DE3884646T2

DE3884646T2 - Humanes Karcinom-assoziertes Antigen und an dieses Antigen bindende Antikörper.

Info

Publication number: DE3884646T2
Application number: DE88105299T
Authority: DE
Inventors: Per Borup-Christensen; Karin Erb; Jens Christian Jensenius
Original assignee: BORUP CHRISTENSEN PER
Current assignee: BORUP CHRISTENSEN PER
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1994-01-27
Anticipated expiration: 2008-04-01
Also published as: FI894650A0; EP0285173A3; US5338661A; IE60993B1; AU1596588A; ZA882353B; ES2059418T3; JPH02503383A; DE3884646D1; EP0285173B1; DK169987D0; IL85955A0; NZ224156A; FI894650A; WO1988007377A1; JPH082920B2; AU618260B2; EP0285173A2; IL85955A; KR890700358A

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein tumorassoziiertes Antigen, einen gegen das Antigen gerichteten Antikörper, ein Diagnosemittel, das das Antigen oder den Antikörper umfaßt, ein Arzneimittel, das das Antigen oder den Antikörper umfaßt, und die Verwendung des Antigens oder des Antikörpers für eine Vielzahl von diagnostischen oder therapeutischen Zwecken.

STAND DER TECHNIK

Die Möglichkeit zur Entwicklung von präziseren Verfahren zum Nachweis und zur Diagnose von Krebs durch Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten Antigenen (d.h. durch Tumoren exprimierten Antigenen) ist für die Medizin von großem Interesse.
Monoclonale Antikörper gegen tumorassoziierte Antigene können aufgrund ihrer höheren Spezifität beim Nachweis von Krebs eine wichtige Rolle spielen. Bisher stammten die meisten der gegen krebsassoziierte Antigene hervorgerufenen monoclonalen Antikörper von Mäusen, wobei sie durch Hybridome exprimiert werden, die durch Fusion von Milzzellen aus einer Maus, die mit einer menschlichen Krebszellinie oder mit Zellen aus einem Krebspatienten immunisiert wurde, mit einer Maus-Myelomzellinie zustande kommen. Antigene, die von monoclonalen Maus-Antikörpern erkannt werden, müssen in der Maus immunogen sein, wobei sie nicht unbedingt den Antigenen entsprechen, die von menschlichen Antikörpern erkannt werden. Außerdem kann der therapeutische Wert dieser monoclonalen Maus-Antikörper begrenzt sein, da Patienten diese Antikörper als fremde Proteine erkennen und aus diesem Grund eine nachteilige Immunantwort gegen den Maus-Antikörper entwickeln können. Das Ergebnis kann eine Neutralisation der therapeutischen Wirkung und ein Auslösen von möglicherweise gefährlichen allergischen Reaktionen sein.
Menschliche Hybridomantikörper sind als Diagnose- und Arzneimittel zur Verabreichung an Krebspatienten deshalb vielversprechend, weil menschliche monoclonale Antikörper in Menschen weniger immunogen sind als heterologe Antikörper und weil sie befähigt sind, die entsprechenden Antigene zu erkennen.
Die Probleme, die die Spezifität von monoclonalen Antitumor-Antikörpern der Maus betreffen, werden durch den Colon- Adenocarcinom-Antikörper 17-A1 erläutert, der in Diagnose und Therpie verwendet worden ist, wobei man jedoch jetzt herausgefunden hat, daß er sowohl mit normalem als auch mit Tumorgewebe reagiert (Hybridoma 5, Ergänz. 1, (1986), Spezialausgabe über Ca-17-A1, Hrsg. Z. Steplewski).
Die Immunantwort von Patienten gegen den verabreichten monoclonalen Maus-Antikörper ist von zahlreichen Forschern beschrieben worden (z.B. H. F. Sears et al., Lancet (1985), i: 762-765; und M. S. Mitchell et al., Prof. Cancer Res. Ther. 21 (1982), Raven Press, New York).
