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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die spezifisch an eine
P-Untereinheit, d. h. eine Phosphatase-Untereinheit, des LAR („leukocyte
antigen related")-Proteins
binden, und betrifft insbesondere solche Antikörper, die spezifisch an eine
intrazelluläre
Domäne
von LAR binden, und Verfahren zur ihrer Erzeugung. Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die zur Analyse
und Quantifizierung von Proteintyrosinphosphatasen, zur Identifikation
und zur Isolation von LAR-verwandten Molekülen verwendbar sind, und Medikamente,
die bei Behandlungen wie z. B. der Therapie, der Prävention
und der Linderung ebenso wie zur Diagnose der mit Insulinresistenz
verbundenen Krankheitszustände
anwendbar sind.
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Hintergrund der Erfindung
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In
jüngster
Vergangenheit wurden am Ausbruch der Arteriosklerose beteiligte
Mechanismen aufgeklärt und
Risikofaktoren dafür
identifiziert. Insbesondere wurden Hypercholesterinämie, Bluthochdruck,
Diabetes und Rauchen als vier manifeste Risikofaktoren identifiziert,
und somit wurden therapeutische Behandlungen extensiv durchgeführt. Die
gemeinsame klinische Pathologie dieser Krankheitsbilder ist die
Insulinresistenz. Die Bedeutung der Insulinresistenz ist mit der
Verringerung der Insulinsensitivität in den Zellen beinahe äquivalent,
durch die die Insulinwirkung auf die Zuckeraufnahme in die Zellen
verschlechtert wird. Die Insulinresistenz kann durch Abnormalitäten bei
der Sekretion von Insulin selbst, durch Abnormalitäten der
Insulinrezeptoren auf den Zielzellen, durch Abnormalitäten eines
intrazellulären
Signalübertragungssystems
und durch verringerte Zuckerversorgung des Gewebes aufgrund hämodynamisch
verursachter peripherer Kreislaufstörung verursacht sein. Reaven,
1988, berichtet, dass sich viele Krankheitsbilder infolge der Insulinresistenz
entwickeln und bezeichnet ein Krankheitsbild als „Syndrom
X", das gleichzeitig
Insulinresistenz, Glukosetoleranzabnormalitäten, Hyperinsulinämie, Hypertriglyzeridämie, Hypo-HDL-Cholesterinämie und
Bluthochdruck repräsentieren
kann und schlägt
weiterhin vor, dass das Krankheitsbild des Syndrom X eng am Ausbruch
der Arteriosklerose beteiligt ist (Reaven, G. M. et al., Diabetes,
37, 1595–1607,
1988).
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Weiterhin
ist bekannt, dass die Zuckerversorgung der Zellen durch Insulinresistenz
allgemein verringert wird, was mit Erhöhung der Insulinsekretion aus
der Bauchspeicheldrüse
einhergeht, was zu Hyperinsulinämie
führt.
Hieraus ergeben sich auf dem klinischen Gebiet mehrere Probleme
im Zusammenhang mit der Insulinresistenz. Beispielsweise wurde berichtet,
dass Insulinresistenz und Hyperinsulinämie die diabetische Nephritis
fördern
(Niskanen, L. et al., Diabetes, 41, 736–741, 1993) und die Häufigkeit
der diabetischen Retinopathie erhöhen (Y-ip, J. et al., Lancet, 341, 369–370, 1993).
Weiterhin wurde berichtet, dass Insulinresistenz den Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
I (PAI-1) fördert,
die Funktionen eines Blutfibrinolysesystems verschlechtert (Potter
van Loon BJ et al., Metab. Clin. Exp., 42, 945–954, 1993) und die arterielle
Arteriosklerose auslöst (Sato,
Y. et al., Diabetes, 38, 91–96,
1989).
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Die
Prävalenz
des Diabetes beträgt
ungefähr
5 % der Gesamtbevölkerung,
und ungefähr
sechs Millionen japanischer Bürger
leiden unter Diabetes. Diabetes umfasst insulinabhängigen Diabetes
mellitus (IDDM) und insulinunabhängigen
Diabetes mellitus (NIDDM). Es wurde berichtet, dass ungefähr 7 % aller
Diabetesfälle
IDDM sind, während
ungefähr
90 % NIDDM sind. Insbesondere wurde ein signifikanter auslösender Faktor für das Auftreten
von NIDDM, das einer Mehrzahl von Diabetesfällen entspricht, als Insulinresistenz
erkannt.
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Inzwischen
wurde gefunden, dass Tyrosinphosphorylierung wichtige Rollen bei
der Insulin-Signalübermittlung
spielt. Der Insulinrezeptor ist ein Hetero-Tetramer aus zwei Glykoproteinunterheiten,
nämlich
einer α-Untereinheit
mit einem Molekulargewicht von 135 kDa und einer β-Untereinheit mit
einem Molekulargewicht von 95 kDa, die durch Disulfidbrücken verbunden
sind, was zu einer 2β 2-Struktur
führt.
Die α-Untereinheit
hat eine Insulinbindungsaktivität,
während
die β-Untereinheit
eine Proteintyrosinkinase (PTK)-Domäne besitzt, die durch Autophosphorylierung
aktiviert wird. Demgemäß werden,
wenn Insulin an die α-Kette
eines Insulinrezeptors gebunden wird, bestimmte Tyrosinreste, die
in der β-Kette
des Insulinrezeptors vorliegen, autophosphoryliert. Die Aktivität der Insulinrezeptortyrosinkinase
wird durch die Tyrosin-Autophosphorylierung
weiter gefördert.
Es wurde berichtet, dass die so aktivierte Insulinrezeptortyrosinkinase
Tyrosinreste des IRS (Insulinrezeptorsubstrats) und die intrazellulären Substrate
davon phosphoryliert, und die Signalübermittlung durch Erkennung
und Bindung der tyrosinphosphorylierten Insulinrezeptoren durch
Ash/Grb2 oder die PI-3 Kinase fortschreitet, was letztlich zur Manifestierung
der biologischen Wirkung von Insulin führt, wie z. B. Glukoseaufnahme,
Zuckermetabolismus und Zellproliferation (siehe 9,
Goldstein, B.J. et al., Receptor, 3, 1–15, 1993; und Kanai, F. et
al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 195(2),
762–768,
1993). Jedoch wurde bei diesem Signalübertragungsweg eine Enzymtyrosinphosphatase,
die die aktivierten Insulinrezeptoren, inaktiviert, d. h. eine Proteintyrosinphosphatase
(nachfolgend als PTP bezeichnet), nicht detailliert studiert.
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Ernsthafte
Untersuchungen von PTPs wurden nach dem Abschluss der Klonierung
des PTP1B-Gens und der Aufklärung
seiner Nukleotidsequenz durch Fischer et. al. 1988 begonnen, wobei
es sich um eine aus der menschlichen Plazenta gewonnene zytoplasmatische
PTP handelt (Tonks, N. K. et al., J. Biol. Chem., 263, 6722–6730, 1988;
Charbonneau, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7182–7186, 1988).
Infolgedessen konnte eine Homologie mit PTP1B nicht bei den bekannten
Serin/Threonin-Phosphatasen beobachtet werden, sondern bei zwei
zytoplasmatischen Regionen von CD45, einem membrandurchquerenden
Molekül,
das am Blutbildungssystem beteiligt ist. Weiterhin wurde auch gefunden,
dass CD45 eine PTP-Aktivität
besitzt (Tonks, N.K. et al., Biochemistry, 27, 8695–8701, 1988;
und Charbonneau, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7182–7186, 1988).
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Inzwischen
wurden viele PTPs anhand der Homologien ihrer cDNA-Sequenzen kloniert,
und es wurden neue PTPs nachfolgend beschrieben (Streuli, M. et
al., J. Exp. Med., 168, 1523– 1530,
1988; Krueger, N. X. et al., EMBO J., 9, 3241–3252, 1990; und Trowbridge
I. S. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1095, 46–56, 1991). Die PTPs können im
Allgemeinen eingeteilt werden in: (1) Membrantyp-PTPs mit einer
Transmembranregion (LCA, leukocyte common antigen, nämlich CD45,
LAR und PTP α, ß, γ, δ, ε und ζ) und (2)
PTPs vom zytoplasmatischen Typ ohne Transmembranregion (PTP1B, TC-PTP,
PTP-MEG, PTPH1, STEP und PTP1C).
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Viele
PTPs vom Membrantyp haben zwei PTP-homologe Domänen im Zellinneren (Domäne 1 und
Domäne
2, siehe 1a und b). Eine Sequenz,
die Cystein (Signaturmotiv) umfasst, Ile/Val-His-Cys-Xaa-Ala-Gly-Xaa-Xaa-Arg-Ser/Thr-Gly
(SEQ ID NO: 2), ist unter den bislang beschriebenen PTPs in der
Phosphatasedomäne
konserviert. Forschungen zur PTP1B-Kristallographie zeigten, dass die Region
kleine Taschen auf der Oberfläche
eines PTP-Moleküls bildet,
und dass der Cysteinrest am Boden der Tasche liegt und direkt an
der Bindung des Moleküls
an Phosphat teilnimmt (Barford, D. et al., Science, 263, 1397–1404, 1994).
Weiterhin wurde auch gefunden, dass die Tiefe der PTP-Tasche die
Spezifität
der Serin/Threonin-Phosphatase
bestimmen kann, da Phosphat, das an Serin oder Threonin binden,
die Tasche des enzymatisch aktiven Zentrums von PTP1B nicht erreichen
kann. Weiterhin wurde die Bedeutung des oben beschriebenen Signaturmotivs
für die
enzymatische Aktivität
aufgeklärt
(Streuli, M. et al., EMBO J., 9, 2399–2407, 1990). Unter Berücksichtigung
dieser Beobachtung wurde vermutet, dass das konservierte Cystein
in Domäne
1 eine wichtige Rolle für
die enzymatische Aktivität
spielen und Domäne
2 die Substratspezifität
des Enzyms bestimmen kann.
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Unter
einer Gruppe von PTPs ist aus dem Menschen gewonnenes LAR ein Prototyp
der Proteintyrosinphosphatasen vom Rezeptortyp, der unter Verwendung
einer Phosphatasedomäne
von CD45, einer Proteintyrosinphosphatase vom Rezeptortyp, als Sonde
aus einer genomischen Bibliothek aus der menschlichen Plazenta kloniert
wurde (Streuli M. et al., J. Exp. Med., 168, 1553–1562, 1988).
CD45 wird spezifisch auf hämatozytischen
Zellen exprimiert, während
LAR auf anderen als hämatozytischen
Zellen exprimiert wird, insbesondere in insulinempfindlichen Organen
wie Leber und Skelettmuskel (Goldstein B. J., Receptor, 3, 1–15, 1993).
LAR ist unter vielen Arten von PTPs vom Rezeptortyp infolge der Ähnlichkeit
seiner extrazellulären
Domäne
mit Zelladhäsionsmolekülen von
besonderem Interesse. Die gesamte Struktur von LAR besitzt 150 kDa einer
extrazellulären
E-Untereinheit, die aus Ig-artigen Domänen und Fibronectin-Typ III-Domänen besteht, und
85 kDa einer P-Untereinheit, die eine Transmembranregion und eine
intrazelluläre
Domäne
mit zwei Phosphatasedomänen
umfasst, die unmittelbar außerhalb
der Zellmembran kovalent gebunden sind (siehe 1, Streuli
M. et al., EMBO J., 11, 897–907,
1992).
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Eine
große
Anzahl funktionaler Rollen von LAR wurden bislang beschrieben. Zum
Beispiel wurde berichtet, dass: Reaktionen auf Neutrotrophin in
LAR-defizienten Nerven verringert sind (Yang, T. et al., 27th Annual
Meeting of the Society for Neuroscience, New Orleans, Louisiana,
USA, October 25–30,
1997, Society for Neuroscience Abstracts, 23, 1–2, 1997); die Sek retion von
Apolipoprotein B durch Suppression der LAR-Aktivität verringert
wird (Phung, T. L. et al., Biochemical and Biophysical Research
Communications, 237(2), 367–371,
1997) und ein Verlust der LAR-Expression die Größe cholinerger Nervenzellen
der Prosencephalonbasis verringert, und auf diese Weise die Kontrolle
durch die cholinergen Nervenzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus
verringert wird (Yeo, T. T. et al., J. Neurosci. Res., 47(3), 348–360, 1997).
Auf diese Weise wurde nach und nach gezeigt, dass LAR mehrere wichtige
Rollen in einem lebenden Organismus spielt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt
sind weiterhin die erwähnungswertesten
Forschungen auf das Verhältnis
zwischen LAR und Insulinrezeptoren gerichtet (Hashimoto, N. et al.,
J. Biol. Chem., 267 (20), 13811–13814,
1992).
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1995
wurde eine erwähnenswerte
Publikation vorgelegt, die beschrieb, dass die LAR-Tyrosinphosphataseaktivität im Fettgewebe
eines übergewichtigen
Menschen abnormal erhöht
ist, wobei eine solche Erhöhung
als Ursache für
das Einsetzen der Insulinresistenz und als Risikofaktor für Herz-/Kreislauf-Erkrankungen vorgeschlagen
wurde (Ahmad, F. et al., J. Clin. Invest., 95 (6) 2806–2812, 1995).
Es folgten mehrere Berichte, die zeigten, dass LAR mit Insulinrezeptoren
im engen Zusammenhang steht (Mooney, R. A. et al., Biochemical and
Biophysical Research Communications, 235 (3), 709–712, 1997;
Orr, S. R. et al., Biochemical Society Transaction, 25 (3), 452S,
1997; Ahmad, F. et al., J. Clin. Investigation, 100 (2), 449–458, 1997;
Ahmad F. et al., J. Biol. Chem., 272 (1), 448–457, 1997; Norris, K. et al.,
Febs Letters, 415 (3), 243–248,
1997; und Li, P. M. et al., Cellular Signaling, 8 (7), 467–473, 1996).
Auf der Basis dieser Information beschrieben Ahmad F. et al. unlängst, dass
PTP1B ein therapeutisches Ziel bei Krankheitsbildern sein kann,
an denen Insulinresistenz beteiligt ist (Ahmad, F. et. al., Metabolism,
Clinical and Experimental, 46 (10), 1140–1145, 1997). Durch die gegenwärtigen Arbeiten
an PTPs wie z.B. LAR, CD45 und dergleichen wurde gezeigt, dass PTPs
extrem wichtige Rollen in einem intrazellulären Signalübertragungssystem spielen.
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1992
berichteten Streuli et al., dass die Bindung zwischen der E-Untereinheit
und der P-Untereinheit von
LAR aufgrund der nichtkovalenten Natur ihrer Bindung aufgelöst werden
kann, und dass auf diese Weise die E-Untereinheit spezifisch von
der Zellmembranoberfläche
abgeworfen wird (Streuli, M. et al., EMBO J., 11 (3), 897–907, 1992).
Jedoch wurde die nur Phosphataseaktivität besitzende P-Untereinheit
ignoriert, da viele Forscher die Untersuchungen unter Verwendung
polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen eine LAR-E-Untereinheit
darauf konzentrierten. Zum Beispiel konnte, wenn ein Anti-LAR-Antikörper mit
der Absicht einer Messung der LAR-Phosphataseaktivität verwendet
wurde, die gesamte Phosphataseaktivität nicht gemessen werden, solange
nicht ein Antikörper
gegen die P-Untereinheit verwendet wurde. In Anbetracht solcher
Umstände
begannen die gegenwärtigen
Erfinder, Antikörper
zu erzeugen, die spezifisch an eine LAR-P-Untereinheit binden, insbesondere
an eine intrazelluläre
Domäne
davon, ohne irgendeine Spezifität
für CD45
zu haben.
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Zu
den bekannten Antikörpern
gegen Proteintyrosinphosphatase gehört ein Antikörper, der
unter Verwendung von 196 Aminosäurenresten,
die von der Transmembranregion von CD45 zu einem Teil der Phosphatasedomäne 1 reichen
(Transduction Laboratories), als Antigen erzeugt wurde. Es ist jedoch
unklar, wie diese Antikörper
für LAR-Phosphatasedomänen und
andere Proteintyrosinphosphatasen immunspezifisch sind. Daher war
es auch notwendig, Antikörper
zu erzeugen, die spezifisch für
eine intrazelluläre
Domäne
von LAR, aber nicht für
CD45 sind.
