JP2003518929A - 基底側部選別シグナル、およびその阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アミノ酸配列、Ｘ₁ｈ₂Ｘ₃ｈ₄Ｌｐ₅ｐ₆〔式中、Ｘ₁は、極性アミノ酸残基またはアラニンを表し、ｈ₂は、いかなる疎水性アミノ酸残基をも表し、Ｘ₃は、いかなるアミノ酸残基をも表し、ｈ₄は、ロイシン及びイソロイシンを除くいかなる疎水性アミノ酸残基をも表し、Ｌは、ロイシン残基を表し、ｐ₅は、極性アミノ酸残基を表し、ｐ₆は、いかなるアミノ酸である〕からなる、モノロイシン依存性基底側部選別シグナル。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、細胞表面に固着した成長因子の、基底側部に対する標的化、および
細胞表面での露出の延長の原因となる新奇な決定因子の特定に関する。本発明は
、基底側部標的化の阻害による細胞表面発現を調整する分子にも関する。本発明
は、さらに、治療、美容および診断の状況設定において細胞表面発現を調整する
方法に関する。

【０００２】 より詳しくは、本発明は、さらに、幹細胞因子（ＳＣＦ）の用量および局在と
、組織中のｃ−ｋｉｔ発現細胞の量との相関関係を活用するための、組織におけ
るＳＣＦ提示の効率的な制御に関する。

【０００３】 幹細胞因子（肥満細胞増殖因子ＭＧＦ、ｋｉｔリガンドＫＬ、およびSteel因
子Ｓｌとしても知られる）は、ＣＳＦ−１、ＴＧＦαおよびＴＮＦαを包含する
、細胞表面固着成長因子のファミリーに属する。ＳＣＦは、ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝
子がコードしている受容体チロシンキナーゼに対するリガンドであって、単一特
異性受容体リガンド対を形成する。1990年に、いくつかの研究室によって特定か
つクローニングされている。

【０００４】 ＳＣＦは、Ｉ型膜貫通トポロジーを有する、交互にスプライシングされた二つ
の膜結合形態（Ｍ１およびＭ２）として発現されて、タンパク質分解による切断
の部位を有するＭ１形態のエキソンによって識別される。この部位は、Ｍ１膜結
合前駆体から可溶性成長因子を生成するのに用いられる。小胞体で合成された後
、ＳＣＦは、会合して、共有結合によらずに結合した二量体を形成し、細胞表面
で発現される。膜結合版であるＭ１およびＭ２は、ともに、ｃ−ｋｉｔ発現細胞
、たとえば骨髄由来肥満細胞、メラニン細胞、および始原生殖細胞との直接の細
胞−細胞接触を仲介することができる。二つの膜結合版のタンパク質分解過程は
、生物学的活性に富む可溶性ＳＣＦタンパク質を放出する。いくつかのサイトカ
インおよび／または成長因子、たとえばコロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）と同
様に、これらのリガンドは、膜結合生成物としても、タンパク質分解によって棄
却された生成物としても活性に富む。

【０００５】 ＳＣＦは、上皮細胞の基底側部の細胞表面に直接送達され、細胞内区画に集積
することはない（８）。その結果、ＳＣＦは、細胞外ドメインが、それぞれのス
プライシング形態に応じて、０．５（Ｍ１）〜５（Ｍ２）時間以内にタンパク質
分解によって廃棄されるまで、細胞表面に残留する（２０）。

【０００６】 ＳＣＦの一次配列は、シグナルペプチドと、後続する約１５０アミノ酸の球状
のｃ−ｋｉｔ結合ドメインとからなる。この球状のドメインと膜貫通セグメント
との間には、交互スプライシングによる可変長のリンカー領域が存在する。タン
パク質分解で切断された細胞外ドメインは、１６４アミノ酸からなる。

【０００７】 ＳＣＦは、いくつかの明確な生物学的機能を促進する。ＳＣＦは、造血および
非造血細胞系譜のｃ−ｋｉｔ発現細胞における増殖、生存、接着／移動および分
化を誘導することができる。

【０００８】 このタンパク質は、特にヒト、マウス、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、
ヒツジ、ブタ、ウズラ、ラットおよびサンショウウオの、いくつかの異なる器官
で既に特定されている。配列は、種間で充分に保存され、特に細胞質ドメインが
高度に保存されている。しかし、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）のようなそ
の他の膜貫通成長因子との相同性も、見出される。

【０００９】 ＳＣＦは、数多くの異なる型の細胞で発現され、その役割も数多い。色素沈着
に対するＳＣＦの影響が、最も良く知られ、その最初は、白斑の表現型の原因で
あるとして研究されている。ケラチノサイトにおけるＳＣＦの役割は、本出願人
らによって大規模に研究されている。

【００１０】 ＳＣＦは、タンパク質分解によって可溶性リガンドが生成される、ケラチノサ
イトの基底側部表面へと運ばれる。メラニン細胞の表面では、ＳＣＦは、in viv
oおよびin vitroでメラニン細胞の増殖、生存および移動を誘導する、受容体チ
ロシンキナーゼ（ｃ−ｋｉｔ）に結合する。さらに、メラニン生成酵素の発現に
決定的に重要である転写因子は、ＳＣＦ／ｃ−ｋｉｔシグナリングによって活性
化される。

【００１１】 表皮でメラニン細胞を維持する際のＳＣＦに対する重要な役割は、最近、マウ
スにおける研究によって確認されている。ＳＣＦは、通常、マウスの皮膚の毛胞
間表皮で下向調節されるが、それは、表皮メラニン細胞の不在によって反映され
る。表皮の基底層でのＳＣＦのトランス遺伝子発現は、表皮のこの領域からのメ
ラニン細胞の喪失を回復する。成マウスの皮膚は、ヒトの皮膚には匹敵できない
ものの、メラニン細胞に対する多くの重要なＳＣＦ活性は、ＳＣＦ遺伝子の異な
る対立遺伝子についてのマウス胚突然変異種の分析から推論することができる。
これらの研究に基づいて、本出願人らは、メラニン細胞の移動は、ＳＣＦの局在
化および提示の後に生じるが、メラニン細胞の増殖は、表皮で発現されたＳＣＦ
の量に比例するとの結論に達した。類似の相関関係は、真皮間充織中の肥満細胞
について確立されている。

【００１２】 様々なＭｇｆ対立遺伝子の分子的特徴付けは、ＳＣＦの可溶性および膜固着形
態の役割に対する重要な洞察を与えた。これらの突然変異種は、三つの無関係に
見える幹細胞集団、すなわち神経冠由来メラニン細胞、生殖細胞、および造血前
駆細胞の発生に強く影響する。

【００１３】 Steel-Dickie突然変異（Ｓｌ^dまたはＭｇｆ^sld）の分子的解析は、正常な生物
学的活性を有する分泌ＳＣＦタンパク質生成物を生じる、膜貫通ドメインおよび
ＣＯＯＨ末端を包含する遺伝子内欠失を示した。Ｍｇｆ^sld突然変異についての
同型接合体は、生存可能であるが、重大な影響を受けていた。ＳＣＦの膜アンカ
ーは、in vivoでのその生物学的活性に必要とされるが、それは、細胞外受容体
結合ドメインのみの発現は、皮膚の色素沈着、不稔性、造血および学習を左右す
るＳＣＦ依存性細胞の喪失へと導くからである（３〜４）。

【００１４】 Ｓｌ^17H対立遺伝子またはＭｇｆ^Sl17Hは、点突然変異を有して、マウスＳＣＦ
の細胞質尾部をコードしているエキソンの跳躍を招く。変更されたＳｌ^17Hによ
って影響される細胞集団は、末梢肥満細胞、始原生殖細胞、睾丸内の精原細胞、
および卵巣内の卵原細胞、皮膚および内耳の神経冠由来メラニン細胞、骨髄内の
造血幹細胞、骨髄からのＴ細胞前駆細胞、および腸管沿いのペースメーカー系統
からなる。そのため、この突然変異は、外皮の色素沈着、雄の稔性を排除し、造
血を低下させる、細胞質の序列の変化へと導く（５〜７）。このマウス突然変異
種では、ＳＣＦの細胞表面発現が低減され、上皮組織における基底側部選別が失
われる（８）。

【００１５】 これらの結果は、ＳＣＦの細胞質尾部が、効率的な細胞表面提示および基底側
部標的化に要する情報を秘めている可能性があることの予備的兆候を与えるが、
この本質的な特性の原因となる正確な序列および機序は、未知のままである。

【００１６】 ちなみに、異なる多数の選別決定因子が、新たに合成された膜タンパク質のト
ランスゴルジ網から基底側部表面への輸送に関与するシグナルを包含する、いく
つかの分類群のタンパク質で既に特定されていることが注目に値する（参考文献
：１１、１６、１７）。しかし、これらの基底側部標的化シグナルは、概して、
決定的に重要なチロシン、ジロイシンまたはジ疎水性モチーフを含む。ＳＣＦは
、これらの典型的な選別配列の機能的等価体をその細胞質尾部に含まないため、
新たな一群の基底側部を標的とする分子を提示することが示唆される。

【００１７】 現在まで、ＳＣＦの細胞表面提示における細胞質尾部が果たす正確な役割、お
よびその他の分子の関与の程度、またはその他の分子間相互作用は、解明されな
いままになっている。ＳＣＦの基底側部発現および保持は、その機能をin vivo
で果たすのに絶対に必要とされる機能であることから、信頼できる機序およびシ
グナルに関する知識の欠如は、細胞表面発現を調整する治療、診断および美容上
の作用因の開発における進歩を妨げている。

【００１８】 本発明者らは、膜貫通ＳＣＦ前駆体の基底側部および細胞表面での発現、なら
びに細胞表面での保持に必要とされる細胞内標的化決定因子の存在について、Ｓ
ＣＦの細胞質ドメインを分析してきた。この状況下で、基底側部標的化はもとよ
り、エンドサイトーシスの原因にも別の方式でなる、ジロイシンに基づくシグナ
ルとの多少の類似性を示す標的化シグナルが特定された。この配列における点突
然変異は、突然変異したＳＣＦ前駆体分子を上皮細胞の頂端表面へと再指向させ
るのに充分である。

【００１９】 ＳＣＦの標的化を調べるために、ＳＣＦをタグ付けした細胞外緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）、またはＳＣＦの膜貫通および細胞質配列に融合させたインター
ロイキン２受容体のα鎖（Ｔａｃ）の細胞外ドメインのキメラからなる、リポー
ター構成体を用いた。これらのキメラでは、ＳＣＦの正常な細胞内ドメインは、
健全なままであって、後者と、分極した細胞の選別機構との最適の相互作用、お
よび突然変異誘発による決定的な標的化ドメインの特定を許す。

【００２０】 本発明者らは、ＳＣＦの細胞内取り込みの阻害に必要とされる決定的な残基も
特定した。Ｍｇｆ^S17Hのように、細胞質尾部を突然変異させたとき、ＳＣＦは、
エンドサイトーシスによって細胞表面から効率的に除去される。したがって、定
常的なエンドサイトーシスは、表面発現されたＳＣＦの定常状態でのレベルを、
メラニン細胞数の変化によって検出できる程度にまで低下させる。

【００２１】 結論として、上皮および繊維芽細胞における野生型および細胞質突然変異種を
分析することによって、基底側部標的化に用いられ、かつエンドサイトーシスを
妨げるか、またはエンドサイトーシスを許さないか、もしくは誘導しないことに
よって膜発現を維持する、新奇なモチーフが膜貫通成長因子中に特定された。Ｓ
ＣＦの基底側部標的化には、決定的なロイシン残基が必要とされる。標的化の効
率は、酸性クラスターの存在によって高められる。

【００２２】 その上、ＣＳＦ−１のようなその他の膜貫通成長因子との機能的類似性および
配列比較に基づいて、基底側部決定因子、および付随する機能は、ＳＣＦに独自
ではなくて、細胞質ドメイン中の類似の単一ロイシンを有する、その他の細胞表
面固着成長因子に共通することが提唱されている。

【００２３】 この新奇なモチーフの特定は、これらの細胞表面成長因子を発現する細胞の挙
動、たとえば、表皮および真皮における、それぞれ、メラニン細胞および肥満細
胞の挙動を変化させるための、完全に新奇な取組み方への基盤を与える。基底ケ
ラチノサイトおよび真皮繊維芽細胞で発現される幹細胞因子中の特定の細胞質標
的化配列の、ペプチド類似体による干渉によって、この成長因子に対する受容体
を発現するメラニン細胞および肥満細胞の挙動（数および局在）を変化させるこ
とが提唱されている。これらの知見は、色素沈着、稔性および造血欠損に関連す
る。

【００２４】 本発明の第一の態様は、ロイシン残基を必須部分として含む新奇な基底側部選
別シグナルを含む。

【００２５】 ＳＣＦ、およびこのタンパク質中の新奇な基底側部選別シグナルの環境の研究
に基づいて、本発明の第二の態様は、このシグナルを含むタンパク質またはペプ
チド、およびこのシグナルが与える特性を含む。

【００２６】 本発明の第三の態様は、細胞内での基底側部選別および表面保持の阻害物質に
関する。そのような阻害物質を特定するためのスクリーニング法も記載される。

【００２７】 本発明の第四の態様は、第二の態様によるペプチド、または第三の態様による
阻害物質の医薬としての用途に関する。

【００２８】 本発明の文脈中、下記の用語は、以下の定義によって理解しなければならない
：

【００２９】 ・「分極した細胞」、たとえば上皮細胞、ニューロンは、その原形質膜の特性に
よって定義される。分極した細胞の原形質膜は、別個のタンパク質および脂質組
成を有する、頂端および基底側部ドメインに区分される。分極した細胞、たとえ
ばＭＤＣＫ（Madin Darbyイヌ腎臓細胞）では、膜貫通タンパク質の基底側部選
別は、トランスゴルジ網（ＴＧＮ）またはエンドソーム区画で行われる。

【００３０】 ・「基底側部選別シグナル」は、あるタンパク質内の、分極した細胞内で基底側
部の膜を該タンパク質の標的にさせるのに必須である、アミノ酸の配列である。
このシグナルは、単一のアミノ酸モチーフ中にあっても、または該タンパク質内
の別個に２もしくは３モチーフで構成されてもよい。好ましくは、基底側部選別
シグナルは、該タンパク質の基底側部標的化に必須かつ充分であるが、他の配列
、たとえば酸性クラスターの存在が、選別の効率を高める可能性がある。基底側
部選別シグナルは、追加的機能、たとえば該タンパク質のエンドサイトーシスを
誘導できる能力をさらに保有してよい（１１）。本発明によれば、これらの追加
的機能は、該タンパク質のエンドサイトーシスを阻害できる能力を包含してよい
。

【００３１】 ・核酸分子とは、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、ま
たはそれらの混合物であることができる、ヌクレオチドの配列を意味する。した
がって、核酸分子は、ＤＮＡフラグメント（一本もしくは二本鎖の）、ＲＮＡフ
ラグメント、またはハイブリッドの分子であることができる。このハイブリッド
分子は、たとえば、ＲＮＡ分子とハイブリダイズさせた一本鎖ＤＮＡであること
ができる。

【００３２】 ・第一の核酸分子は、第一の分子が、その長さの少なくとも一部に沿って第二の
分子とのワトソン−クリック塩基対を形成することができるとき、第二の核酸分
子と相補的であると言われる。アデニンは、チミンまたはウラシルと対合し、グ
アニンは、シトシンと対合する。一本鎖ＤＮＡ分子は、前記の対応が守られるな
らば、ＲＮＡ分子と相補的であることができる。

【００３３】 ・本発明によれば、アミノ酸は、その特性に従って分類される。塩基性アミノ酸
とは、リシンまたはアルギニンを意味する。これらのアミノ酸は、正に荷電した
アミノ酸としても分類される。酸性アミノ酸とは、アスパラギン酸またはグルタ
ミン酸を意味する。これらのアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸としても分類さ
れる。前記の４種類のアミノ酸は、荷電アミノ酸である。

【００３４】 ・小型の非極性アミノ酸とは、グリシン、アラニン、プロリン、システインまた
はバリンを意味する。大型の非極性アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、フ
ェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンを意味する。用語「非極性ア
ミノ酸」は、疎水性アミノ酸と同じ意味を有する。非常に疎水性であるアミノ酸
とは、フェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシンを意味する。非常に疎水
性であるアミノ酸は、大型非極性であるそれである。

【００３５】 ・小型の極性アミノ酸とは、セリンまたはトレオニンを意味する。大型の極性ア
ミノ酸とは、アスパラギンまたはグルタミンを意味する。チロシンは、極性であ
るとしても分類することができる。

【００３６】 ・芳香族アミノ酸とは、チロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンを意
味する。

【００３７】 ・アミノ酸の上記の特性は、ペプチドに挿入されたときも保存される。

【００３８】 ・本発明による酸性クラスターは、残基の半数またはそれ以上が酸性の特性を有
する、連続するアミノ酸の配列である。この定義によれば、本発明による酸性ク
ラスター中に存在するすべてのアミノ酸は、必ずしも酸性ではない。酸性アミノ
酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸である。酸性クラスターは、少なくと
も二つのアミノ酸、たとえば２〜８または１０アミノ酸で構成されることができ
る。

