JPH11505706A - 肥満症遺伝子産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、薬学または動物の健康に関する研究開発に適用される分子生物学の一般的な分野のものであり、生体の脂質組織の量を調節するタンパク質、ＤＮＡ化合物、ベクター，およびタンパク質を発現するのに有用な方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 肥満症遺伝子産物 この発明は医薬または動物薬の研究開発に適用される分子生物学の一般的分野 に属する。本発明は蛋白質、ＤＮＡ化合物、ベクター、および体の脂肪組織容積 を調節する蛋白質を発現するために有用な方法を包含する。 生理学者は以前から過剰な脂肪細胞が脳に送る過食シグナルを経由して、体が 肥満であること、従って、体に食餌を減らし、燃料をさらに燃やすようにさせる ものと仮定してきた。Ｇ．Ｒ．Ｈｅｒｖｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻：６２９ 〜６３１頁（１９６９年）。 パラビオーゼ実験は「フィードバック」モデルを支持し、循環ペプチドホルモ ンが体の脂肪沈着量を調節しているらしいことを示唆する。さらに、肥満症およ び糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスモデルが第６染色体の突然変異にリンクする常染色 体の劣性特性を持つことが知られている。最近、Ｚｈａｎｇおよび協力者はこの 病状にリンクするマウスの遺伝子の位置的クローニングを発表した。Ｚｈａｎｇ など、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２５〜３２頁（１９９４年）。この新たに開 示された前記マウスｏｂ遺伝子産物がそのようなホルモンであると信じられる。 本発明は新規な肥満症遺伝子および肥満症遺伝子産物の発見および分離に基づ くものである。この発明は脂肪組織を調節して、温血動物の肥満症を処置するた めに有用な生物学的に活性な蛋白質を製造するために有用である。 本発明は式Ｉ： ［式中、アミノ酸番号が： ４番の位置にあるＸａａはＴｒｐまたはＣｙｓである。 ５番の位置にあるＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである。 ２２番の位置にあるＸａａはＳｅｒまたはＡｓｎである。 ２７番の位置にあるＸａａはＭｅｔまたはＴｈｒである。 ２８番の位置にあるＸａａはＧｌｎまたは不在である。 ４８番の位置にあるＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである。 ７４番の位置にあるＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである。 ９２番の位置にあるＸａａはＳｅｒまたはＡｌａである。 １０１番の位置にあるＸａａはＡｌａまたはＶａｌである。 １０６番の位置にあるＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである。 １１２番の位置にあるＸａａはＧｌｙまたはＶａｌである。および １３２番の位置にあるＸａａはＡｌａまたはＳｅｒである］ で示される生物学的に活性な蛋白質に関する。 本発明はさらに式Ｉで示される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を提供す る。このＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡベクターおよび宿主細胞はさらに本発明 の別の態様を構成する。このような宿主細胞を培養して、配列番号１で示される アミノ酸配列を含む蛋白質を分離することを含む蛋白質の製法も請求する。本発 明はさらに処置を要する温血動物に配列番号１で示される蛋白質を投与すること を含む肥満症の処置法も提供する。本発明はさらに配列番号１の蛋白質を生物学 的に許容されるそのための希釈剤、担体または添加剤の一種またはそれ以上とと もに含む製剤を提供する。 本明細書に開示し、請求する本発明の目的のために、以下の用語および略号を 次のように定義する： 塩基対（ｂｐ）−−ＤＮＡまたはＲＮＡを示す。略号Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは ＤＮＡ分子の中に存在する時の（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シチジン、 （デオキシ）グアニンおよび（デオキシ）チミンの各ヌクレオチドの５’−モノ ホスフェート型に対応する。略号Ｕ、Ｃ、Ｇ、およびＴはＲＮＡ分子の中に存在 する時のウラシル、シチジン、グアニンおよびチミンの各ヌクレオシドの５’− モノホスフェート型に対応する。二重鎖ＤＮＡでは塩基対はＡとＴまたはＣとＧ の結合を示すこともある。ＤＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖では、塩基対はＴとＵ またはＣとＧの結合を示すこともある。 キレート化するペプチド−−多価金属イオンとコンプレックスを形成すること ができるアミノ酸配列。 ＤＮＡ−−デオキシリボ核酸。 免疫反応性蛋白質−−抗体、由来元の抗体分子と類似の性質を持つ抗原結合性 の抗体断片、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２２０８号、国際公表番号 ＷＯ８８／０１６４９号に記載の単鎖ポリペプチド結合分子を包括的に記載する ために使用する用語。 ｍＲＮＡ−−メッセンジャーＲＮＡ。 プラスミド−−染色体外自己複製性遺伝子エレメント。 読取り枠−−各トリプレットが特定のアミノ酸に対応しているトリプレットを ｔＲＮＡ、リボソームおよび関連因子の翻訳装置によって「読む」翻訳が起きる ヌクレオチド配列。各トリプレットが明白で同じ長さなので、コード配列は３の 倍数でなければならない。塩基対の挿入または欠失（フレームシフト突然変異と 命名されている）で同一のＤＮＡセグメントがコードする異なる蛋白質２種を得 るかも知れない。この危険を避けるため、所望のポリペプチドに対応するトリプ レットコドンを開始コドンから３の倍数に揃え、すなわち正しい「読取り枠」を 維持なければならない。キレート形成ペプチドを含む融合蛋白質の作製において は構造蛋白質をコードするＤＮＡ配列の読取り枠はキレート化ペプチドをコード するＤＮＡ配列内に維持しなければならない。 組換えＤＮＡクローニングベクター−−これに限定するものではないが、追加 のＤＮＡセグメントを１個またはそれ以上を追加でき、または既に追加してある ＤＮＡ分子を含むプラスミドおよびファージを包含する自律的に複製する物質の いずれか。 組換えＤＮＡ発現ベクター−−プロモーターが挿入されている組換えＤＮＡク ローニングベクターのいずれか。 レプリコン−−プラスミドまたはその他のベクターの自律的な複製を制御し、 また可能にするＤＮＡ配列。 ＲＮＡ−−リボ核酸。 転写−−ＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報を相補性ＲＮＡ配列に移行 させる過程。 翻訳−−メッセンジャーＲＮＡの遺伝子情報を使用してポリペプチド鎖の合成 を特定し、指示する過程。 処置−−患者の疾患、病状、または障害に対抗する目的でヒトまたは動物の患 者の管理および看護をすることを記載する。処置には症状または合併症の発症を 予防するため、症状または合併症を緩和するため、または疾患、病状または障害 を排除するための本発明化合物の投与を含む。