KR20010029537A - 제ⅱ형 당뇨병에서의 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도 - Google Patents

제ⅱ형 당뇨병에서의 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20010029537A
KR20010029537A KR1019997002389A KR19997002389A KR20010029537A KR 20010029537 A KR20010029537 A KR 20010029537A KR 1019997002389 A KR1019997002389 A KR 1019997002389A KR 19997002389 A KR19997002389 A KR 19997002389A KR 20010029537 A KR20010029537 A KR 20010029537A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leptin
amino acid
antagonist
pharmaceutical composition
insulin
Prior art date
Application number
KR1019997002389A
Other languages
English (en)
Inventor
에르틀요한
프라이비슈게랄트
뮐러귄터
Original Assignee
훽스트 악티엔게젤샤프트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 훽스트 악티엔게젤샤프트 filed Critical 훽스트 악티엔게젤샤프트
Publication of KR20010029537A publication Critical patent/KR20010029537A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

본 발명은 제II형 당뇨병을 치료하기 위한 렙틴 길항제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 하나의 렙틴 길항제는 쥐의 렙틴 단편을 기초로한 것이고 116 내지 167 또는 116 내지 166번의 아미노산을 포함한다. 제II형 당뇨병을 치료하기 위한 방법이 또한 기술되어 있다.

Description

제Ⅱ형 당뇨병에서의 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도{Use of leptin antagonists for treating insulin resistance in type II diabetes}
＜110＞ Hoechst Aktiengesellschaft
＜120＞ Use of leptin antagonists for treating insulin resistance in type II diabetes
＜130＞ 5-1998-084411-7
＜150＞ PCT/DE 19638487.7
＜151＞ 1996-09-20
＜160＞ 6
＜170＞ KOPATIN 1.0
＜210＞ 1
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ E. coli
＜220＞
＜221＞ exon
＜222＞ (1)..(20)
＜223＞ single, linear
＜400＞ 1
gaatgcagaa taaataaata 20
＜210＞ 2
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ E. coli
＜220＞
＜221＞ exon
＜222＞ (1)..(34)
＜223＞ single, linear
＜400＞ 2
gaaagaagga tccagtgcct atccagaaag tcca 34
＜210＞ 3
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ E. coli
＜220＞
＜221＞ exon
＜222＞ (1)..(34)
＜223＞ single, linear
＜400＞ 3
ggagagaagc ttgagggaga gaaatgaatg atgg 34
＜210＞ 4
＜211＞ 167
＜212＞ PRT
＜213＞ E. coli
＜220＞
＜221＞ PEPTIDE
＜222＞ (1)..(167)
＜223＞ single, linear
＜400＞ 4
Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
35 40 45
Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60
Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln
85 90 95
Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala
100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu
115 120 125
Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val
130 135 140
Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln
145 150 155 160
Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys
165
＜210＞ 5
＜211＞ 167
＜212＞ PRT
＜213＞ E. coli
＜220＞
＜221＞ PEPTIDE
＜222＞ (1)..(167)
＜223＞ single, linear
＜400＞ 5
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys
20 25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr
35 40 45
Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro
50 55 60
Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln
85 90 95
Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala
100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro
115 120 125
Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val
130 135 140
Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln
145 150 155 160
Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys
165
＜210＞ 6
＜211＞ 52
＜212＞ PRT
＜213＞ E. coli
＜220＞
＜221＞ PEPTIDE
＜222＞ (1)..(52)
＜223＞ single, linear
＜400＞ 6
Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu
1 5 10 15
Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val
35 40 45
Ser Pro Glu Cys
50
본 발명은 제II형 당뇨병에서 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도 및 상기 내성을 치료하기 위한 약제에 관한 것이다.
당뇨병은 산업화된 국가에서 가장 흔히 발생하는 대사 질환중 하나이다. 전세계적으로 1억 천만의 당뇨병 환자가 있으며 이중 약 천만이 제I형 당뇨병 환자이며, 대다수의 환자(약 1억)는 제II형 당뇨병 환자이다. 상기 질환은 글루코스 대사의 불완전한 조절이 원인이된다. 제I형 당뇨병에서 췌장의 β세포가 더이상 인슐린을 생산하지 못하게된다. 인슐린의 결핍은 혈액중 글루코스를 증가시키며 인슐린을 공급하여 치료하지 않으면 키토아시도시스, 당뇨성 혼수상태 및 사망하게 된다. 제II형 당뇨병에서 인과관계는 상이하며 인슐린 내성의 초기 발생, 예를 들어, 세포가 인슐린에 적절히 반응하는 능력의 감소로써 특징화된다. 특히, 과체중 및 운동 부족이 인슐린 내성을 유발시킬 수 있는 원인으로서 간주된다. 후자의 경우는 증가된 인슐린 분비에 의해 벌충되기 때문에 초기에 인식되지 않는다. 그러나 계속적인 인슐린 내성이 수년동안 지속되면 내생 보강 기작이 손상되고 이로써 제II형 당뇨병이 발병하게 된다. 식이요법 및 운동이 이러한 일련의 과정을 지연시킬 수 있지만 이들은 흔히 질환의 진행을 예방할 수 없게된다. 혈중 글루코스를 적당히 조절하기 위해서는 의학적 치료가 요구된다.
혈중 글루코스를 가능한한 생리학적 범위로 협소하게 유지시키기 위해서는 장기간의 치료가 중요하다. 현재 관점으로서는 불량하게 조절된 당뇨병(제I형 및 제II형 당뇨병)에서 나타나는 바와 같이 수십년동안 증가된 글루코스 농도가 당뇨병의 후기 합병증을 유발하게된다는 것이다. 이들 후기 합병증은 특히 신장 질환을 유발하는 혈관 손상, 실명 및 심혈관 질환이다. 소위 후기 손상이라고 불리우는 합병증은 당뇨병에서 치명적인 중요한 요소이다.
1994년에, 지방 세포에서 형성되고 유전적으로 과체중의 마우스(ob/ob 마우스)에서는 결핍된 신규한 호르몬인 렙틴이 문헌[참조: Zhang, Y., Proenca, R., Maffei, M, Barone, M., Leopold, L., and Friedman, J.M.(1994). Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432.]에 기술되어 있다. 사람 렙틴과 쥐의 렙틴은 상당히 동일하다. ob/ob 마우스에 재조합적으로 제조된 렙틴을 주사하는 경우 음식물 섭취 및 체중이 감소하게 된다[참조문헌: Pelleymounter, M.A., Cullen, M.J., Baker, M.B., Hecht, R, Winters, D., Boone, T., and Collins, F.(1995). Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science 269, 540-543]. 지금까지는 ob 유전자내의 돌연변이가 사람에게서 흔히 비만을 초래할 수 있다는 어떠한 지적도 없었다(미국에서 인구의 약 30가 과체중이다). 렙틴의 혈청 농도가 비만인 다양한 동물모델에서 나타나는 것처럼 비만인 사람에서 증가했다는 것을 전신성 연구를 통해 입증하였다[문헌참조: Dagogo-Jack, S., Fanelli, C., Paramore, D., Brothers, J., and Landt, M., (1996). Plasma leptin and insulin relationships in obese and nonobese humans. Diabetes 45, 695-698; Considine, R.V., Sinha, M.K., Heiman, M.L., Kriauciunas, A., Stephens, T.W., Nyce, M.R., Ohannesian, J.P., Marco, C.C., McKee, L.J., Bauer, T.L., and Caro, J.F.(1996). Serum immunoreactive leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N. Engl. J. Med. 334, 292-295.)]. 이러한 이유때문에 렙틴이 지방 조직에 저장된 에너지 양을 뇌에 알리는 피드백 신호인 것으로 추측된다. 이러한 추측에 따르면 뇌가 식욕을 감퇴시킴으로써 음식물 섭취를 저하시키고 한편으로는 또 다른 것에 대한 기본적인 대사를 자극시키는 기능을 한다는 것이다. 비만인 사람에서는 이러한 조절 회로가 차단되는 것으로 밝혀졌다.
