FI108140B - Menetelmä ja välineitä kantasolutekijän valmistamiseksi, valmistetun tuotteen käyttö, sitä sisältävä tarvikepakkaus sekä menetelmä kantasolutekijän vasta-aineen valmistamiseksi - Google Patents

Description

108140

Menetelmä ja välineitä kantasolutekijän valmistamiseksi, valmistetun tuotteen käyttö, sitä sisältävä tarvikepakkaus sekä menetelmä kantasolutekijän vasta-aineen valmistamiseksi 5

Esillä oleva keksintö koskee yleensä ottaen menetelmää uusien tekijöiden, jotka stimuloivat alkukantaisia kantaisäsoluja mukaan lukien varhaiset veren muodostumiseen liittyvät (eli hematopoieettiset) kantaisäsolut, sekä 10 tällaisia tekijöitä koodittavia DNA-sekvenssejä. Erityisesti keksintö koskee menetelmää polypeptidin tuot-( tamiseksi, jolla on kuviossa 14C, kuviossa 15C, kuviossa 42 tai kuviossa 44 esitetty koko primaarirakenne tai osa siitä, ja luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän hema-15 topoieettinen biologinen ominaisuus, sekä menetelmää po-lypeptidiä sisältävän farmaseuttisen koostumuksen val-mistmiseksi. Keksintö koskee myös polypeptidin ilmentämiseksi käytettäviä DNA-sekvenssejä, plasmideja tai virus-DNA-vektoreita ja isäntäsoluja. Keksintö koskee lisäksi 20 polypeptidiä sisältävää tarvikepakkausta sekä menetelmää solujen transfektoimiseksi ja hematopoieettisten solujen viljelemiseksi in vitro. Myös menetelmät polypeptidin vastaisten vasta-aineiden valmistamiseksi kuuluvat keksintöön .

( 25 Keksinnön tausta

Ihmisen verenmuodostus- (hematopoieettinen) systeemi koostuu erilaisista valkoisista verisoluista (mukaan lukien neutrofiilit, makrofagit, basofiilit, syöttösolut, eosinofiilit, T- ja B-solut), punaisista verisoluista (pu-30 nasolut) sekä hyytymän muodostavista soluista (suuret luu- . ydinsolut, verihiutaleet).

Arvellaan, että pienet määrät tiettyjä hematopoi-eettisia kasvutekijöitä vastaavat pienen lukumäärän "kan-tasoluja" differentiaatiosta erilaisiksi verisolukanta- 35 isäsoluiksi, näiden solujen valtavasta lisääntymisestä sekä kypsien verisolujen lopullisesta differentiaatiosta näistä solulinjoista. Hematopoieettinen uudistumissysteemi toimii hyvin normaaleissa olosuhteissa. Kuitenkin kun sitä 108140 2 rasittavat kemoterapia, säteily tai luontaiset selkäytimen vajaakehittyneisyyteen liittyvät häiriötilat, seuraa aikajakso, jona potilaita rasittaa vakavasti valkosolujen vähäisyys veressä, he ovat vakavasti aneemisia, tai heitä 5 rasittaa vakavasti verihiutaleiden niukkuus veressä. Hema-topoieettisten kasvutekijöiden kehitys ja käyttö kiihdyttävät luuytimen uudistumista tämän vaarallisen vaiheen kestäessä.

Tietyissä viraalisesti indusoiduissa häiriötilois-10 sa, kuten immuunikadossa (aids), saattaa spesifisesti tuhoutua veriaineksia kuten T-soluja. T-solutuotannon lisääminen saattaa olla terapeuttista tällaisissa tapauk- ) sissa.

Koska hematopoieettisia kasvutekijöitä esiintyy 15 äärimmäisen pieninä määrinä, näiden tekijöiden toteamisessa ja tunnistuksessa on luotettu sarjaan määrityksiä, jotka toistaiseksi vain erottavat eri tekijät toisistaan stimuloivien vaikutusten viljeltyihin soluihin perusteella keinotekoisissa olosuhteissa.

2 0 Yhdistelmä-DNA-geneettisten tekniikoiden soveltami nen on lisännyt yksittäisten kasvutekijöiden biologisten aktiivisuuksien ymmärtämistä. Esimerkiksi on saatu aminohappo- ja DNA-sekvenssit ihmisen erytropoietiinille (EPO), joka stimuloi punasolujen tuotantoa. (Katso Lin, US-pa-: 25 tenttijulkaisu 4 703 008, joka sisällytetään täten viit- ) teeksi). Yhdistelmä-DNA-menetelmiä on samoin sovellettu cDNA:n eristykseen ihmisen jyvässolupesäkkeitä stimuloivalle tekijälle, G-CSF:lle (katso Souza, US-patenttijulkaisu 4 810 643, joka täten sisällytetään viitteeksi),

30 sekä ihmisen jyvässolu-makrofagipesäkkeitä stimuloivalle .· tekijälle (GM-CSF) [Lee, et ai. , Proc.Natl.Acad.Sei. USA

82 (1985) 4360 - 4364; Wong, et ai. . Science 228 (1985) 810 - 814], hiiren G- ja GM-CSF:lle [Yokota, et ai. .

Proc.Natl.Acad.Sei. USA 81 (1984) 1070; Fung, et ai.. Na-35 ture 307 (1984) 233; Gough, et aL, Nature 309 (1984) 763] , sekä ihmisen makrofagipesäkkeitä stimuloivalle tekijälle (CSF-1) [Kawasaki, et ai. . Science 230 (1985) 291] .

108140 3 Määrityssysteemit, joissa määritetään runsaasti lisääntyviä, mahdollisen pesäkkeen muodostavia soluja (HPP-CFC-määrityssysteemit), testaavat tekijöiden vaikutusta varhaisiin hematopoieettisiin kantaisäsoluihin 5 [Zont, J.Exp.Med. 159 (1984) 679 - 690]. Kirjallisuudesta löytyy lukuisia raportteja tekijöistä, jotka ovat aktiivisia HPP-CFC-määrityksessä. Näiden tekijöiden lähteet on mainittu taulukossa 1. Parhaiten karakterisoituja tekijöitä käsitellään alla.

10 Eräs aktiivisuus ihmispernalla käsitellyssä kasvu alustassa on nimetty synergistiseksi tekijäksi (SF). Useat ( ihmiskudokset sekä ihmisen ja hiiren solulinjat tuottavat SF:ää, jota kutsutaan SF-l:ksi, jolla on synergistinen vaikutus CSF-l:n kanssa varhaisimman HPP-CFC:n stimuloin-15 nissa. SF-l:stä on raportoitu kasvualustassa, jota on käsitelty ihmisen pernasoluilla, ihmisen istukkasoluilla, 5637-soluilla (rakkosyöpäsolulinja), ja EMT-6-soluilla (hiiren rintasyöpäsolulinja). SF-l:n identiteetti on toistaiseksi määrittämättä. Alustavat raportit osoittavat 20 interleukiini-l:n limittyviä aktiivisuuksia SF-l:n solu-linjasta 5637 kanssa [Zsebo et ai., Blood 71 (1988) 962 -968]. Kuitenkin lisäraportit ovat osoittaneet, että inter-leukiini-l:n (IL-l:n) ja CSF-l:n yhdistelmä ei kykene sti-^ muloimaan samaa pesäkemuodostusta kuin mikä voidaan saada : 25 CSF-l:n ja osittain puhdistettujen valmisteiden 5637:llä käsitellystä kasvualustasta kanssa (McNiece, Blood 73 (1989) 919].

Raskaana olevan hiiren kohdu-uutteessa läsnä oleva synergistinen tekijä on CSF-1. WEHI-3-solut (hiiren mye-30 lomonosyyttileukemiasolulinja) tuottaa synergististä te- .* kijää, joka vaikuttaa IL-3:en kanssa identtiseltä. Sekä CSF-1 että IL-3 stimuloivat hematopoieettisia kantaisäso-luja, jotka ovat kypsempiä kuin SF-l:n kohde.

Toisen synergistisen tekijäluokan on osoitettu 35 olevan läsnä TC-l-soluilla (luuytimestä peräisin olevia 4 108140 peruskudossoluja) käsitellyssä kasvualustassa. Tämä solu-linja tuottaa tekijää, joka stimuloi sekä varhaisia ydin-että imukudossolutyyppejä. Se on nimetty hemolymfopoieet-tiseksi kasvutekijä-l:ksi (HLGF-1). Sen näennäinen mole-5 kyylipaino on 120 000 [McNiece et ai., Exp♦ Hematol. 16 (1988) 383].

Tunnetuista interleukiineista ja CSFristä IL-l:llä, IL-3:lla ja CSF-l:llä on tunnistettu olevan aktiivisuutta HPP-CFC-määrityksessä. Muita synergistisen aktiivisuuden 10 lähteitä, jotka mainitaan taulukossa 1, ei ole rakenteellisesti tunnistettu. Polypeptidisekvenssin ja biologisen aktiivisuuden profiilin nojalla esillä oleva keksintö kos- ) kee molekyyliä, joka poikkeaa IL-l:stä, IL-3:sta, CSF-l:stä ja SF-l:stä.

15 .) « 108140 5

Taulukko 1

Valmisteita, jotka sisältävät HPP-CFC-määrityksessä aktiivisia tekijöitä 5 Lähde1 Viite

Ihmisperna-CM [Kriegler, Blood 60 (1982) 503]

Hiiriperna-CM [Bradley, Exp.Hematol.Today,

Baum, toim., 285 (1980)] 10 Rottaperna-CM [Bradley, supra, (1980)]

Hiirikeuhko-CM [Bradley, supra, (1980)] ( Ihmisistukka-CM [Kriegler, supra, (1982)]

Raskaana olevan hiiren kohtu [Bradley, supra, (1980)] 15 GTC-C-CM [Bradley, supra, (1980)] RH3-CM [Bradley, supra, (1980)] PHA-PBL [Bradley, supra, (1980)] WEHI-3B-CM [McNiece, Cell Biol.Int.Rep. 6 (1982) 243] 20 EMT-6-CM [McNiece, Exp.Hematol. 15 (1987) 854] L-solu-CM [Kriegler, Exp.Hematol. 12 (1984) 844] 5637-CM [Stanley, Cell 45 (1986) 667] ' ; 25 TC-l-CM [Song, Blood 66 (1985) 273] 1 CM = käsitelty kasvualusta

Kun proteiineja annetaan ruoansulatuskanavan ulko-30 puolisesti, ne poistuvat usein nopeasti verenkierrosta ja voivat siksi synnyttää suhteellisen lyhytaikaisen farmakologisen aktiivisuuden. Tästä seurauksena tarvitaan mahdollisesti taajaan toistuvia ruiskeita bioaktiivisia proteiineja suhteellisen suurina annoksina terapeuttisen te-35 hon ylläpitämiseksi. Proteiineilla, joita on modifioitu 6 108140 kiinnittämällä niihin kovalenttisesti vesiliukoisia polymeerejä kuten polyetyleeniglykoli, polyetyleeniglykolin ja polypropyleeniglykolin kopolymeerit, karboksimetyylisel-luloosa, dekstraani, polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyr-5 rolidoni tai polyproliini, tiedetään olevan vastaaviin ei-modifioituihin proteiineihin nähden oleellisesti pitempiä puoliintumisaikoja veressä laskimonsisäisenä ruiskeena annettuina [Abuchowski et ai., kirjassa "Enzymes as Drugs", Holcenberg et ai., toim., Wiley-Interscience, New 10 York, NY, 1981, ss. 367 - 383; Newmark et ai., J. Appi. -Biochem. 4 (1982) 185 - 189; ja Katre et ai., Proc.Natl.-Acad.Sei. USA 84 (1987) 1487 - 1491]. Tällaiset modifi- ) kaatiot saattavat niinikään lisätä proteiinin liukoisuutta vesiliuokseen, eliminoida aggregaatiota, tehostaa 15 proteiinin fysikaalista ja kemiallista stabiilisuutta sekä suuresti alentaa proteiinin immunogeenisyyttä ja antigee-nisyyttä. Tästä tuloksena haluttuun biologiseen aktiivisuuteen in vivo voidaan päästä antamalla tällaisia poly-meeri-proteiiniadditiotuotteita harvemmin tai alhaisempina 20 annoksina kuin ei-modifioitua proteiinia.

Polyetyleeniglykolin (PEG:n) kiinnittäminen proteiineihin on erityisen käyttökelpoista, koska PEG:n myrkyllisyys nisäkkäissä on hyvin alhainen [Carpenter et ai.,

Toxicol. Appi. Pharmacol. 18 (1971) 35 - 40]. Esimerkiksi , 25 adenosiinideaminaasin PEG-additiotuote hyväksyttiin Yhdys- ^ , valloissa käytettäväksi ihmisillä vakavan yhdistetyn im muunikato-oireyhtymän hoidossa. PEG konjugoimalla saavutettava toinen etu on, että vähennetään tehokkaasti heter-ologisten proteiinien immunogeenisyyttä ja antigeenisyyt-30 tä. Esimerkiksi ihmisproteiinin PEG-additiotuote saattaisi * olla käyttökelpoinen sairauden hoitamiseksi muissa nisä käslajeissa ilman vaaraa vakavan immuunivasteen laukaisemisesta.

Polymeerejä kuten PEGrtä voidaan kiinnittää käte-35 västi yhteen tai useampaan reaktiiviseen aminohappotäh- k 7 108140 teeseen proteiinissa, kuten aminopään aminohapon alfa-ami-noryhmä, lysiinisivuketjujen epsilon-aminoryhmät, kys-teiinisivuketjujen sulfhydryyliryhmät, aspartyyli- ja glutamyylisivuketjujen karboksyyliryhmät, karboksyylipään 5 aminohapon alfa-karboksyyliryhmä, tyrosiinisivuketjut, tai tiettyihin asparagiini-, seriini- tai treoniinitähteisiin kiinnitettyjen glykosyyliketjujen aktivoituihin johdannaisiin.

PEG:n lukuisia aktivoituja muotoja, jotka soveltu-10 vat suoraan reaktioon proteiinien kanssa, on kuvattu.

, Käyttökelpoisia PEG-reagensseja reaktioon proteiiniamino- ryhmien kanssa ovat karboksyylihappo- tai karbonaattijoh dannaisten aktiiviset esterit, erityisesti ne, joissa poistuvat ryhmät ovat N-hydroksisukkinimidejä, p-nitrofe-15 noleja, imidatsoleja tai l-hydroksi-2-nitrobentseeni-4- sulfonaatteja. PEG-johdannaiset, jotka sisältävät maleimi-do- tai halogeeniasetyyliryhmiä, ovat käyttökelpoisia rea-gensseja proteiinin vapaiden sulfhydryyliryhmien modifioi-miseksi. Samoin PEG-reagenssit, jotka sisältävät amino-, 20 hydratsiini- tai hydratsidiryhmiä, ovat käyttökelpoisia reaktioon aldehydien kanssa, jotka on muodostettu proteiinien hiilihydraattiryhmien perjodaattihapetuksella.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyt-^ töön tekijä, joka aikaansaa varhaisten hematopoieettisten 25 kantaisäsolujen kasvua.

Keksinnön yhteenveto

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän uusien tekijöiden valmistamiseksi, joita kutsutaan tässä "kantasolutekijöiksi" (SCP), jotka kykenevät stimuloimaan 30 alkukantaisten kantaisäsolujen, mukaan lukien varhaiset hematopoieettiset kantaisäsolut, kasvua. Nämä SCF:t ky- > · kenevät myös stimuloimaan ei-hematopoieettisia kantasoluja kuten hermokantasolut ja varhaiset sukusolukantasolut.

Tällaisia tekijöitä ovat puhdistetut luontaisesti esiinty-35 vät kantasolutekijät. Keksinnön mukaisesti voidaan valmis taa ei-luontaisesti esiintyviä polypeptidejä, joiden aminohapposekvenssit jäljittelevät riittävästi luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän sekvenssiä, jotta niillä on β 108'140 luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän heraatopoieettinen biologinen aktiivisuus. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 15 esitetään.

5 Esillä oleva keksintö antaa samoin käyttöön DNA- sekvenssejä käytettäviksi polypeptidituotteiden prokary-ootti- tai eukaryootti-isäntäsoluissa, jolla polypeptidi-tuotteella on luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän koko.primaarirakenne tai osa siitä ja luontaisesti esiin-10 tyvän kantasolutekijän hematopoieettinen biologinen ominaisuus. Keksinnön mukaisille DNA-sekvensseille on tunnusomaista, että se valitaan seuraavista: a) kuviossa 14B, kuviossa 14C, kuviossa 15B, kuviossa 15C, kuviossa 42 tai kuviossa 44 esitetyt sekvens- 15 sit, tai niihin nähden komplementaariset säikeet; b) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat kohdassa a) määriteltyihin DNA-sekvensseihin tai niiden fragment-teihin; ja c) DNA-sekvenssit, jotka poissulkien geneettisen 20 koodin degeneraattiluonne hybridisoituisivat kohdissa a) ja b) määriteltyihin DNA-sekvensseihin, ja jotka sekvenssit koodaavat polypeptidiä, jolla on samat aminohapposekvenssit .

Samoin annetaan käyttöön plasmideja tai virus-DNA-25 vektoreita, jotka sisältävät tällaisia DNA-sekvenssejä ) sekä prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsoluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu mainituilla DNA-sekvens-sillä siten, että isäntäsolu pystyy ilmentämään polypep-tidituotteen. Keksintöön kuuluu niinikään menetelmä farma-30 seuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää . SCF:ää ja jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaati muksessa 25 esitetään.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle hematopoieettis-ten solujen transfektoimiseksi ulkopuolisella DNA:11a on 35 tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 26 esitetään ja menetelmälle hematopoieettisten solujen viljelemiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 31 esitetään. Keksinnön mukaisen tarvikepakkauksen tunnusmerkit on 9 1QSH8 esitetty vaatimuksessa 27. Keksinnön mukaiselle menetelmälle vasta-aineen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 38 esitetään ja monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi se, mitä patenttivaatimukses-5 sa 39 esitetään.

Tässä kuvataan myös biologisesti aktiivista addi-tiotuotetta, jolla on aiempaa pitempi puoliintumisaika in vivo sekä tehostunut teho nisäkkäissä, ja joka käsittää SCF:n kovalenttisesti konjugoituna vesiliukoiseen polymee-10 riin kuten polyetyleeniglykoliin tai polyetyleeniglykolin ^ ja polypropyleeniglykolin kopolymeereihin, jolloin mainit tu polymeeri on ei-substituoitu tai substituoitu toisessa päässä alkyyliryhmällä. Esitetään edelleen menetelmä edellä kuvatun additiotuotteen valmistamiseksi, jonka menetel-15 män mukaan SCF saatetaan reagoimaan vesiliukoisen polymeerin kanssa, jossa on ainakin yksi reaktiivinen ryhmä päässä, ja saatu additiotuote puhdistetaan tuotteen saamiseksi, jolla on pidentynyt puoliintumisaika verenkierrossa sekä tehostunut biologinen aktiivisuus.

20 Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 on anioninvaihtokromatogrammi nisäkäs-SCF:n puhdistuksesta.

Kuvio 2 on geelisuodatuskromatogrammi nisäkäs-SCF:n ^ puhdistuksesta.

*. 25 Kuvio 3 on vehnänalkioagglutiniini-agaroosikroma- togrammi nisäkäs-SCF:n puhdistuksesta.

Kuvio 4 on kationinvaihtokromatogrammi nisäkäs-SCF: n puhdistuksesta.

Kuvio 5 on C4-kromatogrammi nisäkäs-SCF:n puhdistu- 30 ksesta.

Kuviossa 6 esitetään natriumdodesyylisulfaatti-(SDS-) polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) (SDS-PAGE) kuvion 5 mukaisista C4-kolonnifraktioista.

Kuvio 7 on analyyttinen C4-kromatogrammi nisäkäs- 35 SCF:stä.

Kuvio 8 esittää SDS-PAGE:ea kuvion 7 mukaisista C4-kolonnifraktioista.

Kuviossa 9 esitetään SDS-PAGE puhdistetusta nisäkäs-SCF: stä ja deglykosyloidusta nisäkäs-SCF:stä.

1 O 8 1 4 G

10

Kuvio 10 on analyyttinen C4-kromatogrammi puhdistetusta nisäkäs-SCF:stä.

Kuviossa 11 esitetään proteiinisekventoinnilla saatu nisäkäs-SCF:n aminohapposekvenssi.

5 Kuviossa 12 esitetään A. oligonukleotideja rotan SCF-cDNA:lle B. oligonukleotideja ihmisen SCF-DNA:lle C. yleisiä oligonukleotideja.

Kuviossa 13 esitetään 10 A. kaavio rotan SCF-cDNA:n vahvistamiseksi polyme raasiketjureaktiolla (PCR) B. kaavio ihmisen SCF-cDNA:n vahvistamiseksi ) PCR:llä.

Kuviossa 14 esitetään 15 A. sekventointistrategia rotan genomi-DNA:lie B. rotan genomi-DNA:n nukleiinihapposekvenssi C. rotan SCF-cDNA:n nukleiinihapposekvenssi sekä rotan SCF-proteiinin aminohapposekvenssi.

Kuviossa 15 esitetään 20 A. strategia ihmisen genomi-DNA:n sekventoimiseksi B. ihmisen genomi-DNA:n nukleiinihapposekvenssi C. ihmisen SCF-cDNA:n yhdistetty nukleiinihapposekvenssi sekä SCF-proteiinin aminohapposekvenssi.

Kuviossa 16 esitetään ihmisen, apinan, koiran, 25 hiiren ja rotan SCF-proteiinien rinnakkain asetetut aminohapposekvenssit .

Kuviossa 17 esitetään nisäkässoluilmennysvektorin V19.8-SCF rakenne.

Kuviossa 18 esitetään nisäkäs-CHO-soluilmennysvek-30 torin pDSVE.l rakenne.

* Kuviossa 19 esitetään coli -ilmennysvektorin pCFMH56 rakenne.

Kuviossa 20 esitetään A. nisäkäs-SCF:n radioimmuunimääritys 35 B. SDS-PAGE immuunisaostetusta nisäkäs-SCF:stä.

11 1 OS 140.

Kuviossa 21 esitetään Western-analyysi yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:stä.

Kuviossa 22 esitetään Western-analyysi yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:stä.

5 Kuvio 23 on pylväskuvaaja, joka esittää COS-l-so- luissa tuotetun yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:n vaikutuksen luuydinsiirtoon.

Kuvio 24 esittää yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:n vaikutuksen Steel-hiirten makrosyyttisen anemian parantamiseen.

10

Kuviossa 25 esitetään ääreisveren valkosolulukua ( (WBC) Steel-hiirille, joita on hoidettu yhdistelmä-DNA- rotta-SCF:llä.

Kuviossa 26 esitetään verihiutalelukuja Steel-hii-15 rille, joita on hoidettu yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:llä.

Kuviossa 27 esitetään differentiaalinen WBC-luku Steel-hiirille, joita on hoidettu yhdistelmä-DNA-rotta-SCF1_164-PEG25: llä.

Kuviossa 28 esitetään imusolualasarjat Steel-20 hiirille, joita on hoidettu yhdistelmä-DNA-rotta-SCF1'164- PEG25:llä.

Kuviossa 29 esitetään yhdistelmä-DNA-ihmissekvens-si-SCF-hoidon vaikutus normaaleihin kädellisiin ääreisve-. ren WBC-luvun lisäämisessä.

v . 25 Kuviossa 30 esitetään yhdistelmä-DNA-ihmissekvens- si-SCF-hoidon vaikutus normaaleihin kädellisiin hemato-kriitti- ja verihiutalelukujen lisäämisessä.

Kuviossa 31 esitetään valokuvia A. ihmisen luuydinpesäkkeistä, joita on stimuloitu 30 yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF1*162:lla : B. Wright-Giemsa-värjättyjä soluja kuvion 31 A mu kaisista pesäkkeistä.

Kuviossa 32 esitetään SDS-PAGE kuviossa 33 esitetyn kromatogrammin S-Sepharose-kolonnifraktioista 35 A. pelkistintä käytettäessä 12 1 Ui 1 Γ· B. ilman pelkistintä.

Kuvio 33 on kromatogrammi E_^ coli -peräisen yhdis-telmä-DNA-ihmis-SCF: n S-Sepharose-kolonnista.

Kuviossa 34 esitetään SDS-PAGE kuviossa 35 esitetyn 5 kromatogrammin C4-kolonnifraktioista A. pelkistintä käytettäessä B. ilman pelkistintä.

Kuvio 35 on kromatogrammi coli -peräisen yhdis-telmä-DNA-ihmis-SCF:n C4-kolonnista.

10 Kuvio 36 on kromatogrammi CHO-peräisen yhdistelmä- DNA-rotta-SCF:n Q-Sepharose-kolonnista.

Kuvio 37 on kromatogrammi CHO-peräisen yhdistelmä- ) DNA-rotta-SCF:n C4-koionnista.

Kuviossa 38 esitetään SDS-PAGE kuviossa 37 esitetyn 15 kromatogrammin C4-kolonnifraktioista.

Kuviossa 39 esitetään SDS-PAGE puhdistetusta CHO-peräisestä yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:stä ennen deglykosy-laatiota ja tämän jälkeen.

Kuviossa 40 esitetään 20 A. geelisuodatuskromatografia pegyloidusta yhdis- telmä-DNA-rotta-SCF1'164-reaktioseoksesta B. geelisuodatuskromatografia yhdistelmä-DNA-rotta-SCF1"164:stä, jota ei ole modifioitu.

Kuviossa 41 esitetään leimatun SCF:n sitoutuminen ^ 25 tuoreisiin leukemiaemosoluihin.

Kuviossa 42 esitetään ihmis-SCF-cDNA-sekvenssi, joka on saatu HT1080-fibrosarkoomasolulinjasta.

Kuviossa 43 esitetään autoradiokuva COS-7-soluista, jotka ilmentävät ihmis-SCF1_248:n, ja CHO-soluista, jotka 30 ilmentävät ihmis-SCF1_164:n.

Kuviossa 44 esitetään ihmis-SCF-cDNA-sekvenssi, joka on saatu 5637-rakkosyöpäsolulinjasta.

Kuviossa 45 esitetään säteilyä saaneiden hiirten lisääntynyt eloonjäänti SCF-hoidon jälkeen.

108140 13

Kuviossa 46 esitetään säteilyä saaneiden hiirten lisääntynyt eloonjäänti luuydinsiirteen vastaanoton jälkeen käytettäessä 5 % reisiluuta sekä SCF-hoitoa.

Kuviossa 47 esitetään säteilyä saaneiden hiirten 5 lisääntynyt eloonjäänti luuydinsiirteen vastaanoton jälkeen käytettäessä 0,1 ja 20 % reisiluuta sekä SCF-hoitoa.

Keksinnön lukuisia näkökohtia ja etuja tulee ilmeisiksi alan ammattilaisille heidän tutustuessaan seuraa-vaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen, jossa esitetään hava-10 innollistuksia keksinnön käytännöstä sen tällä hetkellä edullisina pidetyissä suoritusmuodoissa.

( Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä

Esillä olevan keksinnön mukaan annetaan käyttöön uusia kantasolutekijöitä ja tällaiset SCF:t kokonaisuu-15 dessaan tai osittain koodattavia DNA-sekvenssejä. Ilmaisulla "kantasolutekijä" tai "SCF" tarkoitetaan tässä käytettynä luontaisesti esiintyvää SCF:ää (esim. luontainen ihmis-SCF) sekä ei-luontaisesti esiintyviä (eli luontaisesti esiintyvistä poikkeavia) polypeptidejä, joiden ami-20 nohapposekvenssit ja glykosylaatio jäljittelevät riittävästi luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän vastaavia, jotta niillä on luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän hematopoieettinen biologinen aktiivisuus. Kantasolutekijä kykenee stimuloimaan varhaisten hematopoieettisten kanta-^ 25 isäsolujen kasvua, jotka kykenevät kypsymään punasoluiksi, megakaryosyyteiksi, jyvässoluiksi, imusoluiksi ja makrofagisoluiksi. Nisäkkäitten hoidosta SCF:llä seuraa absoluuttisia lisäyksiä sekä ydin- että imusolulinjojen hematopoieettisten solujen määrissä. Kantasolujen yksi 30 leimaava ominaisuus on niiden kyky differentioitua sekä ‘ ydin- että imusoluiksi [Weissman, Science 241 (1988) 58 - 62]. Steel-hiirien käsittely (esimerkki 8B) yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:llä johtaa lisäyksiin jyvässolujen, mono-syyttien, punasolujen, imusolujen ja verihiutaleiden mää-35 rissä. Normaalien kädellisten käsittely yhdistelmä-DNA- 108140 14 ihmis-SCF:llä johtaa ydin- ja imusolumäärien lisäyksiin (esimerkki 8C).

SCF:n ilmentävät sikiötasolla melaniinivarhaisso-lujen vaellusreitin ja kotiutuskohtien solut, sukusolut, 5 verenmuodostussolut sekä aivot ja selkäydin.

Varhaiset hematopoieettiset kantaisäsolut rikastuvat 5-fluoriurasiililla (5-FU:lla) käsiteltyjen nisäk-käitten luuytimeen. Kemoterapeuttinen lääke 5-FU kuluttaa selektiivisesti myöhäisiä hematopoieettisia kantaisäsolu-10 ja. SCF on aktiivinen luuytimessä, jota on käsitelty 5-FU:11a.

SCF:n biologinen aktiivisuus sekä sen kudosjakau- ) makuvio todistavat sen keskeistä roolia sikiökehityksessä sekä verenmuodostuksessa sekä sen mahdollisuuksia eri-15 laisten kantaisäsoluvajauksien hoidossa.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön DNA-sekvens-sejä, joihin sisältyy: sellaisten kodonien mukaanotto, jotka ovat "edullisia" valituissa ei-nisäkäsisännissä ilmennettäviksi; varustus kohdilla pilkottaviksi restriktio-20 endonukleaasientsyymeillä; sekä varustus ylimääräisillä alku-, päätös- tai väli-DNA-sekvensseillä, jotka helpottavat helposti ilmennettävien vektorien rakentamista. Esillä oleva keksintö antaa niinikään käyttöön DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat SCF:n polypeptidianalogeja tai johdan-. 25 naisia, jotka poikkeavat luontaisesti esiintyvistä muo- ) doista yhden tai useamman aminohappotähteen identiteetin tai sijaintikohdan osalta (eli deleetioanalogit, jotka sisältävät vähemmän kuin kaikki SCF:lie spesifioidut tähteet; substituutioanalogit, joissa yksi tai useampi spesi-30 fioiduista tähteistä on korvattu muilla tähteillä; sekä additioanalogit, joissa yksi tai useampi aminohappotähde on lisätty osaan polypeptidin päässä tai keskellä), ja joilla on yhteisenä joitakin luontaisesti esiintyvien muotojen ominaisuuksista tai ne kaikki. Esillä oleva keksintö 35 antaa spesifisesti käyttöön DNA-sekvenssejä, jotka koodit- 108140 ίο tavat täysimittaisen ei-prosessoidun aminohapposekvenssin, sekä DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat SCF:n prosessoidun muodon.

Uusiin keksinnön mukaisiin DNA-sekvensseihin lu-5 keutuu sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia sellaisten polypeptidituotteiden ilmennyksen prokaryoottisissä tai eukaryoottisissa isäntäsoluissa varmistamiseksi, joilla on ainakin osa luontaisesti esiintyvän SCF:n primaariraken-nekonformaatiosta ja yksi tai useampi sen biologisista 10 ominaisuuksista. Keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit käsittävät spesifisesti: (a) DNA-sekvenssit, jotka esitetään ( kuvioissa 14B, 14C, 15B, 15C, 42 ja 44, tai niiden komp- lementtisäikeet; (b) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat (hybridisaatio-olosuhteissa, jotka julkistetaan esi-15 merkissä 3, tai ankarammissa olosuhteissa) kuvioissa 14B, 14C, 15B, 15C, 42 ja 44 esitettyihin DNA-sekvensseihin tai niiden fragmentteihin; sekä (c) DNA-sekvenssit, jotka ellei geneettinen koodi olisi luonteeltaan degeneroituva, hybridisoituisivat kuvioissa 14B, 14C, 15B, 15C, 42 ja 44 20 esitettyihin DNA-sekvensseihin. Spesifisesti kohtiin (b) ja (c) sisältyvät genomi-DNA-sekvenssit, jotka koodittavat SCF:n alleelisia varianttimuotoja, ja/tai koodittavat SCFiää muista nisäkäslajeista, sekä valmistetut DNA-sekvenssit, jotka koodittavat SCFiää, SCF-fragmentteja ja ( .25 SCF-analogeja. DNA-sekvenssit saattavat sisältää kodoneja, jotka helpottavat lähetti-RNAin kopiointia ja luentaa mikrobi-isännissä. Tällaisia valmistettuja sekvenssejä voidaan rakentaa helposti Altonin et ai., PCT-patenttihake-musjulkaisu WO 83/04053, menetelmien mukaan.

30 Esillä olevan keksinnön toisen näkökohdan mukaan tässä kuvatut DNA-sekvenssit, jotka koodittavat polypep-tidejä, joilla on SCF-aktiivisuutta, ovat arvokkaita ni-säkäsproteiinin aminohapposekvenssistä antamansa sellaisen informaation vuoksi, jota ei tähän asti ole ollut 35 saatavana. DNA-sekvenssit ovat samoin arvokkaita tuottei- 108140 16 na, jotka ovat käyttökelpoisia suoritettaessa SCF-synteesi suuressa mittakaavassa erilaisilla yhdistelmä-DNA-teknii-koilla. Toisin sanottuna DNA-sekvenssit, jotka keksintö antaa käyttöön, ovat käyttökelpoisia muodostettaessa uusia 5 ja käyttökelpoisia viraalisia ja renkaan muotoisia plas-midi-DNA-vektoreita, uusia ja käyttökelpoisia transformoituja ja transfektoituja prokaryoottisia ja eukaryoottisia isäntäsoluja (mukaan lukien bakteeri- ja hiivasolut sekä nisäkässolut, jotka on kasvatettu viljelmänä) sekä uusia 10 ja käyttökelpoisia menetelmiä tällaisten isäntäsolujen kasvattamiseksi viljelmänä, jotka kykenevät ilmentämään SCF:n ja sen sukulaistuotteita. ,)

Keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit ovat samoin sopivia materiaaleja käytettäviksi leimattuina koettimina 15 eristettäessä SCF:ää koodittavaa ihmisgenomi-DNA:ta ja muita, sukulaisproteiinien geenejä sekä cDNA- ja genomi-DNA-sekvenssejä muille nisäkäslajeille. DNA-sekvenssit saattavat niinikään olla käyttökelpoisia proteiinisynteesin erilaisissa vaihtoehtoisissa menetelmissä (esim.

20 hyönteissolut) tai ihmisten tai muiden nisäkkäitten geeniterapiassa. Keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien odotetaan olevan käyttökelpoisia transgeenisten nisäkäslajien kehityksessä, jotka voivat toimia eukaryoottisina "isäntinä" SCF:n ja SCF-tuotteiden tuottamiseksi määrinä. Katso ylei- .

25 sesti Palmiter et ai., Science 222 (1983) 809 - 814. - Tässä esitetään puhdistettua ja eristettyä luontaisesti esiintyvää SCF:ää (eli puhdistettuna luonnosta tai valmistettuna siten, että primaari-, sekundaari- ja terti-aarikonformaatio sekä glykosylaatiokuvio ovat identtiset 30 luontaisesti esiintyvään materiaaliin nähden), sekä ei-luontaisesti esiintyviä polypeptidejä, joiden primaarira-kennekonformaatio (eli aminohappotähteiden jatkuva sekvenssi) ja glykosylaatio jäljittelevät riittävästi luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän vastaavia, jotta 35 niillä on luontaisesti esiintyvän SCF:n hematopoieettinen 17 108140 biologinen aktiivisuus. Tällaisiin polypeptideihin luetaan johdannaiset ja analogit.

Edullisessa suoritusmuodossa SCF on tunnusomaisesta tuote, joka on saatu ilmentämällä prokaryoottisessa tai 5 eukaryoottisessa isännässä (esim. bakteeri-, hiiva-, korkeampi kasvi -, hyönteis- ja nisäkässoluissa viljelmässä) eksogeenisiä DNA-sekvenssejä, jotka on saatu genomi- tai cDNA-kloonauksella tai geenisynteesillä. Toisin sanoen edullisessa suoritusmuodossa SCF on "yhdistelmä-SCF". II-10 mennystuotteiden tyypillisissä hiiva- (esim. Saccharomvces cerevisiae -) tai prokaryoottisissa (esim. EL. coli -) ( isäntäsoluissa yhteydessä ei esiinny mitään nisäkäspro- teiineja. Ilmennystuotteiden selkärankais- [esim. ei-ih-misnisäkäs- (esim. COS- tai CHO-) ja lintu-] soluissa 15 yhteydessä ei esiinny mitään ihmisproteiineja. Riippuen käytetystä isännästä polypeptidit voivat olla glykosyloi-tuja nisäkäs- tai muilla eukaryoottisilla hiilihydraateilla tai ne voivat olla ei-glykosyloituja. Isäntäsolua voidaan muuttaa käyttämällä sen kaltaisia tekniikoita kuin 20 kuvataan julkaisussa Lee et ai. . J.Biol.Chem. 264 (1989) 13848, joka täten sisällytetään viitteeksi. Kuvatut polypeptidit voivat niinikään sisältää alkumetioniiniaminohap-potähteen (asemassa -1) .

SCF:n luontaisesti esiintyvien alleellisten muoto-( . 25 jen lisäksi tässä esitetään niinikään muita SCF-tuotteita kuten SCF:n polypeptianalogit. Tällaisiin analogeihin lukeutuu SCF-fragmentteja. Seuraamalla menettelyjä edellä mainitussa Altonin et ai. patenttihakemusjulkaisussa (WO 83/04053) voidaan helposti suunnitella ja valmistaa geene-30 jä, jotka koodittavat sellaisten polypeptidien mikrobi-ilmennystä, joiden primaarikonformaatiot poikkeavat tässä spesifioidusta yhden tai useamman tähteen identiteetin tai sijaintikohdan osalta (esim. substituutiot, lisäykset ja deleetiot päässä ja keskellä) . Vaihtoehtoisesti cDNA- ja 35 genomigeenejä voidaan vaikeuksitta modifioida hyvin tunne- 108140 18 tuilla paikkaohjatun mutatoinnin tekniikoilla, jolloin modifikaatioita voidaan käyttää SCF-analogien ja -johdannaisten muodostamiseksi. Tällaisilla tuotteilla on yhteisenä ainakin yksi SCF:n biologinen ominaisuus, mutta ne 5 voivat erota muiden osalta. Esimerkkeinä esitettyihin tuotteisiin kuuluvat tuotteet, joita on lyhennetty esim. deleetioilla; tai tuotteet, jotka ovat hydrolyysin suhteen stabiilimpia (ja joilla siksi voi olla selvempiä tai pitkäaikaisempia vaikutuksia kuin luontaisesti esiintyvillä 10 tuotteilla); tai joita on muutettu yhden tai useamman mahdollisen O-glykosylaatio- ja/tai N-glykosylaatiokeskuksen deletoimiseksi tai lisäämiseksi, tai joissa yksi tai - useampi kysteiinitähde on deletoitu tai korvattu esim. alaniini- tai seriinitähteillä, ja jotka ovat mahdollises-15 ti helpommin eristettävissä aktiivisessa muodossa mikro-bisysteemeistä; tai joissa yksi tai useampi tyrosiinitähde on korvattu fenyylialaniinilla ja jotka sitoutuvat helpommin tai aiempaa vähemmän helposti kohdeproteiineihin tai reseptoreihin kohdesolujen pinnalla. Samoin mukaan kuulu-20 vat polypeptidifragmentit, jotka jäljittelevät vain osaa SCF:ään sisältyvästä jatkuvasta aminohapposekvenssistä tai siihen sisältyvistä sekundaarikonformaatioista, ja joilla fragmenteilla voi olla yksi SCF:n ominaisuus (esim. resep-torisitoutuminen) eikä muita (esim. varhaisen hematopoi- x . 25 eettisen solun kasvuaktiivisuus). Huomattakoon, että ak- ^ tiivisuus ei ole välttämätöntä millekään yhdelle tai useammalle esitetylle tuotteelle, jotta sillä olisi terapeuttista käyttöä [katso Weiland et ah., Blut 44 (1982) 173 - 175] tai käyttöä muissa yhteyksissä, kuten SCF-anta-30 gonismimäärityksissä. Kilpailevat antagonistit saattavat olla varsin käyttökelpoisia esimerkiksi tapauksissa, joissa esiintyy SCF:n liikatuotantoa, tai ihmisen leukemiata-pauksissa, joissa pahanlaatuiset solut ilmentävät liian runsaasti SCF-reseptoreita, kuten ilmenee SCF-reseptorien 19 108140 liian voimakkaasta ilmennyksestä leukemiaemosoluissa (esimerkki 13) .

