JP2001515871A - 骨芽細胞性幹細胞因子を阻害することによる破骨細胞形成の制御 - Google Patents
骨芽細胞性幹細胞因子を阻害することによる破骨細胞形成の制御Info
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Abstract
(57)【要約】
骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/または活性に対する阻害剤(例えば、抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなど)を提供する。骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/または活性に対するこれらの阻害剤を含む薬剤学的組成物も提供する。また、骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/または活性を阻害する段階を含む、破骨細胞の活性を制御する方法も提供する。
Description
【0001】 発明の背景 関連出願の説明 本出願は、1997年9月10日に出願され、現在は放棄されている仮特許出願第60
/058,484号の特恵を主張するものである。
/058,484号の特恵を主張するものである。
【0002】 連邦政府補助金 本発明は、部分的には、国立衛生研究所からの補助金(補助金番号AG12951) を使用して行われた。従って、連邦政府は本発明に関し、特定の権利を所有する
。
。
【0003】発明の属する分野 本発明は、一般的には、生化学的内分泌学ならびに骨の形成および分解の制御
の分野に関する。さらに特定すると、本発明は、骨芽細胞性幹細胞因子を阻害す
ることによる破骨細胞形成の制御に関する。
の分野に関する。さらに特定すると、本発明は、骨芽細胞性幹細胞因子を阻害す
ることによる破骨細胞形成の制御に関する。
【0004】関連技術の説明 人間の骨格は常に再構成されており、通常は1〜2年で入れ替わり、骨格のミ
ネラルはカルシウムのホメオスタシス(恒常性)に利用される。骨格の強度およ
び形状は、部分的な置換によって保持されている。骨は、単球マクロファージ前
駆体1〜2から形成される破骨細胞によって分解され、一方、ストローマ細胞(
間質細胞)3由来の骨芽細胞は新しい骨を合成する。これらの無関係な細胞が対
になって分化し、数週間の内に新しい骨を産生する。
ネラルはカルシウムのホメオスタシス(恒常性)に利用される。骨格の強度およ
び形状は、部分的な置換によって保持されている。骨は、単球マクロファージ前
駆体1〜2から形成される破骨細胞によって分解され、一方、ストローマ細胞(
間質細胞)3由来の骨芽細胞は新しい骨を合成する。これらの無関係な細胞が対
になって分化し、数週間の内に新しい骨を産生する。
【0005】 全体的な骨の入れ替わりは副甲状腺(上皮小体)ホルモンに対応しているが、
破骨細胞および骨芽細胞の分化がどのように局所的に調和をとって骨の完全性を
維持しているのかについてはほとんどわかっていない。破骨細胞の分化には、前
駆体が骨芽細胞様細胞4に接触することが必要であることから、特定の認識分子
の存在が示唆される。イン・サイチュー(in situ)でのラベルしていない抗体 およびウェスタンブロット分析から、骨芽細胞は、骨の合成期間中のみ表面結合
型の幹細胞因子(SCF;c-kitリガンド)を発現することが明かになった。単離し
た骨芽細胞中の幹細胞因子の産生は、副甲状腺ホルモンに対応している。イン・
ビトロ(in vitro)においては、単球からの破骨細胞の分化は、骨芽細胞由来の
幹細胞因子産生細胞によって支持されており、この過程は、幹細胞因子を標的と
する抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害されることから、
この過程を制御することが鍵であることが示唆される。
破骨細胞および骨芽細胞の分化がどのように局所的に調和をとって骨の完全性を
維持しているのかについてはほとんどわかっていない。破骨細胞の分化には、前
駆体が骨芽細胞様細胞4に接触することが必要であることから、特定の認識分子
の存在が示唆される。イン・サイチュー(in situ)でのラベルしていない抗体 およびウェスタンブロット分析から、骨芽細胞は、骨の合成期間中のみ表面結合
型の幹細胞因子(SCF;c-kitリガンド)を発現することが明かになった。単離し
た骨芽細胞中の幹細胞因子の産生は、副甲状腺ホルモンに対応している。イン・
ビトロ(in vitro)においては、単球からの破骨細胞の分化は、骨芽細胞由来の
幹細胞因子産生細胞によって支持されており、この過程は、幹細胞因子を標的と
する抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害されることから、
この過程を制御することが鍵であることが示唆される。
【0006】 SCF/kitシグナル経路は非常に複雑である。概説すると、幹細胞因子の結合が レセプターの二量体化(ダイメリゼーション)を誘導し、これはリン酸化が関与
している。srcファミリーの細胞内キナーゼ、癌遺伝子のc-CblキナーゼおよびpI
-3キナーゼを介して活性が変換される。srcおよびCblは破骨細胞の分化に必須で
ある。src、CblおよびpI-3キナーゼは他の破骨細胞シグナル分子と相互作用する
。
している。srcファミリーの細胞内キナーゼ、癌遺伝子のc-CblキナーゼおよびpI
-3キナーゼを介して活性が変換される。srcおよびCblは破骨細胞の分化に必須で
ある。src、CblおよびpI-3キナーゼは他の破骨細胞シグナル分子と相互作用する
。
【0007】 例えば、腎不全でリン酸塩が保持されるなどしてイオン化されたカルシウムが
減少すると、副甲状腺ホルモンが大量に放出され、骨の形成および分解の組合せ
は維持しながら、骨の入れ替わりは10倍にまで増加する。副甲状腺機能亢進状態
の骨の中で幹細胞因子が生じることについて調べた。なぜならば、そのような患
者の骨柱(トラベキュラ)の周囲にはマスト細胞の異常な分化が起こっており5 、このタンパク質がイン・ビトロ(in vitro)においてマスト細胞の分化を起こ
させるからである6。幹細胞因子はいくつかの組織内において様々な形態で発現
され7、6個のエクソンを有する転写体からは可溶型、8個のエクソンを有する
転写体からは長い膜結合型8になる。タンパク質分解およびグリコシル化によっ
てさらに変化が生じる。
減少すると、副甲状腺ホルモンが大量に放出され、骨の形成および分解の組合せ
は維持しながら、骨の入れ替わりは10倍にまで増加する。副甲状腺機能亢進状態
の骨の中で幹細胞因子が生じることについて調べた。なぜならば、そのような患
者の骨柱(トラベキュラ)の周囲にはマスト細胞の異常な分化が起こっており5 、このタンパク質がイン・ビトロ(in vitro)においてマスト細胞の分化を起こ
させるからである6。幹細胞因子はいくつかの組織内において様々な形態で発現
され7、6個のエクソンを有する転写体からは可溶型、8個のエクソンを有する
転写体からは長い膜結合型8になる。タンパク質分解およびグリコシル化によっ
てさらに変化が生じる。
【0008】 従来の技術においては、破骨細胞の形成および活性を阻害し、それによって骨
の形成および/または分解を制御する有効な手段を欠いていたことが欠点である
。本発明は、当該分野におけるこの長年にわたる必要性および要望を満たすもの
である。
の形成および/または分解を制御する有効な手段を欠いていたことが欠点である
。本発明は、当該分野におけるこの長年にわたる必要性および要望を満たすもの
である。
【0009】 発明の概要 本発明は、特に、c-kitリガンドのC末端の保存領域に対する抗体がヒトの破 骨細胞の形成を完全に阻害することを開示している。この領域は、タンパク質の
膜結合領域内に存在し、いくつかの分泌形態を有するが、このタンパク質につい
てのその他の形態は報告されておらず、c-kitリガンドのいくつかの機能に対し ても必要ではないものと考えられる。さらに、骨芽細胞様ストローマ細胞および
単球のみを含む対照イン・ビトロ(in vitro)系においては、幹細胞因子に対す
るアンチセンスヌクレオチドまたは抗体によって破骨細胞形成が阻害され、これ
が骨細胞分化の組合せに特有な制限因子になっている。
膜結合領域内に存在し、いくつかの分泌形態を有するが、このタンパク質につい
てのその他の形態は報告されておらず、c-kitリガンドのいくつかの機能に対し ても必要ではないものと考えられる。さらに、骨芽細胞様ストローマ細胞および
単球のみを含む対照イン・ビトロ(in vitro)系においては、幹細胞因子に対す
るアンチセンスヌクレオチドまたは抗体によって破骨細胞形成が阻害され、これ
が骨細胞分化の組合せに特有な制限因子になっている。
【0010】 破骨細胞は、骨粗鬆症、転位性癌における骨の損傷およびその他の疾患状態に
起因する骨の分解を仲介する。故に、本発明の応用としては、破骨細胞形成の制
御、すなわち、骨の消失、骨の消失の原因となる疾患状態の制御が挙げられる。
起因する骨の分解を仲介する。故に、本発明の応用としては、破骨細胞形成の制
御、すなわち、骨の消失、骨の消失の原因となる疾患状態の制御が挙げられる。
【0011】 c-kitリガンドを用いて骨の分解を減少させることは、(レセプター)欠損mi/
miマウスにおいて、マスト細胞のみに影響を与える系を阻害するという特別な利
点を有し、それ故、わずかしかまたは毒性がない。さらに、C末端阻害を利用し
て破骨細胞活性を阻害することは、他に作用が知られていない分子の一部を用い
ることである。
miマウスにおいて、マスト細胞のみに影響を与える系を阻害するという特別な利
点を有し、それ故、わずかしかまたは毒性がない。さらに、C末端阻害を利用し
て破骨細胞活性を阻害することは、他に作用が知られていない分子の一部を用い
ることである。
