CN103403019B - 具有增强的作用持续时间的工程化多肽 - Google Patents

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Abstract

提供了具有良好的作用持续时间、高效力和/或方便的剂量给药方案等的化合物，所述剂量施用方案包括每周一次施用。所述化合物是工程化多肽，其中掺有与一种或多种生物学活性多肽组合的清蛋白结合域。还提供了针对疾病和病症的药物组合物和治疗方法，所述疾病和病症包括脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、阿耳茨海默氏病、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病或糖尿病(包括I型和II型)。可以通过本文中所描述的化合物和方法治疗的其它疾病和病症包括非酒精性脂肪肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨廷顿氏病。

Description

具有增强的作用持续时间的工程化多肽
对相关申请的交叉引用
本申请要求2010年9月28日提交的美国申请No.61/387,402和2010年12月10日提交的美国申请No.61/422,091的优先权，其公开内容通过提述并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式经EFS-Web提交的序列表，在此通过提述完整并入本文。2011年10月27日创建的所述ASCII拷贝命名为1317WO2.txt且大小为273,524字节。
发明背景
本申请涉及具有良好的作用持续时间、高效力和/或包括口服施用在内的方便的剂量给药方案的化合物及其使用方法。本文中提供了工程化多肽，其中掺有与生物学活性肽组合的清蛋白结合域。不希望受任何理论束缚，认为由于本文中描述的工程化多肽可以结合清蛋白，因此所述化合物在循环中时可以被扣留(例如结合至清蛋白)，从而由于例如降低的肾清除和/或降解而导致延长的作用持续时间。适合于这类治疗的疾病包括脂肪营养不良(lipodystrophy)、血脂障碍(dyslipidemia)、高脂血(hyperlipidemia)、超重(overweight)、肥胖症(obesity)、下丘脑性闭经(hypothalamic amenorrhea)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、瘦蛋白缺陷(leptin deficiency)、脂肪肝病(fatty liverdisease)、糖尿病(diabetes)(包括I型和II型)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis)(NASH)、非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease)(NAFLD)、代谢综合征X(metabolic syndrome X)和亨廷顿氏病(Huntington’s Disease)、或其组合。
仍然需要开发可用于上文所描述的代谢疾病、状况和病症的多肽。因而，本发明的一个目的在于提供可用于治疗上述状况的具有延长的半衰期的工程化多肽及其生成和使用方法。
本文中引用的每篇专利、专利申请和出版物通过提述据此完整并入本文中并用于所有目的。
发明概述
提供了具有对清蛋白的结合亲和力和别的治疗效用的工程化多肽化合物。所述化合物是工程化多肽，其包含能够结合清蛋白的清蛋白结合域(ABD)多肽和与ABD共价连接的激素域(HD)多肽，该HD多肽可以是生物学活性的，并且可以引发有益的生物学应答。任选地，可以在工程化多肽中经由接头L(例如如本文中描述的L1)共价键合本文中描述的任何ABD或HD多肽。不希望受任何理论束缚，认为由于本文中描述的工程化多肽可以结合清蛋白，因此所述化合物在受试者中可以被扣留，从而导致在受试者中延长的作用持续时间。
在第一个方面，提供了如本文中描述的工程化多肽。所述工程化多肽包含清蛋白结合域多肽(ABD)和激素域(HD1)。所述激素域包含多肽，该多肽为瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段。
在另一个方面，提供了用于在需要治疗的受试者中治疗疾病或病症的方法。所述方法包括对受试者施用如本文中描述的工程化多肽。
在又一个方面，提供了包含与药学可接受赋形剂组合的本文中描述的工程化多肽化合物的药物组合物。
在又一个方面是编码所述工程化多肽及其中间体的多核苷酸、携带这类多核苷酸的表达载体、表达这类多核苷酸的宿主细胞、以及用于其表达、合成、翻译后修饰和分离的手段。
附图简述
图1A-1B绘出了对瘦大鼠施用后单次施用如本文中描述的工程化多肽对食物摄取和体重的影响，如实施例3中描述的。图1A：食物摄取。图1B：体重变化(%经媒介物校正的)。图例：媒介物(框)；2.6mg/kg的Cmpd1(三角形尖端朝上)；2.7mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝下)；2.7mg/kg的Cmpd4(菱形)；10mg/kg的Cmpd C2(圆形)。
图2A-2B绘出了对瘦大鼠施用后单次施用如本文中描述的工程化多肽对食物摄取和体重的影响，如实施例4中描述的。图2A：食物摄取。图2B：体重变化(%经媒介物校正的)。图例：媒介物(框)；0.3mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝上)；1.0mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝下)；3.0mg/kg的Cmpd2(菱形)。
图3A-3B绘出了对瘦大鼠施用后单次施用如本文中描述的工程化多肽对食物摄取和体重的影响，如实施例5中描述的。图3A：食物摄取。图3B：体重变化(%经媒介物校正的)。图例：媒介物(框)；1.1mg/kg的Cmpd C2(圆形)； 3.3mg/kg Cmpd C2(框)；11.1mg/kg的CmpdC2(三角形尖端朝上)。
图4A-4B绘出了对瘦大鼠施用后单次施用本文中描述的工程化多肽和对照化合物对食物摄取和体重的影响，如实施例6中描述的。图4A：食物摄取。图4B：体重变化(%经媒介物校正的)。图例：媒介物(框)；2.2mg/kg的Cmpd C6(三角形尖端朝下)。
图5绘出了对DIO大鼠施用后每周一次施用SEQ ID NO:54对体重(%基线)的影响，如实施例7中描述的。图例：媒介物(框)；每次注射为1.3mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝上)。
图6A-6B绘出了对DIO大鼠施用后SEQ ID NO:33(图6A)和SEQ ID NO:54(图6B)的血浆水平的检测和量化，如实施例8中描述的。
图7绘出了对瘦大鼠施用后单次施用本文中描述的指定工程化多肽对体重变化(%经媒介物校正的)的影响，如实施例9中描述的。
图8绘出了对瘦大鼠施用后单次施用本文中描述的指定工程化多肽对体重变化(%经媒介物校正的)的影响，如实施例10中描述的。
图9A-9B绘出了对大鼠施用后单次施用本文中描述的指定工程化多肽对食物摄取和体重变化(%经媒介物校正的)的影响，如实施例11中描述的。图9A：食物摄取。图9B：体重变化(%经媒介物校正的)。
图10绘出了对瘦大鼠施用后单次施用本文中描述的指定工程化多肽对食物摄取和体重变化(%经媒介物校正的)的影响，如实施例12中描述的。
图11A到11B绘出了对瘦大鼠施用后单次施用本文中描述的指定工程化多肽对累积食物摄取(图11A)和百分比体重变化(图11B和11C)的影响，如实施例13中描述的。
图12绘出了在存在清蛋白的情况下由化合物2生成的瘦蛋白功能活性，
如实施例15中描述的。
图13显示了依照实施例16的皮下注射后化合物2在大鼠中延长的血浆浓度对时间概况。
图14显示了依照实施例16的皮下注射后化合物15在大鼠中延长的血浆浓度对时间概况。
图15绘出了对瘦大鼠(图15A)和ZDF大鼠(图15B)施用后单次施用本文中描述的指定工程化多肽对体重变化(%经媒介物校正的)的影响，如实施例17中描述的。
图16绘出了对瘦大鼠施用后每周一次施用化合物2对体重(%基线)的剂量节约影响，如实施例18中描述的。
图17的图绘出了在以下两组大鼠中单独或组合施用瘦蛋白(125μg/kg/天)和胰淀素(1500μg/kg/天)对体重的影响：一组非常肥胖的大鼠和卡路里向下限于中等肥胖症范围的另一组。
图18A的图绘出了在4周里单独或组合施用化合物2(120nmol/kg)和输注的大鼠胰淀素(50μg/kg/天)对体重的影响。图18B的图绘出了在4周里单独或组合施用化合物2(120nmol/kg)和PEG-大鼠胰淀素(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰淀素(SEQ ID NO:148)(125nmol/kg)对体重的影响。
图19绘出了在4周里单独或组合施用化合物15(120nmol/kg)和胰淀素(50μg/kg/天)对食物摄取(图19A)和体重(图19B)的影响。
图20的图绘出了在4周里单独或组合施用化合物15(120nmol/kg)和PEG-大鼠胰淀素(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰淀素(SEQ ID NO:148)(125nmol/kg)对体重的影响。
图21A绘出了在中等肥胖的大鼠中在4周里单独或组合施用瘦蛋白和胰淀素对体重的影响。图21B绘出了在重度肥胖大鼠中在4周里单独或组合施用瘦蛋白和胰淀素对体重的影响缺乏。图21C绘出了在重度肥胖大鼠中在4周里单独或组合施用化合物2(120nmol/kg)和PEG-大鼠胰淀素(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰淀素(SEQ ID NO:148)(125nmol/kg)对体重的影响。
图22绘出了在重度肥胖大鼠中在4周里单独或组合施用(A)化合物15(120nmol/kg)或(B)化合物2(120nmol/kg)和胰淀素(50μg/kg/天)对体重的影响。
图23绘出了对STZ诱导的T1DM小鼠施用后本文中描述的指定工程化多肽对血液葡萄糖的影响，如实施例30中描述的。
图24绘出了对STZ诱导的T1DM小鼠施用后本文中描述的指定工程化多肽对血红蛋白A1C的影响，如实施例30中描述的。
图25绘出了对STZ诱导的T1DM小鼠施用后本文中描述的指定工程化多肽对食物摄取和体重的影响，如实施例30中描述的。
图26绘出了对STZ诱导的T1DM小鼠施用后在有和没有低剂量胰岛素的情况下本文中描述的指定工程化多肽对血液葡萄糖的影响，如实施例30中描述的。
图27绘出了对STZ诱导的T1DM小鼠施用后在有和没有低剂量胰岛素的情况下本文中描述的指定工程化多肽对血红蛋白A1C的影响，如实施例30中描述的。
图28绘出了对STZ诱导的T1DM小鼠施用后在有和没有低剂量胰岛素的情况下本文中描述的指定工程化多肽对食物摄取(%经媒介物校正的)和体重变化(%经媒介物校正的)的影响，如实施例30中描述的。
发明详述
I.定义
“肥胖症”和“超重”指具有比正常预期更大的重量的哺乳动物，并且可以通过例如身体外观、如本领域中已知的体重指数(BMI)、腰臀围比、皮褶厚度、腰围等来确定。疾病控制和预防中心(CDC)将超重定义为成人具有25至29.9的BMI；并将肥胖定义为成人具有30或更高的BMI。存在用于测定肥胖症的其它量度。例如，CDC宣称具有大于1.0的腰臀比的人是超重的。
“瘦体重”指无脂肪的体重，即总体重减去身体脂肪重量为瘦体重。可以通过如本领域中已知的方法如流体静力学称量(hydrostatic weighing)、计算机化室(computerized chamber)、双能x-射线吸收测量学、皮肤卡尺(skin caliper)、磁共振成象(MRI)和生物电阻抗分析(BIA)来测量瘦体重。
“哺乳动物”指一般具有软毛或毛发，活产其后代，并且用乳喂养其后代的温血动物。哺乳动物包括人；同伴动物(例如犬、猫)；家畜动物(例如牛、马、绵羊、猪、山羊)；野生动物等等。在一个实施方案中，所述哺乳动物是雌性。在一个实施方案中，所述哺乳动物是女性。在一个实施方案中，所述哺乳动物是猫或犬。在一个实施方案中，所述哺乳动物是患糖尿病的哺乳动物，例如具有2型糖尿病的人。在一个实施方案中，所述哺乳动物是肥胖的患糖尿病的哺乳动物，例如具有2型糖尿病的肥胖哺乳动物。术语“受试者”在本文中描述的方法的背景中指哺乳动物。
在多肽背景中的“片段”在本文中在习惯的化学意义上指多肽的一部分。例如，片段可以源自亲本多肽的一个或多个残基的N端缺失或C端缺失，和/或片段可以源自亲本多肽的一个或多个残基的内部缺失。“片段”在抗体的背景中指抗体中可以与生物学活性分子连接以调控溶解度、受试者内的分布等的部分。例如，本文中描述的瘦蛋白A200是Fc抗体片段与瘦蛋白的缀合物， 如本领域中已知的。参见例如WO 98/28427和US2007/002084。术语“亲本”在多肽背景中在习惯的意义上指充当修饰，例如插入、缺失和/或取代前的参照结构的多肽。术语“缀合物”在本文中描述的工程化多肽的背景中指组分多肽例如ABD、HD1等之间的共价连接。术语“融合物”在本文中描述的工程化多肽的背景中指组分多肽例如ABD、HD1等之间经由肽主链末端氨基或羧基官能团中任一或两者的共价连接。可以合成或重组制备工程化多肽。通常，融合物使用重组生物技术生成，然而，也可以通过本领域中已知的化学合成和缀合方法来生成。
如用于本文的，“类似物”在多肽的背景中指相对于亲本化合物具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的化合物。类似物可以具有卓越的稳定性、溶解度、效力、半衰期，等等。在一些实施方案中，类似物是相对于亲本化合物具有至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性的化合物。
“同一性”、“序列同一性”等在比较两种或更多种核酸或多肽序列的背景中，指根据使用本领域中已知的序列比较算法例如BLAST或BLAST2.0测量，相同的或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即在比较窗或指定区里为了最大对应性而比较和比对时，在规定区域里约50%同一性，优选地50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)的两种或更多种序列或亚序列。此定义包括具有缺失和/或添加的序列、以及那些具有取代的序列、以及天然存在的(例如多态性或等位)变体、和人工制备的变体。在优选的算法中，如本领域中已知的，解决缺口等。对于序列比较，通常一种序列作用为与测试序列比较的参照序列。当使用序列比较算法时，使测试和参照序列进入计算机中，在必要时指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用缺省程序参数或可以指定备选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。可以进行比较序列的最佳比对，例如通过Smith&Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,1988,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85:2444的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过手动比对和视觉检查来进行。参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等编1995增刊))。适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选例子包括BLAST和BLAST2.0算法，其记载于Altschul等,1977,Nuci.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215:403-410。如本领域中已知的，使用BLAST和BLAST2.0来测定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。用于实施BLAST分析的软件经由国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的网站公开可获得。此算法牵涉首先通过鉴定询问序列中长度W的短词来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短词在与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足某一正值的阈值得分T。T称为相邻词得分阈值(Altschul等,同前)。这些初始的相邻词命中(hits)作用为启动搜索以寻找含有它们的较长HSP的种子。将词命中沿着每条序列以两个方向延伸，只要可以增加累积比对得分。例如对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的惩罚得分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在如下情况时停止每个方向的词命中延伸：累积比对得分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积得分变为0以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N=-4和两条链的比较作为缺省。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=-4和两条链的比较作为缺省。
除非另外明确指出，术语“约”在数字值的背景中指数字值的+/-10%。
术语“肽”和“多肽”在本文中所描述工程化多肽的组分的背景中是同义的。
II.化合物
在第一个方面，提供了工程化多肽化合物，其包含清蛋白结合域(ABD)多肽和至少一种多肽激素域(HD1)。术语“清蛋白结合域”、“ABD”等指能够结合清蛋白的多肽，如本文中描述的。术语“激素域”、“激素域多肽”等 指能够在受试者中引发生物学应答的多肽。例示性激素域包括但不限于瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段，而且可以是瘦蛋白衍生物如PEG化的衍生物。
令人惊讶地，发现了瘦蛋白、瘦蛋白类似物、活性瘦蛋白片段或其瘦蛋白衍生物可以在保留足够的瘦蛋白生物学活性且具有延长的作用持续时间，例如在啮齿类中至少3天且甚至5天的作用持续时间(这转化成人受试者中至少一周的持续时间或更长)的情况中与自如本文中描述的细菌蛋白质的清蛋白结合域衍生的非常高亲和力的清蛋白结合域(ABD)融合。这是令人惊讶的，部分是因为尚未广泛证明这类ABD肽是作为治疗性蛋白质载体的强力平台，它们是相对疏水性的，其可以与附接的治疗性肽不利地相互作用，并且不能起至少一种肽激素家族的载体的作用。例如，大鼠胰淀素化合物(例如SEQ ID NO:108)在与本文中描述的ABD缀合或融合时没有在发现本发明的各种瘦蛋白工程化多肽构建体有活性并具有长作用持续时间的相同啮齿类模型中展现任何显著的或长效的体内活性。
生物学活性组分。设想用在本文中描述的化合物和方法中的生物学活性化合物组分包括瘦蛋白。术语“生物学活性化合物”等在习惯意义中指可以引发生物学应答的化合物，例如多肽等。
瘦蛋白。“多种瘦蛋白”和“一种瘦蛋白”分别意指：多种瘦蛋白、多种瘦蛋白活性片段、多种瘦蛋白类似物、和多种瘦蛋白衍生物；和一种瘦蛋白、一种瘦蛋白活性片段、一种瘦蛋白类似物、和一种瘦蛋白衍生物。因而，除非另外记载，提及“多种瘦蛋白”意为涵盖多种瘦蛋白、多种瘦蛋白活性片段、多种瘦蛋白类似物、和多种瘦蛋白衍生物，如本文中公开的。类似地，除非另外记载，提及“一种瘦蛋白”意为一种瘦蛋白、一种瘦蛋白活性片段、一种瘦蛋白类似物、和一种瘦蛋白衍生物，如本文中公开的。可以在本文中公开的工程化多肽的设计、制备和使用中采用的例示性的此类瘦蛋白包括如下那些瘦蛋白，其引发本领域中已知在对受试者施用瘦蛋白时引发的一种或多种生物学应答(参见例如公布的美国专利申请No.US 2007/0020284和US 2008/0207512，美国专利No.6,309,853和US 7,183,254，以及PCT公布的申请No.WO 96/005309,WO 98/28427和WO 2009/064298)，如：食物摄取减少、体重减轻、体重增加减少、诱发过饱、热量利用度降低、热量效率降低、代谢平台(plateau)降低、胰岛素敏感性升高、高脂血症减轻、改正血脂障碍、 高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)减轻、改善肥胖症、改善超重、改善糖尿病(包括I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病)、改善胰岛素抗性、改善其关联的脂肪营养不良状况、以及本领域中已知在施用瘦蛋白后引发的其它生物学应答(参见例如公布的美国专利申请No.US 2007/0020284和US 2008/0207512，美国专利No.6，309，853，和US 7，183，254，以及PCT公布的申请No.WO 96/005309，WO 98/28427，和WO 2009/064298)。
适合于本文中描述的工程化多肽的设计、制备和使用的例示性瘦蛋白包括但不限于在以下公开内容中描述的化合物：美国专利Nos.US 5，594，101，US 5，851，995，US 5，691，309，US 5，580，954，US 5，554，727，US 5，552，523，US 5，559，208，US 5，756，461，US6，309，853，公开的美国专利申请No.US 2007/0020284、和PCT公开申请Nos.WO 96/23517，WO 96/005309，WO 98/28427，WO 2004/039832，WO 98/55139，WO 98/12224，和WO 97/02004，各项完整并入本文并用于所有目的。体外和体内测定瘦蛋白活性和生物学应答，包括过饱、食物摄取抑制活性和体重减轻活性的方法，是本领域中已知的，并且记载于本文及上述引用和本文中记载的其它引用中。
可以采用本领域中已知的任何瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段、或瘦蛋白衍生物以制备并使用如贯穿本文中公开的工程化多肽。设想用在本文中描述的工程化多肽和方法中的代表性瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段、和瘦蛋白衍生物还包括下列各项：
成熟的鼠瘦蛋白：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC，其中第28位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：1)。
成熟的鼠瘦蛋白形式1：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY
QQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：143).
成熟的鼠瘦蛋白形式2：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQ
QVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTE
VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：144).
具有N端甲硫氨酸的成熟鼠瘦蛋白：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL
AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC，其中第29位Xaa是Q或缺乏的
(SEQ ID NO：2)。
具有N端甲硫氨酸的成熟鼠瘦蛋白形式1：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAV
YQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYS
TEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ IDNO：145).
具有N端甲硫氨酸的成熟鼠瘦蛋白形式2：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ IDNO：146).
成熟的猪瘦蛋白：
VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIY
QQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTEV
VALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC(SEQ ID NO：3).
具有N端甲硫氨酸的成熟猪瘦蛋白：
MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDSHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAI
YQQILLTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTE
VVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC(SEQ ID NO：4).
成熟的牛瘦蛋白：
VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAI
YQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYST
EVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC，其中第28位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：5)。
具有N端甲硫氨酸的成熟牛瘦蛋白：
MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTL
AIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLH LLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLY
STEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC，其中第29位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：6)。
未加工的全长人瘦蛋白(即包含21个残基的N端信号序列)：
MHWGTLCGFLWLWPY LFY VQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTG
LDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP
WASGLETLDSLGGVLEASGY STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：7)
成熟的人瘦蛋白(N端21个氨基酸的信号序列被除去)：
VPIQKVQDDT KTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQT
LAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEAS
GYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，其中第27位Xaa是T或A；且第28位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：8)。
具有N端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQ
TLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLET LDSLGGVLEA
SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，其中第28位Xaa是T或A；且第29位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：9)。
成熟的猕猴瘦蛋白：
VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIYQ
QILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTEVV
ALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：10).
具有N端甲硫氨酸的成熟猕猴瘦蛋白：
MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAI
YQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTE
VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：11).
成熟的大鼠瘦蛋白：
VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY
QQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTE
VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：12).
具有N端甲硫氨酸的成熟大鼠瘦蛋白：
MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAV
YQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：13).
成熟的鸭嘴兽瘦蛋白：成熟的鸭嘴兽瘦蛋白序列如下：
ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQ
QILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEV
VTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG(SEQ ID NO：14).
未加工的全长鸭嘴兽瘦蛋白(即包含21个残基的N端信号序列)：包含21个残基的N端信号序列的鸭嘴兽瘦蛋白的全长序列如下：
MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDF
IPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRS
DGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG(SEQ ID NO：15).
成熟的人瘦蛋白形式1：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：16).
成熟的人瘦蛋白形式2：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：17).
成熟的人瘦蛋白形式3：
VPIQKVQDDTKTL IKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ
QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE
VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：18).
成熟的人瘦蛋白形式4：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ
QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE
VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：19).
具有N端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白形式1(也称为美曲普汀
(Metreletpin)，或A100)：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：20).
具有N端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白形式2：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSR LQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：21).
具有N端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白形式3：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPITLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDL LHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDmLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：22).
具有N端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白形式4：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：23).
海豹瘦蛋白：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQ
ILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV
VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：24)
氨基酸71-92分别用美曲普汀的氨基酸73-94(螺旋3)替换的海豹瘦蛋白：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQ
ILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVV
ALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：25).
氨基酸30和71-92分别用美曲普汀的氨基酸32和73-94(螺旋3)替换的海豹瘦蛋白：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQI
LTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVV
ALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：26).
具有N端甲硫氨酸的海豹瘦蛋白：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ
QILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE
VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：27)
具有N端甲硫氨酸，且氨基酸71-92分别用美曲普汀的氨基酸73-94(螺旋3)替换的海豹瘦蛋白：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ
QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV
VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：28).
具有N端甲硫氨酸，且氨基酸30和71-92分别用美曲普汀的氨基酸32和73-94(螺旋3)替换的海豹瘦蛋白：
MPIQKVQDDTKTLIKTITTKINDISPPQGVSSKPRVAGLDFIPRVQSVKTLSGMDQILATYQ
QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV
VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：29).
瘦蛋白A200：瘦蛋白A200是Fc抗体片段与瘦蛋白的缩合产物，如本领域中已知的。参见例如Lo等，2005，Protein Eng.Design&Selection，18：1-10。A200的氨基酸序列如下：
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVPIQKV
QDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKOKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTS
MPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALS
RLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：30)
瘦蛋白A300：瘦蛋白A300是具有取代W101Q和W139Q(N端1Met以残基1计数)的美曲普汀：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：31).
瘦蛋白A400：瘦蛋白A400是第78位丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换的美曲普汀，如下文列出的：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：32)；其已经经由第78位半胱氨酸残基附接有20千道尔顿(kDa)PEG模块。
瘦蛋白A500：包括发明人在内的许多调查人员的研究聚焦于瘦蛋白中的残基取代对聚集的影响。参见例如Ricci等，2006.“Mutational approach to
improVe physical stability of protein therapeutics susceptible toaggregation：Role of altered conformation in irreversible precipitation，”书章.于：MISBEHAVING PROTEINS：PROTEIN(MIS)FOLDING，AGGREGATION，AND STABILITY，MurphyRM，Tsai AM编，New York.Springer.第331页-第350页，其通过提述并入本文并用于所有目的。因而，在本文中描述的某些化合物和方法中使用了具有以下序列的瘦蛋白A500：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTR INDVSHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：33).
瘦蛋白A100变体：具有下列残基取代的瘦蛋白A100变体如下：
D41E，H98S，W101Q，D109E，G113E，M137I，W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：664).
H98S，W101Q，A102T，G113E，M137I，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：665).
H98S，W101Q，G113E，M137I，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：666).
W101Q，G113E，M137I，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQD ILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：667).
H98S，W101Q，M137I，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTL IKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：668).
W101Q，G113E，M137I，W139Q，L143V，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：669).
H98S，W101Q，A102T，M137I，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：670).
H98S，W101Q，D109E，G113E，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDM LWQLDLSPEC(SEQ ID NO：671).
W101Q，M137I，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：672).
W101Q，M137I，W139Q，L143V，和G146E：
MV PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ IDNO：673).
H98S，W101Q，A102T，M137I，W139Q，L143V，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：674).
H98S，W101Q，A102T，G113E，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC(SEQ ID NO：675).
W101Q，G113E，和W139Q：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：676).
W101Q，G113E，W139Q，和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST
EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC(SEQ ID NO：677).