Tässä kuvattuihin polypeptidianalogeihin voidaan soveltaa raportteja sellaisten synteettisten peptidien im-5 munologisesta ominaisuudesta, jotka oleellisesti jäljittelevät luontaisesti esiintyvissä proteiineissa, gly-koproteiineissa ja nukleoproteiineissa olemassa olevaa aminohapposekvenssiä. Spesifisemmin polypeptidien, joiden molekyylipaino on suhteellisen alhainen, on osoitettu 10 osallistuvan immuunireaktioihin, jotka ovat kestoltaan ja laajuldeltaan samanlaisia kuin fysiologisesti merkittävien ( proteiinien kuten virusantigeenien, polypeptidihormonien ja muiden samankaltaisten immuunireaktiot. Tällaisten po-lypeptidien immuunireaktioihin lukeutuu spesifisten vasta-15 aineiden muodostuksen indusointi immunologisesti aktiivisissa eläimissä [Lerner et. ai. . Cell 23 (1981) 309 - 310; Ross et ai.. Nature 294 (1981) 654 - 656; Walter et ai.. Proc.Nat1.Acad.Sei.USA 77 (1980) 5197 - 5200; Lerner et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei.USA 78 (1981) 3403 - 3407; Walter 20 et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei.USA 78 (1981) 4882 - 4886; Wong et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei.USA 79 (1982) 5322 - 5326; Baron et ai. , Cell 28 (1982) 395 - 404; Dressman et ai. . Nature 295 (1982) 185 - 160; ja Lerner, Scientific Ameri-can 248 (1983) 66 - 741 . Katso mvös Kaiser et ai. [Science ( v t 25 223 (1984) 249 - 255], joka koskee sellaisten synteettis ten peptidien biologisia ja immunologisia ominaisuuksia, joilla likimäärin on yhteisiä sekundaarirakenteita pepti-dihormonien kanssa, mutta joilla ei ole näiden kanssa yhteistä primaarirakennekonformaatiota.

30 Tähän kuvaukseen kuuluu niinikään se polypeptidi- * luokka, jonka koodittavat sellaiset osat DNA:sta, jotka ovat komplementaarisia SCF:n ihmisen cDNA- tai genomi-DNA-sekvenssien proteiinikoodisäikeelle, eli "komplementaariset kääntyneet proteiinit", kuten kuvaavat Tramontano et 35 ai. ΓNucleic Acids Res. 12 (1984) 5049 - 5059].

20 1 08 1 4'0

Edustavia tässä esitettyjä SCF-polypeptidejä ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta SCF1'148, SCF1"162, SCF1' 164, SCF1’165 ja SCF1’183 kuviossa 15C; SCF1-185, SCF1'188, SCF1'189 ja SCF1’248 kuviossa 42; ja SCF1'157, SCF1"160, SCF1'161 ja SCF1'220 5 kuviossa 44.

SCF voidaan puhdistaa käyttäen alan ammattilaisille tuttuja tekniikoita. Tässä kuvataan menetelmä SCF:n puhdistamiseksi SCF:ää sisältävästä materiaalista, kuten käsitelty kasvualusta tai ihmisen virtsa, seerumi, jolloin 10 menetelmä käsittää yhden tai useamman seuraavan kaltaisen vaiheen: SCF-pitoisella materiaalilla suoritetaan ionin- vaihtokromatografia (joko kationin- tai anio- ) ninvaihtokromatografia); SCF-pitoisella materiaalilla suoritetaan käänteisfaasinestekromatografinen erotus, 15 jossa käytetään esimerkiksi immobilisoitua C4- tai C6-hart-sia; nesteellä suoritetaan immobilisoitu-lektiini -kroma-tografia, eli SCF sidotaan immobilisoituun lektiiniin ja eluoidaan käyttäen sokeria, joka kilpailee tästä sitoutumisesta. Yksityiskohdat näiden menetelmien käytöstä ilme-20 nevät selvästi kuvauksista, jotka esitetään esimerkkien 1, 10 ja 11 mukaisissa kuvauksissa SCF:n puhdistuksesta. Esimerkissä 2 kuvatut tekniikat Lain et ai. US-patenttijulkaisussa 4 667 016, jotka täten sisällytetään viitteeksi, ovat samoin käyttökelpoisia kantasolutekijän puhdistukses-2 5 sa. / SCF: n isoformit eristetään käyttäen vakioteknii-koita, kuten tekniikoita, jotka esitetään US-patentissa 5 856 298.

Samoin keksintöön kuuluu menetelmä farmaseuttisten 30 koostumusten valmistamiseksi, jotka käsittävät terapeutti- » · * sesti tehokkaita määriä keksinnön mukaisesti valmistettuja polypeptidituotteita yhdessä sopivien, SCF-terapiassa käyttökelpoisten laimentimien, säilytysaineiden, liukenemista edistävien aineiden, emulgaattorien, lisäainei-35 den ja/tai kantajien kanssa. Tässä käytettynä "terapeutti- • ♦ 21 1 081 40· sesti tehokkaalla määrällä" tarkoitetaan määrää, jolla saadaan terapeuttinen vaikutus tiettyyn tilaan ja tietyllä anto-ohjelmalla. Tällaiset koostumukset ovat nesteitä tai kylmäkuivattuja tai muutoin kuivattuja koostumuksia ja 5 niihin sisältyy laimentimia, joiden puskurisisältö (esim. Tris-HCl, asetaatti, fosfaatti), pH ja ionivahvuus vaihte-levat, lisäaineita kuten albumiini tai gelatiini adsorption pintoihin estämiseksi, pesuaineita (esim. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sappihapposuolat) , liukenemista 10 edistäviä aineita (esim. glyseroli, polyetyleeniglykoli), hapetuksenestoaineita (esim. askorbiinihappo, natriummeta-( bisulfiitti), säilytysaineita (esim. Thimerosal, bentsyy- lialkoholi, parabeenit), täyteaineita tai toonisuutta modifioivia aineita (esim. laktoosi, mannitoli), polymeerejä 15 kuten polyetyleeniglykoli kovalenttisesti proteiiniin kiinnitettyinä (mitä kuvataan esimerkissä 12 alla), komp-leksoituja metalli-ioneja, tai materiaali on voitu sisällyttää polymeeristen yhdisteiden kuten polymaitohapon, polyglykolihapon, hydrogeelin jne. hiukkasvalmisteisiin ja 20 näiden pinnalle, tai liposomeihin, mikroemulsioiksi, mi-selleihin, yksilamellaarisiin tai monilamellaarisiin rakkuloihin, värittömiin punasoluihin tai sferoplasteihin. Tällaiset koostumukset vaikuttavat in vivo -vapautumisen fysikaaliseen tilaan, liukoisuuteen, stabiilisuuteen, no-' ; 25 peuteen, sekä SCF:n poistumisnopeuteen in vivo. Koostu muksen valinta riippuu proteiinin, jolla SCF-aktiivisuutta on, fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista. Esimerkiksi tuote, joka on saatu SCF:n membraaniin sitoutuneesta muodosta, saattaa edellyttää pesuainetta sisältävää 30 koostumusta. Kontrolloidun tai hitaan vaputumisen koostumuksiin lukeutuu koostaminen lipofiilisiin varastoihin (esim. rasvahapot, vahat, öljyt). Esitettyihin koostumuksiin kuuluvat myös hiukkaskoostumukset, jotka on päällystetty polymeereillä (esim. poloksameerit tai polok-35 samiinit) sekä SCF, joka on kytketty kudosspesifisten re- 108140 22 septorien, ligandien tai antigeenien vastaisiin vasta-aineisiin, tai kytketty kudosspesifisten reseptorien ligan-deihin. Koostumusten toiset suoritusmuodot käsittävät hiukkasmuotoja, suojapäällysteitä, proteaasi-inhibiitto-5 reita tai läpäisyä edistäviä aineita eri autoteitä, mukaan lukien ruoansulatuskanavan ulkopuolista, keuhkonsisäistä, nenän tai suun kautta tapahtuvaa, silmällä pitäen.

Koostumukset voivat myös sisältää yhtä tai useampaa muuta hematopoieettista tekijää kuten EPO, G-CSF, GM-CSF, 10 CSF-l, IL-l, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I tai LIF (leukemia-inhibitiotekijä).

Keksinnön mukaisesti valmistettuja polypeptidejä ,) voidaan "leimata" liittämällä niihin todettava merkkiaine (esim. radioleimaus 125I:llä tai biotinylointi) reagenssien 15 saamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia SCF:n tai sen reseptorin käsittävien solujen toteamiseksi ja kvantitoimi-seksi kiinteistä kudosnäytteistä ja nestenäytteistä kuten verestä tai virtsasta.

Biotinyloitu SCF on käyttökelpoinen yhdistettynä 20 immobilisoituun streptavidiiniin leukemiavarhaissolujen poistamiseksi luuytimestä autologisissa luuydinsiirroissa. Biotinyloitu SCF on käyttökelpoinen yhdistettynä immobilisoituun streptavidiiniin kantasolujen suhteen rikastamiseksi autologisissa tai allogeenisissa kantasoluissa auto-.25 logisissa tai allogeenisissa luuydinsiirroissa. SCF:n tok- ) siinikonjugaatit, kuten risiini [Uhr, Prog. Clin. Biol.Res.

288 (1989) 403 - 412], difteriatoksiini [Moolten, J. -

Natl. Con.Inst. 55 (1975) 473 - 477] , ja radioisotoopit ovat käyttökelpoisia suoraan syöpävastäiseen terapiaan 30 (esimerkki 13) tai hoito-ohjelmaksi luuydinsiirtoon.

• Keksinnön mukaiset nukleiinihappotuotteet ovat käyttökelpoisia leimattuina todettavilla merkeillä (kuten radioleimat ja ei-isotooppileimat kuten biotiini), ja käytettyinä hybridisaatiomenetelmissä ihmisen SCF-geenin 35 aseman ja/tai minkä tahansa sukulaisgeeniryhmän aseman 23 1 08 1 40 paikantamiseksi kromosomikartalta. Ne ovat samoin käyttökelpoisia ihmisen SCF-geenihäiriötilojen tunnistamiseksi DNA-tasolla ja käytettyinä geenimerkkeinä naapurigeenien ja niiden häiriötilojen tunnistamiseksi. Ihmis-SCF-geeni 5 on kooditettu kromosomiin 12, ja hiiren SCF-geeni asettuu kartassa kromosomiin 10 Sl-geenipaikkaan.

SCF on käyttökelpoinen yksinään tai yhdistettynä muuhun terapiaan lukuisten hematopoieettisten häiriötilojen hoidossa. SCF:tä voidaan käyttää yksinään tai yhden 10 tai useamman muun hematopoieettisen tekijän kuten EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, ( IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I tai LIF kanssa he matopoieettisten häiriötilojen hoidossa.

Löytyy ryhmä kantasoluhäiriötiloja, joille on tun-15 nusomaista vähenemä funktionaalisessa ydinmassassa, joka johtuu toksisesta, säteilyn aiheuttamasta tai immunologisesta vauriosta ja joka voi olla hoidettavissa SCF:llä. Aplastinen anemia on kantasoluhäiriötila, jossa esiintyy hematopoieettisen kudoksen rasvasiirtymää ja pansytopeniaa 20 eli kaikkien solujen vähäisyyttä veressä. SCF tehostaa hematopoieettista lisääntymistä ja on käyttökelpoinen aplastisen anemian hoitamiseksi (esimerkki 8B) . Steel-hiiriä käytetään ihmisen aplastisen anemian mallina [Jones, Exp.Hematol. 11 (1983) 571 - 580] . Lupaavia tuloksia ' ; 25 on saatu käyttämällä sukulaissytokiinia, GM-CSF:ää, aplastisen anemian hoidossa [Antin et ai. . Blood 70 (1987) 129a] . Kohtauksittain esiintyvä yöajan hemoglobiinin esiintyminen virtsassa (PNH) on kantasoluhäiriötila, jolle on tunnusomaista puutteellisten verihiutaleiden ja jyväs-30 solujen muodostuminen sekä epänormaalit punasolut.

Löytyy monia sairauksia, joita voidaan hoitaa SCF:llä. Näitä ovat seuraavat: luuytimen korvautuminen sidekudoksella, selkäytimen kovettuminen, luun kovettuminen, etäispesäkkeitä muodostava syöpä, akuutti leukemia, 35 multippelimyelooma, Hodgkinin sairaus, lymfooma, Gaucherin 108140 24 sairaus, Niemann-Pick-sairaus, Letterer-Siwe-sairaus, ärsykkeitä vastaanottamaton erytroblastinen anemia, Di Gug-lielmo -oireyhtymä, kongestiivinen pernan laajentuma, Hodgkinin sairaus, mustakuume, sarkoidoosi, primaarinen 5 pernaperäinen kaikkien verisolujen liian vähäinen esiintyminen veressä, äkillinen, yleistynyt tuberkuloosi, useassa elimistön kohdassa esiintyvä sienisairaus, äkillinen verenmyrkytys, malaria, vitamiini B12 - ja foolihap-povajaus, pyridoksiinivajaus, Diamond Blackfan -anemia, 10 liian vähäisestä pigmentistä johtuvat häiriötilat kuten ihon läiskittäinen väriaineen puutos ja valkopälvi. SCF:n punasoluja, megakaryosyytteja ja jyvässoluja stimuloivia ) ominaisuuksia havainnollistetaan esimerkeissä 8B ja 8C.

Ei-hematopoieettisten kantasolujen, kuten varhais-15 sukusolujen, hermopienaperäisten melanosyyttien, selkäytimen yhdistävien hermosoluhaarakkeiden, suolen kuop-pasolujen, mesonefristen ja metanefristen munuaistiehyei-den ja hajuradan etuosan pullistuman, kasvun tehostus on hyödyllistä tiloissa, joissa näissä kohdissa on tapahtunut 20 spesifinen kudosvaurio. SCF on käyttökelpoinen hermovaurion hoitamiseksi ja se on hermosolujen kasvutekijä. SCF on käyttökelpoinen hedelmöitysmenettelyissä in vitro tai hedelmättömyystilojen hoidossa. SCF on käyttökelpoinen säteilystä tai kemoterapiasta seuranneen suolivaurion hoi-: 25 tamiseksi. ) Löytyy kantasolujen myeloproliferatiivisia häiriötiloja, kuten kaikkien eri verisolujen liiallinen tuotanto, krooninen ydinperäinen leukemia, ytimen mataplasia, primaarinen verihiutaleiden runsas määrä veressä ja akuu-30 tit leukemiat, joita voidaan hoitaa SCF:llä, anti-SCF- * vasta-aineilla tai SCF-toksiinikonjugaateilla.

Löytyy lukuisia tapauksia, joissa on dokumentoitu leukemiasolujen kasvanut lisääntyminen hematopoieettisten solukasvutekijöiden G-CSF, GM-CSF ja IL-3 ansioksi [Delwel 35 et ai.. Blood 72 (1988) 1944 - 1949] . Koska monien kemote- 108140 25 rapeuttisten lääkkeiden menestys on riippuvainen siitä, että syöpäsolut kiertävät aktiivisemmin kuin normaalit solut, SCF yksinään tai yhdistettynä muihin tekijöihin toimii kasvutekijänä syöpäsoluille ja herkistää ne kemo-5 terapeuttisten lääkkeiden myrkyllisille vaikutuksille. SCF-reseptorien liiallisen runsas ilmentyminen leukemia-varhaissoluilla on esitetty esimerkissä 13.

Lukuisia hematopoieettisia yhdistelmä-DNA- teki joitä on tutkittavina niiden kyvyn osalta lyhentää kemoterapia-10 ja sädehoito-ohjelmista seuraavaa valkosolunadiria. Vaikka nämä tekijät on varsin käyttökelpoisia tässä asianyhtey-( dessä, on olemassa varhainen hematopoieettinen osasto, joka vaurioituu, etenkin säteilyn vaikutuksesta, ja on repopuloitava ennen kuin nämä myöhemmin vaikuttavat kasvu-15 tekijät voivat harjoittaa optimaalista vaikutustaan. SCF:n käyttö yksinään tai yhdistettynä näihin tekijöihin lyhentää edelleen valkosolu- ja verihiutelanadiria, joka on seurausta kemoterapiasta tai sädehoidosta, tai poistaa sen. Lisäksi SCF mahdollistaa syöpävastaisen tai sädehoi-20 dollisen ohjelman annoksen voimistamisen (esimerkki 19).

SCF on käyttökelpoinen lisäännyttämään varhaisia hematopoieettisia kantaisäsoluja syngeenisessä, allogee-nisessa tai autologisessa luuydinsiirrossa. Hematopoieet-^ tisten kasvutekijöiden käytön on osoitettu lyhentävän ai- ' ' · 25 kaa, jonka neutrofiilit tarvitsevat palautuakseen siirron jälkeen [Donahue et ai.. Nature 321 (1986) 872 - 875; ja

Welte et al^., J.Exp.Med. 165 (1987) 941 - 948] . Luuydin- siirroissa käytetään seuraavia kolmea skeenariota yksinään tai yhdistelmänä: luovuttajaa käsitellään pelkästään 30 SCF:llä tai sillä yhdistettynä muihin hematopoieettisiin ’ tekijöihin ennen luuytimen imemistä tai ääreisveren leu- kafereesiä siirtoon käytettävissä olevien solujen lukumäärän nostamiseksi; luuydintä käsitellään in vitro solu- 26 1C8H0 luvun aktivoimiseksi tai lisäännyttämiseksi ennen siirtoa; lopuksi vastaanottajaa käsitellään luovuttajaytimen istutuksen tehostamiseksi.

SCF on käyttökelpoinen sellaisen geeniterapian te-5 hon nostamiseksi, joka perustuu hematopoieettisten kanta-solujen transfektointiin (tai tartuttamiseen retroviraali-sella vektorilla). SCF mahdollistaa transfektoitavien varhaisten hematopoieettisten kantaisäsolujen viljelyn ja lisäämisen. Viljely voidaan suorittaa SCF:llä pelkästään 10 tai sillä yhdistettynä IL-6:een, IL-3:een tai näihin molempiin. Kun nämä solut on transfektoitu, ne siirretään nes-tesiirron välityksellä luuydinsiirteenä potilaisiin, jotka ) kärsivät geneettisistä häiriötiloista. [Lim, Proc. Natl.

Acad. Sei. 86 (1989) 8892 - 8896]. Esimerkkejä geeneistä, 15 jotka ovat käyttökelpoisia geneettisten häiriötilojen hoitamiseksi, ovat adenosiinideaminaasi, glukokerebrosidaasi, hemoglobiini ja kystinen fibroosi.

SCF on käyttökelpoinen immuunikadon (aids) tai vakavien yhdistettyjen immuunipuutostilojen (SCID) hoitami-20 seksi yksinään tai muiden tekijöiden kuten IL-7:n kanssa (katso esimerkki 14) . Tätä vaikutusta havainnollistaa SCF-terapian kyky nostaa T-avustaja- (CD4+-, OKT4+-) imusolujen absoluuttista tasoa verenkierrossa. Nämä solut ovat ihmisen immuunikatoviruksen (HIV:n) primaarisia solumaale-: 25 ja, joihin osuminen johtaa aids-immuunipuutostilaan potilaissa [Montagnier julkaisussa "Human T-Cell Leukemia/-Lymphoma Virus", toim. R.C. Gallo, Cold Spring Harbor, New York, 1984, ss. 369 - 379]. Lisäksi SCF on käyttökelpoinen anti-HIV-lääkkeiden kuten AZT:n myelosuppressiivisten vai-3 0 kutusten vastustamiseksi [Cogu, Life Sciences 45:4 (1989)] .

SCF on käyttökelpoinen tehostamaan hematopoieet-tista toipumista välittömän verenmenetetyksen jälkeen.

27

1 C 8 1 4 O

In vivo -hoito SCF:llä on käyttökelpoinen immuuni-järjestelmän tukemiseksi syövän vastaisessa taistelussa. Esimerkkiä immuunifunktion suoran tehostuksen terapeuttisesta hyödyllisyydestä vast1 ikään kloonatulla sytokiinilla 5 (IL-2) kuvataan julkaisussa Rosenberg et ai.. N.Eng.J.Med.

313 (1987) 1485.

SCF:n anto muiden aineiden kuten yhden tai useamman hematopoieettisen tekijän kanssa ajoitetaan väliajoin tapahtuvaksi tai aineet annetaan samanaikaisesti. Aiempi 10 hoito SCF:llä kasvattaa kantaisäsolupopulaatiota, joka tuottaa vasteen lopuksi vaikuttaville hematopoieettisille ' tekijöille kuten G-CSF tai EPO. Antotie voi olla laski monsisäisesti, vatsaontelon sisäisesti, ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti.

15 Tämä keksintö koskee niinikään vasta-aineiden val mistusta, jotka sitoutuvat spesifisesti kantasolutekijään. Esimerkissä 7 alla kuvataan polyklonaalisten vasta-aineiden tuotantoa. Seuraavan suoritusmuodon muodostavat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka sitoutuvat spesifisesti 20 SCFrään (katso esimerkki 20) . Vastoin kuin tavanomaiset (polyklonaaliset) vasta-ainevalmisteet, jotka tyypillisesti sisältävät erilaisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat eri määreitä (epitooppeja) vastaan, kukin monoklonaalinen ^ vasta-aine kohdistuu yhtä yksittäistä antigeenimäärettä '· 25 vastaan. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia antigeeni-vasta-ainesitoutumista hyödyntävien diagnostisten ja analyyttisten määritysmenetelmien selektiivisyyden ja spesifisyyden parantamiseksi. Samoin niitä käytetään SCF:n neutraloimiseksi seerumissa tai poistamiseksi siitä. 30 Monoklonaalisten vasta-aineiden toinen etu on, että niitä • »· ' voidaan syntetisoida hybridoomasoluilla viljelmässä, joi- loin muita immunoglobuliineja ei esiinny epäpuhtauksina. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa viljelty- 108140 28 jen hybridoomasolujen supernatanteista tai vatsaontelones-tekasvaimista, jotka on indusoitu siirrostamalla vatsaontelon sisäisesti hybridoomasoluja hiiriin. Hybridoomatek-niikkaa, jota kuvasivat alunperin Köhler ja Milstein 5 fEur.J.Immunol. 6 (1976) 511 - 519], on sovellettu laajalti hybridisolulinjojen tuottamiseksi, jotka erittävät korkeina tasoina useiden spesifisten antigeenien vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita.

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön havainnoi-10 listamiseksi täydellisemmin, jolloin esimerkkien ei tule kuitenkaan tulkita rajoittavan keksinnön kattavuutta.

Esimerkki 1 )

Kantasolutekijän puhdistus/karakterisointi buffa-lorotan maksasoluilla käsitellystä kasvualustasta 15 A. Biologiset määritykset in vitro 1. HPP-CFC-määritys Löytyy lukuisia erilaisia biologisia aktiivisuuksia, jotka voidaan katsoa johtuviksi luontaisesta nisäkäs-rotta-SCF- sekä yhdistelmä-DNA-rotta-SCF-proteiinista.

20 Yksi tällainen aktiivisuus on sen vaikutus varhaisiin he-matopoieettisiin soluihin. Tämä aktiivisuus voidaan mitata määrityksellä, jossa mitataan runsaasti lisääntyviä, mahdollisen pesäkkeen muodostavia soluja (HPP-CFC) [Zsebo et ai.. supra. 1988] . Tekijöiden vaikutuksen varhaisiin he- ·. 25 matopoieettisiin soluihin tutkimiseksi HPP-CFC-määritys- 7 systeemissä käytetään hiiren luuydintä, joka on saatu kyseisistä eläimistä 2 päivän kuluttua 5-fluoriurasiili- (5-FU-) käsittelystä. Kemoterapeuttinen lääke 5-FU kuluttaa selektiivisesti myöhäisiä hematopoieettisia kantaisäsolu-30 ja, jolloin varhaisten kantaisäsolujen ja siten tällaisiin *· soluihin vaikuttavien tekijöiden toteaminen tulee mahdol- liseksi. Rotta-SCF maljoitetaan CSF-l:n tai IL-6:n läsnä ollessa puolikiinteisiin agar-agar-viljelmiin. Agar-agar-viljelmät sisältävät McCoyn täydellistä kasvualustaa (Gib- 108140 29 co), 20 % nautasikiöseerumia, 0,3 % agar-agaria ja 2 x 105 luuydinsolua/ml. McCoyn täydellinen kasvualusta sisältää seuraavat ainesosat: lx McCoyn kasvualustaa, jota on täydennetty pitoisuuksilla 0,1 mM pyruvaatti, 0,24x välttä-5 mättöraiä aminohappoja, 0,24x ei-välttämättömiä aminohappoja, 0,027 % natriumbikarbonaattia, 0,24x vitamiineja, 0,72 mM glutamiinia, 25 μg/ml L-seriiniä ja 12 μg/ml L-asparagiinia. Luuydinsolut saadaan Balb/c-hiiristä, joihin on ruiskutettu i.v. 150 mg/kg 5-FU:ta. Reisiluut otetaan 10 talteen 2 päivän kuluttua hiirten 5-FU-käsittelystä ja luuydin huuhdotaan ulos. Punaisissa verisoluissa aiheute-^ taan lyysi punasolulyysin aikaansaavalla reagenssilla (Becton Dickenson) ennen maljoitusta. Testiaineet mal-joitetaan edeltävän seoksen kanssa 30 mm:n maljoihin. 14 15 päivää myöhemmin lasketaan pesäkkeet (< 1 mm halkaisija), jotka sisältävät tuhansia soluja. Tätä määritystä käytettiin kautta luontaisen nisäkässoluperäisen rotta-SCF:n puhdistuksen.

Tyypillisessä määrityksessä rotta-SCF aikaansaa 20 noin 50 HPP-CFC:n lisääntymisen kohden 200 000 maljoitet-tua solua. Rotta-SCF:llä on synergistinen aktiivisuus 5-FU:lla käsiteltyihin hiiren luuydinsoluihin; HPP-CFC-pe-säkkeitä ei muodostu yksittäisten tekijöiden läsnä olles-^ sa, mutta SCF:n ja CSF-l:n tai SCF:n ja IL-6:n yhdistelmä '25 on aktiivinen tässä määrityksessä.

2. MC/9-määritys

Sekä luontaisperäisen rotta-SCF:n että yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:n toinen käyttökelpoinen biologinen aktiivisuus on kyky aikaansaada IL-4-riippuvaisen hiirisyöttö-30 solusolulinjan, MC/9 (ATCC CRL 8306), lisääntyminen. MC/9-. soluja viljellään IL-4-lähteen kanssa ATCC CRL 8306 -me- nettelyjärjestelyn mukaisesti. Biomäärityksessä käytetty kasvualusta on RPMI 1640, 4 % nautasikiöseerumia, pitoisuudet 5 x 10'5 M 2-merkaptoetanolia ja lx glutamiini-pen-35 strep-valmistetta. MC/9-solut lisääntyvät vasteena SCF:lle 108140 30 ilman, että tarvitaan muita kasvutekijöitä. Tämä lisääntyminen mitataan viljelemällä soluja ensin 24 tunnin ajan ilman kasvutekijöitä, minkä jälkeen 5 000 solua maljoite-taan 96-kuopan kuoppalevyn kuhunkin kuoppaan testinäytteen 5 kanssa 48 tunniksi antaen 4 tunnin ajan sykkeitä 0,5 pCirllä 3H-tymidiiniä (spesifinen aktiivisuus 20 Ci/mmol), minkä jälkeen edelleen liuos otetaan talteen lasikuitusuodattimille ja mitataan sitten spesifisesti sitoutunut radioaktiivisuus. Tätä määritystä käytettiin 10 nisäkässoluperäisen rotta-SCF:n puhdistamiseksi ACA 54 -geelisuodatusvaiheen jälkeen, tämän esimerkin osa C2. Tyypillisesti SCF aikaansai 4-10 kertaisen lisäyksen ) minuutissa taustaa vastaan mitatuissa tuikeluvuissa.

3. CFU-GM

15 Puhdistetun nisäkäs-SCF:n, sekä luontaisesti saadun että yhdistelmä-DNA-teknisen, joka ei sisällä häiritseviä pesäkestimuloivia tekijöitä (CSF:iä), vaikutus normaaliin, kuluttamattomaan hiiriluuytimeen on varmistettu. CFU-GM-määritystä [Broxmeyer et ai., Exp♦Hematol♦ 5 (1977) 87] 20 käytetään SCF:n vaikutuksen normaaliin ytimeen ar vioimiseksi. Lyhyesti, kokonaisia luuydinsoluja maljoite-taan punaisten verisolujen lyysin jälkeen puolikiinteisiin agar-agar-viljelmiin, jotka sisältävät testiaineen. 10 päivän kuluttua lasketaan pesäkkeet, jotka sisältävät > 40 * 25 solua käsittäviä rykelmiä. Agar-agar-viljelmät voidaan ) kuivata objektilaseille ja solujen morfologia voidaan määrittää spesifisillä kudosopillisilla värjäyksillä.

Normaalilla hiiriluuytimellä puhdistettu nisäkäs-rottasolu-SCF oli monipuolinen CSF, joka stimuloi pesäkke-30 itten kasvua, jotka koostuivat epäkypsistä soluista, neu-. trofiileistä, makrofageista, eosinofiileistä ja megakaryo-

syyteistä, ilman, että tarvittiin muita tekijöitä. 200 000 maljoitetusta solusta kasvoi yli 100 tällaista pesäkettä 10 päivän aikana. Sekä rotta- että ihmisyhdistelmä-DNA-SCF

31 108140 ! stimuloi punasolujen tuotantoa yhdistettynä EPO:oon, katso i esimerkki 9.

B. Käsitelty kasvualusta

Buffalorottamaksa- (BRL-) 3A -soluja, jotka saatiin 5 talletuslaitoksesta the American Type Culture Collection (ATCC CRL 1442), kasvatettiin mikrokantajilla 20 litran perfuusioviljelysysteemissä SCF:n tuottamiseksi. Tässä systeemissä käytetään Biolafitte-fermentoria (malli ICC-20) lukuun ottamatta mikrokantajien pidätykseen käytettyjä 10 seuloja sekä hapetusputkitusta. 75 mikroni mesh -seulojen tukkeutuminen mikrokantajasta estetään huuhtomalla ajoit-( tain vastasuuntaan, mihin päästään säätöventtiilien ja atk-säädettyjen pumppujen muodostamalla systeemillä. Kukin seula toimii vaihtovuoroisesti kasvualustänsyöttö- ja tal-15 teenottoseulana. Tämä oskilloiva virtauskuvio takaa, et teivät seulat tukkeudu. Hapetus saatiin silikoniputkitus-kierukan (pituus 50 jalkaa = n. 15 m, sisähalkaisija 0,25" = 0,64 cm, seinämäpaksuus 0,03" = 0,08 cm). BRL 3A -solujen viljelyyn käytetty kasvualusta oli minimivaati-20 muskasvualusta (sisälsi Earlen suoloja) (Gibco), jossa oli ptoisuudet 2 mM glutamiini, 3 g/litra glukoosi, tryptoo-sifosfaattia (2,95 g/litra), 5 % nautasikiöseerumia ja 5 % vasikansikiöseerumia. Talteenottokasvualusta oli identti-^ nen lukuunottamatta, että seerumi oli jätetty pois. Reak- .· 25 tori sisälsi Cytodex 2 -mikrokantajia (Pharmacia) pitoisuuden 5 g/litra ja siihen siirrostettiin 3 x 109 BRL 3A -solua, jotka oli kasvatettu rullapulloissa ja irrotettu trypsinoimalla. Solujen annettiin kiinnittyä mikrokanta-jiin ja kasvaa niillä 8 päivän ajan. Kasvualustaa perfu-30 soitiin reaktoriin glukoosikulutuksesta lasketun tarpeen mukaan. Glukoosipitoisuus pidettiin noin 1,5 g:ssa/litra.

8 päivän kuluttua reaktoriin perfusoitiin 6 tilavuutta kasvualustaa, joka ei sisältänyt seerumia, valtaosan seerumista poistamiseksi (proteiinipitoisuus < 50 pg/ml).

35 Reaktoria käytettiin sitten eräkäytössä kunnes glukoosipi- 108140 32 toisuus laski alle 2 g:n/litra. Tästä pisteestä eteenpäin reaktoria käytettiin jatkuvasti perfusoiden nopeudella noin 10 litraa/päivä. Viljelmän pH pidettiin lukemassa 6,9 ± 0,3 C02-virtausnopeutta säätämällä. Liuennut happi 5 pidettiin yli 20 %:n ilmakyllästyksessä lisäämällä puhdasta happea tarpeen mukaan. Lämpötila pidettiin 37 ± 0,5 °C:ssa.

Edeltävästä systeemistä saatiin noin 336 litraa käsiteltyä kasvualustaa, joka ei sisältänyt seerumia, ja 10 sitä käytettiin lähtömateriaalina luontaisen nisäkässolu-peräisen rotta-SCF:n puhdistamiseksi.

C. Puhdistus )

Kaikki puhdistustyö suoritettiin 4 °C:ssa ellei toisin mainittu.

15 1. DEAE-selluloosa-anioninvaihtokromatografia Käsitelty kasvualusta, joka saatiin kasvattamalla seerumivapaissa olosuhteissa BRL 3A -soluja, kirkastettiin suodattamalla 0,45 μ:η Sarto-kapselien (Sartorius) läpi.

Useampi eri erä (41 litraa, 27 litraa, 39 litraa, 30,2 20 litraa, 37,5 litraa ja 161 litraa) käsiteltiin erikseen konsentroimalla, diasuodattamalla/puskurivaihdolla, ja DEAE-selluloosa-anioninvaihtokromatoggrafisesti samaan tapaan kunkin erän kohdalla. Sitten DEAE-selluloosapoolit yhdistettiin ja prosessoitiin edelleen yhtenä eränä tämän 25 esimerkin osien C2-5 mukaisesti. Tämän havainnollistami- ' seksi, 41 litran erää käsiteltiin seuraavasti. Suodatettu käsitelty kasvualusta konsentroitiin n. 700 mlrksi käyttäen Millipore Pellicon -tangenttivirtausultrasuodatus-laitteistoa, jossa oli 4 polysulfonimembraanikasettia, 30 joiden kynnysarvo oli molekyylipainossa 10 000 (kokonais-membraaniala 20 ft2 * 1,9 m2; pumppausnopeus noin 1 095 ml/min ja suodatusnopeus 250 - 315 ml/min). Anioninvaih-tokromatografiaa valmisteleva diasuodatus/puskurivaihto suoritettiin sitten lisäämällä 500 ml 50 mM Tris-HCl-pus-35 kuria, pH 7,8, konsentraattiin, konsentroimalla toistami-

1 081 4:Q

33 seen 500 ml:ksi käyttäen tangenttivirtausultrasuodatus-laitteistoa, ja toistamalla tämä vielä 6 kertaan. Konsen-troitua/diasuodatettua valmistetta saatiin lopulta talteen 700 ml:n tilavuus. Valmiste panostettiin DEAE-selluloo-5 sa-anioninvaihtokolonniin (5 x 20,4 cm; Whatman DE-52 -hartsi), jota oli tasapainoitettu 50 mM Tris-HCl-pusku-rilla, pH 7,8. Näytteen panostuksen jälkeen kolonni pestiin 2 050 ml:11a Tris-HCl-puskuria, jolloin käytettiin suolagradienttia (0 - 300 mM NaCl Tris-HCl-puskurissa; 4 10 litran kokonaistilavuus). Kerättiin 15 ml:n fraktioita virtausnopeuden ollessa 167 ml/tunti. Kromatografia esi-( tetään kuviossa 1. HPP-CFC-pesäkeluku viittaa biologiseen aktiivisuuteen HPP-CFC-määrityksessä; 100 μΐ mainituista fraktioista analysoitiin. Näytepanostuksen ja pesun aikana 15 kerättyjä fraktioita ei ole esitetty kuviossa; mitään biologista aktiivisuutta ei todettu näistä fraktioista.

Kaikkien käsiteltyjen kasvualustaerien käytös, joille suoritettiin konsentrointi, diasuodatus/puskuri-vaihto ja anioninvaihtokromatografia, oli samankaltainen. 20 Erien proteiinipitoisuudet, jotka määritettiin Bradfordin menetelmällä [Anal.Biochem. 72 (1976) 248 - 254] käyttäen nautaseerumialbumiinia standardina oli 30 - 50 pg/ml. Tähän valmisteeseen käytetyn käsitellyn kasvualustan kokona-, istilavuus oli noin 336 litraa.

25 2. ACA 54 -geelisuodatuskromatografia DEAE-selluloosakolonneista, jotka oli ajettu kullekin 6 käsitellylle kasvualustaerälle, joihin viitattiin edellä (esimerkiksi fraktiot 87 - 114 kuviossa 1 esitetystä ajosta) saadut fraktiot, joilla oli biologista ak-30 tiivisuutta, yhdistettiin (kokonaistilavuus 2 900 ml) ja konsentroitiin 74 ml:n lopputilavuudeksi käyttäen Amiconin sekoitettuja kennoja ja YM10-membraaneja. Tämä materiaali panostettiin ACA 54 - (LKB) geelisuodatuskolonniin (kuvio 2), jota oli tasapainoitettu 50 mM Tris-HCl-puskurilla, 35 jossa oli pitoisuus 50 mM NaCl, pH 7,4. Kerättiin 14 ml:n 34

1 Ο δ Ί 4 Q

fraktioita virtausnopeuden ollessa 70 ral/tunti. Inhiboivien tekijöiden johdosta, jotka eluoituivat yhdessä aktiivisten fraktioiden kanssa, aktiivisuushuippu (HPP-CFC-pe-säkeluku) vaikuttaa hajonneelta; kuitenkin aiempien kroma-5 togrammien nojalla aktiivisuus eluoituu yhdessä pääasiallisen proteiinipiikin kanssa, minkä vuoksi fraktioista valmistettiin yksi pooli.

3. Vehnänalkioagglutiniini-agaroosikromatografia Fraktiot 70 - 112 ACA 54 -geelisuodatuskolonnista 10 yhdistettiin (500 ml). Pooli jaettiin kahtia ja kummallekin puolikkaalle suoritettiin kromatografia-ajo käyttäen vehnänalkioagglutiniini-agaroosikolonnia (5 x 24,5 cm; ) hartsi valmistajalta E-Y Laboratories, San Mateo, CA; vehnänalkioagglutiniini tunnistaa tiettyjä hiilihydraat-15 tirakenteita), jota oli tasapainoitettu 20 mM Tris-HCl-puskurilla, jossa oli pitoisuus 500 mM NaCl, pH 7,4. Näy-tepanostuksien jälkeen kolonnia pestiin noin 2 200 ml:11a kolonnipuskuria, minkä jälkeen sitoutunut materiaali eluoitiin käyttämällä liuosta, jossa oli 350 mM N-asetyy-20 li-D-glukosamiinia liuotettuna kolonnipuskuriin, alkaen kuvion 3 mukaisesta fraktiosta n. 210. Kerättiin 13,25 ml:n fraktioita virtausnopeuden ollessa 122 ml/tunti. Yksi kromatografia-ajoista on esitetty kuviossa 3. Määritettäviä fraktio-osuuksia dialysoitiin vastaan fosfaatti-25 puskuroitua suolaliuosta; 5 μΐ dialysoituja materiaaleja ' käytettiin MC/9-määrityksessä (tuiketta/min-lukemat kuviossa 3) ja 10 μΐ HPP-CFC-määrityksessä (pesäkelukuarvot kuviossa 3). Voidaan havaita, että aktiivinen materiaali sitoutui kolonniin ja eluoitui N-asetyyli-D-glukosamiinin 30 kanssa, kun taas suuri osa epäpuhtauksina läsnä olevasta materiaalista kulki kolonnin läpi näytepanostuksen ja pesun aikana.

108140 35 4. S-Sepharose-nopeavirtauskationinvaihtokromato- grafia

Fraktiot 211 - 225 kuviossa 3 esitetystä vehnänal-kioagglutiniinikromatografiasta sekä ekvivalenttiset 5 fraktiot toisesta ajosta yhdistettiin pooliksi (375 ml), jota dialysoitiin vastaan 25 mM natriumformaattiliuosta, pH 4,2. Alhaiselle pHtlle alttiiksi joutumisajan minimoimiseksi dialyysi suoritettiin 8 tunnin aikana vastaan 5 puskurilitraa, jolloin 8 tunnin aikana suoritettiin 4 10 vaihtoa. Tämän dialyysiäjän päättyessä näytetilavuus oli 480 ml ja näytteen pH ja johtokyky olivat lähellä dialyy-( sipuskurin vastaavia. Näytteeseen ilmaantui saostunutta materiaalia dialyysin aikana. Tämä poistettiin sentrifu-goimalla 22 000 x g:ssä 30 minuutin ajan, ja sentrifugoi-15 dusta näytteestä saatu supernatantti panostettiin S-Seph-arose Fast Flow -kationinvaihtokolonniin (3,3 x 10,25 cm; hatsi valmistajalta Pharmacia), jota oli tasapainoitettu natriumformaattipuskurilla. Virtausnopeus oli 465 ml/tunti ja kerättiin 14,2 ml:n fraktioita. Näytepanostuksen jäl-20 keen kolonnia pestiin 240 ml;11a kolonnipuskuria, minkä jälkeen sitoutunut materiaali eluoitiin käyttäen gradient-tia 0 - 750 mM NaCl (NaCl liuotettiin kolonnipuskuriin; gradientin kokonaistilavuus 2 200 ml), alkaen kuvion mukaisesta fraktiosta n. 45. Eluutioprofiili on esitetty ^ 25 kuviossa 4. Kerättyjen fraktioiden pH säädettiin lukemaan 7 - 7,4 lisäämällä 200 μΐ 0,97 M Tris-emästä. Tuiket-ta/min-lukemat kuviossa 4 viittaavat jälleen biologisessa MC/9-määrityksessä saatuihin tuloksiin; osuuksia mainituista fraktioista dialysoitiin vastaan fosfaattipusku-30 roitua suolaliuosta, ja 20 μΐ käytettiin määrityksessä.

. Kuviosta 4 voidaan havaita, että valtaosa biologisesti aktiivisesta materiaalista kulki kolonnin läpi siihen sitoutumatta, kun taas runsaasti epäpuhtautena läsnä olevaa materiaalia sitoutui ja eluoitui suolagradientin mukana.

