JP4752068B2 - 哺乳動物における新規トランスポータータンパク質およびその利用 - Google Patents
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Description
Pritchard, J. B. and Miller, D. S. (1993) Physiol. Rev.: 73, 765-96 Ullrich, K. J. (1994) Biochim. Biophys. Acta: 1197, 45-62 Oude Elferink, R. P., et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta: 1241, 215-68 Koepsell, H. (1998) Annu. Rev. Physiol.: 60, 243-66 Inui, K. I. Et al., (2000) Kidney Int.: 58, 944-58 Wright, S. H. and Dantzler, W. H. (2004) Physiol. Rev.: 84, 987-1049 Koepsell, H. (2004) Trends Pharmacol. Sci.: 25, 375-81 Brown, M. H. et al. (1999) Mol. Microbiol.: 31, 394-5 Putman, M. et al. (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev.: 64, 672-93 Hvorup, R. N. et al. (2003) Eur. J. Biochem.: 270, 799-813 Genbankアクセッション番号AK001709 Ito, W. et al. (1991) Gene: 1002, 67-70 Morimoto, R. et al. (2003) J. Neurochem.84: 382-91 Tamai, I. Et al. (1997) FEBS Lett.: 419, 107-11 Morita, Y. et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother.: 42, 1778-82 Smith, A. C. et al. (1986) Am. J. Med. Genet.: 24, 393-414 Bi, W. et al. (2002) Genome Res.: 12, 713-28
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列の1個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;または
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列と少なくとも80%同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列の1個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド;
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;または
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列と少なくとも80%同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
・配列番号2、4、6、8または22に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
・配列番号2、4、6、8または22に示されるアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
・配列番号2、4、6、8または22に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
・配列番号2、4、6、8または22に示されるアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
本発明者らは、細菌において見出された毒物排出トランスポーターのオルソログが哺乳動物において存在することを見出し、そのcDNAを単離し、その機能を解析した。
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列の1個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列と少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%または99%同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
〔2−1〕ベクター
本発明は、MATEポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