이뿐만 아니라 또한 렙틴이 뇌외부 조직에 직접적으로 작용하는 것으로 추측된다.
지금까지 분리된 세포에 대한 렙틴의 직접적인 효과에 관한 3개의 연구가 공지되었다.
크로더등은 문헌[참조: Kroder, G., Kellerer, M., and Haring, H.(1996) Exp. Crin. Endocrin. Diabetes 104 Suppl. 2, 66(Abstract)]에서 렙틴이 인슐린 내성 및 비만과의 관계를 확립하는 것으로 추측하였고 렙틴이 사람 인슐린 수용체를 과발현하는 랫트 1 섬유아세포내 인슐린 수용체 및 인슐린 수용체 기질 1(IRS-1)의 인슐린 유도 인산화를 저하시키는 것으로 보고하고 있다. 또한 렙틴이 인슐린의 최종 효과, 예를 들어, 글루코스 수송 또는 글리코겐 신타제의 자극에 대해 영향을 미치는 정도는 조사되거나 논의되지 않았다.
지질합성 호르몬(덱사메타손 및 인슐린)에 대한 민감성은 렙틴을 과발현하는 형질전환된 30A5 전지방세포에서 저하된다는 것이 입증되었다[참조문헌: Bai, Y. L., Zhang, S. Y., Kim, K. S., Lee, J. K., and Kim, K. H.(1996) J. Biol. Chem. 271, 13939-13942]. 지방산 합성 및 중성 지질의 합성은 심지어 자극되지 않은 상태에서 렙틴 과발현에 의해 감소된다. 세포가 덱사메타손 또는 인슐린 또는 배합된 2개의 호르몬으로 처리된 후에 조절 세포의 지질 합성 비율이 현저히 증가하는 것으로 나타나지만 렙틴을 과발현하는 세포는 이들 상황하에서 거의 자극되지 않는다. 이뿐만아니라, 또한 세포를 배합된 덱사메타손 및 인슐린으로 처리한 후에 발생하는 글리세로포스페이트 데하이드로게나제 활성 및 아세틸 CoA 카복실라제 발현의 억제를 연구하였다. 이것은 렙틴 발현 세포를 자극시킬 수 없는 것으로 밝혀졌다. 관찰된 효과는 렙틴이 일반적인 방법으로 지질 대사를 억제한다는 것을 지적한다. 비만과 인슐린 내성과의 어떠한 가능한 관계에 대해서는 언급하지 않았다.
또 다른 모델 시스템, 예를 들어, C2-C12마우스 관상근 세포에서, 렙틴이 인슐린과 유사한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Berti, L., Kellerer, M., and Haring, H.(1996) Diabetologia 39 Suppl. 1, A59(Abstract)]. 이러한 연구는 글루코스 수송 및 글리코겐 합성 모두가 렙틴에 의해 자극된다는 것을 보고하고 있다. 이들 발견은 다른 연구가에 의해 보고된 것과 본원에 제시된 결과와 일치하지 않는다. 이들은 능히 상기 세포 유형에 대해 특이적인 효과를 포함한다.
지방 조직에 대한 모델 시스템인 분리된 랫트 지방세포에 대한 렙틴의 효과에 관한 본 연구에서 놀랍게도 지질합성, 글루코스 수송 및 글리코겐 합성의 자극과 같은 지방 세포의 중요한 대사 경로에 대한 인슐린 민감성은 급격히 저하되는(실시예 4)반면에 기본값은 영향받지 않는다고 밝혀졌다. 이것은 이소프로테레놀-자극된 지질 분해의 억제에 동일하게 적용된다. 분리된 랫트 지방 세포에서의 글루코스 수송은 인슐린(10nM)을 첨가함으로써 약 14배로 자극된다. 이러한 자극 능력은 15시간동안 상이한 농도에서 렙틴과 전배양시킴으로써 용량-의존형 방식으로 저하된다. 렙틴은 세포를 탈감작시키고 예를 들어, 인슐린 내성이 발생한다. 상이한 렙틴 농도(실시예 5)에서 인슐린에 대한 용량/효과 곡선은 인슐린(0.1 - 0.2 nM) 및 렙틴(0.5 - 1nM) 모두를 고려하는 경우 시험관내에서 이미 검출될 수 있는 농도가 생리학적 범위내에 포함됨을 입증한다(Dagogo-Jack et al., 1996; Considine et al., 1996). 보다 높은 렙틴 농도(2 내지 4nM)(Dagogo-Jack et al., 1996; Considine et al., 1996)는 비만인 사람에게서 나타남으로써 인슐린 효과가 이들 대상에서 보다 강하게 손상되었음이 가능하다. 따라서 결론은 비만인 대상에서 알수 있는 바와 같이 만성적으로 상승된 렙틴이 인슐린 내성을 유발한다는 것을 제안한다. 이미 상기에서 설명한 바와 같이 인슐린 내성은 제II형 당뇨병의 병리학에서 중요한 요소이다.
따라서 본 발명의 목적은 약제학적 조성물중에 제형화될 수 있는 신규한 렙틴 길항제를 제공하는 것이다. 또 다른 본 발명의 목적은 제II형 당뇨병 및 또 다른 인슐린 관련 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
결과적으로 본 발명은 제II형 당뇨병에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 렙틴 길항제, 특히, 렙틴 그 자체로부터 유도된 렙틴 길항제의 용도에 관한 것이다. 이러한 용도에 사용되는 렙틴 길항제는 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
발명의 요약
본 발명의 첫번째 목적에 따라 렙틴의 길항제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 동일한 목적에 따라 렙틴으로부터 유도된 렙틴 길항제를 포함하는 약제학적 조성물이 기술된다. 추가로 상기 목적에 따라 가용성 렙틴 수용체인 렙틴 길항제 또는 이의 유도체를 포함하는 약제학적 조성물이 밝혀진다.
본 발명의 두번째 목적에 따라, 제II형 당뇨병을 치료하기 위해 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 제공된다. 또한 상기 목적에 따라 인슐린의 생리학적 효과를 재생시키거나 증폭시키는 방법이 제공된다.