Colorectaler Krebs ist einer der am häufigsten vorkommenden Krebsarten und einer der häufigsten Todesursachen durch Krebs. Die Prognose dieser Krebsart hat sich seit langer Zeit nicht verbessert, aus diesem Grund werden neue Verfahren zum Nachweis von colorectalem Krebs und eine zusätzliche, die Operation begleitende Therapie benötigt.
Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an einem mit menschlichem Carcinomtumor assoziierten Antigen, insbesondere einem solchen Antigen, das im wesentlichen nicht durch normales Gewebe exprimiert wird, und an Antikörpern gegen ein solches Antigen für diagnostische und therapeutische Zwecke.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein mit menschlichem Carcinom assoziiertes cytoplasmatisches Antigen, das mindestens ein Epitop aufweist, welches in gefrorenen, mit Aceton fixierten Gewebeschnitten von Colon-Adenocarcinom, Ovar-Adenocarcinom, Nieren-Adenocarcinom, Mammacarcinom, Lungen-Adenocarcinom, Nicht-Seminom-Modencarcinom, Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenduktuli und Prostataepithel so exponiert ist, daß es an den monoclonalen Antikörper bindet, der von der Mensch-Mensch-Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) produziert wird, und welches nicht so exponiert ist in gefrorenen, mit Aceton fixierten Gewebeschnitten von Lungenepithelcarcinom, Sarcom, malignem Melanom, B-Lymphom, Thymom, Ovarstroma, Ovarepithel, Nierenglomeruli, Nierentubuli, Lungenbläschen, Bronchialepithel, Hoden, Epidermis, Tonsillen-Lymphgewebe, Tonsillenepithel, glatten Muskeln oder Blutgefäßen, wobei das Antigen ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 43 000 und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,4 bis 6,2 aufweist, oder ein Analog davon.
Der Begriff "Analog" wird in der vorliegenden Beschreibung zur Bezeichnung eines Proteins oder Polypeptids einer ähnlichen Aminosäurezusammensetzung oder -sequenz wie das vorliegende Antigen verwendet, wobei kleine Änderungen erlaubt sind, die keine nachteilige Wirkung auf die Immunogenität des Analogs ausüben. Das analoge Polypeptid oder Protein kann aus einer anderen Quelle als Carcinomgewebe stammen, wie z.B. aus einem rekombinanten Organismus, oder es kann teilweise oder vollständig einen synthetischen Ursprung haben. Der Begriff soll außerdem ein beliebiges Derivat des Antigens bedeuten, wie z.B. eine immunogene Subsequenz davon.
Die immunocytochemische Analyse nach Standardverfahren unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers mit spezifischer Reaktivität gegen das Antigen zeigt das Vorliegen des neuen Antigens in menschlichem Coloncarcinom- und Mammacarcinomgewebe, nicht aber in Duodenum-Adenocarcinomgewebe, Melanom- oder Burkitt-Lymphomgewebe oder menschlichen peripheren Blutleucocyten (vgl. die nachstehende Tabelle I).
Die immunohistochemische Analyse nach Standardverfahren unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers mit spezifischer Reaktivität auf das Antigen zeigt das Vorliegen des neuen Antigens in menschlichem Colon-Adenocarcinom-, Ovar- Adenocarcinom-, Nieren-Adenocarcinom-, Mamma-Adenocarcinom-, Lungen-Adenocarcinom- und Nicht-Seminom-Hodencarcinomgewebe, nicht jedoch in Lungenepithelcarcinom-, Sarcom-, malignem Melanom-, B-Lymphom- oder Thymomgewebe oder in normalen Geweben, außer Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenductuli oder Prostataepithel (vgl. die nachstehenden Tabellen IIA und IIB).
