JP4469084B2 - プロテインチロシンホスファターゼの細胞内ドメインに対する抗体 - Google Patents

Description

〔技術分野〕
本発明は、２種以上のプロテインチロシンホスファターゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、以下、ＰＴＰと称する）の中の細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体およびその調製方法に関する。さらに詳細には、ＰＴＰ（例えば、ＬＡＲ（白血球共通抗原類似分子）およびＣＤ４５）における細胞内ドメインに対して特異的であって、ＰＴＰの解析および定量、新規ＰＴＰの同定、検出および単離精製、ならびにインスリン抵抗性に関わる症状の治療、予防、緩和等のための処置や診断に適用可能な医薬の開発などに有用な抗体に関する。
〔背景技術〕
近年、動脈硬化発症メカニズムが徐々に明らかにされ、その危険因子が同定されつつある。特に高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病および喫煙が動脈硬化の４大危険因子と認定され、その治療が積極的に行われている。これらの病態として臨床的に共通しているのが、インスリン抵抗性である。インスリン抵抗性とは細胞におけるインスリン感受性の低下とほぼ同義語であり、細胞での糖の取り込みにおけるインスリン作用が低下していることを指す。その原因としてはインスリン分泌自体の異常、標的細胞におけるインスリン受容体の異常、細胞内情報伝達系の異常および血行力学的に末梢循環障害に基づく糖の組織への供給減等がある。Ｒｅａｖｅｎは１９８８年、このインスリン抵抗性を基盤として多くの病態が引き起こされることを報告し、また、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高インスリン血症、高トリグリセライド血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高血圧をマルチプルに持つ病態をシンドロームＸと名付け、動脈硬化発症に深く関わっていることを提唱した（Ｒｅａｖｅｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７，１５９５−１６０７，１９８８）。
また、一般的に、インスリン抵抗性により細胞への糖の供給は低下し、膵臓におけるインスリン分泌を亢進させ、高インスリン血症を引き起こすことが知られており、臨床の場においてもインスリン抵抗性の問題が種々浮上している。例えば、インスリン抵抗性・高インスリン血症が糖尿病性腎症を促進し（Ｎｉｓｋａｎｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４１，７３６−７４１，１９９３）、糖尿病性網膜症の頻度が高くなる（Ｙｉｐ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．；Ｌａｎｃｏｔ，３４１，３６９−３７０，１９９３）という報告がある。さらに、インスリン抵抗性によってプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）の活性が上昇し、血液線溶系機能を低下させたり（Ｐｏｔｔｅｒ ｖａｎ Ｌｏｏｎ ＢＪ ｅｔ ａｌ．；Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．，４２，９４５−９５４，１９９３）、粥状動脈硬化の引き金になる（Ｓａｔｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．；Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３８，９１−９６，１９８９）という文献等も報告されている。
糖尿病は有病率が全人口の５％を占め、日本人の約６００万人が罹患している。糖尿病にはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）がある。ＩＤＤＭは糖尿病全体に対して約７％、ＮＩＤＤＭは約９０％といわれ、特に、糖尿病の大多数を占めるＮＩＤＤＭの発症は、インスリン抵抗性が重要な成因と考えられている。
現在までに、インスリンのシグナル伝達には細胞内蛋白質のチロシンリン酸化が重要な役割を演じていることが明らかとされている。インスリンレセプターは分子量約１３５ｋＤａのαサブユニットと９５ｋＤａのβサブユニットの２つの糖タンパクサブユニットがジスルフィド結合によりヘテロテトラマーを形成し、α２β２構造をとる。αサブユニットはインスリン結合活性を有し、βサブユニットは自己リン酸化により活性化するプロテインチロシンキナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ：ＰＴＫ）ドメインを有する。すなわち、インスリンがインスリンレセプターのα鎖に結合すると、インスリンレセプターβ鎖に存在するいくつかの特定のチロシン残基がレセプターのチロシンキナーゼ活性により自己リン酸化される。インスリンレセプターチロシンキナーゼは自己チロシンリン酸化によってそのチロシンキナーゼ活性がさらに上昇する。このようにして活性化されたインスリンレセプターチロシンキナーゼは、細胞内に存在するその基質であるＩＲＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）をチロシンリン酸化し、このチロシンリン酸化ＩＲＳ−１をＡｓｈ／Ｇｒｂ２やＰＩ−３キナーゼが認識して結合することによりシグナルが伝達され、最終的にグルコースの取り込み、糖代謝や細胞増殖といったインスリンによる生物活性が発現することが明らかとされている（第９図参照、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂ．ｊ．ｅｔ ａｌ．；Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，３，１−１５，１９９３，Ｋａｎａｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９５（２），７６２−７６８，１９９３）。しかし、このインスリンのシグナル伝達において、活性化されたインスリンレセプターを不活化する酵素、すなわちチロシン脱リン酸化酵素であるＰＴＰの研究はほとんど進展していない。
また、やはりチロシンリン酸化により巧みに制御されている、リンパ球の活性化、増殖、分化、細胞死など免疫系の基礎となる機構もその例外でない。これまでＰＴＫからみたリンパ球のシグナル伝達の研究が主流であったが、最近ＰＴＰからの解析も進み、両面から検討することの重要性が明らかとなってきた。
ＰＴＰに関する研究が本格的に始まったのは、１９８８年にＦｉｓｃｈｅｒのグループによりヒト胎盤由来細胞質型のＰＴＰであるＰＴＰ１Ｂの遺伝子がクローニングされ、そのヌクレオチド配列が解明されてからである（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，６７２２−６７３０，１９８８，Ｃｈａｒｂｏｎｎｃａｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７１８２−７１８６，１９８８）。その結果、ＰＴＰ１Ｂと相同性を示したのは既知のセリン／スレオニンホスファターゼではなく、造血系の膜貫通分子であるＣＤ４５の細胞質内領域の２カ所であった。さらに、ＣＤ４５がＰＴＰ活性を有していることも明らかにされた（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，８６９５−８７０１，１９８８，Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７１８２−７１８６，１９８８）。
ヒトではＰＴＰ遺伝子は５００個に及ぶと推定されており、現在までに８０種以上のＰＴＰがｃＤＮＡ配列の相同性に基づいてクローニングされ、今なお次々と新しいＰＴＰが報告されている（Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８，１５２３−１５３０，１９８８，Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．；ＦＭＢＯ Ｊ．，９，３２４１−３２５２，１９９０，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９５，４６−５６，１９９１）。このように、スーパーファミリーを形成しているＰＴＰは大きく３つのファミリーに分類される。すなわち、ＰＴＰ．ＤＳ−ＰＴＰ（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ＰＴＰ：二重特異性ＰＴＰ）およびＬＭＷ−ＰＴＰ（ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ−ＰＴＰ：低分子量ＰＴＰ）の３群である。それぞれのファミリー間の１次構造の相同性はそれほど高くなく、特にＰＴＰとＬＭＷ−ＰＴＰとは酵素活性中心以外は相同性は示さないが、クリスタログラフィーによる研究より、これらのファミリーに属する分子の３次構造は驚くほどの共通性を示すことが明らかにされた（Ｆａｕｍａｎ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２１，４１３−４１７，１９９６）。更に、ＰＴＰは、（１）細胞膜貫通部分を持つ受容体型（あるいは膜型）ＰＴＰ（ＬＣＡ（白血球共通抗原（Ｌｅｕｋｏ−ｃｙｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ））すなわちＣＤ４５、ＬＡＲならびにＰＴＰα、β、γ、δ、ε、σ、μ、κ、η、ζ等）と、（２）細胞膜貫通部分を持たない細胞質型ＰＴＰ（ＰＴＰ１Ｂ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−ＭＥＧ、ＰＴＰＨ１、ＳＴＥＰ、ＰＴＰ１Ｃ、ＦＡＰ１、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＰＥＰ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ等）とに大別される。
受容体型ＰＴＰの多くは、細胞内に２つのＰＴＰ相同部分（ドメイン１およびドメイン２、第１図（ａ）および（ｂ）参照）を持っている。現在までに報告されている全てのＰＴＰには、Ｉｌｅ／Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号：２）というシステインを含む配列（ｓｉｇｎａｔｕ−ｒｅ ｍｏｔｉｆ）がホスファターゼドメイン内に保存されている。ＰＴＰ１Ｂのクリスタログラフィーによる研究から、この部位はＰＴＰ分子表面の小さな窪みを形成しており、システインは窪みの底に位置しリン酸との結合に直接関与していることが明らかにされた（Ｂａｒｆｏｒｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，１３９７−１４０４，１９９４）。また、ＰＴＰ１Ｂの酵素活性の中心の窪みにはセリンやスレオニンに結合しているリン酸は到達できないことから、窪みの深さがＰＴＰとセリン／スレオニンホスファターゼの特異性を決定していることも示された。さらに、前記ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｍｏｔｉｆの酵素活性発現における重要性は、変異実験から明らかにされている（Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，；ＥＭＢＯ Ｊ．，９，２３９９−２４０７，１９９０）。これらのことから、ドメイン１の保存されたＣｙｓが酵素活性発現に重要であり、またドメイン２は酵素の基質特異性を決めていると考えられている。