표의 간단한 설명
표 1: 랫트 지방세포에서 렙틴에 의한 인슐린 유도된 글루코스 수송의 억제. 실험은 실시예 8에서 상세히 기술된다.
표 2: 렙틴 농도의 함수로서 랫트 지방세포에 의한 2-데옥시글루코스의 흡수. 실험은 실시예 9에서 상세히 기술된다.
표 3: 랫트 지방세포에서 인슐린 유도된 글루코스 수송에 대한 렙틴 단편 116-167에 의한 렙틴 효과의 길항작용. 실험은 실시예 10에서 상세히 기술된다.
표 4: 사람 렙틴의 아미노산 서열. 2개의 시스테인이 디설피드 브릿지에 의해 연결된다.
표 5: 쥐 렙틴의 아미노산 서열. 2개의 시스테인이 디설피드 브릿지에 의해 연결된다.
표 6: 쥐 렙틴의 단편 116-167의 아미노산 서열. 2개의 시스테인이 디설피드 브릿지에 의해 연결된다.
본 발명은 렙틴의 효과를 억제함으로써 인슐린 내성을 저하시키거나 또는 완전히 제거하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 목적을 위해 렙틴 길항제로서 작용하고 시험관내의 분리된 지방 세포에서 렙틴 유도된 인슐린 내성을 제거할 수 있는 펩타이드를 사용할 수 있다. 이들 펩타이드는 결과적으로 인슐린 내성의 치료, 바람직하게는 비만 환자에서의 인슐린 내성 치료에 적합하다.
렙틴 길항제
본 발명에 따른 렙틴 길항제는 특히 펩타이드 길항제를 포함한다. 상기 펩타이드는 렙틴 단편으로부터 유래되고 예를 들어, 화학적 또는 효소적으로(예: 라이실 엔도펩티다제, 트립신, 엔도-Arg C 또는 시아노겐 브로마이드) 절단된 완전한 렙틴에 의해 수득될 수 있거나 미생물에서 융합 단백질로서 직접적으로 발현됨으로써 제조된다. 미생물에서 펩타이드 제조와 관련하여 발현될 단편을 선별하는 경우 중성 절단 부위의 존재 유무에 의존하지 않는다. 사람 및 동물 렙틴, 예를 들어, 랫트, 마우스, 피그 또는 유인원 렙틴으로부터 유도된 펩타이드가 적합하다.
하나의 적합한 예시적인 펩타이드는 문헌[참조: Zhang et al.,(1994)]에 공고된 서열에 따른 아미노산 116 내지 아미노산 167 또는 아미노산 116 내지 아미노산 166(표 6, 서열 4)(실시예 3 및 6)까지 연장된다. 실시예 6에서 지방 세포를 10nM 렙틴 및 상이한 농도의 116-167 길항성 렙틴 단편의 존재하에 약 15시간동안 배양한다. 이어서 세포를 5nM 인슐린으로 자극시킨다. 상기 실험에서, 길항제의 증가량은 인슐린에 의해 자극될 수 있는 능력을 복구시키고 고농도의 렙틴 길항제의 존재하에 어떠한 내성이 나타나지 않는 다는 것이 밝혀졌다. 따라서 이들 및 유사한 검정을 사용하여 당해 기술분야의 기술자가 본 발명에 따라 유용한 임의의 렙틴 길항제의 길항성을 확인할 수 있다.
이뿐만 아니라, 또한 길항 작용성 렙틴 단편의 동족체가 사용될 수 있고 이때 하나 이상의 아미노산이 치환되거나 결실된다. 바람직한 치환은 보존적인 아미산 치환이다. 상기 보존적인 치환은 전하-전하, 극성-극성 및 소수성-소수성 아미노산 치환이다. 예를 들어, 하나 이상의 아스파르테이트 잔기가 글루타메이트 잔기로 치환될 수 있거나/있고 이와 반대인 경우일 수 있고/있거나 하나 이상의 류신 잔기가 이소류신 잔기로 치환될 수 있고/있거나 이와 반대일 수 있다. 입체적 및 구조적인 것을 고려하여, 예를 들어, 아미노산 크기 및 나선형을 형성하거나 파괴하는 경향의 아미노산을 토대로 치환시키거나 결실시킬 수 있다.
분자 생물학 및 생물공학적 방법을 사용하여 특이적인 방법으로 상기 펩타이드의 길항 성질을 최적화하고 변형시킬 수 있다. 이뿐만 아니라, 펩타이드를 화학적으로 변형시켜 예를 들어, 아세틸화, 카바모일화, 포르밀화, 비오티닐화, 아실화 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 친수성 중합체를 사용한 유도화에 의해 이의 안정성을 증가시키거나 혈장 반감기 및 약동력학을 조절할 수 있다.
렙틴, 특히 렙틴 결합 도메인에 대한 항체는 또한 상기 목적에 대한 렙틴 길항제로서 적합하다. 이뿐만 아니라, 가용성 렙틴 수용체 및/또는 렙틴 수용체 단편 및 또 다른 단백질(예: IgG Fc 영역)과의 이의 융합체가 적합하다. 펩타이드 길항제와 동일하게 단백질인 임의의 렙틴 길항제는 분자 생물학적 방법으로 변형될 수 있다. 유사하게, 이들 길항제는 미생물내에서 직접적으로 또는 융합 단백질로서 발현시키거나 다양한 표준 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다.
약제학적 조성물
추가로 본 발명은 본 특허 출원서에 기술된 렙틴 길항제를 포함하는 약제에 관한 것이다.
약제는 예를 들어, 경구적으로 투여될 수 있는 약제학적 제제, 예를 들어, 정제, 제피된 정제, 경질 또는 연질 겔라틴 캅셀제, 용제, 유제 또는 좌제의 형태로 사용될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 좌제의 형태로 직장으로 투여될 수 있거나 비경구적으로 주사 용제의 형태로 투여될 수 있다. 약제는 또한 비강, 구강 또는 폐의 점막을 경유하여 투여될 수 있다. 약제학적 제제를 제조하기 위해 이들 화합물은 치료학적으로 불활성인 유기 및 무기 부형제와 혼합될 수 있다. 정제, 제피된 정제 및 경질 겔라틴 캅셀제용 부형제의 예로서 락토즈, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 탈크 및 스테아르산 또는 이의 염이 있다. 물, 폴리올, 슈크로즈, 전화당 및 글루코스가 용제를 제조하기 위해 적합한 부형제이다. 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤 및 식물성 오일이 주사 용제를 위해 적합한 부형제이다. 식물성 및 경화된 오일, 왁스, 지방 및 반액체 폴리올이 좌제를 위해 적합한 부형제이다. 약제학적 제제는 또한 방부제, 용매, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 염료, 방향제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제, 피복제, 항산화제 및 경우에 따라 치료학적 활성 화합물을 포함할 수 있다.
