KR20010085287A - 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

2종 이상의 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체, 그의 제조방법 및 이러한 항체를 생산하는 세포를 개시한다. 본 발명의 항체는 LAR 및 CD45 모두의 포스파타아제 세브유닛의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖고, PTP의 분석 및 정량, 신규 PTP의 동정 및 검출, 및 클로닝 등에 의한 신규 포스파타아제 취득 외에, 인슐린 저항성 및 NIDDM에 유용한 진단방법의 개발, 인슐린 저항성을 기반으로 하는 증후군 X의 각종 병증의 예방, 치료 등의 처치 및 진단, 그리고 동맥경화 및 심장질환의 예방 및 진단에 유용하다.

Description

단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대한 항체{Antibody against protein tyrosine phosphatase intracellular domains}

최근, 동맥경화의 발병에 관한 메커니즘이 점차 밝혀지고, 그의 위험인자가 동정되고 있다. 특히, 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고혈압(hypertension), 당뇨병 및 흡연은 동맥경화의 4대 위엄인자로 밝혀졌고, 그에 대한 치료가 적극적으로 이루어지고 있다. 이들 질환에서 임상적으로 공통되는 병리원인은 인슐린 저항성이다. 인슐린 저항성이라는 의미는 세포의 인슐린 감수성(sensitivity)이 저하된다는 것과 동일한 의미이고, 세포에서 당물질을 수용할 때, 인슐린의 작용이 저하되는 것을 말한다. 그러한 원인으로는, 인슐린 분비자체의 이상, 표적세포에 대한 인슐린 수용체의 이상, 세포내 신호전달계의 이상, 및 혈액역학적으로(hemodynamically) 말초순환기장애에 의해 당의 조직으로의 공급감소 등을 들 수 있다. 1988년도에 Reaven은 상기 인슐린 저항성으로 인해 많은 병리학적 상태가 유발된다는 것을 보고하였고, 또한 인슐린 저항성, 당부하 이상(glucose tolerance abnormality), 고인슐린 혈증(hyperinsulinemia), 고트리글리세라이드 혈증(hyper-triglyceridemia), 저-HDL 콜레스테롤혈증, 고혈압이 복합적으로 발생하는 병리학적 상태를 특히 "신드롬 X"로 명명하고, 신드롬 X가 동맥경화의 발병에 밀접하게 관련되어 있음을 제안하였다(Reaven, G.M.,et al.,Diabetes,37, 1595∼1607, 1988).

또한, 일반적으로 인슐린 저항성은 세포로의 당 공급이 저하시키고, 췌장의 인슐린 분비를 향상시켜, 고인슐린 혈증을 유발하는 것으로 알려졌고, 임상에서도 인슐린 저항성의 문제가 증가되고 있다. 예를 들면, 인슐린 저항성 및 고인슐린혈증이 당뇨병성 신염(diabetic nephritis)을 촉진시키고(Niskanen, L.et al., Diabetes,41, 736∼741, 1993), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)의 빈도를 증가시킨다(Yip, J.et al.,Lancet.,341, 369∼370, 1993)고 보고되어 있다. 또한, 인슐린 저항성은 플라스민노겐 활성화 인자 억제제 1(PAI-1)의 활성을 상승시키고, 혈액선용계(血液線溶系; blood fibrinolytic system)의 기능을 저하시키거나(Potter van Loon BJet al.,Metab. Clin. Exp.,42, 945∼954, 1993), 아테롬성동맥경화증(arterial atherosclerosis)을 유발한다(Sato, Y.et al.,Diabetes,38, 91∼96, 1989)고 보고되었다.

당뇨병은 발병율이 전인구의 5%를 차지하여, 일본인의 약 600만명이 당뇨병으로 고생하고 있다. 당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)과 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM)이 있다. IDDM은 당뇨병 전체에 대해 약 7%에, NIDDM은 약 90%에 이르고, 특히 당뇨병의 대다수를 차지하는 NIDDM의 발병은 인슐린 저항성이 중요한 원인이라고 생각되고 있다.

현재까지, 인슐린 신호전달에서 세포내 단백질의 타이로신 인산화 (phosphorylation)가 중요한 역활을 하는 것으로 명백히 밝혀졌다. 인슐린 수용체는 분자량이 약 135kDa의 α서브유닛과 95kDa의 β서브유닛 두개의 당단백질 서브유닛들이 디설파이드결합(disulfide bond)에 의해 헤테로테트라머(heterotetramer)를 형성하여 α2β2 구조를 갖는다. α 서브유닛은 인슐린 결합활성을 갖고, β서브유닛은 자기인산화(autophosphorylation)에 의해 활성화되는 단백질 타이로신 키나아제(Protein Tyrosine Kinase: PTK) 도메인을 갖는다. 즉, 인슐린이 인슐린 수용체가 α쇄에 결합하면, 인슐린 수용체의 β쇄에 존재하는 몇개의 특정 타이로신 잔기가 수용체의 타이로신 키나아제 활성에 의해 자기인산화된다. 인슐린 수용체 타이로신 키나아제는 자기타이로신인산화에 의해, 그의 타이로신 키나아제 활성이 더욱 상승된다. 따라서, 활성화된 인슐린 수용체 타이로신 키나아제는 세포내에 존재하는 그의 기질인 IRS(insulin receptor substrate)를 타이로신 인산화하고, 그의 타이로신 인산화된 IRS-1을 Ash/Grb2 또는 PI-3 키나아제가 인식하여 결합하는 것에 의해 신호가 전달되고, 최종적으로 글루코오즈의 수용, 당 대사 또는 세포증식과 같은 인슐린에 의한 생물학적 활성을 일으키는 것으로 보고되었다(도 9 참조, Goldstein, B. J.,et al.,Receptor,3, 1∼15, 1993; Kanai F.,et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,195(2), 962∼768, 1993). 그러나, 상기 인슐린의 신호전달에 있어서, 활성화된 인슐린 수용체를 불활성화시키는 효소, 즉 단백질 타이로신 탈인산화효소인 PTP에 대한 연구는 거의 진행되지 않았다.

또한, 마찬가지로 타이로신 인산화에 의해 정교하게 조절되는 림프구의 활성화, 증식, 분화, 세포사 등의 면역계의 기초적인 메커니즘도 거의 연구되지 않았다. 이제까지는 PTK에 의한 림프구 신호전달 연구가 주류로 였지만, 최근 PTP의 분석도 진행되고 있고, 양측면에서 연구하는 것이 중요하다는 것이 명백히 밝혀졌다.

PTP에 관한 연구가 본격적으로 시작된 것은 1988년 Fischer의 연구그룹에 의해서, 사람 태반(human placenta)으로부터 유래한 세포질형 PTP인 PTP1B의 유전자를 클로닝하여, 그의 뉴클레오타이드 서열을 밝히면서부터이다(Tonks, N. K.,et al.,J. Biol. Chem.,263, 6722∼6730, 1998; Charbonneau H.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 7182∼7186, 1988). 그 결과, PTP1B와 동일성을 나타낸 것은 공지의 세린/트레오닌 포스파타아제가 아니라, 조혈계(hemopoietic system)의 막통과분자(tranmembraneous molecule)인 CD45 세포질내 영역의 두 군데였다. 더욱이, CD45가 PTP 활성을 갖고 있는 것도 밝혀졌다(Tonks, N.K.,et al.,Biochemistry,27, 8695∼8701, 1988; Charbonneau, H. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 7182∼7186, 1988).

사람의 PTP 유전자는 500개 정도가 있는 것으로 추정되며, 현재에 80종 이상의 사람 PTP가 cDNA 서열의 상동성에 기초하여 클로닝되었고, 계속적으로 신규한 PTP가 보고되고 있다(Streuli, M.et al.,J. Exp. Med.,169, 1523∼1530, 1988; Krueger, N.X.,et al.,EMBO J.,9, 3241∼3252, 1990; Trowbridge, I.S.,et al.,Bochim. Biophys. Acta,1095, 46∼56, 1991). 따라서, 상위 페밀리(superfamily)를 형성하는 PTP는 크게 3개로 분류된다. 즉, PTP, DS-PTP(dual-specific-PTP; 이중 특이성 PTP) 및 LMW-PTP(low molecular weight-PTP; 저분자량 PTP)의 세개의 그룹이다. 각각의 패밀리간의 1차 구조의 상동성은 그렇게 높지는 않고, 특히 PTP와 LMW-PTP는 효소활성 중심 외에는 상동성을 나타내지 않지만, 결정화(crystallography) 연구에 의하면 그러한 패밀리에 속하는 분자의 3차구조는 놀랍게도 공통성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Fauman, E. B.et al.,Trends Biochem Sci.,21, 413∼417, 1996). 또한, PTP는 (1) 세포관통부분을 갖는 수용체형(또는 막형) PTP(LCA(Leukocyte Common Antigen; 백혈구공통항원), 즉 CD45, LAR 및 PTPα, β, γ, δ, ε, σ, μ, κ, η, ζ 등), (2) 세포막통과부분을 갖지 않는 세포질형 PTP(PTP1B, TC-PTP, PTP-MEG, PTPH1, STEP, PTP1C, FAP1, SHP1, SHP2, PEP, PTP-PEST 등)로 크게 구별한다.

