KR100501550B1

KR100501550B1 - Ｌａｒ 포스파타제 서브유닛에 대한 항체

Info

Publication number: KR100501550B1
Application number: KR10-2000-7013979A
Authority: KR
Inventors: 야마모토히로시; 츠지카와카즈타케; 우치노유키코; 고니시노보루
Original assignee: 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 2005-07-18
Also published as: JP3991327B2; EP1092772A1; EP1092772B1; WO1999064591A1; US7358061B2; DE69936780D1; US20050008645A1; AU4060399A; US20050042222A1; DE69936780T2; KR20010052712A; US6846912B1; EP1460132A1; AU752642B2; US20050026232A1; CA2329776A1; EP1092772A4; ATE369425T1; CA2329776C

Abstract

본 발명은 LAR 포스파타제 서브유닛, 특히 LAR 포스파타제 서브유닛의 세포내 도메인에 특이적인 항체; 이의 생산방법; 상기 항체를 생산하는 세포; 상기 항체를 사용함으로써 LAR/LAR-유도 분자를 정량하고 검사하는 방법; 및 갑상선암을 진단 또는 치료하기 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

ＬＡＲ 포스파타제 서브유닛에 대한 항체{Antibody against LAR phosphatase subunit}

본 발명은 LAR(Leukocyte antigen related : 백혈구 공통 항원 유사분자)에서 포스파타제 활성을 갖는 P-서브유닛(포스파타제 서브유닛)에 대해 특이성을 갖는 항체, 특히 LAR의 세포내 도메인에 대해 특이성을 갖는 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 단백질 티로신 포스파타제의 분석 및 정량, LAR 연관분자의 동정 및 취득, 및 인슐린 저항성에 관한 증상의 치료, 예방, 완화 등을 위한 조치 및 진단에 적용가능한 의약 개발 등에 유용한 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 갑상선암의 진단, 예방 등에 유용한 항체에 관한 것이다.

최근, 동맥경화 발병 메카니즘이 서서히 밝혀지면서, 이의 위험인자가 동정되고 있다. 특히 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 당뇨병 및 흡연이 동맥경화의 4대 위험인자로 인정되었고, 이의 치료가 적극적으로 행해지고 있다. 이들의 병증으로서, 임상적으로 공통되는 것이 인슐린 저항성이다. 인슐린 저항성은 세포에서 인슐린 감수성의 저하와 동일한 것으로, 세포내 당의 처리에 있어서 인슐린의 작용이 저하되는 것을 가리킨다. 이 원인으로서는 인슐린 분비의 이상, 표적세포에 대한 인슐린 수용체의 이상, 세포내 정보 전달계의 이상 및 혈행역학적으로 말초순환장애로 인한 당의 조직에의 공급의 감소 등이 있다. 참조문헌[Reaven, G. M. et al.; Diabetes, 37, 1595-1607, 1988]은 이러한 인슐린 저항성으로 인해 많은 병증이 발생하게 되는 점을 지적하고 있고, 또한 인슐린 저항성, 내당능의 이상, 고인슐린혈증, 고트리글리세라이드혈증, 저HDL콜레스테롤혈증, 고혈압을 복합적으로 갖는 병증을 증후군 X(Syndrom X)로 정의하고, 동맥경화 발병에 깊이 관계하는 것으로 보고하고 있다.

또한 일반적으로 인슐린 저항성에 의한 세포로의 당의 공급이 저하하면, 췌장에서 인슐린 분비를 증진시키고, 고인슐린혈증을 일으키는 것으로 공지되어 있고, 임상적으로도 인슐린 저항성의 문제가 대두되고 있다. 예를 들어 인슐린 저항성, 고인슐린혈증이 당뇨병성 신염을 촉진시키고[Niskanen, L., et al. ; Diabetes, 41, 736-741, 1993], 당뇨병성 망막병증의 빈도가 높아진다[참조문헌: Yip, J. et al. ; Lancet, 341, 369-370, 1993]는 보고가 있다. 따라서, 인슐린 저항성에 의한 플라스미노겐 활성화 인자 저해제 1(PAI-1)의 활성이 상승하고, 혈액 섬유소용해 시스템의 기능을 저하시키며[Potter van Loon BJ et al. ; Metab. Clin. Exp., 42, 945-954, 1993], 죽상동맥경화를 유발하게 된다[Sato, Y. et al., ; Diabetes, 38, 91-96, 1989]고 문헌 등에 보고되어 있다.

당뇨병은 질병률이 전체 인구의 5%이고, 일본인 약 600만명이 이 질환을 앓고 있다. 당뇨병에는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)과 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM)이 있다. IDDM은 당뇨병 전체인구에 대해 약 7%이고, NIDDM은 약 90%로 알려져 있고, 특히 당뇨병의 대다수를 차지하는 NIDDM은 인슐린 저항성이 중요한 발병 원인으로 생각되고 있다.

현재까지는 인슐린 시그날 전달은 세포내 단백질의 티로신 인산화가 중요한 역할을 수행하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 인슐린 수용체는 분자량 약 135kD의 α서브유닛 및 95kD의 β서브유닛 두개의 당단백질 서브유닛이 디설피드 결합에 의해 헤테로테트라머를 형성하고, α2β2구조를 갖는다. α서브유닛은 인슐린 결합 활성을 가지고, β서브유닛은 자기인산화에 의해 활성화되는 단백질 티로신 키나아제(Protein Tyrosin Kinase:PTK) 도메인을 갖는다. 즉 인슐린이 인슐린 수용체의 α쇄에 결합하면, 인슐린 수용체의 β쇄에 존재하고 있는 몇개의 특정 티로신 잔기가 수용체의 티로신 키나아제 활성에 의해 자기인산화된다. 인슐린 수용체 티로신 키나아제는 자기인산화에 의해 그 티로신 키나아제 활성이 더욱 상승된다. 이런 방식으로 활성화된 인슐린 수용체 티로신 키나아제는 세포내에 존재하는 기질인 IRS(Insulin Receptor Substrate)를 티로신 인산화하여, 그 티로신 인산화 IRS-1을 Ash/Grb2 및 PI-3 키나아제를 인식하여 결합함으로써 시그날을 전달하고, 최종적으로 시그날을 받아, 당 대사 및 세포증식과 같은 인슐린에 의한 생물활성을 발현하게 되는 것이 밝혀져 있다[도 9. Goldstein, B.J. et al.; Receptor, 3, 1-15, 1993, Kanai, F. et al.; Biochemical and Biophysical Research Communication, 195(2), 762-768, 1993]. 그러나, 이 인슐린의 시그날 전달에 있어서, 활성화된 인슐린 수용체를 불활성화하는 효소, 즉 시그날 탈인산화 효소인 단백질 티로신 포스파타제(Protein tyrosine phosphatase, 이하 PTP로 약칭한다)에 관한 연구는 전혀 발전되지 않고 있다.

PTP에 관한 연구가 본격적으로 시작된 것은 1988년 피셔(Fisher 등) 그룹에 의해 사람 태반 유래 세포질형의 PTP인 PTP1B의 유전자가 클로닝되고 그의 뉴클레오티드 서열이 밝혀지면서 부터였다[Tonks, N.K. et al.; J.Biol.Chem., 263, 6722-6730, 1988, Charbonneau, H. et al.; Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 85, 7182-7186, 1988]. 결론적으로 PTP1B와 상동성을 나타내는 위치는 공지의 세린/트레오닌 포스파타제(serine/threonine phosphatase)가 아닌, 조혈 시스템의 막통과분자인 CD45의 세포질내 영역중 2개의 위치이다. 더욱이 CD45가 PTP 활성을 갖고 있는 것도 밝혀지게 되었다[Tonks, N.K. et al.; J.Biochemistry, 27, 8695-8701, 1988, Charbonneau, H. et al.; Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 85, 7182-7186, 1988].

현재까지 많은 PTP가 cDNA 서열과의 상동성에 기초하여 클로닝되어, 신규한 PTP가 계속적으로 보고되고 있다[Streuli, M. et al., J. Exp. Med., 168, 1523-1530, 1988; Krueger, N. X. et al., EMBO J., 9, 3241-3252, 1990; and Trowbridge, I. S. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1095, 46-56, 1991]. PTP는 (1)세포막통과부분을 갖는 막형 PTP(LCA(백혈구공통항원(Leukemia Common Antigen)), 즉 CD45이외에, PTP α, β, γ, δ, ε및 ζ 및 LAR) 및 (2)세포막통과부분을 갖지 않는 세포질형 PTP(PTP1B, TC-PTP, PTP-MEG, PTPH1, STEP 및 PTP1C)로 크게 나뉜다.

막형 PTP의 대다수는 세포내에 2개의 PTP 상동성 부분(도메인 1 및 도메인 2, 도 1(a) 및 (b))을 갖고 있다. 현재까지 보고된 PTP에는 Ile/Val-His-Cys-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Xaa-Arg-Ser/Thr-Gly (서열번호 2)의 시스테인을 갖는 서열(signature motif)이 포스파타제 도메인 내에 존재한다. PTP1B의 결정화에 의한 연구로 부터, 이 부위가 PTP 분자표면에 작은 구멍을 형성하고, 시스테인은 구멍의 바닥에 위치하여 인산과의 결합에 직접 관여하는 것으로 알려져 있다[Barford, D. et al., Science, 263, 1397-1404, 1994]. 또한 세린 및 트레오닌이 결합하고 있는 인산은 PTP1B 효소활성의 중심구멍에 미치지 못하기 때문에, 구멍의 깊이가 PTP와 세린/트레오닌 포스파타제의 특이성을 결정하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이 상기 시스테인을 갖는 서열(signature motif)의 효소활성 발현에 관련된 중요성은 돌연변이 실험으로 부터 밝혀졌다[Streuli, M. et al., EMBO J., 9, 2399-2407, 1990]. 이들로부터 도메인 1에 보존된 Cys이 효소활성 발현에 중요하고, 또한 도메인 2는 효소의 기질특이성을 결정하는 것으로 생각된다.

PTP효소 그룹 중, 사람 유래의 LAR은 수용체형 단백질 티로신 포스파타제(PTP)의 CD45 포스파타제 도메인을 프로브로 사용하여 사람 태반 게놈 라이브러리로 부터 글로닝된 수용체형 단백질 티로신 포스파타제이다[(Streuli M. et al., J. Exp. Med., 168, 1553-1562, 1988]. CD45가 혈구 시스템의 세포에서 특이적으로 발현되는 것에 대하여, LAR은 혈구 시스템 이외의 세포, 특히 간장 및 골격 근육 등의 인슐린 감수성 조직에 발현되고 있다[Goldstein B. J., Receptor, 3, 1-15, 1993]. 많은 수용체형 PTP 중에서 LAR은 세포외부 도메인이 세포 접착 분자와 유사하기 때문에 더욱 흥미롭다. 전체 구조는 Ig-유사 도메인과 피브로넥틴III형 도메인으로 이루어지는 150kD의 세포외 E-서브유닛 및 막통과영역 및 2개의 포스파타제 도메인을 갖는 세포내 도메인을 포함하는 85kD P-서브유닛(서열번호 1)이 세포막의 외측에 비공유결합되어 있는 것이 밝혀졌다[도 1. Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897-907, 1992].

현재까지는 LAR의 기능적인 역할이 대다수 보고되어 있다. 예를 들면 LAR이 결핍된 신경세포에서는 뉴로트로핀(Neurotrophin)의 반응성이 감소되고[Yang, T. et al., 27th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, New Orleans, Louisiana, USA, October 25-30, 1997, Society for Neuroscience Abstracts, 23, 1-2, 1997], LAR 활성의 억제에 따라 아포지단백질 B(apolipoprotein B)의 분비가 감소되고[Phung, T. L. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 237(2), 367-371, 1997], 또한 LAR의 발현이 결핍됨에 따라 전골기저부의 콜린 작용성 신경세포의 크기가 작아지게 되고, 해마균상회(hippocampal dentate gyrus )에의 콜린 작용성 신경지배가 감소한다[Yeo, T. T. et al., J. Neurosci. Res., 47(3), 348-360, 1997] . 이러한 방식으로 LAR은 생체내에서 다양한 역할을 하는 것으로 서서히 알려지게 되었다. 현재 최고로 주목 받는 연구로서는 LAR과 인슐린 수용체와의 관계가 있다[Hashimoto, N. et al., J. Biol. Chem., 267(20), 13811-13814, 1992].

1995년 비만한 사람의 지방조직에 대하여 LAR의 티로신 포스파타제 활성이 비정상적으로 상승하며, 이는 인슐린 저항성의 발병 원인으로서, 또는 심장혈관질환의 위험 인자로서 생각되어 주목받고 있다[Ahmad, F. et al., J. Clin. Invest., 95(6) 2806-2812, 1995]. 이후 LAR은 인슐린 수용체와 밀접하게 관련되어 있는다는 것이 연속적으로 보고되었다[Mooney, R. A. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 235(3), 709-712, 1997; Orr, S. R. et al., Biochemical Society Transaction, 25(3), 452S, 1997; Ahmad, F. et al., J. Clin. Investigation, 100(2), 449-458, 1997; Ahmad, F. et al., J. Biol. Chem., 272(1), 448-457, 1997; Norris, K. et al., Febs Letters, 415(3), 243-248, 1997; and Li, P. M. et al., Cellular Signaling, 8(7), 467-473, 1996]. 그리고 이러한 정보에 기초하여, 아메트(Ahmad, F.) 등은 최근 LAR 및 PTP1B가 인슐린 저항성의 치료 목표가 될지도 모르는 보고를 하고 있다[Ahmad, F. et al., Metabolism, Clinical and Experimental, 46(10), 1140-1145, 1997].

현재까지 LAR 및 CD45 등의 PIP에 관한 연구에 의하면, 세포내 시그날 전달 시스템에 있어서 PIP가 PTK와 공동으로 역할을 수행하여 매우 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 밝혀지고 있다.

1992년에 스트라울리(Streuli) 등에 의해, LAR의 E-서브유닛 및 P-서브유닛과의 결합이 비공유결합으로 인해 해리될 수 있고, E-서브유닛이 세포막 표면으로 부터 떨어질 수 있다는 것이 밝혀졌다[Streuli, M. et al., EMBO J., 11(3), 897-907, 1992]. 그러나, 많은 연구자들은 LAR의 세포외 도메인인 E-서브유닛에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 다양한 연구를 행하였지만, 단독으로 포스파타제 활성을 갖는 P-서브유닛은 완전히 무시하고 연구하지 않았다. 예를 들면 LAR의 포스파타제 활성 측정을 의도한 LAR 항체의 사용에 있어서, P-서브유닛에 대한 항체를 사용하지 않으면 전체로서의 포스파타제 활성이 측정되지 않는다. 본 발명자들은 이러한 상황을 감지하고, LAR의 P-서브유닛, 특히 세포내 도메인에 특이성을 갖고, CD45에 대해 특이성을 가지 않는 항체의 제조에 착수하였다.

공지된 단백질 티로신 포스파타제에 대한 항체로서는 CD45의 막통과영역으로부터 포스파타제 도메인 1의 일부에 이르는 196개의 아미노산 잔기의 펩티드를 항원으로 하여 제조된 항체(Transduction Laboratories 제품) 및 PIPα의 포스파타제 도메인 1(250개의 아미노산 잔기)에 대한 항체(Transduction Laboratories 제품)가 공지되어 있다. 이들 항체가 LAR 및 기타 단백질 티로신 포스파타제의 포스파타제 도메인에 대해 어떻게 면역특이성을 갖는가 여부는 불분명하다. 또한 CD45에 특이성을 갖지 않고, LAR의 세포내 도메인에 대해 특이성을 갖는 항체를 제조할 필요성이 있다.

갑상선 종양에는 양성인 갑상선종과 악성인 갑상선암이 있다. 현재 임상적으로 갑상선 종양의 진단은 주로 회진, 초음파진단, 미세침 흡인 세포조직학적 진단법 및 조직절단의 방법이 사용되고 있다. 갑상선 종양은 선종, 유두암, 여포암, 미분화암, 골수암 및 악성 림프종 등으로 분류되고, 갑상선암을 크게 분류하면 분화형 갑상선암(유두암 및 여포암) 및 미분화형 갑상선암으로 분류될 수 있다.갑상선암의 진단에는 회진 및 초음파진단에서 이상이 있는 경우, 주로 환자의 부담이 적은 미세침 흡인 세포조직학적 진단법이 수행되고 있고, 확정적인 진단이 불가능한 경우에는 갑상선조직을 절제하는 조직진단이 수행되고 있다. 그러나, 조직진단의 경우에는 환자의 부담이 크고, 또한 정상적인 조직도 절제될 가능성이 있다. 실제로, 세포조직학적 진단법에 의해 양성/악성의 구별이 곤란한 경우, 조직진단에 의존하는 경우가 많다. 또한 미세침 흡인 세포조직학적 진단법은 조직 단편에 의한 형태학적 관찰과 비교하여 세포와 세포간의 결합이 파괴되기 때문에 확정적인 진단을 내릴 수가 없다. 추가로 대부분의 여포암에 있어서는 세포조직학적 진단법 뿐만 아니라 조직진단을 수행하여도 양성인지 악성인지 구별하는 것이 어려울 때가 있다. 또한 임상의 또는 병리의들은 미세침 흡인 세포조직학적 진단법에서 양성/악성의 구별을 확실히 할 수 있는 방법이 요망되어 왔고, 여포암에 있어서도 이와 같이 진단이 곤란한 병으로 확정적인 판정을 할 수 있는 방법이 절실히 요망되어 왔다.방법이 절실히 요망되어 왔다.

도 1에서 (a)는 LAR의 서브유닛 구조를 도시하는 모식도이고, (b)는 실시예에서 제조된 LAR의 막내 포스파타제 도메인 구조의 돌연변이체를 도시하는 모식도이다.

도 2는 LAR C/S와 인슐린 수용체의 야생형을 공형질감염시킨 COS 세포에 있어서, 인슐린 자극에 따라 유도되는 티로신 인산화의 시간경과에 따른 면역블럿을 도시하는 것이다.

도 3은 LAR의 야생형 또는 돌연변이형과 인슐린 수용체의 야생형을 공형질감염시킨 COS 세포에 있어서, 인산화-탈인산화를 나타내는 면역블럿을 도시하는 것이다.

도 4는 LAR의 야생형 또는 돌연변이체에 의한 인슐린 수용체 β쇄 탈인산화를 나타내는 면역블럿을 도시하는 것이다.

도 5는 인슐린 수용체의 야생형 또는 돌연변이체와 LAR C/S를 공형질감염시킨 COS 세포에 있어서 티로신 인산화를 나타내는 면역블럿을 도시하는 것이다.