Ί Γ! f' Ί , -

< ϋ ϋ I 4 U

36 υ 5. Kromatografia käyttäen piidioksidiin sidottua hiilivetyhartsia

Fraktiot 4-40 kuvion 4 mukaisesta S-Sepharose-kolonnista yhdistettiin pooliksi (540 ml). 450 ml poolista 5 yhdistettiin samaan tilavuuteen puskuria B (100 mM amm-oniumasetaatti, pH 6:isopropanoli; 25:75) ja panostettiin virtausnopeuden ollessa 540 ml/tunti C4-kolonniin (Vydac Proteins C4; 2,4 x 2 cm), jota oli tasapainoitettu puskurilla A (60 mM ammoniumasetaatti, pH6:isopropanoli; 10 62,5:37,5). Näytteen panostuksen jälkeen virtausnopeus laskettiin 154 ml:ksi/tunti ja kolonnia pestiin 200 ml:11a puskuria A. Sitten käytettiin lineaarista gradienttia pus- ) kurista A puskuriin B (kokonaistilavuus 140 ml) ja kerättiin 9,1 ml:n fraktioita. Näyte-eriin S-Sepharose-kroma-15 tografiapoolista, C4-kolonnilähtönäytteestä, läpiajopoo- lista ja pesupoolista säädettiin pitoisuus 40 pg/ml nauta-seerumialbumiinia lisäämällä oikea tilavuus varastoliuos-ta, jossa pitoisuus oli 1 mg/ml, ja dialysoitiin vastaan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta biologista määritystä 20 silmällä pitäen. Vastaavasti 40 μ1:η eriä gra- dienttifraktioista yhdistettiin 360 pl:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 16 pg nautaseerumial-bumiinia, minkä jälkeen suoritettiin dialyysi vastaan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta biologista määritystä ^ 25 silmällä pitäen. Nämä eri fraktiot määritettiin MC/9-mää- rityksellä (6,3 μ1:η näyte-eriä valmistetuista gradient-tifraktioista? tuiketta/min kuviossa 5). Määritystulokset osoittivat samoin, että noin 75 % talteen saadusta aktiivisuudesta oli läpiajo- ja pesufraktioissa, ja 25 % gra-30 dienttifraktioissa, jotka esiintyvät kuviossa 5. SDS-PAGE . [Laemmli, Nature 227 (1970) 680 - 685; panostusgeelit si sälsivät 4 % (w/v) akryyliamidia ja erotusgeelit sisälsivät 12,5 % (w/v) akryyliamidia] eri fraktioiden näyte- erille on esitetty kuviossa 6. Esitetyn geelin näyte-erät 35 kuivattiin tyhjössä, minkä jälkeen ne uudelleenliuotettiin m 10S Un 37 käyttäen 20 μΐ näytekäsittelypuskuria (ei-pelkistävä, eli ei sisällä 2-merkaptoetanolia) ja keitettiin 5 minuutin ajan ennen panostusta geeliin. Vyöhykkeet A ja B edustavat kolonnilähtömateriaalia (75 μΐ 890 ml:sta) ja vastaavasti 5 kolonniläpiajoa (75 μΐ 880 mlrsta); numeroidut merkit kuviossa vasemmalla edustavat merkkien migraatioasemia (pelkistetty), joiden molekyylipainot ovat 103 kertaa ilmoitettu luku, jolloin merkit ovat fosforylaasi-b (Mr = 97 400), nautaseerumialbumiini (Mr = 66 200), muna-albumiini (Mr = 10 42 700), karbonihappoanhydraasi (Mr = 31 000), soijapapu- trypsiini-inhibiittori (Mr = 21 500) ja lysotsyymi (Mr = { 14 400); vyöhykkeet 4-9 edustavat vastaavia fraktioita, j otka on kerätty gradienttia käytettäessä (60 μΐ 9,1 ml:sta). Geeli värjättiin hopealla [Morrissey, Anal. 15 Biochem. 117 (1981) 307 - 310]. Verrattaessa vyöhykkeitä A ja B voidaan havaita, että valtaosa värjätystä materiaalista kulkee kolonnin läpi. Värjätty materiaali fraktioissa 4 - 6 alueella, joka on juuri Mr = 31 000 standardi-aseman ylä- ja alapuolella, osuu yksiin gradienttifrak-20 tioissa tavatun biologisen aktiivisuuden kanssa (kuvio 5) ja edustaa biologisesti aktiivista materiaalia. Huomattakoon, että tämä materiaali tulee näkyviin vyöhykkeissä 4 -6, mutta ei vyöhykkeissä A ja/tai B, koska huomattavasti suurempi osuus kokonaistilavuudesta (0,66 % kokonaisuudes- ^ 25 ta fraktioille 4-6 verrattuna 0,0084 %:iin kokonaisuu- « desta vyöhykkeille A ja B) panostettiin edeltävässä tapauksessa. Fraktiot 4-6 tästä kolonnista yhdistettiin pooliksi.

Kuten edellä mainittiin, suunnilleen 75 % talteen 30 saadusta aktiivisuudesta kulki kuvion 5 mukaisen C4-ko-’ lonnin läpi. Tällä materiaalilla suoritettiin toinen kro- matografia-ajo käyttäen C4-hartsia oleellisesti kuten edellä kuvattiin lukuunottamatta, että käytettiin suurempaa kolonnia (1,4 x 7,8 cm) ja hitaampaa virtausnopeutta 35 (50 - 60 ml/tunti). Suunnilleen 50 % talteen saadusta ak-

38 108 1 4Q

tiivisuudesta oli läpiajossa,· ja 50 % gradienttifrak- tioissa, jotka näyttivät SDS-PAGE:ssa samanlaisilta kuin kuvion 6 mukaiset aktiiviset gradienttifraktiot. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin pooliksi (29 ml).

5 Analyyttinen C4-kolonniajo suoritettiin samoin oleellisesti kuten edellä esitettiin, ja fraktiot määritettiin kummallakin biomäärityksellä. Kuten esitetään kuviossa 7, tästä analyyttisesta kolonnista saaduista fraktioista sekä MC/9- että HPP-CFC-bioaktiivisuudet eluoitu-10 vat samanaikaisesti. SDS-PAGE-analyysi (kuvio 8) paljastaa, että kolonnifraktioissa, jotka sisältävät biologista aktiivisuutta kummassakin määrityksessä, on läsnä pro- ^ teiini, jolle Mr = n. 31 000.

Aktiivista materiaalia toisesta (suhteellisen pie-15 nestä) aktiivisuuspiikistä, joka nähdään S-Sepharose-kro-matografiässä (esim. kuvio 4, fraktiot 62 - 72, aikaiset fraktiot suolagradienttia käytettäessä) puhdistettiin niinikään C4-kromatografisesti. Se osoitti samaa käytöstä SDS-PAGE:ssa ja sen N-pään aminohapposekvenssi (katso esi-20 merkki 2D) oli samanlainen kuin materiaalin, joka saatiin S-Sepharose-läpiajofraktioiden C4-kromatografiästä.

6. Yhteenveto puhdistuksesta

Yhteenveto edellä kohdissa 1-5 kuvatuista puh-distusvaiheista esitetään taulukossa 2. \ 25 · ^ « 39 108140

Taulukko 2

Yhteenveto nisäkäs-SCF:n puhdistuksesta

Vaihe Tilavuus Kokonais- 5 proteiini (ml) (mg)5 Käsitelty kasvualusta 335 700 13 475 DEAE-selluloosa1 2 900 2 164 10 ACA-54 550 1 513

Vehnänalkioagglutiniini-agaroosi2 375 431 ^ S-Sepharose 5404 10 C4-hartsi3 57,3 0,25 - 0,406 15 1. Ilmoitetut arvot edustavat summaa arvoista, jotka saatiin tekstissä kuvatuille eri erille.

2. Kuten edellä tässä esimerkissä kuvattiin, saostunut materiaali, joka ilmaantui tämän näytteen dialyysin aikana S-Sepharose-kromatografiaan valmistauduttaessa, 20 poistettiin sentrifugoimalla. Sentrifugoinnin jälkeinen näytteen (480 ml) kokonaisproteiinipitoisuus oli 264 mg.

3. Yhdistelmä aktiivisista gradienttifraktioista, jotka saatiin kahdesta C4-kolonnista, jotka ajettiin ku- ( vatun mukaisesti sarjassa.

*.25 4. Vain 450 ml tätä materiaalia käytettiin seuraa- vaan vaiheeseen (tämä esimerkki, edellä).

5. Määritettiin Bradfordin menetelmällä (supra, 1976) ellei toisin mainittu.

6. Arvio, joka perustuu SDS-PAGE:n jälkeisen hopea- 30 värjäyksen voimakkuuteen sekä aminohappokoostumusanalyy- : siin esimerkin 2 osassa K kuvatun mukaisesti.

« D. SDS-PAGE- ja glykosidaasikäsittelyt SDS-PAGE pooliksi yhdistetyistä gradienttifraktioista kahdesta suuren mittakaavan C4-kolonniajosta esi-35 tetään kuviossa 9. 60 μΐ ensimmäisen C4-kolonnin poolista 108140 40 panostettiin (vyöhyke 1), ja 40 μΐ toisen C4-kolonnin poolista (vyöhyke 2). Nämä geelivyöhykkeet värjäytyivät hopealla. Molekyylipainomerkit olivat kuten kuvataan kuviossa 6. Kuten mainittiin, diffuusisti migroituva mate-5 riaali, joka on Mr = 31 000 merkkiaseman ylä- ja alapuolella, edustaa biologisesti aktiivista materiaalia; näennäinen heterogeenisyys johtuu valtaosin heterogeenisyydestä glykosylaatiossa.

Glykosylaation karakterisoimiseksi puhdistettua 10 materiaalia jodattiin käyttäen 125I:tä, käsiteltiin erilaisilla glykosidaaseilla ja analysoitiin SDS-PAGE:lla (pelkistävät olosuhteet) ottaen autoradiokuvia. Tulokset ) esitetään kuviossa 9. Vyöhykkeet 3 ja 9, 125I-leimattu materiaali, jota ei ole käsitelty glykosidaasilla. Vyöhyk-15 keet 4-8 edustavat 125I-leimattua materiaalia, jota on käsitelty glykosidaaseilla seuraavalla tavalla. Vyöhyke 4, neuraminidaasi. Vyöhyke 5, neuraminidaasi ja O-glykanaasi.

Vyöhyke 6, N-glykanaasi. Vyöhyke 7, neuraminidaasi ja N-glykanaasi. Vyöhyke 8, neuraminidaasi, O-glykanaasi ja N-20 glykanaasi. Olosuhteet olivat 5 mM 3-[(3-kolamido-propyyli)dimetyyliammonio]-1-propaanisulfonaatti (CHAPS), 33 mM 2-merkaptoetanoli, 10 mM Tris-HCl, pH 7 - 7,2, 3 tunnin ajan 37 °C:ssa. Neuraminidaasia (organismista Arthrobacter ureafaciens; Calbiochem) käytettiin loppupi-. 25 toisuutena 0,23 yksikköä/ml. O-glykanaasia (Genzyme; endo- ) alfa-N-ase.tyyligalaktosaminidaasi) käytettiin 45 milliyk-sikköä/ml. N-glykanaasia (Genzyme; peptidi:N-glykosidaasi-F; peptidi-N4 [N-asetyyli-beta-glukosaminyyli ] aspa-ragiiniamidaasi) käytettiin pitoisuutena 10 yksikköä/ml.

30 Samankaltaisia tuloksia kuin kuviossa 9 saatiin /· käsittelemällä ei-leimattua puhdistettua SCF:ää glykosi daaseilla ja tekemällä tuotteet näkyviksi värjäämällä hopealla SDS-PAGE:n jälkeen.

Kun tarkoituksenmukaista, suoritettiin erilaisia 35 verrokki-inkubointeja. Näihin lukeutuivat; inkubointi ! 41 108140 tarkoituksenmukaisessa puskurissa, mutta ilman glykosi-daaseja, sen varmistamiseksi, että tulokset johtuivat lisätyistä glykosidaasivalmisteista; inkubointi glykosyloi-duilla proteiineilla (esim. glykosyloitu yhdistelmä-DNA-5 ihmiserytropoietiini), jotka tiedettiin glykosidaasisubs- traateiksi, sen varmistamiseksi, että käytetyt glykosi-daasientsyymit olivat aktiivisia; ja inkubointi glykosi-daaseilla mutta ilman substraattia, sen varmistamiseksi, etteivät itse glykosidaasit myötävaikuttaneet näkyviksi 10 tehtyihin geelinauhoihin tai häirinneet niitä.

Glykosidaasikäsittelyjä suoritettiin myös endo-be-( ta-N-asetyyliglukosamidaasi-F:llä (endo-F; NEN Dupont) ja endo-beta-N-asetyyliglukosaminidaasi-H:lla (endo-H; NEN Dupont) jälleen käyttäen tarkoituksenmukaisia verrokki-15 inkubointeja. Olosuhteet endo-F-käsittelyssä olivat: keittäminen 3 minuutin ajan, kun läsnä olivat pitoisuudet 1 % (w/v) SDS:ää, 100 mM 2-merkaptoetanoli, 100 mM EDTA, 320 mM natriumfosfaatti, pH 6, minkä jälkeen laimennettiin 3-kertaisesti sisällyttämällä mukaan Nonidet P-40 -valmis-20 tetta (1,17 %, v/v, loppupitoisuus), natriumfosfaattia (200 mM, loppupitoisuus) ja endo-F:ää (7 yksikköä/ml, loppupitoisuus ). Endo-H-käsittelyn olosuhteet olivat samankaltaiset lukuunottamatta, että SDS-pitoisuus oli 0,5 % (w/v) ja endo-H:ta käytettiin pitoisuutena 1 pg/ml. Tulok-^ ^ 25 set endo-F:llä olivat samat kuin tulokset N-glykanaasilla, kun taas endo-H:11a ei ollut mitään vaikutusta puhdistettuun SCF-materiaaliin.

Koko joukko johtopäätöksiä voidaan tehdä edellä kuvatuista glykosidaasikokeista. Eri käsittelyt N-glyka-30 naasilla [joka poistaa sekä kompleksista että runsaasti mannoosia sisältävää N-kytkettyä hiilihydraattia (Tarenti-no et ai., Biochemistry 24 (1985) 4665 - 4671], endo-F:llä [joka toimii samalla tavalla kuin N-glykanaasi (Elder ja Alexander, Proc.Natl.Acad.Sei.USA 79 (1982) 4540 - 4544], 35 endo-H:11a [joka poistaa runsaasti mannoosia sisältävää ja 108140 42 tiettyä hybridityyppiä edustavaa N-kytkettyä hiilihydraattia (Tarentino et ai., Methods Enzymol. 50C (1978) 574 -580], neuraminidaasilla (joka poistaa sialiinihappotähtei-tä) ja O-glykanaasilla [joka poistaa tiettyjä O-kytkettyjä 5 hiilihydraatteja (Lambin et ai,, Biochem.Soc.Trans. 12 (1984) 599 - 600], viittaavat siihen, että: läsnä on sekä N-kytkettyjä että O-kytkettyjä hiilihydraatteja; valtaosa N-kytketystä hiilihydraatista edustaa kompleksityyppiä; ja sialiinihappoa on läsnä, jolloin ainakin osa siitä muodos-10 taa osan O-kytketyistä ryhmistä. Joitakin tietoja mahdollisista N-kytkentäkohdista voidaan saada aminohapposek-venssitiedoista (esimerkki 2). Se tosiasia, että käsittely ) N-glykanaasilla, endo-F:llä ja N-glykanaasi/neuraminidaa-silla voi muuttaa SDS-PAGE:ssa ilmeisen heterogeenisen 15 materiaalin nopeammin migroituviksi muodoiksi, jotka ovat hyvin paljon homogeenisempia, sopii johtopäätökseen, jonka mukaan materiaali kokonaisuudessaan on samaa polypeptidiä, jolloin heterogeenisyyden aiheuttaa heterogeenisyys glyko-sylaatiossa. Samoin merkille pantavaa on, että pienimmät 20 muodot, jotka saadaan käsittelemällä eri glykosidaaseilla yhdessä, ovat alueella Mr = 18 000 - 20 000 suhteessa SDS-PAGE:ssa käytettyihin molekyylipainomerkkeihin.

Vahvistuksen siitä, että diffuusista migroituva materiaali Mr = 31 000 aseman SDS-PAGE:ssa ympärillä 25 edustaa biologisesti aktiivista materiaalia, jolla koko- ^ naisuudessaan on sama peruspolypeptidiketju, antaa se tosiseikka, että aminohapposekvenssitiedot, jotka saadaan tälle alueelle migroituvasta materiaalista' (esim. elek-troforeettisen siirron ja käsittelyn syaanibromidilla 30 jälkeen; esimerkki 2), sopivat tietoihin, jotka osoitet-• tiin eristetylle geenille, jonka ilmennys yhdistelmä-DNA- teknisesti johtaa biologisesti aktiiviseen materiaaliin (esimerkki 4).

43 1 Γ: Γ 1 - .·,

I V. ) -· -J

Esimerkki 2

Nisäkäs-SCF:n aminohapposekvenssianalyysi A. Käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiällä (HPLC) puhdistettu proteiini 5 Noin 5 pg:lla SCF:ää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 (pitoisuus = 0,117 mg/ml), suoritettiin

käänteisfaasi-HPLC käyttäen C4-kapeahuokoskolonnia (Vydac, 300 A huokoshalkaisija, 2 mm x 15 cm). Proteiini eluoitiin lineaarisella gradientilla 97 % liikkuva faasi A

10 (0,l-%:inen trifluorietikkahappo)/3 % liikkuva faasi B

(90 % asetonitriiliä 0,l-%:isessa trifluorietikkahapossa) ( -» 30 % liikkuva faasi A /70 % liikkuva faasi B 70 minuu tissa, minkä jälkeen eluoitiin isokraattisesti vielä 10 minuutin ajan virtausnopeuden ollessa 0,2 ml/min. Pusku-15 risokeakokeen antama tausta vähennettiin kromatogrammista, minkä jälkeen SCF nähtiin yksittäisenä symmetrisenä piikkinä, jonka retentioaika oli 70.05 min kuten esitetään kuviossa 10. Mitään merkittäviä epäpuhtauksien antamia proteiinipiikkejä ei voitu havaita näissä olosuhteissa.

20 B. Elektroforeettisesti siirrettyjen proteiininau- hojen sekventointi SCF:ää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 (0,5 - 1,0 nmol) käsiteltiin seuraavasti N-glykanaasilla, joka on entsyymi, joka pilkkoo spesifisesti proteiineihin . 25 kovalenttisesti kiinnittyneitä Asn-kytkettyjä hiilihyd- raattiryhmiä (katso esimerkki ID). 6 ml pooliksi yhdistettyä materiaalia kuvion 5 mukaisen C4-kolonnin fraktioista 4-6 kuivattiin tyhjössä. Sitten lisättiin 150 μΐ liuosta, jossa oli pitoisuudet 14,25 CHAPS, 100 mM 2-mer-30 kaptoetanoli, 335 mM natriumfosfaatti, pH 8,6, ja inkuboi-: tiin 95 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitten lisättiin 300 μΐ liuosta, jossa oli pitoisuudet 74 mM natriumfosfaatti, 15 yksikköä/ml N-glykanaasia, pH 8,6, ja inkubointia jatkettiin 19 tunnin ajan. Sitten näyte ajettiin 9 - 18-%:isessa 35 SDS-polyakryyliamidigradienttigeelissä (paksuus 0,7 mm, 44

1CC 1 4Q

20 x 20 cm). Proteiininauhat geelistä siirrettiin elektro-foreettisesti polyvinyylifluoridiin (PVDF, Millipore Corp.) käyttäen 10 mM Caps-puskuria (pH 10,5) jatkuvan virran ollessa 0,5 Amp ja ajoajan 1 tunti [Matsudaira, Jj_ 5 Biol. Chem. 261 (1987) 10035 - 10038]. Siirretyt pro teiininauhat tehtiin näkyviksi värjäämällä Coomassie Blue -värillä. Nauhoja esiintyi kohdissa Mr = n. 29 000 - 33 000 ja Mr = n. 26 000, eli deglykosylaatio oli vain osittainen (vertaa esimerkki ID, kuvio 9); edeltävä nauha edustaa ei-10 pilkottua materiaalia ja jälkimmäinen nauha edustaa materiaalia, josta N-kytketty hiilihydraatti on poistettu.

Nauhat leikattiin irti ja panostettiin suoraan (40 % Mr = ) 29 000 - 33 000 proteiinille ja 80 % Mr = 26 000 proteiinille) proteiinisekventoijaan (Applied Biosystems 15 Inc., malli 477). Proteiinisekvenssianalyysi suoritettiin käyttäen valmistajan toimittamia ohjelmia [Hewick et ai., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997] ja vapautuneet fe-nyylitiohydantoinyyliaminohapot analysoitiin "on-line" (suoraan) käyttäen mikrohuokos-C18-käänteisfaasi-HPLC:tä.

20 Kumpikaan nauha ei antanut mitään signaaleja 20 - 28 sek- ventointikierroksella, mikä viittasi siihen, että kumpaakaan ei voitu sekventoida Edman-kemiaa soveltavalla metodiikalla. Taustataso kussakin sekventointiajossa oli 1-7 pmol, joka oli runsaasti alle nauhojen sisältämän pro-, 25 teiinimäärän. Nämä tiedot viittasivat siihen, että pro- ) teiini nauhoissa oli N-päästään salvattu.

C. Elektroforeettisesti siirretyn proteiinin CNBr-pilkkominen in situ sekä sekventointi

Sen varmistamiseksi, että proteiini oli tosiaan 30 salvattu, membraanit poistettiin sekventoijasta (osa B) ja suoritettiin siirrettyjen nauhojen in situ -pilkkominen syaanibromidilla (CNBr) [CNBr (5 %, w/v) 70-%:isessa muurahaishapossa 1 tunnin ajan 45 °C:ssa], minkä jälkeen suoritettiin kuivaus ja sekvenssianalyysi. Todettiin voimak-35 kaita sekvenssisignaaleja, jotka edustivat sisäisiä pepti- 45 ^ OS 7 40 dejä, jotka olivat muodostuneet CNBr:n pilkkoessa me-tionyylipeptidisidoksen♦

Kummastakin nauhasta saatiin identtisiä sekasek-venssisignaaleja, jotka on lueteltu alla viidelle ensim-5 mäiselle kierrokselle.

Identifioidut aminohapot Kierros 1: Asp; Glu; Vai; Ile; Leu

Kierros 2: Asp; Thr; Glu; Ala; Pro; Vai

Kierros 3: Asn; Ser; His; Pro; Leu 10 Kierros 4: Asp; Asn; Ala; Pro; Leu Kierros 5: Ser; Tyr; Pro (

Kummastakin nauhasta saatiin samoin samanlaiset signaalit aina kierrokselle 20. Alkuperäiset saannot oli-15 vat 40 - 115 pmol Mr = 26 000 nauhalle ja 40 - 150 pmol Mr = 29 000 - 33 000 nauhalle. Nämä arvot ovat verrattavia alkuperäisiin proteiinimoolimääriin, jotka panostettiin sekventoijaan. Tulokset varmistivat sen, että SCF:ää vastaavissa proteiininauhoissa N-pää oli salvattu. Menette-20 lyjä, joita käytettiin käyttökelpoisen sekvenssitiedon saamiseksi N-päästä salvatusta proteiinista, olivat; (a) salpauksen poisto N-päästä (katso osa D); ja (b) peptidien muodostaminen sisäisesti pilkkomalla CNBr:llä (katso osa E), trypsiinillä (katso osa F), ja Staphylococcus aureus -^ . 25 (kanta V-8) proteaasilla (Glu-C) (katso osa G). Sekvens- sianalyysi voidaan suorittaa, kun N-pään salpaava aminohappo on poistettu, tai peptidifragmentteja eristetty. Esimerkkejä kuvataan alla yksityiskohtaisesti.

D. Sekvenssianalyysi BRL-kantasolutekijälle, jota 30 on käsitelty pyroglutamiinihappoaminopeptidaasilla • SCF:n aminopäässä esiintyvän salpaavan ryhmän ke miallisen luonteen ennustaminen oli vaikeata. Salpaus voi olla tapahtunut luennan jälkeen in vivo [F. Wold, Ann.-Rev.Biochem. 50 (1981) 783 - 814] tai salpaus voi tapahtua 35 in vitro puhdistuksen aikana. Yleisimmin todetaan kahta 7 Π ο .7 * _ 46 ' ^ / 4 Ο ’ ***· luennan jälkeen tapahtunutta modifikaatiota. Tiettyjen N-pään aminohappojen, kuten Ala:n, Ser:n jne., asetylointi voi tapahtua N-alfa-asetyylitransferaasin. katalysoimana.

Tämä voidaan varmistaa eristämällä N-pään salvattu peptidi 5 ja suorittamalla sen massaspektrometrinen analyysi. Jos proteiinin aminopäässä on glutamiini, voi tapahtua sen gamma-amidin deamidaatio. Sen jälkeen voi tapahtua gamma-karboksylaatin ja vapaan N-pään syklisaatio, jossa muodostuu pyroglutamaatti. Pyroglutamaatin toteamiseksi voidaan 10 käyttää entsyymiä pyroglutamaattiaminopeptidaasi. Tämä entsyymi poistaa pyroglutamaattitähteen, jolloin toisesta aminohaposta alkava aminopää jää vapaaksi. Sen jälkeen ^ sekventointi voidaan suorittaa Edman-kemiaa käyttäen.

SCFrää (joka oli puhdistettu kuten esimerkissä 1; 15 400 pmol) 50 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,6; si sältää ditiotreitolia ja EDTA:ta) inkuboitiin 1,5 yksiköllä vasikanmaksapyroglutamiinihappoaminopeptidaasia (pE-AP) 16 tunnin ajan 37 °C:ssa. Reaktion jälkeen seos panostettiin suoraan proteiinisekventoijaan. Runsas sekvenssi 20 voitiin identifioida 46 kierroksella. Alkuperäinen saanto oli noin 40 % ja kertautuva saanto oli 94,2 %. SCF:n N-pääsekvenssi mukaan lukien N-pään pyroglutaamiinihappo oli seuraava: 25 pE-AP-pilkkomiskeskus ^ •4 10 pyroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp-Ile-Thr-Lys- 20 30 30 Leu-Val-Ala-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-ne-Thr-Leu-Asn-Tyr-Val- 40

Ala-Gly-Met-Asp-Val-Leu-Pro-Ser-His-xxx-Trp-Leu-Arg-Asp-.........

xxx, ei määritetty asemaan 43 35 108140 47 Nämä tulokset osoittivat, että SCF sisältää pyro-glutamiinihapon N-päässään.

E. CNBr-peptidien eristys ja sekvenssianalyysi SCF:ää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 5 (20-28 pg; 1,0 - 1,5 nraol), käsiteltiin N-glykanaasilla kuten kuvattiin esimerkissä 1. Materiaalin, jolle Mr = 26 000, konversio oli täydellinen tässä tapauksessa. Näyte kuivattiin ja sitä pilkottiin CNBr:llä 70-%:isessa muurahaishapossa (5 %) 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.

10 Pilkkomistuotetta laimennettiin vedellä, se kuivattiin ja ( uudelleenliuotettiin sitten 0,l-%:iseen trifluorietikka- happoon. CNBr-peptidit erotettiin käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen C4-kapeahuokoskolonnia ja eluointiolosuhteita, jotka olivat identtiset tämän esimerkin osassa A kuvattui-15 hin nähden. Eristettiin useita runsaita peptidifraktioita, jotka sekventoitiin, mistä tulokset on koottu seuraavaan:

Peptidi Retentioaika Sekvenssi4 (min)

20 GB-4 15,5 L-P-P

GB-61 22,1 a. I-T-L-N-Y-V-A-G-(M) b. V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-S-_-_-L-G-P-E-K-D- ( S-R-V-S-V-(_)-K---- 25 GB-8 28,0 D-V-L-P-S-H-C-W-L-R-D-(M) GB-10 30,1 (sisältää sekvenssin CB-8) GB-152 43,0 E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-L-K-K-P-T-R-(N)-F- T-P-E-E-F-F-S-I-F-D3-R-S-I-D-A......

30 GB-14 37,3 ja GB-16 Molemmat peptidit sisältä vät CG-15:een nähden ident-35 tisen sekvenssin.

108140 48 1. Aminohappoja ei todettu asemissa 12, 13 ja 25.

Peptidiä b ei sekventoitu loppuun.

2. (N):ää CB-15:ssä ei todettu; se pääteltiin mahdollisen N-kytketyn glykosylaatiokeskuksen nojalla. Pep- 5 tidiä ei sekventoitu loppuun.

3. Merkitsee kohtaa, jossa Asn on mahdollisesti muuttunut Aspiksi N-glykanaasin poistaessa N-kytketyn sokerin.

4. Käytettiin yksikirjainkoodia: A, Ala; C, Cys; D, 10 Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L,

Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T,

Thr; V, Vai; W, Trp; ja Y, Tyr. ) F. BRL-kantasolutekijätrypsiinifragmenttien eristys 15 ja sekventointi SCFiää, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 (20 pg 150 piissä 0,1 M ammoniumbikarbonaattiliuosta), pilkottiin 1 pgilla trypsiiniä 37 “Cissa 3,5 tunnin ajan. Pilkkomistuotteella suoritettiin välittömästi käänteisfaa-20 sikapeahuokos-C4-HPLC käyttäen eluointiolosuhteita, jotka olivat identtiset olosuhteisiin nähden, joita kuvattiin tämän esimerkin osassa A. Kaikkien eluoitujen peptidipiik-kien retentioajat poikkesivat ei-pilkotun SCFin (osa A) retentioajasta. Eristettyjen peptidien sekvenssianalyysit 25 esitetään alla; ) 108140 j 49

Peptidi Retentio- Sekvenssi4 aika (min) 5 ____

T-l 7,1 E-S-L-K-K-P-E-T-R

T-21 28,1 V-S-V-(_)-K

T-3 , 32,4 I-V-D-D-L-V-A-A-M-E-E-N-A-P-K

T-42 40,0 N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-R

10 T-53 46,4 a, L-V-A-N-L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N-Y-V-A-G-

( M-D-V-L-P-S-H-C-W-L-R

b, S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-S-(_)“(_)-L-G---- T-74 72,8 E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-

15 S-I-F-(_)-R

T-8 73,6 E-S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I- _F-D-R_ 1. Aminohappoa asemassa 4 ei määritetty.

20 2. Aminohappoa asemassa 12 ei määritetty.

3. Aminohappoja asemissa 20 ja 21 6:ssa peptidissä T-5 ei identifioitu; ne määritettiin alustavasti O-kyt-kettyjen sokerien kiinnityskeskuksiksi.

( 4. Aminohappoa asemassa 10 ei todettu; se päätel- 25 tiin Asmksi mahdollisen N-kytketyn glykosylaatiokeskuksen nojalla. Aminohappoa asemassa 21 ei todettu.

G. BRL-kantasolutekijäpeptidien eristys ja sekven-tointi pilkkomisen EL aureus Glu-C-proteaasilla jälkeen 30 SCFrllä, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1 (20 pg 150 pl:ssa 0,1 M ammoniumbikarbonaatti liuosta), suoritettiin pilkkominen Glu-C-proteaasilla proteaasi-substraattisuhteen ollessa 1:20. Pilkkominen suoritettiin 37 °C:ssa 18 tuntia kestävänä. Pilkkomistuote erotettiin 35 välittömästi käänteisfaasi-kapeahuokos-C4-HPLC: llä. Kerät- 50

1 O 8 1 4 O

tiin viisi runsasta peptidifraktiota, jotka sekventoitiin kuten kuvataan alla.

Peptidi Retentio- Sekvenssi 5 aika (min)

S-l 5,1 N-A-P-K-N-V-K-E

S-21 27,7 S-R-V-S-V- (__) -K-P-F-M-L-P-P-V-A- (A) 10 S-32 46,3 Sekvenssiä ei todettu S-53 71,0 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F- '

(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D

15 S-63 72,6 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-

(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D

20 1. Aminohappoa asemassa 6 S-2-peptidissä ei määri tetty; tämä voisi olla O-kytketyn sokerin kiinnityskeskus.

Ala asemassa 16 S-2-peptidissä todettiin alhaisena saantona .

. 2. Peptidi S-3 voisi olla N-päästä salvattu pepti- ^ 25 di, joka on peräisin SCF:n N-päästä.

3. N sulkeissa määritettiin mahdolliseksi N-kytke-tyn sokerin kiinnityskeskukseksi.

H. BRL-kantasolutekijän sekvenssianalyysi pilkko-30 misen BNPS-skatolilla jälkeen -: SCF:ää (2 pg) 10 mM ammoniumbikarbonaatiliuoksessa kuivattiin täydellisesti tyhjösentrifugoimalla, minkä jälkeen se updelleenliuotettiin 100 pl:aan jääetikkaa. Lisättiin sen määrään nähden 10 - 20 kertainen mooliylimäärä 35 BNPS-skatolia ja seosta inkuböitiin 50 °C:ssa 60 minuutin 51 ^ 1 40 ί ajan. Sen jälkeen reaktloseos kuivattiin tyhjösentrifugoi-malla. Kuivattua jäännöstä uutettiin 100 pl:lla vettä ja toistamiseen 50 pl:lla vettä. Sitten yhdistetyllä uutteella suoritettiin sekvenssianalyysi kuten edellä kuvattiin.

5 Todettiin seuraava sekvenssi: 1 10

Leu-Arg-Asp-Met-Val-Thr-His-Leu-Ser-Val-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu-Leu-20 30 10 Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-G1y-Leu-Ser-(Asn)-Tyr-Ser-Ile-Ile- ( 40

Asp-Lys-Leu-Gly-Lys-I1e-Val-Asp---- 15 Asemaa 28 ei määritetty varmuudella; se määritet tiin Asn:ksi mahdollisen N-kytketyn glykosylaatiokeskuksen nojalla.

I. BRL-kantasolutekijän C-pään aminohappomääritys SCF-proteiininäytteellä (500 pmol) suoritettiin 20 puskurivaihto 10 mM natriumasetaattiin, pH 4,0 (lopputi- lavuus 90 pl) ja lisättiin Brij-35-valmistetta pitoisuuteen 0,05 % (w/v). Proteiinin kvantitoimiseksi otettiin 5 μ1:η näyte. 40 μΐ näytteestä laimettiin 100 pl:ksi lisää-( mällä edellä kuvattua puskuria. Lisättiin karboksipepti- 25 daasi-P:tä (Penicillium janthinellum) entsyymi-substraat- tisuhteessa 1:200. Pilkkomisen annettiin tapahtua 25 eC:ssa ja 20 μ1:η näytteitä otettiin ajankohtina 0, 15, 30, 60 ja 120 min. Pilkkominen päätettiin kunakin ajan kohtana lisäämällä trifluorietikkahappoa loppupitoisuuteen 30 5 %. Näytteet kuivattiin ja vapautuneista aminohapoista ; muodostettiin johdannaiset saattaalla ne reagoimaan

Dabsyl-kloridin (dimetyyliaminoatsobentseenisulfo-nyyliklor^di) kanssa 0,2 M NaHC03-liuoksessa (pH 9,0) 70 °C:ssa 12 minuutin ajan [Chang et ai., Methods Enzymol.

35 90 (1983) 41 - 48], Aminohappojohdannaiset (1/6 kustakin 10B un 52 ' v näytteestä) analysoitiin kapeahuokoskäänteiafaasi-HPLC:llä käyttäen muunnosta Changin et ai. menettelystä ["Techniques in Protein Chemistry", T. Hugli, toim. Academic Press, NY, 1989, ss. 305 - 311]. Kvantitatiiviset 5 koostumustulokset kunakin ajankohtana saatiin vertaamalla aminohappojohdannaisstandardeihin (1 pmol). Ajankohtana 0 todettiin kontaminoivaa glysiiniä. Alaniini oli ainoa aminohappo, jonka määrä kasvoi inkubointiajan pidetessä.

Kahden tunnin inkuboinnnin jälkeen Ala:aa todettiin koko-10 naismäärä 25 pmol, mikä vastaa 0,66 mol vapautunutta Ala:aa proteiinimoolia kohden. Tämä tulos osoitti, että luontainen nisäkäs-SCF-molekyyli sisältää Ala:aa karbok- ) syylipäässään, mikä sopii yhteen C-pään peptidin, S-2, sekvenssianalyysin kanssa sen sisältäessä C-päässä Ala:n.

15 Täm johtopäätös sopii niinikään karboksipeptidaasi-P:lle tunnettuun spesifisyyteen [Lu et ai., J.Chromatog. 447 (1988) 351 - 364], Esimerkiksi pilkkominen päättyy, jos sekvenssi Pro-Val tulee vastaan. Peptidin S-2 sekvenssi on S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A), ja se pääteltiin 20 SCF:n C-pääpeptidiksi (katso osa J tässä esimerkissä). C- pääsekvenssi ---P-V-A-(A) rajoittaa proteaasipilkkomisen vain alaniiniin. Peptidin S-2 aminohappokoostumus osoittaa, että läsnä ovat 1 Thr, 2 Ser:iä, 3 Pro:ta, 2 Ala:aa, 3 Vai:ia, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys, ja 1 Arg, mikä on 25 kaikkiaan 16 tähdettä. Kahden Ala-tähteen toteaminen ) osoittaa, että tämän peptidin C-päässä saattaa olla 2 Ala-tähdettä (katso taulukko osassa G). Täten BRL-SCF päättyy Ala 164:ään tai Ala 165:een.

J. SCF:n sekvenssi 30 Yhdistämällä tulokset, jotka saatiin sekvenssiana lyyseistä (1) ehyelle kantasolutekijälle sen jälkeen, kun sen N-pään pyroglutamiinihappo oli poistettu, (2) CNBr-peptideille, (3) trypsiinipeptideille, ja (4) Glu-C-pep-tidaasifragmenteille, pääteltiin N-pääsekvenssi ja C-pää-35 sekvenssi (kuvio 11). N-pääsekvenssi alkaa pyroglutamii- 53 '108140 nihaposta ja päättyy Met-48:aan. C-pääsekvenssi sisältää 84/85 aminohappoa (asemat 82 - 164/165). Sekvenssiä asemat 49 - 81 ei todettu mistään eristetystä peptidistä. Kuitenkin sekvenssi todettiin suurelle peptidille, kun BRL-5 SCF:ää oli pilkottu BNPS-skatolilla kuten kuvattiin tämän esimerkin osassa H. Näistä lisätiedoista sekä DNA-sekvens-sistä, joka saatiin rotta-SCF:lie (esimerkki 3), N- ja C-pään sekvenssit voidaan asettaa rinnan ja kaikenkaikkinen sekvenssi asettaa kuten esitetään kuviossa 11. Molekyylin 10 N-päässä on pyroglutamiinihappo ja C-päässä on alaniini, minkä varmistavat pyroglutamaattiaminopeptidaasipilkkomi-( nen ja vastaavasti karboksipeptidaasi-P-pilkkominen.

Sekvenssitiedoista päätellään, että Asn-72 on gly-kosyloitu; Asn-109 ja Asn-120 ovat todennäköisesti glyko-15 syloituja joissakin molekyyleissä mutta eivät toisissa. Asn-65 voitiin todeta sekvenssianalyysissa ja tämän vuoksi saattaa olla vain osittain glykosyloitu, jos sitäkään. Ser-142:ta, Thr-143:ea ja Thr~155:tä, jotka pääteltiin DNA-sekvenssistä, ei voitu todeta aminohapposekvenssiana-20 lyysissa, joten ne voisivat siten olla O-kytketyn hiili-hydraattikiinnityksen keskuksia. Nämä mahdolliset hiili-hydraattikiinnityskeskukset on merkitty kuvioon 11; N-kyt-ketty hiilihydraatti on merkitty lihavoidulla umpikirjai-mella; O-kytketty hiilihydraatti on merkitty avoimella ^ 25 lihavoidulla kirjaimella.

K. BRL-kantasolutekijän aminohappokoostumusanalyysi Materiaalia kuvion 7 mukaisesta C4-kolonnista valmisteltiin aminohappokoostumusanalyysiin konsentroimalla ja suorittamalla puskurivaihto 50 mM ammoniumbikarbonaat-30 tiliuokseen.

. Kaksi 70 μ1:η näytettä hydrolysoitiin erikseen 6 N

HCl:ssä, joka sisälsi 0,1 % fenolia ja 0,05 % 2-merkapto-etanolia, 110 °C:ssa tyhjössä 24 tunnin ajan. Hydrolysaa-tit kuivattiin, rekonstituoitiin natriumsitraattipuskuriin 35 ja analysoitiin ioninvaihtokromatografisesti (Beckman mal- 1 { '

1 '* -( V

54 1 08 1 40 li 6300 -aminohappoanalysaattori). Tulokset on esitetty taulukossa 3. 164 aminohapon (proteiinisekventointitie- doista) käyttäminen aminohappokoostumuksen arvioimiseksi antaa paremman yhteensopivuuden ennustettuihin arvoihin 5 kuin 193 aminohapon (pääteltyinä PCR:llä saadusta DNA-sek-ventointitiedosta, kuvio 14C) käyttäminen.

Taulukko 3

Nisäkäsperäisen SCF:n kvantitatiivinen aminohappokoostumus 10

Aminohappokoostumus Tähde-ennuste ^ mol/mol proteiinia1 molekyyliä kohden2

Aminohappo Ajo nro 1 Ajo nro 2 (A) (B) 15 — - — --—

Asx 24.46 24.26 25 28

Thr 10.37 10,43 11 12

Ser 14.52 14 30 16 24

Glx 11.44 11 37 10 10

Pro 10)90 10 85 9 10

Gly 5,81 6 20 4 5

Ala 8.62 8 35 7/8 8 20 Cys i>d* nd 4 5

Vai 14,03 13,96 15 15

Met 4,05 3 99 6 7

Ile 8 31 8 33 9 10

Leu 17 02 16 97 16 19

Tyr 2 86 2 84 3 7

Phe 7)96 7 92 8 8 > 25 His 2.11 2 11 2 3

Lys 10 35 11 28 12 14

Trp nd nd 11

Arg 4f93 4;99 5 6

Summa f58 158 164/165 Ϊ93

Laskettu molekyylipaino 18,424^ 3 0 c‘ 108140 55 1. 158 tähteen nojalla proteiinisekvenssianalyy-sista (ei Cys eikä Trp).

