NO316022B1

NO316022B1 - Polypeptid som har ±n eller flere av de biologiske aktiviteter til naturligforekommende stamcellefaktor, inkludert hematopoetisk aktivitet,antistoff sombinder det, samt fremgangsmåte for fremstilling av polypeptidet

Info

Publication number: NO316022B1
Application number: NO19982350A
Authority: NO
Inventors: Krisztina M Zsebo; Robert A Bosselman; Sidney Vaughn Suggs; Francis Hall Martin
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1989-10-16
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2003-12-01
Also published as: IL170681A; PT95524A; JP2657113B2; ES2147720T3; IL127924A0; RU2212411C2; HU220234B; CA2026915C; AU6541090A; CA2026915A1; KR100193050B1; CA2267658A1; GEP20033145B; NO912321D0; CA2267651A1; CA2267651C; CA2267670A1; NO982350L; NO982350D0; FI108140B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører polypeptider som har én eller flere av de m vitro biologiske aktiviteter til naturlig forekommende stamcellefaktor, inkludert hematopoetisk aktivitet, en av den naturlig forekommende human-stamcellefaktors biologiske egenskaper, eller den hematopoetiske, biologiske aktivitet til naturlig forekommende stamcellefaktor Oppfinnelsen vedrører videre antistoffer og fremgangsmåte for fremstilling av polypep-tidene

Oppfinnelsens bakgrunn

Det humane bloddanningssystem (hematopoesesystemet) består av flere forskjellige hvite blodlegemer (inkludert neutrofiler, makrofager, basofiler, mastceller, eosmofiler,

T- og B-celler), røde blodlegemer (erythrocytter) og koagel-dannende celler (megakaryocytter, blodplater).

Det antas at små mengder av hematopoesevekstfaktorer

er ansvarlige for differensieringen av et lite antall av "stamceller" til mange forskjellige blodlegemeprogenitorer for den enorme proliferasjon av disse cellene, og for den endelige differensiering av ferdig utviklede blodceller fra disse cellelinjene. Hematopoese-regenerasjonssystemet virker godt under normale betingelser. Når det påvirkes av kjemo-terapi, bestråling eller naturlige myelodysplastiske sykdommer, inntrer det imidlertid en derav følgende periode hvorunder pasienter er alvorlig leukopeniske, anemiske eller trombocytopeniske. Utviklingen og bruken av hematopoesevekstfaktorer fremskynder benmargregenerering under denne farlige fase.

Ved visse virusinduserte sykdommer, slik som ervervet auto immun sv ikt (AIDS), kan slike blodelementer som T-celler ødelegges spesifikt. Økning av T-celleproduksjon kan være terapeutisk i slike tilfeller.

Ettersom hematopoesevekstfaktorer er til stede i

svært små mengder, har påvisningen og identifikasjonen av disse faktorene vært basert på en rekke analyser som hittil bare skjelner mellom de forskjellige faktorene på grunnlag av stimuleringseffekter på dyrkede celler under kunstige betingelser.

Anvendelsen av rekombmante, genetiske teknikker har gjort forståelsen av de biologiske aktivitetene av enkeltstående vekstfaktorer klarere. F.eks. har man kommet frem til aminosyren og DNA-sekvensene for humant erythropoietin (EPO) som stimulerer produksjonen av erythrocytter. (Se US patentskrift nr. 4 703 008). Rekombinante metoder er også blitt anvendt for isoleringen av cDNA for en human granulocytt-kolomstimulerende faktor, G-CSF(se US patentskrift nr.

4 810 643) og human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende

faktor (GM-CSF) [Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 4360-4364 (1985); Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985)], munn G- og GM-CSF [Yokota et al., Proe.Nati. Acad. Sei. USA, jn., 1O70 (1984); Fung et al., Nature, 307, 233 (1984);

Gough et al., Nature, 309, 763 (1984)], og human makrofag-kolonistimulerende faktor (CSF-1) [Kawasaki et al.. Science, 230, 291 (1985)].

"High Proliferative Potential Colony Forming Cell"

(HPP-CFC)-analysesystemet tester

med hensyn på virkningen av faktorer på tidlige hematopoeseprogenitorer [Zont, J. Exp. Med., 159, 679-690 (1984)]. Det foreligger mange rapporter i litteraturen med hensyn til faktorer som er aktive i HPP-CFC-analysen. Kildene for disse faktorene er angitt i tabell 1. De1 best karakteriserte faktorer er omtalt nedenunder. ^

En aktivitet i medium kondisjonert med humanmilt, er blitt kalt synergistisk faktor (SF). Flere humane vev og humane og muse-cellelinjer produserer en SF, henvist til som SF-1, som virker synergistisk med CSF-1 for stimulering av de tidligste HPP-CFC. SF-1 er blitt rapportert i medier kondisjonert med humane miltceller, humane morkakeceller, 5637-celler (en urinblærecarcinomcellelinje) og EMT-6-celler (en musebrystkjertelcarcinomcellelinje). Identiteten til SF-1 er ennå ikke blitt bestemt. Foreløpige rapporter viser overlappingsaktiviteter for interleukin-1 med SF-1 fra

cellelinje 5637 [Zsebo et al., Blood, 71, 962-968 (1988)]. Tilleggsrapporter har imidlertid vist at kombinasjonen av interleukin-1 (IL-1) pluss CSF-1 ikke kan stimulere den samme kolonidannelse som kan oppnås med CSF-1 pluss delvis

rensede preparater av 5637-kondisjonerte medier [McNiece, Blood, 73, 919 (1989)].

Den synergistiske faktor som er til stede i livmor-ekstrakt fra drektig mus, er CSF-1. WEHI-3-celler (munn myelomonocyttleukemicellelinje) produserer en synergistisk faktor som synes å være identsisk med IL-3. Både CSF-1 og IL-3 stimulerer hematopoeseprogenitorer som er mer ferdig utviklet enn målet SF-1.

En annen klasse synergistisk faktor er blitt påvist å være til stede i kondisjonerte medier fra TC-l-celler (stromale celler utvunnet fra benmarg). Denne cellelinjen produserer en faktor som stimulerer både tidlige myeloid- og lymfoidcelletyper. Den var blitt kalt hemolymfopoese-vekstfaktor 1 (HLGF-1). Den har en tilsynelatende molekylvekt på 120.000 [McNiece et al., Exp. Hematol., 16, 383

(1988) ].

Blant de kjente interleukiner og CSF-er er IL-1, IL-3 og CSF-1 blitt identifisert til å være i besittelse av aktivitet i HPP-CFC-analysen. De andre kildene for synergistisk aktivitet nevnt i tabell 1, er ikke blitt identifisert strukturelt. Basert på polypeptidsekvensen og den biologiske aktivitetsprofil, vedrører foreliggende oppfinnelse et molekyl som er forskjellig fra IL-1, IL-3, CSF-1 og SF-1.

Når de administreres parenteralt, fjernes proteiner ofte hurtig fra blodomløpet og kan derfor utløse forholdsvis kortvarig farmakologisk aktivitet. Hyppige injeksjoner av forholdsvis store doser med bioaktive proteiner kan følgelig være påkrevet for å forlenge terapeutisk virknmgsfullhet.Proteiner modifisert ved hjelp av kovalent binding av vann-oppløselige polymerer, slik som polyethylenglycol, copoly-merer av polyethylenglycol og polypropylenglycol, carboxy-methylcellulose, dextran, polyvmylalkohol, polyvinylpyrro lidon eller polyprolin, er kjent for å oppvise vesentlig lengre halveringstider i blod etter intravenøs injeksjon enn det de tilsvarende ikke-modifiserte proteiner gjør [Abuchowski et al., i: "Enzymes as Drugs", Holcenberg et al., red. Wiley-Interscience, New York, NY, 367-383 (1981),

Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4_:185-189 (1982) og Katre

et al.,Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 1487-1491 (1987)]. Slike modifikasjoner kan også øke proteinets oppløselighet i vandig oppløsning, fjerne aggregasjon, øke den fysiske og kjemiske stabilitet til proteinet og reduserelmmunogenisi-teten og antigenisiteten til proteinet mye. Som et resultat av dette kan denønskede m vivo biologiske aktivitet oppnås ved hjelp av administrering av slike polymer-protein-addukter mindre hyppig eller i lavere doser enn med det ikke-modifiserte protein.

Binding av polyethylenglycol (PEG) til proteiner er særlig nyttig ettersom PEG har svært lav toksisitet i pattedyr [Carpenter et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 11B, 35-40

(1971)]. F.eks. ble et PEG-addukt av adenosmdearainase god-kjent i USA for bruk på mennesker for behandling av alvorlig, kombinert immunsviktsyndrom. En andre fordel som fås ved konjugasjonen av PEG, er det at immunogenisiteten og antigenisiteten til heterologe proteiner reduseres effektivt. F.eks. vil et PEG-addukt av et humanprotein kunne være nyttig for behandlingen av sykdom i andre pattedyrarter uten risiko for å utløse en alvorlig immunrespons. Polymerer, slik som PEG, kan lettvint bindes til én eller flere reaktive ammosyrerester i et protein, slik som alfa-aminogruppen i ammoendeaminosyren, epsilon-amino-gruppene i lysinsidekjeder, sulfhydrylgruppene i cystein-sidekjeder, carboxylgruppene i aspartyl- og glutamylsidekjeder, alfa-carboxylgruppen i carboxylendeaminosyren, tyrosin-sidekjeder eller til aktiverte derivater av glycosylkjeder bundet til visse asparagin-, senn- eller threonmrester. Det er blitt beskrevet mange aktiverte former avPEG som er egnet for direkte omsetning med proteiner. AnvendbarePEG-reagenser for omsetning med proteinaminogrupper om fatter aktive estere av carboxylsyre eller carbonatderivater, særlig de hvor de uttredende grupper er N-hydroxysuccmimid, p-mtrofenol, imidazol eller l-hydroxy-2-nitrobenzen-4-sul-fonat. PEG-derivater som inneholder maleimido- eller halo-genacetylgrupper, er anvendbare reagenser for modifikasjonen av protemfrie sulfhydrylgrupper. Likeledes kan PEG-reagenser som inneholder amino-, hydrazin- eller hydrazidgrupper, anvendes for omsetning med aldehyder frembrakt ved hjelp av perjodatoxydasjon av carbohydratgrupper i proteiner. Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en faktor som forårsaker vekst av tidlige hematopoeseprogenitorceller.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt

et polypeptid som har én eller flere av de in vitro biologiske aktiviteter til naturlig forekommende stamcellefaktor, inkludert hematopoetisk aktivitet, kjennetegnet ved at det har en del av eller hele aminosyresekvensen angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et polypeptid som har én av den naturlig forekommende human-stamcellefaktors biologiske egenskaper, inkludert hematopoetisk aktivitet, kjennetegnet ved at det har en del av eller hele sekundærkonformasjonen til naturlig forekommende stamcellefaktor, og har deler av eller hele aminosyresekvensen angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44

Det er også tilveiebrakt et polypeptid med den hematopoetiske, biologiske aktivitet til naturlig forekommende stam-cellef aktor, kjennetegnet ved at det har en ammosyresekvens som angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44, eller allelvarianter, derivater, delesjonsanaloger, substitusjonsanaloger eller addisjonsanaloger derav med den samme biologiske aktivitet

Oppfinnelsen vedrører også et antistoff som er kjennetegnet ved at det binder stamcellefaktor ifølge kravene 1-3 spesifikt

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, kjennetegnet ved at prokaryote eller eukaryote vertsceller transformert eller transfektert med en DNA-sekvens som angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44, dyrkes under egnede næringsbetingelser, og polypeptidet isoleres

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er et anionbytterkromatogram fra rensingen

av pattedyr-SCF.

Figur 2 er et gelfiltreringskromatogram fra rensingen av pattedyr-SCF. Figur 3 er et hvetekim-agglutinin-agarose-kromatogram

fra rensingen av pattedyr-SCF.

Figur 4 er et kationbytterkromatograin fra rensingen

av pattedyr-SCF.

Figur 5 er et C4-kromatogram fra rensingen av pattedyr-SCF. Figur 6 viser natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacryl-amidgelelektroforese (PAGE) (SDS-PAGE) av C4~kolonnefrak-sjoner fra figur 5. Figur 7 er et analytisk C4-kromatogram av pattedyr-SCF. Figur 8 viser SDS-PAGE av C4~kolonnefraksjoner fra figur 7. Figur 9 viser SDS-PAGE av renset pattedyr-SCF og deglycosylert pattedyr-SCF. Figur 10 er et analytisk C4-kromatogram av renset pattedyr-SCF. Figur 11 viser aminosyresekvensen til pattedyr-SCF avledet fra proteinsekvensering.

Figur 12 viser

A. oligonukleotider for rotte-SCF-cDNA

B. oligonukleotider for human-SCF-DNA

C. universaloligonukleotider.

Figur 13 viser

A. et skjema for polymerasekjedereaksjon (PCR)-amplifikasjon av rotte-SCF-cDNA

B. et skjema for PCR-amplifikasjon av human-SCF-cDNA.

Figur 14 viser

A. sekvenseringsstrategi for rotte-genom-DNA

B. nukleinsyresekvensen til rotte-genom-DNA.

C. nukleinsyresekvensen til rotte-SCF-cDNA og aminosyresekvensen til rotte-SCF-protem.

Figur 15 viser

A. strategien for sekvensering av humangenom-DNA B. nukleinsyresekvensen til humangenom-DNA

C. den sammensatte nuklemsyresekvens til human-SCF-cDNA og aminosyresekvensen til SCF-protein. Figur 16 viser de sammenstilte aminosyresekvensene til human-, apekatt-, hunde-, muse- og rotte-SCF-protem. Figur 17 viser strukturen til pattedyrcelleeks-presjonsvektor V19.8-SCF. Figur 18 viser strukturen til pattedyr-CHO-celle-ekspresjonsvektor pDSVE.l. Figur 19 viser strukturen til E. coli ekspresjons-vektor pCFMH56.

Figur 20 viser

A. en radioimmunologisk analyse av pattedyr-SCF

B. SDS-PAGE avlmmunutfelt pattedyr-SCF.

Figur 21 viser Western-analyse av rekombinant human-SCF. Figur 22 viser Western-analyse av rekombinant rotte-SCF. Figur 23 er en søylekurve som viser effekten av COS-1-celle-produsert, rekombinant rotte-SCF etter benmargtransplantasjon. Figur 24 viser effekten av rekombinant rotte-SCF på helbredelse av makrocyttanemi hos "Steel"-mus. Figur 25 viser antallet perifere, hvite blodlegemer (WBC) hos "Steel"-mus behandlet med rekombinant rotte-SCF. Figur 26 viser blodplatetallene for "Stee^-mus behandlet med rekombinant rotte-SCF. Figur 27 viser den differensielle WBC-telling for "Steel"-mus behandlet med rekombinant rotte-SCF<1-164->PEG25. Figur 28 viser lymfocytt-delmengdene for "Steel"-mus behandlet med rekombinant rotte-SCF<1>~<164->PEG25. Figur 29 viser effekten av rekombinant humansekvens-SCF-behandling av normale primater når det gjelder å øke antallet perifere WBC-er. Figur 30 viser effekten av rekombinant humansekvens-SCF-behandlmg av normale primater når det gjelder å øke hematocriter og blodplateantall.

Figur 31 viser fotografier av

A. humane benmargkolonier stimulert ved hjelp av 1—16 2

rekombinant human-SCF

B. Wright-Giemsa-fargede celler fra kolonier i

figur 31 A.

Figur 32 viser SDS-PAGE av S-Sepharose-kolonnefrak-sjoner fra kromatogram vist i figur 33

A. med reduksjonsmiddel

B. uten reduksjonsmiddel.

Figur 33 er et kromatogram av en S-Sepharose-kolonne av E. coli-utvunnet, rekombinant human-SCF. Figur 34 viser SDS-PAGE av C4~kolonnefraksjoner fra kromatogram vist i figur 35

A. med reduksjonsmiddel

B. uten reduksjonsmiddel.

Figur 35 er et kromatogram av en C^-kolonne av E. coil-utvunnet, rekombinant human-SCF. Figur 36 er et kromatogram av en Q-Sepharose-kolonne av CHO-utvunnet, rekombinant rotte-SCF. Figur 37 er et kromatogram av en C^-kolonne av CHO-utvunnet, rekombinant rotte-SCF. Figur 38 viser SDS-PAGE av C4~kolonnefraksjoner fra kromatogram vist i figur 37. Figur 39 viser SDS-PAGE av renset CHO-utvunnet, rekombinant rotte-SCF før og etter deglycosylering.

Figur 40 viser

A. gelfiltreringskromatografi av reaksjonsblandmg av rekombinant, pegylert rotte-SCF1""1**4

B. gelfiltreringskromatografi av rekombinant rotte-SCF<1-1>64, umodifisert. Figur 41 viser merket SCF-binding til ferske, leukemiske blastceller. Figur 42 viser human SCF-cDNA-sekvens erholdt fra HT1080 fibrosarcomcellelmjen. Figur 43 viser et autoradiografi fra C0S-7-celler som uttrykker human SCF1-^4** og CHO-celler som uttrykker humanSCF1-164. Figur 44 viser human SCF-cDNA-sekvens erholdt fra urmblæresarcinomcellelinjen 5637. Figur 45 viser den økte overlevelse av bestrålte mus etter SCF-behandling. Figur 46 viser den økte overlevelse av bestrålte mus etter benmargtransplantasjon med 5% av et lårben og SCF-behandlmg. Figur 4 7 viser den økte overlevelse av bestrålte mus etter benmargtransplantasjon med 0,1 og 20% av et lårben og SCF-behandling.

Et stort antall aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå for fagfolk innen teknikken etter å ha tatt under overveielse den følgende nærmere beskrivelse som gir illustra-sjoner vedrørende utøvelsen av oppfinnelsen i dens for tiden foretrukne utførelsesformer.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt nye polypeptider (SCF-er) ved å bruke DNA-sekvenser som koder for hele eller en del av slike SCF-er Uttrykket "stamcellefaktor" eller "SCF" henviser, slik det her er brukt, til naturlig forekommende SCF (f.eks. naturlig, human SCF) samtlkke-naturlig forekommende (dvs. forskjellige fra naturlig forekommende) polypeptider med anunosyresekvenser og glycosylermg som er tilstrekkelig duplikativ til aminosyresekvensen til naturlig forekommende stamcellefaktor, til å muliggjøre at de har naturlig forekommende stamcellefaktors biologiske hematopoeseaktivitet. Stamcellefaktor har evne til å stimulere vekst av tidlige hematopoeseprogenitorer som er i stand til å modnes til erythroid-, megakaryocytt-, granulocytt-, lymfocytt- og makrofagceller. SCF-behandling av pattedyr resulterer i absolutte økninger i hematopoeseceller både hos myeloid- og lymfoidcellelmjer. Ett av hoved-kjennetegnene på stamceller er deres evne til å differensi-ere til både myeloid- og lymfoidceller [Weissman, Science, 241, 58-62 (1988)]. Behandling av "Steel"-mus (eksempel 8B) med rekombinant rotte-SCF resulterer i økninger av granulo-cytter, monocytter, erythrocytter, lymfocytter og blodplater. Behandling av normale primater med rekombinant, human SCF resulterer i økninger i myeloid- og lymfoidceller (eksempel 8C) .

Det skjer en embryoekspresjon av SCF ved hjelp av celler i migreringssporet og målsøkingsstedene for melano-blaster, kimceller, hematopoeseceller, hjerne- og ryggmarg.

Tidligere hematopoeseprogenitorceller anrikes i benmarg fra pattedyr som er blitt behandlet med 5-fluoruracil (5-FU) Det kjemoterapeutiske legemiddel 5-FU fjerner selektivt sene hematopoeseprogenitorer. SCF er aktiv på benmarg etter behandling med 5-FU.

Den biologiske aktivitet og vevfordelmgsmønster til SCF demonstrerer dens sentrale rolle i embryogenese og hematopoese, samt dens egenskap for behandling av forskjellige s tame e1lemangle r.

I forbindelse med oppfinnelsen anvendes DNA-sekvenser som omfatter: inkorporeringen av kodoner "foretrukket" for ekspresjon ved hjelp av utvalgte, ikke-pattedyrverter; tilveiebringelsen av seter for spalting ved hjelp av restrik-sjonsendonukleaseenzymer; og tilveiebringelsen av ytterligere initielle, terminale eller intermediære DNA-sekvenser som letter konstruksjon av lett uttrykte vektorer Ved oppfinnelsen anvendes også DNA-sekvenser som koder for polypeptidanaloger eller derivater av SCF som adskiller seg fra naturlig forekommende former når det gjelder identiteten og lokaliseringen av én eller flere ammosyrerester (dvs. delesjonsanaloger inneholdende mindre enn alle restene som er angitt for SCF; substitusjonsanaloger hvor én eller flere spesifiserte rester er erstattet med1 andre rester; og addisjonsanaloger hvor én eller flere ammosyrerester er til-føyet i en terminal eller medial del av polypeptidet) og som har til felles noen eller alle egenskapene til naturlig forekommende former Ved oppfinnelsen anvendes spesifikt DNA-sekvenser som koder for den ubearbeidede ammosyresekvens

i full lengde samt DNA-sekvenser som koder for den bearbeide-de form av SCF

Nye DNA-sekvenser som anvendes omfatter

sekvenser som kan anvendes til å sikre ekspresjon i prokaryot-eller eukaryotvertceller av polypeptidprodukter som har minst

en del av den primære strukturkonformasjon og én eller flere av de biologiske egenskapene til naturlig forekommende SCF.

DNA-sekvenser som anvendes omfatter spesifikt

DNA-sekvenser angitt i figurene 15C, 42 og 44

DNA-sekvensene kan omfatte kodoner som letter transkrip-sjon og translasjon av budbringer-RNA i mikrobeverter Slike kunstig fremstilte sekvenser kan lett konstrueres ifølge metodene til Alton et al , PCT publisert søknad WO 83/04053

DNA-sekvensene som her er beskrevet og som koder for polypeptider med SCF-aktivitet, er verdifulle for den informasjon som de gir vedrørende aminosyresekvensen til pattedyrprotemet som hittil har vært utilgjengelig DNA-sekvensene er også verdifulle som produkter som kan anvendes ved utførelse av storskalasyntese av SCF ved hjelp av flere forskjellige, rekombinante teknikker Sagt på en annen måte er DNA-sekvensene nyttige for frembringelse av nye og nyttige virus-og sirkulære plasmid-DNA-vektorer, nye og nyttige transformerte og transfiserte prokaryot- og eukaryotvertceller (inkludert bakterie- og gjærceller og pattedyrceller dyrket i kultur) , og nye og nyttige fremgangsmåter for dyrket vekst av slike vertceller som er i stand til å uttrykke SCF og dens beslektede produkter

DNA-sekvensene som anvendes er også egnede materialer for bruk som merkede prober ved isolering av human genom-DNA som koder for SCF, og andre gener for beslektede proteiner, samt cDNA- og genom-DNA-sekvenser fra andre pattedyrarter DNA-sekvenser kan også være anvendbare i forskjellige alternative fremgangsmåter for proteinsyntese (f eks for msektceller)

DNA-sekvensene forventes å være anvendbare ved utvikling

av transgene pattedyrarter som kan tjene som eukaryote "vert-er" for produksjon av SCF og SCF-produkter i store mengder Se generelt Palmiter et al , Science 222, 809-814 (1983 )

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer renset og isolert, naturlig forekommende SCF (det vil si kunstig fremstilt slik at primær-, sekundær- og tertiær-kon-formasjonen, og glycosyleringsmønsteret, er identiske med naturlig forekommende materiale), samt ikke-naturlig forekommende polypeptider med en primær strukturkonformasjon (dvs. kontinuerlig sekvens av ammosyrerester) og glycosyl-erxng som er tilstrekkelig duplikativ til tilsvarende hos naturlig forekommende stamcellefaktor til å muliggjøre at de innehar naturlig forekommende SCF-s biologiske hematopoeseaktivitet. Slike polypeptider omfatter derivater og analoger.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles SCF som produktet av prokaryot eller eukaryot vertsekspresjon (for eksempel bakterie-, gjær-, høyere plante-, insekt- og pattedyrceller i kultur) av eksogene DNA-sekvenser erholdt

ved hjelp av genora- eller cDNA-kloning eller ved hjelp av gensyntese. Det vil si at ved en foretrukket utførelsesform er SCF "rekombinant SCF". Produktene av ekspresjon i typiske gjær- (f.eks. Saccharomyces cerevisiae) eller prokaryot-(f.eks. E. coli) vertceller er frie for binding til alle pattedyrproteiner. Produktene av ekspresjon i hvirveldyr-[f.eks. ikke-humane pattedyr- (f.eks. COS- eller CH0-) og fugle] celler er frie for binding til alle humanprotemer. Avhengig av den anvendte vert kan polypeptider ifølge oppfinnelsen være glycosylerte med pattedyr- eller andre eukaryotcarbohydrater, eller kan være ikke-glycosylerte. Vertcellen kan endres ved å bruke teknikker, slik som de som er beskrevet i Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989). Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en mitiell methioninammosyrerest (i stilling -1) .

I tillegg til naturlig forekommende allelformer av SCF omfatter foreliggende oppfinnelse også andre SCF-produkter, slik som polypeptidanaloger av SCF. Slike analoger omfatter fragmenter av SCF. Ved å følge fremgangsmåtene ifølge den ovenfor angitte, publiserte søknad av Alton et al. (WO 83/04053), kan man lett utforme og fremstille gener som koder for raikrobeekspresjon av polypeptider som har primærkonformasjoner som adskiller seg fra den som her er spesifisert for, når det gjelder identiteten eller lokaliseringen av én eller flere rester (f.eks. substitusjoner, ende-og mtermediæraddisjoner og delesjoner). Alternativt kan modifikasjoner av cDNA og genomgener lett utføres ved hjelp av godt kjente, stedrettede mutageneseteknikker og brukes til å generere analoger og derivater av SCF. Slike produkter har minst én av de biologiske egenskapene til SCF felles med SCF, men kan adskille seg med hensyn til andre. Som eksempler omfatter produkter ifølge oppfinnelsen de som er for-kortet ved hjelp av f.eks. delesjoner; eller de som er mer stabile overfor hydrolyse (og derfor kan ha mer uttalte eller langvarige effekter enn naturlig forekommende); eller som er blitt endret for å fjerne eller tilføye ett eller flere potensielle seter for O-glycosylering og/eller N-glycosylering, eller hvor én eller flere cystemrester er blitt fjernet eller erstattet av f.eks. alanin- eller serinrester, og som potensielt isoleres lettere i aktiv form fra mikrobesysternet; eller hvor én eller flere tyrosinrester er blitt erstattet med fenylalanm og som binder seg mer eller mindre lett til målprotemer eller til reseptorer på målceller. Også omfattet er polypeptidfragmenter som duplikerer bare en del av den sammenhengende aminosyresekvens eller sekundærkonforma-sjoner i SCF, hvilke fragmenter kan ha én av SCF's egenskaper (f.eks. reseptorbinding) og ikke andre (f.eks. tidlig hema-topoesecellevekstaktivitet) Det er verdt å legge merke til at aktivitet ikke er nødvendig for at ett eller flere av produktene ifølge oppfinnelsen skal ha ikke-terapeutisk utnyttbarhet, slik som i analyser for SCF-

antagonisme. Kompetitive antagonister kan være ganske nyttige f.eks. i tilfeller med overproduksjon av SCF eller tilfeller med humane leukemier hvor de maligne celler over-uttrykker reseptorer forSCF, slik som angitt ved overeks-presjonen av SCF-reseptorer i leukemiblaster (eksempel 13).

Anvendelige for polypeptidanalogene ifølge oppfinnelsen er rapporter vedrørende den immunologiske egenskap til syntetiske peptider som i det vesentlige duplikerer aminosyresekvensen som finnes i naturlig forekommende proteiner, glycoproteiner og nukleoproteiner. Nærmere bestemt er polypeptider med forholdsvis lav molekylvekt blitt påvist å delta i immunreaksjoner som er like i varighet og utstrekning med immunreaksjonene til fysiologisk betydningsfulle proteiner, slik som virusantigener, polypeptidhormoner og lignende. Inkludert blant immunreaksjonene til slike polypeptider er fremkallelsen av dannelsen av bestemte antistoffer i immunologisk aktive dyr [Lerner et al., Cell, 23/309-310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 5197-5200 (1980); Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 3403-3407 (1981);

Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 4882-4886

(1981) ; Wong et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, 5322-5326

(1982) ; Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dressman et al., Nature, 295, 185-160 (1982) og Lerner, Scientific American, 248, 66-74 (1983)]. Se også Kaiser et al.