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Zum
Knotenkropf gehören
Thyroidtumor und hyperplastischer adenomatoider Kropf.
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Obwohl
der adenomatoide Kropf aus einer Mehrzahl von Knoten besteht, geht
ein Teil davon oftmals mit Karzinom einher. Bei der Diagnose des
Knotenkropfes ist es wichtig, zu vermeiden, das Karzinom zu übersehen.
Gegenwärtig
werden zur klinischen Diagnose von Thyroidkrebs hauptsächlich Abtastung,
Ultraschalldiagnose, Aspiration mit dünnen Nadeln und histologische
Diagnose von Gewebsschnitten durchgeführt. Der Kropf kann klassifiziert
werden als gutartiger Knotenkropf, Papillärkarzinom, Follikulärkarzinom,
anaplastisches Karzinom, medulläres
Karzinom und malignes Lymphom, während
der Thyroidkrebs grundsätzlich
in Thyroidkarzinom vom wohldifferenzierten Typ (Papillärkarzinom
und follikuläres
Karzinom) und Thyroidkarzinom vom undifferenzierten Typ eingeteilt
werden kann. Die Hauptmasse des Kropfes ist gutartig, jedoch ist
es schwierig, eine kleine maligne Läsion unter den zahlreicheren
gutartigen Knoten definitiv zu diagnostizieren. Ein Thyroidkarzinom
vom differenzierten Typ wird ausgeschnitten, wenn ein potentieller
Teil während
der Operation gefunden wird, dann wird die ausgeschnittene Probe
mikroskopisch begutachtet und im Anschluss daran die gesamte Schilddrüse entfernt,
wenn ein Karzinom festgestellt wurde. Überdies kann eine genaue Diagnose
unmöglich
sein, selbst wenn zu Beginn eine Blutuntersuchung und diagnostische
bildgebende Verfahren durchgeführt
werden, weswegen es häufig
notwendig ist, letztlich so oder so das Gewebe zu entfernen. Obwohl
Aspiration mit dünnen
Nadeln durchgeführt
werden kann, ist eine definitive Diagnose weniger gut möglich im
Vergleich zur morphologischen Begutachtung von Gewebsschnitten,
da Verbindungen zwischen den Zellen in den Proben durch Einstich
und Sog zerrissen sein können.
Weiterhin können
Jod-Szintillation und Technetium-Szintillation durchgeführt werden,
jedoch können
sie zu keiner bestätigenden
diagnostischen Grundlage führen.
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Karzinomzellen
nehmen im Vergleich mit normalen Thyroidzellen weniger Jod auf.
Viele gutartige Knoten nehmen radiomarkiertes Jod auf, jedoch existieren
viele gutartige Knoten, die kein radiomarkiertes Jod aufnehmen,
und somit als „kalt" erscheinen. Überdies
können
die Knoten krebsartig sein, auch wenn sie als „heiß" erscheinen. Demgemäß wird die endgültige Diagnose
der morphologischen Begutachtung unter Verwendung der Gewebsschnitte
anvertraut, jedoch können
bei dieser Vorgehensweise Fälle
vorkommen, in denen das Gewebe auf Verdacht entfernt wird, selbst
wenn ein Teil davon normal zu sein scheint, womit die Wahrschein lichkeit
steigt, dass bei der Entfernung des Thyroids der Nervus recurrens,
der die Stimmbänder
innerviert, verletzt wird. Daher existiert ein starkes Bedürfnis von
Klinikern und Pathologen nach definitiven diagnostischen Verfahren,
die vor der Entfernung des Gewebes zwischen normalen Zellen und
malignen Zellen unterscheiden können.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, einen monoklonalen Antikörper bereitzustellen,
der von einem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6343
produziert wird, oder eine chimäre
oder humanisierte Version davon. Der genannte Antikörper bindet
spezifisch an eine Phosphataseuntereinheit von LAR, vorzugsweise
an eine intrazelluläre
Domäne
von LAR. Weiterhin bindet der Antikörper spezifisch an eine intrazelluläre Domäne einer
LAR-Phosphataseuntereinheit,
ohne Spezifität
für andere
Proteinphosphatasen. Alternative Antikörper mit diesen Eigenschaften
können
ebenfalls erzeugt werden.
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Solche
Antikörper
können
vorzugsweise unter Verwendung eines Polypeptids als Antigen hergestellt werden,
das einer intrazellulären
Domäne
von LAR entspricht, codiert von einer in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz,
oder beliebigen Fragmenten davon. Weiterhin kann der bevorzugte
Antikörper
aufgrund seiner immunspezifischen Eigenschaften ein monoklonaler
Antikörper
sein.
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Der
erfindungsgemäße Antikörper wurde
unter Verwendung eines Fusionsproteins als Antigen erzeugt, das
eine LAR-Phosphatasedomäne
und GST (Glutathion-S-Transferase) umfasst. Alternative Fusionsproteine
mit Polyhistidin (vorzugsweise 6 Histidinreste), dem calmodulinbindenden
Peptid (CBP) oder Protein A können
ebenfalls verwendet werden.
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Wenn
Polyhistidin verwendet wird, kann Absorption an Nickel-chelierendes
Harz verwendet werden, um das Fusionsprotein zu isolieren und zu
reinigen, das durch einen Gen-Rekombinationsprozess
exprimiert wird, wobei Zusatz von EDTA oder Imidazolsubstanzen ebenso
wie pH-Veränderungen
verwendet werden können,
um das Protein von dem Harz abzulösen. Wenn CBP verwendet wird,
kann das exprimierte Fusionsprotein einer Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Calmodulinaffinitätsharz unterzogen und dann durch
Zusatz von EGTA von dem Harz abgelöst werden. Weiterhin kann,
wenn Protein A verwendet wird, das exprimierte Fusionsprotein einer
Affinitätschromatographie
unter Verwendung von IgG-Sepharose
(z. B. IgG-Sepharose 6FF) unterzogen und dann durch Veränderung
des pH-Wertes von dem Harz abgelöst
werden.
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Weiterhin
können
z. B. Xpress, Thioredoxin, c-myc, V5, HA/c-myc und dergleichen zu
einem anderen Kandidaten für
ein in dem Fusionsprotein zu verwendendes Protein oder Polypeptid
gehören.
Zur Isolation und Reinigung des beabsichtigten Fusionsproteins mit
einer LAR-Phosphatasedomäne kann
auch der Expression des Proteins eine Passage über eine Antigen-Antikörper-Affinitätssäule folgen.
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Das
genannte bevorzugte erfindungsgemäße Immunogen, nämlich ein
Fusionsprotein von GST und einer LAR-Phosphatasedomäne, kann
zweckmäßigerweise
produziert werden, indem man: mit einem Expressionsvektor, der eine
codierende Region des GST-Gens und eine codierende Region einer
Phosphatasedomäne
des LAR-Gens enthält,
transformierte oder transfizierte Escherichia coli 16–24 Stunden
lang bei 20–30 °C kultiviert,
vorzugsweise 18 Stunden lang bei 23–25 °C; und dann das Fusionsprotein
aus der Kulturflüssigkeit
und/oder den Bakterienzellen isoliert. So erhaltenes Fusionsprotein
kann anhand seiner Affinität
zu einem Glutathion tragenden Träger,
z. B. Glutathion-Sepharose-Beads, weiter gereinigt werden, wobei
die Elution des Fusionsproteins von den Glutathion-Sepharose-Beads
durch Kochen in Gegenwart eines Detergens durchgeführt werden
kann. Das Detergens kann Natriumlaurylsulfat, CHAPS (3-[(3-Cholamidpropyl)dimethylammonio]-1-puropansulfonat),
Deoxycholsäure,
Digitonin, n-Dodecylmaltosid (1-O-n-Dodecyl-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranoside),
NonidetTM P40 (Ethylphenolpoly(ethylenglycolether)n),
n-Octylglucosid (1-O-n-Octyl-β-D-glucopyranosid),
Saccharosemonolaurat, TesitTM (Dodecylpoly(ethylenglycolether)n),
TritonTM X-100 (Octylphenolpoly(ethylenglycolether)n),
TweenTM 20 (Poly(oxyethylen)-n-sorbitan-monolaurat), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
und dergleichen enthalten. [Jedes „n" steht für eine ganze Zahl, die größer oder
gleich 1 ist.] Wenn die Elution des Fusionsproteins durchgeführt wird,
kann das Harz 5–10
Minuten lang bei 100 °C
in der Gegenwart solcher Detergenzien in einer Konzentration, die
bei einem Tier, dem sie zu verabreichen sind, zu keinen Problemen
führt,
vorzugsweise 0,1 % Natriumlaurylsulfat, gekocht werden. Auf diese
Weise kann ein gereinigtes Fusionsprotein erhalten werden, das als
in Betracht gezogenes Immunogen bevorzugt ist.
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Wenn
unter Verwendung eines solchen Fusionsproteins als Immunogen ein
monoklonaler Antikörper erzeugt
wird, kann eine LAR-Phosphataseuntereinheit zum Screening des Antikörpers verwendet
werden, jedoch ist es im Hinblick auf die Spezifität bevorzugter,
das Screening unter Verwendung des Fusionsproteins als Immunogen
durchzuführen.
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Ein
beispielhafter monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung
hat ein Molekulargewicht von ungefähr 150 kDa und wird von Maus/Maus-Hybridomzellen
produziert. Der Antikörper
kann als Werkzeug zur weiteren Aufklärung der Mechanismen eines
Insulinsignalübertragungssystems,
zur Entwicklung nützlicher
diagnostischer Verfahren für
Insulinresistenz und NIDDM, und zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose
verschiedener Arten von im Zusammenhang mit insulinresistenzbasiertem
Syndrom X stehenden Krankheitsbildern verwendet werden. Weiterhin
kann der erfindungsgemäße Antikörper zur
Identifikation und Isolierung von im Zusammenhang mit LAR stehenden
Molekülen
verwendbar sein, z. B. Modulator, Bindungsprotein und dergleichen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Hybridomzelle
bereitzustellen, die den obengenannten monoklonalen Antikörper produziert.
Eine solche Hybridomzelllinie kann die Maus/Maus-Hybridomzelllinie
YU1 umfassen, die am 7. Mai 1998 beim National Institute of Bioscience
und Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology,
1-1-320, Higashi,
Tsukuba, Ibaraki, JAPAN hinterlegt wurde und die Zugangsnummer FERM
BP-6343 erhielt.
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Der
erfindungsgemäße Antikörper hat
spezifische Immunreaktivität
mit dem LAR-Protein und mit Fragmenten und Polypeptiden, die mindestens
eine intrazelluläre
Domäne
von LAR enthalten (das Fragment und Polypeptid werden nachfolgend
kollektiv als „von
LAR abgeleitete Moleküle
(LAR-Derivate)" bezeichnet),
die aus natürlichen
Quellen gewonnen oder teilweise oder vollständig synthetisiert (z. B. durch
chemische Synthese oder durch rekombinante Synthese) wurde.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
bereitzustellen, um einen Antikörper
zu erzeugen, der Spezifität
für eine
LAR-Phosphataseuntereinheit besitzt, wobei das besagte Fusionsprotein,
das eine LAR-Phosphatasedomäne
und eine im GST-LAR-Phosphatasedomäne besitzt,
als Immunogen verwendet wird. Alternative Fusionsproteine und Reinigungsverfahren
dafür sind
wie oben dargestellt.
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Das
genannte bevorzugte erfindungsgemäße Immunogen, nämlich ein
Fusionsprotein von GST und einer LAR-Phosphatasedomäne, kann
zweckmäßigerweise
produziert werden, indem man: mit einem Expressionsvektor, der eine
codierende Region des GST-Gens und eine codierende Region einer
Phosphatasedomäne
des LAR-Gens enthält,
transformierte oder transfizierte Escherichia coli 16–24 Stunden
lang bei 20–30 °C kultiviert,
vorzugsweise 18 Stunden lang bei 23–25 °C; und dann das Fusionsprotein
aus der Kulturflüssigkeit
und/oder den Bakterienzellen isoliert. So erhaltenes Fusionsprotein
kann anhand seiner Affinität
zu einem Glutathion tragenden Träger,
z. B. Glutathion-Sepharose-Beads, weiter gereinigt werden, wobei
die Elution des Fusionsproteins von den Glutathion-Sepharose-Beads
durch Kochen in Gegenwart eines Detergens durchgeführt werden
kann, wie oben dargestellt. Das Harz kann dann 5–10 Minuten lang bei 100 °C in der
Gegenwart des Detergens in einer Konzentration, die bei einem Tier,
dem es zu verabreichen ist, zu keinen Problemen führt, vorzugsweise
0,1 % Natriumlaurylsulfat, gekocht werden. Auf diese Weise kann
ein gereinigtes Fusionsprotein erhalten werden, das als in Betracht
gezogenes Immunogen bevorzugt ist.
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Wenn
unter Verwendung eines solchen Fusionsproteins als Immunogen ein
monoklonaler Antikörper erzeugt
wird, kann eine LAR-Phosphataseuntereinheit zum Screening des Antikörpers verwendet
werden, jedoch ist es im Hinblick auf die Spezifität bevorzugter,
das Screening unter Verwendung des Fusionsproteins als Immunogen
durchzuführen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von LAR und/oder LAR-Derivaten bereit. Das Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, dass man
eine Menge an LAR-Protein und/oder einem Fragment oder einem Polypeptid,
das mindestens eine intrazelluläre
Domäne
von LAR umfasst, bestimmt, die in einer Testprobe enthalten ist,
die den erfindungsgemäßen Antikörper enthält. In diesem
Verfahren wird der Antikörper
vorzugsweise in einem unter Immunoblotting, Immunpräzipitation
und ELISA ausgewählten
Verfahren verwendet, um die Menge an LAR oder LAR-Derivaten zu bestimmen.
Verfahren unter Verwendung anderer Antikörper gegen LAR werden ebenfalls
offenbart.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von LAR und/oder LAR-Derivaten bereitzustellen,
das den Schritt umfasst, dass man: LAR und/oder LAR-Derivate aus
einer Testprobe unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers isoliert;
und eine Aktivität
des isolierten LAR und/oder der LAR-Derivate misst. Bei diesem Verfahren
werden zur Isolation des LAR und/oder der LAR-Derivate Affinitätschromatographie
und/oder Immunpräzipitation
durch Verwendung eines Trägers, an
den ein erfindungsgemäßer Antikörper gebunden
ist, zweckmäßigerweise
verwendet. Namentlich kann Affinitätschromatographie unter Verwendung
einer Säule
oder eines batchweisen Verfahrens und/oder Immunpräzipitation
durchgeführt
werden, wobei der Träger,
an den zuvor der Antikörper
gebunden wurde, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird, um
eine spezifische Interaktion zwischen dem Antigen (LAR/LAR-Derivate)
und dem Antikörper
zu ermöglichen,
dann können
nach Auswaschen des ungebundenen Antikörpers die gebundenen LAR/LAR-Derivat-Moleküle eluiert
werden. Verfahren unter Verwendung anderer Antikörper gegen LAR werden ebenfalls
offenbart.
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In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren
zur Produktion von LAR und/oder LAR-Derivaten bereitgestellt, das
den Schritt umfasst, dass man: LAR und/oder LAR-Derivate unter Verwendung
des erfindungsgemäßen Antikörpers isoliert.
Die Isolation der Zielmoleküle
im Produktionsverfahren kann zweckmäßigerweise durch Affinität und/oder
Immunpräzipitation
unter Verwendung eines Trägers,
an den zuvor der Antikörper
gebunden wurde, durchgeführt
werden, wie in dem zuvor beschriebenen Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von LAR und/oder LAR-Derivaten. Verfahren unter Verwendung
anderer Antikörper
gegen LAR werden ebenfalls offenbart.
-
Ein
weiterer nachfolgend in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener
Aspekt ist es, ein in vitro-Verfahren zur Identifikation der Gegenwart
von LAR und/oder LAR-Derivaten innerhalb eines Gewebes bereitzustellen,
das den Schritt umfasst, dass man: eine immunhistologische Untersuchung
unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers durchführt. Als
immunhistologische Untersuchung kann z. B. eine immunhistologische
Färbung
in situ mit einem markierten Antikörper verwendet werden, wodurch
das LAR-Protein und/oder ein Fragment oder Polypeptid, das mindestens
eine intrazelluläre
Domäne
von LAR enthält,
detektiert werden kann. Verfahren unter Verwendung anderer anti-LAR-Antikörper werden
ebenfalls offenbart.