本発明は、MATEポリペプチドを含有する脂質膜を提供する。本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂質膜であっても、人工の脂質膜であってもよい。本発明に係る脂質膜が天然由来である場合は、細胞膜または膜小胞であればよく、本発明に係る脂質膜が人工である場合は、脂質平面膜またはリポソーム(リポソーム組成物)であればよい。
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、MATEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体の形質膜であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、MATEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された細胞から得られる膜小胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「膜小胞」は、超音波処理などに供されて破壊された細胞の形質膜が形成する、より小さな小胞が意図される。
MATEポリペプチドは種々の有機カチオン(OC)を輸送するトランスポーターである。本発明者らは、これまでに、放射標識した基質を用いて、MATEポリペプチドを発現させたHEK293細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞の系で、MATEポリペプチドによってどのような物質が輸送されるのか調べた。このような発現細胞を用いる系では、MATEポリペプチド以外に細胞由来の多数のタンパク質が共存した条件下にて測定を行うが、共存する多数のタンパク質による干渉は、特に性ホルモンなどの疎水性の高い輸送基質を用いる場合に特に問題になる。すなわち、疎水性の高い輸送基質について信頼性の高い測定を行うためには、MATEポリペプチド以外のタンパク質が存在しない系を用いることが好ましい。
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、MATEポリペプチドを含有している脂質平面膜であり得る。脂質二重層は、極性脂質(特にリン脂質)が二層となった膜状の構造である。脂質二重層構造が二次元構造として安定化するのは球状であるが、末端を水分子から隔離すれば平面構造になり得る。本明細書中で使用される場合、人工的に作製される脂質二重層のうち球状のものをリポソーム、平面状のものを脂質平面膜という。
上述したように、本発明に係るベクターを使用すれば、MATEポリヌクレオチドを導入した生物または細胞にてMATEポリペプチドを発現させることができる。細胞膜は、形質転換体として、または形質転換体の一部として供給されるので、本発明に係るベクターを用いれば、MATEポリペプチドを含有する天然由来の脂質膜を得ることができる。また、人工の脂質膜を得るためには、上述したベクターを用いて作製した精製MATEポリペプチド(発現系であっても無細胞系であってもよい。)を用いればよい。
本発明は、上記脂質膜の利用をさらに提供する。本明細書中、形質転換体またはリポソーム組成物を例に挙げて、脂質膜の利用を説明するが、本発明に係る脂質膜の利用はこれらに限定されない。
MATE1ポリペプチドをHEK293細胞に発現させると、テトラエチルアンモニウム(TEA)および1−メチル−4−フェニルピリジニウム(MPP)のH+依存的な輸送が生じた。MATE1の基質特異性は、腎臓または肝臓に存在するH+依存性有機カチオン輸送体と類似していた。このように、MATE1は、長期にわたって探索されてきた、有機カチオン(OC)を直接尿中または胆汁中に排泄する多機能なOC輸送体であることが明らかになった。
実施例にて詳述するように、MATE1ポリペプチドをHEK293細胞に発現させると、テトラエチルアンモニウム(TEA)および1−メチル−4−フェニルピリジニウム(MPP)のH+依存的な輸送が生じた。また、MATE1ポリペプチドを含有しているリポソーム組成物において、テトラエチルアンモニウム(TEA)のH+依存的な輸送が確認された。MATE1の基質特異性は、腎臓または肝臓に存在するH+依存性有機カチオン輸送体と類似していた。このように、MATE1は、長期にわたって探索されてきた、有機カチオン(OC)を直接尿中または胆汁中に排泄する多機能なOC輸送体であることが明らかになった。
本発明は、配列番号1、3、5、7または21に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、MATEポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明に係る抗体は、hMATE1ポリペプチドまたはmMATE1ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。本実施形態に係る抗体は、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなるペプチド抗原または配列番号20に示されるアミノ酸配列からなるペプチド抗原によって惹起されることが好ましいが、抗体の生成方法としてはこれに限定されない。