[Science, 223, 249-255 (1984)] vedrørende biologiske og immunologiske egenskaper til syntetiske peptider som tilnærmet har samme sekundærstruktur som peptidhormoner, men som ikke behøver å ha deres primærstrukturkonformasjon.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også denne klasse polypeptider kodet for av deler av DNA-en som er komplementær til den proteinkodende tråd i human-cDNA- eller genom-DNA-sekvensene tri SCF, dvs. "komplementært inverterte proteiner" som beskrevet av Tramontano et al. [Nucleic Acid Res., 12, 5049-5059 (1984)].

Representative SCF-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, SCF1 148,

SCF<1>"<162>,SCF<1>"<164>,SCF<1>"<165>ogSCF<1-183>i figur 15C;

SCF<1>"<185>,SCF<1>"<188>,SCF<1>'<189>ogSCF<1>"<248>i figur 42 og

SCF<1>"<157>,SCF<1>"<160>,SCF<1>"<161>ogSCF<1>"<220>i figur 44.

SCF kan renses ved å bruke teknikker som er kjent for fagfolk innen teknikken Det kan anvendes en fremgangsmåte for rensing av SCF fra et SCF-holdig materiale, slik som kondisjonerte medier eller human urin, serum, idet fremgangsmåten omfatter ett eller flere trinn, slik som de følgende å underkaste det SCF-holdige materialelonebytterkromatografi (enten kation- eller anionbytterkromatografi), å underkaste det SCF-holdige materiale reversfase-væskekromatografisk separasjon som omfatter f eks en immobilisert C4- eller C6-harpiks, å underkaste væsken kromatografi på immobilisert lecitm, dvs binding av SCF til detlmmo-biliserte lecitin, og eluering med bruk av et sukker som konkurrerer for denne binding Detaljer vedrørende bruken av disse fremgangsmåtene vil fremgå av beskrivelsen gitt i eksemplene 1, 10 og 11 for rensingen av SCF Teknikkene beskrevet i eksempel 2 i US patentskrift nr 4 667 016, kan også anvendes ved rensing av stamcellefaktor

Isoformer av SCF er isolert ved å bruke standardteknikk-er, slik som teknikkene angitt i US patentsøknad nr 421 444 med tittelen Erythropoietin-isoformer, innlevert 13 oktober 1989

v

Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan svære"merket" ved binding til et påvisbart markørstoff (f eks radioaktivt merket med<125>I eller biotinylert), hvorved man får reagenser som kan anvendes ved påvisning og kvantifisering av SCF eller dens reseptorbærende celler i fast vev og væskeprøver, slik som blod eller urin

Biotinylert SCF kan anvendes sammen med immobilisert streptavidin for å fjerne leukemiblaster fra benmarg ved autolog benmargstransplantasjon Biotinylert SCF kan anvendes sammen med immobilisert streptavidin for å anrike med hensyn på stamceller i autologe eller allogene stamceller ved autolog eller allogen benmargstransplantasjon

Nuklemsyreproduktene kan anvendes når de er

merket med påvisbare markører (slik som radioaktive markører og ikke-isotop-markører, slik som biotm) , og anvendes ved hybridiseringsfremgangsmåter for å lokalisere den humane SCF-genposisjon og/eller posisjonen til enhver beslektet

genfamilie i et kromosomkart De kan også anvendes for identifisering av humane SCF-gensykdommer på DNA-nivået, og brukes som genmarkører for identifisering av nabogener og deres sykdommer Den humane SCF-gen er kodet i kromosom 12,

og det munne SCF-gen befinner seg i kromosom 10 i Sl-stedet

SCF kan anvendes for utvidelse av tidligere hematopoeseprogenitorer ved syngen, allogen eller autolog benmargstransplantasjon Bruken av hematopoesevekstfaktorer er blitt påvist å redusere tiden for neutrofil gjenvinning etter transplantasjon [Donahue et al , Nature 321, 872-875 (1986) og Welte et al., J Exp Med 165, 941-948 (1987)] Benmargen behandles in vitro for å aktivere eller utvide celleantallet før transplantasjon

Foreliggende oppfinnelse vedører også antistoffer

som spesifikt binder stamcellefaktor Eksempel 7 nedenunder beskriver fremstillingen av polyklonale antistoffer En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er monoklonale antistoffer som binder SCF spesifikt (se eksempel 19) I motsetning til konvensjonelle antistoffpreparater (polyklonale) som vanligvis omfatter forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), er hvert monoklonalt antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet Monoklonale antistoffer kan anvendes for å forbedre selek-tiviteten og spesifisiteten til diagnostiske og analytiske prøvemetoder hvor det brukes antigen-antistoff-binding De anvendes også for å nøytralisere eller fjerne SCF fra serum En andre fordel ved monoklonale antistoffer er at de kan syntetiseres ved hjelp av hybridomceller i kultur, forurenset av andre immunglobuliner Monoklonale antistoffer kan fremstilles fra supernatanter av dyrkede hybridomceller eller fra ascites indusert ved hjelp av mtraperitoneal mokulasjon av hybridomceller i mus Hybridomteknikken opprinnelig beskrevet av Kohler og Milstem [Eur J Immunol 6, 511-519 (1976)],

er blitt mye anvendt til å fremstille hybridcellelmjer som utskiller høye nivåer av monoklonale antistoffer mot mange spesifikke antigener

De følgende eksempler gis for mer fullstendig å illustrere oppfinnelsen

Eksempel 1

Rensing/ karakterisering av stamcellefaktor fra Buffalo rottelevercelle- kondisionert medium

A. In vitro biologiske analyser

1. HPP- CFC- analyse

Det er mange forskjellige biologiske aktiviteter som kan tilskrives det naturlige pattedyr rotte-SCF-protem samt det rekombmante rotte-SCF-protein. Én slik aktivitet er dets effekt på tidlige hematopoeseceller. Denne aktiviteten kan måles i en "High Proliferative Potential Colony Forming Cell"-analyse (HPP-CFC) [Zsebo et al., supra (1988)]. For å undersøke virkningene av faktorer på tidlige hematopoeseceller benyttes det ved HPP-CFC-analysesystemet musebenmarg utvunnet fra dyr 2 dager etter behandling med 5-fluoruracil (5-FU). Det kjemoterapeutiske legemiddel 5-FU fjerner selektivt sene hematopoeseprogenitorer, noe som muliggjør påvisning av tidlige progenitorceller og følgelig faktorer som virker på slike celler. Rotte-SCF utplates i nærvær av SCF-1 eller IL-6 i halvfaste agarkulturer. Agarkulturene inneholder McCoys komplette medium, 20% bovint fosterserum, 0,3% agar og 2x10 benmargceller/ml. McCoys komplette medium inneholder de følgende bestanddeler: lxMcCoys medium supplert med 0,1 mM pyruvat, 0,24x essensielle aminosyrer, 0,24xlkke-essensielle aminosyrer, 0,027% natriumbicarbonat, 0,24x vita-miner, 0,72 mM glutamin, 25 pg/ml L-serin og 12 ug/ml L-asparagin. Benmargcellene fås fra Balb/c-mus injisert i.v. med 150 mg/kg 5-FU. Lårbenene tas ut 2 dager etter 5-FU-behandling av musene, og benmargen skylles ut. De røde blodlegemene lyseres med lysermgsreagens for røde blodlegemer før utplatmg. Teststoffer plates ut med den ovenfor angitte blanding i 30 mm skåler. 14 dager senere telles koloniene som inneholder tusener av celler (>1 mm i diameter). Denne analysen ble brukt under rensingen av naturlig pattedyrcelleavledet rotte SCF.

Ved en typisk analyse forårsaker rotte-SCF prolifera sjonen av omtrent 50 HPP-CFC pr. 200.000 celler utplatet. Rotte-SCF har en synergistisk aktivitet på 5-FU-behandlede muse-benmargceller; HPP-CFC-kolonier vil ikke dannes i nærvær av enkeltfaktorer, men kombinasjonen av SCF og CSF-1 eller SCF og IL-6 er aktiv ved denne analysen.

2. MC/ 9- analyse

En annen anvendbar, biologisk aktivitet av både naturlig utvunnet og rekombinant rotte-SCF er evnen til å forårsake proliferasjonen av den IL-4-avhengige, munne mast-cellelmje, MC/9 (ATCC CRL 8306). MC/9-celler dyrkes med en kilde av IL-4 i henhold til fremgangsmåten for ATCC CRL 8306. Mediet anvendt ved den biologiske analyse, er RPMI 1640, 4% bovint fosterserum, 5xl0~^M 2-mercaptoethanol og lx glutamin-pen-strep. MC/9-cellene prolifererer som respons på SCF uten behov for andre vekstfaktorer. Denne proliferasjonen måles ved først å dyrke cellene i 24 timer uten vekstfaktorer, utplate 5000 celler i hver brønn i 96-brønners plater med testprøve i 48 timer, bestråle i 4 timer med 0,5 uCi 3H-thymidm (spesifikk aktivitet 20 Ci/mmol) , innhøste oppløsningen på glassfiberflltere og så måle spesifikt bundet radioaktivitet. Denne analysen ble brukt ved rensingen av pattedyrcelleavledet rotte-SCF etter ACA 54-gelfiltrenngs-tnnnet, avsnitt C2 i dette eksemplet. Vanligvis forårsaket SCF en 4-10-gangersøkning i CPM over bakgrunn.

3. CFU- GM

Virkningen av renset pattedyr-SCF, både naturlig utvunnet og rekombinant, fri for kolonistimulerende faktorer (CSF-er) som virker inn på normal, ikke-uttømt musebenmarg, er blitt fastslått. En CFU-GM-analyse [Broxmeyer et al., Exp. Hematol., 5, 87 (1977)] brukes til å evaluere effekten av SCF på normal marg. I korte trekk plates alle benmargcellene etter lyse av røde blodlegemer ut i halvfaste agarkulturer som inneholder teststoffet. Etter 10 dager telles koloniene som inneholder sammenklumpninger av mer enn 40 celler. Agarkulturene kan tørkes ned på dekkglass, og morfologien til cellene kan bestemmes via spesifikke, histo-logiske farginger.

På normal musebenmarg var den rensede pattedyr-rotte-SCF en pluripotensiell CSF som stimulerer veksten av kolonier bestående av ikke fullt utviklede celler, neutrofiler, makrofager, eosinofiler og megakaryocytter uten behov for andre faktorer. Av 200.000 celler utplatet vokser over 100 slike kolonier over en 10-dagers periode. Både rotte- og human SCF stimulerer produksjonen av erythroidceller i kombinasjon med EPO, se eksempel 9.

B. Kondisjonert medium

Buffalo rottelever (BRL) 3A-celler fra American Type Culture Collection (ATCC CRL1442) ble dyrket på mikrobærere

i et 20-liters perfusjonskultursystem for produksjon av SCF. Ved dette systemet benyttes en "Biolafitte" fermentor (modell ICC-20) bortsett fra utsorteringene som brukes for retensjon av mikrobærere og oxygeneringsrøret. De 75 mikromesh sikter holdes frie for mikrobærertetting ved periodisk tilbake-skylling oppnådd gjennom et system av sjekkventiler og data-maskinregulerte pumper. Hver sikt virker alternativt som mediumtilførsel og innhøstingssikt. Dette oscillerende strøm-ningsmønster sikrer at siktene ikke tettes. Oxygenering ble tilveiebrakt gjennom en spiral av silikonrør (50 fot lang, 0,25 inch indre diameter, 0,03 inch vegg). Dyrkningsmediet som ble brukt for dyrkingen av BRL 3A-celler, var minimalt essensielt medium (med Earles salter), 2 mM glutamm, 3 g/l glucose, tryptosefosfat (2,95 g/l), 5% bovint fosterserum og 5% kalvefosterserum. Innhøstingsmediet var identisk, bortsett fra utelatelsen av serum. Reaktoren inneholdt "Cytodex 2" mikrobærere ved en konsentrasjon på 5 g/l og ble tilsatt 3 x 10 9BRL 3A-celler dyrket i rulleflasker og fjernet ved trypsinisering. Cellene fikk feste seg til og vokse på mikrobærerne i 8 dager. Dyrkningsmedium ble overøst gjennom reaktoren etter behov basert på glucoseforbruk. Glucosekonsentrasjonen ble holdt ved omtrent 1,5 g/l. Etter 8 dager ble reaktoren overøst med 6 volumer serumfritt medium for å

fjerne mesteparten av serumet (protemkonsentrasjon

< 50 ug/ml). Reaktoren ble så drevet satsvis inntil glucosekonsentrasjonen falt under 2 g/l. Fra dette punktet av ble reaktoren drevet ved en kontinuerlig perfusjonshastighet på omtrent 10 l/dag. pH i kulturen ble holdt ved 6,9 0,3 ved å regulere (X^-strømnmgshastigheten. Det oppløste oxygen ble holdt høyere enn 20% luftmetning ved å supplere med rent oxygen etter behov. Temperaturen ble holdt ved 37 - 0,5°C.

Omtrent 336 liter serumfritt, kondisjonert medium ble frembrakt fra systemet ovenfor og ble brukt som startmateriale for rensingen av naturlig pattedyr-celleutvunnet rotte-SCF.

C. Rensing

Alt rensearbeide ble utført ved 4°C med mindre annet

er angitt.

1. DEAE- cellulose- anionbytterkromatografi

Kondisjonert medium frembrakt ved hjelp av serumfri vekst av BRL 3A-cellery ble klaret ved filtrering gjennom 0,45 um "Sartokapsler". Flere forskjellige mengder (41 1,

27 1, 39 1, 30,2 1, 37,5 1 og 161 1) ble separat underkastet konsentrasjon, diafiltrerings/buffer-utbytting og DEAE-cellulose-anionbytterkromatografi, på lik måte for hver mengde. DEAE-cellulose-poolene ble så slått sammen og viderebearbeidet som én mengde i avsnittene C2-5 i dette eksempel. Som illustrasjon var håndteringen av 41-lrtersmengdene som følger. Det filtrerte, kondisjonerte medium ble oppkonsentrert til — 700 ml under anvendelse av et "Millipore Pellicon" ultra-flltreringsapparat med tangensialstrømning med 4 polysulfon-membrankassetter med molekylvektgrense på 10.000 (20 kvadratfot totalt membranareal; pumpehastighet~1095 ml/minutt og flltreringshastighet 250-315 ml/minutt). Diafiltrer-mgs/buffer-utbyttmg ved fremstilling for anionbytterkromatografi ble så utført ved å tilsette 500 ml 50 mM Tris-HCl,

pH 7,8, til konsentratet, rekonsentrere til 500 ml ved bruk av ultraflltreringsapparatet med tangensialstrømning, og gjentagelse av dette seks ytterligere ganger. Det konsen-

trerte/diafiltrerte preparat ble til sist gjenvunnet ved et volum på 700 ml. Preparatet ble tilført en DEAE-cellulose-anionbytterkolonne (5 x 20,4 cm; "Whatman DE-52"-harpiks) som var blitt ekvilibrert med den 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, buffer. Etter tilførsel av prøve ble kolonnen vasket med 2050 ml av Tris-HCl-bufferen, og en saltgradient (0-300 mM NaCl i Tris-HCl-bufferen; 4 1 totalt volum) ble tilført. Fraksjoner å 15 ml ble samlet opp ved en strømningshastighet på 167 ml/time. Kromatograferingen er vist i figur 1. HPP-CFC-koloniantall viser til biologisk aktivitet i HPP-CFC-analysen; 100 ul fra de angitte fraksjoner ble analysert. Fraksjoner samlet opp under prøvetilførselen og vasket, er ikke vist i figuren; ingen biologisk aktivitet ble påvist i disse fraksjonene.

Oppførselen til alle kondisjonerte mediummengder underkastet oppkonsentreringen, diaflltrermgs/buffer-utbyttingen og anionbytterkromatografien, var lik. Protem-konsentrasjoner for mengdene, bestemt ved hjelp av metoden til Bradford [Anal. Biochem. 7_2, 248-254 (1967)] med bovint serumalbumin som standard, var i området 30-50 ug/ml. Det totale volum av kondisjonert medium benyttet for dette preparatet, var ca. 336 liter.

2. ACA 54 gelfiltrerinqskromatografi

Fraksjoner med biologisk aktivitet fra DEAE-cellulose-kolonnene kjørt for hver av de seks porsjonene med kondisjonert medium henvist til ovenfor (f.eks. fraksjonene 87-114 for forsøket vist i figur 1), ble kombinert (totalt volum 2900 ml) og oppkonsentrert til et sluttvolum på 74 ml ved bruk av "Amicon" omrørte celler og YMIO-membraner. Dette materiale ble tilført en ACA 54 (LKB) gelflltreringskolonne (figur 2) ekvilibrert i 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4. Fraksjoner å 14 ml ble samlet opp ved en strømningshastighet på 70 ml/time. På grunn av inhibitorfaktorer som sameluerte med de aktive fraksjoner, fremkom aktivitetstoppen splittet (HPP-CFC koloninummer); basert på tidligere kromatogrammer, sameluerer imidlertid aktiviteten med hovedprotemtoppen, og det ble derfor laget én sammenslått mengde av fraksjonene.

3. Hvetekimagglutinin- agarosekromatograf 3.

Fraksjonene 70-112 fra ACA 54 gelfiltreringskolonnen ble slått sammen (500 ml). Den sammenslåtte mengde ble delt1to og hver halvdel underkastet kromatografi under anvendelse av en hvetekimagglutinin-agarosekolonne (5 x 24,5 cm; harpiks fra E-Y Laboratories, San Mateo, CA; hvetespire-agglutinin gjenkjenner visse carbohydratstrukturer) ekvilibrert120 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,4. Etter prøve-tilsetningene ble kolonnen vasket med ca. 2200 ml av kolonnebufferen, og eluering av bundet materiale ble så utført ved å tilsette en oppløsning av 350 mM N-acetyl-D-glucosamin opp-løst1kolonnebufferen, idet man begynte ved fraksjon **2101figur 3. Fraksjoner å 13,25 ml ble samlet opp ved en strøm-ningshastighet på 122 ml/time. En av kromatograferingene er vist1figur 3. Porsjoner av fraksjonene som skulle ana-lyseres, ble dialysert mot fosfatbufret saltoppløsmng; 5 pl av det dialyserte materiale ble plassert1MC/9-analyseprøven (cpm-verdier1figur 3) og 10 ul1HPP-CFC-analyseprøven (kolonitallverdier1figur 3). Det kan ses at det aktive materiale bandt seg til kolonnen og ble eluert med N-acetyl-D-glucosaminet, mens mye av det forurensende materiale passerte gjennom kolonnen under prøvetilsetning og vasking.

4. S- Sepharose hurtigstrømningskationbytterkromatograf1

Fraksjonene 211-225 fra hvetespireagglutinin-agarose-kromatografi vist1figur 3 og ekvivalente fraksjoner fra den andre kromatografering, ble slått sammen (375 ml) og dialysert mot 25 mM natriumformiat, pH 4,2. For å minimalisere eksponeringstiden mot lav pH ble dialysen gjort over et tids-rom på 8 timer mot 5 liter buffer, idet det ble gjort fire endringer1tidsrommet på 8 timer. Ved slutten av denne dialyseperioden var prøvevolumet 480 ml, og pH og konduktiv-lteten til prøven var nær opp til dialysebufferens. Utfelt materiale fremkom1prøven under dialyse. Dette ble fjernet ved sentrifugering ved 22.000 x g130 minutter, og supernatanten fra den sentrifugerte prøve ble tilført en S-Sepharose hurtigstrømningskationbytterkolonne (3,3 x 10,25 cm; harpiks fra Pharmacia) som var blitt ekvilibrert i natrium-formiatbufferen. Strømningshastighet var 465 ml/time, og fraksjoner å 14,2 ml ble samlet opp. Etter prøvetilsetning ble kolonnen vasket med 240 ml kolonnebuffer, og eluering av bundet materiale ble utført ved å tilføre en gradient av 0-750 mM NaCl (NaCl oppløst i kolonnebuffer; totalt gradientvolum 2200 ml), idet man begynte ved fraksjon~45 i figur 4. Elueringsprofilen er vist i figur 4. Oppsamlede fraksjoner ble regulert til pH 7-7,4 ved tilsetning av 200 yl 0,97 M Tris-base. Cpm i figur 4 henviser igjen til de oppnådde resultater i MC/9 biologisk analyseprøve; porsjoner av de angitte fraksjoner ble dialysert mot fosfatbufret saltoppløs-ning og 20 ul plassert i analyseforsøket. Det kan ses i figur 4 at hoveddelen av biologisk aktivt materiale passerte gjennom kolonnen ubundet, mens mye av det forurensende materiale ble bundet og eluert i saltgradienten.

5. Kromatografi under anvendelse av silicabundet hydrocarbon-harpiks

Fraksjonene 4-40 fra S-Sepharose-kolonnen ifølge

figur 4 ble slått sammen (540 ml). 450 ml av den sammenslåtte mengde ble kombinert med et likt volum buffer B (100 mM ammoniumacetat, pH 6:isopropanol; 25:75) og tilført ved en strømningshastighet på 540 ml/time til en C4~kolonne ("Vydac Proteins C4"; 2,4 x 2 cm) ekvilibrert med buffer A (60 mM ammoniumacetat, pH 6:isopropanol; 62,5:37,5). Etter prøve-tilførsel ble strømnmgshastigheten redusert til 154 ml/time, og kolonnen ble vasket med 200 ml av buffer A. En lineær gradient fra buffer A til buffer B (totalt volum 140 ml) ble så tilført, og fraksjoner å 9,1 ml ble samlet opp. Porsjoner av den sammenslåtte mengde fra S-Sepharose-kromatografi, C4-kolonne-startprøve, gjennomløpt sammenslått mengde og sammenslått vaskemengde, ble brakt til 40 ug/ml bovint serumalbumin ved tilsetning av et passende volum av en 1 mg/ml råmaterialeoppløsning, og det ble dialysert mot fosfatbufret saltoppløsning ved preparering for biologisk analyse. Likeledes ble 40 ml aliquoter av gradientfraksjonene kombinert

med 360 ul fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 16 pg bovint serumalbumm, og dette ble etterfulgt av dialyse mot fosfatbufret saltoppløsning ved fremstilling for biologisk analyse. Disse forskjellige fraksjonene ble analysert ved hjelp av MC/9-analysen (6,3 ul aliquoter av de fremstilte gradientfraksjoner; cpm i figur 5). Analyseresultatene indikerer også at ca. 75% av den utvundne aktivitet var i gjennomløpnings- og vaskefraksjonene, og 25% i gradientfraksjonene angitt i figur 5. SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227,

s. 680-685 (1970); stablegeler inneholdt 4% (vekt/volum) acrylamid og separasjonsgeler inneholdt 12,5% (vekt/volum) acrylamid] av aliquoter av forskjellige fraksjoner er vist i figur 6. For den viste gel ble prøvealiquoter tørket under vakuum og så på nytt oppløst under anvendelse av 20 ul prøve-behandlingsbuffer {ikke-reduserende, dvs. uten 2-mercaptoethanol) og kokt i 5 minutter før påfylling på gelen. Feltene A og B utgjør hhv. kolonne-startmateriale (75 pl av 890 ml)

og kolonne-gjennomløpningsmateriale (75 pl av 880 ml); de nummererte merkene til venstre i figurene viser migrerings-posisjoner (redusert) for markører med molekylvekt på 10<3>ganger de angitte tall, hvor markørene er fosforylase b (Mr på 97.400), bovint serumalbumm (Mr på 66.200), ovalbumin (Mr på 42.700), carbonsyreanhydrase (Mr på 31.000), soya-bønnetrypsininhibitor (M^på 21.500) og lysozym (Mr på 14.400); feltene 4-9 utgjør de tilsvarende fraksjoner samlet opp under tilførsel av gradienten (60 pl av 9,1 ml). Gelen ble sølv-farget [Momssey, Anal. Biochem. , 117, 307-310 (1981)].

Det kan ses ved sammenligning av feltene A og B at hoveddelen av fargbart materiale passerer gjennom kolonnen. Det fargede materiale i fraksjonene 4-6 i områdene like over og under Mr 31.000 standardposisjonen faller sammen med den biologiske aktivitet påvist i gradientfraksjonene (figur 5) og utgjør det biologisk aktive materiale. Det bør legges merke til at dette materiale visualiseres i feltene 4-6, men ikke i feltene A og/eller B, fordi en mye større andel av det totale volum (0,66% av det totale for fraksjonene 4-6 mot 0,0084%

av det totale for feltene A ogB) ble påfylt for den først-

nevnte. Fraksjonene 4-6 fra denne kolonnen ble slått sammen.

Som nevnt ovenfor, løp ca. 75% av den utvundne aktivitet gjennom C4-kolonnen ifølge figur 5. Dette materiale ble rekromatografert under anvendelse av C^-harpiks hovedsakelig som beskrevet ovenfor, bortsett fra at en større kolonne (1,4 x 7,8 cm) og saktere strømningshastighet (50-60 ml/time gjennom hele) ble brukt. Ca. 50% av utvunnet aktivitet var i det som løp gjennom, og 50% i gradientfraksjoner som opp-viser lignende tilsynekomst i SDS-PAGE som de aktive gradientfraksjonene i figur 6. Aktive fraksjoner ble slått sammen

(29 ml).

En analytisk C4~kolonne ble også utført hovedsakelig som angitt ovenfor, og fraksjonene ble analysert i begge bio-analysene. Som indikert i figur 7 i fraksjonene fra denne analytiske kolonne, sameluerte MC/9- og HPP-CFC-bioaktivi-tetene. SDS-PAGE-analyse (figur 8) avslører tilstedeværelsen av proteinet med Mr~31.000 i kolonnefraksjonene som inneholder biologisk aktivitet i begge analyser.

Aktivt materiale i den andre (forholdsvis mindre) aktivitetstopp ses i S-Sepharose-kromatografi (f.eks. figur 4, fraksjonene 62-72, tidlige fraksjoner i saltgradienten) er også blitt renset ved hjelp av C^-kromatografi. Det utviste den samme oppførsel på SDS-PAGE og hadde den samme N-ter-ntinale ammosyresekvens (se eksempel 2D) som materialet erholdt ved hjelp av C4~kromatografi i fraksjonene som løp gjennom i S-Sepharose.

6. Oppsummering av rensing

En oppsummering av rensetrinnene beskrevet i 1-5 ovenfor, er gitt i tabell 2.

D. SDS- PAGE og glycosidasebehandlmger

SDS-PAGE av sammenslåtte gradientfraksjoner fra de to storskala C^-kolonnekjøringer er vist i figur 9. 60 ul av den sammenslåtte mengde for den første C^-kolonne ble tilført (felt 1), og 40 pl av den sammenslåtte mengde for den andre C^-kolonne (felt 2). Disse gelfeltene ble sølv- farget. Molekylvektmarkører var som beskrevet for figur 6. Som nevnt, representerer det diffust migrerende materiale over og under posisjonen til markøren med Mr 31.000 det biologisk aktive materiale; den tilsynelatende heterogenitet skyldes stort sett heterogeniteten ved glycosylering.

For å karakterisere glycosyleringen ble renset materi-125

ale jodert med I, behandlet med flere forskjellige glycosidaser og analysert ved hjelp av SDS-PAGE (reduserende betingelser) med autoradiografi. Resultater er vist i figur 9.

125

Feltene 3 og 9, I-merket materiale uten noen glycosidase-behandling. Feltene 4-8 representerer 12 5I-merket materiale behandlet med glycosidaser på følgende måte. Felt 4, neur-ammidase. Felt 5, neuraminidase og 0-glycanase. Felt 6, N-glycanase. Felt 7, neuraminidase og N-glycanase. Felt 8, neuraminidase, 0-glycanase og N-glycanase. Betingelsene var 5 mM 3-[(3-kolamidopropyl)dimethylammonio]-l-propansulfonat (CHAPS), 33 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 7-7,2,

i 3 timer ved 37°C. Neuraminidase (fra Arthrobacter ureafaciens; Calbiochem) ble brukt ved 0,23 enheter/ml sluttkonsentrasjon. 0-glycanase (Genzyme; endo-alfa-N-acetylgalactosaminidase) ble brukt ved 45 millienheter/ml. N-glycanase [Genzyme; peptid:N-glycosidase F; peptid-N [N-acetyl-betaglucosaminyl]asparagin-amidase) ble brukt ved 10 enheter/ml.