수용체형 PTP의 대다수는 세포내에 2개의 PTP 상동부분(도메인 1 및 도메인 2, 도 1(a) 및 (b))을 갖고 있다. 현재까지 보고된 PTP에는 Ile/Val-His-Cys-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Xaa-Arg-Ser/Thr-Gly (서열번호 2)의 시스테인을 포함하는 서열(signature motif)이 포스파타제 도메인 내에 존재한다. PTP1B의 결정화에의한 연구로 부터, 상기 부위가 PTP 분자표면에 작은 구멍을 형성하고, 시스테인은 구멍의 바닥에 위치하여 인산과의 결합에 직접 관여하는 것으로 밝혀졌다(Barford, D.et al.,Science,263, 1397-1404, 1994). 또한 세린 및 트레오닌이 결합하고 있는 인산은 PTP1B 효소활성의 중심구멍에 미치지 못하기 때문에, 구멍의 깊이가 PTP와 세린/트레오닌 포스파타제의 특이성을 결정하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이 상기 시스테인을 갖는 서열(signature motif)의 효소활성 발현에 관련된 중요성은 돌연변이 실험으로 부터 밝혀졌다(Streuli, M. et al., EMBO J., 9, 2399-2407, 1990). 이들로부터 도메인 1에 보존된 Cys이 효소활성 발현에 중요하고, 또한 도메인 2는 효소의 기질특이성을 결정하는 것으로 생각된다.

수용체형 PTP는 세포내에 2개 또는 1개의 효소영역을 갖고, 세포외 도메인의 특징에 의해 몇개의 그룹으로 분류할 수 있다. 세포외에서 피브로넥틴 Ⅲ형 도메인을 1개 갖고, 고도로 당쇄(sugar chain) 변형된 CD45; Ig형 도메인 및 피브로넥틴 Ⅲ형 도메인을 갖는 LAR, PTPδ및 PTPσ; N말단에 MAM(meprin, A5항원, PTPμ) 도메인을 갖는 PTPμ, PTPκ; N말단에 탄산탈수효소(carbonate dehydratase) 도메인을 갖는 PTPγ, PTPξ; 및 세포외 도메인이 짧은 PTPα, PTPε이 있고, 상기 PTP들 모두는 두개의 효소영역을 갖는다. 한편, 효소영역이 한개인 것은 전부 세포외 도메인이 피브로넥틴 Ⅲ형 도메인만으로 구성되고, 이에는 PTPβ, CD148(PTPη, DEP-1 등)이 있다.

세포질형 PTP는 원칙적으로 효소영역을 1개 갖고, 비효소영역의 특징에 의해 몇개의 그룹으로 분류할 수 있다. SH2 영역, PEST 영역, band 4.1 영역을 갖는 것이 있다. DS-PTP는 타이로신뿐만 아니라, 세린 또는 트레오닌 잔기를 탈인산화하는 효소로서, Cdc25, MAP 키나아제 포스파타아제, VH-1 등이 있다. LMW-PTP는 효소영역만으로 구성되고, 분자량은 약 18kDa인 것으로 보고되어 있다.

PTP효소 그룹 중, 사람 유래의 LAR은 수용체형 단백질 타이로신 포스파타제(PTP)의 CD45 포스파타제 도메인을 프로브로 사용하여 사람 태반 게놈 라이브러리로부터 글로닝된 수용체형 PTP이다(Streuli M.et al.,J. Exp. Med.,168, 1553-1562, 1988). CD45가 혈구 시스템의 세포에서 특이적으로 발현되는 것에 대하여, LAR은 혈구 시스템 이외의 세포, 특히 간장 및 골격 근육 등의 인슐린 감수성 조직에 발현되고 있다(Goldstein B. J.,Receptor,3, 1-15, 1993). 많은 수용체형 PTP 중에서 LAR은 세포외부 도메인이 세포 접착 분자와 유사하기 때문에 더욱 흥미롭다. 전체 구조는 Ig형 도메인과 피브로넥틴III형 도메인으로 이루어지는 150kD의 세포외 E-서브유닛 및 막통과영역을 갖는 2개의 포스파타제 도메인으로 이루어진 85kD의 세포내 도메인인 P-서브유닛(포스파타아제 서브유닛, 서열번호 1)이 세포막의 외측에 비공유결합되어 있는 것이 밝혀졌다(도 1. Streuli M.et al.,EMBO J.,11, 897-907, 1992). 또한, LAR는 PTPδ 또는 PTPσ와 함께 서브유닛을 구성하고, 교소체(desmosome; 인테그린(integrin)를 통한 세포외 기질과의 접합부)의 주변 부위 또는 흡착 접합부(adherens junction; 카드히린(cadherin)을 통한 세포끼리의 접합부위)에 존재한다(Serra-Pages, C.et al.,EMBO J.,14, 2827∼2838, 1995; Pulido, R.et al.,Proc. Natl., USA,92, 11686∼11690, 1995; Kypta, R. M.,et al.,J. Cell Biol. 134, 1519∼1530, 1996; Aicher, B.et al.,J. Cell Biol.,138, 681∼696, 1997).

현재까지는 LAR의 기능적인 역할이 많이 보고되어 있다. 예를 들면, LAR이 결핍된 신경세포에서는 뉴로트로핀(Neurotrophin)의 반응성이 감소되는 것(Yang, T.et al., 27th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, New Orleans, Louisiana, USA, October 25-30, 1997; Society for Neuroscience Abstracts,23, 1-2, 1997), 초파리(drosophila) LAR 유사체는 추로 신경계에 발현되고, 그의 결핍은 운동신경의 축색(軸索)이 신경다발로부터 분리되는 시간을 늦추는 것(Krueger, N.X.et al.,Cell,84, 611∼622, 1996), LAR 효소 도메인을 코딩하는 유저자의 파괴는 유선(乳腺)발육이 불량해지는 것을 확인한 것(Schaapveld, R.Q.et al.,Dev. Biol.,188, 134∼146, 1997), LAR 활성의 억제에 의해 아포지단백질 B(apolipoprotein B)의 분비가 감소되는 것(Phung, T. L.et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,237(2), 367-371, 1997), 및 LAR의 발현의 결핍에 의해 전골기저부의 콜린 작용성 신경세포의 크기가 작아지게 되고, 해마균상회(hippocampal dentate gyrus)에의 콜린 작용성 신경지배가 감소한다는 것(Yeo, T. T.et al.,J. Neurosci. Res.,47(3), 348-360, 1997)이 보고되어 있다. 이러한 방식으로 LAR은 생체내에서 다양한 역할을 하는 것으로 서서히 알려지게 되었다. 현재 최고로 주목 받는 연구로서는 LAR과 인슐린 수용체와의 관계이다(Hashimoto, N.et al.,J. Biol. Chem.,267(20), 13811-13814, 1992).

1995년 비만한 사람의 지방조직에 대하여 LAR의 타이로신 포스파타제 활성이 비정상적으로 상승하며, 이는 인슐린 저항성의 발병 원인으로서, 또는 심장혈관질환의 위험 인자로서 생각되어 주목받고 있다(Ahmad, F.et al.,J. Clin. Invest.,95(6) 2806-2812, 1995). 이후 LAR은 인슐린 수용체와 밀접하게 관련되어 있는다는 것이 연속적으로 보고되었다(Mooney, R. A.et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,235(3), 709-712, 1997; Orr, S. R.et al.,Biochemical Society Transaction,25(3), 452S, 1997; Ahmad, F.et al.,J. Clin. Investigation,100(2), 449-458, 1997; Ahmad, F.et al.,J. Biol. Chem.,272(1), 448-457, 1997; Norris, K.et al.,Febs Letters,415(3), 243-248, 1997; and Li, P. M.et al.,Cellular Signaling,8(7), 467-473, 1996). 그리고 이러한 정보에 기초하여, 아메트(Ahmad, F.) 등은 최근 LAR 및 PTP1B가 인슐린 저항성의 치료 목표가 될지도 모르는 보고를 하고 있다(Ahmad, F.et al.,Metabolism, Clinical and Experimental,46(10), 1140-1145, 1997).

다음으로, PTP들 중 CD45는 백혈구 공통항원(LCA)이라고도 불리며, 성숙된 적혈구 또는 혈소판을 제외한 혈액세포(백혈구) 및 그의 전구세포에서 발현되는 세포표면항원이다. CD45는 분자량 180∼220kDa의 수용체형 PTP이며, 세포내에 두개의 효소영역을 갖고, 세포외 영역의 N말단 근처에 3∼4개 엑손(exon)의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 8∼9 종의 이성질체(isomers)가 존재한다(Saga, Y. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 5364∼5368, 1987; Thmas, M. L.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 5360∼5363, 1987; Trowbridge, I. S.et al.,Annu. Rev. Immunol.,12, 85∼116, 1994). 또한, 스플라이싱될 수 있는 엑손으로 코딩된 아미노산 서열은 세린, 트레오닌 및 프롤린이많고, α-헬릭스 또는 β구조를 기반으로 만들어진 3차구조를 형성하기 어려우며, 또한, O-글리코실레이트된 부위를 많이 함유하고 있다(Barelay, A. N.et al.,EMBO,6, 1259∼1267, 1987). 따라서, 이성질체형(isoform)으로 변화에 의해 세포외 영역의 구조가 많이 변화되는 특징을 갖고 있다. 또한, CD45는 림프구에서 많이 발현되고, 세포종류 또는 세포의 활성화 상태에 따라 고유의 이성질체가 가역적으로 발현된다(Thomas, M. L.et al.,Annu. Rev. Immunol.,7, 339∼369, 1989; Charbonneau, H.et al.,Annu. Rev. Cell. Biol.,8, 402∼493, 1992; Trowbridge, I. S.et al.,Annu. Rev. Immunol.,12, 85∼116, 1994). 또한, 선택적 구조와 막통과 부위의 사이에 낀 영역의 서열은 시스테인을 많이 함유하고, 디설파이드 결합에 의해 안정화된 구조를 형성한다(Thomas, M. L.et al.,Cell,41, 83∼93, 1985; Trowbridge, I. S.,et al.,J. Biol. Chem.,266, 23517∼23520, 1991; Trowbridge, I. S.et al.,Biochim. Biophys. Acta,1095, 46∼56, 1991).