ノックアウト動物は、特定の遺伝子を破壊することによって得られた遺伝子欠損動物である。ノックアウト動物(特にマウス)は、全能性を有する胚性幹細胞(ES細胞)において遺伝子破壊を行い、標的遺伝子破壊を起こしたES細胞を選抜し、その細胞とマウス胚を用いてキメラ個体を作製し、ES細胞に由来する生殖細胞を有するキメラ個体から二世代以上の交配によって標的破壊遺伝子をホモで有する個体として作出される。ノックアウト動物は、新しい実験動物、特に疾患モデル動物の作出に非常に有効な技術である。
〔1−1.cDNAのクローニング〕
ヒトMATE1(hMATE1:アクセッション番号NP−060712)のcDNAをヒト脳より抽出した総RNAからRT−PCRによりクローニングした。逆転写反応後に、cDNA溶液を10倍希釈して、0.6mM dNTPs(150μMの各dNTP)、および25pmolのプライマー対、1.5ユニットのAmpli Taq polymerase(PerkinElmer)を含むPCR緩衝液中に添加した。PCR増幅を以下に従って行った:94℃で30秒間の変性、56℃で30秒間のアニーリング、72℃で1分間の伸長。増幅産物(1804塩基対)をアガロースゲル電気泳動にて解析した。なお、プライマーを、Genbankアクセッション番号AK001709に基づいて作製した(センスプライマー:5’−ggccggtacccgcgagtcacatggaagctc−3’;アンチセンスプライマー:5’−cacttctagacctgtgaattgtgtgtaagc−3’)。増幅したDNA断片を制限酵素(KpnIおよびXbaI)で消化して、pBluescriptKS(+)に挿入した。ヒトMATE1の遺伝子配列をヒトゲノム配列と比較して、エラーがないことを確認した。
非特許文献12の方法に従って、オリゴヌクレオチドプライマー(5’−ggcccaccactgcatgcacagcatgagc−3’)を用いて、ヒトMATE1に点変異(E273Q)を導入した。
ヒトおよびマウスの多組織ノーザンブロット(MTN)をClontechより購入した。PCR増幅して得たヒトMATE1のN末端領域(nt10〜601;592bp)、ヒトMATE2のC末端領域(nt1412〜1712;301bp)、マウスMATE1のC末端領域(nt1336〜1599;264bp)およびマウスMATE2のC末端領域(nt1087〜1648;562bp)を、DNA labeling kit(Boehringer Mannheim)を用いて32P−dCTPで標識し、ノーザンブロットのプローブに用いた。ハイブリダイゼーションを、Express Hyb hybridization buffer(Clontech)を用いて68℃にて1時間行い、50℃にて洗浄した。
ヒトMATE1のアミノ酸461〜546位またはマウスMATE1のアミノ酸P495〜Q532をGSTと融合させたGST融合タンパク質を抗原に用いて、ヒトMATE1またはマウスMATE1に特異的なウサギポリクローナル抗体を作製した。
ヒト組織サンプルをコスモバイオより購入した。マウス組織1gから膜画分を調製した。各組織を、20mM MOPS−Tris(pH7.0)、0.3M sucrose、5mM EDTAおよびタンパク質分解酵素阻害剤(pepstatin A、leupeptin、antipainおよびchymostatinを各10μg/ml)からなる緩衝液中に懸濁した後、ホモジナイズした。核を除去した後、100,000×gで1時間遠心分離した。上清を除去し、沈殿を上記緩衝液中に懸濁した。1% SDSおよび10% β−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えた後、ヒト膜画分(100μg)およびマウス膜画分(200μg)を電気泳動用サンプルとして用いた。ウエスタンブロッティングを定法(非特許文献13を参照のこと)に従って行った。
ヒトパラフィン組織切片をBiochain社より購入した。免疫組織化学解析を、HRP−DAB法または間接蛍光抗体顕微鏡法を用いて、非特許文献13に従って行った。1000倍希釈または1μg/mlの1次抗体を用いて、1次抗体反応を、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)中にて室温で1時間行った。サンプルを、Olymupus BX60顕微鏡またはOlympus FV300共焦点レーザ顕微鏡を用いて解析した。
金コロイド銀増感電子顕微鏡法を、非特許文献13に従って行った。エーテルにて麻酔したマウスを、心臓から生理食塩水を灌流し、次いで、4%パラホルムアルデヒドを溶解した0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)を還流した。腎臓を単離してPBSで洗浄した。30%ショ糖を含むPBS溶液を浸透させた組織を切片化(6mm厚)し、シラン化したスライドグラス上に配置して、OTC化合物(Sakura FineTek)中に包埋した。切片を、0.25%サポニンおよび5% BSAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中にて30分間インキュベートし、次いで、0.005%サポニン、10% BSA、10%ヤギ血清、および0.1% cold water fish gelatin(Sigma)を含むブロッキング溶液を用いてブロッキングした。