-
Der
erfindungsgemäße Antikörper hat
Spezifität
für Thyroidkarzinomzellen.
Andere spezifische Anti-LAR-Antikörper gegen Thyroidkarzinomzellen
werden ebenfalls offenbart, die unter Verwendung eines LAR-Moleküls ebenso
wie eines Fragments davon hergestellt sein können; z. B. einer Phosphatasedomäne, einer
extrazellulären
Domäne
oder dergleichen als Antigen, und zu denen monoklonale und polyklonale
Antikörper,
Peptid-Antikörper,
Einzelketten-Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte
Antikörper, CDR-Graff-Antikörper und
dergleichen gehören
können.
Insbesondere werden die zuvor erwähnten Antikörper gegen eine LAR-Phosphataseuntereinheit,
die Immunreaktivität
mit Thyroidkarzinomzellen besitzen, von der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt. Hier bedeutet „Immunreaktivität mit Thyroidkarzinomzellen", dass mit normalen
Thyroidzellen oder gutartigen Thyroidtumorzellen (weniger als oder
gleich 10 % der normalen Zellen) fast keine Immunreaktivität gezeigt
wird, während
höhere
Immunreaktivität
mit den Thyroidkarzinomen (mehr als oder gleich 20 % der Karzinomzellen)
gezeigt wird.
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Demgemäß ist es
möglich,
Thyroidkrebs unter Verwendung eines solchen Antikörpers zu
diagnostizieren, und somit wird auch ein Verfahren zur histologischen
Diagnose von Thyroidkarzinom beschrieben. Das diagnostische Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, dass man:
eine Thyroidgewebeprobe von einem Patienten entnimmt, der unter
Verdacht auf Thyroidkrebs steht, und eine Diagnose des Thyroidkrebses
durchführt,
indem man die Immunreaktivität
zwischen dem oben beschriebenen Antikörper und der Gewebeprobe misst.
In diesem Fall können
die Thyroidgewebeproben jede beliebige Art von Proben sein, z. B.
durch Aspiration mit feinen Nadeln aus dem Patienten entnommene
oder durch Excision und Exstirpation eines Teils der Schilddrüse gewonnene
Proben. Das diagnostische Verfahren, in dem die durch Aspiration
mit dünnen
Nadeln gewonnenen Proben verwendet werden, ist im Hinblick auf die
geringere Invasivität
in Bezug auf den Patienten bevorzugt. Dies ist ein wesentlicher
Vorteil, der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird,
berücksichtigt
man die Natur des diagnostischen Verfahrens für Thyroidkrebs anhand histologischer
Gutachten des Gewebes, bei dem die Durchführung hochinvasiver Incisionsverfahren
obligatorisch war. Überdies
ist auch im immunhistochemischen Diagnoseverfahren unter Verwendung
des Gewebeschnitts die vorliegende Erfindung nützlicher, da herausragendere
Verlässlichkeit
als mit dem herkömmlichen
Verfahren erreicht werden kann.
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Im
oben beschriebenen diagnostischen Verfahren können die durch Aspiration mit
dünnen
Nadeln entnommenen Proben durch herkömmliche in vitro-Immunoassays
auf ihre Immunreaktivität
gemessen werden, z. B. durch Immunoblotting, Immunpräzipitation,
ELISA oder dergleichen, wobei der erfindungsgemäße Antikörper verwendet wird. Andererseits
können,
wenn Gewebeschnitte als Proben verwendet werden, herkömmliche
immunhistochemische Färbungstechniken
verwendet werden, um anhand von Immunreaktionen die Immunreaktivität zu bestimmen.
-
Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers zur Herstellung
einer den obengenannten Antikörper
umfassenden Zusammensetzung zur histologischen Diagnose von Thyroidkarzinom
bereit. Ein zuverlässiges
diagnostisches Verfahren für
Thyroidkrebs, wie oben beschrieben, kann unter Verwendung dieser
Zusammensetzung durchgeführt
werden. Diese Zusammensetzung kann Hilfsstoff, Träger, Puffer,
Mittel zur Stabilisation des Antikörpers und dergleichen ad libitum
zusätzlich
zu dem Antikörper
enthalten.
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Demgemäß wurde
erfindungsgemäß eine spezifische
und hohe Expression von LAR in Thyroidkarzinomzellen gezeigt. Weiterhin
wurde auch bestätigt,
dass der erfindungsgemäße monoklonale
Antikörper
zur Diagnose von Thyroidkrebs, wie in den Beispielen illustriert,
verwendbar ist. Außerdem
erwies sich der erfindungsgemäße monoklonale
Antikörper
als verwendbar zur Diagnose von Thyroidkarzinom, wenn Gewebsschnitte
verwendet wurden (siehe Beispiele 5, 6), und zur Diagnose, wenn
homogenisiertes Gewebe verwendet wurde (siehe Beispiel 7). Anhand
dieser Ergebnisse versteht der Fachmann, dass die erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
für mehrere
Arten zytologischer oder histologischer Diagnosen oder Biopsien
verwendbar sind. Weiterhin können
neben den vorliegenden monoklonalen Antikörpern in solchen Verfahren
auch monoklonale Antikörper,
polyklonale Antikörper
und/oder Peptidantikörper,
die eine extrazelluläre
Domäne
von LAR erkennen können,
verwendet werden. In solchen Fällen
wiederum können
die Verfahren nichtsdestoweniger auf ähnliche Weise durchgeführt werden
wie diejenigen, in denen die vorliegenden monoklonalen Antikörper verwendet
werden, jedoch werden Wirkungen, die sich aus der Freisetzung der
extrazellulären
Domäne ergeben,
bevorzugter in Betracht gezogen.
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Es
wurde erfindungsgemäß gezeigt,
dass die Antikörper
gegen LAR zur Diagnose und Therapie von Erkrankungen, die in Bezug
zum Thyroidkarzinom stehen, verwendet werden können. Eine Menge an LAR oder
eines Fragmentes davon kann unter Verwendung eines solchen Antikörpers anhand
der immunologischen Bindung zwischen ihnen bestimmt werden. Spezifisch
kann das Verfahren zur Bestimmung einer Menge von LAR oder eines
Fragmentes davon z. B. ein Sandwich-Verfahren umfassen, wobei ein
Sandwich-Komplex detektiert wird, der durch eine Immunreaktion von
LAR oder einem Fragment davon mit einem Antikörper, der an einen unlöslichen
Träger
gebunden ist, und einem markierten Antikörper gebildet wurde; und ein
Verfahren, in dem eine Menge von LAR oder einem Fragment davon in
einer Probe unter Verwendung eines Kompetitionsverfahrens bestimmt
wird, in dem man kompetitiv LAR oder ein Fragment davon und markiertes
LAR mit dem Antikörper
immunreagieren lässt
und dann eine Menge an LAR oder einem Fragment davon anhand der Menge
des markierten Antigens, das an den Antikörper gebunden hat, bestimmt.
-
Wenn
eine Menge an LAR oder einem Fragment davon durch das Sandwich-Verfahren
bestimmt wird, wird ein Zweischritt-Verfahren durchgeführt, in
dem eine Immunreaktion eines immobilisierten Antikörpers mit LAR
oder einem Fragment davon zuerst ermöglicht wird, dann nicht umgesetzte
Substanzen durch Waschen vollständig
entfernt werden, ein markierter Antikörper zugesetzt wird und auf
diese Weise ein Komplex von markiertem Antikörper und LAR oder einem Fragment
davon gebildet wird; oder ein Einschritt-Verfahren, in dem ein immobilisierter
Antikörper,
ein markierter Antikörper
und LAR oder ein Fragment davon gleichzeitig vermischt werden.
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Zu
dem unlöslichen
Träger,
der für
eine solche Bestimmung verwendet werden kann, können z. B. Kunstharze wie z.
B. Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyester,
Polyacrylatester, Nylon, Polyacetal, fluoriertes Harz und dergleichen,
Polysaccharide wie z. B. Cellulose, Agarose und dergleichen, Glas
und Metall usw. gehören.
Der unlösliche
Träger
kann verschiedene Formen haben, z. B. tablettartig, sphärisch, fasrig,
zylindrisch, scheibenförmig,
gefäßförmig, zellförmig, röhrenförmig usw.
Der Träger
mit dem absorbierten Antikörper
wird in der Kälte
in Gegenwart eines antiseptischen Mittels wie Natriumazid gelagert.
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Zur
Immobilisierung eines Antikörpers
kann ein bekanntes chemisches Bindungsverfahren oder ein physikalisches
Absorptionsverfahren verwendet werden. Das chemische Bindungsverfahren
kann z. B. ein Glutaraldehyd verwendendes Verfahren, ein Maleimidverfahren,
bei dem N-Succinimidyl-4-(N-maleimidmethyl)-cyclohexan-1-carboxylat,
N-Succinimidyl-2-maleimidacetat
oder dergleichen verwendet werden, ein Carboiimid-Verfahren, in
dem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminpropyl)carboiimidhydrochlorid
verwendet werden kann, beinhalten. Weiterhin kann es ein Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren,
ein N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionsäure-Verfahren,
ein bisdiazotiertes Benzidin-Verfahren oder ein Dipalmityllysin-Verfahren
umfassen. Alternativ kann ein Komplex, der zuvor durch eine Reaktion
eines Detektionstestmaterials mit einem Antikörper, dessen Epitop von anderer
Art ist, gebildet wurde, eingefangen werden, nachdem der dritte
Antikörper
gegen diesen Antikörper
gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren immobilisiert wurde.
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Das
zur Markierung des Antikörpers
zu verwendende Material kann ein Enzym, ein fluoreszierendes Material,
ein lumineszierendes Material, ein radioaktives Material, ein Metallchelat
oder dergleichen sein. Zu einem Enzym können z. B. Peroxidase, alkalische
Phosphatase, β-D-Galaktosidase, Malatdehydrogenase, Staphylococcus-Nuclease,
Delta-5-Steroidisomerase, α-Glycerolphosphatdehydrogenase,
Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, Asparaginase, Glukoseoxidase,
Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase,
Glucoamylase, Acetylcholinesterase und dergleichen gehören; und
zu dem fluoreszierendem Material können z. B. Fluoresceinisothiocyanat,
Phycobilinprotein, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Orthophthalsäurealdehyd
und dergleichen gehören;
zu dem Lumineszenzmaterial können
Isoluminol, Lucigenin, Luminol, aromatische Acridinester, Imidazol,
Acridinsalz und modifizierte Ester davon, Luciferin, Luciferase,
Aequorin und dergleichen gehören;
und zu dem radioaktiven Material können 125I 127I 131I 14C 3H 32P 35S und dergleichen gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf,
solange das Material in immunologischen Bestimmungsverfahren verwendet
werden kann. Weiterhin können
Haptene mit geringem Molekulargewicht wie z. B. Biotin, Dinitrophenyl,
Pyridoxal oder Fluorescamin an die Antikörper konjugiert werden. Vorzugsweise
kann Meerrettichperoxidase als Markierungsenzym verwendet werden.
Dieses Enzym kann mit vielen Substraten reagieren, während es
ohne weiteres durch ein periodisches Säureverfahren mit dem Antikörper konjugiert
wird.
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Wenn
ein Enzym als Markierungsmaterial verwendet wird, werden ein Substrat
zur Messung seiner Aktivität
und ein Mittel zur Entwicklung von Farbe verwendet. Wenn Peroxidase
als Enzym verwendet wird, können
H2O2 als Substratlösung und
2,2'-Azino-di[3-ethylbenzthiazolinsulfonat]ammonium
(ABTS), 5-Aminosalizylsäure,
Orthophenyldiamin, 4-Aminoantipyrin,
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
oder dergleichen als Mittel zur Entwicklung von Farbe verwendet
werden; wenn alkalische Phosphatase als Enzym verwendet wird, kann das
Substrat Orthophenylphosphat, Paranitrophenylphosphat oder dergleichen
sein; alternativ kann das Substrat, wenn β-D-Galaktosidase als Enzym verwendet
wird, Fluorescein-di(β-D-galaktopyranosid),
4-Methyl-umbelliferyl-D-galaktopyranosid oder dergleichen sein.
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Auch
Kits, die den oben beschriebenen monoklonalen Antikörper oder
polyklonale Antikörper
und Reagenzien enthalten, werden offenbart.
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Als
Quervernetzungsmittel können
N,N'-Orthophenyldimalimid,
4-(N-Maleimidmethyl)-cyclohexanoyl-N-succinimidester,
6-Maleimidhexanoyl-N-succinimidester, 4,4'-Dithiopyridin, Orthophenylendimaleimid, 4-(N-Maleimidmethyl)-cyclohexanoyl-N-succinimidester,
6-Maleimidhexanoyl-N-succinimidester, 4'4'-Dithiopyridin
oder andere bekannte Quervernetzungsmittel verwendet werden. Die
Reaktion eines solchen Quervernetzungsmittels mit dem Enzym und
dem Antikörper
kann in Abhängigkeit
von den Eigenschaften des Quervernetzungsmittels, das verwendet
wurde, gemäß bekannten
Verfahren durchgeführt
werden.
-
Alternativ
kann der zu verwendende Antikörper
ein beliebiges Fragment dieser Antikörper sein, z. B., abhängig von
den Bedingungen, Fab',
Fab, F(ab')2. Weiterhin
kann ein enzymatisch markierter Antikörper sowohl im Falle eines
polyklonalen Antikörpers
als auch eines monoklonalen Antikörpers durch ein ähnliches
Verfahren erhalten werden. Wenn der enzymatisch markierte Antikörper, der
unter Verwendung des obengenannten Quervernetzungsmittels erhalten
wurde, durch irgendein bekanntes Verfahren gereinigt wird, kann
ein empfindlicheres immunologisches Bestimmungssystem erreicht werden.
Der enzymatisch markierte Antikörper,
der auf eine solche Weise gereinigt wurde, kann mit einem Stabilisator
wie Thimerosal, Glyzerin oder dergleichen vermischt werden; alternativ
kann er lyophilisiert und dann in Kälte und Dunkelheit gelagert
werden.
-
Eine
DDS (Drug Delivery System)-Formulierung, die unter Verwendung des
oben beschriebenen Antikörpers
mit spezifischer Immunreaktivität
für Thyroidkarzinomzellen
auf Thyroidkarzinomzellen gerichtet ist, wird ebenfalls offenbart.
-
Es
wurde erkannt, dass am Thyroidkarzinom mehrere Gene beteiligt sind.
Mutationen in der Tyrosinkinasedomäne des Ret- oder TRK-Gens wurden
in einigen der an Papillärkarzinomen
leidenden Patienten gefunden (Fusco, A., et al., Nature, 328, 170–2, 1987).
Weiterhin wurde bei 3–30
% der Papillärkarzinompatienten
ohne Vorgeschichte vergangener Strahlungsexposition eine Mutation
im Ret-Gen beobachtet (Santoro, M. et al., J. Clin Invest, 89, 1517–22, 1992;
Bongdrzone, I. et al, J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 2006–9, 1996; Zou,
M. et al, Cancer, 73, 176–80,
1994), während
eine höhere
Inzidenz von 60–80
% der Ret-Mutation bei diagnostiziertem Papillärkarzinom bei Kindern, die
bei der Katastrophe im Tschernobyl-Kernkraftwerk Strahlenexposition
erlebt hatten, oder bei Patienten mit einer Fallgeschichte der Strahlenexposition
in ihrer Kindheit beobachtet wurde (Fugazzofe, L. et al, Cancer
Res., 55, 5617–20,
1995; Klugbauer, S. et al., Oncogene, 11, 2459–67, 1995; Nikiforov, Y. E.
et al., Cancer Res., 57, 1690–4,
1997; Bounacer, A. et al., Oncogene, 15, 1263–73, 1997), und die Häufigkeit
der TRK-Genmutation
ist signifikant gering (Bongdrzone, I. et al., J. Clin. Endocrinol
Metab., 81, 2006–9,
1996). Eine Punktmutation des Ras-Gens wird häufig bei Kropf- und Follikulärkarzinom
des Thyroids beobachtet. Als Grundlage dieses Umstandes wurde eine
Punktmutation des Ras-Gens
auf einer frühen
Stufe der Tumorentwicklung erkannt (Fagin, J. A., Molecular pathogenesis.
