um ou mais resíduos de aminoãcido adicionais posicionados no N e/ou C-terminal da sequência definida na SEQ ID NO:36. Esses resíduos de aminoãcido adicionais podem desempenhar um papel na melhoria da ligação de albumina através do polipéptido, e no aprimoramento da estabilidade conformacional do domínio de ligação à albumina dobrado, mas pode igualmente servir bem a outros propósitos relacionados, por exemplo, com um ou mais de entre produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, acoplamento, marcação ou deteção do polipéptido, assim como qualquer combinação dos mesmos. Tais resíduos de aminoãcido adicionais podem compreender um ou mais resíduos de aminoãcido adicionados para propósitos de acoplamento químico, por exemplo, a um EDI.

Os aminoácidos diretamente anteriores ou posteriores à hélice alfa na terminação N ou C da sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:36 podem, assim, numa forma de realização, afetar a estabilidade conformacional. Um exemplo de um resíduo de aminoãcido que pode contribuir para a estabilidade conformacional aprimorada é um resíduo ιο i»D i de serina posicionado no N-terminal da SEQ ID MO :36 conforme definido acima, 0 resíduo de serina N-terminal pode, em alguns casos, formar uma caixa de encapsulação S-X-X-E canónica, envolvendo-se uma ligação de hidrogénio entre o oxigénio gama da cadeia lateral de serina e o MH da cadeia principal de polipêptido do resíduo de ácido glutâmieo. Essa encapsulação N-terminal pode contribuir para a estabilização da primeira hélice alfa do domínio de três hélices que constitui o polipêptido de ligação à albumina de acordo com o primeiro aspeto da divulgação.

Assim, numa forma de realização, os aminoáeidos adicionais compreendem pelo menos um resíduo de serina no N-terminal do polipêptido. A sequência de aminoáeidos é, em outras palavras, precedida por um ou mais resíduos de serina. Noutra forma de realização do polipêptido de ligação à albumina, os aminoáeidos adicionais compreendem um resíduo de glicina no N-terminal do polipêptido. Compreende-se que a sequência de aminoáeidos de SEQ ID NO: 36 pode ser precedida por um, dois, três, quatro ou qualquer quantidade adequada de resíduos de amínoãcido. Assim, a sequência de aminoáeidos pode ser precedida por um único resíduo de serina, um único resíduo de glicina ou uma combinação dos dois, tal como uma combinação glicina-serina (GS) ou uma combinação glicina-serina-serina (GSS) . Ainda noutra forma de realização, os resíduos de amínoãcido adicionais compreendem ácido glutâmieo no N-terminal do polipêptido conforme definido pela sequência de SEQ ID NO :36.

Espécies de ABD exemplificativas incluem, porém, sem limitação, os compostos apresentados na Tabela 1 a seguir e nos Exemplos, Veja-se também o Pedido Publicado PCT n-9- WO 2009/016043. Um péptido de ABD útil nos compostos, nos métodos e nas composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser um fragmento ou análogo de um péptido de ABD divulgado no presente documento ou conhecido ιο i»D i na técnica, desde que contenha um motivo de ligação à albumina e se ligue à albumina com a afinidade descrita no presente documento.

Tabela 1. Pépbdos de ABB selecionados

Ligação â Albumina. A albumina sérica é a proteína mais abundante em soros de mamíferos (40 g/1; aproximadamente 0,7 mM em seres humanos), em que a mesma se liga a uma variedade de moléculas, incluindo, porém, sem limitação, a lípidos e bilirubina (Peters T, 1985, Advances in Protein Chemistry 37:161). Observou-se que a meia vida de albumina sérica ê diretamente proporcional ao tamanho do animal, em que, por exemplo, a albumina sérica humana (HSA) tem uma meia-vida de 19 dias e a albumina sérica de coelho tem uma meia-vida de cerca de 5 dias (McCurdy TR et al., J. Lab. Clin. Med. 14 3:115, 2004). A albumina sérica humana é amplamente distribuída por todo o corpo, em particular, nos compartimentos intestinais e sanguíneos, em que é principalmente envolvida na manutenção de osmolaridade. ιο i»D i

Estruturalmente, albuminas sâG proteínas de cadeia simples que compreendem três domínios homólogos e totalizam 584 ou 585 aminoãcidos {Dugaiczyk. L et al. , 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 79:71) . As albuminas contêm 17 pontes dissulfeto e um único tiol reativo, C34, mas carecem de porções químicas de hidrato de carbono ligadas a N ou ligadas a 0 (Peters, 1985, Id.,* Nicholson JP et al. , 2000, Br J Anaesth 85:599). A falta de glicosilação simplifica a expressão recombinante de albumina. Esta propriedade de albumina, juntamente com o facto de que sua estrutura tridimensional é conhecida (veja-se, por exemplo, He XM &amp; Carter DC, 1992, Nature 358:209), tornou a mesma um candidato atrativo para utilização nas proteínas de fusão recombinantes. Tais proteínas de fusão geralmente combinam uma proteína terapêutica (que seria rapidamente eliminada do corpo mediante a administração da proteína por si só) e uma proteína de plasma (que exibe uma eliminação lenta natural) numa cadeia de polipêptido simples. Veja-se, por exemplo, Sheffield WP, 2001, Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol. Discord. 1:1). Taís proteínas podem fornecer benefícios clínicos na necessidade de injeções menos frequentes e níveis mais altos de proteína terapêutica in vivo. No entanto, os polipéptidos manipulados no presente documento não são conjugados com albumina, mas em vez dissG, contêm motivos que permitem a ligação não covalente à albumina.

Modalidades adicionais. Compreende-se que cada um dos polipéptidos divulgados no presente documento é também contempladG para incluir (opcionalmente) uma metionina na terminação N no quadro com o primeiro aminoácido de ocorrência natural do mesmo. Por exemplo, a metreleptina (leptina A100) consiste na leptina humana madura à qual foi adicionada uma metionina N-terminal, conforme divulgado na SEQ ID NO :20. De modo semelhante, um resíduo de metionina pode ser incluído na terminação N de qualquer uma das ιο i»D i sequências de aminoãcidos e Fórmulas divulgadas em todo o presente documento. Compreende-se adicionalmente que quando urn Gly C-terminal aparece numa sequência de polipéptidos manipulados apresentada no presente documento, o resíduo pode ser perdido durante a amidaçâG subsequente.

Em algumas formas de realização, uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina pode ter pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou até mesmo mais de identidade de sequência em relação a uma leptina progenitora. Em algumas formas de realização, a leptina progenitora é uma leptina definida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID MO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO:6, SEQ ID MO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID MO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID

NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID

NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID MO :33, ID NO :14 3, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 ou SEQ ID NO :14 6. Consequentemente, em algumas formas de realização, uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina pode ter pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%,

60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou até mesmo mais de identidade de sequência em relação a qualquer leptina selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO :23. Em algumas formas de realização, uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina pode ter pelG menos 5 0%, por exemplo, 50%, 55%, 6 0%, 6 5%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou até mais de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO:20. ιο i»D i

Em algumas fGrmas de realização, uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina pode ter pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou até mais de identidade de sequência em relação a qualquer leptina selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO: 2 8 ou SEQ ID NO :29. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO:20. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NG:1, SEQ ID NO:2, ID NO :143, SEQ ID MO :144, SEQ ID NO :14 5 ou SEQ ID MO :14 6. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 ou SEQ ID NO :14 6. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Em algumas formas de realizaçâG, um análogo de leptina pode ter pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO:32. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO:32, Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO:33. Em algumas fGrmas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO:33. Em algumas formas de ιο i»D i realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em algumas formas de realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 50% de identidade de sequência em relação à leptina apresentada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO :13. Em algumas formas de

realização, um análogo de leptina pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação â leptina apresentada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO :13. Adicionalmente, as leptinas podem ser projetadas, preparadas e utilizadas em conformidade com a invenção em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou até mesmo 21 aminoácidos de uma leptina selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID

NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID

NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID

NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID

NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID

NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 e SEQ ID NO:14 6; são substituídos por outro aminoãcido, tal como um aminoâcido conservative ou um aminoácido não conservativo ou são alterados de outro modo. Conforme habitualmente na técnica, o termo "conservativo" no contexto de substituições de aminoácidos refere-se à substituição que mantém as propriedades do tipo de carga (por exemplo, aniõnico, catiónico, neutro, polar e semelhantes), hidrofobicidade ou hidrofilicidade, volume (por exemplo, contactos de van der Waals e semelhantes) e/ou funcionalidade (por exemplo, hidróxi, amina, ιο i»D i sulfidrilo e semelhantes). 0 termo "não conservative" refere-se a uma substituição de aminoãcido que não é conservativa,

Adicionalmente, conforme é compreendido na técnica, por exemplo, leptinas murinas, leptinas de rato, leptinas bovinas, leptinas porcinas e leptinas de macaco reso, tais como aquelas divulgadas no presente documento, são, cada uma, substancialmente homólogas às leptinas humanas; particularmente, as formas maduras dessas leptinas são substancialmente homólogas às leptinas maduras e, além disso, particularmente próximas à porção N-terminal da proteína. Pode-se preparar análogos de tais leptinas, tal como a forma 1 de leptina humana madura (SEQ ID NO:16) e metreleptina (SEQ ID NO:20), tal como substituindo ou alterando os resíduos de aminoãcido numa ou mais posições em tais sequências em que a divergência é observada numa leptina de ratinho, de rato, bovina, porcina ou de macaco reso madura correspondente. Por exemplo, as leptinas humanas maduras (por exemplo, SEQ ID NO:20) produzem respostas biológicas em, por exemplo, ratinhos, ratos e macacos). Veja-se, por exemplo, os documentos n- WO 98/28427, n- WO 2009/064298, n£ US2007/0020284, n-US2008/0207512 e Murakami et al. , 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944 a 952. Como leptinas maduras humanas têm atividade biológica em, por exemplo, tais espécies, as leptinas podem ser projetadas e preparadas em que um ou mais aminoácidos nas posições que são divergentes na posição (ou posições) correspondente numa leptina de uma ou mais de tais espécies são substituídos pelG aminoãcido (ou aminoácidos) em tais posições divergentes correspondentes.

Por exemplo, com a utilização de uma proteína leptina madura humana de acordo com a SEQ ID NO: 16 em que o primeiro aminoãcido é valina, e o aminoãcido na pGSÍção 146 é cisteína, pode-se substituir por outro aminoãcido um ou mais dos aminoácidos nas posições 32, 35, 50, 64, 68, 71, ιο i»D i 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 com o aminoãcido (ou aminoácidos) correspondente encontrado na posição (ou posições) correspondente na SEQ ID NO :14 3 a fim de projetar, preparar e utilizar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção. Adicionalmente, pode-se também substituir outro aminoãcido, tal como um aminoãcido conservative ou um aminoãcido não conservative, em uma ou mais das posições 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145, por exemplo, da SEQ ID NO:16 a fim de projetar, preparar e utilizar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção.

Pode-se preparar, ainda, leptinas adicionais com base na sequência de proteína leptina de rato madura (SEQ ID MO:12) , Veja-se, por exemplo, os documentos n2 WO 98/28427, n2 US2007/0020284 e Murakamiet al. , 1995, Id. A leptina de rato madura difere da forma 1 de leptina humana madura (SEQ ID NO: 16) nas seguintes posições: 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 e 145. Consequentemente, em uma ou mais de tais posições na SEQ ID NO:16, pode-se substituir o aminoãcido encontrado na posição (ou posições) correspondente encontrada na leptina de rato madura (SEQ ID NO:12) a fim de projetar, preparar e utilizar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção. Adicionalmente, pode-se também substituir outro aminoãcido, tal como um aminoãcido conservative ou um aminoãcido não conservative, em uma ou mais das posições 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106 107, 108, 111, 118, 136, 138 e 145, por exemplo, da SEQ ID NO: 16 a fim de projetar, preparar e utilizar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção.

As posições tanto da leptina de rato madura (SEQ ID NO:12) quanto da forma 1 de leptina murina madura (SEQ ID NO :143) que divergem da forma 1 de leptina humana madura ιο i»D i (SEQ ID NO :16) são: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145. Consequentemente, em uma ou mais de tais posições na SEQ ID NO :16, pode-se substituir o aixtinoãcido encontrado na posição (ou pGsíções) correspondente encontrada na sequência de leptina de rato madura (SEQ ID NO:12) ou sequência de forma 1 murina madura (SEQ ID NO:143) a fím de projetar, preparar e utilizar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção. Adicionalmente, pode-se também substituir outro aminoãcido, tal como um aminoâcido conservative ou um aminoáeido não conservative, em uma ou mais das posições 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 a fim de projetar, preparar e utilizar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção.

Adicionalmente, os aminoãcidos encontrados na leptina madura de macaco reso (SEQ ID NO:10) que divergem da forma 1 de leptina humana madura (SEQ ID NO: 16) são (com os resíduos de aminoãcido notados em parênteses em abreviação de aminoãcido de uma letra): 8 (S) , 35 (R) , 48 (V), 53 (Q) , 60(1), 66(1), 67(N), 68((L), 89(L), 100(L), 108(E), 112 (D) e 118 (L) . Jã que leptinas maduras humanas produzem uma resposta biológica em macacos, uma leptina, tal como a forma 1 de leptina humana madura (SEQ ID NO:16) que tem um ou mais dos aminoãcidos divergentes de macaco reso substituídos por outro aminoãcido, tais como os aminoãcidos em parênteses, pode ser empregada no projeto, preparo e utilização de polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção. Deve ser notado que determinados aminoãcidos divergentes de reso são também aqueles encontrados, por exemplo, na forma 1 de leptina murina madura acima (posições 35, 68, 89, 100 e 112). Assim, pode-se preparar leptinas em que um ou mais aminoãcidos nas posições 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, ιο i»D i 138, 142 e 145, por exemplG, da forma 1 de leptina humana

madura (SEQ ID NO:16) são substituídos pelo aminoácido (ou aminoácidos) correspondente em tal posição (ou posições) em leptinas murinas ou de macaco reso (por exemplo, SEQ ID NO:143 e/ou SEQ ID NO:10).

Outras leptinas podem ser preparadas deletando-se uma parte de uma sequência de aminoácidos de leptina, desde que tal sequência de aminoácidos de leptina possa produzir uma resposta biológica. Tais sequências de aminoácidos de leptina são fragmentos ativos de leptina. Por exemplo, leptinas murinas maduras, leptinas de macaco reso maduras, leptinas humanas maduras e leptinas de rato maduras, e outras leptinas, todas carecem de sequência de sinal de 21 aminoácidos N-terminal que está presente nas formas de comprimento completo não processadas de tal leptina.

Pode-se preparar os seguintes fragmentos de leptina ativos de tais leptinas maduras: (a) aminoácidos 98 a 146 (b) aminoácidos 1 a 32 (c) aminoácidos 40 a 116 (d) aminoácidos 1 a 99 e (ligados a) 112 a 146 (e) aminoácidos 1 a 99 e (ligados a) 112 a 146 que têm um ou mais dos aminoácidos 100 a 111 colocados entre os aminoácidos 9 9 e 112.

Além disso, tais fragmentos de leptina ativos também podem ser preparados em que um ou mais dos aminoácidos nas posições, por exemplo, na forma 1 de leptina humana madura que são substituídos pelos aminoácidos encontrados na posiçâG (ou posições) correspondente encontrada, por exemplo, nas leptinas maduras de rato, murinas, de macaco, porcinas e/ou bovinas divulgadas acima. Além disso, quaisquer substituições ou alterações podem ser na forma de aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos. .Adicionalmente, a presente invenção abrange ιο i»D i polipéptidos manipulados que compreendem uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina conforme descrito acima, em que a uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina é selecionado de entre: (a) a sequência de aminoácidos 1 a 146 de uma leptina selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO :12. SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :14 3 e SEQ ID NO:144; em que um aminoácido diferente é substituído em uma ou mais das seguintes posições e retém a mesma numeração (mesmo na ausência de um resíduo de glutaminilo na posição 28) : 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145; (b) a sequência de aminoácidos de subparte (a) na qual o resíduo de glutaminilo na posição 28 está ausente; (c) a sequência de aminoácidos de subpartes (a) ou (b) na qual um resíduo de metionilo é adicionado na terminação N; (d) uma leptina que consiste num fragmento da sequência de aminoácidos de (a), (b) ou (c) selecionado a partir do grupo que consiste em: (í) aminoácidos 98 a 146 (ii) aminoácidos 1 a 32 (iii) aminoácidos 40 a 116 (iv) aminoácidos 1 a 99 e 112 a 146 (v) aminoácidos 1 a 99 e 112 a 146 nos quais um ou mais dos aminoácidos 100 a 111 são colocados entre os aminoácidos 99 e 112; e, (vi) a sequência de aminoácidos de subparte (i) em que um ou mais dos aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido; ιο i»D i (vii) a sequência de aminoácidos de subparte (ii) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8 e 32 são substituídos por outro aminoãcido; (viii) a sequência de aminoácidos de subparte (iii) em que um ou mais dos aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 e 112 são substituídos por outro aminoácido; (ix) a sequência de aminoácidos de subparte (iv) em que um ou mais aos aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoãcido; e (x) a sequência de aminoácidos de subparte (v) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 1.02, 105, 1.06, 107, 1.08, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoãcido; (xi) a leptina de qualquer uma das subpartes (i) a (x) em que uma metionina foi adicionada na terminação N; e (e) a leptina de qualquer uma das subpartes (a) até (e) à qual uma porção química é fixada; (f) a leptina de subparte (g) em que a referida porção química é uma porção química de polímero solúvel em água; (g) uma leptina de subparte {£) em que a referida porção química de polímero solúvel em água é polietílenoglícol; (h) uma leptina de subparte (f) em que a referida porção química de polímero solúvel em água é uma. porção química de poliaminoãcido; e (i) uma leptina de qualquer uma das subpartes (e) até (h) em que a referida porção química é fixada apenas à terminação N da referida porção química de proteína.

Em relação ao exposto acima, as leptinas às quais uma porção química é fixada são derivados de leptina. A derivatização de leptinas pela fixação de uma ou mais porções químicas revelou fornecer alguma vantagem sob ιο i»D i determinadas circunstâncias, tal corrtG o aumento da estabilidade e tempo de circulação da proteína terapêutica e a diminuição da imunogenicidade e propensão para, por exemplo, geração de anticorpos neutral!zantes e/ou incidência de reações de sítio de injeção. Veja-se, por exemplo, os documentos n- WO 98/28427, n- US2007/0Q20284, a Patente n- U.S. 4.179.337, Daviset al., depositada em 18 de dezembro de 1979. Para uma revisão, veja-se Abuchowski et al. , em ENZYMES AS DRUGS. (J. S. Holcerberg e J. Roberts, eds. páginas 367 a 383 (1981)); Franciset al., Id. Consequentemente, ao empregar uma leptina derivatizada e um ASM ou um ABD, pode-se vantajosamente gerar os polipéptidos manipulados da invenção que possuem vantagens fornecidas por ambas as entidades.

Os derivados de leptina podem constituir leptinas às quais uma modificação química foi feita de um ou mais de seus grupos laterais de aminoãcido, átomos de a-carbono, grupo amino terminal ou grupo ácido carboxílico terminal. Uma modificação química inclui, porém, sem limitação, ligar uma ou mais porções químicas, criando novas ligações e remover uma ou mais porções químicas. As modificações nos grupos laterais de aminoácido incluem, sem limitação, alquilação, acilação, formação de éster, formação de amida, acoplamento de maleimida, acilação de grupos lisina ε-amino, N-alquílação de arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos ácido carboxílico, glutâmicio ou aspãrtico e desamidação de glutamina ou asparagina. As modificações do amino terminal incluem, sem limitação, modificações de desamino, alquilo N-inferior, alquilo N-di-inferior e N-acilo, tais como alquilacilos, alquilacilos ramificados, alquilaril-acilos. As modificações do grupo carboxi terminal incluem, sem limitação, as modificações de amida, alquil amida inferior, dialquil amida, arilamida, alquilarilamida e éster de alquilo inferior. 0 alquilo inferior é alquilo Ci-C4. Além do mais, um ou mais grupos ιο i»D i laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos pGr grupos protetores conhecidos pelo químico sintético perito na especialidade, 0 α-carbono de um aminoãcido pode ser mono ou dímetílado.

Tais derivados incluem leptinas conjugadas a uma ou mais moléculas de polímero solúveis em água, tais como cadeias de polietilenoglicol ("PEG") ou ácido gordo de vários comprimentos (por exemplo, estearilo, palmítoílo, octanoílo), pela adição de poliaminoãcidos, tais como poli-his, poli-arg, poli-lys e poli-ala ou pela adição de pequenos substituintes de molécula que incluem alquilos curtos e alquilos restritos (por exemplo, ramificados, cíclicos, fundidos, adamantilo) e grupos aromâtícGS. Em algumas formas de realização, as moléculas de polímero solúveis em água terão um peso molecular na faixa de cerca de 500 Daltons a cerca de 60.000 Daltons.

Tais conjugações de polímero podem ocorrer singularmente na terminação N ou C ou nas cadeias laterais de resíduos de aminoácido dentro da sequência de uma leptina conforme divulgado no presente documento. Em alternativa, pode haver múltiplos sítios de derivatizaçâo ao longo da sequência de aminoãcidos de tal leptina. A substituição de um ou mais aminoãcidos por lisina, ácido aspãrtico, ácido glutâmico ou cisterna pode fornecer sítios adicionais para derivatizaçâo. Veja-se, por exemplo, as Patentes n£ U.S. 5.824.784 e n£ 5.824.778. Em algumas formas de realização, uma leptina é conjugada a uma, duas ou três moléculas de polímero.

Em algumas formas de realização, as moléculas de polímero solúveis em água são ligadas a um grupo amino, carboxilo ou tiol e podem ser ligadas por N ou C terminações ou nas cadeias laterais de lisina, ácido aspárticG, ácido glutâmico ou císteína. Em alternativa, as moléculas de polímero solúveis em água podem ser ligadas a grupos diamina e dicarboxílicos, Em algumas formas de ιο i»D i realização, uma leptina é conjugada a uma, duas ou três moléculas de PEG através de um grupo épsilo amino num aminoãcido de lisina.

Derivados de leptina também incluem leptínas com alterações químicas a um ou mais resíduos de aminoãcido. Tais alterações químicas incluem amidação, glicosilação, acilação, sulfatação, fosforilação, acetilação e ciclização. As alterações químicas podem ocorrer singularmente na terminação N ou C ou nas cadeias laterais de resíduos de aminoãcido dentro da sequência de uma leptina. Numa forma de realização, a terminação C destes péptidos pode ter um grupo -OH ou ~NH2 livre. Noutra forma de realização, a extremidade N-terminal pode ser encapsulada com um grupo isobutiloxicarbonilo, um grupo isopropiloxicarbonilo, um grupo n-butiloxicarbonilo, um grupo etoxicarbonilo, um grupo isocaproilo ("isocap"), um grupo octanilo, um grupo actil glicina (denotado como "GÍOct)" ou "octylGly"), um grupo ácido 8-amino-oc:tánico, urn dansilo e/ou um grupo Fmoc. Em algumas formas de realização, a ciclização pode ser através da formação de pontes de dissulfeto. Em alternativa, pode haver múltiplos sítios de alteração química ao longo da sequência de aminoãcidos de leptina.

Em determinadas formas de realização, as leptinas são quimicamente alteradas para incluir um grupo Bolton-Hunter. Os reagentes de Bolton-Hunter são conhecidos na técnica ("Radioimmunoassay and related methods", A. E, Bolton e W. M. Hunter, Capítulo 2 6 de HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUME I, IMMUNOCHEMISTRY, editado por D. M. Weir, Blackwell Scientific Publications, 1986) e podem ser utilizados para introduzir porções químicas do tipo tirosina com ligação neutra, através de grupos oí-amino amino-terminais ou grupos ε-amino da lisina. Em algumas formas de realização, a extremidade N-terminal de uma leptina é modificada com um grupo Bolton-Hunter. Em algumas ιο i»D i formas de realização, um resíduo de lisina interno é modificado com um grupo Bolton-Hunter. Em algumas formas de realização, podem haver múltiplos sítios de modificação de Bolton-Hunter ao longo da sequência de aminoãcidos de leptina. Os reagentes de Bolton-Hunter utilizados para modificação de polipéptido estão comercialmente disponíveis e podem incluir, porém, sem limitação, reagente de Bolton-Hunter solúvel em água, Sulfossuccinimidil-3-[4-hidrofenil]propionato (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) e reagente-2 de Bolton-Hunter, Propionato de N-Succinimidil 3 -(4-hidroxi-3-iodofenil) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japão, n° de catálogo 199--09341). Um grupo Bolton-Hunter exemplificativo conjugado através de uma ligação amida a uma leptina é ilustrado abaixo, em que a linha tracejada passa através da ligação amida:

As leptinas pGdem ser iodadas (tal como radiomarcadas com i23l) antes ou após a modificação de Bolton-Hunter. A fim de preparar polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção, um derivado de leptina para utilização na preparaçâG de tais pode incluir uma ou ma is modificações de um resíduo de aminoácido "não essencial". No contexto da invenção, um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado, por exemplo, derivatizado, sem eliminar ou reduzir substancialmente a atividade (por exemplo, a atividade de agonista) da leptina. Os polipéptidos manipulados da invenção podem incluir derivatizações de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maís resíduos de aminoácido da porção química de leptina; ιο i»D i de entre os mesmGS, um ou mais resíduos de ami node i do podem ser resíduos de aminoácido não essenciais. Adicionalmente, os polipéptidos da invenção podem ser derivatizados de modo a que os mesmos incluam adições de, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 gu mais aminoãcidos da porção química de leptina sem eliminar ou reduzir substancialmente a atividade do polipéptido. Adicionalmente, tais resíduos de aminoácido não essenciais podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido que é recetivo à derivatização conforme descrito por todo o documento.

Conforme utilizado por todo o documento, "aminoácido", "resíduo de aminoácido" e semelhantes referem-· se a aminoãcidos naturais, aminoãcidos não naturais e aminoácidos modificados. A não ser que determinado ao contrário, qualquer referência a um aminoácido, geral ou especificamente pelo nome, inclui referência aos estereoisõmeros D e L se sua estrutura permitir tais formas estereoisoméricas. Os aminoácidos naturais incluem alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gin), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile) , leucina (Leu), Lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Vai). Os aminoãcidos nâG naturais incluem, porém, sem limitação, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido azetidinacarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiínico, ácido 2-aminobutírico, ãcidG 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-amino-heptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisbutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciária, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo- ιο i»D i hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-met i1g1i c ina, N-me ti1i soleuc i na, N-me t ilpenti1g1i c i na, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecõlico e tioprolina. Os aminoácidos não naturais adicionais incluem resíduos de aminoácido modificados que são quimicamente bloqueados, reversível ou irreversivelmente, ou quimicamente modificados no seu grupo amino N-terminal ou seus grupos de cadeia lateral, como, por exemplo, aminoácidos ou resíduos D e L N-metilados, em que os grupos funcionais de cadeia lateral são quimicamente modificados a outro grupo funcional. Por exemplo, os aminoácidos modificados incluem sulfóxido de metionina; metionina sulfona; ácido aspãrtico - (éster beta-metílico), um aminoácido modificado de ácido aspãrtico; N-etilglicina, um aminoácido modificado de glicina; ou alanina carboxamida, um aminoácido modificado de alanina. Os resíduos adicionais que podem ser incorporados são descritos em Sandberg et al. , J. Med. Ctiem. 41: 2.481 a 2.491, 1998.

ConfGrme mencionado acima, as porções químicas adequadas para tal derivatização de leptinas e outros polipéptidos incluem, por exemplo, vários polímeros solúveis em água. De preferência, para utilização terapêutica da preparação de produto final, o polímerG será farmaceuticamente aceitável. Um perito na especialidade terá a capacidade de selecionar o polímero desejado com base em tais considerações, as de se o conjugado de polímero/proteína será utilizado terapeuticamente, e, caso sim, na dosagem desejada, tempo de circulação, resistência à proteõlise e outras considerações. Para os polipéptidos manipulados e as leptinas, a eficácia da derivatização pode ser certificada administrando-se a leptina derivatizada ou o polipéptido manipulado derivatizado, na forma desejada (isto é, por bomba osmôtica ou, mais preferencialmente, por ιο i»D i injeção ou infusão ou, adicionalmente, formulado para entrega oral, pulmonar ou nasal, por exemplo) e observando os efeitos biológicos e as respostas biológicas conforme descrito no presente documento.

Tal polímero solúvel em água pode ser selecionado a partir do grupo que consiste era, por exemplo, poli eti1enoglicol, copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboxímetílcelulose, dextrano, álcool poiivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoãcidos (ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcool poiivinílico. Polietilenoglicol propionaldeído pode ter vantagens no fabrico devido a sua estabilidade em água. Também succinato e estireno também podem ser utilizados.

Os derivados de leptina utilizados no projeto e na preparação de polipéptidos manipulados em conformidade com a invenção podem ser preparados fixando-se poliaminoãcidos ou aminoácidos de ponto de ramificação à porção química de leptina. Por exemplo, o poliaminoácido pode ser uma proteína transportadora adicional, tal como uma porção química Fc, que pode servir para aumentar também a meia-vida de circulação da leptina ou do polipéptido manipulado, além das 'vantagens alcançadas por meio de fixação de um ABM ou um ABD. Adicionalmente, tais poliaminoãcidos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em albumina sérica (tal como albumina sérica humana), um anticorpo adicional ou porção do mesmo (por exemplo, a região Fc) ou outros poliaminoãcidos, por exemplo, polílisínas. Conforme indicado abaixo, a localização da fixação do poliaminoácido pode ser na terminação N da porção química de leptina ou na terminação C ou outros locais entre as mesmas e também pode ιο i»D i ser ligada por uma porção química "ligante" â leptina, tal como um ligante peptídico ou um ligante não peptídico. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietilenoglicol, o peso molecular preferencial está entre cerca de 2 quilodaltons (kDa) e cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indicando que, em preparações de polietilenoglicol, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular determinado) para facilitar o manuseamento e fabrico. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 2 kDa e cerca de 60 kDa. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 2 kDa e cerca de 40 kDa. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 5 k.Da e cerca de 4 0 kDa. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 5 kDa e cerca de 30 kDa. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 5 kDa e cerca de 20 kDa. Em determinadas formas de realização, o polietilenoglicol tem entre cerca de 10 kDa e cerca de 2 0 kDa. Outros tamanhos podem ser utilizados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração da libertação sustentada desejada, as características de solubilidade, os efeitos, se houver, na atividade biológica, a facilidade de manuseamento, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietilenoglicol fixado a uma leptina e/ou a um polipéptido manipulado da invenção). As considerações adicionais que podem influenciar a seleção de um PEG de um peso molecular particular que pode ser fixado a uma leptina para gerar um derivado de leptina em conformidade com a invenção incluem o grau ao qual tal PEG de peso molecular ιο i»D i pode: mitigar a agregação e/'ou aumentar a SGlubilidade da leptina e/ou do polipéptido manipulado, quando presente numa composição ou formulação farmaceuticamente aceitável ou quando exposto a tecidos ou fluidos fisiológicos mediante a administração a um sujeito (tal CGino por injeção); mitigar a incidência de reações de sítio de injeção causadas pela administração da leptina ou do polipéptido manipulado mediante a administração a um sujeito por injeção; mitigar a geração de anticorpos neutralizantes que podem ser criados contra a leptina ou o polipéptido manipulado como um resultado da administração de tal leptina ou polipéptido manipulado a um sujeito; e semelhantes. Várias moléculas de polímero assim fixadas podem variar, e um perito na especialidade terá a capacidade de certificar o efeito resultante na função. Pode-se monoderivatizar ou pode-se fornecer uma di, tri, tetra ou alguma combinação de derivatização com porções químicas iguais ou diferentes (por exemplo, polímeros, tais como diferentes pesos de polietíleno glícóis). A proporção entre as niGlêculas de polímero e as moléculas de leptina ou moléculas de polipéptido manipulado a serem derivatizadas variará, assim como suas concentrações na mistura de reação. Geralmente, a razão ideal, em termos de eficácia de reação em que nâG há nenhuma leptina (ou polipéptido manipulado, conforme pode ser o caso) ou polímero não reagido em excesso, será determinada por fatores tais como o grau desejado de derivatização (por exemplo, mono, di, tri, etc.), o peso molecular do polímero selecionado, se o polímero é ramificado ou não ramificado e as condições de reação.

As porções químicas devem ser fixadas à leptina e/ou ao polipéptido manipulado em consideração aos efeitos nos domínios funcionais ou antigénicos da leptina e/ou do polipéptido manipulado. Há vários métodos de ligação ιο i»D i disponíveis aos perítGS na especialidade. Por exemplo, o documento η- EP 0 401 384 (acoplando PEG a G-CSF), veja-se também Malik et al. , 19 92, Exp. Hematol. 20:1.028 a 1.035 (que relata a peguilação de GM-CSF com a utilização de cloreto de tresilo). Por exemplo, polietilenoglicol pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoácido por meio de um grupo reativo, tal como um grupo carboxilo ou amino livre. Os grupos reativos sáo aqueles aos quais uma molécula de polietilenoglicol ativada pode ser ligada. Os resíduos de aminoácido que têm um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e o resíduo de aminoácido N-terminal. Aqueles que têm um grupo carboxilo livre podem incluir resíduos de ácido aspártíco, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido C-terminal. Os grupos sulfidrilo podem também ser utilizados como um grupo reativo para ligar a molécula (ou moléculas) de polietilenoglicol. É preferencial para propósitos terapêuticos a fixação num grupo amino, tal como a fixação na terminação N ou grupo lisina. A fixação em resíduos importantes para a ligação a recetor deve ser evitada se a ligaçâG a recetor for desejada.

Pode-se desejar especificamente projetar e preparar uma leptina quimicamente modificada em N-terminal para utilização na preparação dos polipéptidos manipulados da divulgação. Utilizando-se polietilenoglicol como uma ilustração das presentes composições, pode-se selecionar a partir de uma variedade de moléculas de polietilenoglicol (por peso molecular, ramificação, etc.) a proporção entre moléculas de polietilenoglicol e moléculas de leptina ou de polipêptido manipulado, conforme pode ser o caso, na mistura de reação, o tipo de reação de peguilação a ser realizado e o método para obter a proteína peguilada em N-terminal selecionada. 0 método para obter a preparação peguilada em N-terminal (isto é, separar essa porção química de outras porções químicas monopeguliadas se ιο i»D i necessário) pode ser pela purificação do material peguilado em N-terminal de uma população de moléculas de proteína peguiladas. A modificação química N-terminal seletiva pode ser realizada pela alquílação redutiva que explora a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupGS amino primários (lisina versus o N-terminal) disponíveis para derivatização numa proteína particular. Sob as condições de reação apropriadas, a derivatização substancialmente seletiva da proteína na terminação N com um grupo carbonilo contendo polímero é alcançada. Por exemplo, pode-se peguilar seletivamente em N-terminal a proteína realizando-se a reação num pH que permite que se aproveitem das diferenças de pKa entre o grupo ε-amino dos resíduos de lisina e este do grupo a-amino do resíduo N-terminal da proteína. Por tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em água a uma proteína é controlada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente na terminação N da proteína, e nenhuma modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino de cadeia lateral de lisina, ocorre. Utilizando-se a alquílação redutiva, o polímero solúvel em água pode ser do tipo descrito acima e deve ter um único aldeído reativo para acoplamento à proteína. Polietilenoglicol propionaldeído, que contém um único aldeído reativo, pode ser utilizado.

Em algumas formas de realização, são fornecidos compostos que têm um ligante, por exemplo, Ll, conforme descrito no presente documento, que liga covalentemente um domíniG de hormona de polípéptido a um péptido de ABD. Em algumas formas de realização, um primeiro ligante (Ll) liga covalentemente o HD1 dentro do polípéptido manipulado. Em algumas formas de realização, o domínio de hormona de polípéptido (por exemplo, HD1), conforme descrito no presente documento, pode ser covalentemente ligado ao péptido de ABD por meio de um ligante peptídico. Qualquer ιο i»D i ligante ê opcional; isto ê, qualquer ligante pode simplesmente ser uma ligação. Quando presente, a estrutura química de um ligante não é crítica visto que cumpre princípalmente uma função espaçadora. Numa forma de realização, o ligante compreende de 1 a 3 0 ou menos aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os aminoãcidos podem ser selecionados de entre 20 aminoácidos de ocorrência natural. De modo alternativo, aminoãcidos não naturais podem ser incorporados por síntese química, modificação química pós-translacional ou por incorporação in vivo por expressão recombinante numa célula hospedeira. Alguns desses aminoãcidos podem ser glicosilados.

Em determinadas fGrmas de realização, o 1 a 3 0 ou menos aminoácidos são selecionados de entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, lisina, aspartato e glutamato. Numa forma de realização adicional, o ligante é constituído de uma maior parte de aminoãcidos que são estericamente desimpedidos, tais como glicina, alanina e/ou serina. As poliglicinas são particularmente úteis, por exemplo, (Gly)3, (Gly)4 (SEQ ID N0:116), (Gly)5 (SEQ ID NO:117), assim como as pGlíalaninas, motivos de poli(Gly-Ala) , poli (Glyn-Ser) , poli (Glyn-Glu) , poli (Glyn-Lys) , poli (Glyn-Asp) e poli (Glyn-Arg) . Outros exemplos específicos de ligantes são (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO : 118) ; (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID N0:119); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 120); e GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO :121) . Combinações de Gly e Ala são particularmente úteis, assim como a combinação de Gly e Ser. Assim, numa forma de realização adicional, o ligante peptídico é selecionado a partir do grupo que consiste num péptido rico em glicina, por exemplo, Gly-Gly-Gly; as sequências [Gly-Ser] n (SEQ ID NO:122), [Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO:123), [Cly-Cly-Cly-Ser]n (SEQ ID MO :124) e [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 12 5) , em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, por exemplo, [Gly-Gly-Gly Ser] u [Gly-Gly-Gly-Gly ιο i»D i

Ser]lf [Gly-Gly-Gly Ser]4 ou [Gly-Gly-Gly-Gly Ser]3,

Em determinadas formas de realização, ligantes carregados podem ser utilizados. Tais ligantes carregados podem conter uma quantidade significativa de resíduos ácidos (por exemplo, Asp, Glu e semelhantes) , ou pGdem conter uma quantidade significativa de resíduos de base (por exemplo, Lys, Arg e semelhantes), de modo que o ligante tenha um pi inferior a 7 ou superior a 7, respetivamente. Conforme compreendido pelo perito na especialidade, e todas as outras coisas sendo iguais, quanto maior a quantidade relativa de resíduos ácidos ou básicos num dado ligante, menor ou maior, respetivamente, será o pi do ligante. Tais ligantes pGdem conferir vantagens aos polipéptidos manipulados divulgados no presente documento, tais como aprimoramento das característícas de solubilidade e/ou estabilidade de tais polipéptidos num pH particular, tal como um pH fisiológico (por exemplo, entre pH 7,2 e pH 7,6, inclusivo), ou um pH de uma composição farmacêutica que compreende tais polipéptidos.

Por exemplo, um "ligante ácido" é um ligante que tem um pi inferior a 7; entre 6 e 7, inclusivo; entre 5 e 6, inclusivo; entre 4 e 5, inclusivo; entre 3 e 4, inclusivo; entre 2 e 3, inclusivo; ou entre 1 e 2, inclusivo. De modo semelhante, um "ligante básicG" é um ligante que tem um pi superior a 7; entre 7 e 8, inclusivo; entre 8 e 9, inclusivo; entre 9 e 10, inclusivo; entre 10 e 11, inclusivo; entre 11 e 12, inclusivo, ou entre 12 e 13, inclusivo. Em determinadas formas de realização, um ligante ácido conterá uma sequência que é selecionada a partir do grupo que consiste em [Gly-Glu]n (SEQ ID NO:126); [Gly-Gly-Gluln (SEQ ID NO:127); [Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:128); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]„ (SEQ ID NO:129), [Gly-Asp]„ (SEQ ID NO:130) ; [Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID N0:131); [Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO:132); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:133), ιο i»D i em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais; por exemplo, [Gly-Gly-Glu]6. Em determinadas formas de realização, urn ligante básico conterá uma sequência que é selecionada a partir do grupo que consiste em [Gly~Lys]n (SEQ ID NO:134); [Gly-Gly-Lys]n (SEQ ID NO:135); [Gly-Gly-Gly-Lys]n (SEQ ID NO:136); [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n (SEQ ID NO :137), [Gly-Arg]n (SEQ ID NO:138); [Gly-Gly-Arg]n (SEQ ID NO:139); [Gly-Gly-Gly-Arg]n (SEQ ID NO:140); [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n (SEQ ID NO :141), em que n ê 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais; por exemplo, [Gly-Gly-Lys]6.

Adicionalmente, podem ser preparados ligantes que possuem determinados motivos ou características estruturais, tais como uma hélice a. Por exemplo, tal ligante pode conter uma sequência que é selecionada a partir do grupo que consiste em [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n (SEQ ID NO :142), em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais; por exemplo, [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3, [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4 ou [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5 .

Adicionalmente, um ligante não peptídico pode ser empregue para servir como a porção química de LI de um polipéptídG manipulado descrito no presente documento. Por exemplo, conforme é compreendido na técnica, um ligante não peptídico exemplificativo, tal como um ligante de PEG, pode ser empregue dessa forma. Veja-se, por exemplo, o documento n- W02000024782. Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 1.000 kDa. Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 500 kDa. Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 100 kDa. Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 50 kDa. Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 10 kDa. Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 5 kDa. Em determinadas formas ιο i»D i de realização, tal ligante de PEG tem um peso molecular de 100 Da a 1 kDa, Em determinadas formas de realização, tal ligante de PEG tern um peso molecular de 100 Da a 500 Da.

Deve-se compreender também que lígantes adequados para utilização de acordo com a invenção podem possuir uma ou mais das características e motivos descritos acima. Por exemplo, um ligante pode compreender um ligante ácido, assim como um motivo estrutural, tal como uma hélice alfa. De modo semelhante, um ligante pode compreender um ligante básico e um motivo estrutural, tal como uma hélice alfa. Um ligante pode compreender um ligante ácido, um ligante básico e um motivo estrutural, tal como uma hélice a. Adicionalmente, deve-se compreender também que polipéptidos manipulados de acordo com a invenção podem possuir mais de um ligante, e cada tal ligante pode possuir uma ou mais das características descritas acima.

Os lígantes descritos no presente documento são exemplificativos, e os lígantes dentro do âmbito desta invenção podem ser muito mais longos e podem incluir outros resíduos. Numa forma de realização, polipéptidos manipulados nos quais o composto de leptina é díretamente ligado ao ABD sem um ligante são expressamente excluídos.

Em algumas formas de realização, o polipéptido manipulado inclui um ABD no N-terminal e um HD1 no C- terminal. De maneira inversa, em algumas formas de realização, o polipéptido manipulado inclui um ABD no C-terminal e um EDI no N-terminal. Em algumas formas de realização, o N-terminal ou o C-terminal é uma leptina, um fragmento de leptina ou um análogo de leptina. De preferência, o ABD está na terminação N de um composto de leptina. Além das formas de realização que incluem um ABD e um HD1, o polipéptido manipulado pode ter a estrutura ABD-HD1 ou HD1-ABD (ambas lidas na orientação de N-terminal para C-terminal).

Compreende-se que na ausência de uma indicação ιο i»D i expressa da terminação N e/ou terminação C de urn polipéptido manipulado apresentado no presente documento, ο polipéptido manipulado deve ser lido na orientação de terminação N para terminação C. Por exemplo, quando HD1 for uma leptina ou análogo da mesma, os termos HD1-ABD, HD1-L1-ABD, HD1-ABD e semelhantes significam, na ausência de uma indicação expressa da terminação N e/ou da terminação C, que o composto de leptina reside na terminação N do polipéptido manipulado, e o ABD reside na terminação. De maneira inversa, caso a terminação N e/ou a terminação C sejam expressamente indicadas, então, o polipéptido manipulado deve ser lido de acordo com a indicação expressa das terminações. Por exemplo, os termos HDlc-term-ABD, HD1-Ll-ABDM-term e semelhantes significam que o ABD reside na terminação N do polipéptido manipulado e EDI reside na terminação C.

Em algumas formas de realização dos polipéptidos manipulados descritos acima, HD1 é leptina ou metreleptina humana. Em algumas formas de realização adicionais, EDI é um análogo de leptina conforme descrito no presente documento. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina é leptina A100, A300 ou A500,

Em algumas formas de realização, o polipéptido manipulado descrito no presente documento tem uma afinidade com albumina sérica que é diferente da afinidade do polipéptido de ABD sozinho, isto é, na ausência de um domínio de hormona conjugado. A fim de obter associação eficaz, o polipéptido manipulado pode ter uma afinidade de ligaçâG para albumina sérica de modo que a constante de dissociação KD seja, por exemplo, inferior a cerca de 10"° M, 1Q“7 Μ, 10'8 Μ, ΙΟ'9 Μ, IO"10 M, 1CT11 Μ, ΙΟ"12 Μ, 10'13 M, IO'14 M ou até 1CT15 M. Em algumas formas de realização, a afinidade não é excessivamente estreita de modo que o polipéptido manipulado possa dissociar-se da albumina e produzir uma resposta biológica, por exemplo, ligando-se a ιο i»D i um recetGr, por exemplo, um recetor de leptina. A afinidade pode ser medida conforme descrito no Pedido Publicado PCT n- WO 2009/016043, de preferência para albumina sêrica humana.

Em algumas formas de realização, um polipêptido manipulado descrito no presente documento é superior a um composto correspondente que tem uma porção química diferente que pode estender a meia-vida de plasma (por exemplo, PEG ou de Fc ou albumina) conjugado com um domínio (ou domínios) de hormona. Nesse contexto, o termo "superior" refere-se a uma variedade de propriedades funcionais que poderiam ser ponderadas na avaliação de um tratamento para uma dGença ou distúrbio. Por exemplo, o polipêptido manipulado descrito no presente documento poderia exigir um componente menos biologicamente ativo (domínio de hormona) , por exemplo, IX, 2X, 3X, 4X, 5X ou ainda menos, do que o composto correspondente que tem uma porção química diferente conjugada com o domínio 9ou domínios) de hormona. Para outro exemplo, o polipêptido manipulado descrito no presente documento poderia ter potência mais alta, por exemplo, 1,5X, 2X, 3X, 4X, 5X, 10X, 20X, 50X ou potência ainda mais alta.

Compostos de polipêptido manipulado contemplados no presente documento incluem os compostos conforme apresentado na Tabela 2 a seguir. ιο i»D i

Tabela 2. P&amp;£ipepbdos manípelades seleclesiades

ιο i»D i

ιο i»D i

ιο i»D i

ιο i»D i

ιο i»D i

ιο i»D i

ιο i»D i

Os compostos das sequências acima nas quais a metionina N-terminal está ausente, por exemplo, em que o N-terminal começa com VPIQKV ou LAEAK, por exemplo, para compostos de leptina são especificamente contemplados. A metionina N-terminal está presente principalmente como uma ιο i»D i conveniência para expressão bacteriana. No entanto, os péptidos conjugados da presente invenção podem ser expressos numa célula hospedeira eucariõtica (por exemplo, levedura (por exemplo, Pichia), mamífero, baculovírus) ou outra célula hospedeira que tem processamento proteolítico N-terminal pós-translacional para render um aminoãcido N-terminal conforme encontrado numa contraparte de péptido maduro de ocorrência natural da sequência de ABD ou hormona desejada. De modo alternativo, uma sequência N-terminal utilizada para a expressão e/ou secreção pode ser uma sequência que pode ser removida de maneira pós-translacional, por exemplo, através da utilização de uma prGtease, tal como TEV. TTT ohotôIio &amp; «b nAr. >> · Λ Λ W V* V/VaS/ Μ rvv J v** (>< w v** M WWi UiV tA\/

Projeto da construtos. Os polipéptidos manipulados descritos no presente documento podem ser projetados no nível de aminoãcido. Essas sequências podem, então, ser retrotraduzidas com a utilização de uma variedade de produtos de software conhecidos na técnica de modo que a sequência de nucleõtido seja otimizada para o hospedeiro de expressão desejado, por exemplo, expressão de proteína baseada, otimização de codão, teor de sítio de restrição. Por exemplo, a sequência de nucleótidos pode ser otimizada para expressão de proteína com base em E, coli e para teor de sitio de restrição. Com base na sequência de nucleótidos de interesse, oligonucleótidos sobrepostos podem ser fornecidos para PCR de múltiplas etapas, conforme conhecido na técnica. Esses oligonucleótidos podem ser utilizados em múltiplas reações PCR sob condições bem conhecidas na técnica para construir o cDNA que codifica a proteína de interesse. Para um exemplo é Tampão Amplitaq IX, MgCi2 a 1,3 mM, dNTPs a 200 uM, Amplitaq Gold a 4 U, 0,2 uM de cada iniciador (AmpliTaq Gold, ABI), com parâmetros de cíclagem: (94C:30 s, 58C:1 min, 72C:1 min) , 35 ciclos. ιο i»D i Sítios de restrição podem ser adicionados às extremidades dos produtos de PCR para utilização na ligação de vetor conforme conhecido na técnica. Os sítios específicos podem incluir Ndel e Xhol, de modo que o cDNA possa, então, estar no quadro de leitura apropriado num vetor de expressão pET45b (Novagen). Utilizando-se esses sítios, qualquer Etiqueta His N-terminal que está nesse vetor pode ser removida na medida que o sítio de início de tradução estaria, então, a jusante da etiqueta. Uma vez que os construtos de expressão são concluídos, uma verificação pode ser conduzida por sequenciação utilizando, por exemplo, iniciador promotor T7, iniciador terminador T7 e protocGlos padrão ABI BigDye Term v3.1 conforme CGnhecido na técnica. As informações de sequência podem ser obtidas a partir de, por exemplo, um Analisador de ADNABI 3730 e podem ser analisadas utilizando o software Vector NTI v.10 (Invitrogen). Os construtos de expressão podem ser projetados de uma maneira modular de modo que sequências ligantes possam ser facilmente cortadas e alteradas, conforme conhecido na técnica.

