JPWO2007119787A1 - 心筋細胞の分化制御を司る脱リン酸化酵素 - Google Patents
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Abstract
心筋細胞の分化制御を司る脱リン酸化酵素ならびにその優性阻害酵素、さらにはこれらの酵素タンパク質をコードする遺伝子とそれらの利用法を提供することを課題とするものである。以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質等を用いる。（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
Description
本発明は、心筋細胞の分化制御を司る脱リン酸化酵素及びその優性阻害酵素に関する。
リン酸化シグナルは、真核生物に保存され多彩な生理過程に重要な役割を果たす。このうち、チロシン残基のリン酸化異常が、多くの遺伝的ならびに後天的疾患の発症に重要な役割を担っていることが知られており、現在多くのチロシンリン酸化酵素の阻害剤が臨床応用されている。
一方、脱リン酸化酵素は、リン酸化シグナル経路における、ある特定部位での脱リン酸化によりその経路を不活化する。脱リン酸化酵素のうち、チロシン脱リン酸化酵素は、様々な生理過程の調節に特異的、主体的にその機能を果たしていることが現在明らかになりつつある（非特許文献１〜３参照）。例えば、自己免疫疾患、糖尿病、遺伝性疾患、及び筋疾患の原因遺伝子として同定されたチロシン脱リン酸化酵素は、これまでに１４種ある。また癌発症との関連が指摘されるチロシン脱リン酸化酵素についても少なくとも３０種が知られている（非特許文献４参照）。しかしながら、それらの生理的役割ならびに標的経路が明らかとされていない現在において、臨床応用可能なチロシン脱リン酸化酵素の阻害剤の開発は未だ未発達な状況にある（非特許文献５参照）。
本発明者らは、これまでに、チロシン脱リン酸化酵素の一種であるdual specificity phosphatases (ＤＳＰｓ)を、degenerate polymerase chain reaction (ＰＣＲ)及びexpression sequence tag (ＥＳＴ) data searchを用いてヒトから２種類同定又はクローニングした（GenBank accession No. AB103375； GenBank accession No. AB103376）。これらのＤＳＰは、現在、それぞれＤＵＳＰ１３、ＤＵＳＰ２６として知られている。なお、ＤＵＳＰ１３については、マウスホモログであるＴＭＤＰ(testis-and skeletal-muscle-specific ＤＳＰ)が知られている。ＴＭＤＰは、マウスでは精巣、骨格筋に特異的に発現しており、マウスのＴＭＤＰは、精子形成への関与が指摘されている（非特許文献６参照）。
しかし、ヒトＤＵＳＰ１３、ＤＵＳＰ２６の生理的役割については、何ら知られていなかった。また、心臓においてその生理的役割及び心疾患との関連について報告のあるチロシン脱リン酸化酵素についても何ら知られていなかった。
Hunter T (1989) Cell. 58: 1013-1016 Mustelin T (2002) Curr Dir Autoimmun. 5: 176-190 Mustelin T et. al. (2002) Front Biosci. 7: 918-969 Andersen JN et. al. (2004) FASEB J. 18: 8-30 Alonso A et. al. (2004) Cell. 117: 699-711 Biochem. J. (1999) 344: 819-825
Hunter T (1989) Cell. 58: 1013-1016 Mustelin T (2002) Curr Dir Autoimmun. 5: 176-190 Mustelin T et. al. (2002) Front Biosci. 7: 918-969 Andersen JN et. al. (2004) FASEB J. 18: 8-30 Alonso A et. al. (2004) Cell. 117: 699-711 Biochem. J. (1999) 344: 819-825
本発明の課題は、心筋細胞の分化制御を司る脱リン酸化酵素ならびにその優性阻害酵素、さらにはこれらの酵素タンパク質をコードするＤＮＡとそれらの利用法を提供することにある。
本発明者らは、配列番号２に示されるアミノ酸配列や配列番号４に示されるアミノ酸配列が、心筋細胞の分化の制御に関与している二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）であることを見い出し、本発明を完成するに至った。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインを他のアミノ酸に置換すると、二重特異性ホスファターゼ活性が失われること、さらに配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインを他のアミノ酸に置換すると、二重特性ホスファターゼ活性が失われることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡや、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（２）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（３）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡや、
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（４）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（７）上記（５）に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、（８）上記（６）に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、（９）タンパク質が、心筋細胞の分化を促進する活性を有することを特徴とする上記（４）又は（５）に記載のタンパク質や、(１０)タンパク質が、心筋細胞の分化を抑制する活性を有することを特徴とする上記（２）又は（６）に記載のタンパク質に関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（２）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（３）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡや、
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（４）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質や、
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（７）上記（５）に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、（８）上記（６）に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、（９）タンパク質が、心筋細胞の分化を促進する活性を有することを特徴とする上記（４）又は（５）に記載のタンパク質や、(１０)タンパク質が、心筋細胞の分化を抑制する活性を有することを特徴とする上記（２）又は（６）に記載のタンパク質に関する。
また本発明は、（１１）上記（４）又は（５）に記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質や、（１２）上記（２）又は（６）に記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質に関する。
さらに本発明は、(１３) 上記（１）に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターや、(１４) 上記（３）に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターや、（１５）上記（７）に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターや、（１６）上記（８）に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターに関する。
また本発明は、（１７）上記（１３）又は（１４）に記載の組換えベクターが導入され、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体や、（１８）上記（１５）又は（１６）に記載の組換えベクターが導入され、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現する形質転換体に関する。
さらに本発明は、（１９）上記（４）若しくは（５）に記載のタンパク質、上記（１１）に記載の融合タンパク質、又は上記（１４）若しくは（１５）に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする心筋細胞の分化促進剤や、（２０）上記（２）若しくは（６）に記載のタンパク質、上記（１２）に記載の融合タンパク質、又は上記（１３）若しくは（１６）に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする心筋細胞の分化抑制剤に関する。
また本発明は、（２１）上記（１３）に記載の組換えベクターが導入され、上記（２）に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（２２）上記（１４）に記載の組換えベクターが導入され、上記（４）に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（２３）上記（１５）に記載の組換えベクターが導入され、上記（５）に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、（２４）上記（１６）に記載の組換えベクターが導入され、上記（６）に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、該心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
さらに本発明は、（２５）上記（１）又は（３）に記載のＤＮＡの、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を製造するための使用や、（２６）上記（５）又は（６）に記載のＤＮＡの、二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を製造するための使用に関する。
また本発明は、（２７）上記（４）又は（５）に記載のタンパク質を用いて、心筋細胞の分化促進を活性化する方法や、（２８）上記（２）又は（６）に記載のタンパク質を用いて、心筋細胞の分化抑制を活性化する方法に関する。