Hieraus ist ersichtlich, daß das neue Antigen ein Antigen ist, das im wesentlichen nicht in normalem menschlichem Gewebe gefunden wird und das, wie gezeigt wurde, durch Carcinomgewebe, insbesondere Adenocarcinomgewebe, nicht jedoch durch andere maligne Gewebe exprimiert wird, dies wurde durch herkömmliche immunocytochemische und immunohistochemische Analysen bestimmt. Insbesondere scheint das neue Antigen mit Colon-Adenocarcinom assoziiert zu sein.
Ein durch Coloncarcinom exprimiertes tumorassoziiertes Antigen wird in EP 199 586 beschrieben. Dieses Antigen unterscheidt sich jedoch vom Antigen der vorliegenden Erfindung in Merkmalen, wie Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt, außerdem wird angegeben, daß es sowohl in normalem als auch in malignem Colongewebe vorliegt (d.h. es scheint nicht tumorspezifisch zu sein), wohingegen gezeigt wurde, daß das Antigen der vorliegenden Erfindung in mehreren verschiedenen malignen Geweben, wie vorstehend angegeben, vorliegt.
Das erfindungsgemäße Antigen kann beispielsweise durch Isolierung aus Extrakten von Carcinomzellen oder aus Extrakten von Carcinomtumoren erhalten werden, indem eine Affinitätschromatographie an einem gegen das Antigen hervorgerufenen, unlöslichgemachten Antikörper, gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. Johnstone, A., & Thorpe, R., Immunochemistry in Practice, Blackwell, Oxford 1987), durchgeführt wird. Eine weitere Reinigung gemäß einem oder mehreren zusätzlichen Verfahren zur Proteinreinigung (z.B. Größenausschluß-Chromatographie, Ionenaustauscher-Chromatographie, Liganden-Affinitätschromatographie, Chromatographie mit hydrophoben Wechselwirkungen, Elektrophorese in Gelen mit oder ohne Denaturierung und verschiedene Fällungsverfahren) kann erforderlich sein, um das Antigen in ausreichend reiner Form für eine ausführliche molekulare Charakterisierung und für die Verwendung für diagnostische und therapeutische Zwecke zu erhalten.
Um eine ausreichende Versorgung mit dem Antigen sicherzustellen, kann es jedoch vorteilhaft sein, das Antigen durch DNA-Rekombinations-Techniken zu produzieren. Diese können umfassen: (a) Isolierung einer das Antigen codierenden Nucleotidsequenz, z.B. durch Herstellung einer cDNA- oder Genbank menschlicher Carcinomzellen und Absuchen auf positive Clone gemäß herkömmlichen Verfahren; (b) Einführung der Sequenz in einen geeigneten, replizierbaren Expressionsvektor; (c) Transformation eines geeigneten Mikroorganismuswirts mit dem in Schritt (b) erzeugten Vektor; (d) Züchtung des in Schritt (c) erzeugten Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Antigens; und (e) Ernten des Antigens aus der Kultur.
Die Schritte (a) bis (e) des Verfahrens können nach Standardmethoden ausgeführt werden, z.B. wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, beschrieben.
Nachdem das das Antigen codierende Gen isoliert worden ist, kann die DNA-Sequenz nach Standardverfahren bestimmt werden, z.B. wie von Sanger et al., Science 214 (1981), 1205, oder Gilbert, Science 214 (1981), 1305, beschrieben, und die Aminosäuresequenz aufgrund der DNA-Sequenz hergeleitet werden. Sodann kann das Antigen oder eine Subsequenz davon durch eine herkömmliche Peptidsynthese, z.B. eine Flüssig- oder Festphasen-Peptidsynthese, erzeugt werden, wobei die Festphasen-Peptidsynthese das bevorzugte Verfahren darstellt (vgl. R. B. Merryfield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149, oder Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, USA, 1969). In der Festphasen-Peptidsynthese wird die Aminosäuresequenz konstruiert, indem eine Anfangsaminosäure an einen festen Träger gekuppelt wird und sodann nach und nach die anderen Aminosäuren der Sequenz durch Peptidbindung angefügt werden, bis die gewünschte Länge erreicht war.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper, der bei der immunohistochemischen Analyse von gefrorenen, in Aceton fixierten Gewebeschnitten an Colon-Adenocarcinom, Ovar-Adenocarcinom, Nieren-Adenocarcinom, Mammacarcinom, Lungen-Adenocarcinom, Nicht-Seminom- Hodencarcinom, Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenductuli und Prostataepithel bindet und der nicht an Lungenepithelcarcinom, Sarcom, malignes Melanom, B-Lymphom, Thymom, Ovarstroma, Ovarepithel, Nierenglomeruli, Nierentubuli, Lungenbläschen, Bronchialepithel, Hoden, Epidermis, Tonsillen-Lymphgewebe, Tonsillenepithel, glatte Muskeln oder Blutgefäße bindet und der an ein mit menschlichem Carcinom assoziiertes cytoplasmatisches Antigen bindet, welches ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 43 000 und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,4 bis 6,2 aufweist und welches mindestens ein Epitop enthält, das mit einem monoclonalen Antikörper reagiert, der durch die menschliche Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) produziert wird.