경구 투여 및 주사가 바람직하다. 주사를 위해 신규한 렙틴 길항제가 수용액 중에서, 바람직하게는 행크 용액 또는 링거 용액과 같은 생리학적으로 허용되는 완충액중에서 제형화된다. 그러나, 신규한 렙틴 길항제는 또한 고형으로 제형화될 수 있고 사용전에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
전형적인 제제는 치료학적으로 유리한 양의 렙틴 길항제를 포함한다. 치료학적으로 유리한 양은 하기에서 논의되는 바와 같이 치료학적 유효량과 동일할 수 있다. 추가로, 치료학적으로 유리한 양은 단위 용량일 수 있고 이것은 단독으로 또는 다중으로 사용되어 치료학적 유효량의 렙틴 길항제를 제공한다. 따라서 치료학적으로 유리한 양은 치료될 질환의 특성 그 자체에 좌우된다.
치료 방법
본 발명의 방법은 렙틴의 활성과 연관된 임의의 질환을 치료하는데 유용하다. 렙틴이 다소 인슐린의 생리학적 활성을 억제한다는 본원의 기술 내용과 관찰에 따라 본 발명의 방법은 특히 인슐린 활성의 차단을 포함하는 질환, 및 특히 제II형 당뇨병을 포함하는 질환의 치료에 유용하다. 인슐린 활성에 있어서의 상기 차단은 지질합성, 글루코스 수송, 글리코겐 합성 및 지방분해의 변형을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 제II형 당뇨병을 치료하기 위한 방법 및 인슐린의 생리학적 효과를 재생시키거나 증폭시키기 위한 방법을 포함한다.
전형적인 방법은 치료학적 유효량의 렙틴 길항제를 치료가 요구되는 환자에게 투여하는 것이다. 렙틴의 작용이 연관된 질환을 앓는 환자가 치료를 필요로한다. 특히 제II형 당뇨병을 앓는 환자의 경우 치료를 필요로한다. 또한 인슐린 활성의 차단, 즉, 지질합성, 글루코스 수송, 글리코겐 합성 및 지방분해에 있어서의 변형으로 특징화되는 질환을 앓는 환자의 경우 치료를 필요로한다. 상기 차단이 연관된 질환에서 인슐린의 생리학적 효과를 재생시키거나 증폭시키는 방법이 유용하다.
치료학적 유효량은 예를 들어, 치료될 질환의 특성, 투여 경로, 선택된 길항제의 특징 및 특히 담당 임상의의 판단에 좌우된다. 일반적으로 치료학적 유효량은 표적화된 질환을 치료하는데 충분히 효과적인 양 또는 방법의 목표를 성취하기위한, 예를 들어 인슐린의 생리학적 효과를 재생시키거나 증폭시키는데 충분한 양이다. 궁극적으로, 치료학적 유효량은 각각의 렙틴 길항제의 임상적으로 결정된 효능 및 독성에 좌우된다. 통상적인 기술을 가진 임상의가 상기 결정을 통상적으로 수행한다.
본 발명에 따른 다양한 문법적 형태의 용어 "치료"는 질환 상태, 질환의 진행, 질환의 원인성 제제 또는 또 다른 비정상적인 증상을 예방하고, 치료하고, 역전시키고, 완화시키고, 경감시키고, 최소화하고, 억제시키거나 방지시킴을 언급한다.
전신성 투여를 위해 바람직한 투여량은 1일 체중당 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg이다.
본 발명은 하기의 표 및 실시예에 의해 명백해지며 여기에 제한되지 않는다.
실시예 1: 쥐 렙틴의 클로닝
RNA 분리
부고환 지방 패드를 마우스 성체로부터 제거하고 액체 질소에 쇼크-동결시킨다. 지방 조직 1g을 액체 질소하에 자기에서 분쇄한후에 트리스 50mM(pH 7.5)의 구아니디늄 티오시아네이트 5M 용액 15ml, 10mM EDTA 및 0.1M DTT를 첨가하고 미세하게 분산시키기 위해 왕성하게 파쇄시킨다. 조직 절편을 완전히 분산시키고 고체 CsCl 10g을 첨가하며 혼합물을 실온에서 교반시킨다. H2O 10ml을 첨가한후에, CsCl 5.7M 용액 9ml을 원심분리 튜브중 상기 25ml 용액상에 붓는다. SW28 로터중에서 25,000 rpm(18℃)으로 15시간동안 원심분리시킨후에 튜브를 액체 질소중에서 심부-동결시키고 튜브의 바닥 1/4을 뜨거운 소형 블레이드를 사용하여 절단시킨다. 동결된 내용물을 꺼내어 RNA 펠렛을 이의 바닥 말단으로부터 긁어낸다. RNA를 용해시킴에 이어서 에탄올로 침전시킨다.
cDNA의 합성
혼합물중에 지방 조직으로부터 총 RNA 1㎍ 및 특이적인 프라이머 올리고뉴클레오타이드 5'-GAATGCAGAATAAATAAATA(서열 1; Zhang et al., 1994) 1㎍을 H2O 10㎕에 용해시킴에 이어서 열 변성시키고 5분동안 65℃에서 항온반응시킨다. RNase 억제제 0.5㎕, 각각의 경우에 dNTP 5nmol 및 AMV 역전사 효소(Boehringer Mannheim) 0.5㎕를 첨가한후에 혼합물을 1시간동안 42℃에서 항온반응시킨다. 이어서, cDNA를 H2O로 200㎕로 만들고 -20℃에서 저장한다.
PCR
특이적으로 프라임된 cDNA 3㎕를 2개의 각각의 프라이머 5'-GAAAGAAGGATCCAGTGCCTATCCAGAAAGTCCA(서열 2) 및 5'-GGAGAGAAGCTTGAGGGAGAGAAATGAATGATGG(서열 3); Zhang et al., 1994) 0.5㎍ 및 Taq 폴리머라제 2.5U를 사용하여 제조업자에 의해 추천된 반응 완충액(1.5mM MgCl2, 100㎕중의 200μM dNTPs)중에서 30싸이클로 증폭시킨다. 각각의 사이클은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분으로 구성된다.
연결
PCR 제조물로부터 특이적으로 증폭된 PCR 산물(583 bp)을 각각의 경우에 2시간동안 37℃에서 및 제조업자의 지침에 따른 완충 조건하에서 제한 효소 BamHI 및 HindIII(Boehringer Mannheim)를 사용하여 절단한후에 564개의 염기쌍 단편을 전기영동으로 정제하고 분리한다. BamHI 및 HindIII-절단된 벡터 pQE31(Qiagen) 0.1㎍ 및 T4 DNA 리가제(New England Biolabs) 20U와 함께 20㎕중에서 2시간동안 30℃에서 항온반응시킨다.
클로닝
연결 혼합물 5㎕를 형질전환-컴피턴트 이.콜라이 세포의 HB101 균주 100㎕와 함께 30분동안 빙상에 유지시키고 이어서 혼합물을 37℃의 물 욕조중에서 5분동안 가볍게 저어준다. 10mM MgCl2를 포함하는 영양 배지 0.9ml을 첨가한후에 혼합물을 1시간동안 37℃에서 진탕시킨다. 상기 혼합물 100㎕ 용적을 각각의 경우에 앰피실린 함유 (100㎍/ml) 한천 플레이트상에 플레이팅한다.