受容体型ＰＴＰは細胞内に２個または１個の酵素領域をもち、細胞外ドメインの特徴により、いくつかのグループに分けられる。細胞外にフィブロネクチンタイプＩＩＩ型ドメインを１個有し、高度に糖鎖修飾されたＣＤ４５、Ｉｇ様ドメインとフィブロネクチンタイプＩＩＩ型ドメインを有するＬＡＲ、ＰＴＰδ、ＰＴＰσ、Ｎ末端にＭＡＭ（ｍｅｐｒｉｎ、Ａ５抗原、ＰＴＰμ）ドメインを有するＰＴＰμ、ＰＴＰκ、Ｎ末端に炭酸脱水酵素ドメインを有するＰＴＰγ、ＰＴＰζ、細胞外ドメインの短いＰＴＰα、ＰＴＰεがあり、以上のＰＴＰはいずれも２個の酵素領域を持つ。一方、酵素領域が１個のものはいずれも細胞外ドメインがフィブロネクチンタイプＩＩＩ型ドメインのみで構成され、ＰＴＰβ、ＣＤ１４８（ＰＴＰη、ＤＥＰ−１等）がある。
細胞質型ＰＴＰは原則として酵素領域を１個有し、非酵素領域の特徴によりいくつかのグループに分けられている。ＳＨ２領城、ＰＥＳＴ領域、ｂａｎｄ４．１領域を有するものがある。ＤＳ−ＰＴＰはチロシンのみならず、セリンあるいはスレオニン残基を脱リン酸化する酵素で、Ｃｄｃ２５、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ、ＶＨ−１等がある。ＬＭＷ−ＰＴＰは酵素領域のみから構成されており、分子量は約１８ｋＤａと報告されている。
ＰＴＰ酵素群のうち、ヒト由来のＬＡＲは、受容体型ＰＴＰであるＣＤ４５のホスファターゼドメインをプローブとしてヒト胎盤ゲノムライブラリーによりクローニングされた、受容体型ＰＴＰである（Ｓｔｒｅｕｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８，１５５３−１５６２，１９８８）。ＣＤ４５が血球系の細胞に特異的に発現しているのに対して、ＬＡＲは血球系以外の細胞、特に肝臓や骨格筋などのインスリン感受性組織に発現している（Ｃｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｂ．Ｊ．；Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，３，１−１５，１９９３）。多くの受容体型ＰＴＰの中でＬＡＲはその細胞外ドメインが細胞接着分子と類似しているため、特に興味深い。その全構造は、Ｉｇ様ドメインとフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインよりなる１５０ｋＤａの細胞外ドメインＥ−サブユニットと、膜貫通領域を持ち２つのホスファターゼドメインよりなる８５ｋＤａの細胞内ドメインであるＰ−サブユニット（ホスファターゼサブユニット、配列番号：１に示される）が細胞膜のすぐ外側で非共有結合していることが明らかとなっている（第１図参照）（Ｓｔｒｅｕｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．；ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，８９７−９０７，１９９２）。また、ＬＡＲはＰＴＰδやＰＴＰσとともにサブファミリーを構成し、接着斑（インテグリンによる細胞外基質との接合部の周辺部分やａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ（カドヘリンによる細胞同士の接着部位）に存在する（Ｓｅｒｒａ−Ｐａｇｅｓ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．；ＥＭＢＯ Ｊ．，１４，２８２７−２８３８，１９９５、Ｐｕｌｉｄｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１１６８６−１１６９０，１９９５、Ｋｙｐｔａ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４，１５１９−１５３０，１９９６、Ａｉｃｈｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ，；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３８，６８１−６９６，１９９７）。
現在までにＬＡＲの機能的な役割が数多く報告されている。例えば、ＬＡＲが欠損した神経細胞ではニューロトロフィンへの反応性が減少すること（Ｙａｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．；２７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，ＵＳＡ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５−３０，１９９７，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２３，１−２，１９９７）、ショウジョウバエのＬＡＲホモログは、主に神経系で発現し、その欠損は運動神経の軸索が神経束から分離するタイミングを遅らせること（Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ，８４，６１１−６２２，１９９６）、ＬＡＲ酵素ドメインの遺伝子破壊では乳腺発育の不良が認められること（Ｓｃｈａａｐｖｅｌｄ，Ｒ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．；Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１８８，１３４−１４６，１９９７）、ＬＡＲ活性の抑制によりアポリポプロテインＢの分泌が減少すること（Ｐｈｕｎｇ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２３７（２），３６７−３７１，１９９７）、また、ＬＡＲの発現が欠損することにより前脳基底部のコリン作動性神経細胞のサイズが小さくなり、海馬歯状回でのコリン作動性神経支配が減少する（Ｙｅｏ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４７（３），３４８−３６０，１９９７）ことが報告されている。このように、ＬＡＲは生体内で様々な役割を担っていることが徐々に明らかになってきているが、現在最も注目が集められている研究として、ＬＡＲとインスリン受容体との関係がある（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（２０），１３８１１−１３８１４，１９９２）。
１９９５年、肥満者の脂肪組織においてＬＡＲのチロシンホスファターゼ活性が異常に上昇しており、これがインスリン抵抗性の発症原因として、また、心臓血管疾患の危険因子として考えられ、注目されるべきであるとの発表が行われた（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５（６），２８０６−２８１２，１９９５）。以後、ＬＡＲがインスリン受容体と密接に関与しているという報告が次々になされている（Ｍｏｏｎｅｙ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２３５（３），７０９−７１２，１９９７，Ｏｒｒ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２５（３），４５２Ｓ，１９９７，Ａｈｍａｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１００（２），４４９−４５８，１９９７，Ａｈｍａｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１），４４８−４５７，１９９７，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．；Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１５（３），２４３−２４８，１９９７，Ｌｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，８（７），４６７−４７３，１９９６）。そして、これらの情報に基づき、最近Ａｈｍａｄ，Ｆ．らのグループはＬＡＲおよびＰＴＰ１Ｂがインスリン抵抗性の治療ターゲットとなり得るかもしれないと報告している（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．；Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ，４６（１０），１１４０−１１４５，１９９７）。
次に、ＰＴＰのうちＣＤ４５は、白血球共通抗原（ＬＣＡ）とも呼ばれ、成熟赤血球や血小板を除くすべての血液細胞（白血球）およびその前駆細胞において発現される細胞表面抗原である。ＣＤ４５は分子量１８０〜２２０ｋＤａの受容体型ＰＴＰであり、細胞内に２つの酵素領域を持ち、細胞外領域のＮ末端に近い３〜４個のエクソンのオルターナティブスプライシングにより、８〜９種類のアイソフォームが存在する（Ｓａｇａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，５３６４−５３６８，１９８７，Ｔｈｍａｓ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，５３６０−５３６３，１９８７，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，８５−１１６，１９９４）。スプライシングを受けるこれらのエクソンでコードされるアミノ酸配列は、セリン、スレオニンおよびプロリンに富み、αヘリックスやβ構造によるまとまった立体構造はとりにくく、また、Ｏ−グリコシレーションを受ける部位を多数含んでいる（Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．；ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１２５９−１２６７，１９８７）。従って、アイソフォームの変化により、細胞外領域の構造が大きく変わり得るという特徴をもっている。また、ＣＤ４５の発現はリンパ球で高く、細胞種や細胞の活性化状態によって固有のアイソマーが可逆的に発現される（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，３３９−３６９，１９８９，Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，４０２−４９３，１９９２，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，８５−１１６，１９９４）。また、オルターナティブな構造と膜貫通部位に挟まれた領域の配列はシステインを多く含み、ジスルフィド結合によって安定化された構造を形成している（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ，４１，８３−９３，１９８５，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２３５１７−２３５２０，１９９１，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９５，４６−５６，１９９１）。