任何上述瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段以及如下文描述的瘦蛋白适合于在本工程化多肽中(与ABD具有或没有接头)使用。
清蛋白结合域(ABD)肽。本发明中使用的清蛋白结合域(ABD)肽是那些对清蛋白具有相当高的亲和力且自链球菌菌株G148的细菌蛋白G的清蛋白结合域衍生的。因而，本文中描述的工程化多肽涵盖的ABD肽包括那些具有 如由Jonsson等(Protein Eng.Design&Selection,2008,21:515-527)描述的清蛋白结合基序的ABD肽以及其中描述的ABD肽，和PCT公开的申请No.WO2009/016043中进一步描述的那些基序和ABD肽，以及其类似物，特别是那些具有至少85%氨基酸同一性的。在一个实施方案中，所述ABD肽可以包含由以下氨基酸序列组成的清蛋白结合基序(“ABM”)：
GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I(SEQ IDNO:34)
其中，彼此独立地，
X5选自Y和F；
X8选自N,R和S；
X9选自V,I,L,M,F和Y；
X11选自N,S,E和D；
X12选自R,K和N；
X14选自K和R；
X20选自D,N,Q,E,H,S,R和K；
X23选自K,I和T；
X24选自A,S,T,G,H,L和D；且
X25选自H,E和D。
在某些实施方案中，X5是Y。在某些实施方案中，X8是N。在某些实施方案中，X23是T。在某些实施方案中，X23是I。在某些实施方案中，X24是S。在某些实施方案中，X24是L。在某些实施方案中，X25是E。在某些实施方案中，X25是H。在某些实施方案中，彼此独立地，X5是Y，和/或X8是N，和/或X23是T或I，和/或X24是S或L，和/或X25是E。在某些实施方案中，所述清蛋白结合基序(“ABM”)是GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI(SEQ ID NO:114)。在某些实施方案中，所述清蛋白结合基序(“ABM”)是GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI(SEQ ID NO:115)。
优选地，ABD肽以至多1x10-6M，且甚至更优选地，至多1x10-9M(甚至更紧密的亲和力)的相互作用K值结合清蛋白。更优选地，相互作用K值为至多1x10-10M，甚至更优选地，为至多1x10-11M，还甚至更优选地，为至多1x10-12M，且甚至进一步地为至多1x10-13M。例如，1x10-14M的KD值是至多为1x10-13M的相互作用K值。可以如PCT公开的申请No.WO 2009/016043中描述的那样测定K值，优选地针对人血清清蛋白。在一个实施方案中，涵盖的是上述种类，只要氨基酸序列不是GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI(SEQ ID NO:35)。
如本文中和引用的参考文献中表明的，尽管有氨基酸变化，但是可以保留ABD肽的清蛋白结合能力，只要这类变化保留ABD肽的足够三级结构。这类变化包括例如取代，其中用属于氨基酸残基的某种功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基交换来自同一功能组的另一种氨基酸残基。因而，在ABD肽的一个这类实施方案中，基序X5是Y。在ABD的一个实施方案中，X8选自N和R，且具体地可以是R。在一个实施方案中，X9是L。在一个实施方案中，X11选自N和S，且具体地可以是N。在一个实施方案中，X12选自R和K，如X12为R或X12为K。在一个实施方案中，X14是K。在一个实施方案中，X20选自D,N,Q,E,H,S和R，且具体地可以是E。在一个实施方案中，X23选自K和I，且具体地可以是K。在一个实施方案中，X24选自A,S,T,G,H和L。在一个更具体的实施方案中，X24是L。在一个甚至更具体的实施方案中，“X23X24”是KL。在另一个甚至更具体的实施方案中，“X23X24”是TL。在一个实施方案中，X24选自A,S,T,G和H。在一个更具体的实施方案中，X24选自A,S,T,G和H且X23是I。在一个实施方案中，X25是H。
在上述式内的单个清蛋白结合基序的序列包括那些在PCT公开的申请No.WO2009/016043(其通过提述并入本文)中以SEQ ID NO:1-257呈现的。在清蛋白结合多肽的某些实施方案中，清蛋白结合基序由选自SEQ ID NO:1-257的氨基酸序列组成。在本发明的此方面的一个更具体的实施方案中，所述基序序列选自PCT公开申请No.WO2009/016043的SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:155,SEQID NO:239,SEQ ID NO:240,SEQ ID NO:241,SEQ ID NO:242,SEQ ID NO:243,SEQ ID NO:244和SEQ ID NO:245。在本发明的此方面的更具体的实施方案中，所述基序序列选自PCT公开申请No.WO 2009/016043的SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:239。含有清蛋白结合基序，且如此适合于与如本文中描述的激素域缀合或融合的清蛋白结合多肽在本文中及下文进一步描述，并且在表1和实施例中例示。不受理论束缚，但认为清蛋白结合基序可以形成三螺旋束蛋白质域的部分。例如，基序可以 基本上构成或形成所述三螺旋束蛋白质域内具有互连环(interconnecting loop)的两个α螺旋的部分。因而，在本发明的具体实施方案中，这类三螺旋束蛋白质域选自由来自链球菌菌株G148的细菌受体蛋白G的三螺旋域组成的组。在此实施方案的不同变体中，基序形成其一部分的三螺旋束蛋白质域选自下组：来自链球菌菌株G148的域GA1、域GA2和域GA3，特别是域GA3。
在基序“形成三螺旋束蛋白质域的部分”的本发明实施方案中，这理解为意指清蛋白结合基序的序列“插入”天然存在的(或其它方面最初的)三螺旋束域中或“移植”到其上或与其“融合”，从而该基序替换初始域中类似的结构基序。例如且不希望受理论束缚，认为该基序构成三螺旋束的3个螺旋中的2个，并且可以替换任何三螺旋束内的这类两螺旋基序。实施通过本文中公开的2个基序螺旋替换三螺旋束域的2个螺旋，使得不影响多肽的基本结构。也就是说，依照本发明的此实施方案的多肽的主链总体折叠与该多肽形成其一部分的三螺旋束蛋白质域的总体折叠会是基本上相同的，例如具有相同次序的相同二级结构元件等。如此，如果依照此实施方案的多肽与初始域具有相同的折叠，那么对本文中的工程化多肽有用的基序可以形成三螺旋束域的部分，暗示共享基本的结构特性，即例如产生类似的CD谱的那些特征。
因而，在一个实施方案中，清蛋白结合域多肽是三螺旋束蛋白质域，其包含如上文限定的清蛋白结合基序和构成三螺旋构型的剩余部分的其它序列。可以将这类清蛋白结合域多肽与瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或其瘦蛋白衍生物融合以创建如本文中描述的工程化多肽。适合于与瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或其瘦蛋白衍生物缀合或融合的清蛋白结合域多肽可以包含以下氨基酸序列：
LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY-[ABM]-LAALP(SEQ ID NO:36)
其中
[ABM]是如上文限定的清蛋白结合基序，且，
彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L,E和D；
Xc选自N,L和I；
Xd选自R和K；且
Xe选自D和K。
在某些实施方案中，Xa为E。在某些实施方案中，Xb为D。在某些实施方案中，Xc为I。在某些实施方案中，Xd为K。在某些实施方案中，独立地，Xa为E，和/或独立地，Xb为D，和/或独立地，Xc为I，和/或独立地，Xd为K。在某些实施方案中，第45位亮氨酸是存在或缺乏的。在某些实施方案中，第46位脯氨酸是缺失的。在某些实施方案中，清蛋白结合域多肽为LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO:50)。在某些实施方案中，清蛋白结合域多肽为LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP(SEQ IDNO:51)。
在又一个实施方案中，ABD包含一种或多种N端螺旋加帽氨基酸，且在又一个实施方案中，所述螺旋加帽氨基酸可以是丝氨酸，或可以是甘氨酸-丝氨酸。因此，对于本文中披露的包括那些在图和序列表中的每种清蛋白结合域序列，在工程化多肽中用于如本文中披露的所有方面还具体涵盖了清蛋白结合域、其Ser-ABD、Gly-Ser-ABD、Gly-ABD、Ala-ABD和其脱C端脯氨酸序列。
由于存在清蛋白结合基序，ABD肽以至多1x10-6M，且甚至更优选地至多1x10-9M(甚至更紧密的亲和力)的相互作用K值结合清蛋白。更优选地，相互作用K值为至多1x10-10M，甚至更优选地为至多1x10-11M，甚至还更优选地为至多1x10-12M，且甚至进一步地为至多1x10-13M。
在此清蛋白结合多肽的一个实施方案中，Xa为V。在此多肽的一个实施方案中，Xb为L。在此多肽的一个实施方案中，Xc为N。在此多肽的一个实施方案中，Xd为R。在此多肽的一个实施方案中，Xe为D。
适合于与如本文中描述的活性激素域肽融合的各清蛋白结合域多肽的序列在Jonsson等(同上)中及以SEQ ID NO:258-514在PCT公开申请No.WO 2009/016043中呈现，它们通过提述并入本文。在下文表1中公开了选出的化合物。本发明还涵盖了与选自SEQ IDNO:258-514的序列具有85%或更大同一性的氨基酸序列的清蛋白结合多肽。在具体的实施方案中，所述清蛋白结合多肽的序列选自PCT公开申请No.WO 2009/016043中的SEQ ID NO:259,SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:266,SEQ ID NO:272,SEQ ID NO:282,SEQ ID NO:284,SEQID NO:303,SEQ ID NO:306,SEQ ID NO:310,SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:312,SEQ ID NO:412,SEQ ID NO:496,SEQ ID NO:497,SEQ ID NO:498,SEQ ID NO:499,SEQ ID NO:500,SEQID NO:501和SEQ ID NO:502，以及与其具有85%或更大同一性的序列。在另外的实施方案中，所述清蛋白结合多肽的序列选自PCT公开申请No.WO 2009/016043中的SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:270,SEQ ID NO:272,SEQ ID NO:291,SEQ ID NO:294,SEQ ID NO:298,SEQ IDNO:299,SEQ ID NO:300,SEQ ID NO:400,SEQ ID NO:484,SEQ ID NO:485,SEQ ID NO:486,SEQ ID NO:487,SEQ ID NO:488,SEQ ID NO:489和SEQ ID NO:490，以及与其具有85%或更大同一性的序列。在又一些实施方案中，所述清蛋白结合多肽的序列多肽选自PCT公开申请No.WO2009/016043中的SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:310,SEQ ID NO:496,和SEQ ID NO:511，以及与其具有85%或更大同一性的序列。
在一个实施方案中，所述清蛋白结合多肽进一步包含位于SEQ ID NO:36中限定的序列的N和/或C端的一种或多种额外的氨基酸残基。这些额外的氨基酸残基在增强多肽对清蛋白的结合并改善折叠的清蛋白结合域的构象稳定性中可以发挥作用，但是同样可以很好地满足其它目的，其例如涉及多肽的生成、纯化、体内或体外稳定化、偶联、标记或检测中的一项或多项、以及其任意组合。这类额外的氨基酸残基可以包含为了化学偶联(例如与HD1)目的而添加的一个或多个氨基酸残基。
如此，在一个实施方案中，SEQ ID NO:36中位于氨基酸序列的N或C端直接在α螺旋之前或之后的氨基酸可以影响构象稳定性。可以促成改善的构象稳定性的氨基酸残基的一个例子是位于SEQ ID NO:36的N端的丝氨酸残基，如上文限定的。N端丝氨酸残基在一些情况下可以形成规范的S-X-X-E加帽盒，其通过牵涉丝氨酸侧链的γ氧和谷氨酸残基的多肽主链NH之间的氢键键合来实现。此N端加帽可以促成构成依照本公开内容第一个方面的清蛋白结合多肽的三螺旋域的第一个α螺旋的稳定化。
如此，在一个实施方案中，所述额外的氨基酸包含位于至少一个位于多肽N端的丝氨酸残基。换言之，氨基酸序列前面有一个或多个丝氨酸残基。在清蛋白结合多肽的另一个实施方案中，所述额外的氨基酸在多肽N端包含甘氨酸残基。理解的是，SEQ ID NO:36的氨基酸序列前面可以有1个、2个、3个、4个或任何合适数目的氨基酸残基。如此，氨基酸序列前面可以有单一的丝氨酸残基、单一的甘氨酸残基或两种的组合，如甘氨酸-丝氨酸(GS)组合或甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸(GSS)组合。在又一个实施方案中，额外的氨基酸残基包含在如SEQ ID NO：36的序列限定的多肽的N端的谷氨酸。
例示性ABD种类包括但不限于，在下文表1和实施例中列出的化合物。亦参见PCT公开申请No.WO2009/016043，通过提述完整并入本文中并用于所有目的。可用于本文中描述的化合物、方法和药物组合物的ABD肽可以是本文中公开的或本领域中已知的ABD肽的片段或类似物，只要其含有清蛋白结合基序并以本文中描述的亲和力结合清蛋白。
表1.选出的ABD肽
ABD肽序列 SEQ ID NO：
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP 37
LAEAKVLANRELDKYGVSDEYKSYINRAKKTVEGVHTLIGHILAALP 38
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP 39
LAEAKVLANRELDKYGVSDYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP 40
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP 41
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP 42
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHAALP 43
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALLAHILAALP 44
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP 45
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP 46
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALADILAALP 47
LAEAKVLANRELDKYYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP 48
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP 49
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP 50
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP 51
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP 52
结合清蛋白。血清清蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质(40g/L；在人中约0.7mM)，其中它结合多种分子，包括但不限于脂质和胆红素(Peters T，1985，Advances inProtein Chemistry37：161)。已经观察到血清清蛋白的半衰期与动物的大小成正比，其中例如人血清清蛋白(HSA)具有19天的半衰期，而兔血清清蛋白具有约5天的半衰期(McCurdyTR等，J.Lab.Clin.Med.143：115，2004)。人血清清蛋白遍及身体广泛分布，尤其是在肠和血液区室中，其中它主要牵涉渗量的维持。在结构上，清蛋白是包含3个同源域和总计584或585个氨基酸的单链蛋白质(Dugaiczyk L等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：71)。清蛋白含有17个二硫化物桥和单个反应性硫醇C34，但是缺乏N连接的和O连接的碳水化合物模块(Peters，1985，同上；Nicholson JP等，2000， Br J Anaesth85:599)。糖基化的缺乏简化清蛋白的重组表达。连同已知其三维结构的实情(见例如He XM&Carter DC,1992,Nature358:209)，清蛋白的此特性已经使其成为一种用于重组融合蛋白的有吸引力的候选物。这类融合蛋白一般在单个多肽链中组合治疗性蛋白(其在施用该蛋白质本身后会从身体快速清除)和血浆蛋白质(其展现出天然的缓慢清除)。见例如Sheffield WP,2001,Curr.Drug Targets Cardiovacs.Haematol.Disord.1:1)。这类蛋白质在需要不太频繁的注射和较高的治疗性蛋白体内水平中可以提供临床优点。然而，本文中的工程化多肽不与清蛋白缀合，而是取而代之含有允许与清蛋白非共价结合的基序。
其它实施方案。理解的是，还涵盖本文中公开的每种多肽包括(任选地)与其天然存在的第一个氨基酸以符合读码框方式融合的N端甲硫氨酸。例如，美曲普汀(瘦蛋白A100)由已经添加有N端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白组成，如SEQ ID NO:20中公开的。类似地，在贯穿本文中所公开的任意氨基酸序列和分子式的N端可以包含甲硫氨酸残基。进一步理解的是在C端Gly出现在本文中列出的工程化多肽序列中的情况下，该残基可能在后续酰胺化期间丧失。
在一些实施方案中，相对于亲本瘦蛋白，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可以具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性。在一些实施方案中，所述亲本瘦蛋白是在下列各项中列出的瘦蛋白：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ IDNO:145,或SEQ ID NO:146。因而，在一些实施方案中，相对于选自下组的任何瘦蛋白，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可以具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性：SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,和SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20中列出的瘦蛋白，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可以具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性。在一些实施方案中，相对于选自下组的任何瘦蛋白，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可以具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性：SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,或SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,或SEQ ID NO:146中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2,ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,或SEQ ID NO:146中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQID NO:14或SEQ ID NO:15中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:32中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:32中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:33中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:33中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物瘦蛋白类似物可以具有至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13中列出的瘦蛋白，瘦蛋白类似物可以具有至少90%的序列同一性。另外，可以依照本发明设计、制备并使用瘦蛋白，其中选自下 组的瘦蛋白的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或甚至21个氨基酸用另一种氨基酸，如保守氨基酸或非保守氨基酸取代或以其它方式改变：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQID NO:145,和SEQ ID NO:146。如本领域中惯用的，术语“保守的”在氨基酸取代的背景中指保留电荷类型(例如阴离子、阳离子、中性、极性，等等)、疏水性或亲水性、体积(bulk)(例如范德华(van der Waals)接触等等)和/或功能性(例如羟基、胺、巯氢基等等)特性的取代。术语“非保守的”指非保守的氨基酸取代。
另外，如本领域中理解的，例如鼠瘦蛋白、大鼠瘦蛋白、牛瘦蛋白、猪瘦蛋白、和猕猴瘦蛋白，如本文中公开的那些瘦蛋白各自与人瘦蛋白是基本上同源的；特别地，这些瘦蛋白的成熟形式与成熟的瘦蛋白是基本上同源的，且进一步地，尤其是在蛋白质的N端部分附近。可以制备这类瘦蛋白的类似物，如成熟的人瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:16)和美曲普汀(SEQ ID NO:20)，如通过取代或以其它方式改变这类序列中的一个或多个如下位置处的氨基酸残基来进行，所述位置处的趋异在相应的成熟小鼠、大鼠、牛、猪或猕猴瘦蛋白中观察到。例如，成熟的人瘦蛋白(例如SEQ ID NO:20)在例如小鼠、大鼠和猴中引发生物学应答。参见例如WO 98/28427,WO 2009/064298,US2007/0020284,US2008/0207512,和Murakami等,1995,Biochem.Biophys.Res.Comm.209:944-952。由于人成熟瘦蛋白在例如这类物种中具有生物学活性，可以设计并制备瘦蛋白，其中在来自一种或多种这类物种的瘦蛋白中的相应位置处趋异的位置处的一个或多个氨基酸用在这类相应的趋异位置处的氨基酸取代。
例如，使用依照SEQ ID NO:16的人成熟瘦蛋白蛋白质(其中第一个氨基酸是缬氨酸，且第146位氨基酸是半胱氨酸)，可以用存在于SEQ ID NO:143中的相应位置处的相应氨基酸用另一种氨基酸取代位置32,35,50,64,68,71, 74,77,89,97,100,101,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145处的一个或多个氨基酸，从而设计、制备并使用依照本发明的工程化多肽。另外，也可以将另一种氨基酸如保守氨基酸或非保守氨基酸取代入例如SEQ ID NO:16的位置32,35,50,64,68,71,74,77,89,97,100,101,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145之一个或多个中，从而设计、制备并使用依照本发明的工程化多肽。
可以基于成熟的大鼠瘦蛋白蛋白质序列(SEQ ID NO:12)来进一步制备其它瘦蛋白。参见例如WO98/28427,US2007/0020284和Murakami等,1995,同上，通过提述完整并入本文中并用于所有目的。成熟的大鼠瘦蛋白与成熟的人瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:16)在下列位置处有所不同：4,32,33,35,50,68,71,74,77,78,89,97,100,101,102,105,106,107,108,111,118,136,138和145。因而，在SEQ ID NO:12中的一个或多个这类位置处，可以用存在于成熟大鼠瘦蛋白(SEQ ID NO:16)中的相应位置处找到的氨基酸取代，从而设计、制备并使用依照本发明的工程化多肽。另外，也可以将另一种氨基酸如保守氨基酸或非保守氨基酸取代入例如SEQ ID NO:16的位置4,32,33,35,50,68,71,74,77,78,89,97,100,101,102,105,106,107,108,111,118,136,138和145之一个或多个中，从而设计、制备并使用依照本发明的工程化多肽。
与成熟人瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:16)趋异的来自成熟大鼠瘦蛋白(SEQ ID NO:12)和成熟鼠瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:143)两者的位置是：4,32,33,35,50,64,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142和145。因而，在SEQ IDNO:16中的一个或多个这类位置处，可以用存在于成熟大鼠瘦蛋白序列(SEQ ID NO:12)或成熟鼠形式1序列(SEQ ID NO:143)中的相应位置处找到的氨基酸取代，从而设计、制备并使用依照本发明的工程化多肽。另外，也可以将另一种氨基酸如保守氨基酸或非保守氨基酸取代入位置4,32,33,35,50,64,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145之一个或多个中，从而设计、制备并使用依照本发明的工程化多肽。
另外，与成熟人瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:16)趋异的存在于猕猴成熟瘦蛋白(SEQID NO:10)中的氨基酸是(以一字母氨基酸缩写在括号中记录氨基酸残基)：8(S),35(R),48(V),53(Q),60(I),66(I),67(N),68((L),89(L),100(L),108(E),112(D)和118(L)。由于人成熟瘦蛋白在猴中引发生物学应答，在设 计、制备及使用依照本发明的工程化多肽中可以采用瘦蛋白，如用另一种氨基酸如括号中的氨基酸替换一个或多个猕猴趋异氨基酸的成熟人瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:16)。应当注意的是，某些猕猴趋异氨基酸也是那些存在于例如上述成熟的鼠瘦蛋白形式1(位置35,68,89,100和112)中的氨基酸。如此，可以制备如下的瘦蛋白，其中例如成熟的人瘦蛋白形式1(SEQ ID NO:16)的位置4,8,32,33,35,48,50,53,60,64,66,67,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,112,118,136,138,142,和145处的一个或多个氨基酸用小鼠或猕猴瘦蛋白(例如SEQ ID NO:143和/或SEQ IDNO:10)中这类位置处的相应氨基酸替换。
可以通过删除瘦蛋白氨基酸序列的一部分来制备其它瘦蛋白，只要这类瘦蛋白氨基酸序列可以引发生物学应答。这类瘦蛋白氨基酸序列是瘦蛋白活性片段。例如，成熟的鼠瘦蛋白、成熟的猕猴瘦蛋白、成熟的人瘦蛋白、成熟的大鼠瘦蛋白和其它瘦蛋白都缺少N端21个氨基酸的信号序列，其存在于这类瘦蛋白的未加工的、全长形式中。
可以制备这类成熟瘦蛋白的下列活性瘦蛋白片段：
(a)氨基酸98-146
(b)氨基酸1-32
(c)氨基酸40-116
(d)氨基酸1-99和(连接的)112-146
(e)氨基酸1-99和(连接的)112-146，其具有置于氨基酸99和112之间的氨基酸100-111之一个或多个。
另外，还可以制备这类活性瘦蛋白片段，其中在例如成熟人瘦蛋白形式1中的位置处的一个或多个氨基酸用存在于例如如上文公开的大鼠、鼠、猴、猪和/或牛成熟瘦蛋白中发现的相应位置处的氨基酸取代。此外，任何取代或变化可以为改变的氨基酸形式，如肽模拟物或D-氨基酸。
另外，本发明涵盖了工程化多肽，其包含如上文所描述的瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物，其中所述瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物选自：
(a)选自下组的瘦蛋白的氨基酸序列1-146：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12.SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:143,和SEQ ID NO:144；其中在下列一个或多个位置中取代不同氨基酸并保留相同的编号方式(即使在第28位谷氨酰胺酰基残基缺乏的情况下)：4,32,33,35,50,64,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145；
(b)子部分(a)的氨基酸序列，其中第28位谷氨酰胺酰基残基是缺乏的；
(c)子部分(a)或(b)的氨基酸序列，其中在N端添加甲硫氨酰基残基；
(d)由(a),(b),或(c)的氨基酸序列的片段组成的瘦蛋白，所述片段选自下组：
(i)氨基酸98-146；
(ii)氨基酸1-32；
(iii)氨基酸40-116
(iv)氨基酸1-99和112-146
(v)氨基酸1-99和112-146，其中氨基酸100-111的一个或多个置于氨基酸99和112之间；和
(vi)子部分(i)的氨基酸序列，其中氨基酸100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145的一个或多个用另一种氨基酸取代；
(vii)子部分(ii)的氨基酸序列，其中氨基酸4,8和32的一个或多个用另一种氨基酸取代；
(viii)子部分(iii)的氨基酸序列，其中氨基酸50,53,60,64,66,67,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111和112的一个或多个用另一种氨基酸取代；
(ix)子部分(iv)的氨基酸序列，其中氨基酸4,8,32,33,35,48,50,53,60,64,66,67,68,71,74,77,78,89,97,112,118,136,138,142,和145的一个或多个用另一种氨基酸取代；和
(x)子部分(v)的氨基酸序列，其中氨基酸4,32,33,35,50,64,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145的一个或多个用另一种氨基酸取代；
(xi)子部分(i)-(x)中任一项的瘦蛋白，其中已经在N端添加甲硫氨酸；
(e)子部分(a)到(e)中任一项的瘦蛋白，其附接有化学模块；
(f)子部分(g)的瘦蛋白，其中所述化学模块是水溶性聚合物模块；
(g)子部分(f)的瘦蛋白，其中所述水溶性聚合物模块是聚乙二醇；
(h)子部分(f)的瘦蛋白，其中所述水溶性聚合物模块是聚氨基酸模块；和
(i)子部分(e)到(h)中任一项的瘦蛋白，其中所述模块仅附接于所述蛋白质模块的N端。
对于上文而言，附接有化学模块的瘦蛋白是瘦蛋白衍生物。已经发现了通过附接一种或多种化学模块对瘦蛋白的衍生化在某些情况下提供一些优点，如增加治疗性蛋白质的稳定性和循环时间及降低免疫原性和例如生成中和性抗体的倾向和/或注射部位反应的发生。见例如WO 98/28427,US2007/0020284,美国专利No.4,179,337,Davis等,1979年12月18日公告。综述参见Abuchowski等，于Enzymes as Drugs。(J.S.Holcerberg和J.Roberts,编第367页-第383页(1981));Francis等,同上。因而，在采用衍生化的瘦蛋白和ABM或ABD时，可以有利地生成本发明的工程化多肽，其拥有由这两种实体提供的优点。
瘦蛋白衍生物可以构成多肽，已经对该多肽对其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基基团或末端羧酸基团之一种或多种做出化学修饰。化学修饰包括但不限于附接一种或多种化学模块、创建新键、和除去一种或多种化学模块。在氨基酸侧基处的修饰包括但不限于烷基化、酰化、酯形成、马来酰亚胺偶联、赖氨酸ε-氨基基团的酰化、精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨羧酸基团的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺作用。对末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烃基、N-二-低级烃基和N-酰基修饰。对末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烃基、N-二-低级烃基和N-酰基修饰，如烷基酰基、分支烷基酰基、烷基芳基-酰基。对末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、低级烃基酰胺、二烃基酰胺、芳基酰胺、烃基芳基酰胺和低级烃基酯修饰。低级烃基是C1-C4烃基。此外，可以通过普通技能的合成化学人员已知的保护基来保护一种或多种侧基或末端基团。氨基酸的α-碳可以是单或二甲基化的。
这类衍生物包括与一种或多种水溶性聚合物分子，如聚乙二醇(“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰基、棕榈酰基、辛酰基)缀合的瘦蛋白，其通过添加多聚氨基酸，如多聚-his、多聚-arg、多聚-lys、和多聚-ala，或通过添加小分子取代基，包括短烃基和约束的烃基(例如分支、环状、融合的、 金刚烷基)，以及芳香基基团来得到。在一些实施方案中，水溶性聚合物分子会具有范围为约500道尔顿到约60,000道尔顿的分子量。
这类聚合物缀合可以在如本文中公开的瘦蛋白的N或C端或序列内的氨基酸残基的侧链单一发生。或者，沿着这类瘦蛋白的氨基酸序列可以有多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸取代一个或多个氨基酸可以为衍生化提供额外的位点。参见例如美国专利No.5,824,784和5,824,778。在一些实施方案中，瘦蛋白可以与1个、2个、或3个聚合物分子缀合。
在一些实施方案中，将水溶性聚合物分子与氨基、羧基或硫醇基团连接，并且可以通过N或C端，或者在赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链连接。或者，水溶性聚合物分子可以与二胺和二羧基基团连接。在一些实施方案中，瘦蛋白经由赖氨酸氨基酸上的ε氨基基团与1个、2个或3个PEG分子缀合。
瘦蛋白衍生物还包括具有对一个或多个氨基酸残基的化学变化的瘦蛋白。这类化学变化包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。化学变化可以在瘦蛋白的N或C端或者在序列内的氨基酸残基的侧链单一发生。在一个实施方案中，这些肽的C端可以具有游离的-OH或-NH2基团。在另一个实施方案中，可以用以下基团对N端末端加帽：异丁基氧基羰基基团、异丙基氧基羰基、n-丁基氧基羰基基团、乙氧基羰基基团、异己酰基基团(“isocap”)、辛酰基基团、辛基甘氨酸基团(称为“G(Oct)”或“octylGly”)、8-氨基辛酸基团、丹酰基和/或Fmoc基团。在一些实施方案中，环化可以经由形成二硫化物桥。或者，沿着瘦蛋白氨基酸序列可以有化学变化的多个位点。
在某些实施方案中，将瘦蛋白化学改变为包含鲍尔通-亨特(Bolton-Hunter)基团。鲍尔通-亨特试剂是本领域中已知的(“Radioimmunoassay and related methods,”A.E.Bolton和W.M.Hunter,HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY的第26章,第I卷,IMMUNOCHEMISTRY,D.M.Weir编,Blackwell Scientific Publications,1986)，并且可以用于经由氨基端α-氨基基团或赖氨酸的ε-氨基基团用中性连接引入酪氨酸样模块。在一些实施方案中，瘦蛋白的N端末端修饰为具有鲍尔通-亨特基团。在一些实施方案中，内部赖氨酸残基修饰为具有鲍尔通-亨特基团。在 一些实施方案中，沿着瘦蛋白氨基酸序列可以有多个鲍尔通-亨特修饰位点。用于多肽修饰的鲍尔通-亨特试剂是商业化的，并且可以包括但不限于水溶性鲍尔通-亨特试剂磺基琥珀酰亚氨基-3-[4-羟苯基]丙酸盐(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL)和鲍尔通-亨特试剂2,N-琥珀酰亚氨基3-(4-羟基-3-碘苯基)丙酸盐(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Japan,产品目录编号#199-09341)。下文例示了经由酰胺连接与瘦蛋白缀合的例示性鲍尔通-亨特基团，其中虚线通过酰胺键：
可以在鲍尔通-亨特修饰之前或之后将瘦蛋白碘化(如用125I放射性标记)。
为了制备依照本发明的工程化多肽，在其制备中使用的瘦蛋白衍生物可以包含“非必需”氨基酸残基的一处或多处修饰。在本发明的背景中，“非必需”氨基酸残基是可以在没有消除或实质性降低瘦蛋白的活性(例如激动剂活性)的情况中改变例如衍生化的残基。本发明的工程化多肽可以包含瘦蛋白模块的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个氨基酸残基的衍生化；这些之中，一个或多个氨基酸残基可以是非必需氨基酸残基。另外，可以将本发明的多肽衍生化，使得它们在没有消除或实质性降低多肽活性的情况中包含瘦蛋白模块的至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个氨基酸的添加。另外，可以将这类非必需氨基酸残基用适合于衍生化的氨基酸残基取代，如全文描述的。
如全文使用的，“氨基酸”、“氨基酸残基”等指天然氨基酸、非天然氨基酸和经修饰的氨基酸。除非相反说明，一般或通过名称明确对氨基酸的任何提述包括提述D和L立体异构体两者，若其结构允许这类立体异构体形式的话。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、高丝氨酸、铃兰氨酸(azetidinecarboxylic acid)、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、 氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸(pipecolic acid)和硫代脯氨酸。其它非天然氨基酸包括可逆或不可逆地化学封闭的或者在其N端氨基基团或其侧链基团上化学修饰的经修饰氨基酸残基，如例如，N-甲基化的D和L氨基酸或如下的残基，其中侧链官能团化学修饰为另一种官能团。例如，经修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲酯)(天冬氨酸的一种经修饰的氨基酸)；N-乙基甘氨酸(甘氨酸的一种经修饰的氨基酸)；或丙氨酸羧酰胺(丙氨酸的一种经修饰的氨基酸)。可以掺入的其它残基记载于Sandberg等,J.Med.Chem.41:2481-91,1998。
如上文提述的，适合于瘦蛋白和其它多肽的这类衍生化的化学模块包括例如各种水溶性聚合物。优选地，为了终产物制备物的治疗性用途，聚合物会是药学可接受的。本领域技术人员会能够基于如下的考虑来选择期望的聚合物，所述考虑诸如聚合物/蛋白质缀合物是否会治疗性使用，并且如果这样的话，期望的剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性，以及其它考虑。对于工程化化多肽和瘦蛋白，可以如下确定衍生化的效率，即以期望的形式(即通过渗透泵，或更优选地通过注射或输注，或进一步配制用于例如口服、肺或鼻投递)施用衍生化瘦蛋白或衍生化的工程化多肽，并观察如本文中描述的生物学效应和生物学应答。
这类水溶性聚合物可以选自下组：例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环(dioxolane)、聚-1,3,6-三口恶烷(trioxane)、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯(polyoxyethylated)多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以具有制造优点。还有，也可以使用琥珀酸酯和苯乙烯。
可以通过与瘦蛋白模块附接聚氨基酸或分支点氨基酸来制备依照本发 明的工程化多肽的设计和制备中使用的瘦蛋白衍生物。例如，聚氨基酸可以是别的载体蛋白如Fc模块，在经由附接ABM或ABD实现的优点外，其还可以用来延长瘦蛋白或工程化多肽的循环半衰期。另外，这类聚氨基酸可以选自下组：血清清蛋白(如人血清清蛋白)、别的抗体或其部分(例如Fc区)、或其它聚氨基酸例如聚赖氨酸。如下文指示的，聚氨基酸的附接位置可以位于瘦蛋白模块的N端或C端或中间的其它位置，并且也可以通过化学“接头”模块与瘦蛋白连接，如肽接头或非肽接头。
聚合物可以具有任意分子量，并且可以是分支的或不分支的。对于聚乙二醇，为了易于操作和制造，优选的分子量在约2千道尔顿(kDa)和约100kDa(术语“约”指示在聚乙二醇制备物中，一些分子的重量会超过叙述的分子量，一些会小于叙述的分子量)之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约2kDa和约60kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约2kDa和约40kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约5kDa和约40kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约10kDa和约40kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约5kDa和约30kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约5kDa和约20kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇在约10kDa和约20kDa之间。根据期望的治疗概况(例如期望的持续释放持续时间、溶解度特征、对生物学活性的影响(若有的话)、操作的方便、抗原性的程度或缺乏和与本发明的瘦蛋白和/或工程化多肽附接的聚乙二醇的其它已知效应)，可以使用其它大小。可以影响选择可与瘦蛋白附接以生成依照本发明的瘦蛋白衍生物的特定分子量的PEG的其它考虑包括这类分子量PEG可以实现如下功能的程度：当存在于药物可接受组合物或配制剂中时，或者当对受试者施用(如通过注射进行)后暴露于生理学流体或组织时，降低瘦蛋白和/或工程化多肽的聚集和/或提高溶解度；在通过注射对受试者施用后降低由于施用瘦蛋白或工程化多肽引起的注射部位反应的发生；减少中和性抗体的生成，所述中和性抗体由于对受试者施用这类瘦蛋白或工程化多肽而可以针对瘦蛋白或工程化多肽生成；等等。
如此附接的聚合物分子的数目可以变化，并且本领域技术人员会能够确定对功能所致的影响。可以用相同或不同的化学模块(例如聚合物，如不同重量的聚乙二醇)单衍生化，或者可以提供二、三、四衍生化或衍生化的某种组合。聚合物分子与要衍生化的瘦蛋白或工程化多肽分子的比例会变化， 它们在反应混合物中的浓度也会变化。一般而言，就没有过量未反应的瘦蛋白(或工程化多肽，其也可以是该情况)或聚合物的反应效率而言，最佳比率会由诸如期望的衍生化程度(例如单、二、三等)、所选聚合物的分子量、聚合物是分支的还是或不分支的、和反应条件等因素确定。
化学模块应当在考虑对瘦蛋白和/或工程化多肽的功能或抗原域影响的情况中与瘦蛋白和/或工程化多肽附接。存在有本领域技术人员可用的许多附接方法。例如通过提述并入本文中的EP 0 401 384(将PEG与G-CSF偶联)，还可见Malik等,1992,Exp.Hematol.20:1028-1035(报告了使用Tresyl氯使GM-CSF聚乙二醇化(pegylation))。例如，聚乙二醇可以经由反应性基团如游离的氨基或羧基基团共价结合到氨基酸残基。反应性基团是那些可以与活化的聚乙二醇分子结合的。具有游离氨基基团的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和N端氨基酸残基。那些具有游离羧基基团的氨基酸残基可以包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基、和C端氨基酸残基。硫氢基基团也可以用作附接聚乙二醇分子的反应性基团。对于治疗目的优选的是在氨基基团附接，如在N端或赖氨酸基团附接。如果期望受体结合，那么应当避免在对受体结合重要的残基处的附接。
可以明确地期望设计并制备在本发明的工程化多肽的制备中使用的N端经化学修饰的瘦蛋白。使用聚乙二醇作为本组合物的例示，可以自多种聚乙二醇分子(根据分子量、分支，等等)、反应混合物中聚乙二醇分子与瘦蛋白和/或工程化多肽分子(其也可以是该情况)的比例、待实施的PEG化反应的类型、和获得选择的N端PEG化的蛋白质的方法选择。获得N端PEG化的制备物(即在必要时将此模块与其它单PEG化的模块分开)的方法可以通过从PEG化的蛋白质分子群体纯化N端PEG化的材料进行。选择性N端化学修饰可以通过还原烷基化完成，所述还原烷基化利用特定蛋白质中可用于衍生化的不同类型的伯氨基团(赖氨酸对N端)的差异反应性。在合适的反应条件下，用含有羰基基团的聚合物实现N端的蛋白质实质性选择性衍生化。例如，可以通过在如下的pH实施反应来使蛋白质选择性地在N端PEG化，该pH允许利用赖氨酸残基的ε-氨基基团和蛋白质N端残基的α-氨基基团之间的pKa差异。通过这类选择性衍生化，水溶性聚合物与蛋白质的附接受到控制：与聚合物的缀合主要在蛋白质的N端发生，并且对其它反应性基团如赖氨酸侧链氨基基团没有发生重大修饰。使用还原烷基化，水溶性聚合物可以是上文所描述的类型的，并且应当具有用于与蛋白质缀合的单一反应性醛。可以使用含有单一反应性醛的PEG化丙醛
在一些实施方案中，提供了具有如本文中描述的接头(例如L1)的化合物，所述接头共价连接多肽激素域与ABD肽。在一些实施方案中，第一接头(L1)在工程化多肽内共价连接HD1。在一些实施方案中，如本文中描述的多肽激素域(例如HD1)可以经由肽接头与ABD肽共价连接。任何接头是任选的；即任何接头可以仅是键。当存在时，接头的化学结构并不是至关重要的，因为它主要发挥间隔物功能。在一个实施方案中，接头包含由肽键连接的1至30个或更少的氨基酸。氨基酸可以选自20种天然存在的氨基酸。或者，可以通过化学合成、翻译后化学修饰或通过宿主细胞中的重组表达通过体内掺入来掺入非天然的氨基酸。这些中的一些氨基酸可以是糖基化的。