도 6은 본 발명의 항체 YU1의 분자량을 나타내는, SDS-폴리아크릴아미드 겔을 도시하는 것이다.

도 7은 본 발명의 항체 YU1의 LAR에 대한 면역 특이성을 나타내는 면역블럿을 도시하는 것이다.

도 8은 인슐린 수용체 티로신 키나아제에 의한 LAR의 인산화를 나타내는 면역블롯을 도시하는 것이다.

도 9는 인슐린 수용체 및 LAR이 관여하고, 인산화 및 탈인산화에 의해 제어되는 인슐린의 시그날 전달의 케스케이드(cascade)를 도시하는 모식도이다.

도 10은 본 발명의 항체 YU1의 사람 갑상선 암조직에 대해 특이적 면역반응성을 비교한, 정상 갑상선 및 암조직의 면역블럿팅 결과를 도시하는 것이다.

도 11 내지 도 13은 본 발명의 항체 YU1을 사용한 사람 갑상선암 조직 단편의 면역염색에 있어서, 암세포의 양성 염색결과를 도시하는 것이다.

도 14는 본 발명의 항체 YU1을 이용하여 마우스에서 LAR의 조직분포를 비교한 면역블럿팅의 결과를 도시하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 LAR 포스파타제 서브유닛, 특히 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체를 제공하는 것이 목적이다. 또한 본 발명은 LAR 포스파타제 서브유닛의 세포외 도메인에 대하여 특이성을 갖고, 단백질 포스파타제에 특이성을 갖지않는 항체를 제공하는 것이다.

상기 항체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열에 의해 코드되는 LAR의 세포내 도메인에 상당하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 항원으로서 제조한 것이 바람직하며, 또한 면역특이성이란 점으로 부터 모노클로닝 항체가 바람직하다.

그리고 관련된 항체는 LAR 포스파타제 도메인 및 기타 단백질 또는 폴리펩티드 단편을 함유하는 융합 단백질을 면역원으로서 사용하여 제조된 것일 수 있다. 관련된 융합 단백질은 구성하고, 기타 단백질 또는 폴리펩티드 단편으로서, 특히 GST(glutamine-S-transferase)가 적당하지만, 이외에도, 폴리히스티딘(바람직하게는 6개의 히스티딘), 칼모듈린 결합 펩티드(CBP:Calmodulin Binding Peptide), 단백질 A 등을 사용하는 것도 가능하다.

폴리히스티딘이 사용되는 경우, 유전자 재조합 방법에 의해 발현된 융합 단백질을 단리정제하기 위하여는 니켈-킬레이트화 수지의 흡착을 이용하는 것이 가능하고, pH변화, EDTA 또는 이미다졸 물질을 첨가함에 의해 상기 수지로 부터 해리하는 것도 가능하다. CBP를 사용하는 경우, 발현시킨 융합 단백질은 칼모듈린 친화 수지를 사용하여 친화 크로마토그래피를 수행하고, 이후 EDTA를 첨가하여 상기 수지로부터 해리시킬 수 있다. 또한 단백질 A를 사용하는 경우, 발현시킨 융합 단백질은 IgG 세파로즈(예를 들면 IgG세파로즈6FF) 컬럼을 사용하여 친화 크로마토그래피를 수행하고, 이후 pH 변화를 통해 상기 수지로부터 해리하는 것도 가능하다.

또한 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질 또는 폴리펩티드 단편의 각각의 예로서, Xpress, Thioredoxin, c-myc, V5 및 HA/c-myc 등을 들 수 있고, 이들을 에피토프(epitope)로서 인식하는 것이 가능한 항체를 사용하여, 목적하는 LAR 포스파타제 서브유닛의 융합 단백질을 발현한 후에 항원-항체 친화컬럼을 이용해 단리 정제하는 것도 가능하다.

상술한 바람직한 면역원인 GST 및 LAR 포스파타제 도메인을 포함하는 융합 단백질은, GST 유전자를 코드하는 영역 및 LAR 유전자의 포스파타제 도메인을 코드하는 영역을 포함하는 발현벡터를 형질전환 또는 형질감염시킨 대장균을 20 내지 30℃에서 16 내지 24시간, 특히 바람직하게는 23 내지 25℃에서 18시간 배양하여, 그 배양액 및/또는 균체로부터 융합 단백질을 단리하는 과정에 의해 적절하게 제조할 수 있다. 또한 이렇게 수득된 융합 단백질은 글루타티온(glutathione)을 갖는 지지체, 예를 들면 글루타디온 세파로즈 비드(bead)의 친화력에 의해 정제되는 것일 수 있고, 상기 글루타티온 세파로즈 비드로부터 융합 단백질을 용출하는 단계는 계면활성제의 존재하에서 가열함으로써 실시할 수 있다. 이러한 계면활성제로는 나트륨 도데실 설페이트, CHAPS (3-[(3-콜아미드 프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판 설포네이트), 데옥시콜린산, 디지토닌(digitonin), n-도데실말토사이드 (1-O-n-도데실-β-D-글루코피라노실 (1-4)-α-D-글루코피라노사이드), 노니데트(Nonidet^TM) P40 (에틸페놀폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n), n-옥틸글루코사이드 (1-O-n-옥틸-βD-글루코피라노사이드), 수크로즈 모노라우레이트, 테시트(Tesit^TM) (도데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n), 트리톤(Triton^TM) X-100 (옥틸페놀폴리 (에틸렌 글리콜 에테르)n), 트윈(Tween^TM) 20 (폴리(옥시에틸렌) n-소르비탄-모노라우레이트), N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 등 [이상 n은 1 이상의 정수를 나타낸다]을 들 수 있다. 융합 단백질을 용출시키는 경우에, 이들의 계면활성제를 동물에 투여하여도 문제가 없는 농도, 바람직하게는 0.1% 나트륨 도데실설페이트의 존재하, 100℃에서 5 내지 10분간 가열한다. 이렇게 목적 면역원으로 바람직하게 정제된 융합 단백질을 수득할 수 있다.

이러한 융합 단백질을 면역원으로 사용하여 모노클로날 항체를 취득하는 경우, 항체의 스크리닝(screening)에는 LAR 포스파타제 서브유닛을 사용하는 것도 좋으나, 면역원으로서 사용된 융합 단백질에서 스크리닝을 실시하는 것이 특이성 면에서 바람직하다.

본 발명의 모노클로날 항체로서, 예를 들면 마우스/마우스의 하이브리도마에 의해 생산되는, 분자량 약 150kD의 항체를 포함하는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 관련된 항체는 인슐린 시그날 전달 시스템의 매커니즘을 밝히기 위한, 또는 인슐린 저항성 및 NIDDM에 유용한 진단방법을 개발하기 위한, 또한 인슐린 저항성을 근거로 하여 증후군 X등의 각종 질환을 예방, 치료, 진단 등에 사용하기 위한 기구로서 사용가능하다. 그리고 LAR 관련분자, 예를 들면 조절자(modulator), 결합 단백질 등의 동정 및 취득에도 본 발명의 항체가 유용하다.

본 발명에 의해 또한 상기 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주가 제공된다. 이 하이브리도마 세포주를, 본 발명자는 1998년 5월 7일 일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고에 위치한 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에, 수탁번호 FERM BP-6343으로 마우스/마우스 하이브리도마 세포주 YU1를 수탁하였다.

본 발명의 항체는 천연산물 유래 또는 전체 또는 부분적으로 합성(화학합성, 유전자 재조합에 의한 합성 등)된, LAR 단백질 및 적어도 LAR 세포내 도메인을 포함하는 단편 및 폴리펩티드(이하 단편 및 폴리펩티드를 총칭하여 'LAR 유래 분자'로 한다)에 대해 특이적인 면역반응성을 갖는다.

또한 본 발명은 LAR 포스파타제 서브유닛에 대해 특이성을 갖는 항체의 제조방법이고, 면역원으로서 상기한 바와 같은 LAR 포스파타제 도메인 및 이외의 단백질 또는 폴리펩티드 단편을 포함하는 융합 단백질, 바람직하게는 GST-LAR 포스파타제 도메인 융합 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다. 여기서 GST이외에 사용가능한 융합 단백질을 구성하는 단백질 또는 폴리펩티드 단편, 이의 융합 단백질의 제조방법은 상기한 바와 같다.

또한 바람직한 면역원인 GST 및 LAR 포스파타제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 GST 유전자를 코드하는 영역 및 LAR 유전자의 포스파타제 도메인을 코드하는 영역을 포함하는 발현벡터를 형질전환 또는 형질감염시킨 대장균을 20 내지 30℃에서 16 내지 24시간, 특히 바람직하게는 23 내지 25℃에서 18시간 배양하여, 그 배양액 및/또는 균체로부터 융합 단백질을 단리하는 과정에 의해 적절하게 제조할 수 있다. 또한 이렇게 수득된 융합 단백질은 글루타티온(glutathione)을 갖는 지지체, 예를 들면 글루타디온 세파로즈의 친화 크로마토그래피에 의해 정제시킬 수 있고, 상기 글루타티온 세파로즈로부터 융합 단백질을 계면할성제 존재하에서 가열하여 용출하는 것도 전술한 바와 같고, 융합 단백질을 용출시키는 경우에는 이들의 계면활성제를 동물에 투여하여도 문제가 되지 않는 농도, 바람직하게는 0.1% 나트륨 도데실설페이트 존재하, 100℃에서 5 내지 10분간 가열한다. 이렇게 목적 면역원으로 바람직하게 정제된 융합 단백질을 수득할 수 있다.

이와 같은 융합 단백질을 면역원으로 사용하는 모노클로날 항체를 제조하는 방법에 있어서, 항체 스크리닝은 LAR 포스파타제 서브유닛을 사용하는 것도 좋지만, 면역원으로서 사용된 융합 단백질로 스크리닝을 실시하는 것이 특이성 면에서 바람직하다.

본 발명은 LAR 및/또는 LAR 유래 분자의 정량방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 항체를 사용하여 피검시료중에 함유된 LAR 단백질, 및/또는 최소한 LAR의 세포내 도메인을 함유하는 단편 또는 폴리펩티드의 양을 측량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 방법에는 LAR 또는 LAR 유래 분자의 양을 정량하기 위해 상기 항체가 바람직하게는 면역블럿팅, 면역침강법 또는 ELISA 중 어느 하나에 사용된다.

본 발명의 또 다른 특징은 상기 항체를 사용하여 피검시료로 부터 LAR 및/또는 LAR 유래 분자를 단리하는 단계, 단리된 LAR 및/또는 LAR 유래 분자의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 정량방법을 제공한다. 관련 방법에서, LAR 및/또는 LAR 유래 분자를 단리하기 위해서 상기 항체를 결합시킨 지지체를 사용하여 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침강법이 적절하게 사용된다. 즉 상기 항체를 결합시킨 지지체에 피검시료를 접촉시킨 항원(LAR/LAR 유래 분자)-항체 간의 특이적인 상호작용을 허용하고, 이어 지지체를 세정한 후, 결합된 LAR/LAR 유래 분자를 용출시키는 단계를 포함하는 컬럼(colum)법, 뱃치(Batch)법 등에 의한 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침강법이 실시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 항체를 사용하여 LAR 및/또는 LAR 유래 분자를 단리하는 단계를 포함하는, LAR 및/또는 LAR 유래 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법에 있어서 목적물의 단리에는, 상기 LAR 및/또는 LAR 유래 분자의 활성을 정량하기 위한 방법과 동일한 방식으로 상기 항체를 결합시킨 지지체를 사용하여 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침강법이 적절히 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 추가로 LAR 및/또는 LAR 유래 분자의 조직내의 존재를 동정하는 방법으로, 상기 방법에서는 상기 항체를 사용하여 면역조직학적 검사를 수행한다. 면역조직학적 검사로는 예를 들면 표지항체를 사용한 in situ 면역조직염색 등의 기술이 사용되고, LAR 단백질 및/또는 최소한 LAR의 세포내 도메인을 포함하는 단편 또는 폴리펩티드를 검출하는 것이다.

본 발명은 또한 갑상선 암세포에 대해 특이적인 면역반응성을 갖는 항 LAR 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 LAR 분자 뿐만 아니라 그의 단편 예를 들면, 포스파타제 도메인, 세포외 도메인 등을 항원으로 하는 항체일 수 있고, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 펩티드 항체, 단쇄 항체, 키메라 항체, 사람화 항체, CDR-이식항체 등이 포함된다. 특히, 상기 LAR 포스파타제 서브유닛에 대한 항체로서, 갑상선 암세포와 면역반응성을 갖는 것이 본 발명에 의해 제공된다. 갑상선 암세포에 대해 특이적 면역반응성을 갖는 것은 정상의 갑상선세포 및 양성암종의 갑상선세포에는 반응하지 않고(정상세포의 약 10% 이하), 갑상선 암세포에 반응하는(암세포의 약 20% 이상) 것을 의미한다.

따라서, 상기 항체를 이용하여, 갑상선암을 진단하는 것이 가능하고, 본 발명은 갑상선암의 조직진단방법을 제공하는 것이다. 상기 진단방법은 갑상선암 환자로 추정되는 피험자로부터 갑상선 조직 시료(검체)를 채취하는 단계; 상기 항체와 당해 조직 시료와의 면역반응성을 평가하는 단계로 갑상선암의 진단을 수행하는 것을 특징으로 한다. 이 경우, 갑상선 조직 검체는 피험자로 부터 주사 등을 사용하여 미세침흡인 세포조직학적 진단법으로 채취한 검체이거나 또는 갑상선의 일부를 절제, 적출하여 제조된 갑상선 조직 단편 등의 어떠한 시료라도 상관없다. 미세침흡인 세포조직학적 진단법으로 채취한 검체를 사용하는 진단방법은 피험자에 대한 침범성(invasiveness)이 저하되는 점에서 바람직하다. 이는 종래의 조직형태학적 검사에 기초한 갑상선암 진단방법에서는 조직을 손상하지 않은 상태로 채취하지 않으면 판정하기 어려워, 이 때문에 침범성이 큰 절개법을 사용하지 않으면 안되는 단점을 해결한 것이 본 발명의 장점이다. 또한, 조직단편을 이용한 진단에서도 종래 방법보다도 진단의 신뢰성이 높기 때문에 유용하다.

상기 진단 방법에서는 미세침흡인 세포조직학적 진단법에 의해 수득된 시료는 본 발명의 항체를 사용하여 예를 들면 면역블럿팅, 면역침강법 또는 ELISA 등의 상용되는 시험관내 면역검정법에 의해 면역반응성이 평가된다. 그리고 조직단편을 시료로 하는 경우, 종래의 면역반응을 이용한 조직염색에 의해 면역반응성이 판정된다.

또한 본 발명은 갑상선암의 조직단편용조성물에 있어서, 상기 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 이 조성물을 사용하여, 상기한 바와 같이 신뢰성이 높은 갑상선암의 진단방법을 실시하는 것이 가능하다. 조성물에는 본 발명의 항체이외에, 적절한 부형제, 담체(carrier), 완충용액, 항체를 안정화시키기 위한 약제 등이 배합될 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따라 LAR이 갑상선 암세포에 특이적으로 고발현되는 것이 판명되었다. 또한 실시예에 표시한 바와 같이 본 발명의 모노클로날 항체가 갑상선암의 진단에 유용한 것이 증명되었다. 또한 본 발명의 모노클로날 항체는 조직단편을 이용한 갑상선암의 진단에 유용하고(실시예 5 및 6), 조직을 파괴하는(homogenized) 방법으로 진단하는 것이 유용하다고 밝혀졌다. 이상의 결과로 부터 당업자라면 본 발명의 모노크로날 항체는 여러가지 세포조직학적 진단법 또는 생검법(biopsy)에 유용한 것이 이해된다. 또한 본 발명의 모노클로날 항체 뿐만 아니라 LAR 세포 이외의 도메인을 인식하는 것이 가능한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및/또는 펩티드 항체를 이용하는 것도 가능하다. 이러한 경우에도 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하게 실시할 수 있지만, 세포 이외의 도메인의 해리에 의한 영향을 고려하는 것이 바람직하다.

본 발명의 LAR에 대한 항체는 갑상선암에 관련된 질병의 진단 및 치료에 이용하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 이들의 항체를 이용하여, LAR 또는 이의 단편과의 면역학적 결합에 근거하여, LAR 또는 이의 단편을 측정하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 이들의 항체를 사용하여 LAR 또는 이의 단편을 측정하는 방법으로는 예를 들면, 불용성 지지체에 결합시킨 항체와 표지화된 항체에 의한 LAR 또는 이의 단편을 항체와 경쟁적으로 반응시키고, 항체와 반응시킨 표지 항원량으로부터 피검체중의 LAR 또는 이의 단편을 측정하는 방법을 들 수 있다.

샌드위치(Sandwich)법에 의한 LAR 또는 이의 단편의 측정에 있어서는, 우선 고정화 항체와 LAR 또는 이의 단편을 반응시킨 후, 미반응물을 세정하여 완전히 제거하고, 표지화 항원을 첨가하여 고정화항원-LAR 또는 LAR 표지화 항원을 형성시킨 2단계법 또는 고정화항체, 표지화항체 및 LAR 또는 이의 단편을 동시에 혼합하는 1단계법 등을 사용할 수 있다.

상기 측정에 사용가능한 불용성 지지체는 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리염화 비닐, 폴리에스테르, 폴리아크릴레이트 에스테르, 나일론, 폴리아세탈, 불소수지 등의 합성수지, 셀룰로즈, 아가로즈 등의 다당류, 유리, 금속 들을 들 수 있다. 불용성 지지체의 형상으로는 예를 들어 접시형, 구형, 섬유상형, 실린더형, 원반형, 배형, 용기형, 셀(cell), 시험관형 등 여러가지 형상일 수 있다. 항체를 흡착하는 지지체는 나트륨 아지드와 같은 적절한 멸균제의 존재하에서 냉소에 보관된다.

항체 고정화에는 공지의 화학적 결합법 또는 물리적 흡착법을 사용하는 것이 가능하다. 화학적 결합법으로는 예를 들어 글루타알데히드를 사용하는 방법, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, N-숙신이미딜-2-말레이미도아세테이트 등이 사용되는 말레이미도법, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 등을 사용하는 카보디이미드 방법 등을 들 수 있다. 또한, 말레이미드벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 방법, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피온산 방법, 비스디아조화된 벤지딘 방법, 디팔미틸리신 방법이 포함될 수 있다. 또한 상기의 피검출물질과 에피토프가 다른 2종류의 항체를 반응시켜 형성된 복합체를, 항체에 대한 제 3의 항체를 상기 방법에 따라 고정화시킨 후 포획하는 것도 가능하다.

