DE69936780T2

DE69936780T2 - Antikörper gegen eine lar-phosphatase untereinheit

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Publication number: DE69936780T2
Application number: DE69936780T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Toyonaka-shi YAMAMOTO; Kazutake Kawanishi-shi TSUJIKAWA; Yukiko Osaka-shi UCHINO; Noboru Kashihara-shi KONISHI
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2019-06-08
Also published as: DE69936780D1; ATE369425T1; CA2329776A1; EP1092772B1; CA2329776C; US20050008645A1; WO1999064591A1; EP1092772A1; EP1092772A4; EP1460132A1; US20050026232A1; US6846912B1; JP3991327B2; AU752642B2; KR100501550B1; AU4060399A; US20050042222A1; KR20010052712A; US7358061B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die spezifisch an eine P-Untereinheit, d. h. eine Phosphatase-Untereinheit, des LAR („leukocyte antigen related")-Proteins binden, und betrifft insbesondere solche Antikörper, die spezifisch an eine intrazelluläre Domäne von LAR binden, und Verfahren zur ihrer Erzeugung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die zur Analyse und Quantifizierung von Proteintyrosinphosphatasen, zur Identifikation und zur Isolation von LAR-verwandten Molekülen verwendbar sind, und Medikamente, die bei Behandlungen wie z. B. der Therapie, der Prävention und der Linderung ebenso wie zur Diagnose der mit Insulinresistenz verbundenen Krankheitszustände anwendbar sind.
Hintergrund der Erfindung
In jüngster Vergangenheit wurden am Ausbruch der Arteriosklerose beteiligte Mechanismen aufgeklärt und Risikofaktoren dafür identifiziert. Insbesondere wurden Hypercholesterinämie, Bluthochdruck, Diabetes und Rauchen als vier manifeste Risikofaktoren identifiziert, und somit wurden therapeutische Behandlungen extensiv durchgeführt. Die gemeinsame klinische Pathologie dieser Krankheitsbilder ist die Insulinresistenz. Die Bedeutung der Insulinresistenz ist mit der Verringerung der Insulinsensitivität in den Zellen beinahe äquivalent, durch die die Insulinwirkung auf die Zuckeraufnahme in die Zellen verschlechtert wird. Die Insulinresistenz kann durch Abnormalitäten bei der Sekretion von Insulin selbst, durch Abnormalitäten der Insulinrezeptoren auf den Zielzellen, durch Abnormalitäten eines intrazellulären Signalübertragungssystems und durch verringerte Zuckerversorgung des Gewebes aufgrund hämodynamisch verursachter peripherer Kreislaufstörung verursacht sein. Reaven, 1988, berichtet, dass sich viele Krankheitsbilder infolge der Insulinresistenz entwickeln und bezeichnet ein Krankheitsbild als „Syndrom X", das gleichzeitig Insulinresistenz, Glukosetoleranzabnormalitäten, Hyperinsulinämie, Hypertriglyzeridämie, Hypo-HDL-Cholesterinämie und Bluthochdruck repräsentieren kann und schlägt weiterhin vor, dass das Krankheitsbild des Syndrom X eng am Ausbruch der Arteriosklerose beteiligt ist (Reaven, G. M. et al., Diabetes, 37, 1595–1607, 1988).
Weiterhin ist bekannt, dass die Zuckerversorgung der Zellen durch Insulinresistenz allgemein verringert wird, was mit Erhöhung der Insulinsekretion aus der Bauchspeicheldrüse einhergeht, was zu Hyperinsulinämie führt. Hieraus ergeben sich auf dem klinischen Gebiet mehrere Probleme im Zusammenhang mit der Insulinresistenz. Beispielsweise wurde berichtet, dass Insulinresistenz und Hyperinsulinämie die diabetische Nephritis fördern (Niskanen, L. et al., Diabetes, 41, 736–741, 1993) und die Häufigkeit der diabetischen Retinopathie erhöhen (Y-ip, J. et al., Lancet, 341, 369–370, 1993). Weiterhin wurde berichtet, dass Insulinresistenz den Plasminogen-Aktivator-Inhibitor I (PAI-1) fördert, die Funktionen eines Blutfibrinolysesystems verschlechtert (Potter van Loon BJ et al., Metab. Clin. Exp., 42, 945–954, 1993) und die arterielle Arteriosklerose auslöst (Sato, Y. et al., Diabetes, 38, 91–96, 1989).
Die Prävalenz des Diabetes beträgt ungefähr 5 % der Gesamtbevölkerung, und ungefähr sechs Millionen japanischer Bürger leiden unter Diabetes. Diabetes umfasst insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) und insulinunabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM). Es wurde berichtet, dass ungefähr 7 % aller Diabetesfälle IDDM sind, während ungefähr 90 % NIDDM sind. Insbesondere wurde ein signifikanter auslösender Faktor für das Auftreten von NIDDM, das einer Mehrzahl von Diabetesfällen entspricht, als Insulinresistenz erkannt.
Inzwischen wurde gefunden, dass Tyrosinphosphorylierung wichtige Rollen bei der Insulin-Signalübermittlung spielt. Der Insulinrezeptor ist ein Hetero-Tetramer aus zwei Glykoproteinunterheiten, nämlich einer α-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 135 kDa und einer β-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 95 kDa, die durch Disulfidbrücken verbunden sind, was zu einer 2β 2-Struktur führt. Die α-Untereinheit hat eine Insulinbindungsaktivität, während die β-Untereinheit eine Proteintyrosinkinase (PTK)-Domäne besitzt, die durch Autophosphorylierung aktiviert wird. Demgemäß werden, wenn Insulin an die α-Kette eines Insulinrezeptors gebunden wird, bestimmte Tyrosinreste, die in der β-Kette des Insulinrezeptors vorliegen, autophosphoryliert. Die Aktivität der Insulinrezeptortyrosinkinase wird durch die Tyrosin-Autophosphorylierung weiter gefördert. Es wurde berichtet, dass die so aktivierte Insulinrezeptortyrosinkinase Tyrosinreste des IRS (Insulinrezeptorsubstrats) und die intrazellulären Substrate davon phosphoryliert, und die Signalübermittlung durch Erkennung und Bindung der tyrosinphosphorylierten Insulinrezeptoren durch Ash/Grb2 oder die PI-3 Kinase fortschreitet, was letztlich zur Manifestierung der biologischen Wirkung von Insulin führt, wie z. B. Glukoseaufnahme, Zuckermetabolismus und Zellproliferation (siehe 9, Goldstein, B.J. et al., Receptor, 3, 1–15, 1993; und Kanai, F. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 195(2), 762–768, 1993). Jedoch wurde bei diesem Signalübertragungsweg eine Enzymtyrosinphosphatase, die die aktivierten Insulinrezeptoren, inaktiviert, d. h. eine Proteintyrosinphosphatase (nachfolgend als PTP bezeichnet), nicht detailliert studiert.
Ernsthafte Untersuchungen von PTPs wurden nach dem Abschluss der Klonierung des PTP1B-Gens und der Aufklärung seiner Nukleotidsequenz durch Fischer et. al. 1988 begonnen, wobei es sich um eine aus der menschlichen Plazenta gewonnene zytoplasmatische PTP handelt (Tonks, N. K. et al., J. Biol. Chem., 263, 6722–6730, 1988; Charbonneau, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7182–7186, 1988). Infolgedessen konnte eine Homologie mit PTP1B nicht bei den bekannten Serin/Threonin-Phosphatasen beobachtet werden, sondern bei zwei zytoplasmatischen Regionen von CD45, einem membrandurchquerenden Molekül, das am Blutbildungssystem beteiligt ist. Weiterhin wurde auch gefunden, dass CD45 eine PTP-Aktivität besitzt (Tonks, N.K. et al., Biochemistry, 27, 8695–8701, 1988; und Charbonneau, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7182–7186, 1988).
Inzwischen wurden viele PTPs anhand der Homologien ihrer cDNA-Sequenzen kloniert, und es wurden neue PTPs nachfolgend beschrieben (Streuli, M. et al., J. Exp. Med., 168, 1523– 1530, 1988; Krueger, N. X. et al., EMBO J., 9, 3241–3252, 1990; und Trowbridge I. S. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1095, 46–56, 1991). Die PTPs können im Allgemeinen eingeteilt werden in: (1) Membrantyp-PTPs mit einer Transmembranregion (LCA, leukocyte common antigen, nämlich CD45, LAR und PTP α, ß, γ, δ, ε und ζ) und (2) PTPs vom zytoplasmatischen Typ ohne Transmembranregion (PTP1B, TC-PTP, PTP-MEG, PTPH1, STEP und PTP1C).
Viele PTPs vom Membrantyp haben zwei PTP-homologe Domänen im Zellinneren (Domäne 1 und Domäne 2, siehe 1a und b). Eine Sequenz, die Cystein (Signaturmotiv) umfasst, Ile/Val-His-Cys-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Xaa-Arg-Ser/Thr-Gly (SEQ ID NO: 2), ist unter den bislang beschriebenen PTPs in der Phosphatasedomäne konserviert. Forschungen zur PTP1B-Kristallographie zeigten, dass die Region kleine Taschen auf der Oberfläche eines PTP-Moleküls bildet, und dass der Cysteinrest am Boden der Tasche liegt und direkt an der Bindung des Moleküls an Phosphat teilnimmt (Barford, D. et al., Science, 263, 1397–1404, 1994). Weiterhin wurde auch gefunden, dass die Tiefe der PTP-Tasche die Spezifität der Serin/Threonin-Phosphatase bestimmen kann, da Phosphat, das an Serin oder Threonin binden, die Tasche des enzymatisch aktiven Zentrums von PTP1B nicht erreichen kann. Weiterhin wurde die Bedeutung des oben beschriebenen Signaturmotivs für die enzymatische Aktivität aufgeklärt (Streuli, M. et al., EMBO J., 9, 2399–2407, 1990). Unter Berücksichtigung dieser Beobachtung wurde vermutet, dass das konservierte Cystein in Domäne 1 eine wichtige Rolle für die enzymatische Aktivität spielen und Domäne 2 die Substratspezifität des Enzyms bestimmen kann.
Unter einer Gruppe von PTPs ist aus dem Menschen gewonnenes LAR ein Prototyp der Proteintyrosinphosphatasen vom Rezeptortyp, der unter Verwendung einer Phosphatasedomäne von CD45, einer Proteintyrosinphosphatase vom Rezeptortyp, als Sonde aus einer genomischen Bibliothek aus der menschlichen Plazenta kloniert wurde (Streuli M. et al., J. Exp. Med., 168, 1553–1562, 1988). CD45 wird spezifisch auf hämatozytischen Zellen exprimiert, während LAR auf anderen als hämatozytischen Zellen exprimiert wird, insbesondere in insulinempfindlichen Organen wie Leber und Skelettmuskel (Goldstein B. J., Receptor, 3, 1–15, 1993). LAR ist unter vielen Arten von PTPs vom Rezeptortyp infolge der Ähnlichkeit seiner extrazellulären Domäne mit Zelladhäsionsmolekülen von besonderem Interesse. Die gesamte Struktur von LAR besitzt 150 kDa einer extrazellulären E-Untereinheit, die aus Ig-artigen Domänen und Fibronectin-Typ III-Domänen besteht, und 85 kDa einer P-Untereinheit, die eine Transmembranregion und eine intrazelluläre Domäne mit zwei Phosphatasedomänen umfasst, die unmittelbar außerhalb der Zellmembran kovalent gebunden sind (siehe 1, Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897–907, 1992).
Eine große Anzahl funktionaler Rollen von LAR wurden bislang beschrieben. Zum Beispiel wurde berichtet, dass: Reaktionen auf Neutrotrophin in LAR-defizienten Nerven verringert sind (Yang, T. et al., 27th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, New Orleans, Louisiana, USA, October 25–30, 1997, Society for Neuroscience Abstracts, 23, 1–2, 1997); die Sek retion von Apolipoprotein B durch Suppression der LAR-Aktivität verringert wird (Phung, T. L. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 237(2), 367–371, 1997) und ein Verlust der LAR-Expression die Größe cholinerger Nervenzellen der Prosencephalonbasis verringert, und auf diese Weise die Kontrolle durch die cholinergen Nervenzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus verringert wird (Yeo, T. T. et al., J. Neurosci. Res., 47(3), 348–360, 1997). Auf diese Weise wurde nach und nach gezeigt, dass LAR mehrere wichtige Rollen in einem lebenden Organismus spielt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind weiterhin die erwähnungswertesten Forschungen auf das Verhältnis zwischen LAR und Insulinrezeptoren gerichtet (Hashimoto, N. et al., J. Biol. Chem., 267 (20), 13811–13814, 1992).
1995 wurde eine erwähnenswerte Publikation vorgelegt, die beschrieb, dass die LAR-Tyrosinphosphataseaktivität im Fettgewebe eines übergewichtigen Menschen abnormal erhöht ist, wobei eine solche Erhöhung als Ursache für das Einsetzen der Insulinresistenz und als Risikofaktor für Herz-/Kreislauf-Erkrankungen vorgeschlagen wurde (Ahmad, F. et al., J. Clin. Invest., 95 (6) 2806–2812, 1995). Es folgten mehrere Berichte, die zeigten, dass LAR mit Insulinrezeptoren im engen Zusammenhang steht (Mooney, R. A. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 235 (3), 709–712, 1997; Orr, S. R. et al., Biochemical Society Transaction, 25 (3), 452S, 1997; Ahmad, F. et al., J. Clin. Investigation, 100 (2), 449–458, 1997; Ahmad F. et al., J. Biol. Chem., 272 (1), 448–457, 1997; Norris, K. et al., Febs Letters, 415 (3), 243–248, 1997; und Li, P. M. et al., Cellular Signaling, 8 (7), 467–473, 1996). Auf der Basis dieser Information beschrieben Ahmad F. et al. unlängst, dass PTP1B ein therapeutisches Ziel bei Krankheitsbildern sein kann, an denen Insulinresistenz beteiligt ist (Ahmad, F. et. al., Metabolism, Clinical and Experimental, 46 (10), 1140–1145, 1997). Durch die gegenwärtigen Arbeiten an PTPs wie z.B. LAR, CD45 und dergleichen wurde gezeigt, dass PTPs extrem wichtige Rollen in einem intrazellulären Signalübertragungssystem spielen.
1992 berichteten Streuli et al., dass die Bindung zwischen der E-Untereinheit und der P-Untereinheit von LAR aufgrund der nichtkovalenten Natur ihrer Bindung aufgelöst werden kann, und dass auf diese Weise die E-Untereinheit spezifisch von der Zellmembranoberfläche abgeworfen wird (Streuli, M. et al., EMBO J., 11 (3), 897–907, 1992). Jedoch wurde die nur Phosphataseaktivität besitzende P-Untereinheit ignoriert, da viele Forscher die Untersuchungen unter Verwendung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen eine LAR-E-Untereinheit darauf konzentrierten. Zum Beispiel konnte, wenn ein Anti-LAR-Antikörper mit der Absicht einer Messung der LAR-Phosphataseaktivität verwendet wurde, die gesamte Phosphataseaktivität nicht gemessen werden, solange nicht ein Antikörper gegen die P-Untereinheit verwendet wurde. In Anbetracht solcher Umstände begannen die gegenwärtigen Erfinder, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an eine LAR-P-Untereinheit binden, insbesondere an eine intrazelluläre Domäne davon, ohne irgendeine Spezifität für CD45 zu haben.