CD45의 발현이 결핍된 T세포 돌연변이주는 그의 세포가 본래 가지고 있던 항원 특이적 반응성(immunogen-specific responsiveness)이 현저하게 저하되는 것이 밝혀졌고, 이는 T세포 수용체(TCR)를 통한 T세포의 활성화 및 기능발현에 CD45가 매우 중요하다는 것을 시사한다(Charbonneau, H.,et al.,Annu. Rev. Immuno.,7, 339∼369, 1989; Pingel, J. T.,et al.,Cell,58, 1055∼1065, 1989; Trowbridge, I.,et al.,Annu. Rev. Immunol.,12, 85∼116, 1994; Koretzky, G. A.,et al.,Nature,346, 66∼68, 1990; Koretzky, G. A.,et al.,Proc. Natl.Acad. Sci. USA,88, 2037∼2041, 1991; Weaver, C. T.,et al.,Mol. Cell Biol.,11, 4415∼4422, 1991). 또한, TCR/CD3 복합체를 통한 T세포의 신호전달물질로서 CD45는 그의 공동수용체(coreceptor)인 CD4 및 CD8의 세포내 도메인에 결합되어 있는 Src 계열의 타이로신 키나아제(PTK)인 Lck(p56^lck) 또는 Fyn(p56^fynT)의 활성화에 관여하는 것도 시사하고 있다(Trowbridge, I. S., et al.,Annu. Rev. Immunol.,12, 85∼116, 1994; Penninger, J. M.,et al.,Immunol. Rev.,135, 183∼214, 1993). CD45는 Lck 또는 Fyn의 C말단에 위치한 음성조절부위(negative regulatory site)의 타이로신 잔기를 탈인산화하고, 그 결과, Lck 또는 Fyn이 자기인산화(autophosphorylation)하여 활성화되어 신호전달되는 것으로 생각된다(Penninger, J. M., et al.,Immuno. Rev.,135, 183∼214, 1993; Ledbetter, J. A.,et al.,Curr. Opin. Immunol.,5, 334∼340, 1993; Janeway, C. A.,Jr.,Annu. Rev. Immunol.,10, 645∼674, 1992; Cahir, McFarland, E. D.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1402∼1406, 1993; Hurley T. R.,et al.,Mol. Cell. Biol. 13, 1651∼1656, 1993; Sieh, M.et al.,EMBO J.,12, 315∼321, 1993; Weiss, A.et al.,Cell,76, 263∼274, 1994; Chan, A. C.et al.,Annu. Rev. Immunol.,12, 555∼592, 1994). 인슐린 반응성 골수종(meyeloma) 세포 중 CD45-결핍 세포주를 이용한 실험으로부터, CD45발현주와 비교하여 인슐린 자극시 인슐린 수용체의 자기인산화, IRS-1의 타이로신 인산화, PI₃키나아제의 활성화 및 MAP키나아제 활성화가 3배 강화된다는 보고에 의해(Kulas, D. T. et al., J.Biol. Chem., 271, 755∼760, 1996), CD45는 LAR과 동일하게 인슐린 음성 조절인자인 것으로 생각된다. 더욱이, CD45-결핍세포의 반응성이 CD45의 세포내 영역만을 갖는 분자의 발현에 의해 회복되는 것은 다음의 실험으로부터 확인될 수 있다. 즉, CD45의 세포내 영역만을 박테리아 또는 바큘로바이러스(baculovirus)계에 발현시켜도 타이로신 포스파타아제의 효소활성이 충분히 관찰되는 것(Ostergaard, H. L.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 8959∼8963, 1989; Streuli, M.,et al.,Proc. Sci. USA,86, 8698∼8702, 1989), 또는 CD45 음성 T세포 클론에 CD45의 세포내 영역을 형질감염(transfection)하는 것만으로도 항원 수용체를 통한 신호전달을 회복하는 것(Volarevic, S.et al.,Science,260, 541-544, 1993; Hovis, R. R.et al.,Science,260, 544-546, 1993; and Desai, D. M.et al.,Cell,73, 541-554, 1993) 등이 있다.

한편, B세포의 경우에서도, 초기 신호전달뿐만 아니라, 최종적으로 증식 또는 아폽토시스에 이르는 과정도 CD45의 발현에 따라 조절되는 것이 CD45를 발현하지 않는 형질세포종(Justement, L, B.et al.,Science, 252, 1839-1842, 1991), 또는 미숙 B 세포주로부터 제작된 CD45 음성 클론을 이용한 실험(Ogimoto, M.et al.,Int. Immunol., 6, 647-654, 1994)을 통해 밝혀졌다. 이러한 결과는 CD45가 항원 수용체를 통한 신호전달에 필수적인 역할을 하는 분자인 것을 나타낸다.

현재, LAR 및 CD45 등의 PTP에 관한 연구에서, 세포내 신호전달계에 있어서 PTP가 PTK와 함께 작용하여, 매우 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

1992년에 스트라울리(Streuli) 등에 의해, LAR의 E-서브유닛 및 P-서브유닛과의 결합이 비공유결합으로 인해 분리될 수 있고, E-서브유닛이 세포막 표면으로 부터 떨어질 수 있다는 것이 밝혀졌다(Streuli, M.et al.,EMBO J.,11(3), 897∼907, 1992). 그러나, 많은 연구자들은 LAR의 세포외 도메인인 E-서브유닛에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 다양한 연구를 행하였지만, 단독으로 포스파타제 활성을 갖는 P-서브유닛은 완전히 무시하고 연구하지 않았다. 예를 들면, LAR의 포스파타아제 활성측정을 위한 LAR 항원을 사용하는 경우, P-서브유닛에 대한 항체를 사용하지 않으면, 전체적으로 포스파타아제의 활성을 측정할 수 없다. 또한, LAR계의 세포외 도메인에는 mRNA의 스플라이싱이 다른 몇개의 이성질체형이 존재하고(Krueger, N. X.et al.,Cell,84, 611-622, 1996; Mizuno, K.et al.,Mol. Cell Biol.,13, 5513-5523, 1993; and Ogata, M.et al.,J. Immunol.,153, 4478-4487, 1994), 세포외 도메인에 대한 항체를 이용하면 각각의 이성질체형에 대하여 특이성이 다르게 된다. 이러한 상황하에서, 본 발명자 등은 PTP의 세포내 도메인에 관한 항체를 제조하기 시작하였다.

또한, 종래 CD45 항체인 T200또는 B200 등의 분자량이 다른 CD45 이성질체형 모두에 반응성을 나타내는 항체와, 특정의 한정된 이성질체형에만 반응성을 나타내는 항체를 구별하고, 후자를 CD45R(restricted) 항체로서 명명하여 왔다(McMichael, A. J., InLeucocyte Typing Ⅲ. Oxford University Press, Oxford, 1987). 그러나, CD45의 세포외 도메인 구조의 다양성이 밝혀짐에 따라, CD45R 항체의 특이성을 분류할 필요가 생겼다. Streuli 등은 cDNA의 형질감염을 이용한 방법으로, 공지의 사람 CD45 항체의 분류를 수행하였고, 선택적 엑손 4, 5또는 6에 의존한 구조를 인식하는 항체를 각각 CD45RA, CD45RB 및 CD45RC로 기술할 것을 제안하였다(Streuli, M.et al.,J. Immunol., 141, 3910-3914, 1988). 동일한 방법으로, Johnson 등도 마우스 CD45 항체의 분류를 보고하였다(Johnson, P.et al.,J. Exp. Med., 169, 1179-1184, 1989).

또한, 공지의 PTP에 관한 항체로서는, CD45의 막통과(TM) 영역으로부터 포스파타아제 도메인 1의 일부인 196 아미노잔기의 펩티드를 항원으로서 제조한 항체(Transduction Laboratories사 제조) 및 PTPα의 포스파타제 도메인 1(260 아미노 잔기)에 대한 항체(Transduction Laboratories사 제조)가 공지되어 있다. 그러나, 이러한 항체가 LAR 또는 그외 PTP의 포스파타아제 도메인에 대하여 면역특이성을 갖는지, 그렇지 않은지는 불명확하다.

본 발명은 2종 이상의 단백질 타이로신 포스파타아제(protein tyrosine phosphatase, 이하, 'PTP'라 함) 중에서 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, PTP(예를 들면, LAR(백혈구 공통항원 관련분자; leukocyte antigen related molecule) 및 CD45)의 세포내 도메인에 대해 특이적인 항체로서, PTP의 분석 및 정량, 신규한 PTP의 동정, 검출, 단리 및 정제, 및 인슐린 저항성에 관련된 질병상태의 치료, 예방, 완화 등의 처치(處置) 또는 진단에 사용가능한 의약의 개발 등에 유용한 항체에 관한 것이다.

도 1은 LAR 서브유닛 구조를 나타내는 모식도 (a), 및 실험예에서 제조된 LAR의 막내 포스파타아제 도메인 구조의 돌연변이체를 나타내는 모식도(b)이다.

도 2는 LAR C/S와 인슐린 수용체(IR)의 야생형을 공형질감염 (cotransfection)시킨 COS 세포에서 인슐린 자극에 의해 유도된 타이로신 인산화의시간 경과에 따른 면역블랏을 도시한 것이다.

도 3은 LAR의 야생형 또는 돌연변이체와 인슐린 수용체의 야생형을 공형질감염시킨 COS 세포에서 인산화-탈인산화를 나타낸 면역블랏을 도시한 것이다.

도 4는 LAR의 야생형 또는 돌연변이체에 의한 인슐린 수용체-β쇄의 탈인산화를 나타내는 면역블랏을 도시한 것이다.

도 5는 인슐린 수용체의 야생형 또는 돌연변이형 및 LAR C/S를 공형질감염시킨 COS세포에서 타이로신 인산화를 나타내는 면역블랏을 도시한 것이다.

도 6은 본 발명의 항체 YU2의 분자량을 나타내고, SDS-폴리아크릴아미드 겔을 도시한 것이다.

도 7은 본 발명의 항체 YU2의 LAR에 대한 면역특이성을 나타내는 면역블랏을 도시한 것이다.