Der Antikörper ist vorteilhafterweise ein monoclonaler Antikörper, da diese eher eine höhere Spezifität aufweisen als polyclonale Antikörper, weswegen sie für präzise diagnostische Bestimmungen nützlich sind. Aufgrund der vorstehend angeführten Überlegungen sollte der Antikörper, sofern er den Patienten injiziert werden soll, vorzugsweise menschlichen Ursprungs sein, d.h. er sollte ein Antikörper sein, der durch ein Fusionsprodukt aus einem menschlichen Lymphocyten und einer menschlichen Zellinie oder durch ein Fusionsprodukt aus einem menschlichen Lymphocyten und beispielsweise einer Maus- Myelomzellinie produziert wird, ein solcher Antikörper eignet sich besser als ein Antikörper, der durch ein Fusionsprodukt aus einem Maus-Lymphocyten und einer Maus-Myelomzellinie produziert wird, ein solches Fusionsprodukt wurde bisher meistens für die Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen menschliche tumorassoziierte Antigene verwendet. Solche monoclonale Antikörper können gegen verschiedene Epitope auf dem Antigen hervorgerufen werden. Ein Beispiel eines nützlichen monoclonalen Antikörpers ist der monoclonale Antikörper, der mit C-OU1 bezeichnet wird und durch die menschliche Hybridomzellinie B9165 produziert wird, die am 2. April 1987 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Großbritannien, unter der Hinterlegungsnummer ECACC 87040201 hinterlegt wurde.
Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper kann nach einem Verfahren hergestellt werden, das
a) die Isolierung von Antikörper-produzierenden Zellen aus einem Krebspatienten,
b) die Fusion der Antikörper-produzierenden Zellen mit Zellen einer geeigneten menschlichen Fusionszellinie und die Selektion und Clonierung der resultierenden, den Antikörper produzierenden Hybridomzellen und
c) die Züchtung der Zellen von Schritt b) in einem geeigneten Medium zur Herstellung des Antikörpers und das Ernten des Antikörpers aus dem Wachstumsmedium umfaßt.
Die Antikörper-produzierenden Zellen, die für die Fusion mit den menschlichen Fusionszellen verwendet werden, sind vorzugsweise Milz- oder Lymphknotenzellen. Die Fusion von Antikörper-produzierenden Zellen und menschlichen Fusionszellen kann im wesentlichen durchgeführt werden, wie von Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495, oder Köhler, Immunological Methods, Bd. II, Academic Press (1981), 285- 298, beschrieben, d.h. vorzugsweise in Gegenwart eines Fusionspromotors, wie z.B. Polyethylenglykol. Die verwendete menschliche Fusionszellinie ist vorzugsweise ein Zellinientyp, der unfähig ist, in Selektivmedium zu überleben; ein Zellinientyp, der häufig für Zellfusionen verwendet wird, ist ein Zellinientyp, dem das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase fehlt und der folglich unfähig ist, in einem Medium zu wachsen, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (HAT-Medium).