Lignende resultater med de ifølge figur 9 ble oppnådd etter behandling av umerket, renset SCF med glycosidaser,

og visualisering av produkter ved sølvfargmg etter SDS-PAGE.

Når det var påkrevet, ble det utført forskjellige kontrollmkubasjoner. Disse omfattet: inkubasjon i passende buffer, men uten glycosidaser, for å bekrefte at resultater skyldtes de tilsatte glycosidasepreparater; inkubasjon med glycosylerte proteiner (f.eks. glycosylert, rekombinant, humant erythropoietin) kjent for å være substrater for glycosidasene, for å bekrefte at de anvendte glycosidaseenzymer var aktive; og inkubasjon med glycosidaser, men ikke noe substrat, for å bekrefte at glycosidasene ikke i seg selv bidro til eller forstyrret de visualiserte gelbånd.

Glycosidasebehandlinger ble også utført med endo-beta-N-acetylglucosamidase F (endo F; NEN Dupont) og med endo-beta-N-acetylglucosammidase H (endo H; NEN Dupont) , igjen med passende kontrollinkubasjoner. Behandlingsbeting-elser med endo F var: koking i 3 minutter i nærvær av 1%

(vekt/volum) SDS, 100 mM 2-mercaptoethanol, 100 mM EDTA, 320 mM natriumfosfat, pH 6, etterfulgt av 3-gangers fortynning med innlemmelse av "Nonidet P-40" (1,17%, volum/volum, sluttkonsentrasjon), natriumfosfat (200 mM, sluttkonsentrasjon) og endo F (7 enheter/ml, sluttkonsentrasjon). Betingelser for endo H-behandling var like, bortsett fra at SDS-konsentrasjon var 0,5% (vekt/volum) og endo H ble brukt ved en konsentrasjon på 1 ug/ml. Resultatene med endo F var de samme som med N-glycanase, mens endo H ikke hadde noen effekt på det rensede SCF-materiale.

Det kan trekkes en rekke konklusjoner ut fra glyco-sidaseforsøkene beskrevet ovenfor. De forskjellige behandlinger med N-glycanase [som fjerner både kompleks og høy-mannose N-bundet carbohydrat (Tarentmo et al., Biochemistry 24, s. 4665-4671) (1985)], endo F [som virker likt med N-glycanase (Elder og Alexander, Proe. Nati. Acad. Sei. USA

19, s. 4540-4544 (1982)], endo H [som fjerner høy-mannose og bestemt hybridtype N-bundet carbohydrat (Tarentmo et al., Methods Enzymol. 50C, s. 574-580 (1978)], neuraminidase

(som fjerner sialmsyrerester) , og 0-glycanase [som fjerner visse 0-bundne carbohydrater (Lambin et al., Biochem. Soc. Trans. 12, s. 599-600 (1984)], tyder på at: både N-bundne og 0-bundne carbohydrater er til stede; mesteparten av det N-bundne carbohydrat er av komplekstypen; og sialinsyre er til stede, idet minst noe av den er en del av de0-bundne rester. Noe informasjon vedrørende mulige seter for N-bindmg kan fås fra ammosyresekvensdata (eksempel 2) . Det faktum at behandling med N-glycanase, endo F, og N-glycanase/neuramin-ldase tydeligvis kan omdanne det heterogene materiale ved hjelp av SDS-PAGE til hurtigere migrerende former som er mye mer homogene, er i overensstemmelse med den konklusjon at alt materialet utgjør det samme polypeptid, idet heterogeni-

teten er forårsaket av heterogeniteten i glycosylermg.

Det er også verdt å legge merke til at de minste formene oppnådd ved hjelp av de kombinerte behandlinger med de forskjellige glycosidaser, er i området Mr 18.000-20.000 i forhold til molekylvektmarkørene brukt ved SDS-PAGE.

Bekreftelse av at det diffust migrerende materiale rundt stillingen Mr 31.000 på SDS-PAGE utgjør biologisk aktivt materiale som alt har den samme grunnleggende poly-peptidkjede, fremgår av det faktum at aminosyresekvensdata utledet fra materiale som migrerer i dette område {f.eks. etter elektroforetisk overføring og cyanbromidbehandling; eksempel 2\ stemmer overens med det som ble demonstrert for det isolerte gen hvis ekspresjon ved hjelp av midler for rekombinant DNA fører til biologisk aktivt materiale (eksempel 4) .

Eksempel 2

Aminosyresekvensanalyse av pattedyr- SCF

A. Reversfase væskekromatografi med høy yteevne ( HPLC) av renset protein

Omtrent 5 ug SCF renset som i eksempel 1 (konsentrasjon = 0,117 mg/ml) ble underkastet reversfase-HPLC under anvendelse av en C4trangboret kolonne ("Vydac", 300 A vid-boret, 2 mm x 15 cm). Proteinet ble eluert med en lineær gradient fra 97% mobil fase A (0,1% trifluoreddiksyre)/3% mobil fase B (90% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre) til 30% mobil fase A/70% mobil fase B i 70 minutter etterfulgt av isokratisk eluering i ytterligere 10 minutter ved en strøm-ningshastighet på 0,2 ml pr. minutt. Etter fratrekking av et buffertomt kromatogram var SCF synlig som en enkel symmet-risk topp ved en retensjonstid på 70,05 minutter, som vist i figur 10. Ingen store topper med forurensende protein kunne påvises under disse betingelser.

B. Sekvensering av elektroforetisk overførte proteinbånd

SCF renset som i eksempel 1 (0,5-1,0 nmol), ble behandlet som følger med N-glycanase, et enzym som spesifikt spalter de Asn-bundne carbohydratrester kovalent festet til proteiner (se eksempel ID). 6 ml av det sammenslåtte materiale fra fraksjonene 4-6 fra C^-kolonnen ifølge figur 5 ble tørket under vakuum. Så ble 150 ul 14,25 mM CHAPS, 100 mM 2-mercaptoethanol, 335 mM natriumfosfat, pH 8,6, tilsatt og inkubasjon utført i 95 minutter ved 37°C. Deretter ble 300 pl 74 mM natriumfosfat, 15 enheter/ml N-glycanase, pH 8,6, tilsatt og inkubasjon fortsatt i 19 timer. Prøven ble så kjørt på en 9-18% SDS-polyacrylamid-gradientgel (0,7 mm tykkelse, 20x20 cm). Proteinbånd i gelen ble overført elektroforetisk på polyvinyldifluorid (PVDF, Millipore Corp.) under anvendelse av 10 mM "Caps" buffer (pH 10,5) ved en konstant strømstyrke på 0,5 Amp i 1 time [Matsudaira, J. Biol. Chem., 261, s. 10035-10038 (1987)]. De overførte proteinbånd ble visualisert ved hjelp av farging med Coomassie Blue. Bånd var til stede ved Mr~29.000-33.000 og Mr~26.000, dvs. deglycosyleringen var bare partiell (se eksempel ID, figur 9); det første bånd utgjør uoppløst materiale og det siste utgjør materiale hvorfra N-bundet carbohydrat er fjernet. Båndene ble kuttet ut og fylt direkte (40% for Mr 29.000-33.000 protein og 80% for Mf 26.000 protein) på et proteinsekvens-apparat (Applied Biosystems Inc., modell 477). Protein-sekvensanalyse ble utført ved å bruke programmer levert av produsenten [Hewick et al., J. Biol. Chem., 256 7990-7997

(1981)], og de frigjorte fenylthiohydantomylaminosyrer ble analysert on-lme under anvendelse av C^g reversfase-HPLC

med mikrobormg. Begge båndene ga ingen signaler for 20-28 sekvenseringssykluser, noe som tyder på at begge ikke lot seg sekvensbestemme ved hjelp av metodikk under anvendelse av Edman-kjemi. Bakgrunnsnivået på hver sekvenseringskjøring var mellom 1 og 7 pmol, noe som var langt under protein-mengden som er til stede i båndene. Disse dataene tyder på at protein i båndene var N-terminalt blokkert.

C. In situ CNBr- spaltmg av elektroforetisk overført protein og sekvensering

For å bekrefte at proteinet faktisk var blokkert, ble membranene fjernet fra sekvenseringsapparatet (del B), og in situ spalting med cyanbromid (CNBr) av de blottede bånd ble utført [CNBr (5%, vekt/volum) i 70% maursyre i 1 time ved 45°C], etterfulgt av tørking og sekvensanalyse. Sterke sekvenssignaler som representerte interne peptider erholdt fra methionylpeptidbindingsspalting ved hjelp av CNBr, ble påvist.

Begge båndene ga identisk blandede sekvenssignaler angitt nedenunder for de første fem syklusene.

Begge båndene ga også like signaler opp til 20 sykluser. De innledende utbytter var 40-115 pmol for båndet med Mr 26.000 og 40-150 pmol for båndet med Mr 29.000-33.000. Disse verdiene er sammenlignbare med de opprinnelige, molare mengder av protein fylt på sekvensapparatet. Resultatene bekreftet at proteinbånd svarer til SCF som inneholder en blokkert N-ende. Fremgangsmåter brukt til å oppnå nyttig sekvens-inf ormas jon for N-termmalt blokkerte proteiner, omfatter: (a) avblokkering av N-enden {se avsnitt D); og (b) frembringelse av peptider ved hjelp av interne spaltinger med CNBr (se avsnitt E), med trypsin (se avsnitt F) og med Staphylococcus aureus (stamme V-8) protease (Glu-C) (se avsnitt C). Sekvensanalyse kan fortsette etter at den blokkerte N-ende-aminosyre er fjernet eller peptidfragmentene er isolert. Eksempler er beskrevet nærmere nedenunder.

D. Sekvensanalyse av BRL stamcellefaktor behandlet med pyroglutaminsyreaminopeptidase

Den kjemiske natur til blokkeringsresten som er til stede i aminoenden til SCF, var vanskelig å forutsi. Blokk-ering kan være post-translasjonell m vivo [F. Wold, Ann.

Rev. Biochem., 50, s. 783-814 (1981)] eller kan oppstå in vitro under rensing. To post-translasjonelle modifikasjoner er mest vanlig å iaktta. Acetylering av visse N-ende-ammosyrer, slik som Ala, Ser, etc, kan opptre, katalysert ved hjelp av N-a-acetyltransferase. Denne kan bekreftes ved isolering og massespektrometrisk analyse av et N-terminalt, blokkert peptid. Dersom aminoenden i et protein er glutamin, kan deamidering av dets gamma-amid oppstå. Cyklisering som omfatter gamraa-carboxylatet og den frie N-ende, kan så oppstå, hvorved man får pyroglutamat. For å påvise pyroglutamat kan enzymet pyroglutamataminopeptidase brukes. Dette enzymet fjerner pyroglutamatrester og etterlater en fri aminoende som starter i den andre aminosyre. Edman-kjemi kan så brukes for sekvensering.

SCF (renset som i eksempel 1; 400 pmol) i 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,6, inneholdende dithiothreitol og EDTA) ble inkubert med 1,5 enheter kalvelever-pyroglutaminsyreaminopeptidase (pE-AP) i 16 timer ved 37°C. Etter omsetning ble blandingen fylt direkte på proteinsekvensapparatet. En hovedsekvens kunne identifiseres gjennom 46 sykluser. Det innledende utbytte var ca. 40%, og repetitivt utbytte var 94,2%. Den N-terminale sekvens i SCF som omfatter den N-terminale pyroglutaminsyre, er:

pE-AP-spaltingssted

+ 10

pyroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp-Ile-Thr-Lys-20 30

Leu-Val-Ala-Asn-leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-I1e-Thr-Leu-Asn-Tyr-Val-

40

Ala-Gly-Met-Asp-Val-Leu-Pro-Ser-His-xxx-Trp-teu-Arg-Asp-

xxx, ikke bestemt i posisjon 43

Disse resultatene indikerte atSCF inneholder pyroglutaminsyre som N-enden.

E. Isolering og sekvensanalyse av CNBr- peptider

SCF renset som i eksempel 1 (20-28 ug; 1,0-1,5 nmol) ble behandlet med N-glycanase som beskrevet i eksempel 1. Omdannelse til materialet med Mr 26.000 var fullstendig i dette tilfelle. Prøven ble tørket og oppløst med CNBr i 70% maursyre (5%) i 18 timer ved væreIsetemperatur. Oppløsningen ble fortynnet med vann, tørket og på nytt oppløst i 0,1% trifluoreddiksyre. CNBr-peptider ble fraskilt ved reversfase-HPLC under anvendelse av en C4~trangboret kolonne og eluer-mgsbetingelser som var identiske med dem som er beskrevet i avsnitt A ifølge dette eksempel. Flere hovedpeptidfraksjoner ble isolert og sekvensbehandlet, og resultatene er oppsummert nedenunder:

F. Isolering og sekvensering av BRL stamcellefaktor trypiske fragmenter

SCF renset som i eksempel 1 {20 ug i 150 ul 0,1 M ammoniumbicarbonat) ble oppløst med 1 ug trypsin ved 37°C i 3,5 timer. Oppløsningen ble øyeblikkelig kjørt på reversfase, trangboret C^-HPLC under anvendelse av elueringsbeting-elser som er identiske med dem som er beskrevet i avsnitt A ifølge dette eksempel. Alle eluerte peptidtopper hadde retensjonstider som er forskjellige fra det ikke-oppløste SCF (avsnitt A). Sekvensanalysene av de isolerte peptider er vist nedenunder:

G. Isolering og sekvensering av BRL stamcellefaktor-peptider etter S. aureus Glu- C proteasespaltmg

SCF renset som i eksempel 1 (20 ug i 150 ul 0,1 M ammoniumbicarbonat) ble underkastet Glu-C-proteasespalting ved et protease-til-substrat-forhold på 1:20. Oppløsningen ble utført ved 37°C i 18 timer. Oppløsningsproduktet ble øyeblikkelig fraskilt ved reversfase-trangboret C^-HPLC.

5 hovedpeptidfraksjoner ble samlet opp og sekvensert som beskrevet nedenunder:

H. Sekvensanalyse av BRL stamcellefaktor etter BNPS-skatol- spalting

SCF (2 ug) i 10 mM ammoniumbicarbonat ble tørket fullstendig ved vakuumsentrifugering og så på nytt oppløst i 100 ul iseddik. Et 10-20-gangers molart overskudd av BNPS-skatol ble tilsatt til oppløsningen, og blandingen ble inkubert ved 50°C i 60 minutter. Reaksjonsblandingen ble så tørket ved vakuumsentrifugering. Den tørkede rest ble ekstrahert med 100 ul vann og på nytt med 50 ul vann. De kombinerte ekstrakter ble så underkastet sekvensanalyse som beskrevet ovenfor. Den følgende sekvens ble påvist:

Stilling 28 ble ikke positivt bestemt; den ble bestemt som Asn basert på det potensielle N-bundne glycosyleringssted.

I. C- endeaminosyrebestemmelse av BRL stamcellefaktor

En aliquot av SCF-protein (500 pmol) ble buffer-byttet i 10 mM natriumacetat, pH 4,0 (sluttvolum 90 pl), og "Brij-35" ble tilsatt til 0,05% (vekt/volum). En 5 pl aliquot ble tatt ut for kvantifisering av protein. 40 pl av prøven ble fortynnet til 100 pl med bufferen beskrevet ovenfor. Carboxypeptidase P (fra Penicillium janthinellum) ble tilsatt ved et enzym-til-substrat-forhold på 1:200. Oppløsningen fortsatte ved 25°C, og 20 pl aliquoter ble tatt ut ved 0, 15, 30, 60 og 120 minutter. Oppløsningen ble bestemt på hvert tidspunkt ved å addere trifluoreddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 5%. Prøvene ble tørket, og de frigjorte aminosyrer ble derivatisert ved omsetning med Dabsylklorid (dimethylaminoazobenzensulfonylklorid) i 0,2 M NaHCO^(pH 9,0)

ved 70°C i 12 minutter [Chang et al., Methods Enzymol., 90,

s. 41-48 (1983)]. De derivatiserte aminosyrer (1/6 av hver prøve) ble analysert ved hjelp av trangborings reversfase-HPLC med en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge Chang et al. [Teknikker i proteinkjemi, T. Hugli red., Acad. Press, NY

(1989), s. 305-311]. Kvantitative sammensetningsresultater på hvert tidspunkt ble oppnådd ved sammenligning med derivatiserte ammosyrestandarder (1 pmol) . Ved 0 tid ble forurensende glycin påvist. Alanin var den eneste aminosyre som økte med inkubasjonstid. Etter 2 timers inkubasjon ble Ala påvist ved en samlet mengde på 25 pmol, ekvivalent med 0,66 mol Ala frigjort pr. mol protein. Dette resultatet indikerte at det naturlige pattedyr-SCF-molekyl inneholder Ala som sin carboxylende, i overensstemmelse med sekvens-analysen av et C-terminalt peptid, S-2, som inneholder C-terminal Ala. Denne konklusjonen er også i overensstemmelse med den kjente spesifisitet til carboxypeptidase P [Lu et al., J. Chromatog. 447, s. 351-364 (1988)]. F.eks. avsluttes spalting dersom sekvensen Pro-Val støtes på. Peptid S-2 har sekvensen S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A) og ble utledet å være det C-terminale peptid i SCF (se avsnitt J i dette eksempel). C-ende-sekvensen P-V-A-(A) begrenser protease-spaltingen til bare alanin. Aminosyresammensetningen til peptid S-2 indikerer tilstedeværelsen av 1 Thr, 2 Ser, 3 Pro, 2 Ala, 3 Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys og 1 Arg, tilsammen 16 rester. Påvisningen av 2 Ala-rester indikerer at det kan være to Ala-rester i C-enden til dette peptid (se tabell i avsnitt G). BRL-SCF stanser således ved Ala 164 eller Ala 165.

J. SCF- sekvens

Ved å kombinere resultatene oppnådd fra sekvensanalyse av (1) intakt stamcellefaktor etter fjerning av dens N-termmale pyroglutammsyre, (2) CNBr-peptidene, (3) tryp-smpeptidene og (4) Glu-C-peptidasefragmentene, ble en N-terminalsekvens og en C-terminalsekvens utledet (figur 11). Den N-terminale sekvens starter ved pyroglutammsyre og ender ved Met-48. Den C-terminale sekvens inneholder 84/85 aminosyrer (stilling 82 til 164/165). Sekvensen fra stilling 49 til 81 ble ikke påvist i noen av de isolerte peptider. Det ble imidlertid påvist en sekvens for et stort peptid etter BNPS-skatol-spalting av BRL-SCF som beskrevet i avsnitt H i dette eksempel. Fra disse ytterligere data,

samt DNA-sekvens oppnådd fra rotte-SCF (eksempel 3), kan de N- og C-terminale sekvenser stilles opp ved siden av hverandre og den totale sekvens avtegnes som vist i figur 11. N-enden til molekylet er pyroglutammsyre, og C-enden er alanin, som bekreftet ved hjelp av hhv. pyroglutamat-aminopeptidase-oppløsnmg og carboxypeptidase P-oppløsnmg.

Fra sekvensdata konkluderes det med at Asn-72 er glycosylert; Asn-109 og Asn-120 er sannsynligvis glycosylerte i noen molekyler, men ikke i andre. Asn-65 kunne påvises under sekvensanalyse og kan derfor bare være delvis glycosylert, om i det hele tatt. Ser-142, Thr-143 og Thr-155, forutsagt ut fra DNA-sekvens, kunne ikke påvises under ammosyre-sekvensanalyse og kunne derfor være steder for O-bundet carbohydratbinding. Disse potensielle carbohydratbindings-steder er angitt i figur 11; N-bundet carbohydrat er angitt ved hjelp av tett, uthevet bokstavering; O-bundet carbohydrat er angitt ved hjelp av åpen, uthevet bokstavering.

K. Aminosyresammensetnmgsanalyse av BRL- stamcelle faktor

Materiale fra C4~kolonnen ifølge figur 7 ble klar-gjort for aminosyresammensetnmgsanalyse ved oppkonsentrering og bufferutbyttmg til 50 mM ammoniumbicarbonat.

To 70 pl prøver ble hver for seg hydrolysert i 6 N HCl inneholdende 0,1% fenol og 0,05% 2-mercaptoethanol ved 110°C under vakuum i 24 timer. Hydrolysatene ble tørket, rekondisjonert i natriumcitratbuffer og analysert under anvendelse avlonebytterkromatografi ("Beckman Model 6300" aminosyreanalyseapparat). Resultatene er vist i tabell 3. Ved å bruke 164 aminosyrer (fra protemsekvenseringsdataene) for å beregne aminosyresammensetning fås en bedre overensstemmelse med forutsagte verdier enn ved å bruke 193 aminosyrer (som utledet fra PCR-avledede DNA-sekvensermgsdata, figur 14C).

Innlemmelse av en kjent mengde av en intern standard i aminosyresammensetningsanalysene muliggjorde også kvanti fisering av protein i prøven; en verdi på 0,117 mg/ml ble oppnådd for den analyserte prøve.

Eksempel 3

Kloning av genene for rotte- og human- SCF

A. Amplifikasjon og sekvensering av rotte- SCF- cDNA-fragmenter

Bestemmelse av aminosyresekvensen til fragmenter av rotte-SCF-protemet gjorde det mulig å utforme oligonukleotider med blandet sekvens som er spesifikke for rotte-SCF. Oligonukleotidene ble brukt som hybridisermgsprober for å screene rotte-cDNA og genombiblioteker, og som primere i for-søk på å amplifisere deler av cDNA under anvendelse av strategier med polymerasekjedereaksjon (PCR) [Mullis et al., Methods in Enzymol. 155, s. 335-350 (1987)]. Oligodeoxy-nukleotidene ble syntetisert ved hjelp av fosforamiditt-metoden [Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22_, s. 1859-1862

(1981); McBride et al., Tetrahedron Lett., 2A, s. 245-248

(1983)]; deres sekvenser er vist i figur 12A. Bokstavene har følgende betydning: A = adenin, T = thymin, C = cytosin,

G = guanin, I = mosin.<*->tegnet i figur 12A representerer oligonukleotider som inneholder restriksjonsendonuklease-gjenkjennelsessekvenser. Sekvensene er skrevet 5'-»3'.

Et rottegenombibliotek, et rottelever-cDNA-bibliotek og to BRL-cDNA-biblioteker ble screenet under anvendelse av 32

P-merkede blandede oligonukleotidprober, 219-21 og 219-22 (figur 12A), hvis sekvenser var basert på aminosyresekvens oppnådd som i eksempel 2. Ingen SCF-kloner ble isolert i disse forsøkene under anvendelse av standardmetoder for cDNA-kloning [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, S. 212-246 (1982)].

En alternativ fremgangsmåte som resulterte i isoleringen av SCF-nukleinsyresekvenser, omfattet bruken av PCR-teknikker. Ved denne metodikken amplifiseres området i DNA som omfattes av to DNA-primere selektivt in vitro ved flere sykluser med replikasjon katalysert ved hjelp av en egnet DNA-polymerase (slik som Tagl-DNA-polymerase) i nærvær av deoxynukleosidtrifosfater i et varme-sykliseringsapparat. Spesifisiteten til PCR-amplifikasjon er basert på to oligonukleotidprimere som flankerer DNA-segmentet som skal amplifiseres, og hybridisere til motsatte tråder. PCR med dobbeltsidig spesifisitet for et bestemt DNA-område i en kompleksblanding oppnås ved bruk av to primere med sekvenser som er tilstrekkelig spesifikke for dette området. PCR med gjensidig spesifisitet benytter én områdespesifikk primer og en andre primer som kan prime ved målseter som er til stede på mange eller alle DNA-molekylene i en bestemt blanding [Lon et al., Science, 243, s. 217-220 (1989)].

DNA-produktene fra vellykkede PCR-ampliflkasjons-reaksjoner er kilder for DNA-sekvensmformasjon [Gyllensten, Biotechmques, 1_, s. 700-708 (1989) ] og kan brukes til å lage merkede hybridiseringsprober som har større lengde og høyere spesifisitet enn oligonukleotidprober. PCR-produkter kan også utformes med passende primersekvenser for kloning i plasmidvektorer som muliggjør ekspresjonen av peptidproduktet som det kodes for.

Den grunnleggende strategi for å oppnå DNA-sekvensen til rotte-SCF-cDNA er skissert i figur 13A. De små pilene indikerer PCR-amplifikasjoner, og de tykke pilene indikerer DNA-sekvenseringsreaksjoner. PCR-er 90.6 og 96.2 sammen med DNA-sekvensering, ble brukt til å oppnå delvis nukleinsyre-sekvens for rotte-SCF-cDNA. De anvendte primere i disse PCR-er var blandede oligonukleotider basert på ammosyresekvens vist i figur 11. Ved å bruke sekvensmformasjonen oppnådd fra PCR-er 90.6 og 96.2, ble det laget unike sekvens-primere (224-27 og 224-28, figur 12A) som ble brukt i etter-følgende amplifikasjoner og sekvenseringsreaksjoner. DNA inneholdende 5<*->enden til cDNA, ble erholdt i PCR-er 90.3, 96.6 og 625.1 under anvendelse av PCR med ensidig spesifisitet. Ytterligere DNA-sekvens nær C-enden til SCF-protem ble oppnådd i PCR 90.4. DNA-sekvens for det gjenværende av det kodende område i rotte-SCF-cDNA ble oppnådd fra PCR-produktene 630.1, 630.2, 84.1 og 84.2 som beskrevet neden under i avsnitt C i dette eksempel. Teknikkene som ble brukt for å oppnå rotte-SCF-cDNA, er beskrevet nedenunder.

RNA ble fremstilt fra BRL-celler som beskrevet av Okayama et al. [MethodsEnzymol., 154, s. 3-28 (1987)]. PolyA+-RNA ble isolert under anvendelse av en oligo(dT)-cellulosekolonne som beskrevet av Jacobson i [Methods in Enzymology, volum 152, s. 254-261 (1987)].

Førstetråds-cDNA ble syntetisert under anvendelse av 1 ug BRL-polyAH—RNA som templat og (dT)12-18somPrimer1henhold til fremgangsmåten levert sammen med enzymet, Mo-MLV-reverstranskriptase (Bethesda Research Laboratories). Nedbrytning av RNA-tråd ble utført ved å bruke 0,14 M NaOH ved 84°C i 10 minutter eller inkubasjon i et kokende vannbad i 5 minutter. Overskudd av ammoniumacetat ble tilsatt for å nøytralisere oppløsningen, og cDNA-en ble først ekstrahert med fenol-kloroform, så ekstrahert med kloroform-isoamyl-alkohol og utfelt med ethanol. For å muliggjøre bruken av oligo(dC)-relaterte primere i PCR-er med ensidig spesifisitet ble en poly(dG)-hale føyet til 3'-enden til en aliquot av førstetråds-cDNA-en med terminal transferase fra kalve-thymus (Boehringer Mannheim) som tidligere beskrevet [Deng et al., Methods Enzymol., 100, s. 96-103 (1983)].

Med mindre annet er angitt i beskrivelsene som følger, ble denatureringstrinnet i hver PCR-syklus innstilt ved 94°C, 1 minutt; og forlengelse var ved 72°C i 3 eller 4 minutter. Temperaturen ved og varigheten av annealing var variabel fra PCR til PCR og utgjorde ofte et kompromiss basert på de beregnede behov for flere forskjellige PCR-er som ble utført samtidig. Når primerkonsentrasjoner ble redusert for å minske akkumuleringen av primerartefakter [Watson, Ampliflcations, 2, s. 56 (1989)], ble det indikert lengre annealingtider; når PCR-produktkonsentrasjonen var høy, ble det brukt kortere annealingtider og høyere primer-konsentras joner for å øke utbyttet. En hovedfaktor ved bestemmelse av annealmgtemperaturen var den beregnede T^for primer-mål-forbmdelse [Suggs et al., i Developmental Biology Using Purified Genes, red. Brown, D.D. og Fox, CF.

(Academic, New York) s. 683-693 (1981)]. Enzymene som ble brukt ved amplifikasjonene, ble erholdt fra en av tre pro-dusenter:Stratagene, Promega eller Perkin-Elmer Cetus. Reaksjonsforbindelsene ble brukt som foreslått av produsentene. Amplifikasjonene ble utført enten i et "Coy Tempcycle" eller et "Perkin-ElmerCetus" DNA-varmesykliseringsapparat.