ＣＤ４５の発現が消失したＴ細胞変異株では、その細胞が本来有していた抗原特異的応答能が顕著に低下することが知られており、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介したＴ細胞の活性化と機能発現にＣＤ４５が極めて重要であることが示唆されている（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，３３９−３６９，１９８９，Ｐｉｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ，５８，１０５５−１０６５，１９８９，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，８５−１１６，１９９４，Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３４６，６６−６８，１９９０，Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２０３７−２０４１，１９９１，Ｗｅａｖｅｒ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１，４４１５−４４２２，１９９１）。また、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したＴ細胞のシグナル伝達機構において、ＣＤ４５はコ・レセプターであるＣＤ４、ＣＤ８の細胞内ドメインに結合しているＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）であるＬｃｋ（ｐ５６^ｌｃｋやＦｙｎ（ｐ５６^ｆｙｎＴ）の活性化に関与していることも示唆されている（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，８５−１１６，１９９４，Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３５，１８３−２１４，１９９３）。ＣＤ４５はＬｃｋやＦｙｎのＣ末端に位置する負の調節部位のチロシン残基を脱リン酸化し、その結果、ＬｃｋやＦｙｎが自己リン酸化して活性型となり、シグナルが伝達されると考えられている（Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｉｍｍｕｎｏ．Ｒｅｖ．，１３５，１８３−２１４，１９９３，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，３３４−３４０，１９９３，Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．Ｊｒ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，６４５−６７４，１９９２，Ｃａｈｉｒ，ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｅ．Ｄ．．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１４０２−１４０６，１９９３，Ｈｕｒｌｅｙ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３，１６５１−１６５６，１９９３，Ｓｉｅｂ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，３１５−３２１，１９９３，Ｗｅｉｓｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ，７６，２６３−２７４，１９９４，Ｃｈａｎ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，５５５−５９２，１９９４）。インスリン反応性ミエローマ細胞のうち、ＣＤ４５欠損株を用いた実験により、ＣＤ４５発現株と比較して、インスリン刺激によるインスリン受容体の自己リン酸化、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化、ＰＩ３キナーゼの活性化およびＭＡＰキナーゼの活性化がすべて３倍に増強したという報告（Ｋｕｌａｓ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７１，７５５−７６０，１９９６）より、ＣＤ４５はＬＡＲと同様インスリンの負の調節因子であると考えられる。さらに、ＣＤ４５欠損細胞の反応性は、ＣＤ４５の細胞内領域だけをもつ分子の発現により回復することが次の実験から明らかにされている。すなわち、ＣＤ４５の細胞内領域だけを細菌、またはバキュウロウィルスの系で発現させてもチロシンホスファターゼの酵素活性が充分に観察されること（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８９５９−８９６３，１９８９，Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８６９８−８７０２，１９８９）、また、ＣＤ４５陰性Ｔ細胞クローンにＣＤ４５の細胞内領域をトランスフェクトするだけで抗原レセプターを介するシグナルが回復すること（Ｖｏｌａｒｅｖｉｃ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，５４１−５４４，１９９３，Ｈｏｖｉｓ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，５４４−５４６，１９９３，Ｄｅｓａｉ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ，７３，５４１−５５４，１９９３）などである。
一方、Ｂ細胞においても、初期シグナルの伝達のみならず、最終的な増殖、またはアポトーシスに至る過程も、ＣＤ４５の発現によって調節されていることが、ＣＤ４５を発現していない形質細胞種（Ｊｕｓｔｅｍｅｎｔ，Ｌ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，１８３９−１８４２，１９９１）、または未熟Ｂ細胞株から樹立したＣＤ４５陰性クローンを用いた実験（Ｏｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，６４７−６５４，１９９４）から示された。これらの結果は、ＣＤ４５が抗原レセプターを介するシグナル伝達に不可欠な役割を担っている分子であることを示唆している。
現在までのＬＡＲおよびＣＤ４５等のＰＴＰに関する研究より、細胞内情報伝達系においてＰＴＰがＰＴＫと共役して極めて重要な役割を担っていることが明らかにされつつある。
１９９２年にＳｔｒｅｕｌｉらのグループによって、ＬＡＲのＥ−サブユニットとＰ−サブユニットの結合が非共有結合のため解離し、Ｅ−サブユニットが細胞膜表面から外れることが明らかにされた（Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，３，８９７−９０７，１９９２）。しかしながら、多くの研究者は、ＬＡＲの細胞外ドメインであるＥ−サブユニットに対するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を使用して様々な研究を行ってきたため、単独でもホスファターゼ活性を有するＰ−サブユニットは全く無視されていた。例えば、ＬＡＲのホスファターゼ活性測定を意図したＬＡＲ抗体の使用において、Ｐ−サブユニットに対する抗体を用いなければ全体としてのホスファターゼ活性が測定できない。また、ＬＡＲファミリーの細胞外ドメインにはｍＲＮＡのスプライシングの違いでいくつかのアイソフォームが存在しており（Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．；Ｃｅｌｌ，８４，６１１−６２２，１９９６、Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３，５５１３−５５２３，１９９３、Ｏｇａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３，４４７８−４４８７，１９９４）、細胞外ドメインに対する抗体を用いると、各々のアイソフォームに対し、特異性が異なってしまう。本発明者らは、これらの状況に鑑み、ＰＴＰの細胞内ドメインに対する抗体の作製に着手した。
また、従来ＣＤ４５抗体については、Ｔ２００またはＢ２２０などの異なる分子量を有するＣＤ４５アイソフォームのいずれにも反応性を示す抗体と、特定の限定されたアイソフォームにのみ反応性を示す抗体を区別し、後者をＣＤ４５Ｒ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）抗体として記述することが行われてきた（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．；Ｉｎ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）。しかし、ＣＤ４５の細胞外ドメインの構造の多様性が明らかにされるに伴い、ＣＤ４５Ｒ抗体の特異性を分類する必要が生じている。ＳｔｒｅｕｌｉらはｃＤＮＡのトランスフェクタントを用いる方法によって、既に知られているヒトＣＤ４５抗体の分類を行い、オルターナティブエキソン４、５、６に依存する構造を認識する抗体をそれぞれＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣと記述することを提唱した（Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１，３９１０−３９１４，１９８８）。同様の方法でＪｏｈｎｓｏｎらもマウスのＣＤ４５抗体の分類を報告した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１１７９−１１８４，１９８９）。