2. Teoreettinen arvo arvioituna proteiinisekvens-sitiedosta (A) tai DNA-sekvenssitiedosta (B).

5 3. 1 - 164 -sekvenssin nojalla.

4. nd = ei määritetty.

Koska aminohappokoostumusanalyyseissa mukaan sisällytettiin tunnettu määrä sisäistä standardia, näytteen 10 sisältämän proteiinin kvantitointi oli samoin mahdollista; analysoidulle näytteelle saatiin arvo 0,117 mg/ml.

( Esimerkki 3

Rotta- ja ihmis-SCF-geenien kloonaus A. Rotta-SCF-cDNA-fragmenttien vahvistaminen ja 15 sekventointi

Rotta-SCF-proteiinin fragmenttien aminohapposekvenssin määritys mahdollisti rotta-SCF:lle spesifisten sekasekvenssioligonukleotidien suunnittelun. Kyseisiä oligonukleotideja käytettiin hybridisaatiokoettimina rot-20 ta-cDNA- ja -genomikirjastojen seulomiseksi sekä alukkeina pyrittäessä vahvistamaan osia cDNA:sta käyttäen polymeraasiketjureaktio- (PCR-) strategioita [Mullis et ai.,

Methods in Enzymol, 155 (1987) 335 - 350). Oligodeoksi-nukleotidit syntetisoitiin fosforamidiittimenetelmällä ^ 25 [Beaucage et ai., Tetrahedron Lett. 22 (1981) 1859 - 1862;

McBride et ai., Tetrahedron Lett♦ 24 (1983) 245 - 248); niiden sekvenssit on esitetty kuviossa 12A. Kirjaimet merkitsevät; A, adeniinia; T, tymiiniä; C, sytosiinia; G, guaniinia; I, inosiinia. Tähti (*) kuviossa 12A merkitsee 30 oligonukleotideja, jotka sisältävät restriktioendonuk-.* leaasitunnistussekvenssejä. Sekvenssit on merkitty suun nassa 5' -» 3 ' .

Rottagenomikirjasto, rottamaksa-cDNA-kirjasto sekä kaksi BRL-cDNA-kirjastoa seulottiin käyttäen 32P-leimattu-35 ja sekaoligonukleotidikoettimia, 219-21 ja 219-22 (kuvio

56 ^ G 8 1 3 Q

12A), joiden sekvenssit perustuivat esimerkin 2 mukaisesti saatuun aminohapposekvenssiin. SCF-klooneja ei eristetty näissä kokeissa cDNA-kloonauksen vakiomenetelmiä käyttäen [Maniatis et ai., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, 5 1982, 212 - 246].

Vaihtoehtoisen lähestymistavan mukaan, joka todella johti SCF-nukleiinihapposekvenssien eristämiseen, käytettiin PCR-tekniikoita. Tässä metodologiassa kahden DNA-alukkeen kattamaa DNA-aluetta vahvistetaan selektiivisesti 10 in vitro suorittamalla useita replikaatiokierroksia katalysoiden sopivalla DNA-polymeraasilla (kuten Taql-DNA-po-lymeraasi) deoksinukleosiditrifosfaattien läsnä ollessa ) lämpökierrättäjässä. PCR-vahvistamisen spesifisyys perustuu kahteen oligonukleotidialukkeeseen, jotka sivuavat 15 vahvistettavaa DNA-segmenttiä ja hybridisoituvat vastakkaisiin säikeisiin. PCR, jonka spesifisyys on kaksipuolinen tietylle DNA-alueelle kompleksisessa seoksessa, suoritetaan käyttämällä kahta aluketta, joiden sekvenssit ovat riittävän spesifiset tuolle alueelle. PCR:ssä, jonka 20 spesifisyys on yksipuolinen, käytetään yhtä aluespesifistä aluketta ja toista alukettta, joka kykenee toimimaan aluk-keena kohdekeskuksissa, joita esiintyy monissa tai kaikissa DNA-molekyyleissä tietyssä seoksessa [Loh et ai.,

Science 243 (1989) 217 - 220].

*. 25 Onnistuneiden PCR-vahvistamisreaktioiden DNA-tuot- ) teet ovat DNA-sekvenssi-informaation lähteitä [Gyllensten, Biotechniques 7 (1989) 700 - 708], ja niitä voidaan käyttää leimattujen hybridisaatiokoettimien valmistamiseksi, jotka ovat oligonukleotidikoettimia pitempiä ja spesifi-30 sempiä. PCR-tuotteita voidaan niinikään tarkoituksenmu-*; kaisia alukesekvenssejä käyttäen suunnitella kloo- naitaviksi plasmidivektoreihin, jotka mahdollistavat koo-ditetun peptidituotteen ilmennyksen.

Perusstrategia rotta-SCF-cDNA:n DNA-sekvenssin 35 saamiseksi hahmotellaan kuviossa 13A. Pienet nuolet sv 108140 ; osoittavat PCR-vahvistukset Ja paksut nuolet osoittavat DNA-sekventointireaktiot. PCR:iä 90.6 ja 96.2 yhdessä DNA-sekventoinnin kanssa käytettiin osittaisen nukleiinihappo-sekvenssin saamiseksi rotta-SCF-cDNA:lie. Näissä PCR:issä 5 käytetyt alukkeet olivat sekaoligonukleotideja, jotka perustuivat kuviossa 11 esitettyyn aminohapposekvenssiin.

PCRiistä 90.6 ja 96.2 saatua sekvenssi-informaatiota käyttäen valmistettiin ainutkertaisia sekvenssialukkeita (224-27 ja 224-28, kuvio 12A), joita käytettiin seuraavissa 10 vahvistamis- ja sekventointireaktioissa. cDNA:n 5'-pään sisältävä DNA saatiin PCR:istä 90.3, 96.6 ja 625.1 käyt-^ täen PCR:ää, jonka spesifisyys oli yksipuolinen. Lisä-DNA- sekvenssi läheltä SCF-proteiinin C-päätä saatiin PCR:stä 90.4. Lopun rotta-SCF-cDNA:n koodialueesta DNA-sekvenssi 15 saatiin PCR-tuotteista 630.1, 630.2, 84.1 ja 84.2 kuten kuvataan alla tämän esimerkin osassa C. Rotta-SCF-cDNA:n saamiseksi käytettyjä tekniikoita kuvataan alla.

RNA valmistettiin BRL-soluista kuten kuvaavat Okayama et ai. [Methods Enzymol. 154 (1987) 3 - 28]. Po-20 lyA+-RNA eristettiin käyttäen oligo(dT)-selluloosakolonnia kuten kuvaa Jacobson julkaisussa Methods in Enzymology 152 (1987) 254 - 261].

1. säikeen cDNA syntetisoitiin käyttäen 1 pg BRL-^ polyA+-RNA:ta templaattina ja (dT)12_18:aa alukkeena ent- ’. 25 syymin, Mo-MLV-käänteiskopioijaentsyymi (Bethesda Research

Laboratories), mukana toimitetun menettelyjärjestelyn mukaan. RNA-säiehajotus suoritettiin käyttäen 0,14 M NaOH-liuosta 84 °C:ssa 10 minuutin ajan tai inkuboimalla kiehuvassa vesihauteessa 5 minuutin ajan. Liuoksen neutraloimi-30 seksi lisättiin ylimäärin ammoniumasetaattia ja cDNA *: uutettiin ensin fenoli/kloroformilla ja sitten klorofor- mi/isoamyylialkoholilla, sekä seostettiin etanolilla. Jotta oligo(dC)-sukuisten alukkeiden käyttö PCR:issä, joiden spesifisyys on yksipuolinen, olisi mahdollista, poly(dG)-35 jatke lisättiin erän 1. säikeen cDNA:ta 3'-päähän käyttäen 108140 58 vasikankateenkorvapäätytransferaasia (Boehringer Mannheim) kuten aiemmin on kuvattu [Deng et ai., Methods Enzymol.

100 (1983) 96 - 103].

Ellei seuraavissa kuvauksissa ole toisin mainittu, 5 denaturoimisvaihe kullakin PCR-kierroksella suoritettiin 94 °C:ssa 1 minuutin kestävänä; ja pidennys suoritettiin 72 °C:ssa 3 tai 4 minuuttia kestävänä. Lämpötila ja juoton kesto vaihtelivat PCR:stä toiseen niiden edustaessa monasti kompromissia samanaikaisesti suoritettujen useiden eri 10 PCR:ien arvioitujen vaatimusten välillä. Alennettaessa al-ukepitoisuuksia alukevaletuotteiden kerääntymisen vähentämiseksi [Watson, Amplifications 2 (1989) 56] tarvittiin ) pitempiä juottoaikoja; kun PCR-tuotepitoisuus oli korkea, saannon kasvattamiseksi käytettiin lyhempiä juottoaikoja 15 ja korkeampia alukepitoisuuksia. Tärkeä tekijä juottoläm-pötilaa määrättäessä oli aluke-kohdeliittymisen arvioitu Td [Suggs et ai., kirjassa "Developmental Biology Using Purified Genes", toim. Brown, D.D., ja Fox, C.F., Academic,

New York, 1981, ss. 683 - 693]. Vahvistamisissa käytetyt 20 entsyymit saatiin joltakin kolmesta valmistajasta; Stratagene, Promega tai Perkin-Elmer Cetus. Reaktioyhdis-teitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vahvistamiset suoritettiin joko Coy Tempcycle -laitteessa tai Perkin-Elmer Cetus -DNA-lämpökierrättäjässä.

25 SCF-cDNA-fragmenttien vahvistaminen määritettiin ^ tavallisesti agaroosigeelielektroforeettisesti etidium-bromidin läsnä ollessa ja tuotteet visualisoitiin tekemällä DNA-nauhat fluoresoiviksi ultraviolettisäteilyllä stimuloiden. Joissakin tapauksissa, kun odotettiin pieniä 30 fragmentteja, PCR-tuotteet analysoitiin polyakryyliamidi-. geelielektroforeettisesti. Vaivistus siitä, että havaitut nauhat edustivat SCF-cDNA-fragmentteja, saatiin tarkastelemalla sopivia DNA-nauhoja seuraavassa vahvistuksessa yhtä tai useampaa sisäisesti asettunutta aluketta käyt-35 täen. Lopullinen vahvistus saatiin suorittamalla PCR-

59 1 O S1 4 O

tuotteen dideoksisekventointi [Sanger et ai., Proc.Natl.-Acad.Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467] ja vertaamalla ennakoituja luentatuotteita SCF-peptidisekvenssi-informaa-tioon.

5 Alustavissa PCR-kokeissa käytettiin SCF-proteiini- sekvenssiin perustuvia sekaoligonukleotideja [Gould, Proc.Natl .Acad. Sei. USA 86 (1989) 1934 - 1938]. Alla kuvataan PCR-vahvistuksia, joita käytettiin DNA-sekvenssi-informaation saamiseksi aminohapot -25 - 162 koodittavasta 10 rotta-cDNA:sta.

PCR:ssä 90.6 BRL-cDNA:ta vahvistettiin käyttäen 4 ( pmol kumpaakin 222-ll:tä ja 223-6:ta 20 μ1:η reaktiotila- vuudessa. Näytteellä PCRtn 90.6 tuotteesta suoritettiin elektroforeesiajo agaroosigeelissä ja havaittiin odotusten 15 mukaista kokoa suunnilleen vastaava nauha. 1 μΐ PCR:n 90.6 tuotetta vahvistettiin edelleen käyttäen 20 pmol kumpaakin aluketta 222-11 ja 223-6 50 pl:ssa 15 kierroksella juottaen 45 °C:ssa. Osalla tästä tuotteesta suoritettiin sitten 25 vahvistamiskierrosta alukkeiden 222-11 ja 219-25 20 (PCR 96.2) läsnä ollessa, jolloin agaroosigeelielektrofo- reesissa saatiin yksi yksittäinen pääasiallinen tuotenau- ha. PCR:n 96.2 tuotteen asymmetrinen vahvistaminen samoja kahta aluketta käyttäen tuotti templaatin, joka sekventoi-tiin menestyksekkäästi. SCF-sekvenssien tuotteessa 96.2 '' 25 edelleenvahvistaminen selektiivisesti suoritettiin tuot teen PCR-vahvistamisena, kun läsnä olivat 222-11 ja asettunut aluke 219-21. Tämän PCR:n tuotetta käytettiin temp-laattina asymmetriseen vahvistamiseen sekä radioleimatun koettimen tuotantoon (PCR2).

30 Rotta-SCF-cDNA:n 5’-pään eristämiseksi ei-spesifi- • sinä alukkeina käytettiin alukkeita, jotka sisälsivät (dC)n-sekvenssejä, jotka olivat komplementaarisia cDNA:n poly(dG)-jatkeille. PCR 90.3 sisälsi (dC)12:ta (10 pmol) ja 223-6:ta (4 pmol) alukkeina ja BRL-cDNA:ta templaatti-35 na. Reaktiotuote toimi kuten aggregaatti, jonka molekyy- 108140 60 lipaino on hyvin korkea, jolloin se pysyi lähellä panos-tuslähdettä agaroosigeelielektroforeesissa. Yksi μΐ tuo-teliuosta vahvistettiin edelleen, kun läsnä oli 25 pmol (dC)12:ta ja 10 pmol 223-6:ta, 25 μ1:η tilavuudessa 15 5 kierroksella, jolloin juottaminen suoritettiin 45 eC:ssa. h μΐ tätä tuotetta vahvistettiin sitten 25 kierroksella käyttäen sisäisesti asettunutta aluketta 219-25 ja 201-7 (PCR 96.6). 201-7:n sekvenssi esitetään kuviossa 12C. Mitään nauhoja ei todettu agaroosigeelielektroforeesissa.

10 Suoritettiin vielä 25 PCR-kierrosta juottaen 40 °C:ssa, minkä jälkeen todettiin yksi selvä nauha. Suoritettiin Southern blot -siirtokopiointi, jolloin havaittiin yksi ) selvä hybridisoituva nauha. Suoritettiin vielä 20 PCR-kierrosta (625.1) juottaen 45 °C:ssa ja käyttäen 201-7:ää 15 ja asettunutta aluketta 224-27. Sekventointi suoritettiin asymmetrisen vahvistamisen PCR:llä jälkeen, jolloin saatiin sekvenssi, joka ulottui pre-SCF:n oletetun signaali-peptidikoodisekvenssin oletetun aminopään ohi. Tätä sekvenssiä käyttäen suunniteltiin oligonukleotidialuke 227-20 29, joka sisältää rotta-SCF-cDNA:n koodialueen 5'-pään.

Vastaavasti 3'-DNA-sekvenssi, joka päättyy aminohappoon 162, saatiin sekventoimalla PCR 90.4 (katso kuvio 13A).

B. Rotta-kantasolutekijä-genomi-DNA:n kloonaus Koettimia, jotka valmistettiin vahvistamalla rotta-> 25 SCF:ää koodattavaa cDNA:ta PCR:llä kuten kuvattiin edellä ) osassa A, käytettiin kirjaston seulontaa, joka sisälsi rottagenomisekvenssejä (jotka saatiin valmistajalta CLON-TECH Laboratories, Inc.; kataloginro RL1022 j). Kirjasto rakennettiin bakteriofagi-lambda-vektoriin EMBL-3 SP6/T7 30 käyttäen DNA:ta, joka oli saatu täysikasvuisesta urospuo-\ lisesta Sprague-Dawley-rotasta. Kirjasto, kuten sitä ka- rakterisoi valmistaja, sisältää 2,3 x 10 riippumatonta kloonia, joissa keskimääräinen inserttikoko on 16 ke:tä.

PCR:iä käytettiin 32P-leimattujen koettimien muo-35 dostamiseksi, joita käytettiin genomikirjaston seulonnas- j ei 108140 sa. Koetin PCR1 (kuvio 13A) valmistettiin reaktiossa, joka sisälsi pitoisuudet 16,7 μΜ 32P[alfa]-dATP, 200 μΜ dCTP, 200 μΜ dGTP, 200 μΜ dTTP, reaktiopuskuria, jonka oli toimittanut Perkin Elmer Cetus, Taq-polymeraasia (Perkin 5 Elmer Cetus) 0,05 yksikköä/ml, 0,5 μΜ 219-26, 0,05 μΜ 223-6 ja 1 μΐ templaattia 90.1, joka sisälsi kohdekeskukset kyseisille kahdelle alukkeelle. Koetin PCR 2 valmistettiin käyttäen samankaltaisia reaktio-olosuhteita lukuunottamatta, että alukkeet ja templaatti vaihdettiin. Koetin PCR 2 10 valmistettiin käyttäen pitoisuudet 0,5 μΜ 222-11, 0,05 μΜ 219-21 ja 1 μΐ templaattia, joka oli saatu PCR 96.2:sta.

( Noin 106 bakteriofagia maljoitettiin kuten ovat ku vanneet Maniatis et ai. [supra, 1982]. Plakit siirrettiin GeneScreen™-suodattimille (22 cm x 22 cm; NEN/DuPont), 15 jotka denaturoitiin, neutraloitiin ja kuivattiin kuten on kuvattu valmistajan toimittamassa menettelyjärjestelyssä.

Kaksi suodatinsiirtoa suoritettiin kutakin maljaa kohden.

Suodattimia esihybridisoitiin liuoksessa, jossa oli pitoisuudet 1 M NaCl, 1 % SDS:ää, 0,1 % nautaseerumialbu-20 miinia, 0,1 % fikolia, 0,1 % polyvinyylipyrrolidonia (hyb-ridisaatioliuos), noin 16 tunnin ajan 65 °C;ssa ja varastoitiin -20 °C:seen. Suodattimet siirrettiin tuoreeseen hybridisaatioliuokseen, joka sisälsi 32P-leimattua PCR 1 -koetinta pitoisuuden 1,2 x 105 tuiketta/min/ml ja hybri-( 25 disoitiin 14 tunnin ajan 65 °C:ssa. Suodattimia pestiin liuoksessa, jossa oli pitoisuudet 0,9 M NaCl, 0,09 M nat-riumsitraatti, 0,1 % SDS:ää, pH 7,2 (pesuliuos), 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen niitä pestiin toistamiseen tuoreella pesuliuoksella 30 minuutin ajan 30 65 °C:ssa. Bakteriofagikloonit, jotka olivat malja- alueilla, jotka vastasivat radioaktiivisia täpliä autora-diokuvissa, poistettiin maljoista ja seulottiin toistamiseen koettimilla PCR1 ja PCR2.

DNA positiivisista klooneista pilkottiin restrik-35 tioendonukleaaseilla BamHI, Sphl tai SstI, ja saadut frag-

62 1 00 HO

mentit alakloonattiin pUC119:ään ja sekventoitiin sitten. Strategia rottagenomi-SCF-DNA:n sekventoimiseksi on esitetty kaaviollisesti kuviossa 14A. Tässä kuviossa viivoitus ylhäällä edustaa rottagenomi-DNArn SCFrää koodittavaa 5 aluetta. Aukot viivassa osoittavat alueet, joita ei ole sekventoitu. Suuret laatikot edustavat eksoneja, jotka koodittavat SCF-geenialueita, jolloin vastaavat kooditetut aminohapot on merkitty kunkin laatikon yläpuolelle. Nuolet edustavat yksittäisiä alueita, jotka sekventoitiin ja joi-10 ta käytettiin rotta-SCF-geenin konsensussekvenssin kokoamisessa. Rotta-SCF-geenin sekvenssi on esitetty kuviossa 14B. ) Käyttäen PCR 1 -koetinta rottagenomikirjaston seulomiseksi eristettiin kloonit, jotka vastaavat eksoneja, 15 jotka koodittavat aminohapot 19 - 175 SCFrssä. Kloonien saamiseksi eksoneille, jotka ovat ylävirtaan aminohapon 19 koodialueesta, kirjasto seulottiin käyttäen oligonuk-leotidikoetinta 228-30. Samaa suodatinsarjaa, jota käytettiin aiemmin koettimen PCR 1 kanssa, esihybridisoitiin 20 kuten edellä ja hybridisoitiin hybridisaatioliuoksessa, joka sisälsi 32P-leimattua oligonukleotidia 228-30 (0,03 pikomoolia/ml), 50 °C:ssa 16 tunnin ajan. Suodattimia pestiin pesuliuoksessa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen pestiin toistamiseen tuoreella pesu-25 liuoksella 45 °C:ssa 15 minuutin ajan. Bakteriofagikloonit malja-alueilla, jotka vastasivat radioaktiivisia täpliä autoradiokuvissa, poistettiin maljoista ja seulottiin toistamiseen koettimella 228-30. DNA positiivisista klooneista pilkottiin restriktioendonukleaaseilla ja alakloo-30 nättiin kuten edellä. Käyttäen koetinta 228-30 saatiin *, kloonit, jotka vastasivat aminohapot -20 - 18 koodittavaa eksonia.

Tehtiin useita yrityksiä kloonien eristämiseksi, jotka vastaisivat eksonia tai eksoneita, joka sisältää/-35 jotka sisältävät 5’-ei-luetun alueen ja koodialueen ami- 63 1081^0 nohapoille -25 - -21. Mitään klooneja rotta-SCF-geenin tälle alueelle ei ole eristetty.

C. Rotta-cDNA:n kloonaus ilmennettäväksi nisäkäs-soluissa 5 Nisäkässoluilmennysjärjestelmiä suunniteltiin sen varmistamiseksi, voitaisiinko aktiivinen rotta-SCF-poly-peptidituote ilmentää ja erittää nisäkässoluissa. Suunniteltiin ilmennysjärjestelmiä typistettyjen muunnoksien rotta-SCF:stä ilmentämiseksi (SCF1*162 ja SCF1'164) ja pro-10 teiinin (SCF1'193) ilmentämiseksi, joka oli ennustettu kuvion 14C mukaisen geenisekvenssin luennasta.

( Näissä tutkimuksissa käytetty ilmennysvektori oli sukkulavektori, joka sisälsi pUCH9-, SV40- ja HTLVI-sek-venssejä. Vektori suunniteltiin sallimaan itsenäinen rep-15 likaatio sekä colissa että nisäkässoluissa sekä ilmentämään insertoitu eksogeeninen DNA viraalisten DNA-sek-venssien säätelyn alaisena. Tämä vektori, joka nimettiin V19.8:ksi, ja joka sisältyy E_^ coli -kantaan DH5, on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture 20 Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. (ATCC-nro 68124). Tämä vektori on johdannainen pSVDM19:stä, jota kuvataan Souzan US-patenttijulkaisussa 4 810 643, joka sisällytetään täten viitteeksi.

, Rotta-SCF1-162-cDNA insertoitiin plasmidivektoriin ,25 V19.8. cDNA-sekvenssi esitetään kuviossa 14C. cDNA, jota käytettiin tässä rakenteessa, syntetisoitiin PCR-reak-tioissa 630.1 ja 630.2, kuten esitetään kuviossa 13A. Nämä PCR:t edustavat riippumattomia vahvistuksia, joissa käytettiin synteettisiä oligonukleotidialukkeita 227-29 ja 30 227-30. Näiden alukkeiden sekvenssit saatiin PCR:llä muo dostetusta cDNA:sta kuten kuvattiin tämän esimerkin osassa A. Reaktiot 50 μ1:η tilavuudessa käsittivät pitoisuudet lx reaktiopuskuria (valmistajan Perkin Elmer Cetus pakkauksesta), 250 μΜ dATP, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP ja 250 μΜ 35 dTTP, 200 ng oligo(dT)-aluke-cDNA:ta, 1 pikomooli 227- 64 108H0 29:ää, 1 pikomooli 227-30:ea ja 2,5 yksikköä Taq-polyme-raasia (Perkin Elmer Cetus). cDNA:ta vahvistettiin 10 kierroksen verran käyttäen 1 minuutin denaturointia 94 °C:n lämpötilassa, juottolämpötilaa 37 °C 2 minuutin 5 ajan ja pidennyslämpötilaa 72 °C 1 minuutin ajan. Näiden alustavien PCR-vahvistamiskierrosten jälkeen kuhunkin reaktioon lisättiin 10 pikomoolia 227-29:ää ja 10 pikomoo-lia 227-30:ea. Vahvistuksia jatkettiin 30 kierroksen ajan samoissa olosuhteissa lukuunottamatta, että juottolämpöti-10 läksi vaihdettiin 55 °C. PCR-tuotteet pilkottiin restrik-tioendonukleaaseilla Hindlll ja Sstll. V19.8 pilkottiin vastaavasti Hindlllrlla ja SstII:lla, ja yhdessä tapauk- ) sessa pilkottua plasmidivektoria käsiteltiin vasikansuolen alkalisella fosfataasilla; muissa tapauksissa pilkkomises-15 sa muodostunut suuri fragmentti eristettiin agaroosigee-listä. cDNA ligatoitiin V19.8:aan T4-polynukleotidiligaa-sia käyttäen. Ligatointituotteet transformoitiin transfor-moitumiskelpoiseen E^ coli -kantaan DH5 kuten on kuvattu [Okayama et ai., supra, 1987]. Yksittäisistä bakteeri-20 klooneista valmistettu DNA sekventoitiin Sangerin dideok-simenetelmällä. Kuviossa 17 esitetään V19.8-SCF:n rakenne.

Näitä plasmideja käyttäen transfektoitiin nisäkässoluja kuten kuvataan esimerkissä 4 ja esimerkissä 5.

Ilmennysvektori rotta-SCF1*164: lie rakennettiin 25 käyttäen samankaltaista strategiaa kuin käytettiin ^ SCF1-162: lie, jossa cDNA syntetisoitiin käyttäen PCR-vahvistamista, ja insertoitiin sitten V19.8:aan. Rakenteissa käytetty cDNA syntetisoitiin PCR-vahvistamisissa V19.8:11a, joka sisälsi SCF1_162-cDNA:n (V19.8:SCF1_162) temp-30 laattina, käyttäen 227-29:ää alukkeena geenin 5'-päätä silmällä pitäen ja 237-19:ää alukkeena geenin 3'-päätä silmällä pitäen. Rinnakkaisreaktiot (50 μΐ) sisälsivät pitoisuuden lx reaktiopuskuria, 250 μΜ kutakin dATPitä, dCTP:tä, dGTP:tä ja dDTTPrtä, 2,5 yksikköä Taq-polymeraa-35 siä, 20 ng Vl9.8:SCF1_162:ta ja 20 pikomoolia kutakin alu- 108140 65 kettä. cDNA:ta vahvistettiin 35 kierroksella käyttäen 94 °C:n denaturointilämpötilaa 1 minuutin ajan, 55 °C:n juottolämpötilaa 2 minuutin ajan ja 72 °C:n pidennyslämpötilaa 2 minuutin ajan. Vahvistamisien tuotteet pilkottiin 5 restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja SstI ja insertoi-tiin V19.8:aan. Saatu vektori sisältää koodialueen SCF:n aminohapoille -25 - 164, jota seuraa päätöskodoni.

cDNA rotta-SCF:n 193 aminohapon muodolle (rotta-Scf1*193 ennustetaan kuvion 14C mukaisen DNA-sekvenssin 10 luennasta) insertoitiin myös plasmidivektoriin V19.8 käyttäen samankaltaista menettelyjärjestelyä kuin käytet-( tiin rotta-SCF1"162:lle. Tässä rakenteessa käytetty cDNA

syntetisoitiin PCR-reaktioissa 84.1 ja 84.2 (kuvio 13A) käyttäen oligonukleotideja 227-29 ja 230-25. Nämä kaksi 15 reaktiota edustavat riippumattomia vahvistamisia eri RNA-valmisteista lähtien. 227-29:n sekvenssi saatiin PCR-reaktioista kuten kuvattiin tämän esimerkin osassa A ja alukkeen 230-25 sekvenssi saatiin rottagenomi-DNA:sta (kuvio 14B). Reaktiot, joiden tilavuus oli 50 μΐ, koos-20 tuivat pitoisuuksista lx reaktiopuskuria (valmistajan Perkin Elmer Cetus pakkauksesta), 250 μΜ dATP, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP ja 250 μΜ dTTP, 200 ng oligo(dT)-aluke-cDNArta, 10 pikomoolia 227-29:ää, 10 pikomoolia 230-25:tä ja 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus).

( 25 cDNA:ta vahvistettiin 5 kierroksen ajan käyttäen 94 °C:n denaturointilämpötilaa 1,5 minuutin ajan, 50 °C:n juotto-lämpötilaa 2 minuutin ajan ja 72 eC:n pidennyslämpötilaa 2 minuutin ajan. Näiden alustavien kierrosten jälkeen vahvistamisia jatkettiin 35 kierroksen verran samoissa 30 olosuhteissa lukuunottamatta, että juottolämpötilaksi vaihdettiin 60 °C. PCR-vahvistamisen tuotteita pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja SstI. V19.8-DNA:ta pilkottiin Hindlll:11a ja Sstl:llä ja pilkkomisessa muodostunut suuri fragmentti eristettiin agaroosigeelistä.

35 cDNA ligatoitiin V19.8:aan T4-polynukleotidiligaasia 66 1 081 40 käyttäen. Ligatointituotteet transformoitiin transformoi-tumiskelpoiseen coli -kantaan DH5 ja yksittäisistä bakteeriklooneista valmistettu DNA sekventoitiin. Näillä plasmideilla transfektoitiin nisäkässoluja esimerkissä 4.

5 D. Ihmis-SCF-cDNÄ-PCR-tuotteiden vahvistaminen ja sekventointi

Ihmis-SCF-cDNA saatiin maksakasvainsolulinjasta HepG2 (ATCC HB8065) käyttämällä PCR-vahvistamista kuten kuvataan kuviossa 13B. Perusstrategia oli vahvistaa ihmis-10 cDNA:ta PCR:llä alukkeita käyttäen, joiden sekvenssit saatiin rotta-SCF-cDNA:sta.

RNA valmistettiin kuten ovat kuvaanneet Maniatis et ^ ai. [supra, 1982]. PolyA+-RNA valmistettiin käyttäen oli-go-dT-selluloosaa noudattaen valmistajan ohjeita.

15 (Collaborative Research Inc.).

1. säikeen cDNA valmistettiin kuten kuvattiin edellä BRL-cDNA:lle lukuunottamatta, että synteesissä käytettiin alukkeena 2 μΜ oligonukleotidia 228-28, joka esitetään kuviossa 12C, ja joka sisältää lyhyen satun-20 naissekvenssin 3'-päässä kiinnittyneenä pitempään yksit- täissekvenssiin. 228-28:n yksittäissekvenssiosa suo koh-dekeskuksen PCR-vahvistamiselle alukketta 228-29 ei-spe-sifisenä alukkeena käytäen. Ihmis-cDNA-sekvenssejä, jotka muistuttivat ainakin osittain rotta-SCF-sekvenssiä, vah- s 25 vietettiin HepG2-cDNA:sta PCRtllä käyttäen alukkeita 227- « 29 ja 228-29 (PCR 22.7, katso kuvio 13B; 15 kierroksella juottaminen 60 °C:ssa, mitä seurasi 15 kierrosta juotto-lämpötilassa 55 °C). Agaroosigeelielektroforeesissa ei paljastunut lainkaan erillisiä nauhoja, vaan ainoastaan 30 tahra ilmeisesti kooltaan heterogeenistä DNA:ta. Rotta-• SCF-cDNA:ta likeisesti muistuttavien sekvenssien ensisi jaiseen vahvistamiseen pyrittiin niinikään suorittamalla PCR käyttäen 1 μΐ PCR 22.7:n tuotetta ja sisäisesti asettunutta rotta-SCF-aluketta 222-11 ja aluketta 228-29 (PCR 35 24.3; 20 kierrosta juottolämpötilassa 55 °C). Jälleen 67

1 Γ C -1 ..: r, i »- C I h 'J

agaroosigeeleissä havaittiin vain heterogeeninen, tah-ranomainen DNA-tuote. PCR 24.3 -tuotteiden kaksipuolisella spesifisellä vahvistamisella käyttäen alukkeita 222-11 ja 227-30 (PCR 25.10; 20 kierrosta) saatiin yksittäinen pää-5 asiallinen tuotenauha, joka oli saman kokoinen kuin vastaava rotta-SCF-cDNA-PCR-tuote. Sekventoimalla asym metrinen PCR-tuote- (PCR 33.1-) DNA käyttäen 224-24:ää sekventointialukkeena saatiin noin 70 emästä ihmis-SCF-sekvenssej ä.

10 Samalla tavalla vahvistettaessa 1 μΐ PCR 22.7:n

tuotetta ensin käyttäen alukkeita 224-25 ja 228-29 (PCR

/ i 24.7, 20 kierrosta) ja sitten alukkeita 224-25 ja 227-30 (PCR 41.11) muodostui yksi pääasiallinen nauha, joka oli saman kokoinen kuin vastaava rotta-SCF-tuote, jolloin 15 siitä asymmetrisesti vahvistamalla (PCR 42.3) saatiin sekvenssi, joka oli erittäin homologinen rotta-SCF-sek-venssiin nähden käytettäessä 224-24:ää sekventointialukkeena. Ainutkertaisen sekvenssin oligodeoksinukleoti-deja, jotka kohdistuivat ituni s-SCF-cDNA: hän, syntetisoi-20 tiin ja niiden sekvenssit on esitetty kuviossa 12B.

Ihmisvastineen saamiseksi rotta-SCF:n PCR:llä muodostetulle koodisekvenssille, jota käytettiin ilmennys- ja aktiivisuustutkimuksissa, suoritettiin PCR käyttäen alukkeita 227-29 ja 227-30 ja 1 μΐ PCR 22.7 -tuotetta 50 μ1:η ^ 25 reaktiotilavuudessa (PCR 39.1). Vahvistaminen suoritettiin

Coy Tempcycler -laitteessa. Koska ihmis-SCF-cDNA:n ja rot-ta-SCF-yksittäisalukkeen 227-30 välisen epäsopivuuden astetta ei tunnettu, ensimmäisillä 3 kierroksella käytettiin juottamista olosuhteissa, jotka eivät olleet ankarat 30 (37 °C); tämän jälkeen juottamislämpötilana oli 55 °C. II- • maantui selvästi näkyvä nauha, jonka koko oli sama (noin 590 ep:tä) kuin rottahomologin, ja sitä vahvistettiin edelleen laimentamalla pieni osa PCR 39.1:n tuotetta ja suorittamalla PCR samoja alukkeita käyttäen (PCR 41.1). 35 Koska enemmän kuin yksi nauha todettiin PCR 41.1:n tuot- 108140 68 teissä, suoritettiin edelleen PCR:iä käyttäen sisäisesti asettuneita alukkeita ainakin osan niiden sekvenssistä määrittämiseksi ennen kloonausta. 23 PCR-kierroksen jälkeen, joilla käytettiin alukkeita 231-27 ja 227-29 (PCR 5 51.2), nähtiin yksittäinen voimakas nauha. Asymmetriset PCR:t käyttäen alukkeita 227-29 ja 231-27 sekä sekventoin-ti vahvistivat ihmis-SCF-cDNA-sekvenssien läsnäolon. PCR 41.1 -SCF-DNA:n kloonaaminen ilmennysvektoriin V19.8 suoritettiin kuten jo kuvattiin rotta-SCF-l-162-PCR-fragmen-10 teille edellä osassa C. DNA yksittäisistä bakteerikloo-neista sekventoitiin Sangerin dideoksimenetelmällä.

E. Ihmis-kantasolutekijä-genomi-DNA:n kloonaaminen ) PCR7-koetintä, joka oli valmistettu cDNA:ta PCR:llä vahvistamalla, katso kuvio 13B, käyttäen seulottiin ihmis-15 genomisekvenssejä sisältävä kirjasto. Käyttäen ribokoetin- ta, joka oli komplementaarinen osalle ihmis-SCF-cDNA:ta, katso alla, seulottiin toistamiseen positiiviset plakit.

PCR 7 -koetin valmistettiin lähtien PCR 41.1:n tuotteesta (kasto kuvio 13B). PCR 41.1:n tuotetta vahvistettiin edel-20 leen käyttäen alukkeita 227-29 ja 227-30. Saatu 590 ep:n fragmentti eluoitiin agaroosigeelistä ja sitä vahvistettiin toistamiseen käyttäen samoja alukkeita (PCR 58.1).

PCR 58.1:n tuote laimennettiin 1 OOOkertaisesti 50 pl:aan reaktioseosta, jossa oli 10 pmol 233-13:ea, ja vahvistet-* 25 tiin 10 kierroksen verran. Reaktioseokseen lisättiin 10 ) pmol 227-30:ea, minkä jälkeen PCR:ää jatkettiin 20 kierroksen verran. Lisättiin vielä 80 pmol 233-13:ea, reak-tiotilavuus nostettiin 90 pl:ksi ja PCR:ää jatkettiin 15 kierroksen verran. Reaktiotuotteet laimennettiin 200-ker-30 taisesti 50 μ1:η reaktioseokseen, lisättiin 20 pmol 231-27:ää ja 20 pmol 233-13:ea, minkä jälkeen PCR:iä suoritettiin 35 kierroksen verran käyttäen juottolämpötilaa 48 °C reaktiossa 96.1. 32P-leimatun PCR7:n valmistamiseksi käytettiin samnalaisia reaktio-olosuhteita, kuin käytettiin 35 PCRl:n valmistamiseksi, seuraavin poikkeuksin: 50 pl:n 108140 69 reaktiotilavuuteen PCR 96.1:tä laimennettiin 100-kertai-sesti; ainoana alukkeena käytettiin 5 pmol 231-27:ää; ja suoritettiin 45 PCR-kierrosta denaturoiden 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, juottaen 48 ®C:ssa 2 minuutin ajan ja piden-5 täen 72 °C:ssa 2 minuutin ajan.

Ribokoetin, ribokoetin 1, oli 32P-leimattu yksisäi-keinen RNA, joka oli komplementaarinen hSCF-DNA-sekvenssin nukleotideille 2 - 436, joka sekvenssi esitetään kuviossa 15B. Vektorin rakentamiseksi tämän koettimen tuottamiseksi 10 PCR 41.1:n (kuvio 13B) tuote-DNA:ta pilkottiin Hindlll:lla ja EcoRI:lla, minkä jälkeen se kloonattiin polyliittäjään ( plasmidivektorissa pGEM3 (Promega, Madison, Wisconsin).

Yhdistelmä-DNA-pGEM3:hSCF-plasmidi-DNA linearisoitiin sitten pilkkomalla Hindlllrlla. 32P-leimattu ribokoetin 1 val-15 mistettiin linearisoidusta plasmidi-DNA:sta Promegan toimittamia ohjeita noudattaen "run-off"-kopioimalla T7-RNA-polymeraasilla. Reaktio (3 μΐ) sisälsi 250 ng linearisoi-tua plasmidi-DNA:ta ja pitoisuuden 20 μΜ 32P-rCTP:tä (ka-taloginro NEG-008H, New England Nuclear (NEN), eikä sisäl-20 tänyt lainkaan ylimääräistä ei-leimattua CTP:tä.

Ihmisgenomikirjasto saatiin valmistajalta Strata-gene (La Jolla, CA; kataloginro 946203). Kirjasto rakennettiin bakteriofagi Lambda Fix II -vektoriin käyttäen DNA:ta, joka oli valmistettu kaukaasialaisesta urospuoli-( 25 sesta istukasta. Kirjasto, valmistajan karakterisoinnin mukaan, sisälsi 2 x 106 primaariplakkia, joissa keskimääräinen inserttikoko oli yli 15 ke:tä. Noin 106 bakteriofagia maljoitettiin kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. [supra, 1982]. Plakit siirrettiin Gene Screen Plus™ -suo-30 dattimille (22 cm2; NEN/DuPont) valmistajan toimittaman • menettelyjärjestelyn mukaan. Kutakin maljaa kohden suori tettiin kaksi suodatinsiirtoa.

Suodattimia esihybridisoitiin liuoksessa 6XSSC (0,9 M NaCl, 0,09 M natriumsitraatti, pH 7,5), 1 % SDS

35 60 °C:ssa. Suodattimia hybridisoitiin vastavalmistetussa 108140 70 liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS, joka sisälsi 3ZP-leimattua PCR 7 -koetinta pitoisuuden 2 x 105 tuiketta/min/ml, ja hyb-ridisoitiin 20 tunnin ajan 62 eC:ssa. Suodattimia pestiin liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS 16 tunnin ajan 62 °C:ssa. Bak-5 teriofagitulppa poistettiin malja-alueelta, joka vastasi radioaktiivisia täpliä autoradiokuvissa, ja seulottiin toistamiseen koettimella PCR 7 ja ribokoettimella 1. Toistamiseen seulominen koettimella PCR 7 suoritettiin samanlaisissa olosuhteissa kuin käytettiin alkuperäisessä 10 seulonnassa. Uudelleenseulonta ribokoettimella 1 suoritettiin seuraavasti: suodattimia esihybridisoitiin liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS, ja hybridisoitiin 62 °C:ssa 18 tun- ) nin ajan liuoksessa 0,25 M NaP04 (pH 7,5), 0,25 NaCl, 0,001 M EDTA, 15 % formamidi, 7 % SDS, jossa oli ribokoetinta 15 pitoisuus 1 x 106 tuiketta/min/ml. Suodattimia pestiin liuoksessa 6XSSC, 1 % SDS 30 minuutin ajan 62 °C:ssa, ja sitten liuoksessa 1XSSC, 1 % SDS 30 minuutin ajan 62 °C:ssa. DNA:ta positiivisista klooneista pilkottiin restriktiendonukleaaseilla BamHI, Sphl tai SstI ja saadut 20 fragmentit alakloonattiin pUC119:ään ja sekventoitiin sitten.