In: Braverman LE, Utiger RD, Hrsg. Werner und Ingbar's, the tyroid: a
fundamental and clinical text. 7. Ausgabe Philadelphia: Lippincott-Raven,
909–16,
1996; Challeton, C. et al., Oncogene, 11, 601–3, 1995). Die Mutation von Genen,
die TSH und das stimulatorische G-Protein codieren, wurde in einigen
Fällen
von Follikulärkarzinom des
Thyroids berichtet (Challeton, C., et al., Oncogene, 11, 601–3, 1995;
Russo, D. et al., Oncogene, 11, 1907–11, 1995). Weiterhin wurde
ebenfalls berichtet, dass eine Mutation des Tumorsuppressorgens
p53 in differenzierten Thyroidkarzinomen selten ist, es jedoch in
undifferenzierten Karzinomen häufig
gefunden wird (Fagin, J.K. et al., J. Clin. Invest, 91, 179–84, 1993;
Ito, T. et al., Cancer Res., 52, 1369–71, 1992).
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Anhand
dieser bekannten Informationen kann eine Nukleinsäure mit
dem Ziel der Therapie oder der Diagnose von Thyroidkrebs in einer
DDS-Formulierung eingeschlossen werden, die durch einen Antikörper gegen
LAR zielgerichtet wird.
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Weiterhin
ist auch bekannt, dass die Proliferation des Thyroidkarzinoms durch
das thyroidstimulierende Hormon (TSH) reguliert wird, und dass Suppression
der TSH-Sekretion durch Verabreichung eines Thyroidhormonmedikaments
das Wiederauftreten, die Überlebensrate
oder dergleichen bei Thyroidtumor verbessern kann. Demgemäß kann auch
ein Protein, eine Nukleinsäure
oder eine Verbindung, das beziehungsweise die die TSH-Stimulation
inhibieren kann, in die DDS-Formulierung eingeschlossen werden.
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Andererseits
kann die vorliegende DDS-Formulierung, die dadurch charakterisiert
ist, dass sie unter Verwendung des oben beschriebenen Antikörpers mit
spezifischer Immunreaktivität
mit Thyroidkarzinomzellen auf Thyroidkarzinomzellen zielgerichtet
ist, eine oder mehrere Substanzen umfassen, die ausgewählt sind
unter Nukleinsäuren,
Jod, Radiojod, Technetium und einem Protein, und demgemäß wird durch
Einschluss solcher Substanzen in die Formulierung eine höhere Zielrichtungsfähigkeit
auf Thyroidkarzinom ermöglicht,
die zur Therapie oder Diagnose von Thyroidkrebs ausgenutzt werden
kann.
-
„Nukleinsäure" bezeichnet hier
z. B. eine Nukleinsäure,
die ein Protein codiert, das in einer Wirtszelle exprimiert werden
kann, eine Gegensinn-Nukleinsäure,
die aus Zellen gewonnen ist, eine Köder-Nukleinsäure mit
einer Sequenz eines Gens, das ein Bindungsprotein für einen
aus einer Zelle gewonnenen Transkriptionsfaktor codiert, oder eine
Sequenz einer Bindungsstelle eines Transkriptionsfaktors oder eine
dazu ähnliche
Sequenz.
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Eine „Gegensinn-Nukleinsäure" stellt eine Nukleinsäure oder
eine Nukleinsäuresequenz
dar, die spezifisch an eine Nukleinsäure bindet, die imstande ist,
zu einem zukünftigen
Zeitpunkt, auf irgendeiner Stufe der Gen-Expression, d. h. Replikation,
Transkription, Translation oder dergleichen, exprimiert zu werden,
und dadurch die Expression der Nukleinsäure inhibiert, die ansonsten
zu einem zukünftigen
Zeitpunkt exprimiert werden könnte.
Die Gegensinn-Nukleinsäure umfasst
auch eine gegen das Gen gerichtete Nukleinsäure, die sich aus einem Dreifachstrang
ergibt. Eine Nukleinsäure,
die einen Köder
codiert, stellt eine Nukleinsäure
dar, die die Sequenz einer Nukleinsäure hat, die ein Bindungsprotein
eines aus einer Zelle gewonnenen Transkriptionsfaktors oder eine
Sequenz einer Bindungsstelle eines Transkriptionsfaktors oder eine
dazu ähnliche
Sequenz codiert, so dass durch Einführung der Nukleinsäure in eine
Zelle als Köder
die Bindung eines Transkriptionsfaktors an seine Bindungsstelle
inhibiert werden kann, was zur Suppression einer Wirkung des Transkriptionsfaktors
führen
kann und schließlich
die Suppression einer Gruppe von Genen, die aktiviert werden sollte, möglicherweise
resultiert. „Ribozym" bezeichnet hier
eine Nukleinsäure,
die die mRNA eines spezifizierten Proteins schneiden kann und dann
die Translation des spezifizierten Proteins inhibiert. Ein Ribozym
kann aus einer Gen-Sequenz, die das spezifizierte Protein codiert,
hergestellt werden, die hier ohne Berücksichtigung des Typs des Ribozyms
z. B. ein Hammerkopftyp-Ribozym, ein Haarnadel-Ribozym, ein Ribozym
vom Deltatyp und dergleichen umfassen kann, solange es die mRNA
eines spezifizierten Proteins schneiden kann, was zur Inhibition
der Translation des spezifizierten Proteins führt. Ein Selbstmordgen bezeichnet
hier ein Gen, das zum Tod einer Zelle führt, wozu ein den programmierten
Zelltod induzierendes Gen, ein die Apoptose induzierendes Gen, ein
die Nekrose induzierendes Gen und dergleichen gehören können.
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Diese
Nukleinsäuren
können
vom Fachmann ausgewählt
werden, und durch Aufnahme dieser Nukleinsäuren in die DDS-Formulierung
kann spezifischer Tod von Thyroidkarzinomzellen erreicht werden.
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Durch
Zusatz von Radiojod (131I) zu der Formulierung
werden normale Thyroidzellen zerstört, und somit kann die Metastase
des Karzinoms durch systemische Radiojodszintillationstests ohne
weiteres detektiert werden. Weiterhin können durch Messung des Blutthyroglo bulinwertes
nach der Operation verbliebene Karzinome oder Wiederauftreten identifiziert
werden. Weiterhin ermöglicht
es die Radiojodtherapie, durch Zerstörung latenter Karzinome ein
Wiederauftreten zu verhindern, und ein systemischer Radiojodszintillationstest kann
durchgeführt
werden, indem man eine Menge Radiojod zur Therapie verwendet. Dieser
Test ist hochsensitiv für
das Auffinden von übriggebliebenen
Karzinomen. Somit kann die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder
des jodmarkierten oder radiomarkierten Antikörpers die Verwendbarkeit zur
Diagnose oder der Therapie weiter gesteigert werden.
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Weiterhin
kann das Protein Antikörper,
TSH (thyroidstimulierendes Hormon), Thyroidhormon und dergleichen
umfassen.
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Die
oben erwähnte
DDS-Formulierung, die die oben beschriebenen Substanzen umfasst,
ist als pharmazeutische Zusammensetzung zur Diagnose von Thyroidkrebs
oder als pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Thyroidkrebs
verwendbar.
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Die
Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur
Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Thyroidkarzinom
oder Krankheiten, die im Zusammenhang mit Thyroidkarzinom stehen,
bilden somit einen Teil der Erfindung. Eine wirksame Chemotherapie,
die mit geringeren Nebenwirkungen verbunden ist, wird erreicht,
indem man ein Medikament auf den Zielpunkt konzentriert, wobei man
eine Fähigkeit dieses
Antikörpers
ausnützt,
aufgrund von spezifischer Immunreaktivität an Thyroidkarzinomzellen
zu binden, wenn eine therapeutische Behandlung des Thyroidkarzinoms
unter Verwendung eines chemotherapeutischen Mittels beabsichtigt
ist.
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Ein
effektives chemotherapeutisches Mittel für Thyroidkarzinom kann Antikrebsmittel
wie Cyclophosphamid, Adriamycin, Streptozotozin, 5-Fluoracil, Dacarbazin,
Vincristin und dergleichen umfassen.
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Ein
Verfahren der Verabreichung der oben beschriebenen pharmazeutischen
Zusammensetzung kann entweder durch systemische Verabreichung oder
durch lokale Verabreichung erfolgen. Zur systemischen Verabreichung
können
orale Verabreichung, intravenöse
Verabreichung, subkutane und intramuskuläre Injektion, rektale Verabreichung
und dergleichen gehören,
und die lokale Verabreichung kann vorzugsweise durch direkte Verabreichung
ins Thyroidgewebe oder durch Verabreichung in ein Blutgefäß, das zum
Thyroidgewebe führt,
erfolgen.
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Die
Dosierungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
von den bekannten wirksamen Blutspiegeln eines Pharmakons abhängen, die
ad libitum vom Fachmann bestimmt werden können. Weiterhin ist es wichtig,
wenn eine Liposomenformulierung hergestellt wird, den Antikörper in
einer Dosierung zu verwenden, die die Liposomenbildung nicht beeinträchtigt.
-
Insbesondere
bei der Verabreichung an einen Menschen kann der in die DDS-Formulierung aufzunehmende
Antikörper
vorzugsweise der oben beschriebene humanisierte Antikörper, chimäre Antikörper oder
dergleichen ohne Immunogenität
für Menschen
oder zu mindest mit verringerter Immunogenität sein. Wenn ein monoklonaler
Mäuseantikörper einem
menschlichen Körper
verabreicht wird, ist das Risiko des Auftretens verschiedener Nebenwirkungen
zu erwarten, da ein solcher Antikörper für einen Menschen ein heterogenes
Protein ist. Demgemäß können, obwohl
die Verwendung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers wünschenswert
ist, die Fusionseffizienzen geringer sein, und es kann schwierig
sein, ein Hybridom zu erhalten, das stabil einen Antikörper bildet.
Jedoch haben sich die Technologien kontinuierlich weiterentwickelt,
was die Erzeugung von menschlichen monoklonalen Antikörpern durch
chimäre
Antikörper
ermöglicht.
-
Ein
chimärer
Antikörper
kann ein chimäres
Molekül
sein, das einen murinen Antikörper
und einen menschlichen Antikörper
umfasst. Einen Antikörper
durch Immunisierung eines Menschen mit einem beliebigen Antigen
herzustellen, ist ethisch unmöglich.
Daher wird zuerst eine Maus immunisiert, dann wird ein Genteil der
variablen Region (V-Region) eines Antikörpers, der ein Antigen des
erhaltenen monoklonalen Mäuseantikörpers bindet,
daraus isoliert, dieser Genteil wird mit einem Gen verbunden, der
die konstante Region (C-Region) eines Antikörpers aus menschlichem Myelom
codiert, um ein chimäres
Gen zu erzeugen. Wenn das so hergestellte chimäre Gen in einer Wirtszelle
exprimiert wird, kann ein menschlich-muriner monoklonaler Antikörper produziert
werden. Da chimäre
Antikörper
für Menschen
weniger immunogen sind, kann er als monoklonaler Antikörper verwendet
werden, der einem menschlichen Körper
zur Therapie oder zu bildgebenden diagnostischen Verfahren verabreicht
wird. Zu bekannten relevanten Vorveröffentlichungen chimärer Antikörper gehören die
vorläufige
japanische Publikation Nr. Hei 05-304989 ,
die vorläufige
japanische Publikation Nr. Hei 04-330295 ,
die
PCT-Publikation Nr. WO9106649 ,
die vorläufige
japanische Publikation Nr. Sho 63-036786 ,
die
japanische Publikation Nr.
Hei 06-98021 und dergleichen.
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In
jüngerer
Zeit wurden jedoch humanisierte Antikörper entdeckt, die als besser
verwendbar als chimäre
Antikörper
beschrieben wurden. Ein humanisierter Antikörper ist ein Antikörper, dessen
gesamtes Molekül
mit der Ausnahme der CDR (komplementaritätsbestimmenden Region) des
Antikörpermoleküls humanisiert
ist, indem nur das die CDR codierende Gen des Antikörpermoleküls auf ein
Gen, das einen humanisierten Antikörper codiert, übertragen
worden ist. Die humanisierten Antikörper haben einen geringeren
aus der Maus stammenden Antikörperanteil
als human-murine chimäre
Antikörper,
weswegen sie als weniger antigen und sicherer beschrieben wurden.
In Japan wurden gegenwärtig
klinische Tests an humanisierten Antikörpern gegen die T-Zelt-Leukämie der
Erwachsenen durchgeführt.
Im Hinblick auf Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper und
dem verwandten Stand der Technik siehe z. B. die
PCT-Publikationen Nummern WO9222653 ,
WO9845332 ,
WO9404679 ,
WO9837200 und
WO9404679 von Genentech, USA, und
die
PCT-Publikationen Nummern
WO9429451 ,
WO9429351 ,
WO9413805 ,
WO9306231 ,
WO9201059 ,
WO9116927 ,
WO9116928 ,
WO9109967 ,
WO8901974 ,
WO8901783 von Celltech, Vereinigtes
Königreich,
und dergleichen.
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Zu
Verfahren zur Erzeugung menschlicher monoklonaler Antikörper können neben
dem Zellfusionsverfahren ein Transformationsverfahren mit dem Epstein-Barr-Virus
(EBV) und ein anderes Fusionsverfahren von so transformierten Zellen
und Elternzellen, ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Antikörpers und eines
humanisierten Antikörpers
unter Verwendung von Gentechnik und dergleichen gehören. Ein
chimärer Antikörper bezieht
sich auf einen Antikörper,
der dadurch hergestellt worden ist, dass man Immunglobulingenfragmente
heterologer Tiere miteinander verbindet, und ein humanisierter Antikörper bezieht
sich auf einen Antikörper,
der dadurch hergestellt wurde, dass man einen zu einem menschlichen
Antikörper
heterologen Antikörper
wie z. B. einen Mäuseantikörper modifiziert,
wobei als Primärstruktur
mit der Ausnahme der CDR (komplementaritätsbestimmenden Region) in der
H-Kette und der L-Kette die entsprechende primäre Struktur eines menschlichen
Antikörpers
eingesetzt wird. Als Ausgangszellen zur Herstellung eines menschlichen
monoklonalen Antikörpers
können
Stamm SHM-D 33 (ATCC CRL 1668) oder Stamm RF-S1 verwendet werden,
welche menschlich/murine Heteromyelome sind, so dass eine hohe Fusionseffizienz,
die der mit Mäuse-Elternzellen gleicht,
erreicht werden kann. Unter Verwendung solcher Elternzellen erhaltene
Hybridome können
ohne Feeder-Zellen kloniert werden, und sie können auf relativ stabile Weise
in großem
Maßstab
Antikörper
vom IgG-Typ bilden. Zur Kultur der Elternzellen kann ERDF-Medium, enthaltend
15 % FCS, verwendet werden, und ein anderes Verfahren kann in ähnlicher
Weise im Fall der Kultur von murinen Elternzellen ausgeführt werden. Weiterhin
ist es bevorzugt, mit dem Antigen hinreichend sensitivierte menschliche
Lymphozyten zu verwenden, die aus peripherem Blut gewonnen werden,
um menschliche monoklonale Antikörper
vom IgG-Typ zu produzieren.
Wenn es schwierig ist, solche hinreichend sensitiven Lymphozyten
mit einem Antigen zu gewinnen, kann auch eine in vitro-Sensitivierung
mit dem Antigen durchgeführt
werden.
-
Unter
Verwendung der dargestellten Verfahren kann der vorliegende Antikörper humanisiert
werden, und somit eignet er sich besonders für die Verabreichung an einen
menschlichen Körper.
-
Weiterhin
kann die Verwendbarkeit als diagnostisches oder therapeutisches
Medikament durch Radiomarkierung solch eines Antikörpers mit
Jod oder durch Einbeziehung von radiomarkiertem Jod in eine mit dem
Antikörper
zielgesteuerte pharmazeutische Zusammensetzung gesteigert werden.