それ故、処置には必要な患者に食 餌摂取を阻止し、体重増加を阻止し、および体重減少を誘導することを含む。 ベクター−−遺伝子操作で細胞を形質転換するために使用するレプリコンで、 適当な蛋白質分子に対応するポリヌクレオチド配列を有し、適当な制御配列と組 合せた時に形質転換さるべき宿主細胞に特定の性質を与えるもの。それ自体がレ プリコンであるため、プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは適当な ベクターである。人工的ベクターは制限酵素および連結酵素を使用して異なる起 源からのＤＮＡ分子を切断し、結合することによって構築される。ベクターには 組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換え発現ベクターを包含する。 配列番号１は配列表に記載のアミノ酸配列を示す。配列番号１は次のアミノ酸 配列である。 ［式中、 ４番の位置にあるＸａａはＴｒｐまたはＣｙｓである。 ５番の位置にあるＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである。 ２２番の位置にあるＸａａはＳｅｒまたはＡｓｎである。 ２７番の位置にあるＸａａはＭｅｔまたはＴｈｒである。 ２８番の位置にあるＸａａはＧｌｎまたは不在である。 ４８番の位置にあるＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである。 ７４番の位置にあるＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである。 ９２番の位置にあるＸａａはＳｅｒまたはＡｌａである。 １０１番の位置にあるＸａａはＡｌａまたはＶａｌである。 １０６番の位置にあるＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである。 １１２番の位置にあるＸａａはＧｌｙまたはＶａｌである。および １３２番の位置にあるＸａａはＡｌａまたはＳｅｒである］ 配列番号２は配列表に記載のＤＮＡ配列を示す。配列番号２は次のＤＮＡ配列 である。 配列番号３は配列表に記載のアミノ酸配列を示す。配列番号３は次のアミノ酸 配列である。 配列番号４は配列表に記載のＤＮＡ配列を示す。配列番号４は次のＤＮＡ配列 である。 配列番号５は配列表に記載のアミノ酸配列を示す。配列番号５は次のアミノ酸 配列である。 配列番号６は配列表に記載のＤＮＡ配列を示す。配列番号６は次のＤＮＡ配列 である。 配列番号７は配列表に記載のアミノ酸配列を示す。配列番号７は次のアミノ酸 配列である。 ヌクレオチドおよびアミノ酸の略号は米国特許商標庁が認可し、３７Ｃ．Ｆ． Ｒ．§１．８２２（ｂ）（２）（１９９３年）に記載されたものである。当技術 分野の熟練者はある種のアミノ酸には転位する傾向があることを認識する筈であ る。例えば、ＡｓｐはＩ．Ｓｃｈｏｅｎなど、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ・Ｐ ｒｏｔｅｉｎ・Ｒｅｓ． 、１４巻：４８５〜９４頁（１９７９年）およびそれが 引用している参考文献が記載しているようにアスパルチミドおよびイソアスパラ ギンに転位する。これら転位誘導体は本発明の範囲内に包含する。別段の指摘が ない限り、アミノ酸はＬ−配置のものである。 前記の通り本発明は式Ｉで示される蛋白質を提供する。本発明の好適な蛋白質 は配列番号３、配列番号５および配列番号７で表されるものである。 さらに本発明は配列番号１で示される蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。 好適なＤＮＡ化合物は配列番号２、配列番号４および配列番号６で表されるもの である。 本発明の蛋白質は組換えＤＮＡ技術または、たとえば液相ペプチド合成または 固相ペプチド合成、または蛋白質断片から始まり通常の溶液法と組合せた溶液中 での半合成のようによく知られている化学操作法のいずれかにより生産される。 ポリペプチド固相化学合成の原理は当技術分野ではよく知られており、たとえ ばＤｕｇａｓ，Ｈ．とＰｅｎｎｅｙ，Ｃ．著、「生物有機化学（Ｂｉｏｏｒｇａ ｎｉｃ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ニュー ヨーク、５４〜９２頁（１９８１年）のようなこの分野の一般的教科書にも見出 される。例えば、ペプチドはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３ ０Ａ型のペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスタ ー市、カリホルニアから購入できる）およびＡｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ社が供給する合成サイクルを使用するものなど固相法によって合成してもよ い。Ｂｏｃアミノ酸、およびその他の試薬はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ社、その他の薬品供給会社から購入できる。二重の結合プロトコルを 使用する逐次的Ｂｏｃ合成法を出発ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂に適用 してＣ−末端カルボキサミドを製造する。Ｃ−末端の酸を製造するためには対応 するＰＡＭ樹脂を使用する。アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジ ンおよびメチオニンは予め形成したヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを使 用して結合する。次の側鎖保護を使用してもよい： Ａｒｇ、トジル Ａｓｐ、シクロヘキシルまたはベンジル Ｃｙｓ、４−メチルベンジル Ｇｌｕ、シクロヘキシル Ｈｉｓ、ベンジルオキシメチル Ｌｙｓ、２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｍｅｔ、スルホキシド Ｓｅｒ、ベンジル Ｔｈｒ、ベンジル Ｔｒｐ、ホルミル Ｔｒｙ、４−ブロモカルボベンゾキシ Ｂｏｃの脱保護は塩化メチレン中でのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で行うこと もある。Ｔｒｐからのホルミル除去にはペプチジル樹脂をジメチルホルムアミド 中の２０％ピペリジンで６０分間４℃で処理する。Ｍｅｔ（Ｏ）はペプチジル樹 脂をＴＦＡ／ジメチルスルフィド／濃ＨＣｌ（９５／５／１）で６０分間２５℃ で処理すれば還元できる。前記前処理の後、ペプチドはさらに１０％ｍ−クレゾ ールまたはｍ−クレゾール／１０％ｐ−チオクレゾールまたはｍ−クレゾール／ ｐ−チオクレゾール／ジメチルスルフィド混合物を含む無水フッ化水素酸で樹脂 から脱保護し、切断してもよい。側鎖保護基の切断および樹脂からのペプチドの 切断は０℃またはそれ以下、好ましくは−２０℃、３０分とそれに続く０℃、３ ０分間実施する。ＨＦの除去後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄する。ペプチ ドを氷酢酸で抽出し、凍結乾燥する。精製は逆相Ｃ１８クロマトグラフィー（Ｖ ｙｄａｃ社）カラムで０．１％ＴＦＡ中アセトニトリル増加勾配によって行う。 当技術分野の熟練者は固相合成がＦＭＯＣ法とＴＦＡ／捕捉剤切断混合物を使用 して行うことができることを認識するであろう。 本蛋白質は組換え技術を使用して製造するのが好ましい。一般に本蛋白質は （ａ）宿主細胞を培養する、 （ｂ）所望なら前駆体蛋白質をプロセッシングして本蛋白質を製造する、および （ｃ）本蛋白質を分離する ことを含めて前駆体蛋白質から製造される。 本出願が請求するＤＮＡ配列は直接的な発現によるか、または融合蛋白質また は前駆体蛋白質としての発現によるかのいずれかによってｏｂ遺伝子産物を発現 するために有用である。請求した配列を融合遺伝子に使用する時には得られる生 成物は酵素的または化学的切断を必要とするであろう。ポリペプチドを特定部位 で切断する種々のペプチダーゼまたはペプチド鎖のアミノまたはカルボキシ末端 からペプチドを消化する種々のペプチダーゼ（たとえばジアミノペプチダーゼ） が知られている。さらに、特定の化学試薬（たとえばシアノーゲンブロミド）は 特定部位でポリペプチド鎖を切断するであろう。熟練した専門家はアミノ酸配列 （および組換え法を採用するならば合成的または半合成的コード配列）に部位特 異的内部切断部位を導入するために必要な修飾を認識するであろう。米国特許第 ５１２６２４９号；「蛋白質の精製：分子的機構から大量生産まで（Ｐｒｏｔｅ ｉｎ・Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍｓ・ｔｏ・Ｌａｒｇｅ・Ｓｃａｌｅ・Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ）」、米国化 学会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９９０年）の第１３章、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．、 「融合蛋白質の部位特異的プロテオリシス（Ｓｉｔｅ・Ｓｐｅｃｉｆｉｃ・Ｐｒ ｏｔｅｏｌｙｓｉｓ・ｏｆ・Ｆｕｓｉｏｎ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」参照。 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクターの構築には標準的連結 技術を採用する。分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、再連 結して必要なプラスミドを形成する。 所望の蛋白質の翻訳を行うためには加工した合成ＤＮＡ配列を適当な過剰組換 えＤＮＡ発現ベクターのいずれかに適当なエンドヌクレアーゼを使用して挿入す る。合成コード配列はこれらの発現および増幅および発現プラスミドからの分離 およびそれへの組込みを促進するために制限エンドヌクレアーゼ切断部位を転写 物の両端に持つように設計する。分離したｃＤＮＡコード配列は当技術分野でよ く知られている技術によってこの配列を所望のクローニングベクターへの挿入を 促進するように合成リンカーを使用して容易に修正してもよい。採用する特定の エンドヌクレアーゼは採用されるべき元の発現ベクターの制限エンドヌクレアー ゼの切断パターンによって支配されるであろう。制限部位は正しい枠内読取りお よび本出願が請求する蛋白質の発現を行うようにコード配列が制御配列とともに 正しい方向に向くように選択される。 一般に、宿主細胞に適合する種に由来するプロモーターおよび制御配列を含む プラスミドベクターをこれらの宿主について使用する。このベクターは通常複製 開始点ならびに形質転換された細胞における表現型選択を提供することができる マーカー配列を有する。例えば大腸菌は典型的には大腸菌の一種に由来するプラ スミドであるｐＢＲ３２２で形質転換する（Ｂｏｌｉｖａｒなど、Ｇｅｎｅ、２ 巻：９５頁（１９７７年））。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテ トラサイクリン耐性遺伝子を含み、形質転換された細胞を確認する容易な手段を 提供する。このｐＢＲ３２２プラスミドまたはその他の微生物プラスミドはまた プロモーターおよびその他の組換えＤＮＡ技術で通常に使用する制御エレメント を含んでいるかまたは含むように修正しなければならない。 所望のコード配列は蛋白質が発現される宿主細胞中でともに機能するプロモー ターおよびリボソーム結合部位から転写されるように正しい方向に向けて発現ベ クターに挿入する。このような発現ベクターの一例は、その教示を参考のために 引用するＢｅｌａｇａｊｅなど、米国特許第５３０４４９３号である。米国特許 第５３０４４９３号に記載されたプロインスリンＡ−Ｃ−Ｂをコードする遺伝子 は制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＲＢ１８２から除去 できる。本出願で請求するＤＮＡ配列はプラスミド骨格のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ 制限断片カセット上に挿入できる。 一般に本発明で有用なベクターを構築するためにＤＮＡ配列のクローニングの ためには原核生物を使用する。例えば、大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１ ４４６）は特に有用である。使用できるであろうその他の微生物株には大腸菌Ｂ および大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ３１５３７）を含む。これらの例は例示で あって、限定ではない。 原核生物はまた発現のためにも利用される。前記の株ならびに大腸菌Ｗ３１１ ０株（原栄養株、ＡＴＣＣ２７３２５）、たとえば枯草菌のようなバチルス菌、 およびその他のたとえばサルモネラ・ティフィムリウムまたはセラチア・マルセ ッ センス のようなエンテロバクター菌、および種々のシュードモナス種も使用され るであろう。原核生物宿主での使用に適するプロモーターにはβ−ラクタメース （ベクターｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］はレプリコンおよびβ−ラク タメース遺伝子を含む）および乳糖プロモーター系（Ｃｈａｎｇなど、Ｎａｔｕ ｒｅ 、２７５巻：６１５頁（１９７８年）；およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎａｔ ｕｒｅ 、２８１巻：５４４頁（１９７９年））、アルカリホスファターゼ、トリ プトフアン（ｔｒｐ）プロモーター系（ベクターｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３７６９ ５］はｔｒｐプロモーターの制御下にｔｒｐＥ融合蛋白質としての読取り枠の発 現を促進するように設計されている）およびたとえばｔａｃプロモーター（プラ スミドｐＤＲ５４０、ＡＴＣＣ３７２８２から分離できる）のようなハイブリッ ドプロモーターを包含する。しかしながら、その他の一般にそのヌクレオチド配 列が知られ、機能性ある細菌プロモーターは当技術分野の熟練者がリンカーまた はアダプターを使用して本蛋白質をコードするＤＮＡを結合できるようにし、必 要な制限部位を供給する。細菌系で使用するためのプロモーターは蛋白質をコー ドするＤＮＡに作動可能に結合するシャイン−ダルガノ配列も含むであろう。本 出願が請求するＤＮＡ分子は真核生物発現系でも組換え的に生産されよう。例え ば、哺乳類宿主細胞中で転写を制御する好適なプロモーターはたとえばポリオー マ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝 炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスのようなウイルスのゲノ ムから；またはたとえばβ−アクチンプロモーターなどの異種哺乳類プロモータ ーからのような様々な起源から入手しうる。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期 プロモーターはＳＶ４０制限断片として好都合に入手でき、これはＳＶ４０ウイ ルス複製開始点も含む。Ｆｉｅｒｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻：１１３頁（ １９７８年）。ＳＶ４０の全ゲノムはプラスミドｐＢＲＳＶ、ＡＴＣＣ４５０１ ９から得られる。ヒトのサイトメガロウイルスの即時プロモーターはプラスミド ｐＣＭＢｂ（ＡＴＣＣ７７１７７）から入手しうる。勿論、宿主細胞または関連 する種からのプロモーターも本発明には有用である。 高等真核生物による本出願が請求するＤＮＡの転写はベクターにエンハンサー 配列を挿入することによって増加する。エンハンサーは通常約１０〜３００ｂｐ でプロモーターに作用して転写を増強するＤＮＡのシス作用エレメントである。 エンハンサーは比較的方向および位置に依存性がなく、転写ユニットの５’（Ｌ ａｉｍｉｎｓ，Ｌなど、ＰＮＡＳ、７８巻：９９３頁（１９８１年））側および ３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．など、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、３巻：１１０ ８頁（１９８３年））側、イントロン中（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．など、Ｃｅ ｌｌ 、３３巻：７２９頁（１９８３年））側ならびにコード配列自体中（Ｏｓｂ ｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．など、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、４巻：１２９３頁（１ ９８４年））に見出されている。哺乳類遺伝子から多数のエンハンサー配列が知 られている（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン 、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかし典型的には真核生物細胞ウ イルスからのエンハンサーを利用する。この例にはＳＶ４０後期エンハンサー、 サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点後期側のポリ オーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを包含する。 真核生物宿主細胞（酵母、糸状菌、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の 多細胞生物からの有核細胞）で使用する発現ベクターはｍＲＮＡ発現に作用して 転写を終結するために必要な配列も含むであろう。これらの領域はｍＲＮＡがコ ードする配列の非翻訳部分にポリアデニル化セグメントとして転写される。３’ −非翻訳領域は転写終結部位も含む。 発現ベクターは選択マーカーとも称される選択遺伝子も含んでもよい。哺乳類 細胞のために適当な選択マーカーの例はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、これ はｐＪＯＤ−１０［ＡＴＣＣ６８８１５］のＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限断 片から誘導しうる）、チミジンキナーゼ（ヘルペルシンプレックスウイルスのチ ミジンキナーゼはｖＰ−５クローン［ＡＴＣＣ２０２８］のＢａｍＨＩ断片に含 まれる）またはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子（ｐＮＮ４１４酵母人工染 色体ベクターから得られる）である。このような選択マーカーが成功裏に哺乳類 宿主細胞に移入されると遺伝子移入された哺乳類宿主細胞は選択圧下に置かれて も生存できる。選択方法には繁用される２種の異なるカテゴリーがある。第一の カテゴリーは細胞の代謝に基づき、添加物培地なしには増殖する性能に欠ける突 然変異細胞系統を使用する。その二例はＣＨＯ・ＤＨＦＲ^-細胞（ＡＴＣＣ・Ｃ ＲＬ−９０９６）およびマウスＬＴＫ^-細胞（Ｌ−Ｍ（ＴＫ^-）、ＡＴＣＣ・ＣＣ Ｌ−２．３）である。これらの細胞はチミジンまたはヒポキサンチンのような栄 養素の添加なしに増殖する性能に欠ける。これらの細胞はヌクレオチド合成経路 の完成のために必要なある種の遺伝子を持っていないので、失われたヌクレオチ ドを補給培地に供給しなければ生存できない。培地に補給する代りに媒体を各遺 伝子を持たない細胞に無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入して増殖での要求 性を変化させるものがある。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった 各細胞は非補給培地中では生存することができないであろう。 第二のカテゴリーは主な選択法であってすべての細胞型にも使用できる選択法 を示し、突然変異細胞系統の使用を必要としない。この方式は典型的には宿主細 胞の増殖を休止させるために薬剤を使用する。新規遺伝子を持った細胞は薬剤耐 性を与える蛋白質を発現し、選択下で生存するであろう。このような主たる選択 の例は薬剤ネオマイシン、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．とＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｊ．Ｍｏ ｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． 、１巻：３２７頁（１９８２年）、ミコフェノ ール酸、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．とＢｅｒｇ，Ｐ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０ ９巻 ：１４２２頁（１９８０年）またはハイグロマイシン、Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．など 、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、５巻：４１０〜４１３頁（１９８５年） を使用する。前記三例は各々適当な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシ ン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性を与 える真核生物の制御下に細菌遺伝子を採用する。 真核生物での発現に好適なベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／ＣＭＶ はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３９８５、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ・Ｖａｌｌｅｙ通り、 サンジェゴ、ＣＡ９２１２１から購入できる。構築されたプラスミド中の正しい 配列を確認するために連結混合物を使用して大腸菌Ｋ１２のＤＨ１０Ｂ株（ＡＴ ＣＣ３１４４６）を形質転換し、成功裏に形質転換されたものを適当な抗生物質 耐性によって選択する。形質転換体からのプラスミドを製造し、Ｍｅｓｓｉｎｇなど 、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：３０９頁（１９８１年） の方法を用いて制限および／または配列によって分析する。 宿主細胞はこの発明の発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形 質転換体を選択し、または遺伝子を増幅するために適当なように修正した通常の 栄養培地で培養する。たとえば温度、ｐＨ、その他のような培養条件は発現のた めに選択した宿主細胞について以前に使用されたものであって、熟練した通常の 専門家には明白である。前記ベクターで細胞を形質転換する技術は当技術分野で はよく知られており、たとえばＭａｎｉａｔｉｓなど、「分子クローニング：実 験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ・Ｍａｎｕａｌ ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓｓ 社、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）または「分子生物 学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ ）」（１９８９年）およびその補遺のような一般的な 参考文献に見出される。 高等真核生物で本出願が請求する蛋白質をコードするベクターを発現するため に好適で適当な宿主細胞には：ＳＶ４０で形質転換したアフリカミドリザル腎臓 系細胞系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６５１）；形質転換ヒト一次胚 腎臓細胞系統２９３（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．など、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． 、３６巻：５９〜７２頁（１９７７年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７７巻：３１９〜 ３２９頁、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８６巻：１０〜２１頁）；幼若ハムスター腎臓細 胞（ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ−１０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６巻 ：１４７頁（１９６２年））；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ− ＤＨＦＲ^-（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ−９０９６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ａ ＴＣＣ・ＣＲＬ−１７１５、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５ ０頁（１９８０年））；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ７６、ＡＴＣＣ ・ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚部上皮様癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ− ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ−３４）；バッファローラッ ト肝 臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ−１４４２）；ヒト二倍体肺臓細胞（Ｗ Ｉ−３８、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ−７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ・Ｇ２、ＡＴ ＣＣ・ＨＢ−８０６５）；およびマウス乳腺癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴ ＣＣ・ＣＣＬ５１）を包含する。 原核生物に加えて酵母培養のような単核真核生物も使用しうる。サッカロミセ ス・セレビジアエ または通常パン酵母は最も普通に使用される真核生物微生物で あるがその他の株多数も同様に利用できる。サッカロミセスでの発現のために、 例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ４００５３、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど、Ｎａｔｕｒｅ 、２８２巻：３９頁（１９７９年）；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど、Ｇｅ ｎｅ 、７巻：１４１頁（１９７９年）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒなど、Ｇｅｎｅ、１ ０巻 ：１５７頁（１９８０年））が通常に使用される。このプラスミドは既にｔ ｒｐ遺伝子を含み、トリプトファン中で増殖する性能を持たない酵母の突然変異 株、例えばＡＴＣＣ４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ 、８５巻：１２頁（１９７７年））に対する選択マーカーを提供する。 酵母宿主で使用するために適当なプロモーター配列は３−ホスホグリセレート キナーゼのプロモーター（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤ、ＡＴＣＣ５３２３１に見 出され、１９９０年６月１９日の米国特許第４９３５３５０号に記載がある）ま たは、たとえばエノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１、ＡＴＣＣ３９５３２に見出さ れる）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素（プラスミドｐＨｃ ＧＡＰＣ１、ＡＴＣＣ５７０９０、５７０９１から誘導）、ザイモモナス・モビ リス（１９９１年３月１９日発行の米国特許第５００００００号）、ヘキソキナ ーゼ、ピルベート脱カルボキシ酵素、ホスホフラクトキネース、グルコース−６ −ホスフェートイソメレース、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートカ イネース、トリオースホスフェートイソメレース、ホスホグルコースイソメレー ス、およびグルコキナーゼのようなその他の解糖酵素のためのプロモーターを包 含する。 増殖条件によって制御される転写という利点が追加されている誘導可能なプロ モーターを含むその他の酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素２、イソチト クロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネ イン（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ、ＡＴＣＣ３９４７５、 米国特許第４８４０８９６号に含まれる）、グリセルアルデヒド３−ホスフェー ト脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用を担当する酵素（プ ラスミドｐＲＹ１２１、ＡＴＣＣ３７６８５に見出されるＧＡＬ１）のためのプ ロモーター領域である。酵母発現に使用するために適当なベクターおよびプロモ ーターはさらにＲ．Ｈｉｔｚｅｍａｎなど、欧州特許公開７３６５７Ａに記載さ れている。サッカロミセス・セレビジアエからのＵＡＳ・Ｇａｌ（プラスミドＹ Ｅｓｐｅｃ−−ｈＩ１ｂｅｔａ、ＡＴＣＣ６７０２４上のＣＹＣ１プロモーター に関連して見出される）のような酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに 有利に使用される。 以下の実施例は本発明の実施方法の記載を補助し、本出願が請求する本発明の ＤＮＡ分子、ベクター、宿主細胞および方法の特性を例示するであろう。本発明 の範囲が下記実施例のみから構成されると理解すべきではない。実施例１ ブタＯＢ遺伝子および遺伝子産物 全ＲＮＡをＰｅｌ−Ｆｒｅｅｚ社から入手したブタの脂肪組織Ｐｅｌ−Ｆｒｅ ｅｚ（商標）から分離し、ｃＤＮＡをＨｓｉｕｎｇなど、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉ ｄｅ 、２５巻：１〜１０頁（１９９４年）に記載の技術に従ってクローニングし た。 公表されたヒトｏｂ遺伝子のアミノ酸配列に基づいてプライマーを設計した。 このプライマーは３８０Ａ型合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ社、８５０、Ｌｉｎｃｏｌｎ・Ｃｅｎｔｅｒ・Ｄｒｉｖｅ、フォスター市、 ＣＡ９４４０４）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法に使用する ために製造した。プライマーＰＣＲＯＢ−１（１２５０４）（ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＧＡ ＭＣＣ ＣＴＧ ＴＧ）（配列番号８）、ＰＣＲＯＢ−２（１ ２５０５）（ＧＧ ＡＴＴ ＣＴＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＴＧ ＧＹＣ ＣＴＡ ＴＣＴ）（配列番号９）、ＰＣＲＯＢ−３（１２５０６）（ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡ）（配列番号１０）、およびＰ ＣＲＯＢ−４（１２５０７）（ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＣ Ｃ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＡ）（配列番号１１）を製造した。 ｃＤＮＡ合成のためにブタの脂肪組織から分離した全ＲＮＡ１μＬ（１μｇ／ μＬ）およびＰｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ社Ｒａｎｄｏｍ・Ｐｒｉｍｅｒ（５０μ Ｍ）１μＬを全容積１２μＬ中、７０℃で１０分間アニーリングし、次に氷冷し た。続いて次のものをこのアニーリング混合物に添加した：４μＬのＢＲＬ社、 ５×Ｈ−逆転写酵素（ＲＴ）反応緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社カタログ＃２８ ０２５−０１３）、２μＬの０．１Ｍ−ＤＴＴ、１μＬの１０ｍＭ−ｄＮＴＰ。 このアニーリング混合物を次に３７℃で２分間インキュベーション後、１μＬの ＢＲＬ社Ｍ−ＭＬＶ−逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ）（カタログ＃２８０２５− ０１３）を添加して３７℃でさらに１時間インキュベーションした。インキュベ ーション後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次に氷冷した。 ｃＤＮＡ増幅のために前記ｃＤＮＡ反応混合物（１μＬ）、２．５単位Ａｍｐ ｌｉＴａｑ・ＤＮＡポリメレース（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）、１０μＬの １０×ＰＣＲ反応緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）、４μＬの１０ｍＭ− ｄＮＴＰおよび各５０ｐｍｏｌのブタＯＢ増幅用センス（ＰＣＲＯＢ−１）およ びアンチセンス（ＰＣＲＯＢ−３）プライマーを含む反応混合物（１００μＬ） 中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲの条件はＰＣＲ・ＤＮＡ ・Ｔｈｅｒｍａｌ・Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を使用して、 ９５℃１分間、５７℃１分間、および７２℃１分間の３０サイクルとした。ＰＣ Ｒ増幅後、５μＬのＢＲＬ社Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、２μＬの ＢＲＬ社Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μＬ）、および５μＬのＡＴ Ｐ（１０ｍＭ）をＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）に直接添加して３７℃で３０ 分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を９５℃に５ 分間加熱し、次に氷冷した。５００ｂｐ断片（〜０．５μｇ）をアガロースゲル 電気泳動によって精製し、フリーズ・スクィーズ法で分離した。この５００ｂｐ 断片（〜０．２μｇ）をＳｍａＩ線状化したｐＵＣ１８プラスミド（〜１μｇ） に連結し、この連結混合物を用いてＤＨ５α（ＢＲＬ）コンピテント細胞を形質 転 換した。形質転換混合物をアンピシリン（Ａｍｐ）（１００μｇ／ｍＬ）添加０ ．０２％Ｘ−Ｇａｌ・ＴＹブイヨンプレートに塗布し、３７℃で一夜インキュベ ーションした。白色のクローンを吊り上げ、Ａｍｐ添加（１００μｇ／ｍＬ）Ｔ Ｙブイヨン中３７℃で一夜増殖させた。このプラスミドをＷｉｚａｒｄ・Ｍｉｎ ｉｐｒｅｐ・ＤＮＡ精製装置（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して分離し、Ａｐｐｌ ｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ・３７０型ＤＮＡシークエンサーでＤＮＡの配列を 決定した。得られた配列は本明細書に配列番号６として記載してある。実施例２ ウシＯＢ遺伝子および遺伝子産物 配列番号２のＤＮＡ配列はウシＯＢｃＤＮＡ増幅用センス（ＰＣＲＯＢ−２） およびアンチセンス（ＰＣＲＯＢ−３）プライマーを使用する以外は実施例１に 類似の技術によって得られた。実施例３ ウシＯＢ遺伝子および遺伝子産物 配列番号４のＤＮＡ配列はウシＯＢｃＤＮＡ増幅用センス（ＰＣＲＯＢ−２） およびアンチセンス（ＰＣＲＯＢ−３）プライマーを使用する以外は実施例１に 類似の技術によって得られた。実施例４ ベクターの構築 本出願が請求する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＮｄｅＩ およびＢａｍＨＩ制限部位を含むようにして構築する。クローニングしたＰＣＲ 産物を有するプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化する。少量 の〜４５０ｂｐ断片をゲルで精製し、ベクターｐＨＲＢ１８２に連結し、それか らＡ−Ｃ−Ｂプロインスリンのコード配列を除去する。連結産物で大腸菌ＤＨ１ ０Ｂ （ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬ社から購入可能）を形質転換して、１０ｍｇ／ｍＬで テトラサイクリンを添加したトリプトン−イースト（ＤＩＦＣＯ社）プレート上 で増殖するコロニーを分析する。プラスミドのＤＮＡを分離し、ＮｄｅＩおよびＢａｍ ＨＩで消化し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動で分離する。予期 される〜４５０ｂｐのＮｄｅＩからＢａｍＨＩへの断片を含むプラスミドを保管 する。大腸菌Ｋ１２のＲＶ３０８株（ＮＲＲＬから寄託番号Ｂ−１５６２４とし て入手できる）をこの第二のプラスミドで形質転換して本蛋白質を発現するため に適する培養物を得る。 前記ベクターで細胞を形質転換する技術は当技術分野でよく知られており、た とえばＭａｎｉａｔｉｓなど、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ ）」 、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉ ｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒ ｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）または「分子生物学の最新プロトコル（Ｃ ｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇ ｙ ）」（１９８９年）およびその補遺のような一般的な参考文献に見出される。 本明細書に例示する本発明の好適な実施に使用する大腸菌細胞の形質転換に含ま れる技術は当技術分野でよく知られている。形質転換した大腸菌細胞を培養する 精密な条件は大腸菌宿主細胞の系統および採用される発現またはクローニング用 ベクターの性質に依存する。例えば温度誘導性プロモーター−オペレーター領域 を移入したベクターは、たとえばｃ１８５７温度誘導性ラムダファージプロモー ター−オペレーター領域のように蛋白質合成を誘導するためには培養条件の中で 温度を約３０℃から４０℃シフトする必要がある。 本発明の好適な態様では大腸菌Ｋ１２のＲＶ３０８株細胞を宿主細胞として採 用するが、その他多数の細胞系統、たとえばこれに限定するものではないが大腸 菌 Ｋ１２のＬ２０１株、Ｌ６８７株、Ｌ６９３株、Ｌ５０７株、Ｌ６４０株、Ｌ ６４１株、Ｌ６９５株、Ｌ８１４株（大腸菌Ｂ）も利用できる。形質転換した宿 主細胞を次に発現プラスミドに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質の選択圧 下の適当な培地に塗布する。培養物を次に採用する宿主細胞系統に対して適切な 時間および温度でインキュベーションする。 細菌発現系で高濃度で発現される蛋白質は過剰発現蛋白質を高濃度で含有する 顆粒中または封入体として特徴的に凝集する。Ｋｒｅｕｇｅｒなど、「蛋白質の 折畳（Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｆｏｌｄｉｎｇ ）」、ＧｉｅｒａｓｃｈとＫｉｎｇ編、 １３６〜１４２頁（１９９０年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ・ｆｏｒ・ｔｈｅ・Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ・ｏｆ・Ｓｃｉｅｎｃｅ・Ｐｕｂｌ ｉ ｃａｔｉｏｎ・Ｎｏ．８９−１８Ｓ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．。このような蛋白質 凝集体はさらに精製して所望の前記蛋白質生成物を分離するためには可溶化しな ければならない。たとえばグアニジウム−ＨＣｌのように強く変性させる溶液お よび／またはたとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）のように弱く変性させる溶 液を使用する種々の技術で蛋白質を可溶化する。溶液中で変性剤を徐々に除去す ると（透析によることが多い）、変性した蛋白質がその在来型立体配座になるも のと推測される。変性および折畳の正確な条件は所定の蛋白質発現系および／ま たは問題の蛋白質によって決定される。 好ましくは、本ＤＮＡ配列はここに参考のために引用する米国特許第５１２６ ２４９号に記載されているようにＭｅｔ−ＡｒｇまたはＭｅｔ−Ｔｙｒをコード するジペプチドリーダー配列とともに発現される。この手法は蛋白質の効率的な 発現を促進し、カテプシンＣまたはその他のジペプチジルペプチダーゼによって 活性型蛋白質への迅速な変換を可能にする。蛋白質精製は当技術分野で知られて いる技術によるが、逆相クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよび サイズ排除を包含する。 本明細書で請求する蛋白質はシステイン残基を含有する。そこで蛋白質を安定 にするためにはジスルフィド結合が形成されるかも知れない。例えば、本発明は 配列番号１の蛋白質を包含するが、それには配列番号１の９６番にあるＣｙｓが 配列番号１の１４６番にあるＣｙｓと交差結合したものと同様に、このようなジ スルフィド結合を持たないものも包含する。これに加えて、本発明の蛋白質は、 特に製剤化した時には、二量体、三量体、四量体、およびその他の多量体として 存在しうる。このような多量体も本発明の範囲内に包含する。実施例５ Ｍｅｔ−Ａｒｇリーダー配列を有する配列番号７の蛋白質を大腸菌内に発現し た。顆粒を５ｍＭ−システイン含有８Ｍ−尿素で可溶化した。蛋白質を５ｍＭ− システイン含有８Ｍ−尿素中でアニオン交換して精製し、８Ｍ−尿素（５ｍＭ− システイン、０．１Ｍ−トリス、ｐＨ９．０含有）で希釈し、ＰＢＳに対して十 分透析して折畳みした。サイズ排除クロマトグラフィーによる本蛋白質の最終的 な精製に続いて、本蛋白質３〜３．５ｍｇ／ｍＬ−ＰＢＳまで濃縮した。実施例６ Ｍｅｔ−Ａｒｇリーダー配列を有する配列番号７の蛋白質を前記の各実施例に 準ずる技術によって大腸菌内に発現し、分離し、折畳みした。蛋白質溶液のｐＨ をｐＨ２．８まで低下させた。Ｍｅｔ−Ａｒｇリーダー配列を蛋白質１ｍｇ当り ６〜１０ミリ単位のｄＤＡＰの添加によって切断した。変換反応を室温で２〜８ 時間進行させた。反応の進行は逆相高速液体クロマトグラフィーで監視した。反 応はＮａＯＨでｐＨを８に調整して停止させた。脱（Ｍｅｔ−Ａｒｇ）蛋白質を ７〜８Ｍ−尿素の存在下のカチオン交換クロマトグラフィーおよびＰＢＳでのサ イズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。サイズ排除クロマトグラ フィーによる本蛋白質の最終的な精製に続いて蛋白質を３〜３．５ｍｇ／ｍＬＰ ＢＳまで濃縮した。構造は質量スペクトル術によって確認した。 本発明は温血動物を処置する方法を提供する。そのような種での好適な使用は 脂肪組織を調節して体重を減少させるためのものである。本方法は約０．００１ ｇ／ｋｇと１０ｇ／ｋｇの間の用量にある有効量の蛋白質をその動物に投与する ことを含む。好適な用量は活性化合物約０．０１から１０ｇ／ｋｇまでである。 成熟種に対する典型的日用量は約０．