【0012】 従って、c-kitリガンドに特異的な抗体またはアンチセンスヌクレオチドを使 用することにより、加齢(骨粗鬆症)または癌の進行(転位性骨疾患)における
骨の消失を減少させる、または阻止することができる。これらの化合物は、破骨
細胞の形成(酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ陽性細胞)および活性(骨吸収)
の両方を標的とする。
骨の消失を減少させる、または阻止することができる。これらの化合物は、破骨
細胞の形成(酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ陽性細胞)および活性(骨吸収)
の両方を標的とする。
【0013】 本発明のひとつの実施態様においては、骨芽細胞性SCFの結合および/または 活性に対する阻害剤を提供する。
【0014】 本発明の別の実施態様においては、骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/また
は活性に対する阻害剤ならびに薬剤学的に許容されるキャリヤを含む薬剤学的組
成物を提供する。
は活性に対する阻害剤ならびに薬剤学的に許容されるキャリヤを含む薬剤学的組
成物を提供する。
【0015】 本発明のさらに別の実施態様においては、骨芽細胞性幹細胞因子の結合および
/または活性を阻害する工程を含む、破骨細胞の活性を制御する方法を提供する
。
/または活性を阻害する工程を含む、破骨細胞の活性を制御する方法を提供する
。
【0016】 本発明のさらにまた別の実施態様においては、治療を要する病理生理学的状態
の動物を治療する方法を提供し、ここで、病理生理学的状態とは骨の消失を含み
、 本明細書に開示している薬剤学的組成物を動物に投与する工程を含む。
の動物を治療する方法を提供し、ここで、病理生理学的状態とは骨の消失を含み
、 本明細書に開示している薬剤学的組成物を動物に投与する工程を含む。
【0017】 本発明のまた別の実施態様においては、骨芽細胞性幹細胞因子の活性を測定す
る工程を含む骨の疾患の診断方法を提供する。
る工程を含む骨の疾患の診断方法を提供する。
【0018】 本発明のその他、ならびにさらなる態様、特徴および利点については、開示の
目的で記述している本発明の好ましい実施態様についての以下の記載から明らか
である。
目的で記述している本発明の好ましい実施態様についての以下の記載から明らか
である。
【0019】 図面の説明 本発明の上述した特徴、利点および目的、ならびにそれらから明らかになるで
あろうその他の事項を達成し、細部にわたり理解できるように、添付の図面に示
している特定の実施態様を参照して、以上に概説している本発明をより詳しく説
明する。これらの図面は明細書の一部をなすものである。しかしながら、添付の
図面は好ましい実施態様を図示するものであって、範囲を限定するためのもので
はないことに注意のこと。
あろうその他の事項を達成し、細部にわたり理解できるように、添付の図面に示
している特定の実施態様を参照して、以上に概説している本発明をより詳しく説
明する。これらの図面は明細書の一部をなすものである。しかしながら、添付の
図面は好ましい実施態様を図示するものであって、範囲を限定するためのもので
はないことに注意のこと。
【0020】 図1〜3は、ヒトの骨細胞内におけるSCF産生を示す。図1および2は骨の バイオプシー切片内の幹細胞因子を示す。7μmの切片をホルマリンで固定し、
メタクリレートで包埋した組織を脱樹脂化し、ヘマトキシリン−カウンター染色
を用いた非ラベル抗体法により幹細胞因子を確認し、細胞の細部を明らかにした
。副甲状腺機能亢進症の患者由来の一切片中の幹細胞因子(図1)および正常の
患者由来の一切片中の幹細胞因子(図2)は、膜様式内(矢印)の立方形の活性
な骨芽細胞(ob)(図1のA、2のC)との前記抗体の反応を示す(茶色部分)
。減弱された不動の骨芽細胞(図1のBおよび2のD)は反応しなかった。無関
係なハイブリドーマの上清は反応しなかった(図示していない)。目盛りのバー
は5μmである。図3は、骨柱細胞および骨髄細胞のウェスタンブロット分析を
示す。骨が急速に消失した患者由来の脊椎の骨柱(コルチゾール治療を受けてい
た52才の女性から得た剖検組織)を渦動によって髄から分離し、記載に従って、
タンパク質の100μgのアリコートをSDS-PAGEによって分離し、ウェスタンブロ ットに供した8。反応しなかったハイブリドーマおよび髄細胞タンパク質は抗体
によってラベルされなかったが、分子量が約45kDおよび約33kDの骨細胞タンパク
質はラベルされた。結果はいくつかの反応の内の代表的なものである。
メタクリレートで包埋した組織を脱樹脂化し、ヘマトキシリン−カウンター染色
を用いた非ラベル抗体法により幹細胞因子を確認し、細胞の細部を明らかにした
。副甲状腺機能亢進症の患者由来の一切片中の幹細胞因子(図1)および正常の
患者由来の一切片中の幹細胞因子(図2)は、膜様式内(矢印)の立方形の活性
な骨芽細胞(ob)(図1のA、2のC)との前記抗体の反応を示す(茶色部分)
。減弱された不動の骨芽細胞(図1のBおよび2のD)は反応しなかった。無関
係なハイブリドーマの上清は反応しなかった(図示していない)。目盛りのバー
は5μmである。図3は、骨柱細胞および骨髄細胞のウェスタンブロット分析を
示す。骨が急速に消失した患者由来の脊椎の骨柱(コルチゾール治療を受けてい
た52才の女性から得た剖検組織)を渦動によって髄から分離し、記載に従って、
タンパク質の100μgのアリコートをSDS-PAGEによって分離し、ウェスタンブロ ットに供した8。反応しなかったハイブリドーマおよび髄細胞タンパク質は抗体
によってラベルされなかったが、分子量が約45kDおよび約33kDの骨細胞タンパク
質はラベルされた。結果はいくつかの反応の内の代表的なものである。
【0021】 図4〜6は、骨芽細胞様細胞系および骨芽細胞による幹細胞因子の産生を示す
。図4は、示されているホルモンを用いて5日間の前処理を行ったSaOS2ヒト骨 肉腫細胞のウェスタンブロット分析を示す。副甲状腺が存在するにもかかわらず
、幹細胞因子の産生は非常に少なかった。1,25−ジヒドロキシビタミンDは効
果がなかった。正常な骨細胞とは異なり(図3参照)分子量約45kDのひとつの形
態のみが観察された。図5は、UMR-106細胞のELISAアッセイを示す。10回継代し
たこのラットの骨芽細胞様細胞系を10−9Mの副甲状腺ホルモン(PTH)、10− 8 Mの1,25−ジヒドロキシビタミンD(D)、またはこれらの両方で120時間 処理した。ELISAアッセイについては、マイクロタイターウェルを5μgのタン パク質で被覆し、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギ血清(バイオ−ラド(Bi
o-Rad)社、カリフォルニア州リッチモンド)およびp−ニトロフェノール−PO 4 基質を用い、550nmにおける吸光度によって、結合したヒト抗幹細胞因子を測 定した。四重試験の結果±偏差値がこの図に示されており、続いて定量試験を行
った。時間経過は、1〜3日間の事前のインキュベーションにおける副甲状腺ホ
ルモンの効果が最小限であったことを示しており、ウェスタンブロット分析は図
3と同様であった(図示していない)。 図6は、単離されたヒトの骨芽細胞中 の幹細胞因子のノーザンブロット分析である。上述の条件下で120時間細胞を前 処理した。2つのmRNAが検出されたが、非形質転換ヒト破骨細胞中にはこれと同
じ大きさの2つのタンパク質が存在している(図2のC)。MG63 RNAを正の対 照として用いた(右のレーン);10−9Mの副甲状腺ホルモンを添加した場合(
2番目のレーン)を除いて、骨芽細胞は検出可能なレベルのmRNAを産生しなかっ
た(左のレーン);この過程は糖質コルチコイドによって影響を受けなかった(
3番目のレーン)。
。図4は、示されているホルモンを用いて5日間の前処理を行ったSaOS2ヒト骨 肉腫細胞のウェスタンブロット分析を示す。副甲状腺が存在するにもかかわらず
、幹細胞因子の産生は非常に少なかった。1,25−ジヒドロキシビタミンDは効
果がなかった。正常な骨細胞とは異なり(図3参照)分子量約45kDのひとつの形
態のみが観察された。図5は、UMR-106細胞のELISAアッセイを示す。10回継代し
たこのラットの骨芽細胞様細胞系を10−9Mの副甲状腺ホルモン(PTH)、10− 8 Mの1,25−ジヒドロキシビタミンD(D)、またはこれらの両方で120時間 処理した。ELISAアッセイについては、マイクロタイターウェルを5μgのタン パク質で被覆し、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギ血清(バイオ−ラド(Bi
o-Rad)社、カリフォルニア州リッチモンド)およびp−ニトロフェノール−PO 4 基質を用い、550nmにおける吸光度によって、結合したヒト抗幹細胞因子を測 定した。四重試験の結果±偏差値がこの図に示されており、続いて定量試験を行
った。時間経過は、1〜3日間の事前のインキュベーションにおける副甲状腺ホ
ルモンの効果が最小限であったことを示しており、ウェスタンブロット分析は図
3と同様であった(図示していない)。 図6は、単離されたヒトの骨芽細胞中 の幹細胞因子のノーザンブロット分析である。上述の条件下で120時間細胞を前 処理した。2つのmRNAが検出されたが、非形質転換ヒト破骨細胞中にはこれと同
じ大きさの2つのタンパク質が存在している(図2のC)。MG63 RNAを正の対 照として用いた(右のレーン);10−9Mの副甲状腺ホルモンを添加した場合(
2番目のレーン)を除いて、骨芽細胞は検出可能なレベルのmRNAを産生しなかっ
た(左のレーン);この過程は糖質コルチコイドによって影響を受けなかった(
3番目のレーン)。
【0022】 図7〜13は、幹細胞因子を阻害した場合の破骨細胞の産生に与える影響を示す
。図7および8は、MG63細胞と共に培養したマクロファージ由来の酒石酸塩耐性