さらに本発明は、（２９）上記（２）又は（４）に記載のタンパク質を用いて、リン酸化されたアミノ酸から脱リン酸化されたアミノ酸を製造する方法に関する。
また本発明は、（３０）上記（２）、（４）、（５）、（６）のいずれかのタンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
本発明のＤＮＡとしては、（１）−（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；（３）−（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；（１）−（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（３）−（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（１）−（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（３）−（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（１）−（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；（３）−（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；（１）−（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（３）−（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（１）−（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（３）−（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；及び後述の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡであれば特に制限されない。
また、本発明のタンパク質としては、（２）−（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；（４）−（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；（２）−（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；（４）−（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；（２）−（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；（４）−（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；（５）−（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；（６）−（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；（５）−（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；（６）−（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；（５）−（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；（６）−（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質であれば特に制限されない。
ここで、「二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質」とは、リン酸化チロシンを脱リン酸化できるチロシンフォスファターゼにおいて、さらにリン酸化セリンあるいはリン酸化スレオニンを脱リン酸化する活性を有するタンパク質を意味する。あるタンパクが二重特異性ホスファターゼ活性を有するかどうかは、リン酸化されたＥＲＫやリン酸化されたＭＥＫ等の、リン酸化された適当な基質に適当な溶媒中でそのタンパクを作用させた場合に、リン酸化チロシンに加えて、リン酸化セリンあるいはリン酸化スレオニンが脱リン酸化されるかどうかを調べることによって容易に確認することができる。
ここで、「二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質」とは、例えば、二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質Ａ」という）を、本発明の二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質Ｂ」という）と同じモル濃度で共存させた場合のタンパク質Ｂの脱リン酸化活性が、タンパク質Ａを共存させなかった場合のタンパク質Ｂの脱リン酸化活性と比較して、９０％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは３０％以下となるようなタンパク質Ａをいう。ここで、脱リン酸化活性を測定する際に用いる基質としては、公知のいずれか一つの基質でよく、例えばＥＲＫ２を例示することができる。
なお、本発明のタンパク質のうち、（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、動物の心筋細胞の分化を調節する活性、特にラット心筋細胞の分化を促進する活性を有している。
本発明のタンパク質のうち、（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列や、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、動物の心筋細胞の分化を調節する活性を有していなくてもよいが、動物の心筋細胞の分化を調節する活性、特にラット心筋細胞の分化を促進する活性を有していることが好ましい。本発明における、動物の心筋細胞の分化を調節する活性とは、動物の心筋細胞の分化を促進又は抑制する活性をいい、ここでの動物は動物であれば特に制限されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒト、ラット、マウス、ウサギであることがより好ましく、ヒト、ラット又はマウスであることがさらに好ましい。
本発明のタンパク質のうち、（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列や、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、動物の心筋細胞の分化を調節する活性を有していなくてもよいが、動物の心筋細胞の分化を調節する活性、特にラット心筋細胞の分化を促進する活性を有していることが好ましい。本発明における、動物の心筋細胞の分化を調節する活性とは、動物の心筋細胞の分化を促進又は抑制する活性をいい、ここでの動物は動物であれば特に制限されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒト、ラット、マウス、ウサギであることがより好ましく、ヒト、ラット又はマウスであることがさらに好ましい。
また、本発明のタンパク質のうち、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、動物の心筋細胞の分化を調節する活性、特にラット心筋細胞の分化を抑制する活性を有している。また、（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質も、同様の効果を有している可能性がある。
本発明のタンパク質のうち、（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列や、（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、動物の心筋細胞の分化を調節する活性を有していなくてもよいが、動物の心筋細胞の分化を調節する活性、特にラット心筋細胞の分化を抑制する活性を有していることが好ましい。
本発明のタンパク質のうち、（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列や、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列や、（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、動物の心筋細胞の分化を調節する活性を有していなくてもよいが、動物の心筋細胞の分化を調節する活性、特にラット心筋細胞の分化を抑制する活性を有していることが好ましい。
あるタンパク質が、動物の心筋細胞の分化を促進する活性又は動物の心筋細胞の分化を抑制する活性を有しているかどうかは、例えば、ラット心筋細胞Ｈ９ｃ２中で前記タンパク質を発現させて培養した場合に、その心筋細胞の分化の程度を、そのタンパク質を発現させないＨ９ｃ２の分化の程度と比較することにより容易に確認することができる。分化の程度は、ＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔのいずれか１つ以上のタンパクの発現レベルを確認することにより調べることができる。ＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔのタンパクは、いずれも分化が進むと発現量が増える傾向にある。ラット以外の動物についても、同様の方法によって、その心筋細胞の分化を促進又は抑制する活性を有しているかどうか容易に確認することができる。
上記配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列からなるＤＮＡとしてはヒトＤＵＳＰ１３（ｈＤＵＳＰ１３）遺伝子を、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質としてはヒトＤＵＳＰ１３タンパク質を、上記配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列からなるＤＮＡとしてはヒトＤＵＳＰ２６（ｈＤＵＳＰ２６）遺伝子を、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質としてはヒトＤＵＳＰ２６タンパク質をそれぞれ挙げることができる。
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１や３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版"と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。また、同様の方法を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを取得でき、さらにこれらのＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１や３に示される塩基配列情報又は配列番号２や４に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