在某些实施方案中，1至30个或更少的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，接头是由大多数空间无阻的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸构成。聚甘氨酸是特别有用的，例如(Gly)3,(Gly)4(SEQ ID NO:116),(Gly)5(SEQ ID NO:117)，聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)、聚(Glyn-Ser)、聚(Glyn-Glu)、聚(Glyn-Lys)、聚(Glyn-Asp)和聚(Glyn-Arg)基序也是特别有用的。接头的其它具体例子是(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:118);(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:119);(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO:120)；和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO:121)。Gly和Ala的组合是特别有用的，Gly和Ser的组合亦然。如此，在另一个实施方案中，肽接头选自下组：富含甘氨酸的肽，例如Gly-Gly-Gly；序列[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:122),[Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:123),[Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:124)和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQID NO:125)，其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10，例如[Gly-Gly-Gly-Ser]1(SEQ ID NO:149),[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]1(SEQ ID NO:150),[Gly-Gly-Gly-Ser]4(SEQ ID NO:151),或[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3(SEQ ID NO:152)。
在某些实施方案中，可以使用带电荷的接头。这类带电荷的接头可以含有相当大数目的酸性残基(例如Asp,Glu等)，或可以含有相当大数目的碱性残基(例如Lys,Arg等)，从而使得接头分别具有低于7或大于7的pI。如技术人员理解的，在所有其它事件相同的情况下，在给定的接头中酸性或碱性残基的相对量越大，接头的pI会相应是越低或越高的。这类接头会赋予本文中公开的工程化多肽以优点，如改善这类多肽在特定pH处的溶解度和/或稳定性特 征，所述pH如生理学pH(例如在pH7.2和pH7.6之间，包括端点在内)，或包含这类多肽的药物组合物的pH。
例如，“酸性接头”是具有小于7；6和7之间(包括端点在内)；5和6之间(包括端点在内)；4和5之间(包括端点在内)；3和4之间(包括端点在内)；2和3之间(包括端点在内)；或1和2之间(包括端点在内)的pI的接头。类似地，“碱性接头”是具有大于7；7和8之间(包括端点在内)；8和9之间(包括端点在内)；9和10之间(包括端点在内)；10和11之间(包括端点在内)；11和12之间(包括端点在内)，或12和13之间(包括端点在内)的pI的接头。在某些实施方案中，酸性接头会含有选自下组的序列：[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:126);[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:127);[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:128);[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQID NO:129),[Gly-Asp]n(SEQ ID NO:130);[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:131);[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:132);[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:133)，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多；例如[Gly-Gly-Glu]6(SEQ ID NO:153)。在某些实施方案中，碱性接头会含有选自下组的序列：[Gly-Lys]n(SEQ ID NO:134);[Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:135);[Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:136);[Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:137),[Gly-Arg]n(SEQ ID NO:138);[Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:139);[Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQID NO:140);[Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:141)，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多；例如[Gly-Gly-Lys]6(SEQ ID NO:154)。
另外，可以制备拥有某些结构基序或特征(如α螺旋)的接头。例如，这类接头可以含有选自下组的序列：[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n(SEQ ID NO:142)，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多；例如[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3(SEQ ID NO:155),[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4(SEQ ID NO:156),或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5(SEQ ID NO:157)。
另外，可以采用非肽性接头来充当本文中描述的工程化多肽的L1模块。例如，如本领域中理解的，可以如此采用例示性的非肽接头如PEG接头。参见例如WO2000024782。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至1000kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至500kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至100kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至50kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至10kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至5kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接 头具有100Da至1kDa的分子量。在某些实施方案中，这类PEG接头具有100Da至500Da的分子量。
还应当理解的是适合于依照本发明使用的接头可以拥有一种或多种上文所描述的特征和基序。例如，接头可以包括酸性接头以及结构基序如α螺旋。类似地，接头可以包含碱性接头和结构基序如α螺旋。接头可以包含酸性接头、碱性接头和结构基序如α螺旋。另外，还应当理解的是依照本发明的工程化多肽可以具有超过1个接头，并且每个这类接头可以拥有一种或多种上文所描述的特征。
本文中描述的接头是例示性的，并且在本发明范围内的接头可以长得多，而且可以包含其它残基。在一个实施方案中，明确排除瘦蛋白化合物不通过接头与ABD直接连接的工程化多肽。
在一些实施方案中，所述工程化多肽包含N端ABD和C末端HD1。相反，在一些实施方案中，所述工程化多肽包含C末端ABD和N端HD1。在一些实施方案中，N端或C末端为瘦蛋白、瘦蛋白类似物、或瘦蛋白类似物。优选地，ABD位于瘦蛋白化合物的N端。在包含ABD和HD1的实施方案外，所述工程化多肽可以具有结构ABD-HD1或HD1-ABD(都以N端至C端取向阅读)。
理解的是，在没有明确指示本文中列出的工程化多肽的N端和/或C末端的情况下，要从N端至C端取向阅读工程化多肽。例如，在HD1是瘦蛋白或其类似物的情况下，术语HD1-ABD,HD1-L1-ABD,HD1-ABD等在没有明确指示N端和/或C端的情况下，意指瘦蛋白化合物驻留于工程化多肽的N端，而ABD驻留于C端。相反，如果明确指示N端和/或C端，那么要依照对末端的明确指示来阅读工程化多肽。例如，术语HD1C-term-ABD,HD1-L1-ABDN-term等意味着ABD驻留于工程化多肽的N端，而HD1驻留于C末端。
在上文所描述的工程化多肽的一些实施方案中，HD1是人瘦蛋白或美曲普汀。在一些别的实施方案中，HD1是如本文中描述的瘦蛋白类似物。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物是瘦蛋白A100,A300或A500。
在一些实施方案中，本文中描述的工程化多肽对血清清蛋白具有的亲和力不同于单独的ABD多肽(即在缺乏缀合的激素域的情况下)的亲和力。为了获得有效的结合，工程化多肽可以对血清清蛋白具有结合亲和力，从而使解离常数KD为例如低于约10-6M,10-7M,10- 8M,10-9M,10-10M,10-11M,10-12M,10-13M,10-14M或甚至10-15M。在一些实施方案中，亲和力并非是过度紧 密的，使得工程化多肽可以从清蛋白解离并引发生物学应答，例如结合受体如瘦蛋白受体。可以测量亲和力(优选地对人血清清蛋白)，如记载于PCT公开申请No.WO 2009/016043中的。
在一些实施方案中，本文中描述的工程化多肽优于具有与激素域缀合的不同模块的相应化合物，所述不同模块可以延长血浆半衰期(例如PEG或Fc或清蛋白)。在此背景中，术语“优于”指可以在评估疾病或病症的治疗中权衡的多种功能特性。例如，本文中描述的工程化多肽可以比具有与激素域缀合的不同模块的相应化合物需要不太有生物学活性的(激素域)组分，例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或甚至更少。关于别的例子，本文中描述的工程化多肽可以具有较高的效力，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或甚至更高的效力。
本文中涵盖的工程化多肽化合物包括如下文表2中列出的化合物。
表2.选出的工程化多肽
具体涵盖了上述序列中缺乏N端甲硫氨酸的化合物，例如，其中N端以VPIQKV(SEQID NO:158)或LAEAK(SEQ ID NO:159)开始，例如对于瘦蛋白化合物。N端甲硫氨酸主要为了便于细菌表达而存在。然而，本发明的缀合肽可以在真核宿主细胞(例如酵母(例如毕赤酵母(Pichia))、哺乳动物、杆状病毒)或具有翻译后N端蛋白水解加工的其它宿主细胞中表达以得到N端氨基酸，如在期望的激素或ABD序列的天然存在的成熟肽对应物中找到的。或者，用于表达和/或分泌的N端序列可以是例如如通过使用蛋白酶如TEB可以在翻译后除去的N端序列。
III.设计和生成方法
构建体的设计。可以在氨基酸水平上设计本文中描述的工程化多肽。然后，可以使用本领域中已知的多种软件产品回译(back translate)这些序列，从而例如针对基于期望的表达宿主的蛋白质表达、密码子优化、限制性位点含量优化核苷酸序列。例如，可以针对基于大肠杆菌的蛋白质表达和限制性位点含量优化核苷酸序列。基于感兴趣的核苷酸序列，可以为多步PCR提供重叠的寡核苷酸，如本领域中已知的。可以在本领域中公知的条件下在多重PCR反应中使用这些寡核苷酸以建立编码感兴趣蛋白质的cDNA。一个例子是1XAmplitaq缓冲液、1.3mM MgCl2、200uM dNTP、4U Amplitaq Gold、0.2uM每种引物(AmpliTaqGold,ABI)，循环参数为：(94C:30秒、58C:1分钟、72C:1分钟)，35个循环。
如本领域中已知的，可以将限制性位点添加至PCR产物的末端以在载体连接中使用。特定的位点可以包括Nde1和Xho1，使得cDNA然后可以在pET45b表达载体(Novagen)中的合适的阅读框中。通过使用这些位点，可以除去此载体中的任何N端His标签，因为那样的话翻译起始位点会在该标签的下游。一旦完成表达构建物，如本领域中已知的，可以使用例如T7启动子引物、T7终止子引物和标准ABI BigDye Term v3.1方案通过测序进行验证。可以从例如ABI3730DNA分析仪获得序列信息，并且可以使用Vector NTI v.10软件(Invitrogen)对其分析。可以以模块方式设计表达构建体，从而可以容易地切出并改变接头序列，如本领域中已知的。
可以将本领域中已知的或本文中描述的蛋白酶识别位点掺入构建体中，该构建体可用于本文中描述的重组工程化多肽的设计、构建、操作和生成。
通用生成方法。可以使用本领域中已知的生物学、化学和/或重组DNA技术来制备本文中描述的嵌合多肽。例示性的方法记载于本文和美国专利No.6,872,700;WO 2007/139941;WO 2007/140284;WO 2008/082274;WO 2009/011544;和美国公开文本No.2007/0238669，其公开内容通过提述完整并入本文并用于所有目的。在本文中列出了用于制备该化合物的其它方法。
可以使用标准的固相肽合成技术，如自动化或半自动化的肽合成仪来制备本文中描述的工程化多肽。通常，使用这类技术，将经α-N-氨基甲酰基保护的氨基酸和对树脂上的生长肽链附着的氨基酸于RT在惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷等)中在存在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑等)的情况下在存在碱(例如二异丙基乙胺等)的情况下偶联。使用试剂(例如三氟乙酸、哌啶等)从所得的肽-树脂除去α-N-氨基甲 酰基保护基，并且用下一期望的、要对肽链添加的、经N保护的氨基酸重复偶联反应。合适的N保护基是本领域中公知的，如叔丁基氧化羰基(t-butyloxycarbonyl)(tBoc)、芴基甲氧基羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)(Fmoc)等。可以从AppliedBiosystems Inc.(Foster City,Calif.)购买溶剂、氨基酸衍生物和肽合成仪中使用的4-甲基二苯甲基胺树脂。
对于化学合成，可以对工程化多肽使用固相肽合成，因为一般地，固相合成是一种具有向商业规模的卓越可扩缩性的直接方法，并且一般与相对较长的工程化多肽相容。可以使用NMP/HOBt(选项1)系统和具有加帽的tBoc或Fmoc化学(参见Applied BiosystemsABI430A肽合成仪用户手册，版本1.3B1988年7月1日，第6部分，第49页-第70页，AppliedBiosystems,Inc.,Foster City,Calif.)用自动肽合成仪(430A型,Applied BiosystemsInc.,Foster City,Calif.)来实施固相肽合成。可以用HF切割Boc-肽-树脂(-5℃至0℃,1小时)。可以用交替的水和乙酸从树脂提取肽，并将滤液冻干。可以依照标准方法(例如Introduction to Cleavage Techniques,Applied Biosystems,Inc.,1990,第6页-第12页)来切割Fmoc-肽树脂。也可以使用Advanced Chem Tech合成仪(MPS350型,Louisville,Ky.)来装配肽。
也可以使用本领域中已知的方法，如Sambrook等,1989,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,第2版,ColdSpringHarbor使用重组DNA技术来制备本文中描述的化合物。可以通过本领域已知的方法来制备非肽化合物。例如，可以使用本领域中已知的方法，如记载于Bartlett等,1986,Biorg.Chem.14:356-377的方法来制备含有磷酸的氨基酸和含有这类氨基酸的肽。
或者，可以通过本领域中公知的重组技术来生成工程化多肽。参见例如Sambrook等,1989(同上)。可以从多核苷酸表达通过重组技术生成的这些工程化多肽。考虑到密码子选择的简并性，本领域技术人员会领会编码这类工程化多肽的多核苷酸(包括DNA和RNA)可以从野生型cDNA(例如人瘦蛋白)获得，并且在期望时可以进一步工程化改造以掺入指定的取代。这些多核苷酸序列可以掺入促进mRNA在微生物宿主中的转录和翻译的密码子。可以依照本领域中公知的方法容易地构建这类制造序列。参见例如WO 83/04053，其通过提述完整并入本文中并用于所有目的。任选地，上述多核苷酸还可以编码N端甲硫氨酰基残基。可用于本发明的非肽化合物可以通过本领域中已知的方法来制备。例如，可以使用本领域中已知的方法来制备含有磷酸的氨 基酸和含有这类氨基酸的肽。参见例如Bartlett和Landen,1986,Bioorg.Chem.14:356-77。
可以利用多种表达载体/宿主系统以含有并表达工程化多肽编码序列。这些包括但不限于微生物如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。可用于重组蛋白质生成的哺乳动物细胞包括但不限于，VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(如COS-7)、WI38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。用于蛋白质重组表达的例示性方案是在本文中描述的和/或本领域中已知的。
因而，多核苷酸序列可用于生成新的且有用的病毒和质粒DNA载体、新的且有用的经转化的和经转染的原核和真核宿主细胞(包括培养物中培养的细菌、酵母和哺乳动物细胞)、和新的且有用的方法，该方法用于能够表达本工程化多肽的这类宿主细胞的培养生长。编码本文中工程化多肽的多核苷酸序列在工程化多肽的生成不足会得到减轻或其水平升高的需要会得到满足的情况中可用于基因疗法。
本发明还提供了用于本工程化多肽的重组DNA生成的方法。提供了用于从含有编码工程化多肽的核酸的宿主细胞生成工程化多肽的方法，包括：(a)在促进DNA分子表达的条件下培养含有编码工程化多肽的多核苷酸的宿主细胞；并(b)获得工程化多肽。
宿主细胞可以是原核或真核的，并且包括细菌、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞或其它细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
用于表达重组蛋白质的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员公知的。可以对宿主细胞菌株选择加工表达的蛋白质或产生在提供蛋白质活性中会有用的某些翻译后修饰的特定能力。对多肽的这类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。切割蛋白质的“前原(prepro)”形式的翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能也可能是重要的。不同宿主细胞（如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38，等等）对于这类翻译后活动具有特异性细胞机器和特征性机制，并且可以对其选择以确保对引入的外来 蛋白质的正确修饰和加工。
或者，可以采用酵母系统来生成本发明的工程化多肽。通过PCR扩增工程化多肽DNA的编码区。使用含有α交配因子基因的核苷酸1-20的一种引物和与此基因的核苷酸255-235互补的另一种引物在PCR反应中从酵母基因组DNA扩增编码酵母前原α前导序列的DNA(Kurjan和Herskowitz,1982,Cell,30:933-43)。将该前原α前导编码序列和工程化多肽编码序列片段连接到含有酵母醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，从而使该启动子指导由融合的前原α因子和成熟的工程化多肽组成的融合蛋白的表达。如由Rose和Broach,Meth.Enz.185:234-79,Goeddel编,Academic Press,Inc.,San Diego,California(1990)教导的，载体进一步包含在克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2微米”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基因、和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别提供细菌和酵母中的选择。leu-2d基因还促进酵母中质粒的拷贝数增加以诱导更高水平的表达。REP1和REP2基因编码牵涉质粒拷贝数调节的蛋白质。
使用已知的方法例如醋酸锂处理(Steams等,1990,.Meth.Enz.185:280-297)，将前段中描述的DNA构建体转化到酵母细胞中。当耗尽生长培养基中的葡萄糖后诱导ADH2启动子(Price等,1987,Gene55:287)。前原α序列实现从细胞分泌融合蛋白。伴随地，酵母KEX2蛋白从成熟的工程化多肽切割前原序列(Bitter等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330-5334)。
也可以使用商品化的表达系统，例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen,San Diego,California)遵循制造商的用法说明书在酵母例如毕赤酵母(Pichia)中重组表达本发明的工程化多肽。此系统也依赖于前原α序列来指导分泌，但是插入物的转录在甲醇诱导后由醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。从酵母生长培养基纯化分泌性工程化多肽，其通过例如用于从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化所述工程化多肽的方法进行。
或者，可以将编码工程化多肽的DNA克隆到杆状病毒表达载体例如pVL1393(PharMingen,San Diego,California)中。然后，依照制造商的指导(PharMingen)或已知的技术使用此工程化多肽编码载体来感染例如在sF9无蛋白质培养基中培养的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，及生成重组蛋白。使用本领域中已知的方法，例如肝素-Sepharose柱(Pharmacia,Piscataway,New Jersey)和序贯分子分筛柱(sequentialmolecular sizing column)(Amicon, Beverly,Massachusetts)从培养基纯化并浓缩蛋白质，并将其在合适的溶液，例如PBS中重悬。可以使用SDS-PAGE分析来表征蛋白质，例如通过显示确认期望的工程化多肽大小的单一条带来进行，全氨基酸氨基酸序列分析(例如Proton2090肽测序仪上的Edman测序)，或其N端序列的确认也可以。
例如，可以将编码预测的成熟工程化多肽的DNA序列克隆到含有期望的启动子和任选地前导序列的质粒中(参见例如Better等,1988,Science240:1041-1043)。可以通过自动化测序确认此构建体的序列。然后使用标准方法将该质粒转化到大肠杆菌菌株MC1061中，该方法采用CaCl2温育和热休克处理细菌(Sambrook等,同上)。在补充有羧苄西林(carbenicillin)的LB培养基中培养经转化的细菌，并通过在合适的培养基中生长诱导表达蛋白质的生成。若存在的话，前导序列会影响成熟工程化多肽的分泌，并且在分泌期间被切割。通过本文中描述的方法从细菌培养基纯化分泌性重组工程化多肽。
或者，可以在昆虫系统中表达工程化多肽。用于蛋白质表达的昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一种这类系统中，将苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)用作载体在草地夜蛾细胞中或在粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因。将工程化多肽编码序列克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于多角体蛋白启动子的控制下。工程化多肽的成功插入会使得多角体蛋白无活性，并生成缺乏外壳蛋白外壳的重组病毒。然后，使用重组病毒来感染草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，其中表达本发明的工程化多肽(Smith等,1983,J.Virol.46:584;Engelhard等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3224-3227)。
在另一个例子中，可以通过PCR扩增编码工程化多肽的DNA序列，并且将其克隆到合适的载体例如pGEX-3X(Pharmacia,Piscataway,New Jersey)中。pGEX载体设计为生成融合蛋白，其包含由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入载体克隆位点中的DNA片段编码的蛋白质。可以生成包含例如合适的切割位点的PCR引物。然后，可以从融合蛋白的GST部分切割重组融合蛋白。将pGEX-3X/工程化多肽构建体转化到大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene,La Jolla,California)中，并分离个别转化体，在LB培养基(补充有羧苄西林)中于37°C培养至波长600nm处光密度为0.4，接着在存在0.5mM异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri)的情况下再温育4小时。将来自个别转化体的质粒DNA纯化，并使用自动化测序 仪来部分测序以确认正确取向的期望的工程化多肽编码基因插入物的存在。
当预期在细菌中以不溶性包含体生成时，可以如上文描述的或如下纯化融合蛋白。通过离心收获细胞；在0.15M NaCl,10mM Tris,pH8,1mM EDTA中清洗；并用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)于RT处理15分钟。通过超声处理使裂解液澄清，并通过以12,000xg离心10分钟使细胞碎片沉淀。将含有融合蛋白的团粒在50mM Tris,pH8,和10mM EDTA中重悬，在50%甘油上成层，并以6000xg离心30分钟。将团粒在无Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中重悬。通过将重悬的团粒在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级来对融合蛋白进一步纯化(Sambrook等，见上文)。将凝胶在0.4M KCl中浸泡以显现蛋白质，将该蛋白质切出，并在缺少SDS的凝胶运行缓冲液中电洗脱。如果GST/工程化多肽融合蛋白在细菌中以可溶性蛋白质生成，那么可以使用GST纯化模块(Pharmacia Biotech)将其纯化。
融合蛋白可以进行消化以从成熟的工程化多肽切割GST。将消化反应(0.5mL PBS中20-40μg融合蛋白，20-30个单位人凝血酶(4000U/mg(Sigma))于RT温育16-48小时，并在变性SDS-PAGE凝胶上加载以分级反应产物。将凝胶在0.4M KCl中浸泡以显现蛋白质条带。可以使用自动化测序仪(Applied Biosystems473A型,Foster City,California)通过部分氨基酸序列分析确认与工程化多肽的预期分子量对应的的蛋白质条带的身份。
在本发明工程化多肽的重组表达的特别例示性方法中，可以通过磷酸钙方法用在pCMV载体(5’CMV启动子，3’HGH多聚A序列)和pSV2neo(含有neo抗性基因)中含有工程化多肽cDNA的质粒共转染293细胞。在一个实施方案中，应当在转染前用ScaI将载体线性化。类似地，可以使用一种备选的构建体，其使用掺有neo基因的类似pCMV载体。从单一细胞克隆选择稳定的细胞系，其通过在含有0.5mg/mL G418(新霉素样抗生素)的生长培养基中有限稀释10-14天来进行。通过ELISA或Western印迹针对工程化多肽的表达筛选细胞系，并且扩大高表达细胞系以用于大规模生长。
优选的是使用经转化的细胞进行长期、高产量的蛋白质生成，因此稳定表达是期望的。一旦用含有与期望的表达盒一起的选择标志物的载体转化这类细胞，可以允许细胞在将它们转换到选择培养基前在富集培养基中生长1-2天。选择标志物设计为赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达导入序列的细胞的生长和回收。可以使用适合于细胞的组织培养技术增殖经稳 定转化的细胞的抗性块。
可以使用许多选择系统来回收已经经过转化以用于重组蛋白质生成的细胞。这类选择系统包括但不限于分别在tk、hgprt或aprt细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。还有，可以将抗代谢物抗性用作对以下基因选择的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G418的抗性；also，其赋予对绿磺隆(chlorsulfuron)的抗性；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性。可用的其它可选择基因包括trpB（其允许细胞利用吲哚代替色氨酸），或hisD（其允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸）。为转化体的鉴定给出视觉指示的标志物包括花色素苷、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物、GUS、和萤光素酶及其底物萤光素。
可以使用自动化肽合成和重组技术两者的组合来生成本发明的工程化多肽。例如，可以合成或重组制备在如本文中公开的工程化多肽的制备中采用的下列任一项或两项：瘦蛋白；瘦蛋白类似物、活性瘦蛋白片段或瘦蛋白衍生物；和ABD；以及任选地，接头；然后使用本领域中已知的方法将其连接在一起，所述方法如“天然化学连接”或其已知变型，其中形成连接亲本化合物的酰胺键。参见例如美国专利No.6,326,468，其通过提述并入本文用于所有目的。或者，例如，本发明的工程化多肽可以含有修饰的组合，所述修饰包括缺失、取代、插入和通过PEG化(或其它模块，例如聚合物、脂肪酰基链、C端酰胺化)的衍生化。可以在各阶段中生成这类工程化多肽。在第一阶段，可以通过如描述的重组技术来生成中间工程化多肽，其含有缺失、取代、插入和其任意组合的修饰。然后，在如本文中描述的任选纯化步骤后，经由用合适的PEG化试剂(例如来自NeKtar Transforming Therapeutics,SanCarlos,California)的化学修饰将中间工程化多肽PEG化(或进行其它化学衍生化，例如酰化、C端酰胺化)以产生期望的工程化多肽衍生物。本领域技术人员会领会，可以将上文所描述的规程一般化以适用于含有修饰的组合的工程化多肽，所述修饰选自缺失、取代、插入、衍生化和本领域中公知的且由本发明涵盖的其它修饰手段。
可以通过使用甘氨酸氨基酸C端延伸的前体来完成C端酰胺化，所述前体在例如酵母(例如毕赤酵母)中以将分泌到培养基中的α-因子融合蛋白合成。纯化后，可以通过酶促酰胺化，例如肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM) 将工程化多肽前体的C端甘氨酸转化为酰胺。参见例如Cooper等,1989,Biochem.Biophys.Acta,1014:247-258。亦参见美国专利6319685(其通过提述完整并入本文并用于所有目的)，其教导了用于酶促酰胺化的方法，包括来自大鼠的α酰胺化酶，其在α酰胺化酶方面足够纯，从而展现出每mg蛋白质至少约25mU的比活，且足够不含蛋白水解杂质，从而适合与从天然来源纯化或通过重组DNA技术生成的底物一起使用。
可以通过本领域中已知的许多方法，包括如本文中描述的方法来纯化肽。在一种方法中，使用Waters Delta Prep3000系统通过RP-HPLC(制备型和分析型)纯化肽。可以使用C4、C8或C18制备柱(10μ,2.2X25cm;Vydac,Hesperia,Calif.)来分离肽，并且可以使用C4、C8或C18分析柱(5μ,0.46X25cm;Vydac)来测定纯度。可以将溶剂(A=0.1%TFA/水且B=0.1%TFA/CH3CN)以1.0ml/分钟的流速投递至分析柱，以15ml/分钟投递制备柱。可以在Waters Pico Tag系统上实施氨基酸分析，并使用Maxima程序处理。可以通过蒸汽相酸水解(115℃,20-24h)将肽水解。可以将水解产物衍生化，并通过标准方法分析(Cohen等,THEPICO TAG METHOD:A MANUAL OF ADVANCED TECHNIQUES FOR AMINO ACID ANALYSIS,第11页-第52页,Millipore Corporation,Milford,Mass.(1989))。可以通过M-Scan,Incorporated(West Chester,Pa.)实施快速原子轰击分析。可以使用碘化铯或碘化铯/甘油来实施质量校正。使用飞行时间检测的等离子体解吸电离分析可以在AppliedBiosystems Bio-Ion20质谱仪上实施。
工程化多肽表达测定法。用于测定宿主细胞的蛋白质表达水平的方法是可用的。在以下典型的方案中例示了可用于测定宿主细胞的蛋白质表达水平的规程。用2ul质粒DNA(工程化多核苷酸的表达载体)转化约25μl BL21大肠杆菌细胞。可以将细胞铺板，并在37℃温育过夜或于室温(RT)在48小时期间里温育。可以选出单个菌落，并用于在4ml具有合适抗生素的LB培养基中培养起始培养物达约6小时。通过向900ul储液添加100ul80%无菌甘油来制备甘油储液，然后可以将其温和混合并在-80C贮存。对于TCP未诱导的样品可以取出250μl样品。可以用5μl起始培养物接种等分试样，例如2ml含有合适抗生素的Magic培养基，然后可以将其于37C以300rpm温育过夜(长达24小时)。如本领域中已知的，Magic培养基是自身诱导的。或者，可以在250ml或125mlThompson烧瓶中用60μl起始培养物接种60ml含有合适抗生素的Magic培养基，然后将其于30C以300rpm温育过夜(长达24小时)。温育后，可以从每管 取出250μl培养物，并将细胞沉淀。可以将细胞在1ml50mM Tris pH8,150mM NaCl中重悬，可以对其添加0.1体积(100ul)POP培养试剂和1μl r-溶菌酶(在r-溶菌酶缓冲液中以1:750稀释)。可以将混合物充分混合，并于RT温育至少10分钟。然后，将制备物以14000x G离心10分钟。可以将上清液(可溶性级分)取出并保留，并且可以制备样品以进行凝胶分析(15μl+5μlLDS)。可以将剩余的包含体团粒通过超声处理在1ml1%SDS中重悬。可以制备样品以进行凝胶分析(15ul+5μl LDS)。对于未诱导的样品，可以添加1.0体积POP培养试剂和1μlr-溶菌酶(在r-溶菌酶缓冲液中以1:750稀释)。可以将溶液充分混合，并于RT温育至少10分钟。这些样品可以不需要离心。然后，可以制备样品以进行凝胶分析(15ul+5μl LDS)。可以运行1XMES缓冲液中的非还原性NU-PAGE凝胶(4-12%)，并用SimplyBlue微波方案染色。可以进行脱色过夜，如本领域中已知的。可以保留凝胶图像，并进行分析以测定蛋白质表达水平。
包含体制备。对于在包含体级分中找到的工程化多肽，以下规程可以是有益的。对于每50ml培养物，可以将细胞团粒在最少100ml裂解缓冲液中重悬。在添加30ml时，可以使用10ml移液管来重悬，然后再用70ml冲洗管。可以将重悬的细胞溶液以100PSI(min)多次运行(例如4次通过)流过微射流仪(microfluidizer)，注意贯穿整个过程将室在冰水中保持。可以以14000x g将流化的浆体离心20分钟(例如JLA10.5，10,000rpm，使用250ml Nalgene瓶)。在用移液管尖端破坏后，可以将包含体团粒在冰上在冰冷的裂解缓冲液中用搅拌棒和搅拌盘于4C重悬1小时。在用移液管尖端破坏后，可以将团粒在蒸馏H2O中用搅拌棒和搅拌盘于4C第二次重悬1小时，接着以14000x g离心15分钟。可以将上清液取出并弃去。可以于-80C贮存所得物。
蛋白质纯化。如本文中描述的，众多用于分离表达的多肽的方法是已知的。以下是一个例子。可以将包含体团粒在合适体积的溶解缓冲液(8M尿素或8M胍,50mM Tris,10mMDTT,pH7.75)中在RT溶解1小时。溶解的团粒可以以27000g离心20分钟。可以将经过滤(例如0.4um)的上清液于RT逐滴转移到适当体积的重折叠缓冲液(50mM Tris-HCl,1M尿素,0.8M精氨酸,4mM半胱氨酸,1mM胱胺;pH8)中。然后，可以将所得物在温和混合的情况下置于4°C过夜或更长。可以将样品浓缩，并在4C环境中使用GE HealthsciencesAKTAFPLCTM以1-2ml/分钟在凝胶过滤柱(SuperdexTM7526/60)上运行。可以 将含有合适蛋白质的级分经由SDS-PAGE鉴定，合并，并运行通过第二凝胶过滤柱。然后，可以将合并的蛋白质在Amicon滤器中浓缩至合适的浓度，并使用例如EndosafePTS阅读器(Charles River)测定内毒素水平，如本领域中已知的。一旦蛋白质样品已经通过内毒素标准，那么就可以将其无菌过滤，分配成等分试样，并运行经过质量控制测定法。质量控制测定法可以包括分析型HPLC-SEC、非还原性SDS PAGE和RP HPLC–MS以获得大致质量。可以在1xPBS(137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、4.3mM磷酸二钠、1.4mM磷酸单钾，pH7.2)中获得蛋白质，分配成等分试样，并速冻以于-70C至-80°C贮存。IV.使用和治疗疾病的方法
适应症。涵盖通过本文中描述的多肽化合物和方法有益治疗的多种疾病和病症。
肥胖症和超重。肥胖症及其关联病症（包括超重）是美国和全世界的常见且严重的公共健康问题。上身肥胖症是2型糖尿病已知的最强的风险因子，并且是心血管疾病的强风险因子。肥胖症是高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性病症如多囊卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌、以及全身麻醉并发症发生率增加的公认的风险因子。参见例如Kopelman,2000,Nature404:635-43。
肥胖症缩短寿命，并且携带上文所列出的合并症，以及病症如感染、静脉曲张、黑棘皮病、湿疹、运动不耐(exercise intolerance)、胰岛素抗性、高血压血胆固醇过多、胆石症、矫形损伤(orthopedic injury)和血栓栓塞性疾病的严重风险。参见例如Rissanen等,1990,Br.Med.J.,301:835-7。肥胖症也是称作胰岛素抗性综合征或“综合征X”和代谢综合征的一组状况的风险因子。肥胖症和关联病症的全世界医学成本是巨大的。
认为肥胖症的发病机制是多因素的。一个问题是，在肥胖的受试者中，营养利用度和能量消耗不进入平衡，直到存在有过量的脂肪组织。中枢神经系统(CNS)控制能量平衡，并协调适合于动物代谢状态的多种行为的、自主的和内分泌的活动。控制这些活动的机制或系统在前脑(例如下丘脑)、后脑(例如脑干)和脊髓间广泛分布。最终，来自这些系统的代谢(即燃料利用度)和认知(即习得偏爱)信息得到整合，并且开启(进餐获取和启动)或关闭(进餐终止)参与食欲(食物寻找)和完成(摄食)行为的决定。认为下丘脑主要负责整 合这些信号，然后向脑干发出命令。脑干核控制完成运动控制系统的元件(例如负责咀嚼和吞咽的肌肉)。因而，这些CNS核照字面意义称为构成摄取行为的“最终共同途径”。
神经解剖学和药理学证据支持能量和营养稳态的信号在前脑核中整合，而且完成运动控制系统驻留于脑干核中，可能在围绕三叉神经运动核的区域中。在下丘脑和脑干之间有广泛的交互连接。多种CNS定向性抗肥胖症治疗剂(例如小分子和肽)主要聚焦于驻留于下丘脑中的前脑基质和/或驻留于脑干中的后脑基质。
肥胖症仍然是一种不太好治疗的、慢性的、基本上难治的代谢性病症。因而，需要可用于受试者中的重量减轻和/或重量维持的新疗法。这类疗法会对受试者的健康产生深刻的有益效果。采用本文中公开的工程化多肽(单独地或与其它抗肥胖症药剂联合(参见例如WO 2009064298和US 20080207512))的方法和疗法可以提供这类有益效果。
瘦蛋白缺陷。已经显示了瘦蛋白缺陷导致肥胖症。一种瘦蛋白缺陷形式是先天性瘦蛋白缺陷，即一种罕见的遗传病症。参见Montaque等,1997,Nature387:903-908。重度瘦蛋白缺陷可以是不受控制的胰岛素缺陷性糖尿病的结果，所述不受控制的胰岛素缺陷性糖尿病源自对胰岛素分泌性β细胞的破坏。理论化的是，胰岛素缺乏导致脂肪组织中甘油三酯的合成和贮存，这阻止重量增加，并且继而显著降低血浆瘦蛋白水平，因为瘦蛋白是在脂肪组织中合成的。可以用瘦蛋白替换疗法，诸如经由每日瘦蛋白或瘦蛋白激动剂注射来治疗这些和其它瘦蛋白缺陷、以及源自这类缺陷的疾病及病症。本文中描述的工程化多肽能提供对这类疾病和病症的更方便的且有利的治疗性处理。
糖尿病和心血管疾病。认为糖尿病是一种复杂的慢性疾病，其中糖尿病患者中占所有病例死亡的60%至70%是心血管并发症的结果。糖尿病不仅被视为冠心病风险等同体，而且还鉴定为不利事件的独立预测物，所述不利事件包括复发性心肌梗死、充血性心力衰竭、和心血管事件后的死亡。预期采用更紧密的葡萄糖控制和心血管风险因子的攻击性治疗会降低冠心病并发症的风险，并且改善糖尿病患者间的总体存活。然而，糖尿病患者比非糖尿病患者以2至3倍更可能经历急性心肌梗死，并且糖尿病患者比非糖尿病患者少活8至13年。
了解糖尿病/急性心肌梗死患者的高风险性质，美国心脏病学会/美国心 脏学会(American College of Cardiology/American Heart Association,“ACC/AHA”)不稳定心绞痛(unstable angina)或非ST-升高心肌梗死(统称为“ACS”)住院患者管理临床实践指南最近认为住院糖尿病患者是一个需要高血糖症攻击性管理的特殊群体。具体地，该指南宣称住院糖尿病/ACS患者的降葡萄糖疗法应当目标为达到小于10mg/dL的餐前葡萄糖、小于180mg/dL的最大每日目标、和小于7%的出院后血红蛋白A1c。
在全国性老年ACS患者样本中，表明糖尿病患者中30天死亡率的增加与医院收治后具有较高葡萄糖值的患者一致。参见“Diabetic Coronary Artery Disease&Intervention,”Coronary Therapeutics2002,Oak Brook,IL,2002年9月20日。有越来越多的证据的是，医院收治后持续的高血糖而非短暂升高的葡萄糖与严重的不利事件相关。尽管不容易知道患者中高血糖和血管风险的理想度量，但是表现为住院期间的均值葡萄糖值对死亡率最具预测性。在来自美国的超过40家医院的ACS患者的不同研究中，发现与医院收治后的随机葡萄糖值形成对比，持续性高血糖对住院死亡率更具预测性。参见AcuteCoronary Syndrome Summit:A State of the Art Approach,Kansas City,MO,2002年9月21日。与收治后的葡萄糖值相比，在整个住院里葡萄糖控制的逻辑回归模型对死亡率最具预测性。在120mg/dL上葡萄糖每升高10mg/dL，住院期间的死亡风险几乎增加2倍。在连续性糖尿病/ACS患者的一个较小分组中，随着医院收治后葡萄糖水平升高，存在有1年时死亡率的分级增加。在医院背景中，ACC/AHA指南建议启动攻击性胰岛素疗法以实现住院期间的较低血液葡萄糖。
已经报道了瘦蛋白对于治疗糖尿病可以具有直接的益处，特别是在I型糖尿病和II型糖尿病(存在或不存在肥胖症)中，且更特别是在低血清瘦蛋白的状况中。已经报道了瘦蛋白补充在伴有或没有肥胖症的1和2型糖尿病的多种动物模型中降低或阻止高胰岛素血症、胰岛素抗性和高血糖症。例如，通过药理学施用瘦蛋白或用腺病毒基因疗法产生的高瘦蛋白血浆水平在STZ诱导的糖尿病中降低高血糖和关联的血浆胰高血糖素水平升高，尽管胰岛素水平持续较低。
脂质调节疾病。如本领域中已知的，脂肪营养不良的特征在于身体脂肪组织的异常或变性性状况。血脂障碍是血液中正常脂质组分受破坏。认为延长的胰岛素水平的升高可以导致血脂障碍。高脂血是血液中存在升高或异常 水平的脂质和/或脂蛋白。下丘脑性闭经是一种由于牵涉下丘脑的问题所致的月经停止数月的状况。已经发现了具有下丘脑性闭经的女性中瘦蛋白替换疗法改善生殖、甲状腺和生长激素轴和骨形成标志物，而不引起不利效应。参见例如Oral等,N Engl J Med.2004,351:959-962,987-997。脂肪肝病，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)指一大批肝病，其范围为简单的脂肪肝(脂肪变性(steatosis))，至非酒精性脂肪肝炎(NASH)，至肝硬化(cirrhosis)(不可逆的、进行性肝瘢痕化)。NAFLD的所有阶段共同具有肝脏细胞(肝细胞)中的脂肪积累(脂肪浸润)。认为瘦蛋白是包括NASH在内的各种慢性肝病中炎症和纤维化进展的关键调节物之一。见例如Ikejima等,HepatologyRes.33:151-154。
另外，不希望受任何理论束缚，认为2型糖尿病中的相对胰岛素缺陷、葡萄糖毒性、和通过经由门静脉从腹内脂肪组织投递的升高而增加的肝游离脂肪酸负荷暗示为脂肪肝病症的可能原因。实际上，已经假设进食行为是驱动肥胖症的代谢综合征及其许多必然结果(包括NASH)的关键因素。因而，如已经在2型糖尿病中证明的，针对减少食物摄取并增加小餐次数的治疗可以有效治疗并预防NASH。促进胰岛素分泌和体重减少，并延迟胃排空的药物也有效改善葡萄糖耐受性，并且如此可以改善脂肪肝及其伴随的高胰岛素血症。如此，瘦蛋白、瘦蛋白类似物例如美曲普汀、或其活性片段的使用可以完全适合作为针对该状况的治疗形式。因此，本文中描述的工程化多肽(其包括瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段)在治疗脂肪肝病症中可以有用的。
阿耳茨海默氏病。如本领域中已知的，阿耳茨海默氏病(AD)与脑中的斑块和缠结(其包括A-β蛋白的失调)有关。认为脑脂质复杂地牵涉A-β相关的致病途径，且脂质稳态的一种重要调控物为瘦蛋白。因而，瘦蛋白可以调控双向A-β动态，在胞外降低其水平。实际上，已经表明了对AD转基因动物长期施用瘦蛋白降低脑A-β负载，从而成为其治疗潜力的基础。参见Fewlass等,2004,FASEB J.,18:1870-1878。另外，2型糖尿病和AD共享的流行病学和生化特征在于两者都以具有纤维状构象的不溶性蛋白聚集物(在2型DM胰岛中为胰淀素(amylin)，而在AD脑中为Aβ)为特征。不希望受任何理论束缚，认为类似的毒性机制可以表征2型DM和AD。参见Lim等,FEBS Lett.,582:2188-2194。
代谢综合征X。代谢综合征X的特征为胰岛素抗性、血脂障碍、高血压、和脂肪组织的内脏分布，并且在2型糖尿病的病理生理学中起着枢要作用。 还已经发现了它与NASH、纤维化、和肝损伤高度关联。因而，本文中描述的工程化多肽可用于治疗代谢综合征X。
亨延顿氏病。亨延顿氏病是一种常染色体显性的神经变性性疾病。该疾病的特征包括运动障碍、痴呆、精神病问题和无意识的重量减轻。本文中描述的嵌合多肽可用于治疗亨延顿氏病。
因而，在一个方面，提供了用于治疗受试者中疾病或病症的方法。受试者需要治疗该疾病或病症。所述疾病或病症可以是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、阿耳茨海默氏病、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病或糖尿病(包括I型和II型)。可以通过本文中描述的化合物和方法治疗的其它疾病和病症包括非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨延顿氏病。治疗方法包括以有效治疗该疾病或病症的量对受试者施用如本文中描述的工程化多肽。工程化多肽会包括瘦蛋白、瘦蛋白片段或瘦蛋白类似物作为HD1。因而，所述工程化多肽可以具有下列一种结构：ABD-HD1,HD1-ABD,ABD-L1-HD1或HD1-L1-ABD。