【００３９】 ・細胞質タンパク質は、それが発現される細胞内の細胞質中に存在するタンパク
質である。一般的に述べると、すべてのタンパク質は、合成の直後、および膜へ
の挿入、分泌、タンパク質分解等々の前は、細胞質性と見なすことができる。し
たがって、細胞質タンパク質とは、好ましくは、それが発現される細胞の細胞質
中に留まるタンパク質を意味する。したがって、本発明によれば、細胞質タンパ
ク質は、細胞内タンパク質である。好ましくは、細胞質タンパク質は、可溶性の
ままであり、封入体を形成しない。

【００４０】 ・可溶性タンパク質は、それが発現される細胞の膜内で結合されていない。可溶
性タンパク質は、細胞外媒体中に分泌されるか、または細胞の細胞質内に留まる
かのいずれかである。

【００４１】 ・膜−、膜貫通−、膜固着−および膜結合−タンパク質は、少なくとも一つのド
メインがそれが発現される細胞の膜に対する親和性を有する、タンパク質である
。より詳しくは、膜貫通タンパク質は、膜に特異的に挿入された、少なくとも一
つのドメインを有する。この膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、非常に特異的なアミ
ノ酸組成および構造を有して、膜の脂質が構成する非常に疎水性である環境にま
たがるのを許す。膜タンパク質は、膜に数回またがってよい。

【００４２】 ・本発明の文脈中で、膜貫通タンパク質とは、ただ一つのＴＭＤを有する膜タン
パク質を意味する。その結果、この種のタンパク質は、細胞内区画に一端を、か
つ細胞外区画に他端を有する。タンパク質の、細胞の細胞質中に留まるドメイン
は、細胞質ドメインまたは細胞質尾部と呼ばれ、膜の他方の側のドメインは、細
胞外ドメインまたは細胞外尾部と呼ばれる。このタンパク質は、そのＣ末端が細
胞内にあるならば、Ｉ型トポロジーを有するか、またはそのＮ末端が細胞内にあ
るならば、II型トポロジーを有するかのいずれかである。

【００４３】 ・タンパク質は、その構造の少なくとも一つのドメインが、それが発現される細
胞の細胞質中に留まるならば、細胞質ドメインを有すると見なすことができる。
好ましくは、この表現は、膜貫通タンパク質の、細胞内区画内に留まるドメイン
を定義するのに用いられる。

【００４４】 以下、本発明の異なる態様を詳述する。

【００４５】 第一の態様によれば、本発明は、連続する７アミノ酸からなる新奇な基底側部
選別シグナルを記載する。このシグナルは、連続する二つの非常に疎水性である
アミノ酸を必要とする、公知のジロイシンまたはロイシン−イソロイシンのモチ
ーフとは異なり、ただ一つの疎水性ロイシンに依存する。したがって、本発明に
よる基底側部選別シグナルは、「モノロイシン依存性」として指定される。

【００４６】 より具体的には、本発明のモノロイシン基底側部選別シグナルは、一般式（Ｉ
）： Ｘ₁ｈ₂Ｘ₃ｈ₄Ｌｐ₅ｐ₆ （Ｉ）

【００４７】 〔式中、Ｘ₁は、極性アミノ酸残基またはアラニンを表し、

【００４８】 ｈ₂は、いかなる疎水性アミノ酸残基も表し、

【００４９】 Ｘ₃は、いかなるアミノ酸残基も表し、

【００５０】 ｈ₄は、ロイシンおよびイソロイシン以外のいかなる疎水性アミノ酸残基も表
し、

【００５１】 Ｌは、ロイシン残基を表し、

【００５２】 ｐ₅は、いかなる極性アミノ酸残基も表し、

【００５３】 ｐ₆は、いかなる極性アミノ酸も表す〕 によって表すことができる。

【００５４】 このシグナルの折り畳みは、おそらく、三次元構造の表面に露出したロイシン
を招く。このヘプタペプチドのシグナルは、好ましくは、その環状の側鎖のため
に構造中に瘤を形成することが知られ、そのためにシグナルの構造を破壊する可
能性が高い、プロリンを欠く。

【００５５】 本発明のシグナルは、線形または環状の構造を有してよい。

【００５６】 この式のもう一つの好適実施態様では、Ｘ₁は、グルタミン酸、グルタミンま
たはアラニン残基を表し、ｈ₂は、イソロイシンまたはアラニン残基を表し、Ｘ₃ は、セリン、アラニンまたはアスパラギン酸残基を表し、ｈ₄は、メチオニンま
たはアラニン残基を表し、ｐ₅は、グルタミンまたはアスパラギン残基を表し、
ｐ₆は、グルタミンまたはグルタミン酸残基を表す。

【００５７】 本発明のこの第一の態様の最も好適な実施態様では、この式は、ＳＣＦ中に本
発明者らが特定した、基底側部選別シグナルに集中される。マウスＳＣＦ中に特
定された、このシグナルは、特定の配列：ＥＩＳＭＬＱを有する。

【００５８】 上記の一般式（Ｉ）で、要素（Ｘ₁；ｈ₂；Ｘ₃；ｈ₄；ｐ₅；ｐ₆）は、可変であ
り、その他は一定している。好適実施態様によれば、一般式（Ｉ）で表されるこ
の群の分子は、したがって、下記のサブクラスを含むが、ここで、（Ｘ₁；ｈ₂；
Ｘ₃；ｈ₄；ｐ₅；ｐ₆）は、下記の意味を有する：

【００５９】 （いかなるアミノ酸；Ｉ；Ｓ；Ｍ；Ｑ；ＱもしくはＥ）、または

【００６０】 （Ｅ；いかなる疎水性アミノ酸；Ｓ；Ｍ；Ｑ；ＱもしくはＥ）、または

【００６１】 （Ｅ；Ｉ；いかなるアミノ酸；Ｍ；Ｑ；ＱもしくはＥ）、または

【００６２】 （Ｅ；Ｉ；Ｓ；ＬおよびＩ以外のいかなる疎水性アミノ酸；Ｑ；ＱもしくはＥ
）、または

【００６３】 （Ｅ；Ｉ；Ｓ；Ｍ；いかなる極性アミノ酸；ＱもしくはＥ）、または

【００６４】 （Ｅ；Ｉ；Ｓ；Ｍ；Ｑ；いかなる極性アミノ酸）。

【００６５】 ちなみに、本発明によれば、アミノ酸は、一文字のアミノ酸コードを用いて表
される。

【００６６】 特に好適な実施態様によれば、一般式（Ｉ）において、（Ｘ₁；ｈ₂；Ｘ₃；ｈ₄ ；ｐ₅；ｐ₆）は、（ＥまたはＱ；ＩまたはＡ；Ｓ；Ｍ；ＱまたはＮ；ＥまたはＱ
）を表す。

【００６７】 たとえば、この実施態様によれば、基底側部選別シグナルは、下記のヘプタペ
プチドから選ばれる：ＥＩＳＭＬＱＱ、ＥＩＳＭＬＱＥ、ＡＩＳＭＬＱＱ、ＡＩ
ＳＭＬＱＥ、ＱＩＳＭＬＱＱ、ＱＩＳＭＬＱＥ、ＥＡＳＭＬＱＱ、ＥＡＳＭＬＱ
Ｅ、ＥＩＤＭＬＱＱ、ＥＩＤＭＬＱＥ、ＥＩＡＭＬＱＱ、ＥＩＡＭＬＱＥ、ＥＩ
ＳＡＬＱＱ、ＥＩＳＡＬＱＥ、ＥＩＳＭＬＮＱ、ＥＩＳＭＬＮＥおよびＱＡＳＭ
ＬＮＱ。

【００６８】 第二の態様によれば、本発明は、上記のとおりのモノロイシン基底側部選別シ
グナルを含むペプチドまたはタンパク質に関する。

【００６９】 本発明のこの変化形によれば、ペプチドの例は、アスパラギンのアミノ酸残基
と、後続する本発明のヘプタペプチドのシグナルとで構成されるオクタペプチド
、ならびにこのオクタペプチドを含むペプチドおよびタンパク質、特に少なくと
も１０アミノ酸、たとえば少なくとも１１、または少なくとも１２アミノ酸の長
さを有するそれである。これらは、約５００以下、たとえば１００〜３００のア
ミノ酸を有してよい。

【００７０】 本発明のこの態様は、本発明の第一の態様によるシグナルを形成する七つのア
ミノ酸と、後続する１、２または３個の極性アミノ酸とで構成されるペプチドに
も関する。これらの残基は、たとえばグルタミン残基であることができる。

【００７１】 本発明のこの態様によるタンパク質またはペプチドは、天然に産するキメラペ
プチド、または合成化合物であることができる。本発明が天然に産するタンパク
質に関するとき、該タンパク質は、全長のヒト、マウス、ニワトリ、ネコ、イヌ
、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウズラ、ラットまたはサンショウウオのＳＣＦを
含まない（データベースのGenbankに、ヒトについてはM59964、マウスについて
はM57647およびU44725、ニワトリについてはD13516、ネコについてはD50833、イ
ヌについてはS53329、ウマについてはAF053498、ウシについてはD28934およびAB
033716、ヒツジについてはU89874、ブタについてはL07786、ウズラについてはU4
3078、ラットについてはAF071204、かつサンショウウオについてはAF119044の登
録番号の下に存在する）。

【００７２】 ＳＣＦの細胞質ドメインの解析は、本発明の基底側部選別シグナルのロイシン
の８残基上流に、配列「ＥＥＤ」を含む酸性クラスターを明らかにした。実際、
フューリンというプロテアーゼ（２５）、ＬＤＬ受容体（１６）、およびＭＨＣ
IIの不変鎖（１７）について記載されたとおり、ＮまたはＣ末端に位置する決定
的に重要な酸性残基を必要とする、多くのジロイシン選別モチーフが記載されて
いる。酸性アミノ酸のクラスターに結合するアダプタータンパク質の、最近特定
されたホスホフューリン酸性クラスター選別（ＰＡＣＳ）ファミリーの成員は、
ＴＧＮ局在化および原形質膜選別を指図することに関与する（１９）。興味深い
ことに、ＰＡＣＳによるフューリンプロテアーゼの細胞内選別は、酸性アミノ酸
のクラスターに隣接する、決定的なセリン残基のリン酸化によって調節される。
ＴＧＮ局在化を指図する、同じＰＡＣＳ結合性の酸性クラスターは、フューリン
の基底側部選別にも必要とされる（２５）。

【００７３】 ＰＡＣＳは、ＳＣＦ中の酸性アミノ酸のクラスターに結合し、それによってＴ
ＧＮでの基底側部選別過程の忠実度を高め得るが、これが、ロイシンに対して−
２の位置に保存されたセリン残基が関与するリン酸化依存性相互作用であること
の兆候は皆無である。

【００７４】 その結果、本発明のこの第二の態様の第一の変化形によれば、モノロイシン依
存性基底側部選別シグナルは、酸性クラスターを伴う。

【００７５】 この酸性クラスターは、効率的な基底側部選別に必要とされる。ロイシンは、
基底側部輸送に不可欠であるが、酸性クラスターの存在は、基底側部選別の効率
を高める。酸性アミノ酸が基底側部標的化に必須である、その他の公知の基底側
部決定因子とは対照的に、本発明の基底側部選別シグナルにおける酸性クラスタ
ーは、部分的に不可欠であるが、しかし、基底側部選別過程の忠実度を高めるの
に役立つ。

【００７６】 そのようなＮ末端局在性酸性クラスターの不在下では（ＣＳＦ−１の細胞質尾
部におけるとおり）、低下したＴＧＮレベルでのタンパク質認識は、こうして、
ＳＣＦのように、そのような酸性クラスターを含む細胞質尾部と比較して、より
非効率的な基底側部標的化を生じかねない。基底側部選別のこの非効率は、Ｎ−
グリカン依存性頂端標的化経路によるＣＳＦ−１の頂端蓄積へと導き得る。

【００７７】 酸性クラスターは、基底側部標的化に絶対に必要とはされないことから、二つ
のモチーフは、単一の選別決定因子を形成しない。好ましくは、二つのモチーフ
が、ペプチドまたはタンパク質中に天然に見出されるならば、それらは、異なる
二つのエキソンにコードされている。それらは、同じエキソンによってコードさ
れていることもできる。

【００７８】 好ましくは、酸性クラスターは、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選ば
れる、少なくとも２種類の酸性アミノ酸を含む。

【００７９】 好適実施態様では、酸性クラスターは、配列ＥｘＥ、ＥｘＤ、ＤｘＥまたはＤ
ｘＤ（ｘは、いかなるアミノ酸でもある）を含む。好ましくは、該アミノ酸配列
は、ＥＥＤ、ＱＥＥ、ＥＡＥまたはＥＫＤである（Ｅは、グルタミン酸残基を、
Ｑは、グルタミン残基を、Ｄは、アスパラギン酸残基を、Ａは、アラニン残基を
それぞれ表す）。

【００８０】 本発明のタンパク質による基底側部選別シグナルおよび酸性クラスターを含む
ペプチドまたはタンパク質では、該酸性クラスターは、好ましくは、基底側部選
別シグナルに対するＮ末端である。特に好適なペプチドまたはタンパク質は、基
底側部選別モチーフであるＥＩＳＭＬＱＱ、ＥＩＳＭＬＱＥ、ＡＩＳＭＬＱＱ、
ＡＩＳＭＬＱＥ、ＱＩＳＭＬＱＱ、ＱＩＳＭＬＱＥ、ＥＡＳＭＬＱＱ、ＥＡＳＭ
ＬＱＥ、ＥＩＤＭＬＱＱ、ＥＩＤＭＬＱＥ、ＥＩＡＭＬＱＱ、ＥＩＡＭＬＱＥ、
ＥＩＳＡＬＱＱ、ＥＩＳＡＬＱＥ、ＥＩＳＭＬＮＱ、ＥＩＳＭＬＮＥおよびＱＡ
ＳＭＬＮＱのいずれか一つに対するＮ末端に位置する、酸性クラスターＥＥＤ、
ＱＥＥまたはＥＡＥを含む。最も好ましくは、これらのタンパク質またはペプチ
ドは、該酸性クラスターと選別シグナルとのまさに間に位置する、アスパラギン
（Ｎ）またはグルタミン酸残基をさらに含む。

【００８１】 もう一つの実施態様では、本発明によるペプチドまたはタンパク質は、連続す
る少なくとも４個の荷電アミノ酸のクラスターをさらに含んでよい。これらの荷
電アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンおよびヒス
チジンのうちから選ばれる。ヒスチジンは、生理学的pHでは荷電されているか、
または中性であることができるため、このアミノ酸は、好ましくは、荷電アミノ
酸の選択肢から除外される。正に荷電したアミノ酸は、塩基性の特性も有し、負
に荷電したそれは、酸性の特性も有することから、荷電アミノ酸のこのクラスタ
ーは、酸塩基性特性を示すクラスターと見なすこともできる。

【００８２】 この荷電クラスターの好適版では、連続する４個のアミノ酸は、交互に正およ
び負に荷電しているか、または交互に酸性および塩基性である。そのようなクラ
スターの好適ないくつかの例は、アミノ酸配列ＫＥＲＥ、ＫＥＫＥ、ＤＥＤＲま
たはＥＥＤＲ（ここで、Ｋはリシン残基を、Ｅはグルタミン酸残基を、Ｒはアル
ギニン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基をそれぞれ表す）を包含する。

【００８３】 その他のクラスターも、特に、４個のうちの第二または第三のアミノ酸が中正
であるクラスターも、４個のうち１個のみ電荷を保有しないならば可能である。
このクラスターは、クラスター中の残基あたりの電荷の数が、ランダムポリペプ
チド中の残基あたりの電荷の平均数を上回るため、実際上、本発明に従って荷電
していると見なすことができる。

【００８４】 本発明の好適実施態様では、この追加の荷電クラスターは、本発明の基底側部
選別シグナルに対するＣ末端に存在する。

【００８５】 注目に値するのは、この第二のクラスターも、上に示した定義に従って酸性ク
ラスターであることができることである。ちなみに、基底側部選別シグナルは、
異なる二つの酸性クラスターの間に位置することができる。

【００８６】 もう一つの実施態様では、本発明によるペプチドまたはタンパク質は、バリン
をそのＣ末端にさらに含む。本出願人らは、ＣＳＦ−１とＳＣＦとの細胞質尾部
を比較し、保存されたＣ末端のバリン残基を特定した。ＳＣＦとの配列比較、お
よび下記に実験の項で提示されたデータに基づき、このＣ末端のバリンは、小胞
体（ＥＲ）からゴルジおよび細胞表面へのＣＳＦ−１およびＳＣＦの効率的な輸
出に重要であると思われる。Ｃ末端バリンを欠く突然変異種構成体は、すべて、
ＥＲ中に保持され、細胞表面の輸送は、遅延され、ＥＲから細胞表面への大量の
タンパク質流を通じてなされる。そのため、このバリンという決定因子の不在は
、細胞表面での本発明のタンパク質またはペプチドの発現の低下を招く。