酸性ホスファターゼ(TRAP)陽性細胞および幹細胞因子に与える抗体の影響を示
す。図7のAは、0.5μg/mlの組換えCSF-1(ジェンザイム(Genzyme)社、マサ
チューセッツ州ケンブリッジ)を増殖3日目に添加して(ストローマ細胞が存在
しない場合には細胞の生育に必要)14日間インキュベートした2cm2の組織培養
中のヒトのマクロファージを示す。多数の巨大細胞が形成されたにもかかわらず
、破骨細胞の分化に特徴的な産物であるTRAPは存在していなかった。図7のBは
、図7のAと同様にMG63細胞と共に14日間共培養した(継代43回、0日目には10 4 個/cm2であったが、14日目にはほぼ全面に広がっていた)マクロファージを
示す。対照培養においては、予め免疫しておいたウサギ血清を1:100に希釈し て加え、以下の図8のDにおけるウサギ血清の添加を調整した。形成された巨大
細胞はTRAPに強い陽性(赤色)を示したことを記しておく。図8は、1:500お よび1:100にそれぞれ希釈した抗幹細胞因子抗体が濃度に依存して染色が薄く なることを示す。目盛りのバーは20μmである。図9および10は、MG63細胞(図
9)またはSaOS2細胞(図10)を用いて14日間共培養したヒトのマクロファージ 内におけるTRAP活性に対する幹細胞因子抗体の影響を示す。MG63細胞およびSaOS
2細胞を用い、予め免疫しておいたウサギ血清(1:25、PICS)対照および広範 な血清濃度範囲について、破骨細胞の分化を支持する試験を行った。両方の場合
において、抗体(Ab)の濃度に依存したTRAPの減少が起こった。マクロファージ
(10μg、MF)およびニワトリ破骨細胞21溶解物(2μg、OC)を陽性および
陰性の対照とした。図11は、ヒトのマクロファージならびにMG63細胞もしくはSa
OS2細胞の14日間の共培養によって形成された破骨細胞による骨の分解、また、2
0μgの3Hラベルした基質を用い、上清に放出されたラベルを測定する21こ とによってアッセイした幹細胞因子に対する抗体の影響を示す。図12および13は
、ヒトのマクロファージと共にMG63細胞、ならびに1.5μMのセンスオリゴヌク レオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを指示に従って用いた、TRAP
の形成および骨の分解に対する幹細胞因子アンチセンスホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドの影響およびセンスオリゴヌクレオチドの制御を示す。
。図7および8は、MG63細胞と共に培養したマクロファージ由来の酒石酸塩耐性
酸性ホスファターゼ(TRAP)陽性細胞および幹細胞因子に与える抗体の影響を示
す。図7のAは、0.5μg/mlの組換えCSF-1(ジェンザイム(Genzyme)社、マサ
チューセッツ州ケンブリッジ)を増殖3日目に添加して(ストローマ細胞が存在
しない場合には細胞の生育に必要)14日間インキュベートした2cm2の組織培養
中のヒトのマクロファージを示す。多数の巨大細胞が形成されたにもかかわらず
、破骨細胞の分化に特徴的な産物であるTRAPは存在していなかった。図7のBは
、図7のAと同様にMG63細胞と共に14日間共培養した(継代43回、0日目には10 4 個/cm2であったが、14日目にはほぼ全面に広がっていた)マクロファージを
示す。対照培養においては、予め免疫しておいたウサギ血清を1:100に希釈し て加え、以下の図8のDにおけるウサギ血清の添加を調整した。形成された巨大
細胞はTRAPに強い陽性(赤色)を示したことを記しておく。図8は、1:500お よび1:100にそれぞれ希釈した抗幹細胞因子抗体が濃度に依存して染色が薄く なることを示す。目盛りのバーは20μmである。図9および10は、MG63細胞(図
9)またはSaOS2細胞(図10)を用いて14日間共培養したヒトのマクロファージ 内におけるTRAP活性に対する幹細胞因子抗体の影響を示す。MG63細胞およびSaOS
2細胞を用い、予め免疫しておいたウサギ血清(1:25、PICS)対照および広範 な血清濃度範囲について、破骨細胞の分化を支持する試験を行った。両方の場合
において、抗体(Ab)の濃度に依存したTRAPの減少が起こった。マクロファージ
(10μg、MF)およびニワトリ破骨細胞21溶解物(2μg、OC)を陽性および
陰性の対照とした。図11は、ヒトのマクロファージならびにMG63細胞もしくはSa
OS2細胞の14日間の共培養によって形成された破骨細胞による骨の分解、また、2
0μgの3Hラベルした基質を用い、上清に放出されたラベルを測定する21こ とによってアッセイした幹細胞因子に対する抗体の影響を示す。図12および13は
、ヒトのマクロファージと共にMG63細胞、ならびに1.5μMのセンスオリゴヌク レオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを指示に従って用いた、TRAP
の形成および骨の分解に対する幹細胞因子アンチセンスホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドの影響およびセンスオリゴヌクレオチドの制御を示す。
【0023】 図14は、生きているMG63細胞の抗体染色を示す。パッチ様の表面染色パターン
が見られる(矢印、上のパネル)。過量の抗原を用いた抗体の事前のインキュベ
ーションによって反応は首尾良く阻害することができた(中央のパネル)。予め
免疫しておいた血清を用いたインキュベーションでは、ごくわずかのバックグラ
ウンド程度の蛍光しか見られなかった。
が見られる(矢印、上のパネル)。過量の抗原を用いた抗体の事前のインキュベ
ーションによって反応は首尾良く阻害することができた(中央のパネル)。予め
免疫しておいた血清を用いたインキュベーションでは、ごくわずかのバックグラ
ウンド程度の蛍光しか見られなかった。
【0024】 図15は、センス/アンチセンス処理を行った幹細胞因子産生についてのウェス
タンブロット分析を示す。この図においては、45kDaの位置において幹細胞因子 が形成されていることがはっきりとわかる。1.5μMのアンチセンスオリゴヌク レオチドを用いた処理後5日以上経過した場合においては阻害が観察され、これ
は矛盾しない結果である。
タンブロット分析を示す。この図においては、45kDaの位置において幹細胞因子 が形成されていることがはっきりとわかる。1.5μMのアンチセンスオリゴヌク レオチドを用いた処理後5日以上経過した場合においては阻害が観察され、これ
は矛盾しない結果である。
【0025】 図16および17は、MG63細胞は、アンチセンスを含むpCDNA3を用いることにより
、CMVプロモーターによって稼働されるヒトc-fmsリガンドの翻訳開始部位に安定
的にトランスフェクトされることを示すものである。図16は、ネオマイシンアナ
ログG418中において増殖するトランスフェクトしたMG63細胞を示す。トランスフ
ェクトした細胞はコロニーを形成しており(左のパネル)、一方、空のベクター
を有する対照では生きた細胞はない(右のパネル)。図17は、ベクターのみを有
する(ベクター対照はV3、V6)MG63細胞中および野生型MG63細胞中(中央のレー
ン)においては36kDa型および50kDa型の幹細胞因子を発現するが、トランスフェ
クトした細胞においては幹細胞因子アンチセンス(アンチセンス13、17)を発現
しなかったことを示すウェスタンブロット分析である。
、CMVプロモーターによって稼働されるヒトc-fmsリガンドの翻訳開始部位に安定
的にトランスフェクトされることを示すものである。図16は、ネオマイシンアナ
ログG418中において増殖するトランスフェクトしたMG63細胞を示す。トランスフ
ェクトした細胞はコロニーを形成しており(左のパネル)、一方、空のベクター
を有する対照では生きた細胞はない(右のパネル)。図17は、ベクターのみを有
する(ベクター対照はV3、V6)MG63細胞中および野生型MG63細胞中(中央のレー
ン)においては36kDa型および50kDa型の幹細胞因子を発現するが、トランスフェ
クトした細胞においては幹細胞因子アンチセンス(アンチセンス13、17)を発現
しなかったことを示すウェスタンブロット分析である。
【0026】 図18は、いくつかのタンパク質のC末端配列(抗体産生領域を四角で囲んであ
る)の比較を示す。
る)の比較を示す。
【0027】 図19は、抗体の開発に用いられた領域を有するヒトの幹細胞因子タンパク質の
分析を示し、この領域を強調して表示している。この選択された領域は、哺乳類
において高度に保存されている(下等種においては最初の3個のアミノ酸におい
てE/QおよびE/D置換が生じている)。
分析を示し、この領域を強調して表示している。この選択された領域は、哺乳類
において高度に保存されている(下等種においては最初の3個のアミノ酸におい
てE/QおよびE/D置換が生じている)。
【0028】 発明の詳細な説明 本発明は、骨芽細胞性SCFの結合および/または活性に対する阻害剤を提供す る。ひとつの態様において、この阻害剤は抗体である。好ましくは、該阻害剤は
膜結合型の骨芽細胞性SCFに直接作用し、該抗体は、SCFタンパク質のC末端に直
接作用する。好ましい実施態様においては、抗体は、10個のアミノ酸からなるペ
プチド(デカペプチド:decapeputides)、EEDNEISMLQ(SEQ ID No.:
1)を含むC末端に直接作用する。ヒト型および非ヒト型の両方の抗体を本明細 書に記載している多様な用途に用いることができる。別の態様において、本発明
は、幹細胞因子の発現に直接作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する
。好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、幹細胞因子の転写開始部
位に直接作用する。
膜結合型の骨芽細胞性SCFに直接作用し、該抗体は、SCFタンパク質のC末端に直
接作用する。好ましい実施態様においては、抗体は、10個のアミノ酸からなるペ
プチド(デカペプチド:decapeputides)、EEDNEISMLQ(SEQ ID No.:
1)を含むC末端に直接作用する。ヒト型および非ヒト型の両方の抗体を本明細 書に記載している多様な用途に用いることができる。別の態様において、本発明
は、幹細胞因子の発現に直接作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する
。好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、幹細胞因子の転写開始部
位に直接作用する。
【0029】 また別の態様において、本発明は、骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/また
は活性を阻害する工程を含む、破骨細胞の活性を制御する方法に関する。上述の
抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも本方法に有用である。
は活性を阻害する工程を含む、破骨細胞の活性を制御する方法に関する。上述の
抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも本方法に有用である。
【0030】 特に、本発明の抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて薬剤学的
組成物を調製することを企図している。そのような場合には、該薬剤学的組成物
は本発明の抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに薬剤学的に許容
されるキャリヤを含む。当業者は、不要な実験をすることなく、本発明の抗体お
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドの適切な投与量および投与経路を決定する
ことができる。
組成物を調製することを企図している。そのような場合には、該薬剤学的組成物
は本発明の抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに薬剤学的に許容
されるキャリヤを含む。当業者は、不要な実験をすることなく、本発明の抗体お
よびアンチセンスオリゴヌクレオチドの適切な投与量および投与経路を決定する
ことができる。
【0031】 治療用途においては、標的遺伝子領域の発現を阻害することにより、様々な病
状の処置に適した方法でオリゴヌクレオチドを使用する。そのような治療に対し
ては、全身性投与、局所(topical)投与または局部(local)投与を含む種々の
投与様式に合わせて、オリゴヌクレオチドを単独でまたは組み合わせて製剤化す
ることができる。一般的には、技術および製剤化については、「レミントン 薬
剤学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(マック出版社(Mac Publish
ing)、ペンシルバニア州イーストン)に記載されている。投与様式および投与 形態の性質に応じて、一般的には、活性なオリゴヌクレオチド材料は、薬剤学的
に許容されるキャリヤ(希釈剤など)、または充填剤(filler)、増量剤、結合
剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤もしくは潤滑剤を含む賦形剤(excipient)と 組み合わせる。一般的な投与形態としては、錠剤、粉末、液状製剤(懸濁液、エ
マルションおよび溶液を含む)、顆粒、カプセル、および坐薬、ならびに注射用
の液状製剤(リポソーム製剤を含む)が挙げられる。
状の処置に適した方法でオリゴヌクレオチドを使用する。そのような治療に対し
ては、全身性投与、局所(topical)投与または局部(local)投与を含む種々の
投与様式に合わせて、オリゴヌクレオチドを単独でまたは組み合わせて製剤化す
ることができる。一般的には、技術および製剤化については、「レミントン 薬
剤学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(マック出版社(Mac Publish
ing)、ペンシルバニア州イーストン)に記載されている。投与様式および投与 形態の性質に応じて、一般的には、活性なオリゴヌクレオチド材料は、薬剤学的
に許容されるキャリヤ(希釈剤など)、または充填剤(filler)、増量剤、結合
剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤もしくは潤滑剤を含む賦形剤(excipient)と 組み合わせる。一般的な投与形態としては、錠剤、粉末、液状製剤(懸濁液、エ
マルションおよび溶液を含む)、顆粒、カプセル、および坐薬、ならびに注射用
の液状製剤(リポソーム製剤を含む)が挙げられる。
【0032】 全身性投与には、筋肉内、静脈内、腹膜内および皮下を含む注射が好ましい。
注射用には、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドを生理学的に等張な緩衝
液を用いた液状溶液に調製する。さらに、オリゴヌクレオチドを固体状に調製し
、使用直前に再溶解または懸濁することもできる。凍結乾燥した形態も含まれる
。全身性投与に使用することができる投与量は、好ましくは約0.01mg/kg〜50mg/
kgであり、1日1回または2回投与する。しかしながら、次のような状況に応じ
て異なる投与計画をたてることもできる:(1)標的となるDNAの活性を阻害す る際の個々のオリゴヌクレオチドの能力;(2)病理学的な疾患の状態の重篤度
もしくは範囲;または(3)与えられたオリゴヌクレオチドの薬物動態学的挙動
。
注射用には、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドを生理学的に等張な緩衝
液を用いた液状溶液に調製する。さらに、オリゴヌクレオチドを固体状に調製し
、使用直前に再溶解または懸濁することもできる。凍結乾燥した形態も含まれる
。全身性投与に使用することができる投与量は、好ましくは約0.01mg/kg〜50mg/
kgであり、1日1回または2回投与する。しかしながら、次のような状況に応じ
て異なる投与計画をたてることもできる:(1)標的となるDNAの活性を阻害す る際の個々のオリゴヌクレオチドの能力;(2)病理学的な疾患の状態の重篤度
もしくは範囲;または(3)与えられたオリゴヌクレオチドの薬物動態学的挙動
。
【0033】 別の態様において、本発明は、治療が必要な動物の病理生理学的状態を治療す
る方法に関する。代表的な病理生理学的状態としては、骨の消失が挙げられる。
本方法は、本明細書に開示している薬剤学的組成物をそのような動物に投与する
工程を含む。好ましくは、病理生理学的状態は、骨粗鬆症、骨癌、および腫瘍性
高カルシウム血症を含む群から選択される。
る方法に関する。代表的な病理生理学的状態としては、骨の消失が挙げられる。
本方法は、本明細書に開示している薬剤学的組成物をそのような動物に投与する
工程を含む。好ましくは、病理生理学的状態は、骨粗鬆症、骨癌、および腫瘍性
高カルシウム血症を含む群から選択される。
【0034】 別の態様において、本発明は個体内の骨の疾患の状態を診断する方法に関し、
その方法は、該個体から採取したサンプル内の骨芽細胞性幹細胞因子の活性を測
定する工程を含む。本技術を用いて診断することができる代表的な骨の疾患とし
ては、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、転位性癌および高カルシウム血症が挙げ
られる。
その方法は、該個体から採取したサンプル内の骨芽細胞性幹細胞因子の活性を測
定する工程を含む。本技術を用いて診断することができる代表的な骨の疾患とし
ては、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、転位性癌および高カルシウム血症が挙げ
られる。
【0035】 本発明のひとつの実施態様においては、幹細胞因子アッセイの診断的使用を骨
の疾患の診断に採用することができる。このアッセイは、血清に基づく安価な試
験である。
の疾患の診断に採用することができる。このアッセイは、血清に基づく安価な試
験である。
【0036】 当業者は、抗体の免疫治療能力が幹細胞因子の活性を阻害することも認識する
ことができるはずである。そのような免疫治療は、短期間の制御が重要な腫瘍性
高カルシウム血症に有効であり、現在使用されているものよりもかなり毒性が低
い。現在使用されているものとしては、例えば、(1)硝酸ガリウム、(2)多
数のビスホスホネート誘導体、(3)抗生物質阻害剤であるハービマイシンおよ
びプリカマイシン(プリカマイシンはミスラマイシンとしてもとしても知られて
おり、重篤な毒性のために使用が中止されている)、(4)骨結合性抗生物質、
主にテトラサイクリン類など、(5)タンパク質分解酵素阻害剤、(6)エスト
ロゲンのアナログまたは阻害剤(ラロキシフェン、タモキシフェン)、ならびに
(7)チロシンキナーゼの阻害剤(ゲニスティン、ハービマイシン)などがある
。
ことができるはずである。そのような免疫治療は、短期間の制御が重要な腫瘍性
高カルシウム血症に有効であり、現在使用されているものよりもかなり毒性が低
い。現在使用されているものとしては、例えば、(1)硝酸ガリウム、(2)多
数のビスホスホネート誘導体、(3)抗生物質阻害剤であるハービマイシンおよ
びプリカマイシン(プリカマイシンはミスラマイシンとしてもとしても知られて
おり、重篤な毒性のために使用が中止されている)、(4)骨結合性抗生物質、
主にテトラサイクリン類など、(5)タンパク質分解酵素阻害剤、(6)エスト
ロゲンのアナログまたは阻害剤(ラロキシフェン、タモキシフェン)、ならびに
(7)チロシンキナーゼの阻害剤(ゲニスティン、ハービマイシン)などがある
。