Os sítios de reconhecimento de prGtease, conhecidos na técnica ou descritos no presente documento, podem ser incorporados em construtos úteis para o projeto, construção, manipulação e produção de polipéptidos manipulados recombinantes descritos no presente documento. Métodos gerais da produção. Os polipéptidos manipulados descritos no presente documento podem ser preparados com a utilização de conjuntos de procedimentos biológicos, químicos e/ou de ADM recombinante que são conhecidos na técnica. Os métodos exemplificativos são descritos no presente documento e nas Patentes n9 US 6.872.700; n9 WO 2007/139941; n- WO 2007/140284; n- WO 2008/082274; n9 WO 2009/011544; e na Publicação n9 US 2007/0238669. Outros métodos para preparar os compostos são apresentados no presente documento. ιο i»D i

Os polipéptidGS manipulados descritos no presente documento podem ser preparados com a utilização de conjuntos de procedimentos de síntese de péptido de fase sólida padrão, tal como um sintetizador de péptido automatizado ou semiautomatizado. Tipicamente, utilizando-se tais conjuntos de procedimentos, um aminoãcido protegido com alfa-N-carbamoílo e um aminoãcido fixado à cadeia de péptido em crescimento numa resina são acoplados à RT num solvente inerte (por exemplo, dimetilformamida, N-metilpirrolidinona, cloreto de metileno e semelhantes) na presença de agentes de acoplamento (por exemplo, diciclo-hexilcarbodi-imida, 1-hidroxibenzo-triazol e semelhantes) na presença de uma base (por exemplo, di-isopropiletilamina e semelhantes). 0 grupo protetor de alfa-N-carbamoílo é removido da resina peptídica resultante com a utilização de um reagente (por exemplo, ácido trifluoroacético, piperidina e semelhantes), e a reação de acoplamento repetida com o próximo aminoãcido N-protegido desejado a ser adicionado à cadeia de péptido. Os grupos N-protetores adequados são bem conhecidos na técnica, tais como t-butiloxicarbonilo ítBoc) fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) e semelhantes. Os solventes, derivados de aminoãcido e resina de 4 - met i 1 benz i d r i 1 - am i na. utilizados no sintetizador de péptido podem ser adquiridos junto à Applied Biosístemas Inc. (Foster City, Califórnia) .

Para síntese química, a síntese de péptido de fase sólida pode ser utilizada para os polipéptidos manipulados, jã que, em geral, a síntese de fase sólida é uma abordagem direta com excelente escalabilidade para escala comercial, e é geralmente compatível com polipéptidos manipulados relativamente longos, A síntese de péptido de fase sólida pode ser executada com um sintetizador de péptido automático (Modelo 430A, Applied Biosístemas Inc., Foster City, Califórnia) utilizando o sistema NMP/HOBt (Opção 1) e química tBoc ou Fmoc (Veja-se Applied Biosístemas User’s ιο i»D i

Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Versão 1.3B, 1 de julho de 1988, secção 6, páginas 49 a 70, Applied Biosistemas, Inc., Foster City, California) corn encapsulação. As resinas de Boc-péptido podem ser clivadas com HF (-5 °C a 0 °C, 1 hora). 0 péptído pode ser extraído da resina com água e ácido acético alternados, e os filtrados liofilizados, As resinas de Fmoe-péptido podem ser clivadas de acordo com métodos padrão (por exemplo, Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosistemas, Inc. , 1990, páginas 6 a 12) . Os pêptidos podem também ser montados utilizando um Sintetizador Advanced Chem Tech (Model MPS 350, Louisville, Ky.).

Os compostGS descritos no presente documento pGdem também ser preparados utilizando conjuntos de procedimentos de ADN recombinante que utilizam os métodos conhecidos na técnica, tal como Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Edição, Cold Spring Harbor. Os compostos de não péptído podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, aminoácidos contendo fosfato e pêptidos contendo tais aminoácidos podem ser preparados com a utilização de métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Bartlett et al, 1986, Biorg. Chem. 14:356 a 377.

Os polipéptidos manipulados podem ser De modo alternativo produzidos por conjuntos de procedimentGS recombinantes bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Sambrook. et al. , 1989 (Id.) . Esses polipéptidos manipulados produzidos por tecnologias recombinantes podem ser expressos a partir de um polinucleótido. Um perito na especialidade entenderá que os polinucleótidos, incluindo .ADN e ARN, que codificam tais polipéptidos manipulados podem ser obtidos a partir do cDNA do tipo selvagem, por exemplo, leptina humana, levando-se em consideração a degenerescência da utilização de codão, e podem ser adicionalmente manipulados conforme desejado para ιο i»D i incorporar as substituições adequadas. Essas sequências de polinucleótidos podem incorporar ciõdãos que facilitam a transcrição e a tradução de mRNA em hospedeiros microbianos. Tais sequências de fabrico podem ser prontamente construídas de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, o documento n2 WO 83/04053. Os polinucleótidos acima podem também codificar um resíduo de metionilo N-terminal. Os compostos de não péptido úteis na presente invenção podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, aminoãcidos contendo fosfato e péptidos contendo tais aminoácidos podem ser preparados com a utilização de métodos conhecidGS na técnica. Veja-se, por exemplo, Bartlett e Landen, 1986, Bioorg. Chem. 14: 356 a 77.

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão/hospedeiro pode ser utilizada para conter e expressar uma sequência de codificação de polipéptido manipulado. Os mesmos incluem, porém, sem limitação, micro-organismos tais como bactérias transformadas com vetores de expressão de bacteriõfago, plasmídeo ou ADN cosmídico recombinantes; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de célula de inseto infetados com vetores de expressão de 'vírus (por exemplo, baculovírus) ; sistemas de célula vegetal transfretados com vetores de expressão de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com 'vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de célula animal. As células de mamíferos que sâo úteis em produções de proteínas recombinantes incluem, porém, sem limitação, células VERO, células HeLa, linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO), células COS (tais como COS-7) , células WI 38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 e 293. Os protocolos exemplif icativos para a expressão recombinante da proteína são descritos no ιο i»D i presente documento e/ou são conhecidos na técnica.

Como tais, sequências de polinucleõtidos são úteis na geração de vetores de ADN de plasmídeo e virais novos e úteis, células hospedeiras procariõticas e eucarióticas transfetadas novas e úteis (incluindo células bacterianas, de levedura e de mamíferos cultivadas em cultura) e métodos novos e úteis para crescimento em cultura de tais células hospedeiras com a capacidade de expressão dos presentes polipéptidos manipulados. As sequências de polinucleõtidos que codificam polipéptidos manipulados no presente documento podem ser úteis para terapia gênica em ocorrências em que a subprodução de polipéptidos manipulados seria aliviada ou a necessidade de níveis aumentacios cie tais seria satisfeita. A presente invenção também fornece processos para produção de ADN recombinante dos presentes polipéptidos manipulados. É fornecido um processo para produzir os polipéptidos manipulados a partir de uma célula hospedeira contendo ácidos nucleicos que codificam o polipéptido manipulado que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira contendo polinucleõtidos que codificam o polipéptido manipulado sob condições que facilitam a expressão da molécula de ADN; e (b) obter o polipéptido manipulado.

As células hospedeiras podem ser procariõticas ou eucarióticas e incluem bactérias, células de mamíferos (tais como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de macaco, células de rim de hamster filhote, células de cancro ou outras células), células de levedura e células de inseto.

Os sistemas hospedeiros de mamífero para a expressão da proteína recombinante são também bem conhecidos pelos peritos na especialidade. As estirpes de célula hospedeira podem ser escolhidas por uma capacidade particular para processar a proteína expressa ou produzir determinadas modificações põs-tradução que serão úteis no fornecimento ιο i»D i da atividade de proteína. Tais modificações do pGlípéptido incluem, porém, sem limitação, acetilaçáo, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. 0 processamento pós-traducional, que cliva uma forma "pré-pró·" da proteína, pode também ser importante para a inserção, dobramento e/ou função corretos. Diferentes células hospedeiras, tais como CEO, HeLa, MDCK, 293, WI38 e semelhantes, têm maquinaria celular específico e mecanismos caracterí sticos para tais atividades pôs-traducíonaís e podem ser escolhidas para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína estranha introduzida.

De modo alternativo, um sistema de levedura pode ser empregado para gerar os polipêptidos manipulados da presente invenção. A região de codificação do ADN de polipêptidos manipulados é amplificada por PCR. Um ADN que codifica a sequência de iniciação pré-pró-alfa de levedura é amplificado a partir do ADN genómíco de levedura numa reação PCR com a utilização de um iniciador contendo os nucleõtidos 1 a 20 do gene de fator conjugado alfa e outro iniciador complementar aos nucleótídos 255 a 235 desse (Kurjan e Herskowitz, 1982, Cell, 30:933 a 943). Os fragmentos de sequência de codificação de iniciação pré-pró-alfa e sequência de codificação de polipéptido manipulado são ligados num plasmídeo que contém o promotor de álcool desídrGgenase de levedura (ADH2), de modo a que o promotor direcione a expressão de uma proteína de fusão que consiste no fator pré-pró-alfa fundido ao polipéptido manipulado maduro. Conforme ensinado por Rose e Broach, Meth. Enz. 185: 234 a 279, Goeddel Edição, Academic Press, Inc. , San Diego, Califórnia (1990), o vetor inclui adicionalmente um terminador de transcrição de ADH2 a jusante do sítio de clonagem, a origem de replicação de "2 mi crones" de levedura, o gene leu-2d de levedura, os genes REP1 e REP2 de levedura, o gene de beta-lactamase de E. coli e uma origem de replicação de E. coli. Os genes de ιο i»D i beta-lactamase e leu-2d fornecera a seleção em bactérias e leveduras, respetivamente. 0 gene leu-2d também facilita ο número de cópias aumentado do plasmídeo na levedura para induzir níveis mais altos de expressão. Os genes REP1 e REP2 codificam as proteínas envolvidas na regulação do número de cópias de plasmídeo. 0 construto de ADN descrito no parágrafo anterior é transformado em células de levedura com a utilização de um método conhecido, por exemplo, tratamento com acetato de lítio (Stearns et al. , 1990, Meth. Enz. 185: 280 a 297) . 0 promotor de ADH2 é induzido mediante a exaustão de glicose no meio de crescimento (Price et al., 1987, Gene 55:287) . A sequência pré-pró-alfa efetua secreção da proteína de fusão a partir das células. Concomitantemente, a proteína KEX2 de levedura cliva a sequência pré-pró dos polipéptidos manipulados maduros (Bitter et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Scí. EUA 81:5.330 a 5.334).

Os polipéptidos manipulados da invenção podem também ser expressos de modo recombinante em levedura, por exemplo, Pichia, com a utilização de um sistema de expressão comercialmente disponível, por exemplo, o Sistema de Expressão de Pichia (Invitrogen, San Diego, Califórnia), seguindo-se as instruções do fabricante. Esse sistema também depende da sequência pré-pró-alfa para direcionar a secreção, mas a transcrição do inserto é acionada pelo promotor de álcool oxidase (A0X1) mediante a indução por metanol. 0 polipéptido manipulado secretado é purificado a partir do meio de crescimento de levedura, por exemplo, pelos métodos utilizados para purificar o referido polipéptido manipulado de sobrenadantes celulares bacterianos e de mamíferos.

De modo alternativo, o ADN que codifica um polipéptido manipulado pode ser clonado num vetor de expressão de baculovírus, por exemplo pVL1393 (PharMingen, San Diego, Califórnia). Esse vetor de codificação de polipéptido ιο i»D i manipulado é, então, utilizado de acordo com as orientações do fabricante (PharMingen) ou técnicas conhecidas para infetar células de Spodoptera frugiperda, cultivado, por exemplo, em meio sem proteína sF9, e para produzir proteína recombinante. A proteína é purificada e concentrada a partir do meio com a utilização de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, uma coluna de heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, Nova Jérsia) e colunas de dimensionamento molecular sequenciais (Amicon, Beverly, Massachusetts), e ressuspensa em solução adequada, por exemplo, PBS. Análise SDS-PAGE pode ser utilizada para caracterizar a proteína, por exemplo, mostrando uma única banda que confirma o tamanho do polipéptido manipulado, assim como a análise de sequência de aminoãcidos completa, por exemplo, sequenciação de Edman num Sequenciador de Péptidos Proton 2090, ou confirmação de sua sequência N-terminal.

Por exemplo, a sequência de ADN que codifica o polipéptido manipulado maduro previsto pode ser clonada num plasmídeo contendo um promotor desejado e, opcionalmente, uma sequência de iniciação (veja-se, por exemplo, Better et al. , 1988, Science 240:1.041 a 1.043). A sequência desse construto pode ser confirmada por sequenciação automatizada. 0 plasmídeo é, então, transformado na estirpe de E. coli, estirpe MC1061, com a utilização de procedimentos que empregam incubação de CaC12 e tratamento de choque térmico das bactérias (Sambrook et al. , Id.) . As bactérias transformadas são cultivadas em meio LB suplementado com carbenicilina, e a produção da proteína expressa é induzida por cultivo num meio adequado. Se presente, a sequência de iniciação afetará a secreção do polipéptido manipulado maduro e será clivada durante a secreção. 0 polipéptido manipulado recombinante secretado é purificado do meio de cultura bacteriano pelo método descrito no presente documento. ιο i»D i

De modo alternativo, os polipêptidos manipulados podem ser expressos num sistema de inseto. Os sistemas de inseto para expressão de proteína são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Em tal sistema, o vírus da poliedrose nuclear de Autographs California (AcNPV) é utilizado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência de codificação de polipéptido manipulado é clonada numa região não essencial do vírus, tal como o gene de poliedrina e colocada sob o controlo do promotor de poliedrina. A inserção bem-sucedida de um polipéptido manipulado tornará o gene de polí-hedrina inativo e prGduzirã g vírus recombinante sem revestimento de proteína de revestimento. Os vírus recombinantes são, então, utilizados para infetar células de S. frugiperda ou Trichoplusia larvae em que um polipéptido manipulado da presente invenção é expresso (Smith et al,, 1983, J. Virol. 46:584; Engelhard et al, , 1994, Proc. Matl. Acad. Sei. EUA 91 :3,224 a 3,227) .

Em outro exemplo, a sequência de ADN que codifica os polipéptídGS manipulados pode ser amplificada por PCR e clonada num vetor apropriado, por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, Nova Jersey). 0 vetor pGEX é projetado para produzir uma proteína de fusão que compreende glutationa-S-transferase (GST), cGdificada pelo vetor e uma proteína codificada por um fragmento de ADN inserido no sítio de clonagem do vetor. Os iniciadores para a PCR podem ser gerados para incluir, por exemplo, um sítio de clivagem apropriado. A prGteína de fusão recombinante pode, então, ser clivada a partir da porção de GST da proteína de fusão. 0 construto de pGEX-3X/polipéptido manipulado é transformado em células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla, Califórnia), e transformantes individuais são isolados e cultivados a 37 °C em meio LB (suplementado com carbenicilina) a uma densidade ótica a um ιο i»D i comprimento de onda 6 00 nm de 0,4, seguido pela incubação adicional por 4 horas na presença de Isopropil beta-D-tiogalactopiranósido a 0,5 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). 0 ADN de plasmídeo de transformantes individuais é puríficadG e parcialmente sequenciado com a utilização de um sequenciador automatizado para confirmar a presença do insert© de gene de codificação de polipéptido manipulado desejado na orientação apropriada. A proteína de fusão, quando se espera que seja produzida como um corpo de inclusão insolúvel nas bactérias, pode ser purificada conforme descrito acima ou conforme segue. As células são colhidas por centrifugação lavadas em NaCl a 0,15 M, Tris a 10 mM, pH 8, EDTA a 1 mM; e tratadas com 0,1 mg/mL de lisozima (Sigma Chemical Co.) por 15 minutos à RT. 0 lisato é retirado por sonicação, e os restos de células são peletizados por centrifugação por 10 minutos a 12.000 xg. 0 pêlete contendo proteína de fusão é ressuspenso em Tris a 50 mM, pH 8 e EDTA a 10 mM, sobreposto sobre glicerol 50% e centrifugado por 30 min. a 6.000 xg. 0 pélete é ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) padrão livre de Mg++ e Ca++. A proteína de fusão é adicionalmente purificada fracionando-se o pélete ressuspenso num gel de poliacrilamida SDS desnaturante (Sambrook et al., supra). 0 gel é embebido em KC1 a 0,4 M para visualizar a proteína que é extirpada e eletroeluída em tampão de execução em gel sem SDS. Se a proteína de fusão de polipéptido manipulado/GST for produzida em bactérias como uma proteína solúvel, a mesma pode ser purificada utilizando o Módulo de Purificação de GST (Pharmacia Biotech).

A proteína de fusão pode ser submetida à digestão para clivar a GST do polipéptido manipulado maduro. A reação de digestão (20 a 40 pg de proteína de fusão, 20 a 30 unidades de trombina humana (4.000 U/mg (Sigma) em 0,5 mL de PBS) é incubada por 16 a 4 8 h à RT e carregada num gel SDS-PAGE ιο i»D i desnaturante para fracionar os produtos de reação. 0 gel é embebido em KC1 a 0,4 M para visualizar as bandas de proteína, A identidade da banda de proteína correspondendo ao peso molecular esperado do polipéptido manipulado pode ser confirmada pela análise de sequência de aminoãcidos parcial que utiliza um sequenciador automatizado (Applied Biosistemas Modelo 4 73A, Foster City, Califórnia).

Num método particularmente exemplificativo da expressão recomhinante dos poiipéptidos manipulado da presente invenção, 293 células podem ser cotransfetadas com plasmídeos contendo o cDNA de poiipéptidos manipulados no vetor pCMV (promotor CMV 5', sequência HGH poli A 3') e pSV2neo (que contém o gene de resistência neo) pelo método de fosfato de cálcio. Numa forma de realização, os vetores devem ser linearizados com Seal antes da transfeção. De modo semelhante, um construto alternativo que utiliza um vetor pCMV semelhante com o gene neo incorporado pode ser utilizado. As linhagens celulares estáveis são selecionadas a partir de clones de célula única limitando--se a diluição no meio de crescimento contendo 0,5 mg/mL de G418 (antibiótico dG tipo neomicina) pGr 10 a 14 dias. As linhagens celulares são triadas por expressão de poiipéptidos manipulados por ELISA ou Western blot, e as linhagens celulares de alta expressão são expandidas para crescimento em larga escala. É preferencial que as células transformadas sejam utilizadas para produção de proteína de alto rendimento a longo prazo, e, como tal, expressão estável é desejável. Uma vez que tais células sâG transformadas com vetores que contêm marcadores selecionáveis juntamente com a cassete de expressão desejado, as células podem ser deixadas a crescer por 1 a 2 dias num meio enriquecido antes que as mesmas sejam comutadas para o meio seletivo. 0 marcador selecionável é projetado para conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento e a ιο i»D i recuperação de células que expressam de modo bem-sucedido as sequências introduzidas. Os agregados resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados com a utilização de conjuntos de procedimentos de cultura de tecido apropriados para a célula. Vários sistemas de seleção podem ser utilizados para recuperar as células que foram transformadas para produção de proteína recombinante. Tais sistemas de seleção incluem, porém, sem limitação, genes de HSV timidina quinase, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase e adenina fosforribosiltransferase, em células tk, hgprt ou aprt, respetivamente. Também, a resistência a antimetabólito pode ser utilizada como a base de seleção para dh.fr que confere resistência a metotrexato; gpt que confere resistência a ácido micofenõlico; neo que confere resistência ao aminoglicósido, G418; também, que confere resistência a clorsulfurâo; e higro que confere resistência à higromicina. Os genes selecionáveis adicionais que podem ser úteis incluem trpB que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano ou hisD que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina. Os marcadores que proporcionam uma indicação visual para a identificação de transformantes incluem antocianinas, foeta-glucuronidase e seu substrato, GUS e luciferase e seu substratG, luciferina.

Os polipéptidos manipulados da presente invenção podem ser produzidos com a utilização de uma combinação tanto de síntese de péptido automatizada como técnicas recombinantes. Por exemplo, um ou ambos de entre: a leptina; uma análogo de leptina, um fragmento de leptina ativo ou um derivado de leptina,· e um ABD; e opcionalmente um ligante; empregues na preparação dos polipéptidos manipulados conforme divulgado no presente documento podem ser podem ser produzidos de maneira sintética ou recombinante e, então, ligados em conjunto com a utilização ιο i»D i de métodos conhecidos na técnica, tais como "ligações química nativa" e variações conhecidas da mesma nas quais urna ligação amida é formada unindo-· se os compostos progenitores. Veja-se, por exemplo a Patente η2 II. S. 6.326.468. De modo alternativo, por exemplo, um polipêptido manipulado da presente invenção pode conter uma combinação de modificações, incluindo deleção, substituição, inserção ou derivação por peguilaçâo (ou outra porção química, por exemplo, polímero, cadeia de acilo gorda, amidaçâo C-terminal). Tal polipêptido manipulado pode ser produzido em estágios. No primeiro estágio, um polipêptido manipulado intermediário contendo as modificações de deleção, substituição, inserção, e qualquer combinação das mesmas, pode ser produzido por técnicas recombinantes conforme descrito. Então, após uma etapa de purificação opcional, conforme descrito no presente documento, o polipêptido manipulado intermediário é peguilado (ou submetido a outra derivação química, por exemplo, acilação, amidaçâo C-terminal) através de modificação química com um reagente de peguilaçâo adequado (por exemplo, da NeKtar Transforming Therapeutics, San Carlos, Califórnia) para render o derivado de polipêptido manipulado desejado. Um perito na especialidade perceberá que o procedimento descrito acima pode ser generalizado para aplicação a um polipêptido manipulado que contém uma combinação de modificações selecionadas de entre deleção, substituição, inserção, derivação e outros meios de modificação bem conhecidos na técnica e contemplados pela presente invenção. A amidaçâo C-terminal pode ser alcançada com a utilização de um precursor estendido de aminoãcido em C-terminal de glicina, sintetizado, por exemplo, em levedura (por exemplo, Pichia) como proteína de fusão de fator alfa que será secretada em meio de cultura. Após a purificação, a glicina C-terminal do precursor polipêptido manipulado pode ser convertida em amida por amidaçâo enzimática, por ιο i»D i exemplo, mono-oxigenase alfa-amidante de peptidilglicina (PAM). Veja-se, por exemplo, Cooper et al. , 1989, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247 a 258. Veja-se também a Patente n-U.S. 6319685, que ensina métodos para amidação enzimática, incluindo uma enzima alfa-amidante de ratG que é suficientemente pura na enzima alfa-amidante para exibir uma atividade específica de pelo menos cerca de 25 mU por mg de proteína, e que é suficientemente livre de impurezas proteolíticas adequadas para utilização com substratos purificados de fontes naturais ou produzidos por técnicas de ADN recombinante.

Os péptidos podem ser purificados por diversos métodos conhecidos na técnica, incluindo conforme descrito no presente documento. Num método, os péptidos são purificados por RP-HPLC (preparativa e analítica) com a utilização de um sistema Waters Delta Prep 3000. Uma coluna preparativa C4, C8 ou Cl 8 (10 μ, 2,2 X 25 cm; Vydac, Hesperia, Calif.) pode ser utilizada para isolar péptidos, e a pureza pode ser determinada com a utilização de uma coluna analítica C4, C8 ou Cl8 (5 μ, 0,4 6 X 2 5 cm; Vydac) . Os solventes (A=0,1% de TEA/água e B=0,1% de TFA/CH3CN) podem ser entregues à coluna analítica a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/rnin e à coluna preparativa a 15 mL/min. Análises de aminoãcido podem ser realizadas no sistema Waters Pico Tag e processadas com a utilização do prGgrama Maxima. Os péptidos podem ser hidrolisados por hidrólise ácida de fase de vapor (115 °C, 2 0 a 24 h) . Os hidrolisados podem ser derivados e analisados por métodos padrão (Cohen et al, THE PICO TAG METHOD: A MANUAL OF ADVANCED TECHNIQUES FOR AMINO ACID ANALYSIS, páginas 11 a 52, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989)). Análise de bombardeio rápido de átomo pode ser realizada por Μ-Scan, Incorporated (West Chester, Pa.). A calibração de massa pode ser realizada com a utilização de iodeto de césio ou iodeto de césio/glicerol. A análise por ionização de dessorção de ιο i»D i plasma com a utilizaçâG de deteção por tempo de voo pode ser executada num espectrõmetro de massa Applied Biosistemas Bio-Ion 20.

Ensaio de expressão da polipêptido manipulado. Estão disponíveis métodos para avaliar o nível de expressão de proteína por uma célula hospedeira. Os procedimentos úteis para avaliar o nível de expressão de proteína por uma célula hospedeira são exemplificados no protocolo típico a seguir. Cerca de 25 μΐ de células BL21 E. coli são transformados com 2 ul de ADN plasmídeo (vetor de expressão para o polinucleótido manipulado). As células são colocadas em placas e incubadas de um dia para o outro a 37 graus C ou à temperatura ambiente (TA) durante um período de 48 horas. Uma colónia única pode ser selecionada e utilizada para cultivar uma cultura inicial em 4 mL de meio LB com antibiótico adequado por ~6 horas. Soluções estoque de glícerol podem ser preparadas adicionando-se 100 ul de glicerol estéril a 80% a 900 ul de solução estoque, que podem ser, então, misturados gentilmente e armazenados a -80 C. Uma amostra de 250 μΐ pode ser removido para amostra nâG induzida pGr TCP. Um alíquota, por exemplo, 2 mL de meio Magic contendo antibiótico adequado podem ser inoculados com 5 μΐ de cultura inicial, que pode ser, então, incubada de um dia para o outro (até 24 horas) a 37 C, 300 rpm. Conforme conhecido na técnica, o meio Magic é autoinduzido. De modo alternativo, 60 mL de meio Magic contendo antibiótico adequado podem ser inoculados com 60 μΐ de cultura inicial num frasco Thompson de 250 mL ou 125 mL, que pode ser, então, incubado de um dia para o outro (até 24 horas) a 30 C, 300 rpm. Após a incubação, 250 μΐ de cultura podem ser removidos de cada tubo, e as células peletizadas. A célula pode ser ressuspensa em 1 mL de Tris a 50 mM pH 8, NaCl a 150 mM, ao qual pode ser adicionado 0,1 volume (100 ul) de reagente de cultura POP e 1 μΐ de r-lisozima (diluição a 1:750 em tampão de r-lisozima). A ιο i»D i mistura pode ser bem misturada e incubada pelo menos 10 minutos à TA. A preparação pode ser, então, centrifugada por 10 mnum 14.000 x G, 0 sobrenadante {fração solúvel) pode ser removido e retido, e as amostras podem ser preparadas por análise em gel (15 μΐ + 5 μΐ de LDS) . 0 pêlete de corpo de inclusão remanescente pode ser ressuspenso em 1 mL de SDS a 1% com sonicação. A amostra pode ser preparada para análise em gel (15 ul + 5 μΐ de LDS). Para amostras não induzidas, 1,0 volume de reagente de cultura POP e 1 μΐ de r-lisozima (diluição a 1:750 em tampão de r-lisozima) pode ser adicionado. A mistura pode ser bem misturada e incubada pelo menos 10 minutos à TA. Essas amostras pGdem não precisar ser centrifugadas. A amostra pode ser, então, preparada para análise em gel (15 μΐ + 5 μ.1 de LDS) . Géis NU-PAGE (4 a 12%) não reduzidos em tampão 1XMES podem ser passados e manchados com protocolo de micro-ondas SimplyBlue. A remoção da mancha pode ser conduzida de um dia para o outro, conforme conhecido na técnica. Uma imagem de gel pode ser retida e analisada para determinar os níveis de expressão de proteína.

Preparação de corpo de inclusão. Para polipéptidos manipulados que são encontrados na fração de corpo de inclusão, o procedimento a seguir pode ser benéfico. 0 pélete celular pode ser ressuspenso num mínimo de 100 mL de tampão de lise para cada 50 mL de cultura. Mediante a adição de 30 mL, uma pipeta de 10 mL pode ser utilizada para ressuspensão, então, o tubo pode ser lavado com 70 mL adicionais. A solução celular ressuspensa pode ser passada múltiplas vezes, por exemplo, 4 passagens, através de um microfluidizados a 689 kPa (100 PSI) (min), tendo-se o cuidado de manter a câmara em água com gelo por todo o processo. A pasta fluida fluidizada pode ser centrifugada a 14.000 x g, 20 min (por exemplo, JLA 10.5, 10.000 rpm, com a utilização de garrafas de 250 mL Nalgene®) . 0 pélete de corpo de inclusão pode ser ressuspenso em gelo em tampão de ιο i»D i lise arrefecido com barra de agitação e placa de agitação por 1 hora a 4 C após a interrupção com a ponta da pipeta. 0 pélete pode ser ressuspenso uma segunda vez ern H20 destinado com barra de agitação e placa de agitação por 1 hora a 4 C após interrupção com a ponta da pipeta, seguida por centrifugação a 14.000 x g, 15 min. 0 sobrenadante pode ser removido e descartado. 0 resultante pode ser armazenado a -80 C.

Purificação de proteína. Conforme descrito no presente documento, inúmeros métodos são conhecidos para isolamento de polipéptidos expressos. 0 seguinte é um exemplo. Os péletes de corpo de inclusão podem ser solubilízados em volume adequado de tampão de SGlubilízaçâo (ureia a 8 M ou guanidina a 8 M, Tris a 50 mM, DTT a 10 mM, pH 7,75) por 1 hora à TA. Os péletes solubilizados podem ser centrifugados por 20 minutos a 27.000 g. 0 sobrenadante filtrado (por exemplo, 0,4 um) pode ser transferido gota a gota em volume adequado de tampão de reenovelamento (Tris-HCl a 50 mM, ureia a 1 M, arginina a 0,8 M, cisteína a 4 mM, cistamina a 1 mM; pH 8) à TA. 0 resultado pode ser, então, colocado a 4 °C de um dia para o outro ou mais tempG com mistura suave. As amostras podem ser concentradas e passadas numa coluna de filtração ern gel (Superdex™ 7 5 2 6/60) a 1 a 2 mL/min em ambiente a 4 C com a utilização de um GE Healthsciences AKTAFPLC™. Frações contendo proteína adequadas podem ser identificadas por meio de SDS-PAGE, agrupadas e passadas através de uma segunda coluna de filtração em gel. A proteína agrupada pode ser, então, concentrada em filtro Amicnum uma concentração adequada e avaliada quanto aos níveis de endotoxina com a utilização, por exemplo, de Leitor Endosafe® PTS (Charles River), conforme conhecido na técnica. Uma vez que uma amostra de proteína tenha passado pelos critérios de endotoxina, a mesma pode ser filtrada estéril, dispensada em alíquotas e passada através de ensaios de controlo de qualidade. Os ensaios de controlo de ιο i»D i qualidade podem incluir HPLC-SEC analítica, SDS PAGE não redutora e RP HPLC - MS para obter a massa aproximada. As proteínas podem ser obtidas em IxPBS (cloreto de sódio a 137 iitM, cloreto de potássio a 2,7 mM, fosfato dissódico a 4,3 mM, fosfato de monopotãssio a 1,4 mM, pH7,2), distribuídas em alíquotas e congeladas rapidamente para armazenamento a -70 a -80 °C. IV. Métodos de Utilização e Tratamento de Doenças

Indicações. Uma variedade de doenças e distúrbios ê contemplada para ser beneficamente tratada pelos compostos de polipéptido e métodos descritos no presente documento.

Obesidade a excesso de peso. A obesidade e seus distúrbios associados, incluindo excesso de peso, sâo problemas de saúde comuns e sérios nos Estados Unidos da América e por todo o mundo. A obesidade na parte superior do corpo é o fator de risco mais forte para diabetes mellitus tipo 2 e é um fator de risco forte para doença cardiovascular. A obesidade é um fator de risco reconhecido para hipertensão, aterosclerose, insuficiência cardíaca congestiva, derrame, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, distúrbios reprodutivos, tais como síndrome do ovário policístico, cancros de mama, próstata e cólon, e incidência aumentada de complicações de anestesia geral. Veja-se, por exemplo, Kopelman, 2000, Nature 404:635 a 643. A obesidade reduz o tempo de vida e produz um risco sério das comorbidades listadas acima, assim como distúrbios, tais como infeções, varizes, Acanthosis nigricans, eczema, intolerância a exercícios, resistência à insulina, hipercolesterolemia por hipertensão, colelitiase, lesão ortopédica e doença tromboembólica. Veja-se, por exemplo, Rissanen et al, 1990, Br. Med. J., 301:835 a 837. A obesidade ê também um fator de risco para o grupo de afeções chamado síndrome de resistência à insulina ou "Síndrome X" e síndrome metabólica. 0 custo médico em todo ιο i»D i g mundo da obesidade e distúrbios associados é enorme.

Acredita-se que a patogénese da obesidade seja multifatorial. Um problema é que, em sujeitos obesos, a disponibilidade de nutriente e o gasto de energia não entram em equilíbrio até haver tecido adiposo em excessG. 0 sistema nervoso central (CMS) controla o saldo de energia e coordena uma variedade de atividades comportamentais, autonômicas e endõcrinas adequadas para a situação metabólica do animal. Os mecanismos ou sistemas que controlam essas atividades são amplamente distribuídos através da prosencéfalo (por exemplo, hipotálamo), rombencéfalo (por exemplo, tronco cerebral) e medula espinhal. Por fim, as informações metabólicas (isto ê, disponibilidade de combustível) e cognitivas (isto é, preferências aprendidas) desses sistemas são integradas e a decisão de iniciar comportamentos apetitivos (busca de alimento) e consumatórios (ingestão) é ativado (obtenção e iniciação da refeição) ou desativado (término da refeição). Acredita-se que o hipotálamo seja principalmente responsável por integrar esses sinais e, então, emitir comandos para o tronco cerebral. Núcleos do tronco cerebral que controlam os elementos do sistema de controlo do motor consumatório (por exemplo, músculos responsáveis por mastigar e engolir). Como tais, esses núcleos do CNS foram literalmente denominados como constituindo a "trajetória comum final" para comportamento ingestivo. 0 suporte de evidência neuroanatómica e farmacológica que sinais de energia e homeostase nutricional integram-se nos núcleos dG prosencéfalo e que o sistema de controlo do motor consumatório reside nos núcleos do tronco cerebral, provavelmente em regiões que circundam o núcleo motor trigeminal. Há conexão recíproca extensiva entre o hipotálamo e o tronco cerebral. Uma variedade de terapêutico antiobesidade direcionados ao CNS (por exemplo, moléculas pequenas e péptidos) foca predominantemente nos ιο i»D i substratGS do prosencéfalo que residem no hipotãlamo e/ou mediante os substratos do rombencéfalo que residem no tronco cerebral. A obesidade permanece um distúrbio metabólico insuficientemente tratãvel, crónico, essencialmente intratável. De modo correspondente, existe a necessidade de novas terapias úteis na redução de peso e/ou conservação de peso num sujeito. Tais terapias poderiam levar a um efeito benéfico profundo sobre a saúde do sujeito. Métodos e terapias que empregam os péptidos manipulados divulgados no presente documento, sozinhos ou em combinação com outros agentes antiobesidade (veja-se, por exemplo, os documentos n2 WO 2009064298 e n2 US 20080207512) podem fornecer tais efeitos benéficos.

Deficiência de leptina. A deficiência de leptina mostrou resultar em obesidade. Uma forma de deficiência de leptina é deficiência de leptina congénita, um distúrbio genético raro. Veja-se Montaque et al. , 1997, Mature 387: 903 a 908. A deficiência de leptina grave pode ser um resultado de diabetes mellitus por deficiência de insulina descontrolada que resulta da destruição de células β de secreção de insulina. Teoriza-se que a falta de insulina leve â síntese e ao armazenamento de triglicerídeos em tecido adiposo, o que impede o ganho de peso e, por sua vez, reduz drasticamente os níveis plasmãtícos de leptina, visto que a leptina é sintetizada no tecido adiposo. Essas e outras deficiências de leptina, e doenças e distúrbios que resultam de tais deficiências, podem ser tratadas com terapia de reposição de leptina, tal como por meio de injeções diárias de leptina ou agonista de leptina. Os polipéptidos manipulados descritos no presente documento podem fornecer um tratamento terapêutico mais conveniente e vantajoso de tais doenças e distúrbios.

Diabetes e doença cardiovascular. A diabetes mellitus é reconhecida como uma doença complexa e crónica em que 60% ιο i»D i a 70% de tGdas as fatalidades de caso entre pacientes diabéticos são resultado de complicações cardiovasculares. A diabetes não é apenas considerada um equivalente de risco de doença cardíaca coronariana, mas é também identificada como um previsor independente de eventos adversos, incluindo infarto do miocárdio recorrente, insuficiência cardíaca congestiva e morte após incidente cardiovascular. Poder-se-ia esperar que a adoção de controlo de glicose mais rígido e tratamento agressivo para fatores de risco cardiovascular reduzisse o risco de complicações de doença cardíaca coronariana e aprimorasse a sobrevida global entre pacientes diabéticos. Além disso, pacientes diabéticos têm prGbabilidade duas a três vezes maior de experimentar um infarto agudo do miocárdio do que pacientes não diabéticos, e pacientes diabéticos vivem oito a trinta anos a menos que pacientes não diabéticos.

Entendendo a natureza de alto risco de pacientes diabéticos/com infarto agudo do miocárdio, as diretivas da prática clínica da American College of Cardiology/American Heart Association ("ACC/AHA") para o gerenciamento de pacientes hospitalizados com angina instável ou infarto do miocárdio sem elevação de ST (coletivamente denominados "ACS") reconheceram recentemente que pacientes diabéticos hospitalizados são uma população especial que exige gerencíamentG agressivo de hiperglicemia. Especificamente, as diretivas determinam que a terapia de redução de glicose para pacientes diabéticos/com ACS hospitalizados deve ser direcionada para atingir glicose pré-prandial menor que 10 mg/dl, um alvG diário máximo menor que 180 mg/dl e uma hemoglobina Alc pôs-descarga menor que 7%.

Numa amostra nacional de pacientes idosos com ACS, foi demonstrado que um aumento em mortalidade em 3 0 dias em pacientes diabéticos correspondeu aos pacientes que têm valores de glicose mais altos mediante admissão no hospital. Veja-se "Diabetic Coronary Artery Disease &amp; ιο i»D i

Intervention", Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, 20 de setembro de 2002, Hã evidência crescente de que hiperglicemia prolongada em vez de glicose elevada temporária mediante admissão no hospital está relacionada com eventos adversos sérios. Embora a métrica ideal para hiperglicemia e risco vascular em pacientes não seja facilmente conhecida, parece que o valor de glicose médio durante a hospitalização é ma is preditivo de mortalidade. Num estudo separado de pacientes com ACS de mais de quarenta hospitais nos Estados Unidos, concluiu-se que a hiperglicemia resistente, em oposição a valores de glicose aleatórios mediante admissão no hospital, foi mais preditiva de mortalidade no hospital. Veja-se Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, 21 de setembro de 2002, Em comparação com os valores de glicose mediante admissão, um modelo de regressão logística de controlo de glicose durante toda a hospitalização foi mais preditivo de mortalidade. Hã quase um risco aumentado em dobro de mortalidade durante a hospitalização para cada 10 mg/dl de aumento em glicose em relaçâG a 120 mg/dl. Numa coorte menor de pacientes diabéticos/com ACS consecutivos, houve um aumento gradual em mortalidade num ano com níveis de glicose crescentes mediante admissão no hospital. No ambiente hospitalar, as diretivas de ACC/AHA sugerem a iniciação de terapia agressiva com insulina para atingir teor de glicose sanguínea mais baixo durante a hospitalização.

Foi relatado que a leptina pode ter benefício direto para tratar diabetes, particularmente em diabetes tipo I e diabetes tipo II, com ou sem a presença de obesidade e, mais particularmente, em condições de baixo teor de leptina sérica. Foi relatado que a reposição de leptina reduziu ou prevenir hiperinsulinemia, resistência à a e hiperglicemia em vários modelos animais de diabetes tipo 1 e 2 com ou sem obesidade presente. Por exemplo, altos níveis plasmáticos ιο i»D i de leptina gerados por administração farmacológica de leptina ou com terapia génica adenoviral reduziram a hiperglicemia e aumentos associados de níveis plasmáticos de glucagon em diabetes induzida por STZ, a despeito de níveis de insulina persistentemente baixos.

Doenças de regulação de lípido. Conforme conhecido na técnica, a lipodistrofia é caracterizada por condições anormais ou degenerativas do tecido adiposo do corpo. A dislipidemia é uma rutura no componente lipídico normal no sangue. Acredita-se que a elevação prolongada de níveis de insulina pode levar à dislipidemia. A hiperlipidemia é a presença de níveis elevados ou anormais de lípídos e/ou lipoprGteínas no sangue. A amenorreía hipotalãmica é uma afeção em que a menstruação cessa por diversos meses devido a um problema que envolve o hipotãlamo. Concluiu-se que a terapia de reposição de leptina em mulheres com amenorreía hipotalãmica aprimora os eixos hormonais reprodutivos, da tireoide e de crescimento e marcadores de formação óssea sem causar efeitos adversos. Veja-se, por exemplo, Oral et al., N Engl J Med. 2004, 351: 959 a 962, 987 a 997. Doença do fígado gordo, por exemplo, doença do fígado gordG não alcoólica (NAFLD), refere-se a um espetro amplo de doença hepática na faixa de fígado gordo simples (esteatose) a esteato-hepatite não alcoólica (NASH) a cirrose (irreversível, cicatrização avançada do fígado). Todos os estágios de NAFLD têm em comum a acumulação de gordura (infiltração de gordura) nas células hepáticas (hepatõcitos). Acredita-se que a leptina seja um dos reguladores principais para inflamação e progressão de fibrose em várias doenças crónicas, incluindo NASH. Veja-se, por exemplo, Ikejima et al. , Hepatology Res. 33:151 a 154 .

Adicionalmente, sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria, acredita-se que a deficiência de insulina relativa em diabetes tipo 2, toxicidade de glicose e carga de ácido ιο i»D i gordG livre hepático aumentada através da entrega elevada de tecido adiposo intra-abdominal por meio da veia portal sejam implicados como causas possíveis em distúrbios do fígado gordo. De facto, criou-se a hipótese de que o comportamento alimentar ê o fator principal que aciona a síndrome metabólica de obesidade com seus muitos corolários, incluindo NASH. Consequentemente, os tratamentos que visam diminuir a ingestão de alimento e aumentar o número de refeições pequenas, conforme jã foi demonstrado em diabetes tipo 2, podem tratar e prevenir eficazmente NASH. Os fârmacos que promovem a secreção de insulina e a perda de peso e atrasam o esvaziamento gástrico sâo também eficazes para aprimorar a tolerância à glicose e, assim, podem aprimorar o fígado gorduroso com sua hiper.insulinemia presente. Assim, a utilização de uma leptina, análogo de leptina, por exemplo, metreleptina, ou um fragmento ativo da mesma, pode ser bem adequada como uma forma de re ci X X ^ ci ção de tratamento para essa afeção. Consequentemente, os polipéptidos manipulados descritos no presente documento, nos quais incluem leptina, análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma, pGdem ser úteis no tratamento de distúrbios de fígado gordo.

Doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (AD) , conforme mostrado na técnica, está associada a placas e emaranhados no cérebro que incluem desregulação da prGteína A-beta. Acredita-se que os lípidos cerebrais estejam intrinsecamente envolvidos nas trajetórias patogénicas relacionada com A-beta e que um modulador importante de homeostase de lípidG seja a leptina. Consequentemente, a leptina pode modular a cinese de A-beta bidirecional, reduzindo seus níveis extracelularmente. De facto, foi demonstrado que a administração crónica de leptina a animais transgénicos com AD reduziu a carga cerebral de A-beta, subjacente a seu potencial terapêutico. Veja-se Fewlass et ai., 2004, FASEB J., 18:1870-1878. ιο i»D i

Adicionalmente, a diabetes mellitus tipo 2 e a AD compartilham características epidemiológicas e bioquímicas pelo facto de que ambas são caracterizadas por agregados de proteína insolúveis com conformação fibrilar amilina em ílhotas pancreãticas de DM tipo 2 e Άβ em cérebro com AD. Sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria, acredita-se que mecanismos tóxicos semelhantes podem caracterízar DM tipo 2 e AD. Veja-se Lim et al. , FEBS Lett., 582:2.188 a 2.194 . Síndrome metabólica X. A síndrome metabólica X é caracterizada por resistência à insulina, dislipidemia, hipertensão e distribuição visceral de tecido adiposo e exerce um papel de pivot na patofisiologia de diabetes tipo 2. Foi também concluído estar fortemente relacionada com NASH, fibrose e cirrose do fígado. Consequentemente, os polípéptidos manipulados descritos no presente documento podem ser úteis no tratamento de síndrome metabólica X.

Doença de Huntington. A doença de Huntington é uma doença neurodegenerativa, dominante autossómica. As características da doença incluem perturbações motoras, demência, problemas psiquiátricos e perda de pesG não pretendida. Os polípéptidos quiméricos descritos no presente documento podem ser utilizados no tratamento de doença de Huntington.

Consequentemente, num aspeto, é fornecido um método para tratar uma doença ou um distúrbio num sujeito. 0 sujeito precisa de tratamento para a doença ou o distúrbio. A doença ou o distúrbio pode ser lípodístrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, excesso de peso, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência de leptina, doença de fígado gordo ou diabetes (incluindo tipo I e tipo II) . As doenças e distúrbios adicionais que podem ser tratados pelos compostos e métodos descritos no presente documento incluem esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e doença do fígado gordo não alcoólica (NAFLD), ιο i»D i síndrome metabólica X e doença de Huntington. 0 método de tratamento inclui a administração ao sujeito de um polipêptido manipulado conforme no presente documento numa quantidade eficaz para o tratamento da doença ou do distúrbio. 0 polipéptídG manipulado incluirá como EDI uma leptina, um fragmento de leptina ou um análogo de leptina. Consequentemente, o polipêptido manipulado pode ter uma das seguintes estruturas: ABD-HD1, HD1-ABD, ABD-L1-HD1 ou HD1 -Ll-ABD.

Em todas as formas de realização de tratamento descritas no presente documento, a leptina pode ser leptina ou metreleptina humana. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina tem peio menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 6 0%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou ainda mais de identidade com a leptina humana. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina tem pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 6 0%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou ainda mais de identidade com a leptina de ratinho. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina tem pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 6 0%, 6 5%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou ainda mais de identidade com a leptina de rato. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina tem pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou ainda mais de identidade cgír a leptina de ornitorrinco. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina tem pelo menos 50%, por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou ainda mais de identidade com a leptina de foca. Em algumas formas de realização, o análogo de leptina é leptina A100, A300 ou A500. V„ Ensaios

Os métodos para a produção e o ensaio de polipéptidos manipulados descritos no presente documento estão, de modo geral, disponíveis ao perito na especialidade. Ademais, os métodos específicos são descritos no presente documento ιο i»D i assim como nas publicações de patente e outras referências citadas no presente documento.