【００８７】 このバリン残基の役割は、そのＳＣＦおよびＣＳＦ−１が好適実施態様である
、本発明のモノロイシン基底側部選別シグナルへと一般化することができる。

【００８８】 興味深いことに、基底側部標的化のモチーフは、チロシンまたはジロイシン決
定因子のファミリーに属さず、かつエンドサイトーシスを仲介しない、重合体の
Ｉｇ受容体について記載されている。この決定的な標的化ドメインは、βターン
中に位置するただ一つのバリンと、二つの決定的残基、すなわちそれに対するＮ
末端の第３および第４アミノ酸とからなる。バリンからアラニンへの突然変異は
、基底側部標的化を低下させ、βターンを不安定化する（３５）。加えて、βタ
ーンに参加しない、バリンに対するＮ末端にあるアミノ酸も、効率的な基底側部
選別に必要とされ、第二の、バリン非依存性の、機能的標的化ドメインを形成す
る（３５）。これらの類似性に基づき、ＳＣＦのロイシン２６は、βターン、ル
ープまたはαヘリックスの一部であって、その疎水性側鎖を、それがクラトリン
被覆小胞のアダプター複合体に結合できるように露出することが可能である。

【００８９】 これらのデータに基づき、本発明のシグナルペプチドを含むペプチドまたはタ
ンパク質は、好ましくは、ロイシンの疎水性側鎖を、それがクラトリン被覆小胞
のアダプター複合体に結合できるように露出する構造を採用している。

【００９０】 好適実施態様では、本発明によるペプチドまたはタンパク質は、細胞内で発現
されようとするのに必要なすべての情報を含む。該ペプチドが、細胞とは異種で
あるヌクレオチド配列によってコードされているならば、この配列は、該ヌクレ
オチド配列がコードしている情報を翻訳することができ、かつ対応するペプチド
を合成することができる細胞に導入される。好ましくは、このペプチドは、少な
くとも一つの細胞質ドメインを保有する。

【００９１】 本発明の特に好都合な実施態様は、基底側部選別シグナルをその細胞質ドメイ
ン内に含み、少なくとも一つの膜貫通ドメインまたは膜アンカーをさらに含むタ
ンパク質またはペプチドである。

【００９２】 好ましくは、このタンパク質またはペプチドは、ただ一つの膜貫通ドメインを
含み、選別シグナルが、該タンパク質の細胞質尾部内に存在する。細胞質尾部内
の基底側部選別シグナルの位置は、重要である。実際、上記で考察されたとおり
、基底側部選別シグナルの構造は、標的化に役割を果たすと思われる。決定的な
ロイシンは、この構造の表面に露出される可能性が非常に高い。ロイシンは、疎
水性残基であるため、表面でのこのアミノ酸の露出は、タンパク質にとってエネ
ルギー論的に不都合である。シグナルの局所的な構造は、露出が必要とするエネ
ルギーを与える。そのため、この特定の構造を許すシグナルの位置を保存するこ
とが重要である。

【００９３】 ちなみに、基底側部シグナルは、好ましくは、膜貫通ドメインの直後に位置し
ない。実際上は、そのような位置は、膜の近位、および脂質の極性を有する頭部
によって課される機械的およびエネルギー論的制約のため、シグナルの配座に関
する可能性の減数を意味すると思われる。膜貫通ドメインと本発明の基底側部選
別シグナルとの間の柔軟なスペーサーの存在は、厳格に必要とはされないものの
、非常に好都合であることができる。好ましくは、このスペーサーは、特定の構
造を全く保有しない。特に好適な変化形では、基底側部選別シグナル中のロイシ
ンは、膜貫通ドメインから１５〜３５アミノ酸に位置する。膜貫通ドメインの末
端は、アミノ酸配列解析装置のプログラムによって、困難なしに確定することが
できる。

【００９４】 本発明の好適実施態様では、本発明の基底側部選別シグナルを含むペプチドま
たはタンパク質は、分極した細胞で発現されたとき、この細胞の基底側部膜を標
的とする。分極した細胞は、セルトリ細胞、ケラチノサイト、肺上皮細胞、腎上
皮細胞、皮膚からの内皮細胞、呼吸および消化管、大動脈ならびに骨髄からの内
皮細胞、骨芽細胞、胸腺上皮細胞、卵巣細胞、およびＳＣＦを発現するニューロ
ンを包含する。本発明に従って用いられる、分極した細胞の代表的な例は、ＭＤ
ＣＫ細胞のような上皮細胞である。

【００９５】 本発明によれば、基底側部シグナルは、膜タンパク質の細胞質ドメインに存在
するとき、分極した細胞の基底側部の膜への指向シグナルとして機能する。上記
に考察したとおり、このシグナルは、それがその選別機能を果たすのを許す位置
に存在しなければならない。本発明によれば、この選別は、そのシグナルが存在
する細胞質尾部のタンパク質またはペプチドの細胞外ドメインの性質とは無関係
に達成される。その上、それは、該ペプチドまたはタンパク質の膜貫通ドメイン
とは無関係である。既に述べた好適実施態様では、該タンパク質またはペプチド
の細胞質尾部のその他の残基とも無関係である。

【００９６】 一般式（Ｉ）およびその好適実施態様によって定義されたとおりの、本発明の
基底側部シグナルは、二つの機能、すなわち基底側部膜の標的化、および／また
は細胞膜からのエンドサイトーシスの限定もしくは阻害を有することができる。
以下、これらの機能を、「機能Ａ」（基底側部膜への指向）および「機能Ｂ」（
細胞膜からのエンドサイトーシスによる細胞内取り込みの限定）と指定する。

【００９７】 機能Ａを表示するためには、基底側部選別シグナルは、上記の特定の分子的環
境にある膜タンパク質内に存在しなければならず、発現は、分極した細胞内でな
ければならない。初めに詳しく考察したとおり、その他の条件の存在、たとえば
酸性クラスターの存在、および／または追加的な荷電クラスターの存在、ならび
にＣ末端バリンの存在も、選別の効率を高めるのに必要とされ得る。

【００９８】 機能Ｂの実施に要する条件は、発現が必ずしも分極した細胞内ではないこと、
およびＣ末端バリンの存在がより決定的であること以外は、機能Ａについてと同
じである。下記の実験の項は、機能Ｂの帰結の例を与える。

【００９９】 本発明の基底側部シグナルを含むペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、
一般式（II）： ｚ−（Ｘ）_p−Ａｃｃ−（Ｘ）_q−（Ｂａ）−（Ｘ）_r−（Ｖ）_f （II）

【０１００】 〔式中、Ｘは、それぞれ、アミノ酸残基を表し；

【０１０１】 ｚは、リシン（Ｋ）またはアルギニン残基（Ｒ）を表し；

【０１０２】 ｐは、１２〜２２の整数を表し；

【０１０３】 ｑは、０、または１〜４の整数を表し；

【０１０４】 ｒは、２〜１２の整数を表し；

【０１０５】 「Ａｃｃ」は、酸性クラスターを表し；

【０１０６】 「Ｂａ」は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナルを表
し；

【０１０７】 Ｖは、バリン残基を表し；

【０１０８】 ｆは、０または１を表し、かつ

【０１０９】 （Ｘ）で表される複数のアミノ酸残基は、同じであるか、または異なることが
できる〕 による細胞質ドメインを有する。

【０１１０】 最も好適な実施態様では、記載されたとおりのペプチドまたはタンパク質は、
図２Ｂに示されるとおり、ヒト、マウス、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、
ヒツジ、ブタ、ウズラ、ラットまたはサンショウウオＳＣＦの細胞質尾部のアミ
ノ酸配列との高度な同一性を共有する細胞質ドメインを有する。高度な同一性と
は、示された細胞質ドメインとの８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ま
しくは９５％以上の同一性を示す配列を意味する。

【０１１１】 本発明は、一般式（Ｉ）によって、またこの式の好適実施態様において記載さ
れたとおりのペプチドである基底側部選別シグナルをコードしている核酸分子に
も関する。本発明は、本発明の基底側部選別シグナルを含むタンパク質またはペ
プチドをコードしている核酸分子にも関する。

【０１１２】 本発明は、先行する記載による核酸分子と相補的である核酸分子にも関する。

【０１１３】 本発明の核酸は、原核および真核細胞内での発現のためのベクター、望みの細
胞型での発現に適切である調節シグナルを包含するキメラ遺伝子、抗血清、およ
びリボソーム配列を包含する。

【０１１４】 本発明は、本発明の基底側部選別シグナルを含むペプチドまたはタンパク質を
発現する細胞も包含する。このペプチドまたはタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子から発現されることができる。そのような分子は、該細胞内に内在してい
ること、または導入することができる。導入は、当技術に慣用的である手法のい
ずれによっても、たとえば電気穿孔、微量注入、または組換えウイルスの利用等
々によって実施することができる。

【０１１５】 本発明は、本発明のシグナルペプチド、または上記されたとおりのペプチドも
しくはタンパク質をコードしている核酸を含有する細胞にも関する。この核酸は
、細胞にとって内因性であること、または細胞にとって異種であることができる
。それは、上に列挙された手法を用いて、細胞に導入することができる。該核酸
分子は、むき出しであることができるか、または導入効率および細胞内生存を向
上させるために、複合体をなすことができる。この核酸配列は、プラスミドまた
はもう一つのベクターの一部であることができる。このベクターは、好ましくは
、該核酸分子の発現に必要なすべての情報を含む。

【０１１６】 本発明の細胞は、好ましくは、真核細胞、特に哺乳動物、とりわけヒトの細胞
である。適する哺乳動物細胞のその他の例は、マウス、ラット、サル、ハムスタ
ー、イヌ、ウマ、ネコ等々である。植物細胞も、本発明は包含し、細菌のような
原核細胞も企図される。

【０１１７】 好適な変化形では、本発明の細胞は、分極しており、たとえば、ＭＤＣＫ細胞
その他の上皮細胞、ならびにセルトリ細胞、ケラチノサイト、肺上皮細胞、腎上
皮細胞、皮膚からの内皮細胞、呼吸および消化管、大動脈ならびに骨髄からの内
皮細胞、骨芽細胞、胸腺上皮細胞、卵巣細胞、およびＳＣＦを発現するニューロ
ンである。

【０１１８】 本発明のペプチドまたはタンパク質を発現する細胞の特性は、発現されるタン
パク質またはペプチドの正確な性質に応じて、かつそれが基底側部標的化タンパ
ク質を既に発現しているか否かに応じて様々である。たとえば、本発明の膜貫通
タンパク質を発現する分極した細胞は、基底側部膜に特異的にあるタンパク質の
表面発現を特徴とする。非分極化細胞で発現される同じタンパク質は、タンパク
質の非特異的表面発現を特徴とすることになる。内因性基底側部タンパク質を既
に発現する分極した細胞、および本発明の異種タンパク質を発現するよう形質転
換されたそれは、一般的には、内因性タンパク質の基底側部発現の低下、および
おそらく該内因性タンパク質の頂端発現の出現を特徴とするものと思われる。

【０１１９】 第三の態様では、本発明は、分極した発現はもとより細胞表面の発現の阻害に
関する。

【０１２０】 実験の項のデータに基づくとともに、他の実験系で得られた標的化のデータか
ら推論して、本発明者らは、可溶性または膜端の細胞質尾部に存在する標的化決
定因子を特異的に認識することができる、異なるアダプタータンパク質の存在を
仮定している。他の系では、そのようなアダプタータンパク質は、類似するが同
一ではない標的化配列の一方または他方に対する高度の特異性を示すことが立証
されている。

【０１２１】 本発明によれば、異なる分類群の阻害物質が存在する。

【０１２２】 第一に、競合阻害物質が存在する。特定された基底側部決定因子はもとより、
Ｃ末端バリン決定因子をも、後者の認識を細胞性機構によって遮断しようとの試
みで模倣する、ペプチドに基づくか、または合成によるすべての化合物。これら
の阻害物質は、膜透過性、細胞質可溶性、膜固着性、または上記の組合せのもの
であり得る。

【０１２３】 実際、本発明で得られた結果は、一般式（Ｉ）を有するか、または含む短いペ
プチド配列が、細胞の、たとえばケラチノサイトのような分極した細胞内の細胞
内タンパク質輸送全体を遮断することなしに、ＳＣＦのその特異的アダプタータ
ンパク質との結合に対して競合できることを示す。したがって、細胞、たとえば
ケラチノサイトへのそのようなペプチドの導入は、この基底側部シグナル決定因
子を含むペプチドまたはタンパク質の分極表面での発現を、たとえば、ケラチノ
サイトでのＳＣＦの分極表面での発現を変更して、変更し、そのため、表皮にお
けるメラニン細胞の数および局在を変化させるものと思われる。同様に、真皮に
局在する肥満細胞も、ＳＣＦの提示に依存する。細胞表面に付随するＳＣＦの、
ペプチド類似体によって誘導される減少は、皮膚における肥満細胞の数も減少さ
せると思われる。

【０１２４】 第一の実施態様によれば、ＳＣＦおよびＳＣＦ様タンパク質の分極表面はもと
より細胞表面の発現の阻害も、細胞内でのペプチド類似体の過剰発現によって得
られる。この過剰発現されたペプチド類似体は、基底側部選別を許す経路を飽和
させる。そのため、基底側部選別は、乱されて、通常は基底側部に発現されるタ
ンパク質の頂端発現へと導く。しかし、チロシンまたはジロイシンモチーフに基
づく基底側部選別は、影響されない。

【０１２５】 本発明のこの態様によれば、阻害性ペプチド類似体は、ＳＣＦ様タンパク質の
基底側部発現に関与する細胞性機序について競合して、こうして分極した細胞で
の基底側部発現の廃絶または低減へと導くことができる能力を有する、いかなる
ペプチドも包含する。

【０１２６】 一般式（Ｉ）によるいかなる基底側部選別シグナル、およびこのシグナルを含
むいかなるペプチドまたはタンパク質も、分極した細胞で過剰発現されたとき、
該細胞内で発現される追加のタンパク質の基底側部発現を阻害できる能力を有す
る可能性がある。

【０１２７】 類似阻害物質の特に好適な例は、一般式（Ｉ）のヘプタペプチドの基底側部標
的化モチーフそれ自体、およびこのモチーフを含む、たとえば８〜５０アミノ酸
、特に８〜４０アミノ酸を有する、より大きいペプチドからなるペプチドを包含
する。それ自体は基底側部発現されないが、同じ細胞性機構について競合するの
に充分な、内在性基底側部タンパク質との類似性を有するペプチドまたはタンパ
ク質を阻害物質として用いることは、特に有利である。たとえば、式（Ｉ）のモ
チーフを含むが、膜貫通ドメインを保有しないタンパク質またはペプチドは、適
する阻害物質である。一般に、上記の式（II）によって定義される細胞質ドメイ
ンからなるか、またはそれを含むタンパク質は、特にＳＣＦに対する基底側部発
現の効率的な阻害物質である。

【０１２８】 本発明による阻害物質の第二の分類群は、本願に記載されたとおりの基底側部
選別シグナルを特異的に認識するか、もしくはそれと相互作用するか、または該
基底側部選別シグナルを含むペプチドもしくはタンパク質の基底側部選別シグナ
ルを特異的に認識するか、またはそれと相互作用する阻害物質である。

【０１２９】 阻害物質のこの分類群は、基底側部または小胞体輸出決定因子と、該決定因子
がその特異的アダプタータンパク質と結合するのに要するより高い親和力で結合
するよう設計される。

【０１３０】 阻害物質と基底側部選別シグナルとの相互作用は、阻害物質が、他のいかなる
細胞内タンパク質とも有意に交差反応しないという点で特異的である。そのよう
な有意な交差反応の不在は、標的とされたタンパク質の基底側部発現以外の細胞
性機能が破壊されないという事実によって示される。

【０１３１】 そのような阻害物質は、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、およ
び抗体の誘導体、たとえば、抗体の、決定因子を認識するフラグメントもしくは
一本鎖抗体、またはイントラボディーを包含する。イントラボディーは、単一の
ポリペプチド中の重鎖または軽鎖可変ドメインで通常構成される一本鎖抗体（ま
たは一本鎖の可変域フラグメント）であり、細胞内発現するよう設計される。抗
体および誘導体は、膜透過性複合体、またはそれぞれの細胞内での、遺伝子療法
的取組み方によって誘導された遺伝子発現のいずれかによって、細胞質に導入す
ることができる。

【０１３２】 この分類群の阻害物質は、ペプチド、たとえば、記載された二つの決定因子と
高い親和力で特異的に相互作用する、ペプチドアプタマーまたは合成化合物も包
含する。これらの阻害物質は、競合阻害物質について記載されたとおりに、細胞
または組織に適用されることになる。