なお、既知のＰＴＰに対する抗体としては、ＣＤ４５の膜貫通（ＴＭ）領域からホスファターゼドメイン１の一部に至る１９６アミノ酸残基のペプチドを抗原として調製された抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）およびＰＴＰαのホスファターゼドメイン１（２６０アミノ酸残基）に対する抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）が知られている。しかしながら、これらの抗体がＬＡＲや、その他ＰＴＰのホスファターゼドメインに対して如何なる免疫特異性を有するか否かは不明である。
〔発明の開示〕
本発明は、２種以上のＰＴＰの細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体、特に少なくとも１種以上の受容体型ＰＴＰの細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体を提供することを目的とする。特に、本発明の抗体は、ＬＡＲおよび／またはＣＤ４５、好ましくはＬＡＲ及びＣＤ４５の双方の細胞内ドメインに対して特異性を有する抗体を提供するものである。かかる抗体は、特にＰＴＰのホスファターゼドメインに対して特異性を有するものが好ましい。
前記抗体は、配列番号：１で示される塩基配列によってコードされる、ＬＡＲのＰ−サブユニットに相当するポリペプチドまたはその断片を抗原として調製されるものが好ましく、また免疫特異性の点からモノクローナル抗体であるとよい。
そして、係る抗体は、プロテインチロシンホスファターゼドメインとその他のタンパク質またはポリペプチドとを含む融合タンパク質を免疫原として用いることによって調製することができる。係る融合タンパク質を構成するプロテインチロシンホスファターゼドメインとしてはＬＡＲホスファターゼドメインが好ましく、その他のタンパク質またはポリペプチドとして、特にＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）が好適であるが、他にも、ポリヒスチジン（好ましくは６個のヒスチジン）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、プロテインＡ等を用いてもよい。
尚、ポリヒスチジンを用いた場合、遺伝子組換え法にて発現させた融合タンパク質を単離精製するためには、ニッケルキレーティング樹脂への吸着を利用することができ、ｐＨ変動の他、ＥＤＴＡまたはイミダゾール物質を添加することによって当該樹脂から解離することができる。ＣＢＰを用いた場合、発現させた融合タンパク質はカルモジュリンアフィニティー樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、その後ＥＧＴＡを加えることにより当該樹脂から解離することができる。また、プロテインＡを用いた場合、発現させた融合タンパク質はＩｇＧセファロース（例えば、ＩｇＧセファロース６ＦＦ）カラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーを行い、その後ｐＨ変動によって当該樹脂から解離することができる。
さらに前記融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリペプチド断片の別の例として、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、ｃ⁻ｍｙｃ、Ｖ５およびＨＡ／ｃ⁻ｍｙｃ等を挙げることができ、これらをエピトープとして認識することができる抗体を用いて、目的とするＬＡＲホスファターゼドメインとの融合タンパク質を発現した後に抗原−抗体アフィニティーカラムにより単離・精製することができる。
前記した、好ましい免疫原であるＧＳＴとＬＡＲホスファターゼドメインとを含む融合タンパク質は、ＧＳＴをコードする遺伝子領域およびＬＡＲのホスファターゼドメインをコードする遺伝子領域を含む発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした大腸菌を、２０〜３０℃にて１６〜２４時間、特に好ましくは、２３〜２５℃にて１８時間培養し、その培養液および／または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適に製造することができる。さらにこうして得られた融合タンパク質は、グルタチオンを有する担体、例えば、グルタチオンセファロースビーズへのアフィニティーによって精製されたものであるとよく、当該グルタチオンセファロースビーズからの融合タンパク質の溶出は、界面活性剤の存在下に煮沸することによって実施すればよい。この界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ（硫酸−３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン）、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド（１−Ｏ−ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−４）α−Ｄ−グルコピラノシド）、ノニデット（商品名）Ｐ４０（エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ）、ｎ−オクチルグルコシド（１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）、モノラウリル酸シュクロース、テシット（商品名、ドデシルポリ（エリレングリコールエーテル）ｎ）、トリトン（商品名）Ｘ−１００（オクチルフェノールポリ（エチレン−グリコールエーテル）ｎ）、ツィーン（商品名）２０（ポリ（オキシエチレン）ｎ−ソルビタン−モノラウレートレート）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート［以上、いずれもｎは１以上の整数を表す］等が挙げられる。融合タンパク質を溶出させる場合に、これらの界面活性剤を動物に投与しても問題にならない濃度、好ましくは、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムの存在下、１００℃にて５〜１０分間煮沸する。こうして、目的の免疫原として好ましい精製された融合タンパク質を得ることができる。
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体を取得する場合、抗体のスクリーニングにはプロテインチロシンホスファターゼドメイン、好ましくはＬＡＲホスファターゼドメインを用いてもよいが、免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
本発明のモノクローナル抗体として、マウス／マウスのハイブリドーマにより産生される、ＬＡＲおよびＣＤ４５のホスファターゼサブユニットの細胞内ドメインに対して特異性を有するモノクローナル抗体が挙げられる。この抗体として、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけの分子量が約１４６ｋＤａであるモノクローナル抗体がある。かかる抗体は、インスリンのシグナル伝達機構のさらなる解明のためのツールとして、またインスリン抵抗性およびＮＩＤＤＭに有用な診断方法を開発し、さらにインスリン抵抗性を基盤とするシンドロームＸの種々の病態の予防、治療、診断等に応用できる。
本発明によってさらに、前記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が提供される。このハイブリドーマ細胞系として、本発明者によって１９９８年５月７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−６３４４であるマウス／マウスハイブリドーマ細胞系ＹＵ２が挙げられる。
本発明の抗体は、天然産物由来または全体もしくは部分合成（化学合成、遺伝子組換えによる合成等）された、ＰＴＰタンパク質ならびに少なくともＰＴＰの細胞内ドメインの一部（３アミノ酸残基以上、好ましくは５アミノ酸残基以上）を含む断片およびポリペプチド（以下、この断片およびポリペプチドを総称して「ＰＴＰ由来分子」と称する）に対して特異的な免疫反応性を有する。
さらに本発明は、２種以上のプロテインチロシンホスファターゼサブユニットに対して特異性を有する抗体の調製方法であって、免疫原として前記したようなプロテインチロシンホスファターゼドメインとその他のタンパク質またはポリペプチド断片とを含む融合タンパク質、好ましくはＧＳＴ−ＬＡＲホスファターゼドメイン融合タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供するものである。ここで、ＧＳＴ以外に使用可能な、融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリペプチド断片、その融合タンパク質の精製方法は、前記したとおりである。
また、好ましい免疫原であるＧＳＴとＬＡＲホスファターゼドメインとを含む融合タンパク質は、ＧＳＴをコードする遺伝子領域およびＬＡＲのホスファターゼドメインをコードする遺伝子領域を含む発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした大腸菌を、２０〜３０℃にて１６〜２４時間、特に好ましくは、２３〜２５℃にて１８時間培養し、その培養液および／または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適に製造することができる。さらにこうして得られた融合タンパク質は、グルタチオンを有する担体、例えば、グルタチオンセファロースビーズへのアフィニティーによって精製されたものであるとよく、当該グルタチオンセファロースビーズからの融合タンパク質の溶出は、界面活性剤の存在下に煮沸することによって実施すればよいことも前述のとおりであり、融合タンパク質を溶出させる場合に、これらの界面活性剤を動物に投与しても問題にならない濃度、好ましくは、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムの存在下、１００℃にて５〜１０分間煮沸する。こうして、目的の免疫原として好ましい精製された融合タンパク質を得ることができる。
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体を調製する方法において、抗体のスクリーニングには、プロテインチロシンホスファターゼドメイン、好ましくはＬＡＲホスファターゼドメインを用いてもよいが、免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
また、本発明によって、新規ＰＴＰを単離するための方法であって、ＰＴＰをスクリーニングする工程を含み、当該スクリーニング工程において如上の抗体が使用されることを特徴とする方法が提供される。前記スクリーニングとして、ｃＤＮＡライブラリーの発現スクリーニングが企図される。
本発明の別の特徴において、ＰＴＰおよび／またはＰＴＰ由来分子の定量方法が提供される。この方法では、如上の抗体を使用して、被検試料中に含まれるＰＴＰのタンパク質、および／または少なくともＰＴＰの細胞内ドメインの一部を含む断片もしくはポリペプチドの量が測定される。この方法において、前記抗体が、イムノブロッティング、免疫沈降またはＥＬＩＳＡのいずれかにおいて使用されることが好ましい。