클론의 동정
37℃에서 밤새 증식시킨 클론을 앰피실린을 함유하는 2ml용적의 액체 배지에 접종하고 정지기에 이를 때까지 배양함에 이어서 원심분리한다. 세포를 0.1ml의 25mM 트리스(pH 8), 50mM 글루코스, 10mM EDTA 및 라이소자임(2㎎/ml)중에 현탁시키고 실온에서 5분동안 배양시킨후에 0.2ml의 0.2M NaOH, 1SDS를 첨가하여 용균시킨다. 150㎕의 3M Na 아세테이트/아세트산(pH 5.2)을 첨가하여 염색체 DNA를 침전시키고 5분동안 4℃에서 원심분리한다(시그마 2MK를 사용하여 10,000rpm). 플라스미드 DNA를 2.5 용적의 에탄올로 침전시키고 원심분리(상기 참조)하며 에탄올로 세척한후에 H2O 100㎕중에 용해시킴에 이어서 RNase 용액(10mg/ml) 10㎕를 첨가한다.
플라스미드 DNA를 제조업자의 지침에 따라 제한 효소(BgII, Xhol + Pvull; Boehringer Mannheim)를 사용하여 분해하고 수득한 DNA 단편을 전기영동후의 아가로스 겔중에서 마커 DNA에 대해 측정하고 에티듐 브로마이드로 염색한다. 정확한 단편 패턴을 갖는 클론을 동일한 방법으로 제한효소 AfIIII(New England Biolabs)를 사용하여 49번의 글루타민 잔기의 존재 여부를 조사한다.
각각의 경우에 Gln49(pQEob3-9)를 포함하는 이.콜라이 클론 및 Gln49(pQEob3-4)를 포함하지 않는 이.콜라이 클론의 존재는 DNA 서열화에 의해 확인한다. 전구서열 MetArgGlySer(His)6ThrAspPro(벡터 pQE31으로부터)에 이어지는 쥐 렙틴의 22번 내지 167번의 아미노산을 포함하는 재조합 렙틴의 생산물을 소량 배양물중에서 조사한다.
재조합 렙틴(Gln49의 존재 및 부재)모두를 하기에 기술된 실험에서 사용할 수 있는 반면에 실시예는 특이적으로 pQEob3-9를 발현시킴으로써 수득되고 Gln49를 포함하는 렙틴에 관한 것이다.
실시예 2: 렙틴의 제조
파쇄
10ℓ의 발효로부터 수득한 세균을 20분동안 4800rpm에서 원심분리한다. 침전물을 -20℃에서 동결시킴에 이어서 용균 완충액(6M 구아니디늄 클로라이드, 0.1M NaH2PO4, 10mM 트리스/HCl, pH 8)(침전물 g당 용균 완충액 5ml)중에 현탁시킨후에 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반시킴에 이어서 30분동안 4800rpm에서 원심분리한다.
Ni-NTA 크로마토그래피
Ni-NTA 아가로스 FF(Qiagen, Hilden) 100ml을 약 800mg의 렙틴을 포함하는 조 추출물에 첨가하고 이를 4℃에서 밤새 교반시킨다. 현탁액을 프릿을 갖는 글래스 칼럼(5cm)을 통하여 흡입한다. Ni-NTA 아가로스를 포함하는 칼럼을 용균 완충액 300ml에 이어서 10mM 이미다졸을 포함하는 용균 완충액 100ml(5ml/분)을 사용하여 세척한다. 이어서 렙틴의 용출물을 용균 완충액중에서 10 내지 200mM의 이미다졸로 농도 구배(농도 구배 용적: 5ml/분에서 300ml)시켜 분획한다. 분획물을 RP-HPLC로 분석하고 적절히 정제된 것과 농축물을 혼합한다(=Ni-NTA 용출물).
폴딩
Ni-NTA 용출물을 용균 완충액을 사용하여 1 내지 3mg/ml로 희석하고 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH 9로 조정한다. β-머캅토에탄올(렙틴의 mole당 β-머캅토에탄올 4 내지 6mol)을 첨가한후에 혼합물을 밀봉된 컨테이너에서 2시간동안 실온에서 항온반응시킨다. 재산화 및 재폴딩을 위해 용액을 폴딩 완충액(0.1M 트리스/HCl, pH 9) 용적의 9배로 붓고 이를 통기시키면서 16 내지 24시간동안 16℃에서 교반시킨다. 형성된 혼탁을 원심분리하여 제거한다(4,000 rpm, 45 분).
역상 HPLC
폴딩 혼합물을 HCl을 사용하여 pH 3으로 조정하고 20ml/분의 비율로 2.5 x 30㎝ RP 칼럼(PLRPS 300Å, 10μ, Polymer Laboratories, Amherst, USA)상으로 펌핑한다. 이어서, 칼럼을 용출제 A(0.1TFA 용액) 300ml로 세척한다. 렙틴을 용출제 B(아세토니트릴중 0.09TFA) 25 내지 50로 농도 구배시켜 100분(유속: 7ml/분)이내에 용출시킨다. 분획물을 분석 HPLC을 사용하여 분석한다. 적당한 순도 및 농도를 갖는 분획물을 혼합한다(RP 풀). 풀을 Na2HPO4/I 7mmol로 처리하고 NaOH를 사용하여 pH 3으로 조정하며 용매를 회전식 증발기상에서 제거한다. 렙틴 수용액을 NaOH로 중성화(pH 7.4)하고 4℃에서 밤새 저장한다. 형성된 혼탁을 원심분리하여 제거한다(4,000 rpm, 10분).
겔 투과 크로마토그래피
중성화되고 원심분리된 렙틴 용액을 한외여과하여 10 내지 15mg/ml로 농축시킴에 이어서 여과하여 살균시킨다. 슈퍼덱스 75 칼럼(2.6 x 60㎝, 스웨덴 파마시아)상에 50 내지 75mg을 로딩한다. PBS(154mM NaCl, 10mM 인산나트륨, pH 7.4)를 3ml/분의 유속에서 용출 완충액으로서 사용한다. 상기 방법으로 정제된 렙틴을 0.22㎛ 막을 사용하여 다시 한번 여과하고 -70℃에서 저장한다.
실시예 3: 길항성 116-167 단편의 제조
1M 트리스/HCl 1ml(pH 8)을 렙틴(PBS중의 1mg/ml)용액 40ml에 첨가하고 라이실 엔도펩티다제 160㎍을 첨가한후에 렙틴을 실온에서 3시간동안 분해한다. 혼합물을 pH 3으로 조정하고 실시예 2에서 기술한 RP-HPLC로 분획한다. 116-167의 단편을 전기 분무 질량 분광기(5532 D)로 동정하고 실시예 2에서 기술된 바와 같이 용매로부터 제거하며 농축시키고 겔 투과 크로마토그래피로 정제한다.