具体的には、本発明のＤＮＡが単離されたヒトより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
また、上記（Ａ）〜（Ｃ）、（Ｅ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異ＤＮＡ又は相同ＤＮＡとしては、配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
さらに、配列番号２や４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２や４に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２や４に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１や３に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１や３に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
本発明の融合タンパク質としては、上記本発明のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ(Horse Radish Peroxidase)等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ(hemagglutinin)、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ(glutathione S-transferase)、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、グルタチオンセファロースとＧＳＴタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（クローンテック社製）、ｐＧＢＴ−９(クローンテック社製)、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン社製）、ｐＥＦ-ＢＯＳ (Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990)、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
酵母用の発現ベクターとして、例えば、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社製）、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクターや、酵母用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換動物（細胞、組織、個体）、形質転換酵母等を挙げることができるが、形質転換動物（細胞、組織、個体）が好ましい。
形質転換酵母の作製に用いられる宿主酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces alluvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
本発明の心筋細胞の分化促進剤は、以下の（Ｉ）のタンパク質、以下の（II）の融合タンパク質、以下の（III）若しくは（IV）の組換えベクターのいずれかを含有している限り特に制限はされない。
（Ｉ）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（II）上記（I）に記載のいずれかのタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質
（III）以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（IV）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（Ｉ）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（II）上記（I）に記載のいずれかのタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質
（III）以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（IV）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
本発明の心筋細胞の分化抑制剤は、以下の（V）のタンパク質、以下の（VI）の融合タンパク質、以下の（VII）若しくは（VIII）の組換えベクターのいずれかを含有している限り特に制限はされない。
（V）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（VI）上記（V）に記載のいずれかのタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質
（VII）以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（VIII）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（V）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（VI）上記（V）に記載のいずれかのタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質
（VII）以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（VIII）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
本発明の心筋細胞の分化調節剤（分化促進剤及び分化抑制剤）は、本発明の効果を妨げない限り、上述の必須成分の他に任意成分を含有していてもよい。本発明の心筋細胞の分化調節剤（分化促進剤及び分化抑制剤）は、心筋細胞の分化と関連した心疾患の予防・治療剤としての用途も期待される。
本発明の心筋細胞の分化促進剤や分化抑制剤の使用方法は、心筋細胞の分化促進効果や分化抑制効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、これらの剤に含まれる上記（III）や（IV）の組換えベクターを、心筋細胞中に導入するなどして、上記（Ｉ）のタンパク質や上記（II）の融合タンパク質を心筋細胞中で発現させること等により用いることができる。
ここで、心筋細胞としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物の心筋細胞を好ましく例示することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれる１種又は２種以上をより好ましく例示することができる。
ここで、心筋細胞としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物の心筋細胞を好ましく例示することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれる１種又は２種以上をより好ましく例示することができる。
本発明の心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法としては、本発明の組換えベクターが導入され、かつ本発明のタンパク質を発現する形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、該心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する方法であれば特に制限されるものではないが、より詳しくは、本発明の組換えベクターが導入され、かつ本発明のタンパク質を発現する形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、該心筋細胞の分化の程度を測定する工程と、前記形質転換心筋細胞を前記被検物質の非存在下で培養した場合の分化の程度と比較し、前記被検物質が心筋細胞の分化に与えた影響を評価する工程を有する。ここで心筋細胞としては、動物の心筋細胞をいい、好ましくは、動物の胎児の心筋細胞等の、分化が終了していない、動物の心筋細胞をいう。動物としては、哺乳動物が好ましく、中でもヒト、マウス、ラット、ウサギ等がより好ましい。本スクリーニング方法に用いる形質転換体としては、形質転換動物をいう。形質転換動物における動物としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物が好ましく、非ヒト哺乳動物の中でもマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれる１種又は２種以上をより好ましく例示することができる。
なお、本発明の心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法には、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質の評価方法も含まれ、例えば、心筋細胞の分化を促進又は抑制することが知られている物質を被検物質として用いることも含まれる。
分化の程度は、ＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔのいずれか１つ以上のタンパクの発現レベルを確認することにより調べることができる。ＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔのタンパクは、いずれも分化が進むと発現量が増える傾向にある。ラット以外の動物についても、同様の方法によって、その心筋細胞の分化を促進又は抑制する活性を有しているかどうか容易に確認することができる。
被検物質が心筋細胞の分化を促進する活性を有しているかどうかは、被検物質の存否以外は同様の好適な条件で心筋細胞を培養した場合に、該被検物質の存在下で培養した方が分化が進むことを確認することにより容易に調べることができる、また、被検物質が心筋細胞の分化を抑制する活性を有しているかどうかは、被検物質の存否以外は同様の好適な条件で心筋細胞を培養した場合に、該被検物質の存在下で培養した方が分化の進行が遅れることを確認することにより容易に調べることができる。
また、本発明の心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法は、心筋細胞の分化と関連した心疾患の予防・治療剤となり得る物質のスクリーニング方法への応用も期待される。
また、本発明における以下の（IX）のＤＮＡは、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を製造するために使用することができる。