次いで、切片を、ブロッキング溶液で1000倍希釈したウサギ抗マウスMATE1抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。0.005%サポニンを含む緩衝液で十分洗浄した後、切片を、ヤギ抗ウサギIgG金コロイド(金粒子の直径は1.4mm)を含むブロッキング溶液中で2時間インキュベートし、緩衝液で6回洗浄し、次いで、1%グルタルアルデヒドを用いて10分間固定した。さらに洗浄した後、切片を、銀増感キット(HQ silver Nanoprobes)を室温で5分間処理し、次いで、0.5% 4酸化オスミウムを用いて90分間固定した。超薄切片を、酢酸ウランおよびクエン酸鉛にて2重染色し、Hitachi H−7100電子顕微鏡にて解析した。
HEK293細胞を、非特許文献14に従って、10%ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中、5% CO2にて、37℃で培養した。ヒトMATE1またはマウスMATE1をコードするcDNAを、発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングして得たpcDNA3.1/hMATE1プラスミドを、TransIT試薬(Mirus)を用いて、培養24時間後のHEK293細胞にトランスフェクトした(細胞数:1.5×106細胞/10cm dish)。2日間培養した細胞を回収し、125mM塩化ナトリウム、4.8mM塩化カリウム、5.6mM D−グルコース、1.2mM塩化カルシウム、1.2mMリン酸二水素カリウム、1.2mM硫酸マグネシウムおよび25mMトリシンからなる活性測定用緩衝液(pH8.0)中に懸濁した。細胞を37℃で5分間インキュベートし、50μMのRI標識化TEA(5kBq/アッセイ)(PerkinElmer Life Science,Inc.)を添加して、輸送活性の測定を開始した。所定の時点で活性測定反応液を200μlずつ回収し、0.45μmのHAメンブレンフィルター(Millipore)を用いて濾過し、フィルター上に残存する放射活性を測定した。
pH8.0における活性測定には、125mM塩化ナトリウム、4.8mM塩化カリウム、5.6mM D−グルコース、1.2mM塩化カルシウム、1.2mMリン酸二水素カリウム、1.2mM硫酸マグネシウムおよび25mMトリシンからなる緩衝液を用いた。また、pH7.0における活性測定には、125mM塩化ナトリウム、4.8mM塩化カリウム、5.6mM D−グルコース、1.2mM塩化カルシウム、1.2mMリン酸二水素カリウム、1.2mM硫酸マグネシウムおよび25mM MOPS−NaOHからなる緩衝液を用いた。
Moriyama Yら、J.Biol.Chem.266,22141−22146(1991)に記載の手順に従って、プロトンポンプであるF0F1タンパク質を調製した。
〔2−1.遺伝子構造およびヒトMATE1の発現〕
バクテリアにおける多剤排泄輸送体であるMATEファミリーの哺乳動物における類似体をデータベース上で検索した結果、MATEファミリー類似体をコードする遺伝子がヒト第17染色体上に3つ並んで存在することを見出し、これらをhMATE1(アクセッション番号NP−060712)、hMATE2(アクセッション番号NP−690872)およびhMATE3と命名した(図1)。なお、MATE3遺伝子は新規遺伝子であった。
本発明者らは、ヒトMATE1がタンパク質レベルでのH+依存性OC輸送体であると考え、その発現および局在を調べた。ヒトMATE1のC末端ペプチドに対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、ヒト腎臓膜画分において、推定の分子量サイズに等しい62kDaのバンドを検出した(図4(b))。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)−DAB染色による免疫組織化学の結果、ヒトMATE1タンパク質は、腎臓の近位尿細管および遠位尿細管の表皮細胞部位に発現されており(図4(c))、特に、肝細胞の胆管部位に発現されていることがわかった(図4(d))。
マウスにおけるMATEファミリー類似体を取得して、哺乳動物におけるMATEファミリーの解析をさらに行った。マウスMATEファミリー類似体をコードする遺伝子は、マウス第11染色体上に2つ並んで存在することを見出し、これらをmMATE1(アクセッション番号AAH31436)およびmMATE2(アクセッション番号XP_354611)と命名した(図5)。これらの推定のアミノ酸配列はヒトMATE1に対してそれぞれ78.1%および38.1%の相同性を有した(図6)。