항체를 표지할 물질로서는 효소, 형광물질, 발광(luminescence)물질, 방사성물질 및 금속킬레이트 등을 사용하는 것이 바람직하다. 효소로서는 예를 들어 과산화효소(peroxidase), 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 말레이트 탈수소효소, 스타필로코코스 누클리아제(staphylococcus nuclease), 델타-5-스테로이드 이성화효소(isomerase), α-그리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오즈 포스페이트 이성화효소, 서양고추냉이 과산화효소, 아스파라기나제, 글루코즈 산화효소, 리보누클레아제, 우레아제, 카탈라제(catalase), 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제, 아세틸콜린 에스테라제 등을 들 수 있고; 형광 물질로는 예를 들어 형광 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌린(phycobilin) 단백질, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 오르토프탈릭 알데히드(orthophthalic aldehyde) 등을 포함할 수 있다. 발광물질은 이소루미놀(isoluminol), 루시게닌(lucigenin), 루미놀(luminol), 방향족 아크리딘에스테르(acridiniumester), 이미다졸, 아크리딘 염 및 그의 개질된 에스테르, 루시페린(luciferin), 루시퍼라제(luciferase), 아쿠오린(aequorin) 등을 들할 수 있고; 방사성 물질로는 ¹²⁵I, ¹²⁷I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, ³²P, ³⁵S 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고 면역학적 측정법에 사용될 수 있으면 특히 한정되지 않는다. 또한 항체에 바이오틴(biotin), 디니트로페닐, 피리독실, 또는 플루오레자민(fluorescamine)과 같은 저분자 헵텐을 사용할 수 있다. 바람직하게는 서양고추냉이 과산화효소를 표지화 효소로 사용할 수 있다. 본 효소는 많은 기질과 반응하는 것이 가능하고, 과요오드산 방법으로 용이하게 항체에 결합시킬 수 있다.

표지화제가 효소인 경우는 이의 활성을 측정하기 위해서 기질, 필요에 따라 발색제를 사용한다. 효소로서 과산화효소를 사용하는 경우에는 기질용액으로 H₂O₂를 사용하고, 발색제로는 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트] 암모니움(2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazino sulfonate] ammonium: ABTS), 5-아미노살리실산, 오르코페닐렌디아민, 4-아미노안티피리딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 등을 사용할 수 있고, 효소로는 알칼리 포스파타제를 사용하는 경우에는, 기질로는 오르토페닐포스파타제, 파라니트로페닐포스파테이트 등을 사용할 수 있고, 선택적으로 β-D-갈락토시다제를 효소로서 사용하는 경우는, 기질로서 플루오레신-디-(β-D-갈락토피라노사이드)(fluorescein-di-β-D-galactopyranoside), 4-메틸-움벨리페릴-β-D-갈락토피라노사이드(4-methyl- umbelliferyl-β-D-galactopyranoside) 등을 사용할 수 있다. 본 발명은 추가로 상기 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 시약류를 키트화한 것도 포함할 수 있다.

가교제로서는 N,N'-오르토페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미드메틸)시아노헥사노일·N-숙신이미드 에스테르, 6-말레이미드헥사노일·N-숙신이미드 에스테르, 4,4'-디티오피리딘 또는 기타 공지된 가교제를 사용할 수 있다. 이들 가교제와 효소 및 항체와의 반응은 각각의 가교제의 성질에 맞추어 공지된 방법에 따라 시행하면 된다. 또한 항체로서는 경우에 따라서는 그 단편, 예를 들어 Fab', Fab, F(ab')2를 사용한다. 또한 폴리클로날항체, 모노클로날항체 뿐만 아니라 동일한 방식으로 처리하여 효소표지체를 수득하는 것이 가능하다. 상기 가교제를 사용하여 수득되는 효소표지체를 친화 크로마토그래피 등의 공지된 방법으로 정제하면, 더욱 민감한 면역 측정 시스템이 수득될 수 있다. 정제된 효소 표지화 항체는 안정제로서 티머로살(thimerosal), 글리세롤 등을 첨가하거나 동결건조하여 냉암소에 보관한다.

본 발명은 추가로 상기의 갑상선 암세포에 대해 특이적 면역반응성을 갖는 항체를 사용하고, 갑상선 암세포에 대해 표적화(타겟팅:targeting)되는 것을 특징으로 하는 약물 운반 시스템(Drug Delivery System; DDS) 제제를 제공한다.

지금까지 몇몇 유전자가 갑상선암에 관여하는 유전자로 밝혀졌다. 유두암 환자의 일부에서 Ret 및 TRK 유전자의 티로신 키나제 도메인의 변이가 밝혀졌다[Fuso, A. et al.; Nature, 328, 170-2, 1987]. 또한 Ret 유전자의 돌연변이는 과거에 방사선에 노출되지 않은 유두암 환자의 3 내지 30%에서 나타나고[Santoro, M. et al., J. Clin. Invest., 89, 1517-22, 1992; Bongdrzone, I. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 2006-9, 1996; Zou, M. et al., Cancer, 73, 176-80, 1994], 체르로빌 원자력 공장에서의 재앙에서 방사선에 노출된 경험이 있는 어린이 및 유소아 시기에 방사선에 노출된 경험이 있는 환자로부터 진단되는 유두암에는 Ret 돌연변이가 60 내지 80%의 높은 비율로 관찰되었고[Fugazzola, L. et al., Cancer Res., 55, 5617-20, 1995; Klugbauer, S. et al., Oncogene, 11, 2459-67, 1995; Nikiforov, Y. E. et al., Cancer Res., 57, 1690-4, 1997; Bounacer, A. et al., Oncogene, 15, 1263-73, 1997)], TRK 유전자 돌연변이 빈도는 상당히 낮았다[Bongdrzone, I. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 2006-9, 1996]. Ras 유전자의 점 돌연변이는 갑상선 선종 및 갑상선 여포암에서 높은 빈도로 관찰된다. 이는 ras 유전자의 점 돌연변이는 종양발생 초기 단계이면 고려될 수 있다[Fagin, J. A., Molecular pathogenesis. In: Braverman LE, Utiger RD, eds. Werner and Ingbar's, the thyroid: a fundamental and clinical text. 7th ed. Philadelphia: Lippincott-Raven, 909-16, 1996; Challeton, C. et al., Oncogene, 11, 601-3, 1995]. TSH 및 자극 G 단백질을 코드하는 유전자의 활동성 돌연변이가 일부의 갑상선 여포암에서 보고되었다[Challeton, C. et al., Oncogene, 11, 601-3, 1995; Russo, D. et al., Oncogene, 11, 1907- 11, 1995]. 또한 암억제유전자인 p53 돌연변이는 분화형 갑상선암에서는 희귀하지만, 미분화암에서는 높은 빈도로 발견되는 것이 보고되어 있다[Fagin, J. A. et al., J. Clin. Invest., 91, 179-84, 1993; Ito, T. et al., Cancer Res., 52, 1369-71, 1992].

이들 공지된 정보로부터 갑상선암의 치료 또는 진단을 목적하는 핵산을 LAR에 대한 항체에 의해 표적화된 DDS 제제 중에 함유시키는 것이 가능하다.

또한 갑상선 암세포의 증식은 갑상선 자극 호르몬(TSH)에 의해 조절되고, 갑상선 호르몬제 투여에 의한 갑상선 자극 호르몬(TSH) 분비의 억제는 재발 및 생존률을 개선하는 것으로 보고되어 있다. 추가로, TSH의 작용을 저해하기 위한 단백질, 핵산 또는 화합물도 DDS 제제 중에 함유시키는 것이 가능하다.

한편, 상기의 갑상선 암세포에 대해 특이적인 면역반응성을 갖는 항체를 이용하여, 갑상선 암세포에 대해 표적화된 것을 특징으로 하는 본 발명의 DDS 제제중에, 핵산, 요오드, 방사성요오드, 테크네튬(technetium) 및 단백질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 1 이상의 물질을 함유할 수도 있고, 상기 물질을 제제 중에 배합함으로써, 갑상선 암세포에의 표적화 능력을 높임으로써 갑상선암의 치료 또는 진단에 이용하는 것이 가능하게 된다.

본원에서 사용된 핵산으로는 숙주 세포에서 발현가능한 단백질을 코드하는 핵산, 세포 유래 유전자의 안티센스 핵산, 세포 유래 전사 조절인자의 결합 단백질을 코드하는 유전자 또는 전사 조절인자 결합 부위의 서열 또는 유사한 서열을 갖는 유인물(decoy)를 코드하는 핵산, 각 세포 유래의 mRNA를 절단하는 라이보자임, 자살 유전자 등을 들 수 있다.

안티센스 핵산으로는 복제, 전사, 번역 등의 유전자 발현 단계에서, 장래 발현될 핵산 서열에 대해 특이적으로 결합하는 핵산 또는 핵산 서열을 나타내며, 결과로서 장래 발현될 핵산 서열의 발현을 방해하는 것이다. 안티센스 핵산에는 3중쇄에 의한 안티-유전자 핵산도 포함된다. 유인물을 코드하는 핵산으로는 세포 유래 전사 조절인자의 결합 단백질을 코드하는 핵산 또는 전사 조절인자의 결합부위의 서열 또는 유사 서열을 갖는 핵산을 나타내고, 이들을 유인물로서 세포내에 도입하는 것으로서, 전자 조절인자의 결합부위의 결합을 방해하고, 전사조절인자의 작용을 억제하여, 최종적으로 활성화되는 유전자 그룹을 억제할 수 있는 가능성이 있다. 본 명세서에서 기술된 라이보자임은 특정의 단백질의 mRNA를 절단하는 것을 말하고, 이들 특정의 단백질의 번역을 방해하는 것을 말한다. 라이보자임은 특정의 단백질을 코드하는 유전자 서열으로 부터 설계가능하고, 예를 들면 망치머리형 라이보자임, 머리핀형 라이보자임, 델타형 라이보자임 등의 라이보자임의 종류에 상관없이, 특정의 단백질의 mRNA를 절단하여 이들 특정의 단백질의 번역을 방해하는 것이면 본 명세서에서 말하는 라이보자임에 포함된다. 본 명세서에서 말하는 자살 유전자로는 프로그램 세포 자살 유발 유전자, 아폽토시스(apoptosis) 유발 유전자, 괴사 유발 유전자 등을 포함하고, 결과적으로 세포를 사멸하도록 유도하는 유전자를 말한다. 이들 핵산은 당업자로부터 적절히 선택되는 것이면 가능하고, 당해 핵산을 DDS 제제에 함유시키는 것에 의해, 갑상선 암세포 특이적으로 세포를 사멸시키는 것이 가능하다.

방사성 요오드(¹³¹I)을 첨가하면 정상 갑상선 세포가 붕괴되고, 따라서 전 방사성 신티레이션 검사(systemic radioactive scintillation test)에 의해 전이된 암을 검출하기가 쉽게 된다. 또한 혈중 티로글로블린 수치를 측정함으로써 수술후 남은 암 또는 재발된 암을 확인할 수 있다. 더욱이 방사성 요오드 치료는 잠재성이 있는 암을 붕괴하여 재발을 방지할 수 있고, 치료를 위해 대량의 방사성 요오드를 사용하는 것으로, 전 방사성 요오드 신틸레이션 검사를 하는 것이 가능하다. 이 검사는 암의 암의 급변전을 관찰할 수 있어 매우 감도가 양호하다. 또한 본 발명의 항체 또는 요오드 표지 또는 방사성 요오드 표지된 항체를 사용하는 것에 의해 진단, 치료를 위한 유용성이 높다.

또한 단백질로서는 항체, TSH(갑상선 자극 호르몬) 및 갑상선 호르몬 등을 열거 할 수 있다.

상기한 바와 같은 구성성분을 함유하는 상기 DDS 제제는 갑상선암의 진단용 의약 조성물 및 갑상선암의 치료용 의약 조성물로서 유용하다.

더욱이 본 발명의 의약 조성물은 갑상선암을 화학치료법 제제로 사용하여 치료하려 의도하는 경우, 화학치료법 제제와 LAR에 대한 항체를 조합시켜, 이 항체가 특이적 면역반응성에 기초하여 갑상선암에 결합하는 것을 이용하여 병변부위에 약물을 농침시키고, 부작용이 적은 유효한 화학요법을 실시하는 것을 가능하게 해 주는 것이다.

여기서 갑상선암치료에 유효한 화학치료법 제제로서, 시클로포스파미드(cyclaphosphamid), 아드리아마이신(adriamycin), 스트렙토조토신(streptozotocin), 5-플루오로우라실, 다카바진(dacarbazine), 빈크리스틴(vincristine) 등과 같은 항암제를 사용할 수 있다.

상기 의약 조성물의 투여방법은 전신투여 또는 국소투여 어느 것이라도 상관없다. 전신투여로서, 경구투여, 정맥내투여, 피하, 근육주사 및 직장투여 등이 있고, 국소투여로서 갑상선 조직내의 직접투여 또는 갑상선 조직에 연결된 혈관내 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물 투여량은 약물의 공지의 유효 혈중농도에 의존하고, 당업자가 적절히 선택할 것이다. 또는 이하에 나타난 리포좀 제제의 경우, 항체의 양은 리포좀이 형성하는 것을 방해하지 않는 양을 사용하는 것이 중요하다.

즉, DDS 제제에 함유되는 항체는 특히 사람에게 투여되는 경우, 상기 나타난 사람화 항체 또는 키메라 항체 등의 사람에 대해 면역원성을 갖지않거나 최소로 면역원성이 억제된 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 마우스 모노클로날 항체를 사람의 체내로 투여하면, 사람에 있어서는 이종 단백질이기 때문에 다양한 부작용이 일어날 위험성이 있다. 그리고, 사람 모노클로날 항체가 바람직하지만, 융합효율이 나쁘거나 항체생산이 안정한 하이브리도마를 수득하는 것이 어려워진다. 그러나, 현재 기술이 진보하여 사람 모노틀로날 항체 또는 키메라 항체를 제작하는 것이 가능하게 되었다. 키메라 항체로는 마우스 항체와 사람 항체의 키메라 분자를 말한다. 사람에 임의의 항원을 면역시켜 항체를 제조하는 것은 윤리상 불가능하다. 또한 마우스에 면역시켜, 이 마우스 모노클로날 항체의 유전자로 부터 항원에 결합하는 항체 가변부(V영역)을 도출하고, 사람 골수종 유래의 항체 불변부(C영역) 유전자와 결합시킨 키메라 유전자를 제작한다. 이 키메라 유전자를 숙주세포에서 발현시키면, 사람·마우스·모노클로날 항체가 생산가능하다. 키메라 항체는 사람에 대한 항원성이 적기 때문에, 사람 체내에 투여되는 치료용 및 화상 진단용 모노클로날 항체 등으로 이용가능하다. 공지의 키메라 항체의 관련 기술로서는 일본국 특허공개번호 제(평)05-304989호, 제(평)04-330295호, WO9106649, 일본국 특허공개번호 제(소)63-036786호, 제(평)06-98021호 등이 있다.

그러나 최근 키메라 항체보다도 유용한 것으로 일컬어지는 사람화 항체가 개발되었다. 사람화 항체로는 항체분자의 항원결합부위(CDR:Complementary determining reagion, 상보성결정영역)의 유전자 서열을 사람 항체 유전자에 이식(CDR 이식)하고, 항체분자의 DCR을 제거한 전분자를 사람화한 항체이다. 본 항체는 사람·마우스·키메라 항체보다 마우스의 항체부위가 작기때문에 항원성이 적어도 안전성이 높다라고 할 수 있다. 현재 일본국에서는 성인성 T 세포 백혈병에 대한 사람화 항체의 임상시험이 행해지고 있다. 사람화 항체의 제조방법 및 이의 관련 기술에 대해서는 미국 젠테크사[WO9222653, WO9845332, WO9404679, WO9837200 and WO9404679] 및 영국 셀텍사[WO9429451, WO9429351, WO9413805, WO9306231, WO9201059, WO9116927, WO9116928, WO9109967, WO8901974, WO8901783] 등의 특허출원이 있다.

사람 모노클로날 항체의 제작방법에는 세포융합법 이외에도 EBV(Epstein-Barr virus)로 형질전환시키는 방법 또는 형질전환시킨 세포를 부모세포와 융합시키는 방법, 유전자공학을 이용한 키메라 항체, 사람화항체를 제작하는 방법 등이 있다. 키메라 항체는 이종의 동물의 면역 클로닝 유전자 단편을 연결하여 제작된 항체이고, 사람화항체는 마우스 항체 등에서 사람에 대한 이종 부분을 개변하고, H쇄와 L쇄의 상보성 결정부(CDR) 이외의 일차구조를 사람의 항체에 대응하는 일차구조에 전환시킨 타항체를 말한다. 사람 모노클로날 항체 제작용의 부모 세포는 사람/마우스의 헤테로멜로머(heteromeloma)인 SHM-D 33주(ATCC CRL 1668) 또는 RF-S1주를 이용하면 마우스의 부모 세포와 동일하게 높은 융합 효율을 얻을 수 있다. 이들의 부모 세포를 사용하여 수득된 하이브리도마는 영양공급세포(feeder cell) 없이 클로닝하는 것이 가능하고, IgG 형 항체를 비교적 안정하게 대량으로 생산하는 것이 가능하다. 부모 세포의 배양에는 15% FCS를 첨가한 FRDF 배양지를 사용하고, 이외 조작은 마우스의 경우와 동일하다. 또한 IgG 형 사람 모노클로날 항체를 제작하는 것에는 항원으로 충분히 감지되는 사람 임파구를 말단혈로부터 채취하여 사용하는 것이 바람직하다. 충분히 항원으로 감지되는 임파구의 취득이 곤란한 경우에는 시험관내에서 항원감지를 수행할 수도 있다.

상기 나타나는 방법 등을 사용하는 것에 의해, 본 발명의 항체를 사람화하는 것이 가능하고, 사람에 투여하는 경우에는 매우 유용하다.

또한 이러한 항체를 요오드로 방사성표지하거나 항체에 표적화시킨 의약 조성물중에 방사성 요도드를 함유시키면 진단, 치료약으로서 유용할 수가 있다.