Amplifikasjon av SCF-cDNA-fragmenter ble vanligvis analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese i nærvær av ethidiumbromid og visualisering ved hjelp av fluoescens av DNA-bånd stimulert ved ultrafiolett bestråling. I noen tilfeller hvor det var antesipert små fragmenter, ble PCR-produkter analysert ved hjelp av polyacrylamidgelelektro-forese. Bekreftelse på at de observerte bånd representerte SCF-cDNA-fragmenter, ble oppnådd ved iakttagelse av pass-

ende DNA-bånd etter etterfølgende amplifikasjon med én eller flere internaliserte primere. Endelig bekreftelse skjedde ved dideoxysekvensermg [Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7j4, s. 5463-5467 (1977)] av PCR-produktet og sammenligning av de forutsagte translasjonsprodukter med SCF-peptidsekvensinformasjon.

Ved de første PCR-forsøk ble det brukt blandede oligonukleotider basert på SCF-proteinsekvens [Gould,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86, s. 1934-1938 (1989)]. Nedenunder er beskrivelser av PCR-amplifikasjonene som ble brukt for å oppnå DNA-sekvensinformasjon for rotte-cDNA som koder for aminosyrene -25 til 162.

Med PCR 90.6 ble BRL-cDNA amplifisert med 4 pmol hver av 222-11 og 223-6 i et reaksjonsvolum på 20 ul. En aliquot av produktet av PCR 90.6 ble elektroforesebehandlet på en agarosegel, og et bånd med ca. den forventede størrelse ble observert. 1 ul av PCR 90.6-produktet ble amplifisert ytterligere med 20 pmol hver av primerne 222-11 og 223-6 i 50 ul for 15 sykluser, annealing ved 45°C. En del av dette produktet ble så underkastet 25 amplifikasjonssykluser i nærvær av primerne 222-11 og 219-25 (PCR 96.2), noe som ga et enkelt hovedproduktbånd etter agarosegelelektroforese. Asymmetrisk amplifikasjon av produktet fra PCR 96.2 med de samme to primerne ga et templat som ble vellykket sekvensert. Ytterligere selektiv amplifikasjon av SCF-sekvenser i produktet til 96.2 ble utført ved PCR-amplifikasjon av produktet i nærvær av 222-11 og nestet primer 219-21. Produktet av denne PCR ble brukt som et templat for asymmetrisk amplifikasjon og fremstilling av radioaktivt merket probe (PCR2).

For å isolere 5'-enden til rotte-SCF-cDNA ble det benyttet primere inneholdende (dC)n~sekvenser som er komple-mentære til poly(dG)-haler i cDNA, som ikke-spesifikke primere. PCR 90.3 inneholdt (dC)12(10 pmol) og 223-6

(4 pmol) som primere, og BRL-cDNA som templat. Reaksjons-produktet virket som et aggregat med svært høy molekylvekt og forble nært påfyllingsbrønnen ved agarosegelelektroforese. 1 ul av produktoppløsningen ble amplifisert videre i nærvær av 25 pmol (dC)12og 10 pmol 223-6 i et volum på 25 ul i 15 sykluser, annealing ved 45 C. 1/2 pl av dette produkt ble så amplifisert for 25 sykluser med internt nestet primer 219-25 og 201-7 (PCR 96.6). Sekvensen til 201-7 er vist i figur 12C. Det ble ikke observert noen bånd ved hjelp av agarosegelelektroforese. Det ble utført ytterligere 25 PCR-sykluser, annealing ved 40°C, hvoretter ett fremtredende bånd ble observert. Southern-blotting ble utført, og et enkelt, fremtredende hybridiseringsbånd ble observert. Det ble utført ytterligere 20 PCR-sykluser (625.1), annealing ved 45°C, under anvendelse av 201-7 og nestet primer 224-27. Sekvensering ble utført etter asymmetrisk amplifikasjon ved hjelp av PCR, noe som ga sekvens som strakk seg etter den putative aminoende til den antatt signalpeptidkodende sekvens i pre-SCF. Denne sekvensen ble brukt for å utforme oligonukleotidprimer 227-29 inneholdende 5'-enden til det kodende område i rotte-SCF-cDNA-en. Likeledes ble 3'-DNA-sekvensenden til aminosyre 162 oppnådd ved sekvensering av PCR 90.4 (se figur 13.A).

B. Kloning av rotte- stamcellefaktor- genom- DNA

Prober laget fra PCR-amplifikasjon av cDNA som koder for rotte-SCF som beskrevet i avsnitt A ovenfor, ble brukt til å screene et bibliotek inneholdende rotte-genomsekvenser (erholdt fra CLONTECH Laboratories, Inc.; katalog nr. RL1022 j). Biblioteket ble konstruert1bakteriofag A.-vektoren EMBL-3 SP6/T7 under anvendelse av DNA erholdt fra en voksen Sprague-Dawley-rotte av hannkjønn. Slik biblioteket erkarakterisertav leverandøren, inneholder det

2,3 x 10 g uavhengige kloner med en gjennomsnittlig mnføy-elsesstørrelse på 16 kb.

PCR-er ble brukt til å frembringe<32>P-merkede prober brukt ved screening av genombiblioteket. Probe PCR1 (figur 13A) ble fremstilt1en reaksjonsblanding som inneholdt 16,7 pM<32>P[alfa]-dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, reaksjonsbuffer levert av Perkin Eimer Cetus, Taq-polymerase (Perkin Eimer Cetus) ved 0,05 enheter/ml, 0,5 pM 219-2 6, 0,05 pM 223-6 og 1 pl templat 90.1 inneholdende mål-setene for de to primerne. Probe PCR 2 ble laget under anvendelse av lignende reaksjonsbetmgelser, bortsett fra at primerne og templatet ble endret. Probe PCR 2 ble laget ved å bruke 0,5 pM 222-11, 0,05 pM 219-21 og 1 pl av et templat utvunnet fra PCR 96.2.

Omtrent 10 bakteriofager ble utplatet som beskrevet1Maniatis et al. [supra (1982)]. Plakkene ble overført til

"GeneScreen Plus"-filtere (22 cm x 22 cm, NEN/DuPont) som

ble denaturert, nøytralisert og tørket som beskrevet1en protokoll fra produsenten. To filteroverføringer ble ut-ført for hver plate.

Filtrene ble prehybridisert1IM NaCl, 1% SDS, 0,1% bovint serumalbumm, 0,1% ficoll, 0,1% polyvinylpyrrolidon (hybridisermgsoppløsning)1omtrent 16 timer ved 65°C og lagret ved -20°C. Filtrene ble overført til nylaget hybri-32

diseringsoppløsning inneholdende P-merket PCR 1-probe ved 1,2 x 10 5 cpm/ml og hybridisert114 timer ved 65 oC. Filtrene ble vasket10,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,1%

SDS, pH 7,2 (vaskeoppløsning)12 timer ved værelsetempera-<*>tur etterfulgt av en andre vasking1ubrukt vaskeoppløs-ning130 minutter ved 65°C. Bakteriofagkloner fra områdene til platene svarende til radioaktive flekker på autoradio grammer, ble fjernet fra platene og på nytt screenet med probene PCR1 og PCR2.

DNA fra positive kloner ble oppløst med restriksjonsendonukleasene BamHI, SphI eller Sstl, og de resulterende fragmenter ble subklonet mn i pUCH9 og deretter sekvensert. Sekvensermgsstrategien for rottegenom-SCF-DNA-en er vist skjematisk i figur 14A. I denne figuren representerer lmjetegningen på toppen området for rottegenom-DNA-kodende SCF. Åpningene i linjen indikerer områder som ikke er blitt sekvensert. De store boksene representerer eksoner for kodende områder i SCF-genet med de tilsvarende utkodede aminosyrer angitt over hver boks. Pilene representerer de enkelte områder som ble sekvensert og brukt til å sette sammen konsensussekvensen for rotte-SCF-genet. Sekvensen for rotte-SCF-genet er vist i figur 14B.

Ved å bruke PCR 1-probe for å screene rottegenom-biblioteket ble kloner svarende til eksoner som koder for aminosyrene 19-176 i SCF isolert. For å oppnå kloner for eksoner oppstrøms for det kodende område for aminosyre 19

ble biblioteket screenet ved å bruke oligonukleotidprobe 228-30. Det samme sett av filtere som tidligere brukt med probe PCR 1, ble forhybridisert som før og hybridisert i hybridiseringsoppløsning inneholdende<32>P-merket oligonukleotid 228-30 (0,03 pikomol/ml) ved 50°C i 16 timer. Filtrene ble vasket i vaskeoppløsnmg ved værelsetemperatur i 30 minutter etterfulgt av en andre vasking i nyfremstilt vaske-oppløsnmg ved 4 5°C i 15 minutter. Bakteriofagkloner fra områdene i platene svarende til radioaktive flekker på autoradiogrammer, ble fjernet fra platene og på nytt screenet med probe 228-30. DNA fra positive kloner ble oppløst med restriksjonsendonukleaser og subklonet som før. Ved å bruke probe 228-30 ble kloner svarende til eksonet som koder for aminosyrene -20 til 18, erholdt.

Flere forsøk ble gjort på å isolere kloner svarende til eksonet eller eksonene som inneholder det 5'-utranslaterte område og det kodende område for aminosyrene

-25 til -21. Ingen kloner for dette område i rotte-SCF-

genet er blitt isolert.

C. Kloning av rotte- cDNA for ekspresjon i pattedyrceller

Pattedyrcelleekspresjonssystemer ble planlagt for

å bekrefte hvorvidt et aktivt polypeptidprodukt av rotte-

SCF kunne uttrykkes i og utskilles av pattedyrceller. Eks-presjonssystemer ble utformet for å uttrykke avkortede versjoner av rotte-SCF (SCF<1-162>og SCF1-164) og et protein (SCF<1-193>) forutsagt fra translasjonen av gensekvensen i figur 14C.

Ekspresjonsvektoren som ble brukt i disse undersøk-elsene, var en fergevektor inneholdende pUC119-, SV40- og HTLVI-sekvenser. Vektoren ble utformet for å muliggjøre autonom replikasjon i både E. coli- og pattedyrceller, og for å uttrykke innføyd, eksogen DNA under kontroll av virus-DNA-sekvenser. Denne vektoren, betegnet V19.8, inneholdt i E. coli DH5, er deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. (ATCC nr. 68124). Denne vektoren er et derivat av pSVDM19 beskrevet i US patentskrift nr. 4 810 643.

1—16 2

cDNA for rotte-SCF ble innføyd i plasmidvektor V19.8. cDNA-sekvensen er vist i figur 14C. cDNA-en som ble brukt i denne konstruksjonen, ble syntetisert i PCR-reaksjonene 630.1 og 630.2 som vist i figur 13A. Disse PCR-ene representerer uavhengige amplifikasjoner og utnyttet syntetiske oligonukleotidprimere 227-29 og 227-30. Sekvensen for disse primerne ble erholdt fra PCR-generert cDNA som beskrevet i avsnitt A i dette eksemplet. Reaksjonsblandingene, 50 ul i volum, besto av lx reaksjonsbuffer

(fra et sett fra Perkin Eimer Cetus), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 pM dGTP og 250 pM dTTP, 200 ng oligo(dT)-primet cDNA, 1 pikomol 227-29, 1 pikomol 227-30 og 2,5 enheter Taq-polymerase (Perkin Eimer Cetus). cDNA-en ble amplifisert for 10 sykluser under anvendelse av en denatureringstemperatur på 94°C i 1 minutt, en annealing-temperatur på 37°C i 2 minutter og en forlengelsestemperatur på 72°C i 1 minutt. Etter disse innledende runder med PCR-amplifika-

sjon ble 10 pikomol 227-29 og 10 pikomol 227-30 tilsatt til hver reaksjonsblanding. Amplifikasjoner ble fortsatt i 30 sykluser under de samme betingelser med unntak av at annealing-temperaturen ble endret til 55°C. Produktene fra PCR ble oppløst med restriksjonsendonukleasene Hindlll og Sstll. V19.8 ble oppløst på lignende måte med Hindlll og Sstll, og i ett tilfelle ble den oppløste plasmidvektor behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm; i andre tilfeller ble det store fragment fra oppløsningen isolert fra en agarosegel. cDNA-en ble ligert til V19.8 under anvendelse av T4-polynukleotidligase. Ligermgsproduktene ble transformert mn i kompetent E. coli stamme DH5 som beskrevet [Okayama et al., supra (1987)]. DNA fremstilt fra individuelle bakteriekloner, ble sekvensert ved hjelp av Sanger-dideoxymetoden. Figur 17 viser en konstruksjon av V19.8

SCF. Disse plasmidene ble brukt til å transfisere pattedyrceller som beskrevet i eksempel 4 og eksempel 5.

Ekspresjonsvektoren for rotte-SCF1 ble konstruert ved å bruke en lignende strategi med den som ble brukt

1—16 2

for SCF hvor cDNA ble syntetisert under anvendelse av PCR-amplifikasjon og deretter innføyd i V19.8. Den cDNA som ble brukt ved konstruksjonene, ble syntetisert i PCR-ampli-1—16 2

fikasjoner med V19.8 inneholdende SCF cDNA (V19.8:SCF<1-162>) som templat, 227-29 som primeren for 5'-enden i genet og 237-19 som primeren for 3'-enden i genet. Reaksjonsblandinger (50 pl) in duplo inneholdt lx reaksjonsbuffer, 250 pM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 2,5 enheter

1 — 16 2

Taq-polymerase, 20 ng V19.8:SCF og 20 pikomol av hver primer. cDNA-en ble amplifisert for 35 sykluser under anvendelse av en denaturermgstemperatur på 94°C i 1 minutt,

en annealmgtemperatur på 55°C i 2 minutter og en forlengelsestemperatur på 72°C i 2 minutter.Produktene fra amplifikasjonene ble oppløst med restriksjonsendonukleasene Hindlll og Sstll og innføyd i V19.8. Den resulterende vektor inneholder det kodende område for aminosyrene -25 til 164 i SCF etterfulgt av et termmeringskodon.

cDNA-en for en 193 ammosyreform av rotte-SCF,

(rotte-SCF<1-193>utledes fra translasjonen

av DNA-sekvensen i figur 14C) ble også innføyd i plasmidvektor V19.8 under anvendelse av en lignende fremgangsmåte

1 — 1 fi ?

som den som ble brukt for rotte-SCF . cDNA-en som ble brukt ved denne konstruksjonen, ble syntetisert i PCR-reaksjonene 84.1 og 84.2 (figur 13A) under benyttelse av oligonukleotidene 227-29 og 230-25. De to reaksjonene representerer uavhengige amplifikasjoner som starter fra forskjellige RNA-preparater. Sekvensen for 227-29 ble erholdt via PCR-reaksjoner som beskrevet i avsnitt A i dette eksemplet, og sekvensen for primer 230-25 ble erholdt fra rottegenom-DNA (figur 14B). Reaksjonsblandingene, 50 pl i volum, besto av lx reaksjonsbuffer (fra et sett fra Perkin Eimer Cetus),

250 pM dATP, 250 pM dCTP, 250 pM dGTP og 250 pM dTTP, 200 ng oligo(dT)-primet cDNA, 10 pikomol 227-29, 10 pikomol 230-25 og 2,5 enheter Taq-polymerase (Perkin Eimer Cetus). cDNA-

en ble amplifisert i 5 sykluser under anvendelse av en denatureringstemperatur på 94°C i 1 1/2 minutt, en annealing-temperatur på 50°C i 2 minutter og en forlengelsestemperatur på 72°C i 2 minutter. Etter disse innledende runder ble amplifikasjonene fortsatt i 35 sykluser under de samme betingelser med unntak av at annealingtemperaturen ble endret til 60°C. Produktene fra PCR-amplifikasjonen ble oppløst med restriksjonsendonukleasene Hindlll og Sstll. V19.8-DNA ble oppløst med Hindlll og Sstll, og det store fragment fra oppløsningen ble isolert fra en agarosegel. cDNA-en ble ligert til V19.8 under anvendelse av T4-polynukleotidligase. Ligeringsproduktene ble transformert inn i kompetent E. coli stamme DH5, og DNA fremstilt fra individuelle bakteriekloner, ble sekvensert. Disse plasmidene ble brukt til å transfisere pattedyrceller i eksempel 4.

D. Amplifikasjon og sekvensering av human- SCF- cDNA- PCR-produkter

Human-SCF-cDNA-en ble erholdt fra en hepatomcelle-linje HepG2 (ATCC HB 8065) under anvendelse av PCR-amplifikasjon som skissert i figur 13B. Den grunnleggende strategi var å amplifisere human-cDNA ved hjelp av PCR med primere hvis sekvens ble erholdt fra rotte-SCF-cDNA.

RNA ble fremstilt som beskrevet av Maniatis et al.

[supra (1982)]. PolyA+-RNA ble fremstilt ved å bruke oligo-dT-cellulose idet produsentens retningslinjer ble fulgt (Collaborative Research Inc.).

Førstetråds-cDNA ble fremstilt som beskrevet ovenfor for BRL-cDNA, bortsett fra at syntese ble primet med 2 uM oligonukleotid 228-28 vist i figur 12C, som inneholder en kort, vilkårlig sekvens i 3'-enden festet til en lengre, unik sekvens. Den unike sekvensdel i 228-28 gir et målsete for amplifikasjon ved hjelp av PCR med primer 228-29 som ikke-spesifikk primer. Human-cDNA-sekvenser relatert til i det minste en del av rotte-SCF-sekvensen ble amplifisert fra HepG2-cDNA ved hjelp av PCRunder anvendelse av primerne 227-29 og 228-29 (PCR 22.7, se figur 13B; 15 sykluser annealing ved 60°C etterfulgt av 15 sykluser annealing ved 55°C). Agarosegelelektroforese avslørte ingen klare bånd, bare en blanding av DNA med tilsynelatende heterogen størr-else. Ytterligere foretrukket amplifikasjon av sekvenser som er nært beslektet med rotte-SCF-cDNA, ble forsøkt ved å utføre PCR med 1 ul av PCR 22.7-produktet under anvendelse av internt nestet rotte-SCF-primer 222-11 og primer 228-29 (PCR 24.3; 20 sykluser annealing ved 55°C). Igjen ble det bare observert en heterogen blanding av DNA-produkt på agarosegeler. Dobbeltsidig, spesifikk amplifikasjon av PCR 24.3-produktene med primerne 222-11 og 227-30 (PCR 25.10; 20 sykluser) ga opphav til et enkelt hovedproduktbånd av den samme størrelse som for det tilsvarende rotte-SCF-cDNA-PCR-produkt. Sekvensering av et asymmetrisk PCR-produkt (PCR 33.1)-DNA under anvendelse av 224-24 som sekvensenngs-primer, ga ca. 70 baser av human-SCF-sekvenser.

Amplifikasjon av 1 ul av produktet fra PCR 22.7, først med primerne 224-25 og 228-29 (PCR 24.7, 20 sykluser), så med primerne 224-25 og 227-30 (PCR 41.11), genererte likeledes ett hovedbånd av den samme størrelse som det tilsvarende rotte-SCF-produkt og ga etter asymmetrisk amplifi kasjon (PCR 42.3) en sekvens som var svært homolog med rotte-SCF-sekvensen når 224-24 ble brukt som sekvenserings-primer. Oligodeoxynukleotider med unik sekvens målrettet mot den humane SCF-cDNA, ble syntetisert, og deres sekvenser er angitt i figur 12B.

For å oppnå den humane motpart til den rotte-SCF-PCR-genererte, kodende sekvens som ble brukt ved ekspresjons-og aktivitetsundersøkelser, ble enPCRmed primere 227-29 og 227-30 utført på 1 ul PCR 22.7-produkt i et reaksjonsvolum på 50 ul (PCR 39.1). Amplifikasjon ble utført i en "Coy Tempcycler". Ettersom graden av mismatching mellom den humane SCF-cDNA og rotte-SCF-unikprimeren 227-30 var ukjent, ble det brukt en lav annealingstringens (37°C) for de første tre syklusene; etterpå skjedde annealing ved 55°C. Et fremtredende bånd med den samme størrelse (ca. 590 bp) som rotte-homologen, kom til syne og ble ytterligere amplifisert ved fortynning av en liten del av PCR 39.1-produktet og PCR med de samme primerne (PCR 41.1). Ettersom det ble observert mer enn ett bånd i produktene fra PCR 41.1, ble det utført ytterligere PCR med nestede, interne primere for å bestemme minst en del av dens sekvens før kloning. Etter 23 PCR-sykluser med primerne 231-27 og 227-29 (PCR 51.2) kom det til syne et enkelt, sterkt bånd. Asymmetriske PCR-er med primerne 227-29 og 231-27 og sekvensering bekreftet tilstedeværelsen av human-SCF-cDNA-sekvensene. Kloning av PCR 41.1-SCF-DNA i ekspresjonsvektoren V19.8 ble utført som allerede beskrevet for rotte-SCF-l-162-PCR-fragmentene i avsnitt C ovenfor. DNA fra individuelle bakteriekloner ble sekvensert ved hjelp av Sanger-dideoxymetoden.

E. Kloning av human- stamcellefaktor- genom- DNA

En PCR7-probe laget fra PCR-amplifikasjon av cDNA, se figur 13B, ble brukt for å screene et bibliotek inneholdende humangenomsekvenser. En riboprobe som er komplementær til en del av human-SCF-cDNA, se nedenunder, ble brukt til å rescreene positive plakker. PCR 7-probe ble fremstilt ved å starte med produktet fra PCR 41.1 (se figur 13B). Prod uktet fra PCR 41.1 ble ytterligere amplifisert med primerne 227-29 og 227-30. Det resulterende 590 bp store fragment ble eluert fra en agarosegel og reamplifisert med de samme primerne (PCR 58.1). Produktet fra PCR 58.1 ble fortynnet 1000 ganger i en 50 ul reaksjonsblanding inneholdende 10 pmol 233-13 og amplifisert for 10 sykluser. Etter tilsetningen av 10 pmol 227-30 til reaksjonsblandingen ble PCR fortsatt i 20 sykluser. Ytterligere 80 pmol 233-13 ble tilsatt og reaksjonsvolumet økt til 90 ul, og PCR-en ble fortsatt i 15 sykluser. Reaksjonsproduktene ble fortynnet 200 ganger i en 50 ul reaksjonblanding, 20 pmol 231-27 og 20 pmol 233-13 ble tilsatt, og PCR ble utført i 35 sykluser under anvendelse av en annealingtemperatur på 48°C i reaksjon 96.1. For å fremstille 3 2P-merket PCR7 ble lignende reaksjonsbetmgelser som de som ble brukt for å lage PCRl, brukt med de følgende unntak: i et reaksjonsvolum på 50 ul ble PCR 96.1 fortynnet 100 ganger; 5 pmol 231-27 ble brukt som den eneste primer; og 45 sykluser med PCR ble utført med denaturering ved 94°C i 1 minutt, annealing ved 48°C i 2 minutter og forlengelse ved 72°C i 2 minutter.

32

Riboproben, riboprobe 1, var en P-merket,

éntrådet RNA som er komplementær til nukleotidene 2-436 i hSCF-DNA-sekvensen vist i figur 15B. For å konstruere vektoren for fremstillingen av denne probe ble PCR 41.1 (figur 13B) produkt-DNA oppløst med Hindlll og EcoRI og klonet inn i polylmkeren i plasmidvektoren pGEM3 (Promega, Madison, Wisconsin). Den rekombinante pGEM3:hSCF-plasmid-DNA ble så linearisert ved oppløsning med Hindlll.<32>P-merket riboprobe 1 ble fremstilt fra den lineariserte plasmid-DNA ved hjelp av utstrømningstranskripsjon med T7-RNA-polymerase ifølge instruksjonene gitt av Promega. Reaksjonsblandmgen

(3 ul) inneholdt 250 ng linearisert plasmid-DNA og 20 uM<32>P-rCTP (katalog nr. NEG-008H, New England Nuclear (NEN)) uten noe ytterligere, umerket CTP.

Humangenombiblioteket ble erholdt fra Stratagene

(La Jolla, CA; katalog nr.: 946203). Biblioteket ble konstruert i bakteriofag Lambda Fix II-vektoren under anvend-

else av DNA fremstilt fra en hannkjønnmorkake av hvit rase. Biblioteket, somkarakterisertav leverandøren, inneholdt

2 x 10^ primære plakker med en gjennomsnittlig mnføyelses-størrelse som er større enn 15 kb. Omtrent 10 bakteriofager ble platet ut som beskrevet i Maniatis et al. [supra

(1982)]. Plakkene ble overført til "Gene Screen Plus"-filtere (22 cm<2>; NEN/DuPont) i henhold til protokollen fra produsenten. To fllteroverføringer ble utført for hver plate. Filtrene ble forhybridisert i 6XSSC (0,9 M NaCl, 0. 09 M natriumcitrat, pH 7,5), 1% SDS ved 60°C. Filtrene ble hybridisert i frisk 6XSSC, 1% SDS-oppløsning mnehold-32 5 ende P-merketPCR 7-probe ved 2 x 10 cpm/ml og hybridisert i 20 timer ved 62°C. Filtrene ble vasket i 6XSSC, 1% SDS i 16 timer ved 62°C. En bakteriofagplugg ble fjernet fra et område av en plate som svarte til radioaktive flekker på autoradiogrammer og rescreenet med probe PCR 7 og riboprobe 1. Rescreeningen med PCR 7-probe ble utført ved å bruke lignende betingelser som de som ble brukt ved den innledende screening. Rescreeningen med riboprobe 1 ble utført på følgende måte: filtrene ble forhybridisert i 6XSSC, 1% SDS og hybridisert ved 62°C i 18 timer i 0,25 M NaP04, (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 0,001 M EDTA, 15% formamid, 7% SDS og riboprobe ved 1 x 10^ cpm/ml. Filtrene ble vasket i 6XSSC, 1% SDS i 30 minutter ved 62°C etterfulgt av 1XSSC, 1% SDS i 30 minutter ved 62°C. DNA fra positive kloner ble oppløst med restriksjonsendonukleasene Barn HI, SphI eller Sstl, og de resulterende fragmenter ble subklonet inn i pUC119 og deretter sekvensert.

Ved å bruke probe PCR 7 ble det erholdt en klon som omfattet eksoner som koder for aminosyrene 40 til 176, og denne klonen er deponert ved ATCC (deponeringsnr. 40681). For å oppnå kloner for ytterligere SCF-eksoner ble humangenombiblioteket screenet med riboprobe 2 og oligonukleotidprobe 235-29. Biblioteket ble screenet på en måte som er lik med den som ble gjort tidligere, med de følgende unntak: hybridiseringen med probe 235-29 ble gjort ved 37°C, og vaskingene for denne hybridiseringen skjedde i 1 time ved 37°C og i 1 time ved 44°C. Positive kloner ble screenet på nytt med riboprobe 2, riboprobe 3 og oligonukleotidprobene 235-29 og 236-31. Riboprobene 2 og 3 ble laget ved å bruke en lignende fremgangsmåte som den som ble brukt for å fremstille riboprobe 1, med de følgende unntak: (a) den rekombinante pGEM3:hSCF-plasmid-DNA ble linearisert med restriksjonsendonuklease PvuII (riboprobe 2) eller Pstl (riboprobe 3), og (b) SP6 RNA-polymerasen (Promega) ble brukt for å syntetisere riboprobe 3.

Figur 15A viser strategien som ble brukt for å sekvensere humangenom-DNA. I denne figuren representerer lmjetegningen øverst området til humangenom-DNA som koder for SCF. Åpningene i denne linjen indikerer områder som ikke er blitt sekvensert. De store boksene representerer eksoner for kodende områder i SCF-genet med de tilsvarende utkodede aminosyrer angitt over hver boks. Sekvensen til human-SCF-genet er vist i figur 15B. Sekvensen til human-SCF-cDNA erholdt ved PCR-teknikker, er vist i figur 15C.

F. Sekvens til human- SCF- cDNA 5'- området

Sekvensering av produkter fra PCR-er primet ved hjelp av to genspesifikke primere, avslører sekvensen til området bundet ved hjelp av 3'-endene i de to primerne. Én-sidige PCR-er, som angitt i eksempel 3A, kan gi sekvensen til flankerende områder. Énsidig PCR ble brukt for å utvide sekvensen til det 5'-utranslaterte område til human-SCF-cDNA.

Førstetråds-cDNA ble fremstilt fra poly A+-RNA fra humanurinblære-carcinomcellelmjen 5637 (ATCC HTB 9) under anvendelse av oligonukleotid 228-28 (figur 12C) som primer, som beskrevet i eksempel 3D. Festing av dG-rester til denne cDNA, etterfulgt av énsidig PCR-amplifikasjon under anvendelse av primere inneholdende (dC)^-sekvenser i kombinasjon med SCF-spesifikke primere, ga ikke cDNA-fragmenter som strekker seg oppstrøms (5<1>) for den kjente sekvens.