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Wenn
ein papilläres
Karzinom oder follikuläres
Karzinom in das umgebende Gewebe eindringt oder durch den Blutstrom
zu einem entfernten Teil des Körpers
(insbesondere in die Lunge und den Knochen) metastasiert, ist eine
gebräuchliche
therapeutische Strategie zur Zerstörung des Tumors die Verabreichung
von radiomarkiertem Jod (131-I). Normale
Thyroidzellen nehmen Jod aus dem Blut auf und konzentrieren es.
Dieser Prozess wird durch das TSH (thyroidstimulierende Hormon)
stimuliert, das von der Hypophyse sezerniert wird. Jod wird danach verwendet,
um das Thyroidhormon zu bilden (Thyroxin T4). Wie oben dargestellt,
nimmt ein Thyroidkarzinom oder metastatisches Karzinom normalerweise
nur geringe Mengen an Jod (oder radioaktivem Jod) auf. Wenn jedoch
das Karzinom unter dem Einfluss großer Mengen von TSH steht, neigt
ein Teil des Thyroidkarzinoms oder der Metastase dazu, bei der Stimulation
eine erhebliche Jodmenge aufzunehmen. Demgemäß ist es möglich, das Karzinom einer hohen
Strahlungsdosis auszusetzen, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen. Wenn
in einem Körper
ein intaktes Thyroid vorliegt und ein normaler Spiegel des Thyroidhormons
gebildet wird, kann der gebildete TSH-Spiegel relativ niedrig bleiben;
beim Absinken des Thyroidhormonspiegels infolge einer Entfernung
oder Zerstörung
des gesamten Thyroids beschleunigt jedoch die Hypophyse rasch die
TSH-Sekretion. Das TSH stimuliert das Thyroidkarzinom, was zur Aufnahme
radioaktiven Jods führt.
Wenn eine Radiojodtherapie für
ein metastasierendes Thyroidkarzinom durchgeführt wird, muss das gesamte
Thyroid fast vollständig
durch eine Operation entfernt werden, und das restliche Gewebe muss unter
Verwendung von Radiojod zerstört
werden. Nachdem dieses Verfahren durchgeführt worden ist, werden Patienten,
bei denen Tumore im Hals verbleiben oder die eine Metastasierung
des Karzinoms an entfernten Stellen haben, einem Scannen unterzogen,
wenn ihr TSH-Spiegel hoch genug ist, wobei eine Testmenge an radioaktivem
Jod verwendet wird (normalerweise 2–10 mCi). Wenn gezeigt wird,
dass eine wesentliche Menge an Radiojod sich in einer Region eines
Thyroidkarzinoms ansammelt, wird in einem Versuch, den Tumor zu zerstören, eine
größere, therapeutische
Menge an Radiojod verabreicht (normalerweise 100–200 mCi ~ 3700–7400 MBq).
Da Radiojod auch bei Patienten mit stärker invasivem Thyroidkarzinom
sicher und wirksam ist, sind viele Ärzte dazu übergegangen, Radiojod routinemäßig für weniger
invasive Papillärkarzinome
oder Follikulärkarzinome
zu verwenden.
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Somit
kann durch Markierung des LAR-bindenden Antikörpers unter Verwendung von
Jod oder durch Einbeziehung von Radiojod in eine mit dem Antikörper zielgerichtete
pharmazeutische Zusammensetzung die Spezifität für Thyroidkarzinomzellen weiter
gesteigert werden, was eine therapeutische oder diagnostische Anwendung
ermöglicht.
-
Demgemäß ist ein
Antikörper
gegen LAR, der spezifisch Thyroidkarzinomzellen erkennt, auch in
einem Drug Delivery System (DDS) verwendbar. Ein Drug Delivery System
(Mitsuru Hashida, Drug Delivery System, New Challenges to Manufacturing
Drugs and Therapy, Kagaku Doujin, (1995)) ist eine neue Technik
im Bereich der Medikamentenverabreichung, die darauf abzielt, Verabreichungswege
oder Formen von Medikamenten zu finden; die Medikamente selektiv
an die Zielorte abzugeben, indem man die Pharmakokinetik der Medikamente
im Körper
kontrolliert; die optimalen therapeutischen Wirkungen als Ergebnis
zu erreichen; und die von den Medikamenten ausgeübten Nebenwirkungen zu minimieren.
Obwohl zuvor schon verschiedene DDS-Formulierungen entwickelt wurden,
werden Liposomenformulierungen (Hiroshi Terada, Tetsuro Yoshimura
Hrsg., Experiment Manual of Liposome in Life Science, Springer-Verlag, Tokyo,
(1992)) vor allen anderen hervorgehoben zur Ergänzung eines defizienten Enzyms,
zur Verabreichung karzinostatischer Mittel und Antibiotika, ebenso
wie in der Gentherapie.
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Ein
Liposom ist ein kleines, geschlossenes Vesikel, das aus einer Lipiddoppelschicht
besteht, deren Basis ein Phospholipid ist, das eine Biomembran bildet,
das als sicher mit einer überlegenen
Funktion als Arzneistoffträger
bekannt ist, da es verschiedene Pharmaka unabhängig von ihrer Löslichkeit
verkapseln kann, ob die Pharmaka nun fettlöslich oder wasserlöslich sind,
wobei die Zusammensetzung eines Liposoms eine Lipidmembran und einen
wässrigen
Schichtenteil umfasst.
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Weiterhin
ist es wohlbekannt, dass eine Zielsteuerungsfähigkeit einem Liposom vermittelt
werden kann, indem man einen Antikörper, ein Peptid oder dergleichen
an die Oberfläche
des Liposoms bindet (Kazuo Maruyama, Tomoko Takizawa, Motoharu Iwatsuru
et al., Biochimica et Biophysica Acta 1234, 74 (1995; Jibao Zaho,
Shunsaku Kimura, Yukio Imanishi, Biochimica et Biophysica Acta 1283,
37 (1996)). Demgemäß können Antikörper gegen
LAR zu dem Zweck verwendet werden, die Spezifität verschiedener Liposomenformulierungen
für Thyroidkarzinomzellen
zu verbessern. Weitere charakteristische Merkmale der Liposomen
sind ihre Fähigkeit,
eine Vielzahl von Trägern
(Vektoren) zu bilden, deren Eigenschaften sich durch Veränderung
einer Art des Lipids oder durch Modifikation mit Polyethylenglykol
unterscheiden: z. B. temperatursensitive Liposomen (Sakae Unezaki,
Kazuo Maruyama, Motoharu Iwatsuru et al., Pharmaceutical Research
11, 1180 (1994)), in Blut stabile Liposomen (Kazuo Maruyama, Tsutomu
Yuda, Motoharu Iwatsuru et al., Biochimica et Biophysica Acta 1128,
44 (1992)), kationische Liposomen als Vektoren zur Einführung von
Plasmiden (Xiang Gao, Daniel Jaffurs, Leaf Huang et al.; Biochemical
and Biophysical Research Communications 200, 1201 (1994)), und dergleichen
können
hergestellt werden.
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Liposomen
werden jedoch üblicherweise
auf einem endozytotischen Weg in die Zellen aufgenommen, gefolgt
von Aufnahme in frühe
Endosomen in der Nähe
der Zellmembran. Dann werden die Liposomen in späte Endosomen in einem tieferen
Teil der Zelle übertragen
und schließlich
in Lysosomen transferiert. Die Liposomen, die in Lysosomen transferiert
wurden, werden durch die Wirkung hydrolytischer Enzyme abgebaut,
und die in Liposomen enthaltenen Pharmaka werden gleichzeitig metabolisiert,
und es existiert somit das Problem, dass die wirksame Menge der
Pharmaka, die unverändert
ins Zytoplasma übergeht,
extrem gering sein kann.
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Gegenwärtig wird
ein Verfahren zum direkten Einbringen von Pharmaka und dergleichen
ins Zytoplasma ohne Schädigung
der Zellmembran, die eine Barriere einer Zelle ist, untersucht.
Wenn z. B. Liposomen eine Fähigkeit
erlangen, mit einer Membran zu fusionieren, sind darin enthaltene
Pharmaka imstande, direkt und ohne Transfer durch die Lysosomen
ins Cytosol abgegeben zu werden. Verfahren zur Fusion des Liposoms
mit einer Zelle wurden zuvor untersucht, und hierzu gehören: pH-empfindliche
Liposomen (Kenji Kono, Ken-ichi Zenitani, Toru Takabishi, Biochimica
et Biophysica Acta 1193, I (1994)); und rekonstituierte Liposomen,
welche Liposomen sind, in die ein Hüllprotein eines Virus einbezogen
ist (Sangeeta Bagai, Debi P. Sarkar, The Journal of Biological Chemistry
269, 1966 (1994)).
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Unlängst wurde
ein fusogenes Liposom (HJV-Liposom) beschrieben, welches ein Liposom
mit der übernommenen
Fähigkeit
des Sendai-Virus (japanisches hämagglutinierendes
Virus), mit einer Membran zu fusionieren, ist (Yoshio Okada, Currenttopics
in Membranes and Transport 32, 297 (1988)). Das Sendai-Virus (HVJ)
ist ein Modellvirus für
die Genetik unter Verwendung von Tierzellen, basierend auf der Beobachtung
eines interzellulären
Fusionsereignisses (Y Maeda, J Kim, Y. Okada et al., Experimental
Cell Research 108, 108 (1977)). Weiterhin kann HVJ auch mit Liposomen
fusionieren (Mahito Nakanishi, Tsuyoshi Uchida, Yoshio Okada et
al., Experimental Cell Research 159, 399 (1985)), und das Fusionsprodukt
(HVJ-Liposom) kann wiederum mit einer Zellmembran fusionieren. Ein
HVJ-Liposom, das durch eine direkte Reaktion zwischen einem Liposom
und HVJ hergestellt wurde, ist ein sogenannter Hybridvektor, der
im Inneren einen Hohlraum trägt,
der von dem Liposom stammt, und eine äußere Stachelstruktur, die mit
der einer Virushülle
identisch ist. HVJ-Liposomen können
beliebige Substanzen, solange sie in Liposomen verkapselt werden
können,
wie z. B. Proteine, chemische Substanzen, Gene und dergleichen,
mit hohen Effizienzen, die denen des Sendai-Virus gleichkommen,
in Zellen übertragen
(Tetsuhiko Nakagawa, Hiriyuki Mizuguchi, Tadanori Mayumi, Drug Delivery
System 11, 411 (1996)). Eine weitere verbesserte Art von HVJ-Liposom
wurde vorgeschlagen, bei der die Übertragungseffizienzen durch
gemeinsame Übertragung
mit DNA und einem Kernprotein HMG-1 (Nicht-Histon-Chromosomenprotein,
High Mobility Group-1) mit DNA-Bindungsfähigkeit gesteigert werden können (Yasufumi
Kaneda et al., J. Molec. Medicine 73, 289 (1995)).
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Ein
anderes Beispiel eines membranfusionierten Liposoms, das verwendet
werden kann, ist eine Liposomenformulierung, in der VSV (vesikuläres Stomatitisvirus;
Yoshiyuki Nagai, Akira Ishihama Hrsg., Protocols for Experiments
of Virus, Medical View (1995)) verwendet wird (J. Virol, 72 (7),
6159–63,
1998, Exp. Cell. Res. 200(2), 333–8, 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87(7), 2448–51,
1990; und Biochim. Biophys. Acta, 987(1), 15–20, (1989)). VSV ist ein Virus
mit einzelsträngiger
(-)-RNA, das zu der Gattung Vesiculovirus in der Familie Rhabdovirus
gehört
und ein G-Protein besitzt, das ein Hüllprotein auf einer Membranoberfläche ist (Akihiko
Kawai, Journal of Virology 24, 826 (1977)). Die Mechanismen der
Zellinfektion von VSV können über einen
endozytotischen Pfad ähnlich
wie bei Liposomen verlaufen. Jedoch überträgt VSV im Unterschied zu Liposomen,
da VSV eine charakteristische Fähigkeit
hat, mit einer Endosomenmembran zu fusionieren, sein eigenes Gen
ohne Abbau durch im Lysosom enthaltene hydrolytische Enzyme in das
Zytoplasma. Bislang wurde beobachtet, dass VSV eine Fähigkeit
hat, mit einer Membran zu fusionieren, und dass keine hämolytische
Wirkung gegenüber
menschlichen Erythrozyten von VSV ausgeht (Carole A. Bailey, Douglas
K. Miller, John Lenard, Virology 133, 111 (1984)). Weiterhin ist
eine große
Vielzahl von Wirten möglich,
da VSV das ubiquitär in
einer Vielzahl von Gewebszellen vorkommende Phosphatidylserin als
Rezeptor verwendet (Michael J. Clague, Christian Schoch, Robert
Blumenthal, Biochemistry 29, 1303 (1990)), und die Vermehrung dieses
Virus geht schnell vonstatten, somit wird VSV dadurch gekennzeichnet,
dass das Virus ohne weiteres in großen Mengen gewonnen werden
kann. Andererseits wurde berichtet, dass VSV in Liposomen zu Fusionen
führen kann
(Satoshi Yamada, Shunichi Ohnishi, Biochemistry 25, 3703 (1986)).
-
Wie
detailliert erklärt,
können
Antikörper
gegen LAR dazu verwendet werden, die Zielsteuerungsfähigkeiten
jeder Art von Liposomenformulierungen zu verbessern, einschließlich von
Membranfusionsliposomen, pH-empfindlichen Liposomen, rekonstituierten
Liposomen, kationischen Liposomen und dergleichen, oder modifizierten
Arten davon.
-
Weiterhin
wurden stichhaltige Berichte von Verfahren zur Verbesserung der
Zielsteuerungsfähigkeiten unter
Verwendung monoklonaler Antikörper
und ihrer Anwendbarkeit gefunden (Hum. Antibodies, 9(1), 61–5, 1999;
J. Clin. Pharm. Ther., 22(1), 7–19,
1997, J. Int. Med. Res. 25(1), 14–23, 1997; Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93 (24), 14164–9,
1996; Hepatology, 22(5), 1482–7,
1995; Hepatology, 22(5), 1527–37,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(15), 6986–90, 1995; Immunomethods, 4(3),
259–72,
1994; J. Drug Target, 2(4), 323–31,
1994; Cancer Res, 57(10), 1922–8,
1997; Crit Rev. Biotechnol. 17(2), 149–69, 1997; Methods Find Exp.
Clin Pharmacol., 16(7), 505–12,
1994; Trends Biotechnol., 12(6), 234–9, 1994; und Bioconjug, Chem.,
4(1), 94–102, 1993),
und somit können
monoklonale Antikörper
gegen LAR gemäß den oben
beschriebenen Literaturstellen oder bekannten Techniken zur therapeutischen
Behandlung von Thyroidkarzinom verwendet werden.
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Weiterhin
können
erfindungsgemäße Antikörper gegen
LAR im Hinblick auf die Zielsteuerung auf Thyroidkarzinom, zur Gentherapie
mit viralen Vektoren oder für
DDS-Formulierungen, in denen Polysäuren-Glykolsäure-Mikrosphären, Lipidmikrosphären, polyethylenglycolmodifizierte
Enzyme oder dergleichen verwendet werden, verwendet werden.
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Eine
hohe Expression von LAR in Thyroidkarzinomzellen kann anzeigen,
dass in diesen Zellen eine hohe Rate der Transkription von einer
ein LAR-Molekül
codierenden Nukleinsäuresequenz
in eine mRNA, gefolgt von Translation, stattfindet. Dementsprechend
kann der Fachmann durch Messung eines Expressionsniveaus der LAR-mRNA
unter Verwendung von Sonden für
die mRNA ein Karzinom einfach diagnostizieren.
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Weiterhin
kann die vorliegende Erfindung einen erheblichen Beitrag zu molekularbiologischen
Untersuchungen an Transkriptionsfaktoren, Promotoren, Enhancern
oder dergleichen, die die Transkription von LAR in Thyroidkarzinomzellen
beschleunigen können,
leisten.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Schemadarstellung, die eine Untereinheitenstruktur von LAR
zeigt (a); und eine Schemazeichnung, die die mutierten LAR-Phosphatasedomänenstrukturen
innerhalb der Membran darstellt (b), wie in den Beispielen dargelegt
hergestellt.
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2 zeigt
Immunoblots, die die zeitabhängige
Tyrosinphosphorylierung illustrieren, die durch Insulinstimulation
in COS-Zellen ausgelöst
wird, die mit LAR/CS und Insulinrezeptor vom Wildtyp cotransfiziert
worden waren.