【0037】 本発明の別の態様において、ペプチド阻害剤を用いて正常幹細胞因子のリガン
ド結合を攻撃することを含む。これは、欠損を有する組換え幹細胞因子(ヒトの
ものである必要はない)を加えて、レセプターに結合はするが活性化はしない形
態にすることを含む。好ましくはこのペプチド阻害剤は、300〜500kDaの範囲で ある。別の方法としては、より小さなペプチドまたは非ペプチド分子である低分
子量阻害剤を用いて上述の系を攻撃することができる。この方法には、詳細な分
子分析を行うために長鎖のSCFを結晶化することを含む。
ド結合を攻撃することを含む。これは、欠損を有する組換え幹細胞因子(ヒトの
ものである必要はない)を加えて、レセプターに結合はするが活性化はしない形
態にすることを含む。好ましくはこのペプチド阻害剤は、300〜500kDaの範囲で ある。別の方法としては、より小さなペプチドまたは非ペプチド分子である低分
子量阻害剤を用いて上述の系を攻撃することができる。この方法には、詳細な分
子分析を行うために長鎖のSCFを結晶化することを含む。
【0038】 以下の実施例は本発明の種々の実施態様を説明する目的で記載したものであり
、いかなる意味においても、本発明を制限するものではない。
、いかなる意味においても、本発明を制限するものではない。
【0039】 実施例1 c-kitリガンドの保存された配列に対する抗体の開発 図1および2においては、ヒトの幹細胞因子に対するモノクローナル抗体7H6 (アムジェン(Amgen)社、カリフォルニア州サウザンド・オークス)を使用し た。図4のウェスタンブロット分析8にはウサギポリクローナル抗ヒト幹細胞因
子(医学および生物学研究所(Medical and Biological Laboratories)、日本 、名古屋)を使用した。
子(医学および生物学研究所(Medical and Biological Laboratories)、日本 、名古屋)を使用した。
【0040】 分子の切断(可溶性)型から単離し、C末端幹細胞因子の親水性、抗原性部位
に対する抗体を作成した8。分岐したリジンコア上の多抗原ペプチドとして、10
個のアミノ酸からなるペプチド、EEDNEISMLQ(SEQ ID No.:1)(これ
はまた、ヒト幹細胞因子のC末端由来の9残基でもある)を合成した(リサーチ
・ジェネティクス(Research Genetics)社、アラバマ州ハンツヴィル)。フロ インドアジュバントを用いてウサギ抗体を産生させ、1:10,000希釈してELISA 反応を行うことにより抗血清を選択し、ウェスタンブロットによってSCFの分子 量約45kDaのものを認識した。生きたMG63細胞を用いた抗原阻害反応によって、 このエピトープがこれらの細胞上に露出していることが示された。
に対する抗体を作成した8。分岐したリジンコア上の多抗原ペプチドとして、10
個のアミノ酸からなるペプチド、EEDNEISMLQ(SEQ ID No.:1)(これ
はまた、ヒト幹細胞因子のC末端由来の9残基でもある)を合成した(リサーチ
・ジェネティクス(Research Genetics)社、アラバマ州ハンツヴィル)。フロ インドアジュバントを用いてウサギ抗体を産生させ、1:10,000希釈してELISA 反応を行うことにより抗血清を選択し、ウェスタンブロットによってSCFの分子 量約45kDaのものを認識した。生きたMG63細胞を用いた抗原阻害反応によって、 このエピトープがこれらの細胞上に露出していることが示された。
【0041】 イヌ(ジェンバンク(GenBank)受け入れ番号S53329)、ニワトリ(SC)、ヒ ト(M59964)、ウズラ(U43078、U43079)およびマウス(M57647)由来の幹細胞
因子のアミノ酸配列を集積法により整列した。親水性、抗原性を有する10個のア
ミノ酸からなるペプチド、EEDNEISMLQ(SEQ ID No.:1)(これはまた
、ヒト幹細胞因子のC末端由来の9残基でもある)を抗体産生に関して選択した
。この領域は、鳥類において最初の3個のアミノ酸残基がE/QまたはD/E置
換していることを除けば、5つの種において一致していた。分子内の位置に基づ
いて選択したところ、この領域は、幹細胞因子の可溶型および膜型のいずれにも
存在し、非常に高いカイト−ドゥーリトル(Kyte-Doolittle)親水性値、ジェイ
ムソン−ウルフ(Jameson-Wolf)抗原性指数、およびエミニ(Emini)表面確率 を有する最も保存された領域である。さらに、この領域は、折りたたみのあるβ
−両親媒性領域の中央に存在し、タンパク質−タンパク質相互作用を含む表面領
域を選択するように設計された特徴の組合せを有する。分析にはレーザージーン
(Lasergene)バイオ−コンピューティングソフトウェア(DNASTAR社、ウィスコ
ンシン州マディソン)を使用した。
因子のアミノ酸配列を集積法により整列した。親水性、抗原性を有する10個のア
ミノ酸からなるペプチド、EEDNEISMLQ(SEQ ID No.:1)(これはまた
、ヒト幹細胞因子のC末端由来の9残基でもある)を抗体産生に関して選択した
。この領域は、鳥類において最初の3個のアミノ酸残基がE/QまたはD/E置
換していることを除けば、5つの種において一致していた。分子内の位置に基づ
いて選択したところ、この領域は、幹細胞因子の可溶型および膜型のいずれにも
存在し、非常に高いカイト−ドゥーリトル(Kyte-Doolittle)親水性値、ジェイ
ムソン−ウルフ(Jameson-Wolf)抗原性指数、およびエミニ(Emini)表面確率 を有する最も保存された領域である。さらに、この領域は、折りたたみのあるβ
−両親媒性領域の中央に存在し、タンパク質−タンパク質相互作用を含む表面領
域を選択するように設計された特徴の組合せを有する。分析にはレーザージーン
(Lasergene)バイオ−コンピューティングソフトウェア(DNASTAR社、ウィスコ
ンシン州マディソン)を使用した。
【0042】 選択した領域を分岐したリジンコア上の多抗原ペプチドとして合成し(リサー
チ・ジェネティクス(Research Genetics)社、アラバマ州ハンツヴィル)、初 回および2回目のブースター投与にはフロインドアジュバントを用い、2匹のウ
サギに抗体を産生させ、酵素結合免疫アッセイのタイターおよびウェスタンブロ
ット分析の結果に基づいて、さらなる使用のために1匹を選択した。
チ・ジェネティクス(Research Genetics)社、アラバマ州ハンツヴィル)、初 回および2回目のブースター投与にはフロインドアジュバントを用い、2匹のウ
サギに抗体を産生させ、酵素結合免疫アッセイのタイターおよびウェスタンブロ
ット分析の結果に基づいて、さらなる使用のために1匹を選択した。
【0043】 実施例2 オリゴヌクレオチドの合成 幹細胞因子のmRNAに対するcDNAプローブは、逆転写、ならびにMG63由来のRNA およびプライマーGCCTTTCCTTATGAAGAAGAC(SEQ ID No.:2
)、TGCTGTCATTCCTAAGGGA(SEQ ID No.:3)を用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応によって作成し、転写開始位置を基準として−10番〜633番に相 当する633bpのセグメントを産生し(ジェンバンク(Genbank)受け入れ番号M599
64)、制限酵素を用いた切断によって産生物の特性を確認した。第一プライマー
配列およびその相補体(CGGAAAGGAATACTTCTTCTG((SEQ
ID No.:4))を用いてセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびアン
チセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを作出した。
)、TGCTGTCATTCCTAAGGGA(SEQ ID No.:3)を用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応によって作成し、転写開始位置を基準として−10番〜633番に相 当する633bpのセグメントを産生し(ジェンバンク(Genbank)受け入れ番号M599
64)、制限酵素を用いた切断によって産生物の特性を確認した。第一プライマー
配列およびその相補体(CGGAAAGGAATACTTCTTCTG((SEQ
ID No.:4))を用いてセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびアン
チセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを作出した。
【0044】 実施例3 ノーザンブロット分析 ノーザン分析については、フェノールGITC抽出によってRNAを単離した。5μ gのアリコートをアガロース上で分離し、ハイブリダイゼーション用にニトロセ
ルロースに移した。ランダムプライミングによって32Pでラベルしたヒト幹細
胞因子のcDNAの633bpのセグメントを変性し、42℃、一晩かけてブロットにハイ ブリダイズした18。膜は、300mMのNaCl、50mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0中
室温(25℃)で、15分間洗浄し、さらに、30mMのNaCl、5mMのクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0中65℃で、15分間、2回洗浄し、オートラジオグラフィーを撮影した 。
ルロースに移した。ランダムプライミングによって32Pでラベルしたヒト幹細
胞因子のcDNAの633bpのセグメントを変性し、42℃、一晩かけてブロットにハイ ブリダイズした18。膜は、300mMのNaCl、50mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0中
室温(25℃)で、15分間洗浄し、さらに、30mMのNaCl、5mMのクエン酸ナトリウ