在本文中描述的所有治疗实施方案中，所述瘦蛋白可以是人瘦蛋白或美曲普汀。在一些实施方案中，所述瘦蛋白类似物与人瘦蛋白具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，所述瘦蛋白类似物与小鼠瘦蛋白具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，所述瘦蛋白类似物与大鼠瘦蛋白具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，所述瘦蛋白类似物与鸭嘴兽瘦蛋白具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，所述瘦蛋白类似物与海豹瘦蛋白具有至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，所述瘦蛋白类似物为瘦蛋白A100,A300或A500。
V.测定法
一般地，用于生成和测定本文中描述的工程化多肽的方法是熟练技术人员可用的。此外，具体的方法记载于本文以及本文引用的专利公开文本和其 它参考文献中，其通过提述并入以用于此额外目的。
食物摄取。不希望受任何理论束缚，认为食物摄取可用于评估如本文中描述的化合物的效用。例如，已知许多代谢病理学涉及食物摄取(例如糖尿病、肥胖症)。因而，可以进行初始筛选以确定通过施用本文中描述的化合物调控食物摄取的程度，并且阳性初始筛选在化合物的后续开发中可以是有用的。
多种食物摄取测定法是本领域技术人员可用的。例如，在食物摄取的所谓“家笼模型(home cage model)”中，将受试者(例如大鼠)在其家笼中维持，并在注射测试化合物后测量连同受试者总重量的食物摄取。在食物摄取测定法的所谓“喂养模式模型”中，使受试者(例如大鼠)习惯于喂养室和测试前的注射。在测试化合物施用后，将受试者立即放到喂养室中，并且将食物摄取以时间函数(例如1分钟时间间隔)自动测定。对于这两种测试，食物是标准食品(chow)或本领域中已知的多种食品(例如高脂肪)之任一种。在所谓的“小鼠食物摄取”测定法中，可以对测试化合物测试食欲抑制或对饮食诱导的肥胖症(DIO)小鼠中体重的影响。在典型的小鼠食物摄取测定法中，将雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)以12:12小时光照：黑暗周期在0600时光照成组收容。除非如记载的，水和标准丸状小鼠食品饮食是随意可用的。在实验前一天在约1500时开始，使动物禁食。在实验当天早上，将动物分为实验组。在典型的实验中，n=4笼，3只小鼠/笼。在时间=0分钟，通常以范围为约10nmol/kg至75nmol/kg的量对所有动物给予媒介物或化合物的腹膜内注射，并立即给予预先称重的标准食品量(10-15g)。在多个时间，通常30,60,和120分钟时取出食物并称重以测定消耗的食物量。参见例如Morley等,1994,Am.J.Physiol.267:R178-R184。通过从最初在时间=0时提供的食物重量减去在例如30,60,120,180和/或240分钟时间点时剩余的食物重量来计算食物摄取。显著的处理效果通过ANOVA鉴定(p<0.05)。在存在显著差异的情况下，使用邓奈特(Dunnett)氏检验(Prism v.2.01,GraphPad Software Inc.,San Diego,Calif.)将测试均值与对照均值进行比较。对于本文中描述的任何测试，可以通过任何手段来施用测试化合物，包括注射(例如皮下、腹膜内等)、口服、或本领域中已知的其它施用方法。
体外测定法。不希望受任何理论或作用机制束缚，认为体外(例如受体)测定法的结果和药剂用于治疗代谢性疾病和病症的效用之间存在相关性。因 而，体外测定法(例如基于细胞的测定法)可用作潜在代谢剂的筛选策略，如本文中描述的。多种体外测定法是本领域中已知的，包括那些如下描述的。
瘦蛋白结合测定法。可以通过测试化合物在从由32D OBECA细胞系呈现的表面膜表达的嵌合瘦蛋白(Hu)–EPO(Mu)受体置换125I-重组瘦蛋白(鼠)中的效力来测量瘦蛋白结合(J Biol Chem1998;273(29):18365-18373)。可以从收获的32D OBECA细胞汇合细胞培养物通过匀浆化制备纯化的细胞膜。可以在96孔聚苯乙烯板中将膜与125I-rec-鼠瘦蛋白和递增浓度的测试化合物于环境温度一起温育3小时。然后，通过快速过滤到在0.5%PEI(聚乙烯亚胺)中预封闭至少60’的96孔GF/B板上分开结合的和未结合的配体级分。然后，可以干燥玻璃纤维板，添加闪烁体，并通过在能够读出放射性标记的碘的多孔闪烁计数器上阅读来测定CPM。
瘦蛋白功能测定法。可以在用测试化合物处理异位表达嵌合Hu-瘦蛋白/Mu-EPO受体的32D-Keptin细胞后测量升高的磷酸化STAT5(信号转导物和转录激活物5)水平。可以使32D-Keptin细胞(与32D-OBECA细胞相同，但是在具有瘦蛋白的培养物中维持)脱离瘦蛋白过夜，然后在96孔板中用测试化合物于37°C处理30分钟，接着进行细胞提取。可以使用Perkin Elmer pSTAT5测定试剂盒以384孔形式(ProxiplateTM384Plus)测定细胞裂解物中的pSTAT5水平。可以相对于来自用人瘦蛋白处理的细胞的细胞裂解物中的最大信号测定测试化合物的效力。
VI.药物组合物
在一个方面，提供了包含与药学可接受赋形剂(例如载体)组合的本文中描述的化合物的药物组合物。如本文中使用的，术语“药学可接受载体”指药用赋形剂，例如适合于肠或胃肠外应用的药学、生理学可接受的有机或无机载体物质，其不与活性剂有害地起反应。合适的药学可接受载体包括水、盐溶液(例如林格(Ringer)氏溶液等)、醇、油、明胶、和碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、和聚乙烯吡咯烷。可以将这类制剂灭菌，并且在期望时与不与本发明的化合物有害地起反应的辅助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、染料、和/或芳香物质等混合。
在另一个方面，提供了药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂组合的 如本文中描述的工程化多肽。在一个实施方案中，药物组合物是口服药物组合物，如本文中描述的。在一些实施方案中，所述药物组合物是长效药物组合物。术语“长效的”在药物组合物施用的背景中指作用持续时间。因而，可以以例如1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月或甚至更长的时间间隔施用长效药物组合物。在一个优选的实施方案中，施用为一日一次(即，每天一次)。在一个更优选的实施方案中，施用为一周一次(每周一次)。
A.方法
可以对受试者单独地或者可以共施用本文中描述的工程化多肽。共施用意为包括单独或组合地(超过一种化合物)同时或序贯施用化合物。例如，已经发现了可以用包括瘦蛋白(例如美曲普汀)和某些其它抗肥胖症化合物的联合疗法有益地治疗肥胖症。参见例如美国公开的申请No.2008/0207512。因而，包含ABD和瘦蛋白的本文中描述的工程化多肽对于肥胖症的治疗可以是有用的。
或者，可以与其它抗肥胖症药剂如艾塞那肽(exenatide)或利拉鲁肽(liraglutide)共施用个别工程化多肽。
由于瘦蛋白化合物是治疗活性化合物，本公开内容提供了用作药物(即在疗法中使用)的组合物。本文中还明确涵盖并例示包含嵌合多肽(液体或干形式)和任选地至少一种药学可接受载体和/或赋形剂的组合物。
在期望时，也可以与如本领域中已知的其它活性物质(例如以降低代谢性降解)或其它治疗活性剂共施用所述制剂。
胰淀素。胰淀素是由胰腺β细胞合成的肽激素，其响应营养物摄取而与胰岛素共分泌。胰淀素的序列在哺乳动物物种间高度保守，其与降钙素基因相关肽(CGRP)、降钙素、垂体中间叶激素、和肾上腺髓质素具有结构相似性，如本领域中已知的。胰淀素的葡萄糖调节作用补充胰岛素的葡萄糖调节作用，其通过经由抑制营养物刺激的胰高血糖素分泌调节循环中葡萄糖出现的速率，并减缓胃排空来实现。在经胰岛素治疗的糖尿病患者中，普兰林肽(人胰淀素的一种合成的且等效的类似物)通过抑制不适当地升高的餐后胰高血糖素分泌并延缓胃排空来降低餐后葡萄糖偏移(excursion)。大鼠胰淀素、人胰淀素和普兰林肽的序列如下：
大鼠胰淀素：
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID NO：108)；
人胰淀素：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(SEQ ID NO：109)；
普兰林肽：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID NO：110)
达瓦林肽(Davalintide)。达瓦林肽，也称为“AC-2307”，是一种可用于治疗多种疾病适应症的有力的胰淀素激动剂。参见WO 2006/083254和WO 2007/114838，每篇通过提述完整并入本文中并用于所有目的。达瓦林肽是一种嵌合肽，其具有胰淀素或降钙素及其类似物的N端环区、降钙素或其类似物的α-螺旋区的至少一部分的α-螺旋区或具有胰淀素α-螺旋区和降钙素α-螺旋区或其类似物的一部分的α-螺旋区、和胰淀素或降钙素的C端尾部区。人降钙素、鲑鱼降钙素和达瓦林肽的序列如下：
人降钙素：
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQ ID NO：111)；
鲑鱼降钙素：
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(SEQ ID NO：112)；
达瓦林肽：
KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(SEQ ID NO：113)。
不希望受任何理论束缚，认为胰淀素和达瓦林肽及其片段和类似物可要求C端酰胺化来引发完全的生物学应答。理解的是，可以在C端酰胺化胰淀素化合物，如本文中描述的那些胰淀素化合物，其包括胰淀素和/或达瓦林肽及其片段和类似物。
“胰淀素激动剂化合物”包括天然的胰淀素肽、胰淀素类似物肽、和其它具有胰淀素激动剂活性的化合物(例如小分子)。“胰淀素激动剂化合物”可以自天然来源衍生，可以是合成的，或可以自重组DNA技术衍生。胰淀素激动剂化合物具有胰淀素激动剂受体结合活性，并且可以包含氨基酸(例如天然的、非天然的或其组合)，肽模拟物，化学模块等。使用胰淀素受体结合测定法或通过在比目鱼肌测定法中测量胰淀素激动剂活性，熟练技术人员会识别胰淀素激动剂化合物。在一个实施方案中，胰淀素激动剂化合物在胰淀素受体结合测定法中会具有约200nM或更低、约100nM或更低、或约50nM或更低的IC50，所述胰淀素受体结合测定法诸如在本文、美国专利No. 5,686,411、和美国公开文本No.2008/0176804(其公开内容通过提述完整并入本文并用于所有目的)中描述的胰淀素受体结合测定法。在一个实施方案中，胰淀素激动剂化合物在比目鱼肌测定法(如在本文中和美国专利No.5,686,411中记载的)中会具有约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、或约5nM或更低的EC50。在一个实施方案中，胰淀素激动剂化合物与 25,28,29Pro-人胰淀素具有至少90%或100%序列同一性。在一个实施方案中，胰淀素激动剂化合物是胰淀素(例如人胰淀素、大鼠胰淀素等)和降钙素(例如人降钙素、鲑鱼降钙素等)的肽嵌合物。合适的且例示性的胰淀素激动剂化合物还记载于美国公开文本No.2008/0274952中，其公开内容通过提述完整并入本文并用于所有目的。
如本文中使用的，“胰淀素类似物”意指与胰淀素的天然存在形式(大鼠的或人的或来自任何其它物种的)具有至少50%序列同一性，优选地至少70%序列同一性，且通过对参照氨基酸序列的修饰(包括插入、取代、延伸和/或缺失)自其衍生而来的胰淀素激动剂。
胰淀素类似物序列与参照胰淀素可以具有至少50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,90%或95%的氨基酸序列同一性。在一个方面，相对于参照化合物，类似物具有0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或甚至16处氨基酸取代、插入、延伸、和/或缺失。在一个实施方案中，胰淀素类似物可以包含保守或非保守的氨基酸取代(包括非天然的氨基酸和L和D形式)。优选地，这些类似物为肽、肽衍生物或肽模拟物。典型的胰淀素类似物会是肽，特别是32-37个氨基酸，例如27-45，特别是28-38，且甚至31-36个氨基酸的肽。
与大鼠和人胰淀素具有同一性的胰淀素类似物包括25,28,29Pro-h-胰淀素(普兰林肽)(SEQ ID NO:110)；脱-1Lys-h-胰淀素(SEQ ID NO:161)； 25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:162)；18Arg,25,28Pro-h-胰淀素(SEQ IDNO:163)；脱-1Lys,18Arg,25,28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:164)；18Arg,25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:165)；脱-1Lys,18Arg,25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:166)；脱-1,Lys25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:167)；25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:168)；28Pro-h-胰淀素,2,7-环-[2Asp,7Lys]-h-胰淀素(SEQ ID NO:169)；2-37h-胰淀素(SEQ ID NO:170)；1Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO:171)；2Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO:172)；2,7Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO:173)；1Ser-h-胰淀素(SEQID NO:174)；29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:175)；25,28Pro-h-胰淀素(SEQID NO:176)；脱-1Lys,25,28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:177)；
23Leu,25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:178)；23Leu25Pro26Val28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO:179)；脱-1Lys,23Leu,25Pro,26Val,28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO: 180)；18Arg,23Leu,2SPro,26Val,28pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：181)；
18Arg,23Leu,25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：182)；18Arg23Leu,25,28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：183)；17Ile,23Leu,25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：184)；
17Ile,25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：185)；脱-1Lys,17Ile,23Leu,25,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：186)；17Ile,18Arg,23Leu-h-胰淀素(SEQ ID NO：187)；
17Ile,18Arg23Leu26Val29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：188)；
17Ile,18Arg,23Leu,25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：189)；
13Thr,21His,23Leu,26Ala28Leu,29Pro,31Asp-h-胰淀素(SEQ ID NO：190)；
13Thr,21His,23Leu,26Ala,29Pro,31Asp-h-胰淀素(SEQ ID NO：191)；脱
-1Lys,13Thr,21His,23Leu,26Ala,28Pro，31Asp-h-胰淀素(SEQ ID NO：192)；
13Thr,18Arg,21His,23Leu,26Ala,29Pro,31Asp-h-胰淀素(SEQ ID NO：193)；
13Thr,18Arg,21His,23Leu,28,29Pro,31Asp-h-胰淀素(SEQ ID NO：194)；和
13Thr,18Arg,21His，23Leu，25Pro，26Ala，28,29Pro,31Asp-h-胰淀素(SEQ ID NO：195)。
合适的和例示性的胰淀素激动剂化合物还记载于PCT专利公开WO2010/085700。
胰淀素类似物包括下述式(I)的残基1-37的氨基酸序列，其中式(I)中列出的氨基酸的多达25％可以缺失或用不同氨基酸取代：
X’-Xaa1-Cys2-Asn3-Thr4-Ala5-Thr6-Cys7-Ala8-Thr9-Gln10-Arg11-Leu12-Ala13-Asn14-Phe15-Leu16-Val17-His18-Ser19-Ser20-Xaa21-Asn22-Phe23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Thr30-Xaa31-Val32-Gly33-Ser34-Asn35-Thr36-Tyr37-X(SEQ ID NO：8001)
(I)。
在式(I)中，X’是氢、N端加帽基团、或与持续时间延长模块的接头。Xaa1是Lys或键，Xaa21是Lys、Cys或Asn，Xaa24是Lys、Cys或Gly，Xaa25是Lys、Cys或Pro，Xaa26是Lys、Cys或Ile，Xaa27是Lys、Cys或Leu，Xaa28是Lys、Cys或Pro，Xaa29是Lys、Cys或Pro，且Xaa31是Lys、Cys或Asn。进一步关于式(I)，变量X代表C端官能度(例如C端帽)。X是取代或未取代的氨基、取代或未取代的烃基氨基(alkylamino)、取代或未取代的二烃基氨基、取代或未取代的环烃基氨基、取代或未取代的芳基氨基、取代或未取代的芳烷基氨基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的芳烷基氧基、或羟基。如果具有式(I)残基1-37的序列的多肽组分的C端用官能度X加帽，那么优选地，X是胺，由此形成C端酰胺。在一些实施方案中，在依照式(I)的多肽组分中缺失或取代式(I)残基1-37的氨基酸的多达5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或甚至50％。在一些实施方案中，相对于式(I)中列出的氨基酸序列，胰淀素类似物组分具有0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15或甚至16处氨基酸取代。在一些实施方案中，胰淀素类似物具有相对于依照式(I)的氨基酸序列的残基1-37具有限定序列同一性的序列。在一些实施方案中，本文中描述的胰淀素类似物和式(I)的残基1-37之间的序列同一性为50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或甚至更高。在一些实施方案中，可以缺失或用不同氨基酸取代式(I)的残基1-37中列出的氨基酸的多达50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%,15%,10%,5%或甚至更少。在一些实施方案中，序列同一性在75%-100%的范围内。在一些实施方案中，序列同一性在75%-90%的范围内。在一些实施方案中，序列同一性在80%-90%的范围内。在一些实施方案中，序列同一性为至少75%。在一些实施方案中，胰淀素类似物具有式(I)的残基1-37的序列。
在一些实施方案中，胰淀素类似物(包括式(I)的那些胰淀素类似物)形成多肽组分的基础，所述多肽组分与一种或多种持续时间延长模块连接(任选地经由接头进行)，以形成胰淀素多肽缀合物。如此，多肽组分充当模板(“多肽模板”)，其优选地通过共价附接来与一种或多种持续时间延长模块附接。持续时间延长模块与多肽组分的连接可以经由如本文中描述的接头进行。或者，持续时间延长模块与多肽组分的连接可以经由直接的共价键进行。持续时间延长模块可以是如本文中描述的水溶性聚合物。在一些实施方案中，多种持续时间延长模块附接于多肽组分，在此情况下与每种持续时间延长模块的每种接头独立选自本文中描述的接头。
可用作本文中描述的多肽组分的胰淀素类似物包括但不限于，在下表3中提供的式(I)的残基1-37中列出的化合物。除非相反指明，以游离的羧化物和酰胺化形式两者涵盖本文中描述的所有肽，包括具有明确提供的序列的肽。
表3.可用在本文中描述的化合物中的组分多肽。
在规定范围内的名义分子量。如本领域中习惯的，通过对通常以千道尔顿(kD)提供的名义分子量的提述指示PEG模块的大小。以本领域中已知的多种方式，包括数目、重量、粘度和“Z”平均分子量计算分子量。理解聚合物如PEG等以约名义平均值的分子量分布存在。
术语“接头”等，在本文中描述的胰淀素多肽缀合物中持续时间延长模块与多肽组分附接的背景中，意指二价种类(-L-)，其依次与具有可用于键合的一价的多肽组分及与具有可用于键合的一价的持续时间延长模块共价键合。便利地，多肽组分上可用的键合位点是侧链残基(例如赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸及其同系物)。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是N端胺。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是C端羧基。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是其主链原子。如本文中使用的，术语“连接氨基酸残基”意指与持续时间延长模块附接(任选地经由接头进行)的式(I)的残基1-37内的氨基酸。
在一些实施方案中，提供了具有将多肽组分与持续时间延长模块共价连接的接头的化合物。接头是任选的；即任何接头可以仅是键。在一些实施方案中，接头附着于多肽组分的侧链。在一些实施方案中，接头与多肽组分的主链原子附接。
在另一个方面，提供了胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且第2位至第37位氨基酸残基已经用赖氨酸残基或半胱氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸酸残基或半胱氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接，其中氨基酸编号方式与SEQ ID NO:110中的氨基酸编号一致。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中位置2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,31,32,33,34,35,36或37之任一个中的氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中位置21,24-29或31之任一个中的氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第21位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第24位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第25位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第26位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第27位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第28位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第29位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在另一个方面，本发明涉及胰淀素多肽缀合物，其是具有SEQ ID NO:110的普兰林肽或其类似物的衍生物，其中第1位氨基酸残基是缺乏的(即脱-Lys1)且其中第31位氨基酸残基用赖氨酸残基取代，且其中所述赖氨酸残基任选地经由接头与聚乙二醇聚合物连接。
在一些实施方案中，所述持续时间延长模块是水溶性聚合物。“水溶性聚合物”意指要可用于本文中描述的方法的聚合物，其在例如温度、离子浓度等生理条件下在水中是充分可溶的，如本领域中已知的。水溶性聚合物可以增加附接有此类水溶性聚合物的肽或其它生物分子的溶解度。实际上，已经提出了这类附接作为用于体内改善施用的蛋白质的循环寿命、水溶解度和/或抗原性的手段。参见例如美国专利No.4,179,337;美国公开的申请No.2008/0032408。针对此目的已经使用了许多不同水溶性聚合物和附接化学，如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)等。
在一些实施方案中，连接的持续时间延长模块包括聚乙二醇。致力于获 得治疗可用的多肽，已经使用聚乙二醇(“PEG”)。参见例如Zalipsky,S.,1995,BioconjugateChemistry,6:150-165;Mehvar,R.,2000,J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3:125-136。如本领域技术人员领会的，PEG主链[(CH2CH2-O-)n,n:重复单体数目]是柔性的且两亲性的。不希望受任何理论或作用机制束缚，认为长的、链样的PEG分子或模块在水性介质中为严重水合的且处于快速运动中。认为此快速运动引起PEG清除较大体积，并阻止其它分子的接近和干扰。因此，当附接于另一化学实体(如肽)时，PEG聚合物链可以保护这类化学实体免于免疫学应答和其它清除机制。因此，PEG化可以通过优化药代动力学、增加生物利用度、并降低免疫原性和剂量给药频率来导致改善的药物效力和安全性。“PEG化”在习惯意义中指PEG模块与另一种化合物的缀合。例如，已经显示PEG的附接保护蛋白质免于蛋白酶解。参见例如Blomhoff,H.K.等,1983,Biochim Biophys Acta,757:202-208。除非相反明确指明，术语“PEG”、“聚乙二醇聚合物”等指聚乙二醇聚合物及其衍生物，包括甲氧基-PEG(mPEG)。
已经使用了多种手段将聚合物模块如PEG及相关聚合物附接至蛋白质上找到的反应性基团。参见例如美国专利No.4,179,337；美国专利No.4,002,531；Abuchowski等,1981,于″Enzymes as Drugs,″J.S.Holcerberg和J.Roberts,(编),第367页-第383页；Zalipsky,S.,1995,Bioconjugate Chemistry,6:150-165。已经讨论了PEG及其它聚合物修饰蛋白质的用途。参见例如Cheng,T.-L.等,1999m,Bioconjugate Chem.,10:520-528；Belcheva,N.等,1999,Bioconjugate Chem.,10:932-937；Bettinger,T.等,1998,Bioconjugate Chem.,9:842-846；Huang,S.-Y.等,1998,Bioconjugate Chem.,9:612-617；Xu,B.等1998,Langmuir,13:2447-2456；Schwarz,J.B.等,1999,J.Amer.Chem.Soc.,121:2662-2673；Reuter,J.D.等,1999,Bioconjugate Chem.,10:271-278；Chan,T.-H.等,1997,J.Org.Chem.,62:3500-3504。蛋白质中典型的附接位点包括伯氨基团如那些在赖氨酸残基上或N末端的伯氨基团、巯基基团如那些位于半胱氨酸侧链上的巯基基团、和羧基基团如那些在谷氨酸或天冬氨酸残基上或C端的羧基基团。附接的常见位点是对糖蛋白的糖残基、半胱氨酸或对靶多肽的N端和赖氨酸。术语“PEG化的”等指聚乙二醇与多肽或其它生物分子的共价附接，任选地经由如本文中描述的和/或如本领域中已知的接头进行。
在一些实施方案中，本文中描述的胰淀素多肽缀合物中的PEG模块具有在规定范围内的名义分子量。如本领域中习惯的，通过对通常以千道尔顿(kD)提供的名义分子量的提述指示PEG模块的大小。以本领域中已知的多种方式，包括数目、重量、粘度和“Z”平均分子量计算分子量。理解聚合物如PEG等以约名义平均值的分子量分布存在。
作为PEG分子量的术语的例示，术语“mPEG40KD”指具有名义分子量40千道尔顿的甲氧基聚乙二醇聚合物。对其它分子量的PEG的提述遵循这一惯例。在一些实施方案中，PEG模块具有10-100 KD, 20-80 KD, 20-60 KD或20-40 KD范围内的名义分子量。在一些实施方案中，PEG模块具有10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95或甚至100 KD的名义分子量。优选地，PEG模块具有20, 25, 30, 40, 60或80KD的分子量。
通常将可用于多肽衍生化的PEG分子分为PEG的线性、分支和Warwick(即)类别，如本领域中已知的。除非相反明确指示，本文中描述的PEG模块是线性PEG。此外，术语“两臂分支的”、“Y形的”等指分支的PEG模块，如本领域中已知的。在PEG背景中的术语“Warwick”，也称为“梳”或“梳型”PEG指附接于主链(通常为聚(异丁烯酸酯))的多种多臂PEG，如本领域中已知的。关于包括在本文提供的表中采用的惯例在内的命名法，缺乏相反指明，PEG模块附接于肽的主链。例如，Cmpd 119是mPEG40KD与Cmpd 101的N末端氮缀合的结果。类似地，Cmpd 120是mPEG40KD与Cmpd 102的N端氮缀合的结果。可以使用氨基酸的标准单字母缩写，也可以使用标准三字母缩写。例如，Cmpd 124是Cmpd 110的类似物，其中对Cmpd 109的第26位残基取代赖氨酸，且赖氨酸26 (即K26)的下垂胺官能度与PEG40KD模块缀合。下表4中提供了例示性化合物。
表4. 聚乙二醇化的化合物
化合物 SEQ ID NO: 描述
119 196 mPEG40KD-Cmpd 101
120 197 mPEG40KD-Cmpd 102
121 198 [K21(mPEG40KD)]-Cmpd 103
122 199 [K21(mPEG40KD)]-Cmpd 104
123 200 [K26(mPEG40KD)]-Cmpd 105
124 201 [K26(mPEG40KD)]-Cmpd 106
125 202 [K31(mPEG40KD)]-Cmpd 107
化合物 SEQ ID NO: 描述
126 203 [K31(mPEG40KD)]-Cmpd108
127 204 [K26(Y型-mPEG40KD)]-Cmpd105
128 205 [K21(mPEG40KD)]-Cmpd111
129 206 [K26(mPEG40KD)]-Cmpd112
130 207 [K31(mPEG40KD)]-Cmpd113
131 208 [K26(Y型-mPEG40KD)]-Cmpd112
132 209 [K24(mPEG40KD)]-Cmpd114
133 210 [K25(mPEG40KD)]-Cmpd115
134 211 [K27(mPEG40KD)]-Cmpd116
135 212 [K28(mPEG40KD)]-Cmpd117
136 213 [K29(mPEG40KD)]-Cmpd118
附接有化学模块的胰淀素和胰淀素类似物是胰淀素衍生物。胰淀素衍生物可以构成如下的胰淀素，已经对该胰淀素对其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基基团或末端羧酸基团之一种或多种做出化学修饰。化学修饰包括但不限于附接一种或多种化学模块、创建新键、和除去一种或多种化学模块。在氨基酸侧基处的修饰包括但不限于烷基化、酰化、酯形成、马来酰亚胺偶联、赖氨酸ε-氨基基团的酰化、精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨羧酸基团的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺作用。对末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烃基、N-二-低级烃基和N-酰基修饰。对末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烃基、N-二-低级烃基和N-酰基修饰，如烷基酰基、分支烷基酰基、烷基芳基-酰基。对末端羧基基团的修饰包括但不限于酰胺、低级烃基酰胺、二烃基酰胺、芳基酰胺、烃基芳基酰胺和低级烃基酯修饰。低级烃基是C1-C4烃基。此外，可以通过普通技能的合成化学人员已知的保护基来保护一种或多种侧基或末端基团。氨基酸的α-碳可以是单或二甲基化的。
胰淀素衍生物包括与如上文所描述的一种或多种水溶性聚合物分子，如聚乙二醇(“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰基、棕榈酰基、辛酰基)缀合的胰淀素和胰淀素类似物，其通过添加多聚氨基酸，如多聚-his、多聚-arg、多聚-lys、和多聚-ala，或通过添加小分子取代基，包括短烃基和约束的烃基(例如分支、环状、融合的、金刚烷基)，以及芳香基基团来得到。在一些实施方案中，水溶性聚合物分子会具有范围为约500道尔顿到约60,000道尔顿的分子量。对于适合作为与本发明的工程化多肽联合使用的抗肥胖剂的胰淀素衍生物，参见例如PCT专利公开文本WO 2007/104789,WO 2009/034119,和WO 2010/046357。
这类聚合物缀合可以在如本文中公开的胰淀素或胰淀素类似物的N或C端或序列内的氨基酸残基的侧链单一发生。或者，沿着这类胰淀素或胰淀素类似物的氨基酸序列可以有多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸取代一个或多个氨基酸可以为衍生化提供额外的位点。在一些实施方案中，胰淀素或胰淀素类似物可以与1个、2个、或3个聚合物分子缀合。
在一些实施方案中，将水溶性聚合物分子与氨基、羧基或硫醇基团连接，并且可以通过N或C端，或者在赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链连接。或者，水溶性聚合物分子可以与二胺和二羧基基团连接。在一些实施方案中，胰淀素或胰淀素类似物经由赖氨酸氨基酸上的ε氨基基团与1个、2个或3个PEG分子缀合。
令人惊讶地，已经发现了本发明的工程化多肽在与某些其它抗肥胖化合物联合施用时，对中等肥胖(BMI等于或大于30)和重度肥胖(BMI等于或大于35)的受试者两者提供有益的协同抗肥胖效果。如先前在例如美国公开申请No.2008/0207512中描述的，已经发现了在肥胖受试者中存在瘦蛋白抗性状态。亦参见例如Tenenbaum,D.,HHMI Bulletin,第25页-第27页(2003年3月);Chicurel,M.,Nature,卷404,第538页-第540页(2000);Scarpace等,Diabetalogia,卷48,第1075页-第1083页(2005);及Bays等,Obesity Research,Vol.12,(8),第1197页-第1211页(2004)。此瘦蛋白抗性(其至少部分以肥胖受试者中异常高的血清瘦蛋白水平的存在为特征)使这些受试者不能有效响应内源或外源施用的瘦蛋白。先前已经发现了此瘦蛋白抗性可以在中等肥胖的受试者中用包含瘦蛋白(例如美曲普汀)和某些其它抗肥胖化合物的联合疗法克服。参见例如美国公开申请No.2008/0207512。还已经进一步发现了瘦蛋白联合疗法的协同抗肥胖效果在重度肥胖的、高BMI受试者中是缺乏的，这推测是由于重度瘦蛋白抗性所致。令人惊讶地，本发明人发现了本发明的工程化化合物在与某些其它抗肥胖化合物联合施用时能够克服甚至重度瘦蛋白抗性。因而，本发明还提供了通过施用至少两种不同抗肥胖剂治疗受试者(包括高BMI受试者)中的肥胖症和肥胖症相关状况、病症和疾病的方法，其 中一种抗肥胖剂是本发明的工程化多肽，而另一种抗肥胖剂是胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂、或胰淀素衍生物(即胰淀素剂)。
在某些实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗肥胖症的方法，包括与选自胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂、或胰淀素衍生物的第二抗肥胖剂联合施用选自本发明的工程化多肽的第一抗肥胖剂，其中与仅施用任一种药剂相比，所述药剂的施用产生协同效应。
在一个方面，本发明的方法提供了施用药剂间的协同抗肥胖效应。因而，在某些实施方案中，抗肥胖剂的联合施用产生大于单独施用抗肥胖剂(单一疗法)的结果组合的效果，例如营养物利用度的降低、体重降低、食物摄取降低、代谢增加。
“降低的营养物利用度”意为身体减少对于身体以脂肪储存可用的营养物的任何手段。换言之，降低营养物利用度可以通过以下手段实现，包括但不限于降低食欲、增加饱足、影响食物选择/味觉厌恶、提高代谢、和/或降低或抑制食物吸收。可以影响的例示性机制包括延缓的胃排空或肠中降低的食物吸收。
如本文中使用的，“有此需要的受试者”包括超重、肥胖或渴望减轻体重的受试者。肥胖受试者包括中等肥胖的、低BMI群体和重度肥胖的、高BMI群体。另外，胰岛素抗性、葡萄糖不耐性、或具有任何形式的糖尿病(例如1、2型或妊娠糖尿病)的受试者可以受益于本发明的方法。
“代谢率”意指每个时间单位释放/消耗的能量量。可以通过食物消耗、以热释放的能量、或在代谢过程中使用的氧来估算每单位时间的代谢。一般地，当想要减轻重量时期望具有较高的代谢率。例如，具有高代谢率的个体实施某活动可以能够比具有低代谢率的个体实施该活动消耗更多能量(例如身体燃烧更多的卡路里)。
如本文中使用的，“瘦重量”或“瘦体重”指肌肉和骨骼。瘦体重不必然指无脂肪重量。瘦体重含有中枢神经系统(脑和脊髓)、骨髓、和内部器官内较小百分比的脂肪(大约3%)。按照密度测量瘦体重。测量脂肪重量和瘦重量的方法包括但不限于水下称重、空气置换体积扫描术、x射线、DEXA扫描、MRI和CT扫描。在某些实施方案中，使用水下称重来测量脂肪重量和瘦重量，如本领域中已知的。
“脂肪分布”意指身体中脂肪沉积物的位置。脂肪沉积的这类位置包括 例如皮下、内脏和异位脂肪仓库。
“皮下脂肪”意指刚好在皮肤表面下脂质沉积物。可以使用任何可用于测量皮下脂肪的方法来测量受试者中的皮下脂肪量。测量皮下脂肪的方法是本领域中已知的，例如那些记载于美国专利No.6,530,886的，其完整内容通过提述并入本文中。
“内脏脂肪”意指作为腹内脂肪组织的脂肪沉积物。内脏脂肪包围至关重要的器官，并且可以被肝代谢以生成血液胆固醇。已经将内脏脂肪与增加的状况(如多囊性卵巢综合征、代谢综合征和心血管疾病)风险联系起来。
“异位脂肪贮存”意指在构成瘦体重的组织和器官(例如骨骼肌、心脏、肝、胰、肾、血管)内和周围的脂质沉积物。一般地，异位脂肪贮存是身体中经典的脂肪组织仓库外部的脂质积累。
如本文中使用的，且如本领域中完全了解的，“治疗/处理”是用于获得有益或期望的结果，包括临床结果的办法。“治疗”或“减轻”疾病、病症或状况意指与没有治疗病症相比，减轻状况、病症或疾病状态的程度和/或不期望的临床表现和/或延缓或延长进展的时程。例如，在治疗肥胖症中，体重降低，例如体重降低至少5%是期望的治疗结果的一个例子。出于本发明的目的，无论可检出还是不可检出，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻或改善、疾病程度的减小、稳定花的(即不恶化的)疾病状态、疾病进展的延迟或延缓、疾病状态的改善或减轻、和消退(无论是部分的还是完全的)。“治疗/处理”还可以意指与没有接受治疗时的预期存活相比延长存活。此外，治疗不必然通过施用一剂发生，而是经常在施用一系列剂量后发生。如此，治疗有效量、足以减轻的量、或足以治疗疾病、病症或疾病的量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中使用的，术语“治疗有效量”意指组合物中会在组织、系统、受试者、或人中引发研究者、兽医、医生或其它临床医生寻求的生物学或医学应答(其包括减轻所治疗病症的症状)的活性化合物量。本发明的新治疗方法用于本领域技术人员已知的病症。
如本文中使用的，术语“预防有效量”意指组合物中会在组织、系统、受试者、或人中引发研究者、兽医、医生或其它临床医生寻求的生物学或医学应答以预防有肥胖症或肥胖症相关病症、状况或疾病风险的受试者中的肥胖症或肥胖症相关病症、状况或疾病发作的活性化合物量。
在本发明的另一个方面，提供了用于降低形成代谢病症的风险的方法，其中所述方法包括以降低受试者重量的有效量对受试者施用抗肥胖剂的组合。
在本发明的一些实施方案中，使用本发明的方法来提高受试者中的代谢率、减少受试者中的代谢率降低、或保持受试者中的代谢率。在某些实施方案中，所述代谢率可以牵涉比瘦身体组织优先使用身体脂肪作为能量来源。在一个方面，瘦体重在施用抗肥胖剂的组合后没有降低。在另一个方面，瘦体重降低在施用抗肥胖剂的组合后得到减轻或阻止。在又一个方面，瘦体重在施用抗肥胖剂的组合后是增加的。脂肪作为能量来源的此类偏爱可以通过比较脂肪组织与瘦体组织的量来测定，通过测量治疗期开始和结束时的总体重和脂肪含量加以确定。代谢率增加是与未施用抗肥胖剂组合情况中在基本上类似或相同的条件下在另一时间段里受试者使用卡路里或其它能量来源的水平相比，受试者在一段时间里使用卡路里或另一能量来源的水平更高。在某些实施方案中，与未施用抗肥胖剂组合情况中在基本上类似或相同的条件下在另一时间段里受试者使用卡路里或其它能量来源的水平相比，代谢率在受试者中增加至少约5%，在其它实施方案中，代谢率在受试者中增加至少约10%,15%,20%25%,30%,或35%。可以使用例如呼吸热量计来测量代谢率的增加。如这些实施例中使用的抗肥胖剂的有效量是与未接受药剂或仅接受药剂之一的受试者相比在组合施用时有效增加受试者中的代谢率的每种药剂量。
在另一个实施方案中，提供了减少受试者中代谢率降低的方法。代谢率的这类降低可以是例如由于降低的卡路里饮食、受限制的饮食或体重减轻而导致代谢率降低的任何条件或营养或体格方案的结果。受限制的饮食包括对食物中允许的食物类型或食物量或这两者的限额或禁止，其不一定基于卡路里。例如，如在个体饮食中，身体基于较低的卡路里摄取补偿以降低的代谢率。实质上，身体下调对食物的需要，由此以更少的食物生存。当继续饮食时，热量摄取的阈值降低。当饮食结束时，个体在食用正常饮食时由于降低的热量摄取阈值和降低的基础代谢率通常会增加体重(NIH Technology Assessment ConferencePanel(1992)Ann.Intern.Med.116:942-949;Wadden(1993)Ann.Intern.Med.119:688-693)。在一个方面，提供了降低受试者中代谢率损失的方法，其中代谢率的损失是降低的卡路里饮食或体重减轻的结 果。通过使用这类方法，受试者的代谢率降低在受试者中降低至少约10%,15%,20%25%,30%,35%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或95%。对于这类方法，可能期望在启动导致代谢率损失或降低的条件或营养或体格方案时施用抗肥胖剂的组合。然而，也涵盖启动条件或营养或体格方案前开始施用药剂。在一种情况下，使用呼吸热量计来测量代谢率。如在此实施方案中使用的抗肥胖剂的有效量是在联合施用时有效减少受试者中的代谢率降低的每种药剂量。
在另一个方面，提供了用于降低代谢平台的方法，其中方法包括对受试者联合施用有效量的抗肥胖剂。在某些实施方案中，所述受试者正减轻体重或已经减轻体重，例如由于降低的卡路里饮食、增加的锻炼或其组合所致。“代谢平台”意指身体适应热量或能源输入变化时的稳定代谢率的时间间隔。热量输入或消耗的变化可能是例如降低的卡路里饮食或增加的身体活动的结果。这类平台可以在例如重量减轻方案中当重量减轻延缓或停止时观察到。在某些实施方案中，与在未施用抗肥胖剂组合的情况下在基本上类似或相同条件下在相同时间段里在其它方面相同的受试者中的代谢平台持续时间相比，本发明的方法降低受试者中代谢平台的持续时间。在其它实施方案中，与在未施用抗肥胖剂组合的情况下在基本上类似或相同条件下在相同时间段里在其它方面相同的受试者中的代谢平台持续时间相比，本发明的方法降低代谢平台的频率。在又一些实施方案中，与在未施用抗肥胖剂组合的情况下在基本上类似或相同条件下在相同时间段里在其它方面相同的受试者中的代谢平台持续时间相比，本发明的方法延迟代谢平台的开始，在某些实施方案中，通过绘制减少的体重减轻或无体重减轻的时期来鉴定代谢平台。在某些实施方案中，至少降低一种代谢平台。在其它实施方案中，至少降低2、3、4、5、6、7、8、9或10种代谢平台。在另一个方面，与在相同或类似条件下未施用抗肥胖剂组合的受试者相比代谢平台延迟1天。在其它方面，代谢平台在受试者中延迟了2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周或3周。
仍在其它实施方案中，提供了保持受试者中代谢率的方法。在某些实施方案中，受试者可以有损失代谢率的风险，例如由于启动降低卡路里饮食、受限制的饮食或预期的体重减轻所致。代谢率的保持是与在未施用抗肥胖剂组合情况中在基本上相似或相同条件下在其它方面相同的受试者中在相同 时间段里的卡路里或其它能量来源的使用水平相比维持受试者在一段时间使用卡路里或另一能量来源的水平。在一个方面，将代谢率维持在启动导致代谢率降低的事件之前的受试者代谢率的15%内。在其它方面，将代谢率维持在所述受试者代谢率的10%内、7%内、5%内、3%或更小内。在一个方面，在开始降低的卡路里饮食、受限制的饮食或锻炼方案时施用抗肥胖剂。
可以使用任何可用于测定这类速率的方法来评估代谢率，例如通过使用呼吸热量计来进行。这类用于测定代谢率的方法和装置是本领域中已知的，且记载于例如美国专利Nos.4,572,208,4,856,531,6,468,222,6,616,615,6,013,009,和6,475,158。或者，可以通过测量饮食期之后动物分解代谢的瘦身体组织对脂肪组织的量来评估动物的代谢率。如此，可以在饮食期结束时测量总体重和脂肪含量。在大鼠中，一种经常用于测定总体身体脂肪的方法是手术取出并称量腹膜后脂肪垫，即位于腹膜后腔(位于后腹壁和后壁腹膜之间的区域)的脂肪体。认为垫重量与动物的百分比身体脂肪成正比。由于大鼠中体重和身体脂肪之间是线性关系，肥胖动物具有相应地更高的百分比身体脂肪和腹膜后脂肪垫重量。
在本发明的另一个方面，提供了通过降低受试者中的代谢率来降低脂肪重量的方法，其中所述方法包括以有效降低脂肪重量的量施用抗肥胖剂的组合，其通过降低受试者的代谢率进行。可以将脂肪重量以占总体重的百分数表达。在一些方面，脂肪重量在治疗过程中降低至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、或至少25%。在一个方面，受试者的瘦重量在治疗过程中未降低。在另一个方面，受试者的瘦重量在治疗过程里得到维持或增加。在另一个方面，受试者按照降低的卡路里饮食或受限制的饮食。“降低的卡路里饮食”意指其与相同受试者的正常饮食相比，受试者每天摄取更低的卡路里。在一种情况下，受试者每天的消耗至少低50卡路里。在其它情况下，受试者每天的消耗至少低100,150,200,250,300,400,500,600,700,800,900或1000卡路里。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于改变受试者中脂肪分布的方法，其中所述方法包括以有效改变受试者中脂肪分布的量施用抗肥胖剂组合。在一个方面，所述改变源自受试者中内脏或异位脂肪或两者的代谢升高。在一些实施方案中，所述方法牵涉以比皮下脂肪大至少约5%,10%,15%,20%,25%,30%,40%,或50%的速率来代谢内脏或异位脂肪或两者。在一个方 面，所述方法导致有利的脂肪分布。在某些实施方案中，有利的脂肪分布是皮下脂肪与内脏脂肪、异位脂肪或两者的比率增加。在一个方面，所述方法牵涉瘦体重的增加，例如由于肌肉细胞重量增加所致。