【０１３３】 阻害物質のさらに一つの分類群は、野生型の基底側部発現されたタンパク質の
二量体化を破壊することによって作用する。実際、ＳＣＦの細胞質尾部における
機能突然変異（１７Ｈ）の利得を、ＳＣＦまたはＣＳＦ−１のような基底側部シ
グナルを含むタンパク質の細胞内局在化を変化または変更させるための、効率的
なツールとして用いることができる。ＳＣＦおよびＣＳＦ−１の二量体化に基づ
いて、細胞外ＳＣＦまたはＣＳＦ−１ドメイン（二量体化に必要とされる）を包
含するが、リソソームへの輸送、およびその後の分解を与える細胞質決定因子を
有する、一分類群の阻害物質を開発することができる。そのような阻害物質は、
細胞内の内在性野生型タンパク質との二量体化を必要とし、一般的には、遺伝子
療法的な方法によって組織に導入される。この分類群の阻害物質は、内因性ＳＣ
ＦまたはＣＳＦ−１の、式（Ｉ）で記載されたとおりの細胞質尾部配列および／
またはシグナルに特異的に結合し、タグ付けされたＳＣＦおよびＣＳＦ−１のリ
ソソーム標的化を誘導する追加のペプチドシグナルを有する、ペプチドまたは合
成化合物も包含する。そのような阻害物質は、競合阻害物質の項に記載された態
様に該当し、かつそれらからなる。

【０１３４】 さらに一つの実施態様では、本発明は、基底側部発現の阻害物質を特定するた
めのスクリーニング法に関する。この方法は、下記の工程からなるか、またはそ
れらを含む：

【０１３５】 ・分極した細胞に、阻害特性について試験しようとする化合物を導入する工程、

【０１３６】 ・該細胞内に、リポータータンパク質の基底側部発現の変更、およびこのリポー
タータンパク質に対する頂端発現の出現を検出する工程、

【０１３７】 ・場合により、基底側部発現に対して阻害効果を有することが認められた試験化
合物を回収する工程。

【０１３８】 細胞への試験しようとする化合物の導入は、異なる手段によって達成すること
ができる。特に、試験しようとする阻害物質が、ペプチドであるならば、このペ
プチドをコードしている核酸分子を、ベクターに組み込み、該ベクターによって
細胞を形質転換することができる。試験しようとする阻害物質が、合成化合物で
あるならば、膜透過によって導入することができる。

【０１３９】 試験しようとする阻害物質の導入の前後で、リポータータンパク質の頂端発現
を比較することによって、可能性のある阻害物質が、基底側部標的化を変更する
か否かを確定することができる。

【０１４０】 好ましくは、リポータータンパク質は、図１に示されるとおりのキメラＧＦＰ
−ＳＣＦタンパク質である。この場合、頂端膜での蛍光を追跡することは、こう
して非常に簡単である。導入後の頂端面での蛍光の強さの２０％の増大は、基底
側部選別機構における摂動の代表例である。このスクリーニング法は、好ましく
は、該細胞の基底側部選別機構を乱さないことが公知である、対照化合物と同時
に実施する。

【０１４１】 本発明は、先行する記載によるスクリーニング法を実施することによって得ら
れる、基底側部標的化シグナルの阻害物質にも関する。

【０１４２】 このようにして特定された阻害物質は、ペプチド、抗体、および抗体のフラグ
メントのような誘導体、一本鎖抗体、イントラボディー、ランダム分子のライブ
ラリーの一部として、たとえばファージライブラリーのファージ内で発現される
ペプチド、または合成化合物を包含する。

【０１４３】 本発明は、上記のとおりのペプチド性阻害物質をコードする核酸分子、および
前記核酸分子と相補的である核酸分子にも関する。

【０１４４】 第四の態様では、本発明は、本発明による基底側部選別シグナルからなるか、
またはそれを含むペプチドおよびタンパク質の異なる用途はもとより、上記の阻
害物質の用途にも関する。本発明は、この新奇な基底側部選別シグナルの知識を
活用する方法にも関する。

【０１４５】 第一に、一般式（Ｉ）と、膜タンパク質の細胞質尾部との比較は、該タンパク
質の発現が基底側部的であるか否かを予測するのを助けることができる。その機
能が未知である多くの配列が特定されている限り、この配列をなす基底側部選別
シグナルの特定は、該配列がコードしているタンパク質の潜在的機能を特定する
のに用いることができる。

【０１４６】 基底側部的に発現されることが既知であるタンパク質については、基底側部選
別シグナルの特定は、該分子の機能の理解に不可欠であり得る。たとえば、どの
残基が決定的であり、単一アミノ酸突然変異による機能の何らかの喪失を説明し
得るかの決定を許す可能性がある。その上、上記に考察したとおり、基底側部選
別シグナルは、異なるエンドサイトーシスの特徴を有する。本発明による基底側
部選別シグナルを含むタンパク質は、細胞表面での露出が延長されている可能性
があり、これは、特定の特性を生じさせることができる。

【０１４７】 たとえば、本発明の基底側部選別シグナルに関するデータは、ＣＳＦ−１の知
識を向上させることに有意に寄与している。ＣＳＦ−１の細胞表面輸送に関する
文献中には、限定された量のデータのみが存在するにすぎない。本発明者らは、
一般式（Ｉ）との比較によって、ＣＳＦ−１中の基底側部標的化ドメインを立証
した最初の者である。この決定因子に加えて、ＣＳＦ−１とＳＣＦとの細胞質尾
部の間のそれ以上の比較は、保存された追加的なＣ末端バリン残基を明らかにし
ている。

【０１４８】 好適実施態様では、本発明は、細胞の包括的選別機構を変更するためのペプチ
ドの用途に関する。本発明の特に好適な用途は、分極した細胞の基底側部膜内で
特異的に発現されるのを常とする、膜貫通タンパク質の基底側部発現を阻害する
ための、基底側部選別シグナルを含むペプチドまたはタンパク質の用途である。
これは、Ｉ型またはII型トポロジーを有する、モノロイシン基底側部選別シグナ
ルを有する膜貫通タンパク質の基底側部選別を廃絶するのに特に役立つことがで
きる。

【０１４９】 下記の実験の項に提示されたデータによれば、特に好適な膜貫通タンパク質は
、ＳＣＦである。新生の頂端発現を伴う基底側部発現の低減を示す結果が、実験
の項に示されている。この場合、基底側部選別の変更は、選別機構を乱すよう指
定されたペプチドまたはタンパク質の発現レベルの関数として追跡することがで
きる。

【０１５０】 さらに一つの実施態様では、本発明は、基底側部を標的にさせた膜貫通タンパ
ク質Ｐの基底側部発現を調整する方法に関する。この方法は、Ｐを発現する細胞
への、本発明による基底側部選別シグナル、または前記のとおりのこのシグナル
を含むタンパク質またはペプチドの導入を含む。

【０１５１】 この方法は、好都合には、このタンパク質を発現する分極した細胞内でのタン
パク質ＳＣＦの基底側部発現を調整するように実施する。この細胞は、セルトリ
細胞、ケラチノサイト、肺上皮細胞、腎上皮細胞、皮膚の内皮細胞、呼吸および
消化管、大動脈ならびに骨髄からの細胞、骨芽細胞、胸腺上皮細胞、卵巣細胞、
およびＳＣＦを発現するニューロンから選ぶことができる。

【０１５２】 本発明のシグナルの機能Ｂによれば、第二の方法も構想することができる。こ
れは、膜貫通タンパク質Ｔの膜保持を調整する方法である。この方法は、Ｔを発
現する細胞への、本発明による基底側部選別シグナル、または前記のとおりのこ
のシグナルを含むタンパク質もしくはペプチドの導入を含む。

【０１５３】 この方法は、好都合には、このタンパク質を発現する細胞内でのタンパク質Ｓ
ＣＦの膜保持を調整するように実施する。この細胞は、分極しているか、または
分極していなくてもよい。ＳＣＦを発現する分極した細胞の例は、上記に示され
ている。細胞が分極していないならば、それは、皮膚の繊維芽細胞、心房、大動
脈の平滑筋細胞、骨髄間質細胞およびライディッヒ細胞から選ぶことができる。

【０１５４】 本発明のさらに一つの態様によれば、一般式（Ｉ）の基底側部選別シグナルを
有する膜貫通タンパク質Ｔの基底側部発現を達成する方法であって、該タンパク
質をコードしている核酸を分極した細胞内で発現させることを含む方法が提供さ
れる。

【０１５５】 この方法では、膜貫通タンパク質Ｔは、（ｉ）可溶性タンパク質Ｐ、（ii）シ
グナルペプチド、（iii）膜貫通ドメイン、および（iv）本発明の基底側部シグ
ナルを含むキメラタンパク質であってよい。該タンパク質のキメラの性質は、該
シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインの少なくとも一方が、タンパク質Ｐにつ
いて異種であることから生じる。

【０１５６】 そのため、この方法は、可溶性タンパク質Ｐに、基底側部発現および保持の特
徴を与える手段を構成することができる。そのような方法は、シグナルペプチド
をコードしている核酸、タンパク質Ｐをコードしている核酸配列、膜貫通ドメイ
ンをコードしている核酸、および本発明による基底側部選別シグナルをコードし
ている核酸配列の、発現ベクター内でのクローニング、次いで、分極した細胞内
でのコードされているタンパク質の発現を伴ってよい。この発現ベクターは、た
とえば、プラスミドまたはウイルス性ベクターであってよい。

【０１５７】 異なる配列の間にスペーサーを導入することができる。異なる配列は、同じ読
み枠内にある。この発現ベクターは、挿入された配列の発現を確保するのに必要
な、すべての特性を含む。導入および発現レベルは、選ばれたベクターの特徴で
ある。それらは、キメラタンパク質を発現させようとする細胞に調整かつ適合さ
せることができる。

【０１５８】 この実施態様のもう一つの変化形では、基底側部発現の特徴は、膜貫通タンパ
ク質Ｔに与える。この変化形は、式（II）： ｚ−（Ｘ）_p−Ａｃｃ−（Ｘ）_q−（Ｂａ）−（Ｘ）_r−（Ｖ）_f （II）

【０１５９】 〔式中、Ｘは、それぞれ、アミノ酸残基を表し；ｚは、リシンまたはアルギニン
残基を表し；ｐは、１２〜２２の整数を表し；ｑは、０、または１〜４の整数を
表し；ｒは、２〜１２の整数を表し；「Ａｃｃ」は、酸性クラスターを表し；「
Ｂａ」は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナルを表し；
（Ｖ）_fは、バリン残基を表し；ｆは、０または１を表し、かつ（Ｘ）で表され
る複数のアミノ酸残基は、同じであるか、または異なることができる〕 を有する細胞質尾部の、Ｔへの導入を伴う。式（II）の細胞質尾部は、タンパク
質Ｔについて異種である。そのような細胞質ドメインのＴへの導入は、該膜貫通
タンパク質の内因性細胞質尾部のアミノ酸配列の全体または部分的削除と同時に
実施することができる。既存のいかなる内因性アミノ酸の削除もなしに、一般式
（II）の細胞質尾部を内因性細胞質尾部に挿入することも可能である。この場合
、式（II）の細胞質尾部の挿入は、好ましくは、膜貫通ドメインの直後で実施す
る。

【０１６０】 本発明によれば、ＳＣＦおよびＣＳＦ−１は、本願に記載された基底側部選別
シグナルを有するタンパク質の例である。ＳＣＦを発現する複数の細胞に関して
は、ＳＣＦの細胞関係の役割の変更を対象とする用途および方法は、特に興味深
い。

【０１６１】 本発明は、ＳＣＦの細胞質尾部についての多くの役割を示唆する。第一に、Ｓ
ＣＦを、分極させる方式で、基底側部で発現させつつ、頂端表面ではなく、細胞
表面をその標的にさせる。第二に、表面に達した後、ＳＣＦは、原形質膜に保持
される。細胞質尾部の第一の機能は、分極した組織内の細胞、たとえばケラチノ
サイト、セルトリ細胞およびニューロンで重要であるのに対し、第二の機能は、
すべてのＳＣＦ発現細胞に関連すると思われる（図８）。そのため、ＳＣＦの基
底側部送達の不在は、Ｍｇｆ^Sl17H突然変異によって例示されるとおり（８）、
それぞれ、分極したケラチノサイトおよびセルトリ細胞からのＳＣＦの基底送達
を必要とするのを常とする、メラニン細胞、および雄性生殖細胞の死へと導く。
色素沈着および稔性の喪失に加えて、空間的学習の不在が、膜貫通および細胞質
ドメインを欠くＳＣＦのマウス突然変異種（Ｍｇｆ^Sld）で立証されている（４
）。野生型ＳＣＦとは対照的に、ＳＣＦのそのような突然変異形態は、分極した
上皮の頂端表面から分泌される（８）。骨髄の分極していない間質細胞でのＳＣ
Ｆの細胞表面発現は、造血に必要とされる（８）。結果的に、ＳＣＦの細胞表面
発現の低下を招く構成的エンドサイトーシスは、Ｍｇｆ^Sl17H突然変異マウスの
それに匹敵する造血欠損へと導くことになる（６、７）。

【０１６２】 特に好適な細胞は、本発明者らがＳＣＦの役割を調べたケラチノサイトである
。

【０１６３】 皮膚は、我々の身体の最大の器官の一つである。それは、層化された表皮を支
持する、血管形成された真皮で構成される。表皮ケラチノサイトの基底層内には
、メラニン細胞が、規則的な間隔で散在する。免疫監視、ホメオスタシスおよび
ＵＶ防護における重要な機能に加えて、皮膚の色素沈着の差も、人種的軋轢はも
とより、不規則な色素沈着に付随する心理学的問題の基盤となっている。

【０１６４】 理解されていないのは、色素の質（赤褐色または黒色）ではなくて、メラニン
細胞とケラチノサイトとの数の間のホメオスタシスである。この均衡が破られた
とき、メラニン細胞の局所的不在または過剰増殖は、劇的な心理学的かつ病理学
的帰結を有することがある。そのため、表皮中のメラニン細胞の数とともに局在
も変更するための手段は、主要な美容および医学的重要性がある。

【０１６５】 肥満細胞の数とともに局在を変更するための手段も、主要な医学的重要性があ
る。肥満細胞は、身体を一定の寄生生物から防護する。しかし、それらは、喘息
その他の（特に皮膚の）アレルギー性疾患のような病態形成の原因でもある。肥
満細胞は、チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔをまさに発現し、移動、生存、増殖およ
びヒスタミン放出のためにリガンドのＳＣＦを必要とする。極端な温度差、機械
的刺激、および／またはＩｇＥ（ＦｃＲＩ）受容体の占拠によって、肥満細胞を
刺激すると、それらは、ヒスタミンその他の炎症メジエーターを分泌することに
よって、炎症反応を誘導する。肥満細胞の機能の遮断は、日焼けその他の皮膚損
傷性事象の後の皮膚のアレルギー反応に対して有益な効果を有し得る。喘息に対
して有益な効果も有し得る。

【０１６６】 さらに一つの実施態様では、本発明は、ＳＣＦの細胞内機能、特に表面発現の
機能を変更する医薬の製造のための、本発明の基底側部選別シグナルを含むタン
パク質もしくはペプチド、および／またはそれらをコードしている核酸、および
／または本発明の阻害物質を含む組成物の用途に関する。

【０１６７】 好適実施態様では、本発明は、ＳＣＦの役割を変更して、メラニン細胞の増殖
数の減少、メラニン細胞局在の変化へと導くためのこの組成物の用途に関する。
好ましくは、該組成物は、ほくろ、老人性ほくろまたは母斑ほくろのような、過
度に色素沈着した皮膚病変を軽減するために用いられる。

【０１６８】 もう一つの好適な事例では、該組成物は、ＵＶ損傷した皮膚からメラニン細胞
を除去するために用いられる。黒色腫細胞を治療するために用いることもできる
。

【０１６９】 造血および肥満細胞増殖におけるＳＣＦの役割によれば、該組成物は、気道お
よび消化管内の肥満細胞が仲介するアレルギー反応を防止するために、肥満細胞
症、白血病または肥満細胞腫を治療するために用いることができる。この組成物
は、好都合には、造血前駆細胞新生物、たとえば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬ
Ｌ）を治療するために投与されてよい。

【０１７０】 雄性および雌性生殖細胞におけるＳＣＦの役割によれば、該組成物は、精子形
成もしくは卵子形成の阻害を治療するため、または精子形成もしくは卵子形成を
遮断するために用いることができる。

【０１７１】 薬用量学はもとより、投与の方法も、臨床熟練者が決定するものとする。治療
しようとする病理学を生起する欠陥が、遺伝性であるときは、遺伝子療法が、非
常に好都合に構想されることになる。

【０１７２】 皮膚の色素沈着におけるＳＣＦの役割の関与によれば、本発明の基底側部選別
シグナルを含むタンパク質またはペプチドを含む組成物は、美容の目的で、皮膚
科学に用いることができる。該組成物に含まれるタンパク質またはペプチドは、
それらをコードしている核酸、および本発明による阻害物質で置き換えるか、ま
たは完了させてもよい。美容学に用いる目的で、該組成物は、好ましくは、局所
的適用によって投与する。この形式の適用のためには、組成物は、好ましくは、
クリーム剤、スプレー、ローション剤、軟膏または粉末の形態をなし、皮膚に直
接塗布される