유두암 및 여포암이 혈행성 또는 림프행성으로 주위의 조직에 침투하거나 떨어진 부위(특히 폐와 뼈) 및 림프절에 전이되는 경우, 종양을 파괴하기 위한 통상적인 치료법은 방사성표지된 (¹³¹I) 요오드를 투여하는 것이다. 정상 갑상선 세포는 혈액으로부터 요오드를 취하여 농축한다. 그리고 이 과정은 뇌하수체로부터 TSH(갑상선 자극 호르몬)에 의해 자극된다. 이후 요오드는 갑상선 호르몬(티록신 T4: Thyroxine T4)를 생산하기 위해 사용된다. 상술한 바와 같이, 갑상선암 또는 갑상선암이 전이된 부위은 극히 소량의 요오드(또는 방사성 요오드)만을 받아들인다. 그러나 대량의 TSH 영향하에 있는 경우는 갑상선암, 또는 이의 전이된 부위의 일부는 자극을 받아, 상당한 양의 요오드를 받아들이게 된다. 이에 따라, 주위의 조직을 손상하게 되고, 암에 직접 대량의 방사선이 조사되게 된다. 갑상선에 존재하여 정상적인 갑상선 호르몬이 생산되고 있는 경우에는 뇌하수체의 TSH 생산량은 비교적 저하된 채 유지되지만, 갑상선 전체가 제거되면, 붕괴하여 갑상선 호르몬의 레벨이 저하되어 뇌하수체는 TSH의 분비를 급격히 증가시킨다. 이 TSH는 갑상선암을 자극하여, 방사성 요오드를 받아들이도록 한다. 광범위한 갑상선암에 대해, 방사성 요오드 치료법을 수행하는 경우는 갑상선 전체를 수술로 대부분 완전히 제거하고, 잔류하는 조직을 방사성 요오드를 사용하여 붕괴시킬 필요가 있다. 일단 이 과정이 수행되면, 두부에 종양이 남아있거나 떨어진 부위에 전이된 것으로 생각되는 환자에는 TSH 레벨이 충분히 높아지면, 시험량의 방사성 요오드(통상 약 2 내지 10 mCi)를 사용하여 스케닝한다. 만일 상당량의 요오드가 갑상선암의 영역에 집중되면, 추가로 대량의 치료양의 방사성 요오드(통상 약 100 내지 200 mCi: 3700 내지 7400MBq)를 투여하고, 종양의 파괴를 시도한다. 보다 침투성이 강한 갑상선암을 가진 환자에 대해서도 방사성 요오드가 안전하고 유효하기 때문에 많은 의사들이 각각 침투성이 강하지 않은 유두암 및 여포암에도 방사성 요오드를 일상적으로 사용하게 된다.

또한 LAR에 결합하는 항체를 요오드 표지하거나 또는 항체 표적화시킨 의약 조성물 중에 방사성 요오드를 함유시킴으로써, 갑상선 암세포에 특이성을 증강시켜 치료 또는 진단에 사용하는 것이 가능하다.

이러한 양식으로 갑상선 암세포를 특이적으로 인식하는 항 LAR 항체는 DDS(Drug Delivery System)에 있어서도 유용하다. 약물 전달 시스템(DDS)[Mitsuru Hashida, Drug Delivery System, New Challenges to Manufacturing Drugs and Therapy, Kagaku Doujin, (1995)]은 약물의 투여방법 및 형태를 연구하여, 체내에서의 약물동태를 제어하는 것에 의해 약물을 표적부위에 선택적으로 이동시키고, 결과적으로 최적의 치료효과를 얻고, 또한 약물에 의한 부작용을 최소화하는 것을 목적으로 하는 약물투여에 관한 신규한 기술이다. 현재까지 다양한 DDS 제제가 개발되었지만, 그중에도 리포좀 제제[Hiroshi Terada, Tetsuro Yoshimura eds., Experiment Manual of Liposome in Life Science, Springer-Verlag, Tokyo, (1992)]는 결핍효소의 보완, 제암제 및 항생물질의 투여, 및 유전자치료 분야에서도 각광받고 있다.

리포좀은 생체막을 구성하고 있는 인지질을 기초로 하는 지질이중층으로 이루어지는 페쇄형 소포체이고, 지용성·수용성에 상관없이 다양한 약물을 내포하는 것이가능하다고 알려져 있고, 우수한 약물 담체(carrier)로서 기능을 갖는 것으로 공지되어 있다.

또한 리포좀의 표면에 항체 및 펩티드 등을 결합하여 표적화 기능을 부여할 수 있는 것이 공지되어 있다[Kazuo Maruyama, Tomoko Takizawa, Motoharu Iwatsuru et al., Biochimica et Biophysica Acta 1234, 74 (1995; Jlbao Zhao, Shunsaku Kimura, Yukio Imanishi, Biochimica et Biophysica Acta 1283, 37 (1996)]. 즉 항 LAR 항체는 다양한 리포좀 제제에 있어서, 갑상선 암세포에 특이성을 높일 목적으로 사용된다. 또한 지질의 종류를 변화시키거나, 폴리에틸렌글리콜 등을 개질하는 것에 의해 온도감수성 리포좀[Sakae Unezaki, Kazuo Maruyama, Motoharu Iwatsuru et al., Pharmaceutical Research 11, 1180 (1994)], 혈중안정성 리포좀[Kazuo Maruyama, Tsutomu Yuda, Motoharu Iwatsuru et al., Biochimica et Biophysica Acta 1128, 44 (1992)], 플라즈미드 도입 벡터로서 양이온성 리포좀[Xlang Gao, Daniel Jaffurs, Leaf Huang et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1201 (1994)] 등의 각종의 성질이 다른 담체(벡터)를 제작가능한 특성을 갖고 있다.

그러나, 통상적으로 리포좀은 엔도사이토시스(endocytosis) 경로에 의해 세포내로 도입되고, 세포막 근처의 초기 엔도좀내에 도입된다. 이후 세포 심부의 후기 엔도좀으로 이동되어 최종적으로 라이소좀(lysosome)으로 운반된다. 라이소좀으로 운반된 리포좀은 가수분해효소의 작용에 의해 분해되어 동시에 리포좀내로 봉입된 약물 등도 대사되기 때문에 약물 등이 미변화체의 상태로 세포질내로 도달하는 비율이 극히 낮은 문제가 있다.

현재로서는 세포의 장벽인 세포막에 장해를 주는 것이 아닌 세포질에 직접 약물 등을 도입하는 방법이 검토되고 있다. 예를 들면 리포좀이 막융합 기능을 취득하면 라이소좀을 경유하지 않고, 직접 약물 등을 세포질 졸까지 송달하는 것이 가능하게 된다. 이로부터, 리포좀을 세포에 융합시키는 방법으로 pH감수성 리포좀[Kenji Kono, Ken-ichi Zenitani, Toru Takabishi, Biochimica et Biophysica Acta 1193, 1(1994)] 및 바이러스의 표피 단백질을 리포좀에 재편한 재구성 리포좀[Sangeeta Bagai, Debi P. Sarkar, The Journal of Biological Chemistry 269, 1966(1994))]이 검토된다.

최근, 센다이 바이러스[(sendai virus : Hemagglutinating Virus of Japan) (Yoshio Okada, Currenttopics in Membranes and Transport 32, 297 (1988)]의 막융합 능력을 리포좀에 부여한 막 융합 리포좀(fusogenic liposome : HVJ-liposome)이 보고되어 있다. 센다이 바이러스(HVJ)는 세포간 융합현상[Y. Maeda, J. Kim, Y. Okada et al., Experimental Cell Research 108, 108 (1977)]에 근거하여, 동물 세포에서 사용되는 유전학의 선구가 된 바이러스이다. 또한 HVJ는 리포좀과도 융합하는 것이 가능하고[[Mahito Nakanishi, Tsuyoshi Uchida, Yoshio Okada et al., Experimental Cell Research 159, 399 (1985)], 이의 융합체(HVJ-리포좀)은 또한 세포막과 융합한다. 결국, 리포좀과 HVJ를 직접반응시켜 제작한 HVJ-리포좀은 소위 하이브리드 벡터이고, 내부에 리포좀 유래 공동(空洞)을 갖고, 외부는 바이러스 표피와 동일한 스파이크 구조를 갖고 있다. HVF-리포좀은 단백질, 화학물질 및 유전자 등, 리포좀내에 봉입가능한 것이면 어떤 물질을 센다이 바이러스와 동일하게 높은 비율로 세포내로 도입하는 것이 가능하다[Tetsuhiko Nakagawa, Hiriyuki Mizuguchi, Tadanori Mayumi, Drug Delivery System 11, 411 (1996)]. 또한 예를 들어 HVJ-리포좀의 개량형으로서 DNA 결합 능력을 갖는 핵 단백질인 HMG-1(Non-histone chromosomal protein High Mobility Group-1)을 DNA와 공도입하는 것에 의해, 또한 도입효율이 향상된다는 보고도 있다[Yasufumi Kaneda et al., J.Molec. Medicine 73, 289 (1995)].

막융합 리포좀의 다른 예로는, VSV(Vesicular Stomatitis Virus: 수포성 구내염 바이러스, Medical View(1995)][Yoshiyuki Nagai, Akira Ishihama ed., Protocols for Experiments of Virus, Medical View (1995)]를 이용한 리포좀 제제도 이용가능하다[J. Virol., 72(7), 6159-63, 1998; Exp. Cell. Res., 200(2), 333-8, 1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(7), 2448-51, 1990; and Biochim. Biophys. Acta, 987(1), 15-20, (1989)]. VSV는 랍도 바이러스(Rhabdovirus)의 베시큘로 바이러스(Vesiculovirus) 속에 속하는 (-) 단쇄 RNA형 바이러스로서, 막 표면에 표피단백질인 G 단백질을 갖고 있다[Akihiko Kawai, Journal of Virology 24, 826 (1977)]. VSV의 세포에의 감염구조는 리포좀과 동일하게, 엔도좀 경로에 의해 수행된다. 그러나, VSV는 리포좀과는 달리, 엔도좀막과 융합하는 특성을 갖고 있기 때문에, 라이소좀내의 가수분해효소에 의한 분해를 받지않고, 자신의 유전자를 세포질내로 도입한다. 지금까지 VSV가 막융합 능력을 갖고, 사람혈액구에 대해 혈액작용을 나타내지 않는 것이 공지되어 있다[Carole A. Bailey, Douglas K. Miller, John Lenard, Virology 133, 111(1984)]. 또한 VSV는 많은 조직세포에 보편적으로 존재하는 포스파티딜세린을 수용체로 하기 때문에, 숙주 영역이 넓고[Michael J. Clague, Christian Schoch, Robert Blumenthal, Biochemistry 29, 1303 (1990)], 또한 바이러스 증식이 빠르기 때문에 대량의 바이러스가 수집될 수 있는 특성이 있다. 한편, VSV와 리포좀이 융합하는 것은 보고되어 있다[Satoshi Yamada, Shunichi Ohnishi, Biochemistry 25, 3703 (1986)].

이와 같이, 항 LAR 항체는 막융합리포좀, pH 감수성 리포좀, 재구성리포좀, 양이온 리포좀 등 또는 이들을 개질한 소위 리포좀 제제의 표적화능을 높일 목적으로 이용하는 것이 가능하다.

그 외의 모노클로날항체를 사용하여 표적화능을 높이는 방법 및 이의 유용성이 다수 보고되어 있고[Hum. Antibodies, 9(1), 61-5, 1999; J. Clin. Pharm. Ther., 22(1), 7-19, 1997; J. Int. Med. Res., 25(1), 14-23, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (24), 14164-9, 1996; Hepatology, 22(5), 1482-7, 1995; Hepatology, 22(5), 1527-37, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(15), 6986-90, 1995; Immunomethods, 4(3), 259-72,1994; J. Drug Target, 2(4), 323-31, 1994; Cancer Res., 57(10), 1922-8, 1997; Crit. Rev. Biotechnol., 17(2), 149-69, 1997; Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 16(7), 505-12, 1994; Trends Biotechnol., 12(6), 234-9, 1994; and Bioconjug, Chem., 4(1), 94-102, 1993], 갑상선암의 치료에 있어서 상기 지재된 문헌 또는 공지의 기술에 따라 LAR에 대한 모노클로날 항체가 이용될 수 있다.

그 외, 바이러스 벡터에 의한 유전자 치료 및 폴리산·글리콜산 미세구(microsphere), 지질 미세구, 폴리에틸렌 글리콜-개질된 효소 등을 사용한 DDS 제제에 있어서도 본 발명의 항 LAR 항체를 이용하여, 갑상선암에의 표적화를 도모하는 것이 가능하다.

더욱이 별개의 실시양태로서, 갑상선 암세포에 있어서 LAR이 고발현된다는 것은 LAR 분자를 코드하는 핵산서열로부터 고비율로 mRNA로의 전사가 수행되고, 번역되는 것으로 이해될 수 있다. 추가로, 당업자라면 mRNA에 대한 프로브를 사용하는 것에 의해 LAR mRNA의 발현량을 측정하는 것으로 암의 진단을 수행하는 것도 용이할 것이다

또한 본 발명은 결과적으로 갑상선 암세포에 있어서 전사를 촉진시키는 전사인자, 프로모터(promotor), 인헨서(enhancer) 등의 분자생물학적 연구에 실질적으로 기여하는 것일 수 있다.

실험예 1

LAR 돌연변이체에 의한 인슐린 수용체의 티로신 인산화 및 LAR과 인슐린 수용체와의 관련성에 관한 연구

우선 LAR에 의한 인슐린의 시그날 전달 억제 매커니즘을 명확히 하기 위해, LAR의 PTP 도메인의 촉매활성 중심에 존재하는 시스테인을 세린으로 치환시켜 제조한 돌연변이형 LAR을 사용하는 전략으로 진행한다.

a. LAR 및 인슐린 수용체의 발현 벡터

LAR 발현 벡터로서, (a)LAR WT: 사람 야생형 LAR(서열번호: 3), (b)LAR C/S: 서열번호: 3의 누클레오티드 제4983위치의 G를 C로 치환하여 LAR-PTP 도메인 1의 활성 중심에 있는 시스테인(서열번호: 3 의 아미노산 제1522위치)을 세린으로 치환시킨 것, 및 (c)LAR DC/S : LAR C/S에 있어서 돌연변이를 첨가하고, 또한 서열번호: 3의 누클레오티드 제5856위치의 G를 C로 치환하여 LAR-PTP 도메인 2의 시스테인(서열번호: 3 의 아미노산 제1813위치)을 세린으로 치환시킨 것, 3종류(도 1b)을 pMT 발현 벡터에 삽입한 것[Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897-907, 1992; and Streuli M. et al., EMBO J., 9, 2399-2407, 1990]을 이용한다.

한편, 인슐린 수용체의 발현 벡터는 (a) IR WT : 야생형 및 (b)IR K1018M : 야생형의 인슐린 수용체의 ATP 결합부위의 제 1018 위치의 리신을 메티오닌으로 치환하여 티로신 키나아제 활성을 결핍시킨 인슐린 수용체의 돌연변이형, 2종의 cDNA를 SRα프로모터의 하류에 삽입시킨 것[Kanai F. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 195, 762-768, 1993]을 이용한다.

b. COS-7 세포에의 형질감염

COS-7 세포를 1.0 × 10⁸ 세포수/8mL/90φ디쉬로 이루어진 10% 태아 소혈청 첨가 RPMI 1640 배지(日水製藥侏式會社) 내로 시딩(seeding)하여 16시간 배양한 후, LAR C/S 와 IR WT의 발현벡터를 DEAE-덱스트란법을 사용하여 COS-7 세포에 공형질감염시킨다. 사용된 LAR C/S는 상기①(b)에 기재된 바와 같이 돌연변이시킨 것으로, 시험관내에서 티로신 포스파타제 활성이 완전히 결핍된 것으로 밝혀진 것[Streuli M. et al., EMBO J., 9, 2399-2407, 1990]도 있다.

공형질감염은 하기의 수순에 따라서 실시한다. 우선 2% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지액(글루타민 0.3g 및 카나마이신 0.1g을 함유하는, RPMI 1640 배지(日水製藥侏式會社) 10.2g/L, 10% NaHCO₃로 pH7.4로 조정) 4ml에, 40㎕의 10mM 클로로퀸(chloroquine)을 첨가한다. 이 용액 2ml에 LAR 발현 벡터 5㎍ 및 IR 발현 벡터 1㎍을 첨가하고, 잔존하는 용액 2ml에는 16㎕의 100mg/ml DEAE-덱스트란을 첨가한다. 이어서 두 용액을 교반혼합한다. 이러한 방식으로 제조된 발현 벡터 용액 3.75ml를 1.0 ×10⁸ 세포수/8ml/디쉬가 되도록 플레이팅하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터내에서 16시간 사전 배양하여 둔 COS-7 세포에 첨가한다. 배양액과 동일한 조건에서 4시간 배양한 후 10% DMSO 용액으로 2시간 처리하고, PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄·12H₂O, 1.4 mM KH₂PO₄)으로 세척한 후, 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 8ml를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂로 조정된 인큐베이터내에서 48시간 배양한다.

c. 인슐린 자극 및 세포용해액 제조

형질감염 종료 후의 COS-7 세포를 혈청을 첨가하지 않은 RPMI 1640 배양액 중에서 16시간동안 배양시키고, 10^-7 M 인슐린(生化學工業社製)으로 일정한 시간, 즉 0, 1, 5, 15 및 30분동안 자극을 실시한다. 0분 자극이란 인슐린 자극을 실시하지만, 얼음 위에 방치하면서 37℃에서 인큐베이션한 것이다. 인슐린 자극 개시로부터 각시간 경과후에 배양액을 전부 흡수처리하고, 바로 PBS n/Inh. (티로신 포스파타제 억제인자를 함유하는 PBS : 1 mM 나트륨 바나데이트(sodium vanadate), 5 mM 나트륨 플루오라이드(sodium fluoride), 5 mM 나트륨 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate), 5 mM EDTA-2Na, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄·12H₂O, 1.4 mM KH₂PO₄) 5ml를 첨가한다. PBS n/Inh.으로 세포 전체를 세정하여 액체를 흡인제거하고, 세포에 용해용 완충용액(1% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 10 mM 요오드아세트아미드, 10 mM 나트륨 플루오라이드, 10 mM 나트륨 파이로포스페이트, 0.4 mM 나트륨 바나데이트, 0.1 mM 산화된 페닐아르신(phenylarsine), 1 mM 벤즈아미딘(benzamidine), 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)을 1ml 첨가하고, 셀 스크레퍼(Cell scraper)를 사용하여 세포를 수집한다. 이 세포 현탁액을 1.5ml 튜브에 옮기고 4℃에서 30분간 인큐베이션한여, 세포를 완전히 용해시킨다. 인큐베이션 후 액체를 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 수득된 상층액을 세포 용해액으로 하기 실험에 사용한다.