（IX）以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（IX）以下の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
また、本発明における以下の（X）のＤＮＡは、二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を製造するために使用することができる。
（X）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（X）以下の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
また、本発明には、本発明における心筋細胞の分化を促進する活性を有するタンパク質を用いて、心筋細胞の分化促進を活性化する方法や、本発明における心筋細胞の分化を抑制する活性を有するタンパク質を用いて、心筋細胞の分化抑制を活性化する方法も含まれる。
さらに、本発明には、本発明における二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を用いて、リン酸化されたアミノ酸から、脱リン酸化されたアミノ酸を製造する方法も含まれる。
また、本発明の抗体は、ＤＵＳＰ１３やＤＵＳＰ２６等の本発明のいずれかのタンパク質に特異的に結合する抗体である限り特に制限されない。本発明のいずれかのタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本発明のタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、本発明のタンパク質の変異又は欠失に起因する疾病の診断や本発明のタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
本発明のタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該タンパク質若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
また、本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
また上記の本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
「本発明のタンパク質に特異的に結合する」という語は、平衡解離定数ＫＤが１０−７〜１０−１０Ｍの範囲で、抗体が本発明のタンパク質と結合する能力を有することを意味する。本発明の方法によって産生される抗体またはその断片の平衡解離定数ＫＤは当業者によって選択される任意の適切な方法によって決定することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．インビトロの脱リン酸化活性試験
ヒトＨｅＬａ細胞又はヒト組織由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子及びヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子をクローニングした。ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また、ヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、High Fidelity DNA ポリメラーゼであるKOD-Plus- (東洋紡社製）を用い、９８℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間を１サイクルとして、これを３５サイクル行った（Perkin-Elmer社製のGene Amp PCR Systemを使用）。このように、ヒトＤＵＳＰ１３（ｈＤＵＳＰ１３）及びヒトＤＵＳＰ２６（ｈＤＵＳＰ２６）のクローニングを行った。それぞれのアミノ酸配列を、配列番号２及び配列番号４にそれぞれ示す。また、ヒトＤＵＳＰ１３及びヒトＤＵＳＰ２６のそれぞれの脱リン酸化酵素の触媒ドメインを図１及び図２のグレイボックスに示す。この触媒ドメインはこれまでに報告されたＤＳＰｓと同様に保存されている。図中、抗体作製時にウサギに免疫した各々のペプチド配列（図１及び図２の二重下線部）を示す。
ヒトＨｅＬａ細胞又はヒト組織由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子及びヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子をクローニングした。ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また、ヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、High Fidelity DNA ポリメラーゼであるKOD-Plus- (東洋紡社製）を用い、９８℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間を１サイクルとして、これを３５サイクル行った（Perkin-Elmer社製のGene Amp PCR Systemを使用）。このように、ヒトＤＵＳＰ１３（ｈＤＵＳＰ１３）及びヒトＤＵＳＰ２６（ｈＤＵＳＰ２６）のクローニングを行った。それぞれのアミノ酸配列を、配列番号２及び配列番号４にそれぞれ示す。また、ヒトＤＵＳＰ１３及びヒトＤＵＳＰ２６のそれぞれの脱リン酸化酵素の触媒ドメインを図１及び図２のグレイボックスに示す。この触媒ドメインはこれまでに報告されたＤＳＰｓと同様に保存されている。図中、抗体作製時にウサギに免疫した各々のペプチド配列（図１及び図２の二重下線部）を示す。
ヒトＤＵＳＰ１３タンパクやヒトＤＵＳＰ２６タンパクが脱リン酸化酵素活性を有するかどうかを確かめるために、以下のような実験を行った。
上述のＰＣＲにより得られたヒトＤＵＳＰ１３タンパクをコードするＤＮＡ及びヒトＤＵＳＰ２６タンパクをコードするＤＮＡをそれぞれ、ＧＳＴ遺伝子を有するｐＧＥＸ(Amersham Biosciences)ベクターにつなぎ、該ベクターで大腸菌を形質転換して、ＧＳＴ(glutathione S-transferase) 融合タンパクを大腸菌内で発現させた。これらの融合タンパクを、グルタチオンセファロース４Ｂ(Amersham Biosciences)を用いてアフィニティ精製した。このようにしてヒトＤＵＳＰ１３タンパク、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクを精製した。
一方、部位特異的変異導入法を用いて、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクの１３８番目のシステインがセリンに置換されたタンパクをコードするＤＮＡを作製した。このＤＮＡをｐＧＥＸベクターにつなぎ、該ベクターで大腸菌を形質転換して、ＧＳＴ(glutathione S-transferase) 融合タンパクを大腸菌内で発現させた。この融合タンパクを、グルタチオンセファロース４Ｂ(Amersham Biosciences)を用いてアフィニティ精製した。このようにして１３８番目のシステインがセリンに置換されたヒトＤＵＳＰ１３タンパク（以下、「ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓタンパク」という）を精製した。同様の方法により、１５２番目のシステインがセリンに置換されたヒトＤＵＳＰ２６タンパク（以下、「ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓタンパク」という）を精製した。
精製して得られたヒトＤＵＳＰ１３タンパク、ヒトＤＵＳＰ２６タンパク、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓタンパク、ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓタンパクの脱リン酸化酵素活性を、パラニトロフェニルフォスフェート(ｐＮＰＰ)を基質として測定した。また、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤であるソディウムバナデート（Vanadate）をパラニトロフェニルフォスフェートに添加して、同様の脱リン酸化酵素活性試験を行った。その結果を図３に示す。なお、ＤＵＳＰ１９とは、本発明者らが既に単離したヒトＤＵＳＰタンパク質である。
図３左上及び図３中央上の結果から分かるように、ヒトＤＵＳＰ１３タンパク及びヒトＤＵＳＰ２６タンパク（以下、「野生型タンパク」という）においては、脱リン酸化酵素活性が時間依存的及び量依存的に検出された。一方、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓタンパク及びＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓタンパク（以下、「ＣＳ変異体タンパク」という）には、脱リン酸化酵素活性が認められなかった。また、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤であるソディウムバナデート（Vanadate）の存在下（濃度１ｍＭ）では、野生型タンパクにも脱リン酸化酵素活性が認められなかった。このことは、かかるＣＳ変異体タンパクが酵素活性欠失タンパクとして優性阻害酵素の機能を持ち得ることを示唆した。
また、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクが、脱リン酸化酵素の中でも、リン酸化チロシン、リン酸化セリン及びリン酸化スレオニンのリン酸基を脱リン酸化するＤＳＰ（Dual Specificity Phosphatase）であることを示すために、活性化された際に、既知のチロシン及びスレオニンが同時にリン酸化されるＥＲＫ２タンパク、あるいはセリンがリン酸化されるＭＥＫ１タンパクを基質として用いた。
ＥＲＫ２をコードするＤＮＡに、ＧＳＴタグをコードするＤＮＡをつなげてベクターに乗せ、該ベクターをＨｅＬａ細胞に形質導入し、ＧＳＴ−ＥＲＫ２タンパクを発現させた。８時間の血清除去後、ＥＲＫ２を活性化することが知られるホルボールエステル（Treatment）でこの細胞を処理し、ＧＳＴ−ＥＲＫ２タンパクにおける既知のチロシン及びスレオニンを同時にリン酸化させた。このＧＳＴ−ＥＲＫ２タンパクを、グルタチオンセファロースを用いて沈殿させ、そこに所定量のヒトＤＵＳＰ１３タンパクを添加し又は添加せずに、バッファー中において３７℃で６０分間アッセイを行った。アッセイの後、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、抗リン酸化スレオニン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ＧＳＴ−ＥＲＫ２タンパクの特定のスレオニン(Ｔｈｒ)残基の脱リン酸化の程度を検出した（図３左下の上から１番目のパネル参照）。また、抗リン酸化スレオニン抗体の代わりに、抗リン酸化チロシン抗体を用いて同様の実験を行い、ＧＳＴ−ＥＲＫ２タンパクの特定のチロシン(Ｔｙｒ)残基の脱リン酸化の程度を検出した（図３左下の上から２番目のパネル参照）。また、ＥＲＫの活性化の際にリン酸化されるスレオニン残基及びチロシン残基を認識する抗リン酸化ＥＲＫ抗体を用いて同様の実験を行ったが、これらの残基の脱リン酸化の程度は、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクの濃度にほとんど依存しないことを確認した（図３左下の上から３番目のパネル参照）。また、抗リン酸化スレオニン抗体の代わりに、抗ＥＲＫ抗体を用いて同様の実験を行い（図３左下の上から４番目のパネル参照）、どのレーンにもＧＳＴ−ＥＲＫ２タンパクがほぼ同量含まれていることを確認した。なお、一番左のレーンは、ＥＲＫ２を活性化することが知られるホルボールエステルで処理しておらず、他のレーンとの比較により、非活性型のＥＲＫ２におけるチロシンやスレオニンのリン酸化の程度が低いことが示される。