Ingestão de alimento. Sem o desejo de ater·· se a qualquer teoria, acredita-se que a ingestão de alimento seja útil na avaliação da utilidade de um composto conforme descrito no presente documento. Por exemplo, sabe-se que diversas patologias metabólicas estão relacionadas com a ingestão de alimento (por exemplo, diabetes, obesidade). Consequentemente, uma triagem inicial pode ser conduzida para determinar a extensão em que a ingestão de alimento é modulada pela administração de compostos descritos no presente documento, e uma triagem inicial positiva pode ser útil hg desenvGlvimentG subsequente de um compGSto.

Uma variedade de ensaios de ingestão de alimento está disponível para um perito na especialidade. Por exemplo, no assim chamado "modelo de gaiola residencial" de ingestão de alimento, sujeitos (por exemplo, ratos) são mantidos em sua gaiola residencial, e a ingestão de alimente juntamente com o peso total do sujeito são medidos após a injeção de composto de teste. No assim chamado "modelo de padrões de alimentação" de ensaio de ingestão de alimento, os sujeitos (por exemplo, ratos) são habituados a uma câmara de alimentação e a injeções antes do teste. Após a administração de composto de teste, os sujeitos são imediatamente colGcadGS na câmara de alimentação, e a ingestão de alimento é automaticamente determinada como uma função de tempo (por exemplo, intervalos de 1 min.) . Para ambos os testes, o alimento é raçáo padrão ou qualquer uma de entre uma variedade de rações (por exemplo, gordura de peixe) conhecidas na técnica. No assim chamado ensaio de "ingestão de alimento de ratinho", um composto de teste pode ser testado para supressão de apetite ou para um efeito no ganho de peso CGrporal em ratinhos com obesidade induzida por dieta (DIO). Num ensaio de ingestão de alimento de ratinho típico, ratinhos fêmeas NIH/Swiss (com ιο i»D i 8 a 24 semanas de idade) são alojados em grupo com um ciclo luz: escuro de 12:12 horas com as luzes ligadas as 06:00. Água e uma dieta de ração de ratinho peletizada padrão estão disponíveis ad libitum, exceto como observado. Os animais são jejuados com início aproximadamente as 15:00 horas, 1 dia antes da experiência. Na manhã da experiência, os animais são divididos em grupos experimentais. Num estudo típico, n=4 gaiolas com 3 ratinhos/gaiola. No tempo =0 min, todos os animais são administrados com uma injeção intraperitoneal de veículo ou composto, tipicamente numa quantidade na faixa de cerca de 10 nmol/kg a 75 nmol/kg, e imediatamente abastecidos com uma quantidade pré-pesada (10 a 15 g) da raçâG padrão. 0 alimento é removido e pesado em vários momentos, tipicamente 30, 60 e 120 minutos, para determinar a quantidade de alimento consumido. Veja-se, por exemplo, Morley et al. , 19:34, Am. J. Physiol. 267:R178 a R184) . A ingestão de alimento é calculada subtraindo-se o peso do alimento remanescente, por exemplo, no ponto no tempo 30, 60, 120, 180 e/ou 240 minutos, do peso do alimento fornecido inicialmente no tempo=0. Efeitos de tratamento significativos são identificadGS por ANO VA íp<0,05). Quando uma diferença significativa existe, os meios de teste são comparados aos meios de controlo com a utilização de um teste de Dunnett (Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia) . Para qualquer teste descrito no presente documento, a administração de composto de teste pode ser através de qualquer meio, incluindo injeção (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal e semelhantes), oral ou outros métodos de administração conhecidos na técnica.

Ensaios in vitro. Sem o desejo de ater-se a qualquer teoria ou mecanismo de ação, acredita-se que existam correlações entre os resultados de ensaios in vitro (por exemplo, recetores), e a utilidade de agentes para o tratamento de doenças e distúrbios metabólicos. ιο i»D i

Consequentemente, ensaios in vitro (por exemplo, ensaiGS baseados em célula) são úteis como uma estratégia de triagem para agentes metabólicos potenciais, tal como descrito no presente documento. Uma variedade de ensaios in vitro ê conhecida na técnica, incluindo aqueles descritos conforme segue.

Ensaio de ligação de leptina. A ligação de leptina pode ser medida pela potência de um composto de teste de deslocar -Leptina recombinante(murina) a partir da membrana de superfície que expressa Leptina quimérica (Hu) - recetor de EPO (Mu) apresentado pela linhagem de células 32D OBECA (J Bíol Chem 1998; 273(29): 18.365 a 18.373). As membranas celulares purificadas pGdem ser preparadas por homogeneização de culturas celulares confluentes colhidas de células 32D OBECA. As membranas podem ser incubadas com l25I-Leptina Murina rec e concentrações crescentes de composto de teste por 3 horas à temperatura ambiente em placas de poliestireno de 96 poços. Frações de ligante ligadas e não ligadas podem ser, então, separadas por filtração rápida em placas de 96 poços GF/B pré-bloqueadas por pelo menos 60 minutos em 0,5% de PEI (polietilenoimina). As placas de fibra de vidro podem ser, então, secas, cintilante adicionado e CPM determinado por leitura num contador de cintilação de múltiplos poços com capacidade para ler iodeto radiomarcado.

Ensaio funcional da leptina. Os níveis aumentados de STAT5 fosforilado (Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição 5) podem ser medidos após o tratamento de células 32D-Keptin que expressam ectopicamente o recetor de Hu-leptina/Mu-EPO quimérico com um composto de teste. As células 32D-Keptin (idênticas às células 32D-OBECA, mas mantidas em cultura com leptina) podem ser leptina separadas de um dia para o outro com compostos de teste em placas de 96 poços por 30 minutos a 37 °C, seguido por extração de células. Os níveis de pSTATS nos lisados ιο i»D i celulares podem ser determinados com a utilização do kit de ensaio Perkin Elmer AlphaScreen<®>SureFire<®>pSTAT5 num formato de 384 poços (Proxiplate™ 384 Plus}. A eficácia de compostos de teste pode ser determinada em relação ao sinal máximo em lisados celulares de células tratadas com leptina humana. VI. Composições Farmacêuticas

Num aspeto, são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem os compostos descritos no presente documento em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, veículo). 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme utilizado no presente documento refere-se a excipientes farmacêuticos, por exemplo, substâncias de veículo orgânico ou inorgânico aceitáveis farmacêutica e fisiologicamente adequadas para aplicação enteral ou parenteral que não reagem deleteriamente com o agente ativo. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, soluções salinas (por exemplo, solução de Ringer e semelhantes}, álcoois, óleos, gelatinas e hidratos de carbono, tal como lactose, amilose ou amido, ésteres de ácido gordo, hidroximetilcelulose e polivinil pirrolidina. Tais preparações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, tais como lubrificantes, conservantes, estabilízantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, coloração e/ou substâncias aromáticas e semelhantes, que não reagem deleteriamente com os compostos da invenção.

Num aspeto adicional, é fornecida uma composição farmacêutica que inclui um polipéptido manipulado conforme descrito no presente documento em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica oral, conforme descrito no presente documento. ιο i»D i

Em algumas formas de realização. A composição farmacêutica é uma composição farmacêutica de longa duração. 0 termo "longa duração" no contexto de administração de uma composição farmacêutica refere-se à duração de ação. Consequentemente, uma composição farmacêutica de longa duração pode ser administrada em intervalos de, por exemplo, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês ou ainda mais. Numa forma de realização preferencial, a administração é uma vez por dia (isto é, "diariamente") . Numa forma de realização mais preferencial, a administração é uma vez por semana (isto é, "semanalmente"). A. Métodos

Os polipéptidos manipulados descritos no presente documento podem ser administrados sozinhos ou podem ser coadministrados a um sujeito. A coadministração significa incluir administração simultânea ou sequencial dos compostos individualmente ou em combinação (mais de um composto). Por exemplo, concluiu-se que a obesidade pode ser beneficamente tratada com uma terapia de combinação que inclui uma leptina (por exemplo, metreleptina) e determinados outros compostos antiobesidade. Veja-se, por exemplo, Pedi do Pub1i c ado n- U. S . 2008/0207512.

Consequentemente, um polipéptido manipulado descrito no presente documento que compreende um ABD e uma leptina poderia ser útil para o tratamento de obesidade. De modo alternativo, os polipéptidos manipulados individuais podem ser coadministrados com outros agentes antiobesidade, tais como exenatida ou liraglutida.

As preparações podem ser também coadministradas, quando desejado, com outras substâncias ativas (por exemplo, para reduzir a degradação metabólica) conforme conhecido na técnica ou outros agentes terapeuticamente ativos.

Amilinas. A amilina é uma hormona peptídica ιο i»D i sintetizada por células β pancreãticas que é cossecretada com insulina em resposta à ingestão de nutrientes. A sequência de amilina é altamente preservada pelas espécies de mamífero, com similaridades estruturais ao péptido relacionado com o gene de calcitonina (CGRP), as calcitoninas, as intermedinas e adrenomedulina, conforme conhecido na técnica. As ações glucorregulatórias da amilina complementam aquelas de insulina regulando-se a taxa de aparecimento de glicose na circulação por meio de supressão de secreção de glucagon estimulada por nutriente e retardando o esvaziamento gástrico. Em pacientes tratados com insulina com diabetes, a pranlintida, um análogo sintético e equipotente de amilina humana, reduz as excursões de glicose pós-prandial suprimindo a secreção de glucagon põs-prandial inadequadamente elevada e retardando o esvaziamento gástrico. Seguem as sequências de amilina de rato, amilina de ser humano e pranlintida: amilina de rato: KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO :108) ; amilina de ser humano:

KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO:109); Pranlintida: KCNTATCATQRLAMFLVHSSNMFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:110).

Davalintida. Davalintida, também conhecida como "AC-2307", é um agonista de amilina potente útil no tratamento de uma variedade de indicações de doença. Veja-se os documentos WO 2006/083254 e WO 2007/114838. A davalintida é um péptido quimérico que tem uma região de laço N-terminal de amilina ou calcitonina e análogos da mesma, uma região alfa-helicoidal de pelo menos uma porção de uma região alfa-helicoidal de calcitonina ou análogos da mesma ou uma região alfa-helicoidal que tem uma porção de uma região alfa-helicoidal de amilina e uma região alfa-helicoidal de calcitonina ou análogo da mesma, e uma região de cauda C-terminal de amilina ou calcitonina. Seguem as sequências de ιο i»D i calcitonina de ser humano, calcitonina de salmão e davalintida:

calcitonina de ser humano: CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO:111);

calcitonina de salmão: CSNLSTCVLCKLSQELHKLQTYPRTNTGSCTP (SEQ ID NO:112);

davalintida: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO:113).

Sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria, acredita-se que amilinas e davalintida, e fragmentos e análogos das mesmas, podem exigir amidação C-terminal para produzir urna resposta biológica completa. Acredita-se que os compostos de amilina, tais como aqueles descritos no presente documento, que incluem amilinas e/ou davalintida, e fragmento e análogos das mesmas, podem ser amidados no exterminai . "Compostos agonistas de amilina" incluem péptidos de amilina nativos, péptidos análogos de amilina e outros compostos (por exemplo, moléculas pequenas) que têm atividade de agonista de amilina. Os "compostos agonistas de amilina" podem ser derivados de fontes naturais, pGdem ser sintéticos ou podem ser derivados de técnicas de ADN recombinante. Os compostos agonistas de amilina têm atividade de ligação de recetor de agonista de amilina e podem compreender aminoãcidos (por exemplo, naturais, não naturais ou uma combinação dos mesmos), miméticos de péptido, porções químicas e semelhantes. 0 perito na especialidade reconhecerá compostos agonistas de amilina com a utilização de ensaiGS de ligação de recetor de amilina ou medindo-se a atividade de agonista de amilina em ensaios de músculo sóleo. Em uma forma de realização, os compostos agonistas de amilina terão um IC50 de cerca de 2 00 nM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, ou cerca de 50 nM ou menos, num ensaio de ligação de recetor de amilina, tal como aquele descrito no presente documento, na Patente ιο i»D i n2 5.686.411 e na Publicação n2 US 2008/0176804. Em uma forma de realização, os compostos agonistas de amilina terão um EC50 de cerca de 2 0 nM ou menos, cerca de 15 nM ου. menos, cerca de 10 nM ou menos, ou cerca de 5 nM ou menos num ensaio de músculo sóleo, tal como aquele descrito no presente documento e na Patente n2 5.686.411. Em uma forma de realização, o composto agonista de amilina tem pelo menos 90% ou 100% de identidade de sequência com 25'28,29Pró-amilina humana. Em uma forma de realização, o composto agonista de amilina é uma quimera peptídica de amilina (por exemplo, amilina de ser, amilina de rato e semelhantes) e calcitonina (por exemplo, calcitonina de ser humano, calcitonina de salmão e semelhantes) . Os compostos agonistas de amilina adequados e exemplificativos são também descritos na Publicação n2 2008/0274952.

Por "análogo de amilina", conforme utilizado no presente documento, quer-se dizer um agonista de amilina que tem pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência, pelo menos 70% de identidade de sequência, com uma forma de ocorrência natural de amilina, de rato ou ser humano ou de qualquer outra espécie, e ê derivado da mesma por modificações, incluindo inserções, substituições, extensões e/ou deleções da sequência de aminoâcidos de referência. A sequência de análogo de amilina pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência de aminoâcidos com a amilina de referência. Em um aspeto, o análogo tem 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mesmo 16 substituições, inserções, extensões e/ou deleções de aminoâcidos em relação ao composto de referência. Em uma forma de realização, o análogo de amilina pode compreender substituições de aminoãcido conservadoras e nâG conservadoras (incluindo aminoâcidos não naturais e formas L e D). Esses análogos são, de preferência, péptidos, derivados de péptido ou ιο i»D i miméticos de pêptido. Os análogos de amilina típícGS serão péptidos, especialmente de 32 a 37 aminoãcidos, por exemplo, 27 a 45, especialmente 28 a 38 e ainda 31 a 36.

Os análogos de amilina com identidade com amilina de rato ou ser humano incluem 29Pro-h-amilina (pranlintida) ; des-LLys-h-amilina; 2bPro, 2oVal, 28,29Pro-h-amilina; 1BArg, ^5,28Pro-h-amilina; des-1Lys, lsArg, "5,28Pro-h amilina,- Arg, ' ' Pro-n-amilina; des- nys, Arg, " ' Pro- h-amilina; des-1Lys, Bb,2&amp;"::9PrO“h~amilina; 25Pro, 26Val, 28,29Pro-h-amilina; 28Pro-h-amilina, 2,7-Ciclo- [íAsp, /Lys] -h-amilina; 2‘j7h-amil ina; íAla-h-amilina; 2Ala-h-amilina; 2,7Ala-h- amilina; ~Ser-h-amilina; 29Pro-hamilina; "5'2oPro-'h~amilina; des-"Lys,2i,28Pro-h-amilina; 23Leu, 25Pro, 26Val, 28,29PrG-h- amilina; 23Leu25Pro20Val28Pro-h-amilina; des- !Lys, 23Leu, 2bPro, 2SVa.l, 2BPro-h-amilina; lSArg, 23Leu, 2bPro, 26Val, 28Pro-h-amilina; lsArg, 23Leu, 25,28'29Pro-hamilina; ^Arg^Leu, Bb,28Pro-h-amilina; i7Ile, 2jLeu, 23'28'29Pro-h-amilina; L 7Ile,2b'28"29Pro-h-amilina; des1Lys, 1/Ile, "3Leu, "5,28'"9Pro-h-amilina; i7Ile, idArg, 23Leu-h-amilina; 17Ile, lsArg, 23Leu, 25Val, 29Pro-h-amilina; i7Ile, i8Arg, 2jLeu, 2bPrG, 2BVal, 28,29Pro-h-amilina; i3Thr, 2lHís, 23Leu, 26Ala, 2SLeu, 29Pro, J Asp-h-amilina; !JThr, 2iHis, 2jLeu, 2oAla, 29Pro, 3iAsp-h-amilina; des- 1Lys, 13Thr, 2iHís, 23Leu, 26Ala, 28Pro, J1Asp-h-amilina; 13Thr, 18Arg, 2iHis, 23Leu, 26Ala, 29Pro, 3 A.sp-h-amilina ; LJThr, LdArg, 2iHis, 2jLeu, 28,29Pro,3Asp-h-amilina; e i3Thr, idArg, 21His, 23Leu, 2bPro, 2SAla, 28,29Pro, 3iAsp-h-amilina.

Compostos agonistas de amilina exemplificativos adequados também são descritos na Publicação de Patente PCT n- W02 010/0 8 5 7 0 0.

Os análogos de amilina incluem sequências de aminoácidos dos resíduos 1 a 37 de Fórmula (I) a seguir, em que até 25% dos aminoácidos apresentados na Fórmula (I) podem ser deletados ou substituídos por um aminoácido diferente: ιο i»D i X^Xââ¾χ:ys^ΛsaVIla'lAlas-·Γbf¾-C>7-Aia^ThΛGta?θ-Aí¾n^ I^“^b-AÍb»w-M^ ám^PW*'3-X&amp;â2*- 'Km**- Xaa-'* - Xa&amp;*?- (SEQ ÍD NO:8QO) 0),

Na Fórmula (I) , X' é hidrogénio, um grupo de capeamento N--terminal ou um ligante a uma porção química de aumento de duração. Xaa1 é Lys ou uma ligação, Xaa21 é Lys, Cys ou Asn, Xaa24 é Lys, Cys ou Gly, Xaa25 é Lys, Cys ou Pro, Xaa26 é Lys, Cys ou Ile, Xaa27 é Lys, Cys ou Leu, Xaa28 é Lys, Cys ou Pro, Xaa29 ê Lys, Cys ou Pro, e Xaa31 é Lys, Cys ou Asn. Adicionalmente em relação à Fórmula (I) , a variável X representa uma funcionalidade C-terminal (por exemplo, um cap C-terminal). X é amino substituído ou não substituído, alquilamino substituído ou nâG substituído, dialquilamino substituído ou não substituído, cicloalquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, aralquilamino substituído ou não substituído, aiquilóxí substituído ou não substituído, arilóxi substiruído ou não substituído, aralquilõxi substituído ou não substituído ou hidroxilo. Se o C-terminal do componente de polipéptido com a sequência de resíduos 1 a 37 de Fórmula (I) tiver cap com uma funcionalidade X, então, X é, de preferência, amina, formando, assim, uma amida C-terminal. Em algumas formas de realização, até 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% gu mesmo 50% dos aminoâcídGS de resíduos 1 a 37 de Fórmula (I) são deletados ou substituídos num componente de polipéptido de acordo com a Fórmula (I). Em algumas formas de realização, o componente análogo de amilina tem 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mesmo 16 substituições de aminoãcido em relação à sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula (I) . Em algumas formas de realização, o análogo de amilina tem uma sequência que tem uma identidade de sequência definida em relação aos ιο i»D i resíduos 1 a 37 da sequência de aminoãcidos de acordo com a Formula (I) . Em algumas formas de realização, a identidade de sequência entre um análogo de amilina descrito no presente documento e os resíduos 1 a 37 de Fórmula (I) é 50%, 55%, 6 0%, 6 5%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou ainda mais alta. Em algumas formas de realização, até 50%, 45%, 4 0%, 3 5%, 3 0%, 25%, 2 0%, 15%, 10%, 5% ou ainda menos dos aminoãcidos apresentados nos resíduos 1 a 37 de Fórmula (I) podem ser deletados ou substituídos por um aminoãcido diferente. Em algumas formas de realização, a identidade de sequência está dentro da faixa de 75% a 100%. Em algumas formas de realização, a sequência de identidade está dentro da faixa de 75% a 90%. Em algumas formas de realização, a sequência de identidade está dentro da faixa de 80% a 90%. Em algumas formas de realização, a sequência de identidade é de pelo menos 75%. Em algumas formas de realização, o análogo de amilina tem a sequência de resíduos 1 a 37 de Fórmula (I).

Em algumas formas de realização, os análogos de amilina, incluindo aqueles de Fórmula (I), formam a base de um componente de polipéptido ao qual uma ou mais porções químicas de aumento de duração são ligadas, opcionalmente através de um ligante, para formar um conjugado de amilina e polipéptido. Assim, o componente de polipéptido serve como um modelo ("modelo de polipéptido") ao qual o mesmo está ligado, de preferência, por ligação covalente, uma ou mais porções químicas de aumento de duração. A ligação da porção química de aumento de duração ao componente de polipéptídG pode ser através de um ligante conforme descrito no presente documento. De modo alternativo, a ligação da porção química de aumento de duração ao componente de polipéptido pode ser por meio de uma ligação covalente direta. A porção química de aumento de duração pode ser um polímero solúvel em água conforme descrito no presente documento. Em algumas formas de realização, uma ιο i»D i pluralidade de porções químicas de aumento de duração é fixada ao componente de polipêptido, em cujo caso cada ligante a cada porção química de aumento de duração é independentemente selecionado de entre os ligantes descritos no presente documento.

Os análogos de amilina úteis como componentes de polipêptido descritos no presente documento incluem, porém, sem limitação, os compostos apresentados nos resíduos 1 a 37 de Fórmula (I) fornecidos na Tabela 1 abaixo. A não ser que indicado ao contrário, todos os péptidos descritos no presente documento, incluindo péptidos que têm uma sequência expressamente fornecida, são contemplados em ambas as formas de carboxilato livre ou amidadas. ιο i»D i

TabeSa 3» PoHpéptÊdQS de eomporserste áíess nos eorrapostas desertos no presente doeomento

Os termos "ligante" e semelhantes, no contexto cle ligação de porções químicas de aumento de duração a um componente de polipéptido num conjugado de amilina e polipéptido descrito no presente documento, significam uma espécie divalente (-L-) ligada covalentemente, por sua vez, a um componente de polipéptido que tem uma valência disponível para ligação e a uma porção química de aumento de duração que tem uma valência disponível para ligação. 0 sítio de ligação disponível no componente de polipéptido é convenientemente um resíduo de cadeia lateral (por exemplo, lisina, cisteína, ácido aspártico e homólogos dos mesmos). ιο i»D i

Em algumas formar de realização, o sítio de ligação disponível no componente de polipéptido é a cadeia lateral de um resíduo de lisina ou cisteína. Em algumas formas de realização, o sítio de ligação disponível no componente de polipéptídG é a amina N-terminal. Em algumas formas de realização, o sítio de ligação disponível no componente de polipéptido é o carboxilo C-terminal. Em algumas formas de realização, o sítio de ligação disponível no componente de polipéptido ê um átomo de cadeia principal do mesmo. Conforme utilizado no presente documento, o termo "resíduo de aminoâcido de ligação" significa um aminoâcido dentro dos resíduos 1 a 3 7 de Fórmula (I) ao qual uma porção química de aumento de duração é ligada, opcionalmente através de um ligante.

Em algumas formas de realização, são fornecidos compostos que têm um ligante que liga covalentemente um componente de polipéptido com uma porção química de aumento de duração. 0 ligante ê opcional; isto é, qualquer ligante pode simplesmente ser uma ligação. Em algumas formas de realização, o ligante é fixado numa cadeia lateral do componente de polipéptido. Em algumas formas de realização, o ligante ê fixado a um átomo de cadeia principal do componente de polipéptido.

Em outro aspeto, é fornecido um conjugado de amílina e polipéptido, que é derivadG de pranlintída com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoâcido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e um resíduo de aminoâcido na posição 2 a 37 foi substituído por um resíduo de lisina ou um resíduo de cisteína e em que o referido resíduo de lisina ou resíduo de cisteína está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante, em que a numeração de aminoãcidos se conforma ao número de aminoâcido na SEQ ID NO :110.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polipéptido, que é um derivado de pranlintída ιο i»D i com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoãcido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoãcido em qualquer uma das posições 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 ê substituído com um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um lígante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polipêptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoãcido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoãcido em qualquer uma de entre as posições 21, 24 a 29 ou 31 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polipêptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID MO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoãcido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoãcido na posição 21 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polipêptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoãcido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoãcido na posição 24 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado ιο i»D i de amilina e polípéptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID MO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 25 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polípéptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 26 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polípéptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 27 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polípéptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 28 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglicol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polípéptido, que é um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) ιο i»D i e em que um resíduo de aminoácido na posição 29 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglícol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em outro aspeto, a invenção refere-se a um conjugado de amilina e polipéptido, que ê um derivado de pranlintida com SEQ ID NO :110 ou um análogo da mesma, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 31 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietilenoglícol, opcionalmente por meio de um ligante.

Em algumas fGrmas de realização, a pGrçâG química de aumento de duração é um polímero solúvel em água. Um "polímero solúvel em água" significa um polímero que é suficientemente solúvel em água sob condições fisiológicas de, por exemplo, temperatura, concentração iónica e semelhantes, conforme conhecido na técnica, para ser útil para os métodos descritos no presente documento. Um polímero solúvel em água pode aumentar a solubilidade de um péptídG ou outra biomolécula a qual o polímero solúvel em água está ligado. De facto, tal ligação foi proposta como um meio para aprimorar a vida em circulação, a solubilidade em água e/ou antigenicidade de proteínas administradas, in vivo. Veja-se, por exemplo, a Patente n- U.S. 4.179.337; o Pedido Publicado n- U.S. 2008/0032408. Muitos polímeros solúveis em água diferentes e químicas de ligação foram utilizados para atingir esse objetivo, tais como polietilenoglícol, copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli- 1,3 dioxo 1 ano, poli -1,3,6 -1rioxano, copo 1 ímero de etíleno/anidrido maleico, poliaminoãcidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e semelhantes.

Em algumas formas de realização, a porção química de ιο i»D i aumento de duração ligada inclui um polietilenoglicol. Polietilenoglicol ("PEG") foi utilizado em esforços para obter polipêptidos terapeuticamente usáveis. Veja-se, por exemplo, Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6:150 a 165; Mehvar, R., 2000, J. Pharm. Pharmaceut. Sei., 3:125 a 136. Conforme percebido por um perito na especialidade, a cadeia principal de PEG [ (CH2CH2-0-) U! n: número de monómeros de repetição] é flexível e anfifílica. Sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria ou mecanismo de ação, acredita-se que a molécula ou porção química de PEG do tipo de cadeia longa seja altamente hidratada e esteja em movimento rápido quando num meio aquoso. Acredita-se que o movimento rápido faça com que o PEG varra um grande volume e impeça a aproximação e interferência de outras moléculas. Como resultado, quando ligado a outra entidade química (tal como um péptido), as cadeias de polímero PEG podem proteger tal entidade química contra resposta imunológica e outros mecanismos de eliminação. Como resultado, a peguilação pode levar à eficácia e segurança do fármaco por otimização da farmacocinética, aumento da biodisponibilidade e diminuição da imunogenicidade e frequência de dosagem. "Peguilação" refere-se no sentido habitual à conjugação de uma porção química PEG com outro composto. Por exemplo, a ligação de PEG mostrou proteger as proteínas contra proteólíse. Veja-se, por exemplo, Blomhoff, Η. K. et al., 1983, Biochim Biophys Acta, 757:202 a 208. A não ser que indicado expressamente ao contrário, os termos "PEG", "polímero de polietilenoglicol" e semelhantes referem-se ao polímero de polietilenoglicol e derivados do mesmo, incluindo metóxi-PEG (mPEG).

Urna variedade de meios foi utilizada para ligar porções químicas poliméricas, cal como PEG e polímeros relacionados, a grupos reativos encontrados na proteína. Veja-se, por exemplo, a Patente n9 U.S. 4.179.337; a Patente n-9- U.S. 4.002.531; Abuchowski et al. , 1981, em ιο i»D i "Enzymes as Drugs", J. S. Holcerberg e J, Roberts, (Eds.), páginas 367 a 383; Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6:150 a 165. A utilização de PEG e outros polímeros para modificar proteínas foi discutida. Veja-se, por exemplo, Cheng, T.-L. et al., 1999m, Bioconjugate Chem., 10:520 a 528; Belcheva, N. et al. , 1999, Bioconjugate Chem., 10:932 a 937; Bettinger, T. et al . , 1998, Bioconjugate Chem., 9:842 a 846; Huang, S.-Y. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:612 a 617; Xu, B. et al. 1998, Langmuir, 13:2.447 a 2.456; Schwarz, J. B. et al., 1999, J. Arner, Chem. Soc, , 121:2.662 a 2.6 73; Reuter, J. D, et al, , 1999, Bioconjugate Chem., 10:271 a 278; Chan, T.-H. et al., 1997, J. Org. Chem., 62:3.500 a 3.504. Os sítios de ligação típicos em proteínas incluem grupos amino primários, tais como aqueles em resíduos de lisina ou no N-terminal, grupos tiol, tais como aqueles em cadeias laterais de cisteína, e grupos carboxilo, tais como aqueles em resíduos de glutamato e aspartato ou no C-terminal. Os sítios comuns de ligação são os resíduos de glicoproteínas, cisteínas ou ao N-terminal e lisínas do polipéptido alvo. Os termos "peguilhados" e semelhantes referem-se à ligação covalente de polietilenoglicol a um polipéptido ou outra biomolécula, opcionalmente através de um ligante conforme descrito no presente documento e/ou conforme mostrado na técnica.

Em algumas formas de realização, uma porção química de PEG num conjugado de amilina e polipéptido descrito no presente documento pode ter um peso molecular nominal dentro de uma faixa especificada. Como habitual na técnica, o tamanho de uma porção química de PEG é indicadG por referência ao peso molecular nominal, tipicamente fornecido em quilodaltons (kD) . 0 peso molecular é calculado numa variedade de formas na técnica, incluindo número, peso, viscosidade e peso molecular médio "Z". Entende-se que os polímeros, tal como PEG e semelhantes, existem como uma distribuição de pesos moleculares cerca de um valor médio ιο i»D i nominal.

Como exemplo da terminologia para peso molecular para PEGs, o termo "mPEG4QKD" refere-se a um polímero de rnetoxi polietilenoglicol que tern um peso molecular nominal de 40 quilodaltons. A referência a PEGs de outros pesos moleculares segue essa convenção. Em algumas formas de realização, a porção química de PEG tern um peso molecular nominal na faixa de 10 a 100 KD, 20 a 80 KD, 20 a 60 KD ou 20 a 40 KD. Em algumas formas de realização, a porção química de PEG tem um peso molecular nominal de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou mesmo 100 KD. De preferência, a porção química de PEG tem um pesG molecular de 20, 25, 30, 40, 60 ou 80 KD.

As moléculas de PEG úteis para derivação de polipéptidos são tipicamente classificadas nas classes linear, ramificadas e Warwick (isto é, poliPEG®) de PEGs, conforme conhecido na técnica. A não ser que expressamente indicado ao contrário, as porções químicas de PEG descritas no presente documento são PEGs lineares. Além disso, os termos "ramificada em dois braços", "com formato de Y" e semelhantes referem-se a porções químicas de PEG ramificadas, conforme conhecido na técnica. 0 termo "Warwick." no contexto de PEGs, também conhecido corno PEGs "em pente" ou "do tipo pente", refere-se a uma variedade de PEGs com múltiplos braços ligados a uma cadeia principal, tipicamente poli(metacrilato) , conforme conhecido na técnica. Em relação à nomenclatura que inclui convenções empregadas na tabela fornecida no presente documento, ausente indicação ao contrário, uma porção química de PEG t i 1 ~L Cj* 1 cí à cadeia principal do péptido. Por exemplo, o Composto 119 é o resultado da conjugação de mPEG40KD ao azoto N-terminal do Composto 101. De modo semelhante, o Composto 120 é o resultado da conjugação de mPEG40KD ao azoto N-terminal do Composto 102. Abreviações de uma letra padrão para aminoácidos podem ser utilizadas, assim como ιο i»D i abreviações de três letras padrão. Por exemplo, o Composto 124 ê um análogo do Composto 110 em que o resíduo na posição 26 do Composto 109 é utilizado no lugar da lisina, e a funcionalidade de amina pendente da lisina 26 (isto é, K26) é conjugada com uma porçâG química de PEG4 0KD. Compostos exemplificativos são fornecidos na Tabela 4 abaixo,

Tabela 4. Camposíos pesíiíilados

Amilinas e análogos de amilina aos quais uma porção química é fixada são derivados de amilina. Os derivados de amilina podem constituir amilinas às quais uma modificação química foi feita de um ou mais de seus grupos laterais de aminoãcidos, átomos de α-carbono, grupo amino terminal ou grupG ácido carboxílico terminal. Uma modificação química inclui, porém, sem limitação, fixar uma ou mais porções químicas, criar novas ligações e remover uma ou mais porções químicas. As modificações em grupos laterais de ιο i»D i aminoãcidos incluem, sem limitação, alquilaçâG, acilação, formação de éster, formação de amida, acoplamento de maleimida, acilação de grupos lisina ε-amino, N-alquilação de arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos ácido carboxílico, glutâmico ou aspãrtico e desamidação de glutamina ou asparagina. As modificações do amino terminal incluem, sem limitação, as modificações de desamino, alquilo N-inferior, alquilo K-di-inferior e N-acilo. As modificações do amino terminal incluem, sem limitação, as modificações de desamino, alquilo N-inferior, alquilo N-di-inferior e N-acilo, tais como alquilacilos, alquilacilos ramificados, alquilaril-acilos. As modificações do grupo carbóxi terminal incluem, sem limitação, as modificações de amida, alquil amida inferior, dialquil amida, arilamida, alquilarilamida e éster de alquilo inferior. Alquilo inferior é alquilo Ci~C4. Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos por grupos protetores conhecidos pelo químico sintético perito na especialidade, 0 α-carbono de um aminoãcido pode ser mono ou dimetilado.

Derivados de amilina incluem amilinas e análogos de amilina conjugados a uma ou mais moléculas de polímero solúveis em água, tais como polietilenoglicol ("PEG"), conforme descrito acima, ou cadeias de ácido gordo de vários comprimentos (por exemplo, estearilo, palmitoílG, octanoílo), através da adição de poliaminoácidos, tais como poli-his, poli-arg, poli-lys e poli-ala, ou pela adição de substituintes de molécula pequena que incluem alquilos curtos e alquilos restritos (por exemplo, adamantilo ramificado, cíclico, fundido), e grupos aromáticos. Em algumas formas de realização, as moléculas de polímero solúveis em água terão um peso molecular na faixa de cerca de 500 Daltons a cerca de 60.000 Daltons. Veja-se, pGr exemplo, as Publicações de Patente PCT n- WO 2007/104789, n-- WO 2009/034119 e n-9- WO 2010/046357 para derivados de ιο i»D i amilina adequados para utilização comG agentes antiobesidade em combinação com os polipéptidos manipulados da invenção.

Tais conjugações de polímeros podem ocorrer particularmente na terminação N ou C ou nas cadeias laterais de resíduos de aminoãcido dentro da sequência de uma amilina ou análogo de amilina conforme divulgado no presente documento. De modo alternativo, podem haver múltiplos sítios de derivatização ao longo da sequência de aminoãcidos de tal amilina ou análogo de amilina. A substituição de um ou mais aminoãcidos por lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína pode fornecer sítios adicionais para derivatização. Em algumas formas de realização, uma amilina ou análogo de amilina pode ser conjugada a uma, duas ou três moléculas de polímero.

Em algumas formas de realização, as moléculas de polímero solúveis em água são ligadas a um grupo amino, carboxilo ou tiol, e podem ser ligadas por terminações N ou C, ou nas cadeias laterais de lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína. De modo alternativo, as moléculas de polímero solúveis em água podem ser ligadas com grupos diamina e dicarboxílico. Em algumas formas de realização, uma amilina ou análogo de amilina é conjugada a uma, duas ou três moléculas de PEG através de um grupo épsilo amino num aminoãcido de lisina.

Constatou-se surpreendentemente que os polipéptidos manipulados da invenção fornecem efeitos antiobesidade sinérgicos benéficos a sujeitos tanto moderadamente obesos (BMI maior ou igual a 30) quanto gravemente GbesGS (BMI maior ou igual a 35) quando administrados em combinação com determinados outros compostos antiobesidade. Conforme descrito anteriormente, por exemplo, no Pedido Publicado n9 2008/0207512, verificou-se que um estado de resistência à leptina existe em sujeitos obesos. Veja-se também, por exemplo, Tenenbaum, D., HHMI Bulletin, páginas 25 a 27 ιο i»D i (março de 2003); Chicurel, M., Mature, Volume 404, páginas 538 a 540 (2000); Scarpace et al., Diabetalogia, Volume 48, páginas 1.075 a 1.083 (2005); e Bays et al., Obesity Research, Volume 12, (8), páginas 1.197 a 1.211 (2004) . Essa resistência à leptina, caracterizada, pelo menos em parte, pela presença de níveis de leptina sérica anormalmente altos ern sujeitos obesos, torna esses sujeitos incapazes de responder de modo eficaz à leptina, administrada endógena ou exogenamente. Verificou-se anteriormente que essa resistência à leptina poderia ser superada em sujeitos moderadamente obesos, com uma terapia de combinação que incluí uma leptina (por exemplo, metreleptina) e determinados outros compostos antiobesidade. Veja-se, por exemplo, o Pedido Publicado n- U.S. 2008/0207512. Verificou-se adicionalmente que os efeitos antiobesidade sinérgicos da terapia de combinação de leptina estão ausentes em sujeitos com BMI alto, gravemente obesos, provavelmente devido a uma grave resistência à leptina. Os inventores constataram surpreendentemente que os compostos manipulados da invenção têm capacidade para superar até mesmo uma grave resistência à leptina quando administrados em combinação com determinados outros compostos antiobesidade. Consequentemente, também são fornecidos pela invenção métodos para tratar obesidade e afeções, distúrbios e doenças relacionadas com obesidade em sujeitos, incluindo sujeitos com BMI alto, através da administração de pelo menos dois agentes antiobesidade diferentes, em que um agente antiobesidade é um polipéptido manipulado da invenção e o outro agente antiobesidade é uma amilina, um análogo de amilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina (isto é, um agente de amilina).

Em determinadas formas de realização, a invenção fornece métodGS para tratar Gbesidade em sujeitos que precisam dos mesmos que compreende a administração de um primeiro agente antiobesidade selecionado de entre urn ιο i»D i polipéptido manipulado da invenção em combinação com um segundo agente antiobesidade selecionado de entre uma amilina, um análogo de amilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina, em que a administração dos agentes resulta num efeito sinérgico em comparação a qualquer agente sozinho.

Em um aspeto, os métodos da invenção fornecem um efeito antiobesidade sinérgico de entre os agentes administrados. Consequentemente, em determinadas formas de realização, a administração de uma combinação de agentes antiobesidade resulta num efeito, por exemplo, uma redução na disponibilidade de nutrientes, uma redução no peso corporal, uma redução na ingestão de alimentos, um aumento no metabolismo, que é maior do que a combinação dos resultados da administração do agente antiobesidade sozinho (monoterapia). "Disponibilidade de nutrientes reduzida" destina-se a incluir quaisquer meios através dos quais o corpo reduz os nutrientes disponíveis para o corpo armazenar como gordura. Em outras palavras, a redução de disponibilidade de nutrientes pGde ser através de meios que incluem, porém, sem limitação, reduzir o apetite, aumentar a saciedade, afetar a escolha de alimento /aversão a sabor, aumentar o metabolismo e/ou diminuir ou inibir a absorção de alimento. Mecanismos exemplificativos que podem ser afetados incluem atraso no esvaziamento gástrico ou diminuição de absorção de alimentos rios intestinos.

Conforme utilizado no presente documento, um "sujeito que precisa do mesmo" inclui sujeitos que estão acima do peso, obesos ou que desejam perder peso. Sujeitos obesos incluem tanto a população moderadamente obesa, com baixo BMI quanto a população gravemente obesa, com alto BMI. Além dissG, sujeitos que são resistentes ã insulina, intolerantes à glicose ou têm qualquer forma de diabetes mellitus (por exemplo, tipo 1, 2 ou diabetes gestacional) ιο i»D i podem beneficiar-se dos métodos da invenção.

Por "taxa metabólica" entende-se a quantidade de energia libertada/gasta por unidade de tempo. 0 metabolismo por unidade de tempo pode ser estimado por consumo de alimento, energia libertada como calor ou oxigénio utilizado em processos metabólicos. Geralmente é desejável ter uma taxa metabólica ma is alta quando deseja-se perder peso. Por exemplo, uma pessoa com uma alta taxa metabólica pode ter capacidade para gastar mais energia (por exemplo, o corpo queima mais calorias) para realizar uma atividade do que uma pessoa com uma baixa taxa metabólica para essa atividade.

ConfGrme utilizado no presente documento, "massa magra" ou "massa corporal magra" refere-se ao músculo ou osso. A massa corporal magra não indica necessariamente massa livre de gordura. A massa corporal magra contém uma pequena percentagem de gordura (aproximadamente 3%) dentro do sistema nervoso central (cérebro e medula espinal), medula dos ossos e órgãos internos. A massa corporal magra é medida em termos de densidade. Métodos para medir massa gorda e massa magra incluem, porém, sem limitação, pesagem subaquática, pletismografia de deslocamento de ar, raio X, varrimento DEXA, MRIs e varrimentos CT. Em determinadas formas de realização, a massa gorda e a massa magra são medidas com a utilização de pesagem subaquática conforme conhecido na técnica.

Por "distribuição de gordura" entende-se a localização de depósitos de gordura no corpo. Tais localizações de deposição de gordura incluem, por exemplo, depósitos de gordura subcutâneos, viscerais e ectópicos.

Por "gordura subcutânea" entende-se o depósito de lípídos logo abaixo da superfície da pele. A quantidade de gordura subcutânea num sujeito pode ser medida com a utilização de qualquer método disponível para a medição de gordura subcutânea. Métodos para medir a gordura subcutânea ιο i»D i são conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos na Patente n£ U.S, 6.530.886.

Por "gordura visceral" entende-se o deposito de gordura como tecido adiposo intra-abdominal. A gordura visceral envolve órgãos vitais e pode ser metabolizada pelo fígado para produzir colesterol no sangue. A gordura visceral foi associada ao aumento de risco de afeções, tais como síndrome do ovário policístico, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares.

Por "armazenamento de gordura ectópico" entende-se depósitos de lípido dentro e ao redor de tecidos e órgãos que constituem a massa corporal magra (por exemplo, músculo esqueléticG, coração, fígado, pâncreas, rins, vasos sanguíneos). Em geral, o armazenamento de gordura ectópico é uma acumulação de lípidos fora de depósitos de tecido adiposo clássicos no corpo.

Conforme utilizado no presente documento, e conforme bem compreendido na técnica, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. "Tratar" ou "paliar" uma doença, distúrbio ou afeção significa que a extensão e/ou manifestações clínicas indesejáveis de um estado de afeção, distúrbio ou doença são diminuídas e/ou o curso de tempo da progressão é retardado ou prolongado, em comparação ao não tratamento do distúrbio. Por exemplo, no tratamento de obesidade, uma diminuição no peso corporal, por exemplo, uma diminuição de pelo menos 5% no peso corporal, é um exemplo de um resultado de tratamento desejável. Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém, sem limitação, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas, diminuição de extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, sem piora), atraso gu retardamento de progressão da doença, melhoria ou paliaçáo do estado de doença e remissão (parcial ou total), detetável ou não detetável. "Tratamento" também pode ιο i»D i significar o prolongamento de sobrevivência em comparação à sobrevivência esperada caso não receba tratamento. Adicionalmente, o tratamento não ocorre necessariamente através de administração de uma dose, mas ocorre frequentemente mediante a administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz, uma quantidade suficiente para paliação ou uma quantidade suficiente para tratar uma doença, distúrbio ou afeção pode ser administrada em uma ou mais administrações.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade dos compostos ativos na composição que produzirá uma resposta biológica ou médica num tecido, sistema, sujeito ou ser humano, que é pretendida pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico, que inclui alívio dos sintomas do distúrbio a ser tratado. Os métodos de tratamento inovadores desta invenção são para distúrbios conhecidos pelos peritos na especialidade.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "quantidade profilaticamente eficaz" significa a quantidade dos compostos ativos na composição que produzirá a respGsta biológica ou médica num tecido, sistema, sujeito ou ser humano, que é pretendida pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico, para prevenir o início de Gbesidade ou um distúrbio, afeção ou doença relacionada com obesidade em sujeitos como risco de obesidade ou do distúrbio, afeção ou doença relacionada com obesidade.

Em outro aspeto da presente invenção, métodos para reduzir o risco de desenvolvimento de distúrbios metabólicos são fornecidos, em que o método compreende administrar ao sujeito uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para reduzir o peso de um sujeito.

Em algumas formas de realização da invenção, os métodos da invenção são utilizados para aumentar a taxa ιο i»D i metabólica num sujeito, diminuir uma redução na taxa metabólica num sujeito ou preservar a taxa metabólica num sujeito. Em determinadas formas de realização, a taxa metabólica pode envolver a utilização preferencial da gordura dG CGrpo como uma fonte de energia sobre o tecido corporal magro. Em um aspeto, a massa corporal magra não diminui após a administração da combinação de agentes antiobesidade. Em outro aspeto, uma redução na massa corporal magra é diminuída ou impedida após a administração da combinação de agentes antiobesidade. Em ainda outro aspeto, a massa corporal magra é aumentada após a administração da combinação de agentes antiobesidade. Tal preferência por gordura como a fonte de energia pode ser determinada comparando-se a quantidade de tecido gorduroso com o tecido corporal magro, verificada medindo-se o peso corporal total e o teor de gordura no início e no fim do período de tratamento. Um aumento na taxa metabólica é um nível mais alto da uuilização de caiorias ou outra fonte de energia por um sujeito ao longo de um período de tempo em comparação ao nível de utilização de calorias ou outra fonte de energia pelo sujeito ao longo de outro período de tempo sob condições substancialmente semelhantes ou idênticas sem a administração da combinação de agentes antiobesidade. Em determinadas formas de realização, a taxa metabólica é aumentada pelo menos cerca de 5% num sujeito, em outras formas de realização, a taxa metabólica é aumentada pelo menos cerca de 10%, 15%, 20% 25%, 30% ou 35% num sujeito em comparação ao nível de utilização de calorias ou outra fonte de energia pelo sujeito ao longo de outro período de tempo sob condições substancialmente semelhantes ou idênticas sem a administração da combinação de agentes antiobesidade. 0 aumento na taxa metabólica pode ser medido com a utilização de um calGrímetro respiratóriG, por exemplo. Uma quantidade eficaz dos agentes antiobesidade, conforme utilizado nestas formas de ιο i»D i realização, é uma quantidade de cada agente eficaz para aumentar a taxa metabólica num sujeito quando administrado em combinação em comparação a um sujeito que não recebe os agentes ou somente um dos agentes.

Em outra forma de realização, é fornecido um método para reduzir uma diminuição na taxa metabólica num sujeito. Tal diminuição na taxa metabólica pode ser o resultado de qualquer afeção ou regime nutricional ou físico que leva a uma redução na taxa metabólica, por exemplo, devido a uma dieta de calorias reduzidas, uma dieta restrita ou perda de peso. Uma dieta restrita inclui permissões e proibições, ou ambos, nos tipos de alimento ou nas quantidades de alimento, ou ambos, permitidGS numa dieta, não necessariamente baseada em calorias. Por exemplo, como em dietas individuais, o corpo compensa com uma taxa metabólica reduzida com base na menor ingestão calórica. Em essência, o corpo regula de modo descendente a exigência por alimento, subsistindo, assim, em menos alimento. À medida que a dieta contínua, o limiar para ingestão calórica é reduzido. Quando a dieta acaba, o sujeito tipicamente ganha peso enquanto come uma dieta normal devido ao limiar de ingestão calórica reduzido e à menor taxa metabólica basal (NIH Technology Assessment Conference Panel (1992) Ann. Intern. Med. 116:942 a 949; Wadden (1993) Ann. Intern. Med. 119:688 a 693). Em um aspeto, é fornecido um método para reduzir a perda de taxa metabólica num sujeito, em que a perda de taxa metabólica é o resultado de uma dieta de calorias reduzidas ou perda de peso. Com a utilização de tal método, a redução na taxa metabólica do sujeito é diminuída em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20% 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% num sujeito. Para caís métodos, pode ser desejável administrar a combinação de agentes antiobesidade no momento em que a afeção ou regime nutricional ou físico é iniciado, o que leva a uma perda ou redução na taxa metabólica. No entanto, ιο i»D i também contempla-se que a administração ogs agentes seja instituída antes da afeção ou do regime nutricional ou físico ser iniciado. Em um caso, a taxa metabólica é medida com a utilização de um calorímetro respiratório. Uma quantidade eficaz dos agentes antíobesidade, conforme utilizado nesta forma de realização, é uma quantidade de cada agente eficaz para diminuir a redução da taxa metabólica num sujeito quando administrados em combinação.