도 8은 본 발명의 항체 YU2를 이용한 CD45에 대한 면역블랏에 의한 분석결과를 도시한 것이다.

도 9는 LAR과 CD45의 세포내 도메인의 아미노산 서열의 상동성을 도시한 것이다.

도 10은 인슐린 수용체 및 LAR이 관여하는 인산화 및 탈인산화에 의해 제어된 인슐린 신호전달의 연쇄반응(cascade)을 나타낸 모식도이다.

본 발명은 2종 이상의 PTP 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체, 특히 적어도 1종 이상의 수용체형 PTP의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 본 발명의 항체는 LAR 및/또는 CD45, 바람직하게는 LAR 및 CD45 모두의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체를 제공하는 것이다. 이러한 항체는 특히 PTP의 포스파타아제 도메인에 대하여 특이성을 갖는 것이 바람직하다.

상기 항체는 서열번호 1에 나타낸 염기서열에 의해 코딩되는 LAR의 P-서브유닛에 상응하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 항원으로서 제조되는 것이 바람직하고, 또한 면역특이성의 관점에서 모노클로날항체인 것이 바람직하다.

또한, 상기 항체는 단백질 타이로신 포스파타아제 도메인과 그 외의 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질(fusion protein)을 면역원으로서 이용하여 제조할 수 있다. 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질 타이로신 포스파타아제 도메인으로서는 LAR포스파타아제 도메인이 바람직하고, 그 외에 단백질 또는 폴리펩티드로서, 특히 GST(glutathione-S-transferase)가 바람직하지만, 그 외에도 폴리히스티딘(바람직하게는 6개의 히스티딘 잔기), 칼모듈린 결합 펩티드(calmodulin binding peptide; CBP) 및 단백질 A등을 이용할 수도 있다.

한편, 폴리히스티딘을 이용한 경우, 유전자 재조합법에 의해 발현된 융합 단백질을 분리정제하기 위해서는 니켈-킬레이트화 수지의 흡착을 이용할 수 있고, pH를 변화시키거나, EDTA 또는 이미다졸 물질을 첨가하는 것에 의해서 상기 수지로부터 분리할 수 있다. CBP를 이용하는 경우, 발현된 융합 단백질은 칼모듈린 친화성 수지를 이용하여 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 행하고, 이후, EGTA를 첨가하여 상기 수지로부터 분리할 수 있다. 또한, 단백질 A를 이용하는 경우, 발현된 융합 단백질은 IgG 세파로오즈(예를 들면, IgG 세포로오즈 6FF) 컬럼을 사용한 친화 크로마토그래피를 수행하고, 그런 다음 pH를 변화시켜 상기 수지로부터 분리할 수 있다.

더욱이, 상기 융합 단백질을 구성하는 단백질 또는 폴리펩티드 단편의 예로서, Xpress, Thoredoxin, c-myc, V5 및 HA/c-myc 등을 들 수 있고, 이들을 에피토프로서 인식할 수 있는 항체를 사용하여, 목적하는 LAR 포스파타아제 도메인의 융합단백질을 발현시킨 후에, 항원-항체 친화 컬럼에 의해 단리정제하는 것이 가능하다.

상기한 바람직한 면역원인 GST와 LAR 포스파타아제 도메인을 포함하는 융합단백질은 GST를 코딩하는 유전자 영역 및 LAR의 포스파타아제 도메인을 코딩하는 유전자 영역을 포함한 발현 단백질을 형질전환 또는 형질감염시킨 대장균을, 20∼30℃에서 12∼24시간, 바람직하게는 23∼25℃에서 배양하고, 그의 배양액 및/또는 균체로부터 융합단백질을 담리함으로써 제조하는 것이 바람직하다. 또한, 상기에서 수득된 융합단백질은 글루타티온(glutathion)을 포함하는 지지체, 예를 들면 상기 글루타티온 세파로오즈 비드의 친화성에 의해 정제되는 것이 바람직하고, 상기 글루타티온 세포로오즈 비드에서 융합단백질의 용출은 계면활성제의 존재하에서 끓이는 것에 의해 수행하면 좋다. 상기 계면활성제로는 나트륨 도데실 설페이트, CHAPS(3-[(3-콜아미드 프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판 설포네이트), 디옥시콜산(dioxycholic acid), 디지토닌(digitonin), n-도데실말토사이드 (1-O-n-도데실-β-D-글루코피라노실 (1-4)α-D-글루코피라노사이드), Nonidet^TMP-40(에틸페놀폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n), n-옥틸글루코시드(1-o-옥틸-β-D-글루코피라노시드), 수크로오즈 모노라우레이트, Tesit^TM(도데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n), Triton^TMX-100(옥틸페놀폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n), Tween^TM20(폴리 (옥시에틸렌) n-소르비탄-모노라우레이트), N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 등을 들 수 있다(여기에서, n은 1이상의 정수이다). 융합 단백질을 용출시키는 경우, 이들 계면활성제를 동물에 투여하여도 문제가 없는 농도, 바람직하게는 0.1%의 나트륨 도데실 설페이트 존재하, 100℃에서 5∼10분간 끓인다. 이렇게 함으로써, 목적의 면역원으로서 바람직하게 정제된 융합단백질을 얻을 수 있다.

이와 같은 융합단백질을 면역원으로서 이용하여 모노클로날 항체를 얻을 경우, 항체 스크리닝은 단백질 포스파타아제 도메인, 바람직하게는 LAR 포스파타아제 도메인을 이용할 수도 있지만, 면역원으로서 이용한 융합단백질로 스크리닝을 하는 것이 특이성(specificity)의 관점에서 바람직하다.

본 발명의 모노클로날 항체로서, 마우스/마우스-하이브리도마에 의해 생산된 LAR 및 CD45의 포스파타아제 서브유닛의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 상기 항체의 예를 들면, SDS-PAGE 상에서 볼 때에 분자량이 약 146kDa인 모노클로날 항체이다. 이러한 항체는 인슐린의 신호전달 물질을 보다 더 해명하기 위한 도구로서, 또한 인슐린 저항성 및 NIDDM에 유용한 진단방법을 개발하고, 더욱이 인슐린 저항성을 기반으로 하는 증후군 X의 여러가지 병증의 예방, 치료, 진단 등에 응용할 수 있다. 상기 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주가 제공된다. 이러한 하이브리도마 세포주로서, 본 발명자가 1988년 5월 7일자로 일본국 이바라키 츠쿠바 히가시 1-1-320에 소재한 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하였고, 수탁번호 FERM BP-6344인 마우스/마우스-하이브리도마 세포주 YU2를 들 수 있다.

본 발명의 항체는 천연물 유래 또는 전체적으로는 부분적으로 합성(화학합성, 유전자 재조합에 의한 합성 등)된 PTP 단백질, 및 PTP 세포내 도메인의 일부분이상(3 아미노산 잔기 이상, 바람직하게는 5 아미노산 잔기 이상)를 포함하는 단편 및 폴리펩티드(이하, 상기 단편 및 폴리펩티드를 총칭하여 'PTP 유래 분자'라 칭한다)에 대하여 특이적 면역반응성을 갖는다.

또한, 본 발명은 2종 이상의 단백질 타이로신 포스파타아제 서브유닛에 대하여 특이성을 갖는 항체의 제조방법에 있어서, 면역원으로서 상기한 바와 같이 단백질 타이로신 포스파타아제 도메인 및 그 외의 단백질 또는 폴리펩티드 단편을 함유하는 융합단백질, 바람직하게는 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합 단백질을 이용한 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 여기에서, GST 이외에 사용가능한 융합 단백질을 구성하는 단백질 또는 폴리펩티드 단편, 그의 융합 단백질의 정제방법은 상기한 바와 같다.

또한, 바람직한 면역원인 GST 및 LAR 포스파타아제 도메인을 포함하는 융합단백질은 GST를 코딩하는 유전자 영역 및 LAR 포스파타아제 도메인을 코딩하는 유전자 영역을 함유한 발현벡터를 형질전환 또는 형질감염된 대장균을 20∼30℃에서 16∼24시간, 더욱 바람직하게는 23∼25℃에서 18시간 배양하고, 그의 배양액 및/또는 균체로부터 융합 단백질을 단리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 상기에서 수득된 융합단백질은 글루타티온을 함유하는 지지체, 예를 들면 글루타티온 세파로오즈 비드의 친화 컬럼에 의해 정제되는 것이 바람직하고, 상기 글루타티온 세포로오즈 비드로부터 융합된 단백질은 계면활성제의 존재하에서 끓임으로써 용출되는 것도 상기한 바와 같고, 융합단백질을 용출시키는 경우에, 이들 계면활성제를 동물에 투여하여도 문제가 되지 않는 농도, 바람직하게는 0.1%의 0.1%의 나트륨 도데실 설페이트 존재하, 100℃에서 5∼10분간 끓인다. 이렇게 함으로써, 목적하는 면역원으로서 바람직하게 정제된 융합단백질을 얻을 수 있다.

상기 얻어진 융합 단백질을 면역원으로서 이용하여 모노클로날 항체를 제조하는 방법에 있어서, 항체 스크리닝은 단백질 타이로신 포스파타아제 도메인, 바람직하게는 LAR 포스파타아제 도메인을 사용할 수 있지만, 면역원으로서 이용하는 융합 단백질로 스크리닝을 수행하는 것이 특이성의 관점에서 바람직하다.

또한, 본 발명에 의해서 신규한 PTP를 단리하기 위한 방법으로, PTP를 스크리닝하는 단계를 포함하고, 상기 스크리닝 단계에 있어서 상기한 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 스크리닝으로서 cDNA 라이브러리의 발현 스크리닝이 고려된다.