Zu den bekannten Antikörpern gegen Proteintyrosinphosphatase gehört ein Antikörper, der unter Verwendung von 196 Aminosäurenresten, die von der Transmembranregion von CD45 zu einem Teil der Phosphatasedomäne 1 reichen (Transduction Laboratories), als Antigen erzeugt wurde. Es ist jedoch unklar, wie diese Antikörper für LAR-Phosphatasedomänen und andere Proteintyrosinphosphatasen immunspezifisch sind. Daher war es auch notwendig, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch für eine intrazelluläre Domäne von LAR, aber nicht für CD45 sind.
Zum Knotenkropf gehören Thyroidtumor und hyperplastischer adenomatoider Kropf.
Obwohl der adenomatoide Kropf aus einer Mehrzahl von Knoten besteht, geht ein Teil davon oftmals mit Karzinom einher. Bei der Diagnose des Knotenkropfes ist es wichtig, zu vermeiden, das Karzinom zu übersehen. Gegenwärtig werden zur klinischen Diagnose von Thyroidkrebs hauptsächlich Abtastung, Ultraschalldiagnose, Aspiration mit dünnen Nadeln und histologische Diagnose von Gewebsschnitten durchgeführt. Der Kropf kann klassifiziert werden als gutartiger Knotenkropf, Papillärkarzinom, Follikulärkarzinom, anaplastisches Karzinom, medulläres Karzinom und malignes Lymphom, während der Thyroidkrebs grundsätzlich in Thyroidkarzinom vom wohldifferenzierten Typ (Papillärkarzinom und follikuläres Karzinom) und Thyroidkarzinom vom undifferenzierten Typ eingeteilt werden kann. Die Hauptmasse des Kropfes ist gutartig, jedoch ist es schwierig, eine kleine maligne Läsion unter den zahlreicheren gutartigen Knoten definitiv zu diagnostizieren. Ein Thyroidkarzinom vom differenzierten Typ wird ausgeschnitten, wenn ein potentieller Teil während der Operation gefunden wird, dann wird die ausgeschnittene Probe mikroskopisch begutachtet und im Anschluss daran die gesamte Schilddrüse entfernt, wenn ein Karzinom festgestellt wurde. Überdies kann eine genaue Diagnose unmöglich sein, selbst wenn zu Beginn eine Blutuntersuchung und diagnostische bildgebende Verfahren durchgeführt werden, weswegen es häufig notwendig ist, letztlich so oder so das Gewebe zu entfernen. Obwohl Aspiration mit dünnen Nadeln durchgeführt werden kann, ist eine definitive Diagnose weniger gut möglich im Vergleich zur morphologischen Begutachtung von Gewebsschnitten, da Verbindungen zwischen den Zellen in den Proben durch Einstich und Sog zerrissen sein können. Weiterhin können Jod-Szintillation und Technetium-Szintillation durchgeführt werden, jedoch können sie zu keiner bestätigenden diagnostischen Grundlage führen.
Karzinomzellen nehmen im Vergleich mit normalen Thyroidzellen weniger Jod auf. Viele gutartige Knoten nehmen radiomarkiertes Jod auf, jedoch existieren viele gutartige Knoten, die kein radiomarkiertes Jod aufnehmen, und somit als „kalt" erscheinen. Überdies können die Knoten krebsartig sein, auch wenn sie als „heiß" erscheinen. Demgemäß wird die endgültige Diagnose der morphologischen Begutachtung unter Verwendung der Gewebsschnitte anvertraut, jedoch können bei dieser Vorgehensweise Fälle vorkommen, in denen das Gewebe auf Verdacht entfernt wird, selbst wenn ein Teil davon normal zu sein scheint, womit die Wahrschein lichkeit steigt, dass bei der Entfernung des Thyroids der Nervus recurrens, der die Stimmbänder innerviert, verletzt wird. Daher existiert ein starkes Bedürfnis von Klinikern und Pathologen nach definitiven diagnostischen Verfahren, die vor der Entfernung des Gewebes zwischen normalen Zellen und malignen Zellen unterscheiden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, einen monoklonalen Antikörper bereitzustellen, der von einem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6343 produziert wird, oder eine chimäre oder humanisierte Version davon. Der genannte Antikörper bindet spezifisch an eine Phosphataseuntereinheit von LAR, vorzugsweise an eine intrazelluläre Domäne von LAR. Weiterhin bindet der Antikörper spezifisch an eine intrazelluläre Domäne einer LAR-Phosphataseuntereinheit, ohne Spezifität für andere Proteinphosphatasen. Alternative Antikörper mit diesen Eigenschaften können ebenfalls erzeugt werden.
Solche Antikörper können vorzugsweise unter Verwendung eines Polypeptids als Antigen hergestellt werden, das einer intrazellulären Domäne von LAR entspricht, codiert von einer in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz, oder beliebigen Fragmenten davon. Weiterhin kann der bevorzugte Antikörper aufgrund seiner immunspezifischen Eigenschaften ein monoklonaler Antikörper sein.
Der erfindungsgemäße Antikörper wurde unter Verwendung eines Fusionsproteins als Antigen erzeugt, das eine LAR-Phosphatasedomäne und GST (Glutathion-S-Transferase) umfasst. Alternative Fusionsproteine mit Polyhistidin (vorzugsweise 6 Histidinreste), dem calmodulinbindenden Peptid (CBP) oder Protein A können ebenfalls verwendet werden.
Wenn Polyhistidin verwendet wird, kann Absorption an Nickel-chelierendes Harz verwendet werden, um das Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen, das durch einen Gen-Rekombinationsprozess exprimiert wird, wobei Zusatz von EDTA oder Imidazolsubstanzen ebenso wie pH-Veränderungen verwendet werden können, um das Protein von dem Harz abzulösen. Wenn CBP verwendet wird, kann das exprimierte Fusionsprotein einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von Calmodulinaffinitätsharz unterzogen und dann durch Zusatz von EGTA von dem Harz abgelöst werden. Weiterhin kann, wenn Protein A verwendet wird, das exprimierte Fusionsprotein einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von IgG-Sepharose (z. B. IgG-Sepharose 6FF) unterzogen und dann durch Veränderung des pH-Wertes von dem Harz abgelöst werden.
Weiterhin können z. B. Xpress, Thioredoxin, c-myc, V5, HA/c-myc und dergleichen zu einem anderen Kandidaten für ein in dem Fusionsprotein zu verwendendes Protein oder Polypeptid gehören. Zur Isolation und Reinigung des beabsichtigten Fusionsproteins mit einer LAR-Phosphatasedomäne kann auch der Expression des Proteins eine Passage über eine Antigen-Antikörper-Affinitätssäule folgen.
Das genannte bevorzugte erfindungsgemäße Immunogen, nämlich ein Fusionsprotein von GST und einer LAR-Phosphatasedomäne, kann zweckmäßigerweise produziert werden, indem man: mit einem Expressionsvektor, der eine codierende Region des GST-Gens und eine codierende Region einer Phosphatasedomäne des LAR-Gens enthält, transformierte oder transfizierte Escherichia coli 16–24 Stunden lang bei 20–30 °C kultiviert, vorzugsweise 18 Stunden lang bei 23–25 °C; und dann das Fusionsprotein aus der Kulturflüssigkeit und/oder den Bakterienzellen isoliert. So erhaltenes Fusionsprotein kann anhand seiner Affinität zu einem Glutathion tragenden Träger, z. B. Glutathion-Sepharose-Beads, weiter gereinigt werden, wobei die Elution des Fusionsproteins von den Glutathion-Sepharose-Beads durch Kochen in Gegenwart eines Detergens durchgeführt werden kann. Das Detergens kann Natriumlaurylsulfat, CHAPS (3-[(3-Cholamidpropyl)dimethylammonio]-1-puropansulfonat), Deoxycholsäure, Digitonin, n-Dodecylmaltosid (1-O-n-Dodecyl-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranoside), Nonidet^TM P40 (Ethylphenolpoly(ethylenglycolether)n), n-Octylglucosid (1-O-n-Octyl-β-D-glucopyranosid), Saccharosemonolaurat, Tesit^TM (Dodecylpoly(ethylenglycolether)n), Triton^TM X-100 (Octylphenolpoly(ethylenglycolether)n), Tween^TM 20 (Poly(oxyethylen)-n-sorbitan-monolaurat), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat und dergleichen enthalten. [Jedes „n" steht für eine ganze Zahl, die größer oder gleich 1 ist.] Wenn die Elution des Fusionsproteins durchgeführt wird, kann das Harz 5–10 Minuten lang bei 100 °C in der Gegenwart solcher Detergenzien in einer Konzentration, die bei einem Tier, dem sie zu verabreichen sind, zu keinen Problemen führt, vorzugsweise 0,1 % Natriumlaurylsulfat, gekocht werden. Auf diese Weise kann ein gereinigtes Fusionsprotein erhalten werden, das als in Betracht gezogenes Immunogen bevorzugt ist.
Wenn unter Verwendung eines solchen Fusionsproteins als Immunogen ein monoklonaler Antikörper erzeugt wird, kann eine LAR-Phosphataseuntereinheit zum Screening des Antikörpers verwendet werden, jedoch ist es im Hinblick auf die Spezifität bevorzugter, das Screening unter Verwendung des Fusionsproteins als Immunogen durchzuführen.
Ein beispielhafter monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung hat ein Molekulargewicht von ungefähr 150 kDa und wird von Maus/Maus-Hybridomzellen produziert. Der Antikörper kann als Werkzeug zur weiteren Aufklärung der Mechanismen eines Insulinsignalübertragungssystems, zur Entwicklung nützlicher diagnostischer Verfahren für Insulinresistenz und NIDDM, und zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose verschiedener Arten von im Zusammenhang mit insulinresistenzbasiertem Syndrom X stehenden Krankheitsbildern verwendet werden. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper zur Identifikation und Isolierung von im Zusammenhang mit LAR stehenden Molekülen verwendbar sein, z. B. Modulator, Bindungsprotein und dergleichen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Hybridomzelle bereitzustellen, die den obengenannten monoklonalen Antikörper produziert. Eine solche Hybridomzelllinie kann die Maus/Maus-Hybridomzelllinie YU1 umfassen, die am 7. Mai 1998 beim National Institute of Bioscience und Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-1-320, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, JAPAN hinterlegt wurde und die Zugangsnummer FERM BP-6343 erhielt.
Der erfindungsgemäße Antikörper hat spezifische Immunreaktivität mit dem LAR-Protein und mit Fragmenten und Polypeptiden, die mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR enthalten (das Fragment und Polypeptid werden nachfolgend kollektiv als „von LAR abgeleitete Moleküle (LAR-Derivate)" bezeichnet), die aus natürlichen Quellen gewonnen oder teilweise oder vollständig synthetisiert (z. B. durch chemische Synthese oder durch rekombinante Synthese) wurde.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um einen Antikörper zu erzeugen, der Spezifität für eine LAR-Phosphataseuntereinheit besitzt, wobei das besagte Fusionsprotein, das eine LAR-Phosphatasedomäne und eine im GST-LAR-Phosphatasedomäne besitzt, als Immunogen verwendet wird. Alternative Fusionsproteine und Reinigungsverfahren dafür sind wie oben dargestellt.
Das genannte bevorzugte erfindungsgemäße Immunogen, nämlich ein Fusionsprotein von GST und einer LAR-Phosphatasedomäne, kann zweckmäßigerweise produziert werden, indem man: mit einem Expressionsvektor, der eine codierende Region des GST-Gens und eine codierende Region einer Phosphatasedomäne des LAR-Gens enthält, transformierte oder transfizierte Escherichia coli 16–24 Stunden lang bei 20–30 °C kultiviert, vorzugsweise 18 Stunden lang bei 23–25 °C; und dann das Fusionsprotein aus der Kulturflüssigkeit und/oder den Bakterienzellen isoliert. So erhaltenes Fusionsprotein kann anhand seiner Affinität zu einem Glutathion tragenden Träger, z. B. Glutathion-Sepharose-Beads, weiter gereinigt werden, wobei die Elution des Fusionsproteins von den Glutathion-Sepharose-Beads durch Kochen in Gegenwart eines Detergens durchgeführt werden kann, wie oben dargestellt. Das Harz kann dann 5–10 Minuten lang bei 100 °C in der Gegenwart des Detergens in einer Konzentration, die bei einem Tier, dem es zu verabreichen ist, zu keinen Problemen führt, vorzugsweise 0,1 % Natriumlaurylsulfat, gekocht werden. Auf diese Weise kann ein gereinigtes Fusionsprotein erhalten werden, das als in Betracht gezogenes Immunogen bevorzugt ist.
Wenn unter Verwendung eines solchen Fusionsproteins als Immunogen ein monoklonaler Antikörper erzeugt wird, kann eine LAR-Phosphataseuntereinheit zum Screening des Antikörpers verwendet werden, jedoch ist es im Hinblick auf die Spezifität bevorzugter, das Screening unter Verwendung des Fusionsproteins als Immunogen durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von LAR und/oder LAR-Derivaten bereit. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, dass man eine Menge an LAR-Protein und/oder einem Fragment oder einem Polypeptid, das mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR umfasst, bestimmt, die in einer Testprobe enthalten ist, die den erfindungsgemäßen Antikörper enthält. In diesem Verfahren wird der Antikörper vorzugsweise in einem unter Immunoblotting, Immunpräzipitation und ELISA ausgewählten Verfahren verwendet, um die Menge an LAR oder LAR-Derivaten zu bestimmen. Verfahren unter Verwendung anderer Antikörper gegen LAR werden ebenfalls offenbart.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von LAR und/oder LAR-Derivaten bereitzustellen, das den Schritt umfasst, dass man: LAR und/oder LAR-Derivate aus einer Testprobe unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers isoliert; und eine Aktivität des isolierten LAR und/oder der LAR-Derivate misst. Bei diesem Verfahren werden zur Isolation des LAR und/oder der LAR-Derivate Affinitätschromatographie und/oder Immunpräzipitation durch Verwendung eines Trägers, an den ein erfindungsgemäßer Antikörper gebunden ist, zweckmäßigerweise verwendet. Namentlich kann Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule oder eines batchweisen Verfahrens und/oder Immunpräzipitation durchgeführt werden, wobei der Träger, an den zuvor der Antikörper gebunden wurde, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird, um eine spezifische Interaktion zwischen dem Antigen (LAR/LAR-Derivate) und dem Antikörper zu ermöglichen, dann können nach Auswaschen des ungebundenen Antikörpers die gebundenen LAR/LAR-Derivat-Moleküle eluiert werden. Verfahren unter Verwendung anderer Antikörper gegen LAR werden ebenfalls offenbart.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion von LAR und/oder LAR-Derivaten bereitgestellt, das den Schritt umfasst, dass man: LAR und/oder LAR-Derivate unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers isoliert. Die Isolation der Zielmoleküle im Produktionsverfahren kann zweckmäßigerweise durch Affinität und/oder Immunpräzipitation unter Verwendung eines Trägers, an den zuvor der Antikörper gebunden wurde, durchgeführt werden, wie in dem zuvor beschriebenen Verfahren zur quantitativen Bestimmung von LAR und/oder LAR-Derivaten. Verfahren unter Verwendung anderer Antikörper gegen LAR werden ebenfalls offenbart.
Ein weiterer nachfolgend in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener Aspekt ist es, ein in vitro-Verfahren zur Identifikation der Gegenwart von LAR und/oder LAR-Derivaten innerhalb eines Gewebes bereitzustellen, das den Schritt umfasst, dass man: eine immunhistologische Untersuchung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers durchführt. Als immunhistologische Untersuchung kann z. B. eine immunhistologische Färbung in situ mit einem markierten Antikörper verwendet werden, wodurch das LAR-Protein und/oder ein Fragment oder Polypeptid, das mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR enthält, detektiert werden kann. Verfahren unter Verwendung anderer anti-LAR-Antikörper werden ebenfalls offenbart.
Der erfindungsgemäße Antikörper hat Spezifität für Thyroidkarzinomzellen. Andere spezifische Anti-LAR-Antikörper gegen Thyroidkarzinomzellen werden ebenfalls offenbart, die unter Verwendung eines LAR-Moleküls ebenso wie eines Fragments davon hergestellt sein können; z. B. einer Phosphatasedomäne, einer extrazellulären Domäne oder dergleichen als Antigen, und zu denen monoklonale und polyklonale Antikörper, Peptid-Antikörper, Einzelketten-Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, CDR-Graff-Antikörper und dergleichen gehören können. Insbesondere werden die zuvor erwähnten Antikörper gegen eine LAR-Phosphataseuntereinheit, die Immunreaktivität mit Thyroidkarzinomzellen besitzen, von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Hier bedeutet „Immunreaktivität mit Thyroidkarzinomzellen", dass mit normalen Thyroidzellen oder gutartigen Thyroidtumorzellen (weniger als oder gleich 10 % der normalen Zellen) fast keine Immunreaktivität gezeigt wird, während höhere Immunreaktivität mit den Thyroidkarzinomen (mehr als oder gleich 20 % der Karzinomzellen) gezeigt wird.
Demgemäß ist es möglich, Thyroidkrebs unter Verwendung eines solchen Antikörpers zu diagnostizieren, und somit wird auch ein Verfahren zur histologischen Diagnose von Thyroidkarzinom beschrieben. Das diagnostische Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, dass man: eine Thyroidgewebeprobe von einem Patienten entnimmt, der unter Verdacht auf Thyroidkrebs steht, und eine Diagnose des Thyroidkrebses durchführt, indem man die Immunreaktivität zwischen dem oben beschriebenen Antikörper und der Gewebeprobe misst. In diesem Fall können die Thyroidgewebeproben jede beliebige Art von Proben sein, z. B. durch Aspiration mit feinen Nadeln aus dem Patienten entnommene oder durch Excision und Exstirpation eines Teils der Schilddrüse gewonnene Proben. Das diagnostische Verfahren, in dem die durch Aspiration mit dünnen Nadeln gewonnenen Proben verwendet werden, ist im Hinblick auf die geringere Invasivität in Bezug auf den Patienten bevorzugt. Dies ist ein wesentlicher Vorteil, der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, berücksichtigt man die Natur des diagnostischen Verfahrens für Thyroidkrebs anhand histologischer Gutachten des Gewebes, bei dem die Durchführung hochinvasiver Incisionsverfahren obligatorisch war. Überdies ist auch im immunhistochemischen Diagnoseverfahren unter Verwendung des Gewebeschnitts die vorliegende Erfindung nützlicher, da herausragendere Verlässlichkeit als mit dem herkömmlichen Verfahren erreicht werden kann.
Im oben beschriebenen diagnostischen Verfahren können die durch Aspiration mit dünnen Nadeln entnommenen Proben durch herkömmliche in vitro-Immunoassays auf ihre Immunreaktivität gemessen werden, z. B. durch Immunoblotting, Immunpräzipitation, ELISA oder dergleichen, wobei der erfindungsgemäße Antikörper verwendet wird. Andererseits können, wenn Gewebeschnitte als Proben verwendet werden, herkömmliche immunhistochemische Färbungstechniken verwendet werden, um anhand von Immunreaktionen die Immunreaktivität zu bestimmen.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers zur Herstellung einer den obengenannten Antikörper umfassenden Zusammensetzung zur histologischen Diagnose von Thyroidkarzinom bereit. Ein zuverlässiges diagnostisches Verfahren für Thyroidkrebs, wie oben beschrieben, kann unter Verwendung dieser Zusammensetzung durchgeführt werden. Diese Zusammensetzung kann Hilfsstoff, Träger, Puffer, Mittel zur Stabilisation des Antikörpers und dergleichen ad libitum zusätzlich zu dem Antikörper enthalten.
Demgemäß wurde erfindungsgemäß eine spezifische und hohe Expression von LAR in Thyroidkarzinomzellen gezeigt. Weiterhin wurde auch bestätigt, dass der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zur Diagnose von Thyroidkrebs, wie in den Beispielen illustriert, verwendbar ist. Außerdem erwies sich der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper als verwendbar zur Diagnose von Thyroidkarzinom, wenn Gewebsschnitte verwendet wurden (siehe Beispiele 5, 6), und zur Diagnose, wenn homogenisiertes Gewebe verwendet wurde (siehe Beispiel 7). Anhand dieser Ergebnisse versteht der Fachmann, dass die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper für mehrere Arten zytologischer oder histologischer Diagnosen oder Biopsien verwendbar sind. Weiterhin können neben den vorliegenden monoklonalen Antikörpern in solchen Verfahren auch monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper und/oder Peptidantikörper, die eine extrazelluläre Domäne von LAR erkennen können, verwendet werden. In solchen Fällen wiederum können die Verfahren nichtsdestoweniger auf ähnliche Weise durchgeführt werden wie diejenigen, in denen die vorliegenden monoklonalen Antikörper verwendet werden, jedoch werden Wirkungen, die sich aus der Freisetzung der extrazellulären Domäne ergeben, bevorzugter in Betracht gezogen.
Es wurde erfindungsgemäß gezeigt, dass die Antikörper gegen LAR zur Diagnose und Therapie von Erkrankungen, die in Bezug zum Thyroidkarzinom stehen, verwendet werden können. Eine Menge an LAR oder eines Fragmentes davon kann unter Verwendung eines solchen Antikörpers anhand der immunologischen Bindung zwischen ihnen bestimmt werden. Spezifisch kann das Verfahren zur Bestimmung einer Menge von LAR oder eines Fragmentes davon z. B. ein Sandwich-Verfahren umfassen, wobei ein Sandwich-Komplex detektiert wird, der durch eine Immunreaktion von LAR oder einem Fragment davon mit einem Antikörper, der an einen unlöslichen Träger gebunden ist, und einem markierten Antikörper gebildet wurde; und ein Verfahren, in dem eine Menge von LAR oder einem Fragment davon in einer Probe unter Verwendung eines Kompetitionsverfahrens bestimmt wird, in dem man kompetitiv LAR oder ein Fragment davon und markiertes LAR mit dem Antikörper immunreagieren lässt und dann eine Menge an LAR oder einem Fragment davon anhand der Menge des markierten Antigens, das an den Antikörper gebunden hat, bestimmt.
Wenn eine Menge an LAR oder einem Fragment davon durch das Sandwich-Verfahren bestimmt wird, wird ein Zweischritt-Verfahren durchgeführt, in dem eine Immunreaktion eines immobilisierten Antikörpers mit LAR oder einem Fragment davon zuerst ermöglicht wird, dann nicht umgesetzte Substanzen durch Waschen vollständig entfernt werden, ein markierter Antikörper zugesetzt wird und auf diese Weise ein Komplex von markiertem Antikörper und LAR oder einem Fragment davon gebildet wird; oder ein Einschritt-Verfahren, in dem ein immobilisierter Antikörper, ein markierter Antikörper und LAR oder ein Fragment davon gleichzeitig vermischt werden.
Zu dem unlöslichen Träger, der für eine solche Bestimmung verwendet werden kann, können z. B. Kunstharze wie z. B. Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyester, Polyacrylatester, Nylon, Polyacetal, fluoriertes Harz und dergleichen, Polysaccharide wie z. B. Cellulose, Agarose und dergleichen, Glas und Metall usw. gehören. Der unlösliche Träger kann verschiedene Formen haben, z. B. tablettartig, sphärisch, fasrig, zylindrisch, scheibenförmig, gefäßförmig, zellförmig, röhrenförmig usw. Der Träger mit dem absorbierten Antikörper wird in der Kälte in Gegenwart eines antiseptischen Mittels wie Natriumazid gelagert.
Zur Immobilisierung eines Antikörpers kann ein bekanntes chemisches Bindungsverfahren oder ein physikalisches Absorptionsverfahren verwendet werden. Das chemische Bindungsverfahren kann z. B. ein Glutaraldehyd verwendendes Verfahren, ein Maleimidverfahren, bei dem N-Succinimidyl-4-(N-maleimidmethyl)-cyclohexan-1-carboxylat, N-Succinimidyl-2-maleimidacetat oder dergleichen verwendet werden, ein Carboiimid-Verfahren, in dem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminpropyl)carboiimidhydrochlorid verwendet werden kann, beinhalten. Weiterhin kann es ein Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren, ein N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionsäure-Verfahren, ein bisdiazotiertes Benzidin-Verfahren oder ein Dipalmityllysin-Verfahren umfassen. Alternativ kann ein Komplex, der zuvor durch eine Reaktion eines Detektionstestmaterials mit einem Antikörper, dessen Epitop von anderer Art ist, gebildet wurde, eingefangen werden, nachdem der dritte Antikörper gegen diesen Antikörper gemäß dem oben beschriebenen Verfahren immobilisiert wurde.
Das zur Markierung des Antikörpers zu verwendende Material kann ein Enzym, ein fluoreszierendes Material, ein lumineszierendes Material, ein radioaktives Material, ein Metallchelat oder dergleichen sein. Zu einem Enzym können z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-D-Galaktosidase, Malatdehydrogenase, Staphylococcus-Nuclease, Delta-5-Steroidisomerase, α-Glycerolphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, Asparaginase, Glukoseoxidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase und dergleichen gehören; und zu dem fluoreszierendem Material können z. B. Fluoresceinisothiocyanat, Phycobilinprotein, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Orthophthalsäurealdehyd und dergleichen gehören; zu dem Lumineszenzmaterial können Isoluminol, Lucigenin, Luminol, aromatische Acridinester, Imidazol, Acridinsalz und modifizierte Ester davon, Luciferin, Luciferase, Aequorin und dergleichen gehören; und zu dem radioaktiven Material können ¹²⁵I ¹²⁷I ¹³¹I ¹⁴C ³H ³²P ³⁵S und dergleichen gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, solange das Material in immunologischen Bestimmungsverfahren verwendet werden kann. Weiterhin können Haptene mit geringem Molekulargewicht wie z. B. Biotin, Dinitrophenyl, Pyridoxal oder Fluorescamin an die Antikörper konjugiert werden. Vorzugsweise kann Meerrettichperoxidase als Markierungsenzym verwendet werden. Dieses Enzym kann mit vielen Substraten reagieren, während es ohne weiteres durch ein periodisches Säureverfahren mit dem Antikörper konjugiert wird.
Wenn ein Enzym als Markierungsmaterial verwendet wird, werden ein Substrat zur Messung seiner Aktivität und ein Mittel zur Entwicklung von Farbe verwendet. Wenn Peroxidase als Enzym verwendet wird, können H₂O₂ als Substratlösung und 2,2'-Azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfonat]ammonium (ABTS), 5-Aminosalizylsäure, Orthophenyldiamin, 4-Aminoantipyrin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin oder dergleichen als Mittel zur Entwicklung von Farbe verwendet werden; wenn alkalische Phosphatase als Enzym verwendet wird, kann das Substrat Orthophenylphosphat, Paranitrophenylphosphat oder dergleichen sein; alternativ kann das Substrat, wenn β-D-Galaktosidase als Enzym verwendet wird, Fluorescein-di(β-D-galaktopyranosid), 4-Methyl-umbelliferyl-D-galaktopyranosid oder dergleichen sein.
Auch Kits, die den oben beschriebenen monoklonalen Antikörper oder polyklonale Antikörper und Reagenzien enthalten, werden offenbart.
Als Quervernetzungsmittel können N,N'-Orthophenyldimalimid, 4-(N-Maleimidmethyl)-cyclohexanoyl-N-succinimidester, 6-Maleimidhexanoyl-N-succinimidester, 4,4'-Dithiopyridin, Orthophenylendimaleimid, 4-(N-Maleimidmethyl)-cyclohexanoyl-N-succinimidester, 6-Maleimidhexanoyl-N-succinimidester, 4'4'-Dithiopyridin oder andere bekannte Quervernetzungsmittel verwendet werden. Die Reaktion eines solchen Quervernetzungsmittels mit dem Enzym und dem Antikörper kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Quervernetzungsmittels, das verwendet wurde, gemäß bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Alternativ kann der zu verwendende Antikörper ein beliebiges Fragment dieser Antikörper sein, z. B., abhängig von den Bedingungen, Fab', Fab, F(ab')2. Weiterhin kann ein enzymatisch markierter Antikörper sowohl im Falle eines polyklonalen Antikörpers als auch eines monoklonalen Antikörpers durch ein ähnliches Verfahren erhalten werden. Wenn der enzymatisch markierte Antikörper, der unter Verwendung des obengenannten Quervernetzungsmittels erhalten wurde, durch irgendein bekanntes Verfahren gereinigt wird, kann ein empfindlicheres immunologisches Bestimmungssystem erreicht werden. Der enzymatisch markierte Antikörper, der auf eine solche Weise gereinigt wurde, kann mit einem Stabilisator wie Thimerosal, Glyzerin oder dergleichen vermischt werden; alternativ kann er lyophilisiert und dann in Kälte und Dunkelheit gelagert werden.
Eine DDS (Drug Delivery System)-Formulierung, die unter Verwendung des oben beschriebenen Antikörpers mit spezifischer Immunreaktivität für Thyroidkarzinomzellen auf Thyroidkarzinomzellen gerichtet ist, wird ebenfalls offenbart.
Es wurde erkannt, dass am Thyroidkarzinom mehrere Gene beteiligt sind. Mutationen in der Tyrosinkinasedomäne des Ret- oder TRK-Gens wurden in einigen der an Papillärkarzinomen leidenden Patienten gefunden (Fusco, A., et al., Nature, 328, 170–2, 1987). Weiterhin wurde bei 3–30 % der Papillärkarzinompatienten ohne Vorgeschichte vergangener Strahlungsexposition eine Mutation im Ret-Gen beobachtet (Santoro, M. et al., J. Clin Invest, 89, 1517–22, 1992; Bongdrzone, I. et al, J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 2006–9, 1996; Zou, M. et al, Cancer, 73, 176–80, 1994), während eine höhere Inzidenz von 60–80 % der Ret-Mutation bei diagnostiziertem Papillärkarzinom bei Kindern, die bei der Katastrophe im Tschernobyl-Kernkraftwerk Strahlenexposition erlebt hatten, oder bei Patienten mit einer Fallgeschichte der Strahlenexposition in ihrer Kindheit beobachtet wurde (Fugazzofe, L. et al, Cancer Res., 55, 5617–20, 1995; Klugbauer, S. et al., Oncogene, 11, 2459–67, 1995; Nikiforov, Y. E. et al., Cancer Res., 57, 1690–4, 1997; Bounacer, A. et al., Oncogene, 15, 1263–73, 1997), und die Häufigkeit der TRK-Genmutation ist signifikant gering (Bongdrzone, I. et al., J. Clin. Endocrinol Metab., 81, 2006–9, 1996). Eine Punktmutation des Ras-Gens wird häufig bei Kropf- und Follikulärkarzinom des Thyroids beobachtet. Als Grundlage dieses Umstandes wurde eine Punktmutation des Ras-Gens auf einer frühen Stufe der Tumorentwicklung erkannt (Fagin, J. A., Molecular pathogenesis. In: Braverman LE, Utiger RD, Hrsg. Werner und Ingbar's, the tyroid: a fundamental and clinical text. 7. Ausgabe Philadelphia: Lippincott-Raven, 909–16, 1996; Challeton, C. et al., Oncogene, 11, 601–3, 1995). Die Mutation von Genen, die TSH und das stimulatorische G-Protein codieren, wurde in einigen Fällen von Follikulärkarzinom des Thyroids berichtet (Challeton, C., et al., Oncogene, 11, 601–3, 1995; Russo, D. et al., Oncogene, 11, 1907–11, 1995). Weiterhin wurde ebenfalls berichtet, dass eine Mutation des Tumorsuppressorgens p53 in differenzierten Thyroidkarzinomen selten ist, es jedoch in undifferenzierten Karzinomen häufig gefunden wird (Fagin, J.K. et al., J. Clin. Invest, 91, 179–84, 1993; Ito, T. et al., Cancer Res., 52, 1369–71, 1992).
Anhand dieser bekannten Informationen kann eine Nukleinsäure mit dem Ziel der Therapie oder der Diagnose von Thyroidkrebs in einer DDS-Formulierung eingeschlossen werden, die durch einen Antikörper gegen LAR zielgerichtet wird.
Weiterhin ist auch bekannt, dass die Proliferation des Thyroidkarzinoms durch das thyroidstimulierende Hormon (TSH) reguliert wird, und dass Suppression der TSH-Sekretion durch Verabreichung eines Thyroidhormonmedikaments das Wiederauftreten, die Überlebensrate oder dergleichen bei Thyroidtumor verbessern kann. Demgemäß kann auch ein Protein, eine Nukleinsäure oder eine Verbindung, das beziehungsweise die die TSH-Stimulation inhibieren kann, in die DDS-Formulierung eingeschlossen werden.
Andererseits kann die vorliegende DDS-Formulierung, die dadurch charakterisiert ist, dass sie unter Verwendung des oben beschriebenen Antikörpers mit spezifischer Immunreaktivität mit Thyroidkarzinomzellen auf Thyroidkarzinomzellen zielgerichtet ist, eine oder mehrere Substanzen umfassen, die ausgewählt sind unter Nukleinsäuren, Jod, Radiojod, Technetium und einem Protein, und demgemäß wird durch Einschluss solcher Substanzen in die Formulierung eine höhere Zielrichtungsfähigkeit auf Thyroidkarzinom ermöglicht, die zur Therapie oder Diagnose von Thyroidkrebs ausgenutzt werden kann.
„Nukleinsäure" bezeichnet hier z. B. eine Nukleinsäure, die ein Protein codiert, das in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, eine Gegensinn-Nukleinsäure, die aus Zellen gewonnen ist, eine Köder-Nukleinsäure mit einer Sequenz eines Gens, das ein Bindungsprotein für einen aus einer Zelle gewonnenen Transkriptionsfaktor codiert, oder eine Sequenz einer Bindungsstelle eines Transkriptionsfaktors oder eine dazu ähnliche Sequenz.
Eine „Gegensinn-Nukleinsäure" stellt eine Nukleinsäure oder eine Nukleinsäuresequenz dar, die spezifisch an eine Nukleinsäure bindet, die imstande ist, zu einem zukünftigen Zeitpunkt, auf irgendeiner Stufe der Gen-Expression, d. h. Replikation, Transkription, Translation oder dergleichen, exprimiert zu werden, und dadurch die Expression der Nukleinsäure inhibiert, die ansonsten zu einem zukünftigen Zeitpunkt exprimiert werden könnte. Die Gegensinn-Nukleinsäure umfasst auch eine gegen das Gen gerichtete Nukleinsäure, die sich aus einem Dreifachstrang ergibt. Eine Nukleinsäure, die einen Köder codiert, stellt eine Nukleinsäure dar, die die Sequenz einer Nukleinsäure hat, die ein Bindungsprotein eines aus einer Zelle gewonnenen Transkriptionsfaktors oder eine Sequenz einer Bindungsstelle eines Transkriptionsfaktors oder eine dazu ähnliche Sequenz codiert, so dass durch Einführung der Nukleinsäure in eine Zelle als Köder die Bindung eines Transkriptionsfaktors an seine Bindungsstelle inhibiert werden kann, was zur Suppression einer Wirkung des Transkriptionsfaktors führen kann und schließlich die Suppression einer Gruppe von Genen, die aktiviert werden sollte, möglicherweise resultiert. „Ribozym" bezeichnet hier eine Nukleinsäure, die die mRNA eines spezifizierten Proteins schneiden kann und dann die Translation des spezifizierten Proteins inhibiert. Ein Ribozym kann aus einer Gen-Sequenz, die das spezifizierte Protein codiert, hergestellt werden, die hier ohne Berücksichtigung des Typs des Ribozyms z. B. ein Hammerkopftyp-Ribozym, ein Haarnadel-Ribozym, ein Ribozym vom Deltatyp und dergleichen umfassen kann, solange es die mRNA eines spezifizierten Proteins schneiden kann, was zur Inhibition der Translation des spezifizierten Proteins führt. Ein Selbstmordgen bezeichnet hier ein Gen, das zum Tod einer Zelle führt, wozu ein den programmierten Zelltod induzierendes Gen, ein die Apoptose induzierendes Gen, ein die Nekrose induzierendes Gen und dergleichen gehören können.
Diese Nukleinsäuren können vom Fachmann ausgewählt werden, und durch Aufnahme dieser Nukleinsäuren in die DDS-Formulierung kann spezifischer Tod von Thyroidkarzinomzellen erreicht werden.
Durch Zusatz von Radiojod (¹³¹I) zu der Formulierung werden normale Thyroidzellen zerstört, und somit kann die Metastase des Karzinoms durch systemische Radiojodszintillationstests ohne weiteres detektiert werden. Weiterhin können durch Messung des Blutthyroglo bulinwertes nach der Operation verbliebene Karzinome oder Wiederauftreten identifiziert werden. Weiterhin ermöglicht es die Radiojodtherapie, durch Zerstörung latenter Karzinome ein Wiederauftreten zu verhindern, und ein systemischer Radiojodszintillationstest kann durchgeführt werden, indem man eine Menge Radiojod zur Therapie verwendet. Dieser Test ist hochsensitiv für das Auffinden von übriggebliebenen Karzinomen. Somit kann die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder des jodmarkierten oder radiomarkierten Antikörpers die Verwendbarkeit zur Diagnose oder der Therapie weiter gesteigert werden.
Weiterhin kann das Protein Antikörper, TSH (thyroidstimulierendes Hormon), Thyroidhormon und dergleichen umfassen.
Die oben erwähnte DDS-Formulierung, die die oben beschriebenen Substanzen umfasst, ist als pharmazeutische Zusammensetzung zur Diagnose von Thyroidkrebs oder als pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Thyroidkrebs verwendbar.
Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Thyroidkarzinom oder Krankheiten, die im Zusammenhang mit Thyroidkarzinom stehen, bilden somit einen Teil der Erfindung. Eine wirksame Chemotherapie, die mit geringeren Nebenwirkungen verbunden ist, wird erreicht, indem man ein Medikament auf den Zielpunkt konzentriert, wobei man eine Fähigkeit dieses Antikörpers ausnützt, aufgrund von spezifischer Immunreaktivität an Thyroidkarzinomzellen zu binden, wenn eine therapeutische Behandlung des Thyroidkarzinoms unter Verwendung eines chemotherapeutischen Mittels beabsichtigt ist.
Ein effektives chemotherapeutisches Mittel für Thyroidkarzinom kann Antikrebsmittel wie Cyclophosphamid, Adriamycin, Streptozotozin, 5-Fluoracil, Dacarbazin, Vincristin und dergleichen umfassen.
Ein Verfahren der Verabreichung der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung kann entweder durch systemische Verabreichung oder durch lokale Verabreichung erfolgen. Zur systemischen Verabreichung können orale Verabreichung, intravenöse Verabreichung, subkutane und intramuskuläre Injektion, rektale Verabreichung und dergleichen gehören, und die lokale Verabreichung kann vorzugsweise durch direkte Verabreichung ins Thyroidgewebe oder durch Verabreichung in ein Blutgefäß, das zum Thyroidgewebe führt, erfolgen.
Die Dosierungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können von den bekannten wirksamen Blutspiegeln eines Pharmakons abhängen, die ad libitum vom Fachmann bestimmt werden können. Weiterhin ist es wichtig, wenn eine Liposomenformulierung hergestellt wird, den Antikörper in einer Dosierung zu verwenden, die die Liposomenbildung nicht beeinträchtigt.
Insbesondere bei der Verabreichung an einen Menschen kann der in die DDS-Formulierung aufzunehmende Antikörper vorzugsweise der oben beschriebene humanisierte Antikörper, chimäre Antikörper oder dergleichen ohne Immunogenität für Menschen oder zu mindest mit verringerter Immunogenität sein. Wenn ein monoklonaler Mäuseantikörper einem menschlichen Körper verabreicht wird, ist das Risiko des Auftretens verschiedener Nebenwirkungen zu erwarten, da ein solcher Antikörper für einen Menschen ein heterogenes Protein ist. Demgemäß können, obwohl die Verwendung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers wünschenswert ist, die Fusionseffizienzen geringer sein, und es kann schwierig sein, ein Hybridom zu erhalten, das stabil einen Antikörper bildet. Jedoch haben sich die Technologien kontinuierlich weiterentwickelt, was die Erzeugung von menschlichen monoklonalen Antikörpern durch chimäre Antikörper ermöglicht.
Ein chimärer Antikörper kann ein chimäres Molekül sein, das einen murinen Antikörper und einen menschlichen Antikörper umfasst. Einen Antikörper durch Immunisierung eines Menschen mit einem beliebigen Antigen herzustellen, ist ethisch unmöglich. Daher wird zuerst eine Maus immunisiert, dann wird ein Genteil der variablen Region (V-Region) eines Antikörpers, der ein Antigen des erhaltenen monoklonalen Mäuseantikörpers bindet, daraus isoliert, dieser Genteil wird mit einem Gen verbunden, der die konstante Region (C-Region) eines Antikörpers aus menschlichem Myelom codiert, um ein chimäres Gen zu erzeugen. Wenn das so hergestellte chimäre Gen in einer Wirtszelle exprimiert wird, kann ein menschlich-muriner monoklonaler Antikörper produziert werden. Da chimäre Antikörper für Menschen weniger immunogen sind, kann er als monoklonaler Antikörper verwendet werden, der einem menschlichen Körper zur Therapie oder zu bildgebenden diagnostischen Verfahren verabreicht wird. Zu bekannten relevanten Vorveröffentlichungen chimärer Antikörper gehören die vorläufige japanische Publikation Nr. Hei 05-304989 , die vorläufige japanische Publikation Nr. Hei 04-330295 , die PCT-Publikation Nr. WO9106649 , die vorläufige japanische Publikation Nr. Sho 63-036786 , die japanische Publikation Nr. Hei 06-98021 und dergleichen.
In jüngerer Zeit wurden jedoch humanisierte Antikörper entdeckt, die als besser verwendbar als chimäre Antikörper beschrieben wurden. Ein humanisierter Antikörper ist ein Antikörper, dessen gesamtes Molekül mit der Ausnahme der CDR (komplementaritätsbestimmenden Region) des Antikörpermoleküls humanisiert ist, indem nur das die CDR codierende Gen des Antikörpermoleküls auf ein Gen, das einen humanisierten Antikörper codiert, übertragen worden ist. Die humanisierten Antikörper haben einen geringeren aus der Maus stammenden Antikörperanteil als human-murine chimäre Antikörper, weswegen sie als weniger antigen und sicherer beschrieben wurden. In Japan wurden gegenwärtig klinische Tests an humanisierten Antikörpern gegen die T-Zelt-Leukämie der Erwachsenen durchgeführt. Im Hinblick auf Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper und dem verwandten Stand der Technik siehe z. B. die PCT-Publikationen Nummern WO9222653 , WO9845332 , WO9404679 , WO9837200 und WO9404679 von Genentech, USA, und die PCT-Publikationen Nummern WO9429451 , WO9429351 , WO9413805 , WO9306231 , WO9201059 , WO9116927 , WO9116928 , WO9109967 , WO8901974 , WO8901783 von Celltech, Vereinigtes Königreich, und dergleichen.
Zu Verfahren zur Erzeugung menschlicher monoklonaler Antikörper können neben dem Zellfusionsverfahren ein Transformationsverfahren mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) und ein anderes Fusionsverfahren von so transformierten Zellen und Elternzellen, ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Antikörpers und eines humanisierten Antikörpers unter Verwendung von Gentechnik und dergleichen gehören. Ein chimärer Antikörper bezieht sich auf einen Antikörper, der dadurch hergestellt worden ist, dass man Immunglobulingenfragmente heterologer Tiere miteinander verbindet, und ein humanisierter Antikörper bezieht sich auf einen Antikörper, der dadurch hergestellt wurde, dass man einen zu einem menschlichen Antikörper heterologen Antikörper wie z. B. einen Mäuseantikörper modifiziert, wobei als Primärstruktur mit der Ausnahme der CDR (komplementaritätsbestimmenden Region) in der H-Kette und der L-Kette die entsprechende primäre Struktur eines menschlichen Antikörpers eingesetzt wird. Als Ausgangszellen zur Herstellung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers können Stamm SHM-D 33 (ATCC CRL 1668) oder Stamm RF-S1 verwendet werden, welche menschlich/murine Heteromyelome sind, so dass eine hohe Fusionseffizienz, die der mit Mäuse-Elternzellen gleicht, erreicht werden kann. Unter Verwendung solcher Elternzellen erhaltene Hybridome können ohne Feeder-Zellen kloniert werden, und sie können auf relativ stabile Weise in großem Maßstab Antikörper vom IgG-Typ bilden. Zur Kultur der Elternzellen kann ERDF-Medium, enthaltend 15 % FCS, verwendet werden, und ein anderes Verfahren kann in ähnlicher Weise im Fall der Kultur von murinen Elternzellen ausgeführt werden. Weiterhin ist es bevorzugt, mit dem Antigen hinreichend sensitivierte menschliche Lymphozyten zu verwenden, die aus peripherem Blut gewonnen werden, um menschliche monoklonale Antikörper vom IgG-Typ zu produzieren. Wenn es schwierig ist, solche hinreichend sensitiven Lymphozyten mit einem Antigen zu gewinnen, kann auch eine in vitro-Sensitivierung mit dem Antigen durchgeführt werden.
Unter Verwendung der dargestellten Verfahren kann der vorliegende Antikörper humanisiert werden, und somit eignet er sich besonders für die Verabreichung an einen menschlichen Körper.
Weiterhin kann die Verwendbarkeit als diagnostisches oder therapeutisches Medikament durch Radiomarkierung solch eines Antikörpers mit Jod oder durch Einbeziehung von radiomarkiertem Jod in eine mit dem Antikörper zielgesteuerte pharmazeutische Zusammensetzung gesteigert werden.
Wenn ein papilläres Karzinom oder follikuläres Karzinom in das umgebende Gewebe eindringt oder durch den Blutstrom zu einem entfernten Teil des Körpers (insbesondere in die Lunge und den Knochen) metastasiert, ist eine gebräuchliche therapeutische Strategie zur Zerstörung des Tumors die Verabreichung von radiomarkiertem Jod (¹³¹-I). Normale Thyroidzellen nehmen Jod aus dem Blut auf und konzentrieren es. Dieser Prozess wird durch das TSH (thyroidstimulierende Hormon) stimuliert, das von der Hypophyse sezerniert wird. Jod wird danach verwendet, um das Thyroidhormon zu bilden (Thyroxin T4). Wie oben dargestellt, nimmt ein Thyroidkarzinom oder metastatisches Karzinom normalerweise nur geringe Mengen an Jod (oder radioaktivem Jod) auf. Wenn jedoch das Karzinom unter dem Einfluss großer Mengen von TSH steht, neigt ein Teil des Thyroidkarzinoms oder der Metastase dazu, bei der Stimulation eine erhebliche Jodmenge aufzunehmen. Demgemäß ist es möglich, das Karzinom einer hohen Strahlungsdosis auszusetzen, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen. Wenn in einem Körper ein intaktes Thyroid vorliegt und ein normaler Spiegel des Thyroidhormons gebildet wird, kann der gebildete TSH-Spiegel relativ niedrig bleiben; beim Absinken des Thyroidhormonspiegels infolge einer Entfernung oder Zerstörung des gesamten Thyroids beschleunigt jedoch die Hypophyse rasch die TSH-Sekretion. Das TSH stimuliert das Thyroidkarzinom, was zur Aufnahme radioaktiven Jods führt. Wenn eine Radiojodtherapie für ein metastasierendes Thyroidkarzinom durchgeführt wird, muss das gesamte Thyroid fast vollständig durch eine Operation entfernt werden, und das restliche Gewebe muss unter Verwendung von Radiojod zerstört werden. Nachdem dieses Verfahren durchgeführt worden ist, werden Patienten, bei denen Tumore im Hals verbleiben oder die eine Metastasierung des Karzinoms an entfernten Stellen haben, einem Scannen unterzogen, wenn ihr TSH-Spiegel hoch genug ist, wobei eine Testmenge an radioaktivem Jod verwendet wird (normalerweise 2–10 mCi). Wenn gezeigt wird, dass eine wesentliche Menge an Radiojod sich in einer Region eines Thyroidkarzinoms ansammelt, wird in einem Versuch, den Tumor zu zerstören, eine größere, therapeutische Menge an Radiojod verabreicht (normalerweise 100–200 mCi ~ 3700–7400 MBq). Da Radiojod auch bei Patienten mit stärker invasivem Thyroidkarzinom sicher und wirksam ist, sind viele Ärzte dazu übergegangen, Radiojod routinemäßig für weniger invasive Papillärkarzinome oder Follikulärkarzinome zu verwenden.
Somit kann durch Markierung des LAR-bindenden Antikörpers unter Verwendung von Jod oder durch Einbeziehung von Radiojod in eine mit dem Antikörper zielgerichtete pharmazeutische Zusammensetzung die Spezifität für Thyroidkarzinomzellen weiter gesteigert werden, was eine therapeutische oder diagnostische Anwendung ermöglicht.
Demgemäß ist ein Antikörper gegen LAR, der spezifisch Thyroidkarzinomzellen erkennt, auch in einem Drug Delivery System (DDS) verwendbar. Ein Drug Delivery System (Mitsuru Hashida, Drug Delivery System, New Challenges to Manufacturing Drugs and Therapy, Kagaku Doujin, (1995)) ist eine neue Technik im Bereich der Medikamentenverabreichung, die darauf abzielt, Verabreichungswege oder Formen von Medikamenten zu finden; die Medikamente selektiv an die Zielorte abzugeben, indem man die Pharmakokinetik der Medikamente im Körper kontrolliert; die optimalen therapeutischen Wirkungen als Ergebnis zu erreichen; und die von den Medikamenten ausgeübten Nebenwirkungen zu minimieren. Obwohl zuvor schon verschiedene DDS-Formulierungen entwickelt wurden, werden Liposomenformulierungen (Hiroshi Terada, Tetsuro Yoshimura Hrsg., Experiment Manual of Liposome in Life Science, Springer-Verlag, Tokyo, (1992)) vor allen anderen hervorgehoben zur Ergänzung eines defizienten Enzyms, zur Verabreichung karzinostatischer Mittel und Antibiotika, ebenso wie in der Gentherapie.
Ein Liposom ist ein kleines, geschlossenes Vesikel, das aus einer Lipiddoppelschicht besteht, deren Basis ein Phospholipid ist, das eine Biomembran bildet, das als sicher mit einer überlegenen Funktion als Arzneistoffträger bekannt ist, da es verschiedene Pharmaka unabhängig von ihrer Löslichkeit verkapseln kann, ob die Pharmaka nun fettlöslich oder wasserlöslich sind, wobei die Zusammensetzung eines Liposoms eine Lipidmembran und einen wässrigen Schichtenteil umfasst.
Weiterhin ist es wohlbekannt, dass eine Zielsteuerungsfähigkeit einem Liposom vermittelt werden kann, indem man einen Antikörper, ein Peptid oder dergleichen an die Oberfläche des Liposoms bindet (Kazuo Maruyama, Tomoko Takizawa, Motoharu Iwatsuru et al., Biochimica et Biophysica Acta 1234, 74 (1995; Jibao Zaho, Shunsaku Kimura, Yukio Imanishi, Biochimica et Biophysica Acta 1283, 37 (1996)). Demgemäß können Antikörper gegen LAR zu dem Zweck verwendet werden, die Spezifität verschiedener Liposomenformulierungen für Thyroidkarzinomzellen zu verbessern. Weitere charakteristische Merkmale der Liposomen sind ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Trägern (Vektoren) zu bilden, deren Eigenschaften sich durch Veränderung einer Art des Lipids oder durch Modifikation mit Polyethylenglykol unterscheiden: z. B. temperatursensitive Liposomen (Sakae Unezaki, Kazuo Maruyama, Motoharu Iwatsuru et al., Pharmaceutical Research 11, 1180 (1994)), in Blut stabile Liposomen (Kazuo Maruyama, Tsutomu Yuda, Motoharu Iwatsuru et al., Biochimica et Biophysica Acta 1128, 44 (1992)), kationische Liposomen als Vektoren zur Einführung von Plasmiden (Xiang Gao, Daniel Jaffurs, Leaf Huang et al.; Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1201 (1994)), und dergleichen können hergestellt werden.
Liposomen werden jedoch üblicherweise auf einem endozytotischen Weg in die Zellen aufgenommen, gefolgt von Aufnahme in frühe Endosomen in der Nähe der Zellmembran. Dann werden die Liposomen in späte Endosomen in einem tieferen Teil der Zelle übertragen und schließlich in Lysosomen transferiert. Die Liposomen, die in Lysosomen transferiert wurden, werden durch die Wirkung hydrolytischer Enzyme abgebaut, und die in Liposomen enthaltenen Pharmaka werden gleichzeitig metabolisiert, und es existiert somit das Problem, dass die wirksame Menge der Pharmaka, die unverändert ins Zytoplasma übergeht, extrem gering sein kann.
Gegenwärtig wird ein Verfahren zum direkten Einbringen von Pharmaka und dergleichen ins Zytoplasma ohne Schädigung der Zellmembran, die eine Barriere einer Zelle ist, untersucht. Wenn z. B. Liposomen eine Fähigkeit erlangen, mit einer Membran zu fusionieren, sind darin enthaltene Pharmaka imstande, direkt und ohne Transfer durch die Lysosomen ins Cytosol abgegeben zu werden. Verfahren zur Fusion des Liposoms mit einer Zelle wurden zuvor untersucht, und hierzu gehören: pH-empfindliche Liposomen (Kenji Kono, Ken-ichi Zenitani, Toru Takabishi, Biochimica et Biophysica Acta 1193, I (1994)); und rekonstituierte Liposomen, welche Liposomen sind, in die ein Hüllprotein eines Virus einbezogen ist (Sangeeta Bagai, Debi P. Sarkar, The Journal of Biological Chemistry 269, 1966 (1994)).
Unlängst wurde ein fusogenes Liposom (HJV-Liposom) beschrieben, welches ein Liposom mit der übernommenen Fähigkeit des Sendai-Virus (japanisches hämagglutinierendes Virus), mit einer Membran zu fusionieren, ist (Yoshio Okada, Currenttopics in Membranes and Transport 32, 297 (1988)). Das Sendai-Virus (HVJ) ist ein Modellvirus für die Genetik unter Verwendung von Tierzellen, basierend auf der Beobachtung eines interzellulären Fusionsereignisses (Y Maeda, J Kim, Y. Okada et al., Experimental Cell Research 108, 108 (1977)). Weiterhin kann HVJ auch mit Liposomen fusionieren (Mahito Nakanishi, Tsuyoshi Uchida, Yoshio Okada et al., Experimental Cell Research 159, 399 (1985)), und das Fusionsprodukt (HVJ-Liposom) kann wiederum mit einer Zellmembran fusionieren. Ein HVJ-Liposom, das durch eine direkte Reaktion zwischen einem Liposom und HVJ hergestellt wurde, ist ein sogenannter Hybridvektor, der im Inneren einen Hohlraum trägt, der von dem Liposom stammt, und eine äußere Stachelstruktur, die mit der einer Virushülle identisch ist. HVJ-Liposomen können beliebige Substanzen, solange sie in Liposomen verkapselt werden können, wie z. B. Proteine, chemische Substanzen, Gene und dergleichen, mit hohen Effizienzen, die denen des Sendai-Virus gleichkommen, in Zellen übertragen (Tetsuhiko Nakagawa, Hiriyuki Mizuguchi, Tadanori Mayumi, Drug Delivery System 11, 411 (1996)). Eine weitere verbesserte Art von HVJ-Liposom wurde vorgeschlagen, bei der die Übertragungseffizienzen durch gemeinsame Übertragung mit DNA und einem Kernprotein HMG-1 (Nicht-Histon-Chromosomenprotein, High Mobility Group-1) mit DNA-Bindungsfähigkeit gesteigert werden können (Yasufumi Kaneda et al., J. Molec. Medicine 73, 289 (1995)).
Ein anderes Beispiel eines membranfusionierten Liposoms, das verwendet werden kann, ist eine Liposomenformulierung, in der VSV (vesikuläres Stomatitisvirus; Yoshiyuki Nagai, Akira Ishihama Hrsg., Protocols for Experiments of Virus, Medical View (1995)) verwendet wird (J. Virol, 72 (7), 6159–63, 1998, Exp. Cell. Res. 200(2), 333–8, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(7), 2448–51, 1990; und Biochim. Biophys. Acta, 987(1), 15–20, (1989)). VSV ist ein Virus mit einzelsträngiger (-)-RNA, das zu der Gattung Vesiculovirus in der Familie Rhabdovirus gehört und ein G-Protein besitzt, das ein Hüllprotein auf einer Membranoberfläche ist (Akihiko Kawai, Journal of Virology 24, 826 (1977)). Die Mechanismen der Zellinfektion von VSV können über einen endozytotischen Pfad ähnlich wie bei Liposomen verlaufen. Jedoch überträgt VSV im Unterschied zu Liposomen, da VSV eine charakteristische Fähigkeit hat, mit einer Endosomenmembran zu fusionieren, sein eigenes Gen ohne Abbau durch im Lysosom enthaltene hydrolytische Enzyme in das Zytoplasma. Bislang wurde beobachtet, dass VSV eine Fähigkeit hat, mit einer Membran zu fusionieren, und dass keine hämolytische Wirkung gegenüber menschlichen Erythrozyten von VSV ausgeht (Carole A. Bailey, Douglas K. Miller, John Lenard, Virology 133, 111 (1984)). Weiterhin ist eine große Vielzahl von Wirten möglich, da VSV das ubiquitär in einer Vielzahl von Gewebszellen vorkommende Phosphatidylserin als Rezeptor verwendet (Michael J. Clague, Christian Schoch, Robert Blumenthal, Biochemistry 29, 1303 (1990)), und die Vermehrung dieses Virus geht schnell vonstatten, somit wird VSV dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ohne weiteres in großen Mengen gewonnen werden kann. Andererseits wurde berichtet, dass VSV in Liposomen zu Fusionen führen kann (Satoshi Yamada, Shunichi Ohnishi, Biochemistry 25, 3703 (1986)).
Wie detailliert erklärt, können Antikörper gegen LAR dazu verwendet werden, die Zielsteuerungsfähigkeiten jeder Art von Liposomenformulierungen zu verbessern, einschließlich von Membranfusionsliposomen, pH-empfindlichen Liposomen, rekonstituierten Liposomen, kationischen Liposomen und dergleichen, oder modifizierten Arten davon.
Weiterhin wurden stichhaltige Berichte von Verfahren zur Verbesserung der Zielsteuerungsfähigkeiten unter Verwendung monoklonaler Antikörper und ihrer Anwendbarkeit gefunden (Hum. Antibodies, 9(1), 61–5, 1999; J. Clin. Pharm. Ther., 22(1), 7–19, 1997, J. Int. Med. Res. 25(1), 14–23, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (24), 14164–9, 1996; Hepatology, 22(5), 1482–7, 1995; Hepatology, 22(5), 1527–37, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(15), 6986–90, 1995; Immunomethods, 4(3), 259–72, 1994; J. Drug Target, 2(4), 323–31, 1994; Cancer Res, 57(10), 1922–8, 1997; Crit Rev. Biotechnol. 17(2), 149–69, 1997; Methods Find Exp. Clin Pharmacol., 16(7), 505–12, 1994; Trends Biotechnol., 12(6), 234–9, 1994; und Bioconjug, Chem., 4(1), 94–102, 1993), und somit können monoklonale Antikörper gegen LAR gemäß den oben beschriebenen Literaturstellen oder bekannten Techniken zur therapeutischen Behandlung von Thyroidkarzinom verwendet werden.
Weiterhin können erfindungsgemäße Antikörper gegen LAR im Hinblick auf die Zielsteuerung auf Thyroidkarzinom, zur Gentherapie mit viralen Vektoren oder für DDS-Formulierungen, in denen Polysäuren-Glykolsäure-Mikrosphären, Lipidmikrosphären, polyethylenglycolmodifizierte Enzyme oder dergleichen verwendet werden, verwendet werden.
Eine hohe Expression von LAR in Thyroidkarzinomzellen kann anzeigen, dass in diesen Zellen eine hohe Rate der Transkription von einer ein LAR-Molekül codierenden Nukleinsäuresequenz in eine mRNA, gefolgt von Translation, stattfindet. Dementsprechend kann der Fachmann durch Messung eines Expressionsniveaus der LAR-mRNA unter Verwendung von Sonden für die mRNA ein Karzinom einfach diagnostizieren.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung einen erheblichen Beitrag zu molekularbiologischen Untersuchungen an Transkriptionsfaktoren, Promotoren, Enhancern oder dergleichen, die die Transkription von LAR in Thyroidkarzinomzellen beschleunigen können, leisten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Schemadarstellung, die eine Untereinheitenstruktur von LAR zeigt (a); und eine Schemazeichnung, die die mutierten LAR-Phosphatasedomänenstrukturen innerhalb der Membran darstellt (b), wie in den Beispielen dargelegt hergestellt.
2 zeigt Immunoblots, die die zeitabhängige Tyrosinphosphorylierung illustrieren, die durch Insulinstimulation in COS-Zellen ausgelöst wird, die mit LAR/CS und Insulinrezeptor vom Wildtyp cotransfiziert worden waren.
3 zeigt Immunoblots, die die Phosphorylierung-Dephosphorylierung in COS-Zellen illustrieren, die mit Wildtyp- oder mutiertem LAR und Insulinrezeptor vom Wildtyp cotransfiziert worden waren.
4 zeigt einen Immunoblot, der die Dephosphorylierung einer β-Kette des Insulinrezeptors durch Wildtyp- oder mutiertes LAR zeigt.
5 stellt einen Immunoblot dar, der die Tyrosinphosphorylierung des Insulinrezeptors und von LAR in COS-Zellen zeigt, die mit LAR/CS und Insulinrezeptor vom Wildtyp oder mutiertem Insulinrezeptor cotransfiziert worden waren.
6 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel, das ein Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1 zeigt.
7 zeigt Immunoblots, die die Immunspezifität des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1 zeigen.
8 zeigt Immunoblots, die die LAR-Tyrosinphosphorylierung durch die Tyrosinkinase des Insulinrezeptors zeigen.
9 ist eine Schemadarstellung, die eine Signaltransduktionskaskade des Insulins zeigt, die durch Phosphorylierung-Dephosphorylierung kontrolliert wird, woran der Insulinrezeptor und LAR teilnehmen.
10 zeigt die Ergebnisse eines Immunoblottings, die die Gewebsverteilung von LAR bei der Maus unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1 zeigt.
11–13 zeigen die Ergebnisse einer selektiven Einfärbung von Krebszellen bei der Immunfärbung von menschlichen Thyroidkarzinomgewebeschnitten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1.
14 zeigt Immunoblots von normalen und karzinomatösen Thyroidgeweben mit dem erfindungsgemäßen Antikörper YU1, die die spezifische Immunreaktivität mit menschlichen Thyroidkarzinomgewebe zeigen.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Experimentelles Beispiel 1: Tyrosinphosphorylierung von Insulinrezeptoren durch LAR-Mutanten und Untersuchungen der Assoziation zwischen LAR und den Insulinrezeptoren
Zuerst wurde, um die die Insulinsignalübertragung Mechanismen durch LAR kontrollierenden Mechanismen aufzuklären, eine Analyse mit einer Strategie durchgeführt, in der ein mu tiertes LAR verwendet wurde, das durch Ersatz von Cystein, das in einem katalytischen Zentrum der PTP-Domäne von LAR vorkommt, mit Serin hergestellt wurde.
A) Expressionsvektoren für LAR und Insulinrezeptoren
Es wurden drei Arten von LAR-Expressionsvektoren verwendet, nämlich (a) LAR-WT: menschliches Wildtyp-LAR (SEQ ID NO: 3); (b) LAR C/S: mutiertes LAR mit einer Cysteinsubstitution in einem katalytischen Zentrum der LAR-PTP-Domäne 1 (Aminosäurenresteposition 1552 der SEQ ID NO:3) durch Serin durch Ersatz von Nukleotid G, Position 4983 der SEQ ID NO: 3, durch C; und (c) LAR DC/S: gegenüber LAR C/S an einer weiteren Stelle mutiert durch Substitution eines Cysteins in der LAR-PTP-Domäne 2 (Aminosäurenrest Position 1813 der SEQ ID NO: 3) durch Serin durch Ersatz des Nukleotids G mit C, Position 5856 der SEQ ID NO: 3 (siehe 1(b)), wobei jede dieser Sequenzen in einen pMT-Expressionsvektor eingebaut wurde (siehe Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897–907, 1992; und Streuli M. et al., EMBO J., 9, 2399–2407, 1990).
Gleichzeitig waren die verwendeten Insulinrezeptorexpressionsvektoren: (a) IR WT: Wildtyp und (b) IR K1018M: mutierter Insulinrezeptor mit einer Substitution des Lysins an der Position 1018 der ATP-Bindungsstelle des Wildtyp-Insulinrezeptors durch Methionin, was zur Tyrosinkinaseaktivitätsdefizienz führte, wobei jede dieser cDNAs stromabwärts eines SRα-Promotors eingefügt wurde (siehe Kanai F. et al., Biochemical und Biophysical Research Communications, 195, 762–768, 1993).
B) Transfektion in COS-7-Zellen
COS-7-Zellen wurden in mit 10 % fötalem Kälberserum ergänztem RPMI 1640 Medium (Nissui Pharmaceutical Co., LTD.) zu 1,0 × 10⁶ Zellen pro 8 mL pro 90 ∅ Schale ausplattiert, dann wurden nach 16-stündiger Inkubation die Expressionsvektoren für LAR C/S und IR WT unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens in die COS-7-Zellen cotransfiziert. Das verwendete LAR C/S war ein Vektor, von dem gefunden wurde, dass er entsprechend der Mutation, wie oben in Paragraph A (b) erwähnt, in vitro zur kompletten Defizienz an Tyrosinphosphataseaktivitäten führt (Streuli M. et al., EMBO J., 9, 2399–2407, 1990).
Die Cotransfektion geschah gemäß dem folgenden Verfahren: Zuerst wurden 40 μl an 10 mM Chloroquin zu 4 ml RPMI 1640 Medium (102 g/L an RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical Co., LTD.) enthaltend 0,3 g Glutamin und 0,1 g Kanamycin, pH 7,4, eingestellt mit 10 % NaH-CO₃), zugesetzt.
Zu 2 ml dieser Lösung wurden 5 μg an LAR-Expressionsvektor und 1 μg an IR-Expressionsvektor zugesetzt, während 16 μl an 100 mg/ml DEAE-Dextran zu 2 ml der übrigen Lösung zugesetzt wurden. Dann wurden beide Lösungen unter Rühren gründlich vermischt. Zu den so hergestellten 3,75 ml der Lösung des Expressionsvektors wurden auf 1,0 × 10⁶ Zellen pro 8 ml/pro Schale ausgebracht, und es wurde zu COS-7-Zellen zugesetzt, die 16 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO₂-Inkubator vorkultiviert worden waren. Nach 4 Stunden Kultur unter ähnlichen Bedingungen wie in der Vorkultur wurden die Zellen 2 Minuten lang mit einer 10 %-igen DMSO-Lösung behandelt, dann mit PBS gewaschen (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄·12H₂O, 1,4 mM KH₂PO₄), danach wurden 8 ml an 10 % FCS enthaltenem RPMI 1640 zugesetzt, und sie wurden 48 Stunden lang bei 37 °C in einem Inkubator, der auf 5 % CO₂ eingestellt war, kultiviert.
C) Insulinstimulierung und Herstellung des Zelllysats
Nach dem Abschluss der Transfektion wurden die COS-7-Zellen 16 Stunden lang in serumfreien RPMI 1640 Kulturmedium inkubiert, gefolgt von Stimulation mit 10^–7 M Insulin (Seikagaku Corporation) über festgelegte Zeiträume hinweg, d. h. 0, 1, 5, 15 und 30 Minuten. Die Stimulation über 0 Minuten wurde durchgeführt, indem man die Zellen ohne Inkubation bei 37 °C auf Eis stehen ließ, obwohl gleichzeitig Insulin zugesetzt wurde. Nachdem die jeweilige Zeit seit dem Beginn der Insulinstimulation verflossen war, wurde die Kulturflüssigkeit vollständig von den Zellen abgesaugt, und 5 ml PBS mit Inhibitoren (PBS enthaltend Tyrosinphosphataseinhibitoren: 1 mM Natriumvanadat, 5 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 5 mM EDTA-2Na, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄·12H₂O, 1,4 mM KH₂PO₄) wurde sofort zugesetzt.
Nach dem Waschen der ganzen Zellen mit PBS mit Inhibitoren wurde die Flüssigkeit durch Absaugen entfernt, und 1 ml Lysispuffer (1 % Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA, 10 mM Jodacetamid, 10 mM Natriumfluorid, 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,4 mM Natriumvanadat, 0,1 mM oxidiertes Phenylarsin, 1 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) wurde den Zellen zugesetzt, die danach mit einem Schaber gesammelt wurden. Die Zellsuspension wurde in ein 1.5-ml-Röhrchen übertragen, dann 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert, um vollständige Lyse der Zellen zu bewirken. Der Überstand, der durch 10-minütige Zentrifugation der Flüssigkeit bei 12.000 rpm und 4 °C nach der Inkubation erhalten wurde, wurde in den nachfolgend beschriebenen Experimenten als Zelllysat verwendet.
D) Immunpräzipitation
Immunpräzipitation wurde für das wie oben in Absatz C beschrieben erhaltene Zelllysat mit einem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR durchgeführt (ein Gemisch von 7,5 μg an 11.1 A und 7,5 μg an 75.3 A, siehe Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897–907, 1992). Zu 1 ml der obengenannten Zelllysislösung wurden 15 μg MOPC 21 (Mäuse-IgG1κ: Sigma Corporation) als Kontrolle zugesetzt, dann wurde die Lösung eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert, man setzte 20 μl γ-Bind (GammaBind Plus Sepharose: Pharmacia Biotech Inc.) zu und inkubierte eine weitere Stunde lang bei 4 °C, um die Präabsorption durchzuführen. Die Lösung wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 rpm zentrifugiert, dann wurden 950 μl des Überstandes in ein anderes Röhrchen übertragen. Im nächsten Schritt wurden im Überstand 15 μg Antikörper gegen die E- Untereinheit von LAR zugesetzt, dann wurde die Lösung eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert, man setzte 20 μl γ-Bind zu und inkubierte eine weitere Stunde lang bei 4 °C.
Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 4 °C und 12.000 rpm wurde das Präzipitat zwei Mal mit 1 ml Lysispuffer, dann ein Mal mit PBS mit Inhibitoren gewaschen und in 20 μl SDS-Probenpuffer aufgenommen. Die Suspension wurde 5 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt, um eine Probe für die Elektrophorese vorzubereiten.
E) Immunoblotting
Die oben beschriebene Probe wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines 7,5 % SDS-Polyacrylamidgels unterzogen, gefolgt von Transfer auf eine Nitrozellulosemembran (Schleicher & Schuell) unter Verwendung eines Transfergerätes bei 400 mA über 4 Stunden hinweg. Dann führte man eine Blockierung durch, indem man die Membran mehr als 30 Minuten lang in einer 3 %-igen Lösung von Rinderserumalbumin bei Raumtemperatur inkubierte. Nach mehr als doppeltem 10-minütigem Waschen mit einem genügenden Volumen an TBS-T (TBS mit Tween 20: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) wurde ein 50.000-fach mit TBS-T verdünnter Antikörper gegen Phosphotyrosin (4G10, UBI), der Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR oder ein Antikörper gegen die β-Kette des Insulinrezeptors (UBI) zugesetzt, dann wurde das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach mehr als 3-maligen 5-minütigen Waschen mit einem genügenden Volumen an TBS-T wurden 15 ml TBS-T-Lösung, enthaltend mit Meerrettichperoxidase markierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (meerrettichperoxidasemarkierter Anti-Maus-IgG, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1,5 ml, zugesetzt, und es wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach mehr als 3-maligen 5-minütigem Waschen mit einem genügenden Volumen an TBS-T wurden durch Chemilumineszenz unter Verwendung eines Kits von Lumineszenzreagenzien (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) die Proteinbanden detektiert, die an jeden einzelnen der Antikörper binden können.
F) Ergebnisse
Als Ergebnis des Immunoblottings mit dem Antiphosphotyrosinantikörper nach Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR aus dem auf die oben beschriebene Weise nach Stimulation mit Insulin über festgelegte Zeiträume von mit LAR C/S und IR WT cotransfizierten COS-7-Zellen konnten bei der 1-minütigen Insulinstimulation Tyrosinphosphorylierungen einer Insulinrezeptor β-Kette ebenso wie eines 85 kDa-Proteins beobachtet werden. Solche Tyrosinphosphorylierungen konnten auch nachfolgend bei der 30-minütigen Insulinstimulation beobachtet werden (siehe 2A).
Weiterhin zeigten die Ergebnisse des Immunoblottings mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR (2B), mit dem Antikörper gegen die β-Kette des Insulinrezeptors (2C) und mit dem Antiphosphotyrosinantikörper (2A), dass sich LAR und der Insulin rezeptor in Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit von Tyrosinphosphorylation des Insulinrezeptors assoziieren können.
Experimentelles Beispiel 2: Untersuchungen der Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors durch verschiedene LARs (1)
Als nächstes wurden COS-7-Zellen in ähnlicher Weise mit LAR WT, LAR C/S oder LAR DC/S und IR WT cotransfiziert, gefolgt von 5-minütiger Stimulation mit Insulin, Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR, und dann wurde Immunoblotting mit verschiedenen Arten von Antikörpern gegen die Präzipitate durchgeführt. Im Vergleich zu den mit LAR C/S oder LAR DC/S cotransfizierten Zellen konnte in den mit dem Insulinrezeptor und LAR WT cotransfizierten Zellen keine Tyrosinphosphorylierung der β-Kette des Insulinrezeptors oder des 85 kDa-Proteins detektiert werden (siehe 3A).
In diesen Experimenten waren die Expressionsmengen von LAR (3C) und dem Insulinrezeptor (3D) in beiden Cotransfektanten überdies beinah identisch, weswegen vorgeschlagen wurde, dass LAR WT das phosphorylierte Tyrosin der β-Kette des Insulinrezeptors ebenso wie das 85 kDa-Proteins dephosphoryliert (3B).
Weiterhin zeigte, als die Immunpräzipitate mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR einem Immunoblotting unter Verwendung des Antikörpers gegen die β-Kette des Insulinrezeptors unterzogen wurden, die Cotransfektante mit LAR DC/S eine schwächere Bande einer Insulinrezeptor-β-Kette im Vergleich zu der Cotransfektante mit LAR WT oder LAR C/S.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Assoziation zwischen dem Insulinrezeptor und LAR DC/S im Vergleich zu der mit LAR WT oder LAR C/S schwächer ist. Der einzige Unterschied zwischen LAR C/S und LAR DC/S ist der eine Aminosäurenrest an Position 1813 der Phosphatasedomäne 2, wodurch gezeigt wurde, dass diese Domäne 2, von der postuliert wurde, dass sie an der Bindung an Substrate ohne Tyrosinphosphataseaktivität beteiligt sei, eine Rolle bei der Bindung zwischen LAR und dem Insulinrezeptor spielt.
Experimentelles Beispiel 3: Untersuchungen zur Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors durch verschiedene LARs (2)
Um weiter zu untersuchen, ob Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors nur in den Fällen erfolgt, in denen LAR gebunden ist, oder bei jedem Insulinrezeptor, wurde ein Zelllysat der Cotransfektanten einer Elektrophorese und dann einem Immunoblotting mit dem Antiphosphotyrosinantikörper unterzogen. Eine deutliche Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors wurde nur bei Zellen gefunden, die mit LAR WT cotransfiziert worden war (siehe 4).
Experimentelles Beispiel 4: Studien zur Tyrosinphosphorylierung des Insulinrezeptors in Gegenwart von LAR C/S
Um aufzuklären, ob die Tyrosinphosphorylierung des 85 kDa-Proteins durch eine Tyrosinkinaseaktivität des Insulinrezeptors berührt wird, wurden COS-7-Zellen erzeugt, die mit LAR C/S und IR WT oder IR K1018M (IR MT) mit einer Defizienz in der Tyrosinkinase des Insulinrezeptors cotransfiziert war. Nach 5-minütiger Insulinstimulation der Zellen wurde eine Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR durchgeführt und Immunoblotting mit dem Antiphosphotyrosinantikörper wurde durchgeführt (siehe 5). Die mit IR WT cotransfizierten Zellen zeigten Tyrosinphosphorylierung einer β-Kette des Insulinrezeptors und des 85 kDa-Proteins bei Insulinstimulation, während die mit IR K1018M cotransfizierten Zellen keinerlei solche Phosphorylierungen zeigten.
Aus diesen Ergebnissen ging hervor, dass die schnelle Tyrosinphosphorylierung des Insulinrezeptors bei Bindung von Insulin an den Insulinrezeptor erfolgt, und dass die Insulinrezeptortyrosinkinase zur Tyrosinphosphorylierung des 85 kDa-Proteins führt.
Es wurde daher spekuliert, dass das 85 kDa-Protein eine P-Untereinheit von LAR war, für die Bindung an einen Insulinrezeptor demonstriert worden war.
Beispiel 1: Erzeugung von Antikörpern gegen eine intrazelluläre Domäne einer P-Untereinheit von LAR
Antikörper gegen eine intrazelluläre Domäne von LAR wurden gemäß dem folgenden Verfahren erzeugt.
A) Herstellung des Immunogens
Ein Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase und LAR (GST-LAR) wurde als Immunogen verwendet. E. coli AD202 wurde gemäß einem gebräuchlichen Verfahren mit einem Expressionsvektor, dem pGEX-2T-Vektor (Pharmacia Biotech Inc.), transformiert, in dessen Bam-HI/EcoRI-Schnittstellen eine cDNA eingefügt war, die 607 Aminosäuren entsprach, die von dem Ende einer Transmembranregion einer P-Untereinheit von LAR zu der gesamten zytoplasmatischen Region aus (SEQ ID NO: 1.3467 bp) reichte. Nachdem die E. coli über Nacht in LB (Amp.+)-Agarmedium (LB (Amp.+), wie unten beschrieben, enthaltend 7,5 g Agar) über Nacht inkubiert worden waren, wurden 50 ml LB (Amp.+)-Medium (enthaltend Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, NaCl 5 g/L, 5 N NaOH 0,2 ml/L und Ampicillin 50 μg/ml) mit einer Einzelkolonie inokuliert und über Nacht weiter inkubiert. Dann wurden 500 ml LB (Amp.+)-Medium mit den E. coli inokuliert und bei 37 °C inkubiert, bis die Absorption bei 600 nm ungefähr 1,0 erreichte, gefolgt vom Zusatz von 50 μl 1 M IPTG (Isopropyl-β-D(-)t-thiogalactopyranosid, Wako Pure Chemical industries, Ltd.), und einer Inkubation bei 25 °C über Nacht. Die so erhaltene Kultur wurde bei 3.000 rpm und 4 °C 15 Minuten lang zentrifugiert, und die präzipitierten Bakteriengebilde wurden in 50 ml NEIN (0,5 % Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl) suspendiert. Danach wurde die Suspension doppelt wiederholten Behandlungen mit Ultraschall über 1 Minute hinweg und Inkubation auf Eis über eine Minute hinweg unterzogen und dann 20 Minuten lang bei 14.000 rpm und 4 °C zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Zu 10 ml des E. coli-Lysats wurden 100 μl einer Suspension von Glutathion-Sepharose-Beads (Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia Biotech Inc.), hergestellt durch dreimaliges Waschen und sus pendiert in 50 % NETN) zugesetzt, dann wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Die so erhaltene Suspension wurde 5 Minuten lang bei 3.000 rpm und 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die präzipitierten Glutathion-Sepharose-Beads wurden zwei Mal mit NETN, dann ein Mal mit PBS gewaschen, danach wurden 100 μl SDS-Probenpuffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 % Natriumlaurylsulfat, 5 % β-Mercaptoethanol) zugesetzt, und sie wurden 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt, um das GST-LAR-Fusionsprotein zu eluieren. Das Eluat, aus dem die Beads entfernt worden waren, wurde durch Zentrifugation unter Verwendung von Centricon-10 (Amicon) bei 3.000 rpm und 4 °C über 45 Minuten hinweg konzentriert.
Ein ml PBS wurde dem Konzentrat zugesetzt, um die Lösung zu Puffern, und die Lösung wurde erneut durch 45-minütige Zentrifugation bei 3.000 rpm und 4 °C konzentriert. Dieses Pufferungsverfahren wurde zwei Mal wiederholt, und die so erhaltene Lösung wurde als Immunogenlösung verwendet. Die Reinheit und Konzentration des Antigenproteins wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestätigt.
Unterdessen wurde die Antigenlösung für die letzte Immunisierung durch ein anderes Verfahren hergestellt, da sie intravenös verabreicht werden sollte. Das Lysat der oben beschriebenen E. colis, die das GST-LAR-Fusionsprotein exprimieren, wurde mit Glutathion-Sepharose-Beads inkubiert, und nach der Zentrifugation wurden die präzipitierten Beads zwei Mal mit NETN und drei Mal mit PBS gewaschen. Als nächstes wurde 100 μl GSH-Elutionspuffer (20 mM Glutathion, 1 M Tris-HCl, pH 9,6) hinzugesetzt, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur gerührt, um die Elution von GST-LAR zu bewirken. Nach dreimaliger Wiederholung der Schritte der 5-minütigen Zentrifugation bei 3.000 rpm und 4 °C und Gewinnung des Überstandes wurde das gesamte Eluat 2 Tage lang bei 4 °C gegen Kochsalzlösung dialysiert, dann wurde die so erhaltene Lösung als Immunogenlösung für die intravenöse Verabreichung verwendet.
B) Immunisierung
Acht weibliche Balb/c-Mäuse, 6 Wochen alt, erhielten intraperitoneale Verabreichung von Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadekan, Sigma Corporation), jeweils 0,5 ml pro Tier. 2 Wochen später wurde die Antigenlösung für die intraperitoneale Immunisierung, die durch Mischen mit Freunds vollständigen Adjuvants (GIBCO) in einem Verhältnis von 1:1 emulgiert worden war, in einer Menge von ungefähr 10 μg GST-LAR Fusionsprotein pro Maus intraperitoneal verabreicht. Danach wurde die Antigenlösung für die intraperitoneale Immunisierung, die mit Freunds unvollständigem Adjuvants (GIBCO) in einem Verhältnis von 1:1 gemischt worden war, auf ungefähr 30–70 μg GST-LAR pro Maus eingestellt, und das Gemisch wurde im Durchschnitt ein Mal alle 2 Wochen intraperitoneal verabreicht. Am 4. Tag nach der vierten Immunisierung wurde Blut aus der Augenhintergrundvene entnommen, und der Antikörpertiter im Serum wurde durch das ELISA-Verfahren bestimmt.
C) ELISA
Proteinlösungen von GST-LAR und GST allein, die durch ein ähnliches Verfahren wie die Antigene zur intravenösen Immunisierung hergestellt worden waren, wurden jeweils über Nacht bei 4 °C gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Diese Lösungen wurden auf 0,5 μg/ml in PBS eingestellt und der Adsorption an eine ELISA-Platte (Falcon 3911 MicroTest^TM Flexible Assay Plate) bei 50 μl/Napf innerhalb von einer Stunde unterzogen. Nach fünfmaligem Waschen mit Waschpuffer (PBS enthaltend 0,05 Tween 20) wurde eine Blockierung mit 5 % entrahmter Milch (hergestellt durch Auflösen von 2,5 g entrahmter Milch in 50 ml PBS) durchgeführt. Nach dem Waschen wurde das Serum, wie in dem obigen Abschnitt B erhalten, mit Verdünnungspuffer (PBS enthaltend 0,25 % BSA) auf das 16.000-fache verdünnt, den Näpfen zu jeweils 50 μl/Napf zugesetzt und dann eine Stunde lang in einem feuchten Kasten inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wurde 1.000-fach verdünnter meerrettichperoxidasemarkierter Anti-Maus-IgG-Antikörper der Platte mit 50 μl/Napf zugesetzt und eine Stunde lang inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit Waschpuffer und einmaligem mit PBS wurde eine Substratlösung von o-Phenylendiamin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), gelöst in einem Zitratpuffer (hergestellt durch Lösen von 5,6325 g Zitronensäure-Monohydrat und 18,35 g Na₂HPO₄·12H₂O in gereinigtem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml) mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu 50 μl/Napf zugesetzt, 30 Minuten lang reagieren gelassen, und dann wurden 50 μl an 10%-iger H₂SO₄ zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Fünfzig μl der Lösung wurden in jeden Napf einer 96-Lochplatte (Sumitomo Bakelite Co., LTD.) zur Messung übertragen, und dann wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
D) Zellfusion
Zwei Mäuse, die laut den Ergebnissen des oben beschriebenen ELISA einen Anstieg der Titer der Antikörper gegen GST-LAR zeigten, wurden zum letzten Mal immunisiert, und die Milz wurde am dritten Tag danach entnommen, um gemäß einem üblichen Verfahren Splenozyten zu präparieren.
Zu Zellfusionen verwendete Elternzellen waren aus Balb/c-Mäusen gewonnene Myelomzellen vom Stamm NS1, zuvor selektiert in einem 20 μg/ml 8-Azaguanin enthaltenden Medium und verifiziert als eine Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT)-defiziente Linie. Zellfusion, HAT-Selektion und Klonierung wurden mit 2 × 10⁷ NS1-Zellen und 1 × 10⁸ Splenozyten unter Verwendung eines ClonaCell^TM-HY Hybridoma Cloning Kit (StemCell Technologies Inc.) durchgeführt.
Das Screening des Überstandes aus der Kultur der klonierten Hybridome wurde gemäß dem in Abschnitt C oben beschriebenen ELISA-Verfahren mit 50 μl des Hybridomkulturüberstands unter Verwendung von Platten, an die 0,5 μg/ml Proteinlösung von GST, GST-LAR oder GST-CD45 gebunden waren (Furukawa, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10928–10932, 1994), hergestellt durch ein Verfahren ähnlich dem zur Herstellung des Antigens zur intravenö sen Immunisierung wie oben beschrieben, durchgeführt. Bei diesem ELISA-Verfahren wurde ein Hybridom selektiert, das keine Immunreaktion auf GST oder GST-CD45 beschichtete Näpfe zeigte, sondern eine Immunreaktion nur auf die mit GST-LAR beschichteten Näpfe zeigte. Die Passagierung der klonierten Hybridome wurde mit RPMI 1640 Medium (Nissui Pharmaceutical Co., LTD.), enthaltend 10 % fötales Kälberserum (GIBCO), durchgeführt.
Indem man auf diese Weise nach dem ELISA-Verfahren den Kulturüberstand des HAT- selektierten Hydridoms screente, konnte ein Klon YU1 mit Spezifität für die intrazelluläre Domäne von LAR mit stabiler Antikörperproduktion und Proliferationsfähigkeit erhalten werden.
Diese Hybridomzelllinie YU1 wurde am 7. Mai 1998 beim National Institute of Bioscience und Human-Technology, Agency of Industrial Science und Technology, 1-1-320, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, JAPAN, hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM-BP-6343.
E) Typisierung des monoklonalen Antikörpers
0,5 ml des Überstands aus einer Kultur des im obigen Abschnitt D erhaltenen Hybridoms YU1 wurden mit 4,5 ml TBS-T verdünnt, und der Isotyp wurde unter Verwendung eines Isotyping-Kit für monoklonale Mäuseantikörper (Amersham International plc) für 3 ml der verdünnten Lösung bestimmt. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass der Isotyp des Antikörpers IgG2bκ war.
F) Herstellung und Reinigung des monoklonalen Antikörpers
6 Wochen alte Balb/c-Mäuse erhielten eine intraperitoneale Verabreichung von Pristan von 0,5 ml/Tier, und nach 10 Tagen wurde die durch Klonierung in Abschnitt D oben erhaltene Hybridomzelle YU1 intraperitoneal mit 2,5 × 10⁶–1,3 × 10⁷ Zellen pro 0,5 ml/Tier injiziert. Ungefähr 10 Tage später wurde abdominale Hypertrophie beobachtet, und dementsprechend wurde Ascitesflüssigkeit mehrfach unter Verwendung einer 20-Gauge-Injektionsnadel gewonnen. Die so gewonnene Ascitesflüssigkeit wurde 5 Minuten lang bei 1.000 rpm und 4 °C zentrifugiert, um Überstand und Präzipitat voneinander zu trennen. Der Überstand wurde 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und über Nacht bei 4 °C gelagert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 12.000 rpm und 4 °C wurde der monoklonale Antikörper YU1 unter Verwendung einer HiTrap Protein-G-Affinitätssäule (Pharmacia Biotech Inc.) aus den erhaltenen 1,5 ml Überstand gereinigt. Die Konzentration des Antikörpers wurde anhand des molekularen Extinktionskoeffizienten von Mäuse-IgG berechnet, basierend auf der bei 280 nm gemessenen Absorption der so erhaltenen Antikörperlösung.
Weiterhin wurde das Molekulargewicht des monoklonalen Antikörpers YU1 anhand der Mobilität in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese abgeschätzt. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Wie aus 6 zu erkennen ist, umfasst der monoklonale Antikörper YU1 H-Ketten von ungefähr 50 kDa und L-Ketten von ungefähr 25 kDa und hat ein Gesamtmolekulargewicht von 150 kDa.
Beispiel 2: Untersuchungen zur Spezifität des monoklonalen Antikörpers
Ein Expressionsvektor für LAR WT wurde gemäß den in Beispiel 1, Abschnitten A und B, beschriebenen Verfahren in COS-7-Zellen transfiziert. Nach Immunpräzipitation des Zelllysats mit dem in Beispiel 1 erhaltenen gereinigten monoklonalen Antikörper wurde ein Immunoblotting durchgeführt. Als Kontrolle für die Immunpräzipitation wurden MOPC 21 für die zur IgG1-Subklasse gehörenden Antikörper (der Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR, oben, und ein Antikörper gegen CD45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., 35-Z6)) oder Mäuse-IgG2bκ (MOPC 195, CAPPEL) für den monoklonalen Antikörper YU1 verwendet.
Laut den Analysen unter Verwendung des forcierten Expressionssystems für LAR in COS-7-Zellen erkannte der monoklonale Antikörper YU1 ein Protein von 85 kDa, das einer P-Untereinheit von LAR entsprach, und ein Protein von ungefähr 200 kDa, das einem Vorläufer entsprach, nach Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR (siehe 76).
Weiterhin war beim Immunoblotting mit einem Antikörper, der eine E-Untereinheit von LAR nach Immunpräzipitation eines Extrakts von mit LAR transfizierten COS-7-Zellen unter Verwendung dieser Antikörper (IgG1, IgG2b oder YU1) erkennt, die Detektion eines Proteins von 150 kDa, das der E-Untereinheit von LAR, und eines von ungefähr 200 kDa, das einem Vorläufer entspricht, nur auf den mit dem Antikörper YU1 immunpräzipitiertem beschränkt (siehe 7A). Aus den genannten Ergebnissen wurde erkannt, dass der monoklonale Antikörper YU1 zur Immunpräzipitation und zum Immunoblotting einer P-Untereinheit von LAR verwendet werden konnte.
Beispiel 3: Phosphorylierung von LAR durch die Insulinrezeptortyrosinkinase
Das experimentelle Beispiel 4 ließ eine Möglichkeit vermuten, dass eine tyrosinphosphorylierte Bande von 85 kDa, die bei Cotransfektion von LAR und dem Insulinrezeptor detektiert wurde, eine P-Untereinheit von LAR sein kann.
Unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers YU1, der in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurden Untersuchungen durchgeführt, ob das 85-kDa-Protein, dessen Tyrosin von der Insulinrezeptortyrosinkinase phosphoryliert wurde, eine P-Untereinheit von LAR war, nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Beispiel 1 beschriebenen.
Ein Zelllysat aus nach Cotransfektion von LAR WT oder LAR CS mit IR 1 Minute lang mit Insulin stimulierten COS-7-Zellen wurde mit dem Antikörper gegen die E-Untereinheit von LAR immunpräzipitiert und dann mit einem Gemisch des Antikörpers gegen die E-Untereinheit von LAR und dem Antikörper YU1 einem Immunoblotting unterzogen, wodurch ein Vorläufer von LAR und jede Untereinheit detektiert wurden.
Eine zweite Sondierung dieses Blots mit dem Antiphosphotyrosinantikörper zeigte eine Übereinstimmung der tyrosinphosphorylierten Bande von 85 kDa mit einer Bande einer P-Untereinheit von LAR (siehe 8). Diese Ergebnisse zeigen, dass LAR eines der Substrate des Insulinrezeptors ist.
Weiterhin wurde angenommen, dass LAR Autodephosphorylierung betreibt, da die Tyrosinphosphorylierung einer P-Untereinheit von LAR bei den LAR WT Cotransfektanten nicht detektiert wurde (siehe 3).
Wie in 9 dargestellt, wird die Tyrosinkinaseaktivität durch Autophosphorylierung der β-Kette des Insulinrezeptors erhöht, wenn Insulin an eine α-Kette des Insulinrezeptors bindet. Diese Aktivität der Tyrosinkinase führt letztlich zum Eintreten von Insulinwirkungen wie z. B. Glukoseaufnahme, Glukosemetabolismus und Zellproliferation. Es wurde gezeigt, dass der aktivierte Insulinrezeptor durch die Tyrosindephosphorylierung durch LAR in einen inaktiven Zustand zurückkehrt.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die Insulinrezeptorkinase das Tyrosin einer intrazellulären Domäne von LAR phosphoryliert, und es wurde angenommen, dass die Phosphorylierung an der Bestimmung der Substratspezifität der intrazellulären Domäne von LAR oder der Steigerung der Phosphataseaktivität beteiligt ist. Überdies wird angenommen, dass LAR seine enzymatische Aktivität durch Autodephosphorylierung des phosphorylierten Tyrosins kontrolliert.
Aus den oben dargestellten Ergebnissen konnte auf dem molekularen Niveau die Möglichkeit dargestellt werden, dass eine Stimulation der enzymatischen Aktivität von LAR für die Insulinresistenz verantwortlich sein kann.
Beispiel 4: Gewebsverteilung von LAR bei der Maus
Zu einem Gramm von jedem der Organe, die sieben Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen entnommen worden waren, wurden 3 ml an kaltem Zelllysispuffer (der gleiche wie im experimentellen Beispiel 1, Abschnitt C beschrieben) zugesetzt, gefolgt von Homogenisation auf Eis und 30-minütiger Inkubation auf Eis. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 4 °C und 15.000 g wurde der Überstand gewonnen, unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen zusätzlich erhaltener Überstand wurde gewonnen, dann wurde der gesamte Überstand als Gewebeprobe verwendet. Die Proteinbestimmung erfolgte gemäß einem Handbuch des DC Protein Assay (Bio-Rad).
Jeder so erhaltene Überstand (entsprechend 0,2 mg Protein) wurde elektrophoretisch aufgetrennt, gefolgt von Immunoblotting mit YU1 gemäß einem im experimentellen Beispiel 1, E, beschriebenen Verfahren.
Die Ergebnisse des Immunoblottings sind in 14 dargestellt. YU1 kann auch Mäuse-LAR erkennen, wodurch Expression in Thymus und Gehirn identifiziert werden konnte. Auch in Nieren und Leber konnte eine geringe Expression gefunden werden.
Beispiel 5: Immunhistochemische Färbung von Thyroidkarzinomgewebeschnitten mit YU1
Thyroidgewebe wurde in einer 10 %igen, mit neutralem Phosphat gepufferten Formaldehydlösung fixiert und zur Herstellung eines Präparats auf einem Objektträger in einem Paraffinblock eingebettet. Die detaillierte Vorgehensweise ist nachfolgend beschrieben.
1) Entfernung des Paraffins
Der fixierte Paraffinblock des Gewebeschnitts wurde zwei Mal fünf Minuten lang in 100 % Xylol eingetaucht, und dann jeweils über einen Zeitraum von 3 Minuten nacheinander in 100 % Ethanol, 90 % Ethanol und 70 % Ethanol eingetaucht. Schließlich wurde der Schnitt in 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) eingetaucht. Zur Exposition antigener Determinanten in diesem Zustand wurde das Präparat einer 5-minütigen Autoklavenbehandlung bei 100 °C unterzogen.
2) Immunfärbung
Der Schnitt wurde mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) enthaltend 0,15 M NaCl (Trislösung) gewaschen und dann in diese Trislösung eingetaucht. Danach wurde die Flüssigkeit von dem Objektträgerglas abgewischt, dann wurde 3 %ige wässrige Wasserstoffperoxidlösung auf den Schnitt geträufelt, und man ließ ihn 3 Minuten stehen, um endogene Peroxidase zu eliminieren.
Nach genügendem Waschen mit Wasser und weiterem genügenden Waschen mit Trislösung wurde die überschüssige Flüssigkeit abgewischt, und der Schnitt wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6)-Lösung, enthaltend ein Trägerprotein (2 % BSA), 0,015 M Natriumazid und 0,15 M NaCl 15 Minuten lang eingetaucht, um Blockierungen zu bewirken.
Als nächstes wurde, nachdem die überschüssige Flüssigkeit ohne Waschen abgewischt worden war, der Primärantikörper YU1 (1000-fache Verdünnung der Stammlösung) dem Schnitt zugegeben und 90 Minuten lang in einem feuchtem Kasten inkubiert.
Der Gewebsschnitt wurde dann genügend mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,15 M NaCl, gewaschen und der Zweitantikörper (Anti-Maus-Immunglobulin biotinyliert) wurde zugesetzt, gefolgt von 45-minütiger Inkubation.
Danach wurde der Schnitt genügend mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) enthaltend 0,15 M NaCl, gewaschen, man träufelte Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase darauf und ließ ihn 25 Minuten lang stehen.
Als nächstes wurde nach genügendem Waschen des Schnittes mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,15 M NaCl, dann 0,05 % DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid)-Lösung in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,02 % Wasserstoffperoxid und 0,15 M NaCl zugesetzt, gefolgt von Überprüfung der Farbentwicklung unter dem Mikroskop, und dann wurde die Reaktion durch Eintauchen des Objektträgers in Wasser beendet.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Probe 5–10 Sekunden lang zur Gegenfärbung in Mayers Hämatoxylin getränkt. Danach wurden nach Waschung des Präparats mit Wasser und zwei Mal 1-minütiges Tränken in 100 %-igem Ethanol als nächstes zweimaliges 1-minütiges Tränken in 100 % Xylol, die Einbettung in Malinol und die Begutachtung durchgeführt.
Bei diesen Experimenten waren die Blockierungs-, Zweitantikörper- und Streptavidin-Peroxidase-Lösungen aus dem von DAKO Japan Co. Ltd., (Kyoto) erhältlichen LSAB-Kit, und DAB war ein von Dojindo (Kumamoto) kommerziell erhältliches Reagens, Malinol war von Muto Pure Chemicals Ltd., (Tokyo) und das verwendete Mayers Hämatoxylin wurde von dem gegenwärtigen Erfinder hergestellt.
Die so erhaltene immunhistochemische Färbung von Thyroidkarzinomzellen ist in den 11–13 dargestellt. Diese Figuren zeigen eine selektive Reaktivität des YU1-Antikörpers mit tumorösen Thyroidgewebszellen (braun eingefärbter Teil), ohne jegliche Reaktion mit normalen follikulären Zellen und dem Stroms des Tumorgewebes (blau eingefärbter Teil).
Demgemäß wurde bewiesen, dass eine Diagnose von Thyroidkarzinom unter Verwendung von immunhistochemischer Färbung mit dem vorliegenden Antikörper durchgeführt werden kann, und dass der vorliegende Antikörper auch in einem DDS-System, das Antikrebsmittel (Chemotherapeutika) enthält, verwendbar sein kann.
Beispiel 6: Immunhistochemische Färbung anderer gutartiger Tumorzellen und Karzinomzellen
In einem Verfahren ähnlich dem vom Beispiel 5 wurde die Immunfärbung verschiedener gutartiger Tumoren und Krebsgewebezellen (aus Menschen gewonnen), in Tabelle 1 unten dargestellt, untersucht.

Als positives Ergebnis wurde das Auftreten von Färbung aufgrund einer Reaktivität mit dem YU1-Antikörper bewertet, und jeder positive Fall ist in Tabelle 1 unten dargestellt. Tabelle 1

	Tumor	Anzahl der Fälle	Anzahl der positiven Fälle	Prozentsatz Positive
Gutartig	Meningiom	10	0	0
	Gliom	13	1	7,7
	Thyroidadenom	10	0	0
Bösartig	Thyroidkarzinom	21	21	100
	Magenkarzinom	16	1	6,3
	Colonkarzinom	26	13	50
	Lungenkarzinom	20	2	10
	Brustkarzinom	20	3	15
	Leberkarzinom	8	0	0
	Nierenkarzinom	21	0	0
	Prostatakarzinom	32	2	6,3

Demgemäß wurde offensichtlich gezeigt, dass die Erkennungsrate bei Thyroidkarzinomen 100 % betrug, während im Gegenteil hierzu gutartige Tumoren und Karzinome, die von anderen Organen abstammten, eine geringere oder gar keine Erkennungsrate zeigten. Obwohl im Vergleich ein Colonkarzinom eine höhere Erkennungsrate gezeigt wurde, war die von Colonkarzinomzellen gezeigte positive Färbung erheblich von der des Thyroidkarzinoms verschieden, so dass eine spezifische Immunreaktivität von YU1 mit Thyroidkarzinomzellen vorgeschlagen wurde, mit denen eine bemerkenswerte Färbung beobachtet wurde.
Beispiel 7: Spezifische Immunreaktion von Thyroidkarzinomen mit YU1:
Untersuchungen zur Machbarkeit der Verwendung von Immunoassays Zu einem Gramm menschlicher Thyroidkarzinom- und Normalgewebe, die in Beispiel 5 verwendet wurden, wurden 3 ml an kalten Zelllysispuffer (oben in Beispiel 5 beschrieben) zugesetzt und unter Verwendung eines Polytrons homogenisiert, danach wurde das Homogenisat 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 4 °C und 15.000 g wurde der Überstand gewonnen, unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen zusätzlich erhaltener Überstand wurde gewonnen, dann wurde der gesamte Überstand als Gewebeprobe verwendet. Die Proteinbestimmung erfolgte gemäß einem Handbuch des DC Protein Assay (Bio-Rad).
Der so erhaltene Überstand (entsprechend 1 mg Protein) oder Immunpräzipitate von mit LAR transfizierten COS-7-Zellen unter Verwendung des Antikörpers gegen LAR als Positivkontrolle (gemäß den in Beispiel 1A–C beschriebenen Verfahren hergestellt) wurden elektrophoretisch aufgetrennt, gefolgt von Immunoblotting mit YU1 gemäß einem im experimentellen Beispiel 1, Sektion E beschriebenen Verfahren. Zur Detektion wurden Immuno Star-Reagenzien (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) verwendet.
Die in diesen Experimenten erhaltenen Ergebnisse sind in 14 dargestellt. Wie aus 14 hervorgeht, war es evident, dass YU1 spezifisch das Thyroidkrebsgewebe, verschieden von den normalen Thyroidgeweben, erkennt. Demgemäß wurde bewiesen, dass durch eine Aspirationsbiopsie des Thyroids erhaltene Gewebeproben zur Diagnose von Thyroidkrebs verwendet werden konnten.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäßen Antikörper gegen eine LAR-Phosphatase-Untereinheit können spezifisch eine intrazelluläre Domäne von LAR mit Phosphataseaktivität erkennen. Daher können die Antikörper äußerst nützliche Werkzeuge zur Aufklärung von Signaltransduktionsmechanismen von Insulin und zur Identifikation und Isolation von LAR-Modulatoren, Bindungsproteinen und dergleichen sein. Weiterhin können die Antikörper zur Entwicklung nützlicher diagnostischer Verfahren für Insulinresistenz und NIDDM, zur Prophylaxe und Diagnose verschiedener Krankheitsbilder des auf Insulinresistenz basierenden Syndroms X, und zur Prophylaxe und Diagnose des Eintretens von Arteriosklerose und Herzkrankheiten verwendet werden.
Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Antikörper, da sie spezifische Immunreaktivitäten mit Thyroidkarzinom haben, zur Diagnose von Thyroidkarzinom unter Verwendung von Aspirationszytologie und Biopsie und in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die DDS für Thyroidkarzinomtherapie verwenden, verwendbar, während sie in molekularbiologischen Studien betreffend die Transkription von LAR-Molekülen in Thyroidkarzinomzellen und Regulationsfaktoren der Expression auf dem Translationsniveau hilfreich sein können.

Claims

Monoklonaler Antikörper, gebildet von einem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6343, oder eine chimäre oder humanisierte Version davon.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 1, enthaltend die V-Region des monoklonalen Antikörpers, der von einem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6343 gebildet wird, und eine C-Region aus einem menschlichen Myelom.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, enthaltend die komplementaritätsbestimmende Region des monoklonalen Antikörpers, der von einem Hybridom mit Hinterlegungsnummer FERM BP-6343 gebildet wird.
Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6343.
Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1, umfassend die Schritte der: – Immunisierung eines Tieres mit einem GST-LAR-Phosphatasedomänen-Fusionsprotein; – Herstellung einer Hybridomzelllinie aus einer aus dem immunisierten Tier erhaltenen antikörperbildenden Zelle; – Bildung des monoklonalen Antikörpers durch die Hybridomzelllinie.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das GST-LAR-Phosphatasedomänen-Fusionsprotein gebildet wird durch: Kultur über einen Zeitraum von 16–24 Stunden bei 20–30 °C von Escherichia coli, das mit einem Expressionsvektor, der eine codierende Region des GST-Gens und eine codierende Region einer Phosphatasedomäne des LAR-Gens umfasst, transformiert oder transfiziert ist, und Isolation des Fusionsproteins aus der Kulturflüssigkeit und/oder den Bakterienzellen.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, weiterhin umfassend den Schritt der Durchmusterung von in dem Bildungsschritt erzeugten Antikörpern unter Verwendung des Fusionsproteins.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von LAR- und/oder von LAR abgeleiteten Molekülen, umfassend den Schritt der: – Bestimmung einer in einer zu prüfenden Probe enthaltenen Menge des LAR-Proteins und/oder eines Fragments oder eines Polypeptids, das mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR umfasst, unter Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Antikörper in einem unter Immunoblotting, Immunopräzipitation und enzymverbundenem Immunosorptionsassay (ELISA) ausgewählten Verfahren verwendet wird.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von LAR- und/oder von LAR abgeleiteten Molekülen, umfassend die Schritte der: – Isolation von LAR und/oder einem Fragment oder Polypeptid, das mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR umfasst, aus einer zu prüfenden Probe unter Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4; und – Messung einer Aktivität der isolierten LAR- und/oder LAR-abgeleiteten Moleküle.
Verfahren zur Bildung von LAR- und/oder von LAR abgeleiteten Molekülen, umfassend den Schritt der: – Isolation von LAR-Protein und/oder einem Fragment oder Polypeptid, das mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR umfasst, unter Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei in dem Isolationsschritt Affinitätschromatographie und/oder Immunopräzipitation unter Verwendung eines Trägers, der mit dem Antikörper gebunden wurde, verwendet wird.
In vitro-Verfahren zur Identifikation der Gegenwart von LAR und/oder LAR-abgeleiteten Molekülen im Gewebe, umfassend den Schritt der: – Durchführung einer immunhistologischen Untersuchung unter Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Detektion von LAR-Protein und/oder einem Fragment oder Polypeptid, das mindestens eine intrazelluläre Domäne von LAR umfasst.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Thyroidkarzinom oder von in Zusammenhang mit Thyroidkarzinom stehenden Erkrankungen.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Diagnose von Thyroidkarzinom oder von in Zusammenhang mit Thyroidkarzinom stehenden Erkrankungen.