실시예 4: 지방세포의 분리
콜라겐아제로 분해시킴으로써 지방세포를 숫컷 위스타르 랫트(140 내지 160g, Hoechst AG breeding station, Kastengrund)의 부고환 지방 조직으로부터 제조[문헌참조: Rodbell, 1964, J. Biol. Chem. 239, 375 - 380]하고 KRH(25mM헤페스 유리산, 25mM 헤페스 나트륨염, 80mM NaCl, 1mM MgSO4, 2mM의 CaCl2, 6mM KCl, 1mM 나트륨 피루베이트, 0.5BSA)로 2회 세척함에 이어서 DMEM(듈베코의 최소 필수 배지)로 1회 세척하며 부유(800 x g, 소량 플라스틱 튜브중에서 1분)시켜 5.5mM 글루코스, 20mM 헤페스(pH 7.4), 2태아 소 혈청, 1BSA, 페니실린 50U/ml, 스트렙토마이신 10mg/ml을 보충하고 최종적으로 지방 조직(세포 역가: 약 2.5 x 105세포/ml)의 습윤 중량 g당 DMEM 20ml 용적으로 희석한다.
실시예 5: 지방 세포의 1차 배양 및 렙틴과의 배양
100nM 페닐이소프로필아데노신(세포 1ml당 DMEM의 4ml, 세포 역가 약 5 x 104세포/ml, 살균된 폴리프로필렌 튜브 50ml)의 존재하에 및 렙틴의 존재 또는 부재하에 지방세포를 5의 CO2대기하에 약하게 진탕시키면서 15 내지 18시간동안 37℃에서 배양시킨다. 이어서 지방세포를 차가운 KRH로 3회 세척하고 마지막 세척 용액을 완전히 제거한후에 잔류하는 세포층으로 글루코스-비함유 KRH 0.7ml을 첨가하여 세포 역가가 약 3 x 105세포/ml이 되도록 조정한다. 인슐린에 의해 자극된 지방세포의 용량을 결정하고 인슐린에 대한 이의 민감성을 결정하기 위해 1차 배양한 후에 세척된 지방 세포를 사람 인슐린의 부재 또는 존재(최종 농도 0.02 내지 50nM)하에 20분동안 37℃에서 배양하고 글루코스 수송 또는 지질합성을 측정한다.
실시예 6: 글루코스 수송
대사될 수 없는 글루코스 동족체 2-데옥시글루코스의 특이적 흡수로서 글루코스 수송을 측정한다[참조문헌: Muller and Wied, 1993, Diabetes 42, 1852 - 1867]. 인슐린과 함께 전배양되거나 전배양되지 않은 KRH중의 지방세포 현탁액 50㎕을 2-데옥시-D-[2,6-3H]글루코스(0.5μCi,0.2mM)을 보충한 KRH 50㎕와 함께 5분동안 25℃에서 배양한다. 배양 혼합물을 얇은 연성 플라스틱 원심분리 튜브로 옮기고 이때 이의 각각은 이미 디노닐 프탈레이트 오일 200㎕를 함유하며 즉시 원심분리한다(2,000 x g, 30초). 특정한 전단 응력을 사용하여 튜브를 오일 층(인접한 상부 말단에서)내에서 단절시키고 각각의 경우 오일 층상에 부유하고 있는 세포층과 함께 튜브의 상부 절반을 섬광 바이엘로 옮긴다. 섬광 유체 10ml(물을 기본으로함)을 첨가한후에 세포와 연관된 방사능을 측정한다. 세포 틈내에 함유되거나 세포내로 확산되는 2-데옥시글루코스에 대해 보정하기 위해 비특이적 방식으로 사이토칼라신 B(20μM)와 전배양된 세포의 방사능을 각각의 배양 혼합물의 총 세포와 연관된 방사능으로부터 공제한다[문헌참조: Gliemann et al., 1972, Biochim. Biophs. Acta 286, 1-9].
실시예 7: 지질합성
톨루엔 추출성 지질내로 D-글루코스의 혼입으로서 지질합성을 측정한다[문헌참조: Moody et al., 1974, Horm. Metab. Res. 6, 12 - 16]. KRH중의 지방 세포 현탁액 200㎕를 3.5mM 글루코스 및 20㎕의 인슐린 용액이 보충된 KRH 680㎕를 함유한 섬광 바이엘중에서 20분동안 30℃에서 배양한다. 100㎕의 D-[3-3H]글루코스(25μCi/ml KRH)를 첨가함으로써 지질합성을 개시한다. 37℃에서 배양한 후에 90분동안 5CO2의 대기하에서 약하게 진탕시키면서 섬광 유체 10ml(톨루엔을 기본으로함)을 첨가하고 강하게 교반시키고 이어서 상분리한후에 톨루엔 상의 방사능을 결정한다(적어도 4시간 배양). 톨루엔 상중의 지질의 방사능을 동일한 양의 [3H]글루코스를 포함하지만 세포를 포함하지 않는 배양 혼합물의 방사능에 대해 보정한다.
실시예 8: 인슐린 유도된 글루코스 수송 및 인슐린 유도된 지질합성에 대한 렙틴의 억제
분리된 랫트 지방 세포를 증가된 농도의 렙틴의 존재 또는 부재하에 1차 배양에서 15시간동안 배양한다. 이어서 세포를 세척하고 정상 상태 및 인슐린(10nM) 자극된 상태에서 글루코스 수송 및 지질합성에 대해 테스트한다. 인슐린에 대한 자극 인자는 인슐린 자극되고 기본적인 활성간의 비율로서 계산한다. 각각의 값은 각각의 경우 2회 또는 3회 측정된 활성을 갖는 2개의 독립적인 지방 세포 배양물의평균값을 나타낸다.
인슐린 농도: 5nM
렙틴 글루코스
농도[nM] 수송* 지질합성*
0 13.4 3.9
0.3 13.4 3.9
1 11.75 3.2
3 7.4 2.15
10 3.5 1.5
30 2.35 1.15
100 1.5 1.05
* 인자는 자극에 따른 값 및 기본값의 지수이다
결과는 표 1에 요약되어 있다.
실시예 9: 인슐린 용량/효과 곡선에 대한 렙틴의 영향
분리된 랫트 지방 세포를 증가된 농도의 렙틴의 존재 또는 부재하에 1차 배양에서 16.5시간동안 배양한다. 이어서 세포를 세척하고 상이한 농도의 인슐린에 따른 글루코스 수송의 자극에 대해 테스트한다. 글루코스 수송 활성은 특이적으로 세포와 연관된 2-데옥시-[3H]글루코스의 "dpm 값"으로서 주어진다. 각각의 값은 각각의 경우 4회 측정된 활성을 갖는 2개의 독립적인 지방 세포 배양물의 평균값을 나타낸다.