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3 zeigt
Immunoblots, die die Phosphorylierung-Dephosphorylierung in COS-Zellen
illustrieren, die mit Wildtyp- oder mutiertem LAR und Insulinrezeptor
vom Wildtyp cotransfiziert worden waren.
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4 zeigt
einen Immunoblot, der die Dephosphorylierung einer β-Kette des
Insulinrezeptors durch Wildtyp- oder mutiertes LAR zeigt.
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5 stellt
einen Immunoblot dar, der die Tyrosinphosphorylierung des Insulinrezeptors
und von LAR in COS-Zellen zeigt, die mit LAR/CS und Insulinrezeptor
vom Wildtyp oder mutiertem Insulinrezeptor cotransfiziert worden
waren.
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6 zeigt
ein SDS-Polyacrylamidgel, das ein Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1
zeigt.
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7 zeigt
Immunoblots, die die Immunspezifität des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1
zeigen.
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8 zeigt
Immunoblots, die die LAR-Tyrosinphosphorylierung durch die Tyrosinkinase
des Insulinrezeptors zeigen.
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9 ist
eine Schemadarstellung, die eine Signaltransduktionskaskade des
Insulins zeigt, die durch Phosphorylierung-Dephosphorylierung kontrolliert
wird, woran der Insulinrezeptor und LAR teilnehmen.
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10 zeigt
die Ergebnisse eines Immunoblottings, die die Gewebsverteilung von
LAR bei der Maus unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1
zeigt.
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11–13 zeigen
die Ergebnisse einer selektiven Einfärbung von Krebszellen bei der
Immunfärbung
von menschlichen Thyroidkarzinomgewebeschnitten unter Verwendung
des erfindungsgemäßen Antikörpers YU1.
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14 zeigt
Immunoblots von normalen und karzinomatösen Thyroidgeweben mit dem
erfindungsgemäßen Antikörper YU1,
die die spezifische Immunreaktivität mit menschlichen Thyroidkarzinomgewebe
zeigen.
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Beste Ausführungsform der Erfindung
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Experimentelles Beispiel 1: Tyrosinphosphorylierung
von Insulinrezeptoren durch LAR-Mutanten
und Untersuchungen der Assoziation zwischen LAR und den Insulinrezeptoren
-
Zuerst
wurde, um die die Insulinsignalübertragung
Mechanismen durch LAR kontrollierenden Mechanismen aufzuklären, eine
Analyse mit einer Strategie durchgeführt, in der ein mu tiertes LAR
verwendet wurde, das durch Ersatz von Cystein, das in einem katalytischen
Zentrum der PTP-Domäne
von LAR vorkommt, mit Serin hergestellt wurde.
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A) Expressionsvektoren für LAR und
Insulinrezeptoren
-
Es
wurden drei Arten von LAR-Expressionsvektoren verwendet, nämlich (a)
LAR-WT: menschliches Wildtyp-LAR (SEQ ID NO: 3); (b) LAR C/S: mutiertes
LAR mit einer Cysteinsubstitution in einem katalytischen Zentrum
der LAR-PTP-Domäne
1 (Aminosäurenresteposition
1552 der SEQ ID NO:3) durch Serin durch Ersatz von Nukleotid G,
Position 4983 der SEQ ID NO: 3, durch C; und (c) LAR DC/S: gegenüber LAR
C/S an einer weiteren Stelle mutiert durch Substitution eines Cysteins
in der LAR-PTP-Domäne
2 (Aminosäurenrest Position
1813 der SEQ ID NO: 3) durch Serin durch Ersatz des Nukleotids G
mit C, Position 5856 der SEQ ID NO: 3 (siehe 1(b)),
wobei jede dieser Sequenzen in einen pMT-Expressionsvektor eingebaut
wurde (siehe Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897–907, 1992; und Streuli M.
et al., EMBO J., 9, 2399–2407,
1990).
-
Gleichzeitig
waren die verwendeten Insulinrezeptorexpressionsvektoren: (a) IR
WT: Wildtyp und (b) IR K1018M: mutierter Insulinrezeptor mit einer
Substitution des Lysins an der Position 1018 der ATP-Bindungsstelle
des Wildtyp-Insulinrezeptors durch Methionin, was zur Tyrosinkinaseaktivitätsdefizienz
führte,
wobei jede dieser cDNAs stromabwärts
eines SRα-Promotors eingefügt wurde
(siehe Kanai F. et al., Biochemical und Biophysical Research Communications,
195, 762–768,
1993).
-
B) Transfektion in COS-7-Zellen
-
COS-7-Zellen
wurden in mit 10 % fötalem
Kälberserum
ergänztem
RPMI 1640 Medium (Nissui Pharmaceutical Co., LTD.) zu 1,0 × 106 Zellen pro 8 mL pro 90 ∅ Schale
ausplattiert, dann wurden nach 16-stündiger Inkubation die Expressionsvektoren
für LAR
C/S und IR WT unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens in die
COS-7-Zellen cotransfiziert. Das verwendete LAR C/S war ein Vektor,
von dem gefunden wurde, dass er entsprechend der Mutation, wie oben
in Paragraph A (b) erwähnt,
in vitro zur kompletten Defizienz an Tyrosinphosphataseaktivitäten führt (Streuli
M. et al., EMBO J., 9, 2399–2407,
1990).
-
Die
Cotransfektion geschah gemäß dem folgenden
Verfahren: Zuerst wurden 40 μl
an 10 mM Chloroquin zu 4 ml RPMI 1640 Medium (102 g/L an RPMI 1640
(Nissui Pharmaceutical Co., LTD.) enthaltend 0,3 g Glutamin und
0,1 g Kanamycin, pH 7,4, eingestellt mit 10 % NaH-CO3),
zugesetzt.
-
Zu
2 ml dieser Lösung
wurden 5 μg
an LAR-Expressionsvektor und 1 μg
an IR-Expressionsvektor
zugesetzt, während
16 μl an
100 mg/ml DEAE-Dextran zu 2 ml der übrigen Lösung zugesetzt wurden. Dann
wurden beide Lösungen
unter Rühren
gründlich
vermischt. Zu den so hergestellten 3,75 ml der Lösung des Expressionsvektors
wurden auf 1,0 × 106 Zellen pro 8 ml/pro Schale ausgebracht,
und es wurde zu COS-7-Zellen zugesetzt, die 16 Stunden lang bei
37 °C in
einem 5 % CO2-Inkubator vorkultiviert worden
waren. Nach 4 Stunden Kultur unter ähnlichen Bedingungen wie in
der Vorkultur wurden die Zellen 2 Minuten lang mit einer 10 %-igen
DMSO-Lösung
behandelt, dann mit PBS gewaschen (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3
mM Na2HPO4·12H2O, 1,4 mM KH2PO4), danach wurden 8 ml an 10 % FCS enthaltenem
RPMI 1640 zugesetzt, und sie wurden 48 Stunden lang bei 37 °C in einem
Inkubator, der auf 5 % CO2 eingestellt war,
kultiviert.
-
C) Insulinstimulierung und Herstellung
des Zelllysats
-
Nach
dem Abschluss der Transfektion wurden die COS-7-Zellen 16 Stunden
lang in serumfreien RPMI 1640 Kulturmedium inkubiert, gefolgt von
Stimulation mit 10–7 M Insulin (Seikagaku
Corporation) über
festgelegte Zeiträume
hinweg, d. h. 0, 1, 5, 15 und 30 Minuten. Die Stimulation über 0 Minuten
wurde durchgeführt, indem
man die Zellen ohne Inkubation bei 37 °C auf Eis stehen ließ, obwohl
gleichzeitig Insulin zugesetzt wurde. Nachdem die jeweilige Zeit
seit dem Beginn der Insulinstimulation verflossen war, wurde die
Kulturflüssigkeit
vollständig
von den Zellen abgesaugt, und 5 ml PBS mit Inhibitoren (PBS enthaltend
Tyrosinphosphataseinhibitoren: 1 mM Natriumvanadat, 5 mM Natriumfluorid,
5 mM Natriumpyrophosphat, 5 mM EDTA-2Na, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM
Na2HPO4·12H2O, 1,4 mM KH2PO4) wurde sofort zugesetzt.
-
Nach
dem Waschen der ganzen Zellen mit PBS mit Inhibitoren wurde die
Flüssigkeit
durch Absaugen entfernt, und 1 ml Lysispuffer (1 % Nonidet P-40,
150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl
(pH 7,4), 5 mM EDTA, 10 mM Jodacetamid, 10 mM Natriumfluorid, 10
mM Natriumpyrophosphat, 0,4 mM Natriumvanadat, 0,1 mM oxidiertes Phenylarsin,
1 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) wurde den Zellen
zugesetzt, die danach mit einem Schaber gesammelt wurden. Die Zellsuspension
wurde in ein 1.5-ml-Röhrchen übertragen,
dann 30 Minuten lang bei 4 °C
inkubiert, um vollständige
Lyse der Zellen zu bewirken. Der Überstand, der durch 10-minütige Zentrifugation
der Flüssigkeit
bei 12.000 rpm und 4 °C
nach der Inkubation erhalten wurde, wurde in den nachfolgend beschriebenen
Experimenten als Zelllysat verwendet.
-
D) Immunpräzipitation
-
Immunpräzipitation
wurde für
das wie oben in Absatz C beschrieben erhaltene Zelllysat mit einem
Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR durchgeführt (ein Gemisch von 7,5 μg an 11.1
A und 7,5 μg
an 75.3 A, siehe Streuli M. et al., EMBO J., 11, 897–907, 1992).
Zu 1 ml der obengenannten Zelllysislösung wurden 15 μg MOPC 21
(Mäuse-IgG1κ: Sigma Corporation)
als Kontrolle zugesetzt, dann wurde die Lösung eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert,
man setzte 20 μl γ-Bind (GammaBind
Plus Sepharose: Pharmacia Biotech Inc.) zu und inkubierte eine weitere
Stunde lang bei 4 °C,
um die Präabsorption
durchzuführen.
Die Lösung
wurde 10 Minuten lang bei 4 °C
und 12.000 rpm zentrifugiert, dann wurden 950 μl des Überstandes in ein anderes Röhrchen übertragen.
Im nächsten
Schritt wurden im Überstand
15 μg Antikörper gegen
die E- Untereinheit
von LAR zugesetzt, dann wurde die Lösung eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert,
man setzte 20 μl γ-Bind zu
und inkubierte eine weitere Stunde lang bei 4 °C.
-
Nach
10-minütiger
Zentrifugation bei 4 °C
und 12.000 rpm wurde das Präzipitat
zwei Mal mit 1 ml Lysispuffer, dann ein Mal mit PBS mit Inhibitoren
gewaschen und in 20 μl
SDS-Probenpuffer
aufgenommen. Die Suspension wurde 5 Minuten lang in einem kochenden
Wasserbad erhitzt, um eine Probe für die Elektrophorese vorzubereiten.
-
E) Immunoblotting
-
Die
oben beschriebene Probe wurde einer Elektrophorese unter Verwendung
eines 7,5 % SDS-Polyacrylamidgels unterzogen, gefolgt von Transfer
auf eine Nitrozellulosemembran (Schleicher & Schuell) unter Verwendung eines
Transfergerätes
bei 400 mA über
4 Stunden hinweg. Dann führte
man eine Blockierung durch, indem man die Membran mehr als 30 Minuten
lang in einer 3 %-igen Lösung
von Rinderserumalbumin bei Raumtemperatur inkubierte. Nach mehr
als doppeltem 10-minütigem
Waschen mit einem genügenden
Volumen an TBS-T (TBS mit Tween 20: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150
mM NaCl, 0,1 % Tween 20) wurde ein 50.000-fach mit TBS-T verdünnter Antikörper gegen
Phosphotyrosin (4G10, UBI), der Antikörper gegen die E-Untereinheit
von LAR oder ein Antikörper
gegen die β-Kette
des Insulinrezeptors (UBI) zugesetzt, dann wurde das Gemisch eine
Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach mehr als 3-maligen
5-minütigen
Waschen mit einem genügenden
Volumen an TBS-T wurden 15 ml TBS-T-Lösung, enthaltend mit Meerrettichperoxidase
markierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (meerrettichperoxidasemarkierter
Anti-Maus-IgG, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1,5 ml, zugesetzt,
und es wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach mehr
als 3-maligen 5-minütigem
Waschen mit einem genügenden
Volumen an TBS-T wurden durch Chemilumineszenz unter Verwendung
eines Kits von Lumineszenzreagenzien (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.) die Proteinbanden detektiert, die an jeden einzelnen der Antikörper binden
können.
-
F) Ergebnisse
-
Als
Ergebnis des Immunoblottings mit dem Antiphosphotyrosinantikörper nach
Immunpräzipitation
mit dem Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR aus dem auf die oben beschriebene
Weise nach Stimulation mit Insulin über festgelegte Zeiträume von
mit LAR C/S und IR WT cotransfizierten COS-7-Zellen konnten bei der
1-minütigen
Insulinstimulation Tyrosinphosphorylierungen einer Insulinrezeptor β-Kette ebenso
wie eines 85 kDa-Proteins beobachtet werden. Solche Tyrosinphosphorylierungen
konnten auch nachfolgend bei der 30-minütigen
Insulinstimulation beobachtet werden (siehe 2A).
-
Weiterhin
zeigten die Ergebnisse des Immunoblottings mit dem Antikörper gegen
die E-Untereinheit von
LAR (2B), mit dem Antikörper gegen
die β-Kette
des Insulinrezeptors (2C) und mit
dem Antiphosphotyrosinantikörper
(2A), dass sich LAR und der Insulin rezeptor
in Abhängigkeit
von der Gegenwart oder Abwesenheit von Tyrosinphosphorylation des
Insulinrezeptors assoziieren können.
-
Experimentelles Beispiel 2: Untersuchungen
der Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors durch verschiedene
LARs (1)
-
Als
nächstes
wurden COS-7-Zellen in ähnlicher
Weise mit LAR WT, LAR C/S oder LAR DC/S und IR WT cotransfiziert,
gefolgt von 5-minütiger
Stimulation mit Insulin, Immunpräzipitation
mit dem Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR, und dann wurde Immunoblotting
mit verschiedenen Arten von Antikörpern gegen die Präzipitate
durchgeführt.
Im Vergleich zu den mit LAR C/S oder LAR DC/S cotransfizierten Zellen
konnte in den mit dem Insulinrezeptor und LAR WT cotransfizierten
Zellen keine Tyrosinphosphorylierung der β-Kette des Insulinrezeptors
oder des 85 kDa-Proteins detektiert werden (siehe 3A).
-
In
diesen Experimenten waren die Expressionsmengen von LAR (3C) und dem Insulinrezeptor (3D) in beiden Cotransfektanten überdies
beinah identisch, weswegen vorgeschlagen wurde, dass LAR WT das
phosphorylierte Tyrosin der β-Kette
des Insulinrezeptors ebenso wie das 85 kDa-Proteins dephosphoryliert
(3B).
-
Weiterhin
zeigte, als die Immunpräzipitate
mit dem Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR einem Immunoblotting unter Verwendung
des Antikörpers
gegen die β-Kette
des Insulinrezeptors unterzogen wurden, die Cotransfektante mit
LAR DC/S eine schwächere
Bande einer Insulinrezeptor-β-Kette
im Vergleich zu der Cotransfektante mit LAR WT oder LAR C/S.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Assoziation zwischen dem Insulinrezeptor
und LAR DC/S im Vergleich zu der mit LAR WT oder LAR C/S schwächer ist.
Der einzige Unterschied zwischen LAR C/S und LAR DC/S ist der eine
Aminosäurenrest
an Position 1813 der Phosphatasedomäne 2, wodurch gezeigt wurde,
dass diese Domäne
2, von der postuliert wurde, dass sie an der Bindung an Substrate
ohne Tyrosinphosphataseaktivität
beteiligt sei, eine Rolle bei der Bindung zwischen LAR und dem Insulinrezeptor
spielt.
-
Experimentelles Beispiel 3: Untersuchungen
zur Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors durch verschiedene
LARs (2)
-
Um
weiter zu untersuchen, ob Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors
nur in den Fällen
erfolgt, in denen LAR gebunden ist, oder bei jedem Insulinrezeptor,
wurde ein Zelllysat der Cotransfektanten einer Elektrophorese und
dann einem Immunoblotting mit dem Antiphosphotyrosinantikörper unterzogen.