ム、pH7.0中65℃で、15分間、2回洗浄し、オートラジオグラフィーを撮影した 。
【0045】 実施例4 細胞培養および酵素アッセイ ボランティアによる成分献血からヒトのマクロファージを単離して、表面結合
(1時間)し、99%以上が非特異的エラスターゼ陽性である細胞を選択した19 。各アッセイには、一回のマクロファージ調製で得られたマクロファージを使用
した。ヒトの骨芽細胞は、外科手術の不要物から得た骨髄から産生し20、10%
の熱不活化ウシ胎児血清および1μMのコルシトールを含むイーグル最小基本培
地中で一面に広がるまで増殖させ、ミネラルを含む細胞集団が現れたときに(約
3週間)使用した。平均±標準偏差、n=4。記載に従ってTRAPを測定した21 。アンチセンスアッセイの場合を除いて培地は3日間隔で交換し、アンチセンス
アッセイの場合には2日毎に交換した。定量アッセイにおいては、540nmにおけ る吸光度によってTRAPを測定した。
(1時間)し、99%以上が非特異的エラスターゼ陽性である細胞を選択した19 。各アッセイには、一回のマクロファージ調製で得られたマクロファージを使用
した。ヒトの骨芽細胞は、外科手術の不要物から得た骨髄から産生し20、10%
の熱不活化ウシ胎児血清および1μMのコルシトールを含むイーグル最小基本培
地中で一面に広がるまで増殖させ、ミネラルを含む細胞集団が現れたときに(約
3週間)使用した。平均±標準偏差、n=4。記載に従ってTRAPを測定した21 。アンチセンスアッセイの場合を除いて培地は3日間隔で交換し、アンチセンス
アッセイの場合には2日毎に交換した。定量アッセイにおいては、540nmにおけ る吸光度によってTRAPを測定した。
【0046】 実施例5 合成骨芽細胞の表面上での幹細胞因子の発現 幹細胞因子は、合成骨芽細胞の非マトリックス表面上において多量に発現され
るが、休止骨芽細胞上では幹細胞因子の発現は検出されなかった(図1)。骨芽
細胞の活性化との関連がこのサイトカインに重要な役割を持っていることが示唆
されたため、正常な骨についても調べた(図2)。予想していたように、骨の内
側に並んだ細胞には活性な骨芽細胞はごくわずかしかなかったが、パターンは同
様であった。
るが、休止骨芽細胞上では幹細胞因子の発現は検出されなかった(図1)。骨芽
細胞の活性化との関連がこのサイトカインに重要な役割を持っていることが示唆
されたため、正常な骨についても調べた(図2)。予想していたように、骨の内
側に並んだ細胞には活性な骨芽細胞はごくわずかしかなかったが、パターンは同
様であった。
【0047】 ウェスタンブロット分析により、骨の内側に並んだ細胞に関連した幹細胞因子
は、小型のものも存在するが、大型のものが大多数を占めていたことが示された
(図3)。骨形成骨芽細胞により幹細胞因子の産生が行われることから、この因
子は骨の入れ替わりに重要であることが示唆された。副甲状腺機能亢進症によっ
て骨の入れ替わりが加速される場合には、副作用としてマスト細胞の形成が起こ
り得る。
は、小型のものも存在するが、大型のものが大多数を占めていたことが示された
(図3)。骨形成骨芽細胞により幹細胞因子の産生が行われることから、この因
子は骨の入れ替わりに重要であることが示唆された。副甲状腺機能亢進症によっ
て骨の入れ替わりが加速される場合には、副作用としてマスト細胞の形成が起こ
り得る。
【0048】 本発明から、骨芽細胞表面の幹細胞因子は、破骨細胞前駆体の分化の末期に作
用していること、ならびにこのことが骨の形成に関係した主要過程であることが
示された。前破骨細胞はc-kit9を提供し、イン・ビトロ(in vitro)において 破骨細胞の分化を支持している骨芽細胞様細胞は幹細胞因子を産生する10こと
が知られている。さらに、マスト細胞を持たず、骨化石症であるmi/miマウスは 、c-kitを産生するW遺伝子座に欠損を有している11。イン・ビトロ(in vitr
o)において、個数のわかっているヒト血液単球2および骨芽細胞用ストローマ 細胞12を用い、調整された条件下での幹細胞因子の骨芽細胞性制御が示された
。
用していること、ならびにこのことが骨の形成に関係した主要過程であることが
示された。前破骨細胞はc-kit9を提供し、イン・ビトロ(in vitro)において 破骨細胞の分化を支持している骨芽細胞様細胞は幹細胞因子を産生する10こと
が知られている。さらに、マスト細胞を持たず、骨化石症であるmi/miマウスは 、c-kitを産生するW遺伝子座に欠損を有している11。イン・ビトロ(in vitr
o)において、個数のわかっているヒト血液単球2および骨芽細胞用ストローマ 細胞12を用い、調整された条件下での幹細胞因子の骨芽細胞性制御が示された
。
【0049】 実施例6 骨芽細胞様細胞によるSCFの産生 系の特性を明らかにする目的で、イン・ビトロ(in vitro)において、ヒトお
よびラットの骨芽細胞様細胞による幹細胞因子の産生をまず確認した。SaOS-2ヒ
ト骨肉腫細胞において見られるように、いくつかの場合においては、幹細胞因子
の産生は副甲状腺ホルモン応答性であったが、正常な骨の分化に必要なステロイ
ドである1,25−ジヒドロキシビタミンDには応答しなかった(図4、5)。破
骨細胞および破骨細胞前駆体は検出可能な量の幹細胞因子を産生しなかった(図
は示していない)。イン・ビトロ(in vitro)における形質転換されていないヒ
トの骨芽細胞による幹細胞因子の産生および副甲状腺ホルモンの活性化について
も確認し(図6)、イン・サイチュー(in situ)での所見のより調製された表 示が可能になった(図1、2)。
よびラットの骨芽細胞様細胞による幹細胞因子の産生をまず確認した。SaOS-2ヒ
ト骨肉腫細胞において見られるように、いくつかの場合においては、幹細胞因子
の産生は副甲状腺ホルモン応答性であったが、正常な骨の分化に必要なステロイ
ドである1,25−ジヒドロキシビタミンDには応答しなかった(図4、5)。破
骨細胞および破骨細胞前駆体は検出可能な量の幹細胞因子を産生しなかった(図
は示していない)。イン・ビトロ(in vitro)における形質転換されていないヒ
トの骨芽細胞による幹細胞因子の産生および副甲状腺ホルモンの活性化について
も確認し(図6)、イン・サイチュー(in situ)での所見のより調製された表 示が可能になった(図1、2)。
【0050】 継代を10回行ったラットの骨芽細胞様細胞系UMR-106についてのELISA(図5)
から、ビタミンDは幹細胞因子の産生に負の影響を与えることが示唆された。逆
に、PTHは幹細胞因子の発現を高レベルにするようである。ELISAについては、5
μgの標的細胞タンパク質を用いてマイクロタイタープレートのウェルを被覆し
、アルカリホスファターゼ結合した抗ウサギ血清(バイオ−ラド(Bio-Rad)社 、カリフォルニア州リッチモンド))およびp−ニトロフェノール基質を用い、
550nmにおける吸光度について、結合した抗ヒト幹細胞因子を測定した。等容量 のブランク溶液を対照として使用した。これらのアッセイは、96穴プレートにお
いて四重試験を行った。これらの結果から、非ヒト細胞系であるUMR-106を含む 骨芽細胞様細胞系における幹細胞因子の産生は、正常な骨芽細胞と同様であるが
、ホルモンに対する応答が異なることが示唆された。
から、ビタミンDは幹細胞因子の産生に負の影響を与えることが示唆された。逆
に、PTHは幹細胞因子の発現を高レベルにするようである。ELISAについては、5
μgの標的細胞タンパク質を用いてマイクロタイタープレートのウェルを被覆し
、アルカリホスファターゼ結合した抗ウサギ血清(バイオ−ラド(Bio-Rad)社 、カリフォルニア州リッチモンド))およびp−ニトロフェノール基質を用い、
550nmにおける吸光度について、結合した抗ヒト幹細胞因子を測定した。等容量 のブランク溶液を対照として使用した。これらのアッセイは、96穴プレートにお
いて四重試験を行った。これらの結果から、非ヒト細胞系であるUMR-106を含む 骨芽細胞様細胞系における幹細胞因子の産生は、正常な骨芽細胞と同様であるが
、ホルモンに対する応答が異なることが示唆された。
【0051】 実施例7 生細胞内のSCFの免疫蛍光検出 生きたMG63細胞を染色によって観察するために(図14)、ノーザン分析または
ウェスタン分析と同様に細胞を調製した。次に、細胞を6穴プレートの10cm2の
ウェルに移し、25mmのカバーガラス上で増殖させた。免疫蛍光によってタンパク
質の局在を調べるために、透過可能な固定化した細胞を使用した。幹細胞因子抗
体をフルオレセインでラベルした。1:100希釈した抗体、抗体+過量の抗原ま たは免疫前の血清を生細胞と共に30分間インキュベートした。次に、細胞を軽く
固定し、エピ蛍光顕微鏡によって分析するために、フルオレセインをコンジュゲ
ートしたヤギ抗ウサギ血清を用いて結合した抗体を可視化した。MG63細胞内の幹
細胞因子の蛍光検出は図14に示す。
ウェスタン分析と同様に細胞を調製した。次に、細胞を6穴プレートの10cm2の
ウェルに移し、25mmのカバーガラス上で増殖させた。免疫蛍光によってタンパク
質の局在を調べるために、透過可能な固定化した細胞を使用した。幹細胞因子抗
体をフルオレセインでラベルした。1:100希釈した抗体、抗体+過量の抗原ま たは免疫前の血清を生細胞と共に30分間インキュベートした。次に、細胞を軽く
固定し、エピ蛍光顕微鏡によって分析するために、フルオレセインをコンジュゲ
ートしたヤギ抗ウサギ血清を用いて結合した抗体を可視化した。MG63細胞内の幹
細胞因子の蛍光検出は図14に示す。
【0052】 実施例8 SCFの抗体による阻止 1週間の共培養によってヒトの単球を融合することにより、骨芽細胞様細胞は
破骨細胞マーカーである酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)の産生を誘導
するが、これは、幹細胞因子に抗体を添加することにより、濃度依存的に阻止さ
れる(図7および8)。使用した抗体は、膜結合型に特異的なタンパク質の保存