d. 면역침강법(Immunoprecipitation)

c.에서 수득된 세포 용해액에 항 LAR E-서브유닛 항체( 7.5㎍ 11.1A and 7.5㎍ 75.3A의 혼합물, [ Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897-907, 1992])을 이용하여 면역침강법을 수행하였다. 세포 용해액 1 ml에, 15㎍ MOPC 21 (mouse IgG1ｋ: Sigma Corporation)을 모의로서 첨가하고, 용액을 4℃에서 1시간동안 인큐베이션한 후 γ-결합 (GammaBind Plus Sepharose: Pharmacia Biotech Inc.) 20㎕를 첨가하고, 4℃에서 1시간동안 인큐베이션하여 사전 흡수를 실시한다. 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액 950㎕를 별개의 튜브에 옮긴다. 항 LAR E-서브유닛 항체를 15㎍ 첨가하고, 4℃에서 1시간동안 인큐베이션한다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 침전물을 용해 완충용액 1ml로 2회 세척하고 PBS w/Ihn.으로 한번 세척한 후 SDS 샘플 완충용액 20㎕에서 현탁시킨다. 이 현탁액을 끓는 수욕에서 5분동안 가열하여 전기영동을 위한 샘플을 제조한다.

e. 면역블럿팅(Immunoblotting)

상기 샘플을 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동시킨 후, 이동 장치를 이용하여 400mA에서 4시간동안 니트로셀룰로즈 막(Schleicher & Schuell) 에서 영동시킨다. 이 막을 3% 소 혈청 알부민 용액 중에서, 실온에서 30분이상 인큐베이션하여 블록킹(blocking)시킨다. 충분한 양의 TBS-T (Tween 20을 함유하는 TBS: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) 로 10분간, 2회 이상 세정한 후, TBS-T로 50,000배로 희석한 항 인산화 티로신 항체(4G10, UBI사), 항 LAR E-서브유닛 항체 또는 항인슐린 수용체 β-쇄 항체(UBI사)를 첨가하고, 실온에서 1시간 진동교반시킨다. 충분한 양의 TBS-T로 5분간, 3회이상 세정한 후, HRP 표지 항마우스 IgG항체(서양 고추냉이 과산화효소-표지된 항-마우스 IgG: Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1.5ml를 함유하는 TBS-T 용액을 15ml 첨가하고, 실온에서 1시간 진동교반한다. 충분한 양의 TBS-T로 5분간 3회이상 세정한 후, 발광시약 세트(和光純藥工業株式會社製)를 사용하여 화학발광법(chemiluminescence)에 의해 각 항체와 결합한 단백질의 밴드를 검출한다.

f. 결과

이와 같이, LAR C/S와 IR WT를 COS-7 세포에 공형질감염시키고 인슐린으로 일정시간동안 자극한 후 제작된 세포 용해액을 항 LAR E-서브유닛 항체로 면역침강시키고, 항인산화 티로신 항체로 면역블럿팅을 수행하고 이후, 인슐린 자극을 1분간하여 인슐린 수용체 β쇄-의 티로신 인산화 및 85kD 단백질의 티로신 인산화가 이루어진다. 이러한 티로신 인산화는 인슐린 자극후 30분에 있어서도 지속적으로 일어난다(도 2의 (A)).

또는 항 LAR E-서브유닛 항체(도 2의 (B)), 항 인슐린 수용체 β-쇄 항체(도 2의 (C)) 및 항인산화 티로신 항체(도 2의 (A))를 사용한 면역블럿팅의 결과, LAR과 인슐린 수용체가 인슐린 수용체의 티로신 인산화의 유무에 의해 회합되는 것도 명확히 밝혀졌다.

실험예 2

다양한 LAR에 의한 인슐린 수용체의 티로신 탈인산화의 검토(1)

다음으로, LAR WT, LAR C/S 및 LAR DC/C와 IR WT를 사용하여 동일한 방식으로 COS-7 세포에 공형질감염시키고, 인슐린으로 5분간 자극한 후, 항 LAR E-서브유닛 항체로 면역침강시키고, 침전물에 대해서 각종 항체를 이용한 면역블럿팅을 실시한다. 이 결과, 인슐린 수용체와 LAR WT를 공형질감염시킨 것은 LAR C/S 및 LAR DE/S를 공형질감염체와 비교하면 인슐린 수용체 β쇄 및 85kD 단백질의 티로신 인산화는 전혀 검출되지 않았다(도 3의 (A)).

또한, 이 실험에 있어서 LAR(도 3의 (C)) 및 인슐린 수용체(도 3의 (D))의 발현량은 각각의 형질감염체에 있어서 거의 동일하고, LAR WT는 인슐린 수용체 β쇄 및 85kD 단백질의 인산화 티로신을 탈인산화하는 것을 의미한다.

또한 항 LAR E-서브유닛 항체에 의한 면역침강물을 항 인슐린 수용체 β쇄 항체로 면역블럿팅시킨 후, LAR DC/S를 공형질감염시킨 것은 LAR WT 및 LAR C/S를 공형질감염시킨 것과 비교하면 인슐린 수용체 β쇄의 밴드가 명확하게 약하다(도 3b).

이 결과는 LAR WT 및 LAR C/S의 것과 비교하여, LAR DC/S 및 인슐린 수용체의 결합이 약하다는 것을 나타내는 것이다. LAR C/S 및 LAR DC/S의 차이점은 포스파타제 도메인 2의 1813번째의 아미노산 잔기 위치이고, 이로 부터 티로신 포스파타제 활성을 나타내지 않는 기질과의 결합에 관여하는 것으로 추측되는 이 도메인 2가 LAR과 인슐린 수용체와의 결합에 관여하는 것이 명확해졌다.

실험예 3

다양한 LAR에 의한 인슐린 수용체의 티로신 탈인산화의 검토(2)

더욱이, 인슐린 수용체의 티로신 탈인산화가 LAR에 결합한 경우에만 일어나는지 또는 인슐린 수용체 전부에서 일어나는지를 확인하기 위해서, 상기 공형질감염체의 세포 용해액을 전기영동한 후, 항인산화 티로신 항체로 면역블럿팅을 실시한다. 이 결과, LAR WT를 도입한 것에서만 인슐린 수용체의 티로신 탈인산화가 현저히 관찰되었다(도 4).

실험예 4

LAR C/S 존재하에서의 인슐린 수용체의 티로신 인산화의 검토

다음으로, 85kD 단백질의 티로신 인산화가 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 활성에 의한 것인지를 명확히 하기 위해서, LAR C/S와 IR WT 또는 인슐린 수용체의 티로신 키나아제 활성을 결핍시킨 IR K1018M(IR MT)를 COS-7 세포에 공형질감염시킨다. 5분동안 인슐린 자극을 수행한 후, 항 LAR E-서브유닛 항체로 면역침강시키고, 항인산화 티로신 항체로 면역블럿팅을 실시한다(도 5). 이 결과, IR WT와 공형질감염시킨 것에는 인슐린 자극에 의한 인슐린 수용체 β쇄 및 85kD 단백질의 수용체 인산화가 확인되었지만, IR K1018M과 공형질감염시킨 것에는 이러한 인산화가 전혀 확인되지 않았다.

이상의 결과로 부터, 인슐린이 인슐린 수용체에 결합하면 인슐린 수용체의 β쇄에 티로신 인산화가 빨리 일어나고, 또한 인슐린 수용체 티로신 키나아제가 85kD 단백질의 티로신 인산화를 일으키는 것이 밝혀졌다.

따라서, 이 85kD 단백질은 인슐린 수용체와 결합하는 것이 확인된 LAR의 P-서브유닛일 가능성이 있다.

실시예 1

LAR의 P-서브유닛의 세포내 도메인에 대한 항체의 제조

하기 과정에 따라, LAR의 세포내 도메인에 대한 항체를 제조한다.

a. 면역원의 제조

면역원으로서, 글루타티온-S-트랜스퍼라제-LAR 융합 단백질(GST-LAR)을 이용한다. LAR P-서브유닛의 세포막통과부분의 말단으로부터 세포질쪽 전부에 해당하는 607 아미노산을 코드하는 cDNA(서열번호 1, 3467염기)를 pGEX-2T 벡터(Pharmacia Biotech 社製)의 BamHI/EcoRI 위치에 삽입한 발현벡터를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 이.콜라이 AD202를 형질전환시킨다. 이 대장균을 LB(Amp.+) 한천배지(아가-7.5g을 함유하는 후술하는 LB(Amp.+)에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 단일 콜로니를 LB(Amp.+)배지(트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 5 g/L, 5 N NaOH 0.2 ml/L, 및 앰피실린 50 ㎍/ ml을 함유) 50ml에서 인큐베이션시키고, 또한 밤새 인큐베이션시킨다. 이를 LB(Amp.+) 배지 500ml에서 인큐베이션시키고, 37℃에서 600nm에서의 흡광도가 약 1.0이 될 때까지 배양하고, 1M IPTG(이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노사이드(和光純藥工業社製)) 50㎕를 첨가하고, 25℃에서 밤새 인큐베이션한다. 이 배양액을 3,000rpm, 4℃에서 15분동안 원심분리하고, 침강된 균체를 NETN (0.5 % Nonidet P-40 , 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl) 50ml에 현탁시킨다. 이후, 1분동안 초음파처리, 얼음위에서 1분동안 조작을 2회 반복하고, 14,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득한다. 이 대장균 용해액 10ml에 글루타티온 세파로즈 비드 현탁액(Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech Inc.) 를 NETN으로 3회 세정하고, 50% NETN 현탁액으로서 제조된 것)를 100㎕ 첨가하고, 실온에서 30분동안 인큐베이션한다. 수득된 현탁액을 3,000rpm, 4℃에서 5분동안 원심분리하고, 상층액을 제거한다. 침전된 글루타티온 세포로즈 비드를 NETN으로 2회, PBS로 1회 세정하고, SDS 샘플 완충용액(125 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.1% 나트륨 도데실설페이트, 5% 2-머캅토에탄올)을 100㎕ 첨가하고, 끓는 수욕중에서 10분간 가열하여 GST-LAR 융합 단백질을 용출시킨다. 비드를 제거한 용출액을 Centricon-10(amicon사제)로 옮기고, 3,000rpm, 45분동안 원심농축한다. 유동화를 목적으로 PBS 1ml를 첨가하고, 재차 3,000rpm, 45분동안, 4℃에서 원심농축한다. 이 유동화 조작을 추가로 2회 반복하여 수득된 것을 면역용의 항원용액으로 한다. 항원 단백질의 정제 및 농축은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한다.

한편, 최종 면역에는 정맥내 투여를 수행하기 위해, 상기와는 다른 방법으로항원용액을 제조한다. GST-LAR 융합 단백질을 발현시키는 상기 대장균 용해액과 글루타티온 세파로즈 비드를 인규베이션시켜, 원심분리 후, 침전된 비드를 NETN으로 2회, PBS로 3회 세정한다. 이어서, GSH 용출 완충용액(20mM 글루타티온, 1M Tris-HCl, pH9.6)을 100㎕ 첨가하고, 10분간 실온에서 가볍게 교반하여 GST-LAR을 용출시킨다. 3,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상층액을 회수하는 조작을 총 3회 수행하고, 전체 용출액을 생리식염수 중 4℃에서 2시간동안 투석한 것을 정맥내 투여용 항원용액으로 한다.

b. 면역처리

6주된 암컷 Bal/c 마우스 8마리에 대해, 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸, Sigma corporation)을 0.5ml/마리로 복강내 투여한다. 2주후, 복강내 투여용 항원용액을 프로인트 완전 아쥬방트(Freund's complete adjuvant)(GIBCO사제)와 1 : 1로 혼합하여 유화액으로 만든 것을 GST-ALR 융합 단백질이 약 10㎍/마리가 되도록 복강내 투여한다. 이후, 약 2주간 간격으로 4회, 복강내 면역용 항원용액과 프로인트 불완전 아쥬방트(GIBCO사제)와의 1 : 1 혼합액을 GST-LAR이 약 30 내지 70㎍/마리가 되도록 제조하여, 복강내 투여한다. 4회째의 면역 4일 후에 안저정맥으로 부터 채혈하고, 혈청중의 항체가를 ELISA법에 의해 측정한다.

c. ELISA

정맥내 투여용 항원과 동일한 방법으로 제조된 GST-LAR 및 GST만의 단백질 용액을 각각 정제수에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 이를 PBS로 0.5㎍/ml로 제조하고, 50㎕/웰에서 ELISA 플레이트(Falcon 3911 MicroTest ^TM Flexible Assay Plate)에서 1시간동안 흡착시킨다. 세정용 완충용액(0.05% Tween20을 함유하는 PBS)로 5회 세정한 후, 5% 탈지유(skim milk)(탈지유 2.5g을 PBS 50ml에 용해시켜 제조)로 블로킹시킨다. 이를 세정한 후, b에서 수득된 혈청을 혈청 희석용 완충용액(0.25% BSA를 함유하는 PBS)으로 1600배로 희석하고, 50㎕/웰 각각에 첨가하고, 젖은 박스(wet box)에서 1시간동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세정한 후, 1000배 희석한 HRP 표지 항 마우스 IgG 항체를 50㎕/웰로 각각 첨가하고 1시간동안 인큐베이션한다. 세정용 완충용액으로 4회, PBS로 1회 세정한 후 ο-페닐디아민(和光純藥工業社製))을 시트레이트(citrate) 완충용액(시트르산 모노하이드레이트 5.6325 g 및 Na₂HPO₄-2H₂O 18.35g을 정제수에 용해시켜 총 500 ml로 제조함)에 1mg/ml 농도로 용해시킨 기질 용액을 50㎕/웰이 되도록 첨가하여 30분간 반응시킨 후, 50㎕의 10% H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 이 중 50㎕를 측정용 96 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., LTD.)에 옮겨 450nm의 흡광도를 측정하였다.

d. 세포융합

상기 ELISA의 결과로 부터 GST-LAR에 대한 항체가의 상승이 인정되는 마우스 2마리에 정맥내 투여로 최종 면역을 수행하고, 그 3일 후에 비장을 적출하여 통상적인 방법으로 비세포를 제조한다.

세포융합을 위한 부모세포는 사전에 20㎍/ml의 8-아자구아닌을 함유하는 배지로 선택하고, 하이포잔틴(hypoxanthine), 구아닌, 포스포라이보실 트랜스퍼라제(HGPRT) 결핍 균주인 Bal/c 마우스 유래 골수종 세포 NS1을 사용한다. NS1 세포 2 × 10⁷ 세포수와 비세포 1 × 10⁸ 세포수에 대하여, ClonaCell(상표명)-HY Hybridoma Cloning Kit(StemCell Technologies Inc.)를 사용하여 세포융합, HAT 선택 및 클로닝을 수행한다.

클로닝된 하이브리도마 배양 상층액의 스크리닝은 정맥내 투여용 항원과 동일한 방법으로 제조된 GST, GST-LAR 또는 GST-CD45(Furukawa, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,10928-10932,1994) 의 단백질 용액 0.5㎍/ml를 결합시킨 플레이트에 두고, 하이브리도마 배양 상층액 50㎕에 관한 상기 c에 있어서 ELISA 법에 따라 수행한다. 이 ELISA 법은 GST 또는 GST-CD45를 결합시킨 웰에는 면역반응을 나타내지 않고, GST-LAR을 결합시킨 웰에 면역반응을 나타내는 하이브리도마를 선택한다. 즉, 클로닝된 하이브리도마의 계대배양은 10% 태 송아지 혈청(GIBCO사제)를 함유하는 RPMI 1640 배양액(日水製藥社製)에서 수행한다.

이와 같이, HAT 선택된 하이브리도마의 배양 상층액을 ELISA법에 의해 스크리닝하는 것에 의해, 항체생산능력, 증식능력도 안정되고, LAR의 세포내 도메인에 특이성을 갖는 클론 YU1이 수득된다.

이 하이브리도마 세포 YU1은 1998년 5월 7일에 일본국 이바라키현, 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고에 소재하는 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하여, 수탁번호가 FERM BP-6343이다.

e. 모노클로날 항체의 형태

상기 d.에서 수득된 하이브리도마 세포 YU1의 배양 상층액 0.5ml를 4.5ml의 TBS-T에서 희석하고, 희석액 중 3ml에 대하여 Mouse monoclonal antibody isotyping kit(Amersham International plc. 제)를 사용하여, 이소타입을 비교하였다. 이 결과, 항체의 이소타입은 IgG2b_k이다.

f. 모노클로날 항체의 제조 및 정제

생후 6주의 암컷 Balb/c 마우스에 대하여, 0.5ml/마리의 프리스탄(pristane)을 복강내 투여하고, 그 10일 후, 상기 d.의 클로닝으로 수득된 하이브리도마 세포 YU1을 1마리당 2.5×10⁶~1.3×10⁷ 세포수/0.5ml/마리로 복강내 주입한다. 10일후 정도부터 마우스의 복부비대를 관찰하고, 20게이지의 주사침을 이용하여 수회에 걸쳐 복수를 채취하였다. 채취된 복수는 1,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상층액과 침전물을 분리하였다. 상층액은 37℃에서 30분간 처리한 후, 4℃에서 밤새 방치하였다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여, 수득된 상층액 1.5ml로 부터 친화 컬럼 HiTrap ProteinG(Pharmacia Biotech사제)를 사용하여 모노클로날 항체 YU1을 제조하였다. 수득된 항체 용액에 대하여 280nm에서 흡광도를 측정하고, 마우스 IgG의 분자흡광계수로부터 항체농도를 산출하였다.

추가로, 이 모노클로날 항체 YU1에 관해, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동상의 이동도로부터 관찰되는 분자량을 밝혔다. 이 결과를 도 6에 도시한다. 도 6에서 명백한 바와 같이, 모노클로날 항체 YU1은 약 50kD의 H쇄와, 약 25kD의 L쇄 를 합쳐 약 150kD의 분자량을 갖는 것이다.

실시예 2

모노클로날 항체의 특이성 검출

실험예 1, a 및 b에 기재된 방법에 따라서, LAR WT의 발현 벡터를 COS-7 세포에 형질감염시킨다. 이 세포 용해액과 실시예 1에서 수득된 정제 모노클로날 항체를 사용하여 면역침강시킨 후, 면역블럿팅을 실시한다. 면역침강의 대조군으로는, IgG 서브그룹에 속하는 항체(항 LAR E-서브유닛 항체(상기) 및 항 CD45 항체(Santa Cruz Biotechnology 사제, 35-Z6)에 대해서는 MOPC 21을, 모노클로날 항체 YU1에 대해서는 마우스 IgG2b_K(MOPC 195, CAPPEL사제)를 이용한다.

관련된 COS-7 세포에의 LAR 강제 발현 시스템을 이용한 해석에 의해, 항 LAR E-서브유닛 항체로 면역침강 후, 모노클로날 항체 YU1은 LAR P-서브유닛에 상당하는 85kD과 전구체에 상당하는 약 200kD의 단백질을 인식한다(도 7b).