MATE1がプロトン共役のOC交換輸送活性を有するか否かを明らかにするために、ヒトMATE1を発現させたHEK293細胞において生体膜を介するOCのpH依存的な輸送を解析した。本方法に従えば、管腔におけるOC輸送を古典的な細胞取り込み活性として解析し得る(非特許文献14を参照のこと)。ヒトMATE1を発現した細胞は、プロトン共役性のOC輸送体に典型的な基質であるTEAに対して、時間依存的な輸送活性を示した(図9(a)、および(b))。野生型MATE1を発現する細胞において、輸送活性は飽和し、TEAに対するKm値は220μMであった(図9(c))。また、野生型MATE1を発現する細胞において、輸送活性はpH依存性を示し、pH6.0では活性が低く、pHが高くなるにつれて活性が増加し、pH8.0〜8.5において活性は最大であった(図9(d))。しかし、図9(e)に示すように、この輸送活性にはナトリウムイオンは必要ではなかった。すなわち、65mMの塩化カリウム存在下で5μMのバリノマイシンを添加することにより膜の脱分極を引き起こしても、TEA取り込み活性に影響はなかった。また、塩化アンモニウムによってTEA取り込み活性は60%阻害された。さらに、プロトンコンダクターであるSF6847(10μM)、または塩化カリウム存在下でのナイジェリシン(5μM)によりpH勾配を消滅させると、TEA取り込み活性は大きく減少した(図9(e))。
hMATE1またはmMATE1を発現させたHEK293細胞を用いて、表中の化合物を示した濃度で存在させた場合と存在させなかった場合において、50μMのRI標識化テトラエチルアンモニウム(TEA)の取り込みをpH8.0にて解析した(表1)。
〔3−1.hMATE1発現用バキュロウイルスの作製〕
5’末端にCACCの4塩基対を付加したhMATE1 cDNAをTOPOベクターと混合し、これらをヒートショック法にてコンピテントセル(DH5α)に導入した。hMATE1を組み込んだプラスミドpENTER−hMATE1をカナマイシンにより選択し、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)にて回収した。このプラスミド中のhMATE1 cDNAを、LRリコンビナーゼ(INVITROGEN)を用いて、発現ベクターpDEST10(INVITROGEN)に組み換えた。得られたプラスミドを、アンピシリン培地上で選択し、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)にて回収した。このプラスミドを用いて形質転換したDH10Bac(INVITROGEN)を、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)培地上で選択した。DH10Bac細胞はバキュロウイルスのゲノムDNAを有しており、pDEST10上に導入されたcDNAはトランスポゾンによって自動的にウイルスゲノム上に組み換えられる。その結果、ウイルスゲノム上のガラクトシダーゼ遺伝子が破壊され、精製されるコロニーは白くなる。この培地上の白いコロニーからバックミド(組換えウイルスゲノムDNA)を、以下の手順に従うミニプレップ法によって回収した。
21枚の1×107細胞/dishで培養したHi−Five cell(Invitrogen)に、hMATE1発現用ウイルスをMOI=1にて感染させた。感染細胞を、27℃で48時間インキュベートした後に回収した。回収した細胞を、100mM酢酸ナトリウム、10%グリセロール、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlペプスタチンAを含有する20mM Tris−Cl(pH8.0)10mlに懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、同一の緩衝液10mlに再度懸濁した。同じ操作を繰り返した(2回洗浄)。その後、同じ緩衝液10mlに懸濁した細胞を、超音波発生装置(TOMY UD200)により破砕した。未破砕細胞を2000rpmで8分間の遠心分離により除去し、得られた後の上清を、さらに40,000rpmで1時間遠心分離(Beckman L−60、60T1ローター))した。得られた沈殿を、2%オクチルグリコシド、10%グリセロール,10μg/mlロイペプチン、10μg/mlペプスタチンAを含有する20mM MOPS−Tris(pH7.0)3mlに懸濁し、この懸濁液を氷上で30分間放置した。続いて、TL−100 Ultracentrifugeを用いて70000rpmで30分間遠心分離し、可溶化されたMATE1粗標品を上清として得た。この粗標品にNi−NTA resin(QIAGEN)を加えて4℃で4時間インキュベートした。樹脂を、1%オクチルグリコシド、10%グリセロール,10μg/mlロイペプチン、10μg/mlペプスタチンAを含有する20mM MOPS−Tris(pH7.0)20mlで洗浄し、続いて、1%オクチルグリコシド、10%グリセロール,10μg/mlロイペプチン、10μg/mlペプスタチンAを含有する20mM MOPS−Tris(pH7.0)3ml中でインキュベートし、1.3mgの精製hMATE1ポリペプチドを得た(図11)。
大豆リン脂質(Sigma type IIS)を、10mM MOPS−Tris(pH7.0)、0.5mM DTT中に懸濁した(10mg/ml)。この懸濁液をbath−type sonicatorで超音波処理し、均質な溶液を分注して−80℃で保存した。