在其它实施方案中，提供了用于降低受试者中皮下脂肪量的方法，其中所述方法包括对有此需要的受试者以有效降低受试者中皮下脂肪量的量施用抗肥胖剂组合。在一种情况下，皮下脂肪的量在受试者中降低至少约5%。在其它情况下，与施用抗肥胖剂之前的受试者相比，皮下脂肪的量至少降低了约10%,15%,20%,25%,30%,40%,或50%。
本文中描述的方法可以用于降低受试者中内脏脂肪的量。在一种情况下，内脏脂肪在受试者中降低至少约5%。在其它情况下，与施用抗肥胖剂之前的受试者相比，受试者中的内脏脂肪降低至少约10%,15%,20%,25%,30%40%,或50%。可以经由可用于测定受试者中内脏脂肪量的任何手段测量内脏脂肪。这类方法包括例如依靠CT扫描和MRI的腹部断层摄影术。其它用于测定内脏脂肪的方法记载于例如美国专利Nos.6,864,415,6,850,797,和6,487,445。
在某些实施方案中，提供了用于在受试者中阻止异位脂肪的累积或降低异位脂肪量的方法，其中所述方法包括对有此需要的受试者以有效阻止受试者中异位脂肪的累积或降低异位脂肪的量施用抗肥胖剂组合。在一种情况下，与施用抗肥胖剂组合之前的受试者相比，受试者中异位脂肪的量降低至少约5%。在其它情况下，异位脂肪量在受试者中降低至少约10%、或至少约15%,20%,25%,30%,40%,或50%。或者，与受试者中皮下脂肪相比，异位脂肪量成比例地降低5%,10%,15%,20%,25%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,或100%。可以使用任何可用于测量异位脂肪的方法来测量受试者中的异位脂肪。
在其它实施方案中，提供了用于在受试者中产生更有利的脂肪分布的方法，其中所述方法包括对受试者以有效产生有利的脂肪分布的量施用抗肥胖剂组合。在某些实施方案中，抗肥胖剂组合的施用降低受试者中内脏脂肪或异位脂肪或两者的量。例如，施用抗肥胖剂组合，其中与至少一种作用于后脑结构(其牵涉食物摄取或体重调控或两者)的抗肥胖剂的施用联合施用至少一种作用于前脑结构(其牵涉食物摄取或体重调控或两者)的抗肥胖剂。在某些实施方案中，所述方法比皮下脂肪降低优先地降低内脏或异位脂肪或两者 的组合的量。这类方法导致皮下脂肪与内脏脂肪或异位脂肪的较高比率。这类改善的比率可以导致形成心血管疾病、多囊性卵巢综合征、代谢综合征、或其任意组合的风险降低。在某些实施方案中，异位或内脏脂肪以高于皮下脂肪5%的比率代谢。在其它实施方案中，异位或内脏脂肪以比皮下脂肪大至少10%15%,20%,25%,30%50%,60%,70%,80%,90%,或100%的比率代谢。
在另一个方面，本发明的方法包括使用治疗有效量的抗肥胖剂组合，其与糖皮质激素联合施用。糖皮质激素具有增加脂肪重量和降低瘦重量的不利效果。因而，在糖皮质激素使用是有益的条件下，设想抗肥胖剂组合可以与糖皮质激素联合使用。
在又一个方面，本发明的方法包括使用治疗有效量的一种抗肥胖剂或抗肥胖剂组合，其与选自下组的治疗剂联合施用：奥利司他(orlistat)、芬特明(phentermine)、托吡酯(topiramate)、CONTRAVE、和QNEXA。在一些实施方案中，本发明的方法包括使用治疗有效量的本发明的工程化多肽，其与选自下组的治疗剂联合施用：奥利司他、芬特明、托吡酯、CONTRAVE、和QNEXA。在其它实施方案中，本发明的方法包括使用治疗有效量的胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂或胰淀素衍生物，其与选自下组的治疗剂联合施用：奥利司他、芬特明、托吡酯、CONTRAVE、和QNEXA。在其它实施方案中，本发明的方法包括使用治疗有效量的本发明的工程化化合物，其与胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂或胰淀素衍生物和选自下组的治疗剂联合施用：奥利司他、芬特明、托吡酯、CONTRAVE、和QNEXA。
还提供了降低病态肥胖受试者的体重的方法，其通过首先将受试者的重量降低至低于病态肥胖水平的水平，然后对受试者以有效量施用抗肥胖剂组合以进一步降低受试者的重量。用于将受试者重量降低至低于病态肥胖水平的方法包括降低热量摄取、增加身体活动、药物疗法、肥胖治疗手术(bariatric surgery)如胃分流术、或前述方法的任意组合。在一个方面，施用抗肥胖剂的组合还降低受试者的体重。在其它实施方案中，提供了用于降低具有40或更小的体重指数的受试者的体重指数的方法，其通过以有效量施用抗肥胖剂组合以进一步降低受试者的重量进行。
降低重量意指受试者在治疗过程里减轻他/她的总体重的一部分，不管治疗时程是数天、数周、数月或数年。或者，降低重量可以定义为降低脂肪重 量与瘦重量的比例(换言之，受试者已经减轻脂肪重量，但是维持或增加瘦重量，不必然是在总体重中的相应减轻)。在这些实施方案中联合施用的抗肥胖剂的有效量是在治疗时程中有效降低受试者体重的量，或者在治疗时程中有效降低受试者的脂肪重量百分比的量。在某些实施方案中，受试者的体重在治疗时程中降低至少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、或至少约20%。或者，受试者的脂肪重量百分比在治疗时程中降低至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、或至少25%。
在某些实施方案中，降低重量的方法包括对对重量维持的坚持改善。不希望受任何理论束缚，通过施用如本文中描述的抗肥胖剂实现的瘦蛋白响应性的恢复克服肥胖受试者的一项重要的挑战。在先前的减轻重量方法中，瘦蛋白水平即使在降低的体重上仍可能高于正常水平，这使得受试者难以维持体重减轻。本文中描述的方法不仅包括降低体重的方法，而且还包括对重量维持的坚持改善的组分。
在某些实施方案中，降低受试者中营养物利用度，例如降低体重的方法包括以每天一次或多次的推注剂量对受试者施用有效量的抗肥胖剂。推注剂量是间断性的药物剂量(与连续输注形成对比)。可以每天对受试者施用一个或多个推注剂量。推注剂量不管在何时对受试者施用时都可以是相同的，或者可以进行调节从而在一天的某些时间时与其它相比以更大的推注剂量施用给受试者。在某些剂型例如持续释放剂型，即推注中施用药剂可以不太频繁地施用推注剂量，例如每三天一次，每周一次，每月两次，每月一次。此外，优选地，推注剂量间的时间足够长的，从而允许在先前推注剂量中施用的药物清理受试者的血流。
在其它实施方案中，降低受试者中营养物利用度，例如降低体重的方法包括以连续剂量对受试者施用有效量的抗肥胖剂。连续剂量意指药物通过例如静脉内注射或透皮贴剂的连续输注。或者，可以以受控释放的胶囊或片剂的形式口服施用连续剂量，所述受控释放的胶囊或片剂在一段时间里将药物释放到受试者的系统中。当通过连续剂量施用时，药物在约1小时的时段内释放，在一些情况下药物在约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,18,或24小时的时段内释放。
“联合/组合施用”意指以分开剂量同时以单独施用或以序贯施用来施用抗肥胖剂。序贯施用指在一种抗肥胖剂之前或之后施用抗肥胖剂之一。在某 些实施方案中，第一抗肥胖剂在至少一种另一抗肥胖剂之前或之后约30分钟施用，在其它实施方案中在至少一种其它抗肥胖剂之前或之后约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,或12小时施用。任何施用的抗肥胖剂可以以推注剂量或以连续剂量施用。
此外，在某些实施方案中，联合施用重量诱导剂产生本发明的任一个方面的协同效应。另外，在某些实施方案中，联合施用重量诱导剂在相同效果情况中导致至少一种药剂的剂量要求降低。
因此，在一个实施方案中是在有此需要的受试者中治疗肥胖症或降低体重的方法，包括外周施用治疗有效量的至少两种不同抗肥胖剂，其中所述至少一种抗肥胖剂是胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂或胰淀素衍生物，且至少一种抗肥胖剂是工程化多肽，其包含：清蛋白结合域多肽(ABD)；和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素域(HD1)，且受试者体重降低至少10%,12%,15%,20%,30%,40%或甚至50%。
其它实施方案包括以下：
实施方案1.一种治疗受试者中肥胖症的方法，包括外周施用治疗有效量的至少两种不同的抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂、或胰淀素衍生物(即胰淀素剂)，且至少一种抗肥胖剂是工程化的多肽，其包含：清蛋白结合域多肽(ABD)；选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素域(HD1)。
实施方案2.一种降低受试者身体重量的方法，包括外周施用治疗有效量的至少两种不同的抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂、或胰淀素衍生物(即胰淀素剂)，且至少一种抗肥胖剂是工程化的多肽，其包含：清蛋白结合域多肽(ABD)；选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素域(HD1)。
实施方案3.依照实施方案1或2中任一项的方法，其中所述至少一种抗肥胖胰淀素剂是胰淀素激动剂。
实施方案4.依照实施方案1至3中任一项的方法，其中所述胰淀素激动剂包含胰淀素类似物或衍生物。
实施方案5.依照实施方案1至4中任一项的方法，其中所述胰淀素类似物或衍生物包含普兰林肽。
实施方案6.依照实施方案1至5中任一项的方法，其中所述胰淀素类似物或衍生物包含表4中公开的化合物。
实施方案7.依照实施方案1至6中任一项的方法，其中所述胰淀素类似物或衍生物包含Des-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]一普兰林肽(SEQ ID NO：214)。
实施方案8.依照实施方案1至7中任一项的方法，其中所述ABD包含任意一种选自下组的肽：
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP(SEQ ID NO：38)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP(SEQ ID NO：39)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP(SEQ ID NO：40)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP(SEQ ID NO：41)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP(SEQ ID NO：42)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：43)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP(SEQ ID NO：44)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP(SEQ ID NO：45)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP(SEQ ID NO：46)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP(SEQ ID NO：47)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP(SEQ ID NO：48)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQ ID NO：49)，
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：50)，
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP(SEQ ID NO：51)，和
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP(SEQ ID NO：52)
实施方案9.依照实施方案1至8中任一项的方法，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146。
实施方案10.依照实施方案1至9中任一项的方法，其中所述HD1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
实施方案11.依照实施方案1至10中任一项的方法，其中所述工程化的多肽包含表2中公开的化合物。
实施方案12.依照实施方案1至11中任一项的方法，其中所述工程化的多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ IDNO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ IDNO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ IDNO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ IDNO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ IDNO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85SEQ ID NO:86,SEQ IDNO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ IDNO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ IDNO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,和SEQ ID NO:107。
实施方案13.依照实施方案1至12中任一项的方法，其中所述工程化的多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
实施方案14.依照实施方案1至12中任一项的方法，其中所述工程化的多肽包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
实施方案15.依照实施方案1至14中任一项的方法，其中所述胰淀素剂的有效量和所述工程化的多肽的有效量包含一定的量，使得在对所述受试者与所述工程化多肽联合施用所述胰淀素剂时比在单独施用任一种药剂时实现的体重减轻量实现更大的体重减轻量。
实施方案16.依照实施方案1至15中任一项的方法，其中同时施用所述两种药剂。
实施方案17.依照实施方案1至16中任一项的方法，其中将所述两种药剂混合在一起。
实施方案18.依照实施方案1至17中任一项的方法，其中所述受试者的BMI大于25。
实施方案19.依照实施方案1至18中任一项的方法，其中所述受试者的BMI为25至35。
实施方案20.依照实施方案1至19中任一项的方法，其中所述受试者的BMI为25至40。
实施方案21.依照实施方案1至20中任一项的方法，其中所述受试者的BMI为25至45。
实施方案22.依照实施方案1至21中任一项的方法，其中所述受试者的BMI为35至45。
实施方案23.依照实施方案1至22中任一项的方法，其中所述受试者的BMI降低至小于30。
实施方案24.依照实施方案1至23中任一项的方法，其中所述受试者的BMI降低至小于325。
实施方案25.依照实施方案1至24中任一项的方法，其中所述受试者的BMI降低至正常。
实施方案26.依照实施方案1至25中任一项的方法，其中在治疗4周内实现体重减轻。
实施方案27.依照实施方案1至26中任一项的方法，其中在治疗8周内实现体重减轻。
实施方案28.依照实施方案1至27中任一项的方法，其中在治疗12周内实现体重减轻。
实施方案29.依照实施方案1至28中任一项的方法，其中在治疗20周内实现体重降低。
实施方案30.依照实施方案1至29中任一项的方法，其中在治疗24周内实现体重降低。
实施方案31.依照实施方案1至30中任一项的方法，其中所述受试者是人。
实施方案32.依照实施方案1至31中任一项的方法，其中所述受试者是肥胖的人。
实施方案33.依照实施方案1至32中任一项的方法，其中所述重量减轻降低至少10%。
实施方案34.依照实施方案1至33中任一项的方法，其中所述重量减轻降低至少12%。
实施方案35.依照实施方案1至34中任一项的方法，其中所述重量减轻降低至少15%。
B.配制剂
本发明的药用化合物可以与药学可接受载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂一起配制，其依照常规技术如那些披露于E.W.Martin的Remington′sPharmaceutical Sciences中的常规技术进行。亦参见Wang等(1988)J.of ParenteralSci.and Tech.,Technical Report No.10,Supp.42:2S。
一般而言，可以将工程化多肽配制成稳定的、安全的药物组合物以对患者施用。设想在本发明方法中使用的药物配制剂可以包含约0.01至1.0%(w/v)，在某些情况下0.05至1.0%的工程化多肽、约0.02至0.5%(w/v)的乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲物(其允许最终组合物的pH为约3.0至约7.0)；约1.0至10%(w/v)碳水化合物或多元醇张力调节剂，以及任选地，约0.005至1.0%(w/v)选自下组的防腐剂：间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯以及酚。如果配制的肽要包含在多用途产品中，那么一般包含这类防腐剂。
在一个具体的实施方案中，本工程化多肽的药用配制剂可以含有一定浓度范围的化合物，例如在这些实施方案中在约0.01%至约98%w/w之间、或在约1至约98%w/w之间、或优选地在80%-90%w/w之间、或优选地在约0.01%至约50%w/w之间、或更优选地在约10%至约25%w/w之间。可以使用足量的注射用水来获得期望的溶液浓度。
若期望的话，也可以存在其它张力调节剂如氯化钠以及其它已知的赋形剂。在一些情况下，这类赋形剂可用于维持化合物的总体张力。可以以各种浓度将赋形剂包含在目前描述的配制剂中。例如，可以以下列浓度范围包含赋形剂：约0.02%至约20%w/w，优选地约0.02%和0.5%w/w之间，约0.02%至约10%w/v，或约1%至约20%w/w。另外，与目前制剂自身类似，可以以 固态(包括粉末的)、液态、半固态或凝胶形式包含赋形剂。
药用配制剂可以以各种形式，例如固体、液体、半固体或液体构成。如本文中使用的，术语“固体”意指涵盖此术语的所有正常使用，例如，粉末或冻干配制剂。目前描述的配制剂可以是冻干的。
术语缓冲剂、缓冲溶液和缓冲的溶液在提及氢离子浓度或pH使用时，指系统(特别是水性溶液)在添加酸或碱后、或用溶剂稀释后对抗pH变化的能力。缓冲溶液(其在添加酸或碱时经历较小的pH变化)的特征在于，存在弱酸和该弱酸的盐、或弱碱或该弱碱的盐。前一种系统的一个例子是醋酸和醋酸钠。只要添加的水合氢离子和氢氧根离子的量不超过缓冲系统将其中和的能力，pH的变化就是略微的。
如本文中描述的，多种液体媒介物适合用于工程化多肽的配制剂，例如水或水性/有机溶剂混合物或悬浮液。
通过将配制剂的pH维持在通过本领域中已知的方法确定的范围中来增强如本文中描述的那样使用的工程化多肽配制剂的稳定性。在某些实施方案中，将配制剂的pH维持在约3.5至5.0或约3.5至6.5，在一些实施方案中约3.7至4.3或约3.8至4.2的范围中。在一些实施方案中，pH可以为约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或甚至更高。在一些实施方案中，pH可以在生理学范围pH6-8，优选地pH7-7.6中。
在某些实施方案中，具有工程化多肽的缓冲液是醋酸盐缓冲液(优选地，最终配制剂浓度为约1-5至约60mM)、磷酸盐缓冲液(优选地，最终配制剂浓度为约1-5至约30mM)或谷氨酸盐缓冲液(优选地，最终配制剂浓度为约1-5至约60mM)。在一些实施方案中，缓冲剂是醋酸盐(优选地，最终配制剂浓度为约5至约30mM)。
配制剂中可以包含稳定剂，但是并非是必要需要的。然而，如果包含的话，可用在本发明的实践中的稳定剂是碳水化合物或多元醇。可用在本发明实践中的合适稳定剂是约1.0至10%(w/v)碳水化合物或多元醇。多元醇和碳水化合物在其主链中具有相同特征，即-CHOH-CHOH-，其负责稳定化蛋白质。多元醇包括诸如山梨糖醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)等化合物。这些化合物是直链分子。在另一方面，碳水化合物如甘露糖、核糖、蔗糖、果糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇和乳糖是可以含有酮或醛基团的环状分子。已经证明了这两类化合物在使蛋白质稳定化免于通过升高的温度及通过冷冻- 融化或冷冻-干燥过程引起的变性中是有效的。合适的碳水化合物包括：半乳糖、阿拉伯糖、乳糖或对糖尿病患者没有不利影响的任何其它碳水化合物，即该碳水化合物没有代谢为在血液中形成大得不可接受的浓度的葡萄糖。适合于糖尿病的这类碳水化合物是本领域中公知的。蔗糖和果糖适合于在非糖尿病应用(例如治疗肥胖症)中与化合物一起使用。
在某些实施方案中，如果包含稳定剂，那么用多元醇如山梨糖醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/聚乙二醇共聚物以及具有分子量200,400,1450,3350,4000,6000,8000和甚至更高的各种聚乙二醇(PEG)使化合物稳定化。在一些实施方案中，甘露醇是优选的多元醇。本发明的冻干配制剂的另一个有用的特征在于，用用来维持其稳定性的相同配制剂组分维持本文中描述的冻干配制剂的张力。在一些实施方案中，甘露醇是优选的用于此目的的多元醇。
美国药典(USP)宣称必须向包含在多剂量容器中的制剂添加抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂。它们在使用时必须以足够的浓度存在，从而阻止在用皮下针和注射器、或使用其它侵入性投递手段(如笔型注射器)取出内容物的部分时疏忽引入到制剂中的微生物的增殖。必须评估抗微生物剂以确保与配方的所有其它组分的相容性，并且应当在总配方中评估其活性以确保在一种配制剂中有效的特定药剂在另一种中不是无效的。不罕见的是，发现一种特定的抗微生物剂在一种配制剂中会是有效的，但是在另一种配制剂中不是有效的。
防腐剂在常见的药学意义中是阻止或抑制微生物生长并且可以为此目的添加到药物配制剂以避免随之发生微生物对配制剂的酸败的物质。尽管防腐剂的量不大，不过其可以影响肽的总体稳定性。
尽管用在药物组合物中的防腐剂可以在0.005至1.0%(w/v)的范围内，在一些实施方案中单独的或与其它防腐剂组合的每种防腐剂的范围为：苯甲醇(0.1-1.0%)、或间甲酚(0.1-0.6%)、或酚(0.1-0.8%)或对羟基苯甲酸甲酯(0.05-0.25%)和乙酯或丙酯或丁酯(0.005%-0.03%)的组合。羟基苯甲酸酯类是对羟基苯甲酸的低级烷基酯。在Remington′sPharmaceutical Sciences(同上)中列出了每种防腐剂的详细描述。
当处于液体形式时，工程化多肽可能没有吸附到玻璃容器中的玻璃上的趋势，因此可能不需要表面活性剂来进一步稳定化药物配制剂。然而，对于 处于液体形式时确实具有这类趋势的化合物，应当在其配制剂中使用表面活性剂。然后，可以将这些配制剂冻干。表面活性剂经常因疏水性破坏及通过盐桥分离两者而引起蛋白质的变性。相对低浓度的表面活性剂可以施加有力的变性活性，这是由于表面活性剂模块与蛋白质上反应性位点之间的强相互作用。然而，对此相互作用的审慎使用能使蛋白质稳定化而免于界面或表面变性。任选地，能进一步稳定化工程化多肽的表面活性剂可以以占总配制剂的约0.001至0.3%(w/v)的范围存在，且包括聚山梨酯80(即聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、CHAPS(即3-[(3-胆氨丙基)二甲基铵基]1-丙烷磺酸盐)、Brij(例如Brij35，其为(聚氧乙烯(23)月桂醚)、泊洛沙姆(poloxamer)、或另一种非离子型表面活性剂。
还可以期望添加氯化钠或其它盐以调节药物配制剂的张力，这取决于选择的张力调节剂。然而，这是任选的，并且取决于选择的具体配制剂。优选地，胃肠外配制剂可以是等张的或实质性等张的。
优选的用于胃肠外产品的媒介物是水。可以通过蒸馏或反渗透来制备具有适合胃肠外施用的质量的水。注射用水是优选用在药物配制剂中的水性媒介物。
有可能的是，其它成分可以存在于药物配制剂中。这类其它成分可以包括例如湿润剂、乳化剂、油、抗氧剂、膨胀剂、张力修饰剂、螯合剂、金属离子、油质媒介物、蛋白质(例如人血清清蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。另外，聚合物溶液或与聚合物的混合物提供肽受控释放的机会。当然，这类其它成分不应当不利地影响本发明的配药物制剂的总体稳定性。
容器也是注射配制剂的组成部分，并且可以视为组件，因为没有完全惰性或不以某种方式影响其含有的液体的容器，特别若液体是水性的话。因此，具体注射液的容器选择必须基于容器以及溶液组成、和其会进行的处理的考虑。如果必要的话，也可以通过使用硼硅酸盐玻璃，例如Wheaton I型硼硅酸盐玻璃#33(Wheaton I型-33)或其等同物(WheatonGlass Co.)使肽对小瓶玻璃表面的吸附最小化。对于制造可接受的类似硼硅酸盐玻璃小瓶和药筒(cartridge)的其它供应商包括Kimbel Glass Co.,West Co.,Bunder Glas GMBH和Form a Vitrum。可以通过在存在5%甘露醇和0.02%Tween80的情况下在Wheaton I型-33硼硅酸盐血清小瓶中配制并冻干至化合物终浓度为0.1mg/ml 和10mg/ml使化合物的生物学和化学特性稳定化。
对于要通过注射投递的配制剂，为了允许将针从皮下注射器导入多剂量小瓶中并在取出针时就提供再密封，优选地，将每个小瓶的开口端用由铝带适当固定的橡皮塞闭合物密封。
可以将玻璃小瓶的塞子如West4416/50,4416/50(以特氟纶(Teflon)为表面)和4406/40、Abbott5139或任何等同的塞子用作注射用药物的闭合物。对于包含肽性抗肥胖症药剂的配制剂，这些塞子与肽以及配制剂其它组分是相容的。本发明还已经发现了，这些塞子在使用患者使用样式测试时通过塞子完整性测试，即塞子可以经受住至少约100次注射。或者，可以将肽冻干入小瓶、注射器或药筒中以用于随后的重建。可以将本发明的液体配制剂填充到1或2室的药筒、或1或2室的注射器中。
上文所描述的药物配制剂的每种组分是本领域中已知的，且记载于PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS:PARENTERAL MEDICATIONS,第1卷,第2版,Avis等编,Mercel Dekker,New York,N.Y.1992，其通过提述完整并入本文并用于所有目的。
上述液体配制剂的制造过程一般牵涉混合、无菌过滤和填充步骤。混合规程牵涉以特定次序(防腐剂，接着是稳定剂/张力剂、缓冲剂和肽)溶解成分或同时溶解。
备选的配制剂(例如非胃肠外)可以不需要灭菌。然而，如果灭菌是期望或必需的话，可以在开发本发明的肽药物配制剂中使用任何合适的灭菌方法。典型的灭菌方法包括过滤、蒸汽(湿热)、干热、气体(例如环氧乙烷、甲醛、二氧化氯、环氧丙烷、β-丙内酯(propiolactone)、臭氧、三氯硝基甲烷(chloropicrin)、过氧乙酸甲基溴等)、暴露于辐射源、和无菌操作。过滤是本发明液体配制剂灭菌的优选方法。无菌过滤牵涉过滤通过0.45um和0.22um(1或2)，其可以串联连接。过滤后，将溶液填充到合适的小瓶或容器中。
在某些实施方案中，将本文中描述的工程化多肽对受试者外部施用。在一些实施方案中，本发明的液体药物配制剂意图用于胃肠外施用。合适的施用途径包括肌内、静脉内、皮下、皮内、关节内、鞘内等等。在一些实施方案中，皮下施用途径是优选的。在某些实施方案中，粘膜投递也是优选的。这些途径包括但不限于口服、鼻、舌下、肺部和含服途径，其可以包括液体、半固体或固体形式的肽的施用。对于包含工程化多肽的配制剂，经由这些途径的施用可以由于与胃肠外投递相比降低的生物利用度而需要实质上更多的化合物来获得期望的生物学效果。另外，可以通过形成聚合的微囊剂、基质、溶液、植入物和装置，并胃肠外施用它们或通过手术手段来实现胃肠外受控释放投递。受控释放配制剂的例子记载于美国专利Nos.6,368,630,6,379,704,和5,766,627中，其通过提述并入本文。这些剂量形式由于有些肽在聚合物基质或装置中包载而可以具有较低的生物利用度。参见例如美国专利Nos.6,379,704,6,379,703,和6,296,842，每篇通过提述完整并入本文并用于所有目的。
可以以剂量单位形式提供所述化合物，该剂量单位形式含有在一剂或多剂中会有效的工程化多肽量。
如本领域技术人员会公认的，工程化多肽的有效量会随许多因素而变化，包括受试者的年龄和重量、受试者的身体状况、待治疗的状况、和本领域中已知的其它因素。工程化多肽的有效量还会随施用的具体组合而变化。如本文中描述的，联合施用工程化多肽可以允许任何施用的工程化多肽的降低量成为有效量。
工程化多肽的长作用持续时间可以提供延长的期望的作用持续时间，如每天一次或每周一次施用。作用持续时间可以例如通过对ABD及其对清蛋白的亲和力的选择来进行选择。尽管不希望受任何理论束缚，认为对清蛋白的较高亲和力会得到较长的循环时间，从而提供较长的作用持续时间。在投递后可以随时间测量药效(治疗效果)和药动学(药物特性)的任意一项或两项，如药物血浆水平、短期或持续的葡萄糖和/或HbA1c降低、胰岛素血浆水平、食物摄取抑制或体重减轻。
C有效剂量
本文中提供的药物组合物包括如下的组合物，其中以治疗有效量，即以有效实现其意图目的的量含有活性成分。对具体应用有效的实际量会取决于所治疗的状况，等等。例如，当在治疗糖尿病的方法中施用时，这类组合物会含有有效实现期望结果(例如降低受试者中的空腹血液葡萄糖)的活性成分量。当在治疗肥胖症的方法中施用时，这类组合物会含有有效实现期望结果(例如降低体重)的活性成分量。
施用的化合物的剂量和频率(单剂或多剂)可以随着多种因素而变化，包括施用途径；体格、年龄、性别、健康、体重、体重指数、和接受者饮食； 所治疗疾病症状的性质和程度(例如响应本文中描述的化合物的疾病)；存在其它疾病或其它健康相关问题；同时治疗的种类；和来自任何疾病或治疗方案的并发症。可以与本发明的方法和化合物联合使用其它治疗方案或药剂。
可以从动物模型中确定人用的治疗有效量。例如，可以将人用剂量配制为达到已经发现在动物中有效的浓度。可以通过监测一种或多种生理学参数，包括但不限于血液葡萄糖和体重，并将该剂量向上或向下调节来调节人用剂量，如上文所描述的且本领域中已知的。
剂量可以随患者要求和所采用的化合物而变化。在本发明的背景中，对患者施用的剂量应当足以随时间影响患者中的有益治疗响应。剂量大小也会通过任何不利副作用的存在、性质和程度来确定。一般地，治疗以较小的剂量启动，该剂量小于化合物的最佳剂量。此后，将剂量增加较小的增量，直到达到各情形下的最佳效果。在本发明的一个实施方案中，剂量范围是0.001%至10%w/v。在另一个实施方案中，剂量范围是0.1%至5%w/v。
然而，典型的剂量可以含有每天的下限约0.1mg至上限约200mg药物化合物。还涵盖了其它剂量范围如每剂1mg至100mg化合物，和每剂3mg至70mg。通常，例如每天且甚至每周一次施用具有长持续时间的工程化多肽的剂量。每日剂量可以以离散单位剂量投递，在24小时时段或该24小时的任何部分中连续提供。
可以个别调节剂量量和时间间隔以提供对所治疗的特定临床适应症有效的施用化合物的水平。这会提供与个体疾病状态的严重性匹配的治疗方案。
利用本文中提供的教导，可以计划有效的预防性或治疗性处理方案，其不引起实质性毒性，但是对于治疗特定患者表明的临床症状却是完全有效的。此计划应当牵涉活性化合物的认真选择，其通过考虑下列因素如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的存在和严重性、优选的施用模式、和所选药剂的毒性概况来进行。
本文中描述的工程化多肽的令人惊讶的节省剂量特性，连同其长得令人惊讶的血浆半衰期和药理学作用持续时间，提供了优越的药剂。所述优越的特性包括节省剂量，其允许更低的剂量施用，由此产生更少的或不那么严重的副作用和改善的商品成本，和/或用于每日一次或每周一次施用的更节省成本和更简单的制剂，这是单独的亲本化合物目前所不能实现的。
D毒性
特定化合物的毒性和治疗效果之间的比率是其治疗指数，并且可以表示为LD50(在50%群体中致命的化合物量)和ED50(在50%群体中有效的化合物量)之间的比率。优选展现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定法和/或动物研究中获得的治疗指数数据可以用于制定人用的剂量范围。优选地，这类化合物的剂量位于包括具有很少毒性或无毒性的ED50的血浆浓度范围内。剂量可以随采用的剂量形式和利用的施用途径而在此范围内变化。参见例如Fingl等，于：THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,第1章,第l页,1975。确切的配制剂、施用途径和剂量可以由各个临床医师根据患者状况和使用化合物的特定方法进行选择。
不希望受任何理论束缚，认为如本文中描述的ABD清蛋白结合域与激素域的缀合可以提供降低的免疫原性，如由相对于无ABD缀合的激素域的免疫应答中的降低判断的。参见例如WO 2009/016043，通过提述完整并入本文并用于所有目的。
VII.实施例
实施例1：工程化多肽回收
设计蛋白质序列，并使用商业软件回译为DNA序列以克隆到大肠杆菌表达载体中。以寡核苷酸获得序列，并使用标准PCR扩增技术缝合在一起，或者使用标准限制酶从现有表达构建体消化出它们，然后将其一起连接回去。将表达感兴趣蛋白质的序列置于具有用于诱导型表达的T7启动子的pET45中。在通过测序验证构建体后，将载体DNA纯化，并转化到表达宿主(通常为BL21(DE3))中。选出单个菌落以在4ml LB培养基中将起始培养物培养约6小时。通过向900ul储液添加100ul80%甘油来制备甘油储液，并于-80C贮存。任选地，保留500μl未诱导的样品用于凝胶分析。在125ml Thompson烧瓶中使用60μl起始培养物接种60ml培养物(Magic培养基)，并于30C温育过夜。取出250ul样品用于分析。向下旋转，并将细胞团粒冷冻用于后续加工。
将细菌细胞收获，随后裂解以分离包含体。由于蛋白质存在于包含体中，将这些溶解，并使蛋白质于4C重折叠。然后，使用大小排阻层析分开蛋白质，直到仅保留单一条带，且内毒素水平是体内测试可接受的。对最终的蛋白质运行分析型HPLC、RP-LC-MS和SDS-PAGE凝胶作为质量控制度量。将蛋白 质分配至预先确定的等分试样，并于-80C贮存。
在下文表5中提供了用于本文中所描述方法的工程化多肽的典型回收。令人惊讶地，对上文所描述的化合物和生成方法观察到的回收可以显著高于用先前报告的缀合种类(例如Fc-瘦蛋白等)观察到的回收。此外，外来ABD域没有不利地影响回收的工程化多肽(尤其对于瘦蛋白缀合物)的表达、回收、重折叠、产量或溶解度，尽管在回收和操作瘦蛋白中存在一般公认的困难。
表5：工程化多肽的回收
化合物 回收，mg/50mL培养物
1 26.2
2 53.5
3 11.2
4 33.6
实施例2：瘦蛋白体外功能活性
方法。此测定法测量处理表达经修饰的瘦蛋白受体的细胞后的受体信号传导。假定测试样品为100%纯度，并在刺激缓冲液中再溶剂化至10X测定浓度。将总共90ul每种10X化合物转移到深孔pp板中，并使用Perkin Elmer MultiprobeII和程序“MSV_Lep_Func_3-Fold_Dil-Deepwell_96.MPT”用刺激缓冲液连续稀释(3倍系列)。将连续稀释的板混合到含有经过18小时瘦蛋白脱离的Keptin细胞的2.5x10^5个细胞团粒的96孔刺激板中，如本领域中已知的，其使用MultiMek测试程序“MSV_Lep_Func_200ul_Transfer”进行，该程序转移200ul每种稀释的化合物并混合细胞。此时，将板用粘性板盖密封，并于37C放置30分钟以允许刺激pSTAT5。参见例如Crouse等,1998,J.Biol.Chem.,273:18365-18373。温育后，将刺激板离心以使细胞再沉淀，除去上清液，并将剩余的细胞团粒于-80C冷冻(>30分钟)。通过于周围RT在旋转20分钟的情况中将100ul1x裂解物添加到融化的细胞团粒(Perkin ElmerpSTAT5测定试剂盒)来生成细胞裂解物。使裂解物以2500rpm澄清20分钟，并在pSTAT5测定试剂盒中以384孔ProxiplateTM中的4ul/孔依照制造商用法说明书检查。使用设置为Alpha阅读参数的Packard融合α-FP HT板阅读器来测定pSTAT5信号(RFU)。在384孔ProxiplateTM板中以11μl总体积完成测定法，数值代表每个剂量点n=4个测定孔的均值。
参照下文表6，Cmpd C1-C6是如本文中描述的例示性瘦蛋白、瘦蛋白类 似物和瘦蛋白衍生物。具体地，Cmpd C1是如本文中描述的SEQ ID NO:20。Cmpd C2是SEQ ID NO:30(即A200)。Cmpd C3是SEQ ID NO:32，其已经经由第78位半胱氨酸残基附接有单个20kDa聚乙二醇(PEG)模块。肽和蛋白质与PEG的缀合方法是本领域中已知的。Cmpd C4是SEQ ID NO:20的PEG化衍生物，其中已经经由SEQ ID NO:20的N端附接单个20kDa PEG。Cmpd C5是SEQID NO:32的双重PEG化的PEG衍生物，其中已经经由第78位半胱氨酸残基附接单个20kDaPEG模块，且已经经由N端附接单个20kDa PEG模块。Cmpd C6是一种PEG化的衍生物，其中已经经由N端附接单个40kDa PEG。
结果。如下文表6中列出的，与多种缀合的瘦蛋白相比，本文中描述的工程化多肽(例如Cmpd1-4)在Obeca STAT5测定法中具有相当的，且甚至优越的功能活性。
表6：瘦蛋白的体外功能活性
实施例3：单次施用后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来(Sprague Dawley)大鼠以低脂肪饮食 维持。均值体重在研究开始时是319克。将动物分成6组(n=6/组)。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中2.6mg/kg的Cmpd1；在媒介物中2.7mg/kg的Cmpd2；在媒介物中2.7mg/kg的Cmpd4；在媒介物中10mg/kg的Cmpd2。每只测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。对食物摄取和体重变化(%经媒介物校正的)监测14天，并记录结果，如显示的(图1A到1B)。施用的化合物：媒介物(框);2.6mg/kg的Cmpd1(三角形尖端朝上);2.7mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝下);2.7mg/kg的Cmpd4(菱形);10mg/kg的Cmpd C2(圆形)。
结果。如图1A到1B中绘出的，施用每种工程化多肽导致降低的食物摄取和体重。所有化合物根据总化合物重量以等摩尔剂量给予；化合物都以120nmol/kg(即Cmpd1以2.6mg/kg;Cmpd2和Cmpd4以2.7mg/kg;Cmpd C2以10mg/kg)给予。应当注意的是，Cmpd C2(即A200)是两个模块的二聚体，每个模块由与人瘦蛋白融合的IgG1FC区组成。Cmpd1和Cmpd2具有与Cmpd C2类似的活性，所述Cmpd C2因为它是二聚体，所以实际上每个分子具有两个瘦蛋白。尽管效力(最低体重)表现为相似的，但是清楚的是与Cmpd C2相比，趋势有利于这两种工程化多肽。当以每摩尔瘦蛋白为基础观察时，工程化多肽对于对食物摄取和体重的抑制两者都是卓越的，因为Cmpd C2在每个Fc-瘦蛋白二聚体复合物中具有2摩尔瘦蛋白，而每摩尔ABD-瘦蛋白模块仅具有1摩尔瘦蛋白。
先前的结果已经显示了，当通过连续输注对瘦大鼠给予时，需要约500ug/kg/天的A500化合物以在7天时影响9-10%重量减轻。这导致在5天时2.5mg的A500瘦蛋白化合物和7天时的3.5mg化合物。由于A500化合物自身是16067.68gm/mol，且Cmpd2的分子量是约22,510gm/mol，会预期在5天里需要多1.4倍的ABD融合蛋白。取而代之，仅给予多1.08倍(2.7mg/2.5mg)的化合物，这指示令人惊讶的剂量节约特性。
实施例4：单次施用Cmpd2后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是324克。将动物分成4组(n=6/组)。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中0.3mg/kg的Cmpd2；在媒介物中1.0mg/kg的Cmpd2；在媒介物中3.0mg/kg的Cmpd2。每只测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。对食物摄取和体重变化(%经媒介物校正的)监测14天，并记录结果，如 显示的(图2A到2B)。施用的化合物：媒介物(框);0.3mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝上);1.0mg/kg的Cmpd2(三角形尖端朝下);3.0mg/kg的Cmpd2(菱形)。
结果。如图2A到2B中绘出的，以每种浓度施用工程化多肽Cmpd2导致降低的食物摄取和体重。在图2B中观察到剂量响应。
实施例5：单次施用Cmpd2后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是324克。将动物分成4组(n=6/组)。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中1.1mg/kg的Cmpd2；在媒介物中3.3mg/kg的Cmpd2；在媒介物中11.1mg/kg的Cmpd2。每只测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。对食物摄取和体重变化(%经媒介物校正的)监测14天，并记录结果，如显示的(图3A到3B)。施用的化合物：媒介物(框);1.1mg/kg的Cmpd C2(圆形);3.3mg/kg的Cmpd C2(框);11.1mg/kg的Cmpd C2(三角形尖端朝上)。
结果。如图3A到3B中绘出的，以每种浓度施用对照Cmpd2导致降低的食物摄取和体重。
实施例6：单次施用Cmpd C6后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是324克。将动物分成2组(n=6/组)。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中2.2mg/kg的Cmpd C6。每只测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。监测食物摄取和体重变化(%经媒介物校正的)，并记录结果，如显示的(图4A到4B)。施用的化合物：媒介物(框);2.2mg/kg的Cmpd C6(三角形尖端朝下)。
结果。如图4A到4B中绘出的，以每种浓度施用对照Cmpd C6导致降低的食物摄取和体重。
实施例7：DIO大鼠中的体重变化
方法。在第0天和第7天给平均值为约500克的饮食诱导肥胖(DIO)倾向的斯普拉-道来大鼠IP注射测试和对照化合物(每种化合物n=6)。测试化合物是以媒介物中1.3mg/kg/周给予的SEQ ID NO:54。在研究期期间在多个点时(第0、4、7、12和14天)测量体重和食物摄取。施用的化合物：媒介物(框);媒介物中1.3mg/kg的SEQ ID NO:54(三角形尖端朝上)。
结果。图5中绘出的结果表明以每周一次时间间隔的IP注射导致7天后3% 的体重减轻，如先前在此剂量看到的。在第二次注射后，大鼠继续减轻体重，从而导致在14天时约7-8%的经媒介物校正的累积体重减轻。相比之下，令人惊讶地，用FC-瘦蛋白(瘦蛋白A200)的先前研究在类似的DIO模型中在第0天和第7天通过注射在5mg/kg/周剂量后在14天时仅产生约4%的体重减轻。
实施例8：血浆中工程化多肽的检测
方法。将平均值约483克的饮食诱导肥胖(DIO)的斯普拉-道来大鼠分成5个组，其中2组植入渗透泵。具有渗透泵的两组之一接受单独的媒介物的连续皮下输注(CSI)；另一组以250μg/kg/天的剂量接受媒介物中SEQ ID NO:33(即A500)的CSI。其它3组如下处理：一组在研究的第0,7,14,和21天接受每周一次皮下注射单独的媒介物；另一组在研究的第0,7,14,和21天接受每周一次皮下注射媒介物中1.3mg/kg剂量的SEQ ID NO:54(ABD-A500工程化多肽)；剩余组在研究的第0,7,14,和21天接受每周一次皮下注射媒介物中3.0mg/kg剂量的SEQ ID NO:54。在第27天(其是终止研究的日期)，从每只动物采集血液样品。
结果。图6中绘出的结果表明以1.3mg/kg每周一次注射SEQ ID NO:54导致相对于通过连续输注SEQ ID NO:33达到的血浆水平略低的血浆水平，而以3.0mg/kg每周一次注射SEQ ID NO:54导致比用SEQ ID NO:33的连续输注达到的血浆水平显著更大的血液水平(比较左侧小图与右侧小图；注意每幅小图的Y轴比例尺的差异)。
实施例9：单次施用工程化多肽后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是330克。每只测试动物(n=5/组)在时间=0时接受单次皮下注射。将动物分成5组。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中的SEQ ID NO:54；在媒介物中的SEQ ID NO:56；在媒介物中的SEQ ID NO:58；在媒介物中的SEQ ID NO:59。将SEQ ID NO;54,56,58,和59各自以120nmol/kg的剂量投递。对每组的体重百分比变化监测14天，并记录结果，如显示的(图7)。
结果。如图7中绘出的，相对于接受单独的媒介物的组，接受所测试的SEQ ID NO之一的单次注射的每组动物在研究的14天长度间展现出显著的且持续的体重减轻。
实施例10：单次施用工程化多肽后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是330克。将动物分成6组(n=5/组)。每只测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中的SEQ ID NO:54；在媒介物中的SEQ ID NO:57；在媒介物中的SEQ ID NO:60；在媒介物中的SEQ ID NO:61；在媒介物中的SEQ ID NO:62。将SEQ ID NO;54,57,60,61,和62各自以120nmol/kg的剂量投递。对每组的体重百分比变化监测14天，并记录结果，如显示的(图8)。
结果。如图8中绘出的，相对于接受单独的媒介物的组，接受所测试的SEQ ID NO之一的单次注射的每组动物展现出显著的且持续的体重减轻。
实施例11：单次施用工程化多肽后体重和食物摄取的变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是317克。每只测试动物(n=7/组)在时间=0时接受单次皮下注射。将动物分成4组。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中的SEQ ID NO:54；在媒介物中的SEQ ID NO:63；在媒介物中的SEQ ID NO:64。将SEQ ID NO;54,63,和64各自以120nmol/kg的剂量投递。对每组的食物摄取和体重百分比变化监测14天，并记录结果，如显示的(分别为图9A和9B)。
结果。如图9A和9B中绘出的，相对于单独的媒介物，接受所测试的SEQ ID NO之一的单次注射的每组动物展现出食物摄取(图9A)和体重(图9B)的显著的且持续的降低。
实施例12：单次施用工程化多肽后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重在研究开始时是330克。将动物分成6组。每只测试动物(n=5/组)在时间=0时接受单次皮下注射。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中的SEQ ID NO:54；在媒介物中的SEQ ID NO:67；在媒介物中的SEQ ID NO:68；和在媒介物中的SEQ ID NO:69。将SEQ ID NO;54,67,68,和69各自以120nmol/kg的剂量投递。对每组的体重百分比变化监测10天，并记录结果，如显示的(图10)。
结果。如图10中绘出的，相对于接受单独的媒介物的组，接受所测试的SEQ ID NO之一的单次注射的每组动物展现出体重的显著且持续的降低。
实施例13：单次施用工程化多肽后的体重变化
方法。在研究期间使瘦斯普拉-道来大鼠以低脂肪饮食维持。均值体重 在研究开始时是320克。将动物分成6组。每只测试动物(n=5/组)在时间=0时接受单次皮下注射。将每组归为接受下列一项：媒介物；在媒介物中的SEQ ID NO:54；在媒介物中的SEQ ID NO:104；在媒介物中的SEQ ID NO:105；在媒介物中的SEQ ID NO:106；和在媒介物中的SEQ ID NO:107。将SEQ ID NO;54,104,105,106,和107各自以120nmol/kg的剂量投递。对每组的体重变化监测9天，并记录结果，如显示的(图11A到11C)。
结果。如图11中绘出的，相对于单独的媒介物，接受所测试的SEQ ID NOS之一的单次注射的每组动物展现出食物摄取(图11A)和体重(图11B和11C)的显著的且持续的降低。
实施例14：清蛋白结合多肽的亲和力测定
在此实施例中，对化合物2和化合物15表征对不同清蛋白变体的亲和力。材料和方法
使用GLC传感器芯片于25℃在BioRad ProteOn XPR36系统上进行所有研究。对于胺偶联，使用在水中自初始储液稀释30倍的sulfo-NHS/EDC的1:1混合物将GLC芯片活化5分钟，如下文显示的。将每份清蛋白样品在10mM醋酸钠pH5.0中稀释至25ug/ml，并在分开的传感器表面上注射5分钟。然后，用1M乙醇胺pH8.5封闭每个表面。将每种清蛋白以2000-5000个共振单位的密度偶联。
使用5nM作为3倍稀释系列中的最高浓度测试工程化多肽的结合。运行缓冲液含有10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005%Tween-20。使用3倍稀释系列测试所有样品。一式两份测试每个浓度系列。对最高浓度的解离相监测3小时。
结果
在下文表7中呈现了对工程化多肽测量的相对KD。结果显示了清蛋白结合多肽以高亲和力与血清清蛋白(SA)结合。
表7:清蛋白结合多肽对清蛋白变体的KD
实施例15：在存在清蛋白的情况下瘦蛋白体外功能活性
在此测定法中，使用实施例2中描述的方法，只是向刺激缓冲液添加清蛋白来测试化合物2在存在清蛋白的情况下的瘦蛋白功能。测试的清蛋白包括0.1%或1%牛血清清蛋白(BSA)、1%大鼠血清清蛋白(RSA)、或1%人血清清蛋白(HSA)。对照样品是具有0.1%BSA的A100瘦蛋白。
结果。如图12中显示的，在瘦蛋白功能测定法中1%牛/大鼠/人清蛋白对由化合物2产生的EC50活性没有影响。结果是令人惊讶的，并且显示了该治疗性化合物即使在与清蛋白结合时也是有活性的。
实施例16：在大鼠中皮下注射后由工程化多肽投递的延长的药动学概况
进行此研究以在大鼠中评估化合物2和化合物15，其通过比较其血液浓度对时间的概况，即药动学概况。
将大鼠置于处理组中。以30nmol/kg、60nmol/kg、或120nmol/kg皮下施用化合物2。在施用前、施用后12,24,48,96,和144小时从侧尾静脉采集血液样品。通过免疫酶测定方法测量血浆中化合物2的浓度。
以120nmol/kg皮下施用化合物15。在施用前、施用后0.5,1,2,4,6,24,48,72,96,120和144小时从侧尾静脉采集血液样品。通过免疫酶测定方法测量血浆中化合物15的浓度。
化合物2(图13)和化合物15(图14)两者都展现出延长的血浆对时间概况。实施例17：由瘦蛋白受体介导的工程化多肽效果
方法。使用瘦斯普拉-道来大鼠和ZDF大鼠进行此研究。ZDF大鼠具有突变(fa)，其产生不与瘦蛋白有效相互作用的缩短的瘦蛋白受体。均值体重在研究开始时是225克。将动物分成2组(n=5/组)。将每组归为接受下列一项：媒介物；媒介物中2.7mg/kg的Cmpd2。每只测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。监测体重变化(%经媒介物校正的)，并记录结果，如显示的(图15A,15B)。施用的化合物：媒介物(实心圆形)；2.7mg/kg的Cmpd2(实心正方形)。
结果。如图15A和15B中绘出的，化合物2在ZDF大鼠中不是有效的，指示其效果经由瘦蛋白受体介导。
实施例18：在工程化多肽情况中的剂量节约
此研究比较在瘦蛋白敏感性瘦大鼠中实现相似体重减轻量需要的A500(SEQ IDNO:33)和化合物2(SEQ ID NO:54)的剂量。在图16中显示了结果。以120nmol/kg/周给药的化合物2实现约18%的经媒介物校正的重量减轻。为了用A500实现相同的重量减轻量，需要在一周过程里120nmol/kg/d或 1680nmol/kg(每次注射120x2(对于BID)x7天)的BID剂量。不希望受任何理论束缚，此“剂量节约”可以至少部分归因于化合物2比A-500改善的PK概况。
实施例19：工程化多肽的溶解度
如下文表8中列出的，本文中描述的工程化多肽在中性pH中具有高得令人惊讶的溶解度。
用以下测定法测量溶解度：用离心滤器单元(Amicon Ultra-15或Ultra-4，具有3KDa MW截留;Millipore)于4℃将6-10mg纯化的蛋白质浓缩至小于0.5ml的体积。将它们于4℃以14,000rpm离心10分钟以除去沉淀物，并将上清液转移至新管。允许蛋白质于室温在黑暗中平衡过夜，然后用0.22微米注射器滤器(Milex GV;Millipore)过滤以除去沉淀物。用NanoDrop分光光度计测量OD280处的吸光度，并使用蛋白质的理论摩尔消光系数来计算浓度。
表8：工程化多肽的溶解度
实施例20：工程化多肽的稳定性
如下文表9中列出的，本文中描述的工程化多肽是化学稳定的。在不同pH的缓冲液中以1mg/mL配制化合物。如表9中显示的，嵌合多肽于40℃在2周后具有良好的效力(表9A)和纯度(表9B)，如通过反相高效液相层析(HPLC)测定的。
表9A：工程化多肽的效力
*效力=主峰面积/参照标准面积
表9B：工程化多肽的纯度
实施例21：工程化多肽的溶解度
如下文表10中列出的，本文中描述的工程化多肽是化学稳定的。在以下缓冲液中以3种不同浓度配制化合物15：10mM谷氨酸、2%甘氨酸、1%蔗糖、0.01%Tween20,pH4.25，并于5℃、15℃、或25℃贮存。如表10中显示的，化合物15在10、20、和30mg/mL时于5-25℃持续至少1个月是化学稳定的，如通过HPLC测定的。
表10：工程化多肽的稳定性
实施例22：工程化多肽的稳定性
如下文表11中列出的，本文中描述的工程化多肽是物理学稳定的。在以下缓冲液中以3种不同浓度配制化合物15：10mM谷氨酸、2%甘氨酸、1%蔗糖、0.01%Tween20,pH4.25，并于37℃贮存。如表11中显示的，化合物15在10、20、和30mg/mL时持续至少1个月是物理稳定的，如通过视觉分析测定的。
表11：工程化多肽的稳定性
实施例23：工程化多肽的稳定性
本文中描述的工程化多肽是物理学稳定的。表12显示了对A100、ABD1-HuSeal、和ABD1-A500实施的大小排阻层析(SEC)的结果。与A100相比，工程化多肽显示很少至没有自身联合成二聚体/寡聚体。
表12：工程化多肽的稳定性
化合物 Pk1(%) Pk2(%) Pk3(%)
ABD1-HuSeal 99.22 0.78 n/a
ABD1-A500 96.73 3.27 n/a
A100 88.21 11.15 0.65
Pk1=单体
Pk2=二聚体
Pk3=寡聚体(三聚体/四聚体)
SEC法：
柱：Tosoh TSK凝胶G3000SWxl7.8mm x30cm(#08541)
流动相：10mM磷酸钠，pH7.4+238mM NaCl+2.7mM KCl
运行时间：22min
流动速率：0.8mL/min
柱温度：25℃
样品温度：5℃
样品加载：40ug
检测：214nm
实施例24：胰淀素和瘦蛋白的协同作用在高BMI受试者中是缺乏的
先前的研究已经描述了称重为500-550克的大鼠中的胰淀素/瘦蛋白协同作用。在注意到效力和BMI的逆关系后，我们在非常肥胖的大鼠(750克)和在启动药物治疗前受食物限制至中等肥胖范围(500-550g)的非常肥胖的大鼠中评估该组合的效果。
在此研究中，允许一组非常肥胖的大鼠(750g)任意喂食，并用胰淀素、瘦蛋白或胰淀素+瘦蛋白的组合处理。尽管胰淀素是有效的，但是在添加瘦蛋白的情况中没有明显的协同作用。将第二组非常肥胖的大鼠(750g)进行卡路里向下限制至500-550g范围，其中先前表明协同作用。然后，这些动物开始胰淀素/瘦蛋白处理，并允许任意喂食。图17显示了研究结果。快速的重量恢复在经媒介物和瘦蛋白单一疗法处理的大鼠中是明显的。用胰淀素单一疗法实现某种重量维持。用该组合未实现进一步的重量维持。这些发现提示了在“高BMI”啮齿类中协同作用的缺乏不能简单地通过饮食引入(diet-lead in)挽救。
实施例25：工程化多肽与胰淀素激动剂的协同作用
此研究检查了每周一次施用PEG-大鼠胰淀素(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰淀素(SEQ ID NO:148)，化合物124)在与ABD1-A500(化合物2)共施用时对于协同作用是否会是足够的。为了比较，还将ABD1-A500与输注的大鼠胰淀素共施用(图18A)。图18B显示了尽管PEG-大鼠胰淀素诱导的重量减轻是稍低的且具有较小的量级，但是体重减轻(和协同作用)的总量与由输注的大鼠胰淀素实现的总量在定性上是相似的。对500g平均值重量的雄性饮食诱导肥胖(DIO)的Harlan斯普拉-道来(HSD)大鼠，通过SC渗透微型泵以50μg/kg/d施用胰淀素，以125nmol/kg每周一次施用PEG-大鼠胰淀素，及以120nmol/kg每周一次施用ABD1-A500。
实施例26：工程化多肽与胰淀素激动剂的协同作用
此研究显示了每周一次施用ABD1-HuSeal(化合物15)在与输注的大鼠胰淀素共施用时对于协同作用是足够的。图19显示了工程化多肽和输注的胰淀素的组合比对单独的每种药剂观察到的结果导致更低的食物摄取(图19A)和更多的重量减轻(图19B)。对500g平均值重量的雄性DIO HSD大鼠，以120nmol/kg施用ABD1-HuSeal，并通过SC渗透微型泵以50μg/kg/d施用胰淀素。
实施例27：工程化多肽与胰淀素激动剂的协同作用
此研究显示了每周一次施用ABD1-HuSeal(化合物15)在与每周2次施用的PEG-大鼠胰淀素(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰淀素(SEQ ID NO:148)，化合物124)共施用时对于协同作用是足够的。图20显示了工程化多肽和PEG-大鼠胰淀素的组合比对单独的每种药剂观察到的结果导致更多的重量减轻。对500g平均值重量的雄性DIO HSD大鼠，以120nmol/kg施用 ABD1-HuSeal，并以125nmol/kg施用PEG-胰淀素。
实施例28：工程化多肽与胰淀素激动剂在高BMI群体中的协同作用
图21A显示了先前研究的结果，其在称重为500-550克的大鼠中描述了胰淀素/瘦蛋白协同作用。图21B显示了在大鼠的高BMI群体(平均值重量为700g)中没有观察到此协同作用。图21C显示了每周一次施用ABD1-A500(化合物15)在高BMI大鼠中与每周2次施用PEG-大鼠胰淀素(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰淀素(SEQ ID NO:148)，化合物124)共施用时对于协同作用是足够的。对700g平均值重量的雄性DIO HSD大鼠，以120nmol/kg施用ABD1-A500，并且以125nmol/kg施用PEG-胰淀素。
实施例29：工程化多肽与胰淀素激动剂在高BMI群体中的协同作用
此研究显示了每周一次施用ABD1-HuSeal(化合物15)或ABD1-A500(化合物2)在对高BMI大鼠与输注的大鼠胰淀素共施用时，对于协同作用是足够的。对700g平均值重量的雄性DIO HSD大鼠，以120nmol/kg施用ABD1-HuSeal(图22A)或ABD1-A500(图22B)，并且通过SC渗透微型泵以50μg/kg/d施用胰淀素。
实施例30：工程化多肽在非肥胖的1型糖尿病小鼠中的抗糖尿病效果
此研究的目的是在1型糖尿病(T1DM)的高剂量STZ小鼠模型中评估工程化多肽在关键的糖尿病和代谢终点的体内影响。对C57 BL/6雄性小鼠给予200mg/kg STZ的单次腹膜内注射以诱导1型糖尿病。以120nmol/kg每周2次皮下施用化合物达2周。测量的终点包括HbA1c水平、葡萄糖水平、体重和食物摄取。
图23显示了化合物15和化合物2两者都使STZ诱导的糖尿病小鼠中的血液葡萄糖标准化。这两种工程化多肽还降低血红蛋白A1c水平，如图24中显示的，并降低体重和累积食物摄取，如图25中显示的。
为了确保疗法的葡萄糖降低效果并非是由于胰岛素效果所致，进行另一项研究以将瘦蛋白疗法与低剂量胰岛素组合。在T1DM的高剂量STZ小鼠模型中在添加或不添加0.05U/天剂量的胰岛素的情况中施用化合物15。对C57BL/6雄性小鼠给予175mg/kg STZ的单次腹膜内注射以诱导1型糖尿病。以60nmol/kg每周2次皮下施用化合物达2周。测量的终点包括HbA1c水平、葡萄糖水平、体重和食物摄取。
图26显示了对于化合物15以叠加方式用低剂量胰岛素加强的葡萄糖降低效果。它还降低血红蛋白A1c水平，如图27中显示的，并降低了体重和累积食物摄取，如图28中显示的。
VIII.实施方案
工程化多肽及其使用方法和本文中描述的药物组合物的其它实施方案如下：
实施方案1.一种工程化多肽，其包含：清蛋白结合域多肽(ABD)；和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素域(HD1)。
实施方案2.依照实施方案1的工程化多肽，其进一步包含与所述HD1共价连接的第一接头(L1)。
实施方案3.依照实施方案1或2的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含作为N端模块的所述ABD和作为C端模块的所述HD1。
实施方案4.依照实施方案1或2的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含作为C端模块的所述ABD和作为N端模块的所述HD1。
实施方案5.依照实施方案3的工程化多肽，其包含结构：ABD-HD1。
实施方案6.依照实施方案3的工程化多肽，其包含结构：ABD-L1-HD1。
实施方案7.依照实施方案4的工程化多肽，其包含结构：HD1-ABD。
实施方案8.依照实施方案4的工程化多肽，其包含结构：HD1-L1-ABD。
实施方案9.依照实施方案1至8中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是所述瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段、或瘦蛋白衍生物。
实施方案10.依照实施方案1至9中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与选自下组的氨基酸序列具有至少50%同一性：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,和SEQ ID NO:12.SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ IDNO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ IDNO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146。
实施方案11.依照实施方案1至10中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与 选自下组的氨基酸序列具有至少90%同一性：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,和SEQ ID NO:12.SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ IDNO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ IDNO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146。
实施方案12.依照实施方案1至11中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与人瘦蛋白具有至少50%同一性。
实施方案13.依照实施方案1至12中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与人瘦蛋白具有至少90%同一性。
实施方案14.依照实施方案1至13中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与SEQ IDNO:20具有至少50%同一性。
实施方案15.依照实施方案1至14中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与SEQ IDNO:20具有至少90%同一性。
实施方案16.依照实施方案1至15中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与鸭嘴兽瘦蛋白具有至少50%同一性。
实施方案17.依照实施方案1至16中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与海豹瘦蛋白具有至少50%同一性。
实施方案18.依照实施方案1至17中任一项的工程化多肽，其中所述HD1具有1至5处氨基酸修饰，所述修饰独立地选自插入、缺失、添加和取代之任一种或组合。
实施方案19.依照实施方案1至18中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,和SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQ IDNO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146。
实施方案20.依照实施方案1至19中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,和SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146。
实施方案21.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:1。
实施方案22.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:2。
实施方案23.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:3。
实施方案24.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:4。
实施方案25.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:5。
实施方案26.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:6。
实施方案27.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:7。
实施方案28.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:8。
实施方案29.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:9。
实施方案30.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:10。
实施方案31.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:11。
实施方案32.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:12。
实施方案33.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:13。
实施方案34.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:14。
实施方案35.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:15。
实施方案36.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:16。
实施方案37.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:17。
实施方案38.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:18。
实施方案39.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:19。
实施方案40.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:20。
实施方案41.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:21。
实施方案42.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:22。
实施方案43.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:23。
实施方案44.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:24。
实施方案45.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是 SEQ IDNO:25。
实施方案46.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:26。
实施方案47.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:27。
实施方案48.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:28。
实施方案49.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:29。
实施方案50.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:30。
实施方案51.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:31。
实施方案52.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:32。
实施方案53.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:33。
实施方案54.依照实施方案1至53中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含由以下氨基酸序列组成的清蛋白结合基序(ABM)：
GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I(SEQ ID NO:34)
其中彼此独立地，
X5选自Y和F；
X8选自N,R和S；
X9选自V,I,L,M,F和Y；
X11选自N,S,E和D；
X12选自R,K和N；
X14选自K和R；
X20选自D,N,Q,E,H,S,R和K；
X23选自K,I和T；
X24选自A,S,T,G,H,L和D；且
X25选自H,E和D。
实施方案55.依照实施方案1至54中任一项的工程化多肽，其中彼此独立地，X5是Y；
X8是N；
X23是T或I；
X24是S或L；且
X25是E或H。
实施方案56.依照实施方案1至55中任一项的工程化多肽，其中清蛋白结合基序包含选自下组的氨基酸序列：GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI(SEQ ID NO:114)和GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI(SEQ ID NO:115)。
实施方案57.依照实施方案1至56中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含不是GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI(SEQ ID NO:35)的清蛋白结合基序(ABM)。
实施方案58.依照实施方案1至57中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含表1中公开的ABM。
实施方案59.依照实施方案1至58中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含氨基酸序列：
LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY-[ABM]-LAALP(SEQ ID NO:36)
其中
[ABM]是清蛋白结合基序，且，
彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L,E和D；
Xc选自N,L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；
第45位亮氨酸是存在或缺乏的；且
第46位脯氨酸是存在或缺乏的。
实施方案60.依照实施方案1至59中任一项的工程化多肽，其中，彼此独立地，Xa为E；
Xb为D；
Xc为I；且
Xd为K。
实施方案61.依照实施方案1至60中任一项的工程化多肽，其中所述清蛋白结合域多肽(ABD)包含选自下组的氨基酸序列：
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：50)；和
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP(SEQ ID N0：51)。
实施方案62.依照实施方案1至61中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含氨基酸序列：
LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY-[ABM]-LAALP(SEQ ID NO:36)
其中
[ABM]为清蛋白结合基序，且
彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L,E和D；
Xc选自N,L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；
第45位亮氨酸是存在或缺乏的；
第46位脯氨酸是存在或缺乏的；且
其中ABM由以下氨基酸序列组成：
GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I(SEQ ID NO:34)
其中，彼此独立地，
X5选自Y和F；
X8选自N,R和S；
X9选自V,I,L,M,F和Y；
X11选自N,S,E和D；
X12选自R,K和N；
X14选自K和R；
X20选自D,N,Q,E,H,S,R和K；
X23选自K，I和T；
X24选自A，S，T，G，H，L和D；且
X25选自H，E和D。
实施方案63.依照实施方案1至62中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含与选自下组的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：51，和SEQ ID NO：52。
实施方案64.依照实施方案1至63中任一项的工程化多肽，其中所述ABD包含任一种选自下组的肽：
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP(SEQ ID NO：38)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALT H HILAA LP(SEQ ID No：39)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP(SEQ ID NO：40)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP(SEQ ID NO：41)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP(SEQ ID NO：42)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：43)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP(SEQ ID NO：44)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP(SEQID NO：45)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP(SEQ ID NO：46)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP(SEQ ID NO：47)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAH ILAALP(SEQ ID NO：48)，
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQ IDNO：49)，
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：50)，
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYY KNLINKAKTVEGVEALISEILAALP(SEQ ID NO：51)，和
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP(SEQ ID NO：52)。
实施方案65.依照实施方案1至64中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1是1至30个氨基酸或小于30个氨基酸的肽。
实施方案66.依照实施方案1至65中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1选自20种天然存在的氨基酸。
实施方案67.依照实施方案1至66中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1是非天然的氨基酸，其通过化学合成、翻译后化学修饰或通过宿主细胞中的重组表达通过体内掺入来掺入。
实施方案68.依照实施方案1至67中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1氨基酸选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸。
实施方案69.依照实施方案1至68中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含包含空间无阻的大多数氨基酸。
实施方案70.依照实施方案1至69中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包括下列一种或多种：酸性接头、碱性接头、和结构基序。
实施方案71.依照实施方案1至70中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)、或聚(Gly-Ser)。
实施方案72.依照实施方案1至71中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含(Gly)3,(Gly)4(SEQ ID NO:116),或(Gly)5(SEQ ID NO:117)的聚甘氨酸。
实施方案73.依照实施方案1至72中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:118);(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:119);(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO:120);和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO:121)。
实施方案74.依照实施方案1至73中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ala的组合。
实施方案75.依照实施方案1至74中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ser的组合。
实施方案76.依照实施方案1至75中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Glu的组合。
实施方案77.依照实施方案1至76中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Lys的组合。
实施方案78.依照实施方案1至77中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:122),[Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:123),[Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:124)和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:125)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10。
实施方案79.依照实施方案1至78中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:126);[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:127);[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:128);[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:129),[Gly-Asp]n(SEQID NO:130);[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:131);[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:132);[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:133)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
实施方案80.依照实施方案1至79中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:126);[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:127);[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:128);[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:129),[Gly-Asp]n(SEQID NO:130);[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:131);[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:132);[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:133)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
实施方案81.依照实施方案1至80中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Lys]n(SEQ ID NO:134);[Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:135);[Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:136);[Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:137),[Gly-Arg]n(SEQID NO:138);[Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:139);[Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:140);[Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:141)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
实施方案82.依照实施方案1至81中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n(SEQ ID NO:142)，其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
实施方案83.依照实施方案1至81中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Gly-Glu]6(SEQ ID NO:153)[Gly-Gly-Lys]6(SEQ ID NO:154).[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3(SEQ ID NO:155),,[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4(SEQ ID NO:156),或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5(SEQ ID NO:157)。
实施方案84.依照实施方案1至83中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含N端TG二肽。
实施方案85.依照实施方案1至84中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含C端AS二肽。
实施方案86.依照实施方案1至85中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含N端TG二肽和C端AS二肽。
实施方案87.依照实施方案1至86中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的氨基酸序列：TG-(GGGS)1(SEQ ID NO:215),TG-(GGGS)2(SEQ ID NO:216),TG-(GGGS)3(SEQ ID NO:217),TG-(GGGS)4(SEQ ID NO:218),TG-(GGGS)5(SEQ ID NO:219),(GGGS)1-AS(SEQ ID NO:220),(GGGS)2-AS(SEQ ID NO:221),(GGGS)3-AS(SEQ ID NO:222),(GGGS)4-AS(SEQ ID NO:223),(GGGS)5-AS(SEQ ID NO:224),TG-(GGGS)1-AS(SEQ ID NO:225),TG-(GGGS)2-AS(SEQ ID NO:226),TG-(GGGS)3-AS(SEQ ID NO:227),TG-(GGGS)4-AS(SEQ ID NO:228),和TG-(GGGS)5-AS(SEQ ID NO:229)。
实施方案88.依照实施方案1至87中任一项的工程化多肽，其中所述TG二肽TG和/或所述二肽AS是缺乏的或用选自T,A,S,和G的氨基酸对替换。
实施方案89.依照实施方案1至88中任一项的工程化多肽，其中所述多肽进一步包含一个或多个额外的接头。
实施方案90.依照实施方案1至89中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含选自下组的氨基酸序列：EQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ IDNO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ IDNO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,和SEQ ID NO:107。
实施方案91.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:53中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案92.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:54中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案93.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:55中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案94.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:56中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案95.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:57中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案96.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:58中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案97.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:59中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案98.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:60中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案99.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:61中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案100.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:62中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案101.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:63中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案102.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:64中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案103.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:65中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案104.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:66中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案105.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:67中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案106.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:68中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案107.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:69中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案108.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:70中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案109.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:71中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案110.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:72中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案111.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:73中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案112.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:74中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案113.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:75中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案114.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:76中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案115.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:77中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案116.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:78中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案117.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化 多肽包含SEQ ID NO:79中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案118.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:80中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案119.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:81中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案120.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:82中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案121.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:83中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案122.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:84中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案123.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:85中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案124.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:86中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案125.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:87中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案126.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:88中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案127.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:89中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案128.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:90中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案129.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:91中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案130.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:92中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案131.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:93中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案132.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:94中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案133.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:95中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案134.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:96中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案135.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:97中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案136.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:98中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案137.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:99中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案138.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:100中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案139.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:102中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案140.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:102中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案141.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:103中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案142.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:104中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案142.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:105中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案144.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:106中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案145.依照实施方案1至90中任一项的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含SEQ ID NO:107中列出的选择的氨基酸序列。