ＭＥＫ１をコードするＤＮＡに、ＨＡタグをコードするＤＮＡをつなげてベクターに乗せ、該ベクターをＨｅＬａ細胞に形質導入し、ＨＡ−ＭＥＫ１タンパクを発現させた。ＭＥＫ１を活性化することが知られている血清刺激（ｓｅｒｕｍ）でこの細胞を処理し、ＨＡ−ＭＥＫ１タンパクの２１７番目のセリン（Ｓｅｒ）残基をリン酸化させた。このＨＡ−ＭＥＫ１タンパクを、抗ＨＡ抗体（anti-HA）にて免疫沈降を行い（ＩＰ：immunoprecipitation）、そこに所定量のヒトＤＵＳＰ１３タンパクを添加し又は添加せずに、バッファー中において３７℃で６０分間アッセイを行った。アッセイの後、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、前述のセリン残基のリン酸化を検知する抗リン酸化ＭＥＫ１／２抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ＨＡ−ＭＥＫ１タンパクの特定のセリン残基の脱リン酸化の程度を検出した（図３中央下の上から１番目のパネル参照）。なお、一番左のレーンは、ＭＥＫ１を活性化することが知られる血清刺激処理をしておらず、他のレーンとの比較により、非活性型のＭＥＫ１におけるセリンのリン酸化の程度が低いことが示される。
２．インビボの脱リン酸化活性試験
ヒトＤＵＳＰ１３タンパク及びヒトＤＵＳＰ２６タンパクが細胞内においても脱リン酸化酵素活性を持ち得るかどうかを確認するために、まず各々の細胞内局在を調べた。Ｎ末にＭｙｃタグを付けたヒトＤＵＳＰ１３タンパクをコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクター（ｐＭＥベクター）に組換えた後、該ベクターをＨｅＬａ細胞に導入して、該組み換えタンパクを一過性に発現させた。ＤＮＡ導入１０時間後において、細胞を４％パラホルムアルデヒドにて室温、１５分間での固定を行い、その後、０.２％のトライトンＸ-１００を用いて膜の透過処理をした。処理後、抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）を一次抗体として反応させて、洗浄した後、ＦＩＴＣ (fluorescein isothiocyanate) でラベルされた抗マウスＩｇＧ二次抗体を反応させて細胞免疫染色を行った。細胞免疫染色を行った細胞を共焦点顕微鏡で観察し、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクの局在を調べた。また、Ｎ末にＭｙｃタグを付けたヒトＤＵＳＰ２６タンパクをコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクター（ｐＭＥベクター）に組換えた後、該ベクターをＨｅＬａ細胞に導入して、該組み換えタンパクを一過性に発現させた。前述同様に、ＤＮＡ導入１０時間後、抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）を一次抗体として反応させて、洗浄した後、ＦＩＴＣでラベルされた抗マウスＩｇＧ二次抗体を反応させて細胞免疫染色を行った。細胞免疫染色を行った細胞を共焦点顕微鏡で観察し、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクの局在を調べた。これらの結果を図４及び図５左に示す。なお、図４の左下は、ＤＵＳＰ１３を一過性発現させた上記ＨｅＬａ細胞を、ＦＩＴＣでラベルされた抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて、ＤＵＳＰ１３を免疫染色すると共に、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅでラベルされたファロイジン(インビトロジェン社製)を用いて細胞染色したものを示す。ファロイジンはアクチンに結合し細胞膜の局在を示し、今回の実験においては、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅによって赤色の蛍光像で見える。そのため、ＤＵＳＰ１３の局在を示すＦＩＴＣの緑色と重なると黄色に見える。図４左下では、核は緑色に見え、細胞膜が黄色く見えた。
図４及び図５左から分かるように、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクは、核周囲及び細胞膜に局在が認められ、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクは、核及び核周囲に局在が認められた。
ヒトＤＵＳＰ１３タンパク及びヒトＤＵＳＰ２６タンパクが細胞内においても脱リン酸化酵素活性を持ち得るかどうかを確認するために、まず各々の細胞内局在を調べた。Ｎ末にＭｙｃタグを付けたヒトＤＵＳＰ１３タンパクをコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクター（ｐＭＥベクター）に組換えた後、該ベクターをＨｅＬａ細胞に導入して、該組み換えタンパクを一過性に発現させた。ＤＮＡ導入１０時間後において、細胞を４％パラホルムアルデヒドにて室温、１５分間での固定を行い、その後、０.２％のトライトンＸ-１００を用いて膜の透過処理をした。処理後、抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）を一次抗体として反応させて、洗浄した後、ＦＩＴＣ (fluorescein isothiocyanate) でラベルされた抗マウスＩｇＧ二次抗体を反応させて細胞免疫染色を行った。細胞免疫染色を行った細胞を共焦点顕微鏡で観察し、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクの局在を調べた。また、Ｎ末にＭｙｃタグを付けたヒトＤＵＳＰ２６タンパクをコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクター（ｐＭＥベクター）に組換えた後、該ベクターをＨｅＬａ細胞に導入して、該組み換えタンパクを一過性に発現させた。前述同様に、ＤＮＡ導入１０時間後、抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）を一次抗体として反応させて、洗浄した後、ＦＩＴＣでラベルされた抗マウスＩｇＧ二次抗体を反応させて細胞免疫染色を行った。細胞免疫染色を行った細胞を共焦点顕微鏡で観察し、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクの局在を調べた。これらの結果を図４及び図５左に示す。なお、図４の左下は、ＤＵＳＰ１３を一過性発現させた上記ＨｅＬａ細胞を、ＦＩＴＣでラベルされた抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて、ＤＵＳＰ１３を免疫染色すると共に、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅでラベルされたファロイジン(インビトロジェン社製)を用いて細胞染色したものを示す。ファロイジンはアクチンに結合し細胞膜の局在を示し、今回の実験においては、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅによって赤色の蛍光像で見える。そのため、ＤＵＳＰ１３の局在を示すＦＩＴＣの緑色と重なると黄色に見える。図４左下では、核は緑色に見え、細胞膜が黄色く見えた。
図４及び図５左から分かるように、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクは、核周囲及び細胞膜に局在が認められ、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクは、核及び核周囲に局在が認められた。
３．ヒトＤＵＳＰ１３及びヒトＤＵＳＰ２６の細胞内分画における脱リン酸化活性試験
次に、上記の両組み換えタンパクを発現させた両細胞の細胞抽出液を細胞質、膜系細胞小器官、核、細胞骨格にて分画した。得られたそれぞれのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングにてそれらの細胞内分画を検出した。その結果を図５右の一番上のパネルに示す。
図５右の一番上のパネルから分かるように、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクは細胞質画分（Ｆ１：Ｃｙｔｏｓｏｌ）及び膜系細胞小器官画分（Ｆ２：Ｍｅｍｂｒａｎｅ／Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）に存在することが認められ、一方、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクは細胞骨格画分（Ｆ４：Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）に存在することが認められた。
次に、上記の両組み換えタンパクを発現させた両細胞の細胞抽出液を細胞質、膜系細胞小器官、核、細胞骨格にて分画した。得られたそれぞれのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングにてそれらの細胞内分画を検出した。その結果を図５右の一番上のパネルに示す。
図５右の一番上のパネルから分かるように、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクは細胞質画分（Ｆ１：Ｃｙｔｏｓｏｌ）及び膜系細胞小器官画分（Ｆ２：Ｍｅｍｂｒａｎｅ／Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）に存在することが認められ、一方、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクは細胞骨格画分（Ｆ４：Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）に存在することが認められた。