En liten mengde sekvensmformasjon ble oppnådd fra PCR-amplifikasjon av produkter av andretråds-syntese primet ved hjelp av oligonukleotid 228-28. Den 5637 førstetråds-cDNA uten påfestede ender beskrevet ovenfor (ca. 50 ng) og 2 pmol av 228-28 ble inkubert med Klenow-polymerase og 0,5 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP ved 10-12°C i 30 minutter i 10 pl lx"Nick"-translasjonsbuffer [Maniatis et al., MolecularCloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Amplifikasjon av den resulterende cDNA ved hjelp av sekvensvise, ensidige PCR-er med primer 228-29

i kombinasjon med nestede SCF-primere (i bruksrekkefølge: 235-30, 233-14, 236-31 og endelig 235-29) ga kompleksprodukt-blandinger som fremkom som flekker på agarosegeler. Signifikant anrikning av SCF-relaterte cDNA-fragmenter ble indikert ved hjelp av den økende styrke til det spesifikke produktbånd observert når sammenlignbare volumer av de suk-sessive, énsidige PCR-produkter ble amplifisert med to SCF-primere (f.eks. 227-29 og 235-29 som ga et produkt med ca. 150 bp). Forsøk på å selektere med hensyn på et bestemt størrelsesområde for produkter ved å stanse ut deler av agarosegelflekkene og reamplifisere ved hjelp av PCR ga i de fleste tilfeller ikke et veldefinert bånd som inneholdt SCF-relaterte sekvenser.

Én reaksjonsblanding, PCR 16.17, som inneholdt bare 235-29-primeren, ga opphav til et bånd som tilsynelatende fremkom fra priming ved hjelp av 235-29 på et ukjent sted 5' i det kodende område i tillegg til det forventede sted, som vist ved kartlegging med restriksjonsenzymene PvuII og Psti, og PCR-analyse med nestede primere. Dette produktet ble gelrenset og reamplifisert med primer 235-29, og det ble gjort forsøk på sekvensering ved hjelp av Sanger-dideoxy-

32

metoden under anvendelse av P-merket primer 228-30. Den resulterende sekvens var grunnlaget for utformingen av oligonukleotid 254-9 (figur 12B). Når denne 3<*->rettede primer ble brukt i påfølgende PCR-er i kombinasjon med 5'-rettede SCF-primere, ble det erholdt bånd med den forventede størr-else. Direkte Sanger-sekvensering av slike PCR-produkter ga nukleotidene 180-204 av en human-SCF-cDNA-sekvens,

figur 15C.

For å oppnå mer sekvens i 5'-enden til hSCF-cDNA-en ble førstetråds-cDNA fremstilt fra 5637-poly A<+->RNA (ca.

300 ng) under anvendelse av en SCF-spesifikk primer (2 pmol av 233-14) i en 16 pl reaksjonsblandmg inneholdende 0,2 U MMLV reverstranskriptase (levert av BRL) og 500 pM av hver dNTP. Etter standardtrinn med fenol-kloroform- og kloroform-ekstraksjoner og ethanolutfelling (fra 1 M ammoniumacetat) ble nukleinsyrene på nytt oppslemmet i 20 pl vann, plassert i et kokende vannbad i 5 minutter, så avkjølt og ender til-føyet med endetransferase i nærvær av 8 pM dATP i en CoC^-holdig buffer [Deng og Wu, Methods in Enzymology, 100,

s. 96-103]. Produktet, (dA)n~tilføyet førstetråds-cDNA, ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon og ethanolutfelling, og på nytt oppslemmet i 20 pl 10 mM tris, pH 8,0, og 1 mM EDTA.

Anrikning og amplifikasjon av human-SCF-relaterte cDNA-5'-endefragmenter fra ca. 20 ng av den (dA)n~tilføyde 5637 cDNA ble utført på følgende måte: 26 innledende sykluser med ensidig PCR ble utført i nærvær av SCF-spesifikk primer 236-31 og en primer eller primerblandmg inneholdende (dT)n~sekvenser i eller nær 3'-enden, f.eks. primer 221-12 eller en blanding av primerne 220-3, 220-7 og 220-11 (figur 12C). Produktene (1 pl) av disse PCR-er ble så amplifisert i et andre sett av PCR-er inneholdende primerne 221-12 og 235-29. Et hovedproduktbånd på omtrent 370 bp ble observert i hvert tilfelle etter agarosegelanalyse. En gelplugg inneholdende en del av dette båndet, ble stanset ut av gelen med spissen på en Pasteur-pipette og overført til et lite mikrosentri-fugerør. 10 pl vann ble tilsatt, og pluggen ble smeltet i en 84°C varmeblokk. EnPCR inneholdende primerne 221-12 og 235-29 (8 pmol av hver) i 40 pl, ble inokulert med 2 pl av den smeltede, fortynnede gelplugg. Etter 15 sykluser var et svakt diffust bånd med omtrent 370 bp synlig etter agarosegelanalyse. Asymmetriske PCR-er ble utført for å frembringe topp- og bunntrådssekvenseringstemplater: for hver reaksjon ble 4 pl PCR-reaksjonsprodukt og 40 pmol av enten primer 221-12 eller primer 235-29 i et samlet reak sjonsvolum på 100 pl underkastet 25 sykluser med PCR (1 minutt, 95°C; 30 sekunder, 55°C; 40 sekunder, 72°C). Direkte sekvensering av de 221-12-primede PCR-produktblandinger

32 (etter standardekstraksjonene og ethanolutfelling) med P-merket primer 262-13 (figur 12B) ga 5'-sekvensen fra nukleo-tid 1 til 179 (figur 15C).

G. Amplifikasjon og sekvensering av humangenom- DNA i

stedet til det første kodende ekson for stamcellefaktoren

Screening av et humangenombibliotek med SCF-oligonukleotidprober avslørte ikke noen kloner som inneholdt den kjente del av det første kodende ekson. Forsøk ble så gjort på å bruke en énsidig PCR-teknikk for å amplifisere og klone genomsekvenser som omgir dette eksonet.

Primerforlengelse av varmedenaturert, human placenta-DNA (levert fra Sigma) ble utført med DNA-polymerase I (Klenow-enzym, stort fragment;Boehringer-Mannheim) under anvendelse av en non-SCF-primer, slik som 228-28 eller 221-11, under ikke-stringente (lav temperatur) betingelser, slik som 12°C, for å favorisere priming ved et svært stort antall forskjellige steder. Hver reaksjonsblandmg ble så fortynnet fem ganger i Taql-DNA-polymerasebuffer inneholdende Taql-polymerase og 100 uM av hver dNTP, og forlengelse av DNA-tråder fikk forløpe ved 72°C i 10minutter. Produktet ble så anriket med hensyn på stamcellefaktor-første eksonsekvenser ved hjelp av PCR i nærvær av et SCF-første ekson-oligonukleotid (slik som 254-9) og den passende non-SCF-primer (228-29 eller 221-11).Agarosegelelektroforese av-slørte at mesteparten av produktene var korte (mindre enn 300 bp). For å anrike med hensyn på lengre arter ble delen av hvert agarosegelfelt som svarer til lengde større enn 300 bp, kuttet ut og fortynnet elektroforetisk. Etter ethanolutfellmg og resuspensjon i vann ble de gelrensede PCR-produkter klonet mn i et derivat av pGEM4 inneholdende et Sfil-sete som et HmdIII-til-Sfil-fragment.

32

Kolonier ble screenet med et P-merket SCF-første ekson-oligonukleotid. Flere positive kolonier ble identi fisert, og sekvensene til innføyelsene ble erholdt ved hjelp av Sanger-metoden. Den resulterende sekvens som strekker seg nedstrøms fra det første ekson gjennom et konsensus-ekson-mtron-renseområde mn i nabomtronet, er vist i figur 15B.

H. Amplifikasjon og sekvensering av SCF- cDNA- kodende

områder fra mus, ape og hund

Førstetråds-cDNA ble fremstilt fra total RNA eller poly A -f-RNA fra apelever (levert fra Clontech) og fra cellelinjene NIH-3T3 (mus, ATCC CRL 1658) og D17 (hund, ATCC CCL 183). Primeren som ble brukt ved førstetråds-cDNA-syntese, var enten den ikke-spesifikke primer 228-28 eller en SCF-primer (227-30, 237-19, 237-20, 230-25 eller 241-6). PCR-amplifikasjon med primer 227-29 og én av primerne 227-30, 237-19 og 237-20 ga et fragment med den forventede størrelse som ble sekvensert enten direkte eller etter kloning mn i V19.8 eller en pGEM-vektor.

Ytterligere sekvenser nær 5'-enden i SCF-cDNA-ene ble oppnådd fra PCR-amplifikasjoner under benyttelse av en SCF-spesifikk primer i kombinasjon med enten 254-9 eller 228-29. Ytterligere sekvenser i 3'-enden til de SCF-kodende områder ble oppnådd etter PCR-amplifikasjon av 230-25-

primet cDNA (i tilfellet med mus) eller 241-6-primet cDNA

(i tilfellet med ape) med enten 230-25 eller 241-6, alt ettersom, og en 3'-rettet SCF-primer. Det ble ikke oppnådd noen SCF-PCR-produktbånd i lignende forsøk på å amplifisere D17-cDNA. Den ikke-spesifikke primer 228-28 ble brukt til

å prime førstetråds-syntese fra D17 total-RNA, og den resulterende, komplekse produktblandmg ble anriket med hensyn på SCF-relaterte sekvenser ved hjelp av PCR med 3'-rettede SCF-primere, slik som 227-29 eller 225-31 i kombinasjon med 228-29. Produktblandingen ble kuttet med Sfil og klonet inn i et derivat av pGEM4 (Promega, Madison, Wisconsin) inneholdende et Sfil-sete som et Sfil-til-buttende-fragment. Det resulterende, heterogene bibliotek ble screenet med radioaktivt merket 237-20, og flere positive kloner ble sekvensert, noe som ga hund-SCF-3'-endesekvenser.

De sammenstilte aminosyresekvenser for menneske- (figur 42) , ape-, hund-, mus- og rotte-SCF fullstendige proteiner er vist i figur 16.

De kjente SCF-aminosyresekvenser er svært homologe gjennom mye av lengden sin. Identiske konsensussignalpeptid-sekvenser er til stede i de kodende områdene til alle fem arter. Den aminosyre som var forventet å være i aminoenden til det fullstendige protein i analogi med rotte-SCF, er betegnet med tallet 1 i denne figuren. Hund-cDNA-sekvensen inneholder en flertydighet som resulterer i en valin/leucin-flertydighet i aminosyresekvensen i kodon 129. Menneske-, ape-, rotte- og mus-aminosyresekvensene er sammenfallende uten noen innføyelser eller delesjoner. Hundesekvensen har en enkel ekstra rest i stilling 130 sammenlignet med de andre artene. Menneske og ape adskiller seg bare i én stilling,

en konservativ erstatning av valin (menneske) med alanin (ape) i stilling 130. Den forutsagte SCF-sekvens umiddelbart før og etter det antatte bearbeidelsessete nær rest 164 er sterkt konservert mellom artene.

Eksempel 4

Ekspresjon av rekombinant rotte- SCF i COS- l- celler

For kortvarig ekspresjon i COS-l-celler (ATCC CRL 1650), ble vektor V19.8 (eksempel 3C) inneholdende rotte-SCF1"162- og SCF<1->19<3->genene transfisert inn i 60 mm plater

in duplo [Wigler et al., Cell, 14, s. 725-731 (1978)]. Plasmid-Vl9.8-SCF er vist i figur 17. Som en kontroll ble også vektoren uten innføyelse transfisert. Vevkultur-supernatanter ble mnhøstet ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon og analysert med hensyn på biologisk aktivitet. Tabell 4 oppsummerer HPP-CFC-bioanalyseresul-tåtene, og tabell 5 oppsummerer MC/9-<3>H-thymidin-opptak-datene fra typiske transfeksjonsforsøk. Bioanalyseresul-tater av supernatanter fra COS-l-celler transfisert med de følgende plasmider, er vist i tabellene 4 og 5: en C-ende-avkortet form av rotte-SCF med C-enden i aminosyrestilling 162 (V19.8-rotte-SCF<1->162),SCF<1-162>inneholdende en glutamin-syre i stilling 81 [V19.8 rotte-SCF<1-162>(Glu81)] og

SCF<1-162>inneholdende et alanin i stilling 19 [V19.8 rotte-1—162

SCF (Alal9)]. Aminosyresubstitusjonene var produktet

av PCR-reaksjoner utført ved amplifikasjonen av rotte-SCF 1—162 som angitt i eksempel 3. Enkeltstående kloner av

1—16 2

V19.8-rotte-SCF ble sekvensert, og to kloner ble funnet

å ha aminosyresubstitusjoner. Som det kan ses i tabellene 4 og 5, er den rekombinante rotte-SCF aktiv i de biologiske analysene brukt til å rense naturlig pattedyr-SCF i eksempel 1.

Rekombinant rotte-SCF og andre faktorer ble testet individuelt i en human-CFU-GM [Broxmeyer et al., supra

(1977)]-analyse som måler proliferasjonen av normale benmarg-celler, og dataene er vist i tabell 6.Resultater for C0S-1-supernatanter fra kulturene 4 dager etter transfeksjon med V19.8 SCF 1—"~ 16 2 i kombinasjon med andre faktorer er også vist i tabell 6. Koloniantallene er gjennomsnittet av kulturer in triplo. Den rekombmante rotte-SCF har først og fremst en synergistisk aktivitet på normal menneskebenmarg i CFU-GM-analysen. I forsøket i tabell 6 synergiserte SCF med human-GM-CSF, human-IL-3 og human-CSF-1. I andre analyser ble synergi observert også med G-CSF. Det var noe proliferasjon av humanbenmarg etter 14 dager med rotte-SCF; sammenklump- ningene var imidlertid sammensatt av <40 celler. Lignende resultater ble oppnådd med naturlig pattedyrutvunnet SCF.

Eksempel 5

Ekspresjon av rekombinant SCF i ovarieceller fra kinesisk hamster

Dette eksemplet vedrører et stabilt pattedyr-ekspresjonssystem for utskillelse av SCF fra CHO-celler (ATCC CCL 61 selektert med hensyn på DHFR~).

A. Rekombinant rotte- SCF

Ekspresjonsvektoren anvendt for SCF-produksjon, var

V19.8 (figur 17). Den selekterbare markør som ble brukt for å etablere stabile transformanter, var genet for dihydro-folatreduktase i plasmidet pDSVE.l. Plasmid pDSVE.1 (figur 18) er et derivat av pDSVE konstruert ved oppløsning av pDSVE ved hjelp av restriksjonsenzymet Sali og ligering til et oligonukleotidfragment bestående av de to oligonukleotidene

Vektor pDSVE er beskrevet i søkerens egne US patent-søknader nr. 25 344 og 152 045. Vektordelen av V19.8 og pDSVE.l inneholder lange strekninger med homologi som omfatter et bakterielt ColEl-opprinnelsessted for replikasjon og ampicillinresistensgen, og SV40-opprinnelsesstedet for replikasjon. Denne overlappingen kan bidra til homolog rekombina-sjon under transformasjonsprosessen og derved lette kotrans-formasjon.

Kalsiumfosfat-koutfellinger av V19.8-SCF-konstruk-sjoner og pDSVE.l ble gjort i nærvær eller fravær av 10 ug bærer-mus-DNA under anvendelse av 1,0 eller 0,1 ug pDSVE.l som var blitt linearisert med restriksjonsendonucleasen Pvul og 10 ug V19.8-SCF som beskrevet [Wigler et al., supra

(1978)]. Kolonier ble selektert basert på ekspresjon av DHFR-genet fra pDSVE.l. Kolonier med evne til vekst i fravær av tilsatt hypoxanthin og thymidm ble plukket ut under anvendelse av kloningssylindere og ekspanderte som uavhengige cellelinjer. Cellesupernatanter fra individuelle cellelinjer ble testet i en MC/9-<3>H-thymidinopptakanalyse. Resultater fra et typisk forsøk er presentert i tabell 7.

B. Rekombinant human- SCF

Ekspresjon av SCF i CHO-celler ble også oppnådd ved å bruke ekspresjonsvektoren pDSVRa2 som er beskrevet i

søkerens US patentsøknad nr. 501 904 innlevert 29. mars 1990. Denne vektoren omfatter et gen for seleksjon og amplifikasjon av kloner basert på ekspresjon av DHFR-genet. Klonen pDSRa2-SCF ble frembrakt ved hjelp av en to-trinnsprosess. V19.8-SCF ble oppløst med restriksjonsenzymet BamHI, og SCF-mn-føyelsen ble ligert mn i BamHI-setet til pGEM3. DNA fra pGEM3-SCF ble oppløst med Hindlll og Sali og ligert inn i pDSRa2 oppløst med Hindlll og Sali. Den samme prosess ble gjentatt for humangener som koder for en COOH-ende i ammo-syrestillmgene 162, 164 og 183 i sekvensen vist i figur 15C og stilling 248 i sekvensene vist i figur 42. Etablerte cellelinjer ble utfordret med methotrexat [Shimke, i Methods in Enzymology, 151, s. 85-104 (1987)] ved 10 nM for å øke ekspresjonsnivåer for DHFR-genet og det tilgrensende SCF-gen. Ekspresjonsnivåer for rekombinant human-SCF ble analysert ved hjelp av radioimmunanalyse som i eksempel 7,

og/eller induksjon av kolonidannelse m vitro under anvendelse av leukocytter fra humant, perifert blod. Denne analyse utføres som beskrevet i eksempel 9 (tabell 12), bortsett fra at det brukes perifert blod istedenfor benmarg, og at inkubasjonen utføres ved 20% 02, 5% C02og 75% N2i nærvær av human-EPO (10 U/ml). Resultater fra typiske forsøk er vist i tabell 8. CHO-klonen som uttrykker human-SCF1-164, ble deponert 25. september 1990 ved ATCC (CRL 10557) og betegnet Hul64SCF17.

Eksempel 6

Ekspresjon av rekombinant SCF i E. coli

A. Rekombinant Rotte- SCF

Dette eksemplet vedrører ekspresjon i E. coli av SCF-polypeptider ved hjelp av en DNA-sekvens som koder for [Met"<1>]-rotte-SCF<1-193>(figur 14C). Selv om hvilken som helst egnet vektor kan anvendes for proteinekspresjon under anvendelse av denne DNA, var det valgte plasmid pCFMH56 (figur 19) . Dette plasmidet kan lett konstrueres fra pCFM 836 (se US patentskrift nr. 4 710 473) ved åødelegge de to endogene Ndel-restriksjonssetene ved endeutfyllmg med T4-polymerase-enzym etterfulgt av buttendeligering og utbytting av den lille DNA-sekvens mellom de unike Clal- og Kpnl-restriksjonssetene med det lille oligonukleotid vist nedenunder.

Kontroll av proteinekspresjon i pCFMll5 6-plasmidet skjer ved hjelp av en syntetisk lambda PTLi-promoter som selv er under kontroll av et temperaturfølsomt lambda Cl857-repressorgen [slik som er tilveiebrakt i E. coli-stammene FM5 (ATCC deponeringsnr. 53911) eller K12AHtrp]. pCFM1156-vektoren er slik konstruert at den har en DNA-sekvens som inneholder et optimalisert ribosombindmgssete og initieringskodon umiddelbart 3' fra den syntetiske PL-promoter. Et unikt Ndel-restriksjonssete som inneholder ATG-initieringskodonet, kommer foran en multirestriksjonssete-klonmgsgruppe etterfulgt av en lambda t-oop-transkripsjonsstoppsekvens.

Plasmid V19.8-SCF<1-193>som inneholder rotte-

1-193

SCF -genet klonet fra PCR-amplifisert cDNA (figur 14C) som beskrevet i eksempel 3, ble oppløst medBglll og Sstll, og et 603 bp stort DNA-fragment ble isolert. For å tilveiebringe et Met-initieringskodon og gjenopprette kodonene for de første tre aminosyrerestene (Gin, Glu og Ile) i rotte-SCF-polypeptidet, ble det laget en syntetisk oligonukleotid linker

med Ndel- og Bglll-"klebrige" ender. Det lille oligonukleotid

1-193

og rotte-SCF -genfragmentet ble innføyd ved ligermg i pCFMH56 i de unike Ndel- og Sstll-setene i plasmidet vist i figur 19. Produktet fra denne reaksjon er et ekspresjons-plasmid, pCFM1156-rotte-SCF<1->193.

pCFM1156-rotte-SCF<1-193->plasmidet ble transformert inn i kompetente FM5 E-coli vertceller. Seleksjon med hensyn på plasmidholdige celler skjedde på grunnlag av antibiotikum (kanamycm)-resistensmarkørgenet som bæres på pCFM1156-vektoren. Plasmid-DNA ble isolert fra dyrkede celler, og DNA-sekvensen i det syntetiske oligonukleotid og dets kobling til rotte-SCF-genet ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvenser-mg.

1—16 2 For å konstruere plasmidet pCFM1156-rotte-SCF som koder for [Met<1>]-rotte-SCF<1->162-polypeptidet, ble et EcoRI—til-Sstll-restriksjonsfragment isolert fra V19.8-1—162

rotte-SCF og innfø<y>d ved ligermg i plasmidet pCFM-1-193

rotte-SCF i de unike EcoRI- og Sstll-restriksjonssetene og erstattet derved det kodende område for carboxylendene i rotte-SCF-genet.

For å konstruere plasmidene pCFMH56-rotte-SCF<1-164>og pCFMll56-rotte-SCF<1-165>som koder for hhv. [Met"<1>]-rotte-SCF<1-164>og [Met"<1>]-rotte-SCF<1-165->polypeptidene, ble EcoRI-til-Sstll-restriksjonsfragmentene isolert fra PCR-amplifisert DNA som koder for 3'-enden i SCF-genet, og utformet for å innføre stedrettede endringer i DNA i området som koder for carboxylenden i SCF-genet. DNA-amplifikasjonene ble utført ved å bruke oligonukleotidprimerne 227-29 og 237-19 i konstruksjonen av pCFMll56-rotte-SCF<1-164>og 227-<2>9 og 237-20

i konstruksjonen av pCFMH56-rotte-SCF

B. Rekombinant human- SCF

Dette eksemplet vedrører ekspresjonen i E. coli av human-SCF-polypeptid ved hjelp av en DNA-sekvens som koder for [Met<-1>]-human-SCF<1-164>og [Met"<1>]-human-SCF<1>-183

(figur 15C). Plasmid V19.8-human-SCF<1-162>inneholdende 1—162

human-SCF -genet, ble brukt som templat for PCR-amplifikasjon av human-SCF-genet. Oligonukleotidprimerne 227-29 og 237-19 ble brukt for å frembringe PCR-DNA-en som så ble oppløst med Pstl- og Sstll-restriksjonsendonukleaser. For å tilveiebringe et Met-initieringskodon og gjenopprette kodonene for de første fire aminosyrerestene (Glu, Gly, Ile, Cys) i human-SCF-polypeptidet, ble det laget en syntetisk oligonukleotidlinker

med Ndel- og Pstl-"klebrige" ender. Den lille oligolmker og det PCR-utvundne human-SCF-genfragment ble innføyd ved ligermg i ekspresjonsplasmidet pCFMH56 (som beskrevet tidligere) i de unike Ndel- og Sstll-setene i plasmidet vist i figur 19. pCFMll56-human-SCF<1-164->plasmidet ble transformert inn i kompetente FM5 E. coli-vertceller. Seleksjon med hensyn på celler som inneholdt plasmid, skjedde på grunnlag av antibiotikum (kanamycin)-resistensmarkørgenet båret på pCFMH56-vektoren. Plasmid-DNA ble isolert fra dyrkede celler og DNA-sekvensen til human-SCF-genet bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering. 1 — 183 For å konstruere plasmidet pCFM1156-human-SCF som koder for [Met<-1>]-human-SCF<1-183>(figur 15C)-polypeptidet, ble et EcoRI-til-HindIII-restriksjonsfragment som koder for carboxylenden i human-SCF-genet, isolert fra pGEM-human-SCF<11>4-183(beskrevet nedenunder), et Sstl-til-EcoRI-restriksjonsfragment som koder for aminoenden i human-SCF-genet, ble isolert fra pCFM1156-human-SCF<1-164>, og det store HindIII-til-SstI-restriksjonsfragmentet fra pCFM1156 ble isolert. De tre DNA-fragmentene ble ligert sammen, hvorved 1—183 pCFM1156-human-SCF -plasmidet ble dannet, og dette ble så transformert mn i FM5 E. coli vertceller. Etter koloni-seleksjon under anvendelse av kanamycm-legemiddelresistens ble plasmid-DNA isolert, og den korrekte DNA-sekvens ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering. pGEM-human-SCF<114-183->plasmidet er et derivat av pGEM3 som inneholder et EcoRI-Sphl-fragment som omfatter nukleotidene 609 til 820 i human-SCF-cDNA-sekvensen vist i figur 15C. EcoRl-Sphl-innføyelsen i dette plasmidet ble isolert fra en PCR som anvendte oligonukleotidprimerne 235-31 og 241-6 (figur 12B) og PCR 22.7 (figur 13B) som templat. Sekvensen til primer 241-6 var basert på humangenomsekvensen til 3'-siden av eksonet som inneholder kodonet for aminosyre 176. C. Fermentering av E. coli- produserende human- SCF1 164 Fermenteringer for fremstillingen av SCF<1-164>ble utført i 16-liters fermentorer under anvendelse av en FM5 E. coli K12-vert inneholdende plasmidet pCFM 1156-human-SCF1-164. Forråd av den produserende kultur ble holdt ved -80°C i 17% glycerol i Luria-nærmgsvæske. For mokulum-produksjon ble 100 ul av det opptinte forråd overført til 500 ml Luria-næringsvæske i en 2-liters Erlenmeyerkolbe og dyrket over natten ved 30°C på en rotasjonsryster (250 rpm).

For fremstillingen av E. coli cellepasta brukt som startmateriale for rensingen av human-SCF1-1 4 skissert i dette eksempel, ble de følgende fermenteringsbetingelser brukt.

Inokulumkulturen ble overført aseptisk til en 16-liters fermentor inneholdende 8 liter satsmedium (se tabell 9). Kulturen ble dyrket satsvis inntil OD-600 til kulturen var omtrent 3,5. På dette tidspunkt ble en steril tilførsel (tilførsel 1, tabell 10) innført i fermentoren under anvendelse av en peristaltisk pumpe for å regulere til-setningshastigheten. Tilsetnmgshastigheten ble økt eks-ponensielt med tiden, hvorved man fikk en veksthastighet på

0,15 t<-1.>Temperaturen ble regulert til 30°C under vekst-fasen. Konsentrasjonen av oppløst oxygen i fermentoren ble

automatisk regulert til 50% metning under anvendelse av luftstrømningshastighet, omrøringshastighet, beholdermottrykk og oxygensupplering for kontroll. pH i fermentoren ble automatisk regulert til 7,0 under anvendelse av fosforsyre og ammoniumhydroxyd. Ved en 0D-6O0 på omtrent 30 ble fermen-teringens produksjonsfase indusert ved å øke fermentortempera-turen til 42°C. Samtidig ble tilsetningen av tilførsel 1 stanset, og tilsetningen av tilførsel 2 (tabell 11) ble startet ved en hastighet på 200 ml/time. Omtrent 6 timer etter at temperaturen i fermentoren var økt, ble fermentorinnholdet avkjølt til 15°C. Utbyttet av SCF<1-164>var omtrent 30 mg/OD-L. Cellepelleten ble så innhøstet ved sentrifugering i en "Beckman J6-B" sentrifuge ved 3000 x g i 1 time.

Den mnhøstede cellepasta ble lagret nedfryst ved -70°C.

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av SCF1 164 er lik<f>remgangsmåten beskrevet ovenfor, bortsett

fra de følgende modifikasjoner.

1) Tilsetningen av tilførsel 1 startes ikke før OD-600 i kulturen når 5-6. 2) Tilsetnmgshastigheten for tilførsel 1økes saktere, noe som resulterer i en lavere veksthastighet (omtrent 0,08).

3) Kulturen induseres ved OD-600 på 20.

4) Tilførsel 2 innføres i fermentoren ved en hastighet på 300 ml/time.