본 발명의 다른 특징으로, PTP 및/또는 PTP 유래 분자의 정량방법이 제공된다. 이러한 방법에서는 상기한 항체를 사용하여 피검시료 중에 함유된 PTP 단백질, 및/또는 PTP의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는 단편 또는 폴리펩티디의 양이 측정된다. 이러한 방법에 있어서, 상기 항체는 면역단백질, 면역침전 또는 ELISA 중 어느 것에 사용되어도 바람직하다.

본 발명의 또 다른 특징에 있어서, 상기한 항체를 이용하여 피검시료 중에 함유된 PTP 단백질, 및/또는 PTP의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는 단편 또는 폴리펩티드를 분리하고, 분리된 단백질, 단편 또는 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계를 포함한 PTP 및/또는 PTP 유래 분자의 활성을 정량하기 위한 방법을 제공한다. 상기 단리단계에 있어서, 상기 항체를 결합시킨 지지체에 의한 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침전이 바람직하게 이용된다.

또한, 본 발명은 PTP 및/또는 PTP 유래 분자를 생산하기 위한 방법에 있어서, 상기한 항체를 이용하여 PTP 단백질, 및/또는 PTP의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는 단편 또는 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 분리공정에 있어서, 상기 항체를 결합시킨 지지체에 의한 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침전이 바람직하게 이용된다.

또한, 본 발명의 목적은 PTP 및/또는 PTP 유래 분자의 조직내의 존재를 확인하기 위한 방법이고, 이러한 방법으로, 상기한 항체를 이용하여 면역조직학적 검사를 수행한다. 면역조직학적 검사로는 예를 들어 표지된 항체를 이용한in situ면역조직염색 등의 기술이 사용되고, PTP 단백질, 및/또는 PTP의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는 단편 또는 폴리펩티드의 검출을 수행한다.

본 발명자 등은 LAR에 대하여 특이적 면역반응성을 갖는 모노클로날 항체가, 갑상선 암세포(thyroid carcinoma cell)를 특이적으로 인식한다는 것을 확인하였다. 따라서, 본발명의 상기 항체는 갑상선암의 검진, 치료 등에 유용하다고 생각된다.

[실험예 1] LAR 돌연변이체에 의한 인슐린 수용체의 타이로신 인산화, 및 LAR과 인슐린 수용체와의 관련성에 대한 실험

먼저, LAR에 의한 인슐린의 신호전달 조절 메커니즘을 알아보기 위해서, LAR의 PTP 도메인의 촉매활성중심에 존재하는 시스테인을 세린으로 변환시킨 돌연변이형 LAR를 이용하는 전략으로 분석을 진행하였다.

a. LAR 및 인슐린 수용체의 발현벡터

LAR 발현벡터로서, (a) LAR WT; 사람 야생형 LAR(서열번호 3); (b) LAR C/S: 서열번호 3의 뉴클레오타이드 4983번 위치의 G를 C로 치환하는 것에 의해, LAR-PTP 도메인 1의 활성중심에 있는 시스테인(서열번호 3의 아미노산 1552번 위치)를 세린으로 변환한 것; 및, (c) LAR DC/S: LAR C/S에 대한 돌연변이에 추가로, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 5856번 위치의 G를 C로 치환하는 것에 의해, LAR-PTP 도메인 2의 시스테인(서열번호 3의 아미노산 1813번 위치)을 세린으로 변환시킨 것의 3종( 도 1 (b) 참조)를, pMT 발현 벡터에 도입시킨 것(Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897∼907, 1992 및 Streuli M. et al., EMBO J., 9, 2399∼2407, 1990 참조)를 이용하였다.

한편, 인슐린 수용체의 발현벡터는 (a) IR WT: 야생형; 및 (b) IR K1018M: 야생형의 인슐린 수용체의 ATP 결합부위의 1018번 위치의 라이신(lysine)을 메티오닌(methionine)으로 변환시켜 타이로신 키나아제 활성을 결핍시킨 인슐린 수용체 돌연변이형 2종류의 cDNA를 SRα 프로모터의 하류에 도입시킨 것(Kanai F.et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,195, 762-768, 1993)을 이용하였다.

b. COS-7 세포로의 형질감염

COS-7 세포를 1.0×10⁹세포수/8㎖/90φ디쉬로 되도록 10% 우태아 혈청 첨가 RPMI 1640 배지(니스이(Nissui) 제약회사)에 파종(播種)하여, 16시간 배양한 후, LAR C/S 및 IR WT 발현벡터를 DEAE-덱스트란법을 이용하여 COS-7세포에 공형질감염 시킨다. 이용된 LAR C/S는 상기① (b)에 기재된 바대로 돌연변이시켜, 시험관내에서 타이로신 포스파타아제 활성을 완전하게 결핍시킨 것이다(Streuli M.et al.,EMBO J.,9, 2399-2407, 1990). 공형질감염은 하기의 단계에 따라 수행한다. 먼저 2% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배양액(글루타민 0.3g, 카나마이신 0.1g을 함유하는 RPMI 1640배지(니스이(Nissui) 제약회사) 10.2g/ℓ, 10% NaHCO₃로 pH를 7.4로 조절) 4㎖에, 40㎕의 10mM 클로로퀸(chloroquine)을 첨가한다. 수득된 용액 2㎖에, LAR 발현벡터 5㎍ 및 IR 발현벡터 1㎍를 첨가하고, 잔사 용액 2㎖에 16㎕의 100㎎/㎖ DEAE-덱스트란을 첨가한다. 그런 다음, 두 용액들을 격렬하게 교반혼합을 한다. 제조된 발현벡터 용액 3.75㎖을, 1.0×10⁴세포수/8㎖/디쉬가 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO₂배양기 내에서 16시간 사전 배양한 COS-7 세포에 첨가한다. 사전배양과 동일한 조건으로 4시간 배양한 후에 10% DMSO 용액에서 2분간 처리하고, PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.4mM KH₂PO₄)로 세척한 후, 10% FCS를 함유한 RPMI 1640을 8㎖ 첨가하고, 37℃, 5% CO₂로 조절한 배양기 내에서 48시간동안 배양한다.

c. 인슐린 자극 및 세포용해액 제조

형질감염 종료 후, COS-7 세포를 혈청 무첨가 RPMI 1640 배양액 중에서 16시간 배양하고, 10^-7M 인슐린(세이카가쿠(Seikagaku)사 제조)에 일정시간, 즉 0, 1, 5, 15 및 30분간 자극을 수행한다. 여기에서, 0분 자극은 인슐린 자극을 수행하지만, 얼음위에 방치하고, 37℃에서 배양하지 않는 것이다. 인슐린 자극 개시로부터 각 시간이 경과한 후에, 배양액을 모두 흡인하고(aspiration), 즉 PBS w/Inh.(타이로신 포스파타아제 저해제 함유 PBS: 1mM 바나데이트, 5mM 나트륨 플루오라이드, 5mM 나트륨 포스페이트, 5mM EDTA-2Na, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄ㆍ12H₂O, 1.4mM KH₂PO₄)를 5㎖ 첨가한다. PBS w/Inh.으로 세포 전체를 세척한 다음, 액체를 흡인하여 제거하고, 세포에 용해용 완충액(1% Nonidet^TMP-40, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 5mM EDTA, 10mM 요오드아세트아미드, 10mM 나트륨 플루오라이드, 10mM 나트륨 포스페이트, 0.4mM 나트륨 바나데이트, 0.1mM 산화 페닐아르신, 1mM 벤자미딘, 1mM 페닐메틸설폰닐 플루오라이드)을 1㎖ 첨가하고, 세포 스크랩퍼(cell scrapper)를 이용하여 세포를 수집한다. 얻어진 세포현탁액을 1.5㎖ 튜브에 옮기고, 4℃에서 30분간 배양하는 것에 의해, 세포를 완전히 용해시킨다. 배양 후, 액체를 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 얻어진 상청액을 세포용해액으로 하여 하기의 실험에 이용한다.

d. 면역 침전

상기 c.에서 얻어진 세포용해액에 관하여, 항LAR E-서브유닛 항체(7.5㎍의 11.1A 및 7.5㎍의 753.A의 혼합물(Streuli M.et al.,EMBO J.,11, 897-907,1992 참조)를 이용하여 면역침전을 수행한다. 상기 세포용해액 1㎖에 대하여 모크(Mock)로서 MOPC21(마우스 IgG1κ:시그마사 제조)를 15㎍을 첨가하고, 4℃에서 1시간 배양한 후, γ-bind(GammaBin Plus Sepharose: Pharmacia Biotech사 제조) 20㎕를 첨가하고, 4℃에서 1시간 배양하는 것에 의해서 상기 흡수를 수행한다. 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리를 행하고, 상청액 950㎕를 다른 튜브에 옮긴다. 항LAR E-서브유닛 항체를 15㎍ 첨가하고, 4℃에서 1시간 배양한 후, γ-bind를 20㎕ 첨가하고, 추가로 4℃에서 1시간 배양한다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 침전물을 1㎖ 용해용 완충액으로 2회, PBS w/Inh.으로 1회 세척하고, 20㎕의 SDS 시료 완충액으로 현탁한다. 현탁액을 끓는 물에서 5분동안 가열하고, 전기영동 검체로 한다.

e. 면역블랏

상기 검사체를 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 한 후, 트랜스퍼 장치를 이용하여 400mA에서 4시간동안 니트로셀룰로오즈막(Schleicher & Schuell)으로 트랜스퍼한다. 상기 막을 3% 소혈청 알부민 용액 중 상온에서 30분 이상 배양하여 블로킹을 수행한다. 충분한 양의 TBS-T(Tween 20 함유 TBS: 10mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 10분간, 2회 이상 세척한 후, TBS-T로 50,000배 희석한 항인산화 타이로신 항체(4G10, UBI사), 항LAR E-서브유닛 또는 항인슐린 수용체-β쇄 항체(UBI사)를 첨가하고, 상온에서 1시간동안 진동교반한다. 충분한 양의 TBS-T로 5분간, 3회 이상 세척한 후, HRP 표지된 항마우스 IgG 항체(서양 고추냉이 퍼옥시다아제 표지 항체 마우스 IgG: Santa CruzBiotechnology사 제조) 1.5㎖을 포함하는 TBS-T 용액을 15㎖ 첨가하고, 상온에서 1시간동안 진동교반한다. 충분한 양의 TBS-T로 5분간, 3회 이상 세척한 후, 발광시약 키트(와코퓨어케미칼 산업 제조)를 이용하여 화학발광법(Chemiluminescence method)에 의해서, 각 항체에 결합하는 단백질의 밴드를 검출하였다.

f. 결과

상기한 바와 같이, LAR C/S 및 IR WT를 COS-7 세포에 공형질감염시키고, 인슐린으로 일정한 시간 자극한 후에, 제조된 세포용해액을 항LAR E-서브유닛 항체로 면역침전시킨 후, 항인산화 타이로신 항체로 면역블랏을 수행한 결과, 인슐린 자극 1분에서 인슐린 수용체-β쇄의 타이로산 인산화 및 85kDa 단백질의 타이로신 인산화가 확인되었다. 이들 타이로신 인산화는 인슐린 자극 후 30분이 되었을 때에도 유지되는 것이 확인되었다(도 2A 참조).