Käyttäen koetinta PCR 7 saatiin klooni, joka sisälsi eksoneja, jotka koodattavat aminohapot 40 - 176, ja tämä klooni on talletettu ATCC-talletuslaitokseen (talle- ^ 25 tusnro 40681). Muiden SCF-eksonien kloonien saamiseksi ihmisgenomikirjasto seulottiin ribokoettimella 2 ja oli-gonukleotidikoettimella 235-29. Kirjasto seulottiin samalla tavalla kuin aiemmin seuraavin poikkeuksin: hybridisaatio koettimeen 235-29 suoritettiin 37 °C:ssa, jolloin 30 tähän hybridisaatioon liittyvät pesut suoritettiin 1 tunnin kestävinä 37 °C:ssa ja 1 tunnin kestävinä 44 °C:ssa. Positiiviset kloonit uudelleenseulottiin ribokoettimella 2, ribokoettimella 3 ja oligonukleotidikoettimilla 235-29 ja 236-31. Ribokoettimet 2 ja 3 valmistettiin käyttäen 35 samankaltaista menettelyjärjestelyä kuin käytettiin ribo- 71 in BUn koettimen 1 tuottamiseksi seuraavin poikkeuksin: (a) yh-distelmä-DNA-pGEM3:hSCF-plasmidi-DNA linearisoitiin restriktioendonukleaasilla PvuII (ribokoetin 2) tai PstI (ribokoetin 3), ja (b) SP6-RNA-polymeraasia (Promega) käy-5 tettiin ribokoettimen 3 syntetisoimiseksi.

Kuviossa 15A esitetään strategia, jota käytettiin ihmisgenomi-DNA:n sekventoimiseksi. Tässä kuviossa viivoitus ylhäällä edustaa ihmisgenomi-DNA:n SCF:ää koodit-tavaa aluetta. Aukot viivoituksessa merkitsevät alueita, 10 joita ei ole sekventoitu. Suuret laatikot edustavat ekso-neja, jotka koodittavat SCF-geenialueita, jolloin vastaa-( vat kooditetut aminohapot on merkitty kunkin laatikon yläpuolelle. Ihmis-SCF-geenin sekvenssi esitetään kuviossa 15B. Ihmis-SCF-cDNA:n PCR-tekniikoilla saatu sekvenssi 15 esitetään kuviossa 15C.

F. Ihmis-SCF-cDNA:n 5'-alueen sekvenssi Sekventoitaessa PCR:ien tuotteet, joihin alukkeina käytettiin kahta geenispesifistä aluketta, paljastuu sen alueen sekvenssi, jota rajaavat kyseisten kahden alukkeen 20 3’-päät. Yksipuolisista PCR:istä, kuten mainittiin esimerkissä 3A, voidaan saada sivuavien alueiden sekvenssi. Yksipuolista PCR:ää käyttäen laajennettiin 5'-ei-luetun ihmis-SCF-cDNA-alueen sekvenssiä.

/ 1. säikeen cDNA valmistettiin poly-A+-RNA: sta, joka 25 oli ihmisen rakkosyöpäsolulinjasta 5637 (ATCC HTB 9), käyttäen oligonukleotidia 228-28 (kuvio 12C) alukkeena kuten kuvataan esimerkissä 3D. Lisäämällä tähän cDNA:han dG-tähdejatkeita ja suorittamalla sitten yksipuolinen PCR-vahvistaminen käyttäen (dC)n-sekvenssejä sisältäviä aluk-30 keitä yhdistettyinä SCF-spesifisiin alukkeisiin ei onnis-*. tuttu saamaan cDNA-fragmentteja, jotka jatkuisivat ylävir- . _ a taan (5') tunnetusta sekvenssistä.

Pieni määrä sekvenssi-informaatiota saatiin PCR-vahvistamalla 2. säikeen synteesituotteita, joihin aluk-35 keena käytettiin oligonukleotidia 228-28. Päässä jatketta 108140 72 vailla olevaa, edellä kuvattua 5637:n 1. säikeen cDNArta (noin 50 ng) ja 2 pmol 228-28:aa inkuboitiin Klenow-poly-meraasilla ja 0,5 mM:lla kutakin dATP:tä, dCTP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä 10 - 12 °C:ssa 30 minuutin ajan 10 pl:ssa 5 lx"nick"-luentapuskuria [Maniatis et ai», "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory", 1982], Vahvistamalla saatua cDNA:ta peräkkäin yksipuolisilla PCR:illä käyttäen aluketta 228-29 yhdistettynä asettuneisiin SCF-alukkeisiin (käyttöjärjestyksessä: 10 235-30, 233-14, 236-31 ja lopuksi 235-29) saatiin komplek sisia tuoteseoksia, jotka näkyivät tahroina agaroosigee-leissä. Merkittävää SCF-sukuisten cDNA-fragmenttien vah- ) vistumista osoitti spesifisen tuotenauhan kasvava voimakkuus, mikä havaittiin vahvistettaessa verrattavia tila-15 vuuksia peräkkäisiä yksipuolisen PCR:n tuotteita käyttäen kahta SCF-aluketta (227-29 ja 235-29, esimerkiksi, jolloin saadaan noin 150 ep:n tuote). Yrityksissä valikoida tuotteiden tietyn kokoluokan suhteen stanssaamalla irti osia agaroosigeelitahroista ja uudelleenvahvistamalla niitä 20 PCR:llä ei useimmissa tapauksissa onnistuttu tuottamaan tarkkarajaista nauhaa, joka sisältäisi SCF-sukuisia sekvenssejä.

Yhdessä reaktiossa, PCR:ssä 16.17, jossa käytettiin vain 235-29-aluketta, saatiin nauha, joka ilmeisesti syn- λ 25 tyi 235-29:n toimiessa alukkeena tuntemattomassa kohdassa ^ * 5'-suuntaan koodialueesta odotuksia vastaavan kohdan ohella, mikä osoitettiin kartoittamalla restriktioentsyymeillä PvuII ja PstI ja PCR-analyysilla asettuneita alukkeita käyttäen. Tätä tuotetta puhdistettiin geelissä ja uudel-30 leenvahvistettiin käyttäen aluketta 235-29, ja sekventoin-• tia yritettiin Sangerin dideoksimenetelmällä käyttäen 32P- leimattua aluketta 228-30. Saatu sekvenssi oli perustana suunniteltaessa oligonukleotidia 254-9 (kuvio 12B). Käytettäessä tätä 3'-suunnattua aluketta seuraavissa PCR:issä 35 yhdistettynä 5'-suunnattuihin SCF-alukkeisiin saatiin odo- 73 1 081 40 tusten mukaista kokoa edustavia nauhoja. Suorittamalla tällaisten PCR-tuotteiden suora Sanger-sekventointi saatiin ihmis-SCF-cDNA-sekvenssin nukleotidit 180 - 204, kuvio 15C.

5 Jotta saataisiin enemmän sekvenssiä hSCF-cDNA:n 5'- päästä, 1. säikeen cDNA valmistettiin 5637:n poly-A+-RNA:sta (noin 300 ng) käyttäen SCF-spesifistä aluketta (2 pmol 233-14:ää) 16 μ1:η reaktiossa, joka sisälsi 0,2 yksikköä MMLV-käänteiskopioijaentsyymiä (hankittu valmistalo jalta BRL) ja 500 μΜ kutakin dNTPrtä. Suoritettiin tavanomaiset fenoli-kloroformi- ja kloroformiuutot ja etanoli- f l saostus (IM ammoniumasetaattiliuoksesta), minkä jälkeen nukleiinihapot uudelleenlietettiin 20 pl:aan vettä, sijoitettiin kiehuvaan vesihauteeseen 5 minuutiksi, jäähdy-15 tettiin sitten ja varustettiin päätyjatkeella käyttäen päätytransferaasia 8 μΜ:η dATPitä läsnä ollessa CoCl2-pit-oisessa puskurissa [Deng ja Wu, Methods in Enzymology 100 96 - 103]. Tuotetta, (dA)n-päätyjatkettua 1. säikeen cDNA:ta, puhdistettiin uuttamalla fenoli-kloroformilla ja 20 seostamalla etanolilla, minkä jälkeen se uudelleenlietettiin 20 pl:aan liuosta 10 mM Tris, pH 8,0, ja 1 mM EDTA.

Ihmis-SCF-sukuisten cDNA-5'-päätyiragmenttien rikastaminen ja vahvistaminen noin 20 ng:sta (dA)n-päätyjat-ketusta 5637-cDNA:sta suoritettiin seuraavasti: alustava ( 25 26 kierroksen yksipuolinen PCR suoritettiin SCF-spesifisen alukkeen 236-31 läsnä ollessa ja alukkeen tai alukeseoksen läsnä ollessa, joka sisältää (dT)n-sekvenssejä 3'-päässä tai lähellä sitä, esimerkiksi alukkeen 221-12 tai seoksen alukkeita 220-3, 220-7 ja 220-11 (kuvio 12C) läsnä olles-30 sa. Näiden PCR:ien tuotteita (1 μΐ) vahvistettiin sitten : toisessa sarjassa PCR:iä, joissa käytettiin alukkeita 221- 12 ja 235-29. Runsas tuotenauha, joka vastasi noin 370 ep:tä, havaittiin kussakin tapauksessa agaroosigeeliana-lyysissa. Osan tästä nauhasta sisältävä geelitulppa 35 stanssattiin irti geelistä pasteur-pipetin kärjellä ja > 74 1 C £ i 4 (j siirrettiin pieneen mikrofugiputkeen. 10 μΐ vettä lisättiin ja tulppa sulatettiin 84 °C:seen säädetyssä kuuraen-nusyksikössä. PCR-seokseen, joka sisälsi alukkeita 221-12 ja 235-29 (8 pmol kumpaakin) 40 piessä, siirrostettiin 2 5 μΐ sulatettua, laimennettua geelitulppaa. 15 kierroksen jälkeen lievästi diffuusi nauha, joka vastasi noin 370 ep:tä, voitiin nähdä agaroosigeelianalyysissa. Asymmetrisiä PCReiä suoritettiin ylä- ja alasäikeen sekventointi-templaattien muodostamiseksi: kutakin reaktiota kohden 4 10 piellä PCR-reaktiotuotetta ja 40 pikomoolilla joko aluket-ta 221-12 tai aluketta 235-29 100 μ1:η kokonaisreak- tiotilavuudessa suoritettiin 25 PCR-kierrosta (1 minuutti, ) 95 ° C; 30 sekuntia, 55 °C; 40 sekuntia, 72 °C). PCR-tuote-seoksia, joissa oli käytetty alukkeena 221-12:ta, suoraan 15 sekventoimalla (tavanomaisten uuttojen ja etanolisaostuk- sen jälkeen) 32P-leimattua aluketta 262-13 (kuvio 12B) käyttäen saatiin 5'-sekvenssi nukleotidista 1 nukleotidiin 179 (kuvio 15C).

G. Ihmisgenomi-DNA:n vahvistaminen ja sekventointi 20 kantasolutekijän ensimmäisen koodieksonin kohdalta

Seulomalla ihmisgenomikirjastoa SCF-oligonukleoti-dikoettimilla ei onnistuttu paljastamaan lainkaan klooneja, jotka sisältäisivät tunnetun osan ensimmäisestä koo-dieksonista. Sitten suoritettiin yritys yksipuolisen PCR- \ 25 tekniikan käyttämiseksi tätä eksonia ympäröivien genomi- - sekvenssien vahvistamiseksi ja kloonaamiseksi.

Ihmisen lämpödenaturoidun istukka-DNA:n (hankittu valmistajalta Sigma) alukelaajennus suoritettiin käyttäen DNA-polymeraasi-I:tä (K1enow-entsyymi, suuri fragmentti; 30 Boehringer-Mannheim) ja ei-SCF-aluketta kuten 228-28:aa .. tai 221-11:tä ei-ankarissa (alhainen lämpötila) olosuh teissa, kuten 12 °C, jotta se suosisi alukkeen hyödyntämistä hyvin suuressa lukumäärässä eri keskuksia. Kutakin reaktiota laimennettiin sitten 5-kertaisesti Taql-DNA-po-35 lymeraasipuskuriin, joka sisälsi TaqI-polymeraasia ja • * 75 108740 100 μΜ kutakin dNTPctä, ja DNA-säikeiden pidennyksen annettiin tapahtua 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tuotetta rikastettiin sitten kantasolutekijän 1. eksoni -sekvenssien suhteen PCR:llä SCF-1. eksoni -oligonukleotidin (kuten 5 254-9) ja tarkoituksenmukaisen ei-SCF-alukkeen (228-29 tai 221-11) läsnä ollessa. Agaroosigeelielektroforeesi paljasti, että valtaosa tuotteista oli lyhyitä (alle 300 ep:tä). Pitempien lajien rikastamiseksi se osa kustakin agaroosigeelivyöhykkeestä, joka vastasi yli 300 ep:n pi-10 tuutta, leikattiin irti ja eluoitiin elektroforeettisesti. Etanolisaostuksen ja uudelleenliettämisen veteen jälkeen ( geelissä puhdistetut PCR-tuotteet kloonattiin pGEM4-joh dannaiseen, joka sisälsi Sfil-keskuksen Hindlll-Sfil-frag-menttina.

15 Pesäkkeet seulottiin 32P-leimatulla SCF-1. eksoni -oligonukleotidilla. Identifioitiin useita positiivisia pesäkkeitä ja inserttien sekvenssit saatiin Sangerin menetelmällä. Saatu sekvenssi, joka ulottuu alavirtaan 1. eksonista konsensuseksoni-intronirajan kautta naapuri-20 introniin, esitetään kuviossa 15B.

H. SCF-cDNA-koodialueiden hiirestä, apinasta ja koirasta vahvistaminen ja sekventointi I. säikeen cDNA valmistettiin kokonais-RNA:sta tai ^ poly-A+-RNA:sta, joka oli saatu apinan maksasta (hankittu ·. 25 valmistajalta Clontech) sekä solulinjoista NIH-3T3 (hiiri, ATCC CRL 1658) ja D17 (koira, ATCC CCL 183). 1. säikeen cDNA-synteesissä käytetty aluke oli joko ei-spesifinen aluke 228-28 tai SCF-aluke (227-30, 237-19, 237-20, 230-25 tai 241-6). PCR-vahvistaminen aluketta 227-29 ja jotain 30 alukkeista 227-30, 237-19 tai 237-20 käyttäen tuotti frag- I * * mentin, joka kooltaan vastasi odotuksia ja joka sekven- toitiin joko suoraan tai kloonauksen V19.8- tai pGEM-vek-toriin jälkeen.

Lisää sekvenssejä läheltä SCF-cDNA-sekvenssien 5'-35 päätä saatiin PCR-vahvistamisista, joissa käytettiin SCF- vt · 76 108140 spesifistä aluketta yhdistettynä joko 254-9:ään tai 228-29:ään. Lisää sekvenssejä SCF-koodialueiden 3'-päästä saatiin PCR-vahvistamalla 230-25-alukkeella käsiteltyä cDNArta (hiiren kohdalla) tai 241-6-alukkeella käsiteltyä 5 cDNArta (apinan kohdalla) käyttäen joko 230-25:tä tai 241-6:ta, tarpeen mukaan, sekä 3'-kohdisteista SCF-aluketta. Lainkaan SCF-PCR-tuotenauhoja ei saatu vastaavissa yrityksissä vahvistaa Dl7-cDNA:ta. Ei-spesifistä aluketta 228-28 käytettiin alukkeena 1. säikeen synteesissä D17-kokonais-10 RNA:sta, ja saatua kompleksista tuoteseosta rikastettiin SCF-sukuisten sekvenssien suhteen PCR:llä käyttäen 3'-koh-disteisia SCF-alukkeita kuten 227-29 tai 225-31 yhdistet- ) tyinä 228-29:ään. Tuoteseos pilkottiin Sfil:llä ja kloonattiin pGEM4- johdannaiseen (Promega, Madison, Wisconsin), 15 joka sisältää Sfil-keskuksen Sfil-tasainen pää -fragmenttina. Saatua heterogeenistä kirjastoa seulottiin radiolei-matulla 237-20:11a, ja useita positiivisia klooneja sek-ventoitiin, jolloin saatiin koiran SCF-3'-pääsekvenssejä.

Rinnan asetetut aminohapposekvenssit ihmisen (kuvio 42), 20 apinan, koiran, hiiren ja rotan kypsille SCF-proteiineille on esitetty kuviossa 16.

Tunnetut SCF-aminohapposekvenssit ovat erittäin homologisia valtaosalla pituudestaan. Identtiset konsen-sussignaalipeptidisekvenssit sisältyvät kaikkien 5 lajin . 25 koodialueisiin. Aminohappo, jonka odotetaan olevan kypsän proteiinin aminopäässä analogisesti rotta-SCF:ään nähden, on tässä kuviossa merkitty numerolla 1. Koira-cDNA-sekvenssi sisältää kaksinaisuuden, josta seuraa valiini/leu-siini-kaksinaisuus aminohapposekvenssissä kodonin 129 30 kohdalla. Ihmisen, apinan, rotan ja hiiren aminohapposekvenssit asettuvat rinnan ilman mitään insertioita tai de-leetioita. Koirasekvenssissä on yksi yksittäinen ylimääräinen tähde asemassa 130 muihin lajeihin verrattuna. Ihminen ja apina eroavat vain yhdessä kohdassa, joka on va-35 liinin (ihminen) säilyvä korvaus alaniinilla (apina) ase- « 77 1 081 si, massa 130. Ennustettu SCF-sekvenssi välittömästi ennen ja jälkeen oletettua prosessointikeskusta lähellä tähdettä 164 on erittäin säilyvä lajien välillä.

Esimerkki 4 5 Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:n ilmentäminen COS-l-so- luissa

Silmällä pitäen tilapäistä ilmennystä COS-l-so-luissa (ATCC CRL 1650) vektori V19.8 (esimerkki 3C), joka sisälsi rotan SCF1"162- ja SCF1_193-geenit, transfektoitiin 10 kaksinkertaisiin 60 mm:n maljoihin [Wigler et ai., Cell 14 (1978) 725 - 731]. Plasmidi V19.8-SCF esitetään kuviossa ( 17. Verrokkina transfektoitiin myös inserttiä vailla oleva vektori. Kudosviljelmäsupernatenttejä otettiin talteen eri ajankohtina transfektoinnin jälkeen ja määritettiin niiden 15 biologinen aktiivisuus. Taulukkoon 4 on kootu HPP-CFC-bio-määritystulokset ja taulukkoon 5 on koottu tulostiedot MC/9 -3H-tymidiinikulutuksesta tyypillisistä transf ektointi-kokeista. Biomääritystulokset COS-l-solusupernatanteista, jotka solut oli transfektoitu seuraavilla plasmideilla, on 20 esitetty taulukoissa 4 ja 5: rotta-SCF:n C-päästä lyhennetty muoto, jossa C-pää on aminohappoasemassa 162 (V19.8-rotta-SCF1'162), SCF1-162, joka sisältää glutamiinihapon asemassa 81 [V19.8-rotta-SCF1'162 (Glul8)], ja SCF1'162, joka ^ sisältää alaniinin asemassa 19 [V19.8-rotta-CSF1-162 ·. 25 (Alal9)]. Aminohapposubstituutiot olivat seurausta PCR- reaktioista, jotka suoritettiin rotta-SCF1_162:n vahvistamisen yhteydessä kuten esitetään esimerkissä 3. Yksittäisiä V19.8-rotta-SCF1’162-klooneja sekventoitiin ja todettiin kaksi aminohapposubstituutioita sisältävää kloonia. Kuten 30 voidaan nähdä taulukoista 4 ja 5, yhdistelmä-DNA-rotta-SCF on aktiivinen biomäärityksissä, joita käytettiin luontai- . . · sen nisäkäs-SCF:n puhdistamiseksi esimerkissä 1.

-♦ ♦ « 78 -? n r; ^

' O 1 4 Q

Taulukko 4 HPP-CFC-määritys COS-l-supernatanteista, jotka on saatu rotta-SCF-DNA:lla transfektoiduista soluista 5 Näyte CM-määritys- Pesäkkeitä, kpl tilavuus (μΐ) /200 000 solua V19.8, 100 0 ei inserttiä 50 0 10 25 0 12 0 ) V19.8-rotta-SCF1'162 100 >50 50 >50 15 25 >50 12 >50 6 30 3 8 20 V19.8-rotta-SCF1·162 100 26 (Glu81) 50 10 25 2 12 0 \ ; 25 VI9.8-rotta-SCF1'162 100 41 ) (Alal9) . 50 18 25 5 12 0 6 0 30 3 0 79 1 0 81 40

Taulukko 5 140/9*11-tyrni di inikulutusmäär i ty s COS -1 - supernatenteistä, jotka on saatu rotta-SCF-DNAilla transfektoiduista soluista 5 Näyte CM-määritys- Tuikkeita/min/ml tilavuus (μΐ) V19.8, 25 1 935 10 ei inserttiä 12 2 252 6 2 182 ^ 31 682 V19.8-SCF1'162 25 11 648 15 12 11 322 6 11 482 3 9 638 V19.8-SCF1"162 25 6 220 20 (Glu81) 12 5 384 6 3 692 3 1 980 ζ V19.8-SCF1'162 25 8 396 ·. 25 (Alal9) 12 6 646 6 4 566 3 3 182

Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:ää ja muita tekijöitä 30 testattiin yksittäin ihmis-CFU-GM- [Broxmeyer et ai., sup-: ra, 1977] määrityksessä, jossa mitataan normaalien luuydinsolujen lisääntymistä, ja tulokset esitetään taulukossa 6. Tulokset COS-l-supernatanteille viljelmistä, jotka oli 4 päivää aiemmin transfektoitu V19.8-35 SCF1"162:11a, yhdessä muiden tekijöiden kanssa, on niinikään • ♦ βο 108140 esitetty taulukossa 6. Pesäkeluvut ovat keskimääräisiä kolminkertaisista viljelmistä.

Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF:llä on pääasiassa syner-gististä aktiivisuutta ihmisen normaalin luuytimen aktii-5 visuuteen CFU-GM-määrityksessä. Taulukon 6 mukaisessa kokeessa SCF oli synergistinen ihmis-GM-CSF:n, ihmisen IL-3:n ja ihmisen CSF-l:n kanssa. Muissa määrityksissä synergiaa havaittiin myös G-CSF:n kanssa. Ihmisen luuydin oli jonkin verran lisääntynyt 14 päivässä rotta-SCF:n 10 kanssa; kuitenkin rykelmät koostuivat < 40 solusta. Samankaltaisia tuloksia saatiin luontaisella nisäkäsperäisellä SCF;llä. )

Taulukko 6 15 Ihmis-CFU-GM-määritys COS-l-supernatanteista, jotka on saatu rotta-SCF-DNA:lla transfektoiduista soluista Näyte Pesäkkeitä, kpl/100 000 solua (± SEM1) 20 Suolaliuos 0 GM-CSF 7+1 G-CSF 24 ± 1 IL-3 5+1 CSF-1 0 .· 25 SCF1'162 0 GM-CSF + SCF1'162 29 + 6 G-CSF + SCF1’162 20 + 1 IL-3 + SCF1"162 11 ± 1 30 CSF-1 + SCF1'162 4 + 0 81 108140

Esimerkki 5

Yhdistelmä-DNA-SCF:n ilmentäminen kiinalaisen hamsterin munasarjasoluissa Tämä esimerkki koskee stabiilia nisäkäsilmennys-5 systeemiä SCF:n erittämiseksi CHO-soluista (ATCC CCL 61 valikoiden DHFR-:n suhteen).

A. Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF

SCF-tuotannossa käytetty ilmennysvektori oli V19.8 (kuvio 17). Valikointimerkki, jota käytettiin stabiilien 10 transformanttien määrittämiseksi, oli dihydrofolaattire-duktaasigeeni plasmidissa pDSVE.l. Plasmidi pDSVE.l (kuvio ( 18) on pDSVE-johdannainen, joka on rakennettu pilkkomalla pDSVE:tä restriktioentsyymillä Sali ja ligatoimalla tuote oiigonukleotidifragmenttiin, joka koostuu kahdesta 15 oligonukleotidista: 5'TCGAC CCGGA TCCCC 3' 3' G GGCCT AGGGG AGCT 5' 20 Vektoria pDSVE kuvataan yhteisesti omistetuissa US- patenteissa julkaisunrot 025 344 ja 152 045, jotka sisällytetään täten viitteiksi. V19.8:n ja pDSVE.l:n vektori-osat sisältävät pitkiä homologiajaksoja mukaan lukien bak-teeriperäisen ColEl-replikaatioalkukohdan sekä ampisill-^ 25 iiniresistenssigeenin ja SV40-replikaatioalkukohdan. Tämä limittyminen saattaa myötävaikuttaa homologiseen DNA-yh-distymiseen transformointiprosessissa helpottaen siten yhteistransformointia.

V19.8-SCF-rakenteista ja pDSVE.l:stä valmistettiin 30 kalsiumfosfaattiyhteissakkoja, kun läsnä oli tai ei ollut ·, 10 pg kantajahiiri-DNA: ta, käyttäen 1,0 tai 0,1 pg pDSVE.l:tä, joka oli linearisoitu restriktioendonukleaa-silla PvuI, ja 10 pg V19.8-SCF:ää kuvatun mukaisesti [Wigler et ai., supra, 1978]. Pesäkkeet valikoitiin DHFR-35 geenin ilmennyksen pDSVE.l:stä perusteella. Pesäkkeet, 1 4 4 108140 82 jotka kykenivät kasvamaan ilman lisättyä hypoksantiinia ja tymidiiniä, noukittiin käyttäen kloonaussylintereitä js niitä lisäännytettiin itsenäisinä solulinjoina. Yksittäisistä solulinjoista saatuja solusupernatantteja testattiin 5 MC/9-3H-tymidiinikulutusmäärityksessä. Tulokset tyypillisestä kokeesta on esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7 MC/iJ-^-tymidiinikulutusmääritys stabiileista CHO-solusu-10 pernatanteista, jotka on saatu rotta-SCF-DNA:11a transfek-toiduista soluista )

Transfektoitu DNA Määritetyn käsitellyn Tuikkeita/min kasvualustan tilavuus 15 V19.8-SCF1'162 2 33 926 12 34 973 6 30 657 3 14 714 20 1,5 7 160 - (ei transfektoitu) 25 694 12 1 082 6 880 λ ·. 25 3 672 ) 1 1 354

B. Yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF

SCF saatiin ilmennetyksi CHO-soluissa myös käyttäen 30 ilmennysvektoria pDSVR-alfa-2, jota kuvataan yhteisesti * omistetussa patentissa julkaisunro 501 904, joka jätettiin 29. maaliskuuta, 1990, joka täten sisällytetään viitteeksi. Tämä vektori sisältää geenin kloonien valikoimiseksi ja vahvistamiseksi DHFR-geenin ilmennyksen perusteella.

35 Klooni pDSR-alfa-2-SCF muodostettiin kaksivaiheisella pro- • « ♦ 1081 4n 83 H ^ sessilla. V19.8-SCF:ää pilkottiin restriktioentsyymillä BamHI ja SCF-insertti ligatoitiin pGEM3:n BamHI-keskuk-seen. pGEM3-SCF-DNA pilkottiin Hindlllilla ja Sali:llä ja ligatoitiin pDSR-alfa-2:een, jota oli pilkottu HindIII:lla 5 ja Sällillä. Sama prosessi toistettiin ihmisgeeneillä, jotka koodittavat COOH-pään aminohappoasemia 162, 164 ja 183 kuviossa 15C esitetyssä sekvenssissä ja asemaa 248 kuviossa 42 esitetyissä sekvensseissä. Vakiintuneita solu-linjoja herkistettiin metotreksaatilla [Shimke kirjassa 10 Methods in Enzymology 151 (1987) 85 - 104] pitoisuutena 10 nM DHFR-geenin sekä viereisen SCF-geenin ilmennystasojen ( nostamiseksi. Yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:n ilmennystasot määritettiin radioimmuunimäärityksellä kuten esimerkissä 7, ja/tai indusoimalla pesäkemuodostus in vitro käyttäen 15 ihmisen ääreisveren valkosoluja. Tämä määritys suoritetaan kuten kuvataan esimerkissä 9 (taulukko 12) lukuunottamatta, että ääreisverta käytetään luuytimen asemesta ja inku-bointi suoritetaan pitoisuuksissa 20 % 02:ta, 5 % C02:ta ja 75 % N2:ta ihmis-EPO:n (10 yksikköä/ml) läsnä ollessa. Tu-20 lokset tyypillisistä kokeista on esitetty taulukossa 8. Ihmis-SCF1-164:n ilmentävä CHO-klooni on 25. syyskuuta, 1990, talletettu talletuslaitokseen ATCC (CRL 10557), ja nimetty Hull64SCF17:ksi.

( .

« 84 1 08 1 40

Taulukko 8 hPBL-pesäkemääritys käsitellystä kasvualustasta, joka on stabiileista CHO-solulinjoista, jotka on transfektoitu ihmis-SCF-DNA:lla 5

Transfektoitu DNA Määritetty Pesäkkeitten kasvualusta (μΐ) lukumääärä/105 pDSR-alf a-2-hSCF1'164 50 53 10 25 45 12,5 27 6.25 13 ) pDSR-alfa-2-hSCF1'162 10 43 15 5 44 2,5 31 1.25 17 0,625 21 20 - (CHO-verrokki) 50 4

Esimerkki 6

Yhdistelmä-DNA-SCF:n ilmentäminen BL colissa

A. Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF

25 Tämä esimerkki koskee SCF-polypeptidien ilmentä- ^ mistä colissa käyttäen DNA-sekvenssiä, joka koodittaa [Met'1]-rotta-SCF1'193^ (kuvio 14C). Vaikka mitä tahansa sopivaa vektoria voidaan käyttää proteiinin ilmentämiseksi tätä DNA:ta käyttäen, valittiin plasmidi pCFM1156 (kuvio 30 19). Tämä plasmidi voidaan rakentaa helposti pCFM-836:sta (katso US-patenttijulkaisu nro 4 710 473, joka sisällytetään täten viitteeksi) tuhoamalla läsnä olevat kaksi endo-geenistä Ndel-restriktiokeskusta täyttämällä päitä T4-po-lymeraasientsyymiä käyttäen, minkä jälkeen tasaiset päät 35 ligatoidaan ja pieni DNA-sekvenssi yksittäisten Clal- ja 108140 85

KpnI-restriktiokeskusten välissä substituoidaan pienellä oligonukleotidilla, joka esitetään alla.

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3' 5 3* T AAACT AAGAT C TT CC TC CTT ATT GT AT AC CA ATTG CG CAAC CTT A AG C 5'

Proteiini-ilmennyksen säätelyn pCFM1156-plasmidissa suorittaa synteettinen lambda-PL-promoottori, joka puolestaan on lämpötilaherkän lambda-Cl857-repressorigee-10 nin säätelyn alainen [ja jollainen on coli -kannassa ( FM5 (ATCC-talletusnro 53911) tai K12-delta-Htrp].

pCFM1156-vektori rakennetaan siten, että siinä on DNA-sek-venssi, joka sisältää optimoidun ribosomisitoutumis-keskuksen ja aloituskodonin välittömästi 3'-suuntaan syn-15 teettisestä PL-promoottorista. Yksittäinen Ndel-restrik- tiokeskus, joka sisältää ATG-aloituskodonin, edeltää mo-nirestriktiokeskuskloonausrykelmää, jota seuraa lambda-t-oop-kopiointipäätössekvenssi.

Plasmidia V19.8-SCF1'193, joka sisältää rotta-20 SCF1_193-geenin kloonattuna PCR-vahvistetusta cDNArsta (ku vio 14C) kuten kuvattiin esimerkissä 3, pilkottiin Bgllltlla ja SstII:lla ja eristettiin 603 ep:n DNA-frag-mentti. Met-aloituskodonin saamiseksi sekä rotta-SCF-po-( lypeptidin ensimmäisten 3 aminohappotähteen (Gin, Glu ja * 25 Ile) kodonien palauttamiseksi valmistettiin synteettinen oligonukleotidiliittäjä 5' TATGCAGGA 3' 31 ACGTCCTCTAG 5’ : 30 jossa oli tarttuvat Ndel- ja Bglll-päät. Pieni oligonuk-leotidi ja rotta-SCF1*193-geenifragmentti insertoitiin li-gatoimalla pCFM1156:een yksittäisiin Ndel- ja Sstl-kes-kuksiin kuviossa 19 esitetyssä plasmidissa. Tämän reaktion 35 tuote on ilmennysplasmidi, pOFMllSe-rotta-SCF1'193.

» 86 1 O 8 1 ·4 o pCFM1156-rotta-SCF1'193-plasmidi transformoitiin transformoitumiskelpoisiin E^ coli -FM5-isäntäsoluihin. Plasmidin sisältävät solut valikoitiin antibiootti- (ka-namysiini-) resistenssimerkkigeenin perusteella, joka si-5 sältyy pCFM1156-vektoriin. Plasmidi-DNA eristettiin viljellyistä soluista ja synteettisen oligonukleotidin DNA-sekvenssi sekä sen liitos rotta-SCF-geeniin varmistettiin DNA-sekventoinnilla.

Plasmidin pCFM1156-rotta-SCF1-162 rakentamiseksi, 10 joka koodittaa [Met'1]-rotta-SCF1'162-polypeptidiä, eristet tiin EcoRI-Sstll-restriktiofragmentti V19.8-rotta-SCF1'162;sta ja insertoitiin se ligatoimalla plasmidiin ^ pCFM-rotta-SCF1"193 yksittäisiin EcoRI- ja Sstll-restrik-tiokeskuksiin, jolloin korvattiin rotta-SCF-geenin kar-15 boksyylipään koodialue.

Plasmidien pCFMllSö-rotta-SCF1'164 ja pCFM1156-rotta-SCF1'165 rakentamiseksi, jotka koodittavat [Mef1]-rotta-SCF1' 64- ja vastaavasti [Met*1]-rotta-SCF1'165-polypeptidit, EcoRI-Sstll-restriktiofragmentit eristettiin PCR-vahvistetusta 20 DNA:sta, joka koodittaa SCF-geenin 3'-pään, ja suunniteltiin suorittamaan paikkaohjattuja muutoksia DNAihan alueella, joka koodittaa SCF-geenin karboksyylipään. DNA-vahvistamiset suoritettiin käyttäen oligonuk-leotidialukkeita 227-29 ja 237-19 rakenteessa pCFM1156-. 25 rotta-SCF1'164 ja 227-29 ja 237-20 rakenteessa pCFM1156- rotta-SCF1'165.

B. Yhdistelmä-DNÄ-ihmis-SCF

Tämä esimerkki koskee ihmis-SCF-polypeptidin ilmentämistä E^_ colissa käyttäen DNA-sekvenssiä, joka koo-30 dittaa [Met'1]-ihmis-SCF1'164:ää ja [Mef1] -ihmis-SCF1*183:ea (kuvio 15C). Plasmidia V19.8-ihmis-SCF1*162, joka sisältää ihmis-SCF1'62-geenin, käytettiin templaattina ihmis-SCF-geenin PCR-vahvistuksessa. Oligonukleotidialukkeita 227-29 ja 237-19 käytettiin PCR-DNA:n muodostamiseksi, jota sit-35 ten pilkottiin PstI- ja Sstl-restriktioendonukleaaseilla.

« 87 108140

Met-aloituskodonin saamiseksi sekä ihmis-SCF-polypeptidin ensimmäisten 4 aminohappotähteen (Glu, Gly, Ile, Cys) ko-donien palauttamiseksi valmistettiin synteettinen oligo-nukleotidiliittäj ä 5 5' TATGGAAGGTATCTGCA 3' 3 ’ ACCTTCCATAG 5' jossa oli tarttuvat Ndel- ja Pstl-päät. Pieni oligoliit-10 täjä ja PCR:llä saatu ihmis-SCF-geenifragmentti insertoi- tiin ligatoimalla ilmennysplasmidiin pCFM1156 (kuten ku-( vattiin aiemmin) yksittäisiin Ndel- ja Sstll-keskuksiin kuviossa 19 esitetyssä plasmidissa.

pCFM1156-ihmis-SCF1_164-plasmidi transformoitiin 15 transformoitumiskelpoisiin E^ coli -FM5-isäntäsoluihin.

Plasmidin sisältävät solut valikoitiin antibiootti- (ka-namysiini-) resistenssimerkkigeenin perusteella, joka sisältyy pCFMl156-vektoriin. Plasmidi-DNA eristettiin viljellyistä soluista ja ihmis-SCF-geenin DNA-sekvenssi var-20 mistettiin DNA-sekventoinnilla.

Plasmidin pCFMUSö-ihmis-SCF1'183 rakentamiseksi, joka koodittaa [Met'1]-ihmis-SCF1'183- (kuvio 15C) polypepti-diä, EcoRI-Hindlll-restriktiofragmentti, joka koodittaa (· ihmis-SCF-geenin karboksyylipään, eristettiin pGEM-ihmis- » 25 SCF114'183:sta (jota kuvataan alla), Sstl-EcoRI-restriktio- fragmenttir joka koodittaa ihmis-SCF-geenin aminopään, eristettiin pCFMUSö-ihmis-SCF1'164: stä, ja suurempi Hindlll-Sstl-restriktiofragmentti pCFM1156:sta eristettiin. Nämä kolme DNA-fragmenttia ligatoitiin yhteen 30 pCFM1156-ihmis-SCF1_183-plasmidin muodostamiseksi, joka sitten transformoitiin coli -FM5-isäntäsoluihin. Pesä-kevalikoinnin kanamysiinilääkeresistenssiä hyödyntäen jälkeen plasmidi-DNA eristettiin ja oikeasta DNA-sekvens-sistä varmistuttiin DNA-sekventoimalla. pGEM-ihmis-35 SCF114'183-plasmidi on pGEM3:n johdannainen, joka sisältää 108140 88

EcoRI-SphI-fragmentin, johon sisältyvät nukleotidit 609 -820 kuviossa 15C esitetystä ihmis-SCF-cDNA-sekvenssistä. EcoRI-Sphl-insertti eristettiin tästä plasmidista PCR:stä, jossa käytettiin oligonukleotidialukkeita 235-31 ja 241-6 5 (kuvio 12B) ja PCR:stä 22.7 (kuvio 13B) templaattina. Alukkeen 241-6 sekvenssi perustui ihmisgenomisekvenssiin 3'-suuntaan eksonista, joka sisältää kodonin aminohapolle 176.

C. lhmis-SCF-1_164:ää tuottavan colin fermentointi 10 Fermentoinnit SCF-l-164:n tuottamiseksi suoritet tiin 16 litran fermentoreissa käyttäen E^ coli FM5-K12-siätnää, joka sisälsi plasmidin pCFM1156-ihmis-SCF1-164. )

Tuotantoviljelmän siemenvarastokantoja ylläpidettiin 80 °C:ssa 17-%:isessa glyserolissa Luria-liemessä. Siir-15 rostetuotantoa varten 100 μΐ sulatettua siemenvarastokan-taa siirrettiin 50 ml:aan Luria-lientä 2 litran erlen-meyerkolviin ja kasvatettiin yön yli 30 °C:ssa pyöröravis-telijassa (250 kierr./min).

E. coli -solupastan tuottamiseksi, jota käytettiin 20 lähtömateriaalina ihmis-SCF1-164 :n puhdistuksessa, jota kuvataan tässä esimerkissä, käytettiin seuraavia fermen-tointiolosuhteita.

Siirrosteviljelmä siirrettiin aseptisesti 16 litran fermentoriin, jossa oli 8 litran erä kasvualustaa (katso - - 25 taulukko 9). Viljelmää kasvatettiin erämuodolla kunnes viljelmän O.D.600 oli noin 3,5. Tänä ajankohtana steriili syöttöliuos (syöttöliuos 1, taulukko 10) lisättiin fermentoriin käyttäen peristaltista pumppua syöttönopeuden säätelemiseksi. Syöttönopeutta nostettiin eksponentiaalisesti 30 ajan funktiona kasvunopeuteen 0,15/tunti. Lämpötila pidettiin kontrolloidusti 30 °C:ssa kasvufaasin ajan. Liuenneen hapen pitoisuutta fermentorissa pidettiin automaattisesti säätäen 50 %:n kyllästyksessä käyttäen säätelyssä ilmavir-tausnopeutta, sekoitusnopeutta, astian vastapainetta ja 35 happilisäystä. pH:ta fermentorissa säädettiin automaatti- 89 1 081 40 sesti 7,Oraan käyttäen fosforihappoa ja ammoniumhydroksi-dia. Kun O.D.600 oli noin 30, fermentoinnin tuotantofaasi indusoitiin nostamalla fermentorin lämpötila 42 °C:seen. Samanaikaisesti syöttöliuoksen 1 lisääminen keskeytettiin 5 ja syöttöliuoksen 2 (taulukko 11) lisääminen nopeudella 200 ml/tunti käynnistettiin. Noin 6 tunnin kuluttua fermentorin lämpötilan nostosta fermentorin sisältö jäähdytettiin 15 eC:seen. SCF1"164-saanto oli noin 30 mg/O.D.-litra. Sitten solupelletti otettiin talteen sentrifugoimalla 10 Beckman J6-B -roottoria käyttäen 3 000 x grssä 1 tunnin ajan. Talteen otettu solupasta varastoitiin jäädytettynä -( 70 °C:seen.

Edullinen menetelmä SCF1"164:n tuottamiseksi on samanlainen kuin edellä kuvattu menetelmä lukuunottamatta 15 seuraavia modifikaatioita.

1) Syöttöliuoksen 1 lisääminen käynnistetään vasta kun viljelmän O.D.600 on 5 - 6.

2) Syöttöliuoksen 1 lisäysnopeutta nostetaan hitaammin, jolloin seurauksena on hitaampi kasvunopeus (noin 20 0,08).

3) Viljelmä indusoidaan O.D.600-lukemassa 20.

4) Syöttöliuosta 2 johdetaan fermentoriin nopeudella 300 ml/tunti.