추가로, LAR을 형질감염시킨 COS-7 세포의 세포용출액을 이들의 항체(IgG1, IgG2b, 또는 YU1)으로 면역침강시킨 후, LAR E-서브유닛을 인식하는 항체로 면역블럿팅을 수행한 후, 항체 YU1으로 면역침강시킨 것에만, LAR E-서브유닛에 상당하는 150kD과 전구체에 해당하는 약 200kD의 단백질이 검출된다(도 7a). 이상의 결과로부터, 모노클로날 항체 YU1은 LAR의 P-서브유닛의 면역침강 및 면역블럿팅에 이용가능한 것이 밝혀졌다.

실시예 3

인슐린 수용체 티로신 키나아제에 의한 LAR의 인산화

실시예 4에 의해, 인슐린 수용체와 LAR의 공형질감염에 의해 검출되는 티로신 인산화된 85kD 밴드가 LAR P-서브유닛일 가능성이 고려될 수 있다.

여기서 실시예 1에서 제조된 모노클로날 항체 YU1을 사용하고, 인슐린 수용체 티로신 키나아제에 의한 티로신 인산화된 85kD 단백질이 LAR P-서브유닛인가의 검토를 실험예 1에 기재된 바와 동일한 양식으로 수행한다.

LAR WT 또는 LAR C/S와 IR을 공형질감염시킨 후, 인슐린으로 1분간 자극한 COS-7 세포 용해액을 항 LAR E-서브유닛 항체로 면역침강시킨 후, 항 LAR E-서브유닛 항체와 항체 YU1의 혼합물로 면역블럿팅시키면, LAR의 전구체와 각 서브유닛이 검출된다.

이 블럿을 추가로 항인산화 티로신 항체로 리프로브(reprobe)항보면, 85kD 티로신 인산화 밴드가 LAR P-서브유닛의 밴드와 일치한다(도 8). 이 결과는 LAR이 인슐린 수용체의 기질의 하나인 것을 나타내는 것이다.

또한 이 LAR P-서브유닛의 티로신 인산화는 LAR WT와 공형질감염으로 검출되었기 때문에, LAR은 자기 탈인산화하는 것으로 생각된다(도 3).

도 9에서 도시된 바와 같이 인슐린이 인슐린 수용체 α 쇄에 결합하면, 인슐린 수용체의 β쇄가 자기인산화되어 티로신 키나아제 활성이 상승한다. 이 티로신 키나아제의 작용에 의해, 최종적으로 글루코즈의 섭취, 글루코즈 대사 및 세포 증식과 같은 인슐린의 작용이 발현된다. 이 활성화된 인슐린 수용체는 LAR에 의한 티로신 탈인산화 과정에 의해 불활성화 상태에 도달한 것을 나타낸다.

또한, 인슐린 수용체 티로신 키나아제는 LAR의 세포내 도메인을 티로신 인산화하는 것이 증명되었고, 이 인산화가 LAR의 기질 특이성이나 포스파타제 활성의 상승에 관여하는 것이 추측된다. 그리고 LAR은 이 인산화 티로신을 자기 탈인산화하는 것에 의해 효소활성을 억제하는 것으로 생각된다.

이상의 결과로 부터, LAR의 효소활성의 촉진이 인슐린 저항성의 원인일 가능성을 분자 수준에서 나타낼 수 있다.

실시예 4

마우스에서 LAR의 조직분포

생후 7주된 숫컷 C57BL/6 마우스로부터 적출된 각 장기 1g에 대해, 차가운 세포용해용 완충용액(실험예 1, c란에 기재된 것과 동일) 3 ml를 첨가하고, 얼음위에서 세포파쇄(homogenization)한 후, 얼음위에서 30분간 인큐베이션한다. 4℃, 15,000g에서 20분간 원심분리후, 상층액을 회수하고, 동일한 조건하에서 재차 원심분리하여 수득된 상층액을 각각의 조직시료로서 사용한다. 단백질 정량은 DC Protein Assay(Bio-Rad)의 안내서(manual)에 따라 실시한다.

수득된 각 상층액(단백질 0.2mg에 상당함)을 전기영동한 후, YU1을 사용하여, 실험예 1, e.란에 기재된 방식으로 면역블럿팅을 실시한다.

수득된 결과를 도 14에 도시한다. YU1은 마우스의 LAR도 인식하는 것이 가능하고, 흉선 및 뇌에서의 LAR 발현을 인식하는 것이 가능하다. 폐와 간에서도 소량 발현이 관찰된다.

실시예 5

YU1에 의한 갑상선암조직단편의 면역염색

갑상선의 조직을 10% 중성 인산 완충된 포르말린 용액에서 고정시킨 후, 파라핀 블록을 제작하고, 슬라이드 표본을 제작한다. 하기에 상세한 수순을 기재한다.

1. 탈파라핀 조작

고정한 파라핀 블록을 100% 크실렌에서 5분간 2회 담구고, 그 후 100% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올에 각각 3분간 담군다. 최후에 10mM 시트르산 유동액(pH6.0)에 담군다. 이 상태에서, 항원결정기를 노출시키기 위해, 100℃, 5분간 오토클레이브에 걸어둔다.

2. 면역염색

0.15M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl(pH7.6)(트리스 용액)으로 세정하고, 추가로 이 트리스 용액에 담군다. 이후, 내인성 과산화효소의 제거를 위해, 용액을 슬라이드 유리로부터 제거하여 3% 과산화수소수를 조직의 위에 적가하고, 3분간 방치한다.

블록킹은 물에서 충분히 세정후, 추가로 트리스액에서 충분히 세정하고, 과량의 액체를 제거하고, 담체 단백질(2% BSA), 0.015M 아지화나트륨 및 0.15M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.6)에서 조직을 인큐베이션하고, 15분간 방치하여 수행하였다.

이어서, 과량의 액체를 세정하지 않고 제거한 후, 일차 항체 YU1(원액의 1000배 희석액)을 조직에 적가한 후, 이대로 젖은 상자내에서 90분간 방치한다.

이후, 0.15M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.6)으로 충분히 세정한 후, 이차항원(바이오틴화 항마우스 면역글로블린: biotined anti mouse immunoglobulin)을 적가하고 45분간 방치한다.

그 후, 0.15M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.6)으로 충분히 세정하고, 스트렙트아비딘(Streptavidine) 접합된 서양 고추냉이 과산화효소를 적가한 후 25분간 방치하였다.

이어서, 0.15M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.6)으로 충분히 세정하고, 0.02% 과산화수소 및 0.15M NaCl을 함유하는 0.05% DAB(3,3'-디아미노벤지딘 테트라-하이드로클로라이드)의 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.6)을 적가하고, 현미경하에서 발색을 확인하고, 수중에 슬라이드 유리를 담구어 반응을 정지시킨다.

반응정지후, 마이어(Mayer)의 헤마톡실린(hematoxlin)에 5 내지 10분간 담구고, 후발색을 실시한다. 이후 물세척하고, 100% 에탄올에 1분간 2회, 100% 크실렌에 1분간 2회 담군후, 마리놀(Malinol)에 봉입하고, 관찰한다.

블록킹, 2차항체, 스트렙트아비딘-과산화효소 용액은 DAKO Japan Co. Ltd., (Kyoto)의 LSAB 키트를 사용하고, DAB는 Dojindo(Kumamoto)의 시약을, 말리놀은 Muto Pure Chemicals Ltd.(Tokyo)를, 마이야의 헤마톡실린은 제작하여 사용하였다.

이와 같이하여 수득된 갑상선 암세포의 면역염색의 결과를 도 11 내지 도 13에 도시한다. 이들 도로부터, 갑상선 암세포에 YU1 항체가 선택적으로 결합하고(갈색염색부위), 정상의 여포세포 및 종양조직의 간질에는 결합하지 않는(청색염색부위) 것이 밝혀졌다.

따라서, 이 항체를 사용하여 갑상선암의 조직단편 염색에 의한 진단이 가능하다는 점, 또한 이 항체가 항암제(화학치료법)을 함유하는 DDS 시스템에 있어서 유용하다는 점이 명확해졌다.

실시예 6

기타 양성종양세포 및 암세포조직의 면역염색

실시예 5에 기재된 바와 동일한 수순에 따라, 이하의 표 1에 나타난 여러가지 양성종양세포 및 암화세포조직(사람 유래)의 면역염색을 실시한다.

YU1 항체와 결합성에 기초한 염색이 인정되는 것을 양성으로 평가하고, 결과를 표 1에 나타낸다.

이 결과, 갑상선암에서의 양성비율은 100%이고, 양성종양 및 기타 장기의 암에는 양성비율이 낮았던가 또는 완전히 음성인 것이 밝혀졌다. 대장암에서 비교적 높은 양성비율이 나타났지만, 정상의 선세포에도 양서을 나타내는 것이기 때문에 갑상선암에 있어서의 것과 분명히 다르고, 확실히 염색된 갑상선 암세포에 대한 YU1의 특이적 면역반응성이 나타난다.

실시예 7

YU1에 의한 갑상선암의 특이적 면역반응: 면역검정 이용가능성의 검토

실시예 5에서 사용된 사람 갑상선암 조직 및 정상조직 각 1g에 대하여, 차가운 세포용해용 완충용액(상기와 동일) 3ml를 첨가하고, 얼음위에서 폴리트론(Polytron)을 이용하여 세포파괴한 후, 얼음위에서 30분간 인큐베이션한다. 4℃, 15,000g에서 20분간 원심분리후, 상층액을 회수하고, 동일한 조건에서 재차 원심분리하여 수득한 상층액을 이용한다. 단백질 정량은 DC Protein Assay(Bio-Rad)의 안내서(manual)에 따라 실시한다.

수득된 각 상층액(단백질 1mg에 상당함) 또는 양성대조군으로서 COS-7 세포에 사람 LAR을 형질감염하고, 항 LAR 항체를 이용하여 면역침강시킨 것(실험예 1 a 내지 c에 기재된 과정에 따라서 제조)을 전기영동한 후, 실험예 1, e.란에 기재된 방법에 따라서 YU1을 사용하여 면역블럿팅을 실시한다. ImmunoStar Reagents(化光純藥工業)을 사용하여 검출한다.

이러한 방식으로 수득된 결과를 도 10에 도시한다. 도 10에 도시된 바와 같이, YU1은 정상의 갑상선세포와 달리, 암화한 갑상선조직을 특이적으로 인식하는 것이 명백하다. 따라서, 갑상선의 미세침 흡인 세포조직학적 진단법에 따라서 수득된 조직시료를 갑상선암의 진단에 이용가능한 것으로 판단된다.

본 발명에 따라 제공되는, LAR의 포스파타제 서브유닛에 대한 항체는 포스파타제 활성을 갖는 LAR의 세포내 도메인을 특이적으로 인식하는 것이 가능하다. 따라서, 이 항체는 인슐린의 시그날 전달 매커니즘을 밝히고, LAR 조절자(modulator), 및 결합 단백질 등을 동정, 취득하기 위해 극히 유용한 도구가 될 것이다. 또한 인슐린 저항성 및 NIDDM에 유용한 진단방법을 개발하고, 추가로는 인슐린 저항성을 기반으로 하는 증후군 X 등 여러가지 질병의 예방 및 진단 또는 동맥경화 및 심혈관계 질환의 예방 및 진단에 응용가능하다.