또한, 항LAR E-서브유닛 항체(도 2B), 항인슐린 수용체-β쇄 항체(도 2C) 및 항인산화 타이로신 항체(도 2A)를 이용한 면역블랏 결과, LAR 및 인슐린 수용체가 인슐린 수용체의 타이로신 인산화의 유무에 의해 연관되는 것도 밝혀졌다.

[실험예 2] 각종 LAR에 의한 인슐린 수용체의 타이로신 탈인산화의 실험(1)

다음으로, LAR WT, LAR C/S 및 LAR DC/S와 IR WT를 이용하여 동일한 방법으로 COS-7 세포에 공형질감염시키고, 인슐린으로 5분간 자극한 후, 항LAR E-서브유닛 항체에 면역침전시켜고, 침전물에 대한 각종 항체를 이용하여 면역블랏을 수행한다. 그 결과로, 인슐린 수용체 및 LAR WT를 공형질감염시킨 것은 LAR C/S 또는 ALR DC/S를 공형질감염시킨 것과 비교하여, 인슐린 수용체-β쇄 또는 85kDa 단백질의 타이로신 인산화가 전혀 검출되지 않았다(도 3 A 참조).

또한, 이 실험에서, LAR(도 3C) 또는 인슐린 수용체(도 3D)의 발현량은 각각의 공형질감염체에서 동일하므로, LAR WT는 인슐린 수용체-β쇄 또는 85kDa 단백질의 인산화 타이로신을 탈인산화한 것을 나타낸다.

또한, 항LAR E-서브유닛 항체에 의한 면역침전물을 항인슐린 수용체-β쇄 항체로 면역블랏한 결과, LAR DC/S를 공형질감염시킨 것에서는 LAR WT 또는 LAR C/S를 공형질감염시킨 것과 비교하여, 인슐린 수용체-β쇄의 밴드가 명백하게 희미해졌다(도 3B).

이런 결과는 LAR WT 또는 LAR C/S에 비교하여, LAR DC/S 및 인슐린 수용체의 연합이 약해졌다는 것을 나타낸다. LAR C/S 및 LAR DC/S의 차이점은 포스파타아제 도메인 2의 1813번째 아미노산뿐이므로, 타이로신 포스파타아제 활성을 나타내지 않고, 기질의 결합에 관여하는 것으로 유추되는 도메인 2가 LAR 및 인슐린 수용체의 결합에 기능하는 것으로 밝혀졌다.

[실험예 3] 각종 LAR에 의한 인슐린 수용체의 타이로신 탈인산화의 실험(2)

또한, 인슐린 수용체의 타이로신 인산화가 LAR에 결합만을 인식하는지, 또는 인슐린 수용체를 전체적으로 인식하는지를 검사하기 위해서, 상기 공형질감염체의 세포용해물을 전기영동한 후, 항인산화 타이로신 항체로 면역블랏을 수행한다. 그 결과로, LAR WT를 도입한 것만이 인슐린 수용체의 타이로신 탈인산화를 현저하게 인식하였다(도 4 참조).

[실험예 4] LAR C/S 존재하에서의 인슐린 수용체의 타이로신 인산화 실험

다음으로, 85kDa 단백질의 타이로신 인산화가 인슐린 수용체의 타이로신 키나아제 활성에 의한 것임을 확인하기 위해서, LAR C/S 및 IR WT 또는 인슐린 수용체의 타이로신 키나아제 활성을 없앤 IR L1018M(IR MT)를 COS-7 세포에 공형질감염시킨다. 5분간 인슐린 자극을 수행한 후, 항LAR E-서브유닛 항체로 면역침전하고, 항인산화 타이로신 항체로 면역블랏을 수행한다(도 5 참조). 그 결과, IR WT로 공형질감염시킨 것에서 인슐린 자극에 의한 인슐린 수용체-β쇄 및 85kDa 단백질의 타이로신 인산화가 확인되었지만, IR K1018로 공형질감염시킨 것에서는 이러한 인산화가 전혀 확인되지 않았다.

이상의 결과에 의해, 인슐린이 인슐린 수용체에 결합하여 인슐린 수용체 β쇄의 빠른 타이로신 인산화가 일어나고, 또한 인슐린 수용체 타이로신 키나아제가 85kDa 단백질의 타이로신 인산화를 일으키는 것이 확인되었다.

따라서, 상기 85kDa 단백질은 인슐린 수용체와 결합하는 것으로 확인된 LAR의 P-서브유닛일 가능성이 있다.

[실시예 1] 항타이로신 포스파타아제 P-서브유닛 항체의 제조

하기의 단계에 따라, 항타이로신 포스파타아제 P-서브유닛의 항체를 제조하였다.

a. 면역원의 제조

면역원으로서, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제-LAR 융합단백질(GST-LAR)을 이용한다. LAR P-서브유닛의 세포막 통과 부분의 말단으로 부터 세포질 영역 전부에 이르는 607 아미노산에 해당하는 cDNA(서열번호 1, 3467bp)를 pGEX-2T벡터(Pharmacia Biotech사 제조)의BamHI/EcoRI 부위에 도입한 발현 벡터를 이용하여, 통상적인 방법에 따라E.ColiAD202를 형질전환시킨다. 상기 대장균을 LB(Amp.+) 한천배지(7.5g 아가(agar)를 함유한 하기의 LB(Amp.+) 배지)에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 LB(Amp.+) 배지(트립톤 10g/ℓ, 효모 추출물 5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 5N NaOH 0.2㎖/ℓ 및 암피실린 50㎍/㎖ 함유) 50㎖에 접종하고, 하룻밤 더 배양한다. 배양액을 LB(Amp.+) 배지 500㎖에 접종하고, 37℃에서 600㎚의 흡광도가 약 1.0이 될 때까지 배양하고, 1M IPTG(이소프로필-β-D(-)-티오칼락토피라노사이드, 와코퓨어케미칼 산업 제조) 50㎕를 첨가한 후, 25℃에서 하룻밤 배양한다. 상기 배양물을 3,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하고, 침전된 군체를 NETN(0.5% Nonidet P-40, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM NaCl) 50㎖에 현탁한다. 그런 다음, 1 분간 초음파처리한 후, 얼음에 1분간 방치하는 조작을 2회 반복하여 실시하고, 14,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상청액을 얻는다. 상기 대장균 용해액 10㎖에 글루타티온 세파로오즈 비드 현탁액(Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech사 제조)를 NETN으로 3회 세척하고, 50% NETN 현탁액으로서 제조)을 100㎕ 첨가하고, 상온에서 30분간 배양한다. 얻어진 현탁액을 3,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 침전된 글루타티온 세파로오즈 비드를 NETN으로 2회, PBS로 1회 세척하고, SDS 시료 완충액(125mM Tris-HCl pH 6.8, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트, 5% 3-메르켑토에탄올)을 100㎕첨가한 후, 끓는 물에서 10분간 가열하여 GST-LAR 융합단백질을 용출한다. 비드를 제거한 용출액을 Centricon-10(아미콘사 제조)으로 옮기고, 3,000rpm, 4℃에서 45분간 원심농축한다. 완충화를 목적으로 1㎖의 PBS를 첨가하고, 다시 3,000rpm, 4℃에서 45분간 원심농축한다. 상기 완충화 조작을 2회 더 반복한 결과물을 면역용 항원용액으로 한다. 항원 단백질의 정제 및 농축은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한다.