【０１７３】 説明で概略を示したとおり、ＣＳＦ−１（ＣＳＦ−１；マクロファージコロニ
ー刺激因子）とＳＣＦとの間の構造的および機能的相同性は、実質的である。Ｓ
ＣＦと同様に、ＣＳＦ−１は、膜結合成長因子として生成され、その後、膜の近
位部位で、タンパク質分解による開裂によって細胞表面から放出される。そのた
め、細胞表面へのＣＳＦ−１の輸送は、ＳＣＦに該当するとおり、生物学的活性
を獲得するために決定的に重要である。変化したＣＳＦ−１発現に関する生物学
的帰結は、病変部位へのマクロファージの異常な動員に起因するアルツハイマー
病、様々な慢性の炎症性疾患（関節炎、リウマチ、乾癬）のような、病理学的状
況に関して充分に定義されている。

【０１７４】 ＣＳＦ−１の追加的な明らかな機能は、循環マクロファージからの破骨細胞の
形成に関する。破骨細胞は、骨組織の喪失を伴う疾患、たとえば骨粗鬆症に関係
する。これらの病理学的状況は、すべて、ＣＳＦ−１の増強された発現によるマ
クロファージの動員および局所的増殖に依存する。そのため、ＣＳＦ−１の表面
レベルを低下させることは、マクロファージの動員によって誘導される組織損傷
または骨除去を低減するのに効果的な方法であり得る。

【０１７５】 もう一つの実施態様では、本発明は、ＣＳＦ−１の役割を変更するための医薬
のの製造のための、本発明の基底側部選別シグナル、および／またはそれらをコ
ードしている核酸、および／または本発明の阻害物質を含むタンパク質またはペ
プチドを含む組成物の用途に関する。

【０１７６】 これによれば、この組成物は、異常な免疫応答を治療するため、特に乾癬また
は関節硬化症を治療するために用いることができる。

【０１７７】 本発明のもう一つの実施態様では、該組成物は、骨粗鬆症、または上皮小体機
能亢進症の骨を治療するために用いることができる。

【０１７８】 ＳＣＦその他の膜貫通成長因子において明確に定義された標的化決定因子は、
これらの因子の分極された提示、および細胞表面を変化させる可能性を与える。
これは、これらの因子の過剰発現または突然変異によって生じる病理学的状態、
たとえばアレルギー、慢性炎症、骨粗鬆症、または過剰色素沈着病変の治療のた
めの新たな治療法の取組み方を発生させる。

【０１７９】 本発明の様々な態様を、図面において例示する。

【０１８０】 実施例 以下の実施例で実験手順は実施例１〜３に、結果は実施例４に示される。実施
例５は別の突然変異に関する。実施例６および７はＣ−末端バリンの役割と、細
胞質尾部による基底側部発現阻害をそれぞれ示す。

【０１８１】 実施例１： ＳＣＦキメラおよび部位指向突然変異誘発 ＳＣＦおよびＴａｃ用ｃＤＮＡはジョン・フラナガン（John Flanagan、ボス
トン）博士およびピエール・コッソン（Pierre Cosson、ジュネーブ）博士から
それぞれ寄贈された。マウスＣＳＦ−１およびマウスチロシナーゼｃＤＮＡはウ
ィリー・ホステッター（Willy Hostetter、ベルン）博士およびフリードリッヒ
・ベールマン（Friedrich Beermann、ローサンヌ）博士からそれぞれ寄贈された
。増幅ＧＦＰ配列（クローンテク）をｍｙｃ−ｔａｇ ５′と共に、ＳＦＣ（Ｓ
ＳＴＬＧＰＥＫ／ＤＳＲＶ）のエクソン５／６ジャンクションに挿入することに
より、ＳＣＦ−ＧＦＰキメラをｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン（Invitrogen））
中に構築し、以下の配列を得た：ＳＳＴＬＧＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＱＳ−Ｉ
Ｖ（増幅ＧＦＰ）＿ＹＫ−ＴＧＰＥＫ／ＤＳＲＶ（単一文字アミノ酸コード；ｍ
ｙｃ ｔａｇの配列に下線）。細胞質ＧＦＰを生産する内部開始部位での翻訳を
阻止するため、ＧＦＰの開始コドンをＣｌａＩ部位をコードするヌクレオチドで
置換した。唯一のＰｉｎＡＴ部位を、この部位で野生型および突然変異型細胞質
尾部配列を交換するためにＧＦＰ配列に導入されたＣ末端である。

【０１８２】 Ｔａｃ−ＳＣＦキメラ（すべてｐｃＤＮＡ３中）を発生させるため、ＳＣＦの
膜貫通および細胞質ドメインをＳＣＦおよびＴａｃの膜貫通配列の上流にある相
同ロイシン（Ｌ）およびグルタミン（Ｇ）残基に位置するＴａｃ中の唯一のＢｇ
１ＩＩ部位で交換した。これにより、配列

【０１８３】

【化１】

【０１８４】 が得られた（ＳＣＦの保存ＬＱは太字とし、膜貫通残基は下線を付した）。

【０１８５】 Ｔａｃ−ＣＳＦ−１およびＴａｃ−チロシナーゼ（Ｔａｃ−ｔｙｒ）キメラを
同様の方法で構築した。ＣＳＦ−１およびチロシナーゼ膜貫通および細胞質配列
を以下のプライマーを含むＢｇｌ II部位で共通のグルタミン残基（Ｑ）でＰＣ
Ｒ増幅し： （ＣＳＦ−１：ＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧ； チロシナーゼ：ＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＣＧＴＡＴＣＴＧＧ
） およびこの領域のＴａｃ配列で交換し、以下のそれぞれのジャンクション配列
を生成した：

【０１８６】

【化２】

【０１８７】 （共通グルタミン残基（Ｑ）は太字、それぞれの膜貫通領域は下線）。Ｔａｃ−
ＥＧＦＰを、プライマーを含みＴａｃ（ＴＩＱＡＳＳストップ）の最Ｃ−末端に
ある唯一のＨｉｎｄIIIに挿入されたＨｉｎｄIIIでＥＧＦＰのＰＣＲ増幅でクロ
ーン化し、新しいジャンクション配列（ＴＩＱＡＳＴＭＶ．．．（ｅｇｆｐ））
を得た。

【０１８８】 ＳＣＦの細胞質尾部の部位特異性突然変異誘発をＰＣＲ重複伸長を用いて行っ
た。特異的突然変異を含む重複ＰＣＲフラグメントを外部プライマー（それぞれ
ＳＣＦ−ＧＦＰまたはＴａｃ−ＳＣＦキメラについてのＰｉｎＡＩまたはＢｇｌ
ＩＩ部位のいずれかを含む）で増幅し、細胞質尾部の野生型配列と交換した。す
べての構築物をジデオキシ配列決定法で確認した。

【０１８９】 実施例２： 細胞培養、生体蛍光顕微鏡および免疫組織化学 ＭＤＣＫＩＩ細胞はカール・マッター（Karl Matter、ジュネーブ）博士から
寄贈され、１０％ＦＣＳ（イノテック）を添加したＤＭＥ培地（ライフテクノロ
ジーズ）中で培養した。標準プロトコールに従って６０％密集度の細胞をリン酸
カルシウム法を用いて形質移入し、０．６mg ml^-1のＧ４１８（ライフテクノロ
ジーズ（Life Technologies））を用いて安定なクローンを選択した。各構築物
に対し、ＳＣＦ−ＦＧＰ蛍光の定常的な分布、または抗Ｔａｃ組織化学について
、少なくとも２個の異なったクローンを分析した。ＧＦＰ蛍光を可視化するため
、細胞をガラスカバースライド上で密集状態に成長させた。観測に先立ち、培養
培地を１０％ＦＣＳを補充したＦ１２培地（ライフテクノロジーズ）に交換し、
ＤＭＥ培地中ではより高くなる自己蛍光を減少させた。細胞を倒立共焦点顕微鏡
（ＬＳＭ−４１０、ツァイス（Zeiss））に搭載し、標準ＦＩＴＣ光学系で可視
化した。ＳＣＦ−ＧＦＰ形質転換ＭＤＣＫＩＩ細胞中の形質転換Ｔａｃ−ＳＦＣ
キメラまたは内因性Ｅ−カドヘリンの局在を明らかにするため、ガラスカバース
ライド上で生育した安定な形質転換細胞の単層をＰＢＳ中の４％パラホルムアル
デヒドで５分間で固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％トリトンＸ−１００（
シグマ（Sigma））で透過性にし、１％ＢＳＡ（シグマ）で保護した。次いでネ
コＥ−カドヘリンに対する指針のとおり、細胞を抗Ｔａｃモノクローナル抗体７
Ｇ７または抗Ａｒｃ−１モノクローナル抗体で染色した。洗浄後、結合抗体を抗
マウス抗体に結合したテキサスレッドで検出した。次いで上記のとおり共焦点顕
微鏡で蛍光を分析した。コントラストの向上をフォトショップ（アドビ（Adobe
））で行った。

【０１９０】 実施例３： 貪食分析 野生型および突然変異Ｔａｃ−ＳＦＣ構築物をフーゲン（Fugen）６を用い、
製造業者（ロッシュ（Roche））の指針に従ってＳＶ４０形質転換アフリカミド
リザル腎臓細胞（ＣＯＳ−７）中に形質移入した。形質移入の２日後、細胞を氷
で冷却し、抗Ｔａｃ抗体を１μg ml^-1の濃度で１時間で加えた。暖める前に未結
合抗体を洗い去り、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥ培地中、３７℃３０分間で内
在化した。次いで細胞表面に結合したままの抗体を氷冷酸性グリシン緩衝液で除
去した（０．１M、pH２．５）。次いで細胞を４％パラアルデヒドで５分間で固
定し、洗浄、透過性化、保護および抗マウス抗体と結合したテキサスレッド（サ
ザーンバイオテク（Southern Biotech））で染色を行い、内在化した抗Ｔａｃ／
Ｔａｃ−ＳＣＦを検出した（上記参照）。細胞をデジタルカメラ（Ｃ４７４２−
９５、ハママツ）とオープンラブ（Openlab）ソフトウエア（インプロビジョン
）を備えたアキシオバート（Axiovert）１００顕微鏡（ツァイス）で観察した。
コントラストの向上をフォトショップ（アドビ）で行った。実験を３回行い定性
的に同様な結果を得、実験からの代表的な細胞の例を選択した。

【０１９１】 実施例４： 実施例１〜３の結果 ｉ）ＳＣＦの基底側部標的化にロイシン２６が必要である。； ＳＣＦの細胞質尾部中の抗原決定基を同定し明確に標的化するため、ＳＣＦの
局在化をモニターするに適切なレポーター構築物を含む緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）を作成した。ＧＦＰを交互に繋ぎ合わせた、二つのＳＣＦの膜結合突然変
異体の細胞外ドメイン中に挿入し、分極上皮ＭＤＣＫＩＩ細胞中に形質移入した
（図１）。共焦点顕微鏡により、二つの野生型構築物が基底および外側膜膜中に
蓄積し、そこで分極上皮細胞中の外側膜コンパートメントに対するマーカーであ
るＥ−カドヘリンと共に局在化することが観察された（Ｍ２突然変異体と共に示
す；図１）。

【０１９２】 基底側部および細胞内標的モチーフ（１６）の存在をＳＣＦの野生型細胞質ド
メインで調べると、最近同定されたトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）標的
配列（１９）と一致する２４位セリンで挟まれた酸性クラスターが観測された。
セリンのリン酸化により、受容体タンパク質のＰＡＣＳファミリーに対するこの
配列の結合が制御される。さらに、２５および２６位のメチオニン−ロイシン（
ＭＬ）は貪食に対する信号の他、ＭＨＣクラスＩＩ複合体（１１、１７）の不変
鎖からの基底側部選別とも類似している。

【０１９３】 基底側部選別に関与するＳＣＦの細胞質尾部中のモチーフを同定するため、Ｇ
ＦＰ標識ＳＣＦ（ＳＣＦ−ＧＦＰ）の様々な膜結合（Ｍ２）型の細胞質ＳＣＦ突
然変異体を作成した（図２Ａ）。最後の８個のＣ−末端アミノ酸（ｄ３６、ｄ２
９）を欠失した突然変異体は基底側部膜に局在化したままであった。しかしなが
ら、１５個以上のアミノ酸が欠失（ｄ２２、ｄ１２）すると、ＳＦＣ−ＧＦＰは
頂膜に位置し、基底側部発現を示さなかった。内部の欠失突然変異体（ｄ２１−
２８）も頂膜に局在化しているため、基底側部選別の限界領域が配列²¹ＭＥＩＳ
ＭＬＱＱ²⁸モチーフ内に存在することが示された。興味のあることに、機能性で
あるためにはこの配列が膜からかなり離れていなければならず：膜に近い介在ア
ミノ酸（ｄ５−２０）の欠失は基底側部選別を妨害した。アミノ酸５−１１（ｄ
１２−２０）を再挿入して²¹ＭＥＩＳＭＬＱＱ²⁸モチーフの膜からの距離を増加
させると基底側部標的の回復は部分的であり、基底画側標的に重要な他のアミノ
酸が²¹ＭＥＩＳＭＬＱＱ²⁸モチーフのＮ末端に存在することを示唆している（下
記参照）。

【０１９４】 ヒト、マウス、ニワトリおよびオオトカゲの間で配列を比較すると、²⁴ＳＭＬ ²⁶ 残基が²¹ＭＥＩＳＭＬＱＱ²⁸モチーフ内で完全に保存されていることが示され
た（図２８）。この配列は２４位のセリンの他、２５および２６位に疎水性メチ
オニン−ロイシンを含んでいる（上記参照）。このモチーフの一部がＳＦＣの基
底側部選別に必要であるかどうかを試験するため、本発明者らはこれらの保存残
基を含む様々な点突然変異体を作成した（図２Ｂ、図３）。セリン２４をアラニ
ン（Ｓ２４Ａ）またはホスホセリンに似たアスパラギン酸（Ｓ２４Ｄ）のいずれ
かに変更すること、および保存性グルタミン酸１９をリシン（Ｅ１９Ｋ）に置換
することは、基底側部標的に何らの影響もなかった（図３Ｃ、Ｅ、Ｆ）。これに
対し、ロイシン２６をアラニン（Ｌ２６Ａ）へ変更、またはメチオニン２５およ
びロイシン２６を２つともアラニン（Ｍ２５Ａ／Ｌ２６Ａ）に置換すると、突然
変異ＳＣＦ−ＧＦＰ構築物が頂端に蓄積する結果となった（図３Ｂ、Ｄ）。した
がって、ＳＣＦ−ＧＦＰキメラ突然変異タンパク質の解析から、ＳＣＦの細胞質
尾部の２６位のロイシンがＳＣＦの基底側部選別に重要であることを示唆する。
しかしながら、この仮想の基底側部信号に二量体ＳＣＦ分子の並列が必要である
かどうか、またはこの仮想の基底側部信号が細胞内標的情報を独立に提供するか
どうかは未知である。

【０１９５】 ii）細胞外ＳＣＦ配列には基底側部標的が必要でない。 ＳＣＦの細胞外ドメイン含む二量体生成、またはＳＣＦの細胞外および／また
は細胞内部分と標的情報を含む他のタンパク質との会合は、事実上ＳＣＦの分極
発現の原因であるかもしれない。したがって、ＳＣＦの細胞質標的配列が細胞外
ドメインとは独立に分極発現を仲介する能力を試験するために、後者をインター
ロイキン−２受容体アルファ鎖（Ｔａｃ）の細胞外ドメインで置換した（図４）
。野生型ＴａｃとＣ−末端融合ＥＧＦＰを有するは、ＭＤＣＫＩＩ細胞中で発現
する場合、頂端に蓄積した（図４Ａ）。一方、ＳＣＦの野生型細胞質ドメインを
発現するＴａｃ−ＳＣＦキメラは、ＳＣＦ−ＧＦＰ野生型構築物と類似の方法で
基底側部膜に局在化した（図４Ｂ）。同様に、ＳＣＦの細胞質尾部の欠失突然変
異（ｄ２９、基底側部、図４Ｃ；ｄ２２、頂端、図４Ｄ；ｄ２１−２８、頂端、
図４Ｅ；ｄ５−２０、頂端、（図示せず）；およびｄ１２−２０基底側部／頂端
、図４Ｆ）を有する細胞外Ｔａｃを含む構築物は、突然変異体ＳＣＦ−ＧＦＰ構
築物と比較して同様な基底側部挙動を示した。このことは、ＳＣＦの細胞外ドメ
インが基底側部標的に必要でなく、細胞質部分に含まれるＳＣＦの基底側部モチ
ーフが基底側部でＴａｃ細胞外ドメインを標的にするに充分であることを示して
いる。さらに、Ｎ−末端からメチオニン２５への配列、およびｄ１２−２０突然
変異で除去されたロイシン２６が基底側部標的の効率に影響する（図４Ｆ）。

【０１９６】 これらの結果に基づき、出願人はＳＣＦ中にロイシン系基底側部標的信号の存
在を提案する。Ｓ１^17Eで示される様なこの信号がない場合、ケラチノサイトと
セルトリ細胞中でＳＣＦの基底配送がなく、メラニン細胞と雄生殖細胞それぞれ
の死を招く（５、８）。