Eine deutliche Tyrosindephosphorylierung des Insulinrezeptors wurde
nur bei Zellen gefunden, die mit LAR WT cotransfiziert worden war
(siehe 4).
-
Experimentelles Beispiel 4: Studien zur
Tyrosinphosphorylierung des Insulinrezeptors in Gegenwart von LAR C/S
-
Um
aufzuklären,
ob die Tyrosinphosphorylierung des 85 kDa-Proteins durch eine Tyrosinkinaseaktivität des Insulinrezeptors
berührt
wird, wurden COS-7-Zellen erzeugt, die mit LAR C/S und IR WT oder
IR K1018M (IR MT) mit einer Defizienz in der Tyrosinkinase des Insulinrezeptors
cotransfiziert war. Nach 5-minütiger
Insulinstimulation der Zellen wurde eine Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen
die E-Untereinheit von LAR durchgeführt und Immunoblotting mit
dem Antiphosphotyrosinantikörper
wurde durchgeführt
(siehe 5). Die mit IR WT cotransfizierten Zellen zeigten
Tyrosinphosphorylierung einer β-Kette
des Insulinrezeptors und des 85 kDa-Proteins bei Insulinstimulation,
während
die mit IR K1018M cotransfizierten Zellen keinerlei solche Phosphorylierungen
zeigten.
-
Aus
diesen Ergebnissen ging hervor, dass die schnelle Tyrosinphosphorylierung
des Insulinrezeptors bei Bindung von Insulin an den Insulinrezeptor
erfolgt, und dass die Insulinrezeptortyrosinkinase zur Tyrosinphosphorylierung
des 85 kDa-Proteins führt.
-
Es
wurde daher spekuliert, dass das 85 kDa-Protein eine P-Untereinheit
von LAR war, für
die Bindung an einen Insulinrezeptor demonstriert worden war.
-
Beispiel 1: Erzeugung von Antikörpern gegen
eine intrazelluläre
Domäne
einer P-Untereinheit von LAR
-
Antikörper gegen
eine intrazelluläre
Domäne
von LAR wurden gemäß dem folgenden
Verfahren erzeugt.
-
A) Herstellung des Immunogens
-
Ein
Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase und LAR (GST-LAR) wurde
als Immunogen verwendet. E. coli AD202 wurde gemäß einem gebräuchlichen
Verfahren mit einem Expressionsvektor, dem pGEX-2T-Vektor (Pharmacia
Biotech Inc.), transformiert, in dessen Bam-HI/EcoRI-Schnittstellen eine cDNA eingefügt war,
die 607 Aminosäuren
entsprach, die von dem Ende einer Transmembranregion einer P-Untereinheit
von LAR zu der gesamten zytoplasmatischen Region aus (SEQ ID NO:
1.3467 bp) reichte. Nachdem die E. coli über Nacht in LB (Amp.+)-Agarmedium
(LB (Amp.+), wie unten beschrieben, enthaltend 7,5 g Agar) über Nacht
inkubiert worden waren, wurden 50 ml LB (Amp.+)-Medium (enthaltend
Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, NaCl 5 g/L, 5 N NaOH 0,2 ml/L
und Ampicillin 50 μg/ml)
mit einer Einzelkolonie inokuliert und über Nacht weiter inkubiert.
Dann wurden 500 ml LB (Amp.+)-Medium mit den E. coli inokuliert
und bei 37 °C
inkubiert, bis die Absorption bei 600 nm ungefähr 1,0 erreichte, gefolgt vom
Zusatz von 50 μl
1 M IPTG (Isopropyl-β-D(-)t-thiogalactopyranosid,
Wako Pure Chemical industries, Ltd.), und einer Inkubation bei 25 °C über Nacht.
Die so erhaltene Kultur wurde bei 3.000 rpm und 4 °C 15 Minuten
lang zentrifugiert, und die präzipitierten
Bakteriengebilde wurden in 50 ml NEIN (0,5 % Nonidet P-40, 1 mM
EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl) suspendiert. Danach wurde
die Suspension doppelt wiederholten Behandlungen mit Ultraschall über 1 Minute
hinweg und Inkubation auf Eis über
eine Minute hinweg unterzogen und dann 20 Minuten lang bei 14.000
rpm und 4 °C
zentrifugiert, um den Überstand
zu erhalten. Zu 10 ml des E. coli-Lysats wurden 100 μl einer Suspension
von Glutathion-Sepharose-Beads (Glutathione Sepharose 4B (Pharmacia
Biotech Inc.), hergestellt durch dreimaliges Waschen und sus pendiert
in 50 % NETN) zugesetzt, dann wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur
inkubiert. Die so erhaltene Suspension wurde 5 Minuten lang bei
3.000 rpm und 4 °C
zentrifugiert, und der Überstand
wurde entfernt. Die präzipitierten
Glutathion-Sepharose-Beads wurden zwei Mal mit NETN, dann ein Mal
mit PBS gewaschen, danach wurden 100 μl SDS-Probenpuffer (125 mM Tris-HCl
pH 6,8, 0,1 % Natriumlaurylsulfat, 5 % β-Mercaptoethanol) zugesetzt,
und sie wurden 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt,
um das GST-LAR-Fusionsprotein
zu eluieren. Das Eluat, aus dem die Beads entfernt worden waren,
wurde durch Zentrifugation unter Verwendung von Centricon-10 (Amicon)
bei 3.000 rpm und 4 °C über 45 Minuten
hinweg konzentriert.
-
Ein
ml PBS wurde dem Konzentrat zugesetzt, um die Lösung zu Puffern, und die Lösung wurde
erneut durch 45-minütige
Zentrifugation bei 3.000 rpm und 4 °C konzentriert. Dieses Pufferungsverfahren
wurde zwei Mal wiederholt, und die so erhaltene Lösung wurde
als Immunogenlösung
verwendet. Die Reinheit und Konzentration des Antigenproteins wurden
durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
bestätigt.
-
Unterdessen
wurde die Antigenlösung
für die
letzte Immunisierung durch ein anderes Verfahren hergestellt, da
sie intravenös
verabreicht werden sollte. Das Lysat der oben beschriebenen E. colis,
die das GST-LAR-Fusionsprotein exprimieren, wurde mit Glutathion-Sepharose-Beads inkubiert,
und nach der Zentrifugation wurden die präzipitierten Beads zwei Mal
mit NETN und drei Mal mit PBS gewaschen. Als nächstes wurde 100 μl GSH-Elutionspuffer
(20 mM Glutathion, 1 M Tris-HCl, pH 9,6) hinzugesetzt, und das Gemisch wurde
10 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur gerührt, um
die Elution von GST-LAR zu bewirken. Nach dreimaliger Wiederholung
der Schritte der 5-minütigen
Zentrifugation bei 3.000 rpm und 4 °C und Gewinnung des Überstandes
wurde das gesamte Eluat 2 Tage lang bei 4 °C gegen Kochsalzlösung dialysiert, dann
wurde die so erhaltene Lösung
als Immunogenlösung
für die
intravenöse
Verabreichung verwendet.
-
B)
Immunisierung
-
Acht
weibliche Balb/c-Mäuse,
6 Wochen alt, erhielten intraperitoneale Verabreichung von Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadekan,
Sigma Corporation), jeweils 0,5 ml pro Tier. 2 Wochen später wurde
die Antigenlösung
für die
intraperitoneale Immunisierung, die durch Mischen mit Freunds vollständigen Adjuvants (GIBCO)
in einem Verhältnis
von 1:1 emulgiert worden war, in einer Menge von ungefähr 10 μg GST-LAR
Fusionsprotein pro Maus intraperitoneal verabreicht. Danach wurde
die Antigenlösung
für die
intraperitoneale Immunisierung, die mit Freunds unvollständigem Adjuvants
(GIBCO) in einem Verhältnis
von 1:1 gemischt worden war, auf ungefähr 30–70 μg GST-LAR pro Maus eingestellt,
und das Gemisch wurde im Durchschnitt ein Mal alle 2 Wochen intraperitoneal
verabreicht. Am 4. Tag nach der vierten Immunisierung wurde Blut
aus der Augenhintergrundvene entnommen, und der Antikörpertiter
im Serum wurde durch das ELISA-Verfahren bestimmt.
-
C) ELISA
-
Proteinlösungen von
GST-LAR und GST allein, die durch ein ähnliches Verfahren wie die
Antigene zur intravenösen
Immunisierung hergestellt worden waren, wurden jeweils über Nacht
bei 4 °C
gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Diese Lösungen wurden auf 0,5 μg/ml in PBS
eingestellt und der Adsorption an eine ELISA-Platte (Falcon 3911
MicroTestTM Flexible Assay Plate) bei 50 μl/Napf innerhalb
von einer Stunde unterzogen. Nach fünfmaligem Waschen mit Waschpuffer
(PBS enthaltend 0,05 Tween 20) wurde eine Blockierung mit 5 % entrahmter
Milch (hergestellt durch Auflösen
von 2,5 g entrahmter Milch in 50 ml PBS) durchgeführt. Nach
dem Waschen wurde das Serum, wie in dem obigen Abschnitt B erhalten,
mit Verdünnungspuffer
(PBS enthaltend 0,25 % BSA) auf das 16.000-fache verdünnt, den
Näpfen
zu jeweils 50 μl/Napf
zugesetzt und dann eine Stunde lang in einem feuchten Kasten inkubiert.
Nach dem Waschen der Platte wurde 1.000-fach verdünnter meerrettichperoxidasemarkierter
Anti-Maus-IgG-Antikörper der
Platte mit 50 μl/Napf
zugesetzt und eine Stunde lang inkubiert. Nach viermaligem Waschen
mit Waschpuffer und einmaligem mit PBS wurde eine Substratlösung von
o-Phenylendiamin
(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), gelöst in einem Zitratpuffer (hergestellt
durch Lösen
von 5,6325 g Zitronensäure-Monohydrat
und 18,35 g Na2HPO4·12H2O in gereinigtem Wasser auf ein Gesamtvolumen
von 500 ml) mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu 50 μl/Napf zugesetzt,
30 Minuten lang reagieren gelassen, und dann wurden 50 μl an 10%-iger
H2SO4 zugesetzt,
um die Reaktion zu beenden. Fünfzig μl der Lösung wurden
in jeden Napf einer 96-Lochplatte (Sumitomo Bakelite Co., LTD.)
zur Messung übertragen,
und dann wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
-
D) Zellfusion
-
Zwei
Mäuse,
die laut den Ergebnissen des oben beschriebenen ELISA einen Anstieg
der Titer der Antikörper
gegen GST-LAR zeigten, wurden zum letzten Mal immunisiert, und die
Milz wurde am dritten Tag danach entnommen, um gemäß einem üblichen
Verfahren Splenozyten zu präparieren.
-
Zu
Zellfusionen verwendete Elternzellen waren aus Balb/c-Mäusen gewonnene
Myelomzellen vom Stamm NS1, zuvor selektiert in einem 20 μg/ml 8-Azaguanin
enthaltenden Medium und verifiziert als eine Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
(HGPRT)-defiziente Linie. Zellfusion, HAT-Selektion und Klonierung
wurden mit 2 × 107 NS1-Zellen und 1 × 108 Splenozyten
unter Verwendung eines ClonaCellTM-HY Hybridoma
Cloning Kit (StemCell Technologies Inc.) durchgeführt.
-
Das
Screening des Überstandes
aus der Kultur der klonierten Hybridome wurde gemäß dem in
Abschnitt C oben beschriebenen ELISA-Verfahren mit 50 μl des Hybridomkulturüberstands
unter Verwendung von Platten, an die 0,5 μg/ml Proteinlösung von
GST, GST-LAR oder GST-CD45 gebunden waren (Furukawa, T. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10928–10932, 1994), hergestellt
durch ein Verfahren ähnlich
dem zur Herstellung des Antigens zur intravenö sen Immunisierung wie oben
beschrieben, durchgeführt.
Bei diesem ELISA-Verfahren wurde ein Hybridom selektiert, das keine
Immunreaktion auf GST oder GST-CD45 beschichtete Näpfe zeigte,
sondern eine Immunreaktion nur auf die mit GST-LAR beschichteten
Näpfe zeigte.
Die Passagierung der klonierten Hybridome wurde mit RPMI 1640 Medium
(Nissui Pharmaceutical Co., LTD.), enthaltend 10 % fötales Kälberserum
(GIBCO), durchgeführt.
-
Indem
man auf diese Weise nach dem ELISA-Verfahren den Kulturüberstand
des HAT- selektierten Hydridoms
screente, konnte ein Klon YU1 mit Spezifität für die intrazelluläre Domäne von LAR
mit stabiler Antikörperproduktion
und Proliferationsfähigkeit
erhalten werden.
-
Diese
Hybridomzelllinie YU1 wurde am 7. Mai 1998 beim National Institute
of Bioscience und Human-Technology, Agency of Industrial Science
und Technology, 1-1-320, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, JAPAN, hinterlegt
und erhielt die Zugangsnummer FERM-BP-6343.
-
E) Typisierung des monoklonalen Antikörpers
-
0,5
ml des Überstands
aus einer Kultur des im obigen Abschnitt D erhaltenen Hybridoms
YU1 wurden mit 4,5 ml TBS-T verdünnt,
und der Isotyp wurde unter Verwendung eines Isotyping-Kit für monoklonale
Mäuseantikörper (Amersham
International plc) für
3 ml der verdünnten
Lösung
bestimmt. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass der Isotyp des Antikörpers IgG2bκ war.
-
F) Herstellung und Reinigung des monoklonalen
Antikörpers
-
6
Wochen alte Balb/c-Mäuse
erhielten eine intraperitoneale Verabreichung von Pristan von 0,5
ml/Tier, und nach 10 Tagen wurde die durch Klonierung in Abschnitt
D oben erhaltene Hybridomzelle YU1 intraperitoneal mit 2,5 × 106–1,3 × 107 Zellen pro 0,5 ml/Tier injiziert. Ungefähr 10 Tage
später
wurde abdominale Hypertrophie beobachtet, und dementsprechend wurde
Ascitesflüssigkeit
mehrfach unter Verwendung einer 20-Gauge-Injektionsnadel gewonnen.
Die so gewonnene Ascitesflüssigkeit
wurde 5 Minuten lang bei 1.000 rpm und 4 °C zentrifugiert, um Überstand
und Präzipitat
voneinander zu trennen. Der Überstand
wurde 30 Minuten lang bei 37 °C
inkubiert und über
Nacht bei 4 °C
gelagert. Nach 10-minütiger
Zentrifugation bei 12.000 rpm und 4 °C wurde der monoklonale Antikörper YU1
unter Verwendung einer HiTrap Protein-G-Affinitätssäule (Pharmacia Biotech Inc.)
aus den erhaltenen 1,5 ml Überstand
gereinigt. Die Konzentration des Antikörpers wurde anhand des molekularen
Extinktionskoeffizienten von Mäuse-IgG
berechnet, basierend auf der bei 280 nm gemessenen Absorption der
so erhaltenen Antikörperlösung.
-
Weiterhin
wurde das Molekulargewicht des monoklonalen Antikörpers YU1
anhand der Mobilität
in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese abgeschätzt. Die
Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Wie aus 6 zu
erkennen ist, umfasst der monoklonale Antikörper YU1 H-Ketten von ungefähr 50 kDa und L-Ketten von ungefähr 25 kDa
und hat ein Gesamtmolekulargewicht von 150 kDa.
-
Beispiel 2: Untersuchungen zur Spezifität des monoklonalen
Antikörpers
-
Ein
Expressionsvektor für
LAR WT wurde gemäß den in
Beispiel 1, Abschnitten A und B, beschriebenen Verfahren in COS-7-Zellen
transfiziert. Nach Immunpräzipitation
des Zelllysats mit dem in Beispiel 1 erhaltenen gereinigten monoklonalen
Antikörper
wurde ein Immunoblotting durchgeführt. Als Kontrolle für die Immunpräzipitation
wurden MOPC 21 für
die zur IgG1-Subklasse
gehörenden
Antikörper
(der Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR, oben, und ein Antikörper gegen
CD45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., 35-Z6)) oder Mäuse-IgG2bκ (MOPC 195,
CAPPEL) für
den monoklonalen Antikörper
YU1 verwendet.