实施方案146.依照实施方案1至145中任一项的工程化多肽，其对血清清蛋白具有解离常数小于约10-6mol/L的亲和力。
实施方案147.依照实施方案1至146中任一项的工程化多肽，其对血清清蛋白具有解离常数小于约10-9mol/L的亲和力。
实施方案148.依照实施方案1至147中任一项的工程化多肽，其对血清清蛋白 具有解离常数小于约10-12mol/L的亲和力。
实施方案149.依照实施方案1至148中任一项的工程化多肽，其中所述多肽具有至少1天的作用持续时间。
实施方案150.依照实施方案1至149中任一项的工程化多肽，其中所述多肽具有至少3天的作用持续时间。
实施方案151.依照实施方案1至150中任一项的工程化多肽，其中所述多肽具有至少5天的作用持续时间。
实施方案152.依照实施方案1至151中任一项的工程化多肽，其中所述多肽在人受试者中具有至少5天的作用持续时间。
实施方案153.一种用于治疗受试者中的疾病或病症的方法，包括以有效治疗所述疾病或病症的量对有此需要的受试者施用依照实施方案1至152和170至192中任一项的工程化多肽。
实施方案154.依照实施方案153的方法，其中所述疾病或病症可以是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、阿耳茨海默氏病、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病、糖尿病(包括I型和II型)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和代谢综合征X。
实施方案155.依照实施方案153或实施方案154的方法，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、阿耳茨海默氏病、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病或糖尿病。
实施方案156.依照实施方案153至155中任一项的方法，其中所述疾病或病症是I型糖尿病或II型糖尿病。
实施方案157.依照实施方案153至155中任一项的方法，其中所述疾病或病症是肥胖症。
实施方案158.依照实施方案153至155中任一项的方法，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良或瘦蛋白缺陷。
实施方案159.一种药物组合物，其包含依照实施方案1至152中任一项的工程化多肽和药学可接受赋形剂。
实施方案160.依照实施方案159的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射药物组合物。
实施方案161.依照实施方案159至160中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是持续释放的或长效的药物组合物。
实施方案162.依照实施方案159至161中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是每日一次的药物组合物。
实施方案163.依照实施方案159至161中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是每周一次的药物组合物。
实施方案164.实施方案159至163中任一项的药物组合物，其用于治疗受试者中的疾病或病症。
实施方案165.依照实施方案159至164中任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、阿耳茨海默氏病、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病、糖尿病(包括I型和II型)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、和代谢综合征X。
实施方案166.实施方案164或实施方案165的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、阿耳茨海默氏病、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病或糖尿病。
实施方案167.依照实施方案164至166中任一项的方法，其中所述疾病或病症是I型糖尿病或II型糖尿病。
实施方案168.依照实施方案164至166中任一项的方法，其中所述疾病或病症是肥胖症。
实施方案169.依照实施方案164至166中任一项的方法，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良或瘦蛋白缺陷。
实施方案170.依照实施方案1至18中任一项的工程化多肽，其中所述HD1选自下组：
(a)选自下组的瘦蛋白的氨基酸序列1-146：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ IDNO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ IDNO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:33,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中在下列一个或多个位置中取代不同氨基酸并保留相同的编号方式(即使在第28位谷氨酰胺酰基残基缺乏的情况下)：4,32,33,35, 50,64,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145；
(b)子部分(a)的氨基酸序列，其中第28位谷氨酰胺酰基残基是缺乏的；
(c)子部分(a)或(b)的氨基酸序列，其中在N端添加甲硫氨酰基残基；
(d)由(a),(b),或(c)的氨基酸序列的片段组成的瘦蛋白，所述片段选自：
(i)氨基酸98-146;
(ii)氨基酸1-32;
(iii)氨基酸40-116;
(iv)氨基酸1-99和112-146;
(v)氨基酸1-99和112-146，其中氨基酸100-111中的一个或多个置于氨基酸99和112之间；
(vi)子部分(i)的氨基酸序列，其中用另一种氨基酸取代氨基酸100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145的一个或多个；
(vii)子部分(ii)的氨基酸序列，其中用另一种氨基酸取代氨基酸4,8和32的一个或多个；
(viii)子部分(iii)的氨基酸序列，其中用另一种氨基酸取代氨基酸50,53,60,64,66,67,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111和112的一个或多个；
(ix)子部分(iv)的氨基酸序列，其中用另一种氨基酸取代氨基酸4,8,32,33,35,48,50,53,60,64,66,67,68,71,74,77,78,89,97,112,118,136,138,142,和145的一个或多个；和
(x)子部分(v)的氨基酸序列，其中用另一种氨基酸取代氨基酸4,32,33,35,50,64,68,71,74,77,78,89,97,100,102,105,106,107,108,111,118,136,138,142,和145的一个或多个；
(xi)子部分(i)-(x)中任一项的氨基酸序列，其中已经在N端添加甲硫氨酸；
(e)子部分(a)到(d)中任一项的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列附接于化学模块；
(f)子部分(e)的氨基酸序列，其中所述化学模块是水溶性聚合物模块；
(g)子部分(f)的氨基酸序列，其中所述水溶性聚合物模块选自下组：聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙 烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸均聚物、聚氨基酸随机共聚物、清蛋白、Fc蛋白、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、聚乙二醇丙醛、琥珀酸酯和苯乙烯；
(h)子部分(g)的氨基酸序列，其中所述水溶性聚合物模块是聚乙二醇；和
(i)子部分(g)的氨基酸序列，其中所述水溶性聚合物是选自下组的聚氨基酸：清蛋白、抗体、Fc蛋白、和聚赖氨酸模块。
实施方案171.依照实施方案1至18和170中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出一处或多处氨基酸取代。
实施方案172.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出1处氨基酸取代。
实施方案173.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出2处氨基酸取代。
实施方案174.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出3处氨基酸取代。
实施方案175.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出4处氨基酸取代。
实施方案176.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出5处氨基酸取代。
实施方案177.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出6处氨基酸取代。
实施方案178.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出7处氨基酸取代。
实施方案179.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出8处氨基酸取代。
实施方案180.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出9处氨基酸取代。
实施方案181.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出10处氨基酸取代。
实施方案182.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22, SEQID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出11处氨基酸取代。
实施方案183.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出12处氨基酸取代。
实施方案184.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出13处氨基酸取代。
实施方案185.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出14处氨基酸取代。
实施方案186.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出15处氨基酸取代。
实施方案187.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出16处氨基酸取代。
实施方案188.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出17处氨基酸取代。
实施方案189.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出18处氨基酸取代。
实施方案190.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145,和SEQ ID NO:146；其中已经做出19处氨基酸取代。
实施方案191.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:143,SEQID NO:144,SEQ ID NO:145, 和SEQ ID NO：146；其中已经做出20处氨基酸取代。
实施方案192.依照实施方案1至18和171中任一项的工程化多肽，其中所述HD1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：143，SEQID NO：144，SEQ ID NO：145，和SEQ ID NO：146；其中已经做出21处氨基酸取代。
实施方案193.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1为SEQ IDNO：143。
实施方案194.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1为SEQ IDNO：144。
实施方案195.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1为SEQ IDNO：145。
实施方案196.依照实施方案1至20中任一项的工程化多肽，其中所述HD1为SEQ IDNO：146。
尽管前述描述公开了本发明，其中实施例为了例示目的而提供，但是应当理解本发明的实践涵盖所有常见变化、改编、或修改，其在所要求保护的发明的范围内。因此，描述和实施例不应解释为限制本发明的范围，其由所附权利要求书描述。
IX.非正式序列表
本文中公开的非正式序列表如下：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKM
DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGG
VLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC，
其中第28位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：1)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL
AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLESLGGVLEA
SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC，
其中第29位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：2)；
VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIY
QQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYS
TEVVA LSRLQGALQDM LRQLDLSPGC(SEQ ID NO：3)；
MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAI
YQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLY
STEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC(SEQ ID NO：4)；
VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAI
YQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASL
YSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC，
其中第28位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：5)；
MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTL
AIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEAS
LYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC，
其中第29位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：6)；
MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTG
LDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH
LPWASGLETLDSLGGVLEASGY STEVVALSRLQGSLQDM LWQLDLSPGC(SEQ ID NO：7)；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQT
LAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLE
ASGYSTLVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，其中：第27位Xaa是T或A；且第28位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：8)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQ
TLAVVQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVL
EASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，
其中：第28位Xaa是T或A；且第29位Xaa是Q或缺乏的(SEQ ID NO：9)；
VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIYQ
QI LINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTE
VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：10)；
MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLH PVLTLSQMDQTLAI
YQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLY
STEVVALSRLQGSLQDM LWQLDLSPGC(SEQ ID NO：11)；
VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILS LSKMDQTLAVY
QQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLV
STEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：12)；
MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRNDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAV
YQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASL
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：13)；
ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQ
QILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYST
EVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG(SEQ ID NO：14)；
MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKT IITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDF
IPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFT
RSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG(SEQ ID NO：15)；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY
STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：16)；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVV
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY
STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：17)；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ
QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：18)；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ
QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYS
TEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：19)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：20)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH AQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：21)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY
STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：22)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY
QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY
STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：23)；
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQ
ILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHST
EVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ IDNO：24)；
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQ
ILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE
VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO25)；
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQI
LTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE
VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：26)；
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ
QILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHS
TEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：27)；
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ
QILTSLQSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHST
EVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：28)；
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ
QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHST
EVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：29)；
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
KVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTL
AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEA
SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：30)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDM LQQLDLSPGC(SEQ ID NO：31)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQIDNO：32)；其经由第78位半胱氨酸残基附接有20千道尔顿(kDa)PEG模块；
MVP IQKVQDDTKTLI KTI VTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLH PILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：33)；
GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I(SEQ ID NO：34)，其中X5，X8，X9，X11，X12，X14，X20，X23，X24和X25如本文中描述的；
GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI(SEQ ID NO：35)；
LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY_[ABM]-LAALP(SEQ ID NO：36)，其中ABM，Xa，Xb，Xc，Xd和Xe如本文中描述的；
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP(SEQ ID NO：37)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTL IGHILAALP(SEQ ID NO：38)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP(SEQ ID NO：39)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRAR T VEGVHALIDHILAALP(SEQ ID NO：40)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP(SEQ ID NO：41)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP(SEQ ID NO：42)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL TLHILAALP(SEQ ID NO：43)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP(SEQ ID NO：44)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP(SEQ ID NO：45)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP(SEQ ID NO：46)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP(SEQ ID NO：47)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAA LP(SEQ ID NO：48)；
LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQ ID NO：49)；
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：50)；
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALP(SEQ ID NO：51)；
LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP(SEQ ID NO：52)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKA KTVEGVEALKLHILAALPTGGGGASVPIQ
KVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQ
ILTSM PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTE
VVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：53)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：54)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDF
YKRLINKAK TVEGVEALKLHILAALP(SEQ ID NO：55)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVL
ANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQ ID NO：56)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILLAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNL
ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDR TQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEI
WGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC(SEQ ID NO：57)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLD
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：58)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVL
ANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQ ID NO：59)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS
GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGL
GNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：60)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS
GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGL
GNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：61)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGPIQRVQDDT
KTLIKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSR
NVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRL
KAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：62)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLD
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：63)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：64)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDS
LGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：65)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGLAEAAAKEA
AAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQ
KVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS
KSCHL PQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDM LQQLDLSPGC(SEQ ID NO：66)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGEGGEGGEG
GEGGEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT
LSKMDQ TLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLE
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：67)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKT VEGVEALKLHILAALPTGGKGGKGGK
GGKGGKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTR INDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLH PI
LTLSKMDQTLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLET
LESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：68)；
MLAEAKVLAN RELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLH ILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLES
LGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDI LQQLDLSPEC(SEQ ID NO：69)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGASV PIQK
VQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQI
LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTE
VVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：70)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVT GLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：71)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVT RINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGL HPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKEDAIKELDKYGVSDY
YKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：72)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
Y QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKED
AIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：73)；
MLAEAKEDAIKELDKYGV SUYYKN LINKAK TVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNL
ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEI
WGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC(SEQ ID NO：74)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKN LINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLD
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：75)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAV
YQQIL TSMPSRN VIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVAL SRLQGSLQDMLWQLDL SPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKED
AIKELDKYGVSDYY KNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQ ID NO：76)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKN LINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS
GMDQI LATYQQIL TSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDT IKGL
GNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：77)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITR INDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLS
GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGL
GNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：78)；
MLAEAKEDAIKEL DKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGPIQRVQDDTK
TLIKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRN
VIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLK
AAL QDML RQLDRNPGC(SEQ ID NO：79)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP TGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLD FIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLD
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：80)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTR INDISHTQSVSSKQKVTGLE FIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHV LAFSKSCH LPQASGLETLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：81)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL TLHILAALP TGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDS
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：82)；
MLAEAKEDAIKELDKNGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGLAEAAAKEA
AAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQ
KVTGLE FIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS
KSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：83)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLH ILAALP TGGEGGEGGEG
GEGGEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT
LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLE
SLGGV LEASGY STEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：84)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKN LINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGKGGKGGKG
GKGGKGGKASV PIQKVQDD T KTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPIL
TL SKMDQTL AVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLL HVL AFSKSCHL PQASGLETL
ESLGGVL EASGYS TEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：85)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLES
LGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDI LQQLDLSPEC(SEQ ID NO：86)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEAL iseILAAL PTGGGGASVPIQKV
QDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPI LTLSKMDQTLAVYQQI LT
SMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYS TEVV
ALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：87)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDD T KTLIK TIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPG LHPILTLS
KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL
GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：88)；
MVPIQKVQDDTK TLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQ TLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSAS LAEAKEDA IKELDKYGVSDY
YKNLINKAKTVEGVEALiseILAALP(SEQ ID NO：89)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPG LH PILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKED
AIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALP(SEQ ID NO：90)；
MLAEAKEDAIKEL DKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASISIEKIQADTKTLTK TII TRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLA
DMDQTLAVYQQI LSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEI
WGGIVEESLYS TEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC(SEQ ID NO：91)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDY YKNLINKAKT VEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS
KMDQT LAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDS
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：92)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDL ENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETL DSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKED
AIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALP(SEQ ID NO：93)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseIL AALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLD FIPRVQSVRTLSG
MDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLG
NVL RASVHSTEVVAL SRL KAAL QDMLRQLDRNPGC(SEQ ID NO：94)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSG
MDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLG
NVLRASVH ST EVVALSRLKAALQDM LRQLDRNPGC(SEQ ID NO：95)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTG PIQRVQDDTKT
LIKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLD FI PRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVI
QISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKA
ALQDMLRQ LDRNPGC(SEQ ID NO：96)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDIS HTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS
KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDS
LGGVLEASGYS TEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：97)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKN LINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDDTKTL IKTIVTRINDISHTQSVSSKQKV TGLEFIPGLHPILTLS
KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL
GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：98)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDDTKTL IKTIV TRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS
KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSL
GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：99)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDY YKN LINKAKTVEGVEALiseILAALPTGLAEAAAKEAA
AKEAAAKEAAAKEAAAKAAAASV PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQK
VTGLEFIPGLH PILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSK
SCHL PQASGL ETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQL DLSPGC(SEQ ID NO：100)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDY Y KNLINKAK T VEGVEALiseILAALP TGGEGGEGGEGG
EGGEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：101)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGKGGKGGKGG
KGGKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT
L SKMDQ TLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLE
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDM LQQLDLSPGC(SEQ ID NO：102)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDD TKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGL HPILT LS
KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESL
GEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：103)；
MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTR INDISHTQSVSSKQKVTGLE FIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLE TLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：104)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH TQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT LS
KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL
GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：105)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLES
LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：106)；
MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALPTGGGGSGGGSGG
GSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPG LHPILTLS
KMDQT LAVYQQ ILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESL
GGVLEASGY STEVVALSRLQGSLQDM LQQLDLSPGC(SEQ ID NO：107)；
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID NO：108)；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAIL SSTNVGSNTY(SEQ ID NO：109)；
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPI LPPTNVGSNTY(SEQ ID NO：110).
CGNLSTCMLG TYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQ ID NO：111)；
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(SEQ ID NO：112)；
KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(SEQ ID NO：113).
GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI(SEQ ID NO：114)；
GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI(SEQ ID NO：115)；
GGGG(SEQ ID NO：116)；
GGGGG(SEQ IDNO：117)；
GGGKGGGG(SEQ ID NO：118)；
GGGNGSGG(SEQ IDNO：119)；
GGGCGGGG(SEQ IDNO：120)；
GPNGG(SEQ ID NO：121)；
[GS]n(SEQ ID NO：122)，其中n为1-10；
[GGS]n(SEQ ID NO：123)，其中n为1-10；
[GGGS]n(SEQ ID NO：124)，其中n为1-10；
[GGGGS]n(SEQ ID NO：125)，其中n为1-10；
[GE]n(SEQ ID NO：126)，其中n为1-10；
[GGE]n(SEQ ID NO：127)，其中n为1-1O；
[GGGE]n(SEQ ID NO：128)，其中n为1-10；
[GGGGE]n(SEQ ID NO：129)，其中n为1-10；
[GD]n(SEQ ID NO：130)，其中n为1-10；
[GGD]n(SEQ ID NO：131)，其中n为1-10；
[GGGD]n(SEQ ID NO：132)，其中n为1-10；
[GGGGD]n(SEQ ID NO：133)，其中n为1-10；
[GK]n(SEQ ID NO：134)，其中n为1-10；
[GGK]n(SEQ ID NO：135)，其中n为1-10；
[GGGK]n(SEQ ID NO：136)，其中n为1-10；
[GGGGK]n(SEQ ID NO：137)，其中n为1-10；
[GR]n(SEQ ID NO：138)，其中n为1-10；
[GGR]n(SEQ ID NO：139)，其中n为1-10；
[GGGR]n(SEQ ID NO：140)，其中n为1-10；
[GGGGR]n(SEQ ID NO：141)，其中n为1-10；
[GAAAK]n(SEQ ID NO：142)，其中n为1-10；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ IDNO：143)；
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ IDNO：144)；
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAV
YQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSC SLPQTSGLQKPESLDGVLEASL
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：145)；and
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH TSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY
QQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLY
STEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：146).
MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSG
GGSGGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL
SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLD
SLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC(SEQ ID NO：147).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGY
ST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：664).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：665).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEASG
YSTEVVAL SRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：666).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：667).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：668).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLEN LRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：669).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：670).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGY
STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC(SEQ ID NO：671).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC(SEQ ID NO：672).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQIL TSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVAL SRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：673).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：674).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEASGY
STEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC(SEQ ID NO：675).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQI LTSMPSRNVIQISNDLENLRD LLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC(SEQ ID NO：676).
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV
YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASG
YSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC(SEQ ID NO：677).
X’-Xaa1-Cys2-Asn3-Thr4-Ala5-Thr6-Cys7-Ala8-Thr9-Gln10-Arg11-Leu12-Ala13-Asn14-Phe15-Leu16-Val17-His18-Scr19-Ser20-Xaa21-Asn22-Phe23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Thr30-Xaa31-Val32-Gly33-Ser34-Asn35-Thr36-Tyr37-X(SEQ ID NO：800)
CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：801)
KCNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPP TNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：802)
CNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：803)
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：804)
CNTATCATQR LANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTV-NH2(SEQ ID NO：805)
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：806)
CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：807)
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：808)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：809)
CNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：810)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPKLPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：811)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTKVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：812)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFKPILPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：813)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：814)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPIKPPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：815)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILKPTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：816)
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY-NH2(SEQ ID NO：817)

Claims (112)

1.一种工程化多肽，其由如下组成：
(a)SEQ ID NO:49的清蛋白结合域多肽(ABD)；
(b)选自以下的肽激素域(HD1)：
(i)瘦蛋白，
(ii)具有选自下组的氨基酸序列的瘦蛋白类似物：SEQ ID No:20、SEQ ID No:25、SEQID No:26、SEQ ID No:28、和SEQ ID No:33；或
(iii)其活性片段；
其中所述HD1域任选地省去N端甲硫氨酸；和
(c)任选的一个或多个接头；
其中所述工程化多肽任选地含有N端甲硫氨酸。
2.依照权利要求1的工程化多肽，其中第一接头(L1)与所述HD1共价连接。
3.依照权利要求1或2的工程化多肽，其中所述ABD为N端模块和所述HD1为C端模块。
4.依照权利要求1或2的工程化多肽，其中所述ABD为C端模块和所述HD1为N端模块。
5.依照权利要求3的工程化多肽，其由结构：ABD-HD1组成。
6.依照权利要求3的工程化多肽，其由结构：ABD-L1-HD1组成。
7.依照权利要求4的工程化多肽，其由结构：HD1-ABD组成。
8.依照权利要求4的工程化多肽，其由结构：HD1-L1-ABD组成。
9.依照权利要求1至8中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与选自下组的氨基酸序列具有至少90％同一性：SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:26,和SEQ ID NO:33。
10.依照权利要求1至9中任一项的工程化多肽，其中所述HD1与人瘦蛋白具有至少90％同一性。
11.依照权利要求1至10中任一项的工程化多肽，其中所述HD1由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,和SEQ ID NO:33。
12.依照权利要求1至11中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO:14。
13.依照权利要求1至11中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO:16。
14.依照权利要求1至11中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO:25。
15.依照权利要求1至11中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO:26。
16.依照权利要求1至11中任一项的工程化多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO:33。
17.依照权利要求1至16中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1是1至30个氨基酸或小于30个氨基酸的肽。
18.依照权利要求1至17中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1选自20种天然存在的氨基酸。
19.依照权利要求1至18中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1是非天然的氨基酸，其通过化学合成、翻译后化学修饰或通过宿主细胞中的重组表达通过体内掺入来掺入。
20.依照权利要求1至19中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1氨基酸选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸。
21.依照权利要求1至20中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含的大多数氨基酸是无空间位阻的。
22.依照权利要求1至21中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包括下列一种或多种：酸性接头、碱性接头、和结构基序。
23.依照权利要求1至22中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)、或聚(Gly-Ser)。
24.依照权利要求1至23中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含(Gly)3、(Gly)4(SEQ ID NO:116)、或(Gly)5(SEQ ID NO:117)的聚甘氨酸。
25.依照权利要求1至24中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:118)；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:119)；(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ IDNO:120)；和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO:121)。
26.依照权利要求1至25中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ala的组合。
27.依照权利要求1至26中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ser的组合。
28.依照权利要求1至27中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Glu的组合。
29.依照权利要求1至28中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含Gly和Lys的组合。
30.依照权利要求1至29中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:122),[Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:123),[Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:124)和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:125)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10。
31.依照权利要求1至30中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:126)；[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:127)；[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:128)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:129),[Gly-Asp]n(SEQ ID NO:130)；[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:131)；[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:132)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:133)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
32.依照权利要求1至31中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Glu]n(SEQ ID NO:126)；[Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:127)；[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:128)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO:129),[Gly-Asp]n(SEQ ID NO:130)；[Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:131)；[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:132)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQ ID NO:133)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
33.依照权利要求1至32中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Lys]n(SEQ ID NO:134)；[Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:135)；[Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:136)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQ ID NO:137),[Gly-Arg]n(SEQ ID NO:138)；[Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:139)；[Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:140)；[Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQ ID NO:141)；其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
34.依照权利要求1至33中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n(SEQ ID NO:142)，其中n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。
35.依照权利要求1至34中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的序列：[Gly-Gly-Glu]6(SEQ ID NO:153)[Gly-Gly-Lys]6(SEQ ID NO:154),[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3(SEQ ID NO:155),[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4(SEQ ID NO:156),或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5(SEQ ID NO:157)。
36.依照权利要求1至35中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含N端TG二肽。
37.依照权利要求1至36中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含C端AS二肽。
38.依照权利要求1至37中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含N端TG二肽和C端AS二肽。
39.依照权利要求1至38中任一项的工程化多肽，其中所述接头L1包含选自下组的氨基酸序列：TG-(GGGS)1(SEQ ID NO:215),TG-(GGGS)2(SEQ ID NO:216),TG-(GGGS)3(SEQ IDNO:217),TG-(GGGS)4(SEQ ID NO:218),TG-(GGGS)5(SEQ ID NO:219),(GGGS)1-AS(SEQ IDNO:220),(GGGS)2-AS(SEQ ID NO:221),(GGGS)3-AS(SEQ ID NO:222),(GGGS)4-AS(SEQ IDNO:223),(GGGS)5-AS(SEQ ID NO:224),TG-(GGGS)1-AS(SEQ ID NO:225),TG-(GGGS)2-AS(SEQ ID NO:226),TG-(GGGS)3-AS(SEQ ID NO:227),TG-(GGGS)4-AS(SEQ ID NO:228),和TG-(GGGS)5-AS(SEQ ID NO:229)。
40.依照权利要求38至39中任一项的工程化多肽，其中所述TG二肽和/或所述AS二肽是缺乏的或用一对选自T,A,S,和G的氨基酸替换。
41.依照权利要求1至40中任一项的工程化多肽，其中所述多肽进一步包含一个或多个额外的接头。
42.依照权利要求1的工程化多肽，其中所述工程化多肽由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ IDNO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,和SEQID NO:69。
43.由氨基酸序列SEQ ID NO:53组成的工程化多肽。
44.由氨基酸序列SEQ ID NO:54组成的工程化多肽。
45.由氨基酸序列SEQ ID NO:55组成的工程化多肽。
46.由氨基酸序列SEQ ID NO:56组成的工程化多肽。
47.由氨基酸序列SEQ ID NO:57组成的工程化多肽。
48.由氨基酸序列SEQ ID NO:58组成的工程化多肽。
49.由氨基酸序列SEQ ID NO:59组成的工程化多肽。
50.由氨基酸序列SEQ ID NO:60组成的工程化多肽。
51.由氨基酸序列SEQ ID NO:61组成的工程化多肽。
52.由氨基酸序列SEQ ID NO:62组成的工程化多肽。
53.由氨基酸序列SEQ ID NO:65组成的工程化多肽。
54.由氨基酸序列SEQ ID NO:66组成的工程化多肽。
55.由氨基酸序列SEQ ID NO:67组成的工程化多肽。
56.由氨基酸序列SEQ ID NO:68组成的工程化多肽。
57.由氨基酸序列SEQ ID NO:69组成的工程化多肽。
58.依照权利要求1至57中任一项的工程化多肽，其对血清清蛋白具有解离常数小于10-6mol/L的亲和力。
59.依照权利要求1至58中任一项的工程化多肽，其对血清清蛋白具有解离常数小于10-9mol/L的亲和力。
60.依照权利要求1至59中任一项的工程化多肽，其对血清清蛋白具有解离常数小于10-12mol/L的亲和力。
61.依照权利要求1至60中任一项的工程化多肽，其中所述多肽具有至少1天的作用持续时间。
62.依照权利要求1至61中任一项的工程化多肽，其中所述多肽具有至少3天的作用持续时间。
63.依照权利要求1至62中任一项的工程化多肽，其中所述多肽具有至少5天的作用持续时间。
64.依照权利要求1至63中任一项的工程化多肽，其中所述多肽在人受试者中具有至少5天的作用持续时间。
65.权利要求1至64中任一项的工程化多肽在制备用于治疗受试者中的脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的药物中的用途，所述治疗包括以有效治疗所述脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的量对有此需要的受试者施用依照权利要求1至64中任一项的工程化多肽。
66.依照权利要求65的用途，其中所述疾病或病症为脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病或糖尿病。
67.依照权利要求65至66中任一项的用途，其中所述疾病或病症是I型糖尿病或II型糖尿病。
68.依照权利要求65至66中任一项的用途，其中所述疾病或病症是肥胖症。
69.依照权利要求65至66中任一项的用途，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良或瘦蛋白缺陷。
70.一种药物组合物，其包含依照权利要求1至64中任一项的工程化多肽和药学可接受赋形剂。
71.依照权利要求70的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射的药物组合物。
72.依照权利要求70至71中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是持续释放的或长效的药物组合物。
73.依照权利要求70至72中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是每日一次的药物组合物。
74.依照权利要求70至72中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是每周一次的药物组合物。
75.权利要求70至74中任一项的药物组合物，其用于治疗受试者中的疾病或病症。
76.依照权利要求70至75中任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
77.权利要求75或权利要求76的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良、血脂障碍、高脂血、超重、肥胖症、下丘脑性闭经、瘦蛋白缺陷、脂肪肝病或糖尿病。
78.依照权利要求75至77中任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症是I型糖尿病或II型糖尿病。
79.依照权利要求75至77中任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症是肥胖症。
80.依照权利要求75至77中任一项的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂肪营养不良或瘦蛋白缺陷。
81.至少两种不同抗肥胖剂在制备用于治疗受试者中肥胖症的药物中的用途，所述治疗包括外周施用治疗有效量的至少两种不同抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是选自下组的胰淀素剂：胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂、和胰淀素衍生物，且至少一种抗肥胖剂是依照权利要求1至64中任一项的工程化多肽。
82.至少两种不同抗肥胖剂在制备用于降低受试者体重的药物中的用途，所述降低包括外周施用治疗有效量的至少两种不同抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是选自下组的胰淀素剂：胰淀素、胰淀素类似物、胰淀素激动剂、和胰淀素衍生物，且至少一种抗肥胖剂是依照权利要求1至64中任一项的工程化多肽。
83.依照权利要求81或82中任一项的用途，其中所述至少一种抗肥胖胰淀素剂是胰淀素激动剂。
84.依照权利要求81至83中任一项的用途，其中所述胰淀素激动剂包含胰淀素类似物或衍生物。
85.依照权利要求81至84中任一项的用途，其中所述胰淀素类似物或衍生物包含普兰林肽(pramlintide)。
86.依照权利要求81至85中任一项的用途，其中所述胰淀素类似物或衍生物包含表4中公开的化合物。
87.依照权利要求81至86中任一项的用途，其中所述胰淀素类似物或衍生物包含脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-普兰林肽(SEQ ID NO:214)。
88.依照权利要求81至87中任一项的用途，其中所述HD1为选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:33。
89.依照权利要求81至88中任一项的用途，其中所述工程化多肽为选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ IDNO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ IDNO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69。
90.依照权利要求81至89中任一项的用途，其中所述工程化多肽为SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
91.依照权利要求81至90中任一项的用途，其中所述工程化多肽为SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
92.依照权利要求81至91中任一项的用途，其中所述胰淀素剂的有效量和所述工程化多肽的有效量包含一定的量，使得在对所述受试者与所述工程化多肽联合施用所述胰淀素剂时比在单独施用任一种药剂时实现的体重减轻量实现更大的体重减轻量。
93.依照权利要求81至92中任一项的用途，其中同时施用所述两种药剂。
94.依照权利要求81至93中任一项的用途，其中将所述两种药剂混合在一起。
95.依照权利要求81至94中任一项的用途，其中所述受试者的BMI大于25。
96.依照权利要求81至95中任一项的用途，其中所述受试者的BMI为25至35。
97.依照权利要求81至96中任一项的用途，其中所述受试者的BMI为25至40。
98.依照权利要求81至97中任一项的用途，其中所述受试者的BMI为25至45。
99.依照权利要求81至98中任一项的用途，其中所述受试者的BMI为35至45。
100.依照权利要求81至99中任一项的用途，其中所述受试者的BMI降低至小于30。
101.依照权利要求81至100中任一项的用途，其中所述受试者的BMI降低至小于25。
102.依照权利要求81至101中任一项的用途，其中所述受试者的BMI降低至正常。
103.依照权利要求81至102中任一项的用途，其中在治疗4周内实现体重减轻。
104.依照权利要求81至103中任一项的用途，其中在治疗8周内实现体重减轻。
105.依照权利要求81至104中任一项的用途，其中在治疗12周内实现体重减轻。
106.依照权利要求81至105中任一项的用途，其中在治疗20周内实现体重减轻。
107.依照权利要求81至106中任一项的用途，其中在治疗24周内实现体重减轻。
108.依照权利要求81至107中任一项的用途，其中所述受试者是人。
109.依照权利要求81至108中任一项的用途，其中所述受试者是肥胖的人。
110.依照权利要求81至109中任一项的用途，其中所述重量减轻降低至少10％。
111.依照权利要求81至110中任一项的用途，其中所述重量减轻降低至少12％。
112.依照权利要求81至111中任一项的用途，其中所述重量减轻降低至少15％。
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