本発明のさらなる特徴において、如上の抗体を用いて被検試料中に含まれるＰＴＰのタンパク質、および／または少なくともＰＴＰの細胞内ドメインの一部を含む断片もしくはポリペプチドを単離し、単離されたタンパク質、断片またはポリペプチドの活性を測定する工程を含むＰＴＰおよび／またはＰＴＰ由来分子の活性を定量するための方法が提供される。この単離工程において、前記抗体を結合させた担体によるアフィニティークロマトグラフィーおよび／または免疫沈降が好適に用いられる。
さらに本発明は、ＰＴＰおよび／またはＰＴＰ由来分子を生産するための方法であって、如上の抗体を用いてＰＴＰのタンパク質、および／または少なくともＰＴＰの細胞内ドメインの一部を含む断片もしくはポリペプチドを単離する工程を含む方法を提供する。この単離工程において、前記抗体を結合させた担体によるアフィニティークロマトグラフィーおよび／または免疫沈降が好適に用いられる。
また、本発明でさらに企図されるのは、ＰＴＰおよび／またはＰＴＰ由来分子の組織内における存在を確認するための方法であり、この方法において、如上の抗体を用いて免疫組織学的検査が行われる。免疫組織学的検査には、例えば、標識抗体を用いたｉｎ ｓｉｔｕ免疫組織染色などの技術が採用され、ＰＴＰのタンパク質、および／または少なくともＰＴＰの細胞内ドメインの一部を含む断片もしくはポリペプチドの検出を行う。
尚、本発明者らは、ＬＡＲに対して特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体が、甲状腺癌細胞を特異的に認識することを確認している。従って、本発明の上記抗体は、甲状腺癌の診断、治療等に有用であると考えられる。
〔発明を実施するための最良の形態〕
［実験例１］ＬＡＲ変異体によるインスリンレセプターのチロシンリン酸化、ならびにＬＡＲとインスリンレセプターとの会合に関する検討
先ず、ＬＡＲによるインスリンのシグナル伝達制御メカニズムを明らかにするために、ＬＡＲのＰＴＰドメインの触媒活性中心に存在するシステインをセリンに変換することにより作製した、変異型ＬＡＲを用いるというストラテジーにより解析を進めた。
ａ．ＬＡＲ、およびインスリンレセプターの発現ベクター
ＬＡＢ発現ベクターとして、（ａ）ＬＡＲ ＷＴ：ヒト野生型ＬＡＲ（配列番号：３）、（ｂ）ＬＡＲ Ｃ／Ｓ：ＬＡＲ−ＰＴＰドメイン１の活性中心にあるシステイン（配列番号：３のアミノ酸第１５２２位）を、配列番号：３のヌクレオチド第４９８３位のＧをＣに置換することによりセリンへと変換したもの、ならびに（ｃ）ＬＡＲ ＤＣ／Ｓ：ＬＡＲ Ｃ／Ｓにおける変異に加えて、さらにＬＡＲ−ＰＴＰドメイン２のシステイン（配列番号：３のアミノ酸第１８１３位）を、配列番号：３のヌクレオチド第５８５６位のＧをＣに置換することによりセリンへと変換したものの３種（第１図（ｂ）参照）を、ｐＭＴ発現ベクターに組み込んだもの（Ｓｔｒｅｕｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，８９７−９０７，１９９２およびＳｔｒｅｕｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，２３９９−２４０７，１９９０を参照）を用いた。
一方、インスリンレセプターの発現ベクターは、（ａ）ＩＲ ＷＴ：野生型、および（ｂ）ＩＲ Ｋ１０１８Ｍ：野生型のインスリンレセプターのＡＴＰ結合部位の、第１０１８位のリジンをメチオニンに変換してチロシンキナーゼ活性を欠失させたインスリンレセプター変異型の２種類のｃＤＮＡを、ＳＲαプロモーターの下流に組み込んだもの（Ｋａｎａｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１９５，７６２−７６８，１９９３を参照）を用いた。
ｂ．ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞を１．０×１０^６細胞数／８ｍＬ／９０φディッシュとなるように１０％牛胎児血清添加 ＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬株式会社）に播種して１６時間培養を行った後、ＬＡＲ Ｃ／ＳとＩＲ ＷＴの発現ベクターをＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクションした。用いたＬＡＲ Ｃ／Ｓは、前記▲１▼（ｂ）に記載のとおりに変異させることにより、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでチロシンホスファターゼ活性が完全に欠失していることが明らかにされている（Ｓｔｒｅｕｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９，２３９９−２４０７，１９９０）ものである。
コトランスフェクションは、以下の手順に従って行った。先ず２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培養液（グルタミン０．３ｇおよびカナマイシン０．１ｇを含む、ＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬株式会社）１０．２ｇ／Ｌ、１０％ＮａＨＣＯ_３でｐＨ７．４に調整）４ｍｌに、４０μｌの１０ｍＭクロロキンを加えた。この溶液２ｍｌに、ＬＡＲ発現ベクター５μｇおよびＩＲ発現ベクター１μｇを加え、残りの溶液２ｍｌには１６μｌの１００ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストランを加えた。次いで双方の溶液をよく撹拌混合した。こうして調製した発現ベクター溶液３．７５ｍｌを、１．０×１０^６細胞数／８ｍｌ／ディッシュとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１６時間前培養しておいたＣＯＳ−７細胞に加えた。前培養と同様の条件で４時間培養した後に１０％ＤＭＳＯ溶液で２分間処理し、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、１．４ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４）で洗浄後、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０を８ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ_２に調整したインキュベーター内で４８時間培養した。
ｃ．インスリン刺激と細胞溶解液調製
トランスフェクション終了後のＣＯＳ−７細胞を血清無添加ＲＰＭＩ １６４０培養液中で１６時間培養し、１０^−７Ｍインスリン（生化学工業社製）で一定時間、すなわち、０、１、５、１５および３０分間の刺激を行った。但し０分刺激とは、インスリン刺激を行ったが、氷上に放置し、３７℃でインキュベートしなかったものである。インシュリン刺激開始より各時間経過後に、培養液をすべて吸い取り、直ちにＰＢＳ ｗ／Ｉｎｈ．（チロシンホスファターゼインヒビター含有ＰＢＳ：１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、５ｍＭ フッ化ナトリウム、５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、１．４ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４）を５ｍｌ加えた。ＰＢＳ ｗ／Ｉｎｈ．で細胞全体を洗浄してから液体を吸引除去し、細胞に溶解用バッファー（１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ヨードアセタミド、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、０．１ｍＭ 酸化フェニルアルシン、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル）を１ｍｌ加え、セルスクレイパーを用いて細胞を集めた。この細胞懸濁液を１．５ｍｌチューブに移し４℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞を完全に溶解させた。インキュベート後の液体を１２，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離して得られた上清を、細胞溶解液として以下の実験に用いた。
ｄ．免疫沈降
前節ｃ．で得られた細胞溶解液につき、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体（７．５μｇの１１．１Ａと７．５μｇの７５３．Ａとの混合物（Ｓｔｒｅｕｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，８９７−９０７，１９９２参照）を用いた免疫沈降を行った。前記細胞溶解液１ｍｌに対してモックとしてＭＯＰＣ ２１（マウスＩｇＧｌκ：Ｓｉｇｍａ社製）を１５μｇ加え、４℃で１時間インキュベート後、γ−ｂｉｎｄ（ＧａｍｍａＢｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）２０μｌを加え、さらに４℃で１時間インキュベートすることにより前吸収を行った。４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上清９５０μｌを別のチューブに移した。抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体を１５μｇ加え、４℃で１時間インキュベート後、γ−ｂｉｎｄを２０μｌ加え、さらに４℃で１時間インキュベートした。１２，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離後、沈査を１ｍｌ溶解用バッファーで２回、ＰＢＳ ｗ／Ｉｎｈ．で１回洗浄し、２０μｌのＳＤＳサンプルバッファーに懸濁した。これを沸騰水中で５分加熱し、電気泳動用の検体とした。
ｅ．イムノブロッティング
上記検体を７．５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、トランスファー装置を用いて４００ｍＡで４時間ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｃｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写した。この膜を３％ウシ血清アルブミン溶液中において室温で３０分間以上インキュベートすることによりブロッキングを行った。充分量のＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＴＢＳ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１０分間、２回以上洗浄後、ＴＢＳ−Ｔで５０，０００倍に希釈した抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０、ＵＢＩ社）、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体または抗インスリンレセプターβ鎖抗体（ＵＢＩ社）を加え、室温において１時間振盪した。充分量のＴＢＳ−Ｔで５分間、３回以上洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．５ｍｌを含むＴＢＳ−Ｔ溶液を１５ｍｌ加え、室温において１時間振盪した。充分量のＴＢＳ−Ｔで５分間、３回以上洗浄後、発光試薬セット（和光純薬工業株式会社製）を用いてケミルミネッセンス法により、各抗体と結合する蛋白質のバンドを検出した。
ｆ．結果
このように、ＬＡＲ Ｃ／ＳとＩＲ ＷＴをＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクションし、インスリンで一定時間刺激した後に作製した細胞溶解液を抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体で免疫沈降後、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行ったところ、インスリン刺激１分でインスリンレセプターβ鎖のチロシンリン酸化および８５ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化が認められた。これらのチロシンリン酸化は、インスリン刺激後３０分においても持続して認められた（第２図Ａ参照）。
また、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体（第２図Ｂ）、抗インスリンレセプターβ鎖抗体（第２図Ｃ）および抗リン酸化チロシン抗体（第２図Ａ）を用いたイムノブロッティングの結果、ＬＡＲとインスリンレセプターがインスリンレセプターのチロシンリン酸化の有無により会合することも明らかとなった。
［実施例２］種々のＬＡＲによるインスリンレセプターのチロシン脱リン酸化の検討（１）
次に、ＬＡＲ ＷＴ、ＬＡＲ Ｃ／ＳおよびＬＡＲ ＤＣ／ＳとＩＲ ＷＴを用いて同様にＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクションし、インスリンで５分間刺激後、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体で免疫沈降し、沈降物について各種抗体を用いたイムノブロッティングを行った。その結果、インスリンレセプターとＬＡＲ ＷＴをコトランスフェクションしたものはＬＡＲ Ｃ／ＳやＬＡＲ ＤＣ／Ｓをコトランスフェクションしたものと比べると、インスリンレセプターβ鎖や８５ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化はほとんど検出されなかった（第３図Ａ参照）。
また、この実験においてＬＡＲ（第３図Ｃ）やインスリンレセプター（第３図Ｄ）の発現量は、それぞれのトランスフェクタントにおいてほぼ同一であったことより、ＬＡＲ ＷＴはインスリンレセプターβ鎖や８５ｋＤａ蛋白質のリン酸化チロシンを脱リン酸化することが示された。
また、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体による免疫沈降物を抗インスリンレセプターβ鎮抗体でイムノブロッティングしたところ、ＬＡＲ ＤＣ／ＳをコトランスフェクションしたものではＬＡＲ ＷＴやＬＡＲ Ｃ／Ｓをコトランスフェクションしたものに比較すると、インスリンレセプターβ鎖のバンドが明らかに弱かった（第３図Ｂ）。
この結果は、ＬＡＲ ＷＴやＬＡＲ Ｃ／Ｓに比べて、ＬＡＲ ＤＣ／Ｓとインスリンレセプターの会合が弱いことを示すものである。ＬＡＲ Ｃ／ＳとＬＡＲ ＤＣ／Ｓの違いは、ホスファターゼドメイン２の１８１３番目のアミノ酸のみであることから、チロシンホスファターゼ活性を示さず基質との結合に関与すると推測されてきたこのドメイン２が、ＬＡＲとインスリンレセプターとの結合に機能していることが明らかとなった。
［実験例３］種々のＬＡＲによるインスリンレセプターのチロシン脱リン酸化の検討（２）
さらに、インスリンレセプターのチロシン脱リン酸化がＬＡＲに結合したもののみであるのか、またはインスリンレセプター全てで確認されるのかを検討するために、このコトランスフェクタントの細胞溶解液を電気泳動後、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行った。その結果、ＬＡＲ ＷＴを導入したもののみ、インスリンレセプターのチロシン脱リン酸化が顕著に認められた（第４図参照）。
［実験例４］ＬＡＲ Ｃ／Ｓ存在下でのインスリンレセプターのチロシンリン酸化の検討
次に、８５ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化がインスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性によるものであるかを明らかにするため、ＬＡＲ Ｃ／ＳとＴＲ ＷＴまたはインスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を欠失させたＩＲ Ｋ１０１８Ｍ（ＩＲ ＭＴ）をＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクションした。５分間インスリン刺激を行った後、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体で免疫沈降し、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行った（第５図照）。その結果、ＩＲ ＷＴとコトランスフェクションしたものではインスリン刺激によりインスリンレセプターβ鎖および８５ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化が認められたが、ＩＲ Ｋ１０１８Ｍとコトランスフェクションしたものではこれらのリン酸化が全く認められなかった。
以上の結果より、インスリンがインスリンレセプターに結合するとインスリンレセプターのβ鎖の速やかなチロシンリン酸化が起こり、さらにインスリンレセプターチロシンキナーゼが８５ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化を引き起こすことが明らかとなった。
従って、この８５ｋＤａ蛋白質は、インスリンレセプターと結合していることが確認されたＬＡＲのＰ−サブユニットである可能性が考えられた。
［実施例１］抗チロシンホスファターゼＰ−サブユニット抗体の作製
以下の手順に従って、抗チロシンホスファターゼＰ−サブユニットの抗体を作製した。
ａ．免疫原の調製
免疫原として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＬＡＲ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＬＡＲ）を用いることとした。ＬＡＲ Ｐ−サブユニットの細胞膜貫通部分の終点より細胞質側すべてにあたる６０７アミノ酸に相当するｃＤＮＡ（配列番号：１、３４６７塩基対）をｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ発現ベクターを用いて、常法に従いＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ２０２を形質転換した。この大腸菌をＬＢ（Ａｍｐ．＋）寒天培地（アガー７．５ｇを含む後述のＬＢ（Ａｍｐ．＋）培地）で一晩培養した後、シングルコロニーをＬＢ（Ａｍｐ．＋）培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、５Ｎ ＮａＯＨ ０．２ｍｌ／Ｌ、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含有）５０ｍｌに接種し、さらに一晩培養した。これをＬＢ（Ａｍｐ．＋）培地５００ｍｌに接種し、３７℃で６００ｎｍにおける吸光度が約１．０になるまで培養し、１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）５０μｌを加え、２５℃で一晩培養した。この培養物を３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、沈澱した菌体をＮＥＴＮ（０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）５０ｍｌに懸濁させた。その後、１分間超音波処理、氷上１分間の操作を２回繰り返し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上清を得た。この大腸菌溶解液１０ｍｌにグルタチオンセファロースビーズ懸濁液（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）をＮＥＴＮで３回洗浄し、５０％ＮＥＴＮ懸濁液として調製）を１００μｌ加え、室温で３０分間インキュベートした。得られた懸濁液を３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を取り除いた。沈殿したグルタチオンセファロースビーズをＮＥＴＮで２回、ＰＢＳで１回洗浄し、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、５％ ２−メルカプトエタノール）を１００μｌ加え、沸騰水中で１０分間加熱してＧＳＴ−ＬＡＲ融合蛋白質を溶出した。ビーズを除いた溶出液を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（アミコン社製）に移し、３，０００ｒｐｍ、４５分間、４℃で遠心濃縮した。緩衝化を目的として１ｍｌのＰＢＳを加え、ふたたび３，０００ｒｐｍ、４５分間、４℃で遠心濃縮した。この緩衝化の操作をさらに２回繰り返して得られたものを、免疫用の抗原溶液とした。抗原蛋白質の精製および濃縮は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。
一方、最終免疫では静脈内投与を行うため、上記とは異なる方法で抗原溶液を調製した。ＧＳＴ−ＬＡＲ融合蛋白質を発現している前記大腸菌溶解液とグルタチオンセファロースビーズをインキュベートし、遠心分離後、沈殿したビーズをＮＥＴＮで２回、ＰＢＳで３回洗浄した。次いでＧＳＨ溶出バッファー（２０ｍＭ グルタチオン、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．６）を１００μｌ加え、１０分間室温で軽く撹拌してＧＳＴ−ＬＡＲを溶出させた。３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を回収する操作を計３回行い、全溶出液を生理食塩水中４℃で２日間透析したものを、静脈内投与用抗原溶液とした。
ｂ．免疫処置
６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス８匹に対し、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、Ｓｉｇｍａ社製）を０．５ｍｌ／匹で腹腔内投与した。２週間後、腹腔内免疫用抗原溶液をフロイント完全アジュバンド（ＧＩＢＣＯ社製）と１：１で混和しエマルジョン化したものを、ＧＳＴ−ＬＡＲ融合蛋白質が約１０μｇ／匹となるよう腹腔内投与した。以後、ほぼ２週間ごとに４回、腹腔内免疫用抗原溶液とフロイント不完全アジュバント（ＧＩＢＣＯ社製）との１：１混和物をＧＳＴ−ＬＡＲが約３０〜７０μｇ／匹となるよう調製し、腹腔内投与した。４回目の免疫の４日後に眼底静脈より採血し、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。
ｃ．ＥＬＩＳＡ
静脈内免疫用抗原と同様の方法で調製したＧＳＴ−ＬＡＲおよびＧＳＴのみの蛋白質溶液を、それぞれ精製水に対して４℃で一晩透析した。これを、ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに調製し、５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３９１１ ＭｉｃｒｏＴｅｓｔ・ＴＭ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ）に１時間吸着させた。洗浄用バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄後、５％スキムミルク（２．５ｇのスキムミルクを５０ｍｌのＰＢＳに溶解して調製）でブロッキングを行った。これを洗浄後、前節ｂで得られた血清を血清希釈用バッファー（０．２５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）で１６，０００倍に希釈し、５０μｌ／ウェルずつ加え、湿箱中１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、１０００倍希釈ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ／ウェルずつ加え１時間インキュベートした。洗浄用バッファーで４回、ＰＢＳで１回洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン（和光純薬工業社製）をクエン酸緩衝液（５．６３２５ｇクエン酸一水和物、１８．３５ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４−１２Ｈ_２Ｏを精製水に溶解し、５００ｍｌとして調製）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた基質溶液を５０μｌ／ウェルとなるように加え、３０分間反応させた後、５０μｌの１０％Ｈ_２ＳＯ_４を加え反応を停止した。このうち５０μｌを測定用９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に移して４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ｄ．細胞融合
上記ＥＬＩＳＡの結果よりＧＳＴ−ＬＡＲに対する抗体価の上昇が認められたマウス２匹に静脈内投与により最終免疫を行い、その３日後に脾臓を摘出して、常法により脾細胞を調製した。
細胞融合のためのｐａｒｅｎｔ ｃｅｌｌは、事前に２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含む培地で選択し、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株であることを確認したＢａｌｂ／ｃマウス由来ミエローマ細胞株ＮＳ１を用いた。２×１０^７細胞数のＮＳ１細胞と１×１０^８細胞数の脾細胞に対し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標名）−ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて細胞融合およびクローニングを行った。
クローニングされたハイブリドーマ培養上清のスクリーニングは、静脈内免疫用抗原と同様の方法で調製したＧＳＴ、ＧＳＴ−ＬＡＲまたはＧＳＴ−ＣＤ４５（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０９２８−１０９３２，１９９４）の蛋白質溶液０．５μｇ／ｍｌを結合させたプレートにて、ハイブリドーマ培養上清５０μｌについて前節ｃにおけるＥＬＩＳＡ法に準じて行った。このＥＬＩＳＡ法において、ＧＳＴを結合させたウェルには免疫反応を示さず、ＧＳＴ−ＬＡＲまたはＧＳＴ−ＣＤ４５を結合させたウェルに免疫反応性を示すハイブリドーマを選択した。なお、クローニングされたハイブリドーマの継代培養は、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含有するＲＰＭＴ １６４０培養液（日水製薬社製）で行った。
このように、ＨＡＴ選択されたハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングしたところ、抗体産生能、増殖能とも安定したクローンＹＵ２が得られた。
このハイブリドーマ細胞ＹＵ２は、１９９８年５月７日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６３４４である。
ｅ．モノクローナル抗体のタイピング
上記ｄで得られたハイブリドーマ細胞ＹＵ２の培養上清０．５ｍｌを４．５ｍｌのＴＢＳ−Ｔで希釈し、希釈液のうち３ｍｌについてＭｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ．製）を用いて、アイソタイプを調べた。その結果、抗体のアイソタイプはＩｇＧ１κであることが判った。
ｆ．モノクローナル抗体の調製と精製
６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し、０．５ｍｌ／匹のプリスタンを腹腔内投与し、その１０日後に、上記ｄのクローニングで得られたハイブリドーマ細胞ＹＵ２を、１匹あたり２．５×１０^６〜１．３×１０^７細胞数／０．５ｍｌ／匹で腹腔内へ注入した。１０日後ごろから、マウスの腹部肥大を認めたため、２０ゲージの注射針を用いて数回にわたり腹水を採取した。採取した腹水は、１，０００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離し、上清と沈殿物とに分けた。上清は、３７℃で３０分間処理した後、４℃に一晩静置した。１２，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた上清１．５ｍｌよりアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてモノクローナル抗体ＹＵ２を精製した。得られた抗体溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、マウスＩｇＧの分子吸光係数より抗体濃度を算出した。
さらに、このモノクローナル抗体ＹＵ２につき、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上の移動度からそれぞれの見かけの分子量を明らかにした。この結果を第６図に示す。第６図に明らかなように、モノクローナル抗体ＹＵ２は、約４８ｋＤａのＨ鎖と約２５ｋＤａのＬ鎖を含み、約１４６ｋＤａの分子量を有していた。
［実施例２］モノクローナル抗体の特異性の検討（１）
実験例１．ａおよびｂに記載した通り、ＬＡＲ ＷＴの発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。その細胞溶解液について、実施例１で得られた精製モノクローナル抗体を用いて免疫沈降後、イムノブロッティングを行った。抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体（前記）、抗ＣＤ４５抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、３５−Ｚ６）およびモノクローナル抗体ＹＵ２はすべてＩｇＧ１サブクラスに属するので、免疫沈降の対照としてＭＯＰＣ２１を用いた。
係るＣＯＳ−７細胞へのＬＡＲ強制発現系を用いた解析により、抗ＬＡＲ Ｅ−サブユニット抗体で免疫沈降後、モノクローナル抗体ＹＵ２は、ＬＡＲ Ｐ−サブユニットに相当する８５ｋＤａとプレカーサーに相当する約２００ｋＤａの蛋白質を認識した（第７図Ｂ参照）。
さらに、ＬＡＲをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の細胞抽出液をこれらの抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂまたはＹＵ２）により免疫沈降後、ＬＡＲ Ｅ−サブユニットを認識する抗体でイムノブロッティングを行ったところ、ＹＵ２の抗体で免疫沈降したもののみＬＡＲ Ｅ−サブユニットに相当する１５０ｋＤａと、プレカーサーに相当する約２００ｋＤａの蛋白質が検出された（第７図Ａ）。
以上の結果より、モノクローナル抗体ＹＵ２は、ＬＡＲのＰ−サブユニットの免疫沈降およびイムノブロッティングに利用可能であることが明らかとなった。
一方、ＹＵ２はＧＳＴ−ＣＤ４５（Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０９２８−１０９３２，１９９４）を抗原としたＥＬＩＳＡでも反応性を示したことから、ＬＡＲとＣＤ４５との共通抗原（おそらく、双方に保存されているＰＴＰドメイン内の配列）をエピトープとして認識していることが推察された。
［実施例３］モノクローナル抗体特異性の検討（２）
モノクローナル抗体ＹＵ２の特異性をさらに調べるために、実験例１に記載したと同様の手順に従ってＣＯＳ−７細胞にＣＤ４５を強制発現させ、その細胞抽出液をＹＵ２を用いてイムノブロッティング解析を行ったところ、約２００ｋＤａと約１８０ｋＤａの位置にバンドが確認された（第８図参照）。
市販の抗ＣＤ４５抗体によるリプローブでも、同じ位置にバンドが検出されたので、これらのバンドはＣＤ４５であることが明らかとなった。
以上実施例２および３の結果より、ＥＬＩＳＡ法によるハイブリドーマのスクリーニングにおいてＬＡＲおよびＣＤ４５の細胞内ドメインの双方に反応性を示すクローンとしてピックアップされたＹＵ２は、イムノブロッティングでもＣＤ４５を認識できることが確認された。
ＬＡＲとＣＤ４５のアミノ酸配列の細胞内ドメインの相同性を第９図に示す。図中、双方のアミノ酸配列間で、「＊」は同一アミノ酸を示し、「・」は類似アミノ酸を示す。ＬＡＲとＣＤ４５の細胞内ドメインのうちホスファターゼドメイン１以降Ｃ末端までのアミノ酸配列を比較すると、３９．４％の相同性を有していることが明らかになっている。なかでも、ドメイン１内のチロシンホスファターゼ活性を担うコンセンサス配列周辺にあたる１２アミノ酸（Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ、配列番号：４（配列番号：１のアミノ酸第２４５〜２５６位））は、完全に一致している（第９図中、白抜き文字部分）。ポリペプチドが抗原決定基となりうるには、８〜１０アミノ酸程度が必要といわれていることから、ＹＵ２が配列番号：４で示される１２アミノ酸を含むホスファターゼのコンセンサス配列をエピトープとして認識することも考えられる。
第９図において、ＬＡＲおよびＣＤ４５の細胞内ドメインの、他の既知のＰＴＰ（すなわち、ＰＴＰα、β、γ、δ、ε、σ、μ、κ、η、ζ等）とのコンセンサス配列部分８箇所に囲みを付した。この８筒所のコンセンサス配列は、ドメイン１およびドメイン２における、４種の配列（第１１図、（１）〜（４））の反復であり、かかる４種の配列の詳細は以下の通りである。
（１）Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−（Ａｒｇ／Ｇｌｕ／Ｌｅｕ）−Ｍｅｔ−（Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｃｙｓ）−Ｔｒｐ （配列番号：５）
（２）Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−（Ａｌａ／Ａｓｐ）−（Ｇｌｎ／Ｇｌｕ／Ｌｙｓ）−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ （配列番号：６）
（３）Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−（Ｈｉｓ／Ｐｈｅ）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
（配列番号：７）
（４）Ｐｒｏ−Ｘａａ−（Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−（Ｉｌｅ／Ｖａｌ）−Ｈｉｓ−ＣＣｙｓ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）−Ｇｌｙ （配列番号：８）
配列番号：４で示されるＬＡＲとＣＤ４５との前記同一配列は、ドメイン１の上記コンセンサス配列（４）に含まれている。このようなＰＴＰのコンセンサス配列をエピトープとして認識しうる本発明の抗体は、ＰＴＰの解析および定量、新規ＰＴＰの同定、検出および単離精製などに有効に利用できるものと考えられる。
また、第１０図に示すように、インスリンがインスリンレセプターα鎖に結合すると、インスリンレセプターのβ鎖が自己リン酸化されチロシンキナーゼ活性が上昇する。このチロシンキナーゼの働きにより、最終的にグルコースの取り込み、糖代謝や細胞増殖といったインスリン作用が発現する。本出願人らは、この活性化されたインスリンレセプターは、ＬＡＲによってチロシン脱リン酸化を受けて不活性化状態に戻ることを明らかにした（１９９８年６月５日出願の国際出願、ＰＣＴ／ＪＰ９８／０２５４２）。さらに、（１）インスリンレセプターチロシンキナーゼはＬＡＲの細胞内ドメインをチロシンリン酸化すること、（２）かかるリン酸化がＬＡＲの基質特異性の決定か、ホスファターゼ活性の上昇に関与していること、および（３）リン酸化チロシンをＬＡＲが自己脱リン酸化することによりその酵素活性を制御していることなどの可能性が示唆され、ＬＡＲの酵素活性の促進がインスリン抵抗性の原因となりうることを分子レベルで例証している。本発明の抗体によって、このようにＬＡＲやＣＤ４５のみならず他のＰＴＰが関与する、リン酸化・脱リン酸化等が関わるシグナル伝達機構や種々の制御機構を解明することが可能となる。
〔産業上の利用可能性〕
本発明によって提供される、ＰＴＰの細胞内ドメインに対する抗体は、ＬＡＲまたは、ＣＤ４５とＬＡＲの双方の細胞内ドメインに結合することができる。
これら本発明の抗体は、ＰＴＰのホスファターゼドメインのコンセンサス配列を認識すると考えられるため、ＰＴＰの解析および定量、新規ＰＴＰの同定および検出、ならびにクローニング等による新規ホスファターゼの取得に有用である。そして、これらの抗体は、インスリンのシグナル伝達機構や種々の制御機構を解明する極めて有用なツールになり得る。また、インスリン抵抗性およびＮＩＤＤＭに有用な診断方法を開発し、さらにはインスリン抵抗性を基盤とするシンドロームＸの種々の病態の予防、治療等の処置および診断、そして動脈硬化および心疾患発症の予防および診断に応用できる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、ＬＡＲのサブユニット構造を示す模式図（ａ）、および実験例にて調製したＬＡＲの膜内ホスファターゼドメイン構造の変異体を示す模式図（ｂ）である。
第２図は、ＬＡＲ Ｃ／Ｓとインスリンレセプター（ＩＲ）の野生型とをコトランスフェクトしたＣＯＳ細胞において、インスリン刺激により誘導されるチロシンリン酸化の時間経過を示すイムノブロットを表す図である。
第３図は、ＬＡＲの野生型または変異体とインスリンレセプターの野生型とをコトランスフェクトしたＣＯＳ細胞における、リン酸化−説リン酸化を示すイムノブロットを表す図である。
第４図は、ＬＡＲの野生型または変異体によるインスリンレセプターβ鎖の脱リン酸化を示すイムノブロットを表す図である。
第５図は、インスリンレセプターの野生型または変異型とＬＡＲ Ｃ／ＳとをコトランスフェクトしたＣＯＳ細胞におけるチロシンリン酸化を示すイムノブロットを表す図である。
第６図は、本発明の抗体ＹＵ２の分子量を示す、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを表す図である。
第７図は、本発明の抗体ＹＵ２のＬＡＲに対する免疫特異性を示すイムノブロットを表す図である。
第８図は、本発明の抗体ＹＵ２を用いた、ＣＤ４５についてのイムノブロッティングによる分析結果を示す図である。
第９図は、ＬＡＲとＣＤ４５の細胞内ドメインのアミノ酸配列の相同性を示す図である。
第１０図は、インスリンレセプターおよびＬＡＲが関与する、リン酸化および脱リン酸化によって制御されるインスリンのシグナル伝達のカスケードを示す模式図である。

Claims (17)

1. 配列番号：１に示す塩基配列によってコードされるＬＡＲの細胞内ドメインと、ＣＤ４５の細胞内ドメインとの両方に対して特異性を有するモノクローナル抗体。
2. プロテインチロシンホスファターゼのホスファターゼドメインに対して特異性を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 配列番号：１に示す塩基配列によってコードされるポリペプチドを用いて調製される請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
4. 免疫原としてＧＳＴ−ＬＡＲホスファターゼドメイン融合タンパク質を用いることによって調製されるモノクローナル抗体であって、ＬＡＲホスファターゼドメインが配列番号：１に示す塩基配列によってコードされる請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
5. 前記ＧＳＴ−ＬＡＲホスファターゼドメイン融合タンパク質が、ＧＳＴをコードする遺伝子領域およびＬＡＲのホスファターゼドメインをコードする遺伝子領域を含む発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした大腸菌を２０〜３０℃にて１６〜２４時間培養し、その培養液および／または菌体から融合タンパク質を単離することによって製造されるものである請求項４に記載のモノクローナル抗体。
6. 前記ＧＳＴ−ＬＡＲホスファターゼドメイン融合タンパク質が、さらにグルタチオンを有する担体へのアフィニティーによって精製されるものであって、該担体からの融合タンパク質の溶出が、界面活性剤の存在下に煮沸によって実施されるものである請求項５に記載のモノクローナル抗体。
7. 前記ＧＳＴ−ＬＡＲホスファターゼドメイン融合タンパク質を免疫原として調製されるモノクローナル抗体が、該融合タンパク質を用いてスクリーニングされるものである請求項４乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
8. 請求項１乃至７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
9. 請求項１乃至７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の調製方法であって、
   免疫原として配列番号：１に示す塩基配列によってコードされるＧＳＴ−ＬＡＲホスファターゼドメインの融合タンパク質を用いて非ヒト動物を免疫する工程と、
   免疫された前記動物からの抗体産生細胞より得られるハイブリドーマ細胞系を調製する工程と、
   前記ハイブリドーマ細胞系からモノクローナル抗体を産生する工程と、
   前記融合タンパク質を用いてモノクローナル抗体をスクリーニングする工程と、
   を有する方法。
10. 新規プロテインチロシンホスファターゼを単離するための方法であって、
    プロテインチロシンホスファターゼをスクリーニングする工程を含み、
    該プロテインチロシンホスファターゼのスクリーニング工程において請求項１乃至７のいずれかに記載のモノクローナル抗体が使用されることを特徴とする方法。
11. 前記スクリーニングが、ｃＤＮＡライブラリーの発現スクリーニングである請求項１０に記載の方法。
12. プロテインチロシンホスファターゼの定量方法であって、
    請求項１乃至７に記載のモノクローナル抗体を使用して、被験試料中に含まれるプロテインチロシンホスファターゼタンパク質を測定する工程を有する定量方法。
13. 前記モノクローナル抗体がイムノブロッティング、免疫沈降またはＥＬＩＳＡのいずれかにおいて使用される、請求項１２に記載の定量方法。
14. プロテインチロシンホスファターゼの定量方法であって、
    請求項１乃至７に記載のモノクローナル抗体を使用して、被験試料中に含まれるプロテインチロシンホスファターゼタンパク質を単離する工程と、
    単離されたプロテインチロシンホスファターゼタンパク質を定量する工程と、
    を有する定量方法。
15. プロテインチロシンホスファターゼの調製方法であって、
    請求項１乃至７に記載のモノクローナル抗体を使用して、被験試料中に含まれるプロテインチロシンホスファターゼタンパク質を単離する工程を含む方法。
16. 前記単離工程において、前記モノクローナル抗体を結合させた担体によるアフィニティクロマトグラフィーおよび／または免疫沈降が用いられる請求項１４または１５に記載の方法。
17. プロテインチロシンホスファターゼの組織内における存在を確認するための方法であって、
    請求項１乃至７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて免疫組織学的検査を行い、プロテインチロシンホスファターゼタンパク質を検出する工程を含む方法。

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