Alle andre operasjoner er lik fremgangsmåten beskrevet ovenfor, inkludert mediene.

Ved å bruke denne fremgangsmåten er det blitt oppnådd utbytter av SCF<1-164>på omtrent 35-40 mg/OD-L ved OD=25.

Eksempel 7

Immunologiske analyser for påvisning av SCF

Fremgangsmåter for radioimmunanalyse (RIA) anvendt for kvantitativ påvisning av SCF i prøver, ble utført i henhold til de følgende fremgangsmåter.

SCF fremstilt fra BRL 3A-celler renset som i eksempel 1, ble inkubert sammen med antiserum i 2 timer ved 37°C. Etter de to timene med inkubasjon ble prøverør så avkjølt på is, 125I-SCF ble tilsatt, og rørene ble inkubert ved 4°C i minst 20 timer. Hvert analyserør inneholdt 500 ul mkuba-sjonsblanding bestående av 50 ul fortynnede antisera,

125 7

"-60.000 cpm av I-SCF (3,8 x 10 cpm/pg) , 5 ul trasylol og 0-400 ul SCF-standard, idet buffer (fosfatbufret saltopp-løsning, 0,1% bovint serumalbumm, 0,05% "Triton X-100", 0,025% azid) utgjorde det gjenværende volum. Antiserumet var den andre testblodprøve fra en kanin immunisert med et 50% rent preparat av naturlig SCF fra BRL 3A-kondisjonert medium. Den endelige antiserumfortynning ved analysen var 1:2000.

125

Den antistoff-bundne I-SCF ble utfelt ved tilsetning av 150 ul "Staph A" (Calbiochem). Etter en 1-times inkubasjon ved værelsetemperatur ble prøvene sentrifugert, og pelletene ble vasket to ganger med 0,75 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,2, inneholdende 0,15M NaCl, 2 mM EDTA og 0,05% "Triton X-100". De vaskede pellets ble tellet i en gamma-teller

125

for å bestemme prosenten av I-SCF bundet. Antall bundet av rør som mangler serum, ble trukket fra alle sluttverdier for å korrigere for ikke-spesifikk utfelling. En typisk

125

RIA er vist i figur 20. Prosentinhibermgen av I-SCF-binding frembrakt ved hjelp av den umerkede standard, er doseavhengig (figur 20A), og, som angitt i figur 20B, når de immunutfelte pellets undersøkes ved hjelp av SDS-PAGE og autoradiografi, får<125>I-SCF-proteinbåndet konkurranse. I figur 20B er felt 1<125>I-SCF, og feltene 2, 3, 4 og 5 er

125

immunutfelt I-SCF som konkurrerer med hhv. 0, 2, 100 og 200 ng SCF-standard. Som bestemt ved hjelp av både reduk-sjonen i antistoffutfellbar cpm observert i RIA-rørene og reduksjon i det immunutfelte<125>I-SCF-proteinbånd (migrer-

mg ved omtrent M^. 31.000) , gjenkjenner de polyklonale antisera SCF-standarden som ble renset som i eksempel 1.

Western-fremgangsmåter ble også anvendt for å påvise rekombinant SCF uttrykt i E. coli-, COS-1- og CHO-celler.

1-193

Delvis renset E. coli-uttrykt rotte-SCF {eksempel 10), COS-l-celle-uttrykt rotte-SCF<1>"<162>og -SCF<1-193>samt human-1—16 2

SCF (eksemplene 4 og 9), og CHO-celle-uttrykt rotte-SCF1"162 (eksempel 5) ble underkastet SDS-PAGE. Etter elek-troforese ble protembåndene overført til 0,2 pm nitro-cellulose under anvendelse av et "Bio-Rad Transblof-apparat ved 60 V i 5 timer. Nitrocellulosefiltrene ble blokkert i 4 timer i PBS, pH 7,6, inneholdende 10% geiteserum etterfulgt av en 14-timers værelsetemperaturmkubasjon med en 1:200 fortynning av enten kanin-preimmun- eller -immunserum (lmmun-lsering beskrevet ovenfor). Antistoff-antiserum-kompleksene ble visualisert under anvendelse av pepperrotperoxydase-konjugerte geit-anti-kanm-IgG-reagenser (Vector Laboratories) og 4-klor-l-nafthol-fargefremkallingsreagens.

Eksempler på to Western-analyser er angitt i figurene 21 og 22. I figur 21 er feltene 3 og 5 200 pl 1 16?

COS-l-celleprodusert human-SCF<1-162>; feltene 1 og 7 er

200 pl COS-l-celleprodusert human-EPO (COS-l-celler transfisert med V19.8-EPO); og felt 8 er for fargede moelkylvekt-markører. Feltene 1-4 ble inkubert med preimmunserum, og feltene 5-8 ble inkubert med immunserum. Immunserumet gjenkjenner spesifikt et diffust bånd med en tilsynelatende Mr på 30.000 dalton fra COS-l-celler som produserer human-

1—16 2

SCF , men ikke fra COS-l-celler som produserer human-EPO.

I den Western som er vist i figur 22, er feltene 1

1-193

og 7 1 pg av et delvis renset preparat av rotte-SCF produsert i E. coli; feltene 2 og 8 er hvetekimagglutinm-1-193 agaroserenset COS-l-celleprodusert rotte-SCF ; feltene 4 og 9 er hvetekimagglutmin-agaroserenset COS-l-celleprodusert rotte-SCF 1—16 2; feltene 5 og 10 er hvetekim-

1—16 2 agglutinin-agaroserenset CHO-celleprodusert rotte-SCF ; og felt 6 er forfargede molekylvektmarkører. Feltene 1-5

og feltene 6-10 ble inkubert med hhv. kanin-preimmun- og

1-193

-immunserum. Den E. coli-produserte rotte-SCF

(feltene 1 og 7) migrerer med en tilsynelatende Mr på

-«24.000dalton, mens den COS-l-celleproduserte rotte-

1-19 3

SCF (feltene 2 og 8) migrerer med en tilsynelatende Mr på 24-36.000 dalton. Denne forskjell i molekylvekter er forventet ettersom pattedyrceller, men ikke bakterier, har evne til glycosylering. Transfeksjon av sekvensen som koder for rotte-SCF1-162 mn i COS-l- (feltene 4 og 9) , eller CHO-celler (feltene 5 og 10), resulterer i ekspresjon av SCF med en lavere gjennomsnittlig molekylvekt enn den som fås ved

1-193

transfeksjon med SCF<1-193>(feltene 2 og 8).

1—16 2 Ekspresjonsproduktene av rotte-SCF fra C0S-1-og CHO-celler er en serie bånd som varierer i tilsynelatende M mellom 24.000 og 36.000 dalton. Heterogeniteten til den uttrykte SCF skyldes sannsynligvis carbohydratvarianter hvor SCF-polypeptidet er glycosylert i forskjellig omfang.

Som en oppsummering indikerer Western-analyser at immunserum fra kaniner immunisert med naturlig pattedyr-SCF, gjenkjenner rekombinant SCF produsert i E. coli-, COS-l- og CHO-celler, men gjenkjenner ikke noen bånd i en kontroll-prøve bestående av COS-l-celleprodusert EPO. Som ytterligere understøttelse av spesifisiteten til SCF-antiserumet reagerte ikke preimmunserum fra den samme kanin med noen av rotte- eller human-SCF-ekspresjonsproduktene.

Eksempel 8

In vivo aktivitet av rekombinant SCF

A. Rotte- SCF i benmargtransplantasjon

COS-l-celler ble transfisert med V19.8-SCF<1->162 i et storskalaforsøk (T175 cm<2>kolber istedenfor 60 mm skåler) som beskrevet i eksempel 4. Omtrent 270 ml supernatant ble innhøstet. Denne supernatanten ble kromatografert på hvete-kimagglutinm-agarose og S-Sepharose hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1. Den rekombmante SCF ble evaluert i en benmargtransplantasjonsmodell basert på munn W/W<V->genetikk. W/W<v->musen har en stamcelledefekt som blant andre trekk resulterer i en makrocytisk anemi (store, røde celler) og muliggjør transplantasjon av benmarg fra normale dyr uten behov for bestråling av mottagerdyrene [Russel et al., Science, 144, s. 844-846 (1964)]. De normale donorstamceller vokser fortere enn de defekte mottagerceller etter transplantasjon.

I det følgende eksempel inneholdt hver gruppe

6 alderstilpassede mus.Benmarg ble mnhøstet fra normale donormus og transplantert inn i W/W<v->mus. Blodprofilen til mottagerdyrene følges til forskjellige tidspunkter etter transplantasjon, og innpoding av donormarg bestemmes ved hjelp av skiftingen i cellene fra perifert blod fra mottager-til donorfenotype. Omdannelsen fra mottager- til donorfenotype påvises ved å overvåke den fremre spredningsprofil (FASCAN, Becton Dickenson) for de-røde blodlegemene. Pro-filen for hvert transplantert dyr ble sammenlignet med pro-filen for både donor- og mottager-utransplanterte kontrolldyr på hvert tidspunkt. Sammenligningen ble gjort ved å benytte et datamaskinprogram basert påKolmogorov-Smirnov-statistikk for analyse av histogrammer fra strømningssystemer [Young,

J. Histochem. and Cytochem. , 25^, s. 935-941 (1977)]. En uavhengig kvalitativ indikator for innpoding er hemoglobm-typen påvist ved hemoglobinelektroforese av mottagerblod

[Wong et al., Mol. and Cell. Biol., 9, s. 798-808 (1989)]

og stemmer godt overens med bestemmelsen av tilpasnmgs-godhet fra Kolmogorov-Smirnov-statistikk.

Omtrent 3 x IO<5>celler ble transplantert uten SCF-behandling (kontrollgruppe i figur 23) fra C56BL/6J-donorer i W/W v -mottagere. En andre gruppe fikk 3 x 10<5>donorceller som var blitt behandlet med SCF (600 U/ml) ved 37°C i 20 minutter og injisert sammen (forbehandlet gruppe i figur 23).

(Én enhet SCF er definert som den mengde som resulterer i halvmaksimal stimulering i MC/9-bioanalysen). I en tredje gruppe ble mottagermusene injisert subkutant (sub-Q) med omtrent 400 U SCF/dag i 3 dager etter transplantasjon av 3 x 10^ donorceller (Sub-Q-injeksjonsgruppe i figur 23).

Som angitt i figur 23, innpodes donormargen hurtigere i begge SCF-behandlede grupper enn i den ubehandlede kontroll gruppe. 29 dager etter transplantasjon hadde den SCF-forbehandlede gruppe blitt omdannet til donorfenotype.

Dette eksemplet illustrerer nytten av SCF-terapi i benmargtransplantasjon.

B. In vivo aktivitet av rotte- SCF i Steel- mus

Mutasjoner i Sl-stedet forårsaker mangler i hematopoeseceller, pigmentceller og kimceller. Hematopoese-defekten manifesteres som reduserte antall røde blodlegemer [Russell, i: Al Gordon, Regulation of Hematopoiesis,

Vol. I, s. 649-675 Appleton-Century-Crafts, New York (1970)], neutrofiler [Ruscetti, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 152,

s. 398 (1976)], monocytter [Shibata, J. immunol. 135, s. 3905

(1985)], megakaryocytter [Ebbe, Exp. Hematol. £, s. 201

(1978)], naturlige dreperceller [(Clark, Immunogenetics, 12, s. 601 (1981)] og mastceller [Hayashi, Dev. Biol., 109, 234

(1985)]. Steel-mus er dårlige mottagere for et benmarg-transplantat på grunn av en redusert evne til å understøtte stamceller [Bannerman, Prog. Hematol., 8, s. 131 (1973)]. Genet som koder for SCF, er fjernet i Steel (Sl/Sl)-mus. Steel-mus gir en følsom in vivo modell for SCF-aktivitet. Forskjellige rekombinante SCF-proteiner ble testet i Steel-Dickie (Sl/Sl )-mus for varierende tids-lengder. 6 til 10 uker gamle Steel-mus (WCB6F1-S1/S1 ) ble levert fra Jackson Labs, Bar Harbor, ME. Perifert blod ble overvåket ved hjelp av en "Sysmex F-800" mikrocelleteller (Baxter, Irvine, CA) med hensyn på røde blodlegemer, hemo-globin og blodplater. For opptelling av hvite blodlegemer i perifert blod (WBC) ble det brukt en "Coulter Channelyzer 256" (Coulter Electronics, Marietta, GA). Ved forsøket i figur 24 ble Steel-Dickie-mus behandlet med E. coli-utvunnet SCF1 164, renset som i eksempel 10, ved en dose på 100 ug/kg/dag i 30 dager, så ved en dose på 30 pg/kg/dag i ytterligere 20 dager. Proteinet ble formulert i mjiserbar saltoppløsning (Abbott Labs, North Chicago, IL) +0,1% bovint fosterserum. Injeksjonene ble ut-ført subkutant daglig. Det perifere blod ble overvåket via blodprøver fra halen på~50 pl ved de angitte tidspunkter i figur 24. Blodet ble samlet opp i 3% EDTA-belagte sprøyter og tømt ut i mikrosentrifugerør med pulver-EDTA (Brinkmann, Westbury, NY). Det er en signifikant korreksjon av den makrocytiske anemi hos de behandlede dyr i forhold til kon-trolldyrene. Etter avslutning av behandling vender de behandlede dyr tilbake til den opprinnelige tilstand med makrocytisk anemi. I forsøket vist i figur 25 og 26, ble Steel-Dickie-mus behandlet med forskjellige rekombinante former av SCF som beskrevet ovenfor, men ved en dose på 100 pg/kg/dag i 20 dager. To former av E. coli-utvunnet rotte-SCF, -SCF1-164

1-193

og -SCF ble fremstilt som beskrevet i eksempel 10. I tillegg ble også E. coli SCF<1-164>, modifisert ved tilsetning av polyethylenglycol (SCF<1-164->PEG25) som i eksempel 12,

1—16 2

testet. CHO-utvunnet SCF fremstilt som i eksempel 5 og renset som i eksempel 11, ble også testet. Det ble tatt blodprøver fra dyrene ved hjertepunktering med 3% EDTA-belagte sprøyter, og blodet ble tømt ut i EDTA-pulverbelagte rør. Profilene for perifert blod etter 20 dager med behandling er vist i figur 25 for hvite blodlegemer (WBC) og figur 26 for blodplater. WBC-forskjellene for SCF<1>"<164->PEG25-gruppen er vist i figur 27. Det er absolutte økninger i neutrofiler, monocytter, lymfocytter og blodplater. Den mest dramatiske effekt ses med SCF1-164-PEG 25.

En uavhengig måling av lymfocyttundergrupper ble også utført, og dataene er vist i figur 28. Den munne ekvivalent til human-CD4 eller markør for T-hjelperceller, er L3T4 [Dialynas, J. Immunol., 131, s. 2445 (1983)]. LyT-2 er et murint antigen på cytotoksiske T-celler [Ledbetter,

J. Exp. Med., 153, s. 1503 (1981)]. Monoklonale antistoffer mot disse antigenene ble brukt til å evaluere T-celle-undergrupper i de behandlede dyr.

Helblod ble farget med hensyn på T-lymfocyttundergrupper på følgende måte. 200 pl helblod ble tatt fra individuelle dyr i EDTA-behandlede rør. Hver prøve med blod ble lysert med sterilt, avionisert vann i 60 sekunder og så gjort isoton med 10X Dulbeccos fosfatbufret saltopp-løsning (PBS) (Gibco, Grand Island, NY). Det lyserte blod ble vasket to ganger med IX PBS (Gibco, Grand Island, NY) supplert med 0,1% bovint fosterserum (Flow Laboratory, McLean, VA) og 0,1% natriumazid. Hver blodprøve ble plassert i 96-brønners gruppeskåler med rund bunn og sentrifugert. Cellepelleten (inneholdende 2-10 x 10 5 celler) ble på nytt oppslemmet med 20 ul rotte-anti-mus-L3T4 konjugert med fycoerythrin (PE) (Becton Dickinson, Mountam View, CA) og 20 pl rotte-anti-mus-Lyt-2 konjugert med fluorescemisothio-cyanat inkubert på is (4°C) i 30 minutter (Becton Dickinson). Etter inkubasjon ble cellene vasket to ganger i IX PBS supplert som angitt ovenfor. Hver blodprøve ble så analysert på et "FACScan" celleanalysesystem (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Dette systemet ble standardisert ved å bruke standard autokompensasjonsfremgangsmåter og "Calibrite Beads" (Becton Dickinson, Mountain View,CA). Disse dataene indikerte en absolutt økning i både hjelper-T-cellepopula-sjoner og i antall cytotoksiske T-celler.

C. In vivo aktivitet av SCF i primater

Human-SCF<1>"<164>uttrykt i E. coli (eksempel 6B) og renset til homogenitet som i eksempel 10, ble testet for in vivo biologisk aktivitet i normale primater. Voksne bavianer av hannkjønn (Papio sp.) ble undersøkt i tre grupper: ubehandlet, n=3; SCF 100 ug/kg/dag, n=6; og SCF 30 ug/kg/dag, n=6. De behandlede dyr fikk enkle, daglige, subkutane injeksjoner av SCF. Blodprøver ble erholdt fra dyrene under ketaminsikring. Prøver for fullstendig blodtellmg, reti-culocyttellmg og blodplatetellmg, ble erholdt på dagene 1, 6, 11, 15, 20 og 25 med behandling.

Alle dyrene overlevde fremgangsmåten og hadde ingen skadelige reaksjoner på SCF-terapi. Antallet hvite blodlegemer økte i dyrene behandlet med 100 ug/kg som vist i figur 29. Differensialtellingen oppnådd manuelt fra Wright Giemsa-fargede, mikroskopiske preparater av perifert blod,

er også angitt i figur 29. Det var en absolutt økning i

neutrofiler, lymfocytter og monocytter. Som angitt i figur 30, var det også en økning av hematocriter og blodplater ved doren på 100ug/kg.

Human-SCF {hSCF<1-164>modifisert ved tilsetning av polyethylenglycol som i eksempel 12) ble også testet i normale bavianer ved en dose på 200 ug/kg dag, administrert ved kontinuerlig, intravenøs infusjon og sammenlignet med det umodifiserte protein. Dyrene startet SCF-behandling på dag 0 og ble behandlet i 28 dager. Resultatene for perifer WBC er gitt i den følgende tabell. Den PEG-modifiserte SCF ga en tidligere økning i perifer WBC enn den umodifiserte SCF.

Behandling med 200 ug/kg-dag hSCF<1->164:

Behandling med 200 ug/kg-dag PEG-hSCF<1-164>:

Eksempel 9

In vitro aktivitet av rekombinant human- SCF

cDNA for human-SCF svarende til aminosyrene 1-162 erholdt ved hjelp av PCR-reaksjoner skissert i eksempel 3D, ble uttrykt i COS-l-celler som beskrevet for rotte-SCF i eksempel 4. COS-l-supernatanter ble analysert med hensyn på human benmarg samt i de munne HPP-CFC- og MC/9-analyser. Humanprotemet var ikke aktivt ved de testede konsentrasjoner i noen av murinanalysene; det var imidlertid aktivt på human benmarg. Dyrkningsbetmgelsene ved analysen var som følger: human benmarg fra friske frivillige ble sentrifugert over "Ficoll-Hypaque"-gradienter (Pharmacia) og dyrket i 2,1% methylcellulose, 30 kalvefosterserum, 6 x 10 ^ M 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, Iscoves medium (Gibco), 20 U/ml EPO og 1 x IO<5>celler/ml i 14 dager i en fuktet atmosfære inneholdende 7% 02, 10% C02og 83% N2- Koloniantallene frembrakt med rekombinant human- og rotte-SCF COS-l-supernatanter, er angitt i tabell 12. Bare koloniene med størrelse 0,2 mm eller større, er angitt.

Koloniene som vokste i løpet av 14-dagersperioden,

er vist i figur 31A (forstørrelse 12x). Pilen viser en typisk koloni. Koloniene lignet de munne HPP-CFC-kolonier i sin store størrelse (gjennomsnitt 0,5 mm). På grunn av tilstedeværelsen av EPO var noen av koloniene hemoglobiniserte. Når koloniene ble isolert og sentrifugert på objektglass

under anvendelse av en "Cytospin" (Shandon) etterfulgt av farging med Wright-Giemsa, var den overveiende celletype en udifferensiert celle med et høyt kjerne:cytoplasma-forhold som vist i figur 31B (forstørrelse 400x). Pilene i figur 31B peker mot de følgende strukturer: pil 1, cytoplasma;

pil 2, kjerne; pil 3, vakuoler. Ikke fullt utviklede celler som klasse er store, og cellene blir progressivt mindre etter hvert som de utvikles [Diggs et al., The Morphology of Human Blood Cells, Abbott Labs, 3 (1978)]. Kjernene i tidligere celler i hematopoesemodningssekvensen er forholdsvis store i forhold til cytoplasmaet. Cytoplasmaet i ikke ferdig utviklede celler farges dessuten mørkere med Wright-Giemsa enn det kjernen gjør. Etter hvert som cellene utvikles, farges kjernen mørkere enn cytoplasmaet. Morfologien til

humanbenmargceliene som fås fra dyrking med rekombinant human-SCF, er i overensstemmelse med den konklusjon at mål-og det øyeblikkelige produkt av SCF-virknmg er en forholdsvis lite ferdig utviklet hematopoeseforløper.

Rekombinant human-SCF ble testet i agarkoloni-analyser på humanbenmarg i kombinasjon med andre vekstfaktorer som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i tabell 13. SCF synergiserer med G-CSF, GM-CSF, IL-3 og EPO, hvorved proliferasjonen av benmargmål for de enkelte CSF-er øker.

En annen aktivitet av rekombinant human-SCF er evnen til å forårsake proliferasjon i mykagar av human, akutt myelogen leukemi (AML)-cellelinjen, KG-1 (ATCC CCL 246). COS-l-supernatanter fra transfiserte celler ble testet i en KG-l-agarkloningsanalyse [Koeffler et al., Science, 200, s. 1153-1154 (1978)] hovedsakelig som beskrevet, bortsett fra at celler ble platet ut ved 3000/ml. Dataene fra kulturer in triplo er gjengitt i tabell 14.

Eksempel 10

Rensing av rekombmante SCF- produkter uttrykt i E. coli

Fermentering av E. coli human-SCF<1-164>ble utført i henhold til eksempel 6C. De mnhøstede celler (912 g våt-vekt) ble oppslemmet i vann til et volum på 4,6 1 og brutt opp ved tre passeringer gjennom en laboratoriehomogenisator

2

(Gaulin modell 15MR-8TBA) ved 562,5 kg/cm . En oppbrutt cellepelletfraksjon ble erholdt ved sentrifugermg (17700 x g, 30 minutter, 4°C), vasket én gang med vann (resuspensjon og resentrifugering) og til sist oppslemmet i vann til et volum på 400 ml.

Pelletfraksjonen inneholdende uoppløselig SCF (estimat av 10-12 g SCF) ble tilsatt til 3950 ml av en passende blanding slik at sluttkonsentrasjonene av bestanddeler i blandingen var 8 M urea (ultraren finhetsgrad), 0,1 mM EDTA, 50 mM natriumacetat, pH 6-7; SCF-konsentrasjon ble anslått til 1,5 mg/ml. Inkubasjon ble utført ved værelsetemperatur i 4 timer for å oppløseliggjøre SCF. Gjenværende, uoppløse-lig materiale ble fjernet ved sentrifugering (17.700 x g,

30 minutter, værelsetemperatur) . For refoldmg/reoxydasjon av det oppløseliggjorte SCF ble supernatantfraksjonen tilsatt sakte med omrøring til 39,15 1 av en passende blanding slik at sluttkonsentrasjonene av bestanddeler i blandingen var 2,5 M urea (ultraren fmhetsgrad) , 0,01 mM EDTA, 5 mM natriumacetat, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM glutathion, 0,02%

(vekt/volum) natriumazid. SCF-konsentrasjon ble anslått til 150 ug/ml. Etter 60 timer ved værelsetemperatur [kortere tider (f.eks.~20 timer) er også egnet] med omrøring ble blandingen oppkonsentrert to ganger under anvendelse av et "Millipore Pellicon" ultraflltreringsapparat med tre poly-sulfonmembrankassetter med molekylvektgrense på 10.000

(1,4 m 2 totalflate) og så diafiltrert mot 7 volumer 20 mM Tris-HCl, pH 8. Temperaturen under oppkonsentreringen/ultra-filtreringen var 4°C, pumpehastighet var 5 l/minutt, og flltreringshastighet var 600 ml/minutt. Sluttvolumet av utvunnet retentat var 26,5 1. Ved bruk av SDS-PAGE utført både med og uten reduksjon av prøver, er det tydelig at mesteparten (>80%) av SCF fra pelletfraksjonen oppløseliggjøres ved inkubasjon med 8 M urea, og at flere arter (former) av SCF er til stede etter foldingen/oxydasjonen, som synlig-gjort ved hjelp av SDS-PAGE av ureduserte prøver. Hoved-formen som utgjør korrekt oxydert SCF (se nedenunder), migrerer med tilsynelatende Mr på ca. 17.000 (uredusert) i forhold til molekylvektmarkørene (redusert) beskrevet for figur 9. Andre former omfatter materiale som migrerer med tilsynelatende Mr på ca. 18-20.000 (uredusert) som menes å utgjøre SCF med ukorrekte intrakjede-disulfldbmdinger; og bånd som migrerer med tilsynelatende Mrs i området 37.000 (uredusert) eller høyere, som antas å representere forskjellige SCF-former med mterkjede-disulfidbindinger som resulterer i SCF-polypeptidkjeder som bindes kovalent slik at det dannes hhv. dimerer eller større oligomerer. De følgende fraksjoneringstrinn resulterer i fjerning av gjen-

værende E. coli-forurensninger og av de uønskede SCF-former slik at det oppnås SCF renset til tilsynelatende homogenitet i biologisk aktiv konformasjon.

pH i ultraflltreringsretentatet ble regulert til 4,5 ved tilsetning av 375 ml 10% (volum/volum) eddiksyre, noe som fører til tilstedeværelsen av synlig utfelt materiale. Etter 60 minutter, da mye av det utfelte materiale hadde falt ut på bunnen av beholderen, ble de øvrige 24 1 fradekantert og filtrert gjennom et "Cuno"-filter med tykkelse 30SP ved 500 ml/minutt for å fullføre klaringen. Filtratet ble så fortynnet 1,5 ganger med vann og tilført ved 4°C til en "S-Sepharose Fast Flow" (Pharmacia)-kolonne (9 x 18,5 cm) ekvilibrert i 25 mM natriumacetat, pH 4,5. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 5 l/time ved 4°C. Etter prøvetilførsel ble kolonnen vasket med fem kolonnevolumer ( ~6 1) kolonnebuf f er, og SCF-materiale som var bundet til kolonnen, ble eluert med en gradient av 0-0,35 M NaCl i kolonnebuffer. Totalt gradientvolum var 20 1, og fraksjoner a 200 ml ble samlet opp.Elueringsprofilen er vist i figur 33. Aliquoter (10 ul) fra fraksjoner samlet opp fra S-Sepharose-kolonnen, ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE ut-ført både med (figur 32 A) og uten (figur 32 B) reduksjon av prøvene. Fra slike analyser er det åpenbart at praktisk talt all absorbans ved 280nm (figurene 32 og 33) skyldes SCF-materiale.

Den korrekt oxyderte form dominerer i hovedabsorbanstoppen (fraksjonene 22-38, figur 33). Arter (former) i mindre mengder som kan synliggjøres i fraksjoner, omfatter det ukorrekt oxyderte materiale med tilsynelatende Mr på 18-20.000 på SDS-PAGE (uredusert) som er til stede i den første skulderen i hovedabsorbanstoppen (fraksjonene 10-21, figur 32 B); og disulfidbundet dimermateriale som er til stede gjennom hele absorbansområdet (fraksjonene 10-38, figur 32 B).

