WO2000002922A1 - Anticorps specifique des domaines intracellulaires de la thyrosinephosphatase - Google Patents

Description

明 細 害 プロティンチロシンホスファタ一ゼの

細胞内ドメインに対する抗体

〔技術分野〕

本発明は、 2種以上のプロテインチロシンホスファターゼ （Protein Tyrosine Phosphatase, 以下、 PTPと称する）の中の細胞内ドメインに対 して特異性を有する抗体およびその調製方法に関する。 さらに詳細には、 ΡΤΡ (例えば、 LAR (白血球共通抗原額似分子） および CD45) における細 胞內ドメインに対して特異的であって、 ΡΤΡの解析および定量、 新規 FTP の同定、 検出および単-離精製、 ならびにィンスリン抵抗性に関わる症状 の治療、 予防、 緩和等のための処置や診断に適用可能な医薬の開発など に有用な抗体に関する。

[背景技術〕

近年、 動脈硬化発症メカニズムが徐々に明らかにされ、 その危険因 が同定されつつある。 特に高コレステロール血症、 高血圧症、 新尿病お よび喫煙が動脈硬化の 4大危険因子と認定され、 その治療が積極的に行 われている。 これらの病態として臨床的に共通しているのが、 インスリ ン抵抗性である。 ィンスリン抵抗性とは細胞におけるィンスリン感受性 の低下とほぼ同義語であり、 細胞での糖の取り込みにおけるインスリン 作用が低下していることを指す。 その原因としてはインスリン分泌自体 の異常、 標的細胞におけるインスリン受容体の異常、 細胞内情報伝達系 の異常おょぴ血行力学的に末梢循琮障害に基づく糖の組織への供給減等 がある。 Reavenは 1988年、 このインスリン抵抗性を S盤として多くの病 態が引き起こされることを報告し、 また、 インスリン抵抗性、 耐搪能異 常、 ¾ィンスリン血症、 卨トリグリセライド血症、 低 HDLコレステロ一 ル fk症、 高血圧をマルチプルに持つ病態をシンドローム Xと名付け. 勅 脈硬化.. 症に深く閔わっていることを提唱した （Reaven, G. . et al. ； Diabetes, 37, 1595-1607, 1988) ₀

また、 一般的に、 ィンスリン抵抗性により細胞への糖の供給は低 Fし、 膝臓におけるィンスリン分泌を亢進させ、 高ィンスリン血症を引き起こ すことが知られており、 臨^の場においてもインスリン抵抗性の問題が 種々浮上している。 例えば、 ィンスリン抵抗性 -高インスリン ik症が糖 尿病性腎症を促進し （Niskanen, し. et al. ； Diabetes, 41, 736-741, 1993)、 糖尿病性網膜症の頻度が高くなる （ p, J- et al. ； ncot₇ 341, 369-370, 丄 993)という報告がある。 さらに、 インスリン抵抗性に よってプラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-].)の活性が上丼し、 血液線溶系機能を低下させたり （Potter van Loon BJ et al. ； Me tab. Clin. Exp. , 42， 945-954. 1993)、 粥状動脈硬化の引き金になる

(Sato, Y. et aj. ； Diabetes, 38, 91-96, 1989)という文献等も報告 されている。

糖尿病は有病率が全人口の 5%を占め、 F1本人の約 600万人が罹患し ている。 糖尿病にはインスリン依存性糖尿病 （IDDM) とインスリン非依 存性糖尿病 （NIDDM) がある。 IDDMは糖尿病全体に対して約 7%、 N1DDM は約 90%といわれ、 特に、 糖尿病の大多数を占める NIDDMの発症は、 イン スリン抵抗性が fi要な成因と考えられている:.

現在までに. インスリンのシグナル伝 iSには細胞内蛋 質のチロシン リン酸化が fi要な役割を演じていることが明らかとされている。 ィンス リンレセプタ一は分子量約 135 kDaの αサブュニットと 95 kl)aの βサブ ュニットの 2つの糖タンパクサブュニットがジスルフィ ド結合によりへ テロテトラマ一を形成し、 ひ 2 /3 2構 i をとる。 _αサブユニットはインス リン結合活性を有し、 /3サブュニットは自己リン酸ィ匕により活性化する プロテインチロシンキナ一ゼ （Protein Tyrosine Kinase ： PT )ドメイ ンを有する。 すなわち、 インスリンがインスリンレセブタ——の α鎖に結 合すると、 インスリンレセプター |3鎖に存在するいくつかの特定のチロ シン残基がレセプターのチロシンキナーゼ活性により自己リン酸化され る。 インスリンレセブターチ口シンキナーゼは自己チロシンリン酸化に よってそのチロシンキナ一ゼ活性がさらに.ヒ爿-する。 このようにして活 性化されたインスリンレセプターチ口シンキナーゼは、 細胞內に存在す るその 質である II?S (insul in receptor substrate) をチロシンリン 酸化し、 このチ πシンリン酸化 IRS-1を Ash/Grb2や PI- 3 キナーゼが認 識して結合することによりシグナルが伝達され、 最終的にグルコースの 取り込み、 糖代謝や細胞増殖といつたィンスリンによる生物活性が発現 することが明らかとされている （第 9図参照、 Goldstein, B. J. et a J. ； Receptor, 3, i-l5， 1993, anai, F'. et a l. ： Biochemica l and Biophysical Research Commun i a tions, 195 (2) , 762-768, 丄 993)。 しか し、 このィンスリンのシグナル伝達において、 性化されたィンスリン レセプタ一を不活化する酵素、 すなわちチコシン脱リン酸化酵; IIである PTPの研究はほとんど進展していない。

また， やはりチロシンリン酸化により巧みに制御されている、 リンパ 球の活性化、 ¾殖、 分化、 細胞死など免疫系の 礎となる機構もその例 外でない。 これまで PTKからみたリンパ球のシグナル伝達の研究が主流で あつたが、 最近 PTPからの解析も進み、 两面から検討することの重要性が 明らかとなってきた。

ΡΐΡに！ ¾する研究が本格的に始まったのは、 1988年に Fischerのグルー プによりヒ 卜胎盤由来細胞質型の PTPである PTPiBの遺伝子がクロ一ニン グされ、 そのヌクレオチド配列が解明されてからである （Tonks, N. K. et al. ； J. Biol. Chem. , 263, 6722-6730, 1988, Charbonncau, H. e t al. ； Proc. Na tl. Acad. Sci. USA, 85, 7182-71 86, 1988)。 その 結果、 TP1Bと相问性を示したのは既知のセリン スレオニンホスファタ ーゼではなく、 造 lilL系の膜貫通分子である CD45の細胞質内領域の 2力所で あった。 さらに， CD45カ TP活性を有していることも明らかにされた

(Tonks, N. K, et a l. Biochemis try, 27, 8695-8701, 1988,

Charbonneau, H. et al. ； Proc. Na tl. Acad. Sci. USA, 85, 7182- 7186, 1 988)。

ヒ トでは PTP遗伝子は 5 0 0個に及ぶと推定されており、 現在までに

8 0種以ヒの PTPが cDNA配列の相同性に基づいてクローニングされ、 今な お次々と新しい I?が報告されている （Streul i , M. et al. ； J. Exp. Med. , 168, 1523-1530, 1988, Krueger, N. X. c t al. ； EMBO J. , 9， 3241 -3252, 1990, Trowbridge, I. S. et al. ； iochim. Biophys. Acta, 1095, 46-56, 1991)。 このように、 スーパーファミリ一を形成し ている PTPは大きく 3つのフアミリーに分類される。 すなわち、 PTド.

DS-PTP (dual -spec ί f i city-PTP：二重特異性 PTP)およびし ff- PTP (l ow molecular weight- PTP：低分チ¾?丁 ）の 3群である。 それぞれのファミ リ一間の 1次構造の相同性はそれほど高くなく、 特に PTPと LMW-PT?とは 酵素活性中心以外は相同性は示さないが、 クリスタ πグラフィ一による 研究より、 これらのフアミリーに属する分子の 3次構造は驚くほどの共 通性を示すことが明らかにされた （Fauman, E. B. et a l. ； Trends Biochem. Sci. , 21， 13-417, 1 996)。 更に、 PTPは、 （1)細胞膜莨通部分 を袢つ受容体型 （あるいは睽型） PTP (LCA (白血球共通抗原 （Leuko- cyte Common Antigen) ) すなわち CD45、 し ARならびに PTP α、 3 , y , δ、 f 、 σ , μ、 κ . 77、 ζ ヒ、 (2)細胞膜萸通部分を持たない細胞質型 PTP (PTP1B, TC-PTP, PTP-MEG, PTPHl , STEP, PTP1 FAPl、 SHP1、 SHP2、 PEP、 PTP-PEST等）とに大別される。

受容体型 PTPの多くは、 細胞内に 2つの PTP相同部分 （ドメイン 1および ドメイン 2、 笫 l l¾ (a)および (b)参照） を持っている。 現在までに報告 されている全ての FTPには、 Tl e/Va卜 Hi s - Cys-XfifHVla-GIy-Xaa- Xaa-Arg -Ser/Thr-Gly (配列番¾ "： 2 ) というシスティンを含む配列 (signature motif)がホスファタ一ゼドメイン内に保存されている。 PTP1Bのクリ スタログラフィ一による研究から、 この部位は PTP分子表面の小さな窪み を形成しており、 システィンは みの底に位置しリン酸との結合に直接 関与していることが明らかにされた （Barfnrd, D. et al. ； Science, 263, 1397-1404, 1994)。 また、 PTP1Bの酵泰活性の巾心の窪みにはセリ ンゃスレオニンに結合しているリン酸は到達できないことから、 窪みの 深さが PTPとセリン /スレォニンホスファタ一ゼの特異性を決定している ことも示された。 さらに、 前記 signature mot ifの酵素活性発現における 重要性は、 変異実験から明らかにされている （Streul i, M. et al. ；

EMBO J. , 9, 2399-2407, 1990)。 これらのことから、 ドメイン 1の保存 された Cysが酵 S-活性 ¾現に重 Sであり、 またドメィン 2は酵素の基質特 異性を决めていると考えられている。

受容体型 PTPは細胞內に 2個または 1個の酵素領域をもち、 細胞外ドメ インの特徵により、 いくつかのグル一プに分けられる。 細胞外にフイブ ネクチンタイプ ΠΙ型ドメインを 1個有し、 高度に糖鎖修飾された CD45、 Ig様ドメインとフイブ αネクチンタイプ ΙΠ型ドメインを有する I-AR、 PTP S、 ΡΤΡ σ , Ν末端に MAM (meprin、 Α5抗原、 ΡΤΡ μ ) ドメインを有する ΡΤΡ μ、 PTP κ、 Ν末端に炭酸脱水酵茶'ドメインを有する PTP y , PTP ζ、 細胞外ド メインの短い ΓΡ α、 PTP ίがあり、 以上の PTPはいずれも 2個の酵秦領域 を持つ。 一方、 酵素螭域が 1個のものはいずれも細胞外ドメインがフィ ブロネクチンタイプ Π1型ドメインのみで構成され、 PTP jS CD 148 (PTP T? , DEP- 1等）がある。

細胞質型 PTPは原則として酵素領域を 1個有し、 非酵素領域の特徴によ りいくつかのグループに分けられている。 SH 2領域、 PEST領域、 band4, 1領域を有するものがある。 DS-PTPはチロシンのみならず、 セリンあるい はスレオ ン残基を脱リン酸化する酵素で、 Crk25 , MAPキナ一ゼホスフ ァクーゼ、 VH - 1等がある。 LMW-PTPは酵素領域のみから構成されており、 分子量は約 18 kl)aと報告されている。

PTP酵素群のうち、 ヒ ト由来の LARは、 受容体型 PTPである CD4Sのホス ファタ、-ゼドメインをプローブとしてヒ ト胎盤ゲノムライブラリ一によ りクローユングされた、 受容体型 PTPである （Streuli M. et ah ； J. Exp. Med. , 168, 1553-1562, 1988) 。 CD45が血球系の細胞に特異的に発 現しているのに対して、 LARは血球系以外の細胞、 特に肝臓や骨格筋など のインスリン感受性組織に発現している （Goldstein B. J. ； Receptor, 3, 1-15, 1993) 。 多くの受容体型 PTPの中でし AKはその細胞外ドメイン が細胞接着分子と類似しているため、 特に興味深い。 その全構造は、 Ig 様ドメインとフイブロネクチン Π Τ型ドメインよりなる 150 kDaの細胞外 ドメイン F--サブュニットと、 ^貫通領域を持ち 2つのホスファターゼド メインよりなる 85 kDaの細胞内ドメインである P-サブユニット （ホス ファタ一ゼサブュニット、 配列番号： 1に示される） が細胞膜のすぐ外 側で非共有結合していることが明らかとなつている （第 1図参照）

(Streul i M. et aJ. ； EMBO J. , 1 1 , 897-907, 1992) 。 また、 LARは PTP 5や PTP σとともにサブファミリ一を構成し、 接着斑 （ィンテグリン による細胞外基質との接合部の周辺部分や adhe rens juncti on (力ドヘリ ンによる細胞同士の接着部位）に存在する （Serira-Pa_Ses， C. et ah ； EMBO J. , 14, 2827-2838, 1995、 Pul ido, R. e t al. ； Proc. Na t]. Acad. Sci. USA, 92, 11686-11690, 1995、 Kypta, R. M. et al. ； J. Cell Biol. , 134, 1519-1530, 1996、 Aicher, B. et a l. ； Cell Biol. , 138, 681-696, 1997) 。

現在までに LARの機能的な役割が数多く報告されている。 例えば、 LAR が欠损した神経細胞では二ュ一口トロフィンへの反応性が減少すること (Yang, T. et al. ； 27th Annual Meeti ng of the Society for Neuro science, New Orleans, Louisiana, USA, October 25 - 30， 1997,

Society for Neurosciencc Abstracts, 23, 1-2, 1997) , ショウジヨウ バエの LAR ホモログは、 主に神経系で発現し、 その欠損は連動神経の軸 索が神経束から分離するタイミングを遜らせること （Krueger, N. X. et al. ； Cell, 84, 611-622, 1996) . U\R酵素ドメインの遺伝子破壊で は乳腺発育の不良が認められること （Schaapveld, . Q. et al. ： Dev. Biol. , 188, 134-146, 1997) 、 LAR活性の抑制によりアポリポブロティ ン Bの分泌が減少すること （Phung, T. し et al. ； Biochemical and Biophysical Research Communications, 237 (2) , 367-371, 1997) また、 LARの発現が欠損することにより 脳; £底部のコリン作動性神経細胞のサ ィズが小さくなり、 海馬薪状回でのコリン作動性祌経支配が减少すろ (Yeo, T. T. at al. ； J. Neurosci. Res. , 47 (3) , 348-360, 1997)こ とが報告されている。 このように、 LARは生体內で様々な役割を担ってい ることが徐々に明らかになってきているが、 現在最も注目が集められて いる研究として、 LARとインスリン受容体との閲係がある （Hash imoto, N. et al. ； J. Bio l. hem. , 267 (20)， 13811-13814, 1992) ₀

1995年、 肥満者の脂肪組織において LARのチロシンホスファタ一ゼ活 性が異常に上昇しており、 これがインスリン抵抗性の発症原因として、 また、 心臓血管疾患の危険因子として考えられ、 注目されるべきである との発表が行われた （Ahmad， F. et nl. ； J. Clin. Invest, , 9ο {&) , 2806-2812, 1995) 。 以後、 LARがインスリン受容体と密接に閔与してい るという報告が次々になされている （Mooney, R. A. et aJ. ；

Biochemical and Biophysical Research Communications, 235 (3)， 709 -712, 1997, Orr, S. R. et al ； Biochemical Society Tra sactions, 25 (3) , 452S, 1997, Ahmad, F. et al. ； J. Clin. In ves Ligation, 100 (2) , 449-458, 1997, Ahmad, F. et al.； J. Biol. Chem. , 272 (1) , 448-457, 1997, Norris, . et al. ； Febs Letters, 415 (3) , 243- 248, 1997, Li, P. M. et al ； Cellular Signalling, 8 (7)， 467- 473， 1996) 。 そして、 これらの愔報に基づき、 S近 Ahmad, F. らのグル - -ブはし ARおよ Ό ΤΡ1Βがィンスリン抵抗性の治療ターゲットとなり得る 力 1もしれないと報告している （Ahmad, F. et al. ； Metabolism, Clinical and Experimental, 46 (10) , 1140—1145, 1997) 。

次に、 PTPのうち CD45は、 白血球共通抗原 （LCA)とも呼ばれ、 成熟赤血 球や血小板を除くすべての血液細胞 （白血球） およびその前駆細胞にお いて癸現される細胞表面抗原である。 CD45は分子量 l80~220 Daの受容体 型 PTPであり、 細胞内に 2つの酵素領域を持ち、 細胞外領域の N末端に近 い 3〜4個のェクソンの; レターナティブスプライシングにより、 S〜9種 類のアイソフォームが存在する （Saga.， Y. et al. ； Proc. Natl Acad, Sci. USA, 84, 5364-5368, 1987, Thmas, M- し. et al. ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5360-5363, 1987， Trowbridge, I. S. et al. ； Annu. Rev. Immunol. , 12, 85-116, 1994)。 スブライシングを受 けるこれらのェクソンでコードされるアミノ酸配列は、 セリン、 スレオ ニンおよびプロリンに富み、 ひヘリックスや 構造によるまとまった立 体構造はとりにくく、 また、 0"グリコシレ一シヨンを受ける部位を多数 含んでいる （Barclay, Λ. N. et al. ； EMBO J. , 6, 1259-1267, 1987〉。 従って、 アイソフォームの変化により、 細胞外領域の構造が大きく変わ り得るという特徴をもっている。 また、 0)45の ¾現はリンパ球で卨く、 細胞 ¾や細胞の活性化状態によって固有のアイソマ一が可逆的に発現さ れる (Thomas, M. し et al. ； Annu. Rev. Immunol. , 7， 339-369, 1989, Charbonneau, H. eL al. ； Annu. Rev. Cel l. Biol. , 8, 102- 493, 1992, Trowbridge, I. S. et al. ； Αηηυ. Rev. Immunol. , 】2,

85-116, 1994)。 また、 オルターナティブな構造と膜莨通部位に挟まれた 領域の配列はシスティンを多く含み、 ジスルフィ ド結合によって安定化 された構造を形成している （Thomas, M. L. et al. ； Cell, 41 , 83-93,

1985, Trowbridge, I. S. et al. ； J, Bio). Chem. , 266, 23517- 23520, 1991 , Trowbri dge, I. S. et al. ； Riochi . Biophys. Acta,

1095， 46-56, 1991)。

CD45の発現が消失した T細胞変異株では、 その細胞が本来有していた抗 原特異的応答能が顕荖に低下することが知られており、 T細胞レセプター (T R)を介した T細胞の活性化と機能発現に CD45が極めて重要であること 力 ί示唆されてレヽる (Charbonneau, H, et al. ； Annu. Rev. Immunol. , 7, 339-369, 1989, Pingel, J. T. et al. ； Cell, 58， J 055-1065, 1989, Trowbridge, I. et al. ： Annu. Rev. Immunol. , 12, 85-1 16, 1994, oretzky, G. A. et al. ; Na ture, 346, 66-68, 1990,

Korctzky, G. Λ- et al. ； Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88, 2037- 2041, 1991, Weaver, C. T. et a h ； Mo l. Cell Biol. , 11， 415-

4422, 1991) ₀ また、 TCR/CD3複合体を介した T細胞のシグナル伝達機構 において、 CD45はコ ' レセプターである 0)4、 CD8の細胞内ドメインに結 合している Srcフアミリーのチロシンキナーゼ （PTK)である Lck (p56 ' ° ^k ) や Fyn (p56 ^f ' ^{n T})の活性化に関与していることも示唆されている

(Trowbridge, ΐ. S. et al. ； Annu. Rev. Immunol. , 12, 85-116, 1994, Penninger, J. M. et al. ； Immunol. Rev. , 135, 183-214, 1"³)。 CM5はし ckや Fynの C末端に位 f する負の調節部位のチロシン残基 を脱リン酸化し、 その結果、 し ckや Fynが自己リン酸化して活性 となり， シグナルが伝達されると考えられている （Penninger, J. M. et al. ； Imrnuno. Rev.， 135, 183-214, 1993, Ledbetter, J. A. et sゾ- ：

Curr. Op in. Immunol. , 5, 334-340, 1993, Janeway, C. A. Jr. ；

A . Rev. Immunol. , 10， 645—674， 1992, Cahir, McFarland, E. D. et al. ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90， 1402—1406， 1993, Hurley, T. R, et al. ： Mol. Cell Biol. , 13, 1651-1656, 1993, Sieh, . et al. EMBO J. , 12, 315-32) , 1993, Weiss, A. et a l.； Cell, 76, 263-274, 1994, Chan, A. C. et al. ； Annu. Rev. Immunol. , 】.2，

555-592, 1994)。 インスリン反応性ミエ口一マ細胞のうち、 CIM5欠損株 を用いた実験により、 CD45発現株と比較して、 インスリン刺激によるィ ンスリン受容体の自己リン酸 ί匕、 IKS- 1のチロシンリン酸化、 ΡΙ3キナー ゼの活性化および MAPキナーゼの活性化がすべて 3倍に増強したという報 ^ ( ulas, D. ΐ. et al. ; J. Biol. Chem. , 271, 755-760, 1996) よ り、 CIM5は LARと同様インスリンの负の跼節因子であると考えられる。 さ らに、 CD45欠损細胞の反応性は、 CD45の細胞内餛域だけをもつ分子の発 現により回復することが次の実験から明らかにされている。 すなわち、 CD45の細胞内領域だけを細菌， またはバキユウロウィルスの系で発現さ せてもチ πシンホスファタ一ゼの酵素活性が充分に観察されること

(Ostergaard, H. し et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8959-8963, 1989, Streuli, . ct al. ； Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, 8698-8702, 1989)、 また、 OM5陰性 T細胞ク o—ンに CD45の細 胞内領域をトランスフエク トするだけで抗原レセプタ一を介するシグナ ノレが回復すること （Volarevic, S. ct al ； Science, 260, 541-544,

1993, Hovis, R. R. et al. ； Science, 260, 544-546, 1993, Desai, I t

D. M. et al. ； Cel l, 73， 541-554, 1993)などである。

一方、 li細胞においても、 初期シグナルの伝達のみならず、 最終的な増 ¾\ またはアポト一シスに至る過程も、 CD45の ¾現によつて調節されて いることが、 O Sを発現していない形質細胞種 （Justcmen t, し， B, et al. ； cience, 252, 1839-1842, 1991 ) , または未熟 B細胞株から樹立し た CD45陰性クロ一ンを用いた実験 （Ogimoto, M. et al. ； Int.

Tmmunol. , 6, 647-654, 1994)から示された。 これらの結果は、 CD45が抗 原レセブターを介するシグナル伝逑に不可欠な役割を担っている分— fで あることを示唆している _u

現在までの および CD45等の PTPに関する研究より、 細胞内情報伝達 系にお/、て PTPが PTKと共役して極めて重要な役割を つていることが明 らかにされつつある。

1992年に Streuliらのグループによって、 LARの E-サブュニッ卜と P-サ ブュニットの結合が非共有結合のため解離し、 E-サブュニッ卜が細胞膜 表面から外れることが明らかにされた （Streul i , M. et al. ； EMBO J. , 11 , 3, 897-907, 1992) _u しかしながら、 多くの研究者は、 LARの細胞外 ドメインである サブュニットに対するポリク口ーナル抗体もしくはモ ノクローナル抗体を使用して搽々な研究を行ってきたため、 単独でもホ スファタ一ゼ活性を有する P-サブュニットは全く無視されていた。 例え ば、 LARのホスファターゼ活性測定を意図したし AR抗体の使用において、 P-サブュニッ 卜に対する抗体を用いなければ全体としてのホスファタ一 ゼ活性が測定できなレ、。 また、 LARフアミリ一の細胞外ドメインには mRNAのスプライシングの違いでいくつかのアイソフォームが存在してお り （Krueger, N. X. et al. ； Cell, 84， 611-622, 1996、 Mizuno, K. et al. ； Mol. Cell Biol. , 13, 5513-5523, 1993、 Ogata, M. et al.

； J. Immunol. , 153, 4478-4487, 1994) 、 細胞外ドメインに対する抗体 を用いると、 各々のァイソフォームに対し、 特異件:が異なってしまう。 本発明者らは、 これらの状況に鑑み、 PTPの細胞内ドメインに対する抗体 の作製に着手した。

また、 従来 CD45抗体については、 T200または B220などの異なる分子量 を有する CD45ァイソフォームのいずれにも反応性を示す抗体と、 特定の 限定されたアインフォームにのみ反応性を示す抗体を ^別し、 後者を CD45R (restricted)抗体として記述することが行われてきた (McMichael, A. j. ； In Leucocyte Typing . Oxford University Press, O ford, 1987) ₀ しカゝし、 CD45の細胞外ドメインの栴造の多様性が明らかにされ るに伴い、 CD45R抗体の特異性を分類する必要が生じている _n Streul iら は cDNAのトランスフエクタントを用いる方法によって、 既に知られてい るヒ ト CD45抗体の分類を行い、 オルタ一ナティブェキソン 4、 5、 6に依存 する構造を認識する抗体をそれぞれ CD45 A、 CD45RB, CD45RCと ¾述する ことを提唱した （Streul i, M. et al. ； 】. Immunol. , 】41, 3910-3914, 1988)。 同様の方法で Johnsonらもマウスの CD45抗体の分類を報告した (Johnson, P. et a]. ； J. Exp. Med. , 169, U 79-1184, 1989〉。

なお、 既知の PTPに対する抗体としては、 CD45の膜貫通 （TM) 領域から ホスファターゼドメイン 1の一部に至る 196ァミノ酸残 のぺプチドを抗 原として調製された抗体 （TYansduetion Laboratories社製） および PTP αのホスファターゼドメイン 1 (2δ0アミノ酸残基） に対する抗体

(Transduction Laboratories社製) が知られている。 し力 iしながら， こ れらの抗体が LARや、 その他 PTPのホスファターゼドメインに対して如何 なる免疫特異性を有するか否かは不明である。 〔発明の開示〕

本発明は、 2種以ト-の ΡΐΡの細胞內ドメインに対して特異性を有する抗 体、 特に少なくとも 1種以上の受.？？体型 PTPの細胞內ドメィンに対して特 異性を有する抗体を提供することを目的とする。 特に、 本 明の抗体は、 LARおよび Zまたは CD45、 好ましくはし AR及び CD45の双方の細胞内ドメイ ンに対して特異性を有する抗体を提供するものである。 かかる抗体は、 特に PTPのホスファタ一ゼドメインに対して特異性を有するものが好まし い。

前記抗体は、 配列番号： 1で示される塩基配列によってコードされる、 LARの サブュニットに相当すろポリぺプチドまたはその断片を抗原とし て調製されるものが好ましく、 また免疫特異性の点からモノクローナル 抗体であるとよい。

そして、 係る抗体は、 プロテインチロシンホスファタ一ゼドメインと その他のタンパク質またはポリペプチドとを含む融合タンパク質を免疫 原として用いることによって調製することができる。 係る融合タンパク 質を構成するブロテインチ口シンホスファタ一ゼドメインとしては LARホ スファタ一ゼドメインが好ましく、 その他のタンパク質またはボリぺプ チドとして、 特に GST (グルタチオン- S-卜ランスフェラーゼ） が好適で あるが、 他にも、 ポリヒスチジン （好ましくは⁶個のヒスチジン） 、 力 ルモジュリン結合ペプチド （CBP) 、 プロテイン A等を用いてもよい。 尚、 ポリヒスチジンを用いた場合、 遺伝子組換え法にて発現させた融 合タンパク質を単離精製するためには、 ニッケルキレーティング樹脂へ の吸着を利用することができ . pH変動の他. EDTAまたはィミダゾ一ル物 質を添加することによって当該樹脂から解離することができる。 CBPを用 いた場合、 発現させた融合タンパク質はカルモジュリンァフィニティ一 樹脂を用いてァフィ二ティ一ク czマトグラフィーを行い、 その後 EGTAを 加えることにより当該樹脂から解離することができる。 また、 プロティ ン Aを用いた場合、 発現させた融合タンパク質は丄 gGセファロース （例え H ば、 TgGセファロース 6FF) カラムを使用したァフィユティークロマトグ ラフィ一を行レ、、 その後 pH変動によつて当該樹脂から解離することがで さる _u

さらに前記融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリぺプチド 断片の別の例として、 Xpress、 Thioredoxin, c - myc、 V5および! ΙΑ/c - myc 等を挙げることができ、 これらをェピトープとして認識することができ る抗体を用いて、 目的とする LARホスファタ一ゼドメインとの融合タンパ ク質を発現しだ後に抗原一抗体ァフィニティーカラムにより単離-精製 することができる。

した、 好ましレ、免疫原である GSTと LARホスファターゼドメインと を含む融合タンパク質は、 GSTをコ一ドする遗伝チ領域およ IRAKのホス ファターゼドメインをコードする遗伝子領域を含む癸現べクタ一を形質 換またはトランスフエク 卜した大腸菌を、 2 0〜3 0 °Cにて 1 6〜2 4時 PP1、 特に好ましくは、 2 3〜 2 5 °Cにて 1 8時問培養し、 その培養 液および または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適 に製造することができる。 さらにこうして得られた融合タンパク質は、 グノレタチオンを有する担体、 例えば、 グルタチオンセファロースビーズ へのァフィ二ティーによって精製されたものであるとよく、 ¾該グルタ チオンセファロースビーズからの融合タンパク質の溶出は、 界面活性剤 の存在下に煮沸することによって奚施すればよい。 この界面活性剤とし ては、 ドデシル硫酸ナトリウム， CHAPS (硫酸- 3- [ (3-コールアミ ドプロ ピル）ジメチルアンモェォ ]-1-プロパン） 、 デォキシコ一ル酸、 ジギト ニン、 n -ドデシルマルトシド （1-0~π-ドデシル- ダルコピラノシ ル（1-4) α -!)-グルコビラノシド） 、 ノニデッ ト （商品名） Ρ40 (ェチルフ エノールポリ（エチレングリコールエーテル） η) 、 η—ォクチルグルコシ ド （1- 0- η-ォクチル- β -D -ダルコピラノシド） 、 モノラウリル酸シュク 口 - -ス、 テシッ ト （商品名、 ドデシルポリ （ェリ レングリコ一ルェ一テ ル） n) 、 トリ トン （商品名） X— 1 0 ϋ (ォクチルフヱノールポリ（ェ チレン-グリコールェ一テル) ri) 、 ツイーン （商品名） 2 0 (ポリ（ォキ シエチレン） _η-ンルビタン-モノラゥレ一トレ一ト） 、 Ν-ドデシル- Ν, Ν -ジ メチル -3-アンモニォ -1-プロパンスルフォネート [以上、 いずれも πは 1以上の整数を表す] 等が挙げられろ。 融台タンパク質を¾出させる場 合に、 これらの界面活性剤を勅物に投与しても問題にならない濃度. 好 ましくは、 ϋ . 1 %のドデシル硫酸ナトリウムの存在下、 丄 o o :にて

5 1 0分問煮沸する。 こうして、 的の免疫原として好ましい精製さ れた融合タンパク質を得ることができる。

このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体 を取^する場合、 抗体のスクリーニングにはプロテインチロシンホスフ ァタ一ゼドメイン、 好ましくはし ARホスファターゼドメインを用いてもよ レ、が、 免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニングを夷施する ことが還机性の点で好ましレ、。

本発月のモノク ーナル抗体として、 マウス Zマウスのハイプリ ドー マにより産生される、 LAKおよび CD45のホスファタ一ゼサブュニットの細 胞內ドメインに対して特異性を有するモノク口 -ナル抗体が挙げられる。 この抗体として、 例えば、 SDS-PAGE上の ¾かけの分^量が約 146 kDaであ るモノクローナル抗体がある。 かかる抗体は、 インスリンのシグナル伝 機構のさらなる解明のためのツールとして、 またインスリン抵抗性お よび NIDDMに有用な診断方法を開発し、 さらにィンスリン抵抗性を基盤 とするシンドローム Xの種々の病態の予防、 治療、 診断^に応用できる。 本発明によってさらに、 前記モノク ο—ナル抗体を生溼するハイブリ ドーマ細胞系が提供される。 このハイブリ ド一マ細胞系として、 本癸明 者によって 1 9 9 8年 5月 7日に日本国茨城県つくば市束丄丁目 ] _番 3 •S "に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された、 受^番号 が FBRM BP— 6344であるマウス Zマウスハイブリ ドーマ細胞系 YU2が举げ られる。

木発明の抗体は、 天然産物由来または全体もしくは部分合成 （化学合 成、 遗伝子組換えによる合成等） された、 PTPタンパク質ならびに少なく とも PTPの細胞内ドメインの一部 （ 3ァミノ酸残基以上、 好ましくは 5ァ ミノ酸残基以上） を含む断片およびポリペプチド （以下、 この断片およ びポリペプチドを総称して 「PTP由来分子」 と称する） に対して特異的な 免疫反応性を有する。

さらに本発明は、 2稗以上のブロテインチ口シンホスファターゼサブ ュニットに対して特異性を有する抗体の調製方法であって、 免疫原とし て前記したようなブロティンチコシンホスファタ—ゼドメインとその他 のタンパク質またはポリぺプチド断片とを^む融合タンパク質、 好まし くは GST -し ARホスファタ - -ゼドメィン融 タンパク質を用いることを特徴 とする方法を提供するものである。 ここで、 GST以外に使用 能な、 融合 タンパク質を構成するタンパク質またはポリぺプチド断片. その融合タ ンパク質の精製方法は、 前記したとおりである c

また、 好ましい免疫原である GSTとし ARホスファタ一ゼドメインとを含 む融合タンパク質は、 GSTをコ一ドする遗伝子領域および LARのホスファ クーゼドメィンをコードする遣伝子領域を含む努現ベクターを形質転換 またはトランスフエク トした大腸菌を、 2 0〜3 0 °Cにて 1 6〜2 4時 間、 特に好ましくは、 2 3〜 2 5でにて 1 8 間培養し、 その培養液お よび Ζまたは菌体から融合タンパク質を単離することによって好適に製 造することができる _u さらにこうして得られた融合タンパク質は、 グル タチオンを^する担体、 例えば、 グルタチオンセファロースビーズへの ァフィ -ティーによって精製されたものであるとよく、 当該グルタチォ ンセファロ一スビーズからの融合タンパク質の溶出は、 界面活性剤の存 在下に煮沸することによつて実施すればよいことも前述のとおりであり、 融合タンパク質を溶出させる場合に、 これらの界面活性剤を動物に投与 しても問題にならない濃度、 好ましくは、 0 · ]. %のドデシル硫酸ナト リウムの存在！ ^、 1 0 0 °Cにて 5〜1 0分問煮沸する。 こうして、 目的 の免疫原として好ましい精製された融合タンパク質を得ることができる。 このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体 を調製する方法において、 抗体のスクリーニングには、 プロテインチロ シンホスファターゼドメイン、 好ましくは LARホスファタ一ゼドメインを 用いてもよいが、 免疫原として用いた融合タンパク質でスクリーニング を突施することが S択性の点で好ましい。

また、 木発明によって、 新規 PTPを単離するための方法であって、 PTP をスクリーニングする工程を含み、 当該スクリーニングェ ¾において如 上の抗体が使用されることを特徴とする方法が提供される。 前記スクリ —二ングとして、 cDNAライブラリーの発現スクリーニングが企図される。 本発明の別の特徴において、 PTPおよび/または FTP由来分 の定 S方 法が提供される。 この方法では、 如上の抗体を使用して、 被検試料中に 含まれる PTPのタンパク質、 および または少なくとも PTPの細胞内ドメ インの--部を含む断片もしくはポリべプチドの量が測定される。 この方 法において、 前記抗体が、 ィムノブロッテイング、 免疫沈降または F丄 IS Aのいずれかにおいて使用されることが好ましい。

本発明のさらなる特徴において、 如上の抗体を用いて被検試枓中に含 まれる PTPのタンパク質、 および Zまたは少なくとも PTPの細胞內ドメイ ンの一部を含む断片もしくはポリぺプチドを単離し、 単離されたタンパ ク質、 断片またはボリぺプチドの活性を測定する工程:を含む PTPおよび/ まだは FTP由来分子の活性を定量するための方法が提供される。 この単離 工程において、 記抗体を結合させた担体によるァフィ二ティ一クロマ トグラフィ一おょぴノまたは免疫沈降が好適に用いられる。

さらに本発明は、 PTPおよび/または PTP由来分子を生産するための方 法であって、 如上の抗体を用いて PTPのタンパク質、 および/または少な くとも PTPの細胞內ドメインの一部を含む断片もしくはポリぺプチドを^ 離する工程を含む方法を提供する。 この単離工程において、 前記抗体を 結合させた抅体によるァフィ二ティークロマトグラフィーおよび Zまた は免疫沈降が好適に用いられろ。

また、 本発明でさらに企図されるのは、 PTPおよび/または PTP由来分 子の組織内における存在を確認するための方法であり、 この方法にぉレ、 て、 如 liの抗体を用いて免疫組織学的検^が行われる。 免疫組織学的検 査には、 例えば、 標識抗体を用いた " ίϋ^疫組織染色などの技術が採 用され、 ΡΤΡのタンパク質、 および Ζまたは少なくとも ΡΤΡの細胞内ドメ インの --部を含む断片もしくはポリぺプチドの検出を行う。

尚、 本発明者らは、 LARに対して特異的な免疫反応性を有するモノクロ —ナル抗体が、 甲状腺癌細胞を特異的に認識することを確認している。 従って、 本発明の上記抗体は、 甲状腺癌の診断、 治療等に有用であると 考えられる。

〔図面の簡^な説明〕

第 1図は、 LARのサブユニット構造を示す模式 0¾ (a)、 および実験例に て調製した の膜內ホスファターゼドメイン構造の変異体を示す模式図 (b)である。

第 2図は、 LAR C/Sとインスリンレセプター （IR) の野生型とをコトラ ンスフ-ク トした COS細胞において、 インスリン刺激により誘導されるチ 口シンリン酸化の時間経過を示すィムノブロットを表す囡である。

第 3図は、 LARの野生型または変異体とインスリンレセプターの野生型 /JP 9/03656

19 とをコトランスフユクトした COS細胞における、 リン酸化一脱リン酸化を 示すィムノブロットを表す図である。

第 4図は、 LARの野生型または変異体によるインスリンレセプタ一) 3鎮 の脱リン酸化を示すィムノブロットを Sす図である。

第 5図は、 インスリンレセプターの野生型または変異型と LAR C/Sとを コトランスフエクトした COS細胞におけるチロシンリン酸化を示すィムノ ブロットを表す ¾である。

第 6図は、 本 明の抗体 YU2の分子量を示す、 SDS—ポリアクリルアミ ドゲルを表す図である。

第 7図は、 本究明の抗体 YU2の LARに対する免疫特異性を示すィムノブ 口ットを表す図である。

第 8図は、 本発明の抗体 YU2を用いた、 CD45についてのィムノブロッテ イングによる分析結果を示す図である _u

第 9図は、 LARと CD45の細胞内ドメィンのァミノ酸配列の相同性を示す 図である。

第 1 0図は、 ィンスリンレセプタ- -および LA1 5;¾与-する、 リン酸化お よび脱リン酸化によって制御されるインスリンのシグナル伝達のカスケ —ドを示す校式図である。 〔発 を実施するための最良の形態〕

[実験例 1 ] LAR変異体によるィンスリンレセプターのチ シンリン酸化、 ならびに LARとインスリンレセブターとの^合に尸1する検討

先ず、 LARによるィンスリンのシグナル伝達制御メ力二ズムを明らかに するために、 LARの PT? メィンの触媒活性中心に存在するシスティンを セリンに変換することにより作製した、 変異型 LAKを用いるというスト ラテジーにより解析を進めた。 a . LAR. およびインスリンレセプタ一の発現ベクター

LAR発現べクタ一として、 （a) LAR WT： ヒ ト野生型 LAK (配列番号： 3 ) 、 （b)し AR C/S： LAR-PTPドメイン 1の活性中心にあるシスティン （配 列番号： 3のァミノ酸第 1522位） を、 配列番 ¾"： 3のヌクレオチド第 49 83位の Gを Cに置換することによりセリンへと変換しだもの ， ならびに (c) LAR DC/S： LAR C/Sにおける変異に加えて、 さらにし AR - ΡΪΡドメイン 2のシスティン （配列番号： 3のアミノ酸第 1 ³位） を、 δ己列番号： 3 のヌクレオチド第⁵ 6位の Gを Cに置換することによりセリンへと変換し たものの 3種 （第 1図（b)参照） を、 pMT発現ベクターに組み込んだもの (Streul i M. e t al, , FMO J. , 11， 897-907, 1992および StreuH M. et al. , EMBO J. , 9, 2399-2407, 1990を参照） を用いだ _c

—方、 ィンスリンレセプターの癸現べクターは、 （a) IR WT：野生型、 および (b) IR 1018M：野生型のィノスリンレセプターの ATP結合部位の、 ^】018位のリジンをメチォニンに変換してチロシンキナーゼ活性を欠失 させたインスリンレセブター変異型の 2種類の cDNAを、 SR aプロモータ —の下流に組み込んた 'もの （Kanai F. et al. , Biochemical

Biophysical Research Communication, 195, 762-768, 1993¾r R?.) を 用いた。

b · COS-7細胞へのトランスフエクシヨン

COS - 7細胞を 1. O X 10^s 細胞数 /8 mL/90 φディッシュとなるように 10% 牛胎児血消添加 PMI 1640培地 （日水製薬株式会社） に播種して 16時間 培赛を行った後、 LAR C/Sと IR WTの発現ベクターを DEAE -デキストラン 法を用いて C0S-7細胞にコトランスフエクシヨンした。 用いた LAR C/Sは、 前記① (b)に記載のとおりに変異させることにより、 In vi trcT チ口シン ホスファターゼ活性が完全に欠失していろことが明らかにされている (Streul i M. et al. , EMBO J. , 9， 2399-2407, 〗990) ものである。 コトランスフエクシヨンは、 以下の手順に従って行った。 先ず 2°/o FCS を含有する RPMI 1640培赛液 （グルタミン 0. 3 gおよびカナマイシ ン 0. 1 gを含む、 KPMI 1⁶⁴0 -地 （日水製薬株式会社） 10. 2 g/L 10% NaHC0₃で pH 7. 4に調整） 4 ml に、 の 10 mM クロ口キンを加え た _u この溶液 2 ml に， LAR発現ベクター⁵ および IR癸現ベクター 1 ^ 3をカ[1ぇ、 残りの溶液 2 ml には】 6 】 の 100 mg/ml DEAR-デキストラ ンを加えた。 次いで双方の溶液をよく投拌混合した。 こうして調製した 発現ベクター溶液 3. 75 ml を、 1. 0 X 10⁸ 細胞数 /8 ml/ディッシュ とな るように播種し， 37。C、 5%CC)₂インキュベータ一内で 16時間前培養し ておいた COS - 7細胞に加えた。 前培養と同様の条件で 4時間培養した後 に 10% DMS0溶液で 2 5》間処理し、 PBS (137 inM NaCl、 2. 7 m KC1、 4. 3 mM Na₂HPC ' 12H₂0、 1. mM KH^POj で洗浄後、 10% FCS をき有す る PMI 1640 を 8 ml 加え、 37。C、 5% C0_Z に調整したインキュベータ 一内で 48時間培養した。

c . インスリン刺激と細胞溶解液調製

トランスフエクション終了後の C0S-7細胞を fill清無添加 RPMI 1⁶40培養 液中で 16時間培整し、 1CT ' Mインスリン （生化学丁-業社製） で一定時問、 すなわち、 0、 5、 】5および 30分間の刺激を行った。 但し 0分刺激と は、 インスリン刺激を行ったが、 氷上に放置し、 37 でインキュベート しなかったものである。 ィンシュリン刺激開始より各時間経過後に、 培 養液をすベて吸い取り、 Kちに PBS w/Inh. (チロシンホスファターゼィ ンヒビタ一含有 PBS： I mMバナジウム酸ナトリウム、 5 mM フッ化ナトリ ゥム、 δ mM ピロリン酸ナトリゥム、 5 mM EDTA · 2Na、 137 mM NaCl、 2. 7 mM KC]、 4- 3 mM Na₂HP0, · 12HiO, 1. 4 mM KH₂P0. ) を 5 ml 加えた。

PBS w/Inh,で細胞全体を冼浄してから液体を吸引除去し、 細胞に溶解用 バッファー （1% Nonidct P-40、 150 mM NaCl、 50 mM Tris-HCl „

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(pH7. 4)、 5 mM EDTA, 10 m ョ一ドアセタミ ド、 10 mMフッ化ナトリウ ム、 10 mM ピロリン酸ナトリウム、 0. 4 mM バナジウム酸ナトリウム、 0. 1 mM酸化フエニルアルシン、 1 mM ベンズアミジン、 1 mM フッ化フエ 二ルメチルスルホニル） を bn】 加え、 セルスクレイパーを用いて細胞を 锒めた。 この細胞懸淘液を 1. 5 mlチューブに移し 4 で 30分問イン キュベ一トすることにより、 細胞を完全に溶解させた。 インキュベート 後の液体を】 2， 000 rpm, でにて 10分問遠心分離して得られた上淸を、 細胞溶解液として以 の実験に用いた。

d . 免疫沈降

前節 c . で得られた細胞溶解液につき、 抗し AR Ε-サブュ-ット抗体

(7. 5 μ gの I I. 1Aと 7. 5 μ gの 753. Αとの混合物 (Streul i . et al. , ΕΜΒΟ J. , 11, 897-907, 1992参照） を用いた免疾沈降を行った。 前記細 胞溶解液 1 ml に対してモックとして MOPC 21 (マウス IgG ： Sigma社 製） を 15 ju g加え、 4でで 1 時問インキュベート後， " - h ind (GammaBin d Plus Scpharose： Pharmacia Biotech社製） 20 // 1をカ[1ぇ、 さらに 4 で 1 時問インキュベートすることにより前吸収を行った。 4 ；、 12, 000 rpmにて 10 分問遠心分離を行い、 淸 0 /z】を別のチューブに移 した。 抗 LAR E -サブュニット抗体を 15 g加え、 4 tで 1 時間インキュ ベ一ト後、 y -bind を 20 μ 1加え、 さらに 4 で 1 時問インキュベート した。 12, 000 rpm、 4 ；にて 10 分間遠心分離後、 沈査を 1 ml 溶解用バ ッファーで 2回、 PBS w/Inh.で〗 回洗浄し、 20 μ 1 の SDSサンプルパッフ ァ一に懸濁した。 これを沸滕水中で 5分加熱し、 泳動用の検体とし た。

_e . ィムノブ口ッティング

上記検体を 7, 5% SDS-ポリアクリルアミ ドゲルを用いて 泳動した 後、 トランスファー装 gを用いて 400 mAで 4時問二トロセルロース膜 2

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(Schl eicher & Schuel l) に転写した。 ：：の膜を³⁰ /o ゥシ 淸アルブミ ン溶液中において室温で 30 分間以上インキュベートすることによりブ ロッキングを行つだ。 充分量の TBS_T (Tween ²0含有 TBS：〖0 mM Tris- HC1 (pH7. 4)、 150 m NaCl , 0. 1 % Tween 20) で 10 分問、 2回以上洗 浄後、 TBS-T で 50， 000倍に希积した抗リン酸化チロシン抗体 G10、

UBi社） 、 抗 LAK E-サブュニット抗体または抗ィノスリンレセプター β鎖 抗体 （UBI社） を加え， 室温において 1 時問振 した。 充分 ¾の TBS-T で 5分間、 3回以上洗浄後、 HRP捺識抗マウス IgG抗体 （西洋ヮサビペル ォキシダーゼ摞識抗マウス IgG： Santa Cruz Biotechnology^:製）

1. 5 ml を含む TBS- T溶液を 15 m) 加え、 室温において 1 時問振盪した。 充分量の TBS-T で 5 分間、 3回以上洗浄後、 発光試薬セット （和光純薬 工業株式会社製） を用いてケミルミネッセンス法により、 各抗体と結合 する蛋白質のバンドを検出した _u このように、 LAR C/Sと 訂を C0S-7細胞にコトランスフエクシヨンし、 ィンスリンで一定時間刺激した後に作製した細胞溶解液を抗 LAR E -サブ ュニシト抗体で免疫沈降後、 抗リン酸化チコシン抗体でィムノブロッテ イングを行ったところ、 インスリン刺激 ）分でインスリンレセブタ一/3 鎖のチロシンリン酸化および 85 ld)a蛋白質のチ C2シンリン酸化が認めら れた。 これらのチロシンリン酸化は、 インスリン刺激後 30分においても 持続して認められた （第 2図 Λ参照） 。

また、 抗 LAR E-サブュ-ット抗体 （第 2 1¾| B ) 、 抗インスリンレセブ ター 3鎖抗体 （第 2図 C ) および抗リン酸化チロシン抗体 （第 2図 A) を用いたィムノブ口ッティングの結果、 LARとインスリンレセプターがィ ンスリンレセプターのチロシンリン酸化の有無により会合することも明 らかとなつた。 JJI験例 2 ] 稗々の LARによろィンスリンレセプターのチロシン脱リン酸 化の検討 （1 )

次に、 I-AR訂、 LAR C/Sおよび LAR DC/Sと IR WTを用いて同様に COS - 7細胞にコ トランスフエクシヨンし， インスリンで 5分間刺激後、 抗

LAR E-サブュニット抗体で免疫沈降し、 沈降物について各種抗体を用い たィムノブ ッティングを った。 その結果、 インスリンレセプターと WTをコトランスフエクシヨンしたものは LAR C/Sや LAR DC/Sをコト ランスフエクシヨンしたものと比べると、 インスリンレセプタ一)3鎖や 85 kDa蛋白質のチコシンリン酸化はほとんど検出されなかった （第 3図 Λ参照） 。

また、 この実験において LAR (第 3図 C ) やインスリンレセプタ一 (第 3図 D) の発現 ¾は、 それぞれのトランスフエクタントにおいてほ ぼ同- -であったことより、 LAR WTはインスリンレセプタ一 や 85 kDa虔 0質のリン酸化チロシンを脱リン酸化することが示された。

また， 抗 LAR Ε-サブュ-ット抗体による免疫沈降物を抗ィンスリンレ セブタ一 β鎖抗体でィムノブロッテイングしたところ、 LAR DC/Sをコト ランスフエクシヨンしたものでは LAR WTや LAR C/Sをコ トランスフエク ションしたものに比較すると、 インスリンレセプタ一 0鎖のバンドが明 らかに弱かった （第 3図 Β )。

この結果は， LAR訂や LAR C/Sに比べて、 LAR DC/Sとインスリンレセ プターの会合が弱いことを示すものである。 ΙΑΚ C/Sと LAR DCZSの違い は、 ホスファタ一ゼドメイン 2の 1813番目のアミノ酸のみであること力 ら、 チロシンホスファターゼ活性を示さず £-質との結合に間与すると推 測されてきたこのドメイン 2が， LAKとインスリンレセブターとの結合に 機能していることが明らかとなった。 [実験例 3 1 種々の LARによるインスリンレセブターのチロシン脱リン酸 化の検討 ( 2 )

さらに、 インスリンレセプターのチロシン脱リン酸化が Κに結合した もののみであるのか、 またはィンスリンレセブタ—全てで確認されるの かを検討するために、 このコトランスフエクタントの細胞溶解液を電気 泳動後、 抗リン酸化チ シン抗体でィムノブロッテイングを行った e そ の結果、 LAR WTを導入したもののみ、 インスリンレセブターのチロシン 脱リン酸化が顕著に認められだ （第 4図参照） 。

「； j 験例 4 ] LAR C/S存在下でのインスリンレセプターのチロシンリン酸 化の検討

次に、 85 kDa蛋白質のチロシンリン酸化がインスリンレセプターのチ 口シンキナーゼ活性によるものであるかを明らかにするため、 LAR C/Sと TR町またはインスリンレセプタ一のチロシンキナーゼ活性を欠失させた TR K1018M (IR T) を C0S-7細胞にコトランスフエクシヨンした。 5分間 ィンスリン刺激を行った後、 抗 I-AK E-サブュニット抗体で免疫沈降し、 抗リン酸化チコシン抗体でィムノブロッテイングを行った （第 5図照） c その結果、 IR WTとコトランスフエクシヨンしたものではインスリン刺激 によりインスリンレセブタ一 β鎖および 85 kDa蛋白質のチロシンリン酸 化が認められたが、 IR K1018Mとコトランスフエクシ 3ンしたものではこ れらのリン酸化が全く認められなかった。

以上の結果より、 インスリンがィンスリンレセブターに結合するとィ ンスリンレセプターの 0鎮の速やかなチ口シンリン酸化が起こり、 さら にインスリンレセプターチ口シンキナーゼが お IcDa蛋白質のチロシンリ ン酸化を引き起こすことが明らかとなった。 26 従って、 この 85 kl a蛋白質は、 インスリンレセプタ一と結合している ことが確認された LARの P -サブュニットである可能性が考えられた。

[実施 l l ] 抗チ口シンホスファターゼ P-サブュ-ット抗体の作製 以下の手順に従って、 抗チロシンホスファタ一ゼ P-サブユニットの抗 体を作製した。

a . 免疫原の調製

免疫原として、 グルタチオン- S-トランスフェラーゼ- LAR融合蛋白質 (GST-LAR) を用いることとした。 LAR P -サブュニットの細胞腠莨通部分 の終^より細胞質側すべてにあたる 607 アミノ酸に相当する cDNA (配列 番 1、 3467 基対） を pGEX-2Tベクタ一 （Pharmacia Bio tech社製） の BamHI/EcoRTサイトに組み込んだ発現ベクターを用いて、 常法に従い li. col i AD202 を形質転換した。 この大腺菌を Lli (Amp. +) 寒天培地 (ァガー 7. 5 gを含む後述の LB (Amp. +) 培地） で一晚 茶した後、 シン グルコロニ一を LB (Amp. +) 培地 （トリプトン 10 g /し 酵 エキス 5 g/L、 NaCl 5 g/ 5 N NaOH 0. 2 ml /し アンピシリンを 50 μ § I ml含 有） 50 m】 に接 ¾し、 さらに--晚培赛した。 これを LB (Amp. +) 培地 500 mlに接禅し、 37。C で 600 nmにおける吸光度が約 1. 0 になるまで 1 赛し、 1 M IPTG (イソプロピル- 0 -D (_) -チォガラクトビラノシド， 和 光純薬工業社製） 50 μ 1 を加え、 25°C で一晚培養した。 この培養物を 3, 000 r_Pm、 4¾： で 15 分間遠心分離し、 沈澱した菌体を NETN (0. δ % Nonidet P-40 , 1 mM EDTA、 20 mM Tris-HCl pH 8. 0、 100 m NaCl) 50 ml に懸濁させた。 その後、 1 分問 超音波処理、 氷上 1 分間の操作 を 2 回繰り返し、 14, 000 rpm、 で 20分問遠心分離して上淸を得た。 この大腸菌溶解液 10 ml に グルタチオンセファロースビーズ懸濁液

(Glutathione Seoharose 4B (Pharmacia BiotechH:製） を NETNで 3回洗 2

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27 浄し、 50 %ΝΕΐ應濁液として調製） を 100 1 加え、 室温で 30分間ィ ンキュペートした。 得られた懸濁液を 3, 000 rpm, 4¾ で 5 分問遠心分離 し、 上淸を取り除いた。 沈殿したグルタチオンセファロ—スビーズを NETNで 2 回、 PBSで 1 0 洗浄し、 SDS sampl eバッファー （125 m Tri s-HCl H 6. 8 , 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウム、 5 % 2-メルカプトェ タノール） を 100 μ 1加え、 沸膾水中で 10 分間加熱して GST-し AR融合蛋 白質を溶出した。 ビーズを除いた溶出液を、 Centri con-10 (アミコンネ： h 製） に移し、 3, 000 rpm, 45分間、 4^rC で遠心濃縮した。 緩衝化を目的 として 1 ml の PBSを加え、 ふたたび ³，000 rpm、 ⁴⁵分問、 4¾で遠心濃縮 した。 この緩衝化の操作をさらに 2 回繰り返して得られたものを、 免疫 用の抗原溶液とした。 抗原蛋白質の精製および濃縮は， SDS-ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で確認した。

-方、 最終免疫では静脈内投与を行うため、 上記とは異なる方法で抗 原溶液を調製した。 GST-LAR融合蛋白質を発現している前記大腸菌溶解液 とグルタチオンセファロ一スビーズをインキュベートし、 遠心分離後、 沈殿したビーズを E で 2回、 PBSで 3回洗浄した。 次いで GSH溶出バツ ファー (20 m グルタチオン、 1 M Tri s-HCl , pH 9. 6) を ΙΟΟ μ Ι加え、 10分間室温で軽く撹拌して GST-LARを溶出させた。 3，000 r_Pm、 4°C で 5 分間遠心分離して上淸を回収する操作を計 3 回行い、 全溶出液を生理食 塩水中 4°C で 2 F1問透析したものを、 静脈内投与用抗原溶液とした。 b . 免疫処置

6週齢の雌性 ' Balb/c マウス 8 |?Cに対し、 ブリスタン（2, 6， 10， 14-テト ラメチノレペンタデカン、 Sigma社製）を 0. 5 ml/匹で腹腔內投与した。 2 週間後、 腹腔内免疫用抗原溶液をフロイント充金アジュバント （GIBC0社 製） と 1 ： ]で混和しェマルジョン化したものを、 GST-LARi¾合蛋白質が 約 10 g/匹となるよう腹腔内投与した。 以後、 ほぼ 2週間ごとに 4回、 腹腔内免疫用抗原溶液とフロイント不完全アジュバント （GIBCO¾ 0 と の 1 ： 1混和物を GST-LAKが約 30〜70 / g/匹となるよう調製し 、 腹腔 內投^した。 4 回目の免疫の 4 S後に眼底静脈より採血し、 iL淸中の抗 体価を ELISA法により測定した。

. ELISA

铮脈內免疫用抗原と同様の方法で調製した GST-し ΑΚおよび GST のみ の蛋白質溶液を、 それぞれ精製水に対して 4 でー晚透析した。 これを、 PBS で 0. 5 μ & / ml に調製し、 SO μ ΐΖクエルで ELiSAプレート

(Falcon 3911 Mi croTest ' TM Flexible Assay Plate) に l時間吸着さ せた。 洗浄用バッファ一 （0. 05% T een20 を含む PBS) で 5回洗浄後、 5%スキムミルク （2. 5 gのスキムミルクを 50 ml の PBS に溶解して調 製） でブロッキングを行った。 これを洗浄後、 前節 bで得られた血淸を 血清希釈用バッファ一 （0. 25% BSA を含む PBS) で 16, 000倍に希釈し、 50 〗Zゥヱルずつ加え. 湿箱中 1時間インキュベートした。 プレートを 洗淨後、 1000倍希釈 HRP搮識抗マウス gG抗体を 50 μ ΐ/ゥヱルずつ加 え 1 時問インキュベートした。 洗浄用バッファ一で 4回、 PBS で 1回 洗净後、 0-フエ二レンジァミン （和光純藥工業社製） をクェン酸緩衝液 (5. 6325 g クェン酸一水和物、 18. 35 g Na₂HP0«-12H₂0を精製水に溶解 し， 500 mlとして調製） に 1 mg /mlの漉度で溶解させた S質溶液を 50 ゥ Iルとなるように加え、 30 分間反応させた後、 50 1 の 10% HaS , を加え反応を停止した。 このうち 5ϋ μ \ を測定用 9⁶ゥエルプレ ート （住友べ一クライ ト社製） に移して 0 ntn の吸光度を測定した。 d . 細胞融合

上記 ELISAの結果より GST-LARに対する抗体価の上界が認められたマゥ ス 2匹に諍脈內投与により最終免疫を行い、 その 3曰後に脾臓を摘出して、 常法により脾細胞を調製した。 細胞融合のための parent cellは、 亊前に 20 /.i g / mlの 8-ァザグァ ニンを含む培地で選択し、 ヒポキサンチン ·グァニン 'ホスホリボシル トランスフェラーゼ （HGPRT)欠損株であることを確認した Balb/c マウス 由来ミエ π—マ細胞株 NS1 を用いた。 2 X 10' 細胞数の NS1細胞と 1 X 10^s 細胞数の脾細胞に対し. CionaCell (商摞名） - HY Hybridoma

Cloning Kit ( StemCel l Technologies Inc. ) を用いて細胞融合および クローニングを行った。

ク u—二ングされたハイプリ ドーマ培養上清のスクリーニングは、 静 脈內免疫用抗原と同様の方法で調製した GST、 GST- LAKまたは GST~CD45 (Furukawa, T. et. ah ； Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91, 10928- 10932, 1994) の蛋白質溶液 0. 5 μ g/tnlを結合させたプレートにて、 ハイ ブリ ドーマ培棻上淸 50 μ 1について前節 ;における F丄 ISA法に準じて行つ た。 この ELiSA法において、 GSTを結合させたゥエルには免疫反応を示さ ず、 GST- LARまたは GST-CD45を結合させたゥヱルに免疫反応性を示すハイ プリ ド一マを選択した。 なお、 クローニングされたハイプリ ドーマの継 代培養は、 10% ゥシ胎児血淸 （GIBC0社製〉を含有する RPMT 16⁴0培養液 ( Π水製薬社製） で行った。

このように、 HAT選択されたハイプリ ドーマの培赛上清を F丄 ISA法によ りスクリーニングしたところ、 抗体産生能、 増殖能とも安定したクロー ン YU2が得られた。

このハイブリ ドーマ細胞 YU2は、 1 9 9 8年 5月 に H本 IS茨城県つ くば市東 1丁目 1番 3号に所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に 寄託し、 その受託番号は FE M BP— ⁶；34⁴である。

e . モノク Π—ナル抗体のタイピング

上記 dで得られたハイブリ ドーマ細胞 YU²の培 ¾上清 0. 5 mi を 4. ⁵ ml の TBS-T で希釈し、 希釈液のうち 3 miについて Mouse monoclonal 922

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30 antibody i sotyping ki t (Amersham International pic.製) を用レ、て、 アイソタイプを調べた。 その結果、 抗体のアイソタイプは IgGl /cである ことが判った。

f . モノクローナル抗体の調製と精製

6 週齢の雌性 Balb/c マウスに対し、 0. 5 ml I 匹のブリスタンを腹腔 內投与し、 その 10 日後に、 上記 dのクローニングで得られたハイブリ ド —マ細胞 YU2を、 1 匹あたり 2. 5 X iO^l:〜 1. 3 X 10⁷ 細胞数 Ζθ· 5 ml /匹 で腹腔內へ注入した。 10 S後ごろから、 マウスの腹部肥大を認めたため、 20ゲージの注射針を用いて数回にわたり腹水を採取した。 採取した股水 は、 000 rpnu 4。Cにて 5分間遠心分離し、 上清と沈殿物とに分けた。 h淸は、 37 tで 30 分間処理した後、 4 °Cに- -晚諍蘆した。 12, 000 rpm、 4 にて！ 0 分間遠心分離し、 得られた上淸 1. 5 m〗 よりァフィ二ティ一 カラム HiTrap Prote inU (Pharmaci a Bi otech社製） を用いてモノクロ一 ナル抗体 YU2を椿製した。 得られた抗体溶液の² run における吸光度を 測定し、 マウス IgG の分子吸光係数より杭体濃度を算出した。

さらに、 このモノクロ一ナル抗体 YU2にっき、 SDS-ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動上の移動度からそれぞれの見かけの分子 ¾を明らカ こした。 この結果を第 6図に示す。 第 6図に明らかなように、 モノクロ一ナル抗 体 YU2は. 約 48 kDaの H鎖と約 25 kDaの L鎖をきみ、 約 146 kDaの分子量 を有していた。

[実施例 2〗 モノクローナル抗体の特異性の検討 ( 1 )

実験例 1 . aおよび bに記截した通り、 し AR WTの発現べクターを COS - 7細胞にトランスフ クシヨンした。 その細胞溶解液について、 実施例 1 で得られた精製モノクローナル抗体を用いて免疫沈降後、 ィムノブ口ッ ティングを行った。 抗 LAR E-サブユニット抗体 （前 ¾) 、 抗 CMS抗体 (Santa Crux Biotechnology社製、 35-76) およびモノクローナル抗体 YU2はすべて IgGlサブクラスに属するので、 免疫沈降の対照として M0PC 21を用いた。

係る COS- 7細胞への LAR強制発現系を用いた解析により、 抗 LAR E-サブ ュニット抗体で免疫沈降後、 モノクロ一ナル抗体 YU2は、 し AR P-サブュニ ットに相 する 85 kDaとプレカーサ一に相当する約 200 kDaの蛋白質を 認識した （第 7 l¾ B参照） 。

さらに、 LARをトランスフエクシヨンした COS - 7細胞の細胞抽出液をこ れらの抗体 （igGl、 IgG2bまたは YU2) により.免疫沈降後、 し AR E-サブュ 二ットを認、識する抗体でィムノブ口ッティングを行ったところ、 YU2の抗 体で免疫沈降したもののみ R E-サブユニットに相当する 0 kDaと、 プレカーサ一に相当する約 200 kDaの蛋白質が検出された （第 7図 A) 。

以上の結果より、 モノクローナル抗体 YU2は、 LARの P-サブユニットの 免疫沈降およびィムノブ口ッティングに利用可能であることが明らかと なった。

—方、 YU2(1GST-CD45 (Furukawa T. , ei al. , Proc. Natl. Acad. Set USA, 91, 10928-10932, 1994) を抗原とした RLISAでも反応性を示 したことから、 LARと CD45との共通抗原 （おそらく、 双方に保存されてい る PTPドメイン内の配列） をェピトープとして認識していることが推察 された。

[実施例 3 ] モノクローナル抗体特異性の検寸 ( 2 )

モノクローナル抗体 YU2の特異性をさらに調べるために、 雞例 1に記 載したと同様の手順に従って COS- 7細胞に CD45を強制発現させ、 その細 胞抽出液を YU2を用いてィムノブロッテイング解析を行ったところ、 約

200 kDaと約 ISO kDaの位置にバンドが確認された （第 8図参照） 。 39. 市販の抗 CD45抗体によるリプローブでも、 同じ位置にバンドが検出さ れたので、 これらのバンドは CD45であることが明らかとなった。

以 h実施例 2および 3の結果より、 EL1SA法によるハイブリ ド一マのス クリ一二ングにおいて LARおよぴ CMSの細 ½i内ドメィンの双方に反応性 を示すクローンとしてピックアップされた YU2は、 ィムノブロッテイン グでも CD45を認識できることが確認された。

LARと CD45のァミノ酸配列の細胞内ドメインの相同性を第 9図に^す。 図中、 双方のアミノ酸配列問で、 「*jは同一アミノ酸を示し、 「 は類似 ァミノ酸を示す。 LARと CD45の細胞內ドメインのうちホスファタ一ゼド メイン 1以降 C末端までのァミノ酸配列を比較すると、 39. 4%の相同性 を有していることが明らかになつている。 なかでも、 ドメイン】内のチ 口シンホスファタ一ゼ活性を担うコンセンサス配列周辺にあたる 12アミ ノ酸 （Val-Val- s-Cys-Ser-Ala~G】y-Val- Gl y- Arg-Thr~Gly、 配列番号： 4 (配列番§ "： 1のアミノ酸第 2⁴⁵〜256位） ） は、 完全に一致している (第 9図中、 白抜き文宇部分） 。 ポリぺプチドが抗原決定基となりうる には、 8〜10アミノ酸程度が必要といわれていることから、 YU2が配列番 号： 4で示される 12アミノ酸を含むホスファターゼのコンセンサス配列 をェピト一プとして認識することも考えられる。

第 9図において、 し ARおよび CD45の細胞内ドメインの、 他の既知の PTP (すなわち、 FTP α、 i3、 y , δ、 ί、 σ、 μ、 κ , η、 ζ等） とのコン irンサス配列部分 8飽所に囲みを付した。 この 8脔所のコンセンサス配 列は、 ドメイン 1およびドメイン 2における、 4種の配列 （第 1 1図、 (1) - (4) ) の反復であり、 かかる 4栩の配列の詳細は以下の通りである。

(1) Phe-Trp- (Arg/Glu/Leu) -Met- (V_al/H e/Cy s) -Trp (配列赉号： 5 ) (2) し ys- Cys (Ala/Asp〉 - (Gln/Glu/Lys) -Tyr-Trp-Pro (配列番号： 6 ) (3) Trp-Pro-Asp- (His/Phe) -Gly-Val (配列番号： 7 ) (4) Pr。- Xaa- (Ile/Val) -(Ile/Val)- His-Cys- Xaa-Ala-Gly-Xaa- G] y- Arg - (Thr/Ser)-Gly (配列番§ "： 8 ) 配列番^： 4で示される LARと CEJ45との前記同一配列は、 ドメイン 1の.ヒ 記コンセンサス配列（4)に含まれている。 このような PTPのコンセンサス 配列をェピ 1、一プとして認識しうる本 明の抗体は、 PTPの解析および定 , 新規 PTPの同定、 検出および単離精製などに有効に利用できるものと 考えられる。

まだ、 第 1 0図に示すように、 インスリンがインスリンレセプター α 鎖に結合すると. インスリンレセブターの 0鎖が自己リン酸化されチロ シンキ J "一ゼ活性が上昇する。 このチロシンキナーゼの働きにより、 最 終的にグルコースの取り込み、 糖代謝や細胞増殖といったィンスリン作 用が発現する。 本出願人らは、 この活性化されたインスリンレセプター は、 LARによってチロシン脱リン酸化を受けて不活性化状態に戻ることを 明らかにした （1998年 6月 5日出願の国際出顧、 PCT/JP98/0254²) 。 さら に、 （1) インスリンレセブターチ口シンキナーゼは LARの細胞内ドメイ ンをチ口シンリン酸化すること、 （2) かかるリン酸化が LA1¾の; S質特異 性の決定か、 ホスファターゼ活性の上昇に間与していること、 および (3)リン酸化チロシンを LARが S己脱リン酸化することによりその酵素活 性を制御していることなどの可能性が示唆され、 し ARの酵素活性の促進が インスリン抵抗性の原因となりうることを分 fレベルで例証している。 本発明の抗体によって、 このように LARや CD45のみならず他の PTPが関与 する、 リン酸化 ·脱リン酸化等が問わるシグナル伝達機構や種々の制御 機構を解明することが可能となる。

〔産業上の利用可能性〕

本発明によって提供される、 TPの細胞内ドメインに対する抗体は、 し ARまたは、 CD45と LARの双方の細胞内ドメインに結合することができる。 これら本発明の抗体は、 PTPのホスファターゼドメインのコンセンサス 配列を認識すると考えられるため、 PTPの解析および定量、 新規 PTPの同 定ぉよぴ検出、 ならびにクロ一ニング等による新規ホスファタ一ゼの取 得に有用である。 そして、 これらの抗体は、 インスリンのシグナル伝逹 機構や種々の制御機構を解明する極めて有用なッ -ルになり得る。 また、 ィンスリン抵抗性および NIDDMに有用な診断方法を開発し、 さらにはィ ンスリン柢抗性を S盤とするシンドローム Xの種 *の病態の予防、 治療等 の処置および診断、 そして動脈硬化および心疾患発症の予防および診断 に応用できる。

Claims

請求 の 範囲

1 . 2種以上のプロティンチロシンホスファターゼの細胞内ドメイン に対して特異性を有する抗体。

2 . |¾記ブ テインチ口シンホスファタ一ゼのうち少なくとも 1種が 受容体型プロテインチ口シンホスファタ一ゼである請求の範囲第 1項記 載の抗体。

3 . 前記受容体型プロテインチロシンホスファタ一ゼが、 LARおよび Ζ または CM5である請求の範囲第 2項 ¾載の抗体。

4 . 前記受容体型プロテインチ αシンホスファターゼが、 LARおよび

CU45である請求の範 Iffl第 2項記载の抗体。

5 . ブロティンチロシンホスファターゼのホスファタ一ゼドメインに 対して特異性を有する請求の範 第 1乃至 4項のいずれかに記載の抗体。

6 . 配列^号： 1で示される塩基配列によってコードされるボリぺブ チドまたはその断片を抗原として調製される請求の範囲第 Ϊ乃至 5項の いずれかに記載の抗体。

7 . ^記抗体が乇ノクローナル抗体である請求の範囲第 1乃至 6項の いずれかに記載の抗体 _u

8 . 免疫原としてプロテインチロシンホスファタ一ゼドメインとその 他のタンパク質またはポリペプチドとを含む融合タンパク質を用いろこ とによって調製される請求の範囲第 1乃至 7項のいずれかに記截の抗体。

9 . 免疫原として GST- LAKホスファタ一ゼドメイン融合タンパク質を用 いることによって調製される請求の範囲第 1乃至 7項のいずれかに ¾載 の抗体。

1 0 . 前記 GST-LAKホスファタ一ゼドメイン融合タンパク質が、 GSTをコ ―ドする遗伝子領域および I ARのホスファターゼドメインをコードする遗 伝子領城を含む発現べクターを形質転換またはトランスフエク トした大 腸菌を 2 0〜 3 0。Cにて 1 6〜 2 4時間 ^:養し、 その培桊液および ま たは菌体から融合タンパク質を単離することによって製造されるもので ある請求の範囲第 9項記載の抗体。

1 1 . 前記 GST-LARホスファターゼドメイン融合タンパク質が、 さらにグ ルタチオンを有する担体へのァフィ二ティ一によって精製されるもので あって、 該柯体からの融合タンパク質の溶出が 界面活性剤の存在下に 煮沸することによって実施されるものである請求の範囲第 1 0項記载の 抗体。

1 2 . 前記融合タンパク質を免疫原として調製される抗 ί∑が、 玆融合タ ンパク質を用いてスクリ一ニングされるものである請求の範囲第 8乃至 1 1項のいずれかに記載の抗体。

1 3 . 受託番^が FREM BP— 6344であるハイプリ ド一マにより產生される、 プロテインチロシンホスファターゼの細胞內ドメインに対して特異性を 有すろモノクロ一ナル抗体。

丄 4 . 約 146 kDaの分子量を有する請求の範囲第 7乃至 1 3項のいずれか に記載の抗体。

1 5 . 請求の範两第 7乃 3ί ϊ 2項のいずれかに記栽のモノクロ一ナル杭 体を -産するハイプリ ドーマ細胞系。

1 6 . 受託! ^号が FKEM BP— 6344であるハイブリ ド一マ細胞系。

1 7 . 請求の範囲第 1乃至 1 4項のいずれかに記载の抗体の調製方法で あって、 免 原としてプロテインチロシンホスファタ- -ゼドメインとそ の他のタンパク質またはポリぺプチドとを含む融合タンパク質を用いる ことを特徴とする方法。

1 8 . 請^の範囲第 i乃至 1 4項のいずれかに ¾载の抗体の調製方法で あって、 免疫原として GST-LARホスファターゼドメイン融合タンパク質を 用いることを特徴とする方法。

1 9 . 前記 GST-し ARホスファタ一ゼドメイン融合クンパク質が、 GSTをコ 一ドする遣伝子領域および LARのホスファタ一ゼドメインをコードする遣 伝子領域を含む発現べクタ一を形質転換またはトランスフエクトした大 腸鹵を 2 0〜3 (TCにて 1 6 ~ 2 4時問培養し、 その培赛液および/ま たは i¾体から融合タンパク質を ¥ -離することによって製造されるもので ある請求の範囲第 1 8項記載の方法。

2 0 , 前記 GST - LARホスファタ一ゼドメイン融合タンパク質が、 さらにグ ルタチオンを有する担体へのアブイ二ティ一によって精製されるもので あって、 該担体からの融合タンパク質の溶出が、 界面活性剤の存在下に 煮沸することによって実施されるものである請 の範囲第 1 9項記載の 方法。

2 1 . 前記融合タンパク質を免疫原として調製される抗体が、 該融合タ ンパク質を用いてスクリーニングされるものである請求の範囲第 1 7乃 至 2 0項のいずれかに記載の方法。

2 2 . 新規プロテインチロシンホスファターゼを^離するための方法で あって、

ブロティンチロシンホスファタ一ゼをスクリ一ニングする工程を含み、 該ブロティンチロシンホスファターゼのスクリ一ニング工程において 請求の範囲第 1乃至 1 4項のいずれかに記載の抗体が使用されることを 特徴とする方法。

2 3 . 前記スクリーニングが、 cDNAライブラリ一の発現スク リーニング である請求の範囲第 2 2項 ¾载の方法。

2 4 . プロティンチロシンホスファタ、 ゼおよび/またはプロティンチ nシンホスファタ一ゼ由来分子の定.≤方法であって，

請求の範囲 ¾ 1乃至 1 4のいずれかに記載の抗体を使用して、 被検試 料中に含まれるプロティンチロシンホスファタ一ゼのタンパク質， およ び Zまたは少なくともブロティンチロシンホスファタ- -ゼの細胞内ドメ ィンの一都を含む断片もしくはポリぺブチドの 1:を測定することを特徴 とする定 S方法。

2 5 . 前 ¾抗体が、 ィムノブロッテイング、 免疫沈降または ELISAのいず れかにおいて使用される請求の範囲第 2 4項記載の定量方法。

2 6 . プロティンチロシンホスファタ一ゼおよびノまたはプロティンチ 口シンホスファターゼ由来分子の活性を定量するための方法であつて、 請求の範囲第 1乃至 1 4項のいずれかに記載の抗体を用いて被検試料 中に含まれるプロテインチロシンホスファターゼのタンパク質， および Zまたは少なくともプロティンチロシンホスファターゼの細胞内ドメイ ンの一部を含む断片もしくはポリべプチドを笮離し、 単離されたタンパ ク質、 断片またはポリぺプチドの活性を測定する工程を含む方法。

2 7 . 前記単離工程において、 ήίί記抗体を結合させた担体によるァフィ 二ティークロマトグラフィーおよぴノまたは免疫沈降が用いられる請求 の範囲第 2 6項記載の方法。

2 8 . プロティンチロシンホスファタ一ゼおよび/またはプロティンチ πシンホスファタ一ゼ由来分子を生産するための方法であって、 請求の範囲第 1乃至 1 4項のいずれかに記載の抗体を/ Πいてプロティ ンチロシンホスファタ一ゼのタンパク質、 および/または少なくともブ ロティンチロシンホスファタ一ゼの細胞内ドメインの一部を含む断片も しくはポリぺプチドを単離する工程を含む方法。

2 9 . ^記単離工程において、 前記抗体を結合させた担体によるァフィ 二ティーク口マトグラフィ一およびノまたは免疫沈降が用いられる請求 の範囲第 2 8項記載の方法。

3 0 . プロテインチロシンホスファタ--ゼおよび Ζまたはプロテインチ 口シンホスファタ一ゼ由来分子の組維内における存在を確認するための 方法であって、

請求の範 第 1乃: έ 1 ⁴項のいずれかに記載の抗体を用いて免疫組織 学的検査を行い、 プロテインチロシンホスファ'タ―ゼのタンパク質、 お よび Ζまたは少なくともプロテインチロシンホスファターゼの細胞內ド メインの一部を含む断片もしくはポリべプチドを検出する！:程を含む方 法。