Kaikki muut suorituksen osatekijät ovat samanlaiset (. 25 kuin edellä kuvatussa menetelmässä mukaan lukien kasvu alusta.

Tätä menetelmää käyttäen on saatu SCF1_164-saantoja, jotka ovat noin 35 - 40 mg/O.D.-litra O.D.-lukemassa 25.

« 108140 90

Taulukko 9

Eräkasvualustan koostumus

Hiivauute 10a g/litra 5 Glukoosi 5 K2HP04 3,5 KH2P04 4

MgS04 ♦ 7H20 1

NaCl 0,625 10 Dow P-2000 -vaahdonesto 5 ml/8 litraa

Vitamiiniliuosb 2 ml/litra

Hivenmetalliliuos0 2 ml/litra ) a Ellei toisin mainittu, kaikki luetellut ainesosat 15 ovat yksiköissä g/litra.

b Hivenmetalliliuos: FeCl3*6H20, 27 g/litra;

ZnCl2*4H20, 2 g/litra; CaCl2*6H20, 2 g/litra; Na2Mo04*2H20, 2 g/litra, CuS04*5H20, 1,9 g/litra; konsentroitu HC1, 100 ml/litra.

20 c Vitamiiniliuos: riboflaviini, 0,42 g/litra; pan- toteenihappo, 5,4 g/litra; niasiini, 6 g/litra; pyridoksiini, 1,4 g/litra; biotiini, 0,06 g/litra; foolihappo, 0,04 g/litra.

. 25 Taulukko 10 ) #

Syöttökasvualustan koostumus

Hiivauute 50a

Glukoosi 450 30 MgS04 · 7H20 8,6 * Hivenmetalliliuosb 10 ml/litra

Vitamiiniliuos0 10 ml/litra a Ellei toisin mainittu, kaikki luetellut ainesosat 35 ovat yksiköissä g/litra.

108140 91 b Hivenmetalliliuos: FeCl3*6H20, 27 g/litra;

ZnCl2‘4H20, 2 g/litra; CaCl2*6H20, 2 g/litra; Na2Mo04*2H20, 2 g/litra, CuS04*5H20, 1,9 g/litra; konsentroitu HC1, 100 ml/litra.

5 c Vitamiiniliuos: riboflaviini, 0,42 g/litra; pan- toteenihappo, 5,4 g/litra; niasiini, 6 g/litra; pyridoksiini, 1,4 g/litra; biotiini, 0,06 g/litra; foolihappo, 0,04 g/litra.

10 Taulukko 11

Syöttöliuoksen 2 koostumus (

Tryptoni 172a

Hiivauute 86 15 Glukoosi 258 a Kaikki luetellut ainesosat ovat yksiköissä g/litra.

20 Esimerkki 7

Xmmuunimäärityksiä SCF:n toteamiseksi

Radioimmuunimääritys- (RIA-) menettelyt, joita käytettiin SCF:n kvantitatiiviseksi toteamiseksi näyt-teistä, suoritettiin seuraavien menettelyjen mukaan.

25 BRL-3A-soluista saatua SCF-valmistetta, jota oli puhdistettu kuten esimerkissä 1, inkuboitiin vastaseerumin kanssa 2 tunnin ajan 37 °C:ssa. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen näyteputket jäähdytettiin sitten jäissä, 125I-SCF;tä lisättiin ja putkien sisältöä inkuboitiin 4 °C:ssa ainakin 30 20 tunnin ajan. Kukin määritysputki sisälsi 500 μΐ inku- bointiseosta, joka koostui 50 pirsta laimennettua vasta-seerumia, määrästä noin 60 000 tuiketta/min 125I-SCF:ää (3,8 x 107 tuiketta/min/pg), 5 pirsta trasylolia ja 0 - 400 pirsta SCF-standardia, jolloin loput tilavuudesta muodosti 35 puskuri (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 0,1 % nautasee- 92 „ Λ 108140 rumialbumiinia, 0,05 % Triton X-100 -valmistetta, 0,025 % atsidia). Vastaseerumi oli toinen verinäyte, joka otettiin kaniinista, joka oli immunoitu luontaisella SCF-valmis-teella, jonka puhtausaste oli 50 % ja joka oli saatu BRL-5 3A-soluilla käsitellystä kasvualustasta. Vastaseerumin lopullinen laimennos määrityksessä oli 1:2 000.

Vasta-aineeseen sitoutunut 125I-SCF saostettiin lisäämällä 150 μΐ Staph A -tuotetta (Calbiochem). Yhden tunnin inkuboinnin huoneenlämpötilassa jälkeen näytteet 10 sentrifugoitiin ja pelletit pestiin kahdesti 0,75 mlrlla 10 mM Tris-HCl:ää, pH 8,2, joka sisälsi pitoisuudet 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA ja 0,05 % Triton X-100 -valmistetta. )

Pestyt pelletit laskettiin gamma-laskijassa sitoutuneen 125I-SCF:n prosentuaalisen osuuden määrittämiseksi. Vailla 15 seerumia olevaan putkeen sitoutuneet tuikkeet vähennettiin kaikista loppuarvoista ei-spesifisen sitoutumisen aiheuttaman korjauksen suorittamiseksi. Tyypillinen RIA on esitetty kuviossa 20. Leimaamattoman standardin tuottaman 125I-SCF-sitoutumisen prosentuaalinen inhibitio on annos-20 riippuvainen (kuvio 20A), ja kuten esitetään kuviossa 20B, tutkittaessa immuunisaostettuja pellettejä SDS-PAGE:lla ja ottamalla autoradiokuvia 125I-SCF-proteiininauhan suhteen esiintyy kilpailua. Kuviossa 20B vyöhyke 1 on 125I-SCF ja vyöhykkeet 2, 3, 4 ja 5 ovat immuunisaostettua 125I-SCF:ää, .25 joka kilpailee 0, 2, 100 ja vastaavasti 200 ng:n SCF-stan- ^ dardia kanssa. Kuten määritetään sekä RIA-putkissa havaitusta alenemasta vasta-aineella saostuvia tuikkeita/min sekä alenemasta immuuni saostettua 125I-SCF-proteiininauhaa (joka migroituu kohtaan noin Mr = 31 000) polyklonaalinen 30 vasta-seerumi tunnistaa SCF-standardin, joka puhdistettiin kuten esimerkissä 1.

Viestern-menettelyitä sovellettiin myös yhdistelmä-DNA-SCF-ilmennyksen coli -, C0S-1- ja CHO-soluissa to teamiseksi. Osittain puhdistetulla colissa ilmennetyllä 35 rotta-SCF1'193:11a (esimerkki 10), COS-1-soluissa ilmenne- 108140 93 tyllä rotta-SCF1-162:11a ja SCF1-193:lla sekä ihmis-SCF1-162:11a (esimerkit 4 ja 9) sekä CHO-soluissa ilmennetyllä rotta-SCF1-162 :11a (esimerkki 5) suoritettiin SDS-PAGE. Elektroforeesin jälkeen proteiininauhat siirrettiin 0,2 pm:n nit-5 roselluloosakalvolle käyttäen Bio-Rad Transblot -laitetta 60 V:n jännitteellä 5 tunnin ajan. Nitroselluloosakalvoja salvattiin 4 tunnin ajan PBS:ssä, pH 7,6, joka sisälsi 10 % vuohiseerumia, minkä jälkeen inkuboitiin 14 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 1:200 laimennoksella joko kaniinin 10 esi-immuuni- tai immuuniseerumia (immunointia kuvattiin edellä). Vasta-aine-vastaseerumikompleksit tehtiin näky-( viksi käyttäen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen antikaniini-IgG-reagensseja (Vector Laboratories) ja 4-kloori-l-naftoli-värinkehitysreagenssia.

15 Esimerkit kahdesta Western-analyysista esitetään kuvioissa 21 ja 22. Kuviossa 21 vyöhykkeet 3 ja 5 ovat 200 μΐ COS-l-soluissa tuotettua ihmis-SCF1-162:ta; vyöhykkeet 1 ja 7 ovat 200 μΐ COS-l-soluissa tuotettua ihmis-EPO:ta (COS-l-solut on transfektoitu V19.8-EPO:lla); vyöhykkeessä 20 8 ovat esivärjätyt molekyylipainomerkit. Vyöhykkeitä 1-4 inkuboitiin esi-immuuniseerumilla ja vyöhykkeitä 5-8 inkuboitiin immuuniseerumilla. Immuuniseerumi tunnistaa spesifisesti diffuusin nauhan, jonka näennäinen Mr = 30 000 daltonia, COS-l-soluista, jotka tuottavat ihmis-SCF1-162:ta, - · 25 mutta eivät COS-l-soluista, jotka tuottavat ihmis-EPO:ta.

Western-analyysissa, joka esitetään kuviossa 22, vyöhykkeet 1 ja 7 ovat 1 pg osittain puhdistettua rotta-SCF1-193-valmistetta, joka on tuotettu E^ colissa; vyöhykkeet 2 ja 8 ovat vehnänalkioagglutiniiniagaroosissa puh-30 distettua COS-l-soluissa tuotettua rotta-SCF1-193:ea; vyöhykkeet 4 ja 9 ovat vehnänalkioagglutiniiniagaroosissa puhdistettua COS-l-soluissa tuotettua rotta-SCF1-162: ta; vyöhykkeet 5 ja 10 ovat vehnänalkioagaroosissa puhdistettua CHO-soluissa tuotettua rotta-SCF1-162: ta; ja vyöhyk-35 keessä 6 ovat esivärjätyt molekyylipainomerkit. Vyöhyk- 94 108140 keitä 1 - 5 ja vyöhykkeitä 6· - 10 inkuboitiin kaniinin esi-immuuni- ja vastaavasti immuuniseerumilla. colissa tuotettu rotta-SCF1"193 (vyöhykkeet 1 ja 7) migroituu näennäiseen molekyylipainoon Mr = n. 24 000 daltonia, kun 5 taas COS-1-soluissa tuotettu rotta-SCF1"193 (vyöhykkeet 2 ja 8) migroituu näennäiseen molekyylipainoon Mr = 24 000 -36 000 daltonia. Tämä ero molekyylipainoissa on odotusten mukainen, koska nisäkässolut, mutta eivät bakteerisolut, kykenevät glykosylaatioon. Rotta-SCF1"162: ta koodittavan 10 sekvenssin transfektoinnista C0S-l-soluihin (vyöhykkeet 4 ja 9) tai CHO-soluihin (vyöhykkeet 5 ja 10) seuraa SCF:n ilmentyminen, jonka keskimääräinen molekyylipaino on ai- ) haisempi kuin tuotteen, joka on saatu transfektoimalla SCF1"193:lla (vyöhykkeet 2 ja 8).

15 Rotta-SCF1'152^ ilmennystuotteet COS-1- ja CHO-so- luista ovat sarja nauhoja, joiden näennäinen Mr = 24 000 -36 000 daltonia. Ilmennetyn SCF:n heterogeenisyys johtuu todennäköisesti hiilihydraattivarianteista, joissa SCF-polypeptidin glykosylaatioaste vaihtelee.

20 Yhteenvetona Western-analyysit osoittavat, että immuuniseerumi, joka on saatu luontaisella SCF:llä immu-noiduista kaniineista, tunnistaa yhdistelmä-DNA-SCF:n, joka on tuotettu E^_ coli -, COS-1- ja CHO-soluissa, mutta ei kykene tunnistamaan mitään nauhoja verrokkinäytteestä, 25 joka koostuu COS-l-soluissa tuotetusta EPO:sta. SCF-vas- ^ taseerumin spesifisyyttä edelleen tukevasti esi-immuuni-seerumi samasta kaniinista ei pystynyt reagoimaan minkään rotta- tai ihmis-SCF-ilmennystuotteen kanssa.

Esimerkki 8 30 Yhdistelmä-DNÄ-SCF:n aktiivisuus iri vivo Ά. Rotta-SCF luuydinsiirrossa COS-l-soluja transfektoitiin V19.8-SCF1*162:lla suuren mittakaavan kokeessa (Tl75 cm2 -kolvit 60 mm:n maljojen asemesta) kuten kuvattiin esimerkissä 4. Talteen saa-35 tiin noin 270 ml supernatanttia. Tällä supernatantilla 95 1 081 40· suoritettiin kromatografia-ajo vehnänalkioagglutiniini-agaroosissa ja S-Sepharose-valmisteessa oleellisesti kuten kuvattiin esimerkissä 1. Yhdistelmä-DNA-SCF:ää arvioitiin luuydinsiirtomallissa, joka perustui hiiri-W/Wv-genetiik-5 kaan. W/WT-hiirellä on kantasoluvajaus, josta muiden piirteiden ohella seuraa makrosyyttinen anemia (suuria punasoluja) ja joka mahdollistaa luuytimen siirtämisen normaaleista eläimistä tarvitsematta säteilyttää vastaanottaja-eläimiä [Russel et ai., Science 144 (1964) 844 - 846]. 10 Normaalit luovuttejakantasolut ohittavat kasvussa vajaat vastaanottajasolut siirron jälkeen.

( Seuraavassa esimerkissä kuhunkin ryhmään kuului 6 saman ikäistä hiirtä. Luuydintä otettiin normaaleista luovuttajahiiristä ja siirrettiin W/Wv-hi±riin. Vastaanot-15 tajaeläinten veriprofiilia seurataan eri ajankohtina siirron jälkeen ja luovuttajaytimen istutus määritetään ääreisverisolujen muuttumisesta vastaanottajan verityypis-tä luovuttajan verityyppiin. Muutos vastaanottajan fenotyypistä luovuttajan fenotyyppiin todetaan tarkkailemalla 20 punaisten verisolujen eteenpäin suuntautunutta sirontapro-fiilia (FASCAN, Becton Dickenson). Siirrännäisen vastaanottaneen kunkin eläimen profiilia verrattiin sekä luovutte javerrokkieläimiin että vastaanottajaverrokkieläimiin, jotka eivät saaneet siirrännäistä, kunakin ajankohtana.

^ , 25 Vertailu suoritettiin käyttäen tietokoneohjelmaa, joka perustui Kolmogorov-Smirnov-tilastotieteeseen virtaussys-teemien histogrammien analysoimiseksi [Young, J.Histochem. and Cytochem. 25 (1977) 935 - 941]. Istutuksen riippumaton kvalitatiivinen indikaattori on hemoglobiinielektroforee-30 silla vastaanottajan verestä todettu hemoglobiinityyppi | [Wong et ai., Mol.and Cell.Biol. 9 (1989) 798 - 808], mikä sopii hyvin sopivuuden hyvyyden asteeseen määrityksessä Kolmogorov-Smirnov-tilastotieteen mukaan.

Noin 3 x 105 solua siirrettiin SCFtllä käsittele-35 mättä (verrokkiryhmä kuviossa 23) C56BL/6J-luovuttajista « 96 1 08140 W/Wv-vastaanottajiin. Toinen ryhmä sai 3 x 105 luovuttaja-solua, joita oli käsitelty SCF:llä (600 yksikköä/ml), 37 °C:ssa 20 minuutin ajan ja jotka ruisutettiin yht'aikaa (esikäsitelty ryhmä kuviossa 23). (Yksi yksikkö SCF:ää 5 määritellään määräksi, josta seuraa puolimaksimaalinen stimulaatio MC/9-biomäärityksessä). Kolmannessa ryhmässä vastaanottajahiiret saivat ruiskeet ihonalaisesti (sub-Q) noin 400 yksikön SCF:ää/päivä kanssa 3 päivän ajan siitä, kun 3 x 105 luovuttajasolua oli ruiskutettu (Sub-Q-ruiske-10 ryhmä kuviossa 23). Kuten kuviossa 23 esitetään, molemmissa SCFrllä käsitellyssä ryhmässä luovuttajäydin tulee istutetuksi nopeammin kuin käsittelemättömässä verrokkiryh- ) mässä. 29 päivän kuluttua siirrosta SCF:llä esikäsitelty ryhmä oli siirtynyt luovuttajafenotyyppiin. Tämä esimerkki 15 havainnollistaa SCF-terapian käyttökelpoisuutta luuydin-siirrossa.

B. Rotta-SCF:n in vivo -aktiivisuus Steel-hiirissä

Mutaatiot Sl-geenipaikassa aiheuttavat vajauksia hematopoieettisissa soluissa, pigmenttisoluissa ja suku-20 soluissa. Hematopoieettinen vajaus ilmenee lukumäärien alenemisena, joka koskee punaisia verisoluja [Russel kirjassa Ai Gordon, "Regulation of Hematopoiesis", osa I, Appleton-Century-Crafts, New York, 1970, ss. 649 - 675], neutrofiilejä [Ruscetti, Proc♦Soc.Exp.Biol.Med. 152 (1976) 25 398], monosyyttejä [Shibata, J. Immunol. 135 (1985) 3905], ) megakaryosyyttejä [Ebbe, Exp.Hematol. 6 (1978) 201], luontaisia tappajasoluja [Clark, Immunogenetics 12 (1981) 601] sekä syöttösoluja [Hayashi, Dev.Biol. 109 (1985) 234].

Steel-hiiret ovat huonoja luuydinsiirrevastaanottajia, 30 mikä johtuu niiden alentuneesta kyvystä tukea kantasoluja [Bannerman, Prog.Hematol. 8 (1973) 131]. SCF:ää koodittava geeni on deletoitunut Steel- (S1/S1-) hiiristä.

Steel-hiiret tarjoavat SCF-aktiivisuuden herkän in vivo -mallin. Eri yhdistelmä-DNA-SCF-proteiineja testat-35 tiin Steel-Dickie- (Sl/Sld-) hiirissä vaihtelevan mittai- 97 1 08 1 40 siä aikoja. 6-10 viikon ikäiset Steel-hiiret (WCB6F1-Sl/Sld) hankittiin laitoksesta Jackson Labs, Bar Harbor, ME. Ääreisverta tarkkailtiin käyttäen SYSMEX F-800 -mikro-solulaskijaa (Baxter, Irvine, CA) punasolujen, hemoglobii-5 nin ja verihiutaleiden määrittämiseksi. Ääreisveren valko-verisolulukemien (WBC) laskemiseksi käytettiin Coulter Channelyzer 256 -laitetta (Coulter Electronics, Marietta, GA).

Kuvion 24 mukaisessa kokeessa Steel-Dickie-hiiriä 10 käsiteltiin E^ coli -peräisellä SCF-l-164:llä, jota oli ^ puhdistettu kuten esimerkissä 10, annoksena 100 pg/kg/- päivä 30 päivän ajan, ja sitten annoksena 30 pg/kg/päivä vielä 30 päivän ajan. Proteiini koostettiin ruiskutettavaan suolaliuokseen (Abbott Labs, North Chicago, IL), joka 15 sisälsi 0,1 %:n nautasikiöseerumia. Ruiskeet annettiin päivittäin ihonalaisesti. Ääreisverta tarkkailtiin ottamalla hännästä verta n. 50 pl kuviossa 24 mainittuina ajankohtina. Veri kerättiin 3-%:isella EDTA:11a päällystettyihin ruiskuihin ja jaettiin EDTA-jauheella käsitel-20 tyihin mikrofugiputkiin (Brinkmann, Westbury, NY). Käsiteltyjen eläinten makrosyyttisessä anemiassa tapahtuu merkittävä korjaus verrokkieläimiin verrattuna. Käsittelyn loppuessa käsitellyt eläimet palautuvat alkuperäiseen mak-^ rosyyttisen anemian tilaansa.

: 25 Kuvioissa 25 ja 26 esitetyssä kokeessa Steel-Dick ie-hiiriä · käsiteltiin eri yhdistelmä-DNA-SCF-muodoilla kuten edellä kuvattiin, jolloin kuitenkin annos oli 100 pg/kg/päivä, 20 päivän ajan. Kaksi E^ coli -peräistä rot-ta-SCF-muotoa, SCF1"164 ja SCF1"193, tuotettiin kuten kuvat-30 tiin esimerkissä 10. Lisäksi testattiin coli -SCF1"164, jota oli modifioitu lisäämällä polyetyleeniglykolia (SCF1' 164-PEG25) kuten esimerkissä 12. Samoin testattiin CHO-pe-räinen SCF1'162, joka tuotettiin kuten esimerkissä 5 ja jota puhdistettiin kuten esimerkissä 11. Eläimistä otettiin 35 verta lävistämällä sydän 3-%:isella EDTA:11a päällyste- 98 1 08 1 40 tylliä ruiskuilla ja se jaettiin EDTA-jauheella käsiteltyihin putkiin. Ääreisveriprofiilit 20 päivän käsittelyn jälkeen on esitetty kuviossa 25 valkoisille verisoluille (WBC) ja kuviossa 26 verihiutaleille. WBC-differentiaalit 5 SCF1_164-PEG25-ryhmälle on esitetty kuviossa 27. Neutrofii-lien, monosyyttien, imusolujen ja verihiutaleiden määrissä tapahtuu absoluuttisia lisäyksiä. Näyttävin vaikutus nähdään SCF1_164-PEG25: llä.

Imusolualasarjoista suoritettiin niinikään riippu-10 maton mittaus, josta tulostiedot on esitetty kuviossa 28. Ihmis-CD4:n, tai T-avustajasolumerkin, hiiriekvivalentti on L3T4 [Dialynas, J.Immunol. 131 (1983) 2445]. LyT-2 on ) hiiriantigeeni sytotoksisten T-solujen pinnalla [Ledbetter, J.Exp.Med. 153 (1981) 1503]. Näiden antigeenien vas-15 täisten monoklonaalisten vasta-aineiden avulla arvioitiin T-solualasarjoja käsitellyissä eläimissä.

Täysverestä värjättiin T-imusolualasarjoja seuraavasti. 200 μΐ täysverta otettiin yksittäisistä eläimistä EDTA:lla käsiteltyihin putkiin. Kussakin verinäytteessä 20 aiheutettiin lyysi käsittelemällä steriilillä deionisoi-dulla vedellä 60 sekunnin ajan, minkä jälkeen näytteistä tehtiin isotoonisia käyttäen 10X Dulbeccon fosfaattipus-kuroitua suolaliuosta (PBS) (Gibco, Grand Island, NY).

Tämä lyysin läpikäynyt veri pestiin 2 kertaan IX PBS:llä Λ . 25 (Gibco, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 0,1 %:lla ^ « nautasikiöseerumia (Flow Laboratory, McLean, VA) ja 0,1 %:lla natriumatsidia. Kukin verinäyte sijoitettiin pyö-reäpohjaiseen 96-kuoppaiseen rykelmälevyyn ja sentrifu-goitiin. Solupelletti (joka sisältää 2 - 10 x 105 solua) 30 uudelleenlietettiin 20 plraan rotan antihiiri-L3T4:ää, .· joka on konjugoitu fykoerytriiniin (PE) (Becton Dickinson,

Mountain View, CA), ja 20 pl:aan rotan antihiiri-LyT-2:ta, joka on konjugoitu fluoreseiini-isotiosynaattiin, minkä jälkeen inkuboitiin jäissä (4 °C) 30 minuutin ajan (Becton 35 Dickinson). Inkuboinnin jälkeen solut pestiin 2 kertaan IX

r 99 108740 PBS:llä, jota oli täydennetty kuten edellä mainittiin. Kukin verinäyte analysoitiin sitten FACSCAN-soluanalyysi-systeemissä (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Tämä systeemi standardoitiin käyttäen standardiautokompensaa-5 tiomenettelyitä ja Calibrite Beads -helmiä (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Nämä tulostiedot osoittavat absoluuttista nousua sekä avustaja-T-solupopulaatioissa että sytotoksisten T-solujen lukumäärissä.

C. SCF:n in vivo -aktiivisuus kädellisissä 10 Ihmis-SCF-l-164:n, joka ilmennettiin colissa (esimerkki 6B) ja puhdistettiin homogeeniseksi kuten esi-( merkissä 10, biologista aktiivisuutta in vivo testattiin normaaleissa kädellisissä. Täysikasvuisia urospuolisia paviaaneja (Papio sp.) tutkittiin kolmessa ryhmässä: kä-15 sittelemättömät, n=3; SCF:tä 100 pg/kg/päivä saavat, n=6; ja SCF:tä 30 pg/kg/päivä saavat, n=6. Käsitellyt eläimet saivat yksittäiset päivittäiset ihonalaiset SCF-ruiskeet. Eläimistä otettiin verinäytteet ketamiinipidäkettä käyttäen. Näytteet täydellistä verilaskentaa, retikulosyytti-20 laskentaa ja verihiutalelaskentaa varten otettiin käsit-telypäivinä 1, 6, 11, 15, 20 ja 25.

Kaikki eläimet jäivät menettelyjärjestelyssä eloon, eikä niillä ilmennyt mitään kielteisiä reaktioita SCF-te-^ rapiaan. Valkosoluluku kohosi käsitellyissä eläimissä an- » 25 noksen ollessa 100 pg/kg kuten esitetään kuviossa 29. Dif- ferentiaalilukema, joka saatiin manuaalisesti Wright Giem-sa -värjätyistä ääreisveritahroista, on samoin merkitty kuvioon 29. Neutrofiilien, imusolujen ja monosyyttien lukumäärissä tapahtui absoluuttinen lisäys. Kuten esitetään 30 kuviossa 30, annoksella 100 pg/kg tapahtui niinikään nousu sekä hematokriittien että verihiutaleiden lukumäärissä.

*

Ihmis-SCF:ää (hSCF1"164, jota oli modifioitu lisäämällä polyetyleeniglykolia kuten esimerkissä 12), testattiin myös normaaleissa paviaaneissa annoksena 200 pg/kg/-35 päivä, joka annos annettiin jatkuvana laskimonsisäisenä 108140 100 nestesiirtona, ja tulosta verrattiin modifvoimattomaan proteiiniin. Eläimille alettiin antaa SCF:ää päivänä 0 ja käsittelyä jatkettiin 28 päivän ajan. Tulokset ääreis-WBC:stä esitetään seuraavassa taulukossa. PEG:llä modi-5 foitu SCF aikaansai varhaisemman nousun ääreis-WBC:ssä kuin modifioimaton SCF.

Käsittely annoksella 200 pg/kg/päivä hSCF1_164:ää: 10 Eläinnro M88320 Eläinnro M88129

Päivä WBC Päivä WBC

) 0 5 800 0 6 800 +7 10 700 +7 7 400 15 +14 12 600 +14 20 900 +16 22 000 +21 18 400 +22 31 100 +23 24 900 +24 28 100 +29 13 000 +29 9 600 +30 23 000 20 +36 6 600 +37 12 100 +43 5 600 +44 10 700 +51 7 800 ) ιοί 108140 Käsittely annoksella 200 pg/kg/päivä PEG-hSCF1_164:ää:

Eläinnro M88350 Eläinnro M89116

Päivä NBC Päivä HBC

5 -7 12 400 -5 7 900 -2 11 600 0 7 400 +4 24 700 +6 16 400 +7 20 400 +9 17 100 10 +11 24 700 +13 18 700 +14 32 600 +16 19 400 ( +18 33 600 +20 27 800 +21 26 400 +23 20 700 +25 16 600 +27 20 200 15 +28 26 900 +29 18 600 +32 9 200 +33 7 600

Esimerkki 9

Yhdistelmä-DNÄ-ihmis-SCF:n aktiivisuus in vitro 20 Ihmis-SCF-cDNA, joka vastasi aminohappoja 1 - 162, ja saatiin esimerkissä 3D hahmotelluissa PCR-reaktioissa, ilmennettiin COS-l-soluissa kuten kuvattiin rotta-SCF:lie esimerkissä 4. COS-l-supernatantit määritettiin ihmisen luuydintä käyttäen sekä hiiri-HPP-CFC- ja MC/9-määrityk- ( 25 sillä. Ihmisproteiini ei ollut aktiivinen testattuina pi- • · toisuuksina kummassakaan hiirimäärityksessä; kuitenkin se oli aktiivinen ihmisen luuytimen suhteen. Määrityksen viljelyolosuhteet olivat seuraavat: ihmisen luuydintä terveistä vapaaehtoisista luovuttajista sentrifugoitiin 30 käyttäen Ficoll-Hypaque-gradientteja (Pharmacia) ja vil-·' jeltiin seoksessa, jossa oli 2,1 % metyyli selluloosaa, 30 % vasikansikiöseerumia, pitoisuudet 6 x 10"5 M 2-merkapto-etanoli, 2 mM glutamiini, ISCOVE-kasvualustaa (Gibco), 20 yksikköä/ml EP0:ta ja 1 x 105 solua/ml, 14 päivän ajan 35 kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 7 % 02:ta, 10 % 102 108140 C02:ta ja 83 % N2:ta. Yhdistelmä-DNA-ihmis- sekä rotta-SCF-COS-l-supernatanteilla saadut pesäkeluvut esitetään taulukossa 12. Vain ne pesäkkeet, jotka ovat kooltaan 0,2 mm tai suurempia, on merkitty.

5

Taulukko 12

Ihmisen luuydinpesäkkeitten kasvu vasteena SCF:lle

Transfektoitu plasmidi Määritetty Pesäkkeitä, kpl 10 CM-tilavuus /100 000 solua

(μΐ) ± SD

VI9.8 (ei inserttiä) 100 0 50 0 15 V19.8-ihmis-SCF1"162 100 33 ± 7 50 22 ± 3 V19.8-rotta-SCF1'162 100 13 + 1 20 50 10 14 päivän aikajaksona kasvaneet pesäkkeet esitetään kuviossa 31A (suurennos 12x). Nuoli osoittaa tyypillistä pesäkettä. Pesäkkeet muistuttivat hiiri-HPP-CFC-pesäkkeitä ^ 25 suuren kokonsa osalta (keskimäärin 0,5 mm). EP0:n läsnäolon johdosta jotkut pesäkkeistä olivat hemoglobinisoitu-ja. Kun pesäkkeet eristettiin ja sentrifugoitiin objekti-laseille käyttäen Cytospin-laitetta (Shandon) ja värjättiin sitten Wright-Giemsa-värillä, vallitseva solutyyppi 30 oli ei-differentioitunut solu, jonka tuma:solulima-suhde oli korkea kuviossa 31B esitetyn mukaisesti (suurennos 400x). Nuolet kuviossa 31B osoittavat seuraavia rakenteita: nuoli 1, solulima; nuoli 2, tuma; nuoli 3, solurakku-loita. Epäkypsät solut ovat luokkana suuria ja soluista 35 tulee lisääntyvässä määrin pienempiä niiden kypsyessä 108140 103 [Diggs et ai., "The Morphology of Human Blood Cells", Abbott Labs, nro 3 (1978)]. Hematopoieettisen kypsymissekvenssin varhaisten solujen tumat ovat suhteellisen suuria verrattuna solulimaan. Lisäksi epäkypsien 5 solujen solulima värjääntyy tummemmaksi Wright-Giemsa-vä-rillä kuin tuma. Solujen kypsyessä tuma värjääntyy tummemmaksi kuin solulima. Ihmisen luuydinsolut, jotka saadaan viljeltäessä yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:llä, sopivat morfologialtaan siihen johtopäätökseen, että SCF-vaiku-10 tuksen kohde ja välitön tuote on suhteellisen epäkypsä he-matopoieettinen kantaisäsolu.

( Yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:ää testattiin agar-pesä- kemäärityksissä ihmisen luuytimen suhteen sen ollessa yhdistetty muihin kasvutekijöihin kuten kuvattiin edellä. 15 Tulokset esitetään taulukossa 13. SCF vaikuttaa synergis-tisesti G-CSF:n, GM-CSF:n, IL-3:n ja EPO:n kanssa nostaen yksittäisten CSF:ien luuydinkohteiden lisääntymistä.

Taulukko 13 20 Yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:n synergia muiden ihmis- solupesäkkeitä stimuloivien tekijöiden kanssa

Pesäkkeitä, kpl ζ /105 solua (14 päivää) . 25

Vale 0 hG-CSF 32 ± 3 hG-CSF + hSCF 74 ± 1 hGM-CSF 14 ± 2 30 hGM-CSF + hSCF 108 ± 5 .* hIL-3 23 ± 1 hIL-3 + hSCF 108 ± 3 hEPO 10 ± 5 hEPO + IL-3 17 ± 1 35 hEPO + hSCF 86 ± 10 hSCF 0 108140 104

Yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF:n toinen aktiivisuus on kyky aikaansaada pehmeässä agar-agarissa ihmisen akuutti ydinperäinen leukemia - (AML-) solulinjan, KG-1 (ATCC CCL 246), lisääntymistä. COS-l-supernatantteja transfektoi-5 duista soluista testattiin KG-l-agar-kloonausmäärityksessä [Koeffler et ai., Science 200 (1978) 1153 - 1154] oleellisesti kuten kuvattiin lukuunottamatta, että soluja mal-joitettiin määrä 3 000/ml. Tulokset kolminkertaisista viljelyistä esitetään taulukossa 14.

10

Taulukko 14 KG-l-pehmeä-agar-kloonausmääritys )

Transfektoitu Määritys- Pesäkkeitä, kpl

15 plasmidi tilavuus (μΐ) /3 000 solua ± SD

V19.8 (ei inserttiä) 25 2 ± 1 V19.8-ihmis-SCF1"162 25 14 ± 0 20 12 8 ± 0 6 9 ± 5 3 6 ± 4 1,5 6 ± 6 ·; 25 V19.8-rotta-SCF1"162 25 6 ± 1 ) ihmis-GM-CSF 50 (5 ng/ml) 14 ± 5

Esimerkki 10 30 colissa ilmennettyjen yhdistelmä-DNA-SCF-tuot- teiden puhdistaminen E. coli -ihmis-SCF1_154:ää fermentoitiin esimerkin 6C mukaisesti. Talteenotetut solut (912 g märkäpaino) lietettiin veteen tilavuuteen 4,6 litraa ja rikottiin 35 käyttämällä liete 3 kertaan laboratoriohomogenisaattorin j 108.140 läpi (Gaulin-malli 15MR-8TBA) paineessa 560 kp/cm2. Sent-rifugoimalla (17 700 x g, 30 min, 4 °C) saatiin rikotusta solupelletistä koostuva fraktio, joka pestiin kerran vedellä (uudelleenliettäminen ja sentrifugointi toistami-5 seen) ja lietettiin lopuksi veteen 400 ml:n tilavuuteen.

Pellettifraktio, joka sisälsi ei-liukoista SCF:ää (arvio 10 - 12 g SCF:ää), lisättiin 3 950 ml:aan tarkoituksenmukaista seosta siten, että ainesosien loppupitoi-suudet seoksessa olivat 8 M urea (laatu, jonka puhtausaste 10 oli hyvin puhdas, "ultra"), 0,1 mM EDTA, 50 mM natrium-, asetaatti, pH 6 - 7; SCF-pitoisuudeksi arvioitiin 1,5 v mg/ml. Inkuboitiin huoneenlämpötilassa 4 tuntia ajan SCF:n tekemiseksi liukoiseksi. Jäljellä oleva ei-liukoinen materiaali poistettiin sentrifugoimalla (17 700 x g, 30 min, 15 huoneenlämpötila). Liukoiseksi tehdyn SCF:n uu-delleenlaskostamiseksi/uudelleenhapettamiseksi superna-tanttifraktio lisättiin hitaasti samalla sekoittaen 39,15 litraan tarkoituksenmukaista seosta siten, että ainesosien loppupitoisuudet seoksessa olivat 2,5 M urea (laatu, jonka 20 puhtausaste oli hyvin puhdas, "ultra"), 0,01 mM EDTA, 5 mM natriumasetaatti, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM glutationi, 0,02 % (w/v) natriumatsidia. SCF-pitoisuudeksi arvioitiin 150 pg/ml. Sekoitettiin 60 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ^ [lyhemmätkin ajat (esim. n. 20 tuntia) sopivat], minkä ,· 25 jälkeen seos konsentroitiin puoleen käyttäen Millipore Pellicon -ultrasuodatuslaitteistoa, jossa oli kolme polys-ulfonimembraanikasettia, joiden molekyylipainokynnys oli 10 000 (kokonaispinta-ala 460 cmz), ja diasuodatettiin vastaan 7 tilavuutta 20 mM Tris-HCl:ää, pH 8. Lämpötila kon-30 sentrointi/ultrasuodatuksessa oli 4 °C, pumppausnopeus oli 5 litraa/min ja suodatusnopeus oli 600 ml/min. Talteen-saadun retentaatin lopputilavuus oli 26,5 litraa. Käyttämällä SDS-PAGE:ea, joka suoritettiin sekä pelkistäen näytteet että niitä pelkistämättä selvitettiin kiistatta, että 35 valtaosa (> 80 %) pellettifraktio-SCF:stä liukeni inku- « 106 1 081 40 boinnissa 8 M urealla ja että laskostamisen/hapetuksen jälkeen läsnä on monia SCF-lajeja (muotoja), mikä visualisoitiin ei-pelkistettyjen näytteiden SDS-PAGE:lla. Valta-muoto, joka vastaa oikein hapettunutta SCFrää (katso al-5 la), migroituu näennäiseen Mr-lukemaan noin 17 000 (ei-pel-kistetty) suhteessa molekyylipainomerkkeihin (pelkistettyjä), joita kuvattiin kuvion 9 yhteydessä. Muita muotoja ovat materiaali, joka migroituu näennäiseen Mr-lukemaan noin 18 - 20 000 (ei-pelkistetty), jonka arvellaan edusta-10 van SCF:ää, jonka ketjunsisäiset disulfidisillat ovat epäasialliset; ja nauhat, jotka migroituvat näennäisiin Mr-lukemiin noin 37 000 (ei-pelkistettyjä) tai enemmän, joi- ) den arvellaan edustavan» eri SCF-muotoja, joissa on ketjun-sisäisiä disulfidisiltoja, joista seuraa SCF-polypeptidi-15 ketjuja, jotka ovat kovalenttisesti kytkettyjä muodostamaan dimeerejä tai vastaavasti suurempia oligomeerejä. Seuraavien fraktointivaiheiden tuloksena loput coli -epäpuhtaudet sekä epätoivottavat SCF-muodot poistuvat siten, että saadaan näennäisesti homogeeniseksi puhdistet-20 tua SCF:ää, joka on biologisesti aktiivisessa konfor-maatiossa.

Ultrasuodatusretentaatin pH säädettiin 4,5:ksi lisäämällä 375 ml 10-%:ista (v/v) etikkahappoa, mikä johti näkyvän saostuneen materiaalin läsnäoloon. 60 minuutin \ 25 kuluttua, jolloin suuri osa saostuneesta materiaalista oli asettunut astian pohjaan, ylemmät 24 litraa dekantoitiin eroon ja suodatettiin Cuno™ 30SP -syväsuodattimen läpi virtausnopeudella 500 ml/min kirkastamisen loppuun-saattaamiseksi. Sitten suodosta laimennettiin 1,5-kertai-30 sesti lisäämällä vettä ja se panostettiin 4 °C:ssa S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) -kolonniin (9 x 18,5 cm), jota oli tasapainoitettu 25 mM natriumasetaatilla, pH 4,5.

Kolonnia käytettiin virtausnopeudella 5 litraa/tunti 4 eC:ssa. Näytepanostuksen jälkeen kolonni pestiin 5 ko-35 lonnitilavuudella (n. 6 litraa) kolonnipuskuria ja kolon- 108140 ! 107 j j niin sitoutunut SCF-materiaali eluoitiin käyttäen gra-dienttia 0 -+ 0,35 M NaCl kolonnipuskurissa. Gradientin kokonaistilavuus oli 20 litraa ja kerättiin 200 ml:n fraktioita. Eluutioprofiili on esitetty kuviossa 33. S-5 Sepharose-kolonnista kerätyistä fraktioista otetut näytteet (10 μΐ) analysoitiin SDS-PAGE:11a, joka suoritettiin sekä näytteet pelkistäen (kuvio 32A) että niitä pelkistämättä (kuvio 32B). Tällaisten analyysien perusteella on ilmeistä, että absorbanssi 280 nm:ssä (kuviot 32 ja 33) 10 johtuu käytännöllisesti katsoen kokonaisuudessaan SCF-ma-teriaalista.

( Oikein hapettunut muoto on vallitseva pääasialli sessa absorbanssipiikissä (fraktiot 22 - 38, kuvio 33).

Vähäisiin lajeihin (muotoihin), joita fraktioista voidaan 15 visualisoida, lukeutuu väärin hapettunut materiaali, jonka näennäinen Mr = 18 - 20 000 SDS-PAGE:ssa (ei-pelkistynyt), joka esiintyy johtavassa olkapäässä pääasiallisessa absorbanssipiikissä (fraktiot 10 - 21, kuvio 32B); ja disulfi-dikytketty dimeerimateriaali, jota esiintyy kautta absor-20 banssialueen (fraktiot 10 - 38, kuvio 32B).

Fraktiot 22 - 38 S-Sepharose-kolonnista yhdistettiin pooliksi, jonka pH säädettiin 2,2:ksi lisäämällä noin 11 ml 6 N HClrää, minkä jälkeen se panostettiin Vydac-C4-^ kolonniin (korkeus 8,4 cm, halkaisija 9 cm), jota oli ta- • 25 sapainoitettu 50-%:isella (v/v) etanolilla, joka sisälsi pitoisuuden 12,5 mM HC1 (liuos A), ja jota käytettiin 4 °C:ssa. Kolonnihartsi valmistettiin liettämällä kuiva hartsi 80-%:iseen (v/v) etanoliin, jossa oli pitoisuus 12,5 mM HC1 (liuos B), minkä jälkeen sitä tasapainoitet-30 tiin liuoksella A. Ennen näytteen panostusta käytettiin • sokeaa gradienttia liuoksesta A liuokseen B (kokonaistilavuus 6 litraa), minkä jälkeen kolonnia tasapainoitettiin toistamiseen liuoksella A. Näytteen panostuksen jälkeen kolonnia pestiin 2,5 litralla liuosta A ja kolonniin si- 35 toutunut SCF-materiaali eluoitiin käyttäen gradienttia 108140 108 liuoksesta A liuokseen B (kokonaistilavuus 18 litraa) virtausnopeuden ollessa 2 670 ml/tunti. Kerättiin 286 fraktiota, joista kukin oli 50 ml, ja joista otetut näytteet analysoitiin mittaamalla absorbanssi 280 nm:ssä (kuvio 35) 5 sekä SDS-PAGE:lla (25 μΐ/fraktio) kuten edellä kuvattiin (kuvio (34A, pelkistävät olosuhteet; kuvio 34B, ei-pelkis-tävät olosuhteet). Fraktiot 62 - 161, jotka sisälsivät oikein hapettunutta SCF:ää erittäin puhtaana, yhdistettiin pooliksi [suhteellisen pienet määrät väärin hapettunutta 10 monomeeriä, jonka Mr = noin 18 - 20 000 (ei-pelkistynyt), eluoitui myöhemmin gradientissa (suunnilleen fraktioissa 166 - 211), jolloin myös disulfidikytketty dimeerimate- ) riaali eluoitui myöhemmin (suunnilleen fraktioissa 199 -235) (kuvio 35)].