Em outro aspeto, sâo fornecidos métodos para reduzir platôs metabólicos, em que um método compreende administrar quantidades eficazes de agentes antíobesidade em combinação a um sujeito. Em determinadas formas de realização, o sujeítG perde pesG, ou perdeu peso, por exemplo, devídG a uma dieta de calorias reduzidas, um aumento de exercícios ou uma combinação dos mesmos. Por "platô metabólico" entende-se intervalos de tempo de taxa metabólica estacionária enquanto o corpo ajusta-se às mudanças na entrada calõrica ou de energia. As mudanças na entrada ou no consumo calórico podem ser o resultado, por exemplo, de dieta de calorias reduzidas ou aumento de atividade física. Tais platôs podem ser observados, por exemplo, durante uma um regime de perda de peso quando a perda de peso diminui ou para. Em determinadas formas de realização, um método da presente invenção reduz a duração de um platô metabólico num sujeito em comparação à duração de platôs metabólicos num sujeito de outra forma idêntico ao longo do mesmo período de tempo sob condições substancialmente semelhantes ou idênticas sem a administração da combinação de agentes antíobesidade. Em outras formas de realização, um métodG da presente invenção reduz a frequência de platôs metabólicos em comparação à frequência de platôs metabólicos num sujeito de outra forma idêntico ao longo do mesmo período de tempo sob condições substancialmente semelhantes ou idênticas sem a administração da combinação de agentes antíobesidade. Em ainda outras formas de realização, um ιο i»D i método da presente invenção retarda o início de um platô metabólico em comparação ao início de um platô metabólico num sujeito de outra forma idêntico ao longo do mesmo período de tempo sob condições substancialmente semelhantes ou idênticas sem a administração da combinação de agentes antiobesidade. Em determinadas formas de realização, os platôs metabólicos são identificados mapeando-se períodos de redução ou nenhuma perda de peso. Em determinadas formas de realização, pelo menos um platô metabólico é reduzido. Em outras formas de realização, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez platôs metabólicos são reduzidos. Em outro aspeto, os platôs metabólicos são retardados um dia em comparação a um sujeito não administrado com a combinação de agentes antiobesidade sob condições idênticas ou semelhantes. Em outros aspetos, os platôs metabólicos são retardados 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 10 dias, 2 semanas ou 3 semanas num sujeito.

Em ainda outras formas de realização, é fornecido um método para preservar a taxa metabólica num sujeito. Em determinadas formas de realizaçâG, o sujeito pGde estar em risco de perda de taxa metabólica, por exemplo, devido à iniciação de uma dieta de calorias reduzidas, dieta restrita ou perda de peso antecipada. Uma preservação de taxa metabólica é uma manutenção do nível da utilização de calorias ou outra fonte de energia por um sujeito ao longo de um período de tempo em comparação ao nível de utilização de calorias ou outra fonte de energia por um sujeito de outra forma idêntico ao longo do mesmo período de tempo sob condições substancialmente semelhantes ou idênticas sem a administração da combinação de agentes antiobesidade. Em um aspeto, a taxa metabólica é mantida dentro de 15% da taxa metabólica do sujeito antes da iniciação do evento que resulta na diminuição na taxa metabólica. Em outros aspetos, a taxa metabólica é mantida dentro de 10%, dentro ιο i»D i de 7%, dentro de 5%, dentro de 3% ou menos da taxa metabólica do sujeito. Em um aspeto, a combinação de agentes antiobesidade é administrada na iniciação de uma dieta de calorias reduzidas, dieta restrita ou regime de exercícios.

As taxas metabólicas podem ser avaliadas com a utilização de qualquer método disponível para determinar tais taxas, por exemplo, com a utilização de um calorímetro respiratório. Tais métodos e dispositivos para avaliar taxas metabólicas são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes n2 U.S. 4,572,208, n2 U.S. 4.856.531, n2 U.S. 6.468.222, n2 U.S. 6.616.615, n2 U.S. 6.013.009 e n2 U.S, 6.475.158. De modo alternativo, a taxa metabólica de um animal pode ser avaliada medindo-se a quantidade de tecido magro versus tecido gorduroso catabolízada pelo animal após o período de dieta. Assim, o peso corporal total e o teor de gordura podem ser medidos no fim do período dietãrio. Em ratos, um método frequentemente utilizado para determina gordura corporal total é remover cirurgicamente e pesar o coxim de gordura retroperitoneal, um corpo de gordura localizado no retroperitónio, a área entre a parede abdominal posterior e o posterior peritónio parietal. Considera-se que o peso de coxim esteja diretamente relacionado com o percentual de gordura corporal do animal. Visto que a relação entre peso corporal e gordura corporal em ratos é linear, aniSmais obesos têm um percentual correspondentemente mais alto de gordura corporal e peso coxim de gordura retroperitoneal.

Em outro aspeto da presente invenção, são fornecidos métodos para reduzir massa gorda aumentando-se a taxa metabólica num sujeito, em que os métodos compreendem administrar uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para reduzir a massa gorda aumentando-se a taxa metabólica do sujeito. A massa gorda pode ser expressa como uma percentagem da massa corporal total. Em ιο i»D i alguns aspetos, a massa gorda ê reduzida em pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20% ou pelo menos 25% ao longo do curso de tratamento. Em um aspeto, a massa magra do sujeito não é diminuída ao longo do curso do tratamento. Em outro aspeto, a massa magra do sujeito é mantida ou aumentada ao longo do curso do tratamento. Em outro aspeto, o sujeito está numa dieta de calorias reduzidas ou dieta restrita. Por "dieta de calorias reduzidas·" entende-se que o sujeito ingere menos calorias por dia em comparação à dieta normal do mesmo sujeito. Em um caso, o sujeito consome pelo menos 50 calorias a menos por dia. Em outros casos, o sujeito consome pelo menos 100, 150, 200, 250, 300, 4Q0, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 calorias a menos por dia.

Em determinadas formas de realização da presente invenção, é fornecido um método para alterar a distribuição de gordura num sujeito, em que o método compreende administrar uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para alterar a distribuição de gordura no sujeito. Em um aspeto, a alteração resulta de um aumento de metabolismo de gordura visceral ou ectópica, ou ambas, no sujeito. Em algumas formas de realização, o método envolve o metabolismo de gordura visceral ou ectópica, ou ambas, a uma taxa de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% ou 50% maior do que para gordura subcutânea. Em um aspeto, os métodos resultam numa distribuição de gordura favorável. Em determinadas formas de realização, a distribuição de gordura favorável é um aumento da razão entre a gordura subcutânea e a gordura visceral, gordura ectópica ou ambas. Em um aspeto, o método envolve um aumento na massa corporal magra, por exemplo, como um resultado de um aumento na massa de células musculares.

Em outras formas de realização, sâo fornecidos métodos para reduzir a quantidade de gordura subcutânea num sujeito, em que o método compreende administrar, a um ιο i»D i sujeito que precisa do mesmo, uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para reduzir a quantidade de gordura subcutânea no sujeito. Em um caso, a quantidade de gordura subcutânea é reduzida num sujeito em pelo menos cerca de 5%. Em outros casos, a quantidade de gordura subcutânea é reduzida em pelo menos cerca de 10%, 15%, 2 0%, 2 5%, 3 0% 4 0% ou 50% em comparação ao sujeito antes da administração dos agentes antiobesidade.

Os métodos descritos no presente documento podem ser utilizados para reduzir a quantidade de gordura visceral num sujeito. Em um caso, a gordura visceral é reduzida num sujeito em pelo menos cerca de 5%. Em outros casos, a gordura visceral é reduzida no sujeito em pelo menos cerca de 10%, 15%, 2 0%, 2 5%, 3 0% 4 0% ou 50% em comparação ao sujeito antes da administração da combinação de agentes antiobesidade. A gordura visceral pode ser medida através de qualquer meio disponível para determinar a quantidade de gordura visceral num sujeito. Tais métodos incluem, por exemplo, tomografia abdominal por meio de varrimento de CT e MRI. Outros métodos para determinar gordura visceral são descritos, por exemplo, nas Patentes n- U.S. 6.864.415, n2 U.S. 6.850.797 e n2 U.S. 6.487.445.

Em determinadas formas de realização, é fornecido um método para prevenir a acumulação de gordura ectõpica ou reduzir a quantidade de gordura ectópica num sujeito, em que o método compreende administrar, a um sujeito que precisa do mesmo, uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para prevenir a acumulação de gordura ectópica ou reduzir a quantidade de gordura ectópica no sujeito. Em um caso, a quantidade de gordura ectõpica é reduzida num sujeito em pelo menos cerca de 5% em comparação ao sujeito antes da administração da combinação de agentes antiobesidade. Em outros casos, a quantidade de gordura ectõpica é reduzida num sujeito em pelo menos cerca de 10%, ou em pelo menos cerca de 15%, ιο i»D i 20%, 25%, 30% 40% on 50%. De modo alternativo, a quantidade de gordura ectópica é proporcionalmente reduzida 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% era comparação à gordura subcutânea num sujeito. A gordura ectópica pode ser medida num sujeito com a utilização de qualquer método disponível para medir gordura ectópica.

Em outras formas de realização, são fornecidos métodos para produzir uma distribuição de gordura ma is favorável num sujeito, em que o método compreende administrar a um sujeito uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para produzir uma distribuição de gordura favorável. Em determinadas formas de realização, a administração de uma combinação de agentes antiobesidade reduz a quantidade de gordura visceral ou gordura ectópica, ou ambas, num sujeito. Por exemplo, a administração de uma combinação de agentes antiobesidade, em que pelo menos um agente antiobesidade que atua sobre estruturas do prosencéfalo envolvidas na ingestão de alimentos ou modulação de peso corporal, ou ambas, em combinação com a administração de pelo menos um agente antiobesidade que atua sobre estruturas do rombencéfalo envolvidas na ingestão de alimentos ou modulação de peso corporal, ou ambas. Em determinadas formas de realização, os métodos, de preferência, reduzem a quantidade de gordura visceral ou ectópica, ou uma combinação de ambas, através da redução na gordura subcutânea. Tais métodos resultam numa razão mais alta entre gordura subcutânea e gordura visceral ou gordura ectópica. Taís razões aprimoradas podem resultar num risco reduzido do desenvolvimento de doenças cardiovasculares, síndrome do ovário policístico, síndrome metabólica ou quaisquer combinações das mesmas. Em determinadas formas de realização, a gordura ectópica ou visceral é metabolizada a uma taxa 5% maior do que a gordura subcutânea. Em outras formas de realização, a gordura ectópica ou visceral é metabo 1 i zada a uma taxa pe 1 o menos 10% 15%, 20%, 25%, 30% ιο i»D i 50%, 6 0%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior do que a gordura subcutânea,

Em outro aspeto, os métodos da invenção incluem a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma combinação de agentes antiobesidade administrada em combinação com glucocorticosteroides. Os glucocorticosteroides têm o efeito adverso de aumentar a massa gorda e diminuir a massa magra. Consequentemente, contempla-se que o agente antiobesidade combinação possa ser utilizados em conjunto com glucocorticosteroides sob condições em que a utilização de glucocorticosteroide é benéfica.

Em ainda outro aspeto, os métodos da invenção incluem a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente antiobesidade ou uma combinação de agentes antiobesidade administrada em combinação com um agente terapêutico selecionado de entre orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE e QNEXA, Em algumas formas de realização, os métodos da invenção incluem a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido manipulado da invenção em combinação com um agente terapêutico selecionado de entre orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE e QNEXA. Em outras formas de realização, os métodos da invenção incluem a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma amíiina, um análogo de amilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina em combinação com um agente terapêutico selecionado de entre orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE e QNEXA. Em outras formas de realizaçâG, os métodos da invenção incluem a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto manipulado da invenção em combinação com uma amilina, um análogo de amilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina e um agente terapêutico selecionado de entre orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE e QNEXA, ιο i»D i

Também são fornecidos métodos para reduzir o peso num sujeito morbidamente obeso primeiramente reduzindo-se o peso do sujeito para um nível abaixo do peso de obesidade mórbida, então, administrando-se ao sujeito uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para reduzir ainda ma is o peso do sujeito. Métodos para reduzir o peso do sujeito para abaixo do peso de obesidade mórbida incluem reduzir a ingestão calõrica, aumentar a atividade física, terapia com fãrmacos, cirurgia bariãtrica, tais como cirurgia de bypass gástrico, ou quaisquer combinações dos métodos anteriores. Em um aspeto, a administração da combinação de agentes antiobesidade reduz ainda mais o peso do sujeito. Em outras formas de realização, são fornecidos métodos para reduzir o índice de massa corporal num sujeito que tem um índice de massa corporal de 4 0 ou menos administrando-se uma combinação de agentes antiobesidade em quantidades eficazes para reduzir ainda mais o peso do suj eito.

Por reduzir o peso entende-se que o sujeito perde uma porção de seu peso corporal total ao longo do curso de tratamento, seja o curso de tratamento em dias, semanas, meses ou anos. De modo alternativo, a redução de peso pode ser definida como uma diminuição na proporção entre massa gorda e massa magra (em outras palavras, o sujeito perdeu massa gorda, mas manteve ou ganhou massa magra, sem necessariamente uma perda correspondente em peso corporal total). Uma quantidade eficaz dos agentes antiobesidade administrados em combinação nessas formas de realização é uma quantidade eficaz para reduzir um peso corporal do sujeito ao longo do curso do tratamento ou, De modo alternativo, uma quantidade eficaz para reduzir a percentagem de massa gorda do sujeito ao longo do curso do tratamento. Em determinadas formas de realização, o peso corporal do sujeito é reduzido, ao longo do curso de tratamento, em pelo menos cerca de 1%, em pelo menos cerca ιο i»D i de 5%, em pelo menos cerca de 10%, era pelo menos cerca de 15% ou em pelo menos cerca de 20%. De modo alternativo, a percentagem de massa gorda do sujeito é reduzida, ao longo do curso de tratamento, em pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, peio menos 20% ou pelo menos 25%.

Em determinadas formas de realização, os métodos para reduzir peso incluem aderência aprimorada à conservação de peso. Sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria, a restauração de capacidade de resposta à leptina alcançada através da administração de agentes antiobesidade conforme descrito no presente documento supera um desafio crítico para sujeitos obesos. Em métodos de perda de peso anteriores, os níveis de leptina podem ainda ser mais altos do que o normal mesmo num peso corporal reduzido, o que torna difícil para sujeitos manterem a perda de peso. Os métodos descritos no presente documento incluem não só os métodos para perder peso, mas também o componente de aderência aprimorada à conservação de peso.

Em determinadas formas de realização, os métodos para reduzir a disponibilidade de nutrientes, por exemplo, reduzir o peso, num sujeito compreendem administrar ao sujeito uma quantidade eficaz dos agentes antiobesidade numa dose em bólus uma ou ma is vezes por dia. Uma dose em bõlus é uma dosagem intermitente de medicamento (em oposição a uma infusão contínua). Um sujeito pode ser administrado com uma ou mais doses em bólus por dia. A dose em bólus pode ser a mesma sem importar quando é administrada ao sujeito, ou pode ser ajustada de modo que o sujeito seja administrado com uma dose em bólus maior em determinados momentos do dia em comparação a outros. A administração de um agente em determinadas formulações, por exemplo, formulações de libertação prolongada, uma dose em bólus pode ser administrada menos frequentemente, por exemplo, uma vez a cada três dias, uma vez por semana, duas ιο i»D i vezes pGr mês, uma vez a cada mês. Além disso, o tempo entre doses em bõlus é, de preferência, longo o suficiente para permitir que o fármaco administrado na dose em bólus anterior seja eliminado da corrente sanguínea do sujeito.

Em Gutras formas de realizaçâG, os métodos para reduzir a disponibilidade de nutrientes, por exemplo, reduzir o peso, num sujeito compreendem administrar ao sujeito uma quantidade eficaz dos agentes antiobesidade em doses contínuas. Por dose contínua pretende-se dizer a infusão contínua do fármaco, por exemplo, por injeção intravenosa ou um emplastro transdérmico. De modo alternativo, uma dose contínua pode ser administrada oralmente na forma de uma cápsula ou comprimido de libertação controlada que liberta o fármaco no sistema do sujeito ao longo de um período de tempo. Quando administrado por uma dose contínua, o fármaco é libertado ao longo de um período de cerca de 1 hora, em alguns casos, o fármaco é libertado ao longo de um período de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 ou 24 horas.

Por "administrado em combinação" entende-se que os agentes antiobesidade são administrados como uma administração única, simultaneamente como doses separadas, ou como sequencialmente administrados. A administração sequencial refere-se à administração de um dos agentes antiobesidade antes ou após um agente antiobesidade. Em determinadas formas de realização, o primeiro agente antiobesidade é administrado cerca de 30 minutos antes ou após o pelo menos um outro agente antiobesidade, em outras formas de realizaçâG, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 horas antes ou após o pelo menos um outro agente antiobesidade. Qualquer um dos agentes antiobesidade administrados pode ser administrado como uma dose em bõlus gu como uma dose contínua.

Além disso, em determinadas formas de realização, a administração dos agentes de indução de peso em combinação ιο i»D i resulta num efeito sinérgico em qualquer um dos aspetos da invenção. Além disso, em determinadas formas de realização, a administração dos agentes de indução de peso em combinação resulta numa exigência de dosagem mais baixa para pelo menos um dos agentes, com o mesmo efeito.

Consequentemente, em uma forma de realização, trata-se de um método para tratar a obesidade ou reduzir o peso corporal num sujeito que precisa do mesmo, que compreende a administração periférica de quantidades terapeuticamente eficazes de pelo menos dois agentes antiobesidade diferentes, em que pelo menos um agente antiobesidade é uma amilina, um análogo de amilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina e pelo menos um agente antiobesidade é um polipéptido manipulado que compreende: um polipéptido de domínio de ligação à albumina (ABD); e um primeiro domínio de hormona de péptido (EDI) selecionado de entre uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma, e o sujeito reduz o peso corporal em pelo menos 10%, 12%, 15%, 20%, 30%, 40% ou até mesmo 50%.

Formas de realização adicionais incluem as seguintes.

Forma de realização 1. Um método para tratar obesidade num sujeito que compreende a administração periférica de quantidades terapeuticamente eficazes de pelo menos dois agentes antiobesidade diferentes, em que pelo menos um agente antiobesidade é uma amilina, um análogo de amilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina (isto é, um agente de amilina) e pelo menos um agente antiobesidade é um polipéptido manipulado que compreende: um polipéptido de domínio de ligação à albumina (ABD); e um primeiro domínio de hormona de péptido (HD1) selecionado de entre uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma.

Forma de realização 2, Um método para reduzir o peso corporal num sujeito que compreende a administração periférica de quantidades terapeuticamente eficazes de pelo ιο i»D i menos dois agentes antiobesidade diferentes, em que pelo menos um agente antiobesidade ê uma amilina, um análogo de arn.ilina, um agonista de amilina ou um derivado de amilina (isto é, um agente de amilina) e pelo menos um agente antiobesidade é um polipêptido manipulado que compreende: um polipêptido de domínio de ligação à albumina (ABD); e um primeiro domínio de hormona de péptido (EDI) selecionado de entre uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma.

Forma de realização 3. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 ou 2, em que o pelo menos um agente de amilina antiobesidade de amilina é um agonista de amilina.

Forma de realização 4. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 3, em que o agonista de amilina compreende um análogo ou derivado de amilina.

Forma de realização 5. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 4, em que o análogo ou derivado de amilina compreende pranlintida.

Forma de realização 6. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 5, em que o análogo ou derivado de amilina compreende um composto divulgado na Tabela 4.

Forma de realização 7. 0 métodG, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 6, em que o análogo ou derivado de amilina compreende Des-Lysl-[Lys26 (mPEG40K) ] Pranlintida.

Forma de realização 8. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que o ABD compreende qualquer um dos péptidos selecionados a partir do grupo que consiste em: ιο i»D i LAEAKVLWRELDKYG¥SDF¥KSYlNRAKTVEGVHTyGHSL^ALF (SEQ ID «0:38), Í.AEAK¥tóNRELOKYGVSDF¥KRURKAKWEGVNM.THH^IAAU> (SEO ID ΝΟ;39), LAEAK¥LARRELDKYGVSD¥¥KRLI!NRART¥EG¥HALID;HILAALP(SEa ID «0:4% LAiM¥LANÍRÊ-LDKY<G¥'SDYYKMIINRAKWEDyRALKLHIlMys (SEQ ID «0:41), LA£ÂKVLANRÊLDK¥GVSDFYK«UNf?AI<1VÊ0VSSiKÔHILAALP (SEQ ID «0:42), l^KVlANREtDKYeVSOYYK:flU«KAKIVEGVEAlJlHllAALP{SEQ ID NOr-fâ), LAE'AKVLANmOKVGVSOFYK«LIN«AiaVEGVDALIAHjLAALP {SEQ10 «0:4#), ÍA£AKVÍjftNREI.DKY^SQFYKSI..!«RAKTVEGYDALTSHIE.AALP (SEQ 10 «0:45), I.AEAKVIÍ.ÂN RRBKYGVSDFYSKME. I«RAKTVE0VNSI:TSHIIAA1P {SEQ ID «0:46), LAEAKVLANR£:LDKYGYSDF¥KMVÍ«KAK1VEGV£$LÍM1LAALP {SEQ 10 «0:47), L^EAKVUWRELDKYOVSDYYK'NUMKAKTVEGVQAtlAHSlAALP (SEQ ID «0:48), LAEAKVLANRELDKYGVSQFYKRLINKAKWEGVEALSLHILAALP (SEQ ID «0:49), l«AKE^mOKYGVSOYYK«yMKAKTVEOVEAlTlHftMlP (SEQ ID NO:SO), LAÊ'AKEDAI)âÊtOKYQ¥SOYYKNy«KAKTV£OVÊAL^ÈÍlAMP {SEQ ID N0:§1) e U^MEE^mDKYGVSDYYITOSIÍÀiaWGVKALISeyyMLP (SEQ ID NOm

Forma de realização 9. 0 método, de acordo com

qualquer uma das formas de realização 1 a 8, em que o HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO :16, SEQ ID MO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID

NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID MO: 26, SEQ ID MO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID MO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID

NO :32, SEQ ID MO : 33, SEQ ID NO :143, SEQ ID MO :144, SEQ ID NO :14 5, SEQ ID NO :146, SEQ ID NO :664, SEQ ID NO :665, SEQ ID

NO :666, SEQ ID MO :667, SEQ ID NO :668, SEQ ID NO :669, SEQ ID

NO :670, SEQ ID NO :671, SEQ ID NO :672, SEQ ID NO :673, SEQ ID ιο i»D i NO :674, SEQ ID NO :675, SEQ ID NO :676 e SEQ ID NO :677.

Forma de realização 10. O método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 9, em que o HD1 é a SEQ ID NO :29.

Forma de realização 11. O métodG, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 10, em que o polipéptido manipulado compreende um composto divulgado na Tabela 2.

Forma de realização 12. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 11, em que o polipéptido manipulado compreende uma sequência de

aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:53, SEQ ID NO :54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID MO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :62, SEQ ID NO :63, SEQ ID NO :64, SEQ ID

NO :65, SEQ ID NO :66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO :68, SEQ ID

NO: 69, SEQ ID NO :70, SEQ ID NO :71, SEQ ID NO :72, SEQ ID

NO :73, SEQ ID NO :74, SEQ ID NO :75, SEQ ID NO :76, SEQ ID

NO :77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO :79, SEQ ID NO :80, SEQ ID

NO :81, SEQ ID NO :82, SEQ ID NO :83, SEQ ID NO :84, SEQ ID

NO: 85 SEQ ID NO :86, SEQ ID NO :87, SEQ ID NO :88, SEQ ID NO :89, SEQ ID NO :90, SEQ ID NO :91, SEQ ID NO :92, SEQ ID

NO :93, SEQ ID NO :94, SEQ ID NO :95, SEQ ID NO :96, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO :99, SEQ ID NO :100, SEQ ID NO :101, SEQ ID NO :102, SEQ ID NO :103, SEQ ID NO :104, SEQ ID NO :105, SEQ ID NO :106 e SEQ ID NO :107.

Forma de realização 13, O método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 12, em que o polipéptidG manipulado compreende uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO:54.

Forma de realização 14. O método, de acordo com qualquer urna das formas de realização 1 a 12, em que o polipéptido manipulado compreende uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO:61.

Forma de realização 15, O método, de acordo com ιο i»D i qualquer uma das formas de realização 1 a 14, em que a quantidade eficaz do agente de amilina e a quantidade eficaz do polipéptido manipulado compreendem uma quantidade de modo que uma quantidade maior de perda de peso seja alcançada quando o agente de amilina for administrado em combinação com o polipéptido manipulado ao referido sujeito do que a quantidade de perda de peso alcançada com qualquer agente administrado sozinho.

Forma de realização 16. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 15, em que os dois agentes são administrados ao mesmo tempo.

Forma de realização 17. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 16, em que os dois agentes são misturados em conjunto.

Forma de realização 18. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 17, em que o BMI do sujeito é superior a 25.

Forma de realização 19. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18, em que o BMI do sujeito é de 25 a 35.

Forma de realização 20. 0 métodG, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 19, em que o BMI do sujeito é de 25 a 40.

Forma de realização 21. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o BMI do sujeito ê de 25 a 45.

Forma de realização 22, 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 21, em que o BMI do sujeito é de 35 a 45.

Forma de realização 23. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 22, em que o BMI do sujeito é reduzido a menos do que 30.

Forma de realização 24. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 23, em que o BMI do sujeito é reduzido a menos do que 25. ιο i»D i

Forma de realização 25. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 24, em que o BMI do sujeito é reduzido para o normal.

Forma de realização 26. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 25, em que a perda de peso é alcançada dentro de 4 semanas de tratamento,

Forma de realização 27. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 26, em que a perda de peso é alcançada dentro de 8 semanas de tratamento.

Forma de realização 28. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 27, em que a perda de peso é alcançada dentro de 12 semanas de tratamento,

Forma de realização 29. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 28, em que a perda de peso é alcançada dentro de 20 semanas de tratamento.

Forma de realização 30. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 29, em que a perda de peso é alcançada dentro de 24 semanas de tratamento,

Forma de realização 31. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 30, em que o sujeito é um ser humano.

Forma de realização 32, 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 31, em que o sujeito ê um ser humano obeso.

Forma de realização 33. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 32, em que a perda de peso é reduzida em pelo menos 10%.

Forma de realização 34. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 33, em que a perda de peso é reduzida em pelo menos 12%. ιο i»D i

Forma de realização 35. 0 método, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 34, em que a perda de peso é reduzida em pelo menos 15%. B. Formulações

Os compostos farmacêuticos da invenção podem ser formulados com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis assim como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos em conformidade com técnicas convencionais, tais como aquelas divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Veja-se também Wang et al. (1988) J. of Parenteral Sei. and Tech,,

Technical Report nc 10, Supp. 42:2 S.

Em geral, os polípéptidos manipulados podem ser formulados numa composição farmacêutica segura e estável para administração a um paciente. As formulações farmacêuticas contempladas para utilização médica de acordo com a invenção podem compreender aproximadamente 0,01 a 1,0% íp/v) , em determinados casos 0,05 a 1,0%, do polipéptido manipulado, aproximadamente 0,02 a 0,5% (p/v) de um tampão acetato, fosfato, citrato ou glutamato que permite um pH da composição final de cerca de 3.0 a cerca de 7.0; aproximadamente 1,0 a 10% (p/v) de um tonificante de hidrato de carbono ou álcool poli-hídrico e, opcionalmente, aproximadamente 0,005 a 1,0% (p/v) de um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em m-cresol, álcool benzílico, metil, etil, propil e butil parabenos e fenol. Tal conservante é, de modo geral, incluído se o péptido formulado precisar ser incluído num prGdutG de utilização múltipla.

Em formas de realização particulares, uma formulação farmacêutica dos presentes polípéptidos manipulados pode conter uma faixa de concentrações do composto (ou compostos), pGr exemplo, entre cerca de 0,01% a cerca de 98% em p/p ou entre cerca de 1 a cerca de 98% em p/p ou, de preferência, entre 80% e 90% em p/p ou, de preferência, ιο i»D i entre cerca de 0,01 % a cerca de 50% em p/p ou, mais preferencialmente, entre cerca de 10% a cerca de 25% era p/p nessas formas de realização. Uma quantidade suficiente de água para injeção pode ser utilizada para obter a concentração desejada de SGlução.

Agentes de tonificação adicionais, tal como cloreto de sódio, assim como outros excipientes, podem estar também presentes, se desejado. Em alguns casos, tais excipientes são úteis na manutenção da tonicidade geral do composto. Um excipiente pode estar incluído nas formulações descritas no presente documento em várias concentrações. Por exemplo, um excipiente pode estar incluído na faixa de concentração de cerca de 0,02% a cerca de 20% em p/p, de preferência, entre cerca de 0,02% e 0,5% em p/p, cerca de 0,02% a cerca de 10% em p/v ou cerca de 1% a cerca de 20% e p/p. Adicionalmente, de modo semelhante às próprias presentes formulações, um excipiente pode estar incluído na forma de sólido (incluindo em pô), líquido, semissólido ou gel.

As formulações farmacêuticas podem ser compostas em várias formas, por exemplo, sólida, líquida, semissólida ou líquida. 0 termo "sólido", conforme utílizadG no presente documento, destina-se a abranger todas as utilizações normais desse termo, incluindo, por exemplo, põs e formulações liofilizadas. As formulações descritas no presente documento pGdem ser liofilizadas.

Os termos tampão, solução tampão e solução tamponada, quando utilizados em referência à concentração de iões de hidrogénio ou pH, referem-se à capacidade de um sistema, partícularmente uma solução aquosa, de resistir a uma alteração de pH na adição de ácido ou álcali, ou na diluição com um solvente. A característica de soluções tamponadas, que passam por pequenas alterações de pH em adição de ácido ou base, é a presença de um ácido fraco e um sal do ácido fraco ou uma base fraca e um sal da base fraca. Um exemplo do sistema anterior é ácido acético e ιο i»D i acetato de sódiG, A alteração de pH é ligeira contanto que a quantidade de ião de hidrõnio ou hidroxilo adicionada não exceda a capacidade do sistema de tampão de neutraliza a mesma.

ConfGrme descrito no presente documento, uma variedade de veículos líquidos ê adequada para utilização nas formulações de polipéptidos manipulados, por exemplo, água ou uma mistura ou uma suspensão de solventes aquosos/orgânicos. A estabilidade de uma formulação de polipéptido manipulado para utilização conforme descrito no presente documento é aumentada mantendo···se o pH da formulação numa faixa determinada por métodos conhecidos na técnica. Em determinadas formas de realização, o pH da formulação é mantido na faixa de cerca de .3,5 a 5,0, ou cerca de 3,5 a 6,5, em algumas formas de realização, de cerca de 3,7 a 4,3 ou cerca de 3,8 a 4,2. Em algumas formas de realização, o pH pode ser cerca de 4,0, cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 8,0, cerca de 9,0 ou ainda mais alto. Em algumas formas de realização, o pH pode estar na faixa fisiológica, pH 6 a 8, de preferência, pH 7 a 7,6.

Em determinadas formas de realização, o tampão com o polipéptido manipulado é um tampão acetato {de preferência, a uma concentração final de formulação de cerca de 1 a 5 a cerca de 60 mM) , tampão fosfato (de preferência, a uma concentração final de formulação de cerca de 1 a 5 a cerca de 30 mM) ou tampão glutamato (de preferência, a uma concentração final de formulação de cerca de 1 a 5 a cerca de 6 0 mM) . Em algumas formas de realização, o tampão é acetato (de preferência, a uma concentração final de formulação de cerca de 5 a cerca de 30 mM).

Um estabilizante pode estar incluído nas formulações, mas não é necessariamente exigido. Se incluído, no entanto, um estabilizante útil na prática da presente invenção é um hidrato de carbono ou um álcool poli-hídrico. Um ιο i»D i estabilizante adequado útil na prática da presente invenção é aproximadamente 1,0 a 10% (p/v) de um hidrato de carbono ou álcool poli-hídrico, Os álcoois poli-hídricos e os hídratos de carbono compartilham a mesma característica em suas cadeias principais, isto é, -CHOH-CHOH-, que é responsável por estabilizar as proteínas. Os álcoois poli-hídricos incluem tais compostos como sorbitol, manitol, glicerol e polietileno glicõis (PEGs). Esses compostos são moléculas de cadeia reta. Os hidratos de carbono, tal como manose, ribose, sacarose, frutose, trealose, maltose, inositol e lactose, por outro lado, são moléculas cíclicas que podem conter um grupo ceto ou aldeído. Essas duas classes de compostos demostraram ser eficazes na estabilização de proteína contra a desnaturação causada por temperatura elevada e por processos de congelamento e descongelamento ou secagem por congelamento. Os hidratos de carbono adequados incluem: galactose, arahinose, lactose ou qualquer hidrato de carbono que não tem um efeito adverso num paciente diabético, isto é, o hidrato de carbono não é metabolizado para formar concentrações inaceitavelmente grandes de glicose no sangue. Tais hidratos de carbono sâo bem conhecidos na técnica conforme adequado para diabéticos, A sacarose e a frutose são adequadas para utilização com o composto em aplicações não diabéticas (por exemplo, tratar Gbesidade).

Em determinadas formas de realização, se um estabilizante estiver incluído, o composto é estabilizado com um álcool poli-hídrico tal como sorbitol, manitol, inositol, glicerol, xilitol e copolímero de polipropileno/etilenoglicol, assim como vários polietilenoglicois {PEG} de peso molecular 200, 400, 1.450, 3.350, 4.000, 6.000, 8.000 e mesmo mais alto}. Manitol é o álcool poli-hídrico preferencial em algumas formas de realização. Outra característica útil das formulações liofilizadas da presente invenção é a manutenção da ιο i»D i tonicidade das formulações liofilizadas descritas no presente documento com o mesmo componente de formulação que serve para manter sua estabilidade. Em algumas formas de realização, o manitol é o álcool poli“hídrico preferencial utilizado para esse propósito. A Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) determina que agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas precisam ser adicionados às preparações contidas em recipientes de múltiplas doses. Os mesmos precisam estar presentes em concentração adequada no momento da utilização para impedir a multiplicação de micro-organismos introduzidos inadvertidamente na preparação durante a remoção de uma porção dos conteúdos com uma agulha ou seringa hipodérmica, ou com a utilização de outros meios invasivos para entrega, tal como injetores de caneta. Os agentes antimicrobianos devem ser avaliados para garantir a compatibilidade com todos os outros componentes da fórmula, e sua atividade deve ser avaliada na fórmula total para garantir que um agente particular que é eficaz numa formulação não seja ineficaz em outra. Não é incomum concluir que um agente antimicrobiano particular será eficaz numa formulação, mas não eficaz em outra formulação,

Um conservante é, no sentido farmacêutico comum, uma substância que impede ou inibe o crescimento microbiano e pode ser adicionada às formulações farmacêuticas para esse propósito para evitar deterioração consequente da formulação por micro-organismos. Embora a quantidade do conservante não seja grande, a mesma pode, tGdavia, afetar a estabilidade geral do pêptido.

Embora o conservante para utilização nas composições farmacêuticas possa estar na faixa de 0,005 a 1,0% (p/v), em algumas formas de realização, a faixa para cada conservante, sozinho ou em combinação com outros, é: álcool benzílico (0,1 a 1,0%), ou m-cresol (0,1 a 0,6%), ou fenol ιο i»D i (0,1 a 0,8%) ou combinação de metil (0,05 a 0,25%) e etil ou propil ou butil (0,005% a 0,03%) parabenos. Os parabenos são éster de alquila inferior de ácido para-hidroxibenzoico. Uma descrição detalhada de cada conservante é aprese4ntada em Remington’s Pharmaceutical Sciences(Id.)

Os polipéptidos manipulados podem não ter uma tendência para absorção no vidro e um recipiente de vidro quando numa forma líquida, portanto, um tensoativo pode não ser exibido para estabilizar adicionalmente a formulação farmacêutica. No entanto, em relação aos compostos que têm uma tendência quando na forma líquida, um tensoativo deve ser utilizado em sua formulação. Essas formulações podem ser, então, liofilizadas. Os tensoativos frequentemente causam desnaturação de proteína, tanto de rutura hidrofõbica como por separação de ponte. Concentrações relativamente baixas de tensoativo podem exercer uma atividade de desnaturação potente, devido às interações fortes entre porções químicas de sobrenadante e os sítios reativos nas proteínas. No entanto, a utilização criteriosa dessa interação pode estabilizar as proteínas contra desnaturação interfacial ou superficial. Os tensoativos que poderiam, ainda, estabilizar o polipéptido manipulado podem estar opcionalmente presentes na faixa de cerca de 0,001 a 0,3% (p/v) da formulação total e incluem polissorbato 80 (isto é, mono-oleato de sorbitano e polioxietileno (20)), CHAPS® (isto ê, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamónio]1-propanossulfonato), Bríj® (por exemplo, Brij® 35, que é (lauril éter de polioxietileno (23)), poloxamero ou outro tensoativo não iónico.

Pode ser também desejável adicionar cloreto de sódio ou outro sal para ajustar a tonicidade da formulação farmacêutica, dependendo do tonificante selecionado. No entanto, isso é opcional e depende da formulação particular selecionada. As formulações parenterais podem ser ιο i»D i isotónicas ou substancialmente isotónicas.

Um veículo preferencial para produtos parenterais é água. Água de qualidade adequada para administração parenteral pode ser preparada por destilação ou por osmose reversa. Água para injeção é o veículo aquosG preferencial para utilização nas formulações farmacêuticas. É possível que outros ingredientes possam estar presentes nas formulações farmacêuticas. Tais ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, agentes umectantes, emulsificant.es, óleos, antioxidantes, agentes avolumadores, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, iões metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina séríca humana, gelatina ou proteínas) e um iâo misto (por exemplo, um aminoãcido, tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Adicionalmente, soluções de polímero ou misturas com polímeros fornecem a oportunidade de libertação controlada do pêptido. Tais ingredientes adicionais, obviamente, não devem afetar adversamente a estabilidade geral da formulação farmacêutica da presente invenção.

Os recipientes sâo também uma parte integrante da formulação de uma injeção e podem ser considerados um componente, jã que não há recipiente que seja totalmente inerte, ou que não afete de alguma forma o líquido que o mesmo contém, particularmente se o líquido for aquosG. Portanto, a seleção de um recipiente para uma injeção particular precisa ser baseada numa consideração da composição do recipiente, assim como da solução, e o tratamento ao qual será submetido. A adsorção do pêptido à superfície de vidro do frasco pode ser também minimizada, se necessário, com a utilização de vidro de borossilicato, por exemplo, vidro de borossilicato Wheaton cipo I ií 33 (Wheaton Tipo 1-33) ou seus equivalentes (Wheaton Glass Co.). Outros fornecedores de frascos e cartuchos de vidro de borossilicato semelhantes aceitáveis para fabrico ιο i»D i incluem Kimbel Glass Co., West Co., Bunder Glas GMBH e Form a Vitrum. As propriedades químicas e biológicas dos compostos podem ser estabilizadas por formulação e liofilização num frasco de soro de borossilicato Wheaton Tipo 1-33 a uma concentração final de 0,1 mg/mL e 10 mg/mL do composto na presença de 5% de manitol e 0,02% de Tween 80 .

Para formulações a serem entregues por injeção, a fim de permitir a introdução de uma agulha de uma seringa hipodérmica num frasco e múltiplas doses e para libertar o quanto antes a agulha é removida, a extremidade aberta de cada fasco é, de preferência, vedada com um fecho tamponador de borracha mantido em pGsíção por uma banda de alumínio.

Os tamponadores para frascos de vidro, tal como, West 4416/50, 4416/50 (com face de Teflon) e 4406/40, Abbott 5139 ou qualquer tamponador equivalente podem ser utilizados como o fecho para produto farmacêutico para injeção. Para formulações que compreendem agentes antiobesidade peptídicos, esses tamponadores são compatíveis com o péptídG assim como os outros componentes da formulação. Os inventores também constataram que esses tamponadores passam no teste de integridade de tamponador quando testados com a utilização de padrões de utilização de paciente, por exemplo, o tamponador pode supGrtar pelo menos cerca de 100 injeções. De modo alternativo, o péptido pode ser liofilizado nos frascos, seringas ou cartuchos para reconstituição subsequente. As formulações líquidas da presente invenção podem ser preenchidas em um ou dois cartuchos com câmara ou uma ou duas seringas com câmara.

Cada um dos componentes da formulação farmacêutica descrita acima é conhecido na técnica e é descrito em PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS: PARENTERAL MEDICATIONS, Volume 1, 23 edição, Avis et al. Edição, Mercel Dekker, Nova Iorque, 1992, ιο i»D i 0 processo de fabrico para as formulações líquidas acima, de modo geral, envolve etapas de formação de composto, filtração estéril e preenchimento. 0 procedimento de formação de composto envolve dissolução de ingredientes numa ordem específica (conservante seguido por estabilizante/agentes de tonicidade, tampões e péptido) ou dissolução ao mesmo tempo.

As formulações alternativas, por exemplo, não parenterais, podem não exigir esterilização. No entanto, se a esterilização for desejada ou necessária, qualquer processo de esterilização adequado pode ser utilizado no desenvolvimento da formulação farmacêutica de péptido da presente invenção. Os processos de esterilização típicos incluem filtração, vapor d'água (calor húmido), calor seco, gases (por exemplo, óxido de eti.Leno, formaldeído, dióxido de cloro, óxido de propileno, beta-propiolactona, ozónío, cloropicrina, metil brometo de ácido peracético e semelhantes) , exposição a uma fonte de radiação e manuseio assético, A filtração é o método de esterilização preferencial para formulações líquidas da presente invenção. A filtração estéril envolve a filtração através de 0,4 5 um e 0,22 um (1 ou 2) que podem ser ligados em série. Após a filtração, a solução é preenchida em frascos ou recipientes adequados.

Em determinadas formas de realização, os polipéptidGS manipulados descritos no presente documento são administrados por 'via periférica aos sujeitos. Em algumas formas de realização, as formulações farmacêuticas líquidas da presente invenção são destinadas à administração parenteral. As vias de administração adequadas incluem intramuscular, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intra-articular, intratecal e semelhantes. Em algumas formas de realização, a via de administração subcutânea é preferencial. Em determinadas formas de realização, a entrega mucosal é também preferencial. Estas vias incluem, ιο i»D i porém, sem limitação, as vias oral, nasal, sublingual, pulmonar e bucal que podem incluir a administração do péptido na forma líquida, semissólida ou sólida. Para formulações que compreendem polipéptidos manipulados, a administração pGr meio dessas vias pode exigir substancialmente mais composto para obter os efeitos biológicos desejados devido à biodisponibilidade desejada em comparação com a entrega parenteral. Adicionalmente, a entrega de libertação controlada parenteral pode ser atingida formando-se microcápsulas poliméricas, matrizes, soluções, implantes e dispositivos e administrando-se os mesmos por via parenteral ou por meio cirúrgico. Os exemplos de formulações de libertação controlada sâo descritos nas Patentes n- U.S. 6.368.630, n- U.S. 6.379.704 e n2 U.S. 5,766,627. Estas formas de dosagem podem ter uma biodisponibilidade mais baixa devido à captura de alguns dos pêptidos na matriz ou dispositivo polimérico. Veja-se, por exemplo, as Patente n2 U.S. 6.379.704, n2 U.S. 6.379.703 e n- U.S. 6.296.842.

Os compostos podem ser fornecidos em forma unitária de dosagem que contêm uma quantidade do polipéptído manipulado que será eficaz numa ou múltiplas doses.

Conforme será reconhecido por aqueles no campo, uma quantidade eficaz do polipéptido manipulado variará com muítGS fatores, incluindo a idade e o peso do sujeito, a condição física do sujeito, a afeção a ser tratada e outros fatores conhecidos na técnica. Uma quantidade eficaz dos polipéptidos quiméricos variará também com a combinação particular administrada. Conforme descrito no presente documento, a administração dos polipéptidos manipulados em combinação pode permitir que uma quantidade reduzida de qualquer um dos polipéptidos manipulados administrados seja uma quantidade eficaz. A longa duração de ação do polipéptido manipulado pode fornecer a duração de ação estendida desejada, tal como ιο i»D i administraçâG uma vez pGr dia ou uma vez por semana. A duração de ação pode ser selecionada, por exemplo, por escolha de ABD e sua afinidade com albumina. Embora sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria, acredita-se que uma afinidade mais alta à albumina renderá tempos de circulação mais longos, o que fornece duração de ação mais longa. Tanto a farmacodinâmica (efeitos terapêuticos) quando a farmacocinética (propriedades de fãrmaco) podem ser medidas ao longo do tempo após a entrega, tal como níveis de plasma de fãrmaco, redução de glicose e/ou HbAlc aguda ou crónica, níveis de plasma de insulina, inibição de ingestão de alimento ou perda de peso. C. Dosagens eficazes

As composições farmacêuticas fornecidas no presente documento incluem composições no ingrediente ativo está contido numa quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, numa quantidade eficaz para atingir o propósito ao qual se destina. A quantidade eficaz atual para aplicação particular dependerá, entre outros, da afeção que é tratada. Por exemplo, quando administradas em métodos para tratar diabetes, tais composições conterão uma quantidade de ingrediente ativo para atingir o resultado desejado (por exemplo, diminuir a glicose sanguínea em jejum num sujeito). Quando administradas nos métodos para tratar Gbesidade, tais composições conterão uma quantidade de ingrediente ativo eficaz para atingir o resultado desejado (por exemplo, diminuir a massa corporal), A dosagem e a frequência (doses únicas ou múltiplas) de compGsto administrada podem variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a via de administração; tamanho, idade, sexo, saúde, peso corporal, índice de massa corporal e dieta do recetor; natureza e extensão de sintomas da doença que é tratada (por exemplo, a doença responsive aos compostos descritos no presente documento); presença de outras doenças ou outros problemas relacionados ιο i»D i com a saúde; tipo de tratamento concomitante; e complicações de qualquer doença ou regime de tratamento. Outros regimes ou agentes terapêuticos podem ser utilizados em conjunto com os métodos e compostos da invenção.

As quantidades terapeuticamente eficazes para utilização em seres humanos podem ser determinadas a partir de modelos animais. Por exemplo, uma dose para seres humanos pode ser formulada para atingir uma concentração que se mostrou eficaz em animais. A dosagem em seres humanos pode ser ajustada monitorizando-se um ou mais parâmetros fisiológicos, incluindo, porém, sem limitação, açúcar sanguíneo e massa corporal, e ajustando-se a dosagem para mais ou para menos, conforme descrito acima e conhecido na técnica.

As dosagens podem ser variadas dependendo dos requisitos do paciente e do composto a ser empregado. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para afetar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo. 0 tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeítGS secundários adversos. De modo geral, o tratamento é iniciado com dosagens menores, que são menores que a dose ideal do composto. Depois disso, a dosagem é aumentada por incrementos pequenos até o efeito ideal sob as circunstâncias ser atingido. Numa forma de realização da invenção, a faixa de dosagem é 0,001% a 10% em p/v. Noutra forma de realização, a faixa de dosagem é 0,1% a 5% em p/v.

No entanto, as doses típicas podem conter de um limite inferior de cerca de 0,1 mg a um limite superior de cerca de 200 mg do composto farmacêutico por dia. São também contempladas outras faixas de dose, tal como 1 mg a 100 mg do composto por dose, e 3 mg a 70 mg por dose. Tipicamente, a dose de polipéptidos manipulados com longa duração de ação é administrada, por exemplo, diariamente ou até mesmo ιο i»D i uma vez por semana. As doses por dia podem ser entregues em doses unitárias distintas ou fornecidas continuamente num período de 24 horas ou qualquer porção dessas 24 horas.

As quantidades e intervalos de dosagem podem ser ajustadas individualmente para fornecer os níveis do composto administrado para a indicação clínica particular que é tratada. Isso fornecerá um regime terapêutico que é proporcional à gravidade do estado doentio do sujeito.

Utilizando-se os ensinamentos no presente documento, pode ser planeado um regime de tratamento profilático ou terapêutico que não cause toxicidade substancial e ainda seja inteiramente eficaz para tratar os sintomas clínicos demonstrados pelo paciente particular. Esse planejamento deve envolver a escolha cuidadosa de composto ativo considerando-se fatores tais como potência de composto, biodisponibílidade relativa, peso corporal do paciente, presença e gravidade de efeitos secundários adversos, modo preferencial de administração e o perfil de toxicidade do agente selecionado. A propriedade de economia de dose surpreendente dos polipéptídGS manipulados descritos no presente documento, juntamente com a sua meia-vida de plasma surpreendentemente longa e duração de ação farmacológica, proporciona um agente farmacêutico superior. As propriedades superiores, incluindG a ecGnomia de dose, permitem uma dosagem mais baixa, assim, efeitos secundários menores ou menos graves e custo de produtos aprimorado, e/ou formulações mais económicas ou mais simples para administração uma vez por dia ou uma vez por semana não atualmente alcançada pelos compostos progenitores sozinhos. D„ Toxicidade A razão entre toxicidade e efeito terapêutico para um composto particular é seu índice terapêutico e pode ser expressa como a razão entre LD50 (a quantidade de composto letal em 50% da população) e ED50 (a quantidade de composto ιο i»D i eficaz em 50% da população). Os compostos que exibem altos indices terapêuticos são preferenciais. Os dados de índice terapêutico obtidos a partir de ensaios de cultura celular e/ou estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagens para utilização em seres humanos. A dosagem de tais compostos, de preferência, encontra-se dentro de uma faixa de concentrações plasmáticas que inclui o ED5Q com baixa ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Veja-se, por exemplo, Fingi et al., In: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Capítulo 1, página 1, 1975. A formulação exata, a via de administraçâG e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual em vista da condição do paciente e do método particular em que o composto é utilizado.

Sem o desejo de se vincular a qualquer teoria, acredita-se que a conjugação de um domínio de ligação à albumina ABD com um domínio de hormona conforme descrito no presente documento, pode fornecer diminuição de imunogenicidade conforme julgado por uma redução na resposta imune em relação ao domínio de hormona sem conjugação com ABD. Veja-se, por exemplo, o documento n-° WO 2009/016043. VII. Exemplos

Exemplo 1: Recuperação de polipêptido manipulado

As sequências de proteínas foram projetadas e traduzidas de volta com utilização de software comercial na sequência de ADM para clonagem num vetor de expressão de Ξ. coli, As sequências foram obtidas como oligonucleotides e unidas com a utilização de técnicas de amplificação por PCR padrão ou foram digeridas a partir de construtos de expressâG existentes com a utilização de enzimas de restrição padrão e, então, ligadas novamente. As sequências que expressam a proteína de interesse foram colocadas em ιο i»D i pET45 com um promotor T7 para expressão induzível. Após os construtos terem sido verificados por sequenciação, o ADN do 'vetor foi purificado e transformado num hospedeiro de expressão, tipicamente BL21(DE3). Uma única colónia foi selecionada para cultivar a cultura inicial em 4 mL de meio LB por ~6 horas. Soluções estoque de glicerol foram preparados adicionando--se 100 ul de glicerol a 80% a 900 ul de solução estoque e armazenamento a -80 C. Opcionalmente, 500 ul de amostra não induzida foram retidos para análise em gel. Uma cultura de 60 mL (meio magic) foi inoculada com a utilização de 60 ul de cultura inicial num frasco Thompson de 12 5 mL e incubada a 3 0 C de um dia para o outro. Remover 250 ui de amostra para análise. Reduzir o giro e congelar pélete celular para processamento posterior.

As células bacterianas foram colhidas e subsequentemente lisadas para isolar os corpos de inclusão. Visto que a proteína estava presente nos corpos de inclusão, os mesmos foram solubilizados, e a proteína enovelada novamente a 4 C. As proteínas foram, então, separadas com a utilização de cromatografia de exclusão de tamanho até apenas uma única banda ter permanecido e os níveis de endotoxina serem aceitáveis para teste in vivo. HPLC analítica, RP-LC-MS e SDS-PAGE gel foram executados como medidas de controlo de qualidade na proteína final. A proteína foi distribuída em alíquotas predeterminadas e armazenada a -80 C.

Recuperações típicas de polipéptido manipulado para os métodos descritos no presente documento são fornecidas na Tabela 5 a seguir. Surpreendentemente, as recuperações observadas para os compostos e métodos de produção descritos acima podem ser significativamente mais altas do que as recuperações observadas com espécies conjugadas relatadas anteriormente, por exemplo, Fc-leptina e semelhantes. Além disso, o domínio ABD estranho não afetou ιο i»D i adversamente a expressão, recuperação, redobragem, rendimento ou solubilidade dos polipêptidos manipulados recuperados, particularmente para os conjugados de leptina, apesar das dificuldades geralmente reconhecidas na recuperação e manipulação de leptina.

TaMa RpríiiíUPírairfíeiK rfp niiSíttíkiíííJos maninijlarins

Exemplo 2: Atividade funcional in vitro de leptina Método. Esse ensaio mede a sinalização de recetor após tratamento de células que expressam um recetor de leptina modificado. As amostras de teste foram assumidas a 100% de pureza e ressolvatadas para concentração de ensaio de 10X no tampão de estimulação. Um total de 90 ul de cada composto 10X foi transferido para uma placa pp de poço profundo e diluído em série (séries de 3 vezes) com Tampão de estimulação com a utilização do Perkin Elmer Multiprobe® II e do programa "MSV_Lep_Func_3-Fold_Dil-Deepwell_96.MPT". A placa diluída em série foi composta na placa de estimulação de 96 poços que contém 2,5 x 10A5 péletes de célula de 18 horas de células Keptin desmembradas de leptina, conforme conhecido na técnica, com a utilizaçâG de programa de teste MultiMek "MSV_Lep_Func_200ul_Transfer" que transfere 200 ul de cada um dos compostos diluídos e mistura as células. Nesse momento, a placa foi vedada com uma tampa de placa adesiva e colocada a 37 °C durante 30 minutos para permitir a estimulação de pSTATS. Veja-se, por exemplo, Crouse et al. , 1998, J. Biol. Chem., 273:18.365 a 18.373. Após a incubação, a placa de estimulação foi centrifugada para repeletizar as células, o sobrenadante foi removido e os péletes de célula restantes foram congelados a -80 °C (>30 minutos) . Os lisatos de célula ιο i»D i foram produzidos através da adição de 100 ul de lisato de Ix aos péletes de célula descongelados (kit de ensaio de pSTATB de Perkin Elmer) com rotação em temperatura RT durante 20 minutos. Os lisatos foram clarificados a 2.500 rpm durante 2 0 minutos e examinados no kit de ensaio de pSTATB como 4 ul/poço num Proxiplateia de 3 84 poços de acordo com as instruções do fabricante. 0 sinal de PSTATB (RFU) foi determinado com a utilização de um leitor de placas Packard Fusion α-FP HT ajustado para parâmetros de leitura Alfa. 0 ensaio foi concluído em placas Proxiplate™ de 3 84 poços em 11 mL de volume total com valores que representam a média de n = 4 poços de ensaio por ponto de dose.

Em referência à Tabela 6 a seguir, os Compostos Cl a C6 são leptinas, análogos de leptina e derivados de leptina exemplificativos, conforme descrito no presente documento. Especif icamente o Composto Cl é a SEQ ID 130:20 conforme descrito no presente documento. 0 composto C2 é a SEQ ID NO: 30 (isto é, A2 0Q) . 0 Composto C3 é a SEQ ID NO: 32, à qual uma porção química única de polietilenoglicol (PEG) a 20 kDa foi fixada por meio do resíduo de cisteína na posição 78. Métodos para a conjugação de péptidos e proteínas com PEG conforme conhecido na técnica. 0 Composto C4 é um derivado PEGuilado de SEQ ID NO: 20, na qual um único PEG de 20 kDa foi fixado por meio da terminação N da SEQ ID NO :20. 0 Composto C5 ê um derivado de PEG PEGuilado duplo de SEQ ID NO:32, no qual uma porção química única de PEG de 20 foi fixada por meio do resíduo de cisteína na posiçâG 78 e uma porção química única de PEG de 20 kDa foi fixada por meio da terminação N. 0 Composto C6 é um derivado de PEGuilado no qual um PEG único de 40 kDa foi fixado por meio da terminação N.

Resultados. Conforme apresentado na Tabela 6 a seguir, os polipéptidos manipulados descritos no presente documento (por exemplo, Compostos 1 a 4) têm atividade funcional ιο i»D i comparável e até mesmo superior no ensaio de STATS de Obeca, em comparação a uma variedade de leptinas conjugadas. Tâbeiâ 6. Atividade Funcionai hi Vitro para iepiinas

Exemplo 3: Mudança no peso corporal apôs administração única. Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio era de 319 gramas no começo do estudG. Os animais foram divididos em seis grupos (n=6/grupo). Cada grupo foi designado para receber um de entre os seguintes: veículo; Composto 1 em 2,6 mg/kg em veículo; Composto 2 em 2,7 mg/kg em veículo; Composto 4 em 2,7 mg/kg em veículo; Composto 2 em 10 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo=0. A ingestão de alimento e a mudança no peso corporal (% de veículo corrigídG) foram monitorizadas durante 14 dias, e os ιο i»D i resultados registados conforme mostrado (Figuras IA a 1B) . Compostos administrados: Veículo (caixa); Composto 1 em 2,6 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Composto 2 em 2,7 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Composto 4 em 2,7 mg/kg (diamante); CompGSto C2 em 10 mg/kg (círculo).

Resultados. Conforme retratado nas Figuras IA a 1B, a administração de cada polipéptido manipulado resultou na inge4stão de alimento e no peso corporal reduzidos. Todos os compostos foram fornecidos numa dose equimolar por peso total de composto; todos os compostos foram fornecidos em 120 nmol/kg (isto é, o Composto 1 em 2,6 mg/kg; Composto 2 e Composto 4 em 2,7 mg/kg; Composto C2 em 10 mg/kg) . Deve-se notar que o Composto C2 (isto é, A2 00) é um dímero de duas porções químicas, em que cada porção química consiste na região FC de IgGl fundida à leptina humana. 0 Composto 1 e o Composto 2 têm uma atividade semelhante ao Composto C2 que, visto que ê um dímero, tem, na verdade, duas leptinas por molécula. Embora a eficácia (menor peso corporal) pareça semelhante, está claro que a tendência favorece ambos os polipéptidos manipulados em relação ao Composto C2. Quando observados numa base de leptina por mol, os polipéptidos manipulados são superiores para inibição tanto de ingestão de alimento quanto de peso corporal, 'visto que o Composto C2 tem 2 mols de leptina para cada complexo dimérico de Fc-leptina, enquanto cada mol de porção química de leptina de ABD tem apenas 1 mol de leptina.

Resultados anteriores mostraram que se precisa de aproximadamente 500 ug/kg/dia de um composto Ά500 para atingir 9 a 10% de perda de peso em 7 dias quando fGrnecido por infusão contínua a um rato magro. Isso resulta em 2,5 mg de composto de leptina A500 em 5 dias e 3,5 mg de composto em 7 dias. Visto que um composto A500 por si só tem 16067,68 gm/mol e o peso molecular do CompostG 2 é -22,510 gm/mol, antecipar-se-ia a necessidade de 1,4X mais da proteína de fusão de ABD ao longo dos 5 dias, Em vez ιο i»D i dissG, apenas mais l,08x (2,7 mg/2,5 mg) de composto foi fornecido, o que indica uma propriedade de economia de dose surpreendente.

Exemplo 4: Mudança no Peso Corporal Apôs Administração Única de Composto 2. Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio era de 324 gramas no começo do estudo. Os animais foram divididos em quatro grupos (n=6/grupo). Cada grupo foi designado para receber um de entre os seguintes: veículo; Composto 2 em 0,3 mg/kg em veículo; Composto 2 em 1,0 mg/kg em veículo; Composto 2 em 3,0 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo==0. A ingestão de alimento e a mudança no peso corporal (% de veículo corrigido) foram monitorizadas durante 14 dias, e os resultados registados conforme mostrado (Figuras 2A a 2B) . Compostos administrados: Veículo (caixa); Composto 2 em 0,3 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Composto 2 em 1,0 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Composto 2 em 3,0 mg/kg (diamante).

Resultados. Conforme retratado nas Figuras 2A a 2B, a administração em cada concentração de Composto 2 de polípéptido manipulado resultou na ingestão de alimento e no peso corporal reduzidos. Uma resposta à dose é observada na Figura 2B.

Exemplo 5: Mudança no Peso Corporal Apôs Administração única de Composto C2. Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio era de 324 gramas no começo do estudo. Os animais foram divididos em quatro grupos (n=6/grupo). Cada grupG foi designado a receber um de entre cs seguintes: veículo; Composto C2 em 1,1 mg/kg em veículo; Composto C2 em 3,3 mg/kg em veículo; Composto C2 em 11,1 ιο i»D i mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo==G. A ingestão de alimento e a mudança no peso corporal (% de veículo corrigido) foram monitorizadas durante 14 dias, e os resultados registados conforme mostrado (E'iguras 3A a 3B) . CGinpostos administrados: Veículo (caixa); Composto C2 em 1,1 mg/kg (círculo); Composto C2 em 3,3 mg/kg (caixa); Composto C2 em 11,1 mg/kg (triângulo com a ponta para cima).

Resultados. Conforme retratado nas Figuras 3A a 3B, a administração em cada concentração de Composto C2 de controlo resultou na ingestão de alimento e no peso corporal reduzidos.

Exemplo 6: Mudança no Peso Corporal Apôs Administração Única de Composto C6. Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio era de 324 gramas no começo do estudo. Os animais foram divididos em dois grupos (n=6/grupo). Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; Composto C6 em 2,2 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo=0. A ingestão de alimento e a mudança no peso corporal (% de veículo corrigido) foram monitorizadas e os resultados registados conforme mostrado (Figuras 4A a 4B) ) . Compostos administrados: Veículo (caixa); Composto C6 em 2,2 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo).

Resultados. Conforme retratado nas Figuras 4A a 4B, a administração em cada concentração de Composto C6 de controlo resultou na ingestão de alimento e no peso corporal reduzidos.

Exemplo 7: Mudança no Peso Corporal em Ratos DIOs Método. Ratos Sprague Dawley propensos à obesidade induzida por dieta (DIO) com uma média de aproximadamente 500 gramas foram injetados IP com compostos de teste e de controlo no dia 0 e no dia 7 (n=6 por composto). 0 composto ιο i»D i de teste foi a SEQ ID NO :54 fornecida em 1,3 mg/kg/semana em veículo. 0 peso corporal e a ingestão de alimento foram medidos em múltiplos pontos (dias 0, 4, 7, 12 e 14 d) durante o período de estudo. Compostos administrados: Veículo (caixa); SEQ ID NO:54 em 1,3 mg/kg em veículo (triângulo com a ponta para cima).

Resultados. Os resultados, retratados na Figura 5, demonstram que a injeção IP num intervalo semanal resulta numa perda de peso de 3% após 7 dias, conforme observado anteriormente nessa dose. Mediante uma segunda injeção, os ratos continuaram a perder peso, o que resultou numa perda de peso corporal corrigida por veículo cumulativa de ~7 a 8% em 14 dias. Em contrapartida e surpreendentemente, estudos anteriores com FC-leptina (leptina A200) resultaram em apenas aproximadamente 4% de perda de peso em 14 dias após uma dose de 5 mg/kg/semana com injeções no dia 0 e no dia 7 num modelo DIO semelhante.

Exemplo 8 s Deteção de polipêptidos manipulados em plasma Método. Ratos Sprague Dawley obesos induzidos por dieta (DIO) com uma média de aproximadamente 4 83 gramas foram divididos em cinco grupos, dois dos quais fGram implantados com bombas osmõticas. Um dos dois grupos com bombas osmõticas recebeu urna infusão subcutânea contínua (CSI) de veículo apenas,- o outro recebeu uma CSI de SEQ ID NO:33 (isto é, Ά500) em veículo numa dose de 250 mg/kg/dia. Os outros três grupos foram tratados da seguinte forma: um grupo recebeu injeções subcutâneas semanalmente de veículo apenas nos dias 0, 7, 14 e 21 do estudo; outro grupo recebeu injeções subcutâneas semanalmente de SEQ ID NO:54 (um polipéptido manipulado de ABD-A500) numa dose de 1,3 mg/kg em veículo nos dias 0, 7, 14 e 21 do estudo; e o grupo remanescente recebeu injeções subcutâneas semanalmente de SEQ ID NO: 54 numa dose de 3,0 mg/kg em veículo nos dias 0, 7, 14 e 21 do estudo. Amostras de sangue foram tomadas de cada animal no Dia 27, que foi o ιο i»D i dia que o estudo foi finalizado.

Resultados. Os resultados, retratados na Figura 6, demonstram que as injeções semanais de SEQ ID MO:54 em 1,3 m9/^9 resultou em níveis de plasma que eram levemente inferiores aos alcançados por infusão contínua de SEQ ID NO:33, e injeções semanais de SEQ ID NO: 54 em 3,0 mg/kg resultou em níveis de plasma que eram significativamente maiores do que os alcançados com infusão contínua de SEQ ID NO: 33 (comparar o painel esquerdo com o painel direito; observe a diferença nas escalas do eixo geométrico Y de cada painel),

Exemplo 9: Mudança no Peso Corporal Apôs Administração Única de Polipêptidos Manipulados Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio era de 330 gramas no começo do estudo. Cada animal de teste (n=5/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo=0. Os animais foram divididos em cinco grupos. Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; SEQ ID NO:54 em veículo; SEQ ID NO: 56 em veículo; SEQ ID NO: 58 em veículo; SEQ ID NO: 59 em veículo. SEQ ID NOS: 54, 56, 58 e 59 foram, cada uma, entregues numa dose de 120 nmol/kg. A mudança percentual no peso corporal para cada grupo foi monitorizada durante 14 dias e os resultados registados conforme mostrado (Figura 7) .

Resultados. ConfGrme retratado na Figura 7, cada grupo de animais que receberam uma única injeção de uma das SEQ ID NOS testadas exibiu perda de peso significativa e prolongada ao longo dos 14 dias de duração do estudo em relação ao grupo que recebeu apenas veículo.

Exemplo 10: Mudança no Peso Corporal Apôs Administração Única de Polipêptidos Manipulados Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 ιο i»D i peso corporal médio era de 330 gramas no começo do estudG. Os animais foram divididos em seis grupos (n=5/grupo). Cada arrimai de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo=0. Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; SEQ ID 130:54 em veículo; SEQ ID 130:57 em veículo; SEQ ID NO: 60 em veículo; SEQ ID NO: 61 em veículo; SEQ ID MO: 62 em 'veículo. SEQ ID NOS: 54, 57, 60, 61 e 62 foram, cada uma, entregues numa dose de 120 nmol/kg. A mudança percentual no peso corporal para cada grupo foi monitorizada durante 14 dias e os resultados registados conforme mostrado (Figura 8).

Resultados. Conforme retratado na Figura 8, cada grupo de animais que receberam uma única injeção de uma das SEQ ID NOS testadas exibiu redução significativa e prolongada no peso corporal em relação ao grupo que recebeu apenas veículo.

Exemplo 11: Mudança no Peso Corpora e na Ingestão de Alimento Apôs Administração Única de Polipéptidos Manipulados Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio foi de 317 gramas no começo do estudo. Cada animal de teste (n=7/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo=0. Os animais foram divididos em quatro grupGS. Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO:63 em veículo; SEQ ID MO:64 em veículo. SEQ ID NOS: 54, 63, e 64 foram, cada uma, entregues numa dose de 120 nmol/kg. A ingestão de alimento e a mudança percentual no peso corporal para cada grupo foram monitorizadas durante 14 dias e os resultados registados conforme mostrado (Figuras 9A e 9B, respetivamente).

Resultados. Conforme retratado nas Figuras 9A e 9B, cada grupo de animais que receberam uma única injeção de uma das SEQ ID NOS testadas exibiu redução significativa e ιο i»D i prolongada na ingestão de alimento (Figura 9A) e no peso corporal (Figura 9B) em relação ao de apenas veículo. Exemplo 12; Mudança no Paso Corporal Apôs Administração Única da Polipéptidos Manipulados Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio foi de 3.3 0 g no começo do estudo. Os animais foram divididos em seis grupos. Cada animal de teste (n=5/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo:=0. Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO:67 em veículo; SEQ ID NO: 6 8 em veículo; e SEQ ID NO: 69 em veículo. SEQ ID MOS; 54, 67, 6 8 e 6 9 foram, cada uma, entregues numa dose de 120 nmol/kg. A mudança percentual no peso corporal para cada grupo foi monitorizada durante 10 dias e os resultados registados conforme mostrado (Figura 10) .

Resultados. Conforme retratado na Figura 10, cada grupo de animais que receberam uma única injeção de uma das SEQ ID NOS testadas exibiu redução significativa e prolongada no peso corporal em relação ao grupo que recebeu apenas veículo.

Exemplo 13: Mudança no Peso Corporal Apôs Administração Única de Polipéptidos Manipulados Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos numa dieta de baixo teor de gordura durante o estudo. 0 peso corporal médio foi de 320 gramas no começo do estudo. Os animais foram divididos em seis grupos. Cada animal de teste (n=5/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo=0. Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO:104 em veículo; SEQ ID NO :105 em veículo,- SEQ ID NO :106 em veículo; e SEQ ID NO :107 em veículo. SEQ ID NOS; 54, 104, 105, 106 e 107 foram, cada uma, entregues numa dose de 120 nmol/kg. A mudança no peso corporal para cada grupo foi ιο i»D i monitorizada durante 9 dias e os resultados registadGS conforme mostrado (Figuras 11Ά a 11C).

Resultados, Conforme retratado na Figura 11, cada grupo de animais que receberam uma única injeção de uma das SEQ ID NOS testadas exibiu redução significativa e prolongada na ingestão de alimento (Figura 11Ά) e no peso corporal (Figuras 11B e 11C) em relação ao de apenas veículo.

Exemplo 14: Determinação de afinidade com polipêptidos de ligação à albumina

Nesse exemplo, o Composto 2 e o Composto 15 foram caracterizados para afinidade a variantes diferentes de albumina.

Material e métodos

Todos os estudos foram conduzidos num sistema BioRad ProteOn XPR36 com a utilização de um chip sensor GLC a 25 graus C. Para acoplamento de amina, o chip GLC foi ativado durante 5 minutos com a utilização de uma mistura de 1:1 de sulfo-NHS/EDC diluída 30 vezes a partir do estoque inicial em água conforme mostrado abaixo. Cada amostra de albumina foi diluída para 25 ug/mL em acetato de Na a 10 tnM pH 5,0 e injetada durante 5 minutos sobre superfícies de sensor separadas. Cada superfície foi, então, bloqueada com etanolamina a 1 M pH 8,5. Cad albumina foi acoplada a uma densidade de 2.000 a 5.000 em unidades de ressonância. A ligação de um polipéptido manipulado foi testada com a utilização de 5 nM como a concentração mais alta e, uma série de diluição de três vezes. 0 tampão de execução continha HEPES a 10 tnM pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e tween-20 a 0,005%. Todas as amostras foram testadas com a utilização de uma série de diluição de 3 vezes. Cada série de concentração foi testada em duplicata. A fase de dissociação para a concentração mais alta foi monitorizada durante 3 horas.

Resultados ιο i»D i

As KD relativas medidas para os polipéptídGS manipulados são apresentadas na Tabela 7 abaixo. Os resultados mostram que os polipéptidos de ligação à albumina associam-se às albuminas séricas (SA) com alta afinidade.

Tabela 1. Kd entre poiipéptidos de Hgaçãe ã albumina e variantes de albumina

Exemplo 15: Atividade funcional in vitro de leptina na presença de albumina.

Nesse ensaio, o método descrito no Exemplo 2 foi utilizado, exceto albumina foi adicionada ao tampão de estimulação para testar a função de leptina do Composto 2 na presença de albumina. As albuminas testadas incluíam 0,1% ou 1% de albumina sérica bovina (BSA), 1% de albumina sérica de rato (RSA) ou 1% de albumina sérica humana (HSA). A amostra de controlo foi leptina A100 com 0,1% de BSA.

Resultados. Conforme mostrado na Figura 12, não houve efeitos de 1% de Albumina Bovina/de Rato/Humana na ativ.idade EC50 gerada pelo Composto 2 no Ensaio de Função de Leptina. Os resultados são surpreendentes e mostram que os compostos terapêuticos sâo ativos mesmo quando ligados à albumina.

Exemplo 16: Perfis Farmacocinêticos Prolongados Entregues por Polipéptidos Manipulados Após Injeções Subcutâneas em Ratos

Esse estudo foi conduzido para avaliar o Composto 2 e o Composto 15 em ratos comparando-se sua concentração sanguínea versus perfis de tempo, isto é, perfis farmacocinêticos.

Os ratos foram colocados em grupos de tratamento. 0 Composto 2 foi administrado de modo subcutâneo em 30 ιο i»D i nmol/kg, 60 nmol/kg on 120 nmol/kg. Amostras de sangue foram tomadas na pré, 12, 24, 48, 96 e 144 horas, pós-admini stração a partir da veia de cauda lateral, A concentração do Composto 2 em plasma foi medida por um método de ensaio imunoenzimétrico. 0 Composto 15 foi administrado de modo subcutâneo em 120 nmol/kg. Amostras de sangue foram tomadas na pré, 0,5, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas, pós~ administração a partir da veia de cauda lateral. A concentração do Composto 15 em plasma foi medida por um método de ensaio imunoenzimétrico.

Tanto o Composto 2 (Figura 13) quanto o Composto 15 (Figura 14) exibiram perfis de plasma versus tempo prolongados.

Exemplo 17 s Efeito de Polipêptidos Manipulados Mediados por Recetores de Leptine Método. Ratos Sprague Dawley magros e ratos ZDF foram utilizados para esse estudo. Ratos ZDF têm uma mutação (fa) que resulta num recetor de leptina encurtado que não interage de modo eficaz com a leptina. 0 peso corporal médio era de 22 5 gramas no começo do estudo. Os animais foram divididos em dois grupos (n:== 5/grupo) . Cada grupo foi designado a receber um de entre os seguintes: veículo; Composto 2 em 2,7 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempG=0. A mudança no peso corporal (% veículo corrigido) foi monitorizada e os resultados registados conforme mostrado (Figuras 15A, 15B)) . Compostos administrados: Veículo (círculo preenchido); Composto 2 em 2,7 mg/kg (quadrado preenchido).

Resultados. Conforme retratado nas Figuras 15A e 15B, o Composto 2 não é eficaz em ratos ZDF, o que indica que seus efeitos são mediados por meio de recetores de leptina. Exemplo 18: Economia de Dose com Polipêptidos Manipulados

Esse estudo comparou as doses de A50Q (SEQ ID NO:33) e Composto 2 (SEQ ID NO :54) exigidas para alcançar uma ιο i»D i quantidade semelhante de perda de peso ratos magrGS sensíveis à leptina. Os resultados são mostrados na Figura 16. 0 Composto 2 dosado em 120 nmol/kg/semana alcança -18% de perda de peso corrigida por veículo. Para alcançar a mesma quantidade de perda de peso com A5Q0 exigiu-se uma dose de BID de 120 nmol/kg/dia ou 1.680 nmol/kg (120 por injeção x 2 para BID x 7 dias) ao longo do curso de uma semana. Sem o desejo de vincular-se a qualquer teoria, essa "economia de dose" pode ser pelo menos parcialmente atribuível ao perfil de PK aprimorado do Composto 2 em relação ao A-500,

Exemplo 19: Solubilidade de Polipêptidos Manipulados

ConfGrme apresentado na Tabela 8 a seguir, os polipêptidos manipulados descritos no presente documento têm surpreendentemente alta solubilidade em pH neutro. A solubilidade foi medida com o seguinte ensaio: 6 a 10 mg de proteínas purificadas foram concentrados a 4 °C com unidades de filtro centrífugo (Amicon Ultra-15 ou UItra-4, com corte de 3 KDa MW; Millipore) num volume inferior a 0,5 mL. As mesmas foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para remover precipitados e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. As proteínas foram deixadas para equilibrar durante a noite à temperatura ambiente no escuro, então, foram filtradas com 0,22 microns de filtros de seringa (Mílex GV; Millipore) para remover os precipitados. A absorbância em OD280 foi medida com um espetrofotõmetro NanoDrop e a concentração foi calculada com a utilização do coeficiente de extinção molar teórico da proteína. ιο i»D i

TabeSa £□ SotabsSidade de Polipêptidos Manipulados

Exemplo 20: Estabilidade de Polipêptidos Manipulados

Conforme apresentado na Tabela 9 a seguir, os polipêptidos manipulados descritos no presente documento são estáveis. Os compostos foram formulados em 1 mg/mL em tampões de pH diferente. Conforme mostrado na Tabela 9, os polipéptídGS químérícGS têm boa potência (Tabela 9A) e pureza (Tabela 9B) após duas semanas a 40 °C, conforme determinado por cromatografia líquida de alta performance de fase inversa (HPLC).

Tabeía 9A. Potência de PeÍipépitidDS itãanipuíados

Tabeia 9B, Pureza de Poiipépíides f^arisptdados

Exemplo 21: Estabilidade de Polipêptidos Manipulados

Conforme apresentado na Tabela 10 a seguir, os polipêptidos manipulados descritos no presente documento são estáveis. 0 Composto 15 foi formulado em três ιο i»D i concentrações diferentes no seguinte tampão: ácido glutâmico a lOmM, glicina a 2%, sacarose a 1%, Tween 20 a 0,01%, pH 4,25 e armazenado a 5 °C, 15 °C ou 2 5 °C.

Conforme mostrado na Tabela 10, o Composto 15 é quimicamente estável em 10, 20 e 30 mg/mL durante pelo menos 1 mês a 5 a 25 °C, conforme determinado por HPLC.

Tabeía 10. EstabiMade de

PGiioéstidos Manrautedos

Exemplo 22: Estabilidade de Polipéptidos Manipulados

Conforme apresentado na Tabela 11 a seguir, os polipéptidos manipulados descritos no presente documento são fisicamente estáveis. 0 CompostG 15 foi formulado em três concentrações diferentes no seguinte tampão: ácido glutâmico a lOmM, glicina a 2%, sacarose a 1%, Tween 20 a 0,01%, pH 4,25 e armazenado a 37 °C. Conforme mostrado na Tabela 11, o Composto 15 é fisicamente estável em 10, 20 e 30 mg/mL durante pelo menos 1 mês, conforme determinado por ιο i»D i análise visual. labels 11, tstasHisíSaííe fie

Pailpéiiiiíjos ii/ianpjiacios

Exemplo 23: Estabilidade de Polipêptidos Manipulados

Os polipêptidos manipulados descritos no presente documento são fisicamente estáveis. A Tabela 12 mostra os resultados de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) realizada em A100, ABDl-HuSeal e ABD1-A500. Os polipêptidos manipulados mostram pouca a nenhuma autoassociação ao dímero/oligõmero, em comparação a A100.

Tabela 12. Estabilidade de Polipêptidos Manipulados

Método de SEC:

Coluna - Tosoh TSK Gel G3G00 SWxl 7,8 mm x 30 cm (#08541) Fase Móvel - Fosfato de Na a 10 mM, pH 7,4 + NaCl a 238 mM + KC1 a 2,7 mM Tempo de execução - 22 min.

Taxa de fluxo - 0,8m 1/min.

Temperatura de coluna - 25 °C Temperatura de amostra - 5 °C Carga de amostra - 40 ug ιο i»D i

Deteção 214 nm

Exemplo 24; Sinergia de Amilina e Leptina está Ausente em Sujeitos com BMI Alto

Estudos anteriores descreveram sinergia de amilína/leptína em ratos que pesam de 500 a 550 gramas. Após uma relação inversa de eficácia e BMI ter sido notada, avaliou-se os efeitos da combinação de ratos muito obesos (750 gramas) e em ratos muito obesos que foram submetidos à restrição alimentar até uma faixa de obesidade moderada (500 a 550 g) antes de iniciar o tratamento com o fármaco.

Nesse estudo, foi permitido que um grupo de ratos muito obesos (750 g) se alimentassem ad libitum e foram tratadGS coin amilina, leptina ou a combinação de amilina-i- leptina. Embora a amilina tenha sido eficaz, não houve sinergia evidente com a adição de leptina. Um segundo grupo de ratos muito obesos (750 g) foi submetido à restrição de calorias até a faixa de 500 a 550 g na qual a sinergia foi anteriormente demonstrada. Esses animais, então, começaram o tratamento com amilina/leptina e permitiu·· se que se alimentassem ad libitum. A Figura 17 mostra os resultados do estudo. A retomada de peso rápida foi evidente nos ratos tratados com monoterapia de leptina e veículo. Alguma conservação de peso foi alcançada com monoterapia com amilina. Nenhuma conservação de peso adicional foi alcançada com a combinaçãG. Essas constatações sugerem que a falta de sinergia em roedores com “BMI alto" não pode simplesmente ser resgatada por uma adaptação de dieta.

Exemplo 25: Sinergia de Polipéptidos Manipulados com Agonista de Amilina

Esse estudo examinou se uma administração semanal de amilina de rato PEG (Des-Lysl-[Lys26(mPEG40K)]-Amilina de Rato, Composto 124) seria suficiente para sinergia quando coadministrada com ABD1-A5G0 (Composto 2). Para comparação, ABD1-A500 também foi coadministrado com amilina de rato ιο i»D i infundida {Figura 18A) . A Figura 18B mostra que embora a amilina de rato PEG que induziu a perda de peso seja um pouco mais lenta e de menor magnitude, a quantidade total de perda de peso (e sinergia) é qualitativamente semelhante àquela alcançada pGr amilina de rato infundida, A amilina foi administrada em 50 mg/kg/dia por minibomba osmótica SC, a amilina de rato PEG foi administrada em 125 nmol/kg semanalmente e ABD1-A500 foi administrado em 120 nmol/kg semanalmente a ratos machos Harlan Sprague Dawley (BSD) obesos induzidos por dieta (DIO) de 500 g de peso médio. Exemplo 26: Sinergia de Polipêptidos Manipulados com

Agonista de Amilina

Esse estudo mostra que uma administração semanal de ABDl-HuSeal (Composto 15) é suficiente para sinergia quando coadministrado com amilina de rato infundida. A Figura 19 mostra que a combinação do polipéptído manipulado e da amilina infundida resultou em menor ingestão de alimento (Figura 19A) e mais perda de peso (Figura 19B) do que os resultados observados para cada agente sozinho. ABDl-HuSeal foi administrado em 120 nmol/kg e a amilina foi administrada em 50 mg/kg/dia por minibomba osmótica SC a ratos machos HSD DIO de 500 g de peso médio.

Exemplo 27 s Sinergia de Polipêptidos Manipulados com

Agonrstas de Asnxlxna

Esse estudo mostra que uma administração semanal de ABDl-HuSeal (Composto 15) é suficiente para sinergia quando coadministrado com uma administração de amilina de rato PEG (Des-Lysl-[Lys26(mPEG40K)]-Amilina de Rato, Composto 124) duas vezes por semana. A B’igura 20 mostra que a combinação do polipéptido manipulado e da amilina de rato PEG resultou em mais perda de peso do que os resultados observados para cada agente sozinho. ABDl-HuSeal foi administrado em 120 nmol/kg e PEG-amilina foi administrada em 125 nmol/kg a ratos machos HSD DIO de 500 g de peso médio.

Exemplo 28: Sinergia da Polipêptidos Manipulados com ιο i»D i

Agonistas de Amilina numa População com Alto BMI A Figura 21A mostra os resultados de estudos anteriores, que descrevem a sinergia de amilina/leptina em ratos que pesam de 500 a 550 gramas. A Figura 21B mostra que essa sinergia nâo ê observada numa população de ratos com alto BMI (peso médio de 700 g). A Figura 21C mostra que a administração semanal de ABD1-A500 (Composto 15) é suficiente para sinergia quando coadministrado com uma administração de amilina de rato PEC (Des-Lysl- [Lys26(mPEG40K)]-Amilina de Rato, Composto 124) duas vezes por semana em ratos com alto BMI. ABD1-A5Q0 foi administrado em 120 nmol/kg e PEG-amilina foi administrada em 125 nmol/kg a ratos machos BSD DIO de 700 g de peso médio.

Exemplo 29: Sinergia de Polipêptidos Manipulados com Agonistas de Amilina numa População com Alto BMI

Esse estudo mostra que uma administração semanal de ABDl-HuSeal (Composto 15) ou ABD1-A500 (Composto 2) é suficiente para sinergia quando coadministrado com amilina de rato infundida a ratos com alto BMI. ABDl-HuSeal (Figura 22A) ou ABD1-A500 (Figura 22B) foi administrado em 120 nmol/kg e amilina foi administrada em 50 mg/kg/dia por minibomba osmótica SC a ratos machos BSD DIO de 700 g de peso médio.

Exemplo 30: Efeitos Antidiabêticos de Polipêptidos

Manipulados em Ratinhos Diabéticos do Tipo 1 Não Obesos 0 propósito desse estudo foi avaliar os efeitos in vivo de polipêptidos manipulados nos principais pontos finais metabólicos e diabéticos num modelo de ratinho com alta dose de STZ de diabetes mellitus do Tipo 1 (T1DM). Foi administrado aos ratinhos machos C57 BL/6 uma única injeção single interperitoneal de STZ em 200 mg/kg para induzir diabetes do Tipo 1. Os compostos foram administrados duas vezes por semana subcutaneamente em 120 nmol/kg durante duas semanas. Os pontos finais medidos incluíram níveis de ιο i»D i

HbAlc, níveis de glicose, peso corporal e ingestão de alimento . A Figura 23 mostra que tanto o Composto 15 quanto o Composto 2 normalizaram a glicose no sangue em ratinhos diabéticos induzidos por STZ. Ambos os polipéptidos manipulados também reduziram os níveis de Hemoglobina Alc, conforme mostrado na Figura 24, e reduziram o peso corporal e a ingestão de alimento cumulativa, conforme mostrado na Figura 25. A fim de assegurar que os efeitos de redução de glicose da terapia não ocorreram devido aos efeitos de insulina, outro estudo foi conduzido para combinar a terapia de leptina com uma baixa dose de insulina. 0 Composto 15 foi administrado com ou sem a adição de uma dose de 0,05 U/dia de insulina num modelo de ratinho com alta dose de STZ de T1DM. Foi administrado a ratinhos machos C57 BL/6 uma única injeção interperitoneal de STZ em 175 mg/kg para induzir diabetes do Tipo 1. Os compostos foram administrados duas vezes por semana subcutaneamente em 60 nmol/kg durante duas semanas. Os pontos finais medidos incluíram níveis de HbAlc, níveis de glicose, peso corporal e ingestão de alimento.

Figura 26 mostra um efeito de redução de glicose potencializado com a baixa dose de insulina de urna forma aditiva para o Composto 15. Os níveis de Hemoglobina Alc também reduziram, conforme mostrado na Figura 27, e peso corporal reduzido e ingestão de alimento cumulativa, conforme mostrado na Figura 28. VIII. Formas de realização

As formas de realização adicionais dos polipéptidos manipulados, o método de utilização dos mesmos e as composições farmacêuticas descritas no presente documento seguem:

Forma de realização 1. Um polipêptido manipulado que compreende: um polipêptido de domínio de ligação à ιο i»D i albumina (ABD); e um primeiro domínio de hormona de péptido (HD1) selecionado de entre uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma.

Forma de realização 2. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 1, que compreende, ainda, um primeiro ligante (Ll) covalentemente ligado ao referido EDI.

Forma de realização 3. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 1 ou 2, em que o referido polipéptido manipulado compreende o referido ABD como uma porção química N-terminal e o referido EDI como uma porção química C-terminal.

Forma de realização 4. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 1 ou 2, em que o referido polipéptido manipulado compreende o referido ABD como uma porção química C-terminal e o referido EDI como uma porção química N-terminal.

Forma de realização 5. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 3, que compreende a estrutura: ABD-HD1.

Forma de realização 6. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 3, que compreende a estrutura: ABD-L1-HD1.

Forma de realização 7. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 4, que compreende a estrutura : HD1-ABD.

Forma de realização 8. 0 polipéptido manipulado, de acordo com a Forma de realização 4, que compreende a estrutura: HD1-L1-ABD.

Forma de realização 9. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 8, em que o referido EDI é a referida leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina.

Forma de realização 10. 0 polipéptido manipulado, de ιο i»D i acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 9, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID 110:8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO :12. SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 e SEQ ID NO :14 6.

Forma de realização 11. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 10, em que o referido tem pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID MO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 e SEQ ID NO :14 6.

Forma de realização 12. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 11, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% identidade com uma leptina humana.

Forma de realização 13. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 12, e, que o referido HD1 tem pelo menos 90% de identidade com uma leptina humana. ιο i»D i

Forma de realização 14. 0 polipéptidG manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 13, em que o referido EDI tem pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO:20.

Forma de realização 15. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 14, em que o referido HD1 tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:20.

Forma de realização 16. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 15, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% de identidade com uma leptina de ornitorrinco.

Forma de realização 17. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 16, em que o referido EDI tem pelo menos 50% de identidade com uma leptina de foca.

Forma de realização IS. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 17, em que o referido HD1 tem de 1 a 5 modificações de aminoãcidos selecionas independentemente a partir de qualquer uma ou uma combinação de entre uma inserção, deleção, adição e substituição.

Forma de realização 19. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 18, em que o referido HD1 compreende uma sequência de

aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO: SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID MO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID ιο i»D i NO :14 5 e SEQ ID NO :14 6,

Forma de realização 20. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 19, em que o referido EDI compreende uma sequência de amínoãcidos que é selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID

NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID

NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID

NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID

NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 e SEQ ID NO :14 6.

Forma de realização 21. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:1.

Forma de realização 22 . O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 ê a SEQ ID NO:2.

Forma de realização 23. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:3.

Forma de realização 24. O polipéptidG manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:4.

Forma de realização 25. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:5.

Forma de realização 26. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:6.

Forma de realização 27. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, ιο i»D i em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:7.

Forma de realização 28. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:8.

Forma de realização 29. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:9.

Forma de realização 30. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID MO:10.

Forma de realização 31. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 ê a SEQ ID NO:11.

Forma de realização 32. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:12.

Forma de realização 33. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:13.

Forma de realização 34. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:14.

Forma de realização 35. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:15.

Forma de realização 36. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:16.

Forma de realização 37. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:17.

Forma de realização 38. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:18.

Forma de realização 39. 0 polipêptido manipulado, de ιο i»D i acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID MO :19.

Forma de realização 40. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 ê a SEQ ID NO:20.

Forma de realização 41. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID MO:21.

Forma de realização 42. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID MO:22.

Forma de realização 43. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:23.

Forma de realização 44 . 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:24.

Forma de realização 45. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:25.

Forma de realização 46. Q polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID MO: 26.

Forma de realização 47. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:27.

Forma de realização 48. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 ê a SEQ ID NO:28.

Forma de realização 49. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:29.

Forma de realização 50. 0 polipéptídG manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:30. ιο i»D i

Forma de realização 51. 0 polipéptidG manipuladG, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:31.

Forma de realização 52. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:32.

Forma de realização 53. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:33.

Forma de realização 54. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 53, em que o referido ABD compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) que consiste na sequência de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 I X:L1 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO :34) em que, independentemente uns dos outros, X5 é selecionado de entre Y e F; X8 é selecionado de entre N, R e S; X9 é selecionado de entre V, I, L, M, F e Y;

Xu ê selecionado de entre N, S, E e D;

Xi2 é selecionado de entre R, K e N;

Xi4 é selecionado de entre K e R; X20 é selecionado de entre D, N, Q, E, H, S, R e K; X23 é selecionado de entre K, I e T; X24 é selecionado de entre A, S, T, G, H, L e D; e X25 é selecionado de entre H, E e D.

Forma de realização 55. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 54, em que, independentemente uns dos outros,

Xs e Y) X8 é N; X23 é T OU I; X24 é S ou L; e X25 ê E OU H. ιο i»D i

Forma de realização 56. 0 polipéptidG manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 55, em que o motivo de ligação à albumina compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada a partir do grupo que consiste em: GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO :114) e GVSDYYKMLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO :115). Forma de realização 57. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 56, em que o referido ABD compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) que não é GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID MO :35) .

Forma de realização 58. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 57, em que o referido ABD compreende um ABM divulgado na Tabela 1.

Forma de realização 59. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 58, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY - [ABM] LAALP (SEQ ID NO :36) em que [ABM] é um motivo de ligação à albumina, e, independentemente uns dos outros,

Xa é selecionado de entre V e E;

Xb ê selecionado de entre L, E e D;

Xc ê selecionado de entre N, L e I;

Xd é selecionado de entre R e K;

Xe ê selecionado de entre D e K; a leucina na posição 45 está presente ou ausente; e a prolina na posição 46 está presente ou ausente. Forma de realização 60. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 59, em que, independentemente uns dos outros,

Xa é E; ιο i»D i

Xb é D;

Xc el; 0 Xd é K.

Forma de realização 61. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 60, em que o polípéptido de domínio de ligação à albumina (ABD) compreende uma sequência de aminoãcidos que é selecionada a partir do grupo que consiste em: LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:50); e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO:51).

Forma de realização 62. 0 polípéptido manipulado, de acGrdo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 61, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoãcidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY [ABM] - LAALP (SEQ ID MO:3 6) em que [ABM] é um motivo de ligação à albumina, e, independentemente uns dos outros,

Xa ê selecionado de entre V e E;

Xb é selecionado de entre L, E e D;

Xc e selecionado de entre N, L e I;

Xd é selecionado de entre R e K;

Xe é selecionado de entre D e K; a leucina na posição 45 está presente ou ausente; a prolina na posição 46 está presente ou ausente; e em que ABM consiste na sequência de aminoãcidos: GVSD X5 YK X8 X9 I Xu X12 A Xi4 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO :34) em que, independentemente uns dos outros, X5 é selecionado de entre Y e F; X8 é selecionado de entre N, R e S; X9 ê selecionado de entre V, I, L, M, F e Y;

Xn é selecionado de entre N, S, E e D; ιο i»D i X12 ê selecionado de entre R; K e N; X14 é selecionado de entre K e R; X2o é selecionado de entre D, N, Q, E, H, S, Re K; X23 é selecionado de entre K, I e T; X24 é selecionado de entre A, S, T, G, H, L e D; e X25 ê selecionado de entre H, E e D,

Forma de realização 63. 0 polipéptido manipulado, de

acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 62, em que o referido ABD compreende uma sequência de aminoãcidos que tem pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoãcidos que é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID

NO :39, SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41, SEQ ID NO :42, SEQ ID

NO :43, SEQ ID NO :44, SEQ ID MO: 45, SEQ ID NO :46, SEQ ID

NO :47, SEQ ID NO :48, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO :52.

Forma de realização 64. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 63, em que o referido ABD compreende qualquer um dos péptidos selecionados a partir do grupo que consiste em: LAE AKVLAN RE LD KY GVS D F1 Y KS YINRAKT VE G VHT LIGHILAAL P (SEQ ID NO:3 8) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID NO :39),

LAEAKVLANRE LDKY GV S DYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO:40) LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKN11NRAKTVEGVRALKLHI LAALP (SEQ ID NO :41), LAEAKVLANRE LDKY GVS D FYKNLINRAKTVEGVS S LKGHILAALP (SEQ ID NO:4 2) , LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:43), LAEAKVLANRE LDKY GV S D FYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO:4 4) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKS LINRAKTVEGVDALTSΗILAALP (SEQ ID NO :45), LAEAKVLANRE LDKY GV S D FYKN LINRAKTVECVNS LTSHILAALP (SEQ ID NO:4 6) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID NO :47), ιο i»D i LAEAKVLANRE LDKY CV S DYYKN LINKAKTVEG VQALI AH ILAAL P (SEQ ID NO :4 8) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP {SEQ ID NO :49} , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO :50) , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP {SEQ ID NO:51) e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLIS KAKTVEGVKALIS EILAALP (SEQ ID NO :52) .