Die Selektion von Hybridomzellen, die einen Antikörper gegen das Carcinomantigen produzieren, kann sodann durchgeführt werden, indem nichtfusionierte Antikörper-produzierende Zellen, nichtfusionierte menschliche Fusionszellen und vermutlich fusionierte Zellen in einem Selektivmedium (wie z.B. HAT) gezüchtet werden, in dem die nichtfusionierten menschlichen Fusionszellen nicht wachsen können und schließlich absterben. Die nichtfusionierten Antikörper-produzierenden Zellen können nur eine begrenzte Zeit überleben, danach sterben sie aus. Andererseits wachsen die erfolgreich fusionierten Zellen weiter, da sie die Eigenschaften des permanenten Wachstums von den parentalen menschlichen Fusionszellen und die Fähigkeit zum Überleben in Selektivmedium von den parentalen Antikörper-produzierenden Zellen geerbt haben.
Die resultierenden Antikörper-produzierenden Zellen können nach der Clonierung in einem geeigneten Medium, wie z.B. RPMI-1640, in vitro gezüchtet werden. Dies führt zur Produktion von monoclonalen Antikörpern mit sehr hoher Reinheit, da diese Antikörper durch die Zellen in den Kulturüberstand sekretiert werden. Anschließend können die Antikörper nach herkömmlichen Verfahren, wie z.B. Zentrifugation, Filtration, Fällung, Chromatographie oder einer Kombination davon, isoliert werden.
In einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung also ein Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers gegen ein mit Coloncarcinom assoziiertes cytoplasmatisches Antigen, welches ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 43 000 und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,4 bis 6,2 aufweist und welches mindestens ein Epitop enthält, das mit einem monoclonalen Antikörper reagiert, welcher durch die menschliche Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) produziert wird, wobei das Verfahren die Bereitstellung von Lymphocyten, die aus mesenterischen Lymphknoten, die den Tumorbereich ableiten, von einem Patienten mit Colonkrebs stammen, die Fusion dieser Lymphocyten mit einer menschlichen Zellinie, die zur Verwendung für eine Fusion zwecks Erzeugung menschlicher Hybridome geeignet ist, das Absuchen der erhaltenen Hybridomzellen auf Hybridome, die einen monoclonalen Antikörper sekretieren, der spezifisch an Colon-Adenocarcinom, Ovar-Adenocarcinom, Nieren-Adenocarcinom, Mammacarcinom, Lungen-Adenocarcinom, Nicht-Seminom-Hodencarcinom, Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenduktuli und Prostataepithel bindet und nicht an Lungenepithelcarcinom, Sarcom, malignes Melanom, B-Lymphom, Thymom, Ovarstroma, Ovarepithel, Nierenglomeruli, Nierentubuli, Lungenbläschen, Bronchialepithel, Hoden, Epidermis, Tonsillen-Lymphgewebe, Tonsillenepithel, glatte Muskeln oder Blutgefäße bindet, umfaßt.
Für Zwecke, die keinen monoclonalen Antikörper erfordern, kann auch ein polyclonaler Antikörper verwendet werden. Dieser kann hergestellt werden, indem ein im wesentlichen reines Präparat des Antigens in ein geeignetes Tier (z.B. ein Kaninchen, eine Maus oder eine Ziege) injiziert wird, worauf eine oder mehrere Auffrischinjektionen in geeigneten Abständen (z.B. 2 Wochen bis 1 Monat) folgen, und die erste Blutabnahme sechs Monate danach durchgeführt wird. Anschließend wird den Tieren, unter Fortführung dieser eingeführten Immunisierungsvorschrift, jeweils etwa eine Woche nach der Auffrischimmunisierung Blut abgenommen und der Antikörper aus dem Serum in herkömmlicher Art und Weise isoliert, z.B. wie in Harboe und Ingild, Scand. J. Immun. 2 (Ergänz. 1), (1973), 161-164, beschrieben.
Für einige Zwecke kann es von Vorteil sein, daß der Antikörper ein Hybridantikörper ist, der eine Kombinationsstelle, die spezifisch gegen ein Epitop des erfindungsgemäßen Antigens gerichtet ist, und eine andere solche Stelle enthält, die spezifisch gegen ein anderes Epitop desselben Antigens, ein Epitop eines anderen Antigens oder ein Arzneimittel gerichtet ist. Der Begriff "Kombinationsstelle" soll so verstanden werden, daß er die Antigenerkennungsstruktur im variablen Bereich des Antikörpermoleküls bedeutet. Hybridantikörper ermöglichen spezielle Arbeitsabläufe, wobei das Antigen in einer Probe nachgewiesen wird und wobei ein Arzneimittel oder ein anderes biologisch aktives Molekül oder ein anderes Antigen gezielt zu der Stelle des Tumors hingeführt wird, wo das Reagens die größte Wirkung hat. In einer vorteilhaften Auführungsform ist das andere Antigen, mit dem der Hybridantikörper reagiert, ein Differenzierungsantigen von cytotoxischen T-Zellen (vgl. Staerz et al., Nature 314 (1985), 628). Das Arzneimittel, mit dem der Hybridantikörper reagieren kann, wird vorzugsweise ausgewählt aus cytotoxischen oder antineoplastischen Mitteln (vgl. Collier, R. J., und Kaplan, D. A., Scientific American 251 (1984), 44).
Der Hybridantikörper kann durch Hybride aus zwei monoclonalen Zellinien hergestellt werden, die die zwei entsprechenden Antikörper produzieren, oder er kann durch eine chemische Verknüpfung von Fragmenten der zwei Antikörper hergestellt werden.
Für andere Zwecke, vgl. nachstehend, kann der Antikörper ein antiidiotypischer Antikörper sein, d.h. ein Antikörper, der gegen die Stelle eines Antikörpers gerichtet ist, welche mit dem Epitop auf dem Antigen reagiert. Der antiidiotypische Antikörper ist gegen einen Antikörper gerichtet, der mit dem erfindungsgemäßen Antigen reagiert. Der antiidiotypische Antikörper kann nach einem ähnlichen Verfahren, wie vorstehend für den monoclonalen oder polyclonalen Antikörper beschrieben, hergestellt werden. Der Antikörper kann auch ein anti-antiidiotypischer Antikörper sein, der gegen den vorstehend definierten antiidiotypischen Antikörper gerichtet ist.
In einem weiteren wichtigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnosemittel, das einen erfindungsgemäßen Antikörper, wie vorstehend beschrieben, ein Fragment eines Antikörpers, wie nachstehend beschrieben, einen antiidiotypischen Antikörper, wie vorstehend beschrieben, oder einen anti-antiidiotypischen Antikörper, wie vorstehend beschrieben, umfaßt.
In einigen Fällen ist zwar keine Markierung des Antikörpers notwendig, z.B. wenn das Diagnosemittel in einem Agglutinationstest eingesetzt werden soll, in welchem feste Partikel, an die der Antikörper gekuppelt ist, in Gegenwart eines in der zu testenden Probe vorliegenden Carcinomantigens agglutinieren, in den meisten Fällen jedoch wird der Antikörper oder das Fragment des Antikörpers vorzugsweise mit einer Markierung bereitgestellt, um den gebundenen Antikörper oder das gebundene Antikörperfragment nachzuweisen. In einem Doppel-Antikörper("Sandwich")-Test kann mindestens einer der Antikörper mit einer Markierung bereitgestellt werden. Substanzen, die in der vorliegenden Beschreibung als Markierung geeignet sind, können aus Enzymen, fluoreszierenden Substanzen, radioaktiven Isotopen und Liganden, wie z.B. Biotin, ausgewählt werden.
Beispiele von Enzymen, die als Markersubstanzen verwendet werden können, sind Peroxidasen, z.B. Meerrettich-Peroxidase, oder Phosphatasen, z.B. alkalische Phosphatase. Da Enzyme nicht direkt nachweisbar sind, müssen sie mit einem Substrat kombiniert werden, wobei ein nachweisbares Reaktionsprodukt erzeugt wird, das beispielsweise fluoreszierend oder gefärbt sein kann. Beispiele von nützlichen Substraten sind H&sub2;O&sub2;/o-Phenylendiamin, H&sub2;O&sub2;/Azinodiethylbenzthiazolinsulfonsäure, H&sub2;O&sub2;/Diaminobenzidin und p-Nitrophenylphosphat. Solche Reaktionsprodukte können mit bloßem Auge durch Farbeentstehung oder Farbänderung oder mit Hilfe eines Spektrophotometers nachgewiesen werden.
Beispiele von fluoreszierenden Substanzen, die als Markersubstanzen verwendet werden können, sind H&sub2;O&sub2;/p-Hydroxyphenylessigsäure und Methylumbelliferylphosphat. Solche Substanzen können mit Hilfe eines Fluoreszenz-Spektrophotometers in bekannter Art und Weise nachgewiesen werden.
Beispiele von radioaktiven Isotopen, die als Markersubstanzen verwendet werden können, sind I-125, S-35 und P-35. Die durch diese Isotope ausgesandte Radioaktivität kann in einem Gammazähler oder Szintillationszähler in bekannter Art und Weise gemessen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Diagnosemittel mindestens einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der (das) an einen festen Träger gekuppelt ist. Dieser kann in einem Doppel-Antikörper-Test verwendet werden, wobei der an den Träger gebundene Antikörper oder das an den Träger gebundene Antikörperfragment nicht markiert ist, während der ungebundene Antikörper oder das ungebundene Antikörperfragment markiert ist. Der feste Träger kann aus einem Polymer bestehen oder er kann eine Matrix umfassen, auf die das Polymer aufgelegt ist. Der feste Träger kann ausgewählt werden aus einem Kunststoff, z.B. Latex, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Nylon, Polyvinylidendifluorid, oder Cellulose, z.B. Nitrocellulose, Silicon, Siliciumdioxid und einem Polysaccharid, wie z.B. Agarose oder Dextran.
Zur Verwendung in einem Diagnosemittel kann der feste Träger in einer geeigneten Form vorliegen. Er kann in Form einer Platte, z.B. einer dünnen Schicht oder vorzugsweise einer Mikrotiterplatte, eines Streifens, Films, Papiers oder in Form von Mikropartikeln, wie z.B. Latexperlen, oder dergleichen vorliegen.
Anstatt direkt an den festen Träger gekuppelt zu sein, kann der monoclonale Antikörper oder das Antikörperfraginent an einen Spacer gekuppelt sein, der an einen festen Träger immobilisiert ist. Beispiele von Spacern umfassen Protein A.
Es sollte beachtet werden, daß stattdessen praktisch alle Verfahren und Anwendungen durchgeführt werden können, die auf intakten Antikörpern beruhen, wobei Fragmente der Antikörper, F(ab')&sub2; oder Fab-Fragmente, verwendet werden (vgl. Delaloye, B., et al., J. Clin. Invest. 87 (1986), 301). Aus diesem Grund kann bei einer Anzahl von Ausführungsformen ein Fragment des erfindungsgemäßen Antikörpers als Alternative zum ganzen Antikörper verwendet werden.
Zur Verwendung in einem Sandwich-Test kann das Diagnosemittel zusätzlich einen weiteren Antikörper umfassen. Dieser weitere Antikörper kann markiert und/oder an einen festen Träger gekuppelt sein, wie vorstehend beschrieben. In dieser Ausführungsform kann ein Antikörper oder alle beiden Antikörper ein monoclonaler Antikörper sein, wie vorstehend beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Diagnosemittel ein Carcinomantigen, wie vorstehend definiert, enthalten. Dieses Mittel kann verwendet werden, um das Vorliegen von Antikörpern gegen das Carcinomantigen in einer Probe nachzuweisen. Das Diagnosemittel kann außerdem beliebige Merkmale aufweisen, die vorstehend für solche Diagnosemittel beschrieben werden, die einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon enthalten, jedoch weisen sie, anstatt der Bindung eines Antikörpers an das Antigen, den gebundenen Antikörper nach.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von menschlichem Carcinom, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit aus einem vermutlichen Krebspatienten mit einem erfindungsgemäßen Diagnosemittel, das einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Antikörperfragment enthält, und die Bestimmung des Vorliegens von an den Antikörper oder das Antikörperfragment gebundenem Antigen. Der Antikörper kann markiert und/oder an einen festen Träger gebunden sein, wie vorstehend beschrieben. Die Körperflüssigkeit kann ausgewählt werden aus Blut, Plasma, Serum, Lymphe, Lungenauswurf, Urin und gastrointestinalen Flüssigkeiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Probe mit einem ersten monoclonalen Antikörper, der an einen festen Träger gekuppelt ist, und danach mit einem zweiten monoclonalen oder polyclonalen Antikörper, der mit einer Markierung bereitgestellt wird, inkubiert. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist der Sandwich-ELISA ("enzyme linked immuno sorbent assay"), der in Voller, A., et al., Bull. World Health Organ. 53 (1976), 55, beschrieben wird.
In einer anderen Ausführungsform (einem sogenannten kompetitiven Bindungstest) kann die Probe mit einem monoclonalen Antikörper, der an einen festen Träger gekuppelt ist, und danach mit einem markierten Carcinomantigen inkubiert werden, wobei das letztere mit einem in der Probe vorliegenden Carcinomantigen um die Bindungsstellen auf dem Antikörper konkuriert.
Eine andere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von menschlichem Carcinom, umfassend das Inkontaktbringen einer Gewebeprobe aus einem vermutlichen Krebspatienten mit einem erfindungsgemäßen Diagnosemittel, das einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment des Antikörpers enthält, und Bestimmung der Stellen auf der Probe, an die der Antikörper oder das Antikörperfragment gebunden ist. Ein solches immunohistochemisches Verfahren kann gemäß eingeführten Verfahren, z.B. wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Diagnosemittel kann in einem Verfahren zur Lagebestimmung von Tumoren (insbesondere Carcinomen) in vivo mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers verwendet werden. Dieses Verfahren umfaßt die Verabreichung einer diagnostisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers, der markiert ist, so daß er nachgewiesen werden kann, und die Lagebestimmung der Stellen, an denen sich der gebundene Antikörper befindet. Der Antikörper kann mittels eines radioaktiven Isotops markiert und sodann injiziert werden, anschließend kann seine Lage nach bekannten Verfahren (z.B. einem geeigneten Gammastrahlendetektor) bestimmt werden, vgl. Mach, J.-P., et al., Nature 248 (1974), 704.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von menschlichem Carcinom, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit aus einem vermutlichen Krebspatienten mit einem erfindungsgemäßen Diagnosemittel, das das Antigen oder den antiidiotypischen Antikörper der Erfindung enthält, und Bestimmung des Vorliegens von in der Körperflüssigkeit vorliegendem, gebundenem Antikörper gegen das erfindungsgemäße Antigen.
Im einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel zur Behandlung von menschlichem Carcinom, das ein erfindungsgemäßes Antigen oder einen Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, einen antiidiotypischen Antikörper oder einen anti-antiidiotypischen Antikörper gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfaßt.
Der im erfindungsgemäßen Mittel eingesetzte Excipient kann ein beliebiger pharmazeutisch verträglicher Träger sein. Dieser Träger kann ein beliebiger Träger sein, der in der Regel bei der Herstellung von injizierbaren Mitteln verwendet wird, z.B. ein Verdünnungsmittel, Suspendiermittel usw., wie z.B. isotonische oder gepufferte Kochsalzlösung. Das Mittel kann hergestellt werden, indem eine therapeutisch wirksame Menge des Antigens, Antikörpers oