HU220234B - Eljárás stem sejtek működését befolyásoló faktorok előállitására - Google Patents

Description

A találmány az 573.616 sorozatszámú, 1990. augusztus 24-én bejegyzett szabadalmi leírás folytatása, ami az 537.198 sorozatszámú, 1990. június 11-én bejegyzett szabadalmi leírás folytatása, ami a 422.383 sorozatszámú, 1989. október 16-án bejegyzett szabadalmi leírás folytatása, melyeket itt referenciaként említünk meg.

A jelen találmány az eredeti őssejtek - beleértve a korai hematopoietikus őssejteket - működését stimuláló új faktorokra, valamint az ilyen faktorokat kódoló DNS-szekvenciákra vonatkozik. A találmány konkrétan ezekre az új faktorokra, ezek fragmentumaira, polipeptidanalógjaira és az ezeket kódoló DNS-szekvenciákra vonatkozik.

A találmány háttere

A humán vérképző (hematopoietikus) rendszer fehérvérsejtekből (beleértve a neutrofileket, a makrofágokat, a bazofíl és a hízósejteket, az eozinofileket, a T- és B-sejteket), vörösvérsejtekből (eritrociták) és alvadékképző sejtekből (megakarociták, vérlemezkék) áll.

Az általános elképzelések szerint bizonyos hematopoietikus növekedési faktorok kis mennyiségére vezethető vissza a kisszámú stemsejtek különböző vérsejtőssé történő differenciálódása, ezeknek a sejteknek a hatalmas méretű szaporodása és ezen vonalak érett vérsejtjeinek végső differenciálódása. A hematopoietikus rendszer regenerálófunkciója normál körülmények között megfelelő. Azonban kemoterápiás, sugárzásos stressz vagy természetes mielodiszpláziás rendellenesség hatására a beteg súlyosan leukopeniás, anémiás vagy trombocitopéniás lehet. A találmány tárgya a hematopoietikus növekedési faktorok alkalmazása ebben a veszélyes időszakban serkenti a csontvelő regenerálódását.

Egyes virális eredetű rendellenességek esetében, amilyen például a szerzett autoimmunhiányos betegség (AIDS), a vér alkotóelemei, például a T-sejtek, erőteljesen károsodhatnak. Ezekben az esetekben a T-sejtek termelésének fokozása terápiásán oldható meg.

Mivel a hematopoietikus növekedési faktorok rendkívül kis mennyiségben vannak jelen, ezen faktorok detektálása és azonosítása olyan mérések sorára épült, mely mostanáig csak a mesterséges körülmények között tenyésztett sejtek stimulálóhatásai alapján tett különbséget a különböző faktorok között. így például az eritrociták termelését stimuláló humán eritroprotein (EPO) aminosav- és DNS-szekvenciája már ismert (lásd Lin, 4.703.008 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, melyet itt referenciaként használtunk fel). Rekombináns eljárásokat alkalmaztak egy humán granulocitatenyészetet stimuláló faktor cDNSének, G-CSF-nek (lásd Souza, 4.810.643 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, melyet itt referenciaként használtunk fel), humán granulocitamakrofág tenyészetstimuláló faktornak (GM-CSF) [lásd Lee és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360-4364 (1985); Wong és társai, Science, 228, 810-814 (1985)], szarvasmarha eredetű G- és GM-CSF-nek [lásd Yokota és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1070 (1984); Fung és társai, Natúré, 307, 233 (1984); Gough és társai, Natúré, 309, 763 (1984)] és humán makrofág tenyészetstimuláló faktornak (CSF-1) [Kawasaki és társai, Science, 230, 291 (1985)] az izolálására.

A „High Proliferative Potential Colony Forming Cell” (HPP-CFC) mérési rendszer az említett faktoroknak a korai hematopoietikus ősökre gyakorolt hatásait vizsgáló teszt [Zont, J. Exp. Med., 159, 679-690 (1984)]. Az irodalomban számos beszámolót találhatunk a HPP-CFC mérések során aktivitást mutató faktorokról. Az említett faktorok eredetét az 1. táblázatban mutatjuk be. A legjobban jellemzett faktorokat az alábbiakban ismertetjük.

Szinergista faktornak (SF) a kondicionált lépet tartalmazó tápközegben található egyik aktivitással rendelkező anyagot nevezzük. Számos humán szövet, valamint humán és egér eredetű sejtvonal termel SF-t, melyre mint SF-l-re hivatkozunk, ami a korai HPP-CFC-t stimuláló CSF-1-gyel szinergizál. SF-1-ről humán lépsejtekkel, humán placentasejtekkel, 5637 sejtekkel (egy hólyagkarcinóma-sejtvonal) és EMT-6 sejtekkel (egér-emlőkarcinómasejtvonal) kondicionált tápközegekben számoltak be. Az SF-1 azonosításának módszere már ismert. A beszámolók eleinte átfedést mutattak az interleukin-1 és az 5637 sejtvonal SF-1-aktivitása között [Zsebo és társai, Blood, 71, 962-968 (1988)]. Ezzel szemben a jelenlegi beszámolók szerint az interleukin-1 (IL-1) plusz a CSF-1 nem képes ugyanazt a telepképzést stimulálni, ami CSF-1 plusz 5637 sejtekkel kondicionált közegű, részlegesen tisztított tenyészetben érhető el [McNiece, Blood, 73, 919 (1988)].

A vemhes egerek uterus extraktumában jelen levő szinergista faktor a CSF-1. Az IL-3-mal azonosnak tűnő szinergista faktort a WEHI-3 sejtek (szarvasmarha mielomonotikus leukémia-sejtvonal) termelik. Mind az IL-3, mind a CSF-1 az SF-1-nél sokkal érettebb hematopoietikus ősöket stimulálják.

A szinergista faktorok másik osztálya a TC-1 sejtek (csontvelőből származó sztrómasejtek) kondicionált közegében van jelen. Ez a sejtvonal azt a faktort termeli, amely mind a korai mieloid, mind a limfoid sejttípusokat stimulálja. Ezt hematopoietikus növekedési faktornak (HLGF-1) nevezték el. Látszólagos molekulatömege 120 000 [McNiece, Exp. Hematol., 16, 383 (1988)].

A jól ismert interleukinokat, a CSF-eket, IL-l-et, IL-3-at és CSF-l-et a HPP-CFC mérések során mint aktivitással rendelkező faktorokat azonosították. A szerkezetileg még nem azonosított szinergista aktivitások forrásait az 1. táblázat említi. A polipeptidszekvenciákra és a biológiai aktivitási profilokra alapozva a jelen találmány az IL-1-től, az IL-3-tól és az SF-1-től eltérő molekulára vonatkozik.

1. táblázat

A HPP-CFC mérések során mint aktív faktorokat tartalmazó készítmények

Forrás1	Referencia
humán lép CM	[Kriegler, Blood, 60, 503 (1982)]
egérlép CM	[Bradley, Exp. Hematol. Today Baum, ed., 285 (1980)]

HU 220 234 Β

1. táblázat (folytatás)

Fonás1	Referencia
patkánylép CM	[Bradley, fent (1980)]
egértüdő CM	[Bradley, fent (1980)]
humán placenta CM	[Kriegler, fent (1980)]
vemhes-egér-uterusz	[Bradley, fent (1980)]
GTC-C CM	[Bradley, fent (1980)]
RH3CM	[Bradley, fent (1980)]
RHAPBL	[Bradley, fent (1980)]
WEHI-3B CM	[McNiece, Cell Bioi. Int. Rep., 6, 243 (1982)]
EMT-6 CM	[McNiece, Exp. Hematol., 15, 854 (1987)]
L-sejt CM	[Kriegler, Exp. Hematol., 12, 844 (1984)]
5637 CM	[Stanley, Cell, 45, 667 (1986)]
TC-1 CM	[Song, Blood, 66, 273 (1985)]

¹ CM=Conditioncd Media=kondicionált közeg.

Parenterális kezelés esetén a fehérjék gyorsan kiürülnek a keringésből, így viszonylag rövid életű farmakológiái aktivitást mutatnak. Ennek következtében a bioaktív fehérjék viszonylag nagy adagjának rendszeres injekciózása szükséges a terápia hatékonyságának fenntartásához. A fehérjéket vízoldható polimerekhez, például polietilénglikolhoz, polietilénglikol és polipropilénglikol kopolimerekhez, karboxi-metil-cellulózhoz, dextránhoz, poli(vinil-alkohol)-hoz, poli(viml-pirrolidin)-hez vagy poliprolinhoz kovalens kötéssel rögzítve módosíthatjuk, így a megfelelő nem módosított fehérjékhez képest alapvetően hosszabb féléletidőt mutatnak a vérben az intravénás injekció után [Abuchowski és társai, „Enzymes as Drugs”; Holcenberg és társai, eds. WileyInterscience, New York, N. Y., 367-383 (1981); Newmark és társai, J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982); és Katre és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 1487-1491 (1987)]. Az ilyen módosítások fokozzák a fehérjék vizes oldatban való oldhatóságát, kizárják az aggregálódást, fokozzák a fehérjék fizikai és kémiai stabilitását, valamint erősen csökkentik a fehérjék immunogenicitását és antigenicitását. Eredményként a kívánt in vivő biológiai aktivitást az ilyen polimer-protein termékek kevésbé rendszeres és kisebb dózisaival érhetjük el, mint a módosítatlan fehérjék esetében.

A protein és a polietilénglikol (PEG) összekapcsolása rendkívül megfelelő, mivel a PEG az emlősökre nézve csak rendkívül kis mértékben toxikus [Carpenter és társai, Toxicol. Appl. Pharmacol., 18, 35-40 (1971)]. így például az Amerikai Egyesült Államokban az adenozin-deamináz és a PEG termékének alkalmazását hagyták jóvá súlyos, összetett humán immunhiányos szindrómák kezelésére. A PEG-gel történő Összekapcsolás másik előnyös tulajdonsága, hogy hatásosan csökkenti a heterológ proteinek immunogenicitását és antigenicitását. így például az említett, humán fehérjékkel létrehozott PEG-termékeket más emlősfajok kezelésére is alkalmazhatjuk, mégpedig anélkül, hogy veszélyes immunválaszt váltanának ki.

A polimerek, például a PEG, könnyen kapcsolódnak a fehérjék egy vagy több aminosavmaradékához, így az amino-terminális aminosav alfa-aminocsoportjához, a lizinoldallánc epszilon-aminocsoportjához, a cisztein-oldallánc szulfhidrilcsoportjához, az aszpartilés a glutamil-oldallánc karboxilcsoportjához, a karboxil-terminális aminosav alfa-karboxilcsoportjához vagy az aszpargin-, szerin- vagy treoningyökhöz kapcsolt aktivált glikoziloldallánc származékaihoz.

A fent említett, fehérjékkel való közvetlen reakcióra a PEG számos aktivált formája alkalmas. A fehérjék aminocsoportjával történő reakció céljára alkalmas PEG-reagensnek a karboxilsavak vagy a karbonátszármazékok aktív észterei alkalmasak, különösképpen azok, amelyekben a gyökcsoportok N-hidroxi-szukcimid-, ρ-nitro-fenil-, imidazol- vagy l-hidroxi-2-nitrobenzén-4-szulfonát-csoport. Hasonlóképpen az amino-, hidrazin- vagy hidrazidcsoportokat tartalmazó PEG-reagensek alkalmasak az aldehidreakcióra, melynek során perjodátos oxidáció megy végbe a fehérjék karbohidrátcsoportjával.

A jelen találmány tárgya olyan faktorok létrehozása, melyek a korai hematopoietikus őssejtek növekedését okozzák.

A találmány összefoglalása

A jelen találmány olyan új faktorokat ad, melyekre az alábbiakban mint „stemsejtfaktorokra” (SCF) hivatkozunk, amelyek az eredeti ősök, például a korai hematopoietikus őssejtek növekedését stimuláló képességgel rendelkeznek. Ezek az SCF-ek tehát képesek a nem hematopoietikus stemsejtek, például az idegstemsejtek és az ősi stemcsírasejtek stimulálására. Ilyen faktorok lehetnek a tisztított, a természetben előforduló stemsejtfaktorok. A találmány tehát olyan, a természetben elő nem forduló polipeptidekre vonatkozik, amelyek a természetben előforduló stemsejtfaktorok aminosavszekvenciájának megfelelő másolatával rendelkeznek és így a természetben előforduló stemsejtfaktorok hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkeznek.

A jelen találmány továbbá olyan DNS-szekvenciákat ad, melyek a prokarióta vagy eukarióta gazdasejtek azon polipeptidtermékeinek expresszióját biztosítják, amelyek a természetben előforduló stemsejtfaktorok aminosavszekvenciájához eléggé hasonló aminosavszekvenciával rendelkeznek, és így a természetben előforduló stemsejtfaktorok hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkeznek. Ilyen DNS-szekvenciák lehetnek:

(a) a 14B., 14C., 15B., 42. és 44. ábrán bemutatott DNS-szekvenciák vagy azok komplementer szála;

(b) az (a) pontban definiált aminosavszekvenciával vagy annak fragmentumaival hibridizálódó DNS-szekvenciák;

(c) azok a DNS-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degeneráltságát figyelembe véve az (a) és (b) pontban definiált DNS-szekvenciákhoz hibridizálódni tudnának.

HU 220 234 Β

A jelen találmány továbbá ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokat ad, valamint ilyen vektorokkal transzformált vagy transzfektált gazdasejteket. A találmány eljárásokat tartalmaz rekombináns technológiával történő SCF előállítására és eljárásokat tartalmaz a rendellenességek kezelésére. Továbbá gyógyszerészeti készítményeket ad, beleértve az SCF-et, és az SCF-hez specifikusan kapcsolódó antitesteket.

A jelen találmány továbbá a stemsejtfaktoroknak az SCF-et tartalmazó anyagból történő kinyerésére alkalmas eljárásra vonatkozik, olyan eljárásra, mely ioncserélő kromatográfián alapuló szeparálásos és/vagy reverz fázisú folyadékkromatográfián alapuló szeparálásos lépésekből áll.

A jelen találmány továbbá olyan biológiailag aktív terméket ad, mely in vivő megnövelt féléletidővel és emlősök esetében fokozott hatékonysággal rendelkezik, ilyenek a vízoldható polimerekhez - például a polietilénglikol vagy a polietilénglikol és polipropilénglikolkopolimerek, ahol az említett polimerek nincsenek szubsztituálva, vagy az egyik végükön alkilcsoporttal vannak szubsztituálva - kovalens kötéssel kapcsolt SCF. Más szempontból nézve a találmány a fenti termék előállításához nyújt eljárást, melynek során az SCF olyan polimerrel reagál, mely legalább egy reaktív terminális csoporttal rendelkezik, és a keletkező termék tisztításához, melynek során a kapott termék megnövelt cirkulációs féléletidővel és fokozott biológiai aktivitással rendelkezik.

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF ioncserélő kromatogramja.

2. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF gélszűréses kromatogramja.

3. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF búzacsíra agglutinin-agaróz kromatogramja (wheat germ agglutinin-agarose chromatogram).

4. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF kationcserélő kromatogramja.

5. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF C4-kromatogramja.

6. ábra Az 5. ábrán látható C4 oszlop frakcióinak sodium-dodecil-szulfátos (SDS) poliakrilamid-gélelektroforézise (PAGE) (SDS-PAGE).

7. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF analitikai C4kromatogramja.

8. ábra A 7. ábrán látható C4 oszlop frakcióinak SDS-PAGE képe.

9. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF és a deglikozilezett emlős-SCF SDS-PAGE képe.

10. ábra Emlős eredetű, tisztított SCF analitikai C4kromatogramja.

11. ábra Emlős eredetű SCF-fehérje szekvenálásának eredményeképpen kapott aminosavszekvencia.

12. ábra

A. patkány eredetű SCF cDNS-ének oligonukleotidjai

B. humán eredetű SCF cDNS-ének oligonukleotidjai

C. univerzális oligonukleotidok.

13. ábra

A. A polimeráz-láncreakció (PCR) rendszere patkány eredetű SCF cDNS-ére kiterjesztve.

B. A polimeráz-láncreakció (PCR) rendszere humán eredetű SCF cDNS-ére kiterjesztve.

14. ábra

A. Patkány genom-DNS szekvenálási terve.

B. Patkány genom-DNS nukleinsavszekvenciája.

C. Patkány SCF-cDNS nukleinsavszekvenciája és patkány SCF-fehéije aminosavszekvenciája.

15. ábra

A. Humán genom-DNS szekvenálási terve.

B. Humán genom-DNS nukleinsavszekvenciája.

C. Humán SCF-cDNS nukleinsavszekvenciája és az SCF-fehérje aminosavszekvenciája.

16. ábra Humán, majom, kutya, egér és patkány eredetű SCF-fehérjék aminosavszekvenciája.

17. ábra Az emlős eredetű V19.8 SCF-sejt expressziós vektorának szerkezete.

18. ábra Az emlős eredetű pDSVE.l CHO sejt expressziós vektorának szerkezete.

19. ábra Az E. coli eredetű pCFM1156 expressziós vektorának szerkezete.

20. ábra

A. Emlős eredetű SCF radioimmunoassay-vizsgálata.

B. Emlős eredetű SCF immunkicsapásos SDS-PAGE képe.

21. ábra Humán eredetű rekombináns SCF Westem-analízise.

22. ábra Patkány eredetű rekombináns SCF Westem-analízise.

23. ábra A COS-1 sejtek által termelt rekombináns, patkány eredetű SCF-nek a csontvelőre gyakorolt hatását ábrázoló sávos diagram.

24. ábra Patkány eredetű rekombináns SCF hatása makrocitás anémiával kezelt „Steef’-egerek esetében.

25. ábra Patkány eredetű rekombináns SCF-fel kezelt „Steef’-egerek fehérvérsejtszáma (WBC, white blood cell count).

26. ábra Patkány eredetű rekombináns SCF-fel kezelt „Steef’-egerek vérlemezkeszáma.

27. ábra Patkány eredetű rekombináns SCF^{1 164} PEG25-tel kezelt „Steef’-egerekben a differenciális WBC-szám.

28. ábra Patkány eredetű rekombináns SCF¹-¹⁶⁴ PEG25-tel kezelt „Steef’-egerekben a limfociták részhalmaza.

29. ábra A normál főemlősök perifériális WBC-számának fokozására alkalmazott humán eredetű rekombináns SCF-szekvenciával történő kezelés hatása.

30. ábra A normál főemlősök hematokrit- és vérlemezkeszámának fokozására alkalmazott humán eredetű rekombináns SCF-szekvenciával történő kezelés hatása.

31. ábra

A. Humán eredetű rekombináns SCF¹“¹⁶⁴-gyel stimulált humán csontvelőtenyészet fényképe.

B. Fénykép a 31 A. ábrán bemutatott tenyészet sejtjeinek Wright-Giemsa-eljárással történt festéséről.

HU 220 234 Β

32. ábra A 33. ábrán bemutatásra kerülő kromatogram S-Sepharose oszlopfrakciójának SDS-PAGEeljárással való vizsgálata

A. redukálószerrel

B. redukálószer nélkül.

33. ábra E. coliból származó humán eredetű rekombináns SCF S-Sepharose oszlopkromatogramja.

34. ábra A 35. ábrán bemutatásra kerülő kromatogram C4 oszlopfrakcióinak SDS-PAGE-eljárással történt vizsgálata

A. redukálószerrel

B. redukálószer nélkül.

35. ábra E. coliból származó humán eredetű rekombináns SCF C4 oszlopkromatogramja.

36. ábra CHO sejtekből származó patkány eredetű rekombináns SCF Q-Sepharose oszlopkromatogramja.

37. ábra CHO sejtekből származó patkány eredetű rekombináns SCF C4 oszlopkromatogramja.

38. ábra A 37. ábrán bemutatásra kerülő kromatogram C4 oszlopfrakcióinak SDS-PAGE-eljárással történt vizsgálata.

39. ábra Tisztított CHO sejtekből származó patkány eredetű rekombináns SCF SDS-PAGE-vizsgálata deglikozilezés előtt és után.

40. ábra

A. Patkány eredetű, pegilezett rekombináns SCF¹-¹⁶⁴ reakcióelegy gélszűréses kromatogramja.

B. Patkány eredetű, nem módosított rekombináns SCF·-¹⁶⁴ gélszűréses kromatogramja.

41. ábra Friss leukémiás magvas vöröstestekhez kötött, jelzett SCF.

42. ábra A HT1080 fibroszarkóma-sejtvonalból kinyert humán eredetű SCF cDNS-ének szekvenciája.

43. ábra Az SCF^1_248-at expresszáló COS-7 sejtek és az SCF¹¹⁶⁴-et expresszáló CHO sejtek autoradiográfiája.

44. ábra Az 5637 hólyagkarcinóma- (bladder carcinoma) sejtvonalból származó humán eredetű SCF cDNS-ének szekvenciája.

45. ábra SCF-kezelés után sugárkezelt egerek fokozott túlélése.

46. ábra A femur 5%-ának csontvelő-transzplantációja és SCF-kezelés után sugárkezelt egerek fokozott túlélése.

47. ábra A femur 0,1-20%-ának csontvelő-transzplantációja és SCF-kezelés után sugárkezelt egerek fokozott túlélése.

A szakmai gyakorlattal rendelkezők számára számos figyelemreméltó szempont és előny található a találmányban az alábbi részletes leírás és ismertetés alapján, mely a találmány jelenleg előnyben részesített megjelenésének gyakorlati alkalmazását mutatja be.

A találmány részletes ismertetése

A jelen találmány új stemsejtfaktorokat és DNSszekvenciákat teljes egészükben vagy részleteiben kódoló SCF-eket szolgáltat. A „stemsejtfaktor”, illetve az „SCF” kifejezés a természetben előforduló SCF-ekre (például természetes, humán eredetű SCF-re), valamint a természetben elő nem forduló polipeptidekre vonatkozik, amelyek a természetben előforduló stemsejtfaktorok aminosavszekvenciájához megfelelő másolatával és glikozilezettségéhez olyan mértékben hasonlóak, hogy a természetben előforduló stemsejtfaktorok hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkeznek. A stemsejtfaktorok azon korai hematopoietikus ősök érését tudják stimulálni, amelyek képesek eritroid, megakarocita-, granulocita-, limfocita- és makrofág sejtekké émi. Az emlősök SCF-kezelése a hematopoietikus sejtek közül mind a mieloid, mind a limfoid ág teljes szaporodását eredményezi [Weissman, Science, 241, 58-62 (1988)]. A „Steel”-egerek [8.B) példa] patkány eredetű rekombináns SCF-fel történő kezelése a granulociták, monociták, limfociták, eritrociták és vérlemezkék szaporodását eredményezi. A normál főemlősök humán eredetű rekombináns SCF-fel történő kezelése a mieloid és a limfoid sejtek szaporádását eredményezi [8. C) példa].

A melanoblasztok, a csírasejtek, a hematopoietikus sejtek, az agy- és a gerincvelő által meghatározott vándorló utak és irányítóhelyek a sejtben az SCF embrionális expresszióját eredményezik.

A korai hematopoietikus ősök az emlősök csontvelőjében 5-fluor-uracillal (5-FU) történő kezelés hatására feldúsulnak. Az 5-FU kemoterápiás anyag, mely szelektíven gyengíti a késői hematopoietikus ősöket. Az SCF a csontvelő 5-FU helyén aktív.

A biológiai aktivitás és az SCF-eloszlás mintája a szövetben SCF-nek az embriogenezisben és a hematopoiezisben mutatott központi szerepét demonstrálja, valamint SCF-nek a különböző stemsejt-elégtelenségek kezelésére való alkalmasságát.

A jelen találmány többek között az alábbi DNSmódszereket nyújtja: olyan kodonok beépítése, amelyek előnyösek nem emlős gazdákban történő expresszióra; restrikciós endonukleáz enzimekkel történő hasítás helyeinek biztosítása; további iniciáló, terminális és intermedier DNS-szekvenciák biztosítása, melyek elősegítik a könnyen expresszálható faktorok létrehozását. A jelen találmány továbbá polipeptidanalógokat kódoló DNS-szekvenciákra és ezek SCF-származékaira vonatkozik, melyek egy vagy több aminosavgyök azonosságában, illetve elhelyezkedésében különböznek a természetben előforduló formáktól (például a deléciós analógok az SCF által meghatározott gyöknél kevesebb aminosavat tartalmaznak; a szubsztitúciós analógok azok, amelyekben egy vagy több gyök meghatározott módon másikkal van helyettesítve; és az addíciós analógok azok, amelyeknél a polipeptidlánc közbülső vagy végső részéhez további aminosavgyököt kapcsolunk), és amelyek a természetben előforduló formák néhány vagy összes tulajdonságával rendelkeznek.

A találmány szerinti új DNS-szekvenciák olyan szekvenciákat tartalmaznak, melyek a prokarióta és eukarióta gazdasejtek expressziója során legalább részben rendelkeznek a természetben előforduló SCF elsődleges szerkezetével és egy vagy több biológiai tulajdonságával. A találmány szerinti DNS-szekvenciák speciálisan az alábbiakat tartalmazzák: (a) a 14B., 14C., 15B., 15C., 42. és 44. ábrán bemutatott DNS-szekvenciákat vagy ezek komplementer szálát; (b) olyan DNS5

HU 220 234 Β szekvenciákat, melyek (a 3. példában bemutatásra kerülő vagy még annál is szigorúbb hibridizációs körülmények mellett) a 14B., 14C., 15B., 15C., 42. és 44. ábrán bemutatott DNS-szekvenciákkal hibridizálódni tudnak; (c) olyan DNS-szekvenciákat, melyek a genetikai kód degenerációját figyelembe véve a 14B., 14C., 15B., 15C., 42. és 44. ábrán bemutatott DNS-szekvenciákkal hibridizálódni tudnának. Speciálisan azokat az (a), (b) és (c) részben jelölt genomikus DNS-szekvenciákat tartalmazza, amelyek az SCF allélikusan változó formáit kódolják és/vagy az SCF-t más emlősfajok által kódolják, valamint az SCF-et, SCF-fragmentumokat és SCFanalógokat kódoló előállított szekvenciákat kódolják. A DNS-szekvenciák a mikrobiális gazdákban a messenger RNS transzkripcióját és transzlációját elősegítő kodonokat tartalmazhatnak. Ilyen szekvenciákat egyszerűen hozhatunk létre Alton és társai eljárása alapján, PCT publikált találmány WO 83/04053.

Más szempont szerint a találmányban bemutatásra kerülő, SCF-aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló DNS-szekvencia értékes információt nyújt az emlősfehérjék eddig szabad rendelkezésre nem álló aminosavszekvenciáiról. A DNS-szekvencia tehát értékes a változatos rekombináns technikák által történő, nagy léptékű SCF-szintézis megvalósításához. Ugyanakkor a találmány szerinti DNS-szekvenciák alkalmazhatók az új és hasznos virális és cirkuláris plazmid-DNS-vektorok, az új és hasznos transzformált és transzfektált prokarióta és eukarióta gazdasejtek előállítására, valamint az új és hasznos - az SCF és termékeinek expressziójára képes - gazdasejtek tenyészetének növekedését fokozó eljárások kialakítására.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák tehát, mint a jelzett minták, megfelelő anyagot biztosítanak az SCF-et és egyéb géneket kódoló humán genomikus DNS-nek, valamint egyéb emlősfajok cDNS-ének és genomikus DNS-ének izolálására. A DNS-szekvenciák felhasználására számos eljárási lehetőség van mind a fehéijeszintézis (például rovarsejtek), mind a humán vagy egyéb emlősfajok génterápiás kezelése során. A találmány szerinti DNS-szekvenciáktól elváljuk, hogy a transzgénikus emlősfajoknál az SCF és az SCF-etermékek mennyiségi termelésének fejlesztéséhez alkalmasak legyenek. Lásd Palmiter és társai, Science, 22, 809-814 (1983).

A jelen találmány a természetben előforduló tisztított és izolált SCF-et (például a természetben előforduló vagy az előállított faktorból tisztítás után kapott anyag, melynek elsődleges, másodlagos és harmadlagos szerkezete és glikozilációja azonos a természetben előforduló anyagéval) és a természetben elő nem forduló polipeptideket biztosítja, amelyek a természetben előforduló stemsejtfaktorok elsődleges szerkezetének megfelelő hasonlósággal és glikozilezettséggel rendelkeznek, és így a természetben előforduló SCF-ek hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkeznek. Ilyen polipeptidek még a származékok és az analógok is.

Az SCF jellemzése előnyösen történhet genomikus vagy cDNS-klónozás által, illetve a gén szintézise során kapott exogén DNS-szekvenciák prokarióta vagy eukarióta gazdában történő (például bakteriális, élesztő, magasabb rendű növényi, rovar és emlős eredetű sejtek tenyészete) expressziója által. A találmány szerint előnyös, ha az SCF „rekombináns SCF”. A tipikus élesztő (például Saccharomyces cerevisiae) vagy prokarióta (például E. coli) gazdasejtek expressziós termékei mentesek a humán fehérjéktől. A gerinces [például nem humán eredetű sejtek (például COS vagy a CHO) vagy madár eredetű sejtek] sejtek expressziós termékei mentesek a humán fehérjékkel való asszociációtól. Az alkalmazott gazdától függően a találmány szerinti polipeptidek emlős vagy egyéb eukarióta eredetű szénhidráttal lehetnek glikozilezve vagy nem glikozilezett formában fordulhatnak elő. A gazdasejteket például Lee és társai eljárása szerint módosíthatjuk, J. Bioi. Chem., 264, 13 848 (1989), melyet itt referenciaként említünk meg. A találmány szerinti polipeptidek iniciáló aminosavként metionint tartalmazhatnak (az 1. pozícióban).

Ráadásul az SCF természetben előforduló allélikus formái mellett a találmány más SCF-etermékeket is tartalmaz, ilyenek például az SCF polipeptidanalógjai. Alton és társai fent említett eljárása szerint (WO 83/04053) könnyen tervezhetünk és gyárthatunk egy vagy több gyök (például szubsztitúciós, terminális vagy közbülső részén addíciós és deléciós) lokalizációjának azonosítása céljából az itt megjelölttől eltérő elsődleges szerkezettel rendelkező polipeptidek mikrobiális expresszióját kódoló géneket. A cDNS és a genomikus gének váltakozó módosítása a jól ismert irányított mutagenezissel könnyen megvalósítható, és így SCF-analógok és származékaik előállítására alkalmazhatók. Ezek a termékek az SCF biológiai tulajdonságai közül legalább eggyel rendelkeznek, de ugyanakkor más tulajdonságaikban különbözhetnek. A találmány termékei lehetnek például azok, melyeket a deléciónál említettünk; vagy azok, melyek a hidrolízissel szemben sokkal stabilabbak (ezáltal hatásuk a természetben előforduló faktorokénál sokkal jellegzetesebb vagy hosszabban tartó); vagy amelyeket delécióval módosítottunk, vagy úgy, hogy egy vagy több lehetőséget biztosítottunk az O-glikoziláció és/vagy N-glikoziláció számára, vagy amelyben egy vagy több ciszteingyököt távolítottunk el vagy helyettesítettünk például alaninvagy szeringyökkel és a mikrobiális rendszerből potenciálisan sokkal könnyebben izolálhatjuk aktív formában; vagy amelyeknek egy vagy több tirozingyökét helyettesítettük fenil-alanin segítségével, és könnyebben vagy kevésbé könnyen célfehérjékhez vagy célfehérjék receptoraihoz kötődnek. A találmány továbbá olyan polipeptidfragmentumokat tartalmaz, melyek legalább részben rendelkeznek az SCF folytonos aminosavszekvenciája vagy másodlagos szerkezete egy részének másolatával, amely fragmentumok az SCF tulajdonságainak (például a receptorkötés) legalább egy részét birtokolják, míg más tulajdonságokat (például a korai hematopoietikus sejtek növekedésének aktivitása) nem. Figyelemreméltó az a tény, hogy a terápiás alkalmazáshoz [lásd Weiland és társai, Blut, 44, 173-175 (1982)] vagy egyéb környezetben történő alkalmazáshoz, például az SCF-antagonisták méréséhez, nem szükséges a találmány szerinti termék aktivitása. A kompetitív ana6

HU 220 234 Β lógok szintén alkalmasak lehetnek például humán leukémiás esetekben, amikor az SCF receptorait a malignáns sejtek túlexpresszálják, amit a leukémiás magvas vörösvértestek SCF-receptorainak túlexpresszálása esetén tapasztalhatunk (13. példa).

A találmány szerinti polipeptidanalógok alkalmazhatóságához kapcsolódva számos beszámolót találhatunk a természetben előforduló proteinekben, glikoproteinekben és nukleoproteinekben fennmaradt aminosavszekvenciák megfelelő másolatával rendelkező peptidek immunológiai tulajdonságairól. A viszonylag kis molekulatömegű polipeptidek szintén hasonló időtartamú és kiterjedésű immunreakciókban vesznek részt, mint a fiziológiásán jelentős fehéijék, például a virális antigének, polipeptidhormonok stb. Ezek a polipeptidek immunreakcióik során az immunológiailag aktív állatokban speciális antitestek képződését váltják ki [Lemer és társai, Cell, 23,309-310 (1981); Ross és társai, Natúré, 294, 654-656 (1981); Walter és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 5197-5200 (1980); Lemer és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3403-3407 (1981); Walter és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 4882-4886 (1981); Wong és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 5322-5326 (1982); Báron és társai, Cell, 28, 395-404 (1982); Dressman és társai, Natúré, 295, 155-160 (1982); és Lemer, Scientific American, 248, 66-74 (1983)]. Lásd tehát Kaiser és társai idevonatkozó beszámolóját [Science, 223, 249-255 (1984)], amely azoknak a szintetikus peptideknek a biológiai és immunológiai tulajdonságaira vonatkozik, melyek a peptidhormonok megfelelő másodlagos szerkezetével rendelkeznek ugyan, de elsődleges szerkezetüket nem birtokolják.

A jelen találmány továbbá a humán cDNS vagy genomikus DNS fehéijekódoló láncával komplementer részei által kódolt polipeptideket tartalmazza, így például a „complementary inverted protein”-eket, amelyeket Tramontano és társai ismertetnek [Nucleic Acid. Rés., 12, 5049-5059 (1984)].

A találmány szerinti polipeptideket az alábbiakban korlátozások nélkül mutatjuk be: SCF¹¹⁴⁸, SCF^1-162, SCF¹-¹⁶⁴, SCF·-¹⁶⁵ és SCF·-'⁸³ a 15C. ábrán; SCF¹¹⁸⁵, SDV^l~¹⁸⁸, SCF¹-¹⁸⁹ és SCF¹-²⁴⁸ a 42. ábrán; és SCF¹-¹⁵⁷, SCF¹¹⁶⁰, SCF*-¹⁶¹ és SCF^1-220 a 44. ábrán.

Az SCF-et általánosan ismert eljárásokkal tisztíthatjuk meg. A jelen találmány az SCF-etartalmú anyagot, például a humán vizeletet vagy szérumot az alábbi lépések segítségével tisztítja meg: az SCF-etartalmú anyagot ioncserélő kromatográfiának vetjük alá (mind anion-, mind kationcserélő kromatográfia); az SCF-etartalmú anyagot reverz fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásnak vetjük alá, beleértve például az immobilizált C4- vagy C6-gyantát; a mintát immobilizált lecitinkromatográfiának vetjük alá, például úgy, hogy az SCF-et immobilizált lecitinhez kapcsoljuk, majd cukor segítségével, ami ennek a kötésnek az inhibitora, eluáljuk. Az 1., 10. és 11. példák leírása alapján részleteiben is világossá fog válni az eljárások kivitelezésének módja. A 2. példában bemutatásra kerülő eljárást

Lau és társai alkalmazták, lásd 4.667.016 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

Az SCF izoformáit alapvető eljárásokkal izolálhatjuk, így például a 421.444 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint, melynek címe „Erythroprotein Isoforms”, bejegyezték 1989. október 13-án, és itt mint referenciát említjük meg.

A találmány továbbá az SCF-eterápia során hasznos, megfelelő hígítókkal, tartósítókkal, szolubilizálókkal, emulzifikálókkal, hatásjavítókkal és/vagy hordozókkal együtt alkalmazott polipeptidtermékek terápiásán hatásos mennyiségeinek gyógyszerészeti készítményeit tartalmazza. A „terápiásán hatásos mennyiség” itt arra a mennyiségre vonatkozik, amely az adott körülmények és diéta mellett megfelelő terápiás hatást biztosít. Ilyen vegyületek folyékony, liofilezett vagy szárított készítmények lehetnek, melyek különféle hígított puffereket (például Tris-HCl-, acetát- vagy foszfátpuffer), pHés ionerősség-beállító adalékanyagokat, így a felületi adszorpció megakadályozása céljából albumint vagy zselatint, detergenseket (például Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, epesavsók), szolubilizálószereket (például glicerol, polietilénglikol), antioxidánsokat (például aszkorbinsav, nátrium-meta-biszulfit), tartósítószereket (például Thimerosal, benzil-alkohol, parabének), térfogatnövelő és tónusmódosító anyagokat (például laktóz, mannitol), a fehérjéhez kovalensen kapcsolódó polimereket, például polietilénglikolt (részletesen alább, a 12. példában ismertetjük), fémionokkal komplexeket képző anyagokat vagy polimer vegyületeket tartalmazó készítményekre vagy készítményekbe vitt anyagokat, például polilaktonsavat, poliglikolsavat, hidrogéleket stb. vagy lipozimekbe, mikroemulziókba, micellákba, unilamelláris vagy multilamelláris vezikulumokba, eritrocitákba vagy szferoplasztokba vitt anyagokat tartalmazhatnak. Ezek a vegyületek az oldhatóságot, a stabilitást, az in vivő kibocsátás arányát és az SCF in vivő clearence rátáját befolyásolják. Az, hogy mely anyagokat választjuk ki, az SCF-aktivitással rendelkező fehérje fizikai és kémiai tulajdonságaitól fiigg. Az ellenőrzött és eltartott készítmények kibocsátása lipofil raktárakból történik (például zsírsavak, viaszok, olajak). A találmány tehát polimerekkel bevont (például poloxamerek, poloxaminok) készítményeket és szövetspecifikus receptorok, ligandumok vagy antigének ellen irányuló antitestekhez vagy szövetspecifikus receptorok ligandumjaihoz kapcsolt SCF-et tartalmaz. A találmány szerinti vegyületek szemcsés formákban, védőbevonatokban, proteázinhibitorokban vagy a permeációt fokozó anyagokban inkorporálódhatnak, így a kezelés számos úton valósulhat meg, például parenterálisan, pulmonárisan vagy orálisan.

A találmány továbbá egy vagy több további hematopoietikus faktort tartalmazó vegyületet foglal magában, például az EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL— 11, IGF-I vagy LIF (leukémiás inhibitor faktor).

A találmány szerinti polipeptideket kimutatható markeranyagokkal (például ¹²⁵I vagy biotinilezés) összekap7

HU 220 234 Β csolva jelölhetjük, így a szilárd szövetekben és a folyékony mintákban, például a vérben vagy a vizeletben, az SCF-et és receptorjait hordozó sejtek detektálhatok és mennyiségük kvantitatívvá tehető.

A biotinilezett SCF immobilizált sztreptavidinnel összekapcsolva az autológ csontvelő-transzplantációk esetében a csontvelő leukémiás magvas vöröstestjeinek megtisztítására alkalmas. A biotinilezett SCF immobilizált sztreptavidinnel összekapcsolva az autológ vagy autogén csontvelő-transzplantációk esetében az autológ vagy autogén stemsejtek feldúsítására alkalmas. Az SCF toxikus konjugátumai, például a ricin [Uhr, Prog. Clin. Bioi. Rés., 288, 403-412 (1988)], a diftériatoxin [Moolten, J. Natl. Con. Inst., 55, 437-477 (1975)] és a radioizotópok a közvetlen antineoplasztikus terápia (lásd 13. példa) és a csontvelő-transzplantáció kondicionáló diétája során alkalmazhatók.

A találmány szerinti nukleinsavtermékek detektálható markerrel jelölve (például radioaktív jelzés vagy biotinnal történő, nem izotopikus jelzés) alkalmazhatók, és hibridizációs folyamatok során a kromoszómatérképen a humán génpozíciók és/vagy az idevonatkozó géncsaládok lokalizálására alkalmazhatók. így tehát mint génmarkerek, alkalmasak a humán SCF gén rendellenességeinek DNS-szintjén történő azonosítására, valamint a szomszédos gének és rendellenességeik azonosításakor. Az SCF az Sl lokuszon helyezkedik el, humán esetben a 12. kromoszómán, szarvasmarha-géntérképen pedig a 10. kromoszómán.

Az SCF önmagában vagy elegyeiben más terápiák esetén is alkalmazható, például a számos hematopoietikus rendellenesség kezelésére. A hematopoietikus rendellenességek kezelése során az SCF további hematopoietikus faktorokkal együtt alkalmazható, például az alábbiakkal: G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL—11, IGF-I vagy LIF.

A stemsejt-rendellenességek egyik csoportjánál toxikus, sugárzási vagy immunológiai károsodások esetén a funkcionális csontvelő tömegének mennyisége csökken, ezek a rendellenességek SCF-fel kezelhetők. Az aplasztikus anémia olyan stemsejt-rendellenesség, melynek során a hematopoietikus szövet zsíros pótlása és pancitopénia lép fel. Az SCF a hematopoietikus sejtburjánzás fokozásával az aplasztikus anémia kezelésére alkalmas (lásd 8. példa). Az aplasztikus anémia tanulmányozása egérmodelleken történt [Jones, Exp. Hematol., 11, 571-580 (1983)]. Az aplasztikus anémia kezelése során sokat ígérő eredményeket kaptunk a citokinnel rokon GM-SCF alkalmazásával [Antin és társai, Blood, 70,129a (1987)]. A paroxizmális nokturnális hemoglobinuria (PNH) defektív vérlemezkék, granulociták és abnormális eritrociták keletkezésével jellemezhető.

SCF-fel számos betegség kezelhető. Ilyenek lehetnek az alábbiak: mielofibrózis, mieloszklerózis, oszteopetrózis, metastatikus karcinóma, akut leukémia, multiple mielóma, Hodgkin-betegség, limfóma, Gaucherbetegség, Niemann-Pick-betegség, Letterer-Siwe-betegség, makacs eritroblasztikus anémia, Di Guglielmoszindróma, vértolulásos lépnagyobbodás, Kala azar, szarkoidózis, primer léppancitopénia, miliáris tuberkolózis, elterjedt gombás betegségek, hiperakut szeptikémia, malária, B₁₂-vitamin- és fólsavhiány, piridoxinhiány, Diámon Blackfan-anémia, hipopigmentációs rendellenességek, piebaldizmia és vitiligo. Az SCF eritroid, megakarocita- és granulocitastimuláló tulajdonságait a 8.B) és 8.C) példák mutatják be.

A nem hematopoietikus sejtek, például az ősi csírasejtek, a melanocitákból származó idegtaréj, a háti gerincvelőből származó komisszurális axonok, a bél kriptasejtjei, a mezonefrikus és metanefrikus vesetubulusok és a szaglószervi bulbusok növekedésének fokozása előnyös lehet azokban az esetekben, amikor a speciális szövetkárosodás ezeken a helyeken történik. Az SCF az idegsejtek növekedési faktora, így az idegi károsodások kezelésére is alkalmas. Az SCF in vitro megtermékenyítést eljárások vagy sterilitási vizsgálatok során is alkalmazható. Továbbá alkalmas még az SCF a sugárzás vagy kemoterápia következtében fellépő bélkárosodások kezelésére.

Ismeretesek SCF-fel, anti-SCF antitestekkel vagy SCF-etoxin konjugátumokkal kezelhető meiloproliferatív rendellenességek, például a policitémia varé, a krónikus mielogén leukémia, a mieloid metaplázia, a primer trombocitémaia és az akut leukémia.

Számos dokumentum bizonyítja a leukémiás sejtek fokozott sejtbuqánzását a hematopoietikus sejtnövekedési faktorok, például G-CSF, GM-CSF és IL-3 hatására [Delvel és társai, Blood, 72, 1944-1949 (1988)]. Mivel számos kemoterápiás drog alkalmazásának sikere attól függ, hogy a neoplasztikus sejtek ciklusa aktívabb, mint a normál sejteké, az SCF-et mint a neoplasztikus sejtek növekedési faktorát önmagában vagy más faktorokkal elegyítve alkalmazhatjuk, és így érzékennyé válnak a kemoterápiás szerek toxikus hatásával szemben. A 13. példa az SCF-receptorok leukémiás magvas vöröstesteken mutatott túlexpresszálódását mutatja be.

A kemoterápiás és besugárzásos diéták következtében fellépő leukocita-mélypont (nadir) megrövidítésére való képesség vizsgálatához számos rekombináns hematopoietikus faktort vizsgáltunk meg. Bár ezek a faktorok ilyen elrendezésben rendkívül megfelelőek, vannak - például sugárzás hatására - károsodott hematopoietikus részek, melyeket a később ható növekedési faktorok optimális hatásának kifejtése előtt újra el kell szaporítani. Az SCF önmagában vagy ezekkel a faktorokkal elegyítve történő alkalmazása megrövidíti vagy kizárja a leukociták és vérlemezkék sugárzás vagy kemoterápia következtében fellépő mélypontját. Továbbá olyan adagok alkalmazását teszi lehetővé, melyek fokozzák az antineoplasztikus vagy sugárzásos diéta hatását.

Az SCF a szingén, allogén vagy autológ csontvelőtranszplantáció során a korai hematopoietikus ősök elterjesztésére alkalmazható. A hematopoietikus növekedési faktorok transzplantáció után történő alkalmazása csökkenti a neutrofilek visszanyerésének idejét [Donahue és társai, Natúré, 321, 872-875 (1986); Welte és

HU 220 234 Β társai, J. Exp. Med., 165, 941-948 (1987)]. A csontvelő-transzplantáció során az alábbi három lehetőség közül választhatunk, önmagában vagy kombinálva: a donort csak SCF-fel vagy annak más hematopoietikus faktorral készült elegyével kezeljük a csontvelő felszívása vagy a perifériális vér leukoforézis előtt, így megnövelhetjük a transzplantáció céljára alkalmas sejtek számát; a csontvelőt úgy kezeljük, hogy a transzplantáció előtt in vitro aktiváljuk, és elterjesztjük a sejteket; végül a transzplantátumot kapó pácienst kezelhetjük úgy, hogy fokozzuk az átültetésre kerülő donorvelő elfogadását.

Az SCF a génterápia hatékonyságának fokozására a hematopoietikus stemsejtek transzfektálására (vagy retrovirális vektorral történő infektálására) alapozva alkalmazható. Az SCF lehetővé teszi a fertőzött korai hematopoietikus őssejtek tenyésztését, mennyiségük megsokszorozását. A tenyészethez csak SCF-et vagy annak IL-6-tal, IL-3-mal, illetve mindkettővel készült elegyét alkalmazhatjuk. A transzfekció után a sejteket a genetikai rendellenességben szenvedő páciens csontvelőjébe visszük [Lim, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 8892-8896 (1989)]. A genetikai rendellenességek kezelésére alkalmas gének lehetnek az adenozin-deamináz, a glikocerebrozidáz, a hemoglobin és a cisztás fibrózis.

Az SCF önmagában vagy más faktorokkal, például IL-7-tel kombinálva alkalmas a szerzett immunhiányos betegség (AIDS) vagy más, súlyos immunhiányos állapotok (severe combined immundeficiency States) (SCID) kezelésére (14. példa). Az SCF-eterápia ilyen alkalmasságát a cirkuláló T-helper (CD4+, OKT4+) limfociták abszolút szintjének fokozása illusztrálja. Ezek a sejtek a humán immunhiányosságot okozó vírus (HÍV) elsődleges celluláris célpontjai, melyek a páciens immunhiányos állapotához vezetnek (AIDS) [Montaigner „Humán T-Cell Leukemia/Lymphoma Vírus”, ed. R. C. Gallo, Cold Spring Harbor, New York, 369-379 (1984)]. Az SCF továbbá a HIV-ellenes AZT nevű drog mieloszupresszív hatásának leküzdésére [Gogu, Life Sciences, 45, No. 4 (1989)] alkalmazható.

Az SCF-fel történő in vivő kezelés a neopláziával (rák) küzdő immunrendszer erősítésére alkalmas. Az immunfunkcióknak az újabban klónozott citokinnel (IL-2) történő közvetlen fokozására mutatnak be egy példát Rosenberg és társai [N. Eng. J. Med., 313, 1485 (1987)].

Az SCF más anyagokkal, például egy vagy több másik hematopoietikus faktorral együtt történő alkalmazása egyidejűleg vagy időben elosztva történhet. Amennyiben kezdetben alkalmazzuk az SCF-et, az a később ható hematopoietikus faktorok, mint például a G-CSF vagy az EPO előtt növeli meg az eredeti populációt. A kezelés intravénás, intraperitoneális szubkután vagy intramuszkuláris lehet.

A jelen találmány továbbá olyan stemsejtfaktorokra vonatkozik, melyek specifikusan kapcsolódnak az antitestekhez. Az alábbiakban bemutatásra kerülő 7. példa poliklonális antitestek előállítását mutatja be. Továbbá bemutat a találmány az SCF-hez specifikusan kapcsolódó monoklonális antitesteket (lásd a 20. példát). Az általános antitestkészítményekkel (poliklonális) szemben, melyek a különböző determinánsok (epitope) ellen irányuló különböző antitestek lehetnek, a monoklonális antitestek az antigének magányos determinánsai ellen irányulnak. A monoklonális antitestek az antigénantitest kötések diagnosztizálása és analitikai mérési eljárásai során a specifitást és a szelektivitást biztosítják, így az SCF semlegesítésére vagy a szérumból való eltávolítására alkalmasak. A monoklonális antitestek alkalmazásának további előnye az, hogy a tenyészetben olyan hibrid sejteket tudnak előállítani, melyek nincsenek más immunglobulinokkal szennyezve. A monoklonális antitestek a tenyésztett hibrid sejtek felülúszójából vagy a hibrid sejtek egerekbe történő intraperitoneális inokulálásának indukálásával állíthatjuk elő. Köhler és Milstein írták le a specifikus antigének ellen irányuló monoklonális antitesteket növelt szinten szekretáló hibrid sejtvonalak hibridóma technikával történő előállítását, mely a későbbiekben széles körben került alkalmazásra [Eur. J. Immunoi., 6, 511-519 (1976)].

Az alábbi példák a találmányt mutatják be a találmány teljes hatáskörének limitálása nélkül.

1. példa

Buffalo-patkánymájsejteket tartalmazó kondicionált közeg stemsejfaktorainak tisztítása és jellemzése

A) In vitro biológiai mérések

1. HPP- CFC mérés

Számos olyan biológiai aktivitást ismerünk, mely mind a természetes patkány eredetű, mind a rekombináns patkány eredetű SCF-nél megtalálható. Ilyen például a korai hematopoietikus sejtekre gyakorolt hatás. Ezt a „High Proliferative Potential Colony Forming Cell” (HPP-CFC) (erőteljes szaporodásra képes tenyészetet képező sejt) [Zsebo és társai, supra (1988)] eljárással mérhetjük. A faktorok korai hematopoietikus sejtekre gyakorolt hatásának meghatározásához a HPP-CFC mérési rendszer egerekből származó csontvelőt használ, 2 nappal az állat 5-fluor-uracillal (5-FU) történő kezelése után. Az 5-FU kemoterápiás anyag, mely elhasználja a késői hematopoietikus progenitorokat, és így lehetővé teszi a korai progenitorok és azoknak a faktoroknak a detektálását, melyek ezekre hatnak. A patkány eredetű SCF-et CSF-1 vagy IL-6 jelenlétében szemiszilárd agarra visszük. Az agar McCoy-féle teljes tápközeget (GIBCO), 20% fetális szarvasmarhaszérumot, 0,3% agart és 2xl0⁵ csontvelősejtet tartalmaz milliliterenként. A McCoy-féle teljes tápközeg az alábbiakból áll: 1 χ McCoy-féle tápközeg 0,1 mM piruváttal kiegészítve, 0,24 χ eszenciális aminosavak, 0,24 χ nem eszenciális aminosavak, 0,027 x nátrium-bikarbonát, 0,24 χ vitaminok, 0,72 mM glutamin, 25 ug/ml L-szerin és 12 ug/ml L-aszparagin. A csontvelősejteket 150 mg/kg 5-FU-val intravénásán injektált Balb/c egerekből nyertük. A femurt az egerekből két nappal az 5-FU-val való kezelés után gyűjtöttük össze, és a csontvelőt átöblítettük. A vörösvérsejteket a kezelés előtt vörösvérsejt-lizáló reagenssel (Becton Dickerson) lizáltuk. A vizsgálandó anyagot a fenti közegből 30 ml-t tartalmazó edényekbe helyez9

HU 220 234 Β tűk. 14 nap után megszámoltuk a sejtek ezreit tartalmazó kolóniákat (>1 mm átmérő). A mérés során mindvégig természetes emlőssejt eredetű patkány SCF-et alkalmaztunk.

A jellegzetes mérési eljárás során a patkány eredetű SCF megközelítőleg 50 HPP-CFC per 200 000 kihelyezett sejt szaporádását eredményezte. A patkány eredetű SCF az 5-FU-val kezelt egér eredetű csontvelősejtekre nézve szinergista aktivitással rendelkezik; egyetlen faktor jelenlétében nem alakulnak ki a HPP-CFC-tenyészetek, de SCF és CSF-1 vagy SCF és IL-6 együttes alkalmazásakor a mérés rendkívül aktív.

2. MC/9 mérés

A biológiai aktivitás másik fontos jellemzője, mely mind a természetes patkány eredetű, mind a rekombináns patkány eredetű SCF-nél megtalálható az a képesség, mellyel az IL-4-függő szarvasmarha-mastsejtvonal (mást cell=hízósejt) az MC/9 (ATCC CRL 8306) burjánzását okozza. Az MC/9 sejteket az ATCC CRL 8306 leírás alapján, IL-4-forrásból tenyésztettük. A mérések során RPMI 1640 tápközeget alkalmaztunk 4% fetális szarvasmarhaszérummal, 5χ10⁵ M 2-merkapto-etanollal és 1 χ glutamin-pen-streppel kiegészítve. Az MC/9 sejtek az SCF hatására burjánzásnak indultak anélkül, hogy ehhez más faktorokat igényeltek volna. Ezt a burjánzást úgy mértük, hogy a sejteket először 24 órán keresztül növekedési faktorok nélkül tenyésztettük, majd 96 lyukú lemezekre vittük a vizsgálandó mintával 48 órára úgy, hogy minden lyuk 5000 sejtet tartalmazott, 4 órán keresztül 0,5 uCi ³H-timidinnel (fajlagos aktivitása 20 Ci/mmol) pulzáltuk, az oldatot üvegszálas szűrőn összegyűjtöttük, és ezután megmértük a speciálisan kötött radioaktivitást. Ezt az eljárást a példa C.2, fejezetében alkalmaztuk, az emlőssejt eredetű patkány-SCF-ek ACA 54 gélszűréses tisztítása után. Az SCF a háttérhez képest 4-10-szeres CPM-növekedést okozott.

3. CFU-GM

A zavaró, tenyészetstimuláló faktoroktól (CSF) (Colony Stimulating Factor) mentes, természetes patkány eredetű és rekombináns patkány eredetű SCF hatását előzőleg még fel nem használt egércsontvelőn határoztuk meg. A CFU-GM mérést [Broxmeyer és társai, Exp. Hematol., 5, 87 (1977)] az SCF normál csontvelőre gyakorolt hatásának kiértékelésére alkalmaztuk. Röviden, a vörösvérsejtek lízise után az összes csontvelősejtet a vizsgálandó anyagot tartalmazó szemiszilárd agartenyészetre helyeztük. A 40-nél több csoportot tartalmazó tenyészeteket jelöltük. Az agartenyészeteket üveglemezre öntöttük, kiszárítottuk, és speciális hisztológiás festési eljárás alkalmazásával meghatároztuk a sejtek morfológiáját.

A tisztított, emlős eredetű patkány-SCF a normál egércsontvelőn többszörös hatóerővel rendelkezett és más faktorok iránti igény felmerülése nélkül stimulálta az éretlen sejteket, neutrofileket, makrofágokat, eozinofileket, megakarocitákat tartalmazó tenyészetek növekedését. A 200 000 sejtet tartalmazó lemezen egy 10 napos periódus alatt 100 ilyen tenyészet nőtt. EPO-val elegyítve mind a patkány, mind a humán eredetű rekombináns SCF stimulálja az eritroid sejtek növekedését, lásd 9. példa.

B) A kondicionált tápközeg

Az „American Type Culture Collection”-ból (ATCC CRL 1442) származó Buffalo-patkánymáj (BRL) Buffalo rat liver) 3A sejtjeit az SCF termelése céljából 20 literes perfúziós tenyésztőrendszerben, mikrohordozókon tenyésztettük. A rendszer Biolafite fermentorból állt (Model ICC-20), kivéve a mikrohordozók visszatartására alkalmazott szűrőket és az oxigénnel telítő csövet. A periodikus visszaáramlás meggátlása céljából 75 mikron átmérőjű szűrőhálón tartottuk vissza a mikrohordozót, melyet szelepekkel és számítógéppel vezérelt pumpákkal hoztunk létre. Az egyes hálók mint táplálóközeg vagy mint gyűjtőháló szerepeltek. Ez az oszcilláló folyadékminta biztosította, hogy a hálók ne tömődjenek el. Az oxigénnel való telítést szilikoncsőköteg biztosította (1,5 m hosszú, 0,63 cm átmérőjű és 0,076 mm falvastagságú). A BRL 3 A sejtek tenyésztéséhez Minimál Essential tápközeget (Earle-féle sóval) alkalmaztunk (GIBCO), 2 mM glutaminnal, 3 g/1 glükózzal, triptóz-foszfáttal (2,95 g/1), 5% fetális szarvasmarhaszérummal és 5% fetális borjúszérummal kiegészítve. Az aratóközeg azonos volt, kivéve azt, hogy a szérumot elhagytuk. Az 5 g/1 koncentrációjú Cytodex 2 mikrohordozót (Pharmacia) tartalmazó reaktort 3 χ 10⁹, henger alakú edényben tenyésztett, tripszinezéssel eltávolított BRL 3A sejttel oltottuk be. A sejteket a megtapadás után nyolc napig hagytuk nőni a mikrohordozón. A reaktort a glükózfogyasztás mértékére alapozva perfundáltuk a növekedési közeggel. A glükózkoncentrációt körülbelül 1,5 g/1 értéken tartottuk. A reaktort nyolc nap után a szérum eltávolítása céljából hatszoros térfogatú szérummentes közeggel perfundáltuk (fehéijekoncentráció <50 ug/ml). Ezután, amíg 2 g/1 glükózkoncentráció alá nem esett, szakaszos üzemmódban üzemeltettük. Majd ezután 10 1/nap elárasztás! rátával üzemelt a reaktor. A pH értékét a CO₂ folyadékráta segítségével 6,9+-0,3 értékre állítottuk be. Az oldottoxigén-szintet 20% levegőtelítettség felett tartottuk, szükség esetén kiegészítőnek tiszta oxigént alkalmaztunk. A hőmérséklet értékét 37+-0,5 °C körül tartottuk.

A fenti rendszerben megközelítőleg 336 liter szérummentes, kondicionált közeget állítottunk elő, melyet az emlőssejt eredetű patkány-SCF tisztítása során kiindulási anyagként alkalmaztunk.

C) Tisztítási eljárás

Amennyiben külön nem jelöltük, minden tisztítási lépést 4 °C-on hajtottunk végre.

1. DEAE-cellulóz anioncserélő kromatográfia

A kondicionált közegben szérummentesen növekedett BRL 3A sejteket 0,45 u pórusméretű Sartocapsulesszűrőn (Sartorius) leszűrtük. A tételeket külön-külön (41 1, 27 1, 39 1, 30,2 1, 37,5 1 és 161 1) betöményítettük, diafiltrálásnak/puffercserének és DEAE-cellulóz anioncserélő kromatográfiának vetettük alá, minden egyes tételt hasonló módon kezelve. Ezután elegyítettük a DEAE-cellulóz poolokat és a továbbiakban a példa C.2-5. pontja szerint mint egy tételt dolgoztuk fel. A 41 1-es tétel feldolgozása az alábbi módon történt.

HU 220 234 Β

A leszűrt, kondicionált közeget Millipore Pellicon tangenciális áramlásos ultraszűrő készülék és 10 000 molekulatömegű levágási ponttal rendelkező poliszulfon membránkazetták alkalmazásával megközelítőleg 700 ml-re töményítettük be (1,86 m² teljes membránfelület; a szivattyú megközelítőleg 1095 ml/min értékkel, a szűrés 250-315 ml/min értékkel üzemelt). Az anioncsere előkészítéséhez szükséges diafiltrálás/puffercsere kivitelezése 500 ml során az anyagot 50 mM TrisHCl-puffeirel, pH=7,8, betöményítettük, majd a tangenciális áramlásos ultraszűrő készülék alkalmazásával 500 ml-re töményítettük be, és az eljárást hatszor megismételtük. A diafiltrálás/puffercsere eredményeként végül 7000 ml anyagot kaptunk. A készítményt a DEAEcellulóz anioncserélő oszlopra vittük (5 χ 20,4 cm; Whatman DE-52 gyanta), melyet 50 mM Tris-HCl-pufferrel, pH=7,8, ekvilibráltunk. A minta felvitele után az oszlopot 2050 Tris-HCl-pufferrel mostuk, majd sógradienst (0-300 mM NaCl Tris-HCl-pufferben; teljes térfogat 4 1) alkalmaztunk. 167 ml/h folyadékáram mellett 15 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A kromatogramot az 1. ábrán mutatjuk be. A HPP-CFC-tenyészetek száma a HPP-CFC-mérések során kapott biológiai aktivitásra vonatkozik; az említett frakciókból 100 μΐ-t mértünk meg. A minta felvitele során gyűjtött frakciókat és a mosást az ábra nem jelöli, ezekben a frakciókban nem tapasztaltunk biológiai aktivitást.

A kondicionált közeget tartalmazó tételeket betöményítettük, diafiltrálásnak/puffercserének és anioncserélő kromatográfiának vetettük alá, az eljárások során az egyes tételek viselkedése hasonlónak bizonyult. A tételek fehérjekoncentrációját Bradford eljárásával határoztuk meg [Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)], standardként szarvasmarha-szérumalbumint alkalmaztunk, 30-50 mg/ml közötti tartományban. Az eljárás során felhasznált kondicionált közeg teljes mennyisége 336 1 volt.

2. ACA 54 gélszűréses kromatográfia

A DEAE-cellulóz anioncserélő oszlopon fent ismertetett 6 futtatás során kapott, biológiai aktivitással rendelkező frakciókat (például a 87-114. frakció futását az 1. ábrán mutatjuk be) elegyítettük (teljes térfogat 2900 ml) és Amicon-készülék, valamint YM10 membrán alkalmazásával 74 ml végső térfogatra töményítettük. Az anyagot ACA 54 gélszűrő oszlopra vittük (2. ábra), melyet 50 mM Tris-HCl-lel és 50 mM NaCllel, pH=7,4 ekvilibráltunk. 70 ml/h folyadékáram mellett 14 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az aktív faktorokkal együtt eluálódó inhibitor faktorok következtében az aktivitáscsúcsok (a HPP-CFC-tenyészetek száma) hasítottak voltak; azonban az előző kromatogramra alapozva az aktivitás a fő fehérjecsúccsal együtt eluálódik, és ezért a frakciókat egy poolba gyűjtöttük össze.

3. Búzacsíra agglutinin-agaróz kromatográfia

ACA 54 gélszűrő oszlopra felvitt anyag 70-112.

frakcióit pooloztuk (500 ml). A poolt két részre osztottuk, és mindegyiket búzacsíra agglutinin-agaróz oszlopon (5x24,5 cm; a gyanta eredete: E-Y Laboratories, San Mateo, CA; a búzacsíra agglutinin bizonyos karbohidrát-szerkezeteket jelöl) kromatografáltuk, melyet mM Tris-HCl-lel és 500 mM NaCl-lel, pH=7,4 ekvilibráltunk. A minta felvitele után az oszlopon alkalmazott puffer 2200 ml-ével mostuk az oszlopot, és a megkötött anyagot megközelítőleg a 210. frakcióval kezdve az oszlopon alkalmazott pufferben feloldott 350 mM N-acetil-D-glükóz-amin-oldattal eluáltuk, lásd 3. ábra. 122 ml/h folyadékáram mellett 13,25 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A kromatográfiás futtatások egyikét a

3. ábrán mutatjuk be. A mért frakciók egyes részeit foszfátpufferes sóoldattal szemben dializáltuk; a dializált anyag 5 ml-ét az MC/9 méréshez használtuk fel (cpm-értékek a 3. ábrán) és 10 ml-ét a HPP-CFC méréshez használtuk fel. Láthatjuk, hogy az oszlopon megkötött aktív anyagot N-acetil-D-glükóz-amin-oldattal eluáltuk, míg a szennyező anyag túlnyomó része a minta felvitele és a mosás során áthaladt az oszlopon.

4. S-Sepharose gyorsáramlásos kationcserélő kromatográfia

A búzacsíra agglutinin-agaróz kromatográfia 211-225. frakcióit, melyeket a 3. ábrán mutatunk be, és a második futtatás ekvivalens frakcióit pooloztuk (375 ml) és 25 mM nátrium-formiáttal szemben dializáltuk, pH=4,2. Az alacsony pH hatásidejének minimálisra csökkentése érdekében a dializálást 8 óránál hosszabb időn keresztül végeztük, 5 liter pufferrel szemben, és a 8 óra alatt a puffért négyszer cseréltük. A dializálási periódus végén a minta térfogata 480 ml volt, pH-ja és vezetőképessége közel hasonló volt a dializálópufferéhez. A dialízis során a mintában csapadékot észleltünk. Ezt 30 perces, 22 000 χ g fordulatszámmal végzett centrifugálással eltávolítottuk, és a centrifugált minta felülúszóját S-Sepharose gyorsáramlásos kationcserélő oszlopra vittük (3,3x10,25 cm; gyanta a Pharmaciatól), melyet előzőleg nátrium-formiát-pufferrel ekvilibráltunk. 465 ml/h folyadékáram mellett 14,2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A minta felvitele után az oszlopot 240 ml mennyiségű, az oszlopon alkalmazott pufferrel mostuk, és a megkötött anyagot 0-750 mM NaCl gradienssel eluáltuk (az NaCl-t az oszlopon alkalmazott pufferben oldottuk fel; a gradiens teljes térfogata 2200 ml), megközelítőleg a 45. frakcióval kezdve, lásd 4. ábra. Az elúciós profilt a 4. ábrán mutatjuk be. Az összegyűjtött frakciók pH-ját 200 ul 0,97 M Tris-bázissal állítottuk be 7-7,4 közötti értékre. A 4. ábra cpm-értékei az MC/9 mérés során kapott eredményekre vonatkoznak; a jelölt frakciók részleteit foszfátpufferelt sóoldattal szemben dializáltuk, és a mérés során 20 ul anyagot használtunk fel. A 4. ábrán láthatjuk, hogy az aktív anyag áthaladt az oszlopon, míg a szennyező anyag túlnyomó része az oszlopon megkötődött, majd onnan a sógradiens hatására eluálódott.

5. Kromatográfiás eljárás szilikán megkötött hidrokarbongyanta felhasználásával

Az S-Sepharose oszlop 4-40. frakcióit, melyeket a

4. ábrán mutatunk be, pooloztuk (540 ml). A pool 450 ml mennyiségét ugyanilyen mennyiségű B pufferrel (100 mM ammónium-acetát, pH=6,0:izopropanol=25:75) elegyítettük és 540 ml/h folyadékárammal C4 oszlopra vittük fel (Vydac Proteins C4; 2,4x2 cm), melyet előzőleg A pufferrel (60 mM ammónium-ace11

HU 220 234 Β tát, pH=6,0:izopropanol=62,5:37,5) ekvilibráltunk. A minta felvitele után a folyadékáramot 154 ml/h-ra csökkentettük, és az oszlopot 200 ml A pufferrel mostuk. Ezután lineáris puffergradienst (összes térfogat 140 ml) alkalmaztunk az A pufferből a B felé, és 9,1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az S-Sepharose kromatográfia eredményeként kapott pool egyes részleteit, a C4 oszlop kiindulási anyagát, az átfutott poolt és a mosópoolt megfelelő mennyiségű 1 mg/ml-es törzsoldattal 40 ug/ml szarvasmarha-szérumalbuminba vittük és a biológiai mérés előkészítése céljából foszfátpufferes sóoldattal szemben dializáltuk. Hasonlóképpen a gradiensfrakció 40 μΐ-es aliquot mennyiségeit 16 pg szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó foszfátpufferes sóoldattal elegyítettük, majd ezt a biológiai mérés előkészítése céljából foszfátpufferes sóoldattal szemben dializáltuk. Az így kapott különböző frakciókat ezután az MC/9 eljárással megmértük (a gradiensfrakcióból 6,3 pl aliquotot készítettünk; cpm-értékek az

5. ábrán). A mérési eredmények szerint a visszanyert aktivitás 75%-a az átfutott és a mosófrakciókból származott és 25%-a a gradiensfrakcióból, amint ezt az

5. ábrán is láthatjuk. A különböző frakciókból nyert aliquotok SDS-PAGE-eljárással [Laemli, Natúré, 227, 680-685 (1970)] végzett vizsgálatának eredményeit a

6. ábrán mutatjuk be. A bemutatott gélhez a minta aliquotjait vákuumban megszárítottuk, majd 20 pl, a minta kezelésére alkalmas pufferben (nem redukáló, azaz 2-merkapto-etanol-mentes) feloldottuk és 5 percig főztük, mielőtt felvittük a gélre. Az A és B sáv különkülön az oszlop kiindulási anyagát (75 pl a 880 ml-ből) és az oszlop átfutási anyagát ábrázolja; az ábra bal oldalán látható jelek a jelzett értékeknél 10³-szor nagyobb molekulatömegű markerek migrálóhelyeit (redukált) mutatják, ahol a markerek az alábbiak voltak: foszforiláz b (M_r 97 400), szarvasmarha-szérumalbumin (M_r 66 200), ovalbumin (M_r 42 700), karbonikus anhidráz (M_r 31 000), szójabab-tripszin inhibitor (M_r 21 500) és lizozim (M_r 14 400); a 4-9. sáv a gradiens alkalmazása alatt összegyűjtött megfelelő frakciókat (60 pl a 9,1 miből) ábrázolja. A gélt ezután ezüstfestésnek vetettük alá [Morrisey, Anal. Biochem., 117, 307-310 (1981)]. Az A és B sáv összehasonlításával láthatjuk, hogy a festhető anyag túlnyomó többsége áthaladt az oszlopon. A 4-6. frakcióban levő festett anyag, mely a 31 000 molekulatömegű standard alatt vagy felett helyezkedik el, egybeesik a gradiensfrakcióban detektált biológiai aktivitással (5. ábra), ami biológiailag aktív anyag jelenlétét mutatja. Meg kell jegyeznünk, hogy az anyagot a 4-6. sávban láthatóvá tettük, míg az A és/vagy B sávban nem, mivel előzőleg a teljes térfogat sokkal nagyobb térfogata futott (a 4-6. frakció az összmennyiség 0,66%-a, míg az A és B sáv a 0,0084%-a). Az oszlop 4-6. frakcióját pooloztuk.

Amint ezt már feljebb is említettük, a C4 oszlopon az aktivitásnak durván 75%-át nyertük vissza, amit az 5. ábrán mutatunk be. Az anyagot C4-gyanta alkalmazásával a fenti módszerrel újrakromatografáltuk, azzal a különbséggel, hogy nagyobb oszlopot (14x7,8 cm) használtunk és lassabb folyadékáramot (50-60 ml/h átfutás). Az átfutás során az aktivitásnak durván 50%-át nyertük vissza, az 50%-nyi aktív gradiensfrakciók megjelenése a 6. ábrán bemutatott SDS-PAGE képhez hasonló volt. Az aktív frakciókat pooloztuk (29 ml).

Ezután egy újabb C4 oszlopon, a fent már ismertetett eljárással végeztük el az analitikai vizsgálatot, és a frakciókat minden biológiai mérési eljárással megmértük. Amint az analitikai célokra alkalmazott oszlop frakcióinak a képe mutatja (7. ábra), mind az MC/9, mind a HPP-CFC biológiai aktivitás együtt eluálódott. Az SDS-PAGE-analízis (8. ábra) mindkét mérési eljárás során biológiai aktivitással rendelkező, megközelítőleg M_r 31 000 fehérjét mutatott.

Az S-Sepharose kromatográfiánál kapott második (viszonylag kisebb) aktivitáscsúcsban található aktív anyagot (4. ábra, 62-72. frakció, a sógradiens kezdeti frakciói) tehát C4-kromatográfiával tisztítottuk meg. Ez az SDS-PAGE-analízis során az S-Sepharose kromatográfiánál kapott átfutófrakcióhoz hasonló viselkedést mutatott és N-terminális aminosavszekvenciája is azonos volt [lásd 2.D) példa].

6. A tisztítási eljárás összegzése

A tisztítási eljárás lépéseinek összegzését alább, a

2. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat

Az emlős eredetű SCF tisztítási eljárásnak összegzése

Lépés	Térfogat (ml)	Összes fehéije (mg)5
kondicionált közeg	335 700	13 475
DEAE-cellulóz1	2 900	2 164
ACA-54	550	1 513
Búzacsíra agglutininagaróz2	375	431
S-Sepharose	5404	10
C4-gyanta3	57,3	0,25-0,466

¹ Az adott értekek a szövegben bemutatott 6 tétel összesített értékeit tartalmazzák.

² Amint ezt már a példában feljebb említettük, az S-Sepharose kromatográfiához dialízissel előkészített kicsapott anyagot centriftigálással távolítottuk el. A centrifúgálás után a minta (480 ml) 264 mg összes fehéijét tartalmazott.

³ A C4 oszlop futása során nyert aktív gradiensfrakciók sorban történő elegyítését már ismertettük.

⁴ A következő lépéshez csak 450 ml anyagot használtunk fel (lásd ebben a példában, fent).

⁵ Amennyiben másképp nem jeleztük, Bradford eljárását alkalmaztuk (lásd fent, 1976).

⁶ Az SDS-PAGE-eljárás utáni ezüstfestésre és az aminosavösszetétel elemzésére alapozott kiértékelést a 2. példa K) pontjában ismertetjük.

D) Az SDS-PAGE-eljárás és a glikozidázos kezelés

A nagyobb méretű C4 oszlop futása során kapott poolozott gradiensfrakciók SDS-PAGE-eljárással való vizsgálatának eredményét a 9. ábrán mutatjuk be. Az első C4 oszlop pooljából 60 μΐ-t, a második C4 oszlop

HU 220 234 Β pooljából 40 μΐ-t vittünk fel (2. sáv) a gélre. Ezután a gél sávjait ezüsttel festettük meg. A molekulatömeg-markerek a 6. ábránál ismertetettekkel azonosak voltak. Amint már említettük, a szétszórtan migráló, a 31 000 molekulatömegű marker alatt vagy felett elhelyezkedő anyag biológiailag aktív anyag jelenlétét mutatja; az észlelhető heterogenitás a glikozilezés heterogenitásának következtében nagyobb.

A glikozilezés jellemzésére a tisztított anyagot ¹²⁵Ival jódoztuk, különféle glikozidázokkal kezeltük és (redukáló körülmények mellett) SDS-PAGE-eljárással, valamint autoradiográfiásan elemeztük. Az eredményeket a 9. ábra mutatja be. A 3. és a 9. sáv a ¹²⁵I-vel jelzett, de glikozidázzal nem kezelt anyagot ábrázolja. A 4-8. sáv a ¹²⁵I-vel jelzett, glikozidázzal kezelt anyagot ábrázolja. 4. sáv, neuraminidáz. 5. sáv, neuraminidáz és O-glikanáz.

6. sáv, N-glikanáz. 7. sáv, neuraminidáz és N-glikanáz. 8. sáv, neuraminidáz és O-glikanáz és N-glikanáz. A vizsgálat során 3-[(3-kólamido-propil)-dimetil-ammónio]-2propánszulfonátot (CHAPS), 33 mM 2-merkapto-etanolt és 10 mM Tris-HCl-t, pH=7-7,2, alkalmaztunk 3 órán keresztül 37 °C-on. O-glikanázt 45 milliU/ml mennyiségben alkalmaztunk (Genzyme; endo-alfa-N-acetilgalaktóz-aminidáz). N-glikanázt 10 U/ml mennyiségben alkalmaztunk [Genzyme; peptid: N-glikozidáz F; peptid-N⁴-(N-acetil-béta-glükóz-aminil)-aszparaginamidáz].

A 9. ábrán bemutatotthoz hasonló eredményeket kaptunk a megtisztított, nem jelzett SCF glikozidázos kezelésével, az SDS-PAGE-vizsgálat után a terméket ezüstfestéssel tettük láthatóvá.

Szükség esetén számos kontrollt is inkubáltunk az eljárás során. Ezek az alábbiak voltak: megfelelő pufferben, glikozidáz nélküli inkubálás, annak igazolására, hogy az eredmények a glikozidázkészítmény jelenlétének köszönhetők; glikozilezett fehérével való inkubálás (például glikozilezett rekombináns humán eritropoiltin, mely közismerten a glikozidáz szubsztrátja, annak igazolására, hogy az alkalmazott glikozidáz enzim aktív volt; és glikozidázzal, de szubsztrát jelenléte nélkül való inkubálás, annak igazolására, hogy maguk a glikozidázok nem járultak hozzá, illetve nem sötétítették a láthatóvá tett gélsávokat.

A glikozidázos kezelés tehát endo-béta-N-acetil-glükóz-amidáz-F (endo F; NEN DuPont) és endo-béta-Nacetil-galaktóz-aminidáz-H (endo H; NEN DuPont) alkalmazásával történt, a megfelelő kontrollok jelenlétében. Az endo F kezelés során alkalmazott körülmények: 3 perces főzés 1% (tömeg/térfogat) SDS, 100 mM 2-merkapto-etanol, 100 mM EDTA, 320 mM nátrium-foszfát, pH=6,0, elegyében, majd az anyagot térfogatának háromszorosára hígítottuk Nonidet P-40nel (1,17%, térfogat/térfogat, végső koncentráció), nátrium-foszfáttal (200 mM végső koncentráció) és endo F-fel (7 U/ml, végső koncentráció). Az endo F kezelés során hasonló körülményeket alkalmaztunk, azzal a különbséggel, hogy az SDS koncentrációja 0,5% (tömeg/térfogat) volt, és az endo H-t 1 pg/ml-es koncentrációban alkalmaztuk. Az endo F-fel végzett kezelés eredménye hasonló volt az N-glikanázzal végzett kezelés eredményéhez, ahol az endo H nem gyakorolt hatást a tisztított SCF-re.

A fenti kísérletekből számos következtetést vonhatunk le. Az N-glikanázzal [ami az összes komplex és magas mannóztartalmú N-kötött karbohidrátot eltávolítja (Tarentino és társai, Biochemistry, 24, 4665 -4671) (1985)], az endo F-fel végzett kezelés [ami az N-glikanázhoz hasonló szerepet játszik (Elder és Alexander, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 4540-4544) (1982)], az endo H-val végzett kezelés [ami a magas mannóztartalmú és néhány hibrid típusú N-kötött karbohidrátot eltávolítja (Tarentino és társai, Methods in Enzimology, 50C, 574-580) (1978)], neuraminidázzal (ami a sziálsavgyököket távolítja el) és O-glikanázzal [ami az O-kötött karbohidrátokat távolítja el (Lambin és társai, Biochem. Soc. Trans., 12,599-600) (1984)] végzett kezelés azt mutatja, hogy mind az N-kötött, mind az Okötött karbohidrátok jelen vannak; az N-kötött karbohidrátok túlnyomó része komplex típusú; és az O-kötött résznek legalább a felénél sziálsav van jelen. Az Nkötések lehetséges helyeiről az aminosavszekvencia-adatok nyújtanak információt (lásd 2. példa). Az a tény, mely szerint az N-glikanázzal, endo F-fel és N-glikanáz/neuraminidáz alkalmazásával végzett kezelés át tudja alakítani az SDS-PAGE alapján heterogénnek tűnő anyagot gyorsabban mozgó, homogénebbnek tűnő anyaggá, összefér azzal a következtetéssel, mely szerint minden anyag ugyanaz a polipeptid, melyek heterogenitása a glikozilezés heterogenitásának következménye. Figyelemreméltó az a tény, mely szerint a különböző glikozidázos kezelések során kapott kisebb formák molekulatömege 18 000-20 000 között van az SDS-PAGE-nél alkalmazott molekulatömeg-markerekhez képest.

Az a megerősítés, mely szerint az SDS-PAGE-n 31 000 molekulatömeg körül szétszórtan migráló, biológiai aktivitással rendelkező anyagok mindegyike ugyanazzal a polipeptidalaplánccal rendelkezik, abból adódik, hogy az ezen tartományban (például az elektroforetikus transzfer és a cianogén-bromiddal végzett kezelés után; 2. példa) migráló anyagból származó aminosavszekvencia-adatok megfelelnek annak, ami az olyan izolált génekből származik, amelyek a rekombináns DNS-módszerekkel expresszálva biológiai aktivitással rendelkező anyagot nyújtanak (4. példa).

2. példa

Az emlős eredetű SCF aminosavszekvencia-analízise

A) A tisztított fehérje reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiája (HPLC)

Az 1. példához hasonló eljárással megtisztított, megközelítőleg 5 ug mennyiségű SCF-et (0,117 mg/ml koncentráció) reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának vetettük alá, keskeny átmérőjű C4 oszlopon (Vydac, 300 A átmérő, 2 mmx 15 cm). A fehérjét 97% mozgó fázisú A (0,1% trifluorecetsav)/3% mozgó fázisú B-től (90% acetonitril 0,1% trifluor-ecetsavban) 30% mozgó fázisú A/70% mozgó fázisú B-ig 70 percen keresztül eluáltuk, majd 10 perces 0,2 ml/perc folyadékrátájú izokrata elúció követke13

HU 220 234 Β zett. A puffermentes kromatogram levonása után az SCF egyedül álló szimmetrikus csúcs formájában jelent meg, 70,05 perces retenciós idővel, amint ez a 10. ábrán látható. Az ismertetett körülmények között szennyező feltétjére utaló csúcs nem jelent meg.

B) Az elektroforetikusan szállítottfehérjesávok szekvenálása

Az 1. példához hasonló eljárással megtisztított SCF-et (0,5-1,0 nmol) a következőképpen kezeltük Nglikanázzal, ami specifikusan hasítja fehérjékhez jórészt kovalens kötéssel kapcsolódott Asn-kötött karbohidrátokat [lásd a példa l.D) pontját]. Az 5. ábrán bemutatott C4 oszlop 4-6. frakciójából poolozott anyag 6 ml-ét vákuumban megszárítottuk. Ezután 150 ul 14,25 mM CHAPS-ot, 100 mM 2-merkapto-etanolt és 335 mM nátrium-foszfátot, pH=8,6, adtunk hozzá és 95 percig 37 °C-on inkubáltuk. Ezután 74 mM nátriumfoszfátot és 15 U/ml N-glikanázt, pH=8,6, adtunk hozzá és további 19 órán keresztül inkubáltuk. A mintát

9-18% SDS-poliakrilamid gélen (0,7 mm vastag, 20x20 cm) megfuttattuk. A fehérjesávokat a gélről elektroforetikusan poli(vinil-fluorid)-ra vittük át (PVDF, Millipore Corp.), 10 mM Caps-puffer (pH = 10,5), 0,5 Amp egyenáram alkalmazásával, 1 óra alatt [Matsudaira, J. Bioi. Chem., 261, 10 035-10 038 (1987)]. Az átvitt fehérjesávokat Coomassie Blue festéssel tettük láthatóvá. A sávokban megközelítőleg 29 000-33 000 molekulatömegű és megközelítőleg 26 000 molekulatömegű fehéijék voltak jelen, azaz a deglikozilezés csak részleges volt [az l.D) példára, 9. ábrára hivatkozva]; a korábbi sávok meg nem emésztett anyagot mutatnak be, míg az utóbbiak olyan anyagot, melyből az N-kötött karbohidrátot eltávolítottuk. A sávokat kivágtuk (40% M_r 29 000-33 000 és 80% M_r 26 000 fehérje) és közvetlenül fehérjeszekvenátorra vittük (Applied Biosystems Inc., model 477). A fehéijeszekvencia-analízist a gyártó által forgalmazott programmal végeztük [Hewick és társai, J. Bioi. Chem., 256, 7990-7997 (1981)], és a kibocsátott fenil-tiohidantoinil aminosavakat C₁₈ mikroátmérőjű reverz fázisú HPLC-vel on-line analizáltuk. A sávok a 20-28 szekvenciaciklus jelét nem mutatták, ami azt sugallja, hogy az Edman-kémia szerinti eljárással nem voltak szekvenálhatók. A szekvenálási futások háttérszintje 1-7 pmol-lal, tehát jóval a sávokban jelen levő fehérje mennyisége alatt volt. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a sávokban a fehérje N-terminálisan blokkolt állapotban volt.

C) Az elektroforetikusan szállított fehérjék in situ CNBr-es hasítása és szekvenálása

Annak megerősítésére, hogy a fehérjék valóban blokkolva voltak, a szekvenálóból eltávolítottuk a membránokat [B) pont], és az átitatott sávokat cianogén-bromiddal (CNBr) in situ hasítottuk [CNBr (5%, tömeg/térfogat), 70% hangyasavban, 1 óra, 45 °C], majd megszárítottuk és szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A kapott erős szekvenciajelek a metionil-peptid kötések CNBrrel hasított közbülső fehérjéit mutatták.

A sávok vegyes, azonos szekvenciajeleket adtak, melyeket az első Öt ciklusra az alábbiakban mutatunk be.

A sávok 20 ciklusig hasonló jeleket eredményeztek. A kezdeti hozamok az M_r 26 000 sáv esetében 40-115 pmol között voltak, az M_r 29 000-33 000 sáv esetében 40-150 pmol között voltak. Ezek az értékek összehasonlíthatók a szekvenálóra eredetileg felvitt fehérje moláris mennyiségével. Az eredmények megerősítik azt a megállapítást, mely szerint a fehéijesávok megfelelnek a blokkolt N-terminális véggel rendelkező SCF-nek. Az N-terminális végükön blokkolt fehérjék szekvenciájára vonatkozó információkat adó eljárás az alábbiakból áll: (a) az N-terminus blokkolásának megszüntetése [lásd a D) pontot]; és (b) a fehéijék CNBrrel [lásd az E) pontot], tripszinezéssel [lásd az F) pontot] és Staphylococcyus aureus (V-8 törzs) proteázzal (Glu-C) [lásd a G) pontot] végzett, belső hasítással történő előállítása. A szekvenciaanalízist a blokkolt Nterminális aminosavak eltávolítása vagy a fehérjefragmentumok izolálása után folytathatjuk. A példákat az alábbiakban részletesen ismertetjük.

D) A piroglutaminsav-amino-peptidázzal kezelt BRL stemsejtfaktor szekvenciaanalizise

Az SCF amino-terminális végén jelen levő blokkolt rész kémiai természetét nehéz volt előre megjósolni. A blokkolás az in vitro transzplantáció után [F. Wold, Ann. Rév. Biochem., 50, 738-814 (1981)] vagy az in vitro tisztítás során alakulhatott ki. Legáltalánosabban két transzlációs módosulást figyelhetünk meg. Néhány N-terminális aminosav, például az Alá, Ser stb. acetilezését az N-alfa-acetil-peptidáz katalizálja. Ezt megerősíti az N-terminálisan blokkolt fehéije izolálása és tömegspektrofotometriás analízise. Amennyiben a fehérje amino-terminusa glutamin, a gamma-amid deaminálása fordulhat elő. Gyűrűképzés is előfordulhat, például a gamma-karboxiláton és a szabad amino-terminuson, ennek eredményeképpen piroglutamát keletkezik. A piroglutamát kimutatásához piroglutamát-amino-peptidáz enzimet alkalmazhatunk. Ez az enzim eltávolítja a piroglutamátgyököt és így a második aminosavat hagyja meg szabad aminosav-terminusnak. A szekvenálás során az Edman-kémia alkalmazható.

Az SCF-et (az 1. példa alapján tisztítottuk meg; 400 pmol), 50 mM nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,6; ditiotreitolt és EDTA-t tartalmaz) 1,5 egység borjúmáj piroglutaminsav-amino-peptidázzal (pE-AP) 16 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A reakció után az elegyet közvetlenül felvisszük a fehérjeszekvenátorra. A fő szekvenciát 46 cikluson keresztül lehetett azonosítani. A kezdeti hozam 46%, az ismétlődő hozam 94,2% volt. Az SCF N-terminális szekvenciája, beleértve az N-terminális piroglutaminsavat, az alábbi volt:

HU 220 234 Β pe-AP hasítási hely piroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp20

Ile-Thr-Lys-Leu-Val-Ala-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-Ile-Thr30

Leu-Asn-Tyr-Val-Ala-Gly-Met-AspLeu-Arg-Asp-.....................

xxx a 43. pozíció nem lett meghatározva.

Az eredmények szerint az SCF az N-terminális végén piroglutaminsavat tartalmaz.

E) A CNBr fehérje izolálása és szekvenciaanalizise Az 1. példa alapján tisztított SCF-t (20-28 pg; 15

1,0-1,5 nmol) az 1. példa szerinti eljárással N-glikanázzal kezeltük. Az M_r 26 000 anyag konverziója ebben az esetben már készen volt. A mintát megszárítottuk és CNBr 70%-os oldatával (5%) 18 óra alatt, szoba40

Val-Leu-Pro-Ser-His-xxx-Trphőmérsékleten feltártuk. A feltárt anyagot vízzel felhígítottuk, megszárítottuk, majd 0,1%-os trifluor-ecetsavban újra feloldottuk. A CNBr fehérjéket reverz fázisú HPLC-vel, keskeny átmérőjű C4-oszlopon szeparáltuk, az elúciós körülmények a példa A) pontjában ismertetett körülményeknek feleltek meg. Több fő fehérjefrakciót izoláltunk és szekvenáltunk, az összesített eredményeket az alábbiakban ismertetjük:

Fehérje	Retenciós idő (min)	Szekvencia4
CB-4	15,5	L-P-P---
CB-61	22,1	a) I-T-L-N-Y-V-A-G-(M) b) VA-SD-T-S-D-C-V-L-S---L-G-P-E-K-D-S-R-V- S-V-O-K----
CB-8	28,0	D-V-L-P-S-H-C-W-L R-D-(M)
CB-10	30,1	(a CB-8 szekvenciáját tartalmazza)
CB-152	43,0	E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-L-K-K-P-T-R-(N)-F-T-P-E-E-FF-S-I-F-D3-R S-l-D-A--------
CB-14és CB-16	37,3	mindegyik a CB 15-tel azonos szekvenciát tartalmaz

¹ A 12., 13. és 25. pozíciókban nem mutattuk ki az aminosavakat. A b) fehérjét nem szekvenáltuk végig.

² A CB-15 (N)-t nem mutattuk ki; erre a potenciális N-kötött glikozilációs hely alapján következtethetünk.

³ Nem jelölt helyek, ahol az Asn Asp-vé alakult, az N-kötött cukor N-glikanázos eltávolításával.

⁴ Az egybetűs kódok jelentése: A, Alá; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, lle; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; és Y, Tyr.

F) A BRL stemsejtfaktor triptikus fragmentumának izolálása és szekvenálása

Az 1. példa alapján tisztított SCF-t (20 ug, 150 μΐ 0,1 M ammónium-bikarbonátban) 1 ug tripszinnel 37 °C-on 3,5 óra alatt feltártuk. A feltárt anyagot közvetlenül reverz fázisú keskeny átmérőjű C4 HPLC-oszlopon futtattuk meg, az elúciós körülményeket a példa A) pont45 jában ismertettük. Minden eluált fehéijecsúcs retenciós ideje eltért a fel nem tárt SCF-étől [A) pont]. Az izolált fehérjék szekvenciaanalízisét az alábbiakban ismertetjük;

Fehérje	Retenciós idő (min)	Szekvencia4
T-l	7,1	E-S-L-K-K-P-E-T-R
T-21	28,1	v-s-v-(j-K
T-3	32,4	I-V-D-D-L-V-A-A-M E-E-N A-P-K
T-42	40,0	N-F-T-P-E-E-F-F-S I-F-()-R
T-53	46,4	a) L-V A-N L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N-Y-V-A-GM-D-V-L-P-S-H-C-W-L-R b) S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D-C-V- L-S-(J-(J-L-G-----

HU 220 234 Β

Táblázat (folytatás)

Fehérje	Retenciós idő (min)	Szekvencia4
T-74	72,8	E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-()-R
T-8	73,6	E-S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D-R

¹ A 4. pozícióban levő aminosav nem volt megjelölve.

² A 12. pozícióban levő aminosav nem volt megjelölve.

³ A T-5 fehérjék közül hatban nem azonosítottuk a 20. és a 21. pozícióban levő aminosavakat; ezeket a próbálkozások során mint O-kötött cukorkapcsolódási helyeket jelöltük.

⁴ A 10. pozícióban levő aminosav nem volt megjelölve; erre a potenciális N-kötött glikozilációs hely alapján, mint Asn-re következtethetünk. A 21. pozíciókban nem mutattuk ki az aminosavat.

G) A BRL stemsejtfaktor fehérjék S. aureus Glu-C proteázos hasítás után történő izolálása és szekvenálása

Az 1. példa alapján tisztított SCF-et (20 ug 150 ul 0,1 M ammónium-bikarbonátban) Glu-C proteázos ha- 20 sításnak vetettük alá, a proteáz: szubsztrát arány 1:20 volt. A feltárás 37 °C-on 18 órát tartott. A feltárt anyagot közvetlenül keskeny belső átmérőjű, reverz fázisú C4 HPLC-oszlopon szeparáltuk. Az 5 fő összegyűjtött, szekvenált fehérjefrakciót az alábbiakban mutatjuk be:

Fehérje	Retenciós idő (min)	Szekvencia4
S-l	5,1	N-A-P-K-N-V-K-E
S-2'	27,7	S-R V-S-V-()-K-P-F-M-L P-P-V-A-(A)
S-32	46,3	nem mutattuk ki a szekvenciát
S-53	71,0	S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-F-K- D-F-M-V-A-S-D
S-63	72,6	S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-AF-K-D-F-M-V A-S-D-T-S-D

¹ Az S -2 fehérje 6. pozíciójában levő aminosav nem volt megjelölve; ezt a próbálkozásaink során mint O-kötött cukorkapcsolódási helyet jelöltük. Az S-2 fehérje 16. pozíciójában levő Alá aminosavat alacsony hozammal detektáltuk.

² Az S-2 fehérje az SCF N-terminusáról származó, N-terminálisan blokkolt fehérje lehet.

³ A zárójelekben levő (N) potenciális N-kötött cukorkapcsolódási helyeket jelöl.

H) A BRL stemsejtfaktor BNPS-szkatolos hasítás után történő szekvenciaanalízise 40

Az SCF-et 10 mM ammónium-bikarbonátban vákuumcentrifuga alkalmazásával teljesen megszárítottuk, majd 100 ul jégecetsavban ismét feloldottuk. Az oldathoz 10-20-szoros moláris feleslegben BNPS-szkatolt adtunk, és az elegyet 50 °C-on 60 percig inkubáltuk. Ezután vákuumcentrifuga alkalmazásával ismét teljesen megszárítottuk a reakcióelegyet. A megszárított anyagot 100 pl vízzel, majd 50 μΐ vízzel extraháltuk. Az extraktumokat elegyítettük és a fent ismertetett szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A következő szekvenciát kaptuk:

10

Leu-Arg-Asp-Met-Val-Thr-His-Leu-Ser-Val-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu20

Leu-Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-(Asn)-Tyr30 40

Ser-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Gly-Lys-Ile-Val-Asp---A 28. pozícióban levő aminosav nem volt megjelölve; ezt a próbálkozások során mint Asn-t jelöltük, az N-kötött cukorkapcsolódási helyre alapozva.

I) A BRL stemsejtfaktor C-terminális aminosavjának meghatározása

Az SCF-fehérje aliquot mennyiségein (500 pmol) 10 mM nátrium-acetátra, pH=4,0, cseréltük ki a puffért (végső térfogat 90 ul) és 0,05% (tömeg/térfogat)

Brij-35-öt adtunk hozzá. A fehéije mennyiségi azonosításához 5 μΐ-es aliquot mennyiségeket használtunk fel. A minta 40 μΐ-ét a fenti pufferrel 100 μΐ-re hígítottuk. Karboxi-peptidáz P-t (Penicillium janthinellum) adtunk hozzá, az enzim: szubsztrát arány 1:200 volt. A feltárást 25 °C-on végeztük, és a 0., 15., 30., 60. és 120. percben 20 μΐ-es aliquot mennyiségeket vettünk. A feltárást minden egyes időpontban trifluor-ecetsav

HU 220 234 Β hozzáadásával fejeztük be úgy, hogy a végső koncentráció 5% volt. A mintákat megszárítottuk, és a kibocsátott aminosavat dabzil-klorid (dimetil-amino-azobenzén-szulfonil-klorid) 0,2 M NaHCO₃-al (pH=9,0) készült oldatával 70 °C-on 12 percig derivatizáltuk [Chang és társai, Methods in Enzymol., 90, 41-48 (1983)]. A derivatizált aminosavakat (minden mintából 1-60) keskeny belső átmérőjű reverz fázisú HPLC alkalmazásával, Chang és társai módosított eljárásának alkalmazásával analizáltuk [Techniques in Protein Chemistry, T. Hudgli ed., Acad. Press, NY (1989), pp 305-311]. Az összetétel kvantív értékeit a különböző időpontokban derivatizált aminosavstandarddal (1 pmol) való összehasonlítás eredményeként kaptuk meg. A 0 időpontban glicinszennyezést mutattunk ki. Az alanin volt az egyetlen aminosav, melynek mennyisége az inkubálási idővel nőtt. 2 órás inkubálás után a teljes mérési mennyiségben 25 pmol alanint mutattunk ki, ami ekvivalens 0,66 mól kibocsátott alanin per mól fehérjeértékkel. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a természetes, emlős eredetű SCF-molekula a karboxil-terminusán alanint tartalmaz, ami megegyezik a C-terminális fehérje, az S-L szekvenciaanalízisének, ami Cterminális alanint tartalmaz. Ez a megállapítás megfelel a karboxi-peptidáz P ismert specifitásának [Lu és társai, J. Chromatog., 447,351-364 (1988)]. Például hasítás esetén, amikor Pro-Val szekvencia kerül össze. Az S-2 fehérje szekvenciája S-R-V-S-V-(T)-KP-F-M-L-P-P-V-A-(A), ami az SCF-fehérje Cterminálisára vezethető vissza [lásd a példa J) pontját],

A C-terminális---P-V-A-(A) szekvenciát csak az alaninnál hasítja a proteáz. Az S-2 fehérje aminosavösszetétele 1 Thr, 2 Ser, 3 Pro, 2 Alá, 3 Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys és 1 Arg, vagyis összesen 16 gyök jelenlétét mutatja. A 2 Alá gyök jelenléte azt mutatja, hogy a fehérje C-terminálisán 2 Alá gyök található [lásd a példa G) pontját], így a BRL SCF Alá 164-nél vagy Alá 165-nél végződik.

J) Az SCF szekvenciája

Az (1) ép stemsejtfaktor N-terminális piroglutaminsavjának eltávolítása utáni, (2) a CNBr fehérje, (3) a tripszinfehérje és (4) a Glu-C peptidázfragmentumok szekvenciaanalízis eredményeinek összevetése egy Nterminális és egy C-terminális szekvenciára vezethetők vissza (11. ábra). Az N-terminális szekvencia piroglutaminsavval kezdődik és Met-48-al végződik. A Cterminális szekvencia 84-85 aminosavat tartalmaz (a 82-től a 164/165 pozícióig). A 49-81-es pozíciókat egyes izolált fehérjéknél nem mutattuk ki. Azonban a BRL SCF-nek a példa H) pontjában bemutatott, BNPSszkatollal végzett hasítása után egy nagyobb fehéijeszekvenciát detektáltunk. Ebből az újabb adatból, valamint a patkány eredetű SCF DNS-szekvenciájából (3. példa) meghatározhatjuk a C-terminális és az Nterminális szekvenciákat, és felvázolhatjuk az átfogószekvenciát, melyet all. ábrán mutatunk be. A molekula N-terminális végén piroglutaminsav található, C-terminális végén alanin, amit a piroglutamát amino-peptidázos feltárás és a karboxi-peptidázos feltárás is megerősít.

A szekvenálási adatokból arra következtethetünk, hogy az Asn-72 glikozilezve van; az Asn-109 és az Asn-120 egyes molekulákban glikozilezve van, másokban nincs. Az Asn-65-öt a szekvenciaanalízis során mutathatjuk ki, és amennyiben egyáltalán glikozilezve van, akkor is csak részlegesen. A Ser-142, a Thr-143 és a Thr-155, amint azt a DNS-szekvenálásból megállapíthatjuk, az aminosavszekvenálás során nem mutatható ki, és így az O-kötött karbohidráthelyekhez kapcsolódhat. Ezeket a potenciális karbohidrát kapcsolódási helyeket all. ábrán mutatjuk be; az N-kötött karbohidrátokat határozott, összefüggő, vastagabb betűkkel jelöltük, míg az O-kötött karbohidrátokat vékonyabbakkal.

K) A BRL stemsejtfaktor aminosav-összetételének analízise

A 7. ábrán bemutatott C4 oszlopról lejövő anyagot az aminosavösszetétel-analízishez betöményítettük, és a puffért 50 mM ammónium-bikarbonátra cseréltük ki.

Kétszer 70 μΐ mintát külön-külön, 0,1% fenolt és 0,05% 2-merkapto-etanolt tartalmazó 6 N HCl-ban, 110 °C-on, vákuumban 24 órán keresztül hidrolizáltunk. A hidrolizátumokat megszáritottuk, nátrium-citrátpufferbe helyeztük és ioncserélő kromatográfiás eljárással elemeztük (Beckman Model 6300 aminosavanalizátor). Az eredményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze. 164 aminosav felhasználásával (a fehéijeszekvenálási adatokból) az előre vártnál sokkal jobban sikerült az aminosav-összetétel meghatározása, mint 193 aminosav felhasználásával (ezt a 14C. ábrán, a PCR-ből származó DNS-szekvenálási adatok mutatják).

3. táblázat

Az emlős eredetű SCF kvantitatív aminosav-összetétele

	Aminosav-összetétel mol/mol fehérje1	A gyökök várt mennyisége molekulánként2
Aminosav	1. futás	1. tiltás	(A)	(B)
Asx	24,46	24,26	25	28
Thr	10,37	10,43	11	12
Ser	14,52	14,30	16	24
Glx	11,44	11,37	10	10
Pro	10,90	10,85	9	10
Gly	5,81	6,20	4	5
Alá	8,62	8,35	7/8	8
Cys	-	-	4	5
Val	14,03	13,96	15	15
Met	4,05	3,99	6	7
Ile	8,31	8,33	9	10
Leu	17,02	16,97	16	19
Tyr	2,86	2,84	3	7
Phe	7,96	7,92	8	8
His	2,11	2,11	2	3

HU 220 234 Β

3. táblázat (folytatás)

	Aminosav-összetétel mol/mol fehérje1	A gyökök várt mennyisége molekulánként2
Aminosav	1. futás	1. futás	(A)	(B)
Lys	10,35	11,28	12	14
Trp	-	-	1	1
Arg	4,93	4,99	5	6
összesen	158	158	164/165	193
Számított molekulatömeg:		18 4243

¹ A 158 gyökfehérje szekvenciaanalízisérc alapozva (a Cys-t és Trp-t kizárva).

² A fehérjcszckvcncia- (A) és a DNS-szekvencia-adatokból (B) számított értékek.

³ Az 1 -164 szekvenciára alapozva.

Tehát az aminosavösszetétel-analízis során alkalmazott belső standard tette lehetővé a fehérje kvantitatív mennyiségi meghatározását; a 0,117 mg/ml értéket a vizsgált mintából kaptuk.

3. példa

A patkány és a humán eredetű SCF-gének klónozása

A) A patkány eredetű SCF cDNS-fragmentumainak szekvenálása és amplifikálása

A patkány eredetű SCF-fehérjefragmentumok aminosavszekvenciáinak meghatározása tette lehetővé a patkány eredetű SCF-re specifikus, kevert szekvenciájú nukleotidok megtervezését. Az oligonukleotidokat a patkány-cDNS és genomkönyvtár ellenőrzésére hibridizációs próbaként és a cDNS egyes részeinek polimerázos láncreakciója (PCR) (polymerase chain reaction) történő amplifikációjának megkísérlésével mint primereket alkalmaztuk [Mullis és társai, Methods in Enzymol., 155, 335-350 (1987)]. Az oligonukleotidokat a foszforamidit-eljárás szerint szintetizáltuk [Beaucage és társai, Tetrahedron Lett., 22,1859-1862 (1981); McBride és társai, Tetrahedron Lett., 24, 245-248 (1983)]; szekvenciájukat a 12A. ábrán mutatjuk be. A betűk jelentése: A, adenin; T, timidin; C, citozin; G, guanin; I, mozin. A 12A. ábrán a * restrikciós endonukleáz-felismerő szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidokat jelöl. A szekvenciákat 5’->3’ irányban írtuk.

Patkány-genomkönyvtárt, cDNS-könyvtárt és két BRL cDNA-könyvtárt vizsgáltunk át ³²P-vel jelzett kevert oligonukleotid-próbákkal, 219-21 és 219-22 (12A. ábra) alkalmazásával, melyek szekvenciáját a 2. példában kapott aminosavszekvenciára alapoztuk. Ezekben a kísérletekben a cDNS-klónozás általánosan ismert eljárása során nem izoláltunk SCF-klónokat [Maniatis és társai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 212-246 (1982)].

Az SCF nukleinsavszekvenciájának izolálása során alternatív lehetőséget nyújt a PCR-eljárás alkalmazása. Az eljárás során a 2 DNS primerrel körülvett DNSterületet - egy alkalmas polimeráz (például a Taql

DNS-polimeráz) hatására deoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében egy hőciklusban katalizált többszörös replikációs ciklus alkalmazásával - in vitro szelektíven amplifikáltuk. A PCR-amplifikáció specifitását két oligonukleotidra alapoztuk, melyek az amplifikált DNS-szegmenst oldalról veszik körül, és azt az ellentétes szálhoz hibridizálják. A komplex elegy fajlagos DNS-ével szemben a PCR kétoldalú specifitással rendelkezik, ami lehetővé teszi az ezen a területen megfelelő specifikus szekvenciával rendelkező két primer alkalmazását. Az egyoldalú specifitással rendelkező PCR egy területspecifikus prímért és egy másik prímért alkalmaz, ami a specifikus elegyben levő néhány vagy összes DNS-molekulát a célhelyre tudja irányítani [Loh és társai, Science, 217-220 (1989)].

A PCR sikeres amplifikációjának DNS-terméke a DNS-szekvenciára vonatkozó információk forrása [Gyllenstein, Biotechniques, 7, 700-708 (1989)] és jelzett hibridizációs próbákhoz használhatjuk fel, melyek hosszabbak és specifikusabbak, mint az oligonukleotid-próbák. így tehát megfelelő primer szekvenciákkal rendelkező PCR-termékeket tervezhetünk és klónozhatunk a plazmidvektorokba, melyek a kódolt fehérjék expresszióját teszik lehetővé.

A patkány eredetű SCF cDNS-szekvenciájának meghatározását a 13A. ábrán mutatjuk be. A kis nyilak a PCR-amplifikációt jelölik, míg a vastag nyilak a DNSszekvenálási reakciót. A DNS-szekvenciához kapcsolódott 90,6 és a 96,2 PCR-eket a patkány eredetű SCF-cDNS nukleinsavszekvenciája meghatározásához alkalmazzuk. A PCR-ekben alkalmazott primerek kevert oligonukleotidok voltak, a 11. ábrán bemutatott aminosavszekvenciára alapozva. A PCR-ek 90,6 és a

96.2 szekvenciájának alkalmazásával különleges primer szekvenciákat (224-27 és 224-28, 12A. ábra) állítottunk elő és alkalmaztunk a következő amplifikációs és szekvenálási reakciók során. A cDNS 5’-végét tartalmazó cDNS-t a 90,3, a 96,6 és a 625,1 PCR-ekben egyoldalú specifitással rendelkező PCR alkalmazásával kaptuk. Az SCF-fehéije C-terminusának közelében levő további aminosavszekvenciákat a PCR 90,4-ben kaptuk. A patkány eredetű SCF-cDNS-t kódoló terület megmaradó DNS-szekvenciáját a 630,1, a 630,2, a 84,1 és a

84.2 PCR-termékekből kaptuk, amint azt a példa C) pontjában bemutatjuk. A patkány eredetű SCF-cDNS-t szolgáltató eljárásokat az alábbiakban ismertetjük.

A BRL sejtekből Okayama és társai eljárása szerint állítottunk elő RNS-t [Methods in Enzymol., 154, 3-28 (1987)]. A poliA+RNS izolálásához Jacobson által bemutatott [Methods in Enzymol., 152, 254-261 (1987)] oligo(dT) cellulózoszlopot alkalmaztunk.

Az első DNS-szálat 1 pg BRL poliA+RNS templát és (dT)|₂_ix primer alkalmazásával, a gyártó útmutatása alapján szintetizáltuk, Mo-MLV reverz transzkriptáz enzimmel. Az RNS-szál degradációját 0,14 M NaOH alkalmazásával hajtottuk végre 84 °C-on, 10 perc alatt vagy forrásban lévő vízfürdőben, 5 perc alatt. Az oldatot feleslegben adagolt ammónium-acetáttal semlegesítettük, és a cDNS-t először fenol/kloroform, majd kloroform/izoamil-alkohol alkalmazásával

HU 220 234 Β extraháltuk és etanollal kicsaptuk. Ahhoz, hogy lehetővé tegyük a PCR-ben az egyoldalú specifitással rendelkező, oligo(dC)-re vonatkozó primerek alkalmazását, a borjútimusz terminális transzferázával (Boehringer Mannheim) egy poli(dG) véget adtunk az egyszálú cDNS aliquot mennyiségének 3'-terminusához, a leírtak szerint [Deng és társai, Methods in Enzymol., 100, 96-103 (1983)].

Amennyiben másképp nem jeleztük, a PCR denaturálása során minden lépést 94 °C-on, 1 percig végeztünk; az elongáció 72 °C-on, 4 percig tartott. A hőkezelés hőmérséklete és időtartama PCR-ről PCR-re változott, gyakran mutatva átmenetet a különböző típusú, párhuzamosan kivitelezett PCR-ek igényeire alapozva. Amennyiben a primer termékek felhalmozódásának csökkentésére a primer termék koncentrációját lecsökkentettük [Watson, Amplifícations, 2, 56 (1989)], hosszabb hőkezelési időt tapasztaltunk; amennyiben a PCR termékének koncentrációja nagy volt, a hozam növelése céljából rövidebb hőkezelési időt és nagyobb primer koncentrációt alkalmaztunk. A hőkezelés hőmérsékletének meghatározásakor a fő tényező a célprimer képződésének T_d-értéke volt [Suggs és társai, Developmental Biology Using Purified Genes, eds. Brown, D. D. és Fox, C. F. (Academic, New York), pp. 683-693 (1981)]. Az amplifikáció során alkalmazott enzimeket az alábbi három gyártócég valamelyikétől szereztük be: Stratagene, Promega és Perkin Elmer Cetus. A vegyületeket a gyártó cég útmutatásának megfelelően alkalmaztuk. Az amplifikáció kivitelezése vagy Coy Tempcycle vagy Perkin Elmer Cetus DNS-szekvenátorban történt.

Az SCF cDNS-ének amplifikációját általában agaróz-gélelektroforézissel mértük etidium-bromid jelenlétében, és a DNS-sávokat UV-sugárzás stimulálásával, fluoreszcenciás eljárással tettük láthatóvá. Azokban az esetekben, amikor kis fragmentumokra számítottunk, a PCR termékeit poliakrilamid-gélelektroforézissel vizsgáltuk. Annak megerősítésére, hogy a megfigyelt sávok SCF-cDNS-fragmentumokat képviseltek, a következő amplifikáció során a megfelelő DNS-sávot egy vagy több belsőleg illesztett primerrel figyeltük. A végső megerősítés a PCR-termék didzeoxiszekvenálásának [Sanger és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)] és az SCF-fehérje-szekvencia-információ transzlációs termékének összehasonlításával történt.

A kezdeti PCR-kísérletek során az SCF-fehérje szekvenciájára alapozva oligonukleotidokat alkalmaztunk [Gould, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 1934-1938 (1989)]. Az alábbi leírások a patkány eredetű cDNS (-25)-162 aminosavját kódoló DNS-szekvenciát adó PCR-amplifikációkat mutatják be.

A PCR 90,6 esetén BRL-cDNS-t amplifikáltunk 4 pmol 222-11-gyel és 223-6-tal, 20 μΐ-es reakció-térfogatban. A PCR 90,6 termék aliquot mennyiségét agaróz-gélelektroforézisnek vetettük alá, melynek eredményeként az előre várt méretű sávot figyeltük meg. A PCR 90,6 termékének 1 μιηοΐ-ját tovább amplifikáltuk, 20 pmol 222-11-gyel és 223-6-tal, 50 μΐ-es reakció-térfogatban, 15 ciklusban, 45 °C-os hőkezeléssel.

Ezután a termékek egy részét 222-11 és 219-25 primerek jelenlétében (PCR 96,2) 25 amplifikációs ciklusnak vetettük alá, melyek eredményeként az agaróz-gélelektroforézisnél egy egyedülálló fő terméksávot kaptunk. A PCR 96,2 ugyanezen termékének ugyanezzel a két príménél történő amplifikációja eredményeként templát keletkezett, melyet sikeresen szekvenáltunk. A 96,2 termékben levő SCF-faktor további szelektív amplifikációját a PCR-terméknek 222-11 és illesztett 219-21 primer jelenlétében történt amplifikációjával hajtottuk végre. Ennek a PCR-nek a termékét az aszimmetrikus amplifikáció és a radioaktívan jelzett próba előállításánál alkalmaztuk (PCR2).

A patkány eredetű SCF-cDNS 5’-végének izolálásakor a (dC)_n szekvenciát tartalmazó prímért, mely a cDNS poli(dG) végével komplementer, mint specifikus prímért alkalmaztuk. A (dC)₁₂-t (10 pmol) tartalmazó PCR 90,3 mint primer és a BRL-cDNS mint templát szerepelt. A reakció terméke rendkívül nagy molekulatömegű aggregátum formájában jelent meg és az agaróz-gélelektroforézis során a felviteli hely közelében maradt. A termék elegyének 1 μΐ-ét tovább amplifikáltuk, 25 pmol (dC)₁₂ és 10 pmol 223-6 alkalmazásával, 25 μΐ-es reakció-térfogatban, 15 ciklusban, 45 °C-os hőkezeléssel. Ezután a termék 1,5 μΐ-ét tovább amplifikáltuk 25 ciklusban, belsőleg illesztett 219-25 és 201-7 templátok alkalmazásával (PCR 96,6). A 201-7 szekvenciáját a 12C. ábrán mutatjuk be. Az agaróz-gélelektroforézis során nem tapasztaltunk megfigyelhető sávokat. A PCR másik 25 ciklusát 40 °C-os hőkezelés mellett hajtottuk végre, mely után egy szembetűnő sávot figyelhettünk meg. A „Southem-blotting”-eljárás eredményeként egyedül álló, szembetűnő sávot kaptunk. A PCR további 20 ciklusát 45 °C-os hőkezelés mellett hajtottuk végre 201 -7 és illesztett 224-27 primer alkalmazásával. A PCR aszimmetrikus amplifikációja után végrehajtott szekvenálás olyan szekvenciát eredményezett, mely a pre-SCF-et kódoló szekvencia feltételezett fehérjeszignálja igazinak vélt amino-terminusa mellett folytatódott. Ezt a szekvenciát a patkány eredetű SCF-cDNS-ét kódoló terület 5’-végét tartalmazó 227-29 oligonukleotid primer tervezésénél alkalmaztuk. Hasonlóan a 162 aminosav befejező 3’ DNS-szekvenciáját a PCR 90,4 szekvenálása eredményeként kaptuk meg (lásd a 13A. ábrát).

B) A patkány eredetű stemsejtfaktor genomikus cDNS-ének klónozása

A patkány eredetű SCF-cDNS PCR-amplifikációjának - melyet a példa A) pontjában, fent ismertettünk - vizsgálatát patkány genomikus könyvtár ellenőrzésére alkalmaztuk (beszerzési forrás a CLONTECH Laboratories, Inc.; katalógusszám RL1022 j). A könyvtárt lambda-vektor EMBL-3 SP6/T7 bakteriofágban hoztuk létre, felnőtt, hímnemű Sprague-Dawley patkányokból származó DNS alkalmazásával. A könyvtár a szállító jellemzése szerint átlagosan 16 kb méretű, beillesztett, 2,3 χ 10⁶ független kiónt tartalmaz.

A ³²P-vel jelzett próbák létrehozásához PCR-eket alkalmaztunk a genomkönyvtár ellenőrzése során. A PCR1 próbát (13A. ábra) az alábbi anyagok jelenlété19

HU 220 234 Β ben hajtottuk végre: 16 μΜ ³²P[alfa]-dATP, 200 μΜ dCTP, 200 μΜ dGTP, 200 μΜ dTTP, Perkin Elmer Cetus-féle reakciópufferrel, 0,05 U/ml Taq-polimeráz (Perkin Elmer Cetus), 0,5 μΜ 219-26, 0,05 μΜ 223-6 és 1 μΐ 90,1 templát, mely a két primer számára szükséges két célhelyet tartalmazta. A PCR2 próba során hasonló körülményeket alkalmaztunk, azzal a különbséggel, hogy a primereket és a templátokat megváltoztattuk. A PCR2 próba során 0,5 μΜ 222-11, 0,05 μΜ 219-21 és 1 μΐ 96,2 templátot alkalmaztunk.

Maniatis és társai eljárása szerint [fent (1982)] megközelítőleg 10⁶ bakteriofágot helyeztünk el a lemezen. A plakkokat a gyártó leírása szerint denaturált, neutralizált és szárított GeneScreen Plus™ szűrőre (22 χ 22 cm; NEN DuPont) vittük. Minden lemezről két átvitelt hajtottunk végre.

A szűrőket előzőleg 1 M HC1, 1% SDS, 0,1% szarvasmarha-szérumalbumin, 0,1% ficoll, 0,1% poli(vinil-pirrolidon) (hibridizációs oldat) alkalmazásával megközelítőleg 16 órán keresztül, 65 °C-on hibridizáltuk, majd -20 °C-on tároltuk. A szűrőket ³²P-vel jelzett PCR1 próbát tartalmazó, 1,2 χ 10⁵ cpm/ml friss hibridizációs oldatba helyeztük és 14 órán keresztül 65 °C-on hibridizáltuk. Ezután a szűrőket 0,9 M NaCl, 0,09 M nátrium-citrát, 0,1% SDS, pH=7,2, elegyével (mosóoldat) két órán keresztül szobahőmérsékleten mostuk, majd friss mosóoldattal további 30 percig, 65 °C-on. A bakteriofág kiónokat az autoradiogramok radioaktív foltjainak megfelelő helyekről a lemezekről eltávolítottuk, és PCR1, valamint PCR2 próbával újra ellenőriztük azokat.

A pozitív kiónokat tartalmazó DNS-eket BamHI, Sphl vagy SstI restrikciós endonukleázokkal feltártuk, és a kapott fragmentumokat pUl 19-be klónoztuk, majd szekvenáltuk. A 14A. ábrán a genomikus, patkány eredetű SCF-cDNS-szekvenciájának sematikus tervét mutatjuk be. Az ábra tetején levő vonalak az SCF-et kódoló, patkány eredetű genomikus DNS-t ábrázolják. Az üres helyek a nem szekvenált területeket jelölik. A nagy boxok az SCF gént kódoló területek exonjait jelölik, a megfelelő kódolt aminosavakat a boxok felett jelöltük. A nyilak azokat a jellegzetes, szekvenált területeket jelölik, melyek a patkány eredetű SCF-gén konszenzus szerinti szekvenciáját tartalmazzák. A patkány eredetű SCF-gén szekvenciáját a 14B. ábrán mutatjuk be.

A patkány genomkönyvtár PCR1 próbával való ellenőrzése során az SCF 19-176 aminosavját kódoló exonoknak megfelelő kiónokat izoláltuk. Ahhoz, hogy megkapjuk a 19 aminosavat kódoló régió exonjainak ellentétesen haladó kiónjait, a könyvtár ellenőrzésére 228-30 oligonukleotidokat alkalmaztunk. Ugyanezt a szűrőkészletet alkalmaztuk előzőleg a PCR1 próba során, az előhibridizálás is úgy történt, mint előzőleg, és a hibridizálást ³²P-vel jelzett 228-30 oligonukleotidokat (0,03 picomol/ml) tartalmazó hibridizáló oldatban, 50 °C-on, 16 óra alatt hajtottuk végre. A szűrőket a mosóoldattal szobahőmérsékleten 30 percig mostuk, majd friss mosóoldattal 45 °C-on 15 percig. Az autoradiogramon a radioaktív foltoknak megfelelő területekről eltávolítottuk a bakteriofág kiónokat, és a 228-30 próbával újra ellenőriztük azokat. A pozitív klónokból a

DNS-eket restrikciós endonukleázokkal feltártuk és az előbbi eljárással újraklónoztuk. A 228-30 próba alkalmazásával megkaptuk a -20 és 18 közötti aminosavakat kódoló exonok megfelelő kiónjait.

Számos kísérletet hajtottunk végre ahhoz, hogy izoláljuk a nem átíródó 5'-területeket és a -25 és a -21 közötti aminosavakat kódoló területet. De ezen a területen nem sikerült a patkány eredetű SCF-gén kiónjait izolálni.

C) Patkány eredetű SCF klónozása emlőssejtekbe történő expresszió céljából

Emlőssejt expressziós rendszert terveztünk abból a célból, hogy kiderítsük, expresszálható-e a patkány eredetű SCF aktív polipeptidterméke és szekretálható-e emlőssejtek által. Az expressziós rendszert a patkány eredetű SCF (SCF^{1 162} és SCF*-¹⁶⁴) deléciós változatainak expressziója, valamint egy olyan fehérje (SCF^1-193) expressziója céljából terveztük, melyet a 14C. ábra génszekvenciájának transzlációja során vártunk.

A tanulmány során alkalmazott expressziós vektor pUC119, SV40 és HTLVI szekvenciákat tartalmazó ingázóvektor (shuttle vector) volt. A tervezett vektor mind az E. coli, mind az emlőssejtek autonóm replikációját, valamint a virális DNS-szekvencia kontrollja alatt beillesztett exogén DNS-expresszióját lehetővé tette. A vektor jelölése V19.8 volt, az E. coli DH5 fogadta be és az alábbi gyűjteményben van elhelyezve: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. (ATCC# 68124). A vektor a pSVDM19 származéka, leírása: Souza, 4.810.643 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, melyet itt referenciaként említünk meg.

A patkány eredetű SCF^1-162 cDNS-t V19.8 vektorba illesztettük. A DNS-szekvenciát a 14C. ábrán mutatjuk be. A beépített cDNS-t a 630.1 és a 630.2 PCR-reakciókban szintetizáltuk, amint az a 13A. ábrán látható. Ezek a PCR-ek független amplifíkációt mutatnak, a reakció során a 227-29 és 227-30 szintetikus oligonukleotid primereket alkalmaztuk. A primerek szekvenciáját a cDNS által alkotott PCR-ből kaptuk, a példa A) pontjában. A reakciót az alábbi körülmények között hajtottuk végre: 50 μΐ reakciótérfogatban 1 xreakciópuffer (Perkin Elmer Cetus-féle készlet), 250 μΜ dATP, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP, 200 μΜ dTTP, 200 ng oligo-(dT) primer cDNS, 2,5 U/ml Taq-polimeráz (Perkin Elmer Cetus), 1 picomol 227-29, 1 picomol 227-30. A PCR2 próba során hasonló körülményeket alkalmaztunk, azzal a különbséggel, hogy a primereket és a templátokat megváltoztattuk. A cDNS-t 10 ciklusban, 94 °C-on, 1 perc alatt amplifikáltuk, a hőkezelés 37 °C-on 2 percig tartott, majd az elongáció 72 °C-on 2 percig. A PCR-amplifikáció ezen kezdeti körei után az egyes reakciókhoz 10 picomol 227-29-et és 10 picomol 227-30-at adtunk. Az amplifikálást további 30 cikluson keresztül ugyanilyen körülmények között folytattuk, azzal az eltéréssel, hogy a hőkezelés hőmérsékletét 55 °C-ra változtattuk. A PCR-termékeket HindlII és SstlI restrikciós endonukleázokkal tártuk fel. A V19.8-at hasonló eljárással, HindlII és SstlI rest20

HU 220 234 Β rikciós endonukleázokkal tártuk fel, és a feltárt plazmidvektort egy esetben borjúbél eredetű alkalikus foszfatázzal kezeltük; vagy egy másik esetben a feltárás során kapott nagyobb fragmentumot agaróz gélelektroforézissel izoláltuk. A cDNS-t T4 polinukleotidligáz alkalmazásával a V19.8-hoz ligáltuk. A ligáció termékét a megfelelő E. coli DH5 törzsbe transzformáltuk [Okayama és társai, fent (1987)]. A jellegzetes bakteriális klónokból származó DNS-eket a Sanger-féle didezoxieljárással szekvenáltuk. A V19.8 SCF szerkezetét a 17. ábrán mutatjuk be. Ezeket a plazmidokat alkalmaztuk a 4. és 5. példában bemutatásra kerülő eljárások során az emlőssejtek megfertőzésére.

A patkány eredetű SCF^1-164 expressziós vektort az SCF¹¹⁶²-höz hasonló eljárással hoztuk létre, melynek során PCR-amplifikációval cDNS-t szintetizáltunk, amit V19.8-ba illesztettünk. Az alkalmazott cDNS-t PCR V19.8 amplifikációjával szintetizáltuk, SCF^1-162 cDNS (V19.8:SCF^1-162) templát, 227-29 primer (a gén 5’végén) vagy 237-19 primer (a gén 3’-végén) alkalmazásával. A párhuzamos reakciók 1 xreakciópuffert 250250 μΜ dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t, 2,5 U/ml Taq-polimerázt, 20 ng V19.8:SCF^1-162-t és 2020 picomol prímért tartalmaztak. A cDNS-t 35 ciklusban, 94 °C denaturációs hőmérsékleten, 1 perc alatt amplifíkáltuk, a hőkezelés 55 °C-on, 2 percig tartott, majd az elongáció 72 °C-on, 2 percig. Az amplifikáció termékeit HindlII és SstlI restrikciós endonukleázokkal tártuk fel és V19.8-ba illesztettük. A kapott vektor az SCF terminális kodonja után következő, a -25 és 164 közötti aminosavakat kódoló területeket tartalmazza.

A patkány eredetű SCF-cDNs 193 aminosav formáját (a patkány eredetű SCF^i-l93-t a 14C. ábrán látható DNS-szekvencia transzlációjából vártuk) tehát az SCF^1-193 esetében alkalmazott eljáráshoz hasonlóan V19.8 plazmidvektorba illesztettük. Az alkalmazott cDNS-szerkezetet a 84,1 és a 84,2 PCR-reakciókban szintetizáltuk (13A. ábra) 227-29 és 230-25 oligonukleotidok alkalmazásával. A két reakció különböző RNS-készítményékből indult és amplifíkációjuk független volt. A 227-29 szekvenciát a példa A) pontjában bemutatott PCR-reakcióval, míg a 230-25 primer szekvenciáját patkány eredetű genomikus DNS-ből kaptuk (14C. ábra). A reakciót az alábbi körülmények között hajtottuk végre: 50 ul reakció-térfogatban lxreakciópuffer (Perkin Elmer Cetus-féle készlet), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 uM dGTP, 200 mM dTTP, 200 ng oligo-(dT) primer cDNS, 2,5 U/ml Taqpolimeráz (Perkin Elmer Cetus), 10 picomol 227-29, 10 picomol 230-25. A cDNS-t 5 ciklusban, 94 °C-os denaturálási hőmérsékleten, 1,5 perc alatt amplifikáltuk, a hőkezelés 50 °C-on 2 percig tartott, majd az elongáció 72 °C-on 2 percig. Az amplifikálást további 35 cikluson keresztül ugyanilyen körülmények között folytattuk, azzal az eltéréssel, hogy a hőkezelés hőmérsékletét 60 °C-ra változtattuk. A PCR-termékeket HindlII és SstlI restrikciós endonukleázokkal tártuk fel. A V19.8-at hasonló eljárással, HindlII és SstlI restrikciós endonukleázokkal tártuk fel, és a feltárás eredményeként kapott nagyobb fragmentumot agaróz-gélelektroforézissel izoláltuk. A cDNS-t T4 polinukleotidligáz alkalmazásával V19.8-hoz ligáltuk. A ligálás eredményeként kapott terméket a megfelelő E. coli DH5 törzsbe transzformáltuk, és az egyéni baktériumklónokból kapott DNS-t szekvenáltuk. A plazmidot a 4. példában emlőssejtek megfertőzésére alkalmaztuk.

D) A humán SCF-cDNS PCR-termékének amplifikálása és klónozása

A humán SCF-cDNS-t egy hepatóma-sejtvonalból, a HepG2-ből (ATCC HB 8065) kaptuk a 13B. ábrán bemutatott PCR-amplifikációval. A humán cDNS-amplifikáció tervét a PCR-re alapoztuk olyan primerek alkalmazásával, melyeknek szekvenciáját a patkány eredetű SCF cDNS-éből kaptuk.

Az RNS-t Maniatis és társai eljárásával [fent (1982)] állítottuk elő. A poliA+RNS előállítása a gyártó utasításai szerint történt (Collaborative Research Inc.).

Az egyszálú cDNS-t BRL-cDNS-ből állítottuk elő a már ismertetett eljárással, azzal az eltéréssel, hogy a szintézist 2 μΜ 228-28 oligonukleotiddal indítottuk, lásd 12C. ábra, amely a 3’-végén egy hosszabb, egyedi szekvenciához kapcsolódó, rövid, random szekvenciát tartalmaz. A 228-28 egyedi szekvencia része a célja a PCR 228-29 primerrel - mint nemspecifikus primerrel - történő amplifikációjának. A patkány eredetű SCF szekvenciájához legalább részben hasonló humán cDNS-szekvenciát HepG2-cDNS-ből PCR-rel amplifíkáltuk, 227-29 és 228-29 primerek alkalmazásával (PCR 22,7; lásd 13B. ábra; 15 ciklus, hőkezelés 60 °C-on, majd további 15 ciklus, hőkezelés 55 °C-on). Az agaróz-gélelektroforézis a megjelenő különböző méretű DNS-ekről nem mutatott megkülönböztethető sávokat, csak elmosódott foltokat. A szekvenciák további előnyös amplifikációja megközelítőleg hasonló volt a patkány eredetű SCF-cDNS-ének amplifikációjához, melyet PCR-rel próbáltunk meg végrehajtani, 1 μΐ PCR 22,7 termékkel és belsőleg illesztett, patkány eredetű 222-11 és 228-29 SCF-primerekkel (PCR 24,3; 20 ciklus, hőkezelés 55 °C-on). Az agarózgélen ismét csak a DNS-termékek elkenődött foltjait figyelhettük meg. A PCR 24,3 termék 222-11 és 227-30 primerekkel történt, kétoldalú specifikus amplifikációja (PCR 25,10; 20 ciklus) a főtermék egyedül álló sávjának ugyanolyan mértékű növekedését okozta, mint a megfelelő patkány eredetű SCF cDNS-ének a PCR-terméke. Egy aszimmetrikus PCR-termék (PCR 33,1) 224-24 DNS primer alkalmazásával történő amplifikációja körülbelül 70 bázisos humán szekvenciát eredményezett.

Hasonlóan 1 μΐ PCR 22,7 termék 224-25 és 228-29 primerekkel (PCR 24,7; 20 ciklus), majd 224-25 és 227-30 primerekkel (PCR 41,11) történő amplifikációja a megfelelő patkány eredetű SCF-etermékkel megegyező méretű fősávot eredményezett, majd az aszimmetrikus amplifikáció (PCR 42,3) után, amikor szekvenáló primerként 224-24-et alkalmaztunk, a patkány eredetű szekvenciával erősen homológ szekvenciát eredményezett. Az oligonukleotidok humán SCF-cDNS-t célzó sajátságos szekvenciáját megszintetizáltuk, melyet a 12B. ábrán mutatunk be.

HU 220 234 Β

Alihoz, hogy megkapjuk a patkány eredetű SCFnek a PCR során kapott kódolószekvenciája humán másolatát, melyet az expresszió és az aktivitás tanulmányozása során alkalmaztunk, 227-29 és 227-30 primerekkel hajtottuk végre a PCR-t, 1 μΐ PCR primer alkalmazásával, 50 μΐ reakció-térfogatban (PCR 39,1). Az amplifikációt Coy Tempcycler készülékben hajtottuk végre. Mivel a humán SCF-cDNS és a patkány eredetű SCF sajátságos primeije közötti hibás párosodás mértéke ismeretlen volt, az első három ciklusban szigorúan alacsony hőfokú (37 °C) hőkezelést alkalmaztunk; ezután a további hőkezelést 55 °C-on hajtottuk végre. A fősávot, melynek mérete (körülbelül 590 bp) megegyezett a patkány esetében kapott homológnak tűnő fősávéval, kis mennyiségű, hígított PCR 39,1 termék és primer PCR-jével tovább amplifikáltuk (PCR 41,1). Mivel a PCR 41,1 termékénél egynél több sávot figyeltünk meg ahhoz, hogy a klónozás előtt legalább a szekvencia egy részét meghatározzuk, a következő PCR-t belsőleg illesztett primerrel hajtottuk végre. A PCR 23 ciklusát 231-27 és 227-29 primerekkel hajtottuk végre (PCR 51,2), ami után egyedül álló, intenzív sáv jelent meg. A humán SCF cDNS-szekvenciájának jelenlétét aszimmetrikus PCR-ek, 227-29 és 231-27 primerek alkalmazásával erősítettük meg. A PCR

41.1 SCF-DNS V19.8 expressziós vektorba történő klónozását a C) pont alapján hajtottuk végre, lásd fent, amint azt a patkány eredetű SCF 1-162 PCR-fragmentumok esetében bemutattuk. Az egyéni bakteriális kiónokat a Sanger-féle didezoxieljárással szekvenáltuk.

E) A humán stemsejtfaktor genomikus DNS-ének klónozása

A cDNS amplifikálásával kapott PCR7 próbát, lásd 13B. ábra, alkalmaztuk a humán genomikus szekvenciát tartalmazó könyvtár átvizsgálásához. A humán SCF-cDNS egy részét kiegészítő ribopróbát, lásd alább, a pozitív plakkok újraellenőrzésére alkalmaztuk. A PCR7 próba preparálását a PCR 41,1 termékének alkalmazásával kezdtük (lásd 13B. ábra). A PCR 41,1 termékét 227-29 és 227-30 primerekkel tovább amplifikáltuk. A keletkező 590 bp méretű fragmentumot az agarózgélről eluáltuk, majd ugyanezekkel a primerekkel ismét amplifikáltuk (PCR 58,1). A PCR

58.1 termékét 50 ul reakció-térfogatban, 10 pmol 233-13 primer jelenlétében 1000-szeresre hígítottuk, majd 10 ciklusban tovább amplifikáltuk. A reakcióelegyhez további 10 pmol 227-30 prímért adtunk, majd a PCR-t további 20 cikluson keresztül folytattuk. Újabb 80 pmol 233-13 hozzáadása után a reakció-térfogatot 90 μΐ-re növeltük, és a PCR-t további 15 cikluson keresztül folytattuk. A reakció termékét 50 μΐ reakció-térfogatban 200-szorosra hígítottuk, 20 pmol 231-27-et és 20 pmol 233-13-at adtunk hozzá, és a PCR-t 35 cikluson keresztül folytattuk, a hőkezelés 48 °C-on történt (PCR 96,1). A ³²P-vei jelzett PCR7 létrehozásához a PCR1 esetében alkalmazotthoz hasonló reakciókörülményeket állítottunk be, az alábbi különbségekkel: a reakció-térfogat 50 μΐ, a PCR 96,1-et 100szorosra hígítottuk; 5 pmol 231-27-et alkalmaztunk, mint egyedüli prímért; a PCR-t 45 ciklusban hajtottuk végre, a denaturálás 94 °C-on 1 perc alatt történt, a hőkezelés 48 °C-on 2 percig tartott, majd az elongáció °C-on 2 percig.

A ribopróba 1 a ³²P-vel jelzett egyszálú RNS volt, mely a hSCF DNS-szekvenciája 2-436 nukleotidjaival, lásd 15B. ábra, komplementer. A próbához szükséges vektorok létrehozása céljából a PCR 41,1 (13B. ábra) DNS-t HindlII és EcoRI alkalmazásával emésztettük és pGEM3 plazmidvektorba (Promega, Madison, Wisconsin) klónoztuk. A rekombináns pGEM3:hSCF DNS-t ezután HindlII emésztéssel linearizáltuk. A ³²P-vel jelzett ribopróbát a linearizált DNS-plazmidból készítettük, T7 RNS-polimeráz „runoff’ transzkripciójával, a Promega utasítása szerint. A reakcióelegy (3 μΐ) 250 ng linearizált DNS-plazmidot és 20 μΜ ³²P-rCTP-t [katalógusszám #NEG-008H, New England Nuclear (NEN)] tartalmazott, további jelzett CTP nélkül.

A humán genomkönyvtárat a Stratagene-től kaptuk (La Jolla, CA; katalógusszám #:946203). A könyvtárt a LambdaFix II vektorban hoztuk létre, hím kaukázusiplacenta-DNS alkalmazásával. A könyvtár a szállító jellemzése szerint 2 χ 10⁶ primer plakkot tartalmazott, az átlagos beillesztési méret 15 kb-nál nagyobb volt. Maniatis és társai leírása szerint [fent (1982)] megközelítőleg 10⁶ bakteriofágot helyeztünk el a lemezen. A plakkokat a gyártó leírását követve Gene Screen Plus™ szűrőre (22 cm²; NEN/DuPont) helyeztük. Minden egyes lemezről két szűrőtranszfert hajtottunk végre.

A szűrőket 6 x SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M nátriumcitrát, pH=7,5) és 1% SDS jelenlétében 60 °C-on előre hibridizáltuk. Ezután a szűrőket friss 6xSSC és 1% SDS-oldat jelenlétében hibridizáltuk, mely 2xl0⁵ cpm/ml mennyiségű ³²P-vel jeleztt PCR7 próbát tartalmazott és 20 órán keresztül 62 °C-on hibridizáltuk. A szűrőket 6xSSC és 1% SDS jelenlétében 62 °C-on 16 órát mostuk. A lemezről az autoradiogramok radioaktív foltjainak megfelelő bakteriofág dugókat eltávolítottuk, majd PCR7, illetve az 1. ribopróba alkalmazásával újra ellenőriztük. A PCR7 próbával való újraellenőrzés az alábbiak szerint történt: a szűrőket 6xSSC és 1% SDS jelenlétében előre hibridizáltuk, majd 62 °Con 18 óra alatt 0,25 M Na₃PO₄ (pH=7,5), 0,25 M NaCl, 0,001 M EDTA, 15% formamid, 7% SDS és 1 χ 10⁶ cpm/ml ribopróba jelenlétében hibridizáltuk. Ezután a szűrőket 6 χ SSC és 1% SDS jelenlétében 30 percig 62 °C-on, majd lxSSC és 1% SDS jelenlétében újabb 30 percig 62 °C-on mostuk. A pozitív klónokból a DNS-t BamHI, Sphl, illetve SstI restrikciós endonukleáz alkalmazásával emésztettük, a kapott fragmentumokat pUCl 19-be klónoztuk, majd szekvenáltuk.

A PCR7 próba alkalmazásával megkaptuk a 40-176 aminosavat kódoló exonokat tartalmazó kiónokat, melyeket az ATCC-ben helyeztünk el (elhelyezés #40681). Ahhoz, hogy megkapjuk a további SCF exonok kiónjait, a humán genomkönyvtárt ribopróba 2vel és a 235-29 oligonukleotid-próbával átvizsgáltuk. A könyvtárt az előző eljáráshoz hasonlóan vizsgáltuk át az alábbi eltérésekkel: a 235-29-cel a hibridizációt 37 °C-on végeztük, és a mosást 1 órán keresztül 37 °Con, majd további 1 órán keresztül 44 °C-on végeztük.

HU 220 234 Β

A pozitív kiónokat ribopróba 2-vel és ribopróba 3-mal, valamint a 235-29 oligonukleotid-próbával és a 236-31 oligonukleotid-próbával újravizsgáltuk. A ribopróba 2-t és a ribopróba 3-at a ribopróba 1-hez hasonló eljárással hajtottuk végre az alábbi eltérésekkel: (a) a rekombináns pGEM3:hSCF plazmid-DNS-t PvuII (ribopróba 2) vagy PstI (ribopróba 3) restrikciós endonukleáz alkalmazásával linearizáltuk, és (b) az SP6 RNSpolimerázt (Promega) alkalmaztuk a ribopróba 3 során.

A 15A. ábra a humán genomikus DNS szekvenciájának tervét mutatja be. Az ábra felső részén látható vonalak az SCF-et kódoló humán genomikus DNS-t jelölik. Az üres helyek a nem szekvenált területeket jelölik. A nagy négyszögek az SCF-gént kódoló területek exonjait jelölik, a megfelelő kódolt aminosavakat a négyszögek felett jelöltük. A humán eredetű SCF-gén szekvenciáját a 15B. ábrán mutatjuk be. A PCR-eljárással kapott humán eredetű SCF cDNS-ének szekvenciáját a 15C. ábrán mutatjuk be.

F) A humán SCF-cDNS 5 '-területének szekvenciája

A PCR-ek termékeinek szekvenálása két génspecifikus primerrel történt, melyek a primerek 3’-végéhez kapcsolódó területre jellemző szekvenciát mutatták. Az egyoldalú PCR-ek, amint azt a 3.A) példában bemutattuk, a környező területek szekvenciáját hozzák létre. Az egyoldalú PCR-t a humán SCF-cDNS nem értelmezett 5'-területének szekvenciájának kiterjesztése során alkalmaztuk.

Az egyszálú cDNS-t humán hólyagkarcinóma 5637 sejtvonalból (ATCC HTB 9) származó poliA+RNS-ből, 228-28 oligonukleotid primerrel (12C. ábra) állítottuk elő, amint azt a 3.D) példában bemutattuk. Ezeknek a cDNS-eknek a dG gyökfarokkal történő ellátása után egyoldalú PCR-amplifikáció következett, (dC)_n szekvenciákat tartalmazó primerek és SCF-specifikus primerek alkalmazásával, így az ismert szekvenciájú cDNS-fragmentum ellentétesen haladó, 5’-végét terjesztettük ki.

A szekvencia információjának kis részét a második szál 228-28 oligonukleotiddal indított szintézise termékének amplifikációjával kaptuk. A nem farkazott 5637 cDNS első szálát (körülbelül 50 ng), melyet fent ismertettünk, 2 pmol 228-28-at Klenow-polimerázzal és 0,5-0,5 mM dATP-vel, dCTP-vel, dGTP-vel, illetve dTTP-vel 10-12 °C-on 30 percig inkubáltuk 10 μΐ 1 x nick transzlációs pufferben [Maniatis és társai, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. A kapott cDNS egyoldalú PCR-ekkel és 228-29 primer más illesztett primerekkel készült keverékével (például: 235-30, 233-14, 236-31, illetve 235-29) való amplifikációja során komplex termékelegy keletkezett, mely a gélen foltokat adott. Az SCF-re vonatkozó cDNS-ffagmentek szignifikáns feldúsítása a speciális terméksávok intenzitásának növekedését mutatta, amikor is az egymás után következő PCR-termékek összehasonlítható mennyiségeit két SCF primerrel amplifikáltuk (például 227-29 és 235-29, a kapott termék körülbelül 150 bp). A termékből a speciális méretű sorozatok kiválasztására irányuló kísérletek, melyek során az agarózgélről a foltokat kivágtuk és PCR-rel újraamplifikáltuk, a legtöbb esetben sikertelennek bizonyultak, nem eredményeztek jól definiálható, az SCF-re vonatkozó sávokat.

Egy reakció, a PCR 16,17, mely csak 235-29 prímért tartalmazott - egy ráadásként várt sávot adott, amely a kódolóterület ismeretlen 5’-helyén a 235-29 priming eredményként keletkezett -, amit a PvuII és a PstI restrikciós enzimekkel történő térképezés és a PCRanalízis mutat meg. A kapott terméket gélen megtisztítottuk, 235-29 primerrel újraamplifikáltuk, és ³²P-vel jelzett 228-30 primerrel Sanger-féle didezoxieljárással szekvenáltuk. Az így kapott szekvencia volt a 245-9 oligonukleotid tervének az alapja (12B. ábra). Amennyiben a következő PCR-ekben ezt a 3’-irányítottságú prímért alkalmaztuk, 5’-irányítottságú SCF primerekkel keverten, az előre várt méretű sávokat kaptuk. Az ilyen PCR-termékek közvetlen Sanger-szekvenálása a humán SCF-cDNS-szekvenciájának 180-204 nukleotidját eredményezte, lásd 15C. ábra.

Ahhoz, hogy a hSCF-cDNS 5’-végének további szekvenciáját megkapjuk, az egyszálú cDNS-t az 5637 poliA⁺ RNS-ből (körülbelül 300 ng) állítottuk elő, 16 μΐ reakció-térfogatban, SCF-specifikus primer (2 pmol 233-14), 0,2 U MMLV reverz transzkriptáz (a BRL-től vettük) alkalmazásával és 500-500 μΜ felhasználással az egyes dNTP-kből. Az alapvető fenolkloroformos és kloroformos extrakciók és az etanolos (1 M ammónium-acetátból) csapadékképző lépések után a nukleinsavakat 20 μΐ desztillált vízben felszuszpendáltuk, 5 percre forró vízfürdőbe helyeztük, majd lehűtöttük és terminális transzferázzal farkaztuk, 8 μΜ dATP jelenlétében, CoCl₂-t tartalmazó pufferben [Deng és Wu, Methods in Enzymology, 100, pp. 96-103]. A terméket a (dA)_n-vel farkazott egyszálú cDNS-t metanol-kloroformos extrakcióval és etanolos csapadékképzéssel tisztítottuk, majd 20 μΐ térfogatban 10 mM tris, pH=8,0, és 1 mM EDTA elegyében felszuszpendáltuk.

A humán SCF-re vonatkozó cDNS 5’-vég fragmentumainak dúsítása és amplifikációja 2 ng (dA)_n-vel farkazott 5637 cDNS-ből történt, az alábbi eljárás szerint: először 26 ciklusos, egyoldalú PCR-t hajtottunk végre, SCF-specifikus 236-31 primer és egy (dT)_n szekvenciát vagy a 3’-vég szekvenciáját - például a 221-12 primer vagy a 220-3, 220-7 és 220-11 primerek elegye - tartalmazó primer vagy primer elegy jelenlétében (12C. ábra). Ezután a PCR-ek termékét (1 μΐ) egy második PCR-sorozatban, 221-12 és 235-29 primerek jelenlétében amplifikáltuk. A fő termék sávja az agaróz-gélanalízis alapján körülbelül 370 bp volt. A sávot tartalmazó géldugót Pasteur-pipettával kivágtuk a gélről és kis mikrofúgacsőbe helyeztük. 10 μΐ vizet adtunk hozzá és 84 °C-on megolvasztottuk. A PCR-t 221-12 és 235-29 primerekkel 40 μΐ térfogatban 2 μΐ hígított, megolvasztott géldugóval inokuláltuk. 15 ciklus után az agaróz-gélanalízis eredményeként kevéssé diffúz, körülbelül 370 bp méretű sávot kaptunk. A templátok alsó és felső száljának szekvenálásához aszimmetrikus PCReket hajtottunk végre: minden egyes reakció esetén 4 μΐ PCR-terméket és 40 pmolt a 221-12 és 235-29 prime23

HU 220 234 Β rek valamelyikéből 100 μΐ teljes térfogatban 25 ciklusos PCR-nek vetettük alá (1 perc, 94 °C; 30 másodperc, 55 °C; 40 másodperc, 72 °C). A 221-12 primerrel indított PCR-termék elegyének (az alapvető extrakciók és etanolos csapadékképzés után) a ³²P-vel jelzett 262-13 primerrel történő közvetlen szekvenálása (12B. ábra) az 5’-vég 1-179 nukleotidjainak szekvenciáját eredményezte (15C. ábra).

G) A humán genomikus DNS amplifikációja és szekvenálása a stemsejtfaktort kódoló első exon helyén

A humán genomkönyvtár SCF oligonukleotidpróbákkal történő ellenőrzése nem eredményezett az első kódolóexon ismert részeit tartalmazó kiónokat. Ezért egyoldalú PCR-eljárások alkalmazásával egy kísérletet indítottunk az exont körülvevő genomikus szekvenciák amplifikálására és klónozására.

A hődenaturált humán placenta (beszerezve a Sigmatól) primer kiteijesztését DNS-polimeráz I-gyel (Klenow-enzim, nagy fragmentum; Boehringer Mannheim) és nem SCF primerrel, mint például a 228-28 és a 221-11, nem erélyes körülmények között (alacsony hőmérséklet), például 12 °C-on hajtottuk végre, előnyben részesítve a rendkívül nagyszámú különböző helyen való indítást. Az egyes reakcióelegyeket ezután Taqlpolimerázt tartalmazó Taql DNS-polimeráz-pufferrel és az egyes dNTP-k mindegyikének 100-100 μΜ-jával 5szörösükre hígítottuk, és a DNS-szálak elongációját 72 °C-on 10 perc alatt hagytuk végbemenni. Ezután a stemsejtfaktorok első exonjának szekvenciáját feldúsítottuk a termékben az SCF első exonjának oligonukleotidjával (például a 254-9) és megfelelő, nem SCF primerrel (228-29 vagy 221-11). Az agaróz-gélelektroforézis alapján a legtöbb termék rövid (rövidebb mint 300 bp). A hosszabb darabok feldúsítása céljából az egyes agarózgélsávokról a 300 bp-nél hosszabb részeket kivágtuk és elektroforetikusan eluáltuk. Az etanolos csapadékképzés és a vízben való felszuszpendálás után a gélen megtisztított PCR-termékeket pGEM4-származékba klónoztuk, mely az Sfil helyet, mint HindlII-Sfil fragmentumot tartalmazta.

A tenyészeteket egy SCF első exonjának ³²P-vel jelzett oligonukleotidjával ellenőriztük. Számos pozitív kiónt sikerült azonosítanunk, és a beillesztések szekvenciáját Sanger eljárásával kaptuk meg. Az első exontól a szomszédos intronkonszenzus exon-intron határáig a lefelé haladó szekvenciát a 15B. ábrán mutatjuk be.

H) Az egér, a majom és a kutya SCF-cDNS-ét kódoló területek amplifikációja és szekvenálása

Az egyszálú cDNS-t teljes RNS-ből vagy majommáj (beszerzés: Clontech) poliA+ RNS-ből és NIH-3T3 sejtvonalból (egér, ATCC CRL 1658), illetve D17 sejtvonalból (kutya, ATCC CCL 183) állítottuk elő. Az egyszálú cDNS szintézise során vagy a nemspecifikus 228-28 prímért vagy egy SCF prímért (227-30, 237-19, 237-20, 230-25 vagy 241-6) alkalmaztunk. A PCR 227-29 primerrel és a 227-30, 237-19, 237-20 primerek valamelyikével történő amplifikációja a kívánt méretű fragmentumot eredményezte, amelyet közvetlenül vagy a V19.8, illetve pGEM vektorba klónozva szekvenáltunk.

Az SCF-cDNS 5’-vége közelében elhelyezkedő további szekvenciákat egy SCF-specifikus primer és a 254-9 vagy 228-29 primerek kombinálásával végrehajtott PCR-amplifikációval kaptuk. Az SCF-et kódoló területek 3’-végénél lévő további szekvenciákat a 230-25 primer cDNS-nek (egerek esetében) vagy a 241-6-tal elkezdett cDNS-nek (kutyák esetében) 230-25 vagy 241-6 - amelyik az adott esetben megfelelő - és egy 3’-véghez rendelt primemek PCRamplifikációjával kaptuk. A hasonló D17 cDNS-amplifikációk során nem kaptunk SCF PCR-formákat. A D17 teljes DNS-éből az egyik szál szintézisét nemspecifikus 228-28 primerrel indítottuk, és a kapott komplex termékelegyet az SCF-re vonatkozó szekvenciára nézve PCR-rel, a 3’-végre irányított SCF primerekkel, például a 227-29-nek vagy a 225-31-nek a 228-29-cel készült elegye, feldúsítottuk. A termékelegyet Sfil-gyel elhasítottuk és az Sfil helyre - tompa végű fragmensként - pGEM4-származékba (Promega, Madison, Wisconsin) klónoztuk. A kapott heterogén könyvtárt radioaktívan jelzett 237-20-szal átvizsgáltuk, ellenőriztük, és a pozitív kiónokat szekvenáltuk, így számos kutya-3'-szekvenciát kaptunk. A humán (42. ábra), majom-, kutya-, egér- és patkány-SCF érett fehérjéinek aminosavszekvenciáját a 16. ábrán mutatjuk be.

Az SCF ismert aminosavszekvenciái hosszuk nagy részén erősen homológok. Mind az öt faj kódolórégióiban azonos konszenzus szignálpeptid-szekvenciák vannak jelen. Az érett fehérje amino-terminusának alapján várt aminosavakat a patkány eredetű SCF analógiájára jelöltük. A kutya cDNS-szekvenciája egy félreérthető részt tartalmaz, ami a 129. kodonnál jelentkezik az aminosavszekvenciában és a valin/leucin félreérthetőségét okozza. A humán, majom-, egér- és patkányaminosavszekvenciák inszerciók és deléciók nélkül illeszkednek. A többi fajjal összehasonlítva a kutyák esetében kapott szekvenciák a 130. pozícióban egyedülálló, különleges gyököt tartalmaznak. A humán, illetve a majomszekvencia csak egy pozícióban tér el egymástól, ami a valinnak (humán) az alaninnal (majom) való helyettesítését eredményezi. Az egyes fajok között erősen konzervált az előre várt SCF-szekvencia a 164. gyök környékén, közvetlenül a feltételezett processing hely előtt és után.

4. példa

A rekombináns patkány-SCF expressziója a COS-2 sejtekben

COS-1 sejtekben (ATCC CRL 1650) történő átmeneti expresszió céljából a patkány-SCF¹-¹⁶² és -SCF¹¹⁹³ géneket tartalmazó 19.8 vektort [3.C) példa] 60 mm-es lemezekre duplikáltuk [Wingler és társai, Cell, 14,725-731 (1978)]. A V19.8 plazmidot a 17. ábrán mutatjuk be. Kontrollként inszertum nélküli vektort transzfektálunk.

A szövettenyészet felülúszóját a transzfekció után különböző időpontokban összegyűjtöttük, és megmértük a kapott anyag biológiai aktivitását. A 4. táblázat a HPP-CFC biomérések eredményeit foglalja össze, míg

HU 220 234 Β

5. táblázat

Patkány eredetű SCF DNS-sel fertőzött COS-1 sejtek felülúszójának MC/9 ³H-timidin-felvétele az 5. táblázat az általánosan alkalmazott transzfekciós kísérletek során kapott MC/9 ³H-timidin-felvétel adatait foglalja össze. A 4. és 5. táblázat az alábbi plazmidokkal fertőzött COS-1 sejtek felülúszójának eredményeit tartalmazza: a patkány eredetű SCF C-terminusának a 162. aminosavpozícióban megrövidített formája (V19.8 patkány-SCF^1-162), a 81. pozícióban glutaminsavat tartalmazó SCF^1-162 [V19.8 patkánySCF^1-162(Glu81)] és a 19. pozícióban alanint tartalmazó SCF^{1 162} [V19.8 patkány SCF^1-162(Alal9)]. A patkány eredetű SCF^1-162 amplifikációját PCR-reakcióval hajtottuk végre, melynek termékeit szubsztituált aminosavak képezték, amint azt a 3. példában bemutattuk. A patkány eredetű SCF¹-¹⁶² egyedi kiónjainak szekvenálása során két klón esetében tapasztaltunk aminosavszubsztitúciót. A 4. és 5. táblázat adatai alapján láthatjuk, hogy a patkány eredetű rekombináns SCF a biomérések során aktivitást mutat, és az 1. példában bemutatott, természetes eredetű emlős-SCF tisztítására alkalmazható.

4. táblázat

Patkány eredetű SCF-DNS-sel fertőzött COS-1 sejtek felülúszójának HPP-CFC elemzése

Minta	A mért CM térfogata (μΐ)	Telep #/200 000 sejt
V19.8 (beillesztés nélkül)	100	0
50	0
25	0
12	0
V19.8 patkány SCF'-162	100	>50
50	>50
25	>50
12	>50
6	30
3	8
V19.8 patkány SCF1-162 (Glu81)	100	26
50	10
25	2
12	0
V19.8 patkány SCF1-162 (Alá 19)	100	41
50	18
25	5
12	0
6	0
3	0

Minta	A mért CM térfogata (μΐ)	cpm
V19.8 (beillesztés nélkül)	25	1 936
12	2 252
6	2 182
3	1 682
V19.8 patkány SCF1162	25	11 648
12	11 322
6	11482
3	9 638
V19.8 patkány SCF·-162 (Glu81)	25	6 220
12	5 384
6	3 692
3	1 980
V19.8 patkány SCF1-162 (Alal9)	25	8 396
12	6 646
6	4 566
3	3 182

A patkány eredetű, rekombináns SCF-et és más faktorokat külön-külön vizsgáltuk a normál csontvelősejtek szaporodásának mérésére alkalmas eljárás, a humán CFU-GM [Broxmeyer és társai, fent (1977)] mérés során, és a kapott eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze. A COS-1 sejteket V19.8 SCF¹-¹⁶² és más, a 6. táblázatban bemutatott faktorok keverékével transzfektáltuk, a felülúszóból 4 nappal a transzfekció után vettünk mintát, és az ezekből kapott eredményeket foglaltuk össze a 6. táblázatban. A telepek száma a megháromszorozódott tenyészetek átlaga.

A patkány eredetű, rekombináns SCF a humán csontvelősejtekkel szemben a CFU-GM mérés során elsődleges szinergista aktivitással rendelkezett. A 6. táblázatban összefoglalt kísérlet eredményei szerint az SCF a humán GM-CSF-fel, a humán IL-3-mal és a humán CSF-1-gyel szinergizált. A G-CSF-fel szemben mutatott szinergizmust más mérések során is tapasztaltuk. Az SCF-fel való transzfekció után 14 nappal a humán csontvelőben némi sejtszaporodás volt megfigyelhető; azonban a képződött „cluster”-ek száma <40 sejt. A természetes emlős eredetű SCF esetén hasonló eredményeket kaptunk.

HU 220 234 Β

6. táblázat

Patkány eredetű SCF-DNS-sel fertőzött COS-1 sejtek felülúszójának humán CFU-GM mérése

Minta	Telep #/100 000 sejt (+- SEM)
Fiziológiás sóoldat	0
GM-CSF	7+-1
G-CSF	24+-1
IL-3	5+-1
CSF-1	0
SCF’-162	0
GM-CSF+SCF'-162	29+-6
G-CSF+SCF'-162	20+-1
IL-3+SCF*-'62	11+-1
CSF-1+SCF1-162!	4+-0

5. példa

Rekombináns SCF-expresszió kínaihörcsögpetefészek-sejtekben

A példa a CHO sejtek (ATCC CCL 61; DHFR-ra szelektálva) SCF-ének emlősökben történő szekréciója stabil expressziós rendszerére vonatkozik.

A) A patkány eredetű rekombináns SCF

Az SCF-etermelés során V19.8 expressziós vektort alkalmaztunk (17. ábra). A stabil transzformátumok létrehozásához szelektálható markerként a pDSVE.l plazmid dihidrofolát-reduktáz génjét alkalmaztuk. A pDSVE.l plazmid (18. ábra) a pDSVE származéka, melyet a pDSVE Sáli restrikciós enzimmel történő emésztésével hoztunk létre, majd az

5’-TCGAC CCGGA TCCCC-3’

3’-G GGCCT AGGGG AGCT-5’ oligonukleotidokat tartalmazó oligonukleotid-fragmentumokhoz ligáltuk azokat.

A pDSVE vektort az általánosan elismert 025.344 és 152.045 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetik, melyeket itt referenciaként említünk meg. A vektor V19.8 és pDSVE.l része hosszú, homológ szakaszt tartalmaz, mely magában foglalja a ColEI replikációs origót, az ampicillin-reszitenciagént és az SV40 replikációs origint. Ez az átfedés a transzformációs folyamatok során hozzájárulhat a homológ rekombinációhoz, ezáltal elősegítve a kotranszformációt.

A kalcium-foszfát a V19.8 SCF-szerkezettel csapadékot képez, és a pDSVE. 1-et 10 pg egér-DNShordozó jelenlétében vagy hiányában hoztuk létre 1,0 pg vagy 0,1 pg pDSVE.l alkalmazásával, melyet Pvul restrikciós endonukleázzal és 10 pg V19.8-cal Wigler és társai leírása szerint [lásd fent (1978)] linearizáltunk. A tenyészeteket a DHFR gén pDSVE.lből történő expressziója alapján szelektáltuk. A további hipoxantin- és timidinadagolás nélkül is növekedett tenyészeteket klónozócilinderbe vittük, majd független sejtvonalként kiterjesztettük. A független sejtvonalak felülúszójának sejtjeit MC/9 ³H-timidin-felvételük alapján vizsgáltuk. A kísérlet eredményeit a 7. táblázatban foglaltuk össze.

7. táblázat

Patkány eredetű SCF-DNS-sel fertőzött stabil CHO sejtek felülúszójának MC/9 ³H-timidin-felvétele

Fertőzött DNS	A mért kondicionált közeg térfogata	cpm
V19.8 SCF'-*62	25	33 926
	12	34 973
	6	30 657
	3	14 714
	1,5	7 160
Üres	25	694
	12	1082
	6	880
	3	672
	1	1 354

B) A humán rekombináns RNS A CHO sejtekben történő SCF-expressziót szintén a pDSVRa2 vektor alkalmazásával értük el, melyet a közösen birtokolt 501.904 sorozatszámú szabadalmi leírás ismertet, melyet itt referenciaként említünk meg. A vektor a DHFR gén expressziójára alapozva a szelekció és az amplifikáció céljára alkalmas gént tartalmaz. Az SCF pDSVRa2 kiónt két lépésből álló folyamatban állítottuk elő. Az SCF V19.8-at BamHl restrikciós enzimmel feltártuk, és az SCF-beillesztést a pGEM3 BamHl helyére ligáltuk. Az SCF pGEM3 DNS-t Hindlll és Sáli alkalmazásával emésztettük és Hindlll és Sáli alkalmazásával emésztett pDSVRa2-be ligáltuk. Ugyanezt az eljárást ismételtük meg a 18C. ábrán ismertetett szekvencia 162., 164. és 183. aminosavpozíciójában és a 42. ábrán ismertetett szekvenciák 248. pozíciójában lévő COOH-terminálist kódoló humán génekkel. A létrehozott sejtvonalakat 10 nmol metotrexáttal [Shimke, Methods in Enzymology, 151, 85-104 (1987)] reagáltattuk, így megnövelve a DHFR gén és a szomszédos SCF gén expressziós szintjét. A humán eredetű rekombináns SCF expressziós szintjét a 7. példában bemutatásra kerülő „radioimmunoassay” alkalmazásával és/vagy humán perifériális vér leukociták in vitro telepképződése indukciójának meghatározásával mértük. Ezt a mérést a 7. példában bemutatásra kerülő eljárás alkalmazásával végeztük el, azzal az eltéréssel, hogy csontvelő helyett perifériális vért alkalmaztunk és az inkubálást humán EPO jelenlétében (10 IU/ml), 20% O₂ 5% CO₂ és 75% N² mellett hajtottuk végre. A kísérlet eredményeit a 8. táblázatban foglaltuk össze. A humán SCF*-¹⁶⁴-et expresszáló humán CHO kiónt Hul64SCF17-tel jelölve 1990. szeptember 25-én helyeztük el az ATCC-ben (CRL 10557).

HU 220 234 Β

8. táblázat

Humán eredetű SCF-DNS-sel fertőzött stabil CHO sejtvonal kondicionált közegének hPBL-tenyészet mérése

Fertőzött (μΐ)	A mért közeg száma/105	Tenyészetek DNS
pDSRa2 hSCF'-'M	50	53
	25	45
	12,5	27
	6,25	13
pDSRa2 hSCF'-164	10	43
	5	44
	2,5	31
	0,625	21
Üres (CHO-kontroll)	50	4

6. példa

Rekombináns SCF E. coliban történő expressziója A) A patkány eredetű rekombináns SCF A példa az SCF polipeptid E. coliban történő expressziójára vonatkozik, melyet patkány eredetű

SCF^1-193 [Met^_1]-et kódoló DNS-szekvencia alkalmazásával hajtottunk végre (14C. ábra). Többféle vektort alkalmazhatunk az említett DNS-sel történő fehérjeexpresszió céljára, mi a pCFM1156 plazmidot választot10 tűk. A plazmidot a pCFM 836-ból (lásd például a

4.7100.473 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, melyet itt referenciaként említünk meg) hozhatjuk létre úgy, hogy a két endogén Ndel restrikciós hely végét T4 polimeráz enzimmel telítjük, majd a tompa véget ligáljuk, és az egyéni Clal és KpnI restrikcós helyek közötti kis DNS-szekvenciákat az alábbi, rövid oligonukleotiddal szubsztituáljuk:

’ -CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTAACGCGTTGGAATTCGGTAC- 3 ’ 3’- TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC- 5’

A pCFM 1156 plazmid fehérjeexpressziójának kontrollja szintetikus lambda P_L promoterrel készült, mely önmaga a lambda CI857 represszor gén [melyet az FM5 (ATCC #53911) vagy a K12deltaHtrp E. coli törzsben hozhatunk létre] kontrollja alatt áll. A pCFM 1156 vektort optimális riboszómakötő helyet és a szintetikus P_L promoter 3’-végének iniciációs kodonját tartalmazó DNS-szekvenciából hoztuk létre. Az egyéni, ATG iniciációs kodont tartalmazó Ndel restrikciós hely megelőzi a klónozott „cluster” multirestrikciós helyeit, melyeket a lambda t-oop transzkripciós stopszekvencia követ.

A patkány eredetű SCF¹¹⁹³ gént tartalmazó V19.8 SCF¹'¹⁹³ plazmidot PCR-rel amplifikált cDNSből (14C. ábra) klónoztuk, a 3. példa leírása szerint, Bglil és SstlI alkalmazásával emésztettük, és a 603 bpból álló DNS-fragmentumot izoláltuk. Ahhoz, hogy megkapjuk a Met iniciációs kodont és helyreállítsuk a patkány-SCF-polipeptid első három aminosavgyökének (Gin, Glu és Ile) kodonját, egy Ndel és Bglil tapadós végű szintetikus oligonukleotid-hidat 5’-TATGCAGGA-3’

3’-ACGTCCTCTAG-5’ hoztunk létre. A kis oligonukleotidot és a patkány eredetű SCF^1-193 génfragmentumot ligálással a pCFM1156ba illesztettük, a plazmid egyedi, Ndel és SstlI helyén, lásd 19. ábra. A reakció terméke a patkány eredetű pCFM1156 SCF¹¹⁹³ expressziós plazmid.

A patkány eredetű pCFM1156 SCF^1-193 expressziós plazmidot a megfelelő RM5 E. coli gazdasejtbe transzformáltuk. A plazmidot tartalmazó sejteket a pCFM1156 vektoron lévő antibiotikum- (kanamicin-) rezisztencia-markergén alapján szelektáltuk. A plazmid-DNS-t izoláltuk a tenyésztett sejtekből, és a szintetikus oligonukleotidok DNS-szekvenciáját, valamint azoknak a patkány eredetű SCF-génhez kapcsolódását DNS-szekvenálással igazoltuk.

A patkány eredetű SCF^{1 162} polipeptid [Met >]-t kódoló patkány eredetű SCF^1-162 pCFM1156 plazmid létrehozásához a V19.8 SCF¹¹⁶²-ből izoláltuk az EcoRI-SstlI fragmentumot és a patkány eredetű SCF¹¹⁶² pCFM plazmidba ligáltuk, így helyettesítettük a patkány SCF-gén karboxi-terminusát kódoló régiót.

A patkány eredetű SCF’-¹⁶⁴ polipeptid [Met“>]-t, illetve patkány eredetű SCF*-¹⁶⁵ polipeptid [Met-*]-t kódoló pCFM1156 patkány eredetű SCF¹'¹⁶⁴ plazmid és pCFM1156 patkány eredetű SCF’-¹⁶⁵ plazmid létrehozásához az SCF-gén 3’-végét kódoló PCR-rel amplifikált DNS-ből EcoRI és SstlI közötti restrikciós fragmentumot izolálunk, és az SCF-gén karboxi-terminálisát kódoló régió DNS-ében irányított cserék (site directed changes) létrehozására alakítottuk ki. Az SCF^1-164 pCFM1156 plazmid létrehozásánál a 227-29 és 237-19 oligonukleotid primereket, míg az SCF^{1 165} pCFM1156 plazmid létrehozásánál a 227-29 és a 237-20 oligonukleotid primereket alkalmaztuk.

B) A humán eredetű, rekombináns SCF

A példa a humán eredetű SCF-polipeptid E. coliban történő expressziójára vonatkozik, a humán eredetű SCF¹-¹⁶⁴ polipeptid [Met-*]-t és a humán eredetű SCF¹-*⁸³ polipeptid [Met-*]-t kódoló DNS-szekvenciák alapján (lásd 15C. ábra). A humán eredetű SCF¹”¹⁶² gént tartalmazó V19.8 humán eredetű SCF¹¹⁶² plazmidot a humán SCF-gén PCR-amplifikációja során templátként alkalmaztuk. A 227-29 és a 237-19 oligonukleotid primereket alkalmaztuk a PCR-DNS generálására, melyeket ezután PstI és SstlI restrikciós endonukleázokkal emésztettük. Egy Met iniciálókodon létrehozása és a humán SCF-polipeptid első négy aminosavgyökének (Glu, Gly, Ile és Cys) helyreállítása céljából Ndel és PstI tapadós véggel rendelkező szintetikus polipeptidet hoztunk létre, az alábbi szekvenciával:

5’-TATGGAAGGTATCTGCA-3’

3’-ACCTTCCATAG-5’

HU 220 234 Β

A kis méretű oligoláncot és a PCR-ből származó humán génfragmentumot az egyéni Ndel és SstlI helyeknél a pCFM1156 expressziós plazmidba ligáltuk (lásd fent) (19. ábra).

A humán eredetű SCF^{1 162} plazmidot a megfelelő FM5 E. coli gazdasejtekben transzformáltuk. A plazmidot tartalmazó sejteket a pCFM1156 vektoron létrehozott antibiotikum- (kanamicin-) rezisztencia-markergén alapján szelektáltuk. A plazmid-DNS-t izoláltuk a tenyésztett sejtekből és a humán SCF-gén-DNSszekvenálással igazoltuk.

A humán eredetű SCF*-¹⁸³ polipeptid [Met-*]-kódoló humán eredetű SCF¹¹⁸³ pCFM1156 plazmidjának létrehozásához (15. ábra) a humán eredetű SCF¹¹⁴¹⁸³ pGEM-ből izoláltuk a humán SCF-gén karboxil-terminusát kódoló EcoRI-HindlII restrikciós fragmentumot (lásd fent), a humán eredetű SCF*-*⁶⁴ pCFM 1156-ból izolált humán SCF-gén amino-terminusát kódoló Sstl-EcoRI restrikciós fragmentumot és a pCFMl 156-ból izolált, nagyobb méretű HindlII-SstI fragmentumot. A tenyészet kanamicin-drogrezisztencián alapuló szelektálása után a plazmid-DNS-t izoláltuk, és a helyes DNS-szekvenciát DNS-szekvenálással igazoltuk. A humán eredetű SCF¹¹⁴¹⁸³ pGEM plazmid a pGEM3 származéka, melynek DNS-szekvenciája a 609-820 nukleotidák között EcoRI-Sphl fragmentumot tartalmaz (lásd 15C. ábra). A plazmid beillesztett EcoRI-Sphl szakaszát a 235-31 és 241-6 oligonukleotid primerek (12B. ábra) és a PCR22.7 templát (13B. ábra) alkalmazásával, PCR-rel izoláltuk. A 241-6 primer szekvenciáját a humán genomszekvencia 3’-végén levő exonra alapoztuk, mely 176 aminosav kodonját tartalmazza.

C) A humán eredetű SCF^'^-et termelő E. coli fermentációja

Az SCF¹-'⁶⁴ fermentációja 16 literes fermentorban történt, a humán eredetű SCF¹*¹⁶⁴ pCFM1156 plazmidot tartalmazó K12 E. coli gazdasejt alkalmazásával. A termelőtenyészet fenntartásához szükséges oltóanyagot -70 °C-on tároltuk, 17% glicerolt tartalmazó Luria táptalajon. Az inokulumhoz 100 ul oltóanyagot olvasztottunk fel, ezt 2 1 űrtartalmú Erlenmeyer-lombikba, 500 ml Luria táptalajba vittük és egy éjszakán keresztül rázógépen, 30 °C-on növekedni hagytuk (250 RPM).

A tisztított, humán eredetű SCF¹¹⁶⁴ kiindulási anyagaként alkalmazott E. coli sejtmassza termelése során az alábbi fermentációs körülményeket alkalmaztuk.

Az inokulumtenyészetet steril körülmények között a 16 1-es fermentorba vittük, mely 8 1 inokulum táptalajt tartalmazott (lásd 9. táblázat). A tenyészeteket sarzsokban szaporítottuk, amíg az OD-600 elért 3,5-öt. A fermentáció során a fermentorba perisztaltikus pumpa segítségével steril táptalajt (1. táptalaj, 10. táblázat) adagoltunk, a folyadékráta ellenőrzése mellett. A folyadékrátát a fermentációs idővel exponenciálisan növeltük, így 0,15 óra-¹ növekedési rátát értünk el. A növekedési fázisban a hőmérséklet értékét folyamatos ellenőrzés mellett 30 °C-on tartottuk. A fermentor oldott oxigénszintjét automatikus ellenőrzés mellett 50%-on tartottuk, az ellenőrzés a levegőáramlási ráta, a keverési ráta és az edény háttémyomása segítségével, valamint az oxigénszint kiegészítésével történt. A fermentor pHját automatikus ellenőrzés mellett, foszforsav és ammónium-hidroxid alkalmazásával 7,0 értéken tartottuk. Megközelítőleg 30-as OD-600 mellett a fermentáció termelőfázisában a hőmérsékletet 42 °C-ra emeltük. Ugyanekkor leállítottuk az 1. táptalaj adagolását, és 200 ml/óra kiindulási folyadékrátával a 2. táptalajt kezdtük adagolni. Körülbelül hat órával később a fermentor hőmérsékletét növeltük, míg tartalmának hőmérsékletét 15 °C-ra hűtöttük le. Az SCF¹¹⁶⁴-hozam körülbelül 30 mg/OD-L volt. A kapott sejtpelletet Beckman J6-B rotor alkalmazásával 1 órán keresztül centrifugáltuk (3000xg). Az összegyűjtött sejtmasszát -70 °C-on fagyasztva tároltuk.

Az SCF^1-164 termelésére egy előnyben részesített eljárást mutatunk be, mely a fenti eljáráshoz hasonló, az alábbi módosítások mellett.

1. Az 1. táptalaj adagolását addig nem kezdtük el, amíg a tenyészet az 5-6 OD-600-at el nem érte.

2. Az 1. táptalaj adagolási rátáját lassabban növeltük, így a növekedési ráta is lassabban nőtt (megközelítőleg 0,08 értékkel).

3. A tenyészetet 20 OD-600 értéknél indukáltuk.

4. A 2. táptalajt 300 ml/óra folyadékrátával vezettük be a fermentorba.

Az eljárás során az összes többi paraméter, beleértve az alkalmazott táptalajokat, a fentihez hasonló volt.

Ezzel az eljárással OD=25 mellett megközelítőleg 35-40 mg/OD-L értéket értünk el.

9. táblázat

Az inokulum táptalaj összetétele

Élesztőextraktum	1(P g/1
Glükóz	5
K2HPO4	3,5
kh2po4	4
MgSO4x7H2O	1
NaCl	0,625
Dow P-2000 habzásgátló	5ml/81
Vitaminoldatb	2 ml/1
Nyomfcmoldatc	2 ml/1

^a Amennyiben másképp nem jelöltük, minden alkotót g/1 dimenzióban adtunk meg.

^b Vitaminoldat: riboflavin, 0,42 g/1; pantoténsav, 5,4 g/1; niacin, 6 g/1; piridoxin, 1,4 g/1; biotin, 0,06 g/1; fólsav, 0,04 g/1. ^c Nyomfémoldat: FeClj χ 6 H₂0,27 g/1; ZnCl₂ χ 4 H₂0,2 g/1; CaCl₂ x 6 HjO, 2 g/1;Na₂MoO₄χ2 H₂0,2 g/1; CuSO₄x 5 H₂0,1,9 g/1; cc. HCI 100 ml/1.

9. táblázat

Az 1. táptalaj összetétele

Élesztőextraktum	50“ g/1
Glükóz	450
MgSO4x7H2O	8,6

HU 220 234 Β

9. táblázat (folytatás)

Vitaminoldat1’	10 ml/1
Nyomfémoldat1	10 ml/1

¹ Amennyiben másképp nem jelöltük, minden alkotót g/1 dimenzióban adtunk meg.

⁶ Vitaminoldat: riboflavin,0,42 g/1; pantoténsav, 5,4 g/1; niacin, 6 g/1; piridoxin, 1,4 g/1; biotin, 0,06 g/1; fólsav, 0,04 g/1. ^c Nyomfémoldat: FeCl₃ x 6 H₂0,27 g/1; ZnCl₂ χ 4 H₂0,2 g/1; CaCl₂ χ 6 H₂0,2 g/1; Na₂MoO₄x2 H₂0,2 g/1; CuSO₄x5 H₂0,1,9 g/1; cc. HCI 100 ml/1.

10. táblázat

A 2. táptalaj összetétele

Tripton	172*
Élesztőextraktum	86
Glükóz	258

^a Minden alkotót g/1 dimenzióban adtunk meg.

7. példa

Az SCR „radioimmunoassay”-vei történő detektálása

Az SCF-minták kvantitatív detektálására alkalmas ,,radioimmunoassay”-(RIA-) eljárás kivitelezése az alábbi módon történt.

Az 1. példa alapján megtisztított BRL 3A sejtekből kapott SCF-készítményt két órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk az antiszérummal. A kétórás inkubálás után a mintát tartalmazó csöveket jégen lehűtöttük, a csövekben ¹²⁵I-SCF-et adtunk, és a csöveket legalább 20 órán keresztül 4 °C-on inkubáltuk. Minden egyes „assay”cső 500 pl inkubációs elegyet tartalmazott, ami 50 μΐ hígított antiszérumból és megközelítőleg 60 000 cpm ¹²⁵I-SCF-ből (3,8xlO⁷ cpm/pg), 5 ul triazolilból és 0-400 μΐ SCF-standardból állt, a megfelelő térfogatra pufferrel (foszfátpufferes fiziológiás sóoldat, 0,1% szarvasmarha-szérumalbumin, 0,05% Triton X-100 és 0,025% azid) kiegészítve. Az antiszérum természetes eredetű SCF-et tartalmazó készítménnyel immunizált nyulak 2. tesztvéreztetéséből nyert 50%-os tisztaságú, BRL 3A-val kondicionált közeg volt. A mérés során az antiszérum végső hígítása 1:2000 volt.

Az antitesthez kötött ¹²⁵I-SCF-et 150 μΐ Staph A (Calbiochem) hozzáadásával kicsaptuk. Az anyagot szobahőmérsékleten egy órán keresztül inkubáltuk, majd centrifugáltuk, és a pelleteket 0,75 ml 10 mM Tris-HCl-lel (pH=8,2), mely 0,15 M NaCl-t, 2 mM EDTA-t és 0,05% Triton Χ-100-at tartalmazott, mostuk. Az átmosott pelleteket gamma-számlálóban megmértük, így meghatároztuk a ¹²⁵I-SCF kötések százalékos mennyiségét. A szérummentes csövekben kapott kötésszámokat levontuk a végső értékekből, így korrigáltuk a nemspecifikus csapadékképződést. A nem jelzett standard által létrehozott ¹²⁵I-SCF kötések inhibíciójának százalékos aránya (lásd 20A. ábra) dózisfuggő, és amint ezt a 20A. ábrán láthatjuk, az immunreakcióban csapadékot képző pelletek SDS-PAGE- és autoradiográfiás vizsgálata szerint a kapott ¹²⁵I-SCF sáv vetélkedik. A 20B. ábrán az 1. sáv a ¹²⁵I-SCF, a 2.,

3., 4. és 5. sáv az immunreakcióban csapadékot képző ¹²⁵I-SCF, mely a 0, 2, 100, illetve 200 ng SCFstandarddal vetélkedik. A RIA-csövekben észlelt antitest-csapadék cpm-csökkenésből és az immunreakcióban csapadékot képző ¹²⁵I-SCF sáv (migrálás megközelítőleg M_r 31 000 körül) csökkenésből megállapíthatjuk, hogy a poliklonális antiszérum felismeri az 1. példa eljárása alapján megtisztított SCF-standardot.

Az E. coli, COS-1 és CHO sejtekben expresszált rekombináns SCF-et a Westem-eljárással detektáltuk. A részlegesen megtisztított, az E. coli által expresszált patkány eredetű SCF^II93-t (10. példa), a COS-1 sejtek által expresszált patkány eredetű SCF'-^|62-t és SCF'-¹⁹³-t éppúgy, mint a humán eredetű SCF¹-¹⁶²-! (4. és 9. példa) és a CHO sejtek által expresszált patkány eredetű SCF¹¹⁶²-t (5. példa) SDS-PAGE-eljárásnak vetettük alá. Az elektroforézis után a fehérjesávot Bio-Rad Transblot apparátus alkalmazásával (60 V, 5 óra) 0,2 pm-es nitro-cellulóz-szürőre vittük. A nitro-cellulóz-szűrőt 4 órán keresztül 10% kecskeszérumot tartalmazó PBS-be vittük, pH=7,6, és szobahőmérsékleten 1:200 hígítású nyúl-preimmun- vagy immunszérummal 14 órát inkubáltuk (az immunizálás menetét lásd fent). Az antitest-antiszérum komplexet torma-peroxidáz-kötött kecske-antinyúl-IgG-reagenssel (Vector laboratories) és 4-kloro-l-nafitol színképző reagens segítségével tettük láthatóvá.

A 21. és a 22. ábra két példát mutat be a Westemeljárás alkalmazásáról. A 21. ábrán a 3. és 4. sávon a COS-1 sejtek által termelt humán eredetű SCF¹-¹⁶²-! 200 μΐ-e látható; az 1. és 7. sávon a COS-1 sejtek által termelt humán eredetű EPO 200 μΐ-e látható (a COS-1 sejteket V19.8-cal fertőztük meg); és a 8. sávon az előre festett molekulatömeg-markerek láthatók. Az 1-4. sávot preimmunszérummal, az 5-8. sávot immunszérummal inkubáltuk. Az immunszérum specifikusan ismeri fel a humán eredetű SCF¹¹⁶²-t termelő, M_r 30 000 látszólagos molekulatömegű COS-1 sejtek diffúz sávját, de nem ismeri fel a humán eredetű EPO-t termelő COS-1 sejteket.

A Westem-eljárást bemutató 22. ábrán az 1. és 7. sávon az E. coliban termelt, részlegesen tisztított patkány eredetű SCF^1-193 1 pg-ja látható; a 2. és 8. sávon a COS-1 sejtekben termelt patkány eredetű SCF^1-193 búzacsíra agglutinin-agarózon tisztított terméke látható; a 4. és 9. sávon a COS-1 sejtekben termelt patkány eredetű SCF^1-162 búzacsíra agglutinin-agarózon tisztított terméke látható, az 5. és 10. sávon a CHO sejtekben termelt patkány eredetű SCF^{1 162} búzacsíra agglutininagarózon tisztított terméke látható; és a 6. sávon az előre festett molekulatömeg-markerek láthatók. Az 1-5., illetve a 6-10. sávot preimmun-, illetve immunszérummal inkubáltuk. Az E. coliban termelt, patkány eredetű SCF^1-193 (1. és 7. sáv) Mr 24 000 dalton látszólagos molekulatömeggel vándorol, míg a COS-1 sejtekben termelt patkány eredetű SCF^{1 193} (2. és 8. sáv) Mr 24 000-36 000 közötti látszólagos molekulatömeggel vándorol (2. és 8. sáv). A molekulatömegek közötti eltérést az okozza, hogy az emlőssejtek - ellentétben a bakteriális sejtekkel - glikozilációra hajlamosak. A pat29

HU 220 234 Β kány eredetű SCF¹-¹⁶²-! kódoló szekvencia COS-1 sejtekbe (4. és 9. sáv) vagy CHO sejtekbe (5. és 10. sáv) történő transzfekciója nagyobb átlagos molekulatömeggel rendelkező SCF expresszióját eredményezi, mint amit az SCF'-¹⁹³ esetében kaptunk (2. és 8. sáv).

A COS-1 és CHO sejtekben termelt patkány eredetű SCF^1-162 expressziós termékei M_r 24 000-36 000 közötti látszólagos molekulatömeggel rendelkező sávok formájában jelennek meg. Az expresszált SCF heterogenitását valószínűleg a különböző mértékben glikozilezett SCF-et tartalmazó szénhidrátok változása okozza.

Összefoglalva, a Westem-analitikai eljárások alapján megállapíthatjuk, hogy a természetes emlős-SCFfel immunizált nyulak immunszéruma felismeri az E. coliban termelt rekombináns SCF-et, de nem ismeri fel a COS-1 sejtek által termelt EPO-t tartalmazó kontrollsávokat. További segítséget jelent az SCF specifitásvizsgálatánál az, hogy az azonos nyálból származó preimmunszérum nem tud reakcióba lépni a patkány vagy humán eredetű expressziós SCF-etermékkel.

8. példa

A rekombináns SCF in vivő aktivitása

A) Patkány-SCF a csontvelő-transzplantációban

A COS-1 sejtek V19.8 SCF^1_,62-vel történő megfertőzését a 4. példában mutattuk be (a 60 mm-es edények helyett T175 cm² edények). Megközelítőleg 270 ml felülúszót gyűjtöttünk össze. Ezt búzacsíra agglutinin-agaróz gélen kromatografáltuk, az 1. példa eljárása szerint. A rekombináns SCF-et a rágcsáló-W/W^v genetikára alapozott csontvelőtranszplantáció-modell alapján értékeltük ki. A W/W^v egerek stemsejthiányossággal rendelkeznek, ami többek között makrocitikus anémia (nagy vörös sejtek) formájában jelentkezik, és így lehetővé teszi a normál állatokból történő csontvelő-transzplantációt anélkül, hogy a befogadóállatot sugárzásos kezelésnek kellene alávetni [Russel és társai, Science, 144, 844-846 (1964)]. A normál donorsejtek a transzplantáció után gyorsabban nőnek, mint a befogadó hiányos sejtjei.

Az alábbi kísérlet során 6-6 egykorú egerekből álló csoportokat vizsgáltunk. A csontvelőt normál donoregerekből gyűjtöttük össze és W/W^v egerekbe transzplantáltuk. A befogadóállatok vérének profilját a transzplantáció után különböző időpontokban követtük, és a donorvelő átültetését a perifériális vérsejteknek a befogadó fenotípusától a donor fenotípusába való átalakulással határoztuk meg. A befogadó fenotípusától a donor fenotípusába való átalakulást a vörösvérsejtek előre haladó szóródásának profilja (Fascan, Becton Dickenson) követésével határoztuk meg. Minden egyes időpontban összehasonlítottuk a donor és a befogadó nem transzplantált kontrollállatoknál kapott profilt és a transzplantált állatoknál kapott profilt. Az összehasonlítást a Kolmogorov-Smimov-statisztika alapján számítógépes programmal végeztük, az áramló rendszerek hisztogramjának analízisével [Young, J., Histochem. and Citochem., 25,935-941 (1977)]. Az átültetések független, kvalitatív indikátora a hemoglobin, ennek típusát határoztuk meg a befogadóállat vérének hemoglobinelektroforézisével [Wong és társai, Mól. and Cell Bioi., 9, 798-808 (1988)], és az eredmények megfelelnek a Kolmogorov-Smimov-statisztika által meghatározottaknak.

A C56BL/6J donorokból megközelítőleg 3 χ 10⁵ sejtet transzplantáltunk SCF-kezelés nélkül (23. ábra, kontrollcsoport) a W/W^v befogadókba. A második csoport 3 χ 10⁵ SCF-fel kezelt (600 U/ml, 37 °C, 20 perc) sejtet kapott injekció útján (23. ábra előkezelt csoport). (Az SCF egységét úgy definiáltuk, mint az az SCFmennyiség, ami az MC/9 biomérések során félmaximális stimulációt eredményez.) A befogadóegerek harmadik csoportjának szubkután (sub-Q) injekcióval megközelítőleg 400 U SCF/nap adagot adtunk 3 nappal a 3xl0⁵ donorsejttel történő transzplantáció után (23. ábra, Sub-Q injekciózott csoport). Amint azt a

23. ábrán láthatjuk, az SCF-fel kezelt csoportok a nem kezelt kontrollcsoportoknál gyorsabban fogadják be a donorvelőt. A transzplantáció után 28 nappal az SCFfel előkezelt csoport átalakult a donor fenotípusává. A példa az SCF csontvelő-transzplantációra való alkalmasságát illusztrálja.

B) Patkány-SCF Steel-egereken vizsgált in vivő aktivitása

Az SÍ lokusz mutációi elégtelenségeket okoznak a hematopoietikus sejtekben, a pigmentsejtekben és a csírasejtekben. A hematopoietikus hiány a vörösvérsejtek [Russel, In: Al Gordon, Regulation of Hematopoiezis, Vol. I, 648-675 Appleton Century-Crafts, New York (1970)], a neutrofilek [Ruscetti, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 152, 398 (1976)], a monociták [Shibata, J. Immunoi., 135, 3905 (1985)], a megakarociták [Ebbe, Exp, Hematol,, 6, 201 (1978)], a természetes killersejtek [Clark, Immunogenetics, 12, 601 (1981)] és a hízósejtek [Hayasi, Dev. Bioi., 109, 234 (1985)] csökkent számában fejeződik ki. A Steel-egerek nehezen fogadják be a transzplantált csontvelőt, mivel a stemsejtek megtartásának képessége esetükben lecsökken [Bannerman, Prog. Hematol., 8, 131 (1973)]. A Steel(Sl/Sl) egerek SCF-et kódoló génje hiányzik.

Az SCF-aktivitás érzékenységének in vivő modelljét Steel-egerek biztosították. A Steel-Dickie- (Sl/Sl^d) egereken különböző rekombináns SCF-fehérjék különböző időtartamon keresztül mutatott hatását vizsgáltuk. A 6-10 hetes Steel-egereket (WCB6F1-Sl/Sl^d) a Jackson Labs-ból szereztük be (Bar Harbor, ME). A perifériális vér vörös sejtjeit, hemoglobinját és vérlemezkéit SYSMEX F-800 microcell-számlálóval (Baxter, Irvine, CA) követtük. A perifériális fehérvérsejtek (WBC) mennyiségének számszerűsítésére Coulter Channelyzer 256 (Coulter Electronics, Mariette, GA) készüléket alkalmaztunk.

A kísérletek során a Steel-Dickie-egereket E. coliban termelt, a 10. példa szerint megtisztított SCF^{1 164}gyel kezeltük 30 napig 100 pg/kg/nap, majd további 20 napig 30 pg/kg/nap mennyiségben. A fehéije injektálható sóoldatban volt (Abbot Labs, North Chicago, IL) és 0,1% fetális szarvasmarhaszérumot tartalmazott. Az injekciózás szubkután úton történt. A perifériális

HU 220 234 Β vért a farok véreztetésével követtük, megközelítőleg 50 μΐ mennyiségekből, lásd 24. ábra. A vért 3% EDTAval bevont fecskendővel összegyűjtöttük és EDTA-val bevont mikrofugacsövekbe (Brinkmann, Westbury, NY) osztottuk. A kezelt állatoknál és a kontrollállatoknál észlelt makrotikus anémia között szignifikáns eltérés tapasztalható. A kezelés megszüntetése után a kezelt állatoknál a makrotikus anémia hasonlóvá válik a kiindulási állapothoz.

A kísérlet során, melyet a 25. és a 26. ábrán szemléltetünk, a Steel-Dickie-egereket a fent bemutatott SCF különböző rekombináns formáival kezeltük 20 napon keresztül, 100 pg/kg/nap dózisokkal. Az E. coliban termelt patkány eredetű SCF két formáját, az SCF^ll64-et és az SCF^I193-at a 10. példa alapján állítottuk elő. Továbbá az E. coliban termelt SCF¹- ¹⁶⁴-et polietilénglikol alkalmazásával a 12. példa szerint módosítottuk (SCF¹¹⁶⁴PEG25) és így vizsgáltuk tovább. Az 5. példa szerint előállított és a 11. példa szerint megtisztított, a CHO sejtek által termelt SCF¹-¹⁶²-! szintén megvizsgáltuk. Az állatokat 3% EDTA-val bevont fecskendővel szívpungálással véreztettük, és a vért EDTA-val bevont mikrofugacsövekbe osztottuk. A 25. ábrán a fehérvérsejtek (WBC), a 26. ábrán a vérlemezkék perifériális vérprofilját mutatjuk be 20 nappal a kezelés után. A 27. ábrán SCF¹¹⁶⁴PEG25 csoport WBC-értékeinek differenciálhányadosát mutatjuk be. A neutrofílek, monociták, limfociták és vérlemezkék számának jelentős növekedése figyelhető meg.

A limfocitákat külön vizsgáltuk, a kapott adatokat a 28. ábrán mutatjuk be. Az L3T4 a humán CD4-gyel ekvivalens vagy a T helper sejtek markere [Dialynas, J. Immunoi., 131, 2445 (1983)]. A LyT-2 a citotoxikus T-sejtek antigénje [Ledbetter, J. Exp. Med., 153, 1503 (1981)]. Ezekkel az antigénekkel szemben termelt monoklonális antitesteket alkalmaztunk a kezelt állatok T-sejtjeinek vizsgálata során.

A T-limfociták vizsgálatához a teljes vért megfestettük, az alábbi eljárással. Az egyes állatokból 200 μΐ teljes vért vittünk az EDTA-val kezelt csövekbe. Az egyes vérmintákat steril, deionizált vízzel 60 másodpercig lizáltuk, majd az oldatot 10 χ Dulbecco-féle foszfátpufferes sóoldattal (PBS) (Gibco, Grand Island, NY) izotóniássá tettük. A lizált vért 0,1% fetális szarvasmarhaszérummal (Flow Laboratory, McLean, VA) és 0,1% nátrium-aziddal kiegészített 1 χ PBS- (Gibco, Grand Island, NY) oldattal kétszer mostuk. A sejtpelletet (megközelítőleg 2-10xl0⁵ sejtet tartalmazott) 20 μΐ patkány-antiegér-L3T4 konjugált ficoeritrinnel (PE) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) és 20 μΐ patkány-antiegér-Lyt-2-vel konjugált fluoreszcein izotiocianáttal felszuszpendáltuk és jégen (4 °C) 30 percig inkubáltuk (Becton Dickinson). Az inkubálás után a sejteket a fenti anyagokkal kiegészített 1 x PBS-oldattal kétszer mostuk. Ezután az egyes mintákat FACScan sejtanalizáló rendszerben (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analizáltuk. A rendszert standard autokompenzációs eljárásokkal és kalibrálógyöngyökkel (Calibrate Beads) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) standardizáltuk. Az adatok alapján mind a helper

T-sejtek populációja, mind a citotoxikus T-sejtek száma jelentősen nőtt.

C) Az SCFfőemlősökben mutatott in vivő aktivitása

Az E. coliban expresszált és a 10. példa alapján megtisztított humán SCF^{1 164} in vivő aktivitását normál főemlősökön vizsgáltuk. Felnőtt, hím páviánokat (Papio faj) 3 csoportban tanulmányoztunk: nem kezelt, n=3; SCF 100 pg/kg/nap, n=6; és SCF 30 pg/kg/nap, n=6. A kezelt állatok naponta egyszer szubkután SCFinjekciót kaptak. Az állatokból ketamin-visszatartás alatt vettünk vérmintát. A teljes vérszám, a retikulocitaszám és a vérlemezkék számának meghatározásához a kezelés 1., 6., 11., 15., 20. és 25. napján vettünk mintát.

Minden állat túlélte az SCF-kezelést, káros mellékhatások nélkül. A 29. ábra alapján láthatjuk, hogy a 100 pg/kg adaggal kezelt állatok fehérvérsejtszáma nőtt. A Wright Giemsa-eljárással festett perifériális vérfoltokból manuálisan kapott differenciálhányadosokat a 29. ábrán mutatjuk be. Mind a neutrofílek, mind a limfociták, illetve a monociták száma jelentősen nőtt. Amint a 30. ábrán láthatjuk, 100 pg/kg adaggal kezelt állatok hematokrit- és vérlemezkeszáma nőtt.

A humán SCF-et (hSCF*-¹⁶⁴-t a 12. példa szerint polietilénglikol adagolásával módosítottuk) tehát 200 pg/kg/nap dózisokban, folyamatos intravénás infúzióval normál páviánokon vizsgáltuk, és a kapott adatokat összehasonlítottuk a nem módosított fehérjénél kapottakkal. Az állatok SCF-kezelését a 0. napon kezdtük és 28 napig folytattuk. A perifériális WBC-adatokat az alábbi táblázatban foglaltuk össze. A PEG-gel módosított SCF a perifériális WBC-ben korábban mutat növekedést, mint a nem módosított SCF.

200 pg/kg/nap hSCF‘-^,64-gyel való kezelés:

Állat #M88320	Állat #M88320
Nap	WBC	Nap	WBC
0	5 800	0	6 800
+7	10 700	+7	7 400
+ 14	12 600	+ 14	20 900
+ 16	22 000	+21	18 400
+22	31 100	+23	24 900
+24	28 100	+29	13 000
+29	9 600	+30	23 000
+36	6 600	+37	12 100
+43	5 600	+44	10 700
		+51	7 800

200 pg/kg/nap PEG-hSCF^1_164-gyel való kezelés:

Állat #M88320	Állat #M88320
Nap	WBC	Nap	WBC
-7	12 400	-5	7 900
-2	11600	0	7 400

HU 220 234 Β

Táblázat (folytatás)

Állat #M88320	Állat #M88320
Nap	WBC	Nap	WBC
+4	24 700	+6	16 400
+7	20 400	+9	17 100
+ 11	24 700	+ 13	18 700
+ 14	32 600	+ 16	19 400
+ 18	33 600	+20	27 800
+21	26 400	+23	20 700
+25	16 600	+27	20 200
+28	26 900	+29	18 600
+32	9 200	+33	7 600

9. példa

Rekombináns humán SCF in vitro aktivitása

A 3.D) példában bemutatott PCR-reakció 1-162.

aminosavjának megfelelő humán eredetű SCF-cDNS-t COS-1 sejtekben expresszáltuk, a 4. példa, a patkány eredetű SCF esetében leírtak alapján. A COS-1 sejtek felülúszóját humán csontvelőn vizsgáltuk, hasonlóan a rágcsáló-HPP-CFC és az MC/9 mérésekhez. A humán fehérje nem mutatott aktivitást azokban a koncentrációkban, melyeket a rágcsálóméréseknél alkalmaztunk; ugyanakkor a humán csontvelővel szemben aktívnak bizonyult. A mérés során a tenyészetben az alábbi körülményeket alkalmaztuk: az egészséges önként jelentkezőkből származó csontvelőt Ficoll-Hypaque gradiensben (Pharmacia) lecentrifúgáltuk és 2,1% metilcellulóz, 30% fetális borjúszérum, 6χ10~⁵ M 2-merkapto-etanol, 2 mM glutamin, ISCOVE-féle közeg (ISCOVE’S médium; GIBCO) és 20 U/ml EPO jelenlétében lxlO⁵ sejt/ml mennyiséget nedves levegőn, 7% O₂, 10% CO₂ és 833% N₂ jelenlétében tenyésztettünk. A COS-1 felülúszójában létrehozott rekombináns humán és patkány-SCF-etenyészetek számát a 12. táblázatban mutatjuk be. Csak a 0,2 mm-nél nagyobb méretű tenyészeteket vettük figyelembe.

12. táblázat

A csontvelőtenyészet növekedése az SCF hatására

Fertőzött plazmid	Mert CM-térfogat (μΐ)	Tenyészet#/ 100 000 sejt+-SD
V19.8 (beillesztés nélkül)	100	0
50	0
VI9.8 humán SCF1-162	100	33+-7
50	22+-3
VI9.8 patkány SCF1162	100	13 + -1
50	10

A 14. nap után növekedett tenyészeteket a 31 A. ábrán mutatjuk be (12 χ nagyítás). A nyilak a tipikus tenyészeteket jelölik. A tenyészetek nagy mérete (átlagosan 5 mm) hasonlít a rágcsáló-HPP-CFC-tenyészetekre. Az EPO jelenlétének következtében a tenyészetek közül néhány hemoglobinizálódott. A tenyészeteket izoláltuk, centrifugáltuk, üveglemezre vittük és citospint alkalmaztunk, majd Wright-Giemsa-festést, a kapott sejtek túlnyomó része differenciálatlan volt, és amint a 31B. ábrán (400 χ nagyítás) is láthatjuk, a nukleusz :citoplazma arány magas volt. A 31B. ábrán látható nyilak magyarázata: 1. nyíl, citoplazma; 2. nyíl, nukleusz; 3. nyíl, vakuólák. Az éretlen sejtek nagy mennyiségben fordultak elő, és a sejtek mérete érésük során fokozatosan csökkent [Diggs és társai, The Morphology of Humán Blood Cells, Abbott Labs., 3 (1978)]. A hematopoietikus érés szekvenciája korai sejtjeinek nukleuszai a citoplazmához képest viszonylag kicsik. Ráadásul az éretlen sejtek citoplazmája a Wright-Giemsa-festés során sötétebbé válik, mint a nukleusz. A sejtek érése során a nukleusz festődése sötétebbé válik, mint a citoplazmáé. A humán csontvelőből származó rekombináns humán SCF-tenyészet morfológiája megfelel annak a következtetésnek, mely szerint az SCF hatásának céljai és közvetlen termékei a viszonylag éretlen hematopoietikus progenitorok.

A rekombináns humán SCF-et humán csontvelőn, agar tenyészetmérési eljárásokkal, egyéb faktorokkal együtt vizsgáltuk. Az eredményeket a 13. táblázatban foglaltuk össze. Az SCF a G-CSF-fel, a GM-CSF-fel, az IL-3-mal és az EPO-val szinergizál, így az egyéni SCF-eket célozva fokozza a csontvelő szaporodását.

13. táblázat

A rekombináns humán SCF szinergizmusa más humán tenyészetstimuláló faktorokkal szemben

	Tenyészet#/105 sejt (14 nap)
mesterséges	0
hG-CSF	32+-3
hG-CSF+hSCF	74+-1
hGM-CSF	12+-2
hGM CSF+hSCF	108+-5
HIL-3	23+-1
HIL-3+hSCF	108+-3
hEPO	10+-5
hEPO+IL-3	17+-1
hEPO+hSCF	86+-10
hSCF	0

A rekombináns humán SCF aktivitása alapján képes a humán akut mielogén leukémia (AML) sejtvonal, KG-1 (ATCC CCL 246) lágyagar tenyészetében osztódást kiváltani. A fertőzött COS-1 sejtek felülúszóját KG-1 agarklónozásos eljárással alapvetően Koeffler és társai eljárása szerint vizsgáltuk [Koeffler és társai, Science, 200, 1153-1154 (1978)], azzal az eltéréssel, hogy a lemezeket 3000/ml sejttel vontuk be. A megháromszorozódott tenyészetek adatait a 14. táblázatban mutatjuk be.

HU 220 234 Β

14. táblázat

KG -1 lágyagar-klónozásos eljárás

Fertőzött plazmid	Mért térfogat (μΐ)	Tenyészet#/ 3000 sejt+-SD
V19.8 (beillesztés nélkül)	25	2+-1
V19.8 humán SCF1162	25	14+-0
	12	8+-0
	6	9+-5
	3	6+-4
	1,5	6+-6
V19.8 patkány SCF'-162	25	6+-1
humán GM CSF	50	14+-5

10. példa

Az E. coliban expresszált rekombináns humán SCF tisztítása

Az E. coli humán SCF^1-164 fermentációját a 6.C) példa szerint hajtottuk végre. Az összegyűjtött sejteket (912 g nedves tömeg) vízben 4,6 1 végső térfogatra szuszpendáltuk fel, majd laboratóriumi homogenizátorban (Gaulin Model 15Mr-8TBA) 55 MPa mellett három adagban összetörtük. Az összetört sejtpelletfrakciót centrifugálással (17 700xg, 30 perc, 4 °C) összegyűjtöttük, egyszer átmostuk friss vízzel és végül vízzel 41 térfogatra szuszpendáltuk fel.

Az oldhatatlan SCF-et tartalmazó pelletfrakciót (10-12 g SCF) 3950 ml térfogatú alkalmas elegybe vittük, melyben az alkotók végső koncentrációja 8 M urea (ultratiszta minőség), 0,1 mM EDTA, 50 mM nátriumacetát, pH=6-7 volt; az SCF-koncentráció 1,5 mg/ml volt. Az SCF szolubilizálása során az inkubálás szobahőmérsékleten, 4 órán keresztül tartott. A visszamaradt oldhatatlan anyagot centrifugálással távolítottuk el (17 700xg, 30 perc, szobahőmérsékleten). A szolubilizált SCF újra-összehajtogatása/újraoxidálása (refolding/reoxidation) céljából a felülúszó frakciót lassan, keverés mellett 39,15 1 térfogatú, megfelelő elegybe öntöttük úgy, hogy az elegy végső térfogata 2,5 M ureát (ultratiszta minőség), 0,01 mM EDTA-t, 5 mM nátrium-acetátot, 50 mM Tris-HCl-t, pH=8,5, 1 mM glutationt, 0,01% (wt/vol) nátrium-azidot tartalmazott. Az SCF-koncentráció 150 pg/ml volt. Az elegyet 60 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertük [rövidebb időtartam (például 20 óra) is elegendő], majd Millipore Pellicon ultraszűrő berendezéssel, három 10 000 molekulatömegű levágást ponttal rendelkező poliszulfon membránkazetta (15 fT² teljes terület) alkalmazásával felére töményítettük és 7-szeres térfogatnyi 20 mM Tris-HCl-lel szemben, pH=7,5, diafiltrálást hajtottunk végre. A töményítés/diafiltrálás során a hőmérséklet 4 °C, a szivattyúzást ráta 5 1/min és a szűrési ráta 600 1/min volt. A visszanyert anyag végső térfogata

26,5 1 volt. Mind a redukált, mind a nem redukált minták esetében SDS-PAGE-vizsgálatot végeztünk, melynek alapján egyértelmű, hogy az SCF pelletfrakciójának túlnyomó része (>80%) szolubilizálódott a 8 M-os urea hatására, és az újra-összehajtogatás/újraoxidálás (refolding/reoxidation) után több SCF-fajta (forma) volt jelen, amint azt a nem redukált minták SDS-PAGE képe alapján láthatjuk. A fő forma, a szabályosan oxidált SCF (lásd lent), a molekulatömeg-markerekhez (redukált) képest 17 000 körüli látszólagos molekulatömeggel vándorol, lásd 9. ábra. A többi forma, például a 17-20 000 körüli látszólagos molekulatömeggel vándorló anyagok (redukált), valószínűleg a láncon belül elhelyezkedő szabálytalan diszulfidhidakat tartalmazó SCF-t reprezentálják; a 37 000 vagy nagyobb látszólagos molekulatömeggel vándorló (nem redukált) sávok valószínűleg a láncok közötti szabálytalan diszulfídhidakat tartalmazó SCF-t reprezentálják, melyek hatására az SCF-ben kovalensen kötött polipeptidláncok keletkeznek, és így dimerek, illetve nagyobb oligomerek jönnek létre. Az alábbi frakcionálási lépések a megmaradt E. coli-szennyezés és a nem kívánt SCF-formák eltávolítását eredményezték, melyek eredményeként homogén, biológiai aktivitással rendelkező tisztított SCF-t kaptunk.

Az ultraszűrés során az anyag pH-ját 375 ml 10% (vol/vol) ecetsavval 4,5 értékre állítottuk be, ennek hatására szemmel látható csapadékképződés indult. 60 perc után, amikor a kicsapódott anyag leülepedett az edény aljára, a felső 24 litert dekantáltuk és Cuno™ 30SP vastag szűrőn 500 ml/perc áramlási sebességgel átszűrtük az anyagot, ezzel befejeztük a derítést. A szűrletet vízzel másfélszeresére hígítottuk és 4 °C-on S-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra (9x18,5 cm) vittük, melyet előzőleg 25 mM nátrium-acetáttal, pH=4,5, ekvilibráltunk. Az oszlopon alkalmazott folyadékáram 5 1/h volt, a hőmérséklet 4 °C. A minta felvitele után az oszlopot az oszlopon alkalmazott puffer ötszörös oszloptérfogatnyi (megközelítőleg 6 1) mennyiségével mostuk, és az oszlopon megkötődött SCF-et gradienselúcióval, 0-0,35 M NaCl-nek az oszlopon alkalmazott pufferben készült elegyével eluáltuk. A teljes gradiens térfogata 20 1 volt, és 20 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk. Az elúciós profilt a 33. ábrán mutatjuk be. Az S-Sepharose oszlopról kapott frakciók aliquot mennyiségeit (10 pl) mind a redukált (32A. ábra), mind a nem redukált (32B. ábra) minták esetében SDS-PAGE-eljárással analizáltuk. Az analízis eredményeként láthatjuk, hogy minden 280 nm-en észlelt abszorbancia az SCF-nek tulajdonítható.

A fő abszorbanciacsúcsban a szabályosan oxidált forma van túlsúlyban (22-28. frakciók, 33. ábra). A kisebb fajták (fonnák), mint például az SDS-PAGE-n 17-20 000 körüli látszólagos molekulatömeggel megjelenő, szabálytalanul oxidált anyag, a fő abszorbanciacsúcs előtti váll formájában jelenik meg (10-21. frakciók, 32B. ábra); a diszulfidkötésekkel létrejött dimer anyag mindvégig jelen van az abszorbancia területén (10-38. frakciók, 32B. ábra).

Az S-Sepharose oszlopról kapott 22-38. frakciókat pooloztuk, a pool pH-ját megközelítőleg 11 ml 6 N HCl-dal 2,2 értékre állítottuk, és az anyagot Vydac C4 oszlopra (magasság 8,4 cm, átmérő 9 cm) vittük, melyet előzőleg 50% (vol/vol) etanollal és 12,5 mM

HU 220 234 Β

HCl-dal (A oldat) ekvilibráltunk és 4 °C-on kezeltünk. Az oszlopban alkalmazott gyantát az alábbi eljárással kaptuk: a száraz gyantát 80% (vol/vol) etanol és

12.5 mM HCl (B oldat) elegyében felszuszpendáltuk és A oldattal ekvilibráltuk. A minta felvitele előtt üres gradienst alkalmaztunk, mely az A oldattól a B oldatig haladt, majd az oszlopot az A oldattal ekvilibráltuk. A minta felvitele után az oszlopot 2,5 1 A oldattal mostuk, és az oszlopon megkötött SCF-et az A oldattól a B oldatig haladó gradiensben, 2670 ml/óra folyadékráta mellett eluáltuk (18 1 össztérfogat). 286, egyenként 50 ml-es frakciót gyűjtöttünk, és az aliquotokat 280 nm-en (35. ábra) SDS-PAGE-eljárással, a fent ismertetett módon analizáltuk (34A. ábra, redukáló körülmények; 34B. ábra, nem redukáló körülmények). A szabályosan oxidált, rendkívül tiszta állapotú SCF-et tartalmazó 62-161. frakciókat pooloztuk [18-20 000 körüli látszólagos molekulatömeggel megjelenő, viszonylag kis mennyiségű, szabálytalanul oxidált anyag (nem redukált) a gradiensben később eluálódott (körülbelül a 166-221. frakciók) és a diszulfidkötésekkel létrejött dimer anyag szintén később eluálódott (körülbelül a 199-235. frakciók) (35. ábra)].

Ahhoz, hogy a pool 62-161. frakcióiról eltávolítsuk az etanolt és az SCF-et betöményítsük, Q-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) ioncserélő gyanta felhasználásával az alábbi eljárást alkalmaztuk. A poolt (5 1) vízzel 15 625 1 térfogatra hígítottuk, ezzel az etanol koncentrációja körülbelül 20% (vol/vol) lett. Ezután az elegyhez 1 M Tris-bázist adtunk, így a pH értéke 8,0 lett, majd 1 M Tris-HCl-t, pH=8,0 (23,6 ml), így a Tris összkoncentrációja 10 mM lett. Ezután az elegyhez 10 mM Tris-HCl-t, pH = 8,0 (megközelítőleg

15.5 1), adtunk, így az össztérfogat 31,25 1 lett, és az etanolkoncentráció körülbelül 10% (vol/vol). Ezután az anyagot 4 °C-on Q-Sepharose Fást Flow oszlopra vittük (magasság 6,5 cm, átmérő 7 cm), melyet 10 mM Tris-HCl-dal, pH=8,0, ekvilibráltunk, majd az oszlopon alkalmazott puffer 2,5 1-nyi mennyiségével mostuk. A minta felvitele alatt a folyadékráta 5,5 1/óra volt. A megkötött SCF eluálása 200 mM NaCl és 10 mM Tris-HCl elegyével történt, pH=8,0, melyet ellenáramban szivattyúztunk át az oszlopon, körülbelül 200 ml/óra folyadékráta mellett. 12 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, melyek abszorbanciáját 280 nm-en elemeztük, és melyeket a fenti SDS-PAGE-eljárással vizsgáltunk. A 16-28. frakciókat pooloztuk (157 ml).

Az SCF-et tartalmazó poolt külön-külön két kromatográfiás futtatással (egyenként 78,5 ml) Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) gélszűrő oszlopra (5 χ 138 cm) vittük, melyet foszfátpufferes fiziológiás sóoldatban ekvilibráltunk, 4 °C-on. 75 ml/óra folyadékráta mellett 15 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Az egyes esetekben az 1370-1635 ml elúciós térfogatnak nagyjából megfelelő frakciókból eluáltuk a 280 nm-en abszorbanciával rendelkező főcsúcsokat. A két oszlop futása során kapott abszorbanciacsúcsokat reprezentáló frakciókat elegyítettük, a kapott térfogat 525 ml volt, mely 2,3 g SCF-et tartalmazott. Az anyagot Millipore Millipak 20 membránfeltéten szűréssel sterileztük.

Egy másik lehetőség szerint a C4 oszlopról lejövő anyagot ultraszűréssel betöményítjük, és a steril szűrés előtt kicseréljük a puffért az ultraszűrőn.

Az izolált rekombináns humán eredetű SCF’-¹⁶⁴ nagy tisztaságúnak bizonyult (az ezüstfestéses SDS-PAGE alapján >98%) és megfelelt a gyógyszerészeti tisztasági foknak. A 2. példában bemutatott eljárások alkalmazása során úgy találtuk, hogy az anyag aminosav-összetétele megfelel annak, amit az SCF-gén analízise alapján vártunk, és a várakozásnak megfelelően a Met-Glu-Gly-Ile-... aminosavszekvenciával rendelkezik, a Met-ben kódolt iniciálókodon visszatartása mellett.

Az E. coliban expresszált humán eredetű SCF¹¹⁶⁴ esetében alkalmazottakkal összehasonlítható eljárások szerint a patkány eredetű SCF*-¹⁶⁴-et (mely tehát a fermentáció után oldhatatlan formában található a sejtek felszínén) magas, specifikus biológiai aktivitással, tisztított állapotban nyerhetjük vissza. Hasonlóan nyerhető vissza a humán eredetű SCF^1-183 és a patkány eredetű SCF'-¹⁹³ is. A patkány eredetű SCF¹¹⁹³ az összehajtogatás/oxidálás (folding/oxidation) során különböző oxidált formákat hoz létre, és a nem kívánt formákat sokkal nehezebb kromatográfiával eltávolítani.

A patkány eredetű SCF¹-¹⁹³ és a humán eredetű SCF¹¹⁸³ a visszanyerés kezdetén, például a szolubilizálás és az összehajtogatás/oxidálás (folding/oxidation) során proteolitikus degradációra hajlamos. A protelízis elsődleges helye a 160-170. gyök között helyezkedik el. A proteolízis a körülmények megfelelő változtatásával minimálisra csökkenthető (például az SCF-koncentráció; pH-érték megváltoztatása; 2-5 mM EDTA vagy más proteázinhibitorok) és a degradált formák alkalmas frakcionálási lépésekkel eltávolíthatók.

Bár a szolubilizálás és az összehajtogatás/oxidálás során (folding/oxidation) az urea előnyösnek tűnt, más szolubilizálószereket is hatékonyan alkalmazhatunk, ilyenek például a guanidin-HCl [például 6 M a szolubilizálás és 12,5 M az összehajtogatás/oxidálás (folding/oxidation) során] és a nátrium-N-lauroil-szarkozin. Az összehajtogatás/oxidálás (folding/oxidation) után a tisztított SCF-ekről az anyagot a már ismertetett SDS-PAGE-eljárással eltávolítjuk és megfelelő frakcionálási lépések során visszanyeljük.

Továbbá bár az összehajtogatás/oxidálás (folding/oxidation) során a glutation megfelelőnek bizonyult, más anyagokat is azonos vagy közel azonos hatékonysággal alkalmazhatunk. Ezek például az alábbiak lehetnek: 1 mM glutation helyett 2 mM glutation és 0,2 mM oxidált glutation, vagy 4 mM glutation és 0,4 mM oxidált glutation, vagy 1 mM 2-merkaptoetanol vagy más tiolreagens.

A bemutatott kromatográfiás eljáráson kívül más eljárások is alkalmasak az SCF-ek tisztított formájának létrehozására, ilyen például a hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfia [például fenil-Sepharose (Pharmacia) alkalmazásával, mintafelvitel semleges pH-n, 1,7 M ammónium-szulfáttal, elúció csökkenő ammónium-szulfát-gradiensben]; immobilizált fémaffinitáskromatográfia [például Cu²-ionokkal töltött

HU 220 234 Β kelátos-Sepharose (Pharmacia) alkalmazásával, mintafelvitel közel semleges pH-η, 1 mM imidazollal, elúció növekvő imidazolgradiensben]; hidroxil-apatit-kromatográfia [felvitel közel semleges pH-η, 1 mM foszfáttal, elúció növekvő foszfátgradiensben]; más, a szakmában általánosan ismert eljárások szintén alkalmasak lehetnek.

A humán SCF más formái - melyek részben vagy egészen megfelelnek a 42. ábrán látható, 1-248 aminosav által kódolt nyitott leolvasási keretnek („open reading frame”) vagy a néha előforduló (például a bemutatott cDNS-szekvenciában, 44. ábra), alternatívan összekapcsolódó mRNS-eknek - E. coliban expresszálhatók és a példában bemutatott eljárással vagy más, a szakmában általánosan ismert eljárásokkal, tisztított formában állíthatók elő.

Az egyes készítmények tisztítása és létrehozása során a 16. példában úgynevezett transzmembránterületekre hivatkozunk, ami detergensek alkalmazását jelenti, beleértve nemionos detergenseket és lipideket, beleértve a foszfolipidtartalmú liposzómaszerkezeteket.

11. példa

Emlőssejtekből származó rekombináns SCF

A) Az SCF-et termelő CHO sejtek fermentációja

A kínaihörcsög-petefészek (Chinese hamster ovary, CHO) eredetű rekombináns sejtek (CHO pDSRa2 hSCF¹-¹⁶² törzs) a hSCF*-¹⁶² termelése céljából 20 1 űrtartalmú elárasztott tenyésztőrendszerben, mikrohordozókon nőttek. A fermentációs rendszer hasonló az l.B) példában bemutatott, a BRL 3A sejtek tenyészetének esetében alkalmazotthoz, az alábbi eltérésekkel : a CHO sejtek tenyésztésére alkalmazott növekedési közeg Dulbecco-féle módosított Eagle-közeget (DMEM) és HAM-féle F-12 tápközeget tartalmazott 1:1 arányban (Gibco), 2 mM glutaminnal, nem esszenciális aminosavakkal (a koncentráció megkétszerezése 1:100-szorosra hígított Gibco #320-1140 oldattal) és 5% fetális szarvasmarhaszérummal kiegészítve. Az összegyűjtött közeget a szérum elhagyásával azonosítottuk. A reaktort 5,6 χ 10⁵ sejt/ml mennyiségű CHO sejttel inokuláltuk, melyek két darab 3 literes edényben nőttek. A sejteket 4xl0⁵ sejt/ml koncentrációig hagytuk nőni. Ekkor 3 liter foszfátpufferes sóoldat-szuszpenzióban 100 g előre sterilezett citodex-2 mikrohordozót (Pharmacia) adtunk a fermentorhoz. A sejtek megtapadtak a hordozón és 4 napig növekedtek. A reaktort a glükózfogyasztás alapján árasztottuk el a táptalajjal. A glükózkoncentrációt 2 g/1 körüli értéken tartottuk. Négy nap után a reaktort a szérum nagy részének eltávolítása céljából hatszoros mennyiségű szérummentes tápközeggel árasztottuk el (fehérjekoncentráció <150 pg/ml). A reaktor 2 g/1 glükózkoncentrációig szakaszosan működött. Ettől kezdve megközelítőleg 20 1/nap folyamatos perfúziós rátával üzemeltettük. A tenyészet pH-ját a CO₂ áramlási sebességgel 6,9+-0,3 értékre állítottuk be. Az oldott oxigént a levegőben 20%-os telítettség felett tartottuk, és szükség esetén tiszta oxigénnel egészítettük ki. A hőmérsékletet 37+-0,5 °C értéken tartottuk.

A fenti eljárással megközelítőleg 450 1 szérummentes kondicionált közeget állítottunk elő, melyet a rekombináns humán eredetű SCF¹¹⁶² tisztítása során kiindulási anyagként alkalmaztunk.

Hasonló eljárással, de a CHO pDSRa2 rSCF^1-162 törzs alkalmazásával megközelítőleg 589 1 szérummentes kondicionált közeget állítottunk elő, melyet a patkány eredetű SCF^1-162 tisztítása során kiindulási anyagként alkalmaztunk.

B) Az emlősökben expresszált rekombináns patkány eredetű SCF¹-¹⁶² tisztítása

Amennyiben másképp nem jelöltük, minden tisztítási lépést 4 °C-on hajtottunk végre.

1. Koncentrálás és diafiltrálás

A példa A) pontjában ismertetett, a CHO pDSRa2 patkány-SCF¹¹⁶² törzs szérummentes közegben való növekedése során termelt kondicionált közeget 0,45 μοβ Sartocapsules (Sartorius) szűrőn szűrtük. Több tételt (361,101 1,1021,2001 és 1501) külön-külön koncentráltunk és diafiltrálásnak/puffercserének vetettünk alá. Szemléltetésképpen bemutatjuk a 36 1-es tétel kezelését. A leszűrt közeget Millipore Pellicon tangenciális áramlású ultraszűrő készülékkel megközelítőleg 500 ml-re töményítettük három 10 000 molekulatömeg le vágási pontú cellulóz-acetát membránkazetta (1,4 m² teljes terület; szivattyúzási ráta megközelítőleg 2200 ml/perc; és a szűrési ráta 750 ml/perc) alkalmazásával. Az anioncserélő kromatográfiás lépésnél a diafiltrálás/puffercsere során a készítményhez 1000 ml 10 mM Tris-HCl-t, pH=6,7-6,8, adtunk és a tangenciális áramlású ultraszűrő készülékkel ismét 500 ml-re töményítettük, majd ezt a lépést még ötször ismételtük meg. A koncentrált/diafiltrált anyag végső mennyisége 1000 ml volt. A koncentrált és diafiltrálásnak/puffercserének alávetett, kondicionált közeget tartalmazó tételek viselkedése hasonló volt. Az egyes tételek fehérjetartalmát Bradford módszerével [Anal. Bioch., 72,248-254 (1976)], 70-90 pg/ml közötti szarvasmarha-szérumalbumin standard sorozattal szemben vizsgáltuk. A készítményhez alkalmazott kondicionált közeg teljes mennyisége 5891 volt.

2. Q-Sepharose Fást Flow anioncserélő kromatográfia

A fenti öt tételből származó koncentrált/diafiltrált anyagot elegyítettük (5000 ml össztérfogat). A pH-t 1 M HCl-dal 6,75 értékre állítottuk. 2000 ml 10 mM Tris-HCl-dal, pH = 6,7, az elegy konduktivitását 0,7000 mmho értékre állítottuk. A készítményt Q-Sepharose Fást Flow anioncserélö oszlopra (36x 14 cm; Pharmacia Q-Sepharose Fást Flow gyanta) vittük, melyet 10 mM Tris-HCl-pufferrel, pH=6,7, ekvilibráltunk. A minta felvitele után az oszlopot 28 700 ml Tris-pufferrel mostuk. Ezután az oszlopot 23 000 ml mennyiségű 5 mM ecetsav/1 mM glicin/6 M urea/20 μΜ CuSO₄ elegyével, pH=4,5, mostuk. A következő lépésben 10 mM Tris-HCl és 20 μΜ CuSO₄, pH=6,7, elegyével mostuk, ezzel visszaállítottuk a semleges pH-t, és eltávolítottuk az ureát, majd sógradienst alkalmaztunk (0-700 mM NaCl 10 mM Tris-HCl-ban, 20 μΜ CuSO₄, pH=6,7, puffer; 40 1 össztérfogat). 3250 ml/óra folyadékrátával 490 ml-es frakciókat gyűj35

HU 220 234 Β gélszűrő oszlopra vittünk (5x55,5 cm), melyet előzőleg foszfátpufferes fiziológiás sóoldattal ekvilibráltunk.

ml/óra folyadékrátával 6,8 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 280 nm-en abszorbanciacsúcsot mutató frakciókat pooloztuk, ez adta a végső tisztított anyagot.

A 15. táblázat a tisztítási eljárásokat foglalja össze.

töttünk. A kromatogramot a 36. ábrán mutatjuk be. Az „MC/9 cpm” az MC/9 mérések során kapott biológiai aktivitásokra vonatkozik; a jelzett frakciókból 5-5 ml-t mértünk. A minta felvitelekor és a mosás során kapott eluátumokat az ábrán nem tüntettük fel; ezekből a frakciókból nem tudtunk biológiai aktivitást kimutatni.

3. Szilikáthoz kötött hidrokarbongyantával végzett kromatográfia

A 36. ábrán bemutatott futtatás 44-66. frakcióját (11 200 ml) elegyítettük és EDTA-t adtunk hozzá, 1 mM végső koncentrációban. Az anyagot körülbelül 2000 ml/óra folyadékrátával C4 oszlopra (Vydac Proteins C4; 7x8 cm) vittük, melyet előzőleg A pufferrel (A puffer: 10 mM Tris, pH=6,7/20% etanol) ekvilibráltunk. A minta felvitele után az oszlopot 1000 ml A pufferrel mostuk. Ezután lineáris A-B puffer (B puffer: 10 mM Tris, pH=6,7/20% etanol) gradienst alkalmaztunk (össztérfogat 6000 ml), és 35-50 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A biológiai méréshez a C4 oszlop kiindulómintájának részeit, az átfutópoolt és a mosópoolt a gradiensfrakciók 0,5 ml-es aliquot mennyiségeinek hozzáadásával foszfátpufferes fiziológiás oldattal szemben dializáltuk. Az egyes frakciókat MC/9 méréssel mértük (a gradiensfrakciókból 5 ml-es aliquotokat vizsgáltunk, cpm a 37. ábrán). Az aliquot frakciók SDS-PAGE [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970); a „stacking” gél 4% (w/v) akrilamidot, míg a szeparálógél 12,5% (w/v) akrilamidot tartalmazott] képét a 38. ábrán mutatjuk be. A bemutatott géleken az aliquot mintákat (100 pl) vákuumban szárítottuk, majd 20 μΐ mintakezelő pufferrel (redukáló, azaz 2-merkapto-etanolt tartalmaz) ismét feloldottuk és a gélre öntés előtt 5 percig főztük. Az ábra bal oldalán látható számozott jelek a migráló molekulatömeg-markerek helyeit jelzik (redukált). A számozott vonalak a gradiens felvitele végén gyűjtött frakciókat szemléltetik. A gélt ezüstfestéssel tettük láthatóvá [Morrisey, Anal. Bioch., 117, 307-310(1981)].

4. Q-Sepharose Fást Flow anioncserélő kromatográfia

A 37. ábrán látható C4 oszlop 989-124. frakcióit pooloztuk (1050 ml). A poolt az etanolkoncentráció csökkentése céljából 1:1 arányban 10 mM Tris-sel, pH=6,7, hígítottuk. A hígított poolt Q-Sepharose Fást Flow anioncserélő oszlopra (3,2x3 cm, Pharmacia Q-Sepharose Fást Flow anioncserélő gyanta), melyet előzőleg 10 mM Tris-HCl-pufferrel, pH=6,7, ekvilibráltunk. A folyadékráta 463 ml/óra volt. A minta felvitele után az oszlopot 135 ml mennyiségű, az oszlopon alkalmazott pufferrel mostuk, és a megkötött anyagot 10 mM Tris-HCl és 350 ml NaCl, pH=6,7, elegyével történő mosással eluáltuk. Az oszlopon ellentétes áramlási irányt alkalmaztunk, így minimálisra csökkentettük az eluált anyag mennyiségét, az elúció során 7,8 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.

5. Sephacryl S-200 HR gélszűréses kromatográfia

A Q-Sepharose Fást Flow anioncserélő kromatográfia sós mosása során eluált fehérjét tartalmazó frakciókat pooloztuk (31 ml). 30 ml-t Sephacryl S-200 HR

75. táblázat

Az emlősökben expresszált rekombináns patkány eredetű SCF*-¹⁶² tisztításának összefoglalása

Lépés	Térfogat (ml)	Összfchcrjc (mg)*
Kondicionált közeg (tömény)	7 000	28 400
Q-Sepharose Fást Flow	11 200	974
C4-gyanta	1 050	19
Q-Sepharose Fást Flow	31	20
Sephacryl S-200 HR	82	19**

* Bradford eljárásával (lásd fent, 1976) meghatározva.

** A 2. példában bemutatott kvantitatív aminosavanalízis alapján 47,3 mg-ot határoztunk meg.

A tisztított, patkány eredetű SCF’-¹⁶² N-terminális aminosavszekvenciájának fele Gln-Glu-Ile..., a másik fele piro-Glu-Glu-Ile..., amit a 2. példa alapján határoztunk meg. Ezek szerint a patkány eredetű SCF¹¹⁶² a proteolitikus eljárás/hasítás (-1) (Thr) és (+1) (Gin) gyökei közötti termék, amit a 14C. ábrán látható számok jelölnek. Hasonlóképpen, a fertőzött CHO sejtek kondicionált közegéből (lásd lent) származó humán eredetű SCF¹¹⁶² N-terminális aminosavszekvenciája Glu-Gly-Ile, ami azt mutatja, hogy az a proteolitikus eljárás/hasítás (-1) (Thr) és (+1) (Glu) gyökei közötti termék, amit a 15C. ábrán mutatunk be.

A fenti eljárás eredményeként CHO sejtek által expresszált vagy természetes eredetű, tisztított, humán SCF-fehérjét kapunk.

Az emlős eredetű rekombináns SCF-ek tisztítására alkalmas tisztítási eljárásokat mutattunk még be az 1. és a 10. példában, ezeken kívül még számos, a szakmai körökben általánosan ismert eljárás alkalmazható.

A humán SCF más formái - melyek részben vagy egészen megfelelnek a 42. ábrán látható, 1-248 aminosav által kódolt nyitott leolvasási keretnek („open reading frame”) vagy a ritkán előforduló (például a bemutatott cDNS-szekvenciában, 44. ábra), alternatívan összekapcsolódó mRNS-eknek - emlőssejtekben expresszálhatók és a példában bemutatott eljárással vagy más, a szakmában általánosan ismert eljárásokkal, tisztított formában állíthatók elő.

C) SDS-PAGE-eljárás és glikozidázkezelés

A Sephacryl S-200 HR gélszűrő oszlopról származó poolozott frakciók SDS-PAGE képét a 39. ábrán mutattuk be; a poolból 25 μΐ-t futtattunk (1. sáv). A sávot ezüstfestéssel tettük láthatóvá. A molekulatömeg-markereket (6. sáv) a 6. ábrán már bemutattuk. Az M_r 31 000 markerpozíció felett és valamivel alatta migráló anyagok biológiai aktivitással rendelkeznek; a jól

HU 220 234 Β látható heterogenitást elsősorban a glikoziláció heterogenitása okozza.

A glikoziláció jellemzésére a megtisztított anyagot különféle glikozidázokkal kezeltük, SDS-PAGE-eljárással elemeztük (redukáló körülmények) és ezüstfestéssel tettük láthatóvá. Az eredményeket a 39. ábrán mutatjuk be. 2. sáv, neuraminidáz. 3. sáv, neuraminidáz és O-glikanáz. 4. sáv, neuraminidáz, N-glikanáz és O-glikanáz. 5. sáv, neuraminidáz és N-glikanáz. 7. sáv, Nglikanáz. 8. sáv, N-glikanáz, szubsztrát nélkül. Az eljárást az alábbi módon hajtottuk végre. 10 mM 3-[(3klór-amido-propil)-dimetil-ammónio]-1 -propánszulfonátot (CHAPS), 66,6 mM 2-merkapto-etanolt, 0,04% (wt/vol) nátrium-azidot és foszfátpufferes fiziológiás sóoldatot 30 percig 37 °C-on tartunk, majd 18 órán keresztül, 37 °C-on a kívánt glikozidázmennyiség felével inkubáljuk. Neuraminidázt (Arthrobacter ureafaciens által termelt; forgalmazza: Calbiochem) 0,5 U/ml végső koncentrációban alkalmaztunk. Az O-glikanázt (Genzyme; endo-alfa-N-acetil-galaktózaminidáz) 7,5 mU/ml koncentrációban alkalmaztuk. Az N-glikanázt [Genzyme; N-glikozidáz F; peptid-N⁴-(N-acetil-béta-glükózaminil)-aszparagin-amidáz] 10 mU/ml koncentrációban alkalmaztuk.

Amennyiben lehetőség nyílt rá, számos kontrollinkubálását hajtottuk végre. Ezek az alábbiak voltak: annak igazolására, hogy az eredmények a glikozidázadagolásnak köszönhetők, inkubálás glikozidázok nélkül; annak igazolására, hogy az alkalmazott glikozidáz enzim aktív volt, inkubálás glikozilezett fehérjékkel (például glikozilezett rekombináns humán eritroproteinnel), ami köztudottan a glikozidáz szubsztrátja; és annak eldöntésére, hogy a glikozidázkészítmények a láthatóvá tett gélsávhoz hozzájárulnak vagy azokat gyengítik, inkubálás glikozidázokkal, de szubsztrát nélkül (39. ábra, 8. és 9. sáv).

A fenti kísérletekből számos következtetést vonhatunk le. Az N-glikanázos [ami a legtöbb komplex és nagy mannóztartalmú N-kötött karbohidrátokat eltávolítja; Tarentino és társai, Biochemistry, 24,4665-4671 (1988)], a neuraminidázos (ami a sziálsavgyököket távolítja el) és az O-glikanázos [ami az egyes O-kötött karbohidrátokat távolítja el; Lambin és társai, Biochem. Soc. Trans., 12, 599-600 (1984)] kezelések azt sugallják, hogy mind N-kötött, mind O-kötött karbohidrátok vannak jelen; valamint sziálsav van jelen, mégpedig legalább az O-kötött rész felében. Az a tény, hogy az N-glikanázos kezelés az SDS-PAGE kép alapján heterogénnek tűnő, migráló anyagot egy jóval homogénebb, gyorsabban migráló formává tudja átalakítani, azt mutatja, hogy az egész anyag azonos polipeptidekből áll, mely heterogenitását a glikozilezés heterogenitása okozza.

12. példa

Rekombináns SCF¹~^I64PEG előállítása

Az E. coli expressziós rendszerből származó, tisztított, patkány eredetű SCF^{1 164}-t, lásd 6. példa, alkalmaztuk az alábbiakban bemutatásra kerülő polietilénglikolos módosítások során.

Metopolietilénglikol-szukcinimidil-szukcinát (18,1 mg=3,63 pmol; SS-MPEG - Sigma Chemical Co. No. M3152, megközelítő molekulatömeg=5000) 0,327 ml deionizált vízzel készült oldatához 13,3 mg (0,727 pmol) patkány eredetű SCF^{1 164} 1,0 ml 138 mM nátrium-foszfáttal, 62 mM NaCl-dal és 0,62 mM nátrium-acetáttal készült elegyét adtuk, pH=8,0. A kapott elegyet 30 percig szobahőmérsékleten óvatosan ráztuk (100 rpm). Ezután a kapott reakcióelegy 1,0 ml-es aliquotját (10 mg fehérje) Pharmacia Superdex 75 gélszűrő oszlopra vittük (1,6x50 cm) és 100 mM-os nátrium-foszfáttal, pH=6,9, folyadékráta 0,25 ml/perc, szobahőmérsékleten eluáltuk. Az oszlopról lefolyó anyag első 10 ml-ét elöntöttük, majd ezután 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 40. ábrán az oszlopról lejövő anyag 280 nm-en folyamatosan mért UV-abszorbanciáját mutatjuk be. A 25-27. frakciókat elegyítettük és ultraszűréssel, 0,2 p pórusméretű poliszulfonmembrán alkalmazásával (Gelman Sciences No. 4454) sterileztük, majd az így kapott poolt PEG-25-tel jeleztük. Hasonlóképpen, a 28-32. frakciókat elegyítettük, sterileztük és PEG-25-tel jeleztük. A PEG-25-tel jelzett poolozott frakciók 3,06 mg fehérjét tartalmaztak, ezt A280-on határoztuk meg, a mérés során a kalibrációt 0,66 abszorbanciájú 1,0 mg/ml nem módosított, patkány eredetű SCF^1-1 «-oldattal végeztük. A reakcióelegy összes fehérjetartalmának 11,8%-át reprezentáló, nem reagált patkány eredetű SCF*-¹⁶⁴-et a 34-37. frakcióban eluáltuk. Hasonló kromatográfiás körülmények között a nem módosított patkány eredetű SCF¹-¹⁶⁴

45,6 ml retenciós térfogatban mint főcsúcs eluálódott, lásd 40B. ábra. A 77-80. frakció a patkány eredetű SCF^{1 164} és az SS-MPEG reakciója melléktermékeként keletkezett N-hidroxi-szukcinimidet tartalmazott.

A patkány eredetű SCF¹-*⁶⁴ potenciálisan reaktív aminocsoportjai a 12 lizingyök és az N-terminális glutamingyök alfa-aminocsoportja. A PEG-25 poolozott frakcióit úgy elegyítettük, hogy 9,3 mól reaktív aminocsoport/mol fehérjemennyiséget tartalmazzanak, ezt Habeeb eljárásával [Anal. Biochem., 14:328-336 (1966)], trinitro-benzénszulfonsavas, spektroszkópiás titrálással határoztuk meg. Hasonlóképpen, a PEG-25 poolozott frakciói 9,3 mól reaktív aminocsoport/mol fehéqemennyiséget tartalmaztak, illetve a nem módosított patkány eredetű SCF^1-164 13,7 mól reaktív aminocsoport/mol fehérjemennyiséget tartalmazott. így az SS-MPEG reakció során a patkány eredetű SCF^1-164 poolozott PEG-32 frakcióiban átlagosan 3,3 (13,7 mínusz 10,4) aminocsoport lett módosítva. Hasonlóképpen, a patkány eredetű SCF^1-164 poolozott PEG-25 frakcióiban átlagosan 4,4 aminocsoport lett módosítva. A 10. példa szerint előállított, humán eredetű SCF (hSCF¹-¹⁶⁴) módosítása szintén a fenti eljárással történt. Speciálisan 714 mg (38,5 pmol) hSCF^{1 164} 962,5 mg (192,5 pmol) SS-MPEG-gel reagált, 75 ml 0,1 M nátrium-foszfát-pufferben, pH=8,0, 30 perc alatt, szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet Sephacryl S-200HR oszlopra vittük (5 χ 134 cm), PBS-sel (Gibco Dulbecco-féle foszfátpufferes sóoldatban, CaCl₂ és MgCl₂ nélkül), 102 ml/óra folyadékráta mellett eluáltuk, és 14,3 ml-es

HU 220 234 Β frakciókat gyűjtöttünk. A 30-53. frakciókat, melyek a fenti PEG-25 pooloknak felelnek meg, lásd 40A. ábra, pooloztuk, összes fehérjetartalmuk 354 mg volt. Ezeknek a módosított SCF-eknek az emlősökön mutatott in vivő aktivitását a 8.C) példában ismertettük.

13. példa

SCF-expresszió a leukémiás blasztsejteken

A leukémiás blasztsejteket vegyes eredetű leukémiás betegek perifériális véréből gyűjtöttük. A sejteket sűrűséggradiens centrifúgálással és a megtapadás legyengülésének kihasználásával tisztítottuk. A humán eredetű SCF^I164-et a 7. példa eljárása szerint jódoztuk. A sejteket a leírás szerint jódozott SCF különböző koncentrációjával inkubáltuk [Broudy, Blood, 75, 1622-1626 (1990)]. A receptorkötéses kísérletek eredményeit a 41. ábrán mutatjuk be. A receptor sűrűségének értéke megközelítőleg 70 000 receptor/sejt volt.

14. példa

Patkány eredetű SCF korai limfoid prekurzorokon mutatott aktivitása

A rekombináns, patkány eredetű SCF·-¹⁶⁴ (rrSCF^1-164) azon képességét, mely szerint a limfoid sejtek burjánzásának fokozására az lL-7-tel szinergizálni tud, egércsontvelő agartenyészetén vizsgáltuk. A mérés során a csak rrSCF^{1 -164}-gyel képződött telepek monocitákat, neutrofileket és magvas vörösvértestsejteket tartalmaztak, míg a csak IL-7-tel vagy IL-7tel és rrSCF^1-164-gyel stimulált telepek elsődlegesen pre-B-sejteket tartalmaztak. A B²²⁰⁺, slg és Cu⁺ alapján jellemzett pre-B-sejteket a poolozott sejtek FACSanalízisével azonosítottuk, az lg felszínéhez [Coffman, Immunoi. Rév., 69, 5 (1982)] és a B220 antigénhez (FITC-kecske-anti-K, Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL) kapcsolódó, fluoreszceinnel jelzett antitestekkel; valamint a citoplazma U expressziója alapján, a citospin lemezek elemzésével, fluoreszceinnel jelzett antitestekkel (TFITC-kecske-anti-K, Southern Biotechnology Assoc.). A rekombináns humán eredetű IL-7-et (rhIL-7) a Biosource Intemationaltól szereztük be (Westlake Viliágé, CA). Amennyiben az rrSCF^1-164-et a pre-B-sejtek növekedési faktorával, az IL-7-tel együtt alkalmaztuk, a tenyészet növekedése során fokozódott a szinergizmus (16. táblázat), ami az rrSCF^1-164-nek a pre-B-sejt progenitorokra gyakorolt stimulálóhatását jelzi.

16. táblázat

Az rrSCF^1-164 és az IL-7 keverékének a pre-B-sejtek tenyészetképzésére gyakorolt stimulálóhatása

Növekedési faktor	Tenyészet száma1
Sóoldat
rrSCF1-164 200 ng	13+-2
100 ng	7+-4
50 ng	4+-2
rhIL 7 200 ng	21 + -6

Növekedési faktor	Tenyészet száma1
100 ng	18+6
50 ng	13 + -6
25 ng	4+-2
rhIL-7 200 ng+rrSCF1-164 200 ng	60+-0
100 ng+rrSCF1-164 200 ng	48+-8
50 ng+rrSCF1 164 200 ng	24+-10
25 ng+rrSCF1-164 200 ng	21 +-2

¹ Tenyészetek száma per 5 χ 10⁴ lemezeit egércsontvelősejt.

Az egyes értékek a megháromszorozódott tenyészetek középértékére vonatkoznak + - SD.

15. példa

Az SCF-receptor azonosítása

A) Az SCF¹ ~¹⁶⁴ receptora a c-kit

Annak vizsgálatához, hogy az SCF^1-164 a c-kit liganduma-e, a teljes rágcsáló-c-kitet [Qiu és társai, EMBO J., 7, 1003-1011 (1988)] az MC/9 hízósejtvonalra érzékeny [Nabel és társai, Natúré, 291, 332-334 (1981)] SCF^1-164 PCR alkalmazásával, az ismertetett szekvenciák primerjeivel amplifikáltuk. Az 1-549. aminosav által kódolt [Yardén és társai, EMBO J., 6, 3341-3351 (1987)] humán c-kit ligand kötéseit és transzmembrándoménjeit a humán eritroleukémia-sejtvonal, a HEL esetében alkalmazott eljárásokkal klónoztuk [Martin és Papayannopoulou, Science, 216, 1233-1235 (1982)]. A c-kit-cDNS-t a COS-1 sejtek által expresszált V19.8 emlős expressziós vektorba illesztettük, és a membránrészeket az alábbiakban bemutatásra kerülő B) és C) pontok alapján, a patkány vagy humán eredetű ¹²⁵I-SCF^1-164 kötések vizsgálata során hoztuk létre. A 17. táblázat egy jellemző kötésvizsgálat eredményeit foglalja össze. A csak V19.8-cal fertőzött COS-1 sejtek és a ¹²⁵I humán SCF^1-164 között nem találtunk detektálható, specifikus kötést. Ugyanakkor a humán rekombináns c-kit ligand kötést és transzmembrándoméneket (hckit-LTl) expresszáló COS-1 sejtek a ¹²⁵I-hSCF^1-164-hez kapcsolódtak (17. táblázat). Amennyiben a rendszerhez további 200-szoros feleslegben nem jelzett, humán SCF^1-164-et adtunk, a kötések mennyisége a háttér szintjére csökkent. Hasonló módon, a teljes rágcsáló-c-kittel (mckit-Ll) transzfektált COS-1 sejtek a ¹²⁵I-SCF^1-164-hez kapcsolódtak. A csak V19.8-cal transzfektált COS-1 sejtek kis mennyisége kapcsolódott a ¹²⁵I-SCF^1-164-hez, de ugyanezt tapasztaltuk a nem transzfektált COS-1 sejtek esetében is (nem ábrázoltuk), ami azt mutatja, hogy a COS-1 sejtek endogén c-kitet expresszálnak. Ez a felfedezés a c-kit-expresszió széles körű celluláris elterjedésével van összhangban. A patkány eredetű ¹²⁵I-SCF^1-164 mind a humán, mind a rágcsáló-c-kithez hasonló mértékben kapcsolódik, míg a humán eredetű ¹²⁵I-SCF^1-164 kisebb aktivitással kapcsolódik a rágcsáló-c-kithez (17. ábra). Ezek az adatok megfelelnek az SCF^1-164 egyes fajok között mutatott keresztreakti38

HU 220 234 Β vitási rendszerének. A patkány eredetű SCF^{1 164} a humán eredetű SCF^{1 164}-hez hasonló aktivitással indukálja a humán csontvelő szaporádását, míg a humán eredetű SCF¹¹⁶⁴ a rágcsáló eredetű hízósejtek szaporádását, ami 800-szor kisebb aktivitással indukálja, mint a pat- 5 kány eredetű fehérjéknél.

Összefoglalásul megállapíthatjuk, hogy a kapott adatok megerősítik a számos sejttípus fejlődése során kritikus c-kit represszor/ligandum kapcsolatok elsődleges hasonlóságai következtében fellépő, a W vagy Sl mutáns egerek által expresszált fenotípusos abnormalitásokat.

17. táblázat

Az SCF¹¹⁶⁴ kapcsolódása a COS-1 sejtekben expresszált rekombináns c-kithez

Transzfektált plazmid	CPM-kötéseka
humán SCF1’164	patkány-SCF1-164
125I-SCFb	'^ISCF+hidegc	125I-SCFd	125I-SCF+hidcge
V19.8	2 160	2 150	1 100	550
V19.8:hckit-LT1	59 350	2 380	70 000	1 100
V19.8:mckit-Ll	9 500	1 100	52 700	600

^a A kétszer megismételt mérések átlagát közöltük; a kísérleteket három alkalommal, egymástól függetlenül hajtottuk végre, az eredmények hasonlóak voltak.

^b 1,6 nM humán SCF^1-164.

^c 1,6 nM humán SCF^1-164+320 nM nem jelzett humán SCF^1-164.

⁴ 1,6 nM patkány-SCF^1-164.

^e 1,6 nM patkány-SCF' ¹⁶⁴+320 nM nem jelzett patkány-SCF¹-¹⁶⁴.

B. Rekombináns c-kit-expresszió a COS-1 sejtekben A humán és a rágcsáló eredetű c-kit-cDNS-klónok a humán eritroleukémia-sejtvonalból, a HEL-ből, illetve az MC/9 sejtekből savas fenolos/kloroformos extrakciós eljárással [Chomczynsky és Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)] izolált teljes RNS PCRtechnikájából [Saiki és társai, Science, 239, 487-491 (1988)] származtak. Az egyéni oligonukleotid-szekvenciákat az ismertetett humán és rágcsáló-c-kitekből terveztük. Az egyszálú cDNS-t a teljes RNS-ből az Mo-MLV reverz transzkriptáz enzimhez (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) kapott eljárással szintetizáltuk, c-kitre érzékeny oligonukleotidn primerek alkalmazásával. A c-kit ligand kötések és a tirozinkináz domének átfedőrégióinak amplifikálása a megfelelő c-kit primer párok alkalmazásával történt. Ezeket a régiókat a COS-1 sejtekben történő expresszió céljából VI 9.8 expressziós vektorba klónoztuk (17. ábra). Az egyes kiónok DNS-szekvenciájában független mutációk jelentkeztek, amelyek valószínűleg a PCR-amplifikáció során keletkeztek. Az egyes kiónok mutációmentes restrikciós fragmentumaiból egy klónmentes mutációt hoztunk létre. Az összes kiónban vagy körülbelül a felükben az ismertetett szekvenciától való eltérés jelentkezett; ez valószínűleg az alkalmazott sejtvonalakban jelen levő aktuális szekvenciák következménye, és az ismertetett szekvenciák allélikus különbségeit tükrözi. A V19.8-ban az alábbi plazmidokat hoztuk létre: V19.8:mckit-LT1, a teljes rágcsáló-c-kit és V19.8:hckit-LT1, amely a humán c-kit ligandkötő, plusz transzmembránrégióját (1-159. aminosav) tartalmazza.

A plazmidokat a 4. példa eljárása szerint transzfektáltuk a COS-1 sejtekbe.

C) A ¹²⁵I-SCF¹~¹⁶⁴ kapcsolása a rekombináns c-kitet expresszáló COS-1 sejtekhez

A transzfekció után két nappal a COS-1 sejteket eltávolítottuk az edényről, PBS-sel mostuk és a felhasználásig fagyasztva tároltuk. A fagyasztás után a sejteket 1 mM MgCl₂-t, 1 mM PMSF-et, 100 pg/ml aprotinint, 25 pg/ml leupeptint, 2 pg/ml pepstatint és 200 pg/ml TLCK-HCl-et tartalmazó, 10 mM TrisHCl-ben felszuszpendáltuk. A szuszpenziót ötszöri felle pipettázással diszpergáltuk, 15 percig jégen inkubáltuk, majd Dounce-homogenizátorral, 15-20 ütéssel homogenizáltuk. A homogenizált anyaghoz cukrózt (250 mM) adtunk, majd a nukleáris frakciót és a megmaradt feltáratlan sejteket 500xg fordulatszám mellett 30 percig 4 °C-on centrifugáltuk, így eltávolítottuk a megmaradt sejttörmeléket. A humán és patkány eredetű SCF^1-164-et Klóramin-T alkalmazásával radioaktívan klóroztuk [Hunter és Greenwood, Natúré, 194, 495-496 (1962)]. A COS-1 membránfrakciót humán és patkány eredetű ¹²⁵I-SCF^1-164-gyel (1,6 nM), 200szoros moláris feleslegben alkalmazott, nem jelzett SCF^l-l64-nek RPMI-t tartalmazó, 1% szarvasmarhaszérumalbuminnal és 50 mM HEPES-szel (pH=7,4) kiegészített kötőpufferében vagy a nélkül 1 órán keresztül, 22 °C-on inkubáltuk. A kötőinkubálásból levont következtetések alapján a membránpreparátumot óvatosan 150 pl ftalátolajra rétegeztük és 20 percig Beckman Microfuge 11-ben centrifugáltuk, így elválasztottuk a membránhoz kapcsolt ¹²⁵I-SCF>-¹⁶⁴-et a szabad ¹²⁵I-SCF^1-164-től. A pelleteket eltávolítottuk,

HU 220 234 Β és a membránhoz kapcsolt ¹²⁵I-SCF^1-164 mennyiségét meghatároztuk.

16. példa

Humán SCF-cDNS izolálása

A) A HT-1080 cDNS-könyvtár létrehozása

A HT-1080 humán fibroszarkóma-sejtvonalból (ATCC CCL 121) izolált teljes RNS-t savas guanidium-tiocianát-fenol-kloroformos extrakciós eljárással [Chomczynsky és társai, Anal. Biochem., 162, 156 (1987)] és poli(A) RNS-sel nyertük vissza, oligo(dT) spin oszlop alkalmazásával, melyet a Clontechtől szereztünk be. A kétszálú cDNS-t 2 pg poli(A) RNS-ből, BRL (Bethesda Research Laboratory) cDNS-szintézis-kittel állítottuk elő, a gyártó által javasolt körülmények között. Az oszlopon frakcionált, körülbelül 100 ng mennyiségű, átlagosan 2 kb méretű kétszálú cDNS-t 300 ng Sall/Notl-gyel feltárt pSPORT 1 vektorba [D’Alessio és társai, Focus, 12, 47-50 (1990)] ligáltuk és elektroporációs eljárással [Dower és társai, Nucl. Acids Rés., 16, 6127-6145 (1988)] DH5alfaba (BRL, Bethesda, MD) transzformáltuk.

B) A cDNS-könyvtár átvizsgálása

Az elsődleges transzformátumok megközelítőleg 2,2xlO⁵ mennyiségét 44 poolra osztottuk, melyek mindegyike megközelítőleg 5000 egyéni kiónt tartalmazott. Az egyes poolokból CTAB-DNS csapadékképző eljárással [Del Sál és társai, Biotechniques, 7, 514-519 (1989)] plazmid-DNS-t állítottunk elő. Az egyes plazmid-DNS-poolokból két-két pg mennyiséget NotI restrikciós enzimmel feltártunk és gélelektroforézissel elválasztottunk. A linearizált DNS-t GeneScreen Plus membránra (DuPont) helyeztük át és ³²P-vel jelzett, humán SCF-cDNS PCR-rel, az előzőekben már ismertetett eljárással [Lin és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 7580-7584 (1985)] hibridizáltuk (3. példa). A hibridizáció során három pozitív jelű poolt azonosítottunk. Ezeknek a tenyészeteknek a pooljait telephibridizációs eljárás alkalmazásával [Lin és társai, Gene, 44, 201-209 (1986)] addig vizsgáltuk, míg minden poolból egyedülálló tenyészetet nem kaptunk. A három izolált klón cDNS-ének mérete 5,0-5,4 kD között volt. A restrikciós enzimmel történő emésztés és az 5’-vég aminosavszekvenciájának meghatározása szerint a három klónból kettőt azonosítottunk (10-la és 21-7a). Ezek az 5’-vég kódolórégióját és a megközelítőleg 200 bp hosszúságú, le nem fordított (untranslated) régióját (5’UTR) tartalmazzák. A harmadik klón (26-la) az 5’-végen megközelítőleg 400 bp-val rövidebb, mint a másik két klón. Különlegességképpen megjegyezzük, hogy a hidrofób transzmembrándomén szekvenciája a 186-190. aminosav területén kezdődik és a 212. aminosavnál ér véget.

C) A pDSRalfa2 hSCV¹^¹⁶⁴ létrehozása

A pDSRalfa2 hSCF^1_164-et a 10-la plazmid [leírását lásd a 16.B) példában] és pGEM hSCF^1-164 alkalmazásával állítottuk elő, az alábbiak szerint. A pGEM hSCF^1I64-ből származó HindlII beillesztést az M13mp 18-ba vittük. Közvetlenül az ATG iniciálókodontól ellentétesen haladó nukleotidokat irányított mutagenezissel (site directed mutagenesis) tttccttATG-ről gccgccgccATG-re változtattuk az antiszensz, ₅,-Tct TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T-3’ oligonukleotid alkalmazásával és az Amersham Corp.tól származó, az oligonukleotidokra irányuló in vitro mutagenezis-rendszer kitjével, a cég által javasolt eljárással M13mpl8 hSCF^{K1 164}-et hoztunk létre. Ezt a DNS-t HindlII-mal feltártuk és HindlII-mal feltárt pDSRalfa2be illesztettük. A kiónt pDSRalfa2 hSCF^KI-l64-gyel jeleztük. a pDSRalfa2 hSCF^K1-'^M cDNS-t Xbal-gyel feltártuk, és a DNS-t Klenow-enzim, valamint négy dNTP hozzáadásával tompává tettük. A reakció következő szakaszában a DNS emésztését Spel enzimmel folytattuk. A 10-la kiónt Dral-gyel emésztettük, (így hoztuk létre a 3’ tompa véget a nyitott leolvasási kerethez az inszertumban) (open reading frame), valamint a Spel-gyel tártuk fel, ami a pDSRalfa2 hSCF^KI~¹⁶⁴ és a 10-la génben ugyanazon a helyen hasít. Az így kapott DNS-eket ligáltuk, így hoztuk létre a hSCF^K1-248-at.

D) A COS-sejtek pDSRalfa2 hSCF^KI-²⁴⁸-cal történő transzfekciója és immun-csapadékképzése

A COS-sejteket (ATCC CRL 1651) a fenti eljárással létrehozott DNS-sel transzfektáltuk. 4xl0⁶ sejtet 0,8 ml DMEM és 5% FBS elegyével 1600 V jelenlétében, 10 pg pDSRalfa2 hSCF^{K1 248} DNS-sel vagy 10 pg pDSRalfa2 vektor-DNS-sel (kontrollvektor) elektroporáltuk. Az elektroporáció után a sejteket 60 nm-es lemezekre vittük. 24 óra elteltével a közeget friss, teljes tápközegre cseréltük.

A transzfekció után 72 órával az egyes edényeket ³⁵S-tápközeggel, Yardén és társai eljárása szerint (PNAS, 87, 2569-2573) jeleztük. A sejteket PBS-sel egyszer mostuk, majd metioninmentes és ciszteinmentes DMEM-mel (met^_cys^_DMEM) inkubáltuk. A közeget eltávolítottuk és 1 ml met cys DMEM-et mely 100 pCi/ml Tran³⁵S jelzést (ICN) tartalmazott adtunk az edényekbe. A sejteket 8 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A közeget összegyűjtöttük, a sejttörmeléket centrifúgálással eltávolítottuk és így megtisztítva -20 °C-ra lefagyasztottuk.

A COS/pDSRalfa2 hSCFKi^-248 és COS/pDSRalfa 2 kontrollvektort tartalmazó jelzett kondicionált közeg aliquot mennyiségeit és a ³⁵S-sel jelzett COS/pDSRalfa2 hSCF^-i®⁴ klón 17 sejtek (lásd 5. példa) közegéből származó mintákat Yardén és társai módosítási eljárása szerint (EMBO, J., 6, 3341-3351) immun-csapadékképzéses eljárásnak vetettük alá. A kondicionált közegből származó 1 ml-es mintákat 10 pl preimmun nyúlszérummal (#1379 P. I.) kezeltük. A mintákat 5 órán keresztül 4 °C-on inkubáltuk. Az egyes csövekhez 0,15 M NaCl, 20 mM Tris, pH=7,5, és 0,2% Triton X-100 elegyében készített 10%-os Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem.) szuszpenziót adtunk. A mintákat további 1 órán keresztül 4 °C-on inkubáltuk. A keletkezett immunkomplexet 13 000 g fordulatszám mellett centrifugáltuk. A felülúszót új csövekbe helyeztük és a 11. példa szerint megtisztított, 5 pl mennyiségű nyúl poliklonális antiszérummal (#1381 TB4) CHO-ból származó SCF^1-164gyel szemben inkubáltuk. A mintához 1 óra alatt 100 pl

HU 220 234 Β

Pansorbint adtunk, és a keletkezett immunkomplexeket a fentiekhez hasonló eljárással kezeltük. A kapott pelleteket az alábbi eleggyel mostuk: 1 χ lizálópuffer (0,5% Na-deoxikolát, 0,5% NP-40, 50 mM NaCl, 25 mM Tris, pH=8,0) 3xmosópuffer (0,5% NaCl, 20 mM Tris, pH=7,5, 0,2% Triton X-100) és 1x20 mM Tris, pH=7,5. A pelleteket 50 μΐ 10 mM Tris, pH=7,5, 0,1% SDS és 0,1 M béta-merkaptoetanol elegyében felszuszpendáltuk. Az SCF-fehéijét 5 perces forralással távolítottuk el. A mintákat 13 000 g fordulatszám mellett 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót visszanyertük.

A glikozidázos kezelést az alábbi eljárással végeztük. 1,6 mU O-glikanázt, 0,5 U N-glikanázt és 0,02 U neuraminidázt tartalmazó 75 mM CHAPS 3 μΐ mennyiségét adtuk a 25 μΐ mennyiségű immunkomplex mintákhoz és 3 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Azonos mennyiségű 2 χ PAGE mintapuffert adtunk hozzá, és a mintákat 3 percig forraltuk. A feltárt és feltáratlan mintákat elektroforézissel, 15%-os SDS-poliakrilamid redukálógélen, 8 mA jelenlétében egy éjszakán keresztül kezeltük. A gélt metanol-ecetsav segítségével fixáltuk, 30 percig Enlightening-fokozóval (Enlightening enhancer) (NEN) kezeltük, megszárítottuk és -70 °Con, Kodak XAR-5 filmre exponáltuk.

A 43. ábrán a kapott eredmények autoradiográfiáját mutatja be. Az 1. és a 2. sáv a kontroll COS/pDSRalfa2 tenyészetet, a 3. és a 4. a COS/pDSRalfa2 hSCF^K1-248at, az 5. és a 6. a COS/pDSRalfa2 hSCF^K1-164-et ábrázolja. Az 1., a 3. és az 5. sáv a feltáratlan immuncsapadékot, a 2., 4. és 6. sáv a fenti, glikanázos feltárással kezelt anyagot ábrázolja. A molekulatömeg-markerek helyzetét az ábra bal oldalán jelöltük. A pDSRalfa2 hSCF^K1-248cal transzfektált COS sejtekben az SCF létrehozása hasonló a pDSRalfa2 hSCF^K1-164-gyel transzfektált CHO sejtek által kiválasztott hSCF^K*-¹⁶⁴-hez (11. példa).

17. példa

A humán SCF kvaterner szerkezetének elemzése

Az SCF-nek BRL-sejtek közegéből származó molekulatömeg-standardokkal történő tisztítása során, melyet az 1. példában mutattunk be, a gélszűrő oszlop (ACA 54) kalibrálása és más, kalibrált gélszűrő oszlopokon történő tisztított SCF elúciója alapján egyértelmű, hogy a BRL-sejtek közegéből tisztított SCF a molekulatömeg-standardokhoz hasonlóan viselkedik és látszólagos molekulatömege a molekulatömeg-standardokhoz viszonyítva 70 000-90 000 között van. Ezzel szemben az SDS-PAGE-eljárás során látszólagos molekulatömege 28 000-35 000 között van. Bár ezek a glikozilezett fehéijék az ilyen elemzések során rendhagyóan viselkednek, az eredmények szerint a BRL-ből származó patkány eredetű SCF nem denaturáló körülmények között nem kovalens kapcsolódású dimerként viselkedik. A rekombináns SCF-formák (azaz az E. coliból származó patkány és humán eredetű SCF^1-164 vagy a CHO-ból származó patkány és humán eredetű SCF^1-162) esetében hasonló eredményeket kaptunk, melyek szerint a nem denaturáló körülmények között történt gélszűrés alapján megbecsült molekulaméret közel kétszerese a denaturáló körülmények (azaz SDS jelenlétében) között történt gélszűrés vagy az SDS-PAGEeljárás során becsült értékeknek. Továbbá az oldat alkotói molekulatömegének pontos meghatározását lehetővé tevő analízis, a szedimentációs sebesség elemzése során az E. coliból származó, rekombináns humán eredetű SCF^1-164 molekulatömege 36 000 körül volt. Bár már említettük, hogy létezhetnek többszörös oligomer állapotok (beleértve a monomer állapotot is), úgy tűnik, hogy a reakcióelegyben ilyen körülmények között a dimer állapot van túlsúlyban.

18. példa

Humán SCF-cDNS-klónok izolálása az 5637 sejtvonalból

A) Az 5637 cDNS-könyvtár létrehozása

A humán hólyagkarcinóma 5637 sejtvonalból (ATCC HTB-121) izolált teljes RNS-t savas guanidium-tiocianát-fenol-kloroformos extrakciós eljárással [Chomczynsky és társai, Anal. Biochem., 162, 156 (1987)] és poli(A) RNS-sel nyertük vissza, oligo(dT) spin oszlop alkalmazásával, melyet a Clontechtől szereztünk be. A kétszálú cDNS-t 2 pg poli(A) RNS-ből, BRL (Bethesda Research Laboratory) cDNS-szintézis-kittel állítottuk elő, a gyártó által javasolt körülmények között. Az oszlopon ffakcionált, körülbelül 80 ng mennyiségű, átlagosan 2 kb méretű kétszálú cDNS-t 300 ng Sall/Notl-gyel feltárt pSPORT 1 vektorba [D’Alessio és társai, Focus, 12,47-50 (1990)] ligáltuk, és elektroporációs eljárással [Dower és társai, Nucl. Acids Rés., 16, 6127-6145 (1988)] DH5alfaba (BRL, Bethesda, MD) transzformáltuk.

B) A cDNS-könyvtár átvizsgálása

Az elsődleges transzformátumok megközelítőleg 2,2xlO⁵ mennyiségét 44 poolra osztottuk, melyek mindegyike megközelítőleg 5000 egyéni kiónt tartalmazott. Az egyes poolokból CTAB-DNS csapadékképző eljárással [Del Sál és társai, Biotechniques, 7, 514-519 (1989)] plazmid-DNS-t állítottunk elő. Az egyes plazmid-DNS-poolokból két-két pg mennyiséget NotI restrikciós enzimmel emésztettük és gélelektroforézissel elválasztottuk. A linearizált DNS-t GeneScreen Plus membránra (DuPont) helyeztük át és ³²P-vel jelzett, humán SCF-cDNS PCR-rel, az előzőekben már ismertetett eljárással [Lin és társai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 7580-7584 (1985)] hibridizáltuk (3. példa). A hibridizáció során hét pozitív jelű poolt azonosítottunk. Ezeknek a tenyészeteknek a pooljait telephibridizációs eljárás alkalmazásával [Lin és társai, Gene, 44, 201-209 (1986)] addig vizsgáltuk át, míg minden poolból egyedülálló tenyészetet nem kaptunk. A négy izolált klón beillesztési helyének mérete megközelítőleg 5,3 kD volt. A restrikciós enzimmel történő feltárás és az 5’-vég aminosavszekvenciájának meghatározása szerint négy kiónt azonosítottunk. A humán cDNS szekvenciáját a 44. ábrán mutatjuk be. A 44. ábrán látható cDNS által kódolt polipeptidben a 42. ábrán látható szekvenciába a 149-177. aminosavak magányos Gly-gyökökkel vannak helyettesítve.

HU 220 234 Β

19. példa

Halálos mértékű besugárzás túlélésének fokozása SCF alkalmazásával

A) Az SCF in vivő aktivitása a halálos mértékű besugárzás túlélőire

Az SCF hatását halálos mértékű besugárzást túlélő egereken vizsgáltuk. 10-12 hetes, hím Balb/c egereket alkalmaztunk. Az egyes kísérletek során 5 egérből álló csoportokat vizsgáltunk, az egereket testtömegük alapján csoportosítottuk. Az egerek besugárzása 850 raddal vagy 950 rad-dal, egyszeri dózisban történt. Az egereket a faktorokkal önmagukban vagy a faktorok Balb/c csontvelősejtekkel készült elegyével injekcióztuk. Az első esetben az egereket a besugárzás után 24 órával E. coliból származó, megtisztított, a 12. példa eljárása szerint polietilénglikol hozzáadásával módosított patkány eredetű PEG-SCF¹- ¹⁶⁴-gyel (20 pg/kg) injekcióztuk, a kontrollállatokat fiziológiás sóoldattal. A transzplantációs modell létrehozása céljából az egereket a besugárzás után 4 órával különböző sejtdózisokban normál Balb/c csontvelősejtekkel injekcióztuk. A PEG-SCF^1-164-gyel történő kezelés során 1 órával az injekciózás előtt 200 pg/kg PEG-SCF^1-164-et adtunk a sejtszuszpenzióhoz, egyszeri intravénás injekció formájában.

A 850 rad-dal való besugárzás után az egereket patkány eredetű PEG-SCF^1-164-gyel vagy fiziológiás sóoldattal injekcióztuk. A patkány eredetű PEG-SCF^1-164gyel történt injekció, a kontrollállatokkal összehasonlítva szignifikánsan fokozta az egerek túlélésének idejét (P<0,0001). A fiziológiás sóoldattal kezelt egerek túlélése átlagosan 7,7 nap volt, míg a patkány eredetű PEG-SCF^1-164-gyel kezelt egerek túlélése átlagosan 9,4 nap volt (45. ábra). A 45. ábrán bemutatott látható eredmények négy szeparált kísérlet összeállítását mutatják be, az egyes csoportok 30 egérből álltak.

A patkány eredetű PEG-SCF¹¹⁶⁴-gyel kezelt egerek fokozott túlélése az SCF-nek a besugárzott állatok csontvelősejtjeire gyakorolt hatását tükrözi. Az állatok hematológiai paramétereinek előzetes tanulmányozása szerint a besugárzás után öt nappal a vérlemezkék számában jelentéktelen mértékű növekedés tapasztalható, összehasonlítva a kontrollállatokkal, de 7 nappal a besugárzás után már nem tapasztalható szignifikáns eltérés a kontrollállatokhoz képest. Az RBC- és a WBCszintben, valamint a csontvelő cellularitásában nem tapasztaltunk különbséget.

B) Az SCF-fel kezelt transzplantált egerek túlélése

A 850 rad-dal besugárzott egerekbe transzplantált normál Balb/c csontvelősejtek 10% femurdózisai 90% vagy még több állatot mentettek meg (adatokat nem mutattunk be). így a 850 rad-dal való besugárzást 5% femurtranszplantációs dózisok tanulmányozására alkalmaztuk a patkány eredetű PEG-SCF¹- ¹⁶⁴-nek a túlélőkre gyakorolt hatásának vizsgálatára. Ezeknél a sejtdózisoknál azt vártuk, hogy az SCF-et be nem fogadó egerek jelentős %-a nem fogja túlélni a besugárzást; amennyiben a patkány eredetű PEG-SCF^1-164 stimulálja a transzplantált sejteket, a túlélés fokozódik. Amint a

46. ábrán látható, a kontrollegereknek megközelítőleg

80%-a élte túl a besugárzás utáni 8. napot. A patkány eredetű PEG-SCF^1-164-gyel való kezelése rendkívül erőteljes túlélést eredményezett, az egereknek több mint 95%-a legalább 30 nappal élte túl a besugárzást (46. ábra). A 46. ábrán bemutatott látható eredmények négy szeparált kísérlet összeállítását mutatják be, az egyes patkány eredetű PEG-SCF^1-164-gyel kezelt csoportok 20 egérből álltak. Nagyobb besugárzási dózis esetén az egerek patkány eredetű PEG-SCF^1-164-gyel való kezelése a csontvelő-transzplantációhoz kapcsolódva szintén fokozott túlélést eredményezett (47. ábra). A 950 rad-dal besugárzott és 10% femurral transzplantált kontroliegerek a kezelés után 8 nappal pusztultak el, míg a patkány eredetű PEG-SCF^1-164gyel kezelt egereknek megközelítőleg 40%-a 20 napos vagy még hosszabb idejű túlélést mutatott (47. ábra).

20. példa

Monoklonális antitestek termelése SCF-fel szemben

A 8 hetes, hím BALB/c egereket (Charles Rí ver, Wilmington, MA) 20 pg E. coliban expresszált humán eredetű SCF^1-164 teljes Freund-féle adjuvánssal (Freund’s adjuvant; H37-Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI) készült elegyével szubkután injekcióztuk. Az emlékeztető immunizálás során ugyanennek az antigénnek nem teljes Freund-féle adjuvánssal készült elegyét alkalmaztuk a 14., a 38. és az 57. napon. Az injekciózás után három nappal két egeret feláldoztunk, és lépsejtjeiket Nowiski és társai eljárása szerint [Virology, 93, 111-116 (1979)] sp 2/0 mieloma-sejtvonallal fúzionáltattuk.

Az sp 2/0 és a hibridóma sejtek tenyésztése során 20%o hőinaktivált fetális szarvasmarhaszérummal (Phibro Chem., Fort Lee, NJ), 110 mg/ml nátrium-piruváttal, 100 U/ml penicillinnel és 100 mcg/ml sztreptomicinnel (Gibco) kiegészített Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium (DMEM) (Gibco, Chargin Falls, Ohio) tápközeget alkalmaztunk. A sejtfúzió után a hibrideket a fenti, ΙΟ^-4 M hipoxantint, 4χ 10^-7 M aminopterint és 1,6 χ 10^-5 M timidint tartalmazó HAT közegben két hétig szelektáltuk, majd hipoxantint és timidint tartalmazó tápközegben két hétig tenyésztettük.

A hibridómákat az alábbi eljárással ellenőriztük. Polisztirénlyukakat (Well) (Costar, Cambridge, MA) 0,25 pg humán eredetű SCF^1-164 (E. coli) 50 pl 50 mM bikarbonátpufferben, pH=9,2, készült elegyével kétórás, szobahőmérsékleten történő, majd egy éjszakán keresztül 4 °C-on történő kezeléssel érzékenyítettünk. A lemezeket 5%o BSA PBS-ben készült elegyével 30 percig szobahőmérsékleten blokkoltuk, majd a hibridóma tenyészet felülúszójával egy órán keresztül inkubáltuk. Az elegyet dekantáltuk, és a kötött antitesteket 1:500-szoros hígítású kecske-antiegér-IgG-hez kapcsolt tormaperoxidázzal (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáltuk. A lemezeket mosóoldattal (KPL, Gaithersburg, MD) mostuk, majd H₂O₂ és ABTS (KPL) elegyével előhívtuk. A kolorimetriás vizsgálat 405 nm-en történt.

A humán eredetű SCF^1-164 (E. coli) specifikus antitestjeit szekretáló hibridóma sejttenyészeteket ELISA42

HU 220 234 Β eljárással ellenőriztük, mely a hibridóma-ellenőrző eljárásnak felel meg, és a humán eredetű SCF¹-¹⁶² (CHO) keresztreaktivitásán alapszik. A hibridómák klónozása limitáló hígításos eljárással történik. A megvizsgált, hibridóma felülúszót tartalmazó lyukak közül 55 erősen pozitív volt a humán eredetű SCF*-¹⁶⁴-gyel (E. coli) szemben; 9 közülük keresztreakciót mutatott a humán eredetű SCF^1_162-vel (CHO).

A különböző hibridóma sejteket az alábbiak szerint klónoztuk:

Monoklonális IgG izotípus A humán SCF^1_162-vel (CHO) szemben mutatott reaktivitás

4-G12-13	IgGl	nincs
6C9A	IgGl	nincs
8H7A	IgGl	van

A 4G12-13 és a 8H7A hibridómákat az ATCC-nél 1990. szeptember 26-án helyeztük el.

***

Bár a jelen találmány során az alkalmazás előnyben részesített lehetőségeit ismertettük, a szakmai gyakorlattal rendelkezők számára számos változat és módosítás is lehetséges. így a mellékelt igénypontok összeállításánál az egyenértékű változatokat is figyelembe vettük, melyek az igénypontok alapján a találmány tárgykörén belül esnek.

Claims (56)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás polipeptid előállítására, mely a 15C. ábra szerinti szekvencia primer szerkezetének részével vagy egészével és a természetben előforduló stemsejtfaktor hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a fenti polipeptid kódolására képes DNS-szekvenciával transzformált vagy átfertőzött prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket expressziós körülmények között tenyésztünk, majd a kapott polipeptid expressziós terméket izoláljuk.
2. 2. Eljárás polipeptid előállítására, mely a 42. ábra szerinti szekvencia primer szerkezetének részével vagy egészével és a természetben előforduló stemsejtfaktor hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a fenti polipeptid kódolására képes DNS-szekvenciával transzformált vagy átfertőzött prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket expressziós körülmények között tenyésztünk, majd a kapott polipeptid expressziós terméket izoláljuk.
3. 3. Eljárás polipeptid előállítására, mely a 44. ábra szerinti szekvencia primer szerkezetének részével vagy egészével és a természetben előforduló stemsejtfaktor hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a fenti polipeptid kódolására képes DNS-szekvenciával transzformált vagy átfertőzött prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket expressziós körülmények között tenyésztünk, majd a kapott polipeptid expressziós terméket izoláljuk.
4. 4. Eljárás polipeptid előállítására, mely a 14C. ábra szerinti szekvencia primer szerkezetének részével vagy egészével és a természetben előforduló stemsejtfaktor hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a fenti polipeptid kódolására képes DNS-szekvenciával transzformált vagy átfertőzött prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket expressziós körülmények között tenyésztünk, majd a kapott polipeptid expressziós terméket izoláljuk.
5. 5. Eljárás polipeptid előállítására, mely a stemsejtfaktor primer szerkezetének részével vagy egészével és a természetben előforduló stemsejtfaktor hematopoietikus biológiai aktivitásával rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a fenti polipeptid kódolására képes DNS-szekvenciával transzformált vagy átfertőzött prokarióta vagy eukarióta gazdasejteket expressziós körülmények között tenyésztünk, majd a kapott polipeptid expressziós terméket izoláljuk.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet egy exogén DNSszekvencia prokarióta vagy eukarióta sejtben történő kifejezésével állítjuk elő.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén DNS-szekvenciaként cDNS-szekvenciát alkalmazunk.
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén DNS-szekvenciaként genomiális DNSszekvenciát alkalmazunk.
9. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy autonóm módon replikálódó plazmid- vagy vírusvektoron jelen lévő exogén DNSszekvenciát alkalmazunk.
10. 10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stemsejtfaktor allélvariánsának megfelelő polipeptidet állítunk elő.
11. 11. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy in vivő hematopoietikus biolgóiai tulajdonságokkal rendelkező polipeptidet állítunk elő.
12. 12. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy in vitro hematopoietikus biológiai tulajdonságokkal rendelkező polipeptidet állítunk elő.
13. 13. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolált polipeptidet kovalens kötéssel detektálható jelzőanyaggal kapcsoljuk.
14. 14. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciák valamelyikét tartalmazó gazdasejteket alkalmazunk:

    i) a 14B., 14C., 15B., 15C., 42. vagy 44. ábrák szerinti DNS-szekvenciák vagy ezek komplementer szálai, ii) az i) pontban említett DNS-szekvenciákkal hibridizáló DNS-szekvenciák vagy ezek fragmensei, vagy iii) olyan DNS-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degenerációja következtében hibridizálódnának az a) és b) pontokban definiált DNS-szekvenciákkal, és melyek ugyanazon aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódolnak.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, nem emlőssejtekben történő kifejeződésre előnyös kodont tartalmazó DNS-szekvenciát alkalmazunk.

    HU 220 234 Β
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, E. coli sejtekben történő kifejeződésre előnyös kodont tartalmazó DNS-szekvenciát alkalmazunk.
17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, élesztősejtekben történő kifejeződésre előnyös kodont tartalmazó DNS-szekvenciát alkalmazunk.
18. 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán stemsejtfaktor kifejeződését kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.
19. 19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát alkalmazunk, mely a 42. ábra szerinti SCF1-162, SCF1-164, SCF1-165 vagy SCF1-248 humán stemsejtfaktor polipeptid kifejeződését kódolja.
20. 20. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát alkalmazunk, mely a 44. ábra szerinti SCFmetl-157, SCF1-157, SCFmetl-160, SCF1-160, SCFmetl-161, SCF1-161, SCFmetl-220 vagy SCF1-220 humán stemsejtfaktor polipeptid kifejeződését kódolja.
21. 21. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid N-terminális metionilgyökének kifejeződését kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.
22. 22. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, mely a molekula N-terminális helyzetében metionilgyököt tartalmaz.
23. 23. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. colit alkalmazunk.
24. 24. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejtet alkalmazunk.
25. 25. Eljárás készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidet legalább egy, gyógyászatilag elfogadható hígító-, adalék- és/vagy hordozóanyaggal keveijük.
26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hemotopoietikus terápiára alkalmas szubkután adagolási formát állítunk elő.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy leukopenia, thrombopenia, anémia kezelésére, transzplantáció során csontvelő beépülését fokozó, sugárkezelés során, kémiai vagy kemoterápiás kezelés során indukált csontvelő aplasia vagy myelosuppressio esetén csontvelő regenerációjának fokozására vagy kemoterápia esetén sejtek érzékenységének fokozására alkalmas készítményeket állítunk elő.
28. 28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy donornak csontvelőcsapolás vagy perifériás vér leukopheresis után a transzplantációra alkalmas sejtek számának növelésére adagolható készítményt állítunk elő.
29. 29. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy AIDS, myelofibrosis, myelosclerosis, osteopetrosis, áttételes karcinóma, akut leukémia, myeloma multiplex, Hodgkin-kór, limphoma, Gaucher-kór, Niemann-Pick-kór, Letterer-Siwe-kór, nehezen gyógyítható erythroblast anémia, DiGuglielmo-szindróma, vértolulásos lépnagyobbodás, Kala azar, szaroidiózis, primer léppancitopénia, miliáris tuberkulózis, elterjedt gombás betegségek, hiperakut szeptikémia, malária,

    B₁₂-vitamin-hiány, fólsavhiány és piridoxinhiány kezelésére alkalmas készítményt állítunk elő.
30. 30. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegi vagy bélkárosodásban szenvedő emlősök kezelésére alkalmas szubkután készítményt állítunk elő.
31. 31. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hipopigmentációs rendellenességben szenvedő emlősök kezelésére alkalmas szubkután adagolható készítményt állítunk elő.
32. 32. A 26-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi hematopoietikus faktorok: EPO, G-SFC, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 és IGF-1 közül legalább eggyel együtt alkalmazható vagy ezek közül legalább egyet is tartalmazó készítményt állítunk elő.
33. 33. A 26-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi hematopoietikus faktorok: IL-8, IL-9 és IL-10 közül legalább eggyel együtt alkalmazható vagy ezek közül legalább egyet is tartalmazó készítményt állítunk elő.
34. 34. A 26-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi hematopoietikus faktorok: IL—11 és IL—12 közül legalább eggyel együtt alkalmazható vagy ezek közül legalább egyet is tartalmazó készítményt állítunk elő.
35. 35. Eljárás hematopoietikus sejteknek exogén DNSsel történő átfertőzésére, azzal jellemezve, hogy (i) hematopoietikus sejteket valamely 1-5. igénypontok szerinti polipeptiddel tenyésztünk, és (ii) a tenyésztett sejtet exogén DNS-sel átfertőzzük.
36. 36. Csontvelősejtek vagy perifériás vérőssejtek tenyésztésére alkalmas komponenseket tartalmazó kit, azzal jellemezve, hogy az alábbi komponenseket tartalmazza:

    (i) az 1-5. igénypontok valamelyikében meghatározott polipeptid, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal kombinálva, és (ii) csontvelősejtek vagy perifériás vérőssejtek tenyészközegének előállítására alkalmas komponensek.
37. 37. A 36. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a komponensek legalább egyike az alábbi hematopoietikus faktorok: EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 és IGF-1 közül legalább egyet tartalmaz.
38. 38. A 36. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a komponensek legalább egyike az alábbi hematopoietikus faktorok: IL-8, IL-9 és IL-10 közül legalább egyet tartalmaz.
39. 39. A 36. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a komponensek legalább egyike az alábbi hematopoietikus faktorok: IL—11 és IL—12 közül legalább egyet tartalmaz.
40. 40. Eljárás hematopoietikus sejtek in vitro tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy (i) a sejteket az 1 - 5. igénypontok bármelyikében leírt polipeptidet tartalmazó tápközeghez adjuk, és

    HU 220 234 Β (ii) a tenyésztést a hematopoietikus sejtek növekedéséhez szükséges körülmények között végezzük.
41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan táptalajt alkalmazunk, mely az alábbi hematopoietikus faktorok: EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, 1L-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 és IGF-1 közül legalább egyet tartalmaz.
42. 42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan táptalajt alkalmazunk, mely az alábbi hematopoietikus faktorok: IL-3, IL-6 és G-CSF közül legalább egyet tartalmaz.
43. 43. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan táptalajt alkalmazunk, mely az alábbi hematopoietikus faktorok: IL-8, IL-9 és IL-10 közül legalább egyet tartalmaz.
44. 44. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan táptalajt alkalmazunk, mely az alábbi hematopoietikus faktorok: IL— 11 és IL-12 közül legalább egyet tartalmaz.
45. 45. A 40-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus sejtekként csőn velősejteket tenyésztünk.
46. 46. A 40-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus sejtekként perifériás vérőssejteket tenyésztünk.
47. 47. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kovalensen vízoldható polimerhez kötjük.
48. 48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polimerként polietilénglikolt vagy polietilénglikol és polipropilénglikol kopolimerjét alkalmazzuk.
49. 49. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet állítunk elő, melynek egy vagy több ciszteingyökét alanin vagy szerin helyettesíti.
50. 50. Eljárás stemsejtfaktomak stemsejtfaktort tartalmazó anyagból történő hatékony kinyerésére, azzal jellemezve, hogy a stemsejtfaktort tartalmazó anyagot ioncserélő kromatográfiának vetjük alá.
51. 51. Az 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ioncserélő kromatográfiás elválasztásként anioncserélő kromatográfiás eljárást alkalmazunk.
52. 52. Az 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ioncserélő kromatográfiás elválasztásként reverz fázisú folyadékkromatográfiás eljárást alkalmazunk.
53. 53. Eljárás stemsejtfaktomak stemsejtfaktort tartalmazó anyagból történő hatékony kinyerésére, azzal jellemezve, hogy a stemsejtfaktort tartalmazó anyagot reverz fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásnak vetjük alá.
54. 54. Eljárás hematopoietikus őssejteknek egy génnel történő átfertőzésére, azzal jellemezve, hogy (i) hematopoietikus őssejteket stemsejtfaktorral tenyésztünk, és (ii) a tenyésztett sejtet valamely génnel átfertőzzük.
55. 55. Eljárás stemsejtfaktort specifikusan kötő antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy stemsejtfaktorral immunizált állatokból ismert módszerekkel kinyerjük az antitestet.
56. 56. Az 55. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestet nyerünk ki.