측정 계수: 글루코스 수송
렙틴[nM]
인슐린 [nM] 0 0.05 1 2 5 10 30 100
0 671 654 634 688 712 755 688 747
0.02 784 735 678 704 734 773 704 766
0.05 1285 1025 824 755 798 802 745 780
0.1 2406 1674 1189 860 883 856 789 803
0.2 4762 3320 1587 1006 923 941 852 813
0.5 6976 5138 2180 1377 1167 1209 943 883
1 7981 6834 3904 1916 1583 1573 1183 896
2 8576 7942 5510 2680 2140 2061 1374 1034
5 8956 8794 6985 4323 2950 2476 1782 1205
10 9064 9134 8241 6107 3682 2710 1972 1451
50 9072 9189 8932 7032 4031 2967 2114 1723
각각의 경우에 주어진 값은 dpm(분당 붕괴)으로 측정된3H-표지된 2-데옥시글루코스의 흡수이다.
결과는 표 2에 요약되어 있다.
실시예 10: 렙틴 효과에 대한 단편 116-167의 길항작용
분리된 랫트 지방 세포를 렙틴의 존재(10nM) 또는 부재하에 및 116-167의 렙틴 단편의 농도를 증가시키면서 1차 배양에서 17.5시간동안 배양한다. 이어서 세포를 세척하고 5nM 인슐린에 의한 글루코스 수송 또는 지질합성에 대해 테스트한다. 인슐린에 대한 자극 인자는 인슐린 자극 활성 및 기본적인 활성간의 비율로서 계산한다. 각각의 값은 각각의 경우 3회 측정된 활성을 갖는 2개의 독립적인 지방 세포 배양물의 평균값을 나타낸다.
렙틴: 10nM, 인슐린: 5nM
단편 글루코스
농도[nM] 수송* 지질합성
0 3.55 1.5
0.3 3.65 1.65
1 4.5 2.15
3 5.75 2.65
10 7.75 3.1
30 10.8 3.6
100 12.55 4
300 13.2 4
단독의 인슐린 13.4 3.9
* 인자는 자극에 따른 값 및 기본값의 지수이다.
결과는 표 3에 요약되어 있다.
서열 4
서열 5
서열 6
표 4 내지 표 6에 기재된 서열중에 존재하는 2개의 시스테인은 디설피드 브릿지에 의해 연결된다.

Claims (21)

  1. 제Ⅱ형 당뇨병을 치료하기 위한 치료학적 유효량의 렙틴 길항제를 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 렙틴 길항제가 사람 또는 동물 렙틴으로부터 유도되는 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 렙틴 길항제가 사람, 랫트, 마우스, 피그 및 유인원 원숭이 렙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 렙틴으로부터 유도되는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 렙틴 길항제가 쥐의 렙틴으로부터 유도되는 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 렙틴 길항제가 쥐의 렙틴의 내부 또는 카복시-말단 단편인 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 렙틴 길항제가 표 6(서열 6)의 아미노산 서열을 포함하는 쥐 렙틴 단편인 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 렙틴 길항제가 하나 이상의 보존적 아미노산 치환체를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 보존적 아미노산 치환이 하나의 이온성 아미노산을 또 다른 이온성 아미노산으로 대체하거나 하나의 소수성 아미노산을 또 다른 소수성 아미노산으로 대체하는 것인 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 보존적 아미노산 치환이, 글루타메이트의 아스파르테이트로의 치환, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 치환, 이소류신의 류신으로의 치환 및 류신의 이소류신으로의 치환으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 렙틴 길항제가 아세틸화, 카바모일화, 포밀화, 비오티닐화, 아실화, 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도화 및 친수성 중합체를 사용한 유도화로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화학적 변환에 의해 변형되는 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 렙틴 길항제가 가용성 렙틴 수용체, 렙틴 수용체 단편, 가용성 렙틴 수용체와의 융합체 및 렙틴 수용체 단편과의 융합체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  12. 치료학적 유효량의 제1항에 따른 약제학적 조성물을 치료를 필요로하는 환자에게 투여함을 포함하여 제II형 당뇨병을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 조성물이 표 6(서열 6)의 아미노산 서열을 포함하는 쥐의 렙틴 단편인 렙틴 길항제를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 렙틴 길항제가 하나 이상의 보존적 아미노산 치환체를 포함하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 조성물이 가용성 렙틴 수용체, 렙틴 수용체 단편, 가용성 렙틴 수용체와의 융합체 및 렙틴 수용체 단편과의 융합체로 이루어진 그룹중에서 선택된 렙틴 길항제를 포함하는 방법.
  16. 치료학적 유효량의 제1항에 따른 조성물을 인슐린의 생리학적 효과의 복구 또는 증폭을 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여 인슐린의 생리학적 효과를 복구시키거나 증폭시키기 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 조성물이 표 6(서열 6)의 아미노산 서열을 갖는 쥐의 렙틴 단편인 렙틴 길항제를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 렙틴 길항제가 하나 이상의 보존적 아미노산 치환체를 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 조성물이 가용성 렙틴 수용체, 렙틴 수용체 단편, 가용성 렙틴 수용체와의 융합체 및 렙틴 수용체 단편과의 융합체로 이루어진 그룹중에서 선택된 렙틴 길항제를 포함하는 방법.
  20. 쥐의 렙틴중 116 내지 167번의 아미노산 또는 116 내지 166번의 아미노산을 포함하는 쥐의 렙틴 단편.
  21. (a) 렙틴 단편을 암호화하는 유전자를 적합한 벡터/숙주 시스템을 사용하여 발현시키는 단계 및
    (b) 렙틴 단편을 숙주 시스템으로부터 분리하는 단계를 포함하여 제2항 내지 제11항 및 제20항 중 어느 한 항에 따른 렙틴 단편을 제조하는 방법.