【０１９７】 iii）有効な基底側部標的はモノマーロイシン抗原決定基に対するＮ−末端酸
性クラスターで媒介される。

【０１９８】 ２６位のロイシン残基が基底側部標的に重要であることは明らかであるが、す
べてのジロイシン様抗原決定基に見出される第２の疎水性残基（メチオニン２５
）もＳＣＦの基底側部選別に同様に必要であるかは未知である。その上、有効な
基底側部標的（¹²ＥＮＩＱＩＮＥＥＤ²⁰）に必要なＭＬモチーフに対するＮ末端
領域は、同様にＳＣＦ選別に重要なドメインを含んでいる。

【０１９９】 最初の質問に応えるため、メチオニン２５をアラニン残基で置換し、Ｔａｃ−
ＳＣＦ構築物の分布を定常状態で分析した。ロイシン２６のアラニンへの突然変
異とは対照的に、メチオニン２５のアラニンへの変化はＴａｃ−ＳＣＦの基底概
則標的に影響しなかった（図５Ａ、Ｂ）。さらに、古典的ジロイシン抗原決定基
を作成する試みにおけるメチオニンのロイシンによる置換は、Ｔａｃ−ＳＣＦが
細胞内および頂端に局在化する結果となった（図示せず）。したがって、この発
見により、機能的であるために第２の疎水性アミノ酸を要求しないＳＣＦ中の新
規タイプのロイシン系基底側部標的信号の存在が明らかとなった。

【０２００】 ｄ１２−２０突然変異で欠失するＮ−末端からロイシン２６への配列の解析に
より、異常な高濃度の酸性アミノ酸が明らかとなる。Ｎ−末端からＦＩモチーフ
への酸性クラスターが、フリンプロテアーゼ中の基底側部標的信号であると最近
同定されている（２５）。ＳＣＦ中の酸性クラスターが基底側部選別に寄与する
かどうか、またはロイシン残基の近くに局在する他の酸性アミノ酸残基が重要で
あるかどうかを試験するため、グルタミン酸２２をアラニンに突然変異（²²Ｅｘ
ｘｘＭＬ^-26）させた（図５Ｃ）。さらに、残基¹⁶ＥＥＤ²⁰で形成する酸性クラ
スターを消滅させるため、グルタミン酸１９をロイシンで置換した（図３Ｆ）。
どの修飾もＴａｃまたはＧＦＰキメラＳＣＦ構築物の基底側部標的に効果がなか
った。しかしながら、３個の酸性残基１８、１９、２０すべてをアラニン残基（
Ｅ−Ｄ１８Ａ−Ａ）で置換すると、Ｔａｃ−ＳＣＦキメラの基底側部選別を変化
させた。比較的少量のＴａｃ−Ｅ−Ｄ１８Ａ−Ａキメラを発現するクローンでは
、基底側部標的はまだ充分であるが、より多量の突然変異体Ｔａｃ−ＳＣＦを発
現するクローンでは基底側部および頂端表面染色が検出された（図５Ｄ）。これ
らのクローンの抗Ｔａｃ染色は、ｄ１２−２０突然変異で既に見られた表現型に
非常に類似していた（図４Ｆ）。これらのデータは、酸性クラスター（¹⁸ＥＥＤ ²⁰ ）の除去が、単量体ロイシン抗原決定基で媒介される基底側部輸送の効率を減
少させるｄ１２−２０突然変異の原因であることを示唆している。

【０２０１】 iv）ＳＣＦとＣＳＦ−１の基底側部標的ドメインの比較 ＳＣＦは、生育、組織止血および血液造成に重要な役割を演じる膜貫通成長因
子の大きな集団に属する。配列および機能の相同性に基づき、ＳＣＦはＣＳＦ−
１と最も類似している。二つの因子間の類似性は、構成的に保存され、染色体複
製で進化するそれらの受容体であるチロシンキナーゼ、ｃ−ｆｍｓ、ＣＳＦ−１
に対する受容体、およびＳＣＦに対する受容体であるｃ−ｋｉｔにまで及ぶ。Ｃ
ＳＦ−１とＳＣＦの細胞質ドメインを配列比較すると（図６Ｅ）、殆どのＣ−末
端バリン残基の他にＳＣＦの基底側部標的に匹敵する位置にあるロイシン含有モ
チーフが明らかとなる。しかしながら、Ｎ−末端からこのロイシンモチーフへの
酸性アミノ酸クラスターはＣＳＦ−１では保存されない。ＣＳＦ−１の基底側部
選別活性を測定するため、Ｔａｃの細胞外ドメインに融合した膜貫通および細胞
質尾部ドメインを発現させ、密集単一層中でのＭＤＣＫＩＩ細胞の定常状態の分
布を検討した（図６）。野生型Ｔａｃ−ＣＳＦ−１キメラ構築物をＭＣＤＫII細
胞の基底側部表面で発現させた（図６Ｃ）。しかしながら、相当量のＴａｃ−Ｃ
ＳＦ−１も密集ＭＤＣＫＩＩ細胞の頂端表面に検出され（図６Ｃ′）、野生型Ｔ
ａｃ−ＳＣＦキメラで観察されたものとは違った状態であった（図６Ａ、Ａ′）
。基底側部および頂端表面上のＴａｃ−ＣＳＦ−１の分布は、この構築物が保存
されないという印象を与えた。ＣＳＦ−１中の相同ロイシンが細胞の選別機構と
相互作用するかどうかを決定するため、ＣＳＦ−１のロイシン２４をアラニンに
突然変異させた。Ｔａｃ−ＳＣＦ−Ｌ２６Ａ（図６Ｄ′）に類似の頂端に集積し
た（図６Ｄ′）個々のＴａｃキメラ（Ｔａｃ−ＣＳＦ−Ｌ２４Ａ）は、ＣＳＦ−
１の個々の位置にあるロイシンが基底側部選別信号として認識されるが、基底側
部輸送の効率は野生型ＳＣＦのものに比べて低いことを示唆している。この差は
、ＣＳＦ−１にはないＳＣＦ中の酸性クラスターの存在によると思われる。

【０２０２】 ｖ）野生型と対照的にＭｇｆ^S117EＳＣＦの突然変異体細胞質尾部は構成的貪
食を誘発する

【０２０３】 Ｃ−末端欠失突然変異（ｄ２９、ｄ３６）により形質転換された細胞を詳しく
調べると、細胞体内にＳＣＦ−ＧＦＰおよびＴａｃ−ＳＣＦの集積が増加してい
ることが分かった（Ｔａｃ−ＳＣＦについて図４Ｃ、Ｄに示す）。この細胞間蓄
積は新たに合成されたＳＣＦがＥＲ中に蓄積されるか（図9参照）、細胞表面Ｓ
ＣＦの貪食によると考えられる。抗Ｔａｃ抗体のＴａｃ−ＳＣＦ形質転換細胞中
への内在化により、貪食を試験した。

【０２０４】 多くの基底側部選別抗原決定基が貪食を誘発することが示された。例えば主要
組織適合性複合体ＩＩの不変鎖中の基底側部標的モチーフ（ＭＬ）が個々のタン
パク質の貪食効果を媒介する（１１）。したがって、Ｔａｃキメラ（Ｔａｃ−Ｓ
ＣＦ）として発現したＳＣＦの野生型細胞質尾部がＴａｃ−ＳＣＦ／抗Ｔａｃ複
合体を非分極ＣＯＳ−７細胞中へ内在化し得るかどうかを試験した。抗Ｔａｃ抗
体は冷却状態で形質移入細胞に結合した。続いて、Ｔａｃ−ＳＣＦ／抗Ｔａｃ抗
体複合体を３７℃で内在化させ、細胞表面に残存する抗Ｔａｃ抗体を酸除去後に
可視化した。野生型発現細胞（図７Ｂ）および様々なＣ−末端欠損を発現する細
胞（ｄ３６、ｄ２９およびｄ２２）、またはＣ−末端バリン置換体（Ｖ３６Ｑ、
ａｄｄ３７Ｑ）につき、抗Ｔａｃ抗体の内在化を試験した。ｄ２９突然変異以外
は、すべての構築物は同様に少量の内在化抗体を示した。興味のあることに、ｄ
２９突然変異を有するＴａｃ−ＳＣＦは中程度のレベルで内在化したが、ＭＬモ
チーフ（ｄ２２）を含む欠損は野生型と比較して内在化されなかった。このこと
は、Ｃ−末端荷電クラスターの除去が基底側部標的モチーフのコンフォーメーシ
ョンを変化させ、このＭＬ（ジロイシン様）モチーフを経由するＳＣＦの中程度
の内在化が生じ得ることを示唆している（図２Ａ参照）。言い換えると、このこ
とはＳＣＦ中のモノロイシン抗原決定基が貪食を誘発しないことを示唆し、膜結
合ＳＣＦの細胞表面発現の持続と矛盾しない発見である。多くの基底側部標的信
号は被覆ｐｉｔ局在化および貪食のものに類似する。プロテアーゼフリンまたは
不変鎖とは対照的に、野生型ＳＣＦは細胞表面に発現し、貪食されない。興味あ
ることに、Ｍｇｆ^S127H突然変異に見出されたＳＣＦの細胞質尾部は、Ｔａｃキ
メラとして発現した場合、高い貪食誘発能を有する。 Ｍｇｆ^S127H突然変異体
の細胞質尾部の解析により、ＫＹＡＡＴＥＲＥＲＩＳＲＧＶＩＶＤＶＳＴＬＬＰ
ＳＨＳＧＷ（５）と、貪食またはリゾソーム／メラノソーム／液胞標的（Ｄｘｘ
ｘＬＬ）の信号との間の配列の一致が見出された。この配列はＣＤ３（Ｄｘｘｘ
ＬＬ）、および不変鎖（ＤＤＱｘＬＩ；ＥｘｘｘＭＬ）（１７）、Ｖａｍ３ｐ（
ＥｘｘｘＬＬ）、ＬＩＭＰ ＩＩ（ＥＥｘｘＬＬ）およびチロシナーゼ（Ｄ／Ｅ
ＥｘｘｘＬＬ）に関連した形で見出されていた（概説は１１参照）。これらのタ
ンパク質のすべてで、貪食活性はジロイシンモチーフの存在に強く依存し、上記
Ｍｇｆ^S117Hの突然変異で観測されたと同様にアラニン突然変異誘発後に失われ
る。

【０２０５】 したがって、Ｍｇｆ^S117Hの突然変異はＳＣＦの貪食とリゾソーム標的に関す
る機能の獲得を現すと思われる。その結果、限られた量の突然変異ＳＣＦのみが
刺激応答性、ｃ−ｋｉｔ発現近隣細胞に対し細胞表面で利用できると考えられる
。これが周辺ＳＣＦ依存性肥満細胞の量の減少と、Ｍｇｆ^S117H突然変異動物で
観察される限られた造血支持能の原因であると思われる（６、７）。対照的に、
本出願に示すデータに基づき、野生型ＳＣＦは貪食に対する信号を欠き、これは
ＳＣＦの細胞質尾部が反応細胞に対しＳＣＦの非開裂型の連続的な表示と信号発
信を行う役割と一致する。

【０２０６】 実施例５： 機能突然変異の獲得 野生型ＳＣＦとは対照的に、Ｍｇｆ^S117H突然変異の細胞質尾部を含むＧＦＰ
およびＴａｃ−ＳＣＦキメラは細胞間小胞構造を蓄積した（Ｔａｃ−ＳＣＦ−１
７Ｈ；図７Ｄ；８も参照）。この突然変異構築物の細胞間蓄積は、新たに合成さ
れたキメラタンパク質のＥＲ中の保持、あるいは細胞表面ＳＣＦの貪食によると
思われる。分極ＭＤＣＫＩＩ中のＴａｃ−ＳＣＦ−１７Ｈの細胞間定常状態局在
化が貪食の結果である（図１７Ｄ）かどうかを決めるため、局在化をチロシナー
ゼ−Ｔａｃキメラ（Ｔａｃ−ｔｙｒ）の局在化と比較した。チロシナーゼは貪食
効果およびリゾソーム／メラノソームに対する確立した信号を有するタンパク質
であり、したがって細胞表面から構成的に内在化される（１１）。興味のあるこ
とに、分極ＭＤＣＫＩＩ細胞では、Ｔａｃ−ｔｙｒが細胞間小胞構造に局在化し
（図７Ｇ）、Ｔａｃ−ＳＣＦ−１７Ｈ構築物に対する染色の様子と類似していた
（図７Ｂ）。Ｍｇｆ^S117Hの細胞質ドメインの配列分析（ＫＹＡＡＴＥＲＥＲＩ
ＳＲＧＶＩＶＤＶＳＴＬＬＰＳＨＳＧＷ；（５））により、チロシナーゼ、ＬＩ
ＭＰ ＩＩおよびＣＤ３（Ｄ¹⁷ｘｘｘＬＬ²²）中で同定された、貪食とリゾソー
ム／メラノソーム標的と相同な配列が明らかとなった（１１参照）。さらに、Ｍ
ｇｆ^S117H中のこの推定モチーフの一部であるロイシン残基（Ｌ²¹Ｌ²²）のアラ
ニンへの突然変異により、分極ＭＤＣＫ細胞中のＴａｃ−１７Ｈ−ＬＬＡＡの細
胞間蓄積はなくなったが、頂端に蓄積した（図７Ｊ）。さらに、ＣＯＳ−７細胞
中の抗Ｔａｃ内在化分析を用いて、Ｍｇｆ^S117H突然変異の細胞間局在化が表面
に発現したＭｇｆ^S117HＴａｃキメラの側細胞作用の増加によるかどうかを試験
した。実際、野生型Ｔａｃ−ＳＣＦと比較して、相当多量のＴａｃ−ＳＣＦ−１
７Ｈ／抗Ｔａｃ複合体が内在化し（図７Ｅ）、同様な細胞間染色パターンがＴａ
ｃ−ｔｙｒ構築物についても観測された（図１７Ｈ）。さらに、Ｔａｃ−ＳＣＦ
−１７Ｈキメラの内在化はジロイシン突然変異（１７Ｈ−ＬＬＡＡ、図７Ｋ）で
妨害された。このことは、Ｍｇｆ^S117H突然変異（８）中で観測される細胞表面
ＳＣＦ量の減少は、Ｍｇｆ^S117H突然変異体を貪食により細胞表面から構成的に
除去したためであることを示唆する。したがって、Ｍｇｆ^S117H突然変異はＳＣ
Ｆの貪食に関して機能突然変異を分子レベルで獲得したことを現す。

【０２０７】 実施例６：効率的なＥＲからゴルジへの輸送、および細胞表面上の効率的な露
出にＣ−末端バリンが必要である 上記のＧＦＰ標的ＳＣＦ構築物を実験で使用した。パルス追跡実験を行うため
、ＧＦＰの蛍光体のフォーメーションをタイマーとして使用する。ＧＦＰの蛍光
体がリボソームでＧＦＰを合成後、３０分以内に生成することが示された（チャ
ルフィエ（chalfie）およびカイン（Kain）、1998年）。したがって、観測者は
新たに翻訳されたＧＦＰ融合タンパク質を、生きた細胞内でこの時間枠内で観測
することが可能である。その結果、野生型ＳＣＦ−ＧＦＰ融合タンパク質のみが
細胞表面、または後−ゴルジ輸送ビヒクル上で観測される（図９Ａ、Ｇ）。Ｃ−
末端バリンを除去（図９Ｂ、Ｈ）するか、グルタミンで置換するかバリンに別な
配列を付加すると（図２Ａ参照）、ＳＣＦ−ＧＦＰキメラタンパク質がＥＲコン
パートメント内に蓄積していることがわかる。この局在化はＥＲコンパートメン
トに対する特異的マーカーであるカレティクリンの２重染色で証明された（デー
タは示されない）。したがって、Ｃ−末端バリンの欠失したすべての突然変異構
築物がＥＲ中に保持され、細胞表面輸送が遅くなり、ＥＲから細胞表面への全体
的なタンパク質の流れを通じて行われる。ＥＲ放出量が減少することは、細胞表
面の定常状態ＳＣＦレベルが減少する結果となる。過渡的に形質移入されたＣＯ
Ｓ−７細胞（繊維芽細胞）の表面ビオチン化、アビジン沈殿とその後の抗ＳＣＦ
ブロッティングで測定して、野生型ＳＣＦ−ＧＦＰ構築物の量は１００％発現レ
ベルに設定された（８）。それぞれの細胞による等量のタンパク質発現が試験さ
れた（８）。Ｃ−末端バリン残基を除去すると、表面発現は野生型構築物の６１
％であったが、１７Ｈ構築物の発現はわずか２１％であった。細胞質尾部を含む
様々な欠損突然変異体の発現は４０〜６０％であった（例えばｄ５突然変異体
４１％）。膜貫通アンカーを欠失する構築物の表面発現は検出されなかった。し
たがって、インビボでのこのバリン抗原決定基をブロックすると、細胞表面での
ＳＣＦの発現が減少する結果になると考えられる。その結果、本発明によれば、
ＣＳＦ−１がＥＲから放出され、細胞表面に効率的に露出するためには、同じ細
胞質保存性バリン残基が必要である。