Forma de realização 65. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 64, em que o referido ligante LI é um péptido com 1 a 3 0 aminoãcidos ou menos do que 3 0 aminoácidos.

Forma de realização 66. Q polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 65, em que o referido ligante LI é selecionado de entre os 20 aminoãcidos de ocorrência natural.

Forma de realização 67. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 66, em que o referido ligante LI é um aminoãcidos não natural incorporado por síntese química, modificação química pós~ translacional ou por incorporação in vivo por expressão recombinante numa célula hospedeira.

Forma de realização 68. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 67, em que os referidos aminoãcidos de ligante LI são selecionados de entre serina, glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, glutamato, aspartato e lisina. Forma de realização 69. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 68, em que o referido ligante LI compreende uma maioria de aminoãcidos que são estericamente desimpedidos.

Forma de realização 70. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 69, em que o referido ligante LI compreende um ou mais de entre os seguintes: um ligante ácido, um ligante básico e ιο i»D i um motivo estrutural.

Forma de realização 71. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 70, em que o referido lígante LI compreende poliglicina, polialaninas, poli(Gly-Ala) ou poli(Gly-Ser).

Forma de realização 72. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 71, em que o referido ligante LI compreende uma poliglicina de (Gly)3, (Gly)4 ou (Gly)s.

Forma de realização 73. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 72, em que o referido ligante LI compreende (Gly) 3Lys(Gly)4 ; (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 ; (Gly) 3Cys (Gly) 4 ; e GlyProAsnGlyGly.

Forma de realização 74 . 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 73, em que o referido ligante LI compreende uma combinação de Gly e Ala.

Forma de realização 75. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 74, em que o referídG ligante LI compreende uma combinaçâG de Gly e Ser.

Forma de realização 76. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 75, em que o referido ligante LI compreende uma combinação de Gly e Glu.

Forma de realização 77. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 76, em que o referídG ligante LI compreende uma combinaçâG de Gly e Lys.

Forma de realização 78. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 77, em que o referido ligante LI compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: [Gly-Ser] n, [Gly-Gly-Ser]n, [Gly-Gly-Gly-Ser]n e [Gly-Gly-Gly- ιο i»D i

Gly-Ser]n; era que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Forma de realização 79. O polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 78, em que o referido ligante LI compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: [Gly-Glu]n; [Gly-Gly-Glu][Gly-Gly-Gly-Glu]n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n/ [Gly-Asp]n; [Gly-Gly-Asp]n; [Gly-Gly-Gly-Asp]n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp] n em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Forma de realização 80. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 79, em que o referido ligante LI compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: [Gly-Glu]n; [Gly-Gly-Glu][Gly-Gly-Gly-Glu]n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu] n, [Gi.y~“Asp] η: [Gly-Gly-Asp] n; [Gi.y-G.i.y-Gi.y—Asp] n j [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Forma de realização 81. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 80, em que o referido ligante LI compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: [Gly-Lys]n; [Gly-Gly-Lys]n; [Gly-Gly-Gly-Lys]n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n, [Gly- Arg]n; [Gly-Gly-Arg]n; [Gly-Gly-Gly-Arg]n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Forma de realização 82. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 81, em que o referido ligante LI compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Forma de realização 83. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 81, em que o referido ligante LI compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: [Gly-Gly-Glu] 6 [Gly—Gly—Lysj 5, [Giu— Ala— Ala— Ala — Lys] 3, [Glu—Ala — ιο i»D i

Ala-Ala-Lys]4 on [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5 .

Forma de realização 84. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 83, em que o referido ligante LI compreende um dipéptido TG N-terminal.

Forma de realização 85. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 84, em que o referido ligante LI compreende um dipéptido AS C-terminal.

Forma de realização 86. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 85, em que o referido ligante LI compreende um dipéptido TG N-terminal e um dipéptido AS C-terminal.

Forma de realização 87. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 86, em que o referido ligante LI compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada a partir do grupo que consiste em TG-(GGGS)1; TG-(GGGS)2, TG-(GGGS)3, TG-(GGGS)4 , TG -(GGGS)5, (GGGS)i-AS, í GGGS)2 - AS, í GGGS)3-AS, (GGGS) 4 ” AS, (GGGS) s - AS, TG - (GGGS) i AS, TG - (GGGS) 2 - AS, TG (GGGS)3 - AS , TG-(GGGS)4-AS e TG-(GGGS)s-AS.

Forma de realização 88. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 87, em que o referido dipéptido TG e/ou o referido dipéptido AS estão ausentes ou são substituídos por um par de aminoácidos selecionados de entre T, Ά, S e G.

Forma de realização 89. 0 polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 88, em que o referido polipêptido compreende, ainda, um ou mais ligantes adicionais.

Forma de realização 90. 0 polipêptido manipulado, de

acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 89, em que o referido polipêptido manipulado compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID ιο i»D i

NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID

NO :59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :62, SEQ ID

NO :63, SEQ ID NO :64, SEQ ID NO :65, SEQ ID NO :66, SEQ ID

NO :67, SEQ ID NO :68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO :70, SEQ ID

NO :71, SEQ ID NO :72, SEQ ID NO :73, SEQ ID NO :74, SEQ ID

NO :75, SEQ ID NO :76, SEQ ID NO :77, SEQ ID NO :78, SEQ ID

NO :79, SEQ ID NO :80, SEQ ID NO :81, SEQ ID NO :82, SEQ ID

NO :83, SEQ ID NO :84, SEQ ID NO :85, SEQ ID NO :86, SEQ ID

NO :87, SEQ ID NO :88, SEQ ID NO :89, SEQ ID NO :90, SEQ ID

NO :91, SEQ ID NO :92, SEQ ID NO :93, SEQ ID NO :94, SEQ ID

NO :95, SEQ ID NO :96, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO :98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO :100, SEQ ID NO :101, SEQ ID NO :102, SEQ ID NO :103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 e SEQ ID NO :107.

Forma de realização 91. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:53.

Forma de realização 92. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:54.

Forma de realização 93. O polipéptidG manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:55.

Forma de realização 94. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:56. Forma de realização 95. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a ιο i»D i 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:57. Forma de realização 96. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:58.

Forma de realização 97. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:5 9.

Forma de realização 98. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:6 Q.

Forma de realização 99. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:61.

Forma de realização 100. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:62.

Forma de realização 101. 0 polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:63.

Forma de realização 102. Q polípéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polípéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:64.

Forma de realização 103. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:6 5.

Forma de realização 104. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:6 6.

Forma de realização 105. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:6 7.

Forma de realização 106. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:6 8.

Forma de realização 107. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:6 9.

Forma de realização 108. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:70.

Forma de realização 109. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:71.

Forma de realização 110. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:72.

Forma de realização 111. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:73.

Forma de realização 112. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:74.

Forma de realização 113. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:75.

Forma de realização 114. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:76.

Forma de realização 115. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:77.

Forma de realização 116. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:78.

Forma de realização 117. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:7 9.

Forma de realização 118. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:80.

Forma de realização 119. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO :81.

Forma de realização 120. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:82.

Forma de realização 121. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:83.

Forma de realização 122. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:84.

Forma de realização 123. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:85.

Forma de realização 124. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:86.

Forma de realização 125. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:87.

Forma de realização 126. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:88.

Forma de realização 127. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:8 9.

Forma de realização 128. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:90.

Forma de realização 129. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:91.

Forma de realização 130. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:92.

Forma de realização 1.31. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:93.

Forma de realização 132. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:94.

Forma de realização 133. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:95.

Forma de realização 134. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:96.

Forma de realização 135. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:97.

Forma de realização 136. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:98.

Forma de realização 137. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:9 9.

Forma de realização 1.38. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:100.

Forma de realização 139. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:102.

Forma de realização 140. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:1Q2.

Forma de realização 141. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:103.

Forma de realização 142. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referídG polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:104.

Forma de realização 143. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realizaçâG 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:105.

Forma de realização 144. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a ιο i»D i sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:106.

Forma de realização 145. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 90, em que o referido polipéptido manipulado compreende a sequência de aminoãcidos selecionada definida na SEQ ID NO:107.

Forma de realização 146. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 145, que tem afinidade com albumina sérica com uma constante de dissociação inferior a cerca de 10 a 6 mol/L.

Forma de realização 147. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 146, que tem afinidade com albumina sérica com uma constante de dissociação inferior a cerca de 10 a 9 mol/L.

Forma de realização 148. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 147, que tem afinidade com albumina sérica com uma constante de dissociação inferior a cerca de 10 a 12 mol/L.

Forma de realização 149. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 148, em que o polipéptido tem uma duração de ação de pelo menos 1 dia.

Forma de realização 150. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 149, em que o polipéptido tem uma duração de ação de pelo menos 3 dias.

Forma de realização 151. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 150, em que o polipéptido tem uma duração de ação de pelo menos 5 dias.

Forma de realização 152. 0 polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 151, em que o polipéptido tem uma duração de ação de pelo menos 5 dias num sujeito humano. ιο i»D i

Forma de realização 153. Um método para trata uma doença ou distúrbio num sujeito, que compreende administrar um polipéptido manipulado de acordo com qualquer urna das realização 1 a 152 e 170 a 192 a um sujeito que precisa do mesmo numa quantidade eficaz para tratar a referida doença ou distúrbio.

Forma de realização 154. 0 método, de acordo com a Forma de realização 153, em que a referida doença ou distúrbio pode ser lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, excesso de peso, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes (incluindo tipo I e tipo II) , esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e síndrome metabólica X.

Forma de realização 155. 0 método, de acordo com a Forma de realização 153 ou a Forma de realização 154, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, excesso de peso, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa ou diabetes Forma de realização 156. 0 método, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 153 a 155, em que a referida doença ou distúrbio é diabetes tipo I ou diabetes tipo II,

Forma de realização 157. 0 método, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 153 a 155, em que a referida doença ou distúrbio é obesidade.

Forma de realização 158. 0 métodG, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 153 a 155, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia ou deficiência em leptina.

Forma de realização 159. Uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido manipulado de acordo com qualquer uma das Formas de realização 1 a 152 e um ιο i»D i excipiente farmaceuticamente aceitável,

Forma de realização 160. A composição farmacêutica, de acordo com a Forma de realização 159, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica inj etável.

Forma de realização 161. A composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 159 a 160, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica de libertação prolongada ou de longa duração.

Forma de realização 162. A composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 159 a 161, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica diária.

Forma de realização 163 . A composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 159 a 161, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica semanal.

Forma de realização 164. Uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 159 a 163, para tratar uma doença ou distúrbio num sujeito. Forma de realização 165. A composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 159 a 164 em que a doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, excesso de peso, Gbesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes (incluindo tipo I e tipo II), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e síndrome metabólica X.

Forma de realização 166. A composição farmacêutica, da Forma de realização 164 ou da Forma de realização 165, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, excesso de peso, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência ιο i»D i em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes.

Forma de realização 167. 0 método, de acordo com qualquer uma das Fornias de realização 164 a 166, em que a referida doença ou distúrbio é diabetes tipo I ou diabetes tipo II.

Forma de realização 168. 0 método, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 164 a 166, em que a referida doença ou distúrbio é obesidade.

Forma de realização 169. 0 método, de acordo com qualquer uma das Formas de realização 164 a 166, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrof ia. ou deficiência em leptina.

Forma de realização 170. 0 polipêptido manipulado de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18, em que o referido HD1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) a sequência de aminoãcidos 1 a 146 de uma leptina

selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID

NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID

NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO:20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID IMO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

MO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID MO:28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que um aminoãcído diferente é substituído numa ou mais das seguintes posições e retêm a mesma numeração (mesmo na ausência de um resíduo de glutaminilo na posição 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145; (b) a sequência de aminoãcidos da subparte (a) na qual o resíduo de glutaminilo na posição 28 está ausente; ιο i»D i (c) a sequência de aminoãcidGS das subpartes (a) cu (b) na qual um resíduo de metionilo é adicionado na terminação N; (d) uma leptina que consiste num fragmento da sequência de aminoãcidos de (a) , (b) ou (c) selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) ami noác i do s 98 a 14 6 ; (i i) aminoãcidos 1 a 32; (iií) aminoãcidos 40 a 116; (iv) aminoãcidos 1 a 99 e 112 a 146; (v) aminoãcidos 1 a 99 e 112 a 146 nos quais um ou mais dos aminoãcidos 100 a 111 são colocados entre os aminoãcidos 99 e 112; (vi) a sequência de aminoãcidos da subparte (i) em que um ou mais dos aminoãcidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoãcido; (vii) a sequência de aminoãcidos da subparte (ii) em que um ou mais dos aminoãcidos 4, 8 e 32 são substituídos por outro aminoãcido; íviii) a sequência de aminoãcidos da subparte (iií) em que um ou mais dos aminoãcidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 e 112 são substituídos por outro aminoácidG; (ix) a sequência de aminoãcidos da subparte (iv) em que um ou mais dos aminoãcidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoãcido; e (x.) a sequência de aminoãcidos da subparte (v) em que um ou mais dos aminoãcidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido; ιο i»D i (xi) a sequência de aminoãcidGS de qualquer uma das subpartes (i) a (x) em que a metionina foi adicionada na terminação N; (e) a sequência de aminoãcidos de qualquer uma das subpartes (a) a (d) em que a referida sequência de aminoácidos ê fixada a uma porção química; (f) a sequência de aminoácidos da subparte (e) em que a referida porção química é uma porção química de polímero solúvel em água; (g) a sequência de aminoácidos da subparte (f) em que a referida porção química de polímero solúvel em água é selecionada a partir do grupo que consiste em: pGlíetilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol/propilenoglicol, uma carboximeti lcelulose, um dextra.no, um álcool polivinílico, uma polivinil pirrolidona, um poli-1,3-díoxolano, um poli-1,3,β-trioxano, um copolímero de etileno/anidrido maleico, um homopolímero poliaminoácido, um copolímero aleatório poliaminoácido, uma albumina, uma proteína Fc, um poli(n-vinilpirrolidona)polietilenoglicol, um homopolímero de propilenoglicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, um poliol polioxietilado, um álcool polivinílico, um propinoaldeído de polietilenoglicol, um sucinato e um estireno; (h) a sequência de aminoácidos da subparte (g) em que a referida porção química de polímero solúvel em água é um polietilenoglicol; e (i) a sequência de aminoãcidos da subparte (g) em que o referido polímero solúvel em água é um poliaminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: uma albumina, um anticorpo, uma proteína Fc e uma porção química de polilisina.

Forma de realização 171. 0 polipéptido manipulado, de ιο i»D i acordo cora qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 170, em que o referido HD1 compreende uma sequência de

aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que uma ou mais substituições de aminoácido foram feitas.

Forma de realização 172. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de

aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que uma substituição de aminoácido foi feita.

Forma de realização 173. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ιο i»D i

ID NO:9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que duas substituições de aminoãcído foram feitas ,

Forma de realização 174. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir dG grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que três substituições de aminoãcído foram feitas.

Forma de realização 175. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID MO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID ιο i»D i NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que quatro substituições de aminoãcido foram feitas.

Forma de realização 176. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID IMO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID MO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que cinco substituições de aminoãcido foram feitas.

Forma de realização 177. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende um sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID MO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que seis substituições de aminoãcido foram feitas.

Forma de realização 178. O polipéptido manipulado, de ιο i»D i

acordo cora qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que sete substituições de aminoácido foram feitas .

Forma de realização 179. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que oito substituições de aminoácido foram feitas .

Forma de realização 180. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ιο i»D i

ID NO:9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO:146; em que nove substituições de aminoãcído foram feitas ,

Forma de realização 181. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir dG grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que dez substituições de aminoãcído foram feitas.

Forma de realização 182. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID MO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID MO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID ιο i»D i NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que 11 substituições de arninoâcido foram feitas .

Forma de realização 183. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que 12 substituições de arninoâcido foram f eitas .

Forma de realização 184. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID

NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 146; em que 13 substituições de arninoâcido foram feitas .

Forma de realização 185. O polipéptido manipulado, de ιο i»D i

acordo cora qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que 14 substituições de aminoácido foram feitas .

Forma de realização 186. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 146; em que 15 substituições de aminoácido foram feitas .

Forma de realização 187. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ιο i»D i

ID NO:9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 146; em que 16 substituições de aminoãcido foram feitas,

Forma de realização 188. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir dG grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 146; em que 17 substituições de aminoãcido foram feitas.

Forma de realização 189. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID MO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID MO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID ιο i»D i NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que IS substituições de arninoâcido foram feitas .

Forma de realização 190. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido EDI compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que 19 substituições de arninoâcido foram f eitas .

Forma de realização 191. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 146; em que 20 substituições de arninoâcido foram feitas .

Forma de realização 192. O polipéptido manipulado, de ιο i»D i

acordo cora qualquer uma das formas de realização 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID

NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID

NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID

NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID

NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO: 14 6; em que 21 substituições de aminoácido foram feitas .

Forma de realização 193. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:143.

Forma de realização 194. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO :144.

Forma de realização 195. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO :14 5.

Forma de realização 196. O polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:146. IX. Listagem de Sequência Informal

Uma listagem de sequência informal divulgada no presente documento segue: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGG VLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, em que Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO:l); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-

SVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLL ιο i»D i

HVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC , em que Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO :2) ; VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLA IYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASL YS TEWALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO : 3 ) ; MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSK.QRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTL AIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEAS LYSTEWALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO : 4 ) ; VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-

SVS S KQRVTGLDFIPGLHPLLS LSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNWQISNDLENLRDLL HLLAASKSCPLPQVRALESLESLGWLEASLYSTEWALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC , em que Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO :5) ; MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISET-Xaa-

SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNWQISNDLENLRDLL HLLAASKSCPLPQVRALESLESLGWLEASLYSTEWALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC , em que Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO :6) ;

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTG LDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO :7) ; VP I QKVQDDTKTL I KTIVTRIND ISH Xaa Xaa SVSSKQKVTCLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLL HVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC , em que: Xaa na posição 27 é T ou A; e Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO:8); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-

SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLL HVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC , em que: Xaa na posição 28 é T ou A, e Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO:9);

VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLA

IYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSK.SCHLPLASGLETLESLGDVLEASL ιο i»D i YSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC {SEQ ID NO:10); MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTL AIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEAS LYSTEVYALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:ll); VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLA VYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASL YSTEVYALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ IDNO:12); MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTL AVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEAS LYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:13); ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLA VYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESL YSTEWTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO: 14);

MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSG

LDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCP FTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEWTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO:15); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLA VYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG YSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:16); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLA VYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG YSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:17); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISETSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY STEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:18); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAV YQQILTSMPSRNYIQISNDLENLRDLLHYLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY STEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:19); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDS LGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID N0:20); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPWASGLETLDS LGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:21); ιο i»D i MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLA VYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG YSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:22);

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISEASVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLA VYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG YSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:23); PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILAT YQQILTSLQSRSWQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVH STEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 24); PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILAT YQQILTS LQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVH STEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:25); PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILAT YQQILTS LQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVH STEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:26);

MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILA

TYQQILTSLQSRSWQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASV HSTEYVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:27); MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILA TYQQILTS LQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CPYPRARGSDTIKGLGNVLRASY HSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 28);

MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILA TYQQILTS LQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CPYPRARGSDTIKGLGNVLRASY HSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:29); MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKS LS LS PGKVPIQKVQD DTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTS MPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEWAL SRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 30); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO :31) ;

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL ιο i»D i

AVYQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:32); à qual uma porção química de PEG de 20 quilodaltons (kDa) foi fixada por meio do resíduo de cisteína na posição 78,-

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILTLS KMDQTL

AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:33); GVSD X5 YK X8 X9 I Xn X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO :34), em que X5, X8, X9, Xn, Xi2, Xi4, X2o, X23, X24 e X25 são conforme descrito no presente documento; GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO:35); LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY- [ABM] -LAALP (SEQ ID NO :36), em que ABM, Xa, Xb, Xc, Xd e Xe são conforme descrito no presente documento;

LAEAKVLANR E LDKYGVS DYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP (SEQ ID NO:3 7) ;

LAEAKVLANRE LDKYGVS D FYKSYINRAKTVEGVHTLIGHI LAALP (SEQ ID NO:3 8) ;

LAEAKVLANRE LDKYGVS DFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID IMG : 3 9) ;

LAEAKVLANRE LDKYGVS DYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO:4 0) ;

LAEAKVLANR E LDKYGVS DYYKN11NRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:41);

LAEAKVLANRE LDKYGVS D FYKNLINRAKTVEGVS S LKGHILAALP (SEQ ID NO :42) ;

LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID IMO :43) ;

LAEAKVLANRE LDKYGVS D FYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO :44) ;

LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKS LINRAKTVEGVDALTSΗILAALP (SEQ ID NO:4 5) ;

LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO:4 6) ;

LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID ιο i»D i NO :47) ;

LAEAKVLANRE LDKYGVS DYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO :4 8) ;

LAEAKVLANRE LDKY GVS D FYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO :4 9) ;

IAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:50);

LAEAKEDAI KE LDKY GV S D Y YKNL INKAKTVEGVEAL i S e I LAAL P (SEQ ID NO:51);

LAEAKE DAIKELDKYGVSDYYKRLIS KAKTVEGVKALIS EILAALP (SEQ ID NO:52); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGASVPIQK VQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO :5.3) ; MLAEAKVLANRE LDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRIMDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:54); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVIAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYK RLINKAKTVEGVEALKLHIIAALP (SEQ ID NO:55);

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTL

AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVLANR E LDKY GV S D FYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO :56) ; MLAEAKVLANRE LDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNL ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIW GGIVEESLYSTEWTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC (SEQ ID NO :57) ;

MLAEAKVLANRE LDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG

GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:58); ιο i»D i MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KSCHLPWASGLETLDSLGGVLEAS GYSTEYVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVLANR ELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:59); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS GMDQILATYQQILTS LQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CPVPRARGSDTIKGLG NVLRASVHSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:60); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS GMDQILATYQQILTS LQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CPVPRARGSDTIKGLG NVLRASVHSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:61); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGPIQRVQDDTK TLIKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSR NVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEWALSRLK AALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:62); MLAEAKVLANRE LDKYGVS DYYKN11NRAKTVEGVRALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPWASGLETLDS L GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:63); MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLESL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:64); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLDS L GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:65); MLAEAKVLANRE LDKY GVS D F YKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGLAEAAAKEAA AKEAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSS KQKVT GLE FIPGLHPILTLS KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS C HLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO :6 6) ;

MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGEGGEGGEGG EGGEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILT ιο i»D i LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES LGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:67); MLAEAKVLANRE LDK.YGVS DFYKR LINKAKTVEGVEALKLHILAAL PTGGKGGKGGKGG KGGKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLEFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES LGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:68); MLAEAKVLANRE LDKYGVS DFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLEFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESL GEVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:69); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGASVPIQK VQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 70);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLEFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 71); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLEFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKS CHLPQASGLETLESLGGVLEAG YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGCGSASLAEAKEDAIKELDKYCVSDYYKN LINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO :72) ; MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLEFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEAS GYSTEVYALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIK ELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO :73) ; MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGYSTDQRYSGLDFIPGNQQFQNL ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIW GGIVEESLYSTEWTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC (SEQ ID NO:74); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:75);

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL ιο i»D i

AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEAS

GYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIK ELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:76);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG

GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS

GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLG NVLRASVHSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:77);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLI1MKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG

GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS

GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLG NVLRASVHSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:78);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGPIQRVQDDTK

TLIKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSR

NVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEWALSRLK AALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:79);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLI1MKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG

GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL

SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID N0:80);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG

GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL

SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID N0:81);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLI1MKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG

GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL

SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:82);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGLAEAAAKEAA

AKEAAAKEAAAKEAAAKAAAAS VP IQKVQDDTKTLIKTIVTRIMDISHTQS VS S KQK'VT

GLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSC

HLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:83);

MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGEGGEGGEGG

EGGEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT

LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES ιο i»D i LGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:84); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGKGGKGGKGG KGGKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:85); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESL GEVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:86); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGASVPIQK VQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:87); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALi s e1LAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLE FIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:88); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKEDAIKELDKYGVSDY YKNLINKAKTVEGVEALise1LAALP (SEQ ID NO:89); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKED AIKELDKY GV SDYYKNLINKAKTVEGVEALise1LAALP (SEQ ID NO:90); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALIS EILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNL ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIW GGIVEESLYSTEWTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC (SEQ ID NO:91); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL ise1LAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO :92) ;

MYPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKS CHLPWASGLETLDSLGGVLEAS ιο i»D i GYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIK ELDKY GV SDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALP (SEQ ID NO :93) ; MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALi s eILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS GMDQILAT YQQILTS LQSRMVIQISNDLENLRDLLH VLAFS KS CPVPRARGSDTIKGLC-NVLRASVHSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:94); MLAEAK.EDAI KE LDKYGVS DY YKNL I NKAKTVEGVEAL i s e 1 LAAL PTGGGGS GGGS GG GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISMDLEMLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLG NVLRASVHSTEWALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:95); MLAEAKEDAIK.ELDK.YGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL.ise ILAALPTGPIQRVQDDTK. TLIKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSR NVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEWALSRLK AALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:96); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL i s e1LAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:97); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL i seILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVTQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:98); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL i s e1LAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSL GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:99); MLAEAKEDA I KE LDK.Y GVS DY YKNL I NKAKTVEGVEAL i s e I LAAL PTGLAEAAAKE AA ABCEAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKV TGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKS CHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:100); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGEGGEGGEGG EGGEGGEASYPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES LGGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO :101); ιο i»D i MLAEAKEDAIBCELDKYGYSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGKGGKGGKG GKGGKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSYSS KQKVTGLEFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKS CHLPQASGLETLE SLGGYLEASGYSTEVYALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:102); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL SKMDQTLAYYQQILTSMPSRNYIQISNDLENLRDLLHYLAFSKSCSLPQASGLETLESL GEVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:103); MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSYSSKQKYTGLEFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLES L GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO :104); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRIMDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLES L GGYLEASGYSTEVYALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:105); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLES L GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 106); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRIMDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL S KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLES L GGVLEASGYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:107); KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:108); KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO:109); KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:110). CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO:111); CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO:112); KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID 110:113) , GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO:114); GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO:115); GGGG (SEQ ID NO:116); GGGGG (SEQ ID NO :117) ; GGGKGGGG (SEQ ID NO :118) ; ιο i»D i GGGNGSGG {SEQ ID NO:119); GGGCGGGG (SEQ ID NO:120); GPNGG (SEQ ID NO:121); [GS]n (SEQ ID NO :122), em que n é de 2 a 10; [GGS]n (SEQ ID NO :123), em que n é de 2 a 10; [GGGS]ri (SEQ ID NO:124), em que n é de 1 a 10; [GGGGSln (SEQ ID NO :125), em que n é de 1 a 10; [GE] n (SEQ ID NO :126), em que n é de 2 a 10; [GGE]n (SEQ ID NO:127), em que n é de 2 a 10; [GGGE]n (SEQ ID NO :12 8) , em que n e cie 1 a 10; [GGGGEj (SEQ .lD NO: .12^) , em que n e d.e .1 a i0; [GD] n (SEQ ID NO :130), em que n é de 2 a 10; [GGD]n (SEQ ID NO:131), em que n é de 2 a 10; [GGGD]π (SEQ ID NO :132), em que n é de 1 a 10; [GGGGD]n (SEQ ID NO :133), em que n é de 1 a 10; [GK] n (SEQ ID NO :134), em que n é de 2 a 10; [GGK]n (SEQ ID NO:13 5), em que n é de 2 a 10; [GGGK]n (SEQ ID NO:136), em que n é de 1 a 10; [GGGGKj π (SEQ .lD NO: .131) , em que n e de .1 a .10 ; [GR] n (SEQ ID NO :138), em que n é de 2 a 10; [GGR]n (SEQ ID NO :139), em que n é de 2 a 10; [GGGR]π (SEQ ID NO :140), em que n é de 1 a 10; [GGGGRJn (SEQ ID NO :141), em que n é de 1 a 10; [GAAAK]n (SEQ ID NO :142), em que n é de 1 a 10; VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLA VYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASL YSTEWALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO:143); VP IQKVQDDTKTLIKTIVTRINDI SPITS'VSAKQRVTGLDFIPGLHPILS LS KMDQTLAV YQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLY STEWALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO:144);

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQS'VSAKQRVTGLDFIPGLHPILS LS KMDQTL AVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEAS LYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO:145); e MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLA VYQQYLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASL ιο i»D i YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC {SEQ ID MO :146) , MLAEAKVLANRE LDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGG GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSS KQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSL GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID MO:147). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CS LPQASGLETLES LGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 664) . MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 665) . MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRMVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 666). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:667). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CS LPQASGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO :668). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEAS GYSTEYVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO:669). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 670) . MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CS LPQASGLETLESLGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC (SEQ ID NO: 671) . MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLDS LGGVLEAS GYSTEW/ALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:672). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 673) . ιο i»D i MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 674) „ MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC (SEQ ID NO :675). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NQ:676). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVS S KQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS KS CHLPQASGLETLDSLGEVLEAS GYSTEWALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC (SEQ ID NO :677) . X ' -Xaa1 -Cys2-AsnJ -Thr4 - Ala3-Thr6 -Cys7- Ala8-Thr9-GlrV0-Argil-Leu1,i-Ala1:i-Asn14-Phe15-Leu16-Val1 '-Hisli!-Ser19-Ser2L-Xaa21-Asn2‘‘':-Ρπθ -Xaa 4-Xaa' -Xaa' -Xaa' ~Xa.aJ ~Xa.aJ -Thr^ ~Xa.a^ -Va.X^~~GXy^ -Ser34~Asn35 Thr36Tyr37-X (SEQ ID NO: 800) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :801) KCNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :802) CNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :803) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :804) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :805) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NI-L (SEQ ID NO :806) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :807) KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :808) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :809) CNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :810) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :811) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :812) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFKPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :813) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :814) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPIKPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :815) CNT AT CAT Q R LAN F L VH S SNNFGPILKPTNVGSNT Y NH2 (SEQ ID NO : 816 ) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO :817)

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ιο i»D i <110> AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC.

<12 0 > POLIPÉPTIDO DE FUSÃO DE LEPTINA-ABD COM DURAÇÃO DE AÇÃO MELHORADA <130> 1317W02 <14 0 > PCT/US2 011/0 5 3 7 8 6 <141> 28-09-2011 <150> 61/387.402 <151> 28-09-2010 <150> 61/422.091 <151> 10-12-2010 <16 0 > 817 <170> PatentIn versão 3.5 <210> 1 < 211> 146 < 212 > PRT <213> Mus sp. < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (28) . . (28) <223> Pode ou não estar presente < 4 0 0 > 1 ιο i»D i

Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Asm Asp Π® $®r His Thr Gin $®r val S®r $®r 20 25 30

Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe 11® Pro Gly Leu His Pro 11® 35 40 45

Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95

His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Gly 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys 145 < 210 > 2 < 211> 147

< 212 > PRT < 213 > Mus sp. <220> <221> MOD RES <222> (29) . . (29) <223> Pode ou não estar presente ιο i»D i < 4 0 0 > 2

Met Val Pro II® Gin Lys val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu XI® Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie hsn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hi® Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cy® His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Glv Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin leu Asp leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 < 210 > 3 < 211> 146 <212> PRT <213> Sus sp. < 4 0 0 > 3 ιο i»D i

Val Pro lie Trp Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Ser Asp lie Ser His Met Gin Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro Val 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala lie Tyr Gin Gin lie 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp Leu 65 70 75 30

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Ser Ser Lys Ser Cys 85 90 95

Pro Leu Pro Gin Ala Arg Ala Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Gly too 105 no

Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys 145 < 210 > 4 < 211> 147

< 212 > PRT < 213 > Sus sp. < 4 0 0 > 4 crzoz is i

Met Val Pro II® Trp Arg val Gin Asp Asp Thr Lys Thr leu Π® lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Ser Asp He Ser His Met Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leo His Pro 35 40 45

Val leu Ser leu Ser lys Met Asp Gin Thr Leu Ala He Tyr Gin Gin 50 55 60

He leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hi® Leu Leu Ala Ser Ser Ly® Ser 85 90 95

Cys Pro leu Pro Gin Ala Arg Ala Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val leu Gl\i Ala Ser leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin leu Asp leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 < 210 > 5 < 211> 146 < 212 > PRT <213> Bos sp. <220>

<221> M0D_RES <222> (28) , . (28) <223> Pode ou não estar presente < 4 0 0 > 5 ιο i»D i

Val Pro lie Cys Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 15 10 15 II® Val Thr Arg II® Aan Asp II® S®r Hie Thr Gin S®r Val S®r Ser 20 25 30

Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro Leu 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala lie Tyr Gin Gin lie 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val Val Gin lie Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Ala Ser Lys Ser Cys 85 30 95

Pro Leu Pro Gin Val Arg Ala Leu Glu Ser Leu Glu Ser Leu Gly Val 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Glv Ser Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys 145 < 210 > 6 < 211> 147 < 212 > PRT <213> Bos sp, <220>

<221> MODJRES <222> (29) , . (29) <223> Pode ou não estar presente ιο i»D i < 4 0 0 > 6

Mat V®1 Pro He Cys Lye Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Len Ila Lys 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Asa Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Lan His Pro 35 40 45

Len Lan Ser Lan Ser Lys Met Asp Gin Thr hen Ala He Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Len Pro Ser Arg Asn Val Val Gin He Ser As» Asp 65 70 75 80

Len Gin Asn Lan Arg Asp Len Leu His Len Len Ala Ala Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Pro Len Pro Gin Val Arg Ala hen Gin Ser Len Gin Ser Len Gly 100 105 110

Val Val Len Gin Ala Ser Len Tyr Ser Thr Gin Val Val Ala Len Ser 115 120 125

Arg Len Gin Gly Sar Len Gin Asp Mat Len Arg Gin Lan Asp Lan Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 < 210 > 7

<211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 7 ιο i»D i

Met His Trp Sly Thr Leu Cys Sly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 15 10 15

Phe Tyr Val Sin Ala Val Pro lie Gin Lys Val Sin Asp Asp Thr Lys 20 25 30

Thr Leu 11® Lys Thr lie val Thr Arg Ha Asn Asp 11® Ser His Thr 35 40 45

Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60

Gly Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala 65 70 75 80

Val Tyr Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin 85 90 95 lie Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110

Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125

Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140

Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin 145 150 155 160

Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 <210> 8 < 211> 146

< 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 2 2 0 >

<221> M0D_RES <222> (27) . . (27) ιο i»D i <223> Thr ou Ala < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (28) . . (28) <223> Pode ou não estar presente < 4 0 0 > 8

Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Asn Aap lie Ser His Xaa Gin Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Lys Val Thr Giy Leu Asp Phe lie Pro Giy Leu His Pro lie 35 40 45

Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 §0

Glu hen Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Gys 85 90 95

His Leu Pro Trp Ala Ser Giy Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Giy Giy 100 105 110

Val Leu Glu Ale Ser Giy Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Giy Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Giy Cys 145 < 210 > 9 < 211> 147 ιο i»D i

<212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (28) . . (28) <223> Thr ou Ala < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (29) . . (29) <223> Pode ou não estar presente <400> 9 ιο i»D i

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr &amp;rg lie Asa Asp lie Ser His Xaa Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Xle Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 < 210 > 10 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Macaca mulatta <4 0 0 > 10 ιο i»D i

Val Pro He Gin Lys Val Gin Ser Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro Val 35 40 45

Leu Thr Leu Ser Gin Met Asp Gin Thr Leu Ala He Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu He Asn Leu Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 00

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95

His Leu Pro Leu Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Asp 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Gy® 145 <210> 11 <211> 147

< 212 > PRT <213> Macaca mulatta < 4 0 0 > 11 crzoz is i

Met Val Pro Π® Gin Lys Val Gin Ser Asp Thr Lys Thr Leu He Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

Val Leu Thr Leu Ser Gin Met Asp Gin Thr Leu Ala lie Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu lie Asn Leu Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cy® His Leu Pro Leu Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Asp Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 < 210 > 12 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Rattus sp. < 4 0 0 > 12 ιο i»D i

Val Pro lie His Lys V'al Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lens lie Lys Thr 15 10 15

He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ala 20 25 30

Arg Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Lens Ala Val Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin He Ala His Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Gys 85 80 95

Ser Leu Pro Gin Thr Arg Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Glu Cys 145 <210> 13 <211> 147

< 212 > PRT < 213 > Ra11us sp. < 4 0 0 > 13

Met Val Pro He Hi® Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys ιο i»D i 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ala Arg Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

Lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin lie Ala His Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Thr Arg Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 14 < 211> 145

< 212 > PRT < 213 > Ornithorhynchus anatinus < 4 0 0 > 14 ιο i»D i

He Ser He Glu Lys He Gin Ala Asp Thr Lys Thr Leu Thr Lys Thr 15 10 15

He He Thr Axg He He Gin Leu Ser Thr Gin Asm Gly Val Ser Thr 20 25 30

Asp Gin Arg Val Ser Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Asn Gin Gin Phe 35 40 45

Gin Asn Leu Ala Asp Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Ser Ser Leu Pro Met Pro Asp Arg Thr Gin He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Ser Leu Phe Ala Leu Leu Ala Thr Leu Lys Asn Cys 85 30 35

Pro Phe Thr Arg Ser Asp Gly Leu Asp Thr Met Glu He Trp Gly Gly 100 105 110

He Val Glu Glu Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Thr Leu Asp Arg 115 120 125

Leu Arg Lye Ser Leu Lys Asn He Glu Lys Gin Leu Asp His He Gin 130 135 140

Gly 145 < 210 > 15

< 211> 166 <212> PRT < 213 > Ornithorhynchus anatinus < 4 0 0 > 15 crzoz is i

Met Arg Cys lie Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Cys Val Trp Glu Hie Leu 15 10 15

Tyr Tyr Ser His Pro He Ser He Glu Lys He Gin Ala Asp Thr Lys 20 25 30

Thr Leu Thr Lys Thr He He Thr Arg He He Gin Leu Ser Thr Gin 35 40 45

Asn Gly Val Ser Thr Asp Glu Arg Val Ser Gly Leu Asp Phe He Pro 50 55 60

Gly Asn Gin Gin Phe Gin Asn Leu Ala Asp Met Asp Gin Thr Leu Ala 65 70 75 80

Val Tyr Gin Glu He Leu Ser Ser Leu Pro Met Pro Asp Arg Thr Glu 85 30 85

He Ser Asu Asp Leu Glu Asu Leu Arg Ser Leu Phe Ala Leu Leu Ala 100 105 110

Thr Leu Lys Asu Cys Pro Phe Thr Arg Ser Asp Gly Leu Asp Thr Met 115 120 125

Glu He Trp Gly Gly He Val Glu Glu Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140

Val Thr Leu Asp Arg Leu Arg Lys Ser Leu Lys Asn He Glu Lys Gin 145 150 155 160

Leu Asp His He Gin Gly 165 < 210 > 16 < 211> 146

< 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 4 Q 0 > 16 crzoz is i Vâl Pro II® Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu II® Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie 35 40 45

Leu Thr Leu S®r Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin lie 50 55 60

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95

His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys 145 < 210 > 17 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 17

Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr L®u lie Lys Thr 15 10 15 ιο i»D i lie Val Thr Arg lie Asm Asp He Ser His Ala Gin Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Lys Val Thr Gly Lev Asp Phe He Pro Gly Lev His Pro He 35 40 45

Lev Thr Lev Ser Lye Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin He 50 55 60

Lev Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Lev 65 70 75 80

Glv Asn Lev Arg Asp Lev Lev Hi® Val Lev Ala Phe Ser Ly® Ser Cys 85 90 95

His Lev Pro Trp Ala Ser Gly Lev Glv Thr Lev Asp Ser Lev Gly Gly 100 105 110

Val Lev Glv Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glv Val Val Ala Lev Ser Arg 115 120 125

Lev Gin Gly Ser Lev Gin Asp Met Lav Trp Gin Lev Asp Lev Sar Pro 130 135 140

Gly Cys 145 <210> 18 < 211> 145

< 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 18 ιο i»D i

Val Pro He Sin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Asn Asp He Ser His Thr Ser Val Ssr Ser Lys 20 25 30

Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He Leu 35 40 45

Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin He Leu 50 55 60

Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu Glu 65 70 75 80

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His 85 30 35

Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu asp Ser Leu Gly Glv val 100 105 110

Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 115 120 125

Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly 130 135 140

Cys 145 < 210 > 19

< 211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 19 crzoz is i

Val Pro Ila Gin Lys Val Gift Asp Asp Thr Lys Thr Last lie Lys Thr 15 10 15 lie Val Thr Arg lie Asn Asp He Ser His Ala Ser Val Ser Ser lys 20 25 30

Gin lys Val Thr Gly leu Asp Phe He Pro Gly leu His Pro He leu 35 40 45

Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala, Val Tyr Gin Gin He Leu 50 55 60

Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu Gin 65 70 75 80

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val leu Ala Phe Ser lys Ser Cys His 85 SO 95 leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser leu Gly Gly Val 100 105 110 leu Gl\i Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 115 120 125

Glu Gly Ser Le\i Glu Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly 130 135 140

Cys 145 <210> 20 < 211> 147

< 212 > PRT < 213 > Homo sapiens <400> 20 crzoz is i

Mat Val Pro lie Gin Lye Val Gin Asp Asp Thr Lye Thr Leu lie Lye 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lye Gin Lye Val Thr Gly Leu Asp Phe II® Pro Gly Leu Hi® Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lye Met Asp Gin Thr Leu Ala Vel Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80 hen Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 35 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Gin Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Len Gin Gly Ser Len Gin Asp Mat Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 <210> 21 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 21 ιο i»D i

Met Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Len He Lys 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Aan Asp He Ser Hie Ala Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Len Asp Phe He Pro Gly Len His Pro 35 40 45

He Len Thr Len Ser Lys Met Asp Gin Thr Len Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Len Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Len Gin Asn Len Arg Asp Len Len His Val Len Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Len Pro Trp Ala Ser Gly Len Gin Thr Len Asp Ser Len Gly 100 105 110

Gly Val Len Gin Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Gin Val Val Ala Len Ser 115 120 125

Arg Len Gin Gly Ser Len Gin Asp Met Len Trp Gin Len Asp Len Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 <210> 22 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 22 crzoz is i

Met Val Pro II® Gin Lys val Gin Asp Asp Thr Ly® Thr Leu lie Ly® 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Aan Asp He Ser His Thr Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Lys Val Thr Gly Lee Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45

Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95

His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys 145 <210> 23 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 23 ιο i»D i

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Ays Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Ala Ser Val Ser Ser 20 25 30

Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie 35 40 45

Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin lie 50 55 60

Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn val lie Gin lie Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95

His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Al® Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys 145 <210> 24 < 211> 145

< 212 > PRT <213> Desconhecido <220> <223> Descrição do Desconhecido: Polipéptído de leptina de foca <400> 24 crzoz is i

Pro He Gin Arg val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr He 15 10 15

He Thr Arg He Asm Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val Cys Ser Arg 20 25 30

Pro Arg Vai Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val Arg 35 40 45

Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin Gin He Leu 50 55 60

Thr Ser Leu Gin Ser Arg Ser Val Val Gin He Ala Asn Asp Leu Ala 65 70 75 80

Asn Leu Arg Ala Leu Leu Arg Leu Leu Ala Ser Ala Lys Ser Cys Pro 85 90 95

Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu Gly A an Val 100 105 110

Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 115 120 125

Lys Ala Ala Leu Glu Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro Gly 130 135 140

Cys 145 <210> 25

<211> 145 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético ιο i»D i <400> 25

Pro lie Gin Arg val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lew lie Lys Thr lie 15 10 15 lie Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val Cys Ser Arg 20 25 30

Pro Arg Val Ala Gly Lea Asp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val Arg 35 40 45

Thr Lea Ser Gly Met Asp Gin He Lea Ala Thr Tyr Gin Gin He Lea 50 55 60

Thr Ser Lea Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Lea Gin 65 70 75 80

Asn Lea Arg Asp Lea Lea His Val Lea Ala Phe Ser Lys Ser Cys Pro 85 90 95

Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Lea Gly Asn Val 100 105 110

Lea Arg Ala Ser Val His Ser Thr Gla Val Val Ala Lea Ser Arg Lea 115 120 125

Lys Ala Ala Lea Gin Asp Met Lea Arg Gin Lea Asp Arg Asn Pro Gly 130 135 140

Cys 145 <210> 26

< 211> 145 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polípéptido sintético ιο i»D i <400> 26

Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lye Thr Leu He Lye Thr lie 15 10 15 lie Thr Arg lie Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val Ser Ser Arg 20 25 30

Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val Arg 35 40 45

Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin lie Leu Ala Thr Tyr Gin Gin lie Leu 50 55 60

Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu Glu 65 70 75 80

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Pro 85 90 95

Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu Gly Asn Val 100 105 110 L®u Arg Ala Ser Val His S®r Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 115 120 125

Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Axg Gin Leu Asp Axg Asn Pro Gly 130 135 140

Cys 145 <210> 27 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Desconhecido < 2 2 0 > <223> Descrição do Desconhecido: Polipéptido de leptina ιο i»D i de foea <400> 27

Met Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 15 10 15 lie He Thr Arg lie Asn Asp He Set Pro Pro Gin Gly Vel Cys Ser 20 25 30

Arg Pro Arg Val Ale Gly Lee Asp Phe He Pro Arg V®1 Gin Ser Vel 35 40 45

Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Ser Val Val Gin He Ala Asn Asp Leu 65 70 75 80

Ala Asn Leu Arg Ala Leu Leu Arg Leu Leu Ala Ser Ala Lys Ser Cys 85 90 95

Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu Gly Asn 100 105 110

Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Giu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Lye Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro 130 135 140

Gly Cys 145 <210> 28 < 211> 146

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > ιο i»D i <223> Descrição de sequência artificial: polípéptido sintético <400> 28

Met Pro He Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 15 10 15

He He Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val Cys Ser 20 25 30

Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu A sp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val 35 40 45

Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hi® Val Leu Ala Phe Ser Ly® Ser Cy® 85 90 95

Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu Gly Asn 100 105 110

Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro 130 135 140

Gly Cys 145 <210> 29

< 211> 146 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > ιο i»D i <223> Descrição de sequência artificial: polípéptido sintético <400> 29

Met Pro He Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 15 10 15

He He Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val Ser Ser 20 25 30

Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val 35 40 45

Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin Gin He 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hi® Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cy® 85 90 95

Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu Gly Asn 100 105 110

Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro 130 135 140

Gly Cys 145

<210> 30 <211> 374 < 212 > PRT <213> Sequência artificial ιο i»D i < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <4Q0> 30

Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Giu Leu Leu 15 10 15 61y Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leo 20 25 30 crzoz is i

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asa Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 II® Glu Lys Thr 11® Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120 125

Val Tyr Thr l®u Pro Pro S®r Arg Asp Glu L@u Thr Lys Asn Gin Val 130 135 140 S®r L®u Thr Cys L®u Val Lys Gly Ph@ Tyr Pro S®r Asp II® Ala Val 145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Fha Ser Cys Ser Val 195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220

Ser Pro Gly Lys Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr 225 230 235 240

Leu He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin 245 250 255 S®r Yal Ser Ser Lys Gin Lys Yal Thr Gly L®u Asp Phe He Pro Gly 260 265 270

Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Yal ιο i»D i 275 280 285

Tyr Gin Gin lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn val He Gin lie 290 295 300

Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 305 310 315 320

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp 325 330 335

Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 340 345 350

Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu 355 360 365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 < 210 > 31 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 31 crzoz is i

Met Val Pro Iie Gin Lys val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser lys Gin lys Val Thr Gly leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80 leu Gin Asn leu Arg Asp leu leu His Val leu Ala Phe Ser lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly leu Glu Thr Leu Asp Ser leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg leu Gin Gly Ser leu Gin Asp Met leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 <210> 32 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > ιο i»D i <221> MOD_RES <222> (78) . . (78)

<22.3 > Cys-PEG20K <400> 32

Met Val Pro lie Gin Lye Yal Gin Asp Asp Thr Lye Thr Lee lie Lye 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Lee Asp Phe He Pro Gly Lee His Pro 35 40 45

He Lee Thr Lee Ser Lys Met Asp Gin Thr Lee Ala V®1 Tyr Gin Gin 50 55 60

He Lee Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Cys Asn Asp 65 70 75 80

Leu Gle Asn Lee Arg Asp Leu Lee His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Gle Thr Lee Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Gle Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Lee Gin Gly Ser Lee Gin Asp Met Lee Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145