KR1019997002389A 1996-09-20 1997-09-15 제ⅱ형 당뇨병에서의 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도 KR20010029537A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19638487 1996-09-20
DE19638487.7 1996-09-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010029537A true KR20010029537A (ko) 2001-04-06

Family

ID=7806282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019997002389A KR20010029537A (ko) 1996-09-20 1997-09-15 제ⅱ형 당뇨병에서의 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6399745B1 (ko)
EP (1) EP0956302A1 (ko)
JP (1) JP2001500869A (ko)
KR (1) KR20010029537A (ko)
CN (1) CN1230966A (ko)
AR (1) AR008444A1 (ko)
AU (1) AU735178B2 (ko)
BR (1) BR9711513A (ko)
CA (1) CA2266585A1 (ko)
CZ (1) CZ90999A3 (ko)
HU (1) HUP9904023A3 (ko)
ID (1) ID21861A (ko)
IL (1) IL129057A0 (ko)
NO (1) NO991186L (ko)
PL (1) PL332458A1 (ko)
RU (1) RU2201249C2 (ko)
WO (1) WO1998012224A1 (ko)
ZA (1) ZA978455B (ko)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU756617B2 (en) 1998-07-28 2003-01-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Leptin-mediated gene-induction
US6777388B1 (en) 1998-08-21 2004-08-17 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Leptin-related peptides
US7208572B2 (en) 1998-08-21 2007-04-24 Albany Medical College Leptin-related peptides
US20050272652A1 (en) 1999-03-29 2005-12-08 Gault Victor A Peptide analogues of GIP for treatment of diabetes, insulin resistance and obesity
AU782230B2 (en) 1999-09-22 2005-07-14 Serono Genetics Institute S.A. Methods of screening for compounds that modulate the LSR-leptin interaction and their use in the prevention and treatment of obesity-related diseases
EP1283878B1 (en) 2000-05-22 2005-07-27 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Receptor-based interaction trap
US7235629B2 (en) 2000-11-14 2007-06-26 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Functional fragment of the leptin receptor
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
CN103897066A (zh) 2004-02-11 2014-07-02 安米林药品有限责任公司 具有可选择特性的杂合多肽
US7407929B2 (en) * 2004-05-07 2008-08-05 Boston Biomedical Research Institute Leptin peptide antagonists
US7423113B2 (en) 2004-08-25 2008-09-09 Vib Vzw Leptin antagonist
KR101123549B1 (ko) 2004-11-01 2012-04-18 아밀린 파마슈티칼스, 인크. 비만 및 관련 장애의 치료
US8394765B2 (en) * 2004-11-01 2013-03-12 Amylin Pharmaceuticals Llc Methods of treating obesity with two different anti-obesity agents
WO2006053883A1 (en) 2004-11-18 2006-05-26 Vib Vzw Fibronectin iii domain as leptin receptor antagonists
US7307142B2 (en) * 2004-11-26 2007-12-11 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Leptin antagonists
EP2392595A1 (en) 2005-02-11 2011-12-07 Amylin Pharmaceuticals Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
BRPI0614649A2 (pt) 2005-08-11 2011-04-12 Amylin Pharmaceuticals Inc polipeptìdeos hìbridos com propriedades selecionáveis
EP1922336B1 (en) 2005-08-11 2012-11-21 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
EA200870365A1 (ru) * 2006-03-23 2009-02-27 Амилин Фармасьютикалз, Инк. Эндотелин и агонисты рецепторов к эндотелину в лечении заболеваний обмена веществ
US8497240B2 (en) 2006-08-17 2013-07-30 Amylin Pharmaceuticals, Llc DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
US20100323955A1 (en) * 2007-11-14 2010-12-23 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating obesity and obesity related diseases and disorders
US8778890B2 (en) 2009-03-31 2014-07-15 Temple University—Of the Commonwealth System of Higher Education Leptin antagonist and methods of use
EP2416797A4 (en) 2009-04-10 2013-04-24 Amylin Pharmaceuticals Llc AMYLINAGONIST COMPOUNDS FOR OXYGEN ANIMAL MICE
CA3138758A1 (en) 2010-09-28 2012-04-19 Amylin Pharmaceuticals, Llc Highly soluble leptins
JP6040464B2 (ja) 2011-07-08 2016-12-07 アエゲリオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＡｅｇｅｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド
RU2650646C2 (ru) 2012-09-27 2018-04-16 Дзе Чилдрен'З Медикал Сентер Корпорейшн Соединения, предназначенные для лечения ожирения, и способы их применения
HUE042196T2 (hu) 2013-11-26 2019-06-28 Childrens Medical Ct Corp Vegyületek elhízás kezelésére és alkalmazási eljárásaik
WO2015153933A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 The Children's Medical Center Corporation Hsp90 inhibitors for the treatment of obesity and methods of use thereof
CN104829707B (zh) * 2015-05-06 2017-12-19 广东省生物资源应用研究所 一条cd环和e螺旋区突变的瘦素活性肽及其编码基因和应用
CN104829708B (zh) 2015-05-06 2017-11-28 广东省生物资源应用研究所 一条d螺旋区突变的瘦素活性肽及其编码基因和应用
WO2017013270A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Universite De Strasbourg Use of leptin signaling inhibitor for protecting kidneys from patients having ciliopathy
EA201990720A1 (ru) 2016-09-12 2019-08-30 Эгерион Фармасьютикалс, Инк. Способы детекции нейтрализующих антител к лептину
EP3675961A1 (en) * 2017-08-31 2020-07-08 University Of Dundee Leptin peptides and their use for treating neurological disorders

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6001968A (en) * 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US5563243A (en) * 1995-01-31 1996-10-08 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5574133A (en) * 1995-01-31 1996-11-12 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5521283A (en) * 1995-01-31 1996-05-28 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5525705A (en) * 1995-01-31 1996-06-11 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5569743A (en) * 1995-01-31 1996-10-29 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
KR19990028388A (ko) * 1995-06-30 1999-04-15 피터 지. 스트링거 당뇨병 치료 방법
US7063958B1 (en) * 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US5922678A (en) * 1996-06-28 1999-07-13 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes

Also Published As

Publication number Publication date
PL332458A1 (en) 1999-09-13
ZA978455B (en) 1998-03-20
NO991186D0 (no) 1999-03-11
WO1998012224A1 (en) 1998-03-26
ID21861A (id) 1999-08-05
IL129057A0 (en) 2000-02-17
HUP9904023A2 (hu) 2000-03-28
NO991186L (no) 1999-03-11
US6399745B1 (en) 2002-06-04
BR9711513A (pt) 1999-08-24
AR008444A1 (es) 2000-01-19
JP2001500869A (ja) 2001-01-23
CA2266585A1 (en) 1998-03-26
HUP9904023A3 (en) 2002-01-28
RU2201249C2 (ru) 2003-03-27
AU4458697A (en) 1998-04-14
EP0956302A1 (en) 1999-11-17
CN1230966A (zh) 1999-10-06
AU735178B2 (en) 2001-07-05
CZ90999A3 (cs) 1999-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010029537A (ko) 제ⅱ형 당뇨병에서의 인슐린 내성을 치료하기 위한 렙틴 길항제의 용도
JPH11508895A (ja) 糖尿病を処置する方法
EP0725079A1 (en) Anti-obesity proteins
JPH11500925A (ja) 抗肥満症タンパク質
JPH11505706A (ja) 肥満症遺伝子産物
JP2000504319A (ja) 肥満症タンパク質製剤
JP2000505079A (ja) 肥満症タンパク質製剤
EP0849276A1 (en) Anti-obesity proteins
JP2000504318A (ja) 肥満症タンパク質製剤
US5922678A (en) Methods for treating diabetes
MXPA99002267A (en) Use of leptin antagonists for treating insulin resistance in type ii diabetes
JP2001507228A (ja) 抗肥満タンパク質
US20040033954A1 (en) Therapeutic method for combined use of modified CNTF and thiadolidinedione
AU723997B2 (en) Obesity protein formulations
AU703316B2 (en) Anti-obesity proteins
MXPA97010239A (en) Anti-obesi proteins
JP2000506517A (ja) 肥満症タンパク質化合物およびその製剤
MXPA98000133A (en) The use of a leptine or mimetico de leptina paratratar la diabe
AU3019700A (en) Methods of treatment
EP0983091A1 (en) Obesity protein formulations
AU3022400A (en) Proteins and methods

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application