한편, 최종 면역으로, 정맥내 투여를 수행하기 위해서, 상기와 다른 방법으로 항원용액을 제조한다. GST-LAR 융합 단백질을 발현하는 상기 대장균 용해액 및 글루타티온 세파로오즈 비드를 배양하고, 원심분리한 후, 침전된 비드를 NETN으로 2회, PBS로 3회 세척한다. 그런 다음, GSH 용출 완충액(20mM 글루타티온, 1M Tris-HCl, pH 9.6)을 100㎕ 첨가하고, 10분간 상온에서 가볍게 교반하여 GST-LAR를 용출시킨다. 3,000rpm 4℃에서 5분간 원심분리하여 상청액을 회수하는 조작을 총 3회 수행하고, 모든 용출액을 4℃에서 생리식염수로 2일간 투석한 것을 정맥내 투여용 항원 용액으로 한다.

b. 면역처리

6주된 암컷 Balb/c 마우스 8마리에 대해, 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸, 시그마사 제조)을 0.5㎖/마리로 복막내 투여한다. 2주 후, 복강내 면역용 항원용액을 프로인트 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant)(GIBCO사 제조)와 1:1로 혼합시키고, 에멀젼화한 것을 GST-LAR 융합 단백질이 약 10㎍/마리가 되도록 복막내 투여한다. 그럼 다음, 거의 2주마다 한 번씩 4회 복강내 면역용 항원용액과 플로인트 불완전 애주번트(Freund's incomplete adjuvant)(GIBCO사 제조)의 1:1 혼합물을 GST-LAR이 약 30∼70㎍/마리가 되도록 제조하여, 복강내 투여한다. 4회째 면역 후, 4일이 되었을 때, 안저정맥(眼底靜脈; ocular fundus vein)을 통해 채혈하고, 혈청중의 항체가를 ELISA법으로 측정한다.

c. ELISA

정맥내 면역용 항원과 동일한 방법으로 제조된 GST-LAR 및 GST만의 단백질 용액 각각을 정제수(精製水)에서 4℃에서 하룻밤 투석한다. 투석액을 PBS로 0.5㎍/㎖로 제조하고, 50㎕/웰로 ELISA 플레이트(Falcon 3911 MicroTest^TM, Flexible Assay Plate)에 1시간 흡착시킨다. 세척용 완충액(0.05% Tween20을 함유한 PBS)로 5회 세척한 후, 5% 탈지유(2.5g의 탈지유를 50㎖ PBS로 용해시켜 제조)로 블로킹을 수행한다. 이를 세척한 후, 상기 b.에서 얻어진 혈청을 혈청희석용 완충액(0.25% BSA를 함유한 PBS)로 16,000배 희석하고, 50㎕/웰씩 첨가한 후, 습윤 상자(wet box)에서 1시간 배양하였다. 플레이트를 세척한 후, 1,000배 희석한 HRP 표지된 항마우스 IgG항체를 50㎕/웰씩 첨가하고, 1시간동안 배양하였다. 세척용 완충액으로 4회, PBS로 1회 세척한 후,o-페닐렌디아민(와코퓨어케미칼사 제조)을 시트르산 완충액(5.6325g 시트르산 수화물, 18.25g Na₂HPO₄ㆍ12H₂O를 정제수로 용해하여, 500㎖로 제조)으로 1㎎/㎖의 농도로 용해시킨 기질 용액을 50㎕/웰이 되도록 첨가하고, 30분 동안 반응시킨 후, 50㎕의 10% H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 이중 50㎕를 측정용 96웰 플레이트(Sumitomo Bakelite사 제조)로 옮겨서 450㎚ 흡광도를 측정한다.

d. 세포융합

상기 ELISA의 결과에 의해 GST-LAR에 대한 항체가의 상승이 확인된 마우스 2마리에 정맥내 투여에 의해 최종 면역을 수행하고, 3일 후에 비장을 적출(摘出)하여 일반적인 방법에 의해 비장세포를 제조하였다.

세포융합을 위한 모세포는 사전에 20㎍/㎖의 8-아자구아닌을 함유한 배지로 선택하고, 히포크산틴, 구아닌, 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT) 결핍주인 것을 확인한 Balb/c 마우스 유래 골수종 세포주 NS1을 이용한다. 2×10⁷세포수의 NS1 세포와 1×10⁸세포수의 비장세포에 대하여, ClonaCell^TM- HY 하이브리도마 클로닝 키트(StemCell Technologies사)을 이용하여 세포융합 및 클로닝을 수행한다.

클로닝된 하이브리도마 배양 상청액의 스크리닝은 정맥내 면역용 항원과 동일한 방법으로 제조된 GST, GST-LAR 또는 GST-CD45(Furukawa, T.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91, 10928∼10932, 1994)의 단백질 용액 0.5㎍/㎖를 결합시킨 플레이트에서, 하이브리도마 배양 상청액 50㎕에 대하여 상기 c.의 ELISA법에 따라 수행한다. 상기 ELISA법에 대해서, GST를 결합시킨 웰에 면역반응을 나타내지 않고, GST-LAR 또는 GST-CD45를 결합시킨 웰에서 면역반응성을 나타내는 하이브리도마를 선택한다. 또한, 클로닝된 하이브리도마의 계대배양(繼代培養)은 10% 우태아혈청(GIBCO사 제조)를 함유하는 RPMI 1640 배양액(니스이 제약사 제조)으로 수행한다.

상기와 같이, HAT선택된 하이브리도마의 배양 상청액을 ELISA법에 의한 스크리닝을 통해, 항체 생산능력, 증식능력이 안정한 클론 YU2를 얻었다.

상기 하이브리도마 세포 YU2는 1998년 5월 7일자로 일본국 이바라키 츠쿠바 히가시 1-1-320에 소재한 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하였고, 수탁번호는 FERM BP-6344이다.

e. 모노클로날 항체의 타이핑(typing)

상기 d에서 얻어진 하이브리도마 세포 YU2의 배양상청액 0.5㎖을 4.5㎖의 TBS-T로 희석하고, 희석액 중 3㎖에 대해서 마우스 모노클로날 항체 이소타이핑 키트(Amersham Inernational plc.사 제조)를 이용하여, 이소타입(isotype)을 결정한다. 그 결과로, 항체의 이소타입은 IgG1κ인 것으로 판명되었다.

f. 모노클로날 항체의 제조 및 정제

6주된 암컷 Balb/c 마우스에 대해, 0.5㎖/마리의 프리스탄(pristane)을 복강내 투여하고, 10일 후에 상기 d의 클로닝으로 얻어진 하이브리도마 세포 YU2를 1마리당 2.5×10⁶∼1.3×10⁷세포수/0.5㎖/마리로 복막내에 주입한다. 10일정도 후에, 마우스의 복부 비대(肥大)를 확인하기 위해서, 20-게이지(gause)의 주사침을 이용하여 수회에 걸쳐 복수(腹水)를 채취한다. 채취된 복수는 1,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상청액 및 침전물로 분리하였다. 상청액은 37℃에서 30분간 처리한 후 4℃에서 하룻밤 방치한다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 얻어진 상청액 1.5㎖로 친화 컬럼 HiTrap ProteinG(Pharmacia Biotech사 제조)를 이용하여 모노클로날 항체 YU2를 정제한다. 수득된 항체 용액을 280㎚에서 흡광도를 측정하고, 마우스 IgG의 분자 흡광계수에 의해 항체농도를 계산하였다.

또한, 상기 모노클로날 항체 YU2에 관하여, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상의 이동도(移動度)로부터 각각의 보여진 분자량을 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에서 보는 바와 같이, 모노클로날 항체 YU2는 약 48kDa의 H쇄 및 약 25kDa의 L쇄를 포함하고, 약 146kDa의 분자량을 갖는다.

[실시예 2] 모노클로날 항체의 특이성 실험(1)

실험예 1의 a 및 b에 기재한 방법에 따라, LAR WT의 발현벡터를 COS-7 세포에 형질감염시킨다. 상기 세포용해액에 대해서, 실험예 1에서 수득된 정제 모노클로날 항체를 이용하여 면역침전시킨 후, 면역블랏을 수행하였다. 항LAR E-서브유닛항체(상기함), 항CD45항체(Santa Cruz Biotechnology사 제조, 35-76) 및 모노클로날 항체 YU2 모두는 IgG1 부류에 속하기 때문에, 면역침전의 대조로서 MOPC21을 이용한다.

상기 COS-7 세포로의 LAR 강제발현계를 이용한 분석에 의해, 항LAR E-서브유닛 항체로 면역침전한 후, 모노클로날 항체 YU2는 LAR P-서브유닛에 해당하는 85kDa 및 전구체(precursor)에 해당하는 약 200kDa의 단백질을 인식하였다.

또한, LAR을 형질감염시킨 COS-7 세포의 세포유출액을 이들 항체(IgG1, IgG2 또는 YU2)에 의해 면역침전시킨 후, LAR E-서브유닛을 인식하는 항체로 면역블랏을 수행한 결과, YU2의 항체로 면역침전시킨 것만, 즉 LAR E-서브유닛에 해당하는 150kDa, 전구체에 해당하는 200kDa의 단백질이 검출되었다(도 7A).

이상의 결과에 의해, 모노클로날 항체 YU2는 LAR의 P-서브유닛의 면역침전 및 면역블랏에 이용가능한 것이 밝혀졌다.

한편, YU2는 GST-CD45(Furukawa T.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91, 10928∼10932, 1994)를 항원으로 한 ELISA에서도 반응성을 나타낸 것으로부터, LAR 및 CD45는 공통항원(아마, 모두에 존재하는 PTP 도메인 내의 서열)을 에피토프(epitope)로서 인식하는 것이 제안되었다.

[실시예 3] 모노클로날 항체 특이성 실험(2)

모노클로날 항체 YU2의 특이성을 더 조사하기 위해서, 실험예 1에 기재된 것과 동일한 단계에 따라 COS-7세포에 CD45를 강제발현시키고, 그의 세포 유출액을 YU2를 이용하여 면역블랏 검사를 수행한 결과, 약 200kDa 및 약 180kDa의 위치에서 밴드가 확인되었다(도 8 참조).

시판되는 항CD45 항체에 의해서 재확인하였을 때에도, 동일한 위치에서 밴드가 검출되었기 때문에, 이들 밴드는 CD45인 것으로 확인되었다.

이상 실시예 2 및 3의 결과로부터, ELISA법에 의한 하이브리도마의 스크리닝에서 LAR 및 CD45의 세포내 도메인 모두에 반응성을 나타낸 클론으로서 선택된 YU2는 면역블랏에서도 CD45를 인식하는 것이 확인되었다.