【０２０８】 実施例７： 細胞質尾部の競合阻害による分極および細胞表面発現の変化 ＣＭＶプロモーターで促進される、ＳＣＦの野生型細胞質尾部とのＧＦＰの融
合タンパク質（ＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴ）を製作した。この構築物は細胞質で発現
し、そこで過剰発現のため高発現レベルに蓄積する。図１１および１２にＧＦＰ
−ＳＣＦ−ＣＴを発現する密集ＭＤＣＫＩＩ細胞と、基底側部発現に対するレポ
ーターとしての野生型膜貫通Ｔａｃ−ＳＣＦの実施例を示す（図１１Ｂおよび１
２Ａ）。図１１は、適度の量のＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴを発現する細胞では、Ｔａ
ｃ−ＳＣＦリポーターの基底側部発現は変化しないことを示す。しかしながら、
ＳＣＦの可溶性細胞質尾部を高量（ＧＦＰと結合）で発現する細胞では、外側膜
での膜貫通レポーター構築物の正常な局在化が乱され、その結果、頂端および細
胞間蓄積を生じる。同様な状況が図１２に示されるが、そこでは共焦点切片を各
パネルの下に作成し（上部パネル）、対応するＺ走査がその下に示される（図示
した白線に沿ってＺ−走査を行った）。繰り返すと、高度発現ＧＦＰ−ＳＣＦ−
ＣＴ細胞では、膜貫通Ｔａｃ−ＳＣＦレポーター構築物が頂端に蓄積するが、そ
の発現は低い（右側の細胞群）。

【０２０９】 これらの結果は、抗原決定基との競合に基づく阻害剤、 およびＳＣＦおよび
ＣＳＦ−１の細胞質尾部（基底側部標的ドメインおよびＣ−末端バリン）中の特
定の抗原決定基を被覆する阻害剤の開発は、インビボでのＳＣＦおよびＣＳＦ−
１の局在化を変化させる機能を有することを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＳＣＦ−ＧＦＰキメラは、分極したＭＤＣＫII細胞の基底側部の方面に局在する
。 固定したＭＤＣＫIIの野生型の膜結合（Ｍ２）ＳＣＦ−ＧＦＰタンパク質（Ａ
、ＦＩＴＣチャンネル）、および抗Ｅカドヘリン染色（Ｂ、Texas Redチャンネ
ル）の共焦点顕微鏡検査。単層の対応するＺ走査を下に示す。個々の細胞の側方
領域における染色の重複に注目されたい。 パネルの上に、示差的に切断した２種類の野生型形態のＳＣＦ（ＳＣＦ−Ｍ１
；切断可能、およびＳＣＦ−Ｍ２；切断不能）、およびＧＦＰとのＳＣＦのキメ
ラ（ＳＣＦ−ＧＦＰ）の模式図を示す。ＥＧＦＰを、エキソン５／６接合部に対
する５′に挿入して（ＳＳＴＬＧＰＥＫ／ＤＳＲＶ）、それが下記の配列を招い
た：ＳＳＴＬＧＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＱＳ−ＩＶ．．．（ＥＧＦＰ）．．．
ＹＫ−ＴＧＰＥＫ／ＤＳＲＶ（一文字アミノ酸コード；ｍｙｃタグの配列に下線
を施した）。ＳＰ：シグナルペプチド、ＲＢＤ：ＳＣＦ受容体結合ドメイン、Ｐ
ＣＳ（矢印）：タンパク質分解の部位、ＭＤ：膜ドメイン、ＣＴ：細胞質尾部、
ＥＧＦＰ：増強された緑色蛍光タンパク質（ｍｙｃエピトープのタグは、明解さ
のために図面から削除した）。Ｂにおける棒線は、２４μmに相当する。

【図２Ａ】 野生型および突然変異ＳＣＦの細胞質尾部の配列 （Ａ）マウスＳＣＦの野生型、および細胞質尾部の突然変異種の配列の整列、な
らびにＭＤＣＫII細胞内でのそれぞれの定常状態での分布。（１）構成体の名称
は、アミノ酸欠失（点線で標識した）または点突然変異（太字であり、下線を施
した）の部位を表す。（２）分極したＭＤＣＫII細胞内でのＧＦＰおよびＴａｃ
のＳＣＦキメラタンパク質の定常状態での局在（ｗｔ：野生型、ＢＬ：基底側部
、ＡＰ：頂端）。欠失は点線で標識し、点突然変異は太字であり、下線を施した
。（３）定常状態での分布。Ｓ：表面、Ｉ：ＥＲ（ＥＲ）または小胞（vesic）
での内部。（４）エンドサイトーシスできる能力を、構成体のそれぞれについて
示した（−：取り込まれず、＋：程々に取り込まれた、＋＋：強く取り込まれた
、＋＋＋：非常に強く取り込まれた、ｎｄ：決定されなかった）。

【図２Ｂ】 野生型および突然変異ＳＣＦの細胞質尾部の配列 （Ｂ）異なるＳＣＦ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部配列のクラスタルＷ整列。
GenBank登録番号：ヒト（M59964）、マウス（M57647）、イヌ（S53329）、ウマ
（AF053498）、ウシ（D28934）、ヒツジ（U89874）、ネコ（D50833）、ブタ（L0
7786）、ニワトリ（D13516）、ウズラ（U43078）、およびアホロートルAmbystom
a mexicanum（サンショウウオ、AF119044）。ドブネズミRattus norvegicus（ラ
ット、AF071204）に対する配列は、マウスと同一である。

【図３】 分極したＭＤＣＫII細胞でのＳＣＦ−ＧＦＰ構成体の基底側部標的化には、ロイ
シン２６が必要とされる。 生存する野生型（Ａ）および突然変異ＳＣＦ−ＧＦＰ−Ｍ２（Ｂ〜Ｆ）を発現
する集密的ＭＤＣＫII細胞の共焦点顕微鏡検査（ＦＩＴＣチャンネル）。基底側
部染色は、ロイシン２６からアラニンへ（Ｂ）、またはメチオニン２５およびロ
イシン２６から二重アラニンへ（Ｄ）の突然変異の際に失われた。セリン２４か
らアラニン（Ｃ）またはアスパラギン酸（Ｅ）への置換、ならびにグルタミン酸
１９からリシンへの変化（Ｆ）は、構成体の基底側部局在を変えなかった。各パ
ネルの下に、対応するＺ走査を示す。Ｆにおける棒線は、２４μmに相当する。

【図４】 ＳＣＦにおける基底側部標的化決定因子は、細胞外ドメインとは無関係に作用す
る。 抗Ｔａｃ抗体で染色した、固定したＭＤＣＫII細胞を、Ｔａｃ−ＥＧＦＰで（
Ａ）、および野生型（Ｂ）または突然変異種（Ｃ〜Ｆ）のＴａｃ−ＳＣＦキメラ
構成体で安定的にトランスフェクションした共焦点顕微鏡検査。Ｔａｃ−ＳＣＦ
キメラを表す図式を、パネルの上に示す。融合タンパク質は、ＩＬ２受容体α鎖
（Ｔａｃ）の細胞外ドメインと、ＳＣＦの膜貫通および細胞質配列とからなる。
Ｃ末端ＥＧＦＰ融合した変更されなかったＴａｃの抗Ｔａｃ抗体染色を示す（Ａ
）。野生型ＳＣＦ配列とのＴａｃ−ＳＣＦキメラ（Ｂ）。ＳＣＦの細胞質尾部か
らの最後の８アミノ酸の欠失は、Ｔａｃハイブリッドの基底側部標的化を変化さ
せない（ｄ２９）（Ｃ）。しかし、最後の１５アミノ酸（ｄ２２）（Ｄ）、また
は第２１〜２８アミノ酸（Ｅ）の除去は、Ｔａｃ−ＳＣＦの頂端局在を招いた。
ロイシン２６含有領域に対するＮ末端アミノ酸の欠失（ｄ１２〜２０）は、キメ
ラタンパク質の基底側部とともに頂端の局在も招いた（Ｆ）。各パネルの下に、
対応するＺ走査を示す。ＳＰ：それぞれ、ＳＣＦおよびＴａｃのシグナルペプチ
ド、ＥＤ：細胞外ドメイン。Ｆにおける棒線は、２４μmに相当する。

【図５】 酸性クラスターは、単量体ロイシン依存性基底側部標的化決定因子を助けた。 抗Ｔａｃ抗体で染色した、固定したＭＤＣＫII細胞を、疎水性および酸性アミ
ノ酸のＴａｃ−ＳＣＦ点突然変異で安定的にトランスフェクションした共焦点顕
微鏡検査。メチオニン２５およびロイシン２６の二重アラニン置換（Ｍ２５Ａ／
Ｌ２６Ａ）を有するＴａｃ−ＳＣＦキメラの頂端局在（Ａ）。メチオニン２５で
のアラニンへの単一点突然変異は、基底側部標的化を変化させなかった（Ｂ）。
同様に、グルタミン酸２２のアラニンへの点突然変異（Ｅ２２Ａ）は、基底側部
標的化に影響しなかった（Ｃ）。酸性クラスター¹⁸ＥＥＤ²⁰のアラニン置換（Ｅ
−Ｄ１８Ａ−Ａ）は、Ｔａｃキメラタンパク質の基底側部とともに頂端の蓄積を
招いた（Ｄ）。各パネルの下に、対応するＺ走査を示す。Ｄにおける棒線は、２
４μmに相当する。

【図６】 ＣＳＦ−１におけるロイシン決定因子の機能的保存 抗Ｔａｃ抗体で染色した、固定したＭＤＣＫII細胞を、野生型、ならびにＴａ
ｃ−ＳＣＦ（Ａ、Ｂ）およびＴａｃ−ＣＳＦ−１（Ｃ、Ｄ）キメラのロイシン−
アラニン突然変異（Ｌ２６Ａ、ＳＣＦ；Ｌ２４Ａ、ＣＳＦ−１）で安定的にトラ
ンスフェクションした共焦点顕微鏡検査。定常状態レベルでの野生型と対比して
の突然変異キメラ構成体の基底側部と頂端との発現の差を認識するために、核（
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）および頂端細胞表面（Ａ′、Ｂ′、Ｃ′、Ｄ′）のレベルでの
共焦点切片を示す。各パネルの下に、対応するＺ走査を示す。Ｄ′における棒線
は、２４μmに相当する。（Ｅ）マウスＣＳＦ−１とのマウスＳＣＦの細胞質尾
部配列の比較。この研究（酸性クラスターおよびロイシン²⁶）で特定された、Ｓ
ＣＦに対する基底側部標的化配列、およびＣＳＦ−１における機能的に保存され
たロイシン²⁴に下線を施した。

【図７】 リソソーム標的化シグナルによるＭｇｆ^Sl17H突然変異種Ｔａｃ−ＳＣＦのエン
ドサイトーシス 異なるＴａｃ−ＳＣＦ構成体（Ａ、Ｄ、Ｊ）およびＴａｃ−チロシナーゼ（Ｔ
ａｃ−ｔｙｒ、Ｇ）で安定的にトランスフェクションした、抗Ｔａｃ抗体標識化
した、集密的ＭＤＣＫII細胞の、核または頂端表面のレベルでの共焦点顕微鏡に
よる切片。細胞内Ｔａｃキメラの弱い染色のみが、野生型Ｔａｃ−ＳＣＦ発現細
胞で検出された（Ａ）。Ｔａｃ−ＳＣＦ−１７Ｈ構成体でトランスフェクション
した細胞では（Ｄ）、広範な細胞内小胞状抗Ｔａｃ染色を観察することができた
が、これは、Ｔａｃ−ｔｙｒキメラでトランスフェクションした細胞（Ｇ）に類
似した。Ｔａｃ−ＳＣＦ−１７Ｈの推定される取り込みモチーフのジロイシンの
ジアラニンへの突然変異（１７Ｈ−ＬＬＡＡ）は、細胞内局在の喪失を招いたが
、頂端局在へと導いた（Ｊ）。 野生型、および突然変異種Ｔａｃ−ＳＣＦまたはＴａｃ−ｔｙｒ構成体に結合
した、エンドサイトーシスされた抗Ｔａｃ抗体を、ＣＯＳ−７細胞に一時的にト
ランスフェクションした標準的な蛍光顕微鏡検査。３７℃で３０分後、取り込ま
れたＴａｃ−ＳＣＦ（またはｔｙｒ）／抗Ｔａｃ抗体複合体を、細胞表面に結合
した、取り込まれなかった抗体の酸除去あり（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）、または酸除去
なし（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）で視覚化した。野生型Ｔａｃ−ＳＣＦタンパク質は、３
０分の温置期間の間に取り込まれなかった（Ｂ）。対照的に、Ｔａｃ−ＳＣＦ−
１７Ｈ突然変異タンパク質は、大きい細胞内小胞内に蓄積した（Ｅ）。同様に、
Ｔａｃ−ｔｙｒ構成体は、効率的に細胞内取り込みされた（Ｈ）。しかし、Ｔａ
ｃ−ＳＣＦ−１７Ｈにおけるジロイシン突然変異（１７Ｈ−ＬＬＡＡ）は、細胞
表面に結合した抗Ｔａｃ抗体を取り込める能力を失った（Ｋ）。匹敵するレベル
の異なるＴａｃ−ＳＣＦ構成体が、初め、ＣＯＳ−７細胞表面で発現されたが、
これは、平行培養の染色によって示されたとおりであり、これからは抗Ｔａｃ抗
体が、細胞表面から除去されなかった（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。Ｌにおける棒線は、
２４μmに相当する。

【図８】 ＳＣＦにおける細胞質突然変異の多方面の生物学的効果 それぞれ、基底ケラチノサイト（Ａ）、セルトリ細胞（Ｃ）、およびニューロ
ン（Ｅ）の基底側部および樹枝状態様におけるＳＣＦの分極した発現の例示であ
る。ＳＣＦの細胞表面発現は、骨髄の非分極間質細胞、または皮膚の真皮繊維芽
細胞でも見出される（Ｇ）。細胞表面ＳＣＦタンパク質は、灰色の陰影で表され
、ｃ−ｋｉｔ発現（ＳＣＦ依存性）細胞は、濃い陰影で表される（Ａ、Ｃ、Ｅ、
Ｇ）。ＳＣＦの細胞質標的化決定因子の突然変異は、頂端または軸索蓄積はもと
より、細胞表面発現の低下へも導く（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈにおける淡い陰影）。その
結果、色素沈着の欠損（Ｂ）、雄における不稔性（Ｄ）、学習（Ｆ）および造血
（Ｈ）の欠損が、それぞれの組織で観察される（影響された細胞は、大きさおよ
び数の低減、ならびに淡い陰影によって示される；Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）。ニューロ
ン中の野生型および細胞質突然変異種ＳＣＦタンパク質の樹枝状および軸索局在
は、本論文で報告された上皮細胞での分極した発現パターンから外挿されている
ことに留意されたい。空間的学習の喪失は、これまでは、ＳＣＦ（Ｍｇｆ^Sld）
の膜貫通および細胞質の配列を欠く、分極した上皮の頂端態様から分泌されるＳ
ＣＦの突然変異種形態のマウスで立証されているにすぎない（８）。ｗｔ：野生
型組織、mutant：ＳＣＦの細胞質尾部突然変異種を発現する組織。

【図９】 ＥＲ区画でのＳＣＦ−ＧＦＰタンパク質の蓄積 ＣＯＳ−７細胞を、野生型のか、またはＣ末端に欠失を有するＳＣＦ−ＧＦＰ
融合タンパク質で一時的にトランスフェクションした。２４時間後、ＧＦＰ蛍光
を記録した。パネルＧおよびＨは、ＡおよびＢ内の指定された部域の拡大図を表
す。ｗｔ：野生型細胞質尾部、ｄ３６〜ｄ０５：ＳＣＦの細胞質尾部のアミノ酸
に対応するＣ末端欠失。

【図１０】 Ａ：二つの標的化ドメイン、および推定されるアダプタータンパク質を包含する
ＳＣＦのモデル。 Ｂ：表皮におけるメラニン細胞の局在および挙動を、ＳＣＦの基底側部発現の変
更（中央のパネル）、または細胞表面発現の低下（右のパネル）によって変更で
きる方法のあり得るモデル。

【図１１】 ＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴおよびＴａｃ−ＳＣＦリポーターで二重トランスフェク
ションした、単層のＭＤＣＫII細胞。ＧＦＰ蛍光を、Ａで、および抗Ｔａｃ抗体
の染色（ＢにTexas redで明らかにされている）で示す。Ｔａｃ−ＳＣＦ染色は
、高度に陽性のＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴ細胞では破壊される。