また、ＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)タグをＮ末に付加した、ヒトＤＵＳＰ１３タンパク及びヒトＤＵＳＰ２６タンパクをコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクター（ｐＥＧＦＰ-Ｃ３: クローンテック社）に組換えた後、該ベクターをＨｅＬａ細胞に導入した。導入後、７５０ μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地にて３週間培養を行い、各々の安定発現細胞株 (ＧＦＰ-ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ)を作製し、いくつかのクローンを得た。同様に、ＤＵＳＰ１３の１３８番目のシステイン (Ｃｙｓ)がセリン (Ｓｅｒ)に置換された変異体、及びＤＵＳＰ２６の１５２番目のシステイン (Ｃｙｓ)がセリン (Ｓｅｒ)に置換された変異体の安定発現細胞株（ＧＦＰ-ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａ）を作製した。作製後、これらを用いて、細胞内局在ならびに細胞内分画を調べたところ、図４及び図５と同様の結果を得た。
４．ヒトＤＵＳＰ１３又はヒトＤＵＳＰ２６の安定発現細胞の細胞内分画における脱リン酸化活性試験
次に、これらの安定発現細胞株ＧＦＰ-ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａを用いて、発現させたタンパクの細胞内分画における脱リン酸化酵素活性を確認した。各々において作製した安定発現細胞株のクローン番号を括弧内に示す。ＧＦＰ−ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ（ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ（４−１））及びＧＦＰ−ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ（ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ（９−２））については、発現させたこれらの細胞内タンパクを、安定発現細胞株から抗ＤＵＳＰ１3抗体を用いて免疫沈降し（ＩＰ：immunoprecipitation）、その脱リン酸化酵素活性をパラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として測定した。その結果、ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ（４−１）からの抗ＤＵＳＰ１３抗体による免疫沈降物の酵素活性は、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａ及びＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ（９−２）からの免疫沈降物と比較してより高い脱リン酸化酵素活性を認めた。このことはＤＵＳＰ１３タンパクが細胞内においても酵素活性を有することを示唆した（図６左）。また、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａを用いた場合と同様に、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａを用いた場合は、抗ＤＵＳＰ１３抗体を用いて免疫沈降した場合（ＤＵＳＰ１３ ＩＰ＋）と、該抗体を用いた免疫沈降を行わなかった場合（ＤＵＳＰ１３ ＩＰ−）とで脱リン酸化酵素活性に有意な差が見られなかったことから、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓは細胞内でも脱リン酸化活性がないことが確認された（図６左）。
次に、これらの安定発現細胞株ＧＦＰ-ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ、ＧＦＰ-ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａを用いて、発現させたタンパクの細胞内分画における脱リン酸化酵素活性を確認した。各々において作製した安定発現細胞株のクローン番号を括弧内に示す。ＧＦＰ−ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ（ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ（４−１））及びＧＦＰ−ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ（ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ（９−２））については、発現させたこれらの細胞内タンパクを、安定発現細胞株から抗ＤＵＳＰ１3抗体を用いて免疫沈降し（ＩＰ：immunoprecipitation）、その脱リン酸化酵素活性をパラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として測定した。その結果、ＤＵＳＰ１３／ＨｅＬａ（４−１）からの抗ＤＵＳＰ１３抗体による免疫沈降物の酵素活性は、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａ及びＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａ（９−２）からの免疫沈降物と比較してより高い脱リン酸化酵素活性を認めた。このことはＤＵＳＰ１３タンパクが細胞内においても酵素活性を有することを示唆した（図６左）。また、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａを用いた場合と同様に、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／ＨｅＬａを用いた場合は、抗ＤＵＳＰ１３抗体を用いて免疫沈降した場合（ＤＵＳＰ１３ ＩＰ＋）と、該抗体を用いた免疫沈降を行わなかった場合（ＤＵＳＰ１３ ＩＰ−）とで脱リン酸化酵素活性に有意な差が見られなかったことから、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓは細胞内でも脱リン酸化活性がないことが確認された（図６左）。
一方、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａ、ＧＦＰ−ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ（ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ（５））、ＧＦＰ−ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａ（ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａ（２））のそれぞれのトライトン可溶画分について、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫沈降した（ＩＰ：immunoprecipitation）サンプル（ＧＦＰ ＩＰ＋）と免疫沈降しなかったサンプル（ＧＦＰ ＩＰ−）を作製した。そこで、これらの各サンプルについてパラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）を基質とした脱リン酸化酵素活性の測定を行った。その結果、いずれの細胞のサンプルにおいても、抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降したものと免疫沈降しなかったものとの間で脱リン酸化酵素活性の差が見られず（図６中央の下パネル参照）、いずれの細胞にも細胞内脱リン酸化酵素活性が可溶画分には認められなかったことが示された。次に、これらの各サンプルについて抗ＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果、３２．５Ｋより下に特異的なバンドが確認された（図６中央の上パネル２番目のレーン参照）。この３２．５Ｋのバンドは、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａにおいてのみ検出されていることから、ＥＧＦＰそのものの発現を意味する。一方、他のサンプルにおいては、ＥＧＦＰを付加したＤＵＳＰ２６を示唆する４７．５Ｋ付近のバンドが検出されなかった。このことから、前述の結果に一致して、ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ（５）及びＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａ（２）のいずれの細胞においても、ＤＵＳＰ２６が可溶画分に存在しないことが示された。
そこで、ＤＵＳＰ２６の発現を認めたトライトン不溶画分に、パラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として加え、その脱リン酸化酵素活性を測定した。その結果、ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ（５）からの不溶画分には、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａ及びＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａ（２）からの不溶画分と比較して、より高い脱リン酸化酵素活性を検出した（図６右）。この結果とＤＵＳＰ２６の細胞内分画（図５）における結果から、ＤＵＳＰ２６が細胞骨格上において活性を有することが示唆された。
そこで、ＤＵＳＰ２６の発現を認めたトライトン不溶画分に、パラニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として加え、その脱リン酸化酵素活性を測定した。その結果、ＤＵＳＰ２６／ＨｅＬａ（５）からの不溶画分には、Ｖｅｃｔｏｒ／ＨｅＬａ及びＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／ＨｅＬａ（２）からの不溶画分と比較して、より高い脱リン酸化酵素活性を検出した（図６右）。この結果とＤＵＳＰ２６の細胞内分画（図５）における結果から、ＤＵＳＰ２６が細胞骨格上において活性を有することが示唆された。
５．各組織におけるヒトＤＵＳＰ１３又はヒトＤＵＳＰ２６等のｍＲＮＡの発現
ヒト及びマウス組織における各々のｍＲＮＡの発現レベルについて、各組織のfirst-strand ｃＤＮＡを特異的なプライマーにてＰＣＲ増幅し、Ｇ３ＰＤＨを内部標準として半定量ＰＣＲにて検出した。その結果、ヒトにおいては、各ｍＲＮＡ共に心臓（ｈｅａｒｔ）に発現を認めたが（図７左）、マウスにおいては、各ｍＲＮＡの心臓での発現は検出できず、また各々に明らかな組織特異性を認めた（図７右）。一方、本発明者が既に単離したｈＤＵＳＰ２２、ｈＤＵＳＰ１４ならびにｈＤＵＳＰ１９については、そのｍＲＮＡに組織特異性は認められなかった（図７）。さらに、ヒト心臓においては、各ｍＲＮＡ共に胎児よりも成人において発現が増し（図８）、ｈＤＵＳＰ１３については、左右の心房、心耳、心室、ならびに心室間中隔、房室結節において発現を認めたが、ｈＤＵＳＰ２６については、心尖部、左心房、ならびに心室間中隔においてのみ発現が検出され、左右心室には明らかな発現は認められなかった（図８）。