<210> 33 < 211> 147 <212> PRT ιο i»D i <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 33

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly Leu Hi® Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp

65 70 75 SO

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 SO 85

Cys Hi® Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 <210> 34 <211> 26 ιο i»D i

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: pêptido sintético < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> Tyr ou Phe <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8} <223> Asn, Arg ou Ser < 2 z. 0 >

<221> MOD_RES < 2 2 2 > (9)..(9) <223> Val, lie, Leu, Met, Phe ou Tyr <220>

<221> MOD_RES < 2 2 2 > (11) . . (11) <223> Asn, Ser, Glu ou Asp < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222 > (1z ) . . (12 j <223> Arg, Lys ou Asn <220>

<221> MOD_RES <222> (14)..(14} ιο i»D i <223> Lys ou Arg < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (20) . . (20) <223> Asp, Asn, Gin, Glu, His, Ser, Arg ou Lys < 2 2 0 >

<221> MOD_RES < 2 2 2 > (23).,(23) <223> Lys, lie ou Thr <220>

<221> MOD_RES < 2 2 2 > (24)..(24) <223> Ala, Ser, Thr, Gly, His, Leu ou Asp < 2 z. 0 >

<221> MOD_RES <222> (25) . . (25) <223> His, Glu ou Asp <400> 34

Sly Val Ser Asp Xaa Tyr Lys Xaa Xaa lie Xaa Xaa Ala Xaa Thr Val 15 10 15

Gits Gly Val Xaa Ala Lets Xaa Xaa Xaa lie 20 25 < 210 > 3 5

<211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > ιο i»D i <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 3 5

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Asn Ala Ays Thr Val 15 10 15

Glu Gly Val Ays Ala Aen lie Asp Glu lie 20 25

<210> 36 <211> 46 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> M0D_RES <222 > (6)..(6) <223> Val ou Glu < 2 2 0 > <221> M0D_RES <222> (7)..(7) <223> Leu, Glu ou Asp <220> <221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Asn, Leu ou lie < 2 2 0 > ιο i»D i <221> MOD_RES <2^i2> (10j . , (IQ) <223> Arg ou Lys <220> <221> M0D_RES <222> (13) . . (13) <223> Asp on Lys < 2 z. 0 > <221> MOD_RES <222> (20) . . (20) <223> Tyr ou Phe <220> <221> MOD_RES <222> (23) , . (23) <223> Asn, Arg ou Ser < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (24) . . (24) <223> Val, lie, Leu, Met, Phe ou Tyr < 2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (26) . . (26) <223> Asn, Ser, Glu ou Asp <220>

<221> M0D_RES <222> (27) . . (27) <223> Arg, Lys ou Asn < 2 2 0 > ιο i»D i

<221> MOD_RES <222> (29) . . (29) <223> Lys ou Arg <220> <221> MOD_RES <222> (35) . . (35) <223> Asp, Asn, Gin, Glu, His, Ser, Arg ou Lys < 2 z. 0 > <221> MOD_RES <222> (38) . . (38) <223> Lys, lie ou Thr <220> <221> MOD_RES <222> (39) , . (39) <223> Ala, Ser, Thr, Gly, His, Leu ou Asp < 2 2 0 > <221> MODJS.ES <222> (40) . . (40) <223> His, Glu ou Asp <400> 36

Leu Ala Glu Ala Lys Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Glu Leu Xaa Lys Tyr Gly 15 10 15 val Ser Asp xaa Tyr Lys xaa xaa He xaa xaa Ala xaa Thr val Glu 20 25 30

Gly Val Xaa Ala Leu Xaa Xaa Xaa He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 37 < 211> 4 6 ιο i»D i

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 Q 0 > 3 7

Leu Ala Glu Ala Lys Vai Ií8b Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu He Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Lys Ala Leu lie Asp Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45

<210> 38 <211> 46 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <4Q0> 38

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ly® Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Ser Tyr He Asn Arg Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val His Thr Leu He Gly His He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 ιο i»D i <210> 39 < 211> 4 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 39

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala As η Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Asn Ala Leu Thr His His He Leu Ala Ala Lex? Pro 35 40 45 <210> 40 <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 4 0 crzoz is i

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu. Ala Asn Arg Glu L®u Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr lys Asn leu He Asn Arg Ala Arg Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val His Ala Leu lie Asp His He leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 < 210 > 41 < 211> 4 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 0 0 > 41

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu leu Asp lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Tie He Asn Arg Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Arg Ala Leu lys Leu His He leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45

<210> 42 <211> 46 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético ιο i»D i <400> 42

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 ID 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asn Leu He Asn Arg Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Ser Ser Leu Lys Gly His He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 < 210 > 4 ό <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 4 3

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Ly® Asn Leu 11® Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 44 <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido ιο i»D i sintético <400> 44

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phs Tyr Lys Asn Leu He Asn Arg Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Asp Ala Leu He Ala His He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 45 < 211> 4 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 4 5

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Ser Leu Ha Asn Arg Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Asp Ala Leu Thr Ser His He Leu Ale Ala Leu Pro 35 40 45

<210> 46 <211> 46 <212> PRT <213> Sequência artificial ιο i»D i < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <4Q0> 46

Leu Ala Glu Ala Lys Val Lens Ala Asa Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asa Leo lie Asn Arg Ala Ays Thr Val Glo 20 25 30

Gly Val Asa Ser Leu Thr Ser His lie Leo Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 47 <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 47

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asa Arg Glu Leo Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asa Val lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glo 20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu He Ala Asp He Leo Ala Ala Leu Pro 35 40 45

< 210 > 4 8 <211> 46 <212> PRT ιο i»D i <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 4 8

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 ID 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asa Leu XI® Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Gin Ala Leu lie Ala His lie Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 < 210 > 4 9 <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22G> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 4 9

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 50 ιο i»D i <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 50

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asu Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 < 210 > 51 < 211> 4 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 51

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu 11® Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Glu Ala Leu lie Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 ιο i»D i < 210 > 52 <211> 46

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético <400> 52

Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15 V&amp;l Ser Asp Tyr Tyr Lys Arg Leu He Ser Lys Ala Lys Thr V&amp;l Glu 20 25 30

Gly Val Lys Ala Leu He Ser Glu He Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 53 <211> 200

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético <400> 53 crzoz is i

Met Leu Ala Glu Ala Lye Val Leu Ala As n Arg Glu Leu Asp Lye Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asu Ly® Ala Ly® Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ala S®r Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr 50 55 60

Lys Thr Leu He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His 65 70 75 80

Thr Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He 85 90 95

Pro Gly Leu His Pro II® Leu Thr Leu Ser Ly® Met Asp Gin Thr Leu 100 105 110

Ala Val Tyr Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He 115 120 125

Gin 11® Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu 130 135 140

Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr 145 150 155 160

Leu Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu 165 170 175

Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin

ISO 185 ISO

Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 135 200 <210> 54

<211> 213 <212> PRT ιο i»D i <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 54 crzoz is i

Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly ¥al Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr ¥al 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80 lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser 85 90 95 ¥al Ser Ser Lys Gin Lys ¥al Thr Gly leu Glu Phe lie Pro Gly leu 100 105 110

His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn leu Arg Asp Leu leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Gys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr leu Glu Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 55 ιο i»D i

<211> 201 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 55 ιο i»D i

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr II® Val Thr Arg II® Asn Asp 11® S®r His Thr Gin S®r Val S®r 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly L®u Gin Ph® 11® Pro Gly L®u His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg L®u Gin Gly S®r L®u Gin Asp Met L®u Gin Gin Leu Asp Leu S®r 130 135 140

Pro Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys 145 150 155 160

Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr 165 170 175

Lys Arg Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu 180 185 190

Lys Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro 195 200 < 210 > 56 < 211> 213

< 212 > PRT ιο i»D i <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 56 crzoz is i

Met Yal Pro lie Gin Lys val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asm Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Gin Phe He Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Gin Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn 165 170 175

Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu He 180 185 190

Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His He 195 200 205

Leu Ala Ala Leu Pro 210 ιο i»D i <210> 57 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 57

Met Lets Ala Gits Ala Lys Val Lets Ala Asn Arg Gits Leia Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glia Ala Leia Lys Leia His lie Leu Ala Ala Leia Pro Thar 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Sar Gly Gly Gly Sar Gly Gly Gly Sar Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser He Ser He Glu Lys He Glri Ala Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

Thr Lys Thr He He Thr Arg He He Gin Leu Ser Thr Gin Asn Gly 85 90 95 ιο i»D i

Val 8e r Thr Asp Sin Arg Val Ser Sly Leu Asp Phe He Pro Sly Asa 100 105 110

Gin Gla Ph® Gla Asn Lea Ala Asp Met Asp Gin Thr Lea Ala Vel Tyr 115 120 125

Gin Gin 11® Lea Ser Ser Lea Pro Met Pro Asp Arg Thr Gin lie Ser 130 135 140

Asn Asp Lea Gla Asa Lea Arg Ser Lea Phe Ala Leu Lea Ala Thr Leu 145 150 155 160

Lys Asn Cys Pro Ph® Thr Arg Ser Asp Gly Lea Asp Thr Met Gla lie 165 170 175

Trp Gly Gly He Val Gla Gla Ser Lea Tyr Ser Thr Gla Val Val Thr 180 185 130

Leu Asp Arg Lea Arg Lys Ser Lea Lys Asn He Gla Lys Gin Leu Asp 195 200 205

His He Gin Gly Cys 210 <210> 58 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 58 ιο i»D i

Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60 S@r Ala Ser Val Pro lie Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu

65 70 75 SO lie Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 59 < 211> 213 ιο i»D i

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Met V'al Pro lie Sin Lys Val Gin Asp Asp Thr Ays Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr II® Val Thr Arg II® Aan Asp II® S®r Hi® Thr Sin S®r Val S®r 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 crzoz is i

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn val lie Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Lew Glu Asn Leu Arg Asp Lea Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ale Asn 165 170 175

Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu He 160 185 190

Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His He 195 200 205

Leu Ala Ala Leu Pro 210 <210> 60 < 211> 212

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Met Leu Ale Glu Ale Ly® Val Leu Ale Asn Arg Glu Leu Asp Lye Tyr 15 ID 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ale Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ale Ser Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Ly® Thr Leu XI® 65 70 75 80

Lys Thr He He Thr Arg He Asn Asp lie Ser Pro Pro Gin Gly Val 85 90 95

Cys Ser Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin 100 105 110

Ser Val Arg Thr L®« Ser Gly Met Asp Gin XI® Leu Ala Thr Tyr Gin 115 120 125

Gin He Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn 130 135 140

Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 145 150 155 160

Ser Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu 165 170 175

Gly Asn Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 180 185 190

Ser Arg Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg 195 200 205

Asn Pro Gly Cys 210 ιο i»D i < 210 > 61 < 211> 212

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys ihr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Pro He Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He 65 70 75 80

Lys Thr He He Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val 85 90 95

Ser Ser Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin 100 105 110

Ser Val Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin 115 120 125

Gin He Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn 130 135 140

Asp Leu Glu Asm Leu Arg Asp Leu Leu Hi® Val Leu Ala Phe Ser Lys 145 150 155 160

Ser Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu 165 170 175

Gly Asm Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 180 185 190

Ser Arg Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg 195 200 205

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Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asa Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

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Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val Arg 85 SO 85

Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin lie Leu Ala Thr Tyr Gin Gla He Leu 100 105 110

Thr Ser Le\i Gla Ser Arg Asn Val He Gla He Ser Asn Asp Leu Glu 115 120 125

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Pro 130 135 140

Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu Gly Asn Val 145 150 155 160

Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 165 170 175

Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro Gly ISO 185 180

Cys

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Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn lie II® Asn Arg Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Arg Ala Leu Lys Leu Hie He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu loo 105 no

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Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 195 200 205

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Val lexs Ala Asn Arg Glu Lea Asp Lye Tyr 15 10 15

Sly Val Ser Asp Tyr Tyr lys Asa lie lie Asn Arg Ala lys Thr Val ιο i»D i 20 25 30

Glu Gly Val Arg Ala Leu Lys Leu His lie Lau Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80 lla Lys Thr II® Val Thr Arg II® Asn Asp lie S®r His Thr Gin S®r 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lla Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro lla Leu Thr Leu Ser Lys Mat Asp Gin Thr Lau Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Lau Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175 L®u Gly Gly Val L®u Gin Ala Ser Gly Tyr S®r Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Lau Gin Gly Ser Lau Gin Asp Met Lau Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asa Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80 lie Lys Thr lie Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 SO 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Fhe He Fro Gly Leu 100 105 110

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Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Fhe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cya His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Len Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 66 ιο i»D i <211> 227

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Met 1«®« Ala Glu Ala Lye Val Leu Ala Asm Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu He Asa Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 50 55 60

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80

Ser Val Pro lie Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 85 90 95

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Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly Leu His Pro 115 120 125 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 130 135 140 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 145 150 155 160

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 165 170 175

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Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 135 200 205

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Cys 225 ιο i»D i <210> 67 < 211> 214

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Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly 50 55 60

Gly Glu Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr 65 70 75 80

Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin 85 90 95

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Fhe Ha Fro Gly 100 105 110

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Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 180 185 190

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly 50 55 60

Gly Lys Ala Ser Val Pro lie Glu Lys Val Glu Asp Asp Thr Lys Thr 65 70 75 80

Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp Tie Ser His Thr Gin 85 90 95

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly 100 105 110

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Tyr Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He 130 135 140

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asu Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

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He Lys Thr He Val Thr Arg He Asm Asp He Ser His Thr Glu Ser 85 90 35

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Lys Ser Cys Ser Leu Pro Glu Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175

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Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Glu Leu Asp 135 200 205

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Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Assn Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

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Gly Gly Gly Gly Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr 50 55 SO

Lys Thr Leu He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His 65 70 75 80

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Pro Gly Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu 100 105 110

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Gin He Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hi® Val Leu 130 135 140

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 ID 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asa Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

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Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arcs· Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 135 200 205

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<211> 201 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 72 crzoz is i

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 ID 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pr© Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

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Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pr© Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys 145 150 155 160

Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr 165 170 175

Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu 180 185 190

Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro 195 200 < 210 > 7 3 < 211> 213

< 212 > PRT ιο i»D i <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 73 crzoz is i

Mat Vai Pro IIs Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ila Lys 15 ID 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lla Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lla Lay Thr Leu Sar Lys Mat Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lla Leu Thr Ser Mat Pro Sar Arg Asn Val lla Gin lla Ser Asn Asp 65 70 75 80

Lau Glu Asn Leu Arg Asp Lau Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Sar Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Sar Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Sar 115 120 125

Arg Lau Gin Gly Ser Lau Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie 165 170 175

Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie 180 185 190

Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie 195 200 205

Leu Ala Ala Leu Pro 210 ιο i»D i <210> 74 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 74 crzoz is i

Met Leu Ala. Glia Ala Lys Glia Asp Ala lie Lys Glia Lea Asp Lye Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asa Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glia Ala Leu Thr Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser lie Ser lie Glu Lys lie Gin Ala Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

Thr Lys Thr He He Thr Arg He He Gin Leu Ser Thr Gin Asn Gly 85 90 95

Val Ser Thr Asp Gin Arg Val Ser Gly Leu Asp Fha He Fro Gly Asn 100 105 110

Gin Gin Phe Gin Asn Leu Ala Asp Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Ser Ser Leu Pro Met Pro Asp Arg Thr Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glia Asn Leia Arg Ser Leu Fhe Ala Leia Leu Ala Thr Leia 145 150 155 160

Lys Asn Cys Pro Phe Thr Arg Ser Asp Gly Leu Asp Thr Met Glu He 165 170 175

Trp Gly Gly He Val Glu Glu Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Thr 180 185 190

Leu Asp Arg Leu Arg Lys Ser Leu Lys Asn He Glu Lys Gin Leu Asp 195 200 205

His He Gin Gly Cys 210 <210> 75 ιο i»D i < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 75

Met Lau Al® Glu Al® Lys Glu Asp Al® lie Lys Glu Lew Asp Lye Tyr 15 10 15

Gly val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Lew He Asm Lye Al® Lye Thr val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Sar Gly Gly Gly 50 55 60

Sar Ala Sar Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lew

65 70 75 SO

Ila Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Sar Lys Gin Lys Val Thr Gly Lew Asp Phe lla Pro Gly Lew 100 105 110

His Pro lla Lew Thr Lew Sar Lys Mat Asp Gin Thr Law Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser 130 135 140

Asn Asp Lew Glu Asm Law Arg Asp Lew Law His Val Lew Ala Phe Sar 145 150 155 160 crzoz is i ly® Ser Cy® Hi® leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu ¢31¾ Thr Lai® A®p Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cy® 210 <210> 76

< 211> 213 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 76 crzoz is i

Met Val Pro lie Gin Lye val Gin Asp Asp Thr Lye Thr Leu lie Lye 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly leu Asp Phe lie Pro Gly leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lye Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu leu His Val leu Ala Phe Ser lys Ser 85 SO 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Le\i Trp Gin leu Asp leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie 165 170 175

Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie 180 185 190

Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He 195 200 205

Leu Ala Ala Leu Pro 210 <210> 77 ιο i»D i < 211> 212

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 77 crzoz is i

Met Leu Ala Gi u Ala Lys Glu Asp Ala ll@ Lys Glu lieu Asp Lys Tyr 15 ID 15

Gly Vai Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He 65 70 75 80

Lys Thr He He Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val 85 90 95

Cys Ser Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin 100 105 110

Ser Val Arg Thr leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin 115 120 125

Gin He Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn 130 135 140

Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 145 150 155 160

Ser Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu 165 170 175

Gly Asn Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu ISO 185 190

Ser Arg Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg 195 200 205

Asn Pro Gly Cys 210 ιο i»D i

<210> 78 < 211> 212 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 78 ιο i»D i

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 SO

Ser Ala Ser Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie 65 70 75 80

Lys Thr lie lie Thr Arg lie Asn Asp lie Ser Pro Pro Gin Gly Val 85 30 95

Ser Ser Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe lie Pro Arg Val Gin 100 105 110

Ser Val Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin lie Leu Ala Thr Tyr Gin 115 120 125

Gin lie Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn 130 135 140

Asp Leu Glu Aan Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 145 150 155 160

Ser Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr lie Lys Gly Leu 165 170 175

Gly Asn Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 180 185 130

Ser Arg Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg 195 200 205

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Met Leu Ala Glu Ala Lys G1 a Asp Ala lie Ays Glu Lea Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly ¥al Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Lea lie Asa Lys Ala Lys Thr ¥al 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr L®u lie Lys Thr 50 55 60 lie lie Thr Arg lie Asn Asp lie Ser Pro Pro Gin Gly Val Cys Ser 65 70 75 80

Pro Arg ¥al Ala Gly Leu Asp Phe lie Pro Arg Val Gin Ser ¥a! Arg 85 90 95

Thr Lea Ser Gly Met Asp Gin lie Leu Ala Thr Tyr Gin Gin lie Lea 100 105 110

Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp Leu Glu 115 120 125

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Pro 130 135 140

Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr lie Lys Gly Leu Gly Asn Val 145 150 155 160

Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu ¥al Val Ala Leu Ser Arg Leu 165 170 175

Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro Gly 180 185 190

Cys <210> 80 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial ιο i»D i < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 80

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro H® Glu Lys Val Glu Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu 100 105 110 crzoz is i

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Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 195 200 205

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Met Leu Ala G.1u Ala Lys ©la Asp Ala lie IiVS G.1 u Lea Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asm Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lea

65 70 75 SO lie Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Ly® Gin Ly® Val Thr Gly Lea Glu Pha He Pro Gly Lea

100 105 HO

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Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Lea Glu Asn Leu Arg Asp Lea Leu His Val Lea Ala Phe Ser 145 150 155 160

Ly® Ser Cy® His Lea Pro Gin Ala Ser Gly Lea Glu Thr Leu Gla Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 ιο i»D i <210> 82 < 211> 213

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Gi u Lea Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asa Leu He As π Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr* 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu

65 70 75 SO

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

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Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Glu Gly Ser Leu Glu Asp Met Leu Glu Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 83 ιο i»D i

<211> 227 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 83

Met Leu Ale Glu Ale Ly® Glu Asp Ale lie Lye Glu Leu Asp Lye Tyr 15 ID 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ale Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Leu Ala Glu Ala Ale Ala Lys Glu Ale Ala Ale Lys Glu Ala Ale 50 55 60 A1 s Gl Avl sl A1 ^ A^l sl s ^^1 Atl ^ JA1 â Atl ^ @ Atl ^ 1l1 â Atl ^ 1l1 â 65 70 75 80 ιο i»D i

Ser Val Pro lie Glut Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 85 90 95

Thr lie Val Thr Arg lie Asm Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 100 105 110

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Gin Phe He Pro Gly Leu Hie Pro 115 120 125

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 130 135 140

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 145 150 155 160

Leu Glu Assn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 165 170 175

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Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 195 200 205

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Set Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Agn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly 50 55 60

Gly Glu Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr 65 70 75 80

Leu lie Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp lie Ser His Thr Gin 85 90 95

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly 100 105 110

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Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 145 150 155 160

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu 165 170 175

Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 180 1S5 190

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Asp Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 85 ιο i»D i < 211> 214

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He Leu Ale Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Lye Gly Gly Lys Gly Gly Lye Gly Gly Lys Gly Gly Lye Gly 50 55 60

Gly Lys Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr 65 70 75 80

Leu He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin 85 30 35

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly 100 105 110

Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val 115 120 125

Tyr Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He 130 135 140

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Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu Hi a He Leu Ale Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Glu Lys Val Glu Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 30 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

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<211> 200 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 87 ιο i»D i

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Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu II® Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

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Gly Gly Gly Gly Ala Ser Val Pro He Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr 50 55 60

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Thr Gin Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He 85 90 95

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Gin He Ser Asn Asp Len Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu 130 135 140

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Glu Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Glu Lys val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

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Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175

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Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

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<211> 201 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 89

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lets lie Lys ιο i»D i 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Lew Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Hi® Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

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Ly® Asn Leu lie A®n Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu 180 185 190 lie Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro 195 200 <210> 90 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial ιο i»D i < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 90

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys 15 10 15

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Lsu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 80 95

Cys His Leu Fro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Lau Gin Gly Ser Lau Gin Asp Met Lau Gin Gin Leu Asp Leu Sar 130 135 140

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Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lau Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala Ha 165 170 175

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Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu He Ser Glu He 195 200 205

Leu Ala Ala Leu Pro 210 < 210 > 91 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 91

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asm Leu lie Asa Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu He Ser Glu He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser He Ser He Glu Lys He Gin Ala Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

Thr Lys Thr He He Thr Arg He He Gin Leu Ser Thr Gin Asn Gly 85 90 95

Val Ser Thr Asp Gin Arg Val Ser Gly Leu Asp Phe H® Pro Gly Asn 100 105 110

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Gin Glu He Leu Ser Ser Leu Pro Met Pro Asp Arg Thr Glu He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn L®u Arg Ser Leu Fh® Ala Leu Leu Al® Thr Leu 145 150 155 160

Lys Asn Cys Pro Pha Thr Arg S®r Asp Gly Leu Asp Thr Met Glu II® 165 170 175

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Leu Asp Arg Leu Arg Lys Ser Leu Lys Asn He Glu Lys Gin Leu Asp 195 200 205

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< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 92

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu II® Asn Lys Ala Lys Thr val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu lie Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu

65 70 75 SO lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser 85 90 35

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Gys His Leu Pro Trp Al® Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 93 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 93

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie 165 170 175

Lys Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie 180 185 190

Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu lie Ser Glu lie 195 200 205

Leu Ala Ala Leu Pro 210 <210> 94 <211> 212

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <4Q0> 94

Met Leu Ala Glu Ala Lye Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lye Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu He Ser Glu He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Pro He Glu Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He 65 70 75 80

Lys Thr He He Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val 85 SO 35

Cys Ser Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin 100 105 110

Ser Val Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin 115 120 125

Gin He Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn 130 135 140

Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 145 150 155 160

Ser Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu 165 170 175

Gly Asn Val Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 180 185 130

Ser Arg Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg 135 200 205

Asn Pro Gly Cys 210

<210> 95 < 211> 212 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 95

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu lla Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Sex' Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Pro lie Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie 65 70 75 80

Lys Thr He He Thr Arg He Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val 85 90 95

Ser Ser Arg Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin 100 105 110

Ser Val Axg Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin 115 120 125

Gin He Leu Thr Ser Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn 130 135 140

Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys 145 150 155 160

Ser Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr He Lys Gly Leu 165 170 175

Gly Asn Val Leu Arg Ala Ser val His Ser Thr Glu val val Ala Leu 180 185 130

Ser Arg Leu Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg 195 200 205

Asn Pro Gly Cys 210 <210> 96 < 211> 193

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 96

Met Leu Ala Glu Ala Ays Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Xyr 15 10 15

Gly V®1 Sar Asp Tyr Tyr Lys Asn Lau lie Asn Lys Ala Lys Thr V®1 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu lie Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Pro He Gin Arg Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 50 55 60 lie He Thr Arg lie Asn Asp He Ser Pro Pro Gin Gly Val Cys Ser 65 70 75 80

Pro Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe He Pro Arg Val Gin Ser Val Arg 85 90 95

Thr Leu Ser Gly Met Asp Gin He Leu Ala Thr Tyr Gin Gin He Leu loo 105 no

Thr Sar Leu Gin Ser Arg Asn Val He Gin He Sar Asn Asp Leu Glu 115 120 125

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Pro 130 135 140

Val Pro Arg Ala Arg Gly Ser Asp Thr lie Lys Gly Leu Gly Asn Val 145 150 155 160

Leu Arg Ala Ser Val His Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 165 170 175

Lys Ala Ala Leu Gin Asp Met Leu Arg Gin Leu Asp Arg Asn Pro Gly 180 185 190

Cys <210> 97 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 δ Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 97

Met. Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu He Asπ Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu He Ser Glu He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 35 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 98 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 98

Met Leia Ala Glia Ala. Lys Glia Asp Ala He Lys Glia Lea Asp Lye Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Lea He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Gits Gly Val Glu Ala Lea He Ser Gia He Lea Ala Ala Lea Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lea 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asa Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Lea Glu Fhe He Pro Gly Lea 100 105 110

His Pro He Lea Thr Lea Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Lea Gia Asn Lea Arg Asp Lea Lea His Val Lea Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Lea Pro Gin Ala Ser Gly Lea Gia Thr Lea Gia Ser 165 170 175

Lea Gly Gly Val Lea Gia Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Gia Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Lea Gin Gly Ser Lett Gin Asp Met Lett Gin Gin Lea Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 99 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 9 9

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala II® Lys Glu Lea Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu He Asπ Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu He Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Fro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Glu Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 35 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu Hie Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Le\i Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 <210> 100 <211> 227

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 100

Met Lens Ala Gins Ala Lys Gits Asp Ala He Lys Gins Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asrs Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Gins Ala Leu He Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Gins Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 50 55 60

Ala Lys Gins Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80

Ser Val Pro lie Gin Lye Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys 85 90 95

Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 100 105 110

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu His Pro 115 120 125

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 130 135 140

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 145 150 155 160

Leu Glu Asη Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 165 170 175

Gys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 180 185 190

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 195 200 205

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Cys 225 < 210 > 101 < 211> 214

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 101

Met L®u Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala II® Lya Glu lea Asp lya Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn leu II® Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu lie Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly 50 55 60

Gly Glu Ala Ser val Pro 11® Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr 65 70 75 80

Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Aan Asp lie Ser His Thr Gin 85 90 95

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly 100 105 110

Leu His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val 115 120 125

Tyr Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He 130 135 140

Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 145 150 155 160

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu 165 170 175

Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 180 185 190

Ala Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu 195 200 205

Asp Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 102 < 211> 214

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 102

Mat Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Lea Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn lys Ala lys Thr Val 20 25 30

Gin Gly Val Glu Ala Laa Ha Sar Gin Ha Leu Ala Ala Lea Pr© Thr 35 40 45

Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly 50 55 60

Gly Lys Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr 65 70 75 80

Lea lie Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin 85 90 35

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Lea Gla Fhe He Fro Gly 100 105 110

Lea His Pro He Lea Thr Lea Ser Lys Met Asp Gin Thr Lea Ala Val 115 120 125

Tyr Gin Gin He Lea Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He 130 135 140

Ser Asn Asp Lea Gla Asn Lea Arg Asp Lea Lea His Val Lea Ala Phe 145 150 155 160

Ser Lys Ser Cys His Lea Pro Gin Ala Ser Gly Lea Gla Thr Lea Gla 165 170 175

Ser Laa Gly Gly Val Laa Gla Ala Ser Gly Tyr Sar Thr Gla Val Val 180 185 190

Ala Laa Ser Arg Lea Gin Gly Sar Leu Gin Asp Mat Leu Gin Gin Laa 195 200 205

Asp Laa Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 103 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 103

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Ays Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Ass. Leu He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu ll@ Ser Glu He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175

Leu Gly Glu Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Glu Cys 210 <210> 104 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 104

Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asm Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val See Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Glu Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Vai Ser Ser Lys 61n Lys Vai Thr Gly Leu 61u Phe lie Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin lie Leu Thr Sar Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Sar 130 135 140

Asn Asp Leu Slu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 ISO 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 105 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 105

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly V'al Ser Asp Tyr Tyr Lys Arg Leu He Ser Lys Ala Lys Thr V'al 20 25 30

Glu Gly Val Lys Ala Leu He Ser Glu lie Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

Ha Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 30 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 135 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 106 < 211> 213

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 Q 0 > 106

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glu Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asm Lau He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Sar Ala Sar Val Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lau 65 70 75 80

He Lys Thr Ha Val Thr Arg Ha Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Sar Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe lie Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro Ha Leu Thr Leu Sar Lys Mat Asp Gin Thr Lau Al® Val Tyr 115 120 125

Gin Gin 11a Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val 11a Gin 11a Ser 130 135 140

Asn Asp Lau Glu Asn Lau Arg Asp Lau Lau His Val Lau Ala Phe Sar 145 150 155 160

Lys Sar Cys His Lau Pro Gin Ala Sar Gly Lau Glu Thr Lau Glu Sar 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ale Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Sar Arg Lau Gin Gly Ser Lau Gin Asp Met Lau Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Sar Pro Gly Cys 210 < 210 > 107 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 107

Met Leu Ala Glu Ala Lys Glia Asp Ala He Lys Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leia He Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu lie Ser Glu He Leu Ala Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro He Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80

He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Glu Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 1S5 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp 195 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 108 <211> 37 < 212 > PRT <213> Rattus sp. < 4 Q 0 > 108

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asπ Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Asη Asn Lau Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 109 <211> 37

< 212 > PRT < 21.3 > Homo s ap i en s < 4 Q 0 > 109

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala lie Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyx 35

< 210 > 110 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 110

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 111 <211> 32

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 111

Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gin Asp Phe 15 10 15

Asn Lye Phe His Thr Phe Pro Gin Thr Ala lie Gly Val Gly Ala Pro 20 25 30 <210> 112 <211> 32

< 212 > PRT < 213 > Qncorhynchus sp. < 4 0 0 > 112

Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gin Glu Leu 15 10 15

His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro 20 25 30 < 210 > 113 <211> 32

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 113

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Lea Gly Arg Leu Ser Gin Gla Leu 15 10 15

His Axg Lea Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Asn Thr Tyr 20 25 30 <210> Hi <211> 26

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: pêptido sintético < 4 0 0 > 114

Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Lea lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 15 10 15

Gla Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu His lie 20 25 < 210 > 115 < 211> 2 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 115

Gly Vai Ser Asp Tyr Tyr Lys Asa Leu Xle Asu Lys Ala Lys Thr Vai 15 10 15

Glu Gly Vai Glu Ala Leu Ile Ser Glu Ile 20 25 < 210 > 116 < 211 > 4

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 116

Gly Gly Gly Gly 1 < 210 > 117 < 211 > 5

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 Ο Ο > 117

Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 < 210 > 118 < 211 > 8

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptído sintético < 4 0 0 > 118

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 < 210 > 119

< 211 > 8 <212> PRT <213> Sequência artifi cial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 119

Gly Gly Gly hsn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 120 <211> 8

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: pêptido sintético < 4 Q 0 > 120

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 < 210 > 121

< 211 > 5 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: pêptido sinxetico < 4 0 0 > 121

Gly Pro Asn Gly Gly 1 5

< 210 > 122 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificiai: pêptido sintético < 2 2 Ο > <221> misc_feature < 2 2 2 > (1)..(20} <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Ser" < 4 0 0 > 122

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 S 10 15

Gly Ser Gly Ser 20 < 210 > 123 <211> 30

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 a 0 > <221> misc__feature < 2 2 2 > (1)..(30) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições uGly Gly Ser" < 4 0 0 > 123

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 20 25 30 < 210 > 124 < 211> 4 0

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (40) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Ser” < 4 0 0 > 124

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40 < 210 > 125 <211> 50

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (50) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Gly Sen" <400> 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Ser 50

< 210 > 126 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (20) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Glu" < 4 0 0 > 126

Gly Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glia Gly Glia Gly Glia Gly Glia Gly Glu 15 10 15 G 1,y Glxi G 1,y G1 i: 20 < 210 > 127 <211> 30

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> rrdsc feature <222> (1) . . (30) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Glu" < 4 0 0 > 127

Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly 15 10 15

Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu 20 25 30 < 210 > 128 < 211> 4 0

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ Ο > <221> misc_£eature <222> (1) . . (40) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Glu" < 4 0 0 > 128

Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu 15 10 15

Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu 20 25 30

Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu 35 40

< 210 > 129 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> misc_feature <222> (1) . . (50) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Gly Glu" < 4 0 0 > 129

Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Glu 50 < 210 > 130 <211> 20

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 2 2 0 > <221> rrdsc feature <222> (1) . . (20) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Asp" < 4 0 0 > 130

Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp 15 10 15

Gly Asp Gly Asp 20 <210> 131 <211> 30

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> misc feature <222> (1)., (30) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Asp" < 4 0 0 > 131

Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly 15 10 15

Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly Gly Asp 20 25 30 <210> 132 <211> 40

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> misc_feature < 2 2 2 > (1)..(40} <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Asp'1 < 4 0 0 > 132

Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp 15 10 15

Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp 20 25 30

Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Asp 35 40 < 210 > 133 <211> 50

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(50) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Gly Asp" < 4 0 0 > 133

Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Asp 50 < 210 > 134 <211> 20

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptído sintético < 2 2 0 > <221> rnisc feature <222> (1) . . (20) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Lys " < 4 0 0 > 134

Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys 15 10 15

Gly Lys Gly Lys 20 < 210 > 135 <211> 30

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> misc__feature <222> (1) . . (30) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Lys" < 4 0 0 > 135

Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly 15 10 15

Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Lys 20 25 30 < 210 > 136 < 211> 4 0

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (40) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Lys" < 4 0 0 > 136

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys 15 10 15

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys 20 25 30

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys 35 40 <210> 137 <211> 50

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> misc__feature <222> (1)..(50) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Gly Lys" < 4 0 0 > 137

Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Lys 50 < 210 > 138 <211> 20

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 2 2 Ο > <221> misc_feature < 2 2 2 > (1)..(20} <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Arg" < 4 0 0 > 138

Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg 15 10 15

Gly Arg Gly Arg 20 < 210 > 139 <211> 30

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 G > <221> misc__feature <222> (1) . . (30) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Arg" < 4 0 0 > 139

Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly 15 10 15

Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg 20 25 30 < 210 > 140 < 211> 4 0

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (40) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Arg" < 4 0 0 > 14 0

Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg 15 10 15

Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg 20 25 30

Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg 35 40 < 210 > 141 <211> 50

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 z. 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (50) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Gly Gly Gly Gly Arg'! <400> 141

Sly Gly Sly Gly Arg Gly Sly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Arg 50 <210> 142 <211> 50

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> misc__feature <222> (1) . . (50) <223> Essa região pode abranger 1 a 10 repetições "Glu Ala Ala Ala Lys" < 4 0 0 > 142 ¢31¾ Ala Ala Ala Lys Gin Ala Ala Ala Lys ¢31¾ Ala Ala Ala Lys ¢31¾ 15 10 15

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Gin Ala Ala 35 40 45

Ala Lys 50 < 210 > 143 < 211> 146

< 212 > PRT < 213 > Mus sp. < 4 Q 0 > 143

Val Pro lie Gin Lye Yal Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lev lie lys Thr 15 10 15 lie Yal Thr Arg lie Asn Asp lie Ser Hi® Thr Gin Ser Yal Ser Ala 20 25 30

Lys Gin Arg Yal Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Lev Ala Val Tyr Gin Gin Yal 50 55 60

Leu Thr Ser Lev Pro Ser Gin Asn Val Lev Gin He Ala Asn Asp Lev 65 70 75 80

Glv Asn Lev Arg Asp Lev Lev His Lev Lev Ala Phe Ser Lys Ser Cys S5 90 95

Ser Leu Pro Gin Thr Ser Glv Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp Glv 100 105 110

Yal Leu Glv Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Yal Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Lev Gin Gly Ser Lev Gin Asp He Lev Gin Gin Lev Asp Yal Ser Pro 130 135 140

Glv Cy® 145 <210> 144 < 211> 145 < 212 > PRT <213> Mus sp. < 4 0 0 > 144

Val Pro IIs Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ila Lys Thr 15 ID 15 lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Ser Val Ser Ala Ays 20 25 30

Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie Leu 35 40 45

Ser Leu Ser Lye Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Val Leu 50 55 60

Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin He Ala Asn Asp Leu Glu 65 70 75 80

Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser 85 90 95

Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val 100 105 110

Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu 115 120 125

Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser Pro Glu 130 135 140

Cys 145 < 210 > 145 < 211> 147 < 212 > PRT <213> Mus sp. < 4 0 0 > 14 5

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 ID 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Sly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin lie Ala Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 146 <211> 146 < 212 > PRT <213> Mus sp. < 4 0 0 > 146

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Ser Val Ser Ala 20 25 30

Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie 35 40 45

Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Val 50 55 60

Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Aen Vai Leu Gin lie Ala Aen Asp Leu 65 70 75 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95

Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly 100 105 110

Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser Pro 130 135 140

Glu Cys 145 <210> 147 < 211> 213

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 14 7

Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 15 10 15

Gly Val Ser Asp Phe Tyr Ays Arg Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Al® Leu Lys Leu His lie Leu Ale Ala Leu Pro Thr 35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60

Ser Ala Ser Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 65 70 75 80 lie Lys Thr lie Val Thr Arg He Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser 85 90 95

Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu 100 105 110

His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr 115 120 125

Gin Gin He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser 130 135 140

Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser 145 150 155 160

Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser 165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala 180 185 190

Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp 135 200 205

Leu Ser Pro Gly Cys 210 < 210 > 148 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> MOD_RES <222> (25) . . (25) <223 > Lys(mPEG4OK) < 4 0 0 > 14 8

Cya Aan Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Agn Phe Leu Val 15 10 15

Arg Ser Sex' Asn Aan Leu Giy Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Giy 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 149 < 211 > 4

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 δ 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 149 Gly Giy Giy Ser < 210 > 150 < 211 > 5

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptído sintético < 4 0 0 > 150 Gíy Gly Gly Gíy Ser 1 5 < 210 > 151 < 211> 16

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificiai: péptído sintético < 4 0 0 > 151

Gly Gly Gly S®r Gly Gly Gly S®r Gly Gly Gly S®r Gly Gly Gly S®r 15 10 15 < 210 > 152 < 211> 15

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificiai: péptído sintético <4 Ο Ο > 152

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

< 210 > 153 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 153

Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gly Glu Gly 15 10 15

Gly Glu <210> 154 < 211> 18

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 154

Gly Gly Lyg Gly Gly Ly® Gly Gly Lys Gly Gly Ly® Gly Gly Lys Gly 15 10 15

Gly Lys <21G> 155 <211> 15

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 a 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 155

Glu ala ala ala Lys Giu ala ala ala Lys Gla ala ala ala Lys 15 10 15 < 210 > 156 <211> 20

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 156

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Gits 15 10 15

Ala Ala Ala Lys 20 < 210 > 157 <211> 25

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 157

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ays Glu 15 10 15

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 20 25 <210> 158 <211> 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 158 val Pro lIs Gin Lys Val 1 5 < 210 > 159 < 211 > 5

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 159

Leu Ala Glu Ala Lys 1 5 < 210 > 160 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 z. 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 160

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Vai Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Vai Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly S®r Asn Thr Tyr 35

< 210 > 161 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 δ Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 161

Cys Asm Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

Hls Ser Ser Asn Asn Ph® Gly Ala lie L®u Ser S®r Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

< 210 > 162 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 162

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Ph® Leu 1 5 10 15

Vai His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Vai Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 163 <211> 37

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 Q 0 > 163

Lys Cys Asa Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg leu Ala Asn the leu 15 10 15

Val Arg Sar S®r Asn Asn Phe Gly Pro 11® Lsu Pro Ssr Thr Asn V®1 20 25 30

Gly S®r Asn Thr Tyr 35 < 210 > 164 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 0 0 > 164

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

Arg S®r Ser Asn Asn Fh® Gly Pro He L®u Pro S®r Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 165 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 165

Lys Cys Asa Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr Asn ¥al 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 166 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 166

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Ph® Leu val 15 10 15

Arg S®r Sar Asn Asn Ph® Gly Pro lla Lea Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tvr 35 <210> 167 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 167

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leo Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Sar Asn Thr Tyr 35

< 210 > 168 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 Ο Ο > 168

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg leu Ala Asn Phe leu 1 5 ID 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Vai Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 169 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 16 9

Lys Asp Asn Thr Ala Thr Lys Ala Thr Gin Arg Law Ala Asn Ph© Law 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala lie Leu Pro Ser Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 170 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 170

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His $ar $®r Asn Asn Ph® Gly Ala il@ Lau $®r $ar Thr Aan Val Gly 20 25 30 S®r Asn Thr Tyr 35 <210> 171 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 171

Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg L®n Ala Asn Ph® L®n 15 10 15

Val His Sar S@r Asn Asn Ph® Gly Ala 11® Lau S®r Sar Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 172 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 δ Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> i7a

Lys Ala Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leis Ala Asn Phe Leis 15 10 15

Vai His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala lie Lsa Ser Sar Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 173 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 173

Lys Ala Asn Thr Ala Thr Ala Ala Thr Gin Arg Leis Ala Asn Ph® Leis 15 10 15

Vai His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 174 <211> 37

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 Q 0 > 174

Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin A.rg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Sly Ala lie Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30

Sly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 175 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 0 0 > 175

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala lie Leu Ser Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 176 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 176

Lya Cys A.?n Thr Ala Thr Cya Ala Thr Gin Arg Leu Ala Aso Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asm Phe Gly Pro He Leu Pro Ser Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 177 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 177

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Ser Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 178 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 178

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Lan Ala Asn Phe Lau 15 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35

< 210 > 179 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 Ο Ο > 179

Lyβ Cys Asη Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser Asa Asa Leu Gly Pro Val Leu Pro Ser Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 180 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 180

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Ser Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 181 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 181

Lys Cys As n Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Ser Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 182 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipeptido sintético < 4 0 0 > 182

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro He Leu Pro Pro Thr Asn Vel 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <21Q> 183 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 183

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Vai Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro lie Iran Pro Sar Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 184 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 184

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leo Ala Asn Phe Leu 15 10 15 lie His Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 185 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 185

Lys Cys Asa Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gla Arg Leu Ala Asa Phe Leu 15 10 15 lie His Ser Ser Asa Asa Phe Gly Pro lia Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asa Thr Tyr 35

< 210 > 186 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 186

Cys Asa Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gla Arg Lea Ala Asa Phe Leu lie 15 10 15

His Ser Ser Asa Asa Leu Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr Asa Vai Gly 20 25 30

Ser Asa Thr Tyr 35 <210> 187 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 187

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Ph® Leu 15 10 15 lie Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Ala lie Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35

< 210 > 188 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artifi cial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 188

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

He Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Ala Val Leu Ser Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 189 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético < 4 0 0 > 189

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Lau Ala Asn Phe Lau 15 10 15 lie Arg Ser Ser Asn Asn Lee Gly Pro V&amp;l Leu Pro Pro Thr As» V&amp;l 20 25 30

Giy Ser As» Thr Tyr 35

< 210 > 190 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético < 4 0 0 > 190

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg leu Thr Asn Phe leu 15 10 15

Val His Ser Ser His Asn Leu Gly Ala Ala Leu leu Pro Thr Asp Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 191 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 4 0 0 > 191

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Thr Asn Phe Leu 15 10 15

Val His Ser Ser His Asn Leu Gly Ala Ala Leu Ser Pro Thr Asp Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 192 < 211> 3 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <4 Ο Ο > 192

Cys Asη Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Thr Asn Ph® Leu Val 15 10 15

His Sen San His Asn Lea Gly Ala Ala Lea Pro Sen Thr Asp Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 193 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 193

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Thr Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg S®r Ser His Asn L®u Gly Ala Ala Leu Ser Pro Thr Asp Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 194 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 194

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Thr Asn Pha Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser His Asn Leu Gly Ala lie Leu Pro Pro Thr Asp Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 195 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 0 0 > 195

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Thr Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser His Asn Leu Gly Pro Ala Leu Pro Pro Thr Asp Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 196 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220>

<223> N-term mPEG40KD < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 196

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Vai Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Vai Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 197 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220>

<223> N-term mPEG4QKD < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 Ο Ο > 197

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

Arg $er Ser Assn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 198 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220>

<221> M0D_RES <222> (21) . . (21) < 2 2 3 > Ly8(mPEG40KD) < 2 2 0 > < 2 2 3 > C t e r m NH 2 <400> 198

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Lys Asn Len Gly Pro Val Len Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 199 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético < 2 2 0 > <221> MOD RES <222> (20) . . (20) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 199

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

Arg Ser Ser lys Asn leu Gly Pro Vai leu Pro Pro Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

<210> 200 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético < 2 δ Ο > <221> MOD_RES <222> (26) . . (26) < 2 2 3 > Lys(mPEG4Ο KD) <220> < 2 2 3 > C-1erm NH2 <4QO> 200

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15 V®1 Arg Sar Sar Asn Asn Lan Gly Pro Lya Lan Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Sar Asn Thr Tyr 35 <210> 201 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> MOD_RES <222> ¢25) . . (25) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) <22Q> < 2 2 3 > C-1 erm NH2 < 4 Ο Ο > 201

Cys Asm Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

See Asn Thr Tyr 35

<210> 202 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> M0D__RSS <222> (31) . . (31) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) < 2 z. 0 > <223> C-term NH2 <4Q0> 202

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Val 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 203 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> MOD_RES <222> (30) . . (30) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) <220> < 2 2 3 > C-1erm NH2 <4Q0> 203

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asa Phe Leu Val 15 10 15

Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 204 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 Ο >

<221> MOD_RES <222> (26) . . (26) <223> Lys(mPEG40KD em formato de Y) <220> <223> C-term MH2 <400> 204

Lys Gys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala àsn Phe Leu 15 10 15

Vai Arg Ser Ser Asa Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Ase vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 205 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> M0D_RES <222> (20) , . (20) < 2 z. 3 > Lys (mPEG4 0KD) < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 Ο Ο > 205

Cys Asn Thr Ala Thr Cya Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asa Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Lys Asn Phe Gly Pro He Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

<210> 206 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <221> MOD RES <222> (25) . . (25) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) < 2 z. 0 > <223> C-term NH2 <4Q0> 206

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 207 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> MOD RES <222> (30) . . (30) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) < 2 2 0 > <223> C-term NH2 <400> 207

Cys Asm Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie lieu Pro Pro Thr Lys Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 208 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> MOD__R.ES <222> (25) . . (25) <223> Lys(PEG40KD em formato de Y) < 2 2 0 > <223> C-term MH2 <400> 208

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phs Leu. Vai 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 209 < 211> 3 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 a 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220>

<221> M0DJR.ES < 2 2 2 > (23)..(23) < 2 2 3 > Lys(mPEG40KD) < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 Ο Ο > 209

Cys Asa Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

Hi® $er s®r Agn A®n Phe Ly® Pro II® Leu Pro Pro Thr Agn Val Gly 20 25 30

Ser Asm Thr Tyr 35

< 210 > 210 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220>

<221> MOD RES < 2 2 2 > (24)..(24) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) < 2 z. 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 210

Cys Asm Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn &amp;®n Phe Gly Lye He Leu Pro Pro Thr Asn Vel Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 211 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220>

<221> M0D_RES <222> (26) , . (26) < 2 z. 3 > Lys (mPEG4 OKD) < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 211

Cy® Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Lys Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 212 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (27) . . (27) < 2 2 3 > Lys(mPEG40 KD) <220> <223> C--term NH2 < 4 0 0 > 212

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Pha Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro He Leu lys Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 213 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <221> MOD_RES < 2 2 2 > (28).,(28) < 2 2 3 > Lys(mPEG4 0 KD) <220> <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 213

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Lau Ala Asn Phs Law Val 15 10 15

His Ssr $®r Asn Asn Ph® Gly Pro lie ln®o Pro Lys Thr Asn Val Gly 20 25 30

Sar Asn Thr Tyr 35 < 210 > 214 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <221> MOD_RES <222> (25) . . (25) <223 > Lys(mPEG4OK) < 4 0 0 > 214