Fraksjonene 22-38 fra S-Sepharose-kolonnen ble slått sammen, og blandingen ble regulert til pH 2,2 ved tilsetning av ca. 11 ml 6 N HC1 og tilført til en "Vydac C4"-kolonne

(høyde 8,4 cm, diameter 9 cm) ekvilibrert med 50%

(volum/volum) ethanol, 12,5 mM HC1 (oppløsning A) og drevet ved 4°C. Kolonneharpiksen ble fremstilt ved oppslemming av den tørre harpiksen i 80% (volum/volum) ethanol, 12,5 mMHCl (oppløsning B) , og så ble den ekvilibrert med oppløsning A. Før prøvetilsetning ble en blindgradient fra oppløsning A til oppløsning B (6 1 totalvolum) tilført, og kolonnen ble så reekvilibrert ved oppløsning A. Etter prøvetilsetning ble kolonnen vasket med 2,5 1 av oppløsning A, og SCF-materiale bundet til kolonnen, ble eluert med en gradient fra oppløs-ning A til oppløsning B (18 1 totalvolum) ved en strømnings-hastighet på 2670 ml/time. 286 fraksjoner å 50 ml hver ble samlet opp, og aliquoter ble analysert ved hjelp av absorbans ved 280 nm (figur 35) og ved hjelp av SDS-PAGE (25 ul pr. fraksjon) som beskrevet ovenfor (figur 34 A, reduserende betingelser; figur 34 B, ikke-reduserende betingelser). Fraksjonene 62-161 som inneholder korrekt oxydert SCF i en høyrenset tilstand, ble slått sammen [de forholdsvis små mengder av ukorrekt oxydert monomer med Mr på ca. 18-20.000 (uredusert) eluerte senere i gradienten (ca. fraksjonene 166-211), og det disulfldbundne dimermateriale eluerte også senere (ca. fraksjonene 199-235) (figur 35)].

For å fjerne ethanol fra blandingen av fraksjonene 62-161 og for å oppkonsentrere SCF, ble det anvendt følgende fremgangsmåte under benyttelse av 'Q-Sepharose Fast Flow"

(Pharmacia)lonebytterharpiks. Blandingen (5 1) ble fortynnet med vann til et volum på 15,625 1, noe som brakte ethanolkonsentrasjonen til ca. 20% (volum/volum). Så ble 1 M Tris-base (135 ml) tilsatt for å bringe pH til 8, etterfulgt av 1 M Tris-HCl, pH 8, (23,6 ml) for å bringe total-Tris-konsentrasjonen til 10 mM. De neste 10 mM Tris-HCl, pH 8

<~15,5 1), ble tilsatt for å bringe totalvolumet til 31,25 1 og ethanolkonsentrasjonen til ca. 10% (volum/volum). Materialet ble så tilført ved 4°C til en kolonne av "Q-Sepharose Fast Flow" (høyde 6,5 cm, diameter 7 cm) ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl, pH 8, og dette ble etterfulgt av vasking av kolonnen med 2,5 1 kolonnebuffer. Strømnings-

hastighet under prøvetilførsel og vasking var ca. 5,5 l/time. For å eluere den bundne SCF ble 200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8, pumpet i reversretning gjennom kolonnen ved ca. 200 ml/time. Fraksjoner å ca. 12 ml ble samlet opp og analysert ved hjelp av absorbans ved 280 nm og SDS-PAGE som ovenfor. Fraksjonene 16-28 ble slått sammen (157 ml).

Blandingen som inneholder SCF, ble så tilført i to separate kromatograferinger (78,5 ml tilført for hver) til en "Sephacryl S-200 HR" (Pharmacia)-gelflltreringskolonne

(5 x 138 cm) ekvilibrert med fosfatbufret saltoppløsning ved 4°C. Fraksjoner å ca. 15 ml ble samlet opp ved en strøm-ningshastighet på ca. 75 ml/time. I hvert tilfelle eluerte en hovedtopp av materiale med absorbans ved 280 nm i fraksjoner svarende grovt sett til elueringsvolumområdet 1370 - 1635 ml. Fraksjonene som utgjør absorbanstoppene fra de to kolonneomgangene, ble slått sammen i en enkel blanding å

525 ml inneholdende ca. 2,3 g SCF. Dette materiale ble sterilisert ved filtrering under anvendelse av en "Millipore Millipak 20" membraninnsats.

Alternativt kan materiale fra C^-kolonnen oppkonsen-treres ved ultrafiltrering og bufferen bygges ved diafiltrering før sterilfiltrering.

Det isolerte, rekombmante human-SCF<1><164->materiale er svært rent (>98% ved SDS-PAGE med sølvfarging) og anses for å være av farmasøytisk finhetsgrad. Ved å bruke metodene skissert i eksempel 2, er det funnet at materialet har ammo-syresammensetning som passer til det forventede fra analyse av SCF-genet, og har N-ende-aminosyresekvens Met-Glu-Gly-Ile..., som forventet, med bibeholdelse av Met som kodes for av initieringskodonet.

Ved fremgangsmåter som er sammenlignbare med de som er skissert for human-SCF<1-164>uttrykt i E. coli, kan rotte-SCF<1><164>(også til stede i uoppløselig form inne i cellen etter fermentering) utvinnes i en renset tilstand med høy biologisk, spesifikk aktivitet. Likeledes kan human-

1.100 l.ioi

SCF OJ og rotte-SCFutvinnes. Rotte-SCF y er til-bøyelig under folding/oxydasjon til å danne mer forskjellig oxyderte arter, og de uønskede artene er vanskeligere å fjerne kromatografisk.

Rotte-SCF1-193 og human-SCF1-183 er tilbøyelige til proteolytisk nedbrytning under de tidlige stadier av ut-vinning, dvs. oppløseliggjøring og folding/oxydasjon. Et hovedsete for proteolyse befinner seg mellom restene 160 og 170. Proteolysen kan minimaliseres ved passende manipula-sjon av betingelser (f.eks. SCF-konsentrasjon; variering av pH; innlemmelse av EDTA ved 2-5 mM, eller andre protease-inhibitorer), og nedbrutte former i den utstrekning de er til stede, kan fjernes ved passende fraksjoneringstrinn.

Selv om bruken av urea for oppløseliggjøring og under folding/oxydasjon er en foretrukket utførelsesform slik som skissert, kan andre oppløseliggjørmgsmidler slik som guanidin-HCl (f.eks. 6 M under oppløseliggjøring og 1,25 M under folding/oxydasjon) og natrium-N-lauroyl-sarcosin, benyttes effektivt. Etter fjerning av midlene etter fold-ing/oxydasjon kan rensede SCF-er, som bestemt ved hjelp av SDS-PAGE, utvinnes ved bruk av passende fraksjoneringstrinn.

Selv om bruken av glutathion ved 1 mM under fold-ing/oxydasjon er en foretrukket utførelsesform, kan i tillegg andre betingelser benyttes med lik eller tilnærmet lik effektivitet. Disse omfatter f.eks. bruken istedenfor 1 mM glutathion av 2 mM glutathion pluss 0,2 mM oxydert glutathion, eller 4 mM glutathion pluss 0,4 mM oxydert glutathion, eller 1 mM 2-mercaptoethanol, eller også andre thiolrea-genser.

I tillegg til de kromatografiske fremgangsmåter som er beskrevet, omfatter andre fremgangsmåter som kan anvendes ved utvinningen av SCF-er i en renset, aktiv form, hydrofob mteraksjonskromatografi [f.eks. bruken av fenyl-Sepharose (Pharmacia), tilførsel av prøven ved nøytral pH i nærvær av 1,7 M ammoniumsulfat og eluering med en gradient av avtag-ende mengde ammoniumsulfat]; immobilisert metallaffmitets-kromatografi [f.eks. bruken av chelaterende-Sepharose (Pharmacia) tilsatt Cu<2+->ion, tilførsel av prøven nær nøytral pH i nærvær av 1 mM imidazol og eluering med en gradient av økende mengdelmidazol]; hydroxylapatittkromatografi [til-førsel av prøven ved nøytral pH i nærvær av 1 mM fosfat og eluering med en gradient av økende mengde fosfat]; og andre fremgangsmåter som er åpenbare for fagfolk innen teknikken.

Andre former av human-SCF som svarer til hele eller en del av den åpne leseramme som koder for aminosyrene 1-248 i figur 42, eller svarende til den åpne leseramme kodet for av alternativt spleisede mRNA-er som kan foreligge (slik som den vist ved hjelp av cDNA-sekvensen i figur 44), kan også uttrykkes i E. coli og utvinnes i renset form ved lignende fremgangsmåter som de som er beskrevet i dette eksemplet, og ved andre fremgangsmåter som er åpenbare for fagfolk innen teknikken.

Rensingen og formuleringen av former som omfatter det såkalte transmembranområdet henvist til i eksempel 16, kan omfatte utnyttelse av detergenter, inkludertlkke-loniske detergenter, og lipider, inkludert fosfolipidholdige liposomstrukturer.

Eksempel 11

Rekombmant- SCF fra pattedyrceller

A. Fermentering av CHO- celler som produserer SCF

Rekombmante ovarie (CHO)-celler fra kinesisk

1—16 2

hamster (stamme CHO pDSRa2-hSCF<1-162>) ble dyrket på mikrobærere i et 20-liters perfusjonsdyrkningssystem for frem-1—16 2

stilling av human-SCF . Fermentorsystemet er likt med det som ble brukt for dyrkingen av BRL-3A-celier, eksempel IB, bortsett fra det følgende: Vekstmediet brukt for dyrkingen av CHO-celler, var en blanding av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og Hams F-12 næringsblandmg i et Is-forhold (Gibco), supplert med 2 mM glutamin, ikke-essensielle aminosyrer (for å fordoble den foreliggende konsentrasjon ved å bruke 1:100-fortynning av Gibco nr. 320-1140) og 5% bovint fosterserum. Innhøstingsmediet var identisk, bortsett fra utelatelsen av serum. Reaktoren ble inokulert med 5,6 x 10<9>CHO-celler dyrket i to 3-liters spinnerkolber.

Cellene fikk vokse til en konsentrasjon på 4 x 10 5 celler/ml. På dette punkt ble 100 g forsterilisert cytodex-2-mikrobærere (Pharmacia) tilsatt til reaktoren som en 3-liters suspensjon i fosfatbufret saltoppløsning. Cellene fikk feste seg og vokse på mikrobærerne i 4 dager. Vekstmedium fikk renne gjennom reaktoren etter behov, basert på glucoseforbruk. Glucosekonsentrasjonen ble holdt ved omtrent 2,0 g/l. Etter 4 dager fikk 6 volumdeler serumfritt medium renne gjennom reaktoren for å fjerne mesteparten av serumet (proteinkon-sentrasjon <50 ug/ml). Reaktoren ble så drevet satsvis inntil glucosekonsentrasjonen falt under 2 g/l. Fra dette punkt av ble reaktoren drevet ved en kontinuerlig perfusjonshastighet på omtrent 20 l/dag. pH i kulturen ble holdt ved 6,9 - 0,3 ved å regulere C02-strømningshastigheten. Det oppløste oxygen ble holdt høyere enn 20% luftmetning ved å supplere med rent oxygen etter behov. Temperaturen ble holdt ved 37°C - 0,5°C.

Omtrent 450 liter serumfritt, kondisjonert medium ble frembrakt fra systemet ovenfor og ble brukt som start-1—162 materiale for rensingen av rekombinant human-SCF

Omtrent 589 liter serumfritt, kondisjonert medium ble også frembrakt på lignende måte, men ved å bruke stamme

1 — 16 2

CH0-pDSRct2-rSCF og brukt som startmateriale for rensing av rotte-SCF1"162.

1—162 Rensing av rekombinant pattedyruttrykt rotte - SCF

Alt rensearbeid ble utført ved 4°C med mindre annet er angitt.

1. Oppkonsentrering og diafiltrering

Kondisjonert medium frembrakt ved hjelp av serum-1—162

fri vekst av cellestamme CH0-pDSRa2-rotte-SCF som ut-ført i avsnitt A ovenfor, ble klaret ved filtrering gjennom

0,45 um "Sartokapsler" (Sartorius). Flere forskjellige porsjoner (36 1, 101 1, 102 1, 200 1 og 150 1) ble separat underkastet oppkonsentrering og diafiltrermg/bufferutbytt-ing. Som illustrasjon var håndteringen av 36-liters-

porsjonen som følger. Det filtrerte, kondisjonerte medium ble oppkonsentrert til ca. 500 ml under anvendelse av et "Millipore Pellicon" tangensialstrømnings-ultraflltrerings-apparat med tre celluloseacetatmembrankassetter med molekylvektgrense på 10.000 (1,4 m<2>total membranflate; pumpehastighet~2.200 ml/minutt og flltreringshastighet~750 ml/mm. Diafiltrering/bufferutbytting ved preparering for anionbytterkromatografi ble så utført ved å tilsette 1.000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7-6,8, til konsentratet, rekonsentrering til 500 ml under anvendelse av tangensialstrømnmgs-ultraf il-treringsapparatet og gjentagelse av dette 5 ytterligere ganger. Det oppkonsentrerte/diaflltrerte preparat ble til sist utvunnet i et volum på 1.000 ml. Oppførselen til alle kondisjonerte mediumporsjoner underkastet oppkonsentreringen og diafiltrering/bufferutbytting, var lik. Proteinkonsentra-sjoner for porsjonene bestemt ved hjelp av Bradford [Anal. Bioch. _7_2, 248-254 (1976) ] med bovint serumalbumm som standard, var i området 70-90 ug/ml. Det totale volum av kondisjonert medium benyttet for denne fremstilling, var ca. 589 1.

2. " Q- Sepharose Fast Flow"- anionbytterkromatografi

De konsentrerte/diaflltrerte preparater fra hver av de fem kondisjonerte mediumporsjoner henvist til ovenfor,

ble slått sammen (totalt volum 5.000 ml). pH ble regulert til 6,75 ved å tilsette 1 M HC1. 2.000 ml 10 mM Tris-HCl,

pH 6,7, ble brukt til å bringe konduktivitet til ca.

0,700 mmho. Preparatet ble tilført til en "Q-Sepharose Fast Flow"-amonbytterkolonne (36 x 14 cm; Pharmacia "Q-Sepharose Fast Flow"-harpiks) som var blitt ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl-, pH 6,7, bufferen. Etter prøvetilførsel ble kolonnen vasket med 28.700 ml av Tris-bufferen. Etter denne vasking ble kolonnen vasket med 23.000 ml 5 mM eddiksyre/1 mM glycm/6 M urea/20 uM CuS04ved ca. pH 4,5. Kolonnen ble så vasket med 10 mM Tris-HCl, 20 um CuS04~, pH 6,7, buffer for å vende tilbake til nøytral pH og fjerne urea, og en saltgradient (0-700 mM NaCl i 10 mM Tris-HCl, 20 UM CuS04-, pH

6,7, bufferen; 40 1 totalvolum) ble tilført. Fraksjoner å

ca. 490 ml ble samlet opp ved en strømningshastighet på ca. 3.250 ml/time. Kromatogrammet er vist i figur 36.

"MC/9 cpm" henviser til biologisk aktivitet i MC/9-analysen; 5 ul fra de angitte fraksjoner ble analysert. Eluater samlet opp under prøvetilførselen og vaskinger, er ikke vist i figuren; ingen biologisk aktivitet ble påvist i disse fraksjonene. 3. Kromatografi under anvendelse av silicabundet hydrocar-bonharpiks

Fraksjonene 44-66 fra kromatograferingen vist i figur 36, ble slått sammen (11.200 ml), og EDTA ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Dette materialet ble tilført ved en strømningshastighet på ca. 2.000 ml/time til en C4~kolonne ("Vydac Proteins C^"; 7 x 8 cm) ekvilibrert med buffer A (10 mM Tris, pH 6,7/20% ethanol). Etter prøve-tilførsel ble kolonnen vasket med 1.000 ml buffer A. En lineær gradient fra buffer A til buffer B (10 mM Tris, pH 6,7/94% ethanol) (totalvolum 6.000 ml) ble så tilført, og fraksjoner å 30-50 ml ble samlet opp. Porsjoner av C^-kolonnestartprøven, gjennomløpsblandingen og vaskebland-mgen i tillegg til 0,5 ml aliquoter av gradientfraksjonene, ble dialysert mot fosfatbufret saltoppløsning ved preparering for biologisk analyse. Disse forskjellige fraksjonene ble analysert ved hjelp av MC/9-analysen (5 ul aliquoter av de fremstilte gradientfraskjoner; cpm i figur 37). SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227, s. 680-685 (1970); stablegeler inneholdt 4% (vekt/volum) acrylamid og separasjonsgeler inneholdt 12,5% (vekt/volum) acrylamid] av aliquoter av forskjellige fraksjoner er vist i figur 38. For de viste geler ble prøve-aliquoter (100 ul) tørket under vakuum og så på nytt opp-løst under anvendelse av 20 ul prøvebehandlmgsbuffer (ved reduksjon f.eks. med 2-mercaptoethanol) og kokt i 5 minutter før påfylling på gelen. De nummererte merker til venstre i figuren viser migrermgsposisjoner for molekylvektmarkører (redusert) som i figur 6. De nummererte feltene representerer de tilsvarende fraksjoner samlet opp under tilførsel av den siste del av gradienten. Gelene ble sølvfarget

[Morrissey, Anal. Bioch. 117, s. 307-310 (1981)].

4. " Q- Sepharose Fast Flow"- anionbytterkromatografi

Fraksjonene 98-124 fra C4~kolonnen vist i figur 37, ble slått sammen (1050 ml). Blandingen ble fortynnet 1:1

med 10 mM Tris-, pH 6,7, buffer for å redusere ethanolkonsen-trasjon. Den fortynnede blanding ble så tilført til en "Q-Sepharose Fast Flow"-anionbytterkolonne (3,2 x 3 cm, Pharmacia "Q-Sepharose Fast Flow"-harpiks) som var blitt ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl-, pH 6,7, bufferen, strøm-ningshastighet var 463 ml/time. Etter prøvetilførsel ble kolonnen vasket med 135 ml kolonnebuffer, og eluering av bundet materiale ble utført ved vasking med 10 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, pH 6,7. Strømningsretningen i kolonnen ble snudd for å minimalisere volum av eluert materiale, og 7,8 ml fraksjoner ble samlet opp under eluering.

5. " Sephacryl S- 200 HR"- gelflltreringskromatografi

Fraksjoner inneholdende eluert protein fra saltvask-mgen av "Q-Sepharose Fast Flow"-anionbytterkolonnen, ble slått sammen (31 ml). 30 ml ble tilført til en "Sephacryl S-200 HR"- (Pharmacia) gelflltreringskolonne, (5 x 55,5 cm) ekvilibrert i fosfatbufret saltoppløsning. Fraksjoner a 6,8 ml ble samlet opp ved en strømningshastighet på 68 ml/time. Fraksjoner svarende til absorbanstoppen ved 280 nm, ble slått sammen og utgjør det endelige, rensede materiale.

Tabell 15 viser en oppsummering av rensingen.

1—16 2 N-ende-aminosyresekvensen til renset rotte-SCF er omtrent halvt Gln-Glu-Ile... og halvt PyroGlu-Glu-Ile..., som bestemt ved hjelp av metodene skissert i eksempel 2.

1-162

Dette resultatet indikerer at rotte-SCF<1-162>er produktet av proteolytisk bearbeiding/spalting mellom restene angitt som numrene (-1) (Thr) og (+1) (Gin) i figur 14C. På samme måte

1—162

har renset human-SCF<1-162>fra transfisert CHO-celle-kondisjonert medium (nedenunder) N-ende-aminosyresekvens Glu-Gly-Ile, noe som indikerer at det er produktet av bearbeidelse/spalting mellom rester angitt som numrene (-1) (Thr) og (+1) (Glu) i figur 15C.

Bruk av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte vil gi renset human-SCF-protein, enten rekombinante former uttrykt i CHO-celler eller naturlig utvunnet.

Ytterligere rensemetoder som kan benyttes ved rensingen av pattedyrcelle-utvundne, rekombinante SCF-er, omfatter de som er skissert i eksemplene 1 og 10, og andre fremgangsmåter som er åpenbare for fagfolk innen teknikken.

Andre former for human-SCF som svarer til hele

eller en del av den åpne leseramme som koder for aminosyrene 1-248, vist i figur 42, eller som svarer til den åpne leseramme som kodes for av alternativt spleisede mRNA-er som kan foreligge (slik som den som er representert ved cDNA-sekvensen i figur 44), kan også uttrykkes i pattedyrceller og utvinnes i renset form ved lignende fremgangsmåter som de som er beskrevet i dette eksemplet, og ved hjelp av andre fremgangsmåter som er åpenbare for fagfolk innen teknikken.

C. SDS- PAGE og glycosidasebehandlinger

SDS-PAGE av sammenslåtte fraksjoner fra "Sephacryl S-200 HR"-gelflltrermgskolonnen er vist i figur 39; 2,5 ul av blandingen ble fylt på (felt 1). Feltet ble sølvfarget. Molekylvektmarkører (felt 6) var som beskrevet for figur 6. Det forskjellig migrerende materiale over og litt under Mr~31.000-markørstillmgen utgjør det biologisk aktive materiale; den tilsynelatende heterogenitet skyldes stort sett heterogeniteten i glycosylering.

For å karakterisere glycosyleringen ble renset materiale behandlet med forskjellige glycosidaser, analysert ved hjelp av SDS-PAGE (reduserende betingelser) og synlig-gjort ved hjelp av sølvfargmg. Resultater er vist i figur 39. Felt 2, neuraminidase. Felt 3, neuraminidase og 0-glycanase. Felt 4, neuraminidase, O-glycanase og N-glycanase. Felt 5, neuraminidase og N-glycanase. Felt 7, N-glycanase. Felt 8, N-glycanase uten substrat. Felt 9, O-glycanase uten substrat. Betingelsene var 10 mM 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-l-propansulfonat (CHAPS), 66,6 mM 2-mercaptoethanol, 0,04% (vekt/volum) natriumazid, fosfatbufret saltoppløsning, i 30 minutter ved 37°C, etterfulgt av inkubasjon ved halvparten av beskrevne konsentrasjoner i nærvær av glycosidaser i 18 timer ved 37°C. Neuraminidase (fra Arthrobacter ureafaciens; levert av Calbiochem) ble brukt ved 0,5 enheter/ml sluttkonsentrasjon. 0-glycanase (Genzyme; endo-alfa-N-acetylgalactosaminidase) ble brukt ved 7,5 milli- enheter/ml. N-glycanase (Genzyme; peptid: N-glycosidase F; peptid-N 4[N-acetyl-beta-glucosaminyl]-asparaginamidase) ble brukt ved 10 enheter/ml.

Der det passet slik, ble forskjellige kontrollmkubasjoner utført. Disse omfattet: inkubasjon uten glycosidaser for å verifisere at resultatene skyldtes de tilsatte glycosidasepreparater; inkubasjon med glycosylerte proteiner (f.eks. glycosylert, rekombinant humanerythropoietin) kjent for å være substrater for glycosidasene, for å verifisere at de anvendte glycosidaseenzymer var aktive; og inkubasjon med glycosidaser, men ikke noe substrat, for å bedømme hvor glycosidasepreparatene bidro til eller svekket de visualiserte gelbånd (figur 39, feltene 8 og 9).

Det kan trekkes en rekke konklusjoner fra forsøkene beskrevet ovenfor. De forskjellige behandlingene med N-glycanase [som fjerner både kompleks- og N-bundet carbohydrat med høyt mannosemnhold (Tarentmo et al., Biochemistry 2A, s. 4665-4671 (1988)], neuraminidase (som fjerner sialinsyrerester), og 0-glycanase [som fjerner visse 0-bundne carbohydrater (Lambin et al., Biochem. Soc. Trans.

12, s. 599-600 (1984)], tyder på at: både N-bundne og O-bundne carbohydrater er til stede; og sialmsyre er til stede, idet minst noe av den er en del av de 0-bundne rester. Det faktum at behandling med N-glycanase kan omdanne det heterogene materiale som kommer til syne ved hjelp av SDS-PAGE

til en hurtigere migrerende form som er mye mer homogen, indikerer at alt materiale utgjør det samme polypeptid, idet heterogeniteten forårsakes hovedsakelig av heterogenitet i glycosy lermg.

Eksempel 12

Fremstilling av rekombinant SCF1~ 164PEG

Rotte-SCF<1>"<164>, renset fra et rekombinant E. coli ekspresjonssystem ifølge eksemplene 6A og 10, ble brukt som utgangsmateriale for polyethylenglycolmodifikasjon beskrevet nedenunder.

Methoxypolyethylenglycol-succinimidylsuccinat

{18,1 mg = 3,63<p>mol; SS-MPEG = Sigma Chemical Co. nr.

M3152, omtrentlig molekylvekt = 5.000) i 0,327 ml avionisert vann ble tilsatt til 13,3 mg (0,727 pmol) rekombinant rotte-SCF<1-164>i 1,0 ml 138 mM nariumfosfat, 62 mM NaCl, 0,62 mM natriumacetat, pH 8,0. Den resulterende oppløsning ble rystet forsiktig (100 rpm) ved værelsetemperatur i 30 minutter. En 1,0 ml aliquot av sluttreaksjonsblandingen (10 mg protein) ble så tilført til en Pharmacia "Superdex 75"-gelf lltrermgs-kolonne (1,6 x 50 cm) og eluert med 100 mM natriumfosfat,

pH 6,9, ved en hastighet på 0,25 ml/minutt ved værelsetemperatur. De første 10 ml kolonneeffluent ble kastet, og fraksjoner å 1,0 ml ble deretter samlet opp. UV-absorbansen

(280 nm) til kolonneeffluenten ble overvåket kontinuerlig og er vist i figur 40A. Fraksjonene nr. 25-27 ble slått sammen og sterilisert ved ultrafiltrering gjennom en 0,2 pm polysul-fonmembran (Gelman Sciences nr. 4454), og den resulterende blanding ble betegnet PEG-25. Likeledes ble fraksjonene nr. 28-32 slått sammen, sterilisert ved ultrafiltrering og betegnet PEG-32. Sammenslått fraksjon PEG-25 inneholdt 3,06 mg protein, og sammenslått fraksjon PEG-32 inneholdt 3,55 mg protein, beregnet ut fra A280-målmger ved bruk av en absorbans på 0,66 for en 1,0 mg/ml oppløsning av umodifisert rotte-SCF<1-164>for kalibrering. Uomsatt rotte-SCF<1-164>som utgjør 11,8% av totalproteinet i reaksjonsblandingen, ble eluert i fraksjonene nr. 34-37. Under lignende kromatografiske betingelser ble umodifisert rotte-SCF<1-164>eluert som en hovedtopp med et retensjonsvolum på 45,6 ml, figur 40B. Fraksjonene nr. 77-80 i figur 40A inneholdt N-hydroxy-succinimid, et biprodukt fra reaksjonen mellom rotte-SCF1 164 og SS-MPEG.

Potensielt reaktive ammogrupper i rotte-SCF1 164 omfatter 12 lysmrester og alfa-aminogruppen i N-ende-glutaminresten. Sammenslått fraksjon PEG-25 inneholdt 9,3 mol reaktive ammogrupper pr. mol protein, bestemt ved hjelp av spektroskopisk titrering med trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) under anvendelse av metoden beskrevet av Habeeb, Anal. Biochem., _14, s. 328-336 (1966). Likeledes inneholdt sammenslått fraksjon PEG-32 10,4 mol, og umodifisert rotte-SCF<1>"164 inneholdt 13,7 mol reaktive ammogrupper pr. mol protein.

Et gjennomsnitt på 3,3 (13,7 minus 10,4) ammogrupper i rotte-SCF<1>"<164>i sammenslått fraksjon PEG-32 ble således modifisert ved omsetning med SS-MPEG. Likeledes var et gjennomsnitt på 4,4 ammogrupper av rotte-SCF1 164 i sammenslått fraksjon PEG-25 modifisert. Human-SCF (hSCF<1>"<164>) fremstilt som i eksempel 10, ble også modifisert ved å bruke fremgangsmåtene angitt ovenfor. Nærmere bestemt ble 714 mg (38,5 pmol) hSCF<1>"<164>omsatt med 962,5 mg (192,5 pmol) SS-MPEG i 75 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8,0, i 30 minutter ved værelsetemperatur. Reaksjonsblandingen ble til-ført til en "Sephacryl S-200HR"-kolonne (5 x 134 cm) og eluert med PBS (Gibco Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning uten CaCl2og MgCl2) ved en hastighet på 102 ml/time, og 14,3 ml fraksjoner ble samlet opp. Fraksjonene nr. 39-53, analogt med PEG-25-blandingen beskrevet ovenfor og i figur 40A, ble slått sammen og funnet å inneholde i alt 354 mg protein. In vivo aktivitet av denne modifiserte SCF i primater er vist i eksempel 8c.