ヒト及びマウス組織における各々のｍＲＮＡの発現レベルについて、各組織のfirst-strand ｃＤＮＡを特異的なプライマーにてＰＣＲ増幅し、Ｇ３ＰＤＨを内部標準として半定量ＰＣＲにて検出した。その結果、ヒトにおいては、各ｍＲＮＡ共に心臓（ｈｅａｒｔ）に発現を認めたが（図７左）、マウスにおいては、各ｍＲＮＡの心臓での発現は検出できず、また各々に明らかな組織特異性を認めた（図７右）。一方、本発明者が既に単離したｈＤＵＳＰ２２、ｈＤＵＳＰ１４ならびにｈＤＵＳＰ１９については、そのｍＲＮＡに組織特異性は認められなかった（図７）。さらに、ヒト心臓においては、各ｍＲＮＡ共に胎児よりも成人において発現が増し（図８）、ｈＤＵＳＰ１３については、左右の心房、心耳、心室、ならびに心室間中隔、房室結節において発現を認めたが、ｈＤＵＳＰ２６については、心尖部、左心房、ならびに心室間中隔においてのみ発現が検出され、左右心室には明らかな発現は認められなかった（図８）。
６．ＤＵＳＰ１３のタンパクレベルでの内在性発現
次に、ＤＵＳＰ１３のタンパクレベルでの内在性発現を確認するために、上記ｍＲＮＡにて発現が確認されたヒト心臓及びヒト骨格筋衛星細胞(ＳｋＭＣ)の細胞抽出液をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、その後、抗ＤＵＳＰ１３抗体にてウェスタンブロッティングを行った。その結果、予測された分子量２３ｋＤａ付近にＤＵＳＰ１３の発現を検出したが、ヒト脳、ヒト冠状動脈内皮細胞においては認められなかった（図９中央）。一方、ＤＵＳＰ２２については、ヒト脳、心臓、骨格筋細胞及び冠状動脈内皮細胞のいずれにおいても、抗ＤＵＳＰ２２抗体を用いた同一メンブレン上でのウェスタンブロッティングによって発現を認めた（図９中央）。
ＤＵＳＰ１３に対する抗体（anti-DUSP13）は、ｈＤＵＳＰ１３のＮ末端から１７アミノ酸残基からなるペプチド（図１左及び図２左の二重下線部参照）をウサギに免疫し、血清をＩｇＧ精製後作製したもので、大腸菌で発現、精製した各ＤＳＰ組換えタンパクに対し、ＤＵＳＰ１３にのみ特異的に反応することを認めている（図９左）。また、筋肉細胞の分化過程におけるＤＵＳＰ１３の発現変化を調べるために、ヒト骨格筋衛星細胞ＳｋＭＣを分化後、そのタンパクレベルの発現をウェスタンブロッティングにて検出した。結果は、タンパクレベルにおいては、分化後１日目より増加を認め、その後３日目より減少し（図９右の一番上のパネル）、同様の結果がｍＲＮＡレベルにおいても得られた。
次に、ＤＵＳＰ１３のタンパクレベルでの内在性発現を確認するために、上記ｍＲＮＡにて発現が確認されたヒト心臓及びヒト骨格筋衛星細胞(ＳｋＭＣ)の細胞抽出液をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、その後、抗ＤＵＳＰ１３抗体にてウェスタンブロッティングを行った。その結果、予測された分子量２３ｋＤａ付近にＤＵＳＰ１３の発現を検出したが、ヒト脳、ヒト冠状動脈内皮細胞においては認められなかった（図９中央）。一方、ＤＵＳＰ２２については、ヒト脳、心臓、骨格筋細胞及び冠状動脈内皮細胞のいずれにおいても、抗ＤＵＳＰ２２抗体を用いた同一メンブレン上でのウェスタンブロッティングによって発現を認めた（図９中央）。
ＤＵＳＰ１３に対する抗体（anti-DUSP13）は、ｈＤＵＳＰ１３のＮ末端から１７アミノ酸残基からなるペプチド（図１左及び図２左の二重下線部参照）をウサギに免疫し、血清をＩｇＧ精製後作製したもので、大腸菌で発現、精製した各ＤＳＰ組換えタンパクに対し、ＤＵＳＰ１３にのみ特異的に反応することを認めている（図９左）。また、筋肉細胞の分化過程におけるＤＵＳＰ１３の発現変化を調べるために、ヒト骨格筋衛星細胞ＳｋＭＣを分化後、そのタンパクレベルの発現をウェスタンブロッティングにて検出した。結果は、タンパクレベルにおいては、分化後１日目より増加を認め、その後３日目より減少し（図９右の一番上のパネル）、同様の結果がｍＲＮＡレベルにおいても得られた。
７．ＤＵＳＰ１３の心筋細胞分化に対する影響
次に、哺乳動物心筋細胞における該タンパクの生理的役割を調べるために、ラット胎児心筋細胞Ｈ９ｃ２を用いて、各野生型タンパク及びその優性阻害タンパクであるＣＳ変異体の安定発現細胞株を、コントロールとしてのＶｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と共に得た。その後、各々のクローンを血清除去により分化させ、ウェスタンブロッティングによる分化指標の検出（図１０）、細胞免疫染色（図１１及び図１２）及び形態学的観察（図１３）により、各々の脱リン酸化酵素の心筋細胞分化に対する影響を調べた。その結果、分化させた各々の細胞抽出液におけるウェスタンブロッティングにおいては、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２が、経時的に筋分化指標となるＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔを発現して行くのに対し、ＤＵＳＰ１３／Ｈ９ｃ２はＶｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２に比べて発現が抑制されており、また一方でＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／Ｈ９ｃ２においては、これらの発現が促進されていることが示された（図１０）。一方、ＤＵＳＰ２６については、ＤＵＳＰ２６／Ｈ９ｃ２は、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と比較して早い時期より筋分化指標の発現を認め、ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／Ｈ９ｃ２はほとんど発現を認めなかった。このことは、二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）であるＤＵＳＰ２６及びＤＵＳＰ１３が、互いに異なる細胞内標的分子を特異的に脱リン酸化することを示唆した。
次に、哺乳動物心筋細胞における該タンパクの生理的役割を調べるために、ラット胎児心筋細胞Ｈ９ｃ２を用いて、各野生型タンパク及びその優性阻害タンパクであるＣＳ変異体の安定発現細胞株を、コントロールとしてのＶｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と共に得た。その後、各々のクローンを血清除去により分化させ、ウェスタンブロッティングによる分化指標の検出（図１０）、細胞免疫染色（図１１及び図１２）及び形態学的観察（図１３）により、各々の脱リン酸化酵素の心筋細胞分化に対する影響を調べた。その結果、分化させた各々の細胞抽出液におけるウェスタンブロッティングにおいては、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２が、経時的に筋分化指標となるＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔを発現して行くのに対し、ＤＵＳＰ１３／Ｈ９ｃ２はＶｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２に比べて発現が抑制されており、また一方でＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／Ｈ９ｃ２においては、これらの発現が促進されていることが示された（図１０）。一方、ＤＵＳＰ２６については、ＤＵＳＰ２６／Ｈ９ｃ２は、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と比較して早い時期より筋分化指標の発現を認め、ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／Ｈ９ｃ２はほとんど発現を認めなかった。このことは、二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）であるＤＵＳＰ２６及びＤＵＳＰ１３が、互いに異なる細胞内標的分子を特異的に脱リン酸化することを示唆した。
次に、このことをさらに確認するために、上記安定発現細胞株において、筋分化指標であるＭｙＨＣに対しては抗ＭｙＨＣ抗体を、核に対してはＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて、細胞免疫染色を経時的に行った。各々、蛍光像としてＭｙＨＣは赤色に、核は青色で観察される。その結果、ＤＵＳＰ１３／Ｈ９ｃ２はＶｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と比較してＭｙＨＣの発現が経時的に抑制されており、一方、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／Ｈ９ｃ２は、かかる発現が促進されていることが示された（図１１）。また、ＤＵＳＰ２６／Ｈ９ｃ２は、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と比較して早くからＭｙＨＣの発現を認め、ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／Ｈ９ｃ２においては、ほとんど発現を認められなかった（図１２）。さらに、これらに一致する結果は、分化過程における筋管細胞の形成（図１３中の黒三角の先端参照）の有無等の、光学顕微鏡を用いた形態学上の観察においても確認された（図１３）。
８．ＤＵＳＰ１３の基質の検討
ＤＵＳＰ１３が心筋分化を抑制することから、その標的となる生理的基質を求めることにした。ここで、これまでに分化シグナルとして報告のあるｐ３８ＭＡＰＫ経路あるいはＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ経路が、Ｈ９ｃ２における分化においても関与しているかをまず調べた。作製した安定発現細胞株と共にその親株であるＨ９ｃ２に、各々の阻害剤であるＳＢ２０３５８０及びＬＹ２９４００２を分化培地に加え、ｖｅｈｉｃｌｅであるＤＭＳＯをコントロールとして加えた後、血清除去にて分化させた。分化の指標としては、前述の通り形態学的観察、細胞免疫染色（図１４）、ウェスタンブロッティングによる分化指標の検出にて行い、その結果、いずれの阻害剤もＤＭＳＯと比較して、親株を含むすべての細胞株の分化を抑制することが示された。このことは、ｐ３８ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ経路のいずれもがＨ９ｃ２の分化に必要であることを意味した。