上述した再構成リポソーム(MATEポリペプチドを含有するリポソーム)40μl(約12μg protein相当)を分取し、さらに、1mMの14C−TEA(0.5μCi)を含む緩衝液(20mM Tricine−NaOH(pH8.0),0.1M酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム)540μlを添加することにより、測定を開始した。
以上の結果に基づけば、MATE1は、これまで長い間にわたって探索されてきた、腎臓および/または肝臓にてOCの排泄の最終段階を担うプロトン共役性OC輸送体であるといえる(図13)。上記結果に基づけば、毒性を有するOCを生体内から排泄する機構に関与する輸送体の全貌を明らかにし得る。
Claims (16)
- 以下のポリペプチド:
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド
を含有している脂質膜を候補因子とともにインキュベートする工程を包含する、哺乳動物の腎臓または肝臓において、最終段階で該ポリペプチドを介して膜輸送されることにより排泄される物質をスクリーニングする方法。 - 前記脂質膜によって区画される二領域の間に、前記候補因子が輸送される方向に向かってpHが低くなるpH勾配を設ける工程をさらに包含することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記脂質膜が、内部のpHが外部のpHより低いベジクルを形成していることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ベジクル内部のpHが6.5〜7.5であり、かつ該ベジクル外部のpHが8.0〜8.5であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記脂質膜は、H+−ATPaseタンパク質をさらに含有していることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 以下のポリペプチド:
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド
を含有している脂質膜を備えている、哺乳動物の腎臓または肝臓において、最終段階で該ポリペプチドを介して膜輸送されることにより排泄される物質をスクリーニングするためのキット。 - 前記脂質膜は、H+−ATPaseタンパク質をさらに含有していることを特徴とする請求項6に記載のキット。
- 以下のポリペプチド:
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド
を含有している脂質膜を、哺乳動物の腎臓または肝臓において、最終段階で該ポリペプチドを介して膜輸送されることにより排泄される物質、および候補因子とともにインキュベートする工程を包含する、該物質の細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングする方法。 - 前記物質が、テトラエチルアンモニウム(TEA)、1−メチル−4−フェニルピリジニウム(MPP)、ニコチン、シメチジン、キニヂン、ベラパミルまたはキニンであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記脂質膜によって区画される二領域の間に、前記候補因子が輸送される方向に向かってpHが低くなるpH勾配を設ける工程をさらに包含することを特徴とする請求項8または9に記載の方法。
- 前記脂質膜が、内部のpHが外部のpHより低いベジクルを形成していることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ベジクル内部のpHが6.5〜7.5であり、かつ該ベジクル外部のpHが8.0〜8.5であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記脂質膜は、H+−ATPaseタンパク質をさらに含有していることを特徴とする請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 以下のポリペプチド:
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;あるいは
・配列番号2または6に示されるアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド
を含有している脂質膜と、哺乳動物の腎臓または肝臓において、最終段階で該ポリペプチドを介して膜輸送されることにより排泄される物質とを備えている、該物質の細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングするためのキット。 - 前記物質が、テトラエチルアンモニウム(TEA)、1−メチル−4−フェニルピリジニウム(MPP)、ニコチン、シメチジン、キニヂン、ベラパミルまたはキニンであることを特徴とする請求項14に記載のキット。
- 前記脂質膜は、H+−ATPaseタンパク質をさらに含有していることを特徴とする請求項14または15に記載のキット。
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