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Lau Ala Asn Pha Lan Val 15 ID 15

His San Ser Asn Asn Pha Gly Pro Lys Lao Pro Pro Thr Asn Val Gly 2D 25 3D

Ser Asn Thr Tyr 35

< 210 > 215 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 Q 0 > 215

Thr G!y Gly Gly Gly Ser 1 5

< 210 > 216 < 211> 10 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 216

Thr Gly Gly Gly Gly Sar Gly Gly Gly Sar 15 10 < 210 > 217 < 211> 14

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 217

Thr Gly Sly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 <210> 218 <211> 18

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 218

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 15 10 15

Gly Ser <210> 219 <211> 22

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 0 0 > 219

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 15 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 <210> 220 < 211 > 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 220

Gly Gly Gly Ser Ala Ser 1 5 <210> 221 < 211> 10

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 221

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser 15 10 <210> 222 < 211> 14

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptído sintético <400> 222

Gly Gly Gly S®r Gly Gly Gly S®r Gly Gly Gly S®r Ala S®r 15 10 <210> 223 <211> 18

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 223

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Ala Ser <210> 224 <211> 22

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 224

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Gly Gly Gly Ser Ala Ser 20 <210> 225 < 211 > 8

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 225

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser 1 5

<210> 226 < 211> 12 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético < 4 Ο Ο > 226

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Sar 15 10 <210> 227

< 211> 16 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 227

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser 15 10 15

<210> 228 <211> 20 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 228

Thr Gly Gly Gly Gly Sar Gly Gly Gly S®r Gly Gly Gly S®r Gly Gly 15 10 15

Gly Ala 20 <210> 229

<211> 24 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: péptido sintético <400> 22 9

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 15 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly S®r Ala S®r 20 <210> 2j0 <4Q0> 230 000 <210> 231 <4Q0> 231 000 <210> 232 <400> 232 000 <21Q> 233 <400> 233 000 <210> 234 < 4 Ο Ο > 234 000 <210> 235 <400> 235 000 <210> 236 <400> 236 000 <210> 237 <400> 237 000 <210> 238 < 4 0 0 > 2 3 8 000 <210> 239 <400> 239 000 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <4 Ο Ο > 241 000 <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <400> 243 000 <210> 244 < 4 0 0 > 244 000 <210> 245 < 4 0 0 > 24 5 000 <210> zi46 <400> 246 000 <210> 247 <400> 247 000 <210> 248 < 4 Ο Ο > 248 000 <210> 249 <400> 249 000 <210> 250 <400> 250 000 <210> 251 < 4 0 0 > 2 51 000 <210> 252 <400> 252 000 <210> 253 <400> 253 000 <210> 254 <400> 254 000 <210> 255 < 4 Ο Ο > 255 000 <210> 256 <400> 2 56 000 <210> 257 <400> 257 000 <210> 258 <400> 258 000 <210> 259 < 4 0 0 > 2 5 9 000 <210> 260 <400> 260 000 < 210 > 2 61 <400> 261 000 <210> 262 < 4 Ο Ο > 262 000 <210> 263 <400> 2 63 000 <210> 264 <400> 264 000 <210> 265 < 4 0 0 > 2 6 5 000 <210> 266 <400> 266 000 <210> 267 <400> 267 000 <210> 268 <400> 268 000 <210> 269 < 4 Ο Ο > 269 000 <210> 270 <400> 270 000 <210> 271 <400> 271 000 <210> 272 <400> 272 000 <210> 273 <400> 273 000 <210> 274 <400> 274 000 <210> 275 <400> 275 000 <210> 276 < 4 Ο Ο > 276 000 <210> 277 <400> 277 000 <210> 278 <400> 278 000 <210> 279 <400> 279 000 <210> 280 <400> 280 000 <210> 281 <400> 281 000 <210> 282 <400> 282 000 <210> 283 < 4 Ο Ο > 283 000 <210> 284 <400> 2 84 000 <210> 285 <400> 285 000 <210> 286 <400> 286 000 <210> 287 <400> 287 000 <210> 288 <400> 288 000 <210> 289 <400> 289 000 <210> 290 <400> 290 000 <210> 291 <400> 291 000 <210> 292 <400> 292 000 <210> 293 <400> 293 000 <210> 294 < 4 0 0 > 2 94 000 <210> 295 <400> 2 95 000 <210> 296 <400> 296 000 <210> 297 < 4 Ο Ο > 297 000 <210> 298 <400> 298 000 <210> 299 <400> 299 000 <210> 300 <400> 300 000 <210> 301 <400> 301 000 <210> 302 <400> 302 000 <210> 303 <400> 303 000 <210> 304 <400> 3 04 000 <210> 305 <400> 3 05 000 <210> 306 <400> 306 000 <210> 307 <400> 3 07 000 <210> 308 <400> 308 000 <210> 309 <400> 309 000 < 210 > 310 < 4 0 0 > 310 000 < 210 > 311 < 4 Ο Ο > 311 000 <210> 312 < 4 0 0 > 312 000 < 210 > 313 < 4 0 0 > 313 000 < 210 > 314 < 4 0 0 > 314 000 <210> 315 < 4 0 0 > 315 000 < 210 > 316 < 4 0 0 > 316 000 < 210 > 317 < 4 0 0 > 317 000 < 210 > 318 < 4 Ο Ο > 318 000 <210> 319 < 4 0 0 > 319 000 <210> 320 <400> 320 000 <210> 321 <400> 321 000 <210> 322 <400> 322 000 <210> 323 <400> 323 000 <210> 324 <400> 324 000 <210> 325 < 4 Ο Ο > 325 000 <210> 326 <400> 326 000 <210> 327 <400> 327 000 <210> 328 <400> 328 000 <210> 329 <400> 329 000 <210> 330 <400> 33 0 000 <210> 331 <400> 331 000 <210> 332 < 4 Ο Ο > 332 000 <210> 333 <400> 333 000 <210> 334 <400> 334 000 <210> 335 <400> 335 000 <210> 336 <400> 336 000 <210> 337 <400> 33 7 000 <210> 338 <400> 338 000 <210> 339 < 4 Ο Ο > 339 000

<210> 34Q <400> 340 000 <210> 341 <400> 341 000 <210> 342 <400> 342 000 <210> 343 <400> 343 000 <210> 344 <400> 344 000 <210> 345 <400> 345 000 <210> 346 < 4 Ο Ο > 346 000 <210> 347 <400> 347 000 <210> 348 <400> 348 000 <210> 349 <400> 349 000 <210> 350 <400> 350 000 <210> 351 < 4 0 0 > 3 51 000 <210> 352 <400> 352 000 <210> 353 < 4 Ο Ο > 353 000 <210> 354 <400> 3 54 000 <210> 355 <400> 355 000 <210> 356 <400> 3 56 000 <210> 357 <400> 357 000 <210> 358 <400> 3 58 000 <210> 359 <400> 359 000 <210> 360 <400> 360 000 <210> 361 <400> 361 000 <210> 362 <400> 362 000 <210> 363 <400> 363 000 <210> 364 < 4 0 0 > 3 64 000 <210> 365 <400> 365 000 <210> 366 <400> 366 000 <210> 367 < 4 Ο Ο > 367 000 <210> 368 <400> 368 000 <210> 369 <400> 369 000 <210> 370 <400> 3 70 000 <210> 371 <400> 371 000 <210> 372 <400> 372 000 <210> 373 <400> 373 000 <210> 374 <4 Ο Ο > 3 74 000 <210> 375 <400> 3 75 000 <210> 376 <400> 376 000 <210> 377 <400> 3 77 000 <210> 378 <400> 378 000 <210> 379 <400> 379 000 <210> 380 <400> 380 000 <210> 381 < 4 Ο Ο > 381 000 <210> 382 <400> 382 000 <210> 383 <400> 383 000 <210> 384 <400> 384 000 <210> 385 <400> 385 000 <210> 386 <400> 386 000 <210> 387 <400> 387 000 <210> 388 < 4 Ο Ο > 388 000 <210> 389 <400> 389 000 <210> 390 <400> 390 000 <210> 391 <400> 391 000 <210> 392 <400> 392 000 <210> 393 <400> 393 000 <210> 394 <400> 394 000 <210> 395 < 4 Ο Ο > 395 000 <210> 396 < 4 0 0 > 3 96 000 <210> 397 <400> 397 000 <210> 398 <400> 398 000 <210> 399 <400> 399 000 <210> 400 <400> 400 000 <210> 401 <400> 401 000 <210> 402 <400> 402 000 <210> 403 <400> 403 000 <210> 4 04 <400> 404 000 <210> 405 < 4 0 0 > 4 05 000 <210> 406 <400> 406 000 <210> 407 <400> 407 000 <210> 408 <400> 408 000 <210> 409 <400> 4 09 000

<210> 41Q < 4 0 0 > 410 000 < 210 > 411 < 4 0 0 > 411 000 <210> 1 ζ. < 4 0 0 > 412 000 <210> 413 < 4 0 0 > 413 000 < 210 > 414 < 4 0 0 > 414 000 < 210 > 415 < 4 0 0 > 415 000 < 210 > 416 < 4 Ο Ο > 416 000 <210> 41/ < 4 0 0 > 417 000 < 210 > 418 < 4 0 0 > 418 000 < 210 > 419 < 4 0 0 > 419 000 <210> 420 <400> 42 0 000 <210> 421 <400> 421 000 <210> 422 <400> 422 000 <210> 423 < 4 Ο Ο > 423 000 <210> 424 <400> 424 000 <210> 425 <400> 425 000 <210> 426 <400> 426 000 <210> 427 <400> 42 7 000 <210> 428 <400> 428 000 <210> 429 <400> 429 000 <210> 430 <400> 4 30 000 <210> 4_ί1 <400> 431 000 < 210 > 4 32 <400> 432 000 <210> 433 < 4 0 0 > 4 33 000 <210> 434 <400> 434 000 <210> 435 <400> 43 5 000 <210> 436 <400> 436 000 <210> 437 < 4 Ο Ο > 437 000 <210> 4_ί8 <400> 438 000 <210> 439 <400> 439 000 <210> 440 < 4 0 0 > 44 0 000 <210> 441 <400> 441 000 <210> 442 <400> 442 000 <210> 443 <400> 443 000 <210> 444 < 4 Ο Ο > 444 000 <210> 445 <400> 445 000 <210> 446 <400> 446 000 <210> 447 < 4 0 0 > 44 7 000 <210> 448 <400> 448 000 <210> 449 <400> 449 000 <210> 450 <400> 450 000 <210> 451 < 4 Ο Ο > 4 51 000 <210> 452 <400> 452 000 <210> 4 53 <400> 453 000 <210> 454 < 4 0 0 > 4 54 000 <210> 455 <400> 455 000 <210> 456 <400> 456 000 <210> 457 <400> 457 000 <210> 458 < 4 Ο Ο > 4 58 000 <210> 459 <400> 459 000 <210> 4 60 <400> 460 000 <210> 461 < 4 0 0 > 4 61 000 <210> 462 < 4 0 0 > 4 62 000 <210> 463 <400> 463 000 < 210 > 4 64 <400> 464 000 <210> 465 < 4 Ο Ο > 4 6 5 000 <210> 466 <400> 466 000 <210> 467 <400> 467 000 <210> 468 < 4 0 0 > 4 6 8 000 <210> 469 < 4 0 0 > 4 6 9 000 <210> 470 <400> 470 000 <210> 471 <400> 471 000 <210> 472 < 4 Ο Ο > 472 000 <210> 473 <400> 473 000 <210> 4 74 <400> 4 74 000 <210> 475 <400> 475 000 <210> 476 <400> 476 000 <210> 477 <400> 477 000 <210> 478 <400> 478 000 <210> 479 < 4 Ο Ο > 479 000

<210> 4 8Q <400> 480 000 < 210 > 4 81 <400> 481 000 <210> 482 < 4 0 0 > 4 82 000 <210> 483 <400> 483 000 <210> 484 <400> 484 000 <210> 485 <400> 485 000 <210> 486 < 4 Ο Ο > 486 000 <210> 487 <400> 487 000 <210> 4 88 <400> 488 000 <210> 489 <400> 489 000 <210> 490 <400> 490 000 <210> 491 <400> 491 000 <210> 492 <400> 492 000 <210> 493 < 4 Ο Ο > 4 93 000 <210> 494 <400> 4 94 000 <210> 4 95 <400> 495 000 <210> 496 <400> 496 000 <210> 497 <400> 497 000 <210> 498 <400> 498 000 <210> 499 <400> 499 000 <210> 500 <400> 500 000 <210> 501 <400> 501 000 <210> 502 <400> 502 000 <210> 503 <400> 503 000 <210> 504 <400> 504 000 <210> 505 <400> 505 000 <210> 506 <400> 506 000 <210> 507 <400> 507 000 <210> 508 <400> 508 000 <210> 509 <400> 509 000 < 210 > 510 < 4 0 0 > 510 000 <210> 511 < 4 0 0 > 511 000 < 210 > 512 < 4 0 0 > 512 000 < 210 > 513 < 4 0 0 > 513 000 < 210 > 514 < 4 Ο Ο > 514 000 <210> 515 < 4 0 0 > 515 000 < 210 > 516 < 4 0 0 > 516 000 < 210 > 517 < 4 0 0 > 517 000 <210> 518 < 4 0 0 > 518 000 < 210 > 519 < 4 0 0 > 519 000 <210> 520 <400> 520 000 <210> 521 <4 Ο Ο > 521 000 <210> 522 <400> 522 000 <210> 523 <400> 523 000 <210> 524 <400> 524 000 <210> 525 <400> 525 000 <210> 526 <400> 526 000 <210> 527 <400> 527 000 <210> 528 < 4 Ο Ο > 528 000 <210> 529 <400> 529 000 <210> 530 <400> 530 000 <210> 531 <400> 531 000 <210> 532 <400> 532 000 <210> 533 <400> 533 000 <210> 534 <400> 534 000 <210> 535 < 4 Ο Ο > 53 5 000 <210> 536 <400> 536 000 <210> 537 <400> 537 000 <210> 538 <400> 538 000 <210> 539 <400> 539 000 <210> 540 <400> 54 0 000 <210> 541 <400> 541 000 <210> 542 < 4 Ο Ο > 54 2 000 <210> 543 <400> 54 3 000 <210> 544 <400> 544 000 <210> 545 <400> 545 000 <210> 546 <400> 54 6 000 <210> 547 <400> 54 7 000 <210> 548 <400> 548 000 <210> 549 < 4 Ο Ο > 549 000 <210> 550 <400> 550 000 <210> 551 <400> 551 000 <210> 552 <400> 552 000 <210> 553 <400> 553 000 <210> 554 <400> 554 000 <210> 555 <400> 555 000 <210> 556 < 4 Ο Ο > 556 000 <210> 557 <400> 557 000 <210> 558 <400> 558 000 <210> 55 9 <400> 55 9 000 <210> 560 < 4 0 0 > 56 0 000 <210> 561 <400> 561 000 <210> 562 <400> 562 000 <210> 563 < 4 Ο Ο > 563 000 <210> 564 <400> 564 000 <210> 565 <400> 565 000 <210> 566 <400> 566 000 <210> 567 <400> 567 000 <210> 568 <400> 568 000 <210> 569 <400> 569 000 <210> 570 <400> 570 000 <210> 571 <400> 571 000 <210> 572 <400> 572 000 <210> 573 <400> 573 000 <210> 574 <400> 574 000 <210> 575 <400> 575 000 <210> 576 <400> 576 000 <210> 577 < 4 Ο Ο > 577 000 <210> 578 <400> 578 000 <210> 579 <400> 579 000 <210> 580 <400> 580 000 <210> 581 <400> 581 000 <210> 582 <400> 582 000 <210> 583 <400> 583 000 <210> 584 <4 Ο Ο > 584 000 <210> 585 <400> 585 000 <210> 586 <400> 586 000 <210> 587 <400> 587 000 <210> 588 <400> 588 000 <210> 589 <400> 589 000 <210> 590 <400> 590 000 <210> 591 < 4 Ο Ο > 591 000 <210> 592 <400> 592 000 <210> 593 <400> 593 000 <210> 594 <400> 594 000 <210> 595 <400> 595 000 <210> 596 <400> 596 000 <210> 597 <400> 597 000 <210> 598 < 4 Ο Ο > 598 000 <210> 599 <400> 599 000 <210> 600 <400> 600 000 <210> 601 <400> 601 000 <210> 602 <400> 602 000 <210> 603 <400> 603 000 <210> 604 <400> 604 000 <210> 605 <400> 605 000 <210> 606 <400> 606 000 <210> 607 <400> 607 000 <210> 608 <400> 608 000 <210> 609 <400> 609 000 < 210 > 610 < 4 0 0 > 610 000 < 210 > 611 < 4 0 0 > 611 000 < 210 > 612 < 4 Ο Ο > 612 000 <210> 613 < 4 0 0 > 613 000 < 210 > 614 < 4 0 0 > 614 000 < 210 > 615 < 4 0 0 > 615 000 <210> 616 < 4 0 0 > 616 000 < 210 > 617 < 4 0 0 > 617 000 < 210 > 618 < 4 0 0 > 618 000 < 210 > 619 < 4 Ο Ο > 619 000 <210> 62 0 <400> 620 000 <210> 621 <400> 621 000 <210> 622 <400> 622 000 <210> 623 <400> 623 000 <210> 624 <400> 624 000 <210> 625 <400> 625 000 <210> 626 < 4 Ο Ο > 626 000 <210> 627 <400> 627 000 <210> 628 <400> 628 000 <210> 629 <400> 629 000 <210> 630 <400> 630 000 <210> 631 <400> 631 000 <210> 632 <400> 632 000 <210> 633 < 4 Ο Ο > 633 000 <210> 634 <400> 634 000 <210> 635 <400> 635 000 <210> 636 <400> 636 000 <210> 637 <400> 637 000 <210> 638 <400> 638 000 <210> 639 <400> 639 000 <210> 640 <400> 640 000 <210> 641 <400> 641 000 <210> 642 <400> 642 000 <210> 643 <400> 643 000 <210> 644 < 4 0 0 > 644 000 <210> 645 <400> 645 000 <210> 646 <400> 646 000 <210> 647 < 4 Ο Ο > 647 000 <210> 648 <400> 648 000 <210> 649 <400> 649 000 <210> 650 <400> 650 000 <210> 651 <400> 651 000 <210> 652 <400> 652 000 <210> 653 <400> 653 000 <210> 654 <4 Ο Ο > 6 54 000 <210> 655 <400> 6 55 000 <210> 656 <400> 656 000 <210> 657 <400> 657 000 <210> 658 <400> 658 000 <210> 659 <400> 659 000 <210> 660 <400> 660 000 <210> 661 < 4 Ο Ο > 661 000 <210> 662 <400> 662 000 <210> 663 <400> 663 000 <210> 664 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 664

Met Val Pro lie Gin lys Val Gin Asp Asp Thr lys Thr leu lie lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Gin Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp

65 70 75 SO

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 $0 95

Cys Ser Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Giu Ser Leu Gly 100 105 110

Glu Val Leu Gl\i Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 665 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 665

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Pha He Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 666 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <400> 666

Met Val Pro ϊΐθ Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Ley He Lys 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phs lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Lee Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Law Gly Asn Leu Arg Asp Lay Leu His Val Lay Al® Pha Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Lay Pro Gin Al® Sar Gly Lay Gly Thr Ley Asp Ser Lay Gly 100 105 110

Glu Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Ley Gin Gly Ser Ley Gin Asp He Ley Gin Gin Ley Asp Ley Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 <21G> 667 <211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 4 Ο Ο > 667

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys 15 ID 15

Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys val Thr Gly Lee Asp Phe He Pro Gly Lee His Pro 35 40 45

He Lee Thr Lee Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ale Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Lee Glu Asn Leu Arcr Asp Lee Leu His Val Lee Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Lee Pro Gin Ala Ser Gly Lee Glu Thr Leu Asp Ser Lee Gly 100 105 110

Glu Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gin Lee Asp Lee Ser 130 135 140

Pro Glu Gy® 145 <210> 668 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <400> 668

Met Val Pro lie Gin Lys V®1 Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 I Is Leu Thr Leu Ssr Lys Mat Asp Gin Thr 'Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp lie Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 669 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 669

Mat Val Pro lie Gin Lye Yal Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Yal Thr Arg lie Asa Asp lie Ser His Thr Gin Ser Yal Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Yal Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80 leu Glu Asn leu Arg Asp leu leu His Val leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His leu Pro Gin Ala Ser Gly leu Glu Thr Leu Asp Ser leu Gly 100 105 HO

Glu Yal leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Yal Val Ala leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gin leu Asp Val Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 670 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 670

Met val Pro li® Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lem il® Lys 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Asa Asp He Ser His Thr Gift Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Fh® Π® Fro Gly L®u His Fro 35 40 45 II® L®u Thr L®u Ser Lys Met Asp Gift Thr Lew Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Axg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 SO 95

Cys Ser Leu Pro Gift Thr Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg L®u Gift Gly Ser L®u Gift Asp He L®u Gift Gin Leu Asp Leu S®r 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 671 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 671

Met Vai Pro He Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp He Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin He Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly 100 105 110

Glu Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 672 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 δ Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 672

Met Vai Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr II® Val Thr Arg II® Asn Α®ρ XI® S®r Hi® Thr Gin S®r Val S®r 20 25 30 S®r Lys Gin Lys Val Thr Gly L®u Asp Ph® XI® Pro Gly L®u Hi® Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro S®r Arg Asn Val 11® Gin 11® Ser Asn Asp 65 70 75 80 L®u Glu Asn Leu Arg Asp L®u Leu His Val L®u Ala Ph® Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val L®u Glu Ala $®r Gly Tyr S®r Thr Glu Val Val Ala L®u $®r 115 120 125

Arg L®u Gin Gly S®r L®u Gin Asp II® L®u Gin Gin L®u Asp L®u $®r 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 673 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 673

Met Vai Pro II® Gin Lys Vai Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie .Lys 15 10 15

Thr lie Vai Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Vai Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Vai Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 II® Leu Thr Leu Ser Ly® Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 II® Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val 11® Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 674 <211> 147

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <4Q0> 6 74

Met Val Pro lie Gin Lye Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr He Val Thr Arg He Asa Asp He Ser His Thr Gla Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gla Lys Val Thr Gly Lee Asp Phe He Pro Gly Lee His Pro 35 40 45

He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gla 50 55 60

He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gla He Ser Asm Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp He Leu Gin Gla Leu Asp Val Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 675 <211> 147

<212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético <4Q0> 675

Met Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lye Gin Lye Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gin lie Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 S5

Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Glu Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 676 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 6 76

Met Val Pro II® Gin Lya Val Gin Asp Asp Thr Lya Thr Leu II® Lya 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp II® Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie L®u Thr L®u Ser Lys Met Asp Gin Thr Lee Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 lie L®u Thr S®r Met Pro Ser Arg Aen Val lie Gin lie S®r Aen Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp S®r Leu Gly 100 105 110

Glu Val Leu Glu Ala $®r Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu $®r 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 <210> 677 < 211> 147

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <400> 677

Met val Pro lie Gin Lye val Gin Asp Asp Thr Lye Thr Leu lie Lye 15 10 15

Thr lie Val Thr Arg lie Aen Asp lie Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Aap Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 II® Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60 II® Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gin II® Ser Asn Asp 65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95

Cys His Leu Pro Gin Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110

Glu val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu val val Ala Leu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Aap Met Leu Gin Gin Leu Aap Leu Ser 130 135 140

Pro Glu Cys 145 <210> 678 < 4 Ο Ο > 678 000 <210> 679 <400> 679 000 <210> 680 <400> 680 000 <210> 681 <400> 681 000 <210> 682 <400> 682 000 <210> 683 <400> 683 000 <210> 684 < 4 0 0 > 6 84 000 <210> 685 < 4 Ο Ο > 685 000 <210> 686 <400> 6 86 000 <210> 687 <400> 687 000 <210> 688 <400> 688 000 <210> 689 <400> 689 000 <210> 690 <400> 690 000 <210> 691 <400> 691 000 <210> 692 < 4 Ο Ο > 692 000 <210> 693 <400> 693 000 <210> 694 <400> 694 000 <210> 695 <400> 695 000 <210> 696 <400> 696 000 <210> 697 <400> 697 000 <210> 698 <400> 698 000 <210> 699 < 4 Ο Ο > 699 000 <210> 700 <400> 700 000 <210> 701 <400> 701 000 <210> 702 <400> 702 000 <210> 703 <400> 703 000 <210> 704 <400> 7 04 000 <210> 705 <400> 705 000 <210> 706 <400> 706 000 <210> 707 <400> 707 000 <210> 708 <400> 708 000 <210> 709 <400> 709 000 <210> 710 < 4 0 0 > 710 000 < 210 > 711 < 4 0 0 > 711 000 < 210 > 712 < 4 0 0 > 712 000 < 210 > 713 < 4 Ο Ο > 713 000 < 210 > 714 < 4 0 0 > 714 000 < 210 > 715 <400> 715 000 < 210 > 716 < 4 0 0 > 716 000 <210> 717 < 4 0 0 > 717 000 < 210 > 718 < 4 0 0 > 718 000 < 210 > 719 < 4 0 0 > 719 000 <210> 720 <400> 720 000 <210> 721 <400> 721 000 <210> 722 <400> 722 000 <210> 723 <400> 723 000 <210> 724 <400> 724 000 <210> 725 <400> 725 000 <210> 726 <400> 726 000 <210> 727 < 4 Ο Ο > 727 000 <210> 728 <400> 728 000 <210> 729 <400> 729 000 <210> 730 <400> 730 000 <210> 731 <400> 731 000 <210> 732 <400> 732 000 <210> 733 <400> 733 000 <210> 734 <4 Ο Ο > 734 000 <210> 735 <400> 735 000 <210> 736 <400> 736 000 <210> 737 <400> 737 000 <210> 738 <400> 738 000 <210> 739 <400> 739 000 <210> 740 <400> 740 000 <210> 741 <4 Ο Ο > 741 000 <210> 742 <400> 742 000 <210> 743 <400> 743 000 <210> 744 <400> 744 000 <210> 745 <400> 74 5 000 <210> 746 <400> 74 6 000 <210> 747 < 4 0 0 > 74 7 000 <210> 748 < 4 Ο Ο > 748 000 <210> 749 <400> 74 9 000 <210> 750 <400> 750 000 <210> 751 <400> 751 000 <210> 752 <400> 752 000 <210> 753 <400> 753 000 <210> 754 < 4 0 0 > 7 54 000 <210> 755 < 4 Ο Ο > 755 000 <210> 756 <400> 756 000 <210> 757 <400> 757 000 <210> 758 <400> 758 000 <210> 759 <400> 75 9 000 <210> 760 <400> 760 000 <210> 761 <400> 761 000 <210> 762 < 4 Ο Ο > 762 000 <210> 763 <400> 763 000 <210> 764 <400> 764 000 <210> 765 <400> 765 000 <210> 766 <400> 766 000 <210> 767 <400> 767 000 <210> 768 <400> 768 000 <210> 769 < 4 Ο Ο > 769 000 <210> 770 <400> 770 000 <210> 771 <400> 771 000 <210> 772 <400> 772 000 <210> 773 <400> 773 000 <210> 774 <400> 7 74 000 <210> 775 <400> 775 000 <210> 776 < 4 Ο Ο > 776 000 <210> 777 <400> 777 000 <210> 778 <400> 778 000 <210> 779 <400> 779 000 <210> 780 <400> 780 000 <210> 781 <400> 781 000 <210> 782 <400> 782 000 <210> 783 < 4 Ο Ο > 783 000 <210> 784 <400> 784 000 <210> 785 <400> 785 000 <210> 786 <400> 786 000 <210> 787 <400> 787 000 <210> 788 <400> 788 000 <210> 789 <400> 789 000 <210> 790 <400> 790 000 <210> 791 <400> 791 000 <210> 792 <400> 792 000 <210> 793 <400> 793 000 <210> 794 <400> 7 94 000 <210> 795 <400> 795 000 <210> 796 <400> 796 000 <210> 797 < 4 Ο Ο > 797 000 <210> 798 <400> 798 000 <210> 799 <400> 799 000 <210> 800 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 z. 0 > <223> Hidrogénio N-term, grupo de capeamento N-term ou um ligante para uma porção química de melhora de duração <220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Pode ou não estar presente < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (21) . . (21) <22.3 > Lys, Cys ou Asn <220>

<221> MOD_RES < 2 2 2 > (24)..(24) <223> Lys, Cys ou Gly < 2 z. 0 > <221> MOD_RES <222> (25) . . (25) <223> Lys, Cys ou Pro <220> <221> MOD_RES <222> (26) . . (26) <223> Lys, Cys ou lie < 2 2 0 >

<221> MOD_RES <222> (27) . . (27) <2^3> Lys, Cys ou Leu <220>

<221> MOD_RES <222> (28) . . (29) <223> Lys, Cys ou Pro <220>

<221> MOD_RES <222> (31) . . (31) <223> Lys, Cys ou Asn < 2 2 0 > <223> alquilamino substituído ou não substituído, dialquilamino substituído ou não substituído, cicloalquilarrd.no substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, aralquilamino <220> <223> cont. desde cima; substituído ou não substituído, alquiloxi substituído ou não substituído, ariloxi substituído ou não substituído, aralquiloxi substituído ou não substituído, hidroxilo ou amino substituído ou não substituído C-terminal <400> 800

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15 ¥ãl HÍ.S X33 A&amp;n Ph€> Xââ X33 Xââ X33 Xââ X33 Thr X33 Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 801 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> < 2 2 3 > C-1erm NH2 <400> 801

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

<210> 802 <211> 37 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <223> C-term NH2 <400> 802

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Sar Lye Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30

Gly Sar Asn Thr Tyr 35

<210> 803 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <223> C-term NH2 <400> 803

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

Arg Ser Ser Lys Asn Leu Gly Pro Vai Leu Pro Pro Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 804 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <223> C-term MH2 <400> 804

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Val Arg Ser Ser Asn Asn Lets Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly $®r Asn Thr Tyr 35

<210> 805 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <223> C-term NH2 <400> 805

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

<210> 806 <211> 37 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <223> C-term NH2 <400> 806

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Vai Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 807 < 211> 3 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <223> C-term MH2 <400> 807

Cys Asn Th r Ala Th r Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Ph@ Leu Vai 15 10 15

Arg Ser Ser Asn Asn Haw Gly Pro Vai Haw Pro Pro Thr Lys vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 808 <211> 37

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipêptido sintético < 2 2 0 > <223> O term NH2 <400> 808

Lys Cys Ãsn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu 15 10 15

Vai His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr Asn Vai 20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr 35

<210> 809 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artifi C Í cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <223> C-term NH2 <400> 809

Gys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

His Ser Sar Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Pro Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

< 210 > 810 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 810

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Sin Arg Lets Ala Asn Phe Leu Val IS 10 15

His Ser Sar Lys Asn Phe Gly Pro He Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 811 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 δ 0 > <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 811

Cys Asn Thr Al® Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Al® Asn Fh® Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 812 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético < 2 2 0 > < 2 2 3 > C t e r m NH 2 <400> 812

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

His Ser Ser Asn Asa Phe Giy Pro He Leu Pro Pro Thr Lys Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 813 < 211> 3 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <223> C-term MH2 < 4 0 0 > 813

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Vai 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Lys Pro lie Leu Pro Pro Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 < 210 > 814 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético < 2 2 0 > < 2 2 3 > C t e r m NH 2 <400> 814

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala. Thr Gin Arg Len Ala Asn Phe Le® Vai 15 10 15

His Ser S®r Asn Asn Phe Gly Lys II® Leia Pro Pro Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 815 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptído sintético <22Q> < 2 2 3 > C-1erm NH2 < 4 Ο Ο > 815

Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser S®r Asn Asn Phe Gly Pro II® Lys Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 S®r Asn Thr Tyr 35 <210> 816 < 211> 3 6

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 z. 0 > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <223> C-term NH2 < 4 0 0 > 816

Cys Asn Thr Ala Thr Cvs Ala Thr Gin Arg leu Ala Asn Phe Leu Val 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro He Leu Lys Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 $®r Asn Thr Tyr 35 <210> 817 <211> 36

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 δ Ο > <223> Descrição de sequência artificial: polipéptido sintético <220> <223> C-term MH2 < 4 0 0 > 817

Cys Asu Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gin Arg Leu Ala Asn Phs Leu Vai 15 10 15

His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro lie Leu Pro Lys Thr Asn Vai Gly 20 25 30

Ser Asn Thr Tyr 35

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição ® US 61387402 B [0001] [0350] ® US 61422091 B [0001] [0350] • WO 9828427 A [0013] [0021] [0022] [0044] [0046] [0053] ® US 2007002084 A [0013] ® US 20070020284 A [0021] [0022] [0044] [0046] [0053] ® US 20080207512 A [0021] [0044] [0121] [0142] [0178] ® US 6309853 B [0021] [0022] ® US 7183254 B [0021] ® WO 96005309 A [0021] [0022] ® WO 2009064298 A [0021] [0044] [0121] ® US 5594101 A [0022] ® US 5851995 A [0022] ® US 5691309 A [0022] ® US 5580954 A [0022] ® US 5554727 A [0022] ® US 5552523 A [0022] ® US 5559208 A [0022] ® US 5756461 A [0022] ® WO 9623517 A [0022] ® WO 2004039832 A [0022] ® WO 9855139 A [0022] ® WO 9812224 A [0022] ® WO 9702004 A [0022] ® WO 2009016043 A [0025] [0027] [0029] [0036] [0040] [0081] [0287] • US 4179337 A, Davis [0053] [0168] [0170] ® US 5824784 A [0056] • US 5824778 A [0056] ® EP 0401384 A [0068] ® WO 2000024782 A [0075] ® US 6872700 B [0088] ® WO 2007139941 A [0088] ® WO 2007140284 A [0088] • WO 2008082274 A [0088] • WO 2009011544 A [0088] • US 20070238669 A [0088] • WO 8304053 A [0092] • US 6326468 B [0110] • US 6319685 B [0111] • WO 2006083254 A [0145] • WO 2007114838 A [0145] • US 5686411 A [0147] • US 20080176804 A [0147] • US 20080274952 A [0147] • WO 2010085700 A [0151] • US 20080032408 A [0168] • US 4002531 A [0170] • WO 2007104789 A [0175] • WO 2009034119 A [0175] • WO 2010046357 A [0175] • US 6530886 B [0186] • US 4572208 A [0197] • US 4856531 A [0197] • US 6468222 B [0197] • US 6616615 B [0197] • US 6013009 A [0197] • US 6475158 B [0197] • US 6864415 B [0201] • US 6850797 B [0201] • US 6487445 B [0201] • US 6368630 B [0274] ® US 6379704 B [0274] ® US 5766627 A [0274] ® US 6379703 B [0274] ® US 6296842 B [0274] ® US 2011053786 W [0350]

Documentos de não patente citados na descrição ® SMITH; WATERMAN, the local homology algorithm. Adv. Appl. Math., 1981, vol. 2, 482 [0015] ® NEEDLEMAN ; WUNSCH. the homology alignment algorithm. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 [0015] • PEARSON ; LIPMAN. he search for similarity method. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 2444 [0015] • Current Protocols in Molecular Biology. 1995 [0015] ® ALTSCHUL et al. Nuci. Acids Res., 1977, vol. 25, 3389- 3402 [0015] ® ALTSCHUL et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0015] ® HENJKOFF; HENIKGFF. Proc. Natl. Acad. Sci . USA., 1989, vol. 89, 10915 [0015] ® LO et al. Protein Eng. Design &amp; Selection, 2005, vol. 18, 1-10 [0023] • Mutational, approach to improve physical stability of protein therapeutics susceptible to aggregation: Role of altered conformation in irreversible precipitation. RICCI et al. Book Chapter. In: MISBEHAVING PROTEINS: PROTEIN (MIS)FOLDING, AGGREGATION, AND STABILITY. Springer, 2006, 331-350 [0023] ® JONSSON et al. Protein Eng. Design &amp; Selection, 2008, vol. 21, 515-527 [0025] ® PETERS T. Advances in Protein Chemistry, 1985, vol. 37, 161 [0041] ® MCCURDY TR et al. J. Lab. Clin. Med., 2004, vol. 143, 115 [0041] • DUGAICZYK L et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 19 82, vol. 79, 71 [0041] ® NICHOLSON JP et al. Br J Anaesth, 2 000, vol. 85, 599 [0041] ® HE XM I CARTER DC. Nature, 1992, vol. 358, 209 [0041] • SHEFFIELD WP. Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol. Discord., 2001, vol. 1, 1 [0041] • MURAKAMI et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, vol. 209, 944-952 [0044] • ABUCHOWSKI et al. ENZYMES AS DRUGS. 1981, 367-383 [0053] • Radioimmunoassay and related methods. A. E. BOLTON ; W. M. HUNTER. HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUME I, IMMUNOCHEMISTRY. Blackwell Scientific Publications, 1986 [0059] • SANDBERG et al. J. Med. Chem. , 1998, vol. 41, 2481-91 [0062] ® MALIK et al. Exp. Hematol., 1992, vol. 20, 1028-1035 [0068] • Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430a Peptide

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Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipéptido manipulado que compreende: um polipéptido de domínio de ligação à albumina (ABD) que compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) que compreende a sequência de aminoãcidos: GVSD X5 YK X8 Xg I Xu X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO: 34), em que, independentemente uns dos outros, Xs é selecionado de entre Y e F; X8 é selecionado de entre N, R e S; X9 é selecionado de entre V, I, L, M, F e Y; Xn é selecionado de entre N, S, E e D; X12 é selecionado de entre R, K e N; X]4 é selecionado de entre K e R; X20 é selecionado de entre D, N, Q, E, H, S, R e K; X23 é selecionado de entre K, I e T; X24 ê selecionado de entre A, S, T, G, H, L e D; e X25 é selecionado de entre H, E e D; e um primeiro domínio de hormona de péptido (HD1) que tem uma sequência de aminoãcidos selecionada de entre: (a) SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 , SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID MO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID IMO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, aminoãcidos 2 a 14 7 de SEQ ID NO: 31 e aminoãcidos 2 a 147 de SEQ ID NO:33; ou (b) a sequência de aminoãcidos 1 a 14 6 de urna leptina selecionada de entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID MO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22 SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :14 4, SEQ ID NO :145 e SEQ ID NO :14 6; etn que ’dm aminoãcido diferente é substituído numa ou ma is das seguintes posições e retêm a mesma numeração (mesmo na ausência de um resíduo de glutaminilo na posição 28) : 4, 32, 33, 35,50,64,68,71,74,77,78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145; (c) a sequência de aminoácidos da subparte (b) na qual o resíduo de glutaminilo na posição 28 está ausente; (d) a sequência de aminoácidos das subpartes (b) ou (c) nas quais um resíduo de metionilo é adicionado à terminação N; (e) uma leptina que consiste num fragmento da sequência de aminoácidos de (b), (e) ou (d) selecionada de entre: i) aminoácidos 98 a 14 6; ií) aminoácidos 1 a 32; iii) aminoácidos 40 a 116; iv) aminoácidos 1 a 99 e 112 a 146; v) aminoácidos 1 a 9 9 e 112 a 14 6, em que um ou ma is cgs aminoácidos 100 a 111 sâG colocados entre aminoácidos 99 e 112; vi) a sequência de aminoácidos da subparte (i) , em que um ou mais dos aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 sâo substituídos por outro aminoácido; vii) a sequência de aminoácidos da subparte (ii), em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8 e 32 são substituídos por outro aminoácido; viii) a sequência de aminoácidos da subparte (iii), em que um ou mais dos aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 e 112 são substituídos por outro aminoácido; ix) a sequência de aminoãcídos da subparte (iv) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido; e x) a sequência de aminoácidos da subparte (v), em que um ou mais dos aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoâcídG; xi) a sequência de aminoácidos de qualquer uma das subpartes (i) a (x), em que uma metionina foi adicionada na terminação N; (f) a sequência de aminoácidos de qualquer uma das subpartes (b) a (e) , em que a referida sequência de aminoácidos é fixada a urna porção química; (g) a sequência de aminoácidos da subparte (f) em que a referida porção química ê uma porção química de polímero solúvel em água; (h) a sequência de aminoácidos da subparte (g), em que a referida porção química de polímero solúvel em água é selecionada de entre: polietilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol/propilenoglicol, uma carboximetilcelulose, um dextrano, um álcool polivinílico, uma polivinil pirrolidona, um poli-1,3-dioxolano, um poli-1,3,6 -trioxano, um copolímero de etileno/anidrido maleico, um homopolímero de poliaminoãcido, um copolímero aleatório de poliaminoãcido, uma albumina, uma proteína Fc, um poli(n-vinilpirrolidona)polietilenoglícGl, um homopolímero de propilenoglicol, um óxido de polipropileno/óxido de etileno, um poliol polioxietílado, um álcool pGlívinílico, um polietilenoglicol propionaldeído, um succinato e em estireno; (i) a sequência de aminoãcidos da subparte (h), em que a referida porção química de polímero solúvel em água é um polietilenoglicol; e (j) a sequência de aminoãcidos da subparte (h), em que o referido polímero solúvel em água é um poliaminoãcido selecionado de entre: uma albumina, um anticorpo, uma proteína Fc e uma porção química de polilisina; e um primeiro ligante (Ll) ligado covalentemente ao referido HD1, sendo que o referido ligante compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada de entre Gly-Gly-Gly, [Gly-Ser] n-, [ G l y - G l y - S e r ] n <, [Gly-Gly-Gly-Ser]n e [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
2. 2. Polipêptido manipulado, de acordo com a reivindicação 1, em que o HD1 tem uma sequência selecionada de entre as sequências da subparte (a).
3. 3. Polipêptido manipulado, de acordo com a reivindicação 2, em que o referido polipêptido manipulado compreende o referido ABD como uma porção química N-terminal e o referido HD1 como uma porção química C-terminal.
4. 4. Polipêptido manipulado, de acordo com a reivindicação 2, em que o referido polipêptido manipulado compreende o referido ABD como uma porção química C-terminal e o referido HD1 como uma porção química N-terminal.
5. 5. Polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido HD1 tem uma sequência de aminoãcidos selecionada de entre: SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, aminoãcidos 2 a 14 7 da SEQ ID NO :31 e aminoãcidos 2 a 14 7 da SEQ ID NO :33.
6. 6. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido HD1 tem uma sequência de aminoãcidos selecionada de entre: SEQ ID NO:26, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO:33 e aminoãcidos 2 a 147 da SEQ ID NO :33.
7. 7. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reiv.indicações 1 a 6, em que, independentemente uns dos outros, X5 ê Y; X8 é N; X23 e T ou. I; Λ24 e S ou L; e X25 ê E ou H.
8. 8. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o motivo de ligação à albumina compreende uma sequência de aminoãcidos que é selecionado de entre: GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO :114) e GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO :115).
9. 9. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o referido ABD compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) que não é GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO :35) .
10. 10. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o polipéptido de domínio de ligação à albumina (ABD) compreende uma sequência de aminoãcidos que é selecionado de entre: LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:50); e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO:51).
11. 11. Polipéptido manipulado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoãcidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO :36) em que [ABM] é o motivo de ligação à albumina e, independentemente uns dos outros, Xa é selecionado de entre V e E; Xb ê selecionado de entre L, E e D; Xc é selecionado de entre N, L e I; Xd é selecionado de entre R e K; Xe é selecionado de entre D e K; a leucina na posição 45 está presente ou ausente; e a prolina na posição 46 está presente ou ausente.
12. 12. Polipéptido manipulado, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ABD compreende uma sequência de aminoãcidos que tem pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoãcidos que é selecionada de entre: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41, SEQ ID NO :43, SEQ ID MO :44, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO:52.
13. 13. Polipéptido manipulado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido ABD compreende qualquer um dos péptidos selecionados de entre: LAEAKVLANRE LDKYGVS D FYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID NO:3 9) , LAEAKVLANRE LDKYGVS DYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO :4 0) , LAEAKVLANRE LDKY GV S DYYKN11NRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO :41), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO :43) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO :44) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO :45), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID NO :47), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO :48) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO :49), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:50), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALi selLAALP (SEQ ID NO:51) e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO:52).
14. 14. Polipéptido manipulado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO:49.
15. 15. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o referido ligante LI é um pêptido com 1 a 3 0 aminoãcidos ou menos do que 3 0 aminoãcidos.
16. 16. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o referido ligante LI compreende um dipéptido TG N-terminal , ou um dipéptido AS C-terminal, ou ambos.
17. 17. Polipéptido manipulado, de acordo corn qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o referido ligante LI compreende uma sequência de amínoãeidos que é selecionada de entre: TG-(GGGS);l (SEQ ID NO: 215), TG-(GGGS)2 (SEQ ID NO: 216), TG (GGGS)3 (SEQ ID NO: 217), TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO: 218), TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 219), (GGGS) r-AS (SEQ ID NO: 220), (GGCS)2-AS (SEQ ID NO: 221), (GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 222), (GGGS) 4-AS (SEQ ID NO: 223), (GGGS) 5-AS (SEQ ID NO: 224), TG - (GGGS) 1 - AS (SEQ ID NO: 225), TG- (GGGS) 2-AS (SEQ ID NO: 226), TG- (GGGS) 3-AS (SEQ ID NO: 227), TG- (GGGS) 4-AS (SEQ ID NO: 228) e TG-(GGGS)s-AS (SEQ ID MO: 22 9) .
18. 18. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o referido polipéptido manipulado compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de entre: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :56, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :62, SEQ ID NO :63, SEQ ID NO :64, SEQ ID NO :65, SEQ ID NO :66, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :69, SEQ ID NO :70, SEQ ID NO :71, SEQ ID NO :72, SEQ ID NO :73, SEQ ID NO :74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO :76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO :78, SEQ ID NO :79, SEQ ID NO :80, SEQ ID NO :81, SEQ ID NO :82, SEQ ID NO :83, SEQ ID NO :84, SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO :86, SEQ ID NO :87, SEQ ID NO :88, SEQ ID NO :89, SEQ ID NO :90, SEQ ID NO :91, SEQ ID NO :92, SEQ ID NO :93, SEQ ID NO :94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO :96, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO :98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO :100, SEQ ID NO :101, SEQ ID NO :102, SEQ ID NO :103, SEQ ID NO :104, SEQ ID NO :105, SEQ ID NO :106 e SEQ ID NO :107.
19. 19. Polipéptido manipulado, de acordo com a reivindicação 18, em que o referido polipêptido manipulado compreende uma sequência de aminoãciidos selecionada de entre: SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO :61.
20. 20. Polipêptido manipulado, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido HD1 tem uma sequência selecionada de entre as sequências nas subpart.es (b) a (j).
21. 21. Polipêptido manipulado, de acordo com a reivindicação 20, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada de entre: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO:145 e SEQ ID NO:146; em que uma ou mais substituições de aminoãcidos foram feitas.
22. 22. Polipêptido manipulado, de acordo corn a reivindicação 19, em que o referido EDI é a SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :14 5 ou SEQ ID NO :14 6.
23. 23. Polipêptido manipulado, de acordo com a reivindicação 20, em que o referido HD1 é a SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO :33, em que uma ou mais substituições de aminoãcidos foram feitas.
24. 24. Polipêptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO:49.
25. 25. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio num sujeito.
26. 26. Polipéptido manipulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio selecionado de entre lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hipotalamica, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes (incluindo tipo I e tipo II) , esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), síndrome metabólica X e doença de Huntington.
27. 27. Polipéptido manipulado para utilização, conforme definido na reivindicação 26, em que a referida doença ou distúrbio ê lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes.
28. 28. Composição farmacêutica que compreende um polipéptido manipulado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
29. 29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica ínjetável.
30. 30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica de libertação prolongada ou de longa duração.
31. 31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, para utilização no tratamento de lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hípotalâmíca, doença de Alzheimer, deficiência em leptina, doença hepática gordurosa, diabetes (incluindo tipo I e tipo II) , esteato-hepatite não alcoólica (NASH) , doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) ou síndrome metabólica X.
32. 32. Combinação de pelo menos dois agentes antiobesidade diferentes para utilização no tratamento de obesidade num sujeito, em que pelo menos um agente antiobesidade é um conjugado de amilina com polietilenoglicol (PEG) e pelo menos um agente antiobesidade é um polipéptido manipulado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24 .
33. 33. Utilização não terapêutica de uma combinação de pelo menos dois agentes antiobesidade diferentes na redução de peso corporal num sujeito, em que pelo menos um agente antiobesidade é um conjugado de amilina com polietilenoglicol (PEG) e pelo menos um agente antiobesidade é um polipéptido manipulado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.