ＤＵＳＰ１３が心筋分化を抑制することから、その標的となる生理的基質を求めることにした。ここで、これまでに分化シグナルとして報告のあるｐ３８ＭＡＰＫ経路あるいはＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ経路が、Ｈ９ｃ２における分化においても関与しているかをまず調べた。作製した安定発現細胞株と共にその親株であるＨ９ｃ２に、各々の阻害剤であるＳＢ２０３５８０及びＬＹ２９４００２を分化培地に加え、ｖｅｈｉｃｌｅであるＤＭＳＯをコントロールとして加えた後、血清除去にて分化させた。分化の指標としては、前述の通り形態学的観察、細胞免疫染色（図１４）、ウェスタンブロッティングによる分化指標の検出にて行い、その結果、いずれの阻害剤もＤＭＳＯと比較して、親株を含むすべての細胞株の分化を抑制することが示された。このことは、ｐ３８ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ経路のいずれもがＨ９ｃ２の分化に必要であることを意味した。
そこで、ＤＵＳＰ１３は、これらの経路に関与するシグナル分子を脱リン酸化することで、かかる経路を抑制し、結果的に分化の抑制をすると考え、各経路のシグナル分子に対するＤＵＳＰ１３の影響を調べた。そこで、各安定発現細胞株、ＤＵＳＰ１３／Ｈ９ｃ２、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２、ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／Ｈ９ｃ２を分化させ、その細胞抽出液をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、各経路の活性を表す抗リン酸化抗体にてウェスタンブロッティングを行った。結果は、ＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ経路において、Ａｋｔの活性型を示すＳｅｒ４７３のリン酸化が、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と比較してＤＵＳＰ１３／Ｈ９ｃ２において抑制されており、また一方でＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ／Ｈ９ｃ２は促進していることが示された（図１５左上）。このことは、ＤＵＳＰ１３がＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ経路の調節に関与していることを示唆し、Ａｋｔを含めその経路のシグナル分子を脱リン酸化する可能性を示した。また、ＤＵＳＰ１３は、インビトロにおいて、ＡｋｔのアイソフォームであるＡｋｔ１及びＡｋｔ２と結合し（図１５左下）、またこれらのリン酸化Ｓｅｒ４７３を直接脱リン酸化することを示した（図１５右の上から２番目のパネル参照）。また、各安定発現細胞株、ＤＵＳＰ２６／Ｈ９ｃ２、Ｖｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２、ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／Ｈ９ｃ２を分化させ、その細胞抽出液をＡｋｔの活性型を認識する抗リン酸化Ａｋｔ(Ｓｅｒ４７３)抗体及び抗リン酸化Ａｋｔ(Ｔｈｒ３０８)抗体を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、両者共にＤＵＳＰ２６／Ｈ９ｃ２においてはＶｅｃｔｏｒ／Ｈ９ｃ２と比較してＡｋｔのリン酸化が促進されており、一方、ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ／Ｈ９ｃ２は抑制されていることが示された。このことは、ＤＵＳＰ２６もまたＡｋｔ経路の調節に関与していることを示唆した。
本発明のタンパク質は、心筋細胞の分化制御を司る脱リン酸化酵素又はその優性阻害酵素であり、心筋細胞の分化を調節する活性を有している。本発明のタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクターは、心筋細胞の分化調節剤として用いることができ、また心筋細胞の分化と関連した心疾患の予防・治療剤としての用途も期待される。
また、本発明の組換えベクターが導入された形質転換体は、例えば被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価することにより、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に用いることができる。また、同様のスクリーニング方法は、心筋細胞の分化と関連した心疾患の予防・治療剤となり得る物質のスクリーニング方法への応用も期待される。本発明における分化調節剤や、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質は、心臓の再生医学への応用も期待される。すなわち、心臓の再生医学においては、幹細胞から心筋細胞等を誘導し、それを人体に効率良く移植する方法が不可欠と考えられているが、このような状況において、本発明における心筋細胞の分化調節剤や、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質は、移植に用いる心筋細胞をより効率よく製造したり、再生した心臓を患者に移植した際の定着率を上げる等の心臓の移植効率を上げることにも有用であると考えられる。
また、本発明の組換えベクターが導入された形質転換体は、例えば被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価することにより、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に用いることができる。また、同様のスクリーニング方法は、心筋細胞の分化と関連した心疾患の予防・治療剤となり得る物質のスクリーニング方法への応用も期待される。本発明における分化調節剤や、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質は、心臓の再生医学への応用も期待される。すなわち、心臓の再生医学においては、幹細胞から心筋細胞等を誘導し、それを人体に効率良く移植する方法が不可欠と考えられているが、このような状況において、本発明における心筋細胞の分化調節剤や、心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質は、移植に用いる心筋細胞をより効率よく製造したり、再生した心臓を患者に移植した際の定着率を上げる等の心臓の移植効率を上げることにも有用であると考えられる。
Claims (30)
- 以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列； - 以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列； - 以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列； - 以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ活性を有するアミノ酸配列； - 以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列； - 以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列； - 請求項５に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
- 請求項６に記載のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
- タンパク質が、心筋細胞の分化を促進する活性を有することを特徴とする請求項４又は５に記載のタンパク質。
- タンパク質が、心筋細胞の分化を抑制する活性を有することを特徴とする請求項２又は６に記載のタンパク質。
- 請求項４又は５に記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質。
- 請求項２又は６に記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合タンパク質。
- 請求項１に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター。
- 請求項３に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター。
- 請求項７に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター。
- 請求項８に記載のＤＮＡを含み、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクター。
- 請求項１３又は１４に記載の組換えベクターが導入され、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体。
- 請求項１５又は１６に記載の組換えベクターが導入され、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を発現する形質転換体。
- 請求項４若しくは５に記載のタンパク質、請求項１１に記載の融合タンパク質、又は請求項１４若しくは１５に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする心筋細胞の分化促進剤。
- 請求項２若しくは６に記載のタンパク質、請求項１２に記載の融合タンパク質、又は請求項１３若しくは１６に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする心筋細胞の分化抑制剤。
- 請求項１３に記載の組換えベクターが導入され、請求項２に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
- 請求項１４に記載の組換えベクターが導入され、請求項４に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
- 請求項１５に記載の組換えベクターが導入され、請求項５に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
- 請求項１６に記載の組換えベクターが導入され、請求項６に記載のタンパク質を発現することができる形質転換心筋細胞を、被検物質の存在下で培養し、該心筋細胞の分化の程度を測定・評価する工程を有する心筋細胞の分化を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
- 請求項１又は３に記載のＤＮＡの、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質を製造するための使用。
- 請求項５又は６に記載のＤＮＡの、二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質を製造するための使用。
- 請求項４又は５に記載のタンパク質を用いて、心筋細胞の分化促進を活性化する方法。
- 請求項２又は６に記載のタンパク質を用いて、心筋細胞の分化抑制を活性化する方法。
- 請求項２又は４に記載のタンパク質を用いて、リン酸化されたアミノ酸から脱リン酸化されたアミノ酸を製造する方法。
- 請求項２、４、５、６のいずれかのタンパク質に特異的に結合する抗体。
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