Eksempel 13

SCF- reseptorekspresjon på leukemiske blastceller

Leukemiske blastceller ble innhøstet fra det perifere blod hos en pasient med en blandingsleukemi. Cellene ble renset ved densitetgradientsentrifugering og adherens-uttømmmg. Human-SCF<1>"<164>ble jodert i henhold til fremgangsmåten i eksempel 7. Cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner jodert SCF som beskrevet [Broudy,

Blood, 75, s. 1622-1626 (1990)]. Resultatene av reseptor-bmdmgsforsøket er vist i figur 41. Den anslåtte reseptor-tetthet er omtrent 70.000 reseptorer/celle.

Eksempel 14

Rotte- SCF- aktivitet på tidlige lymfoidforløpere

Evnen til rekombinant rotte-SCF<1>"<164>(rrSCF<1-164>) når det gjelder å virke synergistisk med IL-7 for å øke lymfoidcelleproliferasjon, ble undersøkt i agarkulturer av musebenmarg. Ved denne analysen inneholdt kolonier dannet med rrSCF<1-164>alene, monocytter, neutrofiler og blastceller, mens koloniene stimulert ved hjelp av IL-7 alene eller i kombinasjon med rrSCF1~''"64, inneholdt hovedsakelig pre-B-celler. Pre-B-celler,karakterisertsom B220<+>, sig , cu+, ble identifisert ved hjelp av FACS-analyse av sammenslåtte celler under anvendelse av fluorescensmerkede antistoffer mot B220-antigenet [Coffman, Immunol. Rev., j>9, s. 5 (1982)] og mot overflate-Ig (FITC-geit-anti-K, Southern Biotechnology Assoc, Birmingham, AL); og ved analyse av cytospinn-objektglass med hensyn på cytoplasmisk u-ekspresjon under anvendelse av fluorescensmerkede antistoffer (TRITC-geit-anti-u, Southern Biotechnology Assoc). Rekombinant human-IL-7 (rhIL-7) ble erholdt fra Biosource International (Westlake Village, CA). Når rrSCF<1>"<164>ble tilsatt i kombinasjon med pre-B-cellevekstfaktor IL-7, ble det iakttatt en synergistisk økning i kolonidannelse (tabell 16), noe som indikerer en stimulerende rolle av rrSCF1 164 på tidlige B-celleforløpere.

Eksempel 15

Identifikasjon av reseptoren for SCF

A. c- kit er reseptoren for SCF1 164

For å teste hvorvidt SCF<1>"<164>er liganden for c-kit, ble cDNA for den hele, munne c-kit [Qiu et al., EMBO J., 7, s. 1003-1011 (1988)] amplifisert under anvendelse av

PCR fra den SCF<1-164->responsive mastcelielinje MC/9 [Nabel

et al., Nature, 291, s. 332-334 (1981)] med primere utformet fra den publiserte sekvens. Ligandbindingen og transmembran-doménene til human-c-kit, kodet for ved hjelp av aminosyrene 1-549 [Yarden et al.,EMBO J., 6, s. 3341-3351 (1987)], ble klonet under anvendelse av lignende teknikker fra human-erythroleukemicellelinjen HEL [Martin og Papayannopoulou, Science, 216, s. 1233-1235 (1982)]. c-kit-cDNA-ene ble inn-føyd i pattedyrekspresjonsvektoren V19.8 transfisert inn i COS-l-celler, og membranfraksjoner fremstilt for bindmgs-analyser under anvendelse av enten rotte- eller human- I-SCF<6>ifølge fremgangsmåtene beskrevet i avsnittene B og C nedenunder. Tabell 17 viser dataene fra en typisk bindmgsanalyse. Det var ingen påvisbar, spesifikk binding av<125>I-human-SCF<1-164>til COS-l-celler transfisert med V19.8 alene. COS-l-celler som uttrykker human, rekombinant c-kit-ligand-bindmg pluss transmembrandoméner (hckit-LTl), bandt imidlertid<125>I-hSCF<1-164>(tabell.17). Tilsetningen av et 200-gangers molart overskudd av umerket human-SCF<1><164>reduserte binding til bakgrunnsnivåer. På samme måte bandt COS-l-celler transfisert med det munne c-kit i full lengde (mckit-Ll) rotte-<125>I-SCF<1-164.>En liten mengde rotte-<125>I-SCF<1-164->binding ble påvist i COS-l-celler transfisert med V19.8 alene, og er også blitt observert i utransfiserte celler (ikke vist), noe som tyder på at COS-l-celler uttrykker endogent c-kit. Dette funn er i overensstemmelse med den brede, cellulære fordeling av c-kit-ekspresjon. Rotte-<125>I-SCF<1_164>bindes likeledes til både human- og murin-c-kit, mens human-125I-SCF1 164 bindes med lavere aktivitet til murin-c-kit (tabell 17). Disse data er i overensstemmelse med mønsteret for SCF1 164-kryss-reaktivitet mellom arter. Rotte-SCF1 164 induserer proliferasjon av human benmarg med en spesifikk aktivitet som er lik den spesifikke aktivitet til human-SCF1 16^, mens human-SCF1 164-indusert proliferasjon av munne mastceller opptrer med en spesifikk aktivitet som er 800 ganger mindre enn rotteproteinet.

Tilsammen bekrefter disse funn at de fenotypiske abnormaliteter som uttrykkes ved hjelp av W- eller Sl-mutant-mus, er følgene av primærdefekter i c-kit-reseptor/ligand-mteraksjoner som er kritiske for utviklingen av uensartede celletyper.

B. Rekombinant c- kit- ekspresjon i COS- l- celler

Human- og murin-c-kit-cDNA-kloner ble utvunnet ved bruk av PCR-tekmkker [Saiki et al., Science, 239, s. 487-491

(1988)] fra total-RNA isolert ved hjelp av en sur fenol/kloroform-ekstraksjonsfremgangsmåte [Chomczynsky og Sacchi, Anal. Biochem., 162, s. 156-159 (1987)] fra hhv. human-erythroleukemi-cellelmjen HEL og MC/9-celler. Unike sekvensoligonukleotider ble utformet fra de publiserte human-og murin-c-kit-sekvenser. Førstetråds-cDNA ble syntetisert fra den totale RNA ifølge fremgangsmåten inngitt sammen med enzymet, Mo-MLV-reverstranskripsjon (Bethesda Research Laboratories, Bethesda,MD), under anvendelse av c-kit-antisense-oligonukleotider som primere. Amplifikasjon av overlappingsområder i c-kit-ligandbindingen og tyrosmkinase-doménene ble utført under anvendelse av passende par av c-kit-primere. Disse områdene ble klonet inn i pattedyrekspresjonsvektoren V19.8 (figur 17) for ekspresjon i COS-l-celler. DNA-sekvenser ing av flere kloner avslørte uavhengige mutasjoner som sannsynligvis oppsto under PCR-amplifikasjon, i hver klon. En klon fri for disse mutasjonene, ble konstruert ved ny-sammensetning av mutasjonsfrie restriksjonsfragmenter fra separate kloner. Noen forskjeller fra den publiserte sekvens fremkom i alle eller i ca. halvparten av klonene; det ble kon-kludert med at disse var de faktiske sekvenser som var til stede i de anvendte cellelinjer og kan utgjøre allelfor-skjeller fra de publiserte sekvenser. De følgende plasmider ble konstruert i V19.8: V19.8:mckit-LTl, det hele murin-c-kit; og V19.8:hckit-Ll, inneholdende ligandbindingen pluss trans-membranområde (aminosyrene 1-549) i human-c-kit. Plasmidene ble transfisert mn i COS-l-celler hovedsakelig som beskrevet i eksempel 4.

C. 125I- SCF1"" 164- binding til COS- l- celler som uttrykker rekombinant- c- kit

To dager etter transfeksjon ble COS-l-cellene skrapet bort fra platen, vasket i PBS og nedfryst inntil bruk. Etter opptining ble cellene på nytt oppslemmet i 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2inneholdende 1 mM PMSF, 100 ug/ml aprotinin, 25 ug/ml leupeptin, 2 ug/ml pepstatin og 200 ug/ml TLCK-HCl. Suspensjonen ble dispergert ved pipettering og

ned 5 ganger, inkubert på is i 15 minutter, og cellene ble homogenisert med 15-20 slag i en "Dounce"-homogenisator. Sucrose (250 mM) ble tilsatt til homogenatet, og kjernefrak-sjonen og gjenværende, ikke-oppbrutte celler ble pelletert ved sentrifugermg ved 500 x g i 5 minutter. Supernatanten ble sentrifugert ved 25.000 g i 30 minutter ved 4°C for å pelletere den gjenværende cellerest. Human- og rotte-

SCF1 164 ble radiojodert under anvendelse av kloramin-T

[Hunter og Greenwood, Nature, 194, s. 495-496 (1962)]. COS-l-membranfraksjoner ble inkubert med enten human- eller rotte-1<25>I-SCF<1-164>(1,6 nM) med eller uten et 200-gangers molart overskudd av umerket SCF<1>"<164>i bmdingsbuffer bestående av RPMI supplert med 1% bovint serumalbumm og 50 mM HEPES (pH 7,4) i 1 time ved 22°C. Ved avslutningen av bmd-mgsmkubasjonen ble membranpreparatene forsiktig belagt på 150 ul fthalatolje og sentrifugert i 20 minutter i en "Beckman Microfuge 11" for å skille membranbundet<125>I-SCF<1-164>fra fri<125>I-SCF<1-164>. Pelletene ble klippet bort, og membranbundet<125>I-SCF<1-164>ble kvantifisert.

Eksempel 16

Isolering av en human- SCF- cDNA

A. Konstruksjon av HT- 1080- cDNA- biblioteket

Total-RNA ble isolert fra human-flbrosarcom-cellelinje HT-1080 (ATCC CCL 121) ved den sure guanidin-thio-cyanat-fenol-kloroform-ekstraksjonsmetoden [Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, s. 156 (1987)], og poly(A)-RNA ble utvunnet ved å bruke oligo(dT)-spinnkolonne levert fra Clontech. Dobbelttrådet cDNA ble fremstilt fra 2 pg poly(A)-RNA med et BRL (Bethesda Research Laboratory) cDNA-syntesesett under betingelser anbefalt av leverandøren. Omtrent 100 ng kolonnefraksjonert, dobbelttrådet cDNA med en gjennomsnittlig størrelse på 2 kb ble ligert til 300 ng Sall/Notl-oppløst vektor pSPORT 1 [D'Alessio et al., Focus, 12» s- 47-50

(1990)] og transformert inn i DH5a-(BRL, Bethesda, MD) celler ved hjelp av elektroporasjon [Dower et al., Nucl. Acids Res., 16, s. 6127-6145 (1988)].

B. Screening av cDNA- biblioteket

Omtrent 2,2 x 10<5>primærtransformanter ble oppdelt i 44 puljer som hver inneholdt~>5.000 individuelle kloner. Plasmid-DNA ble fremstilt fra hver pulje ved hjelp av CTAB-DNA-utfellingsmetoden som beskrevet [Del Sal et al., Biotechniques, 2, s. 514-519 (1989)]. 2 mikrogram av hver plasmid-DNA-pulje ble oppløst med restriksjonsenzym Noti og separert ved hjelp av gelelektroforese. Linearisert DNA ble overført på "GeneScreen Plus"-membran (DuPont) og hybridisert med<32>P-merket PCR-generert human-SCF-cDNA (eksempel 3) under betingelser som er beskrevet tidligere [Lm et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, s. 7580-7584 (1985)]. Tre puljer inneholdende positivt signal, ble identifisert fra hybridiseringen. Disse puljene av kolonier ble på nytt screenet ved hjelp av kolonihybridiseringsfremgangsmåten [Lin et al.,

Gene, 4_4, s. 201-209 (1986)] inntil en enkel koloni ble erholdt fra hver pulje. cDNA-størrelsene til disse tre isolerte klonene er mellom 5,0 og 5,4 kb. Restriksjonsenzymoppløs-ninger og nukleotidsekvensbestemmelse i 5'-enden indikerer at to av de tre klonene er identiske (10-la og 21-7a).

Begge inneholder det kodende område og omtrent 200 bp av 5'-utranslatert område (5'UTR). Den tredje klon (26-la) er omtrent 400 bp kortere i 5'-enden enn de to andre klonene. Sekvensen til denne human-SCF-cDNA er vist i figur 42. Særlig verdt å legge merke til er den hydrofobe transmembrandoméne-sekvens som starter i området til aminosyrene 186-190 og ender i aminosyre 212.

C. Konstruksjon av pDSRoc2- hSCF1~ 248

pDSRa2-hSCF<1-248>ble generert under anvendelse av plasmider 10-la (som beskrevet i eksempel 16B) og pGEM3-hSCF<1>"<1>64 som følger: Hindlll-innføyelsen fra pGEM3-hSCF<1>-164ble overført til M13mpl8. Nukleotidene umiddelbart oppstrøms fra ATG-initiermgskodonet ble endret ved stedrettet muta-genese fra tttccttATG til gccgccgccATG under anvendelse av antisense-oligonukleotidet

5'-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3'

og det oligonukleotid-rettede in vitro mutagenesesystemsett og fremgangsmåter fra Amersham Corp. for å frembringe M13mpl8-hSCF<K1>~164.Denne DNA ble oppløst med Hindlll og innføyd i pDSRa2 som var blitt oppløst med Hindlll. Denne klonen er betegnet pDSRa2-hSCF<K1>"<164>. DNA fra pDSRa2-

hSCFK1 164 ble oppløst med Xbal og DNA-en gjort buttendet ved tilsetning av Klenow-enzym og fire dNTP-er. Etter avslutning av denne reaksjonen ble DNA-en videre oppløst med enzymet Spel. Klon 10-la ble oppløst med Dral for å frembringe en buttende 3' i forhold til den åpne leseramme i innføyelsen og med Spel som kutter på det samme sted i genet i både pDSRa2-hSCFK1~164 og 10-la. Disse DNA-ene ble ligert sammen, hvorved pDSRot2-hSCF^ ° ble frembrakt.

D. Transfeksjon og immunoutfelling av COS- celler med pDSRa2- hSCFK1~ 248- DNA

C0S-7- (ATCC CRL 1651) celler ble transfisert med DNA konstruert som beskrevet ovenfor. 4 x lo6 celler i

0,8 ml DMEM + 5% FBS ble elektroporert ved 1600 V med enten 10 ug pDSRa2-hSCFK1-248-DNA eller 10 ug pDSRa2-vektor-DNA (vektorkontroll). Etter elektroporasjon ble celler på nytt utplatet i to 60-mm skåler. Etter 24 timer ble mediet erstattet med nytt, fullstendig medium.

72 timer etter transfeksjon ble hver skål merket

med<35>S-medium ifølge en modifikasjon av fremgangsmåten til Yarden et al. (PNAS, jT7, s. 2569-2573, 1990). Celler ble vasket én gang med PBS og så inkubert med methionin-fri, cystem-fri DMEM (met~cys~DMEM) i 30 minutter. Mediet ble fjernet, og 1 ml met~cys~ DMEM inneholdende 10O uCi/ml "Tran<35>S-Label" (ICN) ble tilsatt til hver skål. Celler ble inkubert ved 37°C i 8 timer. Mediet ble mnhøstet, klaret ved sentrifugering for å fjerne cellerest og nedfryst ved -20°C.

Aliquoter av merket, kondisjonert medium av COS/pDSRa2-hSCF<K1>~<2>48 og C0S/pDSRa2-vektorkontroll ble immunologisk utfelt sammen med mediumprøver av<35>S-merkede celler av CHO/pDSRa2-hSCF<1_164->klon 17 (se eksempel 5) ifølge en modifikasjon av fremgangsmåten til Yarden et al. (EMBO, J., 6, s. 3341-3351, 1987). 1 ml av hver prøve av kondisjonert medium ble behandlet med 10 ul pre-immun-kaninserum

(nr. 1379 P.I.). Prøver ble inkubert i 5 timer ved 4°C.

100 mikroliter av en 10% suspensjon av Staphylococcus aureus

("Pansorbin", Calbiochem.) i 0,15 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,2% "Triton X-100", ble tilsatt til hvert rør. Prøver ble inkubert i ytterligere 1 time ved 4°C. Immunkomplekser ble pelletert ved sentrifugering ved 13.000 x g i 5 minutter. Supernatanter ble overført til nye rør og inkubert med 5 pl kanin-polyklonal-antiserum (nr. 1381 TB4), renset som i eksempel 11, mot CHO-utvunnet hSCF1-162 over natten ved 4°C.

100 pl "Pansorbin" ble tilsatt i 1 time, og immunkomplekser ble pelletert som tidligere. Pellets ble vasket lx med lyse-buffer (0,5% Na-deoxycholat, 0,5% NP-40, 50 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 8), 3x med vaskebuffer (0,5 M NaCl, 20 mM Tris,

pH 7,5, 0,2% "Triton X-100"), og lx med 20 mM Tris, pH 7,5. Pellets ble på nytt oppslemmet i 50 pl 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1% SDS, 0,1 M (3-mercaptoethanol. SCF-protein ble eluert ved koking i 5 minutter. Prøver ble sentrifugert ved 13.000 x g i 5 minutter, og supernatanter ble utvunnet.

Behandling med glycosidaser ble utført på følgende måte: 3 pl 75 mM CHAPS inneholdende 1,6 mU O-glycanase,

0,5 U N-glycanase og 0,02 U neuraminidase ble tilsatt til 25 pl immunkompleksprøver og inkubert i 3 timer ved 37°C. Et likt volum med 2xPAGE-prøvebuffer ble tilsatt, og prøver ble kokt i 3 minutter. Oppløste og uppløste prøver ble elektroforesebehandlet på en 15% SDS-polyacrylamid-reduserende gel over natten ved 8 mA. Gelen ble fiksert i methanol-eddiksyre, behandlet med "Enlightening enhancer" (NEN) i 30 minutter, tørket og eksponert mot 'Kodak XAR-5-film ved -70°C.

Figur 43 viser autoradiografiet av resultatene. Feltene 1 og 2 er prøver fra kontroll C0S/pDSRa2-kulturer,

Kl— 2 4 fl

feltene 3 og 4 fra C0S/pSRo2-hSCF Kl<-248>, feltene 5 og 6 fra CHO/pDSRa2-hSCF<1>"<164>. Feltene 1, 3 og 5 er uoppløste imraun-utfellinger; feltene 2, 4 og 6 er blitt oppløst med glycan-aser som beskrevet ovenfor. Posisjonene til molekylvekt-markørene er vist til venstre. Bearbeidelse av SCF i COS

Kl—2 4 8

transfisert med pDSRa2-hSCF Kl<->248, kommer nært opp til hSCF<1>"<164>utskilt fra CHO transfisert med pDSRa2-hSCF<1-164>, (eksempel 11). Dette tyder sterkt på at det naturlige, proteolytiske bearbeidelsessted som frigjør SCF fra cellen, er i nærheten av aminosyre 164.

Eksempel 17

Kvaternærstrukturanalyse av human- SCF

Etter kalibrering av gelfiltreringskolonnen (ACA 54) beskrevet i eksempel 1 for rensing av SCF fra BRL-cellemedium med molekylvektstandarder, og etter eluering av renset SCF fra andre kalibrerte gelflltreringskolonner, er det tydelig at SCF renset fra BRL-cellemedium, opptrer med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 70.000-90.000 i forhold til molekylvektstandardene. I motsetning til dette er den tilsynelatende molekylvekt ved SDS-PAGE omtrent 28.000-35.000. Selv om det er erkjent at glycosylerte proteiner kan opptre anomalt i slike analyser, tyder resultatene på at den BRL-utvundne rotte-SCF kan foreligge som ikke-kovalent bundet dimer under ikke-denaturerende betingelser. Lignende resultater gjelder for rekombinante SCF-former (f.eks. rotte- og human-SCF<1-164>utvunnet fra E. coli, rotte- og human-SCF<1-162>utvunnet fra CHO-celler) ved at molekylstørrelsen beregnet ved hjelp av gelfiltrering under ikke-denaturerende betingelser,

er omtrent to ganger den som beregnes ved gelfiltrering under denaturerende betingelser (dvs. tilstedeværelse av SDS), eller ved SDS-PAGE, i hvert enkelt tilfelle. Dessuten gir sedi-mentas jonshastighetsanalyse som gir en nøyaktig bestemmelse av molekylvekt i oppløsning, en verdi på ca. 36.000 for molekylvekt til E. coli-utvunnet, rekombinant human-SCF1 Denne verdien er igjen omtrent to ganger den som ses ved SDS-PAGE (~18.000-19.000). Selv om det er erkjent at det

kan være multiple, oligomere tilstander (inkludert den mono-mere tilstand), synes det derfor som om den dimere tilstand dominerer under noen omstendigheter i oppløsning.

Eksempel 18

Isolering av human- SCF- cDNA- kloner fra 5637- cellelmjen

A. Konstruksjon av 5637- cDNA- biblioteket

Total-RNA ble isolert fra human urinblærecarcmom-cellelinje 5637 (ATCC HTB-9) ved hjelp av den sure guanidimum-thiocyanat-fenol-kloroform-ekstråksjonsmetoden [Chomczynski

et al., Anal. Biochem, 162, s. 156 (1987)], og poly(A)-RNA

ble utvunnet ved anvendelse av en oligo (dT)-spmnkolonne levert fra Clontech.Dobbelttrådet cDNA ble fremstilt fra 2 ug poly(A)-RNA med et BRL-cDNA-syntesesett under betingelsene anbefalt av leverandøren. Omtrent 80 ng kolonnefraksjonert, dobbelttrådet cDNA med en gjennomsnittsstørrelse på 2 kb ble ligert til 300 ng Sall/Notl-oppløst vektor pSPORT 1 [D'Alessio et al., Focus, 12. > s* 47-50 (1990)] og transformert mn i DH5a-celler ved elektroporasjon [Dower et al., Nucl. Acids Res., 16, s. 6127-6145 (1988)].

B. Screening av cDNA- biblioteket

Omtrent 1,5 x 10<5>primærtransformanter ble oppdelt i 30 puljer som hver inneholdt omtrent 5.000 individuelle kloner. Plasmid-DNA ble fremstilt fra hver pulje ved CTAB-DNA-utfell-mgsmetoden som beskrevet [Del Sal et al., Biotechnigues,

1_, s. 514-519 (1989)]. 2 ug av hver plasmid-DNA-pulje ble oppløst med restriksjonsenzym Noti og separert ved hjelp av gelelektroforese. Linearisert DNA ble overført til

32 "GeneScreen Plus"-membran (DuPont) og hybridisert med P-merket, fullengde human-SCF-cDNA isolert fra HTl080-cellelinje (eksempel 16) under betingelsene som tidligere er beskrevet [Lm et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82,

s. 7580-7584 (1985)]. 7 puljer inneholdende positivt signal, ble identifisert fra hybridiseringen.Puljene med kolonier ble screenet på nytt med<32>P-merket PCR-generert human-SCF-cDNA (eksempel 3) ved hjelp av kolonihybridiseringsfremgangsmåten [Lin et al., Gene, 4_4, s. 201-209 (1986)] mntil det ble erholdt en enkel koloni fra fire av puljene. Innføyelses-størrelsene til fire isolerte kloner er omtrent 5,3 kb. Restriksjonsenzymoppløsninger og nukleotidsekvensanalyse av 5'-endene til klonene indikerer at de fire klonene er identiske. Sekvensen til denne human-cDNA er vist i figur 44. cDNA ifølge figur 44 koder for et polypeptid hvor aminosyrene 149-177 i sekvensene i figur 42 er erstattet med en enkel Gly-rest.

Eksempel 19

Fremstilling av monoklonale antistoffer mot SCF

8 uker gamle Balb/c-mus av hunnkjønn (Charles River,Wilmmgton, MA) ble injisert subkutant med 20 ug human-SCF<1>"<164>uttrykt fra E. coli i komplett Freunds adjuvans (H37-Ra; Difco Laboratories, Detroit,MI). Forsterknings-lmmuniseringer å 50 ug med det samme antigen i ukomplett Freunds adjuvans ble deretter administrert på dagene 14, 38

og 57. Tre dager etter den siste injeksjon ble 2 mus avlivet, og miltcellene deres ble smeltet sammen med sp 2/0-myelom-linjen ifølge fremgangsmåten beskrevet av Nowmski et al. , [Virology, 93, s. 111-116 (1979)].

De anvendte media for cellekultur av sp 2/0 og hybridom var Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), Gibco, Chagrin Falls, Ohio) supplert med 20% varmeinaktivert, bovint fosterserum (Phibro Chem., Fort Lee, NJ) , 110 mg/ml natriumpyruvat, 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (Gibco). Etter cellefusjon ble hybrider valgt ut i HAT--4

medium, mediet ovenfor inneholdende 10 M hypoxanthm, 4x10 —7 M aminopterin og 1,6x10 —5 M thymidin, i 2 uker og så dyrket i medier inneholdende hypoxanthin og thymidin i 2 uker.

Hybridomer ble screenet på følgende måte: Poly-styren-brønner (Costar, Cambridge, MA) ble sensibilisert med 0,25 ug human-SCF " (E. coli) i 50 ul 50 mM bicarbonat-buffer, pH 9,2, i 2 timer ved værelsetemperatur og så over natten ved 4°C. Plater ble så blokkert med 5%BSAi PBS i 30 minutter ved værelsetemperatur og så inkubert med hybridom-kul tur supe r na tant i 1 time ved 37°C. Oppløsningen ble dekantert og de bundne antistoffer inkubert med en 1:500 fortynning av geit-anti-mus-IgG konjugert med pepperrot-peroxydase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket med vaskeopp-løsnmg (KPL, Gaithersburg, MD) og så fremkalt med blanding av H202og ABTS (KPL). Kolorimetri ble utført ved 405 nm.

Hybridomcellekulturer som utskiller antistoff som 1 3 4

er spesifikt for human-SCF (E. coli), ble testet ved hjelp av ELISA, den samme som ved hybridomscreenings-

fremgangsmåter, med hensyn på kryssreaktiviteter overfor human-SCF<1>"<162>(CHO). Hybridomer ble subklonet ved begrenset fortynningsmetode. 55 brønner med hybridomsupernatant viste seg ved testen å vært sterkt positive overfor human-SCF<1-164>(E. coli); 9 av dem kryssreagerte med human-SCF<1-162>(CHO) .

Flere hybridomceller er blitt klonet på følgende måte:

Hybridomene 4G12-13 og 8H7A ble deponert ved ATCC 26. september 1990.

Claims

1 Polypeptid som har én eller flere av de in vitro biologiske aktiviteter til naturlig forekommende stamcellefaktor, inkludert hematopoetisk aktivitet, karakterisert vedat det har en del av eller hele aminosyresekvensen angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44

2 Polypeptid som har én av den naturlig forekommende human-stamcellefaktors biologiske egenskaper, inkludert hematopoetisk aktivitet, karakterisert vedat det har en del av eller hele sekundærkonformasjonen til naturlig forekommende stam-cellef aktor, og har deler av eller hele aminosyresekvensen angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44

3 Polypeptid med den hematopoetiske, biologiske aktivitet til naturlig forekommende stamcellefaktor, karakterisert vedat det har en aminosyresekvens som angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44, eller allelvarianter, derivater, deles]onsanaloger, substitusj ona-analoger eller addisjonsanaloger derav med den samme biologiske aktivitet

4 Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av SCF<1>"<148>, SCF<1*162>, SCF1"164, SCF1"165, SCF<1>"<183>, (figur 15C) , SCF<1>"<185>, SCF1*188,SCF<1>"<189>og SCF<1>"<2>4<8>(figur 42) og SCF<1>"<1>57,SCF<1>"160, SCF<1>"<161>og SCF<1>"<220>(figur 44)

5 Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av [Met"1] SCF1-148, [Met<->^SCF<1>"<162>, [Met"1] SCF1"164, [Met"1]-SCF1"165, [Met"1] SCF1"183, (figur 15C) , [Met"1] SCF1"185, [Met"1] SCF1"188, [Met"1] SCF1"189 og [Me<t>"<1>] SCF1"248 (figur 42) og [Met"1] SCF1"157, [Met"<1>] SCF1"160, [Met"1] SCF<1>"<161>og [Met"<1>] SCF1"220(figur 44)

6 Antistoff, karakterisert vedat det binder stamcellefaktor ifølge kravene 1-3 spesifikt

7 Antistoff ifølge krav 6, karakterisert vedat antistoffet er et monoklonalt antistoff

8 Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert vedat prokaryote eller eukaryote vertsceller transformert eller transfektert med en DNA-sekvens som angitt i figur 15C, figur 42 eller figur 44, dyrkes under egnede nærmgsbetingelser, og polypeptidet isoleres