領域に対するものであった。抗体と生きたMG63細胞の表面との反応から(この反
応は、抗体と抗原との事前のインキュベーションによって阻害される)、このエ
ピトープが調べた細胞に露出していることが示された(図14)。
破骨細胞マーカーである酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)の産生を誘導
するが、これは、幹細胞因子に抗体を添加することにより、濃度依存的に阻止さ
れる(図7および8)。使用した抗体は、膜結合型に特異的なタンパク質の保存
領域に対するものであった。抗体と生きたMG63細胞の表面との反応から(この反
応は、抗体と抗原との事前のインキュベーションによって阻害される)、このエ
ピトープが調べた細胞に露出していることが示された(図14)。
【0053】 これらの実験においては、一種類のMG63細胞の調製および一種類のマクロファ
ージの調製を使用した。培養は、50mg/cmの失活した骨を加え、1枚の24穴プレ ート上の2cm2のウェル内で行った。MG63の共培養をしないマクロファージの培
養においては、増殖3日目に0.5μg/mlの組換えCSF-1(ジェンザイム(Genzym
e)社、マサチューセッツ州ケンブリッジ)を添加した(ストローマ細胞不在の 場合には、細胞の生育に必要)。マクロファージと共培養したMG63細胞は43代継
代し、細胞密度は継代0日目には104個/cm2であり、14日目にはほぼ一面に広
がった。幹細胞因子の検出に使用した抗体は、上述した10個のアミノ酸からなる
ペプチド、EEDNEISMLQ(SEQ ID NO.:1)であった。
ージの調製を使用した。培養は、50mg/cmの失活した骨を加え、1枚の24穴プレ ート上の2cm2のウェル内で行った。MG63の共培養をしないマクロファージの培
養においては、増殖3日目に0.5μg/mlの組換えCSF-1(ジェンザイム(Genzym
e)社、マサチューセッツ州ケンブリッジ)を添加した(ストローマ細胞不在の 場合には、細胞の生育に必要)。マクロファージと共培養したMG63細胞は43代継
代し、細胞密度は継代0日目には104個/cm2であり、14日目にはほぼ一面に広
がった。幹細胞因子の検出に使用した抗体は、上述した10個のアミノ酸からなる
ペプチド、EEDNEISMLQ(SEQ ID NO.:1)であった。
【0054】 破骨細胞の形成によるTRAPの量およびラベルした骨の基質の分解を測定するこ
とにより、抗体を阻止する効果についてさらに特徴を明らかにした。抗体量に対
応して、破骨細胞特異的酵素(TRAP)または骨の分解は完全に阻害され、これは
、副甲状腺ホルモン応答性(SaOS2)細胞または非応答性の(MG63)骨芽細胞様 支持細胞を用いた共培養における結果と同様であった(図9〜11)。予め免疫し
た血清は全く効果がなく、支持細胞の密度または外形には影響しなかった。骨の
再生は複雑であり、多くの制御されたメカニズムを含んでいるが、図7〜13に示
す阻害データから、細胞表面における幹細胞因子の制御された発現が骨の合成お
よび分解の調和の根幹であることが示唆される。
とにより、抗体を阻止する効果についてさらに特徴を明らかにした。抗体量に対
応して、破骨細胞特異的酵素(TRAP)または骨の分解は完全に阻害され、これは
、副甲状腺ホルモン応答性(SaOS2)細胞または非応答性の(MG63)骨芽細胞様 支持細胞を用いた共培養における結果と同様であった(図9〜11)。予め免疫し
た血清は全く効果がなく、支持細胞の密度または外形には影響しなかった。骨の
再生は複雑であり、多くの制御されたメカニズムを含んでいるが、図7〜13に示
す阻害データから、細胞表面における幹細胞因子の制御された発現が骨の合成お
よび分解の調和の根幹であることが示唆される。
【0055】 実施例9 アンチセンスオリゴヌクレオチドによるSCFの発現の阻害 アンチセンスオリゴヌクレオチドを独立した方法に使用し、幹細胞因子の発現
を減少させた。破骨細胞前駆体と支持細胞との共培養に、幹細胞因子転写開始部
位に集中しているアンチセンスまたはセンス(制御)ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドを添加した。培地は、オリゴヌクレオチドと併せて2日毎に交換し
た。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、0.5μMで破骨細胞活性またはTRAPの 産生を20〜40%減少させ、1.5μMでほぼ完全に抑制した(図12および13)。こ れらの結果から、骨芽細胞によって産生される幹細胞因子は破骨細胞の分化の末
期に必要であることが示唆される。SCF cDNAのPCR増幅にアンチセンス配列を使
用することにより、追加の制御として、幹細胞因子翻訳開始部位に結合している
オリゴヌクレオチドが確認された。
を減少させた。破骨細胞前駆体と支持細胞との共培養に、幹細胞因子転写開始部
位に集中しているアンチセンスまたはセンス(制御)ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドを添加した。培地は、オリゴヌクレオチドと併せて2日毎に交換し
た。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、0.5μMで破骨細胞活性またはTRAPの 産生を20〜40%減少させ、1.5μMでほぼ完全に抑制した(図12および13)。こ れらの結果から、骨芽細胞によって産生される幹細胞因子は破骨細胞の分化の末
期に必要であることが示唆される。SCF cDNAのPCR増幅にアンチセンス配列を使
用することにより、追加の制御として、幹細胞因子翻訳開始部位に結合している
オリゴヌクレオチドが確認された。
【0056】 実施例10 安定なトランスフェクションによるMG63細胞中での標的発現の排除 オリゴヌクレオチド法には、阻害が不完全であることおよび毒性があることを
含む多数の制限がある。より確実な方法は、プラスミドを用いてMG63細胞にトラ
ンスフェクトし、様々な膜幹細胞因子を発現する細胞を産生することである。幹
細胞因子のセンスRNAおよびアンチセンスRNAを発現するプラスミドを構成し、MG
63細胞にこれらを安定的にトランスフェクトし、ウェスタンブロット分析を行っ
て、得られた細胞系中での幹細胞因子の様々な発現レベルを示した(図17)。幹
細胞因子陽性細胞と共培養することによって形成した破骨細胞および幹細胞因子
陰性細胞と共培養することによって形成した破骨細胞のアッセイによって得られ
た結果は、図12および13に示されている結果と同様であった。
含む多数の制限がある。より確実な方法は、プラスミドを用いてMG63細胞にトラ
ンスフェクトし、様々な膜幹細胞因子を発現する細胞を産生することである。幹
細胞因子のセンスRNAおよびアンチセンスRNAを発現するプラスミドを構成し、MG
63細胞にこれらを安定的にトランスフェクトし、ウェスタンブロット分析を行っ
て、得られた細胞系中での幹細胞因子の様々な発現レベルを示した(図17)。幹
細胞因子陽性細胞と共培養することによって形成した破骨細胞および幹細胞因子
陰性細胞と共培養することによって形成した破骨細胞のアッセイによって得られ
た結果は、図12および13に示されている結果と同様であった。
【0057】 CMVプロモーターによって稼動化されるヒトc-fmsリガンドの翻訳開始部位に対
するアンチセンスを含むpCDNA3を用いてMG63細胞を安定的にトランスフェクトす
ることができる。EcoR1部位およびXba1部位においてアンチセンス方向である真 核細胞性発現ベクターpCDNA3(インヴィトロジェン(Invitrogen)社、カリフォ
ルニア州サンディエゴ)内に633塩基対(bp)の部分c-fmsリガンドcDNAを組み込
んだ。塩基配列決定法によってこの構成体を確認した。CMVの直接の初期遺伝子 に対するエンハンサー−プロモーターおよびポリアデニル化/転写終了部位をベ
クターの構成要素として含んでいることから、RNAの安定性、ならびに真核細胞 およびエピソーム複製用のSV40 oriの選択におけるネオマイシン耐性が向上した
。0.5μgのベクターおよび3:1に過量に電荷を帯びた陽イオン性リピドを用 い、陽イオン性リピド法(Tfx 20、プロメガ(Promega)社、ウィスコンシン州 マディソン)によって空のベクターおよびアンチセンス幹細胞因子を有するベク
ターをトランスフェクトした。60%広がっているMG63細胞を37℃、1時間インキ
ュベーションし、続いて、100μg/mlのG418(ネオマイシン)中で10日間選択 を行った。
するアンチセンスを含むpCDNA3を用いてMG63細胞を安定的にトランスフェクトす
ることができる。EcoR1部位およびXba1部位においてアンチセンス方向である真 核細胞性発現ベクターpCDNA3(インヴィトロジェン(Invitrogen)社、カリフォ
ルニア州サンディエゴ)内に633塩基対(bp)の部分c-fmsリガンドcDNAを組み込
んだ。塩基配列決定法によってこの構成体を確認した。CMVの直接の初期遺伝子 に対するエンハンサー−プロモーターおよびポリアデニル化/転写終了部位をベ
クターの構成要素として含んでいることから、RNAの安定性、ならびに真核細胞 およびエピソーム複製用のSV40 oriの選択におけるネオマイシン耐性が向上した
。0.5μgのベクターおよび3:1に過量に電荷を帯びた陽イオン性リピドを用 い、陽イオン性リピド法(Tfx 20、プロメガ(Promega)社、ウィスコンシン州 マディソン)によって空のベクターおよびアンチセンス幹細胞因子を有するベク
ターをトランスフェクトした。60%広がっているMG63細胞を37℃、1時間インキ
ュベーションし、続いて、100μg/mlのG418(ネオマイシン)中で10日間選択 を行った。
【0058】 以下の文献を本明細書中に引用しておく。
【0059】
【表1】 本明細書中に掲載している特許または文献は、本発明の属する分野の当業者の