-
Laut
den Analysen unter Verwendung des forcierten Expressionssystems
für LAR
in COS-7-Zellen erkannte der monoklonale Antikörper YU1 ein Protein von 85
kDa, das einer P-Untereinheit
von LAR entsprach, und ein Protein von ungefähr 200 kDa, das einem Vorläufer entsprach,
nach Immunpräzipitation
mit dem Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR (siehe 76).
-
Weiterhin
war beim Immunoblotting mit einem Antikörper, der eine E-Untereinheit
von LAR nach Immunpräzipitation
eines Extrakts von mit LAR transfizierten COS-7-Zellen unter Verwendung
dieser Antikörper (IgG1,
IgG2b oder YU1) erkennt, die Detektion eines Proteins von 150 kDa,
das der E-Untereinheit von LAR, und eines von ungefähr 200 kDa,
das einem Vorläufer
entspricht, nur auf den mit dem Antikörper YU1 immunpräzipitiertem
beschränkt
(siehe 7A). Aus den genannten Ergebnissen
wurde erkannt, dass der monoklonale Antikörper YU1 zur Immunpräzipitation
und zum Immunoblotting einer P-Untereinheit von LAR verwendet werden
konnte.
-
Beispiel 3: Phosphorylierung von LAR durch
die Insulinrezeptortyrosinkinase
-
Das
experimentelle Beispiel 4 ließ eine
Möglichkeit
vermuten, dass eine tyrosinphosphorylierte Bande von 85 kDa, die
bei Cotransfektion von LAR und dem Insulinrezeptor detektiert wurde,
eine P-Untereinheit von LAR sein kann.
-
Unter
Verwendung des monoklonalen Antikörpers YU1, der in Beispiel
1 hergestellt wurde, wurden Untersuchungen durchgeführt, ob
das 85-kDa-Protein, dessen Tyrosin von der Insulinrezeptortyrosinkinase phosphoryliert
wurde, eine P-Untereinheit von LAR war, nach einem ähnlichen
Verfahren wie dem in Beispiel 1 beschriebenen.
-
Ein
Zelllysat aus nach Cotransfektion von LAR WT oder LAR CS mit IR
1 Minute lang mit Insulin stimulierten COS-7-Zellen wurde mit dem
Antikörper
gegen die E-Untereinheit von LAR immunpräzipitiert und dann mit einem
Gemisch des Antikörpers
gegen die E-Untereinheit von LAR und dem Antikörper YU1 einem Immunoblotting
unterzogen, wodurch ein Vorläufer
von LAR und jede Untereinheit detektiert wurden.
-
Eine
zweite Sondierung dieses Blots mit dem Antiphosphotyrosinantikörper zeigte
eine Übereinstimmung
der tyrosinphosphorylierten Bande von 85 kDa mit einer Bande einer
P-Untereinheit von
LAR (siehe 8). Diese Ergebnisse zeigen,
dass LAR eines der Substrate des Insulinrezeptors ist.
-
Weiterhin
wurde angenommen, dass LAR Autodephosphorylierung betreibt, da die
Tyrosinphosphorylierung einer P-Untereinheit von LAR bei den LAR
WT Cotransfektanten nicht detektiert wurde (siehe 3).
-
Wie
in 9 dargestellt, wird die Tyrosinkinaseaktivität durch
Autophosphorylierung der β-Kette
des Insulinrezeptors erhöht,
wenn Insulin an eine α-Kette
des Insulinrezeptors bindet. Diese Aktivität der Tyrosinkinase führt letztlich
zum Eintreten von Insulinwirkungen wie z. B. Glukoseaufnahme, Glukosemetabolismus und
Zellproliferation. Es wurde gezeigt, dass der aktivierte Insulinrezeptor
durch die Tyrosindephosphorylierung durch LAR in einen inaktiven
Zustand zurückkehrt.
-
Weiterhin
wurde gezeigt, dass die Insulinrezeptorkinase das Tyrosin einer
intrazellulären
Domäne
von LAR phosphoryliert, und es wurde angenommen, dass die Phosphorylierung
an der Bestimmung der Substratspezifität der intrazellulären Domäne von LAR
oder der Steigerung der Phosphataseaktivität beteiligt ist. Überdies
wird angenommen, dass LAR seine enzymatische Aktivität durch
Autodephosphorylierung des phosphorylierten Tyrosins kontrolliert.
-
Aus
den oben dargestellten Ergebnissen konnte auf dem molekularen Niveau
die Möglichkeit
dargestellt werden, dass eine Stimulation der enzymatischen Aktivität von LAR
für die
Insulinresistenz verantwortlich sein kann.
-
Beispiel 4: Gewebsverteilung von LAR bei
der Maus
-
Zu
einem Gramm von jedem der Organe, die sieben Wochen alten männlichen
C57BL/6-Mäusen
entnommen worden waren, wurden 3 ml an kaltem Zelllysispuffer (der
gleiche wie im experimentellen Beispiel 1, Abschnitt C beschrieben)
zugesetzt, gefolgt von Homogenisation auf Eis und 30-minütiger Inkubation
auf Eis. Nach 20-minütiger
Zentrifugation bei 4 °C
und 15.000 g wurde der Überstand
gewonnen, unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen zusätzlich erhaltener Überstand
wurde gewonnen, dann wurde der gesamte Überstand als Gewebeprobe verwendet.
Die Proteinbestimmung erfolgte gemäß einem Handbuch des DC Protein
Assay (Bio-Rad).
-
Jeder
so erhaltene Überstand
(entsprechend 0,2 mg Protein) wurde elektrophoretisch aufgetrennt,
gefolgt von Immunoblotting mit YU1 gemäß einem im experimentellen
Beispiel 1, E, beschriebenen Verfahren.
-
Die
Ergebnisse des Immunoblottings sind in 14 dargestellt.
YU1 kann auch Mäuse-LAR erkennen, wodurch
Expression in Thymus und Gehirn identifiziert werden konnte. Auch
in Nieren und Leber konnte eine geringe Expression gefunden werden.
-
Beispiel 5: Immunhistochemische Färbung von
Thyroidkarzinomgewebeschnitten mit YU1
-
Thyroidgewebe
wurde in einer 10 %igen, mit neutralem Phosphat gepufferten Formaldehydlösung fixiert
und zur Herstellung eines Präparats
auf einem Objektträger
in einem Paraffinblock eingebettet. Die detaillierte Vorgehensweise
ist nachfolgend beschrieben.
-
1) Entfernung des Paraffins
-
Der
fixierte Paraffinblock des Gewebeschnitts wurde zwei Mal fünf Minuten
lang in 100 % Xylol eingetaucht, und dann jeweils über einen
Zeitraum von 3 Minuten nacheinander in 100 % Ethanol, 90 % Ethanol
und 70 % Ethanol eingetaucht. Schließlich wurde der Schnitt in
10 mM Citratpuffer (pH 6,0) eingetaucht. Zur Exposition antigener
Determinanten in diesem Zustand wurde das Präparat einer 5-minütigen Autoklavenbehandlung
bei 100 °C
unterzogen.
-
2) Immunfärbung
-
Der
Schnitt wurde mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) enthaltend 0,15
M NaCl (Trislösung)
gewaschen und dann in diese Trislösung eingetaucht. Danach wurde
die Flüssigkeit
von dem Objektträgerglas
abgewischt, dann wurde 3 %ige wässrige
Wasserstoffperoxidlösung
auf den Schnitt geträufelt,
und man ließ ihn
3 Minuten stehen, um endogene Peroxidase zu eliminieren.
-
Nach
genügendem
Waschen mit Wasser und weiterem genügenden Waschen mit Trislösung wurde die überschüssige Flüssigkeit
abgewischt, und der Schnitt wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6)-Lösung, enthaltend
ein Trägerprotein
(2 % BSA), 0,015 M Natriumazid und 0,15 M NaCl 15 Minuten lang eingetaucht, um
Blockierungen zu bewirken.
-
Als
nächstes
wurde, nachdem die überschüssige Flüssigkeit
ohne Waschen abgewischt worden war, der Primärantikörper YU1 (1000-fache Verdünnung der
Stammlösung)
dem Schnitt zugegeben und 90 Minuten lang in einem feuchtem Kasten
inkubiert.
-
Der
Gewebsschnitt wurde dann genügend
mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,15 M NaCl, gewaschen
und der Zweitantikörper
(Anti-Maus-Immunglobulin biotinyliert) wurde zugesetzt, gefolgt
von 45-minütiger
Inkubation.
-
Danach
wurde der Schnitt genügend
mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) enthaltend 0,15 M NaCl, gewaschen,
man träufelte
Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase darauf und ließ ihn 25
Minuten lang stehen.
-
Als
nächstes
wurde nach genügendem
Waschen des Schnittes mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,15 M NaCl,
dann 0,05 % DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid)-Lösung in
50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), enthaltend 0,02 % Wasserstoffperoxid
und 0,15 M NaCl zugesetzt, gefolgt von Überprüfung der Farbentwicklung unter
dem Mikroskop, und dann wurde die Reaktion durch Eintauchen des
Objektträgers
in Wasser beendet.
-
Nach
Beendigung der Reaktion wurde die Probe 5–10 Sekunden lang zur Gegenfärbung in
Mayers Hämatoxylin
getränkt.
Danach wurden nach Waschung des Präparats mit Wasser und zwei
Mal 1-minütiges Tränken in
100 %-igem Ethanol als nächstes
zweimaliges 1-minütiges Tränken in
100 % Xylol, die Einbettung in Malinol und die Begutachtung durchgeführt.
-
Bei
diesen Experimenten waren die Blockierungs-, Zweitantikörper- und
Streptavidin-Peroxidase-Lösungen aus
dem von DAKO Japan Co. Ltd., (Kyoto) erhältlichen LSAB-Kit, und DAB
war ein von Dojindo (Kumamoto) kommerziell erhältliches Reagens, Malinol war
von Muto Pure Chemicals Ltd., (Tokyo) und das verwendete Mayers
Hämatoxylin
wurde von dem gegenwärtigen
Erfinder hergestellt.
-
Die
so erhaltene immunhistochemische Färbung von Thyroidkarzinomzellen
ist in den 11–13 dargestellt.
Diese Figuren zeigen eine selektive Reaktivität des YU1-Antikörpers mit tumorösen Thyroidgewebszellen
(braun eingefärbter
Teil), ohne jegliche Reaktion mit normalen follikulären Zellen
und dem Stroms des Tumorgewebes (blau eingefärbter Teil).
-
Demgemäß wurde
bewiesen, dass eine Diagnose von Thyroidkarzinom unter Verwendung
von immunhistochemischer Färbung
mit dem vorliegenden Antikörper
durchgeführt
werden kann, und dass der vorliegende Antikörper auch in einem DDS-System,
das Antikrebsmittel (Chemotherapeutika) enthält, verwendbar sein kann.
-
Beispiel 6: Immunhistochemische Färbung anderer
gutartiger Tumorzellen und Karzinomzellen
-
In
einem Verfahren ähnlich
dem vom Beispiel 5 wurde die Immunfärbung verschiedener gutartiger
Tumoren und Krebsgewebezellen (aus Menschen gewonnen), in Tabelle
1 unten dargestellt, untersucht.
-
Als
positives Ergebnis wurde das Auftreten von Färbung aufgrund einer Reaktivität mit dem
YU1-Antikörper
bewertet, und jeder positive Fall ist in Tabelle 1 unten dargestellt. Tabelle 1
| Tumor | Anzahl
der Fälle | Anzahl
der positiven Fälle | Prozentsatz
Positive |
Gutartig | Meningiom | 10 | 0 | 0 |
Gliom | 13 | 1 | 7,7 |
Thyroidadenom | 10 | 0 | 0 |
Bösartig | Thyroidkarzinom | 21 | 21 | 100 |
Magenkarzinom | 16 | 1 | 6,3 |
Colonkarzinom | 26 | 13 | 50 |
Lungenkarzinom | 20 | 2 | 10 |
Brustkarzinom | 20 | 3 | 15 |
Leberkarzinom | 8 | 0 | 0 |
Nierenkarzinom | 21 | 0 | 0 |
Prostatakarzinom | 32 | 2 | 6,3 |
-
Demgemäß wurde
offensichtlich gezeigt, dass die Erkennungsrate bei Thyroidkarzinomen
100 % betrug, während
im Gegenteil hierzu gutartige Tumoren und Karzinome, die von anderen
Organen abstammten, eine geringere oder gar keine Erkennungsrate
zeigten. Obwohl im Vergleich ein Colonkarzinom eine höhere Erkennungsrate
gezeigt wurde, war die von Colonkarzinomzellen gezeigte positive
Färbung
erheblich von der des Thyroidkarzinoms verschieden, so dass eine
spezifische Immunreaktivität
von YU1 mit Thyroidkarzinomzellen vorgeschlagen wurde, mit denen
eine bemerkenswerte Färbung
beobachtet wurde.
-
Beispiel 7: Spezifische Immunreaktion
von Thyroidkarzinomen mit YU1:
-
Untersuchungen
zur Machbarkeit der Verwendung von Immunoassays Zu einem Gramm menschlicher
Thyroidkarzinom- und Normalgewebe, die in Beispiel 5 verwendet wurden,
wurden 3 ml an kalten Zelllysispuffer (oben in Beispiel 5 beschrieben)
zugesetzt und unter Verwendung eines Polytrons homogenisiert, danach
wurde das Homogenisat 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach 20-minütiger Zentrifugation
bei 4 °C
und 15.000 g wurde der Überstand
gewonnen, unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen zusätzlich erhaltener Überstand
wurde gewonnen, dann wurde der gesamte Überstand als Gewebeprobe verwendet.
Die Proteinbestimmung erfolgte gemäß einem Handbuch des DC Protein
Assay (Bio-Rad).
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Der
so erhaltene Überstand
(entsprechend 1 mg Protein) oder Immunpräzipitate von mit LAR transfizierten
COS-7-Zellen unter Verwendung des Antikörpers gegen LAR als Positivkontrolle
(gemäß den in
Beispiel 1A–C
beschriebenen Verfahren hergestellt) wurden elektrophoretisch aufgetrennt,
gefolgt von Immunoblotting mit YU1 gemäß einem im experimentellen
Beispiel 1, Sektion E beschriebenen Verfahren. Zur Detektion wurden
Immuno Star-Reagenzien (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) verwendet.
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Die
in diesen Experimenten erhaltenen Ergebnisse sind in 14 dargestellt.
Wie aus 14 hervorgeht, war es evident,
dass YU1 spezifisch das Thyroidkrebsgewebe, verschieden von den
normalen Thyroidgeweben, erkennt. Demgemäß wurde bewiesen, dass durch
eine Aspirationsbiopsie des Thyroids erhaltene Gewebeproben zur
Diagnose von Thyroidkrebs verwendet werden konnten.
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Die
erfindungsgemäßen Antikörper gegen
eine LAR-Phosphatase-Untereinheit können spezifisch eine intrazelluläre Domäne von LAR
mit Phosphataseaktivität
erkennen. Daher können
die Antikörper äußerst nützliche
Werkzeuge zur Aufklärung
von Signaltransduktionsmechanismen von Insulin und zur Identifikation und
Isolation von LAR-Modulatoren, Bindungsproteinen und dergleichen
sein. Weiterhin können
die Antikörper zur
Entwicklung nützlicher
diagnostischer Verfahren für
Insulinresistenz und NIDDM, zur Prophylaxe und Diagnose verschiedener
Krankheitsbilder des auf Insulinresistenz basierenden Syndroms X,
und zur Prophylaxe und Diagnose des Eintretens von Arteriosklerose
und Herzkrankheiten verwendet werden.
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Weiterhin
sind die erfindungsgemäßen Antikörper, da
sie spezifische Immunreaktivitäten
mit Thyroidkarzinom haben, zur Diagnose von Thyroidkarzinom unter
Verwendung von Aspirationszytologie und Biopsie und in pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die DDS für
Thyroidkarzinomtherapie verwenden, verwendbar, während sie in molekularbiologischen
Studien betreffend die Transkription von LAR-Molekülen in Thyroidkarzinomzellen
und Regulationsfaktoren der Expression auf dem Translationsniveau
hilfreich sein können.
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