또한 본 발명의 항체는 갑상선암에 대해 특이적인 면역반응성을 갖는 것으로, 미세침 흡인 세포조직학적 진단법 및 조직단편을 이용한 갑상선암의 진단, 갑상선암 치료를 위한 DDS를 이용하는 의약 조성물 등에 유용하고, 또한 갑상선 암세포에 대해 LAR 분자의 전사, 번역 수준에서의 발현조절인자의 분자생물학적 연구에도 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Antibody Specific for Phosphatase Subunit of LAR <130> 99P133WO <160> 3 <210> 1 <211> 3467 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (6)..(1826) <220> <221> misc_feature <222> (213)..(953) <223> Phosphatase Domain 1 <220> <221> misc_feature <222> (1080)..(1826) <223> Phosphatase Domain 2 <300> <308> DDBJ/EMBL/GenBank Accession No.Y00815 <309> 1995-09-19 <400> 1 gatcc gga ctg aag gac tcc ttg ctg gcc cac tcc tct gac cct gtg gag 50 Gly Leu Lys Asp Ser Leu Leu Ala His Ser Ser Asp Pro Val Glu 1 5 10 15 atg cgg agg ctc aac tac cag acc cca ggt atg cga gac cac cca ccc 98 Met Arg Arg Leu Asn Tyr Gln Thr Pro Gly Met Arg Asp His Pro Pro 20 25 30 atc ccc atc acc gac ctg gcg gac aac atc gag cgc ctc aaa gcc aac 146 Ile Pro Ile Thr Asp Leu Ala Asp Asn Ile Glu Arg Leu Lys Ala Asn 35 40 45 gat ggc ctc aag ttc tcc cag gag tat gag tcc atc gac cct gga cag 194 Asp Gly Leu Lys Phe Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile Asp Pro Gly Gln 50 55 60 cag ttc acg tgg gag aat tca aac ctg gag gtg aac aag ccc aag aac 242 Gln Phe Thr Trp Glu Asn Ser Asn Leu Glu Val Asn Lys Pro Lys Asn 65 70 75 cgc tat gcg aat gtc atc gcc tac gac cac tct cga gtc atc ctt acc 290 Arg Tyr Ala Asn Val Ile Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Ile Leu Thr 80 85 90 95 tct atc gat ggc gtc ccc ggg agt gac tac atc aat gcc aac tac atc 338 Ser Ile Asp Gly Val Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile 100 105 110 gat ggc tac cgc aag cag aat gcc tac atc gcc acg cag ggc ccc ctg 386 Asp Gly Tyr Arg Lys Gln Asn Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu 115 120 125 ccc gag acc atg ggc gat ttc tgg aga atg gtg tgg gaa cag cgc acg 434 Pro Glu Thr Met Gly Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Gln Arg Thr 130 135 140 gcc act gtg gtc atg atg aca cgg ctg gag gag aag tcc cgg gta aaa 482 Ala Thr Val Val Met Met Thr Arg Leu Glu Glu Lys Ser Arg Val Lys 145 150 155 tgt gat cag tac tgg cca gcc cgt ggc acc gag acc tgt ggc ctt att 530 Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Ala Arg Gly Thr Glu Thr Cys Gly Leu Ile 160 165 170 175 cag gtg acc ctg ttg gac aca gtg gag ctg gcc aca tac act gtg cgc 578 Gln Val Thr Leu Leu Asp Thr Val Glu Leu Ala Thr Tyr Thr Val Arg 180 185 190 acc ttc gca ctc cac aag agt ggc tcc agt gag aag cgt gag ctg cgt 626 Thr Phe Ala Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Glu Lys Arg Glu Leu Arg 195 200 205 cag ttt cag ttc atg gcc tgg cca gac cat gga gtt cct gag tac cca 674 Gln Phe Gln Phe Met Ala Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Tyr Pro 210 215 220 act ccc atc ctg gcc ttc cta cga cgg gtc aag gcc tgc aac ccc cta 722 Thr Pro Ile Leu Ala Phe Leu Arg Arg Val Lys Ala Cys Asn Pro Leu 225 230 235 gac gca ggg ccc atg gtg gtg cac tgc agc gcg ggc gtg ggc cgc acc 770 Asp Ala Gly Pro Met Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr 240 245 250 255 ggc tgc ttc atc gtg att gat gcc atg ttg gag cgg atg aag cac gag 818 Gly Cys Phe Ile Val Ile Asp Ala Met Leu Glu Arg Met Lys His Glu 260 265 270 aag acg gtg gac atc tat ggc cac gtg acc tgc atg cga tca cag agg 866 Lys Thr Val Asp Ile Tyr Gly His Val Thr Cys Met Arg Ser 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1886 cctctgagcc ataccgacca tcgtccagcc ctcctacgca gatgctgtca ctggcagagc 1946 acagcccacg gggatcacag cgtttcagga acgttgccac accaatcaga gagcctagaa 2006 catccctggg caagtggatg gcccagcagg caggcactgt ggcccttctg tccaccagac 2066 ccacctggag cccgcttcaa gctctctgtt gcgctcccgc atttctcatg cttcttctca 2126 tggggtgggg ttggggcaaa gcctcctttt taatacatta agtggggtag actgagggat 2186 tttagcctct tccctctgat ttttcctttc gcgaatccgt atctgcagaa tgggccactg 2246 taggggttgg ggtttatttt gttttgtttt tttttttttt ttgtatgact tctgctgaag 2306 gacagaacat tgccttcctc gtgcagagct ggggctgcca gcctgagcgg aggctcggcc 2366 gtgggccggg aggcagtgct gatccggctg ctcctccagc ccttcagacg agatcctgtt 2426 tcagctaaat gcagggaaac tcaatgtttt tttaagtttt gttttccctt taaagccttt 2486 ttttaggcca cattgacagt ggtgggcggg gagaagatag ggaacactca tccctggtcg 2546 tctatcccag tgtgtgttta acattcacag cccagaacca cagatgtgtc tgggagagcc 2606 tggcaaggca ttcctcatca ccatcgtgtt tgcaaaggtt aaaacaaaaa caaaaaacca 2666 caaaaataaa aaacaaaaaa aacaaaaaac ccaaaaaaaa aaaaaaaaag agtcagccct 2726 tggcttctgc ttcaaaccct caagagggga agcaactccg tgtgcctggg gttcccgagg 2786 gagctgctgg ctgacctggg cccacagagc ctggctttgg tccccagcat tgcagtatgg 2846 tgtggtgttt gtaggctgtg gggtctggct gtgtggccaa ggtgaatagc acaggttagg 2906 gtgtgtgcca caccccatgc acctcagggc caagcggggg cgtggctggc ctttcaggtc 2966 caggccagtg ggcctggtag cacatgtctg tcctcagagc aggggccaga tgattttcct 3026 ccctggtttg cagctgtttt caaagccccc gataatcgct cttttccact ccaagatgcc 3086 ctcataaacc aatgtggcaa gactactgga cttctatcaa tggtactcta atcagtcctt 3146 attatcccag cttgctgagg ggcagggaga gcgcctcttc ctctgggcag cgctatctag 3206 ataggtaagt gggggcgggg aagggtgcat agctgtttta gctgagggac gtggtgccga 3266 cgtccccaaa cctagctagg ctaagtcaag atcaacattc cagggttggt aatgttggat 3326 gatgaaacat tcatttttac cttgtggatg ctagtgctgt agagttcact gttgtacaca 3386 gtctgttttc tatttgttaa gaaaaactac agcatcattg cataattctt gatggtaata 3446 aatttgaata atcagatttc t 3467 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signature Motif Conserved in Phosphatase Domain of Known PTPs. <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> "Xaa"="Ile" or "Val". <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> "Xaa"="Ser" or "Thr". <400> 2 Xaa His Cys Xaa Ala Gly Xaa Xaa Arg Xaa Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 7702 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (371)..(6064) <220> <221> sig_peptide <222> (371)..(418) <220> <221> mat_peptide <222> (419)..(6061) <220> <221> misc_feature <222> (419)..(4120) <223> Extracellular Domain <220> <221> misc_feature <222> (4121)..(4192) <223> Transmembrane Domain <220> <221> misc_feature <222> (4193)..(6061) <223> Cytoplasmic Domain <300> <308> DDBJ/EMBL/GenBank Accession No.Y00815 <309> 1995-09-19 <400> 3 cgggagcggc gggagcggtg gcggcggcag aggcggcggc tccagcttcg gctccggctc 60 gggctcgggc tccggctccg gctccggctc cggctccagc tcgggtggcg gtggcgggag 120 cgggaccagg tggaggcggc ggcggcagag gagtgggagc agcggcccta gcggcttgcg 180 gggggacatg cggaccgacg gcccctggat aggcggaagg agtggaggcc ctggtgcccg 240 gcccttggtg ctgagtatcc agcaagagtg accggggtga agaagcaaag actcggttga 300 ttgtcctggg ctgtggctgg ctgtggagct agagccctgg atggcccctg agccagcccc 360 agggaggacg atg gtg ccc ctt gtg cct gca ctg gtg atg ctt ggt ttg 409 Met Val Pro Leu Val Pro Ala Leu Val Met Leu Gly Leu -15 -10 -5 gtg gca ggc gcc cat ggt gac agc aaa cct gtc ttc att aaa gtc cct 457 Val Ala Gly Ala His Gly Asp Ser Lys Pro Val Phe Ile Lys Val Pro 1 5 10 gag gac cag act ggg ctg tca gga ggg gta gcc tcc ttc gtg tgc caa 505 Glu Asp Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gly Val Ala Ser Phe Val Cys Gln 15 20 25 gct aca gga gaa ccc aag ccg cgc atc aca tgg atg aag aag ggg aag 553 Ala Thr Gly Glu Pro Lys Pro Arg Ile Thr Trp Met Lys Lys Gly Lys 30 35 40 45 aaa gtc agc tcc cag cgc ttc gag gtc att gag ttt gat gat ggg gca 601 Lys Val Ser Ser Gln Arg Phe Glu Val Ile Glu Phe Asp Asp Gly Ala 50 55 60 ggg tca gtg ctt cgg atc cag cca ttg cgg gtg cag cga gat gaa gcc 649 Gly Ser Val Leu Arg Ile Gln Pro Leu Arg Val Gln Arg Asp Glu Ala 65 70 75 atc tat gag tgt aca gct act aac agc ctg ggt gag atc aac act agt 697 Ile Tyr Glu Cys Thr Ala Thr Asn Ser Leu Gly Glu Ile Asn Thr Ser 80 85 90 gcc aag ctc tca gtg ctc gaa gag gaa cag ctg ccc cct ggg ttc cct 745 Ala Lys Leu Ser Val Leu Glu Glu Glu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Pro 95 100 105 tcc atc gac atg ggg cct cag ctg aag gtg gtg gag aag gca cgc aca 793 Ser Ile Asp Met Gly Pro Gln Leu Lys Val Val Glu Lys Ala Arg Thr 110 115 120 125 gcc acc atg cta tgt gcc gca ggc gga aat cca gac cct gag att tct 841 Ala Thr Met Leu Cys Ala Ala Gly Gly Asn Pro Asp Pro Glu Ile Ser 130 135 140 tgg ttc aag gac ttc ctt cct gta gac cct gcc acg agc aac ggc cgc 889 Trp Phe Lys Asp Phe Leu Pro Val Asp Pro Ala Thr Ser Asn Gly Arg 145 150 155 atc aag cag ctg cgt tca ggt gcc ttg cag ata gag agc agt gag gaa 937 Ile Lys Gln Leu Arg Ser Gly Ala Leu Gln Ile Glu Ser Ser Glu Glu 160 165 170 tcc gac caa ggc aag tac gag tgt gtg gcg acc aac tcg gca ggc aca 985 Ser Asp Gln Gly Lys Tyr Glu Cys Val Ala Thr Asn Ser Ala Gly Thr 175 180 185 cgt tac tca gcc cct gcg aac ctg tat gtg cga gtg cgc cgc gtg gct 1033 Arg Tyr Ser Ala Pro Ala Asn Leu Tyr Val Arg Val Arg Arg Val Ala 190 195 200 205 cct cgt ttc tcc atc cct ccc agc agc cag gag gtg atg cca ggc ggc 1081 Pro Arg Phe Ser Ile Pro Pro Ser Ser Gln Glu Val Met Pro Gly Gly 210 215 220 agc gtg aac ctg aca tgc gtg gca gtg ggt gca ccc atg ccc tac gtg 1129 Ser Val Asn Leu Thr Cys Val Ala Val Gly Ala Pro Met Pro Tyr Val 225 230 235 aag tgg atg atg ggg gcc gag gag ctc acc aag gag gat gag atg cca 1177 Lys Trp Met Met Gly Ala Glu Glu Leu Thr Lys Glu Asp Glu Met Pro 240 245 250 gtt ggc cgc aac gtc ctg gag ctc agc aat gtc gta cgc tct gcc aac 1225 Val Gly Arg Asn Val Leu Glu Leu Ser Asn Val Val Arg Ser Ala Asn 255 260 265 tac acc tgt gtg gcc atc tcc tcg ctg ggc atg atc gag gcc aca gcc 1273 Tyr Thr Cys Val Ala Ile Ser Ser Leu Gly Met Ile Glu Ala Thr Ala 270 275 280 285 cag gtc aca gtg aaa gct ctt cca aag cct ccg att gat ctt gtg gtg 1321 Gln Val Thr Val Lys Ala Leu Pro Lys Pro Pro Ile Asp Leu Val Val 290 295 300 aca gag aca act gcc acc agt gtc acc ctc acc tgg gac tct ggg aac 1369 Thr Glu Thr Thr Ala Thr Ser Val Thr Leu Thr Trp Asp Ser Gly Asn 305 310 315 tcg gag cct gta acc tac tat ggc atc cag tac cgc gca gcg ggc acg 1417 Ser Glu Pro Val Thr Tyr Tyr Gly Ile Gln Tyr Arg Ala Ala Gly Thr 320 325 330 gag ggc ccc ttt cag gag gtg gat ggt gtg gcc acc acc cgc tac agc 1465 Glu Gly Pro Phe Gln Glu Val Asp Gly Val Ala Thr Thr Arg Tyr Ser 335 340 345 att ggc ggc ctc agc cct ttc tcg gaa tat gcc ttc cgc gtg ctg gcg 1513 Ile Gly Gly Leu Ser Pro Phe Ser Glu Tyr Ala Phe Arg Val Leu Ala 350 355 360 365 gtg aac agc atc ggg cga ggg ccg ccc agc gag gca gtg cgg gca cgc 1561 Val Asn Ser Ile Gly Arg Gly Pro Pro Ser Glu Ala Val Arg Ala Arg 370 375 380 acg gga gaa cag gcg ccc tcc agc cca ccg cgc cgc gtg cag gca cgc 1609 Thr Gly Glu Gln Ala Pro Ser Ser Pro Pro Arg Arg Val Gln Ala Arg 385 390 395 atg ctg agc gcc agc acc atg ctg gtg cag tgg gag cct ccc gag gag 1657 Met Leu Ser Ala Ser Thr Met Leu Val Gln Trp Glu Pro Pro Glu Glu 400 405 410 ccc aac ggc ctg gtg cgg gga tac cgc gtc tac tat act ccg gac tcc 1705 Pro Asn Gly Leu Val Arg Gly Tyr Arg Val Tyr Tyr Thr Pro Asp Ser 415 420 425 cgc cgc ccc ccg aac gcc tgg cac aag cac aac acc gac gcg ggg ctc 1753 Arg Arg Pro Pro Asn Ala Trp His Lys His Asn Thr Asp Ala Gly Leu 430 435 440 445 ctc acg acc gtg ggc agc ctg ctg cct ggc atc acc tac agc ctg cgc 1801 Leu Thr Thr Val Gly Ser Leu Leu Pro Gly Ile Thr Tyr Ser Leu Arg 450 455 460 gtg ctt gcc ttc acc gcc gtg ggc gat ggc cct ccc agc ccc acc atc 1849 Val Leu Ala Phe Thr Ala Val Gly Asp Gly Pro Pro Ser Pro Thr Ile 465 470 475 cag gtc aag acg cag cag gga gtg cct gcc cag ccc gcg gac ttc cag 1897 Gln Val Lys Thr Gln Gln Gly Val Pro Ala Gln Pro Ala Asp Phe Gln 480 485 490 gcc gag gtg gag tcg gac acc agg atc cag ctc tcg tgg ctg ctg ccc 1945 Ala Glu Val Glu Ser Asp Thr Arg Ile Gln Leu Ser Trp Leu Leu Pro 495 500 505 cct cag gag cgg atc atc atg tat gaa ctg gtg tac tgg gcg gca gag 1993 Pro Gln Glu Arg Ile Ile Met Tyr Glu Leu Val Tyr Trp Ala Ala Glu 510 515 520 525 gac gaa gac caa cag cac aag gtc acc ttc gac cca acc tcc tcc tac 2041 Asp Glu Asp Gln Gln His Lys Val Thr Phe Asp Pro Thr Ser Ser Tyr 530 535 540 aca cta gag gac ctg aag cct gac aca ctc tac cgc ttc cag ctg gct 2089 Thr Leu Glu Asp Leu Lys Pro Asp Thr Leu Tyr Arg Phe Gln Leu Ala 545 550 555 gca cgc tcg gat atg ggg gtg ggc gtc ttc acc ccc acc att gag gcc 2137 Ala Arg Ser Asp Met Gly Val Gly Val Phe Thr Pro Thr Ile Glu Ala 560 565 570 cgc aca gcc cag tcc acc ccc tcc gcc cct ccc cag aag gtg atg tgt 2185 Arg Thr Ala Gln Ser Thr Pro Ser Ala Pro Pro Gln Lys Val Met Cys 575 580 585 gtg agc atg ggc tcc acc acg gtc cgg gta agt tgg gtc ccg ccg cct 2233 Val Ser Met Gly Ser Thr Thr Val Arg Val Ser Trp Val Pro Pro Pro 590 595 600 605 gcc gac agc cgc aac ggc gtt atc acc cag tac tcc gtg gcc cac gag 2281 Ala Asp Ser Arg Asn Gly Val Ile Thr Gln Tyr Ser Val Ala His Glu 610 615 620 gcg gtg gac ggc gag gac cgc ggg cgg cat gtg gtg gat ggc atc agc 2329 Ala Val Asp Gly Glu Asp Arg Gly Arg His Val Val Asp Gly Ile Ser 625 630 635 cgt gag cac tcc agc tgg gac ctg gtg ggc ctg gag aag tgg acg gag 2377 Arg Glu His Ser Ser Trp Asp Leu Val Gly Leu Glu Lys Trp Thr Glu 640 645 650 tac cgg gtg tgg gtg cgg gca cac aca gac gtg ggc ccc ggc ccc gag 2425 Tyr Arg Val Trp Val Arg Ala His Thr Asp Val Gly Pro Gly Pro Glu 655 660 665 agc agc ccg gtg ctg gtg cgc acc gat gag gac gtg ccc agc ggg cct 2473 Ser Ser Pro Val Leu Val Arg Thr Asp Glu Asp Val Pro Ser Gly Pro 670 675 680 685 ccg cgg aag gtg gag gtg gag cca ctg aac tcc act gct gtg cat gtc 2521 Pro Arg Lys Val Glu Val Glu Pro Leu Asn Ser Thr Ala Val His Val 690 695 700 tac tgg aag ctg cct gtc ccc agc aag cag cat ggc cag atc cgc ggc 2569 Tyr Trp Lys Leu Pro Val Pro Ser Lys Gln His Gly Gln Ile Arg Gly 705 710 715 tac cag gtc acc tac gtg cgg ctg gag aat ggc gag ccc cgt gga ctc 2617 Tyr Gln Val Thr Tyr Val Arg Leu Glu Asn Gly Glu Pro Arg Gly Leu 720 725 730 ccc atc atc caa gac gtc atg cta gcc gag gcc cag tgg cgg cca gag 2665 Pro Ile Ile Gln Asp Val Met Leu Ala Glu Ala Gln Trp Arg Pro Glu 735 740 745 gag tcc gag gac tat gaa acc act atc agc ggc ctg acc ccg gag acc 2713 Glu Ser Glu Asp Tyr Glu Thr Thr Ile Ser Gly Leu Thr Pro Glu Thr 750 755 760 765 acc tac tcc gtt act gtt gct gcc tat acc acc aag ggg gat ggt gcc 2761 Thr Tyr Ser Val Thr Val Ala Ala Tyr Thr Thr Lys Gly Asp Gly Ala 770 775 780 cgc agc aag ccc aaa att gtc act aca aca ggt gca gtc cca ggc cgg 2809 Arg Ser Lys Pro Lys Ile Val Thr Thr Thr Gly Ala Val Pro Gly Arg 785 790 795 ccc acc atg atg atc agc acc acg gcc atg aac act gcg ctg ctc cag 2857 Pro Thr Met Met Ile Ser Thr Thr Ala Met Asn Thr Ala Leu Leu Gln 800 805 810 tgg cac cca ccc aag gaa ctg cct ggc gag ctg ctg ggc tac cgg ctg 2905 Trp His Pro Pro Lys Glu Leu Pro Gly Glu Leu Leu Gly Tyr Arg Leu 815 820 825 cag tac tgc cgg gcc gac gag gcg cgg ccc aac acc ata gat ttc ggc 2953 Gln Tyr Cys Arg Ala Asp Glu Ala Arg Pro Asn Thr Ile Asp Phe Gly 830 835 840 845 aag gat gac cag cac ttc aca gtc acc ggc ctg cac aag ggg acc acc 3001 Lys Asp Asp Gln His Phe Thr Val Thr Gly Leu His Lys Gly Thr Thr 850 855 860 tac atc ttc cgg ctt gct gcc aag aac cgg gct ggc ttg ggt gag gag 3049 Tyr Ile Phe Arg Leu Ala Ala Lys Asn Arg Ala Gly Leu Gly Glu Glu 865 870 875 ttc gag aag gag atc agg acc ccc gag gac ctg ccc agc ggc ttc ccc 3097 Phe Glu Lys Glu Ile Arg Thr Pro Glu Asp Leu Pro Ser Gly Phe Pro 880 885 890 caa aac ctg cat gtg aca gga ctg acc acg tct acc aca gaa ctg gcc 3145 Gln Asn Leu His Val Thr Gly Leu Thr Thr Ser Thr Thr Glu Leu Ala 895 900 905 tgg gac ccg cca gtg ctg gcg gag agg aac ggg cgc atc atc agc tac 3193 Trp Asp Pro Pro Val Leu Ala Glu Arg Asn Gly Arg Ile Ile Ser Tyr 910 915 920 925 acc gtg gtg ttc cga gac atc aac agc caa cag gag ctg cag aac atc 3241 Thr Val Val Phe Arg Asp Ile Asn Ser Gln Gln Glu Leu Gln Asn Ile 930 935 940 acg aca gac acc cgc ttt acc ctt act ggc ctc aag cca gac acc act 3289 Thr Thr Asp Thr Arg Phe Thr Leu Thr Gly Leu Lys Pro Asp Thr Thr 945 950 955 tac gac atc aag gtc cgc gca tgg acc agc aaa ggc tct ggc cca ctc 3337 Tyr Asp Ile Lys Val Arg Ala Trp Thr Ser Lys Gly Ser Gly Pro Leu 960 965 970 agc ccc agc atc cag tcc cgg acc atg ccg gtg gag caa gtg ttt gcc 3385 Ser Pro Ser Ile Gln Ser Arg Thr Met Pro Val Glu Gln Val Phe Ala 975 980 985 aag aac ttc cgg gtg gcg gct gca atg aag acg tct gtg ctg ctc agc 3433 Lys Asn Phe Arg Val Ala Ala Ala Met Lys Thr Ser Val Leu Leu Ser 990 995 1000 1005 tgg gag gtt ccc gac tcc tat aag tca gct gtg ccc ttt aag att ctg 3481 Trp Glu Val Pro Asp Ser Tyr Lys Ser Ala Val Pro Phe Lys Ile Leu 1010 1015 1020 tac aat ggg cag agt gtg gag gtg gac ggg cac tcg atg cgg aag ctg 3529 Tyr Asn Gly Gln Ser Val Glu Val Asp Gly His Ser Met Arg Lys Leu 1025 1030 1035 atc gca gac ctg cag ccc aac aca gag tac tcg ttt gtg ctg atg aac 3577 Ile Ala Asp Leu Gln Pro Asn Thr Glu Tyr Ser Phe Val Leu Met Asn 1040 1045 1050 cgt ggc agc agc gca ggg ggc ctg cag cac ctg gtg tcc atc cgc aca 3625 Arg Gly Ser Ser Ala Gly Gly Leu Gln His Leu Val Ser Ile Arg Thr 1055 1060 1065 gcc ccc gac ctc ctg cct cac aag ccg ctg cct gcc tct gcc tac ata 3673 Ala Pro Asp Leu Leu Pro His Lys Pro Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ile 1070 1075 1080 1085 gag gac ggc cgc ttc gat ctc tcc atg ccc cat gtg caa gac ccc tcg 3721 Glu Asp Gly Arg Phe Asp Leu Ser Met Pro His Val Gln Asp Pro Ser 1090 1095 1100 ctt gtc agg tgg ttc tac att gtt gtg gta ccc att gac cgt gtg ggc 3769 Leu Val Arg Trp Phe Tyr Ile Val Val Val Pro Ile Asp Arg Val Gly 1105 1110 1115 ggg agc atg ctg acg cca agg tgg agc aca ccc gag gaa ctg gag ctg 3817 Gly Ser Met Leu Thr Pro Arg Trp Ser Thr Pro Glu Glu Leu Glu Leu 1120 1125 1130 gac gag ctt cta gaa gcc atc gag caa ggc gga gag gag cag cgg cgg 3865 Asp Glu Leu Leu Glu Ala Ile Glu Gln Gly Gly Glu Glu Gln Arg Arg 1135 1140 1145 cgg cgg cgg cag gca gaa cgt ctg aag cca tat gtg gct gct caa ctg 3913 Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Leu Lys Pro Tyr Val Ala Ala Gln Leu 1150 1155 1160 1165 gat gtg ctc ccg gag acc ttt acc ttg ggg gac aag aag aac tac cgg 3961 Asp Val Leu Pro Glu Thr Phe Thr Leu Gly Asp Lys Lys Asn Tyr Arg 1170 1175 1180 ggc ttc tac aac cgg ccc ctg tct ccg gac ttg agc tac cag tgc ttt 4009 Gly Phe Tyr Asn Arg Pro Leu Ser Pro Asp Leu Ser Tyr Gln Cys Phe 1185 1190 1195 gtg ctt gcc tcc ttg aag gaa ccc atg gac cag aag cgc tat gcc tcc 4057 Val Leu Ala Ser Leu Lys Glu Pro Met Asp Gln Lys Arg Tyr Ala Ser 1200 1205 1210 agc ccc tac tcg gat gag atc gtg gtc cag gtg aca cca gcc cag cag 4105 Ser Pro Tyr Ser Asp Glu Ile Val Val Gln Val Thr Pro Ala Gln Gln 1215 1220 1225 cag gag gag ccg gag atg ctg tgg gtg acg ggt ccc gtg ctg gca gtc 4153 Gln Glu Glu Pro Glu Met Leu Trp Val Thr Gly Pro Val Leu Ala Val 1230 1235 1240 1245 atc ctc atc atc ctc att gtc atc gcc atc ctc ttg ttc aaa agg aaa 4201 Ile Leu Ile Ile Leu Ile Val Ile Ala Ile Leu Leu Phe Lys Arg Lys 1250 1255 1260 agg acc cac tct ccg tcc tct aag gat gag cag tcg atc gga ctg aag 4249 Arg Thr His Ser Pro Ser Ser Lys Asp Glu Gln Ser Ile Gly Leu Lys 1265 1270 1275 gac tcc ttg ctg gcc cac tcc tct gac cct gtg gag atg cgg agg ctc 4297 Asp Ser Leu Leu Ala His Ser Ser Asp Pro Val Glu Met Arg Arg Leu 1280 1285 1290 aac tac cag acc cca ggt atg cga gac cac cca ccc atc ccc atc acc 4345 Asn Tyr Gln Thr Pro Gly Met Arg Asp His Pro Pro Ile Pro Ile Thr 1295 1300 1305 gac ctg gcg gac aac atc gag cgc ctc aaa gcc aac gat ggc ctc aag 4393 Asp Leu Ala Asp Asn Ile Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Gly Leu Lys 1310 1315 1320 1325 ttc tcc cag gag tat gag tcc atc gac cct gga cag cag ttc acg tgg 4441 Phe Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile Asp Pro Gly Gln Gln Phe Thr Trp 1330 1335 1340 gag aat tca aac ctg gag gtg aac aag ccc aag aac cgc tat gcg aat 4489 Glu Asn Ser Asn Leu Glu Val Asn Lys Pro Lys Asn Arg Tyr Ala Asn 1345 1350 1355 gtc atc gcc tac gac cac tct cga gtc atc ctt acc tct atc gat ggc 4537 Val Ile Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Ile Leu Thr Ser Ile Asp Gly 1360 1365 1370 gtc ccc ggg agt gac tac atc aat gcc aac tac atc gat ggc tac cgc 4585 Val Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr Arg 1375 1380 1385 aag cag aat gcc tac atc gcc acg cag ggc ccc ctg ccc gag acc atg 4633 Lys Gln Asn Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Glu Thr Met 1390 1395 1400 1405 ggc gat ttc tgg aga atg gtg tgg gaa cag cgc acg gcc act gtg gtc 4681 Gly Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Val Val 1410 1415 1420 atg atg aca cgg ctg gag gag aag tcc cgg gta aaa tgt gat cag tac 4729 Met Met Thr Arg Leu Glu Glu Lys Ser Arg Val Lys Cys Asp Gln Tyr 1425 1430 1435 tgg cca gcc cgt ggc acc gag acc tgt ggc ctt att cag gtg acc ctg 4777 Trp Pro Ala Arg Gly Thr Glu Thr Cys Gly Leu Ile Gln Val Thr Leu 1440 1445 1450 ttg gac aca gtg gag ctg gcc aca tac act gtg cgc acc ttc gca ctc 4825 Leu Asp Thr Val Glu Leu Ala Thr Tyr Thr Val Arg Thr Phe Ala Leu 1455 1460 1465 cac aag agt ggc tcc agt gag aag cgt gag ctg cgt cag ttt cag ttc 4873 His Lys Ser Gly Ser Ser Glu Lys Arg Glu Leu Arg Gln Phe Gln Phe 1470 1475 1480 1485 atg gcc tgg cca gac cat gga gtt cct gag tac cca act ccc atc ctg 4921 Met Ala Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Tyr Pro Thr Pro Ile Leu 1490 1495 1500 gcc ttc cta cga cgg gtc aag gcc tgc aac ccc cta gac gca ggg ccc 4969 Ala Phe Leu Arg Arg Val Lys Ala Cys Asn Pro Leu Asp Ala Gly Pro 1505 1510 1515 atg gtg gtg cac tgc agc gcg ggc gtg ggc cgc acc ggc tgc ttc atc 5017 Met Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile 1520 1525 1530 gtg att gat gcc atg ttg gag cgg atg aag cac gag aag acg gtg gac 5065 Val Ile Asp Ala Met Leu Glu Arg Met Lys His Glu Lys Thr Val Asp 1535 1540 1545 atc tat ggc cac gtg acc tgc atg cga tca cag agg aac tac atg gtg 5113 Ile Tyr Gly His Val Thr Cys Met Arg Ser Gln Arg Asn Tyr Met Val 1550 1555 1560 1565 cag acg gag gac cag tac gtg ttc atc cat gag gcg ctg ctg gag gct 5161 Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Ile His Glu Ala Leu Leu Glu Ala 1570 1575 1580 gcc acg tgc ggc cac aca gag gtg cct gcc cgc aac ctg tat gcc cac 5209 Ala Thr Cys Gly His Thr Glu Val Pro Ala Arg Asn Leu Tyr Ala His 1585 1590 1595 atc cag aag ctg ggc caa gtg cct cca ggg gag agt gtg acc gcc atg 5257 Ile Gln Lys Leu Gly Gln Val Pro Pro Gly Glu Ser Val Thr Ala Met 1600 1605 1610 gag ctc gag ttc aag ttg ctg gcc agc tcc aag gcc cac acg tcc cgc 5305 Glu Leu Glu Phe Lys Leu Leu Ala Ser Ser Lys Ala His Thr Ser Arg 1615 1620 1625 ttc atc agc gcc aac ctg ccc tgc aac aag ttc aag aac cgg ctg gtg 5353 Phe Ile Ser Ala Asn Leu Pro Cys Asn Lys Phe Lys Asn Arg Leu Val 1630 1635 1640 1645 aac atc atg ccc tac gaa ttg acc cgt gtg tgt ctg cag ccc atc cgt 5401 Asn Ile Met Pro Tyr Glu Leu Thr Arg Val Cys Leu Gln Pro Ile Arg 1650 1655 1660 ggt gtg gag ggc tct gac tac atc aat gcc agc ttc ctg gat ggt tat 5449 Gly Val Glu Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Leu Asp Gly Tyr 1665 1670 1675 aga cag cag aag gcc tac ata gct aca cag ggg cct ctg gca gag agc 5497 Arg Gln Gln Lys Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ala Glu Ser 1680 1685 1690 acc gag gac ttc tgg cgc atg cta tgg gag cac aat tcc acc atc atc 5545 Thr Glu Asp Phe Trp Arg Met Leu Trp Glu His Asn Ser Thr Ile Ile 1695 1700 1705 gtc atg ctg acc aag ctt cgg gag atg ggc agg gag aaa tgc cac cag 5593 Val Met Leu Thr Lys Leu Arg Glu Met Gly Arg Glu Lys Cys His Gln 1710 1715 1720 1725 tac tgg cca gca gag cgc tct gct cgc tac cag tac ttt gtt gtt gac 5641 Tyr Trp Pro Ala Glu Arg Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Phe Val Val Asp 1730 1735 1740 ccg atg gct gag tac aac atg ccc cag tat atc ctg cgt gag ttc aag 5689 Pro Met Ala Glu Tyr Asn Met Pro Gln Tyr Ile Leu Arg Glu Phe Lys 1745 1750 1755 gtc acg gat gcc cgg gat ggg cag tca agg aca atc cgg cag ttc cag 5737 Val Thr Asp Ala Arg Asp Gly Gln Ser Arg Thr Ile Arg Gln Phe Gln 1760 1765 1770 ttc aca gac tgg cca gag cag ggc gtg ccc aag aca ggc gag gga ttc 5785 Phe Thr Asp Trp Pro Glu Gln Gly Val Pro Lys Thr Gly Glu Gly Phe 1775 1780 1785 att gac ttc atc ggg cag gtg cat aag acc aag gag cag ttt gga cag 5833 Ile Asp Phe Ile Gly Gln Val His Lys Thr Lys Glu Gln Phe Gly Gln 1790 1795 1800 1805 gat ggg cct atc acg gtg cac tgc agt gct ggc gtg ggc cgc acc ggg 5881 Asp Gly Pro Ile Thr Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly 1810 1815 1820 gtg ttc atc act ctg agc atc gtc ctg gag cgc atg cgc tat gag ggc 5929 Val Phe Ile Thr Leu Ser Ile Val Leu Glu Arg Met Arg Tyr Glu Gly 1825 1830 1835 gtg gtc gac atg ttt cag acc gtg aag acc ctg cgt aca cag cgt cct 5977 Val Val Asp Met Phe Gln Thr Val Lys Thr Leu Arg Thr Gln Arg Pro 1840 1845 1850 gcc atg gtg cag aca gag gac cag tat cag ctg tgc tac cgt gcg gcc 6025 Ala Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Gln Leu Cys Tyr Arg Ala Ala 1855 1860 1865 ctg gag tac ctc ggc agc ttt gac cac tat gca acg taactaccgc 6071 Leu Glu Tyr Leu Gly Ser Phe Asp His Tyr Ala Thr 1881 1870 1875 1880 tcccctctcc tccgccaccc ccgccgtggg gctccggagg ggacccagct cctctgagcc 6131 ataccgacca tcgtccagcc ctcctacgca gatgctgtca ctggcagagc acagcccacg 6191 gggatcacag cgtttcagga acgttgccac accaatcaga gagcctagaa catccctggg 6251 caagtggatg gcccagcagg caggcactgt ggcccttctg tccaccagac ccacctggag 6311 cccgcttcaa gctctctgtt gcgctcccgc atttctcatg cttcttctca tggggtgggg 6371 ttggggcaaa gcctcctttt taatacatta agtggggtag actgagggat tttagcctct 6431 tccctctgat ttttcctttc gcgaatccgt atctgcagaa tgggccactg taggggttgg 6491 ggtttatttt gttttgtttt tttttttttt ttgtatgact tctgctgaag gacagaacat 6551 tgccttcctc gtgcagagct ggggctgcca gcctgagcgg aggctcggcc gtgggccggg 6611 aggcagtgct gatccggctg ctcctccagc ccttcagacg agatcctgtt tcagctaaat 6671 gcagggaaac tcaatgtttt tttaagtttt gttttccctt taaagccttt ttttaggcca 6731 cattgacagt ggtgggcggg gagaagatag ggaacactca tccctggtcg tctatcccag 6791 tgtgtgttta acattcacag cccagaacca cagatgtgtc tgggagagcc tggcaaggca 6851 ttcctcatca ccatcgtgtt tgcaaaggtt aaaacaaaaa caaaaaacca caaaaataaa 6911 aaacaaaaaa aacaaaaaac ccaaaaaaaa aaaaaaaaag agtcagccct tggcttctgc 6971 ttcaaaccct caagagggga agcaactccg tgtgcctggg gttcccgagg gagctgctgg 7031 ctgacctggg cccacagagc ctggctttgg tccccagcat tgcagtatgg tgtggtgttt 7091 gtaggctgtg gggtctggct gtgtggccaa ggtgaatagc acaggttagg gtgtgtgcca 7151 caccccatgc acctcagggc caagcggggg cgtggctggc ctttcaggtc caggccagtg 7211 ggcctggtag cacatgtctg tcctcagagc aggggccaga tgattttcct ccctggtttg 7271 cagctgtttt caaagccccc gataatcgct cttttccact ccaagatgcc ctcataaacc 7331 aatgtggcaa gactactgga cttctatcaa tggtactcta atcagtcctt attatcccag 7391 cttgctgagg ggcagggaga gcgcctcttc ctctgggcag cgctatctag ataggtaagt 7451 gggggcgggg aagggtgcat agctgtttta gctgagggac gtggtgccga cgtccccaaa 7511 cctagctagg ctaagtcaag atcaacattc cagggttggt aatgttggat gatgaaacat 7571 tcatttttac cttgtggatg ctagtgctgt agagttcact gttgtacaca gtctgttttc 7631 tatttgttaa gaaaaactac agcatcattg cataattctt gatggtaata aatttgaata 7691 atcagatttc t 7702