【図１２】 ＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴおよびＴａｃ−ＳＣＦリポーターでトランスフェクション
したＭＤＣＫII単層の共焦点顕微鏡切片。単層の抗Ｔａｃ抗体の染色は、Ａに示
すが、ＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴの蛍光は、Ｂに示す。各パネルの下に、（指定され
た白線沿いの）対応するＺ走査を示す。Ｔａｃ−ＳＣＦリポーターは、高度に発
現するＧＦＰ−ＳＣＦ−ＣＴ細胞内で頂端部に蓄積する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年１月１０日（２００２．１．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/7088 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８４ 38/00 48/00 ４Ｃ０８６ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/04 ４Ｈ０４５ 48/00 5/18 Ａ６１Ｐ 1/04 11/00 5/18 15/08 11/00 17/00 15/08 17/06 17/00 17/16 17/06 19/02 17/16 19/10 19/02 35/00 19/10 35/02 35/00 37/08 35/02 43/00 １０５ 37/08 １０７ 43/00 １０５ １１１ １０７ Ｃ０７Ｋ 7/06 １１１ 14/52 Ｃ０７Ｋ 7/06 16/24 14/52 19/00 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB14 BB24 BB29 BB50 CB01 DA13 DA36 FA16 FB02 FB03 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA01 DA02 EA04 FA18 GA11 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ20 QQ79 QR48 QR77 4B065 AA01X AA88X AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C083 AD411 AD601 BB51 CC19 EE12 EE13 EE16 EE17 FF01 4C084 AA01 AA02 AA13 BA01 BA02 BA08 BA17 DC50 NA14 ZA811 ZA891 ZA961 ZA971 ZB131 ZB212 ZB222 ZB261 ZB271 ZC061 ZC202 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA81 ZA89 ZA96 ZA97 ZB13 ZB21 ZB22 ZB26 ZB27 ZC06 ZC20 4H045 AA10 AA11 AA30 BA14 BA41 CA40 DA01 DA75 EA20 EA28 FA72 FA74

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ酸配列： Ｘ₁ｈ₂Ｘ₃ｈ₄Ｌｐ₅ｐ₆ 〔式中、Ｘ₁は、極性アミノ酸残基またはアラニンを表し、 ｈ₂は、いかなる疎水性アミノ酸残基も表し、 Ｘ₃は、いかなるアミノ酸残基も表し、 ｈ₄は、ロイシンおよびイソロイシン以外のいかなる疎水性アミノ酸残基も表
   し、 Ｌは、ロイシン残基を表し、 ｐ₅は、いかなる極性アミノ酸残基も表し、 ｐ₆は、いかなる極性アミノ酸も表す〕 からなるモノロイシン依存性基底側部選別シグナル。
2. 【請求項２】 Ｘ₁が、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）またはアラ
   ニン（Ａ）残基を表し、 ｈ₂が、イソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）残基を表し、 Ｘ₃が、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）またはアスパラギン酸（Ｄ）残基を表
   し、 ｈ₄が、メチオニン（Ｍ）またはアラニン（Ａ）残基を表し、 ｐ₅が、グルタミン（Ｑ）またはアスパラギン残基（Ｎ）を表し、 ｐ₆が、グルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）残基を表す、請求項１記
   載のモノロイシン依存性基底側部選別シグナル。
3. 【請求項３】 （Ｘ₁；ｈ₂；Ｘ₃；ｈ₄；ｐ₅；ｐ₆）が、 （ｉ）（いかなる極性アミノ酸残基もしくはＡ；Ｉ；Ｓ；Ｍ；Ｑ；ＱもしくはＥ
   ）、 （ii）（Ｅ；いかなる疎水性アミノ酸残基；Ｓ；Ｍ；Ｑ；ＱもしくはＥ）、 （iii）（Ｅ；Ｉ；いかなるアミノ酸残基；Ｍ；Ｑ；ＱもしくはＥ）、 （iv）（Ｅ；Ｉ；Ｓ；ロイシンおよびイソロイシン以外のいかなる疎水性アミノ
   酸残基；Ｑ；ＱもしくはＥ）、 （ｖ）（Ｅ；Ｉ；Ｓ；Ｍ；いかなる極性アミノ酸残基；ＱもしくはＥ）、または
   （vi）（Ｅ；Ｉ；Ｓ；Ｍ；Ｑ；いかなる極性アミノ酸残基） を表す、請求項１記載のモノロイシン依存性基底側部選別シグナル。
4. 【請求項４】 下記のアミノ酸配列：ＥＩＳＭＬＱＱ、ＥＩＳＭＬＱＥ、Ａ
   ＩＳＭＬＱＱ、ＡＩＳＭＬＱＥ、ＱＩＳＭＬＱＱ、ＱＩＳＭＬＱＥ、ＥＡＳＭＬ
   ＱＱ、ＥＡＳＭＬＱＥ、ＥＩＤＭＬＱＱ、ＥＩＤＭＬＱＥ、ＥＩＡＭＬＱＱ、Ｅ
   ＩＡＭＬＱＥ、ＥＩＳＡＬＱＱ、ＥＩＳＡＬＱＥ、ＥＩＳＭＬＮＱ、ＥＩＳＭＬ
   ＮＥおよびＱＡＳＭＬＮＱのいずれか一つからなる、請求項３記載の基底側部選
   別シグナル。
5. 【請求項５】 プロリン残基を欠く、請求項３記載の基底側部選別シグナル
   。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナル
   を含むペプチドまたはタンパク質であって、該ペプチドまたはタンパク質が、全
   長のヒト、マウス、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウズラ
   、ラットまたはサンショウウオＳＣＦを含まないことを条件とする、ペプチドま
   たはタンパク質。
7. 【請求項７】 少なくとも一つの酸性クラスターをさらに含む、請求項６記
   載のペプチドまたはタンパク質。
8. 【請求項８】 該酸性クラスターが、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギ
   ン酸（Ｄ）から選ばれる少なくとも２つの酸性アミノ酸を含む、請求項７記載の
   ペプチドまたはタンパク質。
9. 【請求項９】 該酸性クラスターが、モノロイシン基底側部選別シグナルの
   ロイシンから８または９アミノ酸に位置するグルタミン酸残基である、請求項７
   記載のペプチドまたはタンパク質。
10. 【請求項１０】 該酸性クラスターが、アミノ酸配列ＥＥＤもしくはＱＥＥ
    、ＥＡＥ、またはＥＫＤを含む、請求項７記載のペプチドまたはタンパク質。
11. 【請求項１１】 該酸性クラスターが、基底側部選別シグナルに対するＮ末
    端である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質。
12. 【請求項１２】 連続する少なくとも４個の荷電アミノ酸のクラスターをさ
    らに含む、請求項６記載のペプチドまたはタンパク質。
13. 【請求項１３】 該連続する４個のアミノ酸が、交互に正および負に荷電し
    ている、請求項１２記載のペプチドまたはタンパク質。
14. 【請求項１４】 該追加のクラスターが、アミノ酸配列ＫＥＲＥ、ＫＥＫＥ
    、ＤＥＤＲまたはＥＥＤＲ〔式中、Ｋはリシン残基を、Ｅはグルタミン酸残基を
    、Ｒはアルギニン残基を、Ｄはアスパラギン酸残基をそれぞれ表す〕を含む、請
    求項１２記載のペプチドまたはタンパク質。
15. 【請求項１５】 該追加のクラスターが、基底側部選別シグナルに対するＣ
    末端である、請求項１２記載のペプチドまたはタンパク質。
16. 【請求項１６】 さらにバリンをそのＣ末端に含む、請求項６〜１５のいず
    れか一項に記載のペプチドまたはタンパク質。
17. 【請求項１７】 細胞内で発現されたとき、少なくとも一つの細胞質ドメイ
    ンを含む、請求項６〜１６のいずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質。
18. 【請求項１８】 少なくとも一つの膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１
    ７記載のペプチドまたはタンパク質。
19. 【請求項１９】 該基底側部選別シグナルが、細胞質ドメイン内に含まれる
    、請求項１８記載のペプチドまたはタンパク質。
20. 【請求項２０】 基底側部選別シグナル中のロイシンが、膜貫通ドメインか
    ら１５〜３５アミノに位置する、請求項１９記載のペプチドまたはタンパク質。
21. 【請求項２１】 分極した細胞内で発現されたとき、該基底側部選別シグナ
    ルが該細胞の基底側部膜をその標的とさせる、請求項１８〜２０のいずれか一項
    に記載のペプチドまたはタンパク質。
22. 【請求項２２】 細胞内で発現されたとき、該基底側部選別シグナルによっ
    て細胞膜から内部化されない請求項２１記載のペプチドまたはタンパク質。
23. 【請求項２３】 細胞質ドメインが、一般式： ｚ−（Ｘ）_p−Ａｃｃ−（Ｘ）_q−（Ｂａ）−（Ｘ）_r−（Ｖ）_f 〔式中、Ｘは、それぞれ独立して、アミノ酸残基を表し； ｚは、リシン（Ｋ）またはアルギニン残基（Ｒ）を表し； ｐは、１２〜２２の整数を表し； ｑは、０、または１〜４の整数を表し； ｒは、２〜１２の整数を表し； 「Ａｃｃ」は、酸性クラスターを表し； 「Ｂａ」は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナルを表
    し； Ｖは、バリン残基を表し； ｆは、０または１を表し、かつ （Ｘ）で表される複数のアミノ酸残基が、同じであるか、または異なることが
    できる〕 を有する、請求項１９記載のペプチドまたはタンパク質。
24. 【請求項２４】 細胞質ドメインが、図２Ｂに示されるとおり、ヒト、マウ
    ス、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウズラ、ラットまたは
    サンショウウオＳＣＦの細胞質尾部のアミノ酸配列を含む、請求項２３記載のペ
    プチドまたはタンパク質。
25. 【請求項２５】 分極した細胞内で過剰発現されたとき、該細胞内でさらに
    発現されるタンパク質の基底側部発現を阻害できる能力を有する、請求項１〜２
    ４のいずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質。
26. 【請求項２６】 ・請求項１〜６のいずれか一項に記載の基底側部選別シグ
    ナル、または ・該シグナルを含むペプチドもしくはタンパク質の基底側部選別シグナル を特異的に認識する抗体、又はそのフラグメント。
27. 【請求項２７】 一本鎖抗体またはイントラボディーである、請求項２６記
    載の抗体。
28. 【請求項２８】 細胞内で発現されるタンパク質の基底側部発現を阻害でき
    る能力を有する、請求項２６または２７記載の抗体。
29. 【請求項２９】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナ
    ルをコードしている配列を含む核酸分子。
30. 【請求項３０】 請求項６〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質または
    ペプチドをコードしている配列を含む核酸分子。
31. 【請求項３１】 請求項２９または３０記載の核酸分子と相補的である核酸
    分子。
32. 【請求項３２】 請求項６〜２８のいずれか一項に記載のペプチドまたはタ
    ンパク質を発現している細胞。
33. 【請求項３３】 請求項２９〜３０のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞
    。
34. 【請求項３４】 該細胞が、分極している、たとえばＭＤＣＫ細胞である、
    請求項３２または３３記載の細胞。
35. 【請求項３５】 分極した細胞の側底膜内で特異的に発現されるのを常とす
    る、膜貫通タンパク質の基底側部発現を阻害するための、請求項１〜２８のいず
    れか一項に記載のペプチドまたはタンパク質の使用。
36. 【請求項３６】 モノロイシン基底側部選別シグナルを担持する、Ｉ型また
    はII型のトポロジーの膜貫通タンパク質の基底側部選別を廃絶するための、請求
    項３５記載の使用。
37. 【請求項３７】 該膜貫通タンパク質が、ＳＣＦである、請求項３５または
    ３６記載の使用。
38. 【請求項３８】 基底側部を標的にさせた膜貫通タンパク質Ｐの基底側部発
    現を調整する方法であって、Ｐを発現する細胞に、請求項１〜５のいずれか一項
    に記載の基底側部選別シグナル、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載の
    タンパク質もしくはペプチドを導入することを含む方法。
39. 【請求項３９】 基底側部タンパク質ＰがＳＣＦであり、該細胞が、セルト
    リ細胞、ケラチノサイト、肺上皮細胞、腎上皮細胞、皮膚の内皮細胞、呼吸およ
    び消化管、大動脈ならびに骨髄からの細胞、骨芽細胞、胸腺上皮細胞、卵巣細胞
    、およびＳＣＦを発現するニューロンから選ばれる、請求項３８記載の方法。
40. 【請求項４０】 膜貫通タンパク質Ｔの膜保持を調整する方法であって、Ｔ
    を発現する細胞に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナル
    、または請求項１〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチドを
    導入することを含む方法。
41. 【請求項４１】 膜貫通タンパク質ＴがＳＣＦであり、該細胞が、皮膚の繊
    維芽細胞、心房、大動脈の平滑筋細胞、骨髄間質細胞およびライディッヒ細胞か
    ら選ばれる、請求項４０記載の方法。
42. 【請求項４２】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナ
    ルを有する膜貫通タンパク質Ｔの基底側部発現を得る方法であって、該タンパク
    質をコードしている核酸を分極した細胞内で発現させることを含む方法。
43. 【請求項４３】 該膜貫通タンパク質Ｔが、（ｉ）可溶性タンパク質Ｐ、（
    ii）シグナルペプチド、（iii）膜貫通ドメイン、および（iv）請求項１〜５の
    いずれか一項に記載のシグナルを含むキメラタンパク質であり、該シグナルペプ
    チドおよび膜貫通ドメインの少なくとも一方が、タンパク質Ｐについて異種であ
    る、請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 該タンパク質Ｔが、（ｉ）シグナルペプチド、（ii）細胞
    外ドメイン、（iii）膜貫通ドメイン、および（iv）式： ｚ−（Ｘ）_p−Ａｃｃ−（Ｘ）_q−（Ｂａ）−（Ｘ）_r−（Ｖ）_f 〔式中、Ｘは、それぞれ、アミノ酸残基を表し； ｚは、リシン（Ｋ）またはアルギニン残基（Ｒ）を表し； ｐは、１２〜２２の整数を表し； ｑは、０、または１〜４の整数を表し； ｒは、２〜１２の整数を表し； 「Ａｃｃ」は、酸性クラスターを表し； 「Ｂａ」は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部選別シグナルを表
    し； Ｖは、バリン残基を表し； ｆは、０または１を表し、かつ（Ｘ）で表される複数のアミノ酸残基が、同じ
    であるか、または異なることができる〕 を有する細胞質尾部、 を含むキメラ膜貫通タンパク質であって、該細胞質尾部が、タンパク質Ｔに関し
    て異種であり、Ｔの内生の細胞質尾部に加えてか、または該内生の尾部の全体も
    しくは部分的置換としてかのいずれかでＴに存在する、請求項４２記載の方法。
45. 【請求項４５】 基底側部発現の阻害物質を特定するためのスクリーニング
    法であって、 ・分極した細胞に、阻害特性について試験しようとする化合物を導入し、 ・該細胞内の、リポータータンパク質の基底側部発現の改変、およびこのリポー
    タータンパク質に対する頂端発現の出現を検出し、 ・場合により、こうして特定された阻害物質を回収する ことを含むスクリーニング法。
46. 【請求項４６】 該リポータータンパク質が、図１に示されるとおりのキメ
    ラＧＦＰ−ＳＣＦタンパク質である、請求項４５記載のスクリーニング法。
47. 【請求項４７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の基底側部標的化シグ
    ナルの、該シグナルを含むタンパク質の基底側部発現を阻害できる阻害物質であ
    って、請求項４５または４６記載のスクリーニング法を実施することによって得
    られる阻害物質。
48. 【請求項４８】 該阻害物質が、ペプチド、抗体、抗体のフラグメント、一
    本鎖抗体、イントラボディー、ファージライブラリーの成員によって発現される
    ペプチド、または合成化合物である請求項４７記載の阻害物質。
49. 【請求項４９】 ＳＣＦの細胞内の役割を変更する医薬の製造のための、請
    求項１〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチド、および／ま
    たは請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の核酸、および／または請求項４７
    もしくは４８記載の阻害物質を含む組成物の使用。
50. 【請求項５０】 ＳＣＦの役割の該改変が、メラニン細胞増殖、メラニン細
    胞局在の数または変化の低下へと導く、請求項４９記載の使用。
51. 【請求項５１】 ほくろ、老人性ほくろまたは母斑ほくろのような過度に色
    素沈着した皮膚病変を軽減するための、請求項４９記載の使用。
52. 【請求項５２】 黒色腫細胞を処置するための、請求項４９記載の使用。
53. 【請求項５３】 ＵＶ損傷した皮膚からメラニン細胞を除去するための、請
    求項４９記載の使用。
54. 【請求項５４】 気道および消化管内の肥満細胞が仲介するアレルギー反応
    を防止するための、請求項４９記載の使用。
55. 【請求項５５】 単球増加症、白血病または肥満細胞腫を処置するための、
    請求項４９記載の使用。
56. 【請求項５６】 精子形成または卵子形成の阻害を処置するための、請求項
    ４９記載の使用。
57. 【請求項５７】 骨粗鬆症、または上皮小体機能亢進症の骨を処置するため
    の、請求項４９記載の使用。
58. 【請求項５８】 造血前駆細胞新生物、たとえば急性リンパ芽球性白血病（
    ＡＬＬ）を処置するための、請求項４９記載の使用。
59. 【請求項５９】 乾癬または関節硬化症を処置するための、請求項４９記載
    の使用。
60. 【請求項６０】 皮膚の色素沈着を軽減するための美容学における、請求項
    １〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質もしくはペプチド、および／または
    請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の核酸、および／または請求項４７もし
    くは４８記載の阻害物質を含む組成物の使用。