レベルを示すものである。これらの特許および文献を参考として本明細書中に取
り入れ、同様に、特別に、個々に示している各文献も参考として取り入れておく
。 当業者であれば、容易に本発明を十分に適合させて実施し、示されている目
的および利益並びに固有の利益を得ることができる。本明細書に記載している方
法、手段、処理、分子および特定の化合物を用いた本実施例は、好ましい実施態
様を代表して示したものであって、例示であり、本発明の範ちゅうを制限するた
めのものではない。当業者においては、それらの変更およびその他の用途が可能
であり、それらも請求項によって定められる本発明の範囲内に包含される。
レベルを示すものである。これらの特許および文献を参考として本明細書中に取
り入れ、同様に、特別に、個々に示している各文献も参考として取り入れておく
。 当業者であれば、容易に本発明を十分に適合させて実施し、示されている目
的および利益並びに固有の利益を得ることができる。本明細書に記載している方
法、手段、処理、分子および特定の化合物を用いた本実施例は、好ましい実施態
様を代表して示したものであって、例示であり、本発明の範ちゅうを制限するた
めのものではない。当業者においては、それらの変更およびその他の用途が可能
であり、それらも請求項によって定められる本発明の範囲内に包含される。
【配列表】
【図1】 骨のバイオプシー切片内の幹細胞因子
【図2】 骨のバイオプシー切片内の幹細胞因子
【図3】 骨柱細胞および骨髄細胞のウェスタンブロット分析
【図4】 示されているホルモンを用いて行った5日間の前処理中のSaOS2ヒト骨肉腫細 胞のウェスタンブロット分析
【図5】 UMR-106細胞のELISAアッセイ
【図6】 単離されたヒトの骨芽細胞中の幹細胞因子のノーザンブロット分析
【図7】 2cm2の組織培養中のヒトのマクロファージ
【図8】 1:500および1:100にそれぞれ希釈した抗幹細胞因子抗体
【図9】 MG63細胞を用いて14日間共培養したヒトのマクロファージ内におけるTRAP活性
に対する幹細胞因子抗体の影響
に対する幹細胞因子抗体の影響
【図10】 SaOS2細胞を用いて14日間共培養したヒトのマクロファージ内におけるTRAP活 性に対する幹細胞因子抗体の影響
【図11】 ヒトのマクロファージならびにMG63細胞もしくはSaOS2細胞の14日間の共培養 によって形成された破骨細胞による骨の分解、また、幹細胞因子に対する抗体の
影響
影響
【図12】 TRAPの形成に対する幹細胞因子アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドの影響およびセンスオリゴヌクレオチドの制御
オチドの影響およびセンスオリゴヌクレオチドの制御
【図13】 骨の分解に対する幹細胞因子アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドの影響およびセンスオリゴヌクレオチドの制御
チドの影響およびセンスオリゴヌクレオチドの制御
【図14】 生きているMG63細胞の抗体染色
【図15】 センス/アンチセンス処理を行った幹細胞因子産生についてのウェスタンブロ
ット分析
ット分析
【図16】 ネオマイシンアナログG418中において増殖するトランスフェクトしたMG63細胞
【図17】 MG63細胞の幹細胞因子の発現に関するウェスタンブロット分析
【図18】 いくつかのタンパク質のC末端配列の比較
【図19】 ヒトの幹細胞因子タンパク質の分析
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 48/00 A61P 3/14 4H045 A61P 3/14 5/18 5/18 19/08 19/08 19/10 19/10 35/04 35/04 43/00 43/00 C07H 21/04 B C07H 21/04 C07K 16/00 C07K 16/00 A61K 37/02 C12N 15/09 C12N 15/00 A (72)発明者 ドン,サイ−サイ アメリカ合衆国 アラバマ州 35014 ア ルパイン ロブロリー トレイス 231 (72)発明者 ジュリアン,ブルース エイ アメリカ合衆国 アラバマ州 35216 ヴ ェスタヴィア ヒルズ パーラメント レ イン 1280 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA41 BA80 DA02 EA04 GA11 HA17 4C057 BB05 DD03 MM04 4C084 AA02 AA13 AA17 BA03 BA44 CA17 CA56 DB70 NA14 ZA512 ZA972 ZB262 ZC032 ZC612 4C085 AA13 CC03 CC04 CC21 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA51 ZA97 ZB26 ZC03 ZC61 4H045 AA11 CA40 DA75 DA76 EA20 FA72
Claims (24)
- 【請求項1】 骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/または活性に対する阻
害剤。 - 【請求項2】 前記阻害剤が抗体であることを特徴とする請求項1記載の阻
害剤。 - 【請求項3】 前記阻害剤が骨芽細胞性幹細胞の膜結合型を標的とすること
を特徴とする請求項1記載の阻害剤。 - 【請求項4】 前記抗体が幹細胞因子タンパク質のC末端を標的とすること
を特徴とする請求項2記載の阻害剤。 - 【請求項5】 前記C末端が10個のアミノ酸からなるペプチド、EEDNE
ISMLQ(SEQ ID No.:1)を含むことを特徴とする請求項4記載の阻害剤。 - 【請求項6】 前記抗体が非ヒト由来のものであることを特徴とする請求項
2記載の阻害剤。 - 【請求項7】 前記阻害剤が幹細胞因子の発現を標的とするアンチセンスオ
リゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載の阻害剤。 - 【請求項8】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが幹細胞因子の転写開
始部位を標的とすることを特徴とする請求項7記載の阻害剤。 - 【請求項9】 要治療患者の破骨細胞の活性を制御する方法であって、 該患者の体内において骨芽細胞性幹細胞因子の結合および/または活性を阻害
する、 工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項10】 前記阻害剤が抗体であることを特徴とする請求項9記載の
方法。 - 【請求項11】 前記阻害剤が骨芽細胞性幹細胞の膜結合型を標的とするこ
とを特徴とする請求項9記載の方法。 - 【請求項12】 前記抗体が幹細胞因子タンパク質のC末端を標的とするこ
とを特徴とする請求項10記載の方法。 - 【請求項13】 前記C末端が10個のアミノ酸からなるペプチド、EEDN
EISMLQ(SEQ ID No.:1)を含むことを特徴とする請求項12記載の方法。 - 【請求項14】 前記抗体が非ヒト由来のものであることを特徴とする請求
項10記載の方法。 - 【請求項15】 前記阻害剤が幹細胞因子の発現を標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項10記載の方法。 - 【請求項16】 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが幹細胞因子の転写
開始部位を標的とすることを特徴とする請求項15記載の方法。 - 【請求項17】 請求項2記載の抗体および薬剤学的に許容されるキャリヤ
を含むことを特徴とする薬剤学的組成物。 - 【請求項18】 請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬
剤学的に許容されるキャリヤを含むことを特徴とする薬剤学的組成物。 - 【請求項19】 要治療動物に対して、骨の消失を含む病理生理学的状態を
治療する方法であって、 請求項17記載の薬剤学的組成物を該動物に投与する、 工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項20】 要治療動物に対して、骨の消失を含む病理生理学的状態を
治療する方法であって、 請求項18記載の薬剤学的組成物を該動物に投与する、 工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項21】 前記病理生理学的状態が、骨粗鬆症、骨癌および腫瘍性高
カルシウム血症からなる群より選択されることを特徴とする請求項19記載の方法
。 - 【請求項22】 前記病理生理学的状態が、骨粗鬆症、骨癌および腫瘍性高
カルシウム血症からなる群より選択されることを特徴とする請求項20記載の方法
。 - 【請求項23】 骨の疾患を診断する方法であって、そのような診断を必要
とする患者から採取したサンプル内の骨芽細胞性幹細胞因子の活性を測定する工
程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項24】 前記骨の疾患が、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、転位性
癌および高カルシウム血症からなる群より選択されることを特徴とする請求項23
記載の方法。
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PCT/US1998/018812 WO1999012567A1 (en) | 1997-09-10 | 1998-09-10 | Regulation of osteoclast formation by inhibition of osteoblastic stem cell factor |
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