Claims

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수탁번호 FERM BP-6343을 부여받은 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체로서, LAR(백혈구 공통항원 유사 분자 : Leukocyte Common Antigen-Related Moleucle) 포스파타제 서브유닛의 세포내 도메인에 대해 특이적으로 결합하고, CD45에 대해서는 특이적으로 결합하지 않는 모노클로날 항체.
제 3항에 있어서, 상기 세포내 도메인이 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 4193∼6061 부위에서 연속하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
수탁번호 FERM BP-6343을 부여받은 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체로서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 제6~1826 부위에서 연속하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드 단편에 대하여 특이적으로 결합하고, CD45에 대해서는 특이적으로 결합하지 않는 모노클로날 항체.
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제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, SDS-PAGE에 의해 결정되는 추정분자량이 150kDa인 것임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
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수탁번호 FERM BP-6343가 부여된 하이브리도마 세포주.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 면역원이 LAR 포스파타제 도메인을 포함하는 융합 단백질임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 면역원이 GST(Glutathione-S-Transferase)와 LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule)의 포스파타제 도메인에서 기인하는 GST-LAR 포스파타아제 융합단백질임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
제 16항에 있어서, 상기 융합 단백질은

GST(Glutathione-S-Transferase)를 코딩하는 유전자 영역 및 LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule) 포스파타제 도메인을 코딩하는 유전자 영역 양쪽을 포함하는 발현벡터를 제조하는 공정;

상기 발현벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 대장균을 20∼30℃에서 16∼24시간 배양하는 공정; 및

그 배양액, 세균 또는 이의 조합물로부터 GST-LAR 포스파타제 도메인 융합 단백질을 단리시키는 공정;

을 포함하는 공정을 거쳐 제조된 것임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
제 17항에 있어서, 상기 융합 단백질을 글루타치온을 담지시킨 지지체에서 도데실 황산 나트륨의 존재하에 가열하여 용출시키는 정제공정을 더 포함하는 공정을 거쳐 제조된 것임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 GST-LAR 포스파타제 도메인 융합 단백질을 사용하는 스크리닝 과정을 더 포함하는 공정을 거쳐 제조된 것임을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule) 또는 LAR 유래 분자의 정량방법에 있어서,

제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 검체에 작용시키고, 그 검체에 포함된 LAR 단백질 또는 LAR 세포내 도메인의 일부를 함유하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 단편을 정량하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
제 20항에 있어서, 상기 항체가 면역블럿팅(immunoblotting), 면역침전법(immunoprecipitation) 및 ELISA 중 어느 하나의 방법에 의해 정량되는 것임을 특징으로 하는 정량 방법.
LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule) 또는 LAR 유래 분자의 활성을 정량하는 방법에 있어서,

제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 검체에 작용시켜 그 검체에 포함되는 LAR 단백질 또는 LAR 세포내 도메인의 일부를 함유하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 단편을 단리시키는 공정; 및

단리된 단백질, 단편 또는 폴리펩티드 활성을 측정하는 공정;

을 포함하는 정량 방법.
제 22항에 있어서, 상기 모노클로날 항체를 담지시킨 지지체를 사용하여 친화 크로마토그래피 또는 면역침전법에 의해 단리시키는 공정이 이루어지는 것임을 특징으로 하는 정량 방법.
LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule)의 단백질 또는 LAR 세포내 도메인의 일부를 함유하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드 단편을 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 사용하여 단리하는 공정을 포함하는 LAR 또는 LAR 유래 분자의 정제 방법.
제 24항에 있어서, 상기 모노클로날 항체를 담지시킨 지지체를 사용하여 친화 크로마토그래피 또는 면역침전법에 의해 단리가 이루어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
사람 이외의 동물 생체 조직내에서 LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule) 또는 LAR 유래 분자를 검출하는 방법에 있어서,

상기 생체조직에 제 3항 내지 제 5항 중의 어느 한 항의 모노클로날 항체를 작용시켜 면역조직학적 검사를 실시하는 공정; 및

상기 생체조직내에 함유되는 LAR 단백질 또는 LAR의 세포내 도메인의 일부를 함유하는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드 단편을 검출하는 공정;

을 포함하는 검출방법.
수탁번호 FERM BP-6343을 부여받은 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체로서, 갑상선 암세포에 대해 특이적 면역반응성을 갖는 항 LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule) 모노클로날 항체.
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사람 이외의 동물 갑상선 조직내에서 갑상선암을 검출하는 방법에 있어서,

갑상선암에 걸린 것으로 추정되는 사람이외의 동물에서 갑상선 조직을 채취하는 공정;

제 27항에 기재된 모노클로날 항체를 상기 갑상선 조직에 작용시키는 공정; 및

상기 모노클로날 항체와 갑상선 조직간에 면역반응성 유무를 평가하는 공정;

을 포함하는 검출방법.
제 29항에 있어서, 상기 갑상선 조직이 미세침흡인 세포조직학적 진단법(fine needle aspiration)에 의해 채취된 조직이고, 상기 면역반응성이 면역검정(immunoassay)에 의해 평가되는 것임을 특징으로 하는 검출방법.
제 29항에 있어서, 상기 갑상선 조직이 갑상선 조직단편이고, 상기 면역반응성이 조직 염색에 의해 평가되는 것임을 특징으로 하는 검출방법.
제 27항의 모노클로날 항체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 갑상선암의 조직 진단용 조성물.
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LAR(Leukocyte Common Antigen-Related Molecule)의 mRNA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 제4193~6061 부위에 연속하는 뉴클레오티드 또는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 제6~1826 부위에 연속하는 뉴클레오티드로 이루어진 프로브.
제 39항에 의한 프로브를 사용하여 인간 이외의 동물에서 갑상선암을 진단하는 방법.
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