５から１０００ｍｇまでである。この方法 を実行するに当り、配列番号１の蛋白質を毎日単回用量としてまたは毎日多回用 量として投与できる。処置管理には長期間の投与を必要とすることもある。投与 用量当りの量または全投与量は医師が決定するものであって、疾患の重症度、患 者の年齢および一般的健康状況、およびその化合物に対する患者の忍容性に依存 する。 本発明はさらに配列番号１の蛋白質を含む製剤を提供する。好ましくは生物学 的に許容される塩の型である、本蛋白質は肥満症の医療的または予防的な処置の ための非経口投与用に製剤化できる。例えば、配列番号１の蛋白質は通常の医薬 用担体および添加剤と混合できる。この明細書で請求する蛋白質を含む組成物は 約０．１から９０重量％まで、さらに一般には約１０から３０重量％までの、好 ましくは溶解型の、活性蛋白質を含む。さらにその上、本蛋白質は単独でまたは その他の脂肪調節化合物と組合せて投与することもある。静脈内（ｉｖ）使用で は、通常に使用する静脈内用液剤に溶解して本蛋白質を投与し、また本蛋白質を 点滴によって投与する。このような液剤には、例えば生理学的食塩水、リンゲル 溶液または５％デキストロース溶液を使用できる。筋肉内用製剤では無菌製剤、 好ましくは配列番号１の蛋白質の適当な可溶性塩型、例えば塩酸塩型、をたとえ ば熱発物質不含水（蒸留水）、生理学的食塩水または５％グルコース溶液のよう な医薬的希釈剤、に溶解して投与できる。本化合物の適当な不溶性型を調製して 水性基剤または、たとえばオレイン酸エチルのような長鎖脂肪酸のエステルなど の医薬的に許容される油状基剤中の、懸濁液として投与することもある。 肥満症を処置し、脂肪組織を調節するための本化合物の性能は次の生体内実験 で証明される。実施例７ 生物学的試験 パラビオーゼ実験はある蛋白質が末梢脂肪組織から放出されることおよびその 蛋白質が正常マウスならびに肥満症マウスにおいて体重増加を制御できることを 示唆する。それ故、最も関連の深い生物学的試験は数種ある投与経路（ｉｖ、ｓ ｃ、ｉｍ、ｉｐ、またはミニポンプまたはカニューレによる）のいずれかで被験 物質を注射し、次に食餌と水の摂取、体重増加、血漿の化学またはホルモン（グ ルコース、インスリン、ＡＣＴＨ、コルチコステロン、ＧＨ、Ｔ４）を種々の期 間にわたって監視するものである。適当な被験動物には正常マウス（ＩＣＲ種な ど）および肥満症マウス（ｏｂ／ｏｂ、Ａｖｙ／ａ、ＫＫ−Ａｙ、ｔｕｂｂｙ、 ｆａｔ）を包含する。肥満症および糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスモデルは肥満症の 病状を示すものとして当技術分野で一般に認められている。これらの注射に対す る非特定的効果についての対照実験は同じ動物で類似組成の活性薬剤含有または 不含の基剤を使用し、同じパラメーターを監視するか、または受容体を持たない と思われる動物（ｄｂ／ｄｂマウス、ｆａ／ｆａまたはｃｐ／ｃｐラット）で活 性薬剤自体を監視することによって行われる。これらモデルで活性を示す蛋白質 は他の哺乳類でも同様な活性を示すであろう。 標的器官は食餌摂取および脂肪生成状態を調節する下垂体であると予期される ので、同様なモデルは被験物質を脳に直接注射（たとえば、側方または第三側脳 室を経るｉ．ｃ．ｖ．注射または特定の下垂体核、たとえば弓状核、傍室核、脳 弓周核）への直接的注射）するものである。前記と同様なパラメーターを測定で きようが、または食餌または代謝を調節することが知られている神経伝達物質の 放出（たとえば、ＮＰＹ、ガラニン、ノルエピネフィリン、ドパミン、β−エン ドルフィンの放出）も監視できよう。 同様な研究は摘出した脳下垂体を潅流または組織浴装置中で使用して試験管内 でも達成される。この場合には、神経伝達物質の放出または電気生理学的変化を 監視する。 本発明の蛋白質がＯＢ／ＯＢマウスにおいて肥満症を処置する性能を代表的な 蛋白質について次表に表示する。実施例６の蛋白質 これらの蛋白質は前記生物学的試験の少なくとも１種で活性であり、抗肥満症 剤である。それ自体として、それらは肥満症および肥満症に関連する病状の処置 に有用である。しかしながら、本蛋白質は脂肪組織調節剤として有用であるのみ ならず、当技術分野の熟練者は本蛋白質は診断用の抗体製造に有用であり、また 蛋白質として動物への食餌添加剤として有用であることを認識する。さらにその 上、本化合物は温血動物で美容目的での体重制御のために有用である。美容目的 は体の外見を改善するために動物の体重を制御することを探求する。このような 美容的使用も本発明の一部を構成する。本明細書で請求するＤＮＡ配列は蛋白質 組成物を製造するため、スクリーニングのため、および診断用抗体産生増強用の 免疫原を製造するために有用である。 本発明の原理、好適な態様および操作様式を本明細書に前記した。しかしなが ら、開示した個々の型は例示的であるが限定的ではないので、本明細書で保護を 受けることを意図している本発明がそれらに限定されると理解すべきではない。 当技術分野の熟練者は本発明の本質から離脱せずに様々な変動および変化を行い うる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＶ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ｉ： ［式中、 ４番の位置にあるＸａａはＴｒｐまたはＣｙｓである。 ５番の位置にあるＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである。 ２２番の位置にあるＸａａはＳｅｒまたはＡｓｎである。 ２７番の位置にあるＸａａはＭｅｔまたはＴｈｒである。 ２８番の位置にあるＸａａはＧｌｎまたは不在である。 ４８番の位置にあるＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである。 ７４番の位置にあるＸａａはＩｌｅまたはＶａｌである。 ９２番の位置にあるＸａａはＳｅｒまたはＡｌａである。 １０１番の位置にあるＸａａはＡｌａまたはＶａｌである。 １０６番の位置にあるＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒである。 １１２番の位置にあるＸａａはＧｌｙまたはＶａｌである。および １３２番の位置にあるＸａａはＡｌａまたはＳｅｒである］ で示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩。 ２．配列番号３、配列番号５、配列番号７である請求項１の蛋白質。 ３．請求項１または２の蛋白質をコードするヌクレオチド配列から構成され る分離されたＤＮＡ分子。 ４．請求項３のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡベクター。 ５．請求項４のベクターを含む組換え宿主細胞。 ６．請求項１または２の蛋白質を、その蛋白質を含む前駆体蛋白質から製造 する方法であって、次を含むもの： （ａ）請求項５の宿主細胞を培養すること； （ｂ）所望ならば前駆体蛋白質をプロセッシングして請求項１または２の蛋白質 を製造すること；および （ｃ）蛋白質を分離すること。 ７．医薬または動物薬として使用するための請求項１または２の蛋白質。 ８．請求項１または２の蛋白質を医薬的に許容される希釈剤、担体または添 加剤の１種またはそれ以上をとともに含む医薬的製剤。 ９．さらに、式： Ｍｅｔ−Ａ₀− ［式中、Ａ₀はＰｒｏ以外のアミノ酸のどれかである］ で示されるリーダー配列を含む請求項１または２の蛋白質。 １０．リーダー配列がＭｅｔ−Ａｒｇ−である請求項９の蛋白質。