15 Etanolin poistamiseksi fraktioiden 62 - 161 muo dostamasta poolista sekä SCFrn konsentroimiseksi käytettiin seuraavaa menettelyä, jossa käytettiin Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) -ioninvaihtohartsia. Poolia (5 litraa) laimennettiin lisäämällä vettä tilavuuteen 15,625 20 litraa, jolloin etanolipitoisuudeksi tuli noin 20 % (v/v).

Sitten lisättiin 1 M Tris-emästä (135 ml) pH: n nostamiseksi 8:aan, ja sen jälkeen 1 M Tris-HCl:ää, pH 8 (23,6 ml) kokonais-Tris-pitoisuuden nostamiseksi 10 mM:ksi. Sitten lisättiin 10 mM Tris-HCl:ää, pH 8 (n. 15,5 : 25 litraa) kokonaistilavuuden nostamiseksi 31,25 litraksi, ) jolloin etanolipitoisuudeksi tuli noin 10 % (v/v). Sen jälkeen materiaali panostettiin 4 °C:ssa Q-Sepharose Fast Flow -kolonniin (korkeus 6,5 cm, halkaisija 7 cm), jota oli tasapainoitettu 10 mM Tris-HCl:llä, pH 8, minkä jäl-30 keen kolonni pestiin 2,5 litralla kolonnipuskuria. Virtausnopeus näyttepanostuksen ja pesun aikana oli noin 5,5 litraa/tunti. Sitoutuneen SCFrn eluoimiseksi liuosta 200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8, pumpattiin käänteiseen suuntaan kolonnin läpi virtausnopeudella noin 200 ml/tun-35 ti. Kerättiin noin 12 ml:n fraktioita, joita analysoitiin 109 10 8140 mittaamalla absorbanssi 280 nm:ssä ja suorittamalla SDS-PAGE kuten edellä. Fraktiot 16 - 28 yhdistettiin (157 ml).

Sitten SCF:n sisältävä pooli panostettiin kahta erillistä ajoa silmällä pitäen (78,5 ml panostettiin kum-5 paakin varten) Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) -geelisuo-datuskolonniin (5 x 138 cm), jota oli tasapainoitettu fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella 4 °C:ssa. Kerättiin noin 15 ml:n fraktioita virtausnopeuden ollessa noin 75 ml/tunti. Kummassakin tapauksessa pääasiallinen materiaa-10 lipiikki, joka absorboi 280 nm:ssä, eluoitui fraktioissa, jotka vastasivat karkeasti eluutiotilavuutta noin 1 370 -( 1 635 ml. Näitä absorbanssipiikkejä vastaavat fraktiot kyseisistä kahdesta kolonniajosta yhdistettiin yhdeksi pooliksi, jonka tilavuus oli 525 ml ja joka sisälsi noin 15 2,3 g SCF:ää. Tämä materiaali steriloitiin suodattamalla käyttäen Millipore Millipak 20 -membraanipanosta.

Vaihtoehtoisesti C4-kolonnista saatu materiaali voidaan konsentroida ultrasuodattamalla ja puskuri vaihtaa diasuodattamalla ennen steriilisuodatusta.

20 Eristetty yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF1'164-materiaali on erittäin puhdasta (> 98 % SDS-PAGE:ssa hopealla vär jättäessä) ja se katsotaan farmaseuttiseksi laaduksi. Käyttäen esimerkissä 2 hahmoteltuja menetelmiä on todettu, ^ että materiaalin aminohappokoostumus vastaa SCF-geenin ,· 25 analyysin perusteella odotettua koostumusta, ja että sen N-pään aminohapposekvenssi on Met-Glu-Gly-Ile... odotusten mukaisesti, jolloin Met:n pysymisen koodittaa aloituskodoni.

Menettelyillä, jotka ovat verrattavia niihin, joita 30 hahmoteltiin E_^ colissa ilmennetylle ihmis-SCF1-164:lle, * rotta-SCF1-164 (joka samoin on ei-liukoisessa muodossa solun sisässä fermentoinnin jälkeen) voidaan ottaa talteen puhtaana siten, että sen biologinen spesifinen aktiivisuus on korkea. Vastaavasti ihmis-SCF1'183 ja rotta-SCF1-193 voidaan 35 ottaa talteen. Rotta-SCF1-193:11a on laskostamisessa/hape- no 108140 tuksessa taipumus muodostaa enemmän eri tavoin hapettuneita lajeja, ja epätoivottavat lajit ovat vaikeammin poistettavissa kromatografisesti.

Rotta-SCF1'193 ja ihmis-SCF1"183 ovat taipuvaisia ha-5 joamaan proteolyyttisesti talteenoton varhaisissa vaiheissa, eli liukoiseksi tekemisessä ja laskostamisessa/-hapetuksessa. Ensisijainen proteolyysikohta sijaitsee tähteiden 160 ja 170 välissä. Proteolyysi voidaan minimoida manipuloimalla tarkoituksenmukaisesti olosuhteita 10 (esim. SCF-pitoisuutta; vaihtelemalla pH:ta; sisällyttämällä mukaan EDTA:ta pitoisuus 2-5 mM, tai muita pro-teaasi-inhibiittoreita), sekä hajonneita muotoja siinä ' määrin, että läsnä olevat voidaan poistaa tarkoituksenmukaisilla fraktiointivaiheilla.

15 Vaikka urean käyttö liukoiseksi tekemisessä sekä laskostamisessa/hapetuksessa on kuten hahmoteltu edullinen suoritusmuoto, muitakin liukoiseksi tekeviä aineita kuten guanidiini-HCl:ää (esim. 6 M liukoiseksi tekemisessä ja 1,25 M laskostamisessa/hapetuksessa) sekä natrium-N-lau-20 royylisarkosiinia voidaan käyttää tehokkaasti. Kun nämä aineet on poistettu laskostamisen/hapetuksen jälkeen, puhdistettuja SCFriä, SDS-PAGE:lla määritettyinä, voidaan saada talteen käyttämällä tarkoituksenmukaisia fraktioin-tivaiheita. ^ 25 Lisäksi vaikka glutationin käyttäminen pitoisuutena 1 mM laskostamisen/hapetuksen aikana on edullinen suoritusmuoto, muitakin olosuhteita voidaan käyttää samalla tai lähes samalla teholla. Näitä ovat esimerkiksi, että 1 mM glutationin asemesta käytetään 2 mM glutationia sekä 0,2 30 mM hapetettua glutationia, tai 4 mM glutationia sekä 0,4 . mM hapetettua glutationia, tai 1 mM 2-merkaptoetanolia, tai muitakin tiolireagensseja.

Kuvattujen kromatografisten menettelyjen lisäksi muitakin menettelyjä, jotka ovat käyttökelpoisia SCFrien 35 talteenottamiseksi puhdistetussa aktiivisessa muodossa, U1 108140 ovat hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia [esim. fe-nyyli-Sepharosen (Pharmacia) käyttö, jolloin näyte panostetaan neutraalissa pH:ssa, kun läsnä on pitoisuus 1,7 mM ammoniumsulfaatti, ja eluoidaan käyttäen laskevaa ammo-5 niumsulfaattigradienttia]? immobilisoitu metalli -affini-teettikromatografia [esim. Cu2+-ionilla varatun kelatoivan Sepharosen (Pharmacia) käyttö, jolloin näyte panostetaan lähes neutraalissa pH:ssa, kun läsnä on pitoisuus 1 mM imidatsoli, ja eluoidaan kasvavalla imidatsoligradientil-10 la]; hydroksyyliapatiittikromatografia [jolloin näyte panostetaan neutraalissa pH:ssa, kun läsnä on pitoisuus 1 mM ( fosfaatti, ja eluoidaan kasvavalla fosfaattigradientilla]; ja muut alan ammattilaisille ilmeiset menettelyt.

Muita ihmis-SCF-muotoja, jotka vastaavat kokonai-15 suudessaan tai osittain avointa lukualuetta, joka koodit-taa aminohapot 1 - 248 kuviossa 42, tai vastaavat avointa lukualuetta, jonka koodittavat vaihtovuoroisesti silmukoidut mRNA:t, joita voi esiintyä (kuten se, joka esiintyy kuvion 44 mukaisessa cDNA-sekvenssissä), voidaan niinikään 20 ilmentää colissa ja ottaa talteen puhdistetussa muodossa samankaltaisilla menettelyillä, kuin menettelyt, joita kuvattiin tässä esimerkissä, ja muilla menettelyillä, jotka ovat alan ammattilaisille ilmeisiä.

Muotojen, jota käsittävät niinsanotun transmemb-' > 25 raanialueen, johon viitattiin esimerkissä 16, puhdistami seen ja koostamiseen saattaa liittyä pesuaineiden käyttäminen, mukaan lukien ei-ionisten pesuaineiden, ja lipidien, mukaan lukien fosfolipidipitoisten liposomiraken-teiden.

30 Esimerkki 11

Yhdistelmä-DNA-SCF nisäkässoluista A. SCF:ää tuottavien CHO-solujen fermentointi

Kiinalaisen hamsterin munasarja- (CH0-) yhdistelmä-DNA-soluja (kanta CHO pDSR-alfa-2-hSCF1'162) kasvatettiin 35 mikrokantajilla 20 litran perfuusioviljelysysteemissä ih- 108140 112 mis-SCF1'162^ tuottamiseksi. Fermentointisysteemi on samankaltainen kuin BRL 3A -solujen viljelyyn käytetty esimerkissä IB lukuunottamatta, että CHO-solujen viljelyyn käytetty kasvualusta oli seos Dulbeccon modifioitua Eagle-5 kasvualustaa (DMEM) ja Hamin F-12-ravinnekasvualustaa suhteessa 1:1 (Gibco), jota oli täydennetty pitoisuudella 2 mM glutamiini, ei-välttämättömillä aminohapoilla (olemassa olevan pitoisuuden kaksinkertaistamiseksi käyttämällä 1:100 laimennoksena Gibco nro 320-1140 -tuotetta) ja 5 10 %:lla nautasikiöseerumia. Talteenotettu kasvualusta oli identtinen lukuunottamatta seerumin poisjättöä. Reaktoriin siirrostettiin 5,6 x 109 CHO-solua, jotka oli kasvatettu 3 ) litran kehrääjäpulloissa. Solujen annettiin kasvaa pitoisuuteen 4 x 105 solua/ml. Tässä vaiheessa reaktoriin lisät-15 tiin 100 g esisteriloituja Cytodex-2-mikrokantajia (Pharmacia) 3 litran lietteenä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Solujen annettiin kiinnittyä ja kasvaa mikro-kantajilla 4 päivän ajan. Kasvualustaa perfusoitiin reaktorin läpi glukoosikulutusta määräytyvän tarpeen mukaan.

20 Glukoosipitoisuus pidettiin noin 2,0 g:ssa/litra. 4 päivän kuluttua reaktoriin perfusoitiin 6 tilavuutta kasvualustaa, jossa ei ollut seerumia, valtaosan seerumista poistamiseksi (proteiinipitoisuus < 50 yg/ml). Sitten reaktoria käytettiin erämuodolla kunnes glukoosipitoisuus laski alle 25 2 g:n/litra. Tästä hetkestä eteenpäin reaktoria käytettiin ) jatkuvatoimisesti perfuusionopeuden ollessa noin 20 lit-raa/päivä. Viljelmän pH pidettiin lukemassa 6,9 ± 0,3 säätämällä C02-virtausnopeutta. Liuenneen hapen pitoisuus pidettiin yli 20 %:n ilmakyllästysasteessa lisäämällä täy-30 dennykseksi puhdasta happea tarpeen mukaan. Lämpötila pidettiin 37 ± 0,5 °C:ssa.

Edeltävästä systeemistä saatiin noin 450 litraa käsiteltyä kasvualustaa, jossa ei ollut seerumia ja jota käytettiin lähtömateriaalina yhdistelmä-DNA-ihmis-35 SCFW62:n puhdistamiseksi.

i 108140 113

Samalla tavalla mutta kantaa CHO pDSR-alfa-2-rSCF1"162 käyttäen muodostettiin noin 589 litraa käsiteltyä kasvualustaa, jossa ei ollut seerumia ja jota käytettiin lähtömateriaalina rotta-SCF1'162^ puhdistamiseksi.

5 B. Yhdistelmä-DNA-nisäkäsilmennetyn rotta-SCF1_16Z:n puhdistaminen

Kaikki puhdistustyö suoritettiin 4 °C:ssa, ellei toisin ole mainittu.

1. Konsentrointi ja diasuodatus 10 Käsitelty kasvualusta, joka muodostettiin kasvat- ^ tamalla seerumivapaissa olosuhteissa solukantaa CHO pDSR- v alfa-2-rotta-SCF1-162 suoritettuna kuten osassa A edellä, kirkastettiin suodattamalla 0,45 μ:η Sarto-kapselien (Sar-torius) läpi. Monta eri erää (36 litraa, 101 litraa, 102 15 litraa, 200 litraa ja 150 litraa) konsentroitiin erikseen ja suoritettiin diasuodatus/puskurivaihto. Tämän havainnollistamiseksi 36 litran erää käsiteltiin seuraavasti.

Suodatettu käsitelty kasvualusta konsentroitiin n. 500 ml:ksi käyttäen Millipore Pellicon -tangentiaalivirtaus-20 ultrasuodatuslaitteistoa, jossa oli 3 selluloosa-asetaat-timembraanikasettia, joiden molekyylipainokynnys oli 10 000 (kokonaismembraanipinta-ala 460 cm2; pumppausnopeus n. 2 200 ml/min ja suodatusnopeus n. 750 ml/min). Diasuo-^ datus/puskurivaihto valmisteluna anioninvaihtokromatogra- 25 fialle suoritettiin sitten lisäämällä 1 000 ml 10 mM Tris-HCl:ää, pH 6,7 - 6,8, konsentraattiin, minkä jälkeen konsentroitiin toistamiseen 500 ml:ksi käyttäen tangentiaa-livirtausultrasuodatuslaitteistoa, minkä jälkeen tämä toistettiin vielä 5 kertaan. Konsentroitua/diasuodatettua 30 valmistetta otettiin lopulta talteen tilavuus 1 000 ml.

·* Kaikkien käsiteltyjen kasvualustaerien käytös, joille suo ritettiin konsentrointi ja diasuodatus/puskurivaihto, oli samankaltainen. Erien proteiinipitoisuus, joka määritettiin Bradfordin menetelmällä [Anal.Biochem. 72 (1976) 35 248 - 254] käyttäen nautaseerumialbumiinia standardina, 114 1081.40 oli 70 - 90 μg/ml. Tähän valmisteeseen käytetyn käsitellyn kasvualustan kokonaistilavuus oli noin 589 litraa.

2. Q-Sepharose Fast Flow -anioninvaihtokromatogra- fia 5 Konsentroidut/diasuodatetut valmisteet kustakin edellä mainitusta viidestä käsitellystä kasvualustaerästä yhdistettiin (kokonaistilavuus 5 000 ml). pH säädettiin 6,75:ksi lisäämällä 1 M HCl:ää. Johtokyvyn saamiseksi noin 0,700 mmho:hon käytettiin 2 000 ml 10 mM Tris-HCl:ää, pH 10 6,7. Valmiste panostettiin Q-Sepharose Fast Flow -anionin- vaihtokolonniin (36 x 14 cm; Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow -hartsi), jota oli tasapainoitettu käyttäen 10 mM )

Tris-HCl, pH 6,7 -puskuria. Näytepanostuksen jälkeen kolonnia pestiin 28 700 ml:11a Tris-puskuria. Tämän pesun 15 jälkeen kolonnia pestiin 23 000 ml:11a seosta 5 mM etikka-happo/1 mM glysiini/6 M urea/20 μΜ CuS04 pHrssa noin 4,5. Kolonnia pestiin sitten 10 mM Tris-HCl, 20 μΜ CuS04, pH 6,7 -puskurilla neutraalin pH: n palauttamiseksi sekä urean poistamiseksi, ja käytettiin suolagradienttia (0 -» 700 mM 20 NaCl 10 mM Tris-HCl, 20 μΜ CuS04, pH 6,7 -puskurissa; kokonaistilavuus 40 litraa). Kerättiin noin 490 ml:n fraktioita virtausnopeuden ollessa noin 3 250 ml/tunti. Kroma-togrammi on esitetty kuviossa 36. "MC/9 tuiketta/min" viittaa biologiseen aktiivisuuteen MC/9-määrityksessä; 5 25 μΐ mainituista fraktioista käytettiin määrityksessä. Näy- y tepanostuksen sekä pesujen aikana kerättyjä eluaatteja ei ole esitetty kuviossa; näissä fraktioissa ei todettu lainkaan biologista aktiivisuutta.

3. Kromatografia käyttäen piidioksidiin sidottua 30 hiilivetyhartsia

Fraktiot 44 - 66 kuviossa 36 esitetystä ajosta yh-distettiin (11 200 ml) ja lisättiin EDTA:ta loppupitoi-suuteen 1 mM. Tämä materiaali panostettiin virtausnopeuden ollessa noin 2 000 ml/tunti C4-kolonniin (Vydac Proteins 35 C4; 7x8 cm), jota oli tasapainoitettu puskurilla A (10 mM

H5 108140

Tris, pH 6,7/20 % etanolia). Näytepanostuksen jälkeen kolonnia pestiin 1 000 ml:11a puskuria A. Sitten käytettiin lineaarista gradienttia puskurista A puskuriin B (10 mM Tris, pH 6,7/94 % etanolia) (kokonaistilavuus 6 000 ml), 5 ja kerättiin 30 - 50 ml:n fraktioita. Eriä C4-kolonniläh-tönäytteestä, läpivirtauspoolista ja pesupoolista 0,5 ml:n näyte-erien gradienttifraktioista ohella dialysoitiin vastaan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta biologista määritystä silmällä pitäen. Nämä erilaiset fraktiot määritet-10 tiin MC/9-määritystä käyttäen (5 pl:n näyte-erät valmis-tetuista gradienttifraktioista; tuiketta/min kuviossa 37). v Kuviossa 38 esitetään SDS-PAGE [Laemmli, Nature 227 (1970) 680 - 685; panostusgeelit sisälsivät 4 % (w/v) akryyli-amidia ja erotusgeelit sisälsivät 12,5 % (w/v) akryyli-15 amidia] eri fraktioista otetuille näyte-erille. Esitettyjen geelien kohdalla näyte-erät (100 μΐ) kuivattiin tyhjössä ja uudelleenliuotettiin sitten käyttäen 20 μΐ näyte-käsittelypuskuria (pelkistävä, eli 2-merkaptoetanolia sisältävä), minkä jälkeen niitä keitettiin 5 minuutin ajan 20 ennen panostamista geeliin. Numeroidut merkit kuviossa vasemmalla edustavat raolekyylipainomerkkien (pelkistettyjä) migraatioasemia kuten kuviossa 6. Numeroidut vyöhykkeet edustavat vastaavia fraktioita, jotka on kerätty ^ gradientin viimeosan käytön aikana. Geelit värjättiin ho- • 25 pealla [Morrissey, Anal,Biochem. 117 (1981) 307 - 310].

4. Q-Sepharose Fast Flow -anioninvaihtokromatogra- fia

Fraktiot 98 - 124 kuviossa 37 esitetystä (^-kolonnista yhdistettiin pooliksi (1 050 ml). Poolia laimennet-30 tiin 1:1 lisäämällä 10 mM Tris, pH 6,7 -puskuria etanoli-pitoisuuden laskemiseksi. Laimennettu pooli panostettiin sitten Q-Sepharose Fast Flow -anioninvaihtokolonniin (3,2 x 3 cm, Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow -hartsi), jota oli tasapainoitettu 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 -puskurilla. Vir-35 tausnopeus oli 463 ml/tunti. Näytepanostuksen jälkeen ko 116 108140 lonnia pestiin 135 ml:11a kolonnipuskuria ja sitoutunut materiaali eluoitiin pesemällä liuoksella 10 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, pH 6,7. Virtaussuunta kolonnissa vaihdettiin vastakkaiseksi eluoidun materiaalin tilavuuden minimoimi-5 seksi, ja eluoinnin aikana kerättiin 7,8 ml:n fraktioita.

5. Sephacryl S-200 HR -geelisuodatuskromatografia Fraktiot, jotka sisälsivät eluoitua proteiinia Q-Sepharose Fast Flow -anioninvaihtokolonnin suolapesusta, yhdistettiin pooliksi (31 ml). 30 ml panostettiin Seph-10 acryl S-200 HR (Pharmacia) -geelisuodatuskolonniin (5 x 55,5 cm), jota oli tasapainoitettu fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Kerättiin 6,8 ml:n fraktioita virtausno- ) peuden ollessa 68 ml/tunti. Fraktiot, jotka vastasivat absorbanssipiikkiä 280 nm:ssä, yhdistettiin pooliksi ja ne 15 edustavat lopullista puhdistettua materiaalia.

Taulukossa 15 on esitetty yhteenveto puhdistuksesta.

' · ) > 117 108140

Taulukko 15

Yhteenveto nisäkäs ilmennetyn rotta-SCF1-162:n puhdistuksesta 5 Vaihe Tilavuus Kokonais- (ml) proteiini (mg)* Käsitelty kasvualusta (konsentroitu) 7 000 28 420 10 Q-Sepharose Fast Flow 11 200 974 C4-hartsi 1 050 19 ( Q-Sepharose Fast Flow 31 20

Sephacryl S-200 HR 82 19** 15 * Määritetty Bradfordin menetelmällä (supra, 1976).

** Määritetty 47,3 mg:ksi kvantitatiivisella amino-happoanalyysilla käyttäen esimerkissä 2 hahmoteltuun nähden samankaltaista metodologiaa.

20 Puhdistetun rotta-SCF1"162:n N-pään aminohapposek venssi on suunnilleen puolet Gln-Glu-Ile... ja puolet Py-roGlu-Glu-Ile... määritettynä esimerkissä 2 esitetyillä menetelmillä. Tämä tulos osoittaa, että rotta-SCF1-162 on tuote proteolyyttisestä prosessoinnista/pilkkomisesta . 25 tähteiden välistä, jotka on osoitettu numeroilla (-1) (Thr) ja (+1) (Gin) kuviossa 14C. Vastaavasti puhdistetun ihmis-SCF1'162^ transfektoiduilla CHO-soluilla käsitellystä kasvualustasta (alla) N-pään aminohapposekvenssi on Glu-Gly-Ile, mikä osoittaa, että se on tuote prosessoinnis-30 ta/pilkkomisesta tähteiden välistä, jotka on osoitettu numeroilla (-1) (Thr) ja (+1) (Glu) kuviossa 15C.

Käyttämällä edellä kuvattua menettelyjärjestelyä saadaan puhdistettua ihmis-SCF-proteiinia, joko yhdistel-mä-DNA-muotoja ilmennettyinä CHO-soluissa tai luontaisista 35 lähteistä saatuja.

118

' o 8 1 4 Q

Muita puhdistusmenetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia nisäkässoluperäisten yhdistelmä-DNA-SCF:ien puhdistamiseksi, ovat esimerkeissä 1 ja 10 hahmotellut, sekä muut alan ammattilaisille ilmeiset menetelmät.

5 Muitakin ihmis-SCF-muotoja, jotka vastaavat koko naisuudessaan tai osittain avointa lukualuetta, jonka koodittavat kuviossa 42 esitetyt aminohapot 1 - 248, tai jotka vastaavat avointa lukualuetta, jonka koodittavat vaihtovuoroisesti silmukoidut mRNA:t, joita voi esiintyä 10 (kuten se, jota edustaa cDNA-sekvenssi kuviossa 44), voidaan samoin ilmentää nisäkässoluissa ja ottaa talteen puhdistetussa muodossa samankaltaisilla menettelyillä kuin ) tässä esimerkissä kuvatut, sekä muilla, alan ammattilaisille ilmeisillä menettelyillä.

15 C. SDS-PA6E ja glykosidaasikäsittelyt

Pooliksi yhdistettyjen fraktioiden SDS-PAGE Seph-acryl S-200 HR -geelisuodatuskolonnista on esitetty kuviossa 39; 2,5 μΐ poolista panostettiin (vyöhyke 1). Vyöhyke värjättiin hopealla. Molekyylipainomerkit (vyöhyke 6) 20 olivat kuten kuvattiin kuvion 6 yhteydessä. Edeltävä, erilainen migroituva materiaali ja merkkiasema, joka on hieman alle Mr = 31 000, edustavat biologisesti aktiivista materiaalia; näennäinen heterogeenisyys johtuu valtaosin glykosylaation heterogeenisyydestä.

: 25 Glykosylaation karakterisoimiseksi puhdistettua ) materiaalia käsiteltiin erilaisilla glykosidaaseilla, analysoitiin SDS-PAGE:11a (pelkistävät olosuhteet) ja visualisoitiin värjäämällä hopealla. Tulokset esitetään kuviossa 39. Vyöhyke 2, neuraminidaasi. Vyöhyke 3, neurami-30 nidaasi ja O-glykanaasi. Vyöhyke 4, neuraminidaasi, 0-glykanaasi ja N-glykanaasi. Vyöhyke 5, neuraminidaasi ja N-glykanaasi. Vyöhyke 7, N-glykanaasi. Vyöhyke 8, N-glykanaasi ilman substraattia. Vyöhyke 9, O-glykanaasi ilman substraattia. Olosuhteet olivat 10 mM 3-[(3-kolamidopro-35 pyyli)dimetyyliammonio]-1-propaanisulfonaatti (CHAPS), 108140 119 66,6 mM 2-merkaptoetanoli, 0,04 % (w/v) natriumatsidi, fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 30 minuuttia ja 37 °C, minkä jälkeen inkuboitiin kuvatuista pitoisuuksista puolikkaissa glykosidaasien läsnä ollessa 18 tunnin ajan 5 37 °C:ssa. Neuraminidaasia (Arthrobacter ureafaciens; toi mittaja Calbiochem) käytettiin määrä loppupitoisuus 0,5 yksikköä/ml. O-glykanaasia (Genzyme; endo-alfa-N-asetyyli-galaktosaminidaasi) käytettiin määrä 7,5 milliyksikköä/ml. N-glykanaasia (Genzyme; peptidi: N-glykosidaasi-F; pepti-10 di-N4 [N-asetyyli-8-glukosaminyyli] asparagiiniamidaasi) käytettiin määrä 10 yksikköä/ml.

( Silloin kun se oli tarkoituksenmukaista, suoritet tiin erilaisia verrokki-inkubointeja. Näitä olivat: inku-bointi ilman glykosidaaseja sen varmistamiseksi, että tu-15 lokset johtuivat lisätyistä glykosidaasivalmisteista; in-kubointi glykosyloiduilla proteiineilla (esim. glykosy-loidulla yhdistelmä-DNA-ihmiserytropoietiinilla), joiden tiedetään olevan glykosidaasien substraatteja, sen varmistamiseksi, että käytetyt glykosidaasientsyymit olivat 20 aktiivisia; ja inkubointi glykosidaaseilla mutta ilman substraattia, jotta voitaisiin päätellä, milloin glykosi-daasivalmisteet myötävaikuttivat visualisoituihin geeli-nauhoihin tai häiritsivät niitä (kuvio 39, vyöhykkeet 8 ja 9).

( .25 Edellä kuvatuista kokeista voidaan vetää lukuisia johtopäätöksiä. Eri käsittelyt N-glykanaasilla [joka poistaa sekä kompleksisen että runsaasti mannoosia sisältävän N-kytketyn hiilihydraatin (Tarentino et ai., Biochemistry 24 (1988) 4665 - 4671)], neuraminidaasilla (joka 30 poistaa sialiinihappotähteitä) ja O-glykanaasilla [joka . poistaa tiettyjä 0-kytkettyjä hiilihydraatteja (Lambin et *' ai., Biochem.Soc.Trans. 12 (1984) 599 - 600] viittaavat siihen, että: läsnä on sekä N-kytkettyjä että O-kytkettyjä hiilihydraatteja; ja sialiinihappoa on läsnä, jolloin ai-35 nakin osa siitä on osana O-kytkettyjä ryhmiä. Se, että 108140 120 käsittely N-glykanaasilla voi muuttaa SDS-PAGE:ssa ilmeisesti heterogeenisen materiaalin nopeammin migroituvaksi muodoksi, joka on paljon homogeenisempaa, osoittaa, että materiaali kokonaisuudessaan on samaa polypeptidiä, jol-5 loin heterogeenisyyden aiheuttaa pääasiassa heterogeenisyys glykosylaatiossa.

Esimerkki 12

Yhdistelmä-DNA-SCF^^-PEGrn valmistus

Rotta-SCF1'164:ää, joka oli puhdistettu yhdistelmä-10 DNA-E. coli -ilmennyssysteemistä esimerkkien 6A ja 10 mukaan, käytettiin lähtömateriaalina polyetyleeniglykolimo-difikaatiossa, jota kuvataan alla. )

Liuos, jossa oli metoksipolyetyleeniglykoli-suk-kinimidyylisukkinaattia (18,1 mg = 3,63 pmol; SS-MPEG = 15 Sigma Chemical Co. nro M3152, likimääräinen molekyylipaino = 5 000) 0,327 ml:ssa deionisoitua vettä, lisättiin liuokseen, jossa oli 13,3 mg (0,727 pmol) yhdistelmä-DNA-rotta-SCF1'164:ää 1,0 ml:ssa liuosta 138 mM natriumfosfaatti, 62 mM NaCl, 0,62 mM natriumasetaatti, pH 8,0. Saatua liuosta 20 ravistettiin kevyesti (100 kierr./min) huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Sitten 1,0 ml:n erä lopullista reaktio-seosta (10 mg proteiinia) panostettiin Pharmacia Superdex 75 -geelisuodatuskolonniin (1,6 x 50 cm) ja eluoitiin 100 mM natriumfosfaattiliuoksella, pH 6,9, nopeudella 0,25 ^ 25 ml/min huoneenlämpötilassa. Ensimmäiset 10 ml kolonni-effluenttia heitettiin pois, minkä jälkeen kerättiin 1,0 ml:n fraktioita. Kolonnieffluentin UV-absorbanssia (280 nm) tarkkailtiin jatkuvasti ja se esitetään kuviossa 40A.

Fraktiot nro 25 - 27 yhdistettiin ja steriloitiin ultra-30 suodattamalla 0,2 μ:η polysulfonimembraanin läpi (Gelman Sciences nro 4454) ja saatu pooli nimettiin PEG-25:ksi.

‘ Samoin fraktiot nro 28 - 32 yhdistettiin, steriloitiin ultrasuodattamalla ja nimettiin PEG-32:ksi. Poolifraktio PEG-25 sisälsi 3,06 mg proteiinia ja poolifraktio PEG-32 35 sisälsi 3,55 mg proteiinia, mikä laskettiin A280-mittauk-

121 10814Q

slsta käyttäen kalibroinnissa absorbanssia 0,66 liuokselle, jossa oli 1,0 mg/ml ei-modifioitua rotta-SCF1-164 :ää. Reagoimatta jäänyt rotta-SCF1'164, joka edustaa 11,8 % ko-konaisproteiinista reaktioseoksessa, eluoitiin fraktioissa 5 nro 34 - 37. Samanlaisissa kromatografiaolosuhteissa ei-modifioitu rotta-SCF1-164 eluoitui valtapiikkinä, ja sen retentiotilavuus oli 45,6 ml, kuvio 40B. Fraktiot nro 77 -80 kuviossa 40A sisälsivät N-hydroksisukkinimidiä, joka on sivutuote rotta-SCF1-164:n reaktiosta SS-MPEG:n kanssa. 10 Mahdollisesti reaktiivisia aminoryhmiä rotta- SCF1"164 :ssä ovat 12 lysiinitähdettä sekä alfa-aminoryhmä N- pään glutamiinitähteessä. Poolifraktio PEG-25 sisälsi 9,3 mol reaktiivisia aminoryhmiä proteiinimoolia kohden, mikä määritettiin spektroskopisesti titraamalla trinitrobent-15 seenisulfonihapolla (TNBS) käyttäen menetelmää,' jota kuvaa Habeeb, Anal.Biochem. 14 (1966) 328 - 336. Samoin poolifraktio PEG-32 sisälsi 10,4 mol ja ei-modifioitu rotta-SCF1-164 sisälsi vastaavasti 13,7 mol reaktiivisia aminoryhmiä proteiinimoolia kohden. Täten keskimäärin 3,3 20 (13,7 - 10,4) aminoryhmää rotta-SCF1-164:ssä poolifraktiossa PEG-32 tuli modifioiduksi reaktiossa SS-MPEG:n kanssa. Vastaavasti keskimäärin 4,4 aminoryhmää rotta-SCF1-164:ssä poolifraktiossa PEG-25 tuli modifioiduksi. Ihmis-SCF:ää ^ (hSCF1"164), joka tuotettiin kuten esimerkissä 10, modifioi- : 25 tiin niinikään käyttäen edellä kuvattuja menettelyjä.

Spesifisesti 714 mg (38,5 pmol) hSCF1-164:ää annettiin reagoida 962,5 mg:n (192,5 pmol) SS-MPEG:tä kanssa 75 ml:ssa 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0, 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos panostettiin Sephacryl S-30 200HR -kolonniin (5 x 134 cm) ja eluoitiin PBS:llä (Gibcon > ·

Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos, joka ei sisällä CaCl2:ta eikä MgCl2:ta) nopeudella 102 ml/tunti ja kerättiin 14,3 ml:n fraktioita. Fraktiot nro 39 - 53, jotka ovat analogiset edellä kuvattuun PEG-25-pooliin sekä ku-35 vioon 40A nähden, yhdistettiin pooliksi, jonka todettiin 108140 122 sisältävän kaikkiaan 354 mg proteiinia. Tämän modifioidun SCF:n in vivo -aktiivisuus kädellisissä esitetään esimerkissä 8C.

Esimerkki 13 5 SCF-reseptori-ilmennys leukemiaemosolujen pinnalla

Leukemiaemosoluja otettiin talteen potilaan ää-reisverestä, joka poti sekasolulinjaleukemiaa. Solut puhdistettiin tiheysgradienttisentrifugoinnilla ja tart-tumisdepleetiolla. Ihmis-SCF1'164 jodattiin esimerkissä 7 10 esitetyn menettelyjärjestelyn mukaan. Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksilla jodattua SCFrää kuten on kuvattu [Broudy, Blood 75 (1990) 1622 - 1626]. Tulokset resepto- ) risitoutumiskokeesta on esitetty kuviossa 41. Arvioitu reseptoritiheys on noin 70 000 reseptoria/solu.

15 Esimerkki 14

Rotta-SCF-aktiivisuus varhaisten imukudosprekurso-rien suhteen

Yhdistelmä-DNA-rotta-SCF1'164:n (rrSCF1'164) kykyä vaikuttaa synergistisesti IL-7:n kanssa imukudossolujen li-20 sääntymisen tehostuksessa tutkittiin hiiren luuytimen agar-agar-viljelmissä. Tässä määrityksessä pelkästään rrSCF1'164:llä muodostuneet pesäkkeet sisälsivät monosyyt-tejä, neutrofiilejä ja emosoluja, kun taas IL-7:llä pelkästään tai sillä yhdistettynä rrSCF1'164: ään stimuloidut , 25 pesäkkeet sisälsivät pääasiassa esi-B-soluja. Esi-B-solut, ) jotka karakterisoidaan B220+, slg", cp+, identifioitiin pooliksi yhdistettyjen solujen FACS-analyysilla käyttäen fluoresoivasti leimattuja B220-antigeenivastaisia [Coffman, Immunol.Rev. 69 (1982) 5] sekä pinta-Ig-vastaisia 30 (FITC-vuohi-anti-K, Southern Biotechnology Assoc., Bir mingham, AL) vasta-aineita; sekä analysoimalla objekti-laseille sentrifugoiduista soluista solulima-p-ilmennys käyttäen fluoresoivasti leimattuja vasta-aineita (TRITC-vuohi-anti-μ, Southern Biotechnology Assoc.). Yhdistelmä-35 DNA-ihmis-IL-7 (rhlL-7) saatiin valmistajalta Biosource 123 1 081 40

International (Westlake Village, CA). Lisättäessä rrSCF1"164: ää yhdistettynä esi-B-solukasvutekijään IL-7 havaittiin synergistinen lisäys pesäkemuodostuksessa (taulukko 16), mikä osoitti rrSCF1'164: n stimuloivan roolin var-5 haisiin B-solukantaisäsoluihin.

Taulukko 16

Esi-B-solupesäkemuodostuksen stimulointi rrSCF1-164: llä yhdistettynä hIL-7:ään 10

Kasvutekijät Pesäkeluku1 (

Suolaliuos 0 rrSCF1'164 200 ng 13 ± 2 15 100 ng 7 ± 4 50 ng 4 ± 2 rhIL-7 200 ng 21 ± 6 100 ng 18 ± 6 50 ng 13 ± 6 20 25 ng 4 ± 2 rhIL-7 200 ng + rrSCF1-164 200 ng 60 ± 0 100 ng + 200 ng 48 ± 8 50 ng + 200 ng 24 ± 10 25 ng + 200 ng 21 ± 2 ' * 25 1 Pesäkeluku kohden 5 x 104 maljoitettua hiiren luuydinsolua.

Kukin arvo on keskiarvo kolminkertaisista määri-tysastioista ± SD.

30 ' Esimerkki 15

Reseptorin SCF:lle identifiointi A. c-kit on SCF1_164-reseptori

Sen testaamiseksi, onko SCF1'164 ligandi c-kitille, 35 hiiri-c-kitin cDNA:ta kokonaisuudessaan [Qiu et ai., EMBO

108140 124 J. 7 (1988) 1003 - 1011] vahvistettiin käyttäen PCR:ää SCF1_164-responsiivisesta syöttösolulinjasta MC/9 [Nabel et ai., Nature 291 (1981) 332 - 334] käyttäen julkistetusta sekvenssistä suunniteltuja alukkeita. Ihmis-c-kitin li-5 gandisitoutumis- ja transmembraanialueet, jotka kooditta-vat aminohapot 1 - 549 [Yarden et ai., EMBO J. 6 (1987) 3341 - 3351], kloonattiin samankaltaisia tekniikoita käyttäen ihmisen erytroleukemiasolulinjasta HEL [Martin ja Papayannopoulou, Science 216 (1982) 1233 - 1235]. c-kit-10 cDNA:t insertoitiin nisäkäsilmennysvektoriin V19.8, joka transfektoitiin COS-l-soluihin, ja membraanifraktiot valmisteltiin sitoutumismäärityksiin käyttäen joko rotta- tai ) ihmis-125I-SCF1-164:ää alla osissa B ja C kuvattujen menetelmien mukaan. Taulukossa 17 on esitetty tulostiedot tyypil-15 liselle sitoutumismääritykselle. Ei ilmennyt mitään todettavaa 125I-ihmis-SCFl"164:n spesifistä sitoutumista pelkästään V19.8:lla transfektoituihin COS-l-soluihin. Kuitenkin COS-1-solut, jotka ilmensivät ihmis-yhdistelmä-DNA-c-kit- ligandisitoutumis- sekä -transmembraanialueita (hckit-LTl) 20 sitoivat 125I-hSCF1-164:ää (taulukko 17). 200-kertaisen mooli-ylimäärän ei-leimattua ihmis-SCF1_164:ää lisääminen vähensi sitoutumisen taustatasoihin. Vastaavasti COS-l-solut, jotka oli transfektoitu täysimittaisella hiiri-c-kitillä (mckit-Ll), sitoivat rotta-125I-SCF1_164:ää. Pieni määrä rot-. 25 ta-125I-SCF1_164-sitoutumista todettiin COS-l-soluilla, jotka oli transfektoitu vain Vl9.8:lla, ja sitä on havaittu myös ei-transfektoiduilla soluilla (ei esitetty), mikä osoittaa, että COS-l-solut ilmentävät endogeenisen c-kitin.

Tämä havainto on sopusoinnussa c-kit-ilmennyksen laajan 30 solu jakauman kanssa. Rotta-125I-SCF1-164 sitoutuu vastaavasti sekä ihmis- että hiiri-c-kitiin, kun taas ihmis-125I-SCF1-164 sitoutuu alhaisemmalla aktiivisuudella hiiri-c-kitiin (taulukko 17). Nämä tulostiedot ovat sopusoinnussa lajien välisen SCF1'164-ristireaktiivisuuskuvion kanssa. Rotta-SCF1' 35 164 indusoi ihmisen luuytimen lisääntymistä samanlaisella 108140 125 spesifisellä aktiivisuudella kuin ihmis-SCF1'164, kun taas ihmis-SCF1_164:n indusoima hiiren syöttösolujen lisääntyminen tapahtuu 800-kertaa alhaisemmalla spesifisellä aktiivisuudella kuin rottaproteiinilla.

5 Yhteenvetona nämä havainnot vahvistavat, että fe- notyyppiepänormaaliudet, joita ilmentävät W- tai Sl-mu-tanttihiiret, ovat seurauksia primaaripuutoksista c-kit-reseptori/ligandivuorovaikutuksissa, jotka ovat kriittisiä erilaisten solutyyppien kehitykselle.

10

Taulukko 17 ( SCF164-sitoutuminen yhdistelmä-DNA-c-kitiin ilmen nettynä COS-l-soluissa 15 CPU sitoutunut®

Tranefektoi tu Xhsis-SCF1-164 Rotta-SCF1-164 plasnidi 125I-SCFb 125I-SCF+kyluJ4c 125I-SCFd 125I-SCF*kyle»e V19.8 2 160 2 150 1 100 550 20 Vl9.8:hckit-LT1 59 350 2 380 70 000 1 100 V19.8:mckit-Ll 9 500 1 100 52 700 600 “ Esitetään kaksinkertaisten mittausten keskiarvo; koe on suoritettu riippumattomalla tavalla saaden samat tulokset 3 kertaan.

25 b 1,6 nM ihmis-125I-SCF1_164:ää.

( c 1,6 nM ihmis-125I-SCF1’164: ää + 320 nM ei-leimattua ihmis-SCF1"164: ää.

d 1,6 nM rotta-1Z5I-SCF1_164;ää.

* 1,6 nM rotta-125I-SCF1_164:ää + 320 nM ei-leimattua 30 rotta-SCF1"164; ää.

B. Yhdistelmä-DNA-c-kit-ilmennys COS-l-soluissa

Ihmis- ja hiiri-c-kit-cDNA-klooneja saatiin käyttäen PCR-tekniikoita [Saiki et ai., Science 239 (1988) 487 35 - 491] kokonais-RNA:sta, joka oli eristetty hapan feno- li/kloroformiuuttomenettelyillä [Chomczynsky ja Sacchi, Anal.Biochem. 162 (1987) 156 - 159] ihmisen erytroleuke- 108140 126 miasolulinjasta HEL ja vastaavasti MC/9-soluista. Oligo-nukleotideja, joiden sekvenssit olivat yksilölliset, suunniteltiin julkistetuista ihmis- ja hiiri-c-kit-sek-vensseistä. 1. säikeen cDNA syntetisoitiin kokonais-5 RNA:sta menettelyjärjestelyn mukaan, joka toimitettiin entsyymin, Mo-MLV-käänteiskopioijaentsyymi (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), mukana käyttäen c-kit-ei-tieto-oligonukleotideja alukkeina. c-kit-ligandisitou-tumis- ja tyrosiinikinaasialueiden limittyvien alueiden 10 vahvistaminen suoritettiin käyttäen tarkoituksenmukaisia c-kit-alukepareja. Nämä alueet kloonattiin nisä-käsilmennysvektoriin V19.8 (kuvio 17) ilmennystä COS-1- ) soluissa silmällä pitäen. Useiden kloonien DNA-sekven-tointi paljasti itsenäisiä mutaatioita, jotka oletetta-15 vasti syntyivät PCR-vahvistuksessa, jokaisessa kloonissa.

Rakennettiin näistä mutaatioista vapaa klooni kokoamalla uudestaan mutaatioita vailla olevat restriktiofragmentit erillisistä klooneista. Joitakin eroja julkistettuun sekvenssiin nähden ilmeni kaikissa tai noin puolessa kloo-20 neista; nämä pääteltiin todellisiksi, käytetyissä solu- linjoissa esiintyviksi sekvensseiksi, ja ne voivat edustaa alleellisia eroja julkistettuihin sekvensseihin nähden. Seuraavat plasmidit rakennettiin V19.8.aan: V19.8:mckit-LTl, täydellinen hiiri-c-kit; ja V19.8:hckit-Ll, joka si-. 25 sältää ligandisitoutumis- sekä transmembraanialueen (ami nohapot 1 - 549) ihmis-c-kitistä.

Plasmidit transfektoitiin COS-l-soluihin oleellisesti kuten kuvattiin esimerkissä 4.

C. 125I-SCF1-164-sitoutuminen COS-l-soluihin, jotka 30 ilmentävät yhdistelmä-DNA-c-kitin

Kahden päivän kuluttua transfektoinnista COS-l-so-lut raaputettiin maljasta, pestiin PBS:llä ja jäädytettiin käyttöön asti. Sulatuksen jälkeen solut lietettiin uudelleen liuokseen 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, joka sisälsi 35 pitoisuudet 1 mM PMSF, 100 pg/ml aprotiinia, 25 pg/ml leu- 108140 127 peptiinia, 2 pg/ml pepstatiinia ja 200 pg/ml TLCK-HCl:ää. Liete dispergoitiin pipetoimalla edestakaisin 5 kertaan ja sitä inkuboitiin jäissä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen solut homogenisoitiin 15 - 20 iskulla Dounce-homogenisaat-5 torissa. Homogenaattiin lisättiin sakkaroosia (250 mM) ja tumafraktio sekä jäljelle jääneet ei-hajonneet solut pel-letoitiin sentrifugoimalla 500 x g:ssä 5 minuutin ajan. Supernatanttia sentrifugoitiin 25 000 x g:ssä 30 minuutin ajan 4 °C jäljellä olevan solujätteen pelletoimiseksi. Ih-10 mis- ja rotta-SCF1"164: ää radiojodattiin käyttäen kloramii-ni-T:tä [Hunter ja Greenwood, Nature 194 (1962) 495 -( 496]. COS-1-membraanifraktioita inkuboitiin joko ihmis- tai rotta-125I-SCF1-164: llä (1,6 nM) käyttäen 200-kertaista mooliylimäärää ei-leimattua SCF1_154:ää sitoutumispuskuris-15 sa, joka koostui RPMI:stä, jota oli täydennetty 1 %:lla nautaseerumialbumiinia ja pitoisuudella 50 mM HEPES (pH 7,4), tai mainittua lisäystä käyttämättä, 1 tunnin ajan 22 °C:ssa. Sitoutumisinkuboinnin päätteeksi membraanival-misteet sijoitettiin varovaisesti kerroksiksi 150 μ1:η 20 erille ftalaattiöljyä ja sentrifugoitiin 20 minuutin ajan Beckman Microfuge 11 -laitteessa membraaniin sitoutuneen 125I-SCF1_164:n erottamiseksi vapaasta 125I-SCF1_164:stä. Pelletit leikattiin irti ja membraaniin liittynyt 125I-SCF1-164 kvantitoitiin.

( . 25 Esimerkki 16

Ihmis-SCF-cDNA:n eristäminen A. HT-1080-cDNA-kirjaston rakentaminen

Kokonais-RNA eristettiin ihmisen fibrosarkoomaso-lulinjasta HT-1080 (ATCC CCL 121) käyttäen happo-guanidi-30 niumtiosyanaatti-fenoli-kloroformiuuttomenetelmää [Chomc- zynski et ai., Anal.Biochem. 162 (1987) 156], ja poly(A)-RNA otettiin talteen käyttäen oligo(dT)-kehrääjäkolonnia, joka hankittiin valmistajalta Clontech. Kaksisäikeinen cD-NA valmistettiin 2 pg:sta poly(A)-RNA:ta käyttäen BRL-35 (Bethesda Research Laboratory -laboratorion) cDNA-syntee- 128 1Q814° sipakkausta toimittajan suosittelemissa olosuhteissa. Noin 100 ng kolonnifraktioitua kaksisäikeistä cDNA:ta, jonka keskimääräinen koko oli 2 ke:tä, ligatoitiin 300 ngraan Sall/Notl-pilkottua vektoria pSPORT 1 [D'Alessio et ai., 5 Focus 12 (1990) 47 - 50] ja transformoitiin DH5-alfa-so-luihin (BRL, Bethesda, MD) elektroporaatiolla [Dower et ai., Nucl.Acids Res. 16 (1988) 6127 - 6145].

B. cDNA-kirjaston seulominen

Noin 2,2 x 105 primaaritransformanttia jaettiin 44 10 pooliksi, joista kukin sisälsi n. 5 000 yksittäistä kloonia. Plasmidi-DNA valmistettiin kustakin poolista käyttäen CTAB-DNA-saostusmenetelmää kuten on kuvattu [Del Sai et ) ai., Biotechniques 7 (1989) 514 - 519]. Kaksi mikrogrammaa kutakin plasmidi-DNA-poolia pilkottiin restrik-15 tioentsyymillä NotI ja erotettiin geelielektroforeesilla. Linearisoitu DNA siirrettiin GeneScreen Plus -membraanille (DuPont) ja hybridisoitiin 32P-leimattuun, PCR:llä muodostettuun ihmis-SCF-cDNA:han (esimerkki 3) aiemmin kuvatuissa olosuhteissa [Lin et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 20 (1985) 7580 - 7584]. Kolme positiivisen signaalin sisältä vää poolia identifioitiin hybridisaatiosta. Näitä pesäke-pooleja seulottiin toistamiseen pesäkehybridisaatiomenet-telyllä [Lin et ai., Gene 44 (1986) 201 - 209], kunnes kustakin poolista saatiin yksi yksittäinen pesäke. Näiden \ : 25 kolmen eristetyn kloonin cDNA-koot ovat 5,0 - 5,4 ke:tä. )

Restriktioentsyymipilkkomiset ja nukleotidisek-venssimääritys 5'-päässä osoittavat kaksi kolmesta kloonista identtisiksi (10-la ja 21-7a). Ne molemmat sisältävät koodialueen ja noin 200 ep:tä 5'-ei-luettua aluetta 30 (5'UTR). Kolmas klooni (26-la) on noin 400 ep:tä lyhyempi 5'-päästä kuin muut kaksi kloonia. Tämän ihmis-SCF-cDNA:n sekvenssi on esitetty kuviossa 42. Erityisen huomionarvoinen on hydrofobinen transmembraanialuesekvenssi, joka alkaa aminohappojen 186 - 190 alueelta ja päättyy amino-35 happoon 212.

129 108140 C. pDSR-alfa-2-hSCF1_248:n rakentaminen pDSR-alfa-2-hSCF1-248 muodostettiin käyttäen plasmi-deja 10-la (kuten kuvattiin esimerkissä 16B) ja pGEM3-hSCF1"164 seuraavasti: Hindi II-insertti pGEMS-hSCF1'164: stä 5 siirrettiin Ml3mpl8:aan. Nukleotidit, jotka ovat välittömästi ylävirtaan ATG-aloituskodonista, vaihdettiin paik-kaohjatulla mutatoinnilla tttccttATG:stä gccgccgccATG:ksi käyttäen ei-tieto-oligonukleotidia 10 5 *-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3' ( ja käyttäen oligonukleotidiohjattua in vitro -mu- tatointisysteemipakkausta ja menettelyjärjestelyjä valmistajalta Amersham Corp. M13mpl8-hSCFK1_164:n saamiseksi. Tämä 15 DNA pilkottiin HindIII:lla ja insertoitiin pDSR-alfa-2:een, jota oli pilkottu HindIII:lla. Tämä klooni nimetään pDSR-alf a-2-hSCFKl‘164: ksi. DNA pDSR-alfa-2-hSCFK1'164: sta pilkottiin Xbal:llä ja DNA:n päistä tehtiin tasaiset lisäämällä Klenow-entsyymiä ja neljää dNTP:tä. Tämän reaktion 20 päätyttyä DNA:ta pilkottiin edelleen entsyymillä Spel. Klooni 10-la pilkottiin Dral:llä tasaisen pään muodostamiseksi 3' avoimeen lukualueeseen insertissä, sekä Spel:llä, joka pilkkoo geeniä samasta kohdasta sekä pDSR-alfa-2-hSCFK1'164:ssä että 10-la:ssa. Nämä DNA:t ligatoitiin C 25 toisiinsa pDSR-alfa-2-hSCFKl'248:n saamiseksi.

D. COS-solujen transfektointi ja immuuni seostaminen pDSR-al£a-2-hSCF*1-24e-DNA: 11a C0S-7-soluja (ATCC CRL 1651) transfektoitiin edellä kuvatun mukaisesti rakennetulla DNA:11a. 4 x 106 solua 0,8 30 ml:ssa kasvualustaa DMEM + 5 % FBS käsiteltiin elektropo-\ raatiolla käyttäen 1 600 voltin jännitettä ja joko 10 pg pDSR-alfa-2-hSCFK1'248-DNA: ta tai 10 pg pDSR-alfa-2-vektori-DNA:ta (vektoriverrokki). Elektroporaation jälkeen solut maljoitettiin uudelleen kahteen maljaan, joiden halkaisija 108140 130 oli 60 mm. 24 tunnin kuluttua kasvualusta korvattiin tuoreella täydellisellä kasvualustalla.

72 tunnin kuluttua transfektoinnista kumpikin malja leimattiin 35S-kasvualustalla käyttäen modifikaatiota 5 Yardenin et ai. menettelyjärjestelystä [PNAS 87 (1990) 2569 - 2573]. Solut pestiin kerran PBS:llä, minkä jälkeen niitä inkuboitiin DMEM-kasvualustalla, joka ei sisältänyt metioniinia eikä kysteiiniä (met'cys’DMEM), 30 minuutin ajan. Kasvualusta poistettiin ja kuhunkin maljaan lisät-10 tiin 1 ml met'cys’DMEM i iä, joka sisälsi 100 pCi/ml Tran35S-leimaa (ICN). Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 8 tunnin ajan. Kasvualusta otettiin talteen, kirkastettiin sentrifugoi- ) maila solujätteen poistamiseksi ja jäädytettiin 20 °C:ssa.

15 Näytteitä leimatusta käsitellystä COS/pDSR-alfa-2- hSCFK1'248- ja C0S/pDSR-alfa-2-vektoriverrokkikasvualustasta immuunisaostettiin yhdessä kasvualustanäytteiden kanssa 35S-leimatuista CH0/pDSR-alfa-2-hSCF1'164-klooni 17 -soluista (katso esimerkki 5) käyttäen modifikaatiota Yardenin et 20 ai. menettelyjärjestelystä (EMBO J. 6 (1987) 3341 - 3351).

Yhtä millilitraa kustakin näyteestä, joka oli otettu käsitellystä kasvualustasta, käsiteltiin 10 piillä esi--immuunikaniiniseerumia (nro 1379 P.I.). Näytteitä inkuboitiin 5 tunnin ajan 4 °C:ssa. 100 pl 10-%lista Staphylo- \

; 25 coccus aureus -lietettä (Pansorbin, Calbiochem) liuoksessa J

< 0,15 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,2 % Triton X-100 -valmistetta lisättiin kuhunkin putkeen. Näytteitä inkuboitiin vielä tunnin ajan 4 °C:ssa. Immuunikompleksit pelletoitiin sentrifugoimalla 13 000 x g:ssä 5 minuutin ajan. Superna-30 tantit siirrettiin uusiin putkiin ja inkuboitiin 5 piillä « kaniinin polyklonaalista vastaseerumia (nro 1381 TB4), minkä jälkeen niitä puhdistettiin kuten esimerkissä 11, vastaan CHO-peräistä hSCF1_162ita yön yli 4 “Cissa. 100 pl Pansorbin-valmistetta lisättiin 1 tunniksi, minkä jälkeen 35 immuunikompleksit pelletoitiin kuten aiemmin. Pelletit 131 08 7 40 pestiin lx lyysipuskurilla (0,5 % Na-deoksikolaatti, 0,5 % NP-40:ää, 50 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 8), 3x pesupuskurilla (0,5 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,2 % Triton X-100 -valmistetta) ja lx 20 mM Tris, pH 7,5 -liuoksella. Pelletit 5 uudelleenlietettiin 50 pl:aan liuosta 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1 % SDS:äS, 0,1 M β-merkaptoetanoli. SCF-proteiini eluoitiin keittämällä 5 minuutin ajan. Näytteitä sentrifu-goitiin 13 000 x g:ssä 5 minuutin ajan ja supernatantit otettiin talteen.

10 Käsittely glykosidaaseilla suoritettiin seuraavas ti: 3 μΐ 75 mM CHAPS-liuosta, joka sisälsi 1,6 milliyk-( sikköä O-glykanaasia, 0,5 yksikköä N-glykanaasia ja 0,02 yksikköä neuraminidaasia, lisättiin 25 μΐ:aan immuuni-kompleksinäytteitä ja inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 eC:ssa.

15 Sama tilavuus 2xPAGE-näytepuskuria lisättiin ja näytteitä keitettiin 3 minuutin ajan. Pilkotuilla ja ei-pilkotuilla näytteillä suoritettiin elektroforeesi 15-%:isessa pelkistävässä SDS-polyakryyliamidigeelissä yön yli käyttäen 8 mA:n virtaa. Geeli kiinnitettiin metanoli-etikkahapolla, 20 sitä käsiteltiin Enlightening-tehosteella (NEN) 30 minuutin ajan, se kuivattiin ja valotettiin Kodak XAR-5 -filmille -70 °C:ssa.

Kuviossa 43 esitetään autoradiokuva tuloksista.

/ Vyöhykkeet 1 ja 2 ovat näytteitä verrokki-C0S/pDSR-alfa-2- 25 viljelmistä, vyöhykkeet 3 ja 4 C0S/pSR-alfa-2-hSCFK1‘248-vil-jelmistä, vyöhykkeet 5 ja 6 CHO/pDSR-alfa-2-hSCF1"164-viljelmistä. Vyöhykkeet 1, 3 ja 5 ovat ei-pilkottuja im-muunisakkoja; vyöhykkeitä 2, 4 ja 6 on pilkottu glykanaa-seilla edellä kuvattuun tapaan. Molekyylipainomerkkien 30 asemat on esitetty vasemmalla. SCF:n prosessointi pDSR-al-fa-2-hSCFK1_248:lla transfektoidussa C0S:issa muistuttaa hSCF1_164:n prosessointia, joka eritetään pDSR-alfa-2-hSCF1'164:llä transfektoidussa CH0:ssa (esimerkki 11). Tämä viittaa voimakkaasti siihen, että luontainen proteo- 132 108140 lyyttinen prosessointikeskus, jonka kautta SCF vapautuu solusta, on aminohapon 164 läheisyydessä.

Esimerkki 17 lhmis-SCF:n kvaternaarisen rakenteen analyysi 5 Kun geelisuodatuskolonni (ACA 54), jota kuvataan esimerkissä 1 SCF:n puhdistamiseksi BRL-solukasvualustas-ta, kalibroidaan molekyylipainostandardeilla ja kun puhdistettua SCF:ää eluoidaan muista kalibroiduista geeli-suodatuskolonneista, on ilmeistä, että BRL-solukasvualus-10 tästä puhdistettu SCF käyttäytyy siten, että sen näennäinen molekyylipaino on noin 70 000 - 90 000 suhteessa mo-lekyylipainostandardeihin. Sitä vastoin SDS-PAGE:ssa ) näennäinen molekyylipaino on noin 28 000 - 35 000. Vaikka otetaan huomioon, että glykosyloidut proteiinit saattavat 15 käyttäytyä epäsäännöllisesti tällaisissa analyyseissa, tulokset viittaavat siihen, että BRL-peräinen rotta-SCF saattaa esiintyä ei-kovalenttisesti liittyneenä dimeerinä ei-pelkistävissä olosuhteissa. Samankaltaiset tulokset ovat voimassa yhdistelmä-DNA-SCF-muodoille (esim. E^_ coli 20 -peräiset rotta- ja ihmis-SCF1'164, CHO-soluista saadut rotta- ja ihmis-SCF1'162) sikäli, että geelisuodatuksella ei-pelkistävissä olosuhteissa arvioitu molekyylikoko on karkeasti ottaen kaksi kertaa denaturoivissa olosuhteissa (eli SDS:n läsnä ollessa) geelisuodatuksella, tai SDS-• 25 PAGE:11a, kulloisessakin nimenomaisessa tapauksessa, ar- ) vioitu molekyylikoko. Edelleen sedimentaationopeusanalyy-silla, jolla saadaan tarkka määritys molekyylipainosta liuoksessa, saadaan lukema noin 36 000 molekyylipainoksi E. coli -peräiselle yhdistelmä-DNA-ihmis-SCF1'164:lie. Tämä 30 arvo on jälleen noin kaksi kertaa SDS-PAGE:lla saatava , arvo (n. 18 000 - 19 000). Tämän vuoksi vaikka myönnetään, että useampia oligomeerisiä tiloja saattaa esiintyä (mukaan lukien monomeerinen tila), vaikuttaa siltä, että di-meerinen tila on vallitseva joissakin olosuhteissa 35 liuoksessa.

108140 133

Esimerkki 18

Ihmis-SCF-cDNA-kloonien eristäminen 5637-solulin- jasta A. 5637-cDNA-kirjaston rakentaminen 5 Kokonais-RNA eristettiin ihmisen rakkosyöpäsolulin hasta 5637 (ATCC HTB-9) happo-guanidiniumtiosyanaatti-fe-noli-kloroformiuuttomenetelmällä [Chomczynski et ai., Anal.Biochem. 162 (1987) 156] ja poly(A)-RNA otettiin talteen käyttäen oligo(dT)-kehrääjäkolonnia, joka hankitit) tiin valmistajalta Clontech. Kaksisäikeinen cDNA valmistettiin 2 pg:sta poly(A)-RNA:ta käyttäen BRL:n cDNA-syn-( teesipakkausta valmistajan suosittelemissa olosuhteissa.

Noin 80 ng kolonnifraktioitua kaksisäikeistä cDNA:ta, jonka keskimääräinen koko oli 2 ke:tä, ligatoitiin 300 15 ng:aan Sall/Notl-pilkottua vektoria pSPORT 1 [D'Alessio et ai., Focus 12 (1990) 47 - 50] ja transformoitiin DH5-alfa-soluihin elektroporaatiota käyttäen [Dower et ai., Nucl.Acids Res. 16 (1988) 6127 - 6145].

B. cDNA-kirjaston seulominen 20 Noin 1,5 x 105 primaaritransformanttia jaettiin 30 pooliksi, joista kukin sisälsi noin 5 000 yksittäistä kloonia. Plasmidi-DNA valmistettiin kustakin poolista CTAB-DNA-saostamismenetelmällä kuten on kuvattu [Del Sai / et ai., Biotechniques 7 (1989) 514 - 519]. 2 pg kutakin

^ . 25 plasmidi-DNA-poolia pilkottiin restriktioentsyymillä NotI

ja tuote erotettiin geelielektroforeesilla. Linearisoitu DNA siirrettiin GeneScreen Plus -membraanille (DuPont) ja hybridisoitiin 32P-leimattuun täysimittaiseen ihmis-SCF-cDNA:han, joka oli eristetty HT1080-solulinjasta (esi-30 merkki 16), aiemmin kuvatuissa olosuhteissa [Lin et ai., Proc.Natl.Acad♦Sei. USA 82 (1985) 7580 - 7584]. Hybridi-saatiosta identifioitiin 7 poolia, jotka sisälsivät positiivisen signaalin. Pesäkepooleja seulottiin toistamiseen 32P-leimatulla, PCRrllä muodostetulla ihmis-SCF-cDNA:lla 35 (esimerkki 3) käyttäen pesäkehybridisaatiomenettelyä [Lin 134 10814.0 et ai., Gene 44 (1986) 210 - 209], kunnes 4 poolista saatiin yksi yksittäinen pesäke. Neljän eristetyn kloonin inserttikoot ovat noin 5,3 ke:tä. Kloonien restriktioent-syymipilkkomiset ja 5'-päiden nukleotidisekvenssianalyysi 5 osoittavat, että kyseiset 4 kloonia ovat identtiset. Tämän ihmis-cDNA:n sekvenssi on esitetty kuviossa 44. Kuvion 44 mukainen cDNA koodittaa polypeptidin, jossa aminohapot 149 - 177 kuvion 42 mukaisissa sekvensseissä on korvattu yksittäisellä Gly-tähteellä.

10 Esimerkki 19

Eloonjäännin SCF-tehostus kuolettavan säteilyannoksen jälkeen ) Ä. SCF:n aktiivisuus in vivo eloonjäämiseen kuolettavan säteilyannoksen jälkeen 15 Testattiin SCF:n vaikutusta hiirten eloonjäämiseen näiden saatua kuolettavan annoksen säteilyä. Käytetyt hiiret olivat 10 - 12 viikon ikäisiä naaraspuolisia

Balb/c-hiiriä. Kaikissa kokeissa käytettiin 5 hiiren ryhmää ja kuhunkin kokeeseen valittiin samanpainoisia hiiriä.

20 Hiirille annettiin säteilyä annos 850 rad tai 950 rad yhtenä annoksena. Hiiriin ruiskutettiin pelkästään tekijöitä tai tekijöitä yhdessä normaalien Balb/c-luuydinsolujen kanssa. Ensimmäisessä tapauksessa hiiret saivat 24 tunnin kuluttua säteilyannoksesta laskimonsisäisenä ruiskeena 25 rotta-PEG-SCF1_164:ää (20 pg/kg), joka oli puhdistettu ) colista ja jota oli modifioitu lisäämällä polyetyleenigly-kolia kuten esimerkissä 12, tai suolaliuosta verrokki-eläinten osalta. Siirrännäismallissa hiiriin ruiskutettiin i.v. eri soluannoksia normaalia Balb/c-luuydintä 4 tunnin 30 kuluttua säteilyannoksesta. Käsittely rotta-PEG-SCF1_164:llä | suoritettiin lisäämällä 200 pg/kg rotta-PEG-SCF1_164:ää so- lulietteeseen 1 tunti ennen ruisketta, joka annettiin yhtenä yksittäisenä i.v.-ruiskeena, jossa oli tekijää ja soluja.

135 108140 850 radin säteilyannoksen jälkeen hiiriin ruiskutettiin rotta-PEG-SCF1"164 :ää tai suolaliuosta. Tulokset on esitetty kuviossa 45. Rotta-PEG-SCF1"164: n ruiskuttaminen kasvatti merkittävästi hiirten eloonjääntiaikaa verrokki-5 eläimiin verrattuna (P<0,0001). Hiiret, joihin oli ruiskutettu suolaliuosta, elivät keskimäärin 7,7 päivää, kun taas rotta-PEG-SCF1_164:llä käsitellyt hiiret elivät keskimäärin 9,4 päivää (kuvio 45). Kuviossa 45 esitetyt tulokset edustavat koostetta 4 erillisestä kokeesta kunkin kä-10 sittelyryhmän sisältäessä 30 hiirtä.

Rotta-PEG-SCF1"164 :llä käsiteltyjen hiirten kasvanut ( eloonjäänti viittaa siihen, että SCFtllä on vaikutusta säteilyä saaneiden eläinten luuydinsoluihin. Alustavat tutkimukset näiden eläinten hematologisista parametreistä 15 osoittavat lieviä kohoamisia verihiutaletasoissa verrat tuna verrokkieläimiin päivänä 5 säteilyannoksen jälkeen, jolloin kuitenkaan 7 päivän kuluttua säteilyannoksesta verihiutaletasot eivät merkittävästi poikkea verrokki-eläimistä. Mitään eroja RBC- tai WBC-tasoissa tai luu-20 ydinsoluisuudessa ei ole havaittu.

B. Eloonjääminen SCF:llä käsitellyissä siirrännäis-hiirissä 10 %:n reisiluuannokset normaaleja Balb/c-luuydin-soluja voivat siirrettyinä hiiriin, joita on säteilytetty ^ . 25 850 radin annoksella, pelastaa 90 % tai enemmän eläimistä (tulostietoja ei ole esitetty). Tämän vuoksi säteilyannosta 850 rad käytettiin siirrännäisannoksen 5 % reisiluuta kanssa rotta-PEG-SCF1"164^ vaikutusten eloonjääntiin tutkimiseksi. Tällä soluannoksella odotettiin, ettei runsas 30 prosenttiosuus SCF:ää ei saavista hiiristä pelastuisi; jos *: rotta-PEG-SCF1"164 voisi stimuloida siirrännäissoluja, eloonjäänti saattaisi lisääntyä. Kuten esitetään kuviossa 46, noin 30 % verrokkihiiristä jäi henkiin yli 8 päiväksi säteilyn jälkeen. Käsittelystä rotta-PEG-SCF1"164:llä seu-35 rasi näyttävä kohoaminen eloonjäännissä, jolloin yli 95 % • · .

136 1 08 1 4 O

näistä hiiristä jäi henkiin ainakin 30 päiväksi (kuvio 46). Kuviossa 46 esitetyt tulokset edustavat koostetta tuloksista 4 erillisestä kokeesta, joissa oli 20 hiirtä sekä verrokkeina että rotta-PEG-SCF1"164: llä käsiteltyinä 5 hiirinä. Korkeammilla säteilyannoksilla luuydinsiirrettä käyttäen hiirten käsittelystä rotta-PEG-SCF1-164: llä seurasi niinikään eloonjäännin kasvu (kuvio 47). Verrokkihiiret, joille annettiin 950 radin säteilyannos ja joihin siirrettiin 10 % reisiluuta, olivat kuolleet päivään 8 mennessä, 10 kun taas noin 40 % rotta-PEG-SCF1*164:llä käsitellyistä hiiristä eli 20 päivää tai kauemmin. 20 % verrokkihiiristä, joihin oli siirretty 20 % reisiluuta, eli pitempään kuin ) 20 päivää, kun taas 80 % rSCF:llä käsitellyistä eläimistä jäi henkiin (kuvio 47).

15 Esimerkki 20 SCF-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto 8-viikon ikäisiin naaraspuolisiin Balb/c-hiiriin (Charles River, Wilmington, MA) ruiskutettiin ihonalai-20 sesti 20 pg ihmis-SCF1*164:ää, joka oli ilmennetty E^ colis-sa, täydellisessä Freundin tehosteessa (H37-Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI). 50 pgrsta samaa antigeeniä koostuvia tehosteimmunointeja epätäydellisessä Freundin tehosteessa annettiin sitten päivinä 14, 38 ja 57. 3 päivän -> 25 kuluttua viimeisestä ruiskeesta 2 hiirtä uhrattiin ja nii- den pernasolut fuusioitiin sp 2/0 -myeloomasolulinjaan menettelyjen mukaan, joita kuvaavat Nowinski et ai. [Virology 93 (1979) 111 - 116].

Kasvualusta, jota käytettiin sp 2/0 - ja hybridoo-30 masoluviljelmissä, oli Dulbeccon modifioitu Eagle-kasvual-• usta (DMEM) (Gibco, Chagrin Falls, Ohio), jota oli täyden netty 20 %:lla lämpöinaktivoitua nautasikiöseerumia (Phibro Chem., Fort Lee, NJ), 110 mg:lla/ml natriumpyruva-attia, 100 yksiköllä/ml penisilliiniä ja 100 pg:lla/ml 35 streptomysiiniä (Gibco). Solufuusion jälkeen hybridejä va- ί 137 108140 likoitiin HAT-kasvualustassa tämän kasvualustan sisältäessä pitoisuudet 10 "4 M hypoksantiinia, 4 x 10"7 M aminopt-eriiniä ja 1,6 x 10'5 M tymidiiniä, kahden viikon ajan, minkä jälkeen niitä viljeltiin kasvualustassa, joka sisäl-5 si hypoksantiinia ja tymidiiniä, kahden viikon ajan.

Hybridoomat seulottiin seuraavasti: polystyreeni-kuoppia (Costar, Cambridge, MA) herkistettiin liuoksella, jossa oli 0,25 pg ihmis-SCF1"164:ää (E^ coli) 50 piissä 50 mM bikarbonaattipuskuria, pH 9,2, kahden tunnin ajan 10 huoneenlämpötilassa ja sitten yön yli 4 eC:ssa. Sitten levykuoppia salvattiin liuoksella, jossa oli 5 % BSA:ta ( PBSissä, 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jäl keen niitä inkuboitiin hybridoomaviljelmäsupernatantilla 1 tunnin ajan 37 eC:ssa. Liuos dekantoitiin pois ja si-15 toutuneita vasta-aineita inkuboitiin laimennoksella 1:500 vuohen antihiiri-IgG:tä, joka oli konjugoitu piparjuuri-peroksidaasiin (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin pesu-liuoksella (KPL, Gaithersburg, MD) ja kehitettiin sitten 20 H202:n ja ABTS: n (KPL) seoksella. Kolorimetrinen tulos luettiin 405 nm:ssä.

Hybridoomasoluviljelmiä, jotka erittivät ihmis- SCF1_164:lle (E^ coli) spesifistä vasta-ainetta, testattiin ELISA:11a, jolloin käytettiin hybridoomaseulontamenette- ( 25 lyjen kaltaisia menettelyjä, ristireaktiivisuuksien suh- • · teen ihmis-SCF1_162:n (CHO) kanssa. Hybridoomat alakloonat-tiin rajaavan laimentamisen menetelmällä. 55 hybridooma-supernatanttikuoppaa testattiin voimakkaasti positiivisiksi ihmis-SCF1-164:lie (E^_ coli); 9 niistä ristireagoi 30 ihmis-SCF1"162^ (CHO) kanssa.

• Useita hybridoomasoluja on kloonattu seuraavasti: 138 108140

Monoklooni IgG-isotyyppi Reaktiivisuus ihmis-SCF1_162:n (CHO) suhteen 4G12-13 IgGl ex 5 6C9A IgGl ex 8H7A IgGl kyllä

Hybridoomat 4G12-13 ja 8H7A talletettiin ATCC-tal-letuslaitokseen 26. syyskuuta, 1990.

10 Vaikka esillä olevaa keksintöä on kuvattu edullis ten suoritusmuotojen valossa, otetaan huomioon, että alan ammattilaisten mieleen saattaa tulla muunnoksia ja modi- ) fikaatioita. Tämän vuoksi tarkoitus on, että oheiset patenttivaatimukset kattavat kaikki tällaiset samanarvoiset 15 muunnokset, jotka tulevat keksinnön piiriin sellaisena kuin se patentoitavaksi vaaditaan.

\ « •« <

Claims (39)

108140

1. DNA-sekvenssi käytettäväksi polypeptidituotteen ilmentämiseksi prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsolus- 5 sa, jolla polypeptidituotteella on luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän koko primaarirakenne tai osa siitä, ja luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän hematopoieettinen biologinen ominaisuus, tunnettu siitä, että se valitaan seuraavista: 10 a) kuviossa 14B, kuviossa 14C, kuviossa 15B, kuvi- ^ ossa 15C, kuviossa 42 tai kuviossa 44 esitetyt sekvenssit, tai niihin nähden komplementaariset säikeet; b) DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat kohdassa a) määriteltyihin DNA-sekvensseihin tai niiden fragment- 15 teihin; ja c) DNA-sekvenssit, jotka poissulkien geneettisen koodin degeneraattiluonne hybridisoituisivat kohdissa a) ja b) määriteltyihin DNA-sekvensseihin, ja jotka sekvenssit koodaavat polypeptidiä, jolla on samat aminohapposek- 20 venssit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useamman kodonin, joka on edullinen ilmentämiselle ei-nisäkässo- ( luissa. #

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useamman kodonin, joka on edullinen ilmentämiselle E. coli-soluis-sa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, 30 tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useamman .'·· kodonin, joka on edullinen ilmentämiselle hiivasoluissa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa ihmisen SCF:n ilmentämisen.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa ihmisen SCF- ♦ 108140 polypeptidin SCF1-162, SCF1-164, SCF1-165 tai SCF1-248 ilmentämisen (käyttäen kuvion 42 mukaista numerointia).

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa ihmisen SCF-poly- 5 peptidin SCFmetl-157, SCF1-157, SCFmetl-160, SCF1-160, SCFmetl-161, SCF1-161, SCFmetl-220 tai SCF1-220 ilmentämisen (käyttäen kuvion 44 mukaista numerointia).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa metionyyliryhmän, 10 joka on polypeptidin kypsän muodon N-päädyssä.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen ^ DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on kovalentti- sesti liitetty havaittavaan leimaan.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen DNA-sekvenssi, 15 tunnettu siitä, että leima on radioleima.

11. Biologisesti toimiva plasmidi tai virus-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukaisen DNA:n.

12. Prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäsolu, 20 tunnettu siitä, että se on transformoitu tai transfek- toitu jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaisella DNA-sekvenssillä siten, että isäntäsolu pystyy ilmentämään po-lypeptidituotteen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, ^ . 25 tunnettu siitä, että se on E. coli.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on nisäkässolu.

15. Menetelmä polypeptidin tuottamiseksi, jolla on kuviossa 14C, kuviossa 15C, kuviossa 42 tai kuviossa 44 30 esitetty koko primaarirakenne tai osa siitä, ja luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän hematopoieettinen biologinen ominaisuus, tunnettu siitä, että viljellään sopivissa ravinto-olosuhteissa prokaryootti- tai eukaryoot-ti-isäntäsoluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu 35 DNA-sekvenssillä, joka koodittaa mainittua polypeptidiä siten, että isäntäsolu pystyy ilmentämään mainitun poly- t » i τ 08 UO 1 peptidin, ja eristetään DNA-sekvenssin ilmentämät halutut polypeptidituotteet.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ulkopuolinen DNA-sekvenssi on 5 cDNA-sekvenssi.

17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ulkopuolinen DNA-sekvenssi on genominen DNA-sekvenssi.

18. Jonkin patenttivaatimuksista 15 - 17 mukainen 10 menetelmä, tunnettu siitä, että ulkopuolinen DNA- sekvenssi sijaitsee itsenäisesti replikoituvassa plasmi-' dissa tai virus-vektorissa.

19. Jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi edelleen 15 liitetään kovalenttisesti havaittavaan leima-aineeseen.

20. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen DNA-sekvenssi.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että tuotetaan polypeptidituote, joka ei esiinny luonnossa.

22. Jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi edelleen ^ kytketään kovalenttisesti vesiliukoiseen polymeeriin. : 25 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polymeeri on polyetyleeniglykoli tai polyetyleeniglykolin ja polypropyleeniglykolin kopoly-meeri.

24. Jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 mukainen 3 0 menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai useampi kys-teiiniryhmä korvataan alaniini- tai seriiniryhmällä.

25. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää polypeptidin, jolla on kuviossa 14C, kuviossa 15C, kuviossa 42 tai kuviossa 44 esitetty 35 koko primaarirakenne tai osa siitä, ja luontaisesti esiintyvän kantasolutekijän hematopoieettinen biologinen omi- 108140 naisuus, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 15 mukaisesti valmistettu polypeptidi sekoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttävän laimentimen, adjuvantin tai kantajan kanssa farmaseuttisen koostumuksen muodostamiseksi.

26. Menetelmä hematopoieettisten solujen transfek- toimiseksi ulkopuolisella DNA: 11a, tunnettu siitä, että i) viljellään hematopoieettiset solut jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 mukaisella menetelmällä val io mistetun polypeptidin kanssa ja ii) transfektoidaan viljellyt solut ulkopuolisella . DNA:11a.

27. Tarvikepakkaus, joka sisältää luuydinsolujen tai veren perifeeristen kantaisäsolujen viljelyn kom- 15 ponentteja, tunnettu siitä, että se sisältää i) jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 mukaisella menetelmällä valmistetun polypeptidin mahdollisesti farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa; ii) komponentteja, jotka soveltuvat viljelyalustan 20 valmistamiseksi luuydinsolujen tai veren perifeeristen kantaisäsolujen viljelemiseen.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen tarvikepak kaus, tunnettu siitä, että komponentit käsittävät ainakin yhden toisen hematopoieettisen tekijän joukosta EPO, j ’* 25 G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 ja IGF-1.

29. Patenttivaatimuksen 27 mukainen tarvikepakkaus, tunnettu siitä, että komponentit käsittävät ainakin yhden toisen hematopoieettisen tekijän joukosta IL- . 30 8, IL-9 ja IL-10.

30. Patenttivaatimuksen 27 mukainen tarvikepakkaus, tunnettu siitä, että komponentit käsittävät ainakin yhden toisen hematopoieettisen tekijän joukosta IL-11 ja LIF.

31. Menetelmä hematopoieettisten solujen viljele miseksi in vitro, tunnettu siitä, että · 108140 143 i i) mainitut solut viedään sopivaan viljelyalus-taan, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 mukaisella menetelmällä valmistetun polypeptidin, ja ii) järjestetään sopivat olosuhteet hematopoieet-5 tisten solujen viljelyä varten.

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sopiva viljelyalusta sisältää ainakin yhden toisen hematopoieettisen tekijän joukosta EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,

10 IL-7 ja IGF-1. ζ 33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisättävät hematopoieettiset tekijät ovat IL-3, IL-6 ja G-CSF.

34. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että sopiva viljelyalusta sisältää ainakin yhden toisen hematopoieettisen tekijän joukosta IL-8, IL-9 ja IL-10.

35. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sopiva viljelyalusta sisältää ai- 20 nakin yhden toisen hematopoieettisen tekijän joukosta IL-11 ja LIF.

36. Jonkin patenttivaatimuksista 31 - 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hematopoieettiset so- ( lut ovat luuydinsoluja.

37. Jonkin patenttivaatimuksista 31 - 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hematopoieettiset solut ovat veren perifeerisiä kantasoluja.

38. Menetelmä vasta-aineen valmistamiseksi, joka valikoivasti sitoutuu jonkin patenttivaatimuksista 15 - 18 30 mukaisella menetelmällä valmistettuun polypeptidiin, tunnettu siitä, että immunologisesti reaktiivinen eläin immunisoidaan mainitulla polypeptidillä ja otetaan talteen tuotetut vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä mainitulle polypeptidille.

39. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmis tamiseksi, joka valikoivasti sitoutuu jonkin patenttivaa- 108140 i timuksista 15 - 18 mukaisella menetelmällä valmistettuun polypeptidiin, tunnettu siitä, että immunologisesti reaktiivinen eläin immunisoidaan mainitulla polypeptidillä, vasta-ainetta tuottavia soluja otetaan talteen immuni-5 soidusta eläimestä, vasta-ainetta tuottavat solut fuusioidaan immortaaliin solulinjaan, ja otetaan talteen fuusio-soluja, jotka kykenevät tuottamaan jatkuvasti vasta-ainetta mainittua polypeptidiä vastaan. ) ) • · · .10814 0