LAR 및 CD45의 아미노산 서열의 세포내 도메인의 상동성을 도 9에 나타내었다. 도면 중에서, 두 개 모두의 아미노산 서열간에, 「*」는 동일한 아미노산을 나타내고, 「ㆍ」는 유사한 아미노산 서열을 나타낸다. LAR 및 CD45의 세포내 도메인 중 포스파타아제 도메인 1부터 C-말단까지의 아미노산을 비교하면, 39.4%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 특히, 도메인 1 내의 타이로신 포스파타아제 활성을 갖는 컨센서스 서열(consensus sequence) 주변부의 12 아미노산 (Val-Val-His-Cys-Ser-Ala-Gly-Val-Gly-Arg-Thr-Gly, 서열번호 4(서열번호 1의 아미노산 245∼256 위치)는 전체적으로 일한다(도 9중, 표시한 문자부분). 폴리펩티드가 항원결정기로 되는 것은 8∼10 아미노산 정도가 필수적으로 포함되어져야 하므로, YU2가 서열번호 4로 표시된 12 아미노산을 함유하는 포스파타아제의 컨센서스 서열을 에피토프로서 인식하는 것으로 생각된다.

도 9에서, LAR 및 CD45의 세포내 도메인의 다른 공지의 PTP(즉, PTPα, β, γ, δ, ε, σ, μ, κ, η, ξ 등)의 컨센서스 서열부분 8개에 대해 상자로 표시하였다. 상기 8개부분의 컨센서스 서열은 도메인 1 및 도메인 2에 대해서, 4종의 서열(도 11, (1)∼(4))의 반복적인 이러한 4종 서열이고, 상세하게는 다음과 같다:

(1) Phe-Trp-(Arg/Glu/Leu)-Met-(Val/Ile/Cys)-Trp (서열번호 5)

(2) Lys-Cys-(Ala/Asp)-(Gln/Glu/Lys)-Tyr-Trp-Pro (서열번호 6)

(3) Trp-Pro-Asp-(His/Phe)-Gly-Val (서열번호 7)

(4) Pro-Xaa-(Ile/Val)-(Ile/Val)-His-Cys-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Gly-Arg

-(Thr/Ser)-Gly (서열번호 8).

서열번호 4로 표시된 LAR 및 CD45의 상기 동일서열은 도메인 1의 상기 컨센서스 서열(4)에 포함된다. 이와 같은 PTP의 컨센서스 서열을 에피토프로서 인식하는 본 발명의 항체는 PTP의 분석 및 정량, 신규한 PTP의 동정, 검출 및 분리정제 등에 유용하게 인식할 것으로 생각된다.

또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 인슐린이 인슐린 수용체의 α쇄에 결합하면, 인슐린 수용체의 β쇄가 자기인산화되어 타이로신 키나아제 활성이 상승된다.상기 타이로신 키나아제의 활성에 의해서, 최종적으로 글루코오즈의 수용, 당대사 또는 세포증식 등과 같은 인슐린 작용이 발현된다. 본 출원인 등은 활성화된 인슐린 수용체는 LAR에 의한 타이로신 탈인산화를 통해 불활성화 상태로 되돌려지을 밝혀내었다(1998년 6월 5일 출원의 국제출원, PCT/JP98/02542). 또한, (1) 인슐린 수용체 타이로신 키나아제는 LAR의 세포내 도메인을 타이로신 인산화하는 것, (2) 이러한 인산화가 LAR의 기질특이성의 결정하거나, 포스파타아제의 활성의 상승에 관여하는 것, 및 (3) 인산화 타이로신을 LAR이 자기인산화하는 것에 의해 효소활성을 조절하는 것 등의 가능성을 제안하고, LAR의 효소활성의촉진이 인슐린 저항성의 원인이 되는 것을 분자 수준에서 예증하였다. 본 발명의 항체에 따라, 이와 같은 LAR 또는 CD45뿐만 아니라, 그 외의 PTP가 관여하는 인산화ㆍ탈인산화 등에 관계된 신호전달 물질 또는 각종의 조절물질을 해명하는 것이 가능하다.

본 발명에 따라 제공되는 PTP의 세포내 도메인에 대한 항체는 LAR 또는 CD45 및 LAR 모두의 세포내 도메인에 결합할 수 있다.

이러한 본 발명의 항체는 PTP의 포스파타아제 도메인의 컨센서스 서열을 인식하는 것으로 생각되기 때문에, PTP의 분석 및 정량, 신규 PTP의 동정 및 검출, 및 클로닝 등에 의해 신규 포스파타아제의 취득에 유용하다. 또한, 이들 항체는 인슐린의 신호전달 물질 또는 각종 조절물질을 해명하는데 매우 유용한 기술이 될 수 있다. 또한, 인슐린 저항성 및 NIDDM에 유용한 진단 방법을 개발하고, 또한 인슐린 저항성을 기반으로 하는 증후군 X의 각종 병증의 예방, 치료 등의 처방 및 진단, 그리고 동맥경화 및 심장질환의 예방 및 진단에 응용될 수 있다.

Claims (30)

1. 2종 이상의 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체.
2. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 타이로신 포스파타아제 중 1종 이상이 수용체형 단백질 타이로신 포스파타아제인 항체.
3. 제 2항에 있어서, 상기 수용체형 단백질 타이로신 포스파타아제가 LAR 및/또는 CD45인 항체.
4. 제 2항에 있어서, 상기 수용체형 단백질 타이로신 포스파타아제가 LAR 및 CD45인 항체.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 타이로신 포스파타아제의 포스파타아제 도메인에 대하여 특이성을 갖는 항체.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 항원으로 하여 제조되는 항체.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원으로서 단백질 타이로신 포스파타아제 도메인 및 그 외의 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 융합단백질을 이용하여 제조되는 항체.
9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원으로서 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합단백질을 이용하여 제조되는 항체.
10. 제 9항에 있어서, 상기 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합단백질이 GST를 코딩하는 유전자 영역 및 LAR의 포스파타아제 도메인을 코딩하는 유전자 영역을 함유하는 발현벡터를 대장균에 형질전환 또는 형질감염시키고, 상기 대장균을 20∼30℃에서 16∼24시간 배양하고, 그의 배양액 및/또는 균체로부터 융합 단백질을 단리하여 제조된 것인 항체.
11. 제 10항에 있어서, 상기 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합단백질이 글루타티온(glutathione)을 포함하는 지지체에 대한 친화성에 의해 정제된 것이고, 정제에 있어서, 계면활성제의 존재하에서 끓임으로써 융합단백질이 상기 지지체로부터 용출되어 단리된 것인 항체.
12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합단백질을 면역원으로 하여 제조된 항체가 상기 융합단백질을 이용하여 스크리닝(screening)되는 항체.
13. 수탁번호가 FREM BP-6344인 하이브리도마에 의해 생산되고, 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대하여 특이성을 갖는 모노클로날 항체.
14. 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 약 146 kDa의 분자량을 갖는 항체.
15. 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
16. 수탁번호가 FREM BP-6344인 하이브리도마 세포주.
17. 면역원으로서 단백질 타이로신 포스파타아제 도메인 및 그 외의 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 융합단백질을 이용함을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14중 어느 한 항의 항체의 제조방법.
18. 면역원으로서 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 14중 어느 한 항의 항체의 제조방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합단백질이 GST를 코딩하는 유전자 영역 및 LAR의 포스파타아제 도메인을 코딩하는 유전자 영역을 포함하는 발현벡터를 대장균에 형질전환 또는 형질감염시키고, 상기 대장균을 20∼30℃에서 16∼24시간 배양하고, 그의 배양액 및/또는 균체로부터 융합단백질을 단리함으로써 제조되는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 GST-LAR 포스파타아제 도메인 융합 단백질이 글루타티온을 함유하는 지지체에 대한 친화성에 의해 정제된 것이고, 정제에 있어서, 계면활성제의 존재하에서 끓임으로써, 융합단백질이 상기 지지체로부터 용출되어 단리되는 방법.
21. 제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합단백질은 면역원으로하여 제조된 항체가 상기 융합 단백질을 이용하여 스크리닝되는 것인 방법.
22. 단백질 타이로신 포스파타아제를 단리하기 위한 방법이

    단백질 타이로신 포스파타아제를 스크리닝하는 단계를 포함하고,

    상기 단백질 타이로신 포스파타아제를 스크리닝하는 단계에서 제 1항 내지제 14항 중 어느 한 항의 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 스크리닝이 cDNA 라이브러리의 발현 스크리닝인 방법.
24. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 항체를 사용하여 피검시료 중에 포함된 단백질 타이로신 포스파타아제의 단백질, 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는 단편 또는 폴리펩티드의 양을 측정하는, 단백질 타이로신 포스파타아제 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제 유래 분자의 정량방법.
25. 제 24항에 있어서, 상기 항체가 면역블랏, 면역침전 또는 ELISA 중 어느 하나를 사용하여 정량되는 정량방법.
26. 제 1항 내지 14항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여 피험시료 중에 함유된 단백질 타이로신 포스파타아제의 단백질, 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는 단편 또는 폴리펩티드를 단리하고, 단리된 단백질, 단편 또는 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 단백질 타이로신 포스파타아제 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제 유래 분자의 활성을 측정하기 위한 정량방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 단리단계에서 상기 항체를 결합시킨 지지체에 의한 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침전이 이용되는 방법.
28. 제 1항 내지 14항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여 단백질 타이로신 포스파타아제의 단백질, 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인의 일부분 이상을 포함하는, 단편 또는 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 단백질 타이로신 포스파타아제 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제 유래 분자의 제조방법.
29. 제 28항에 있어서, 상기 단리단계에서 상기 항체를 결합시킨 지지체에 의한 친화 크로마토그래피 및/또는 면역침전이 이용되는 방법.
30. 제 1항 내지 14항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여 면역 조직학적 검사를 수행하고, 단백질 타이로신 포스파타아제의 단백질, 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인의 일부분 이상을 함유하는 단편 또는 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함하는, 단백질 타이로신 포스파타아제 및/또는 단백질 타이로신 포스파타아제 유래 분자가 조직내에 존재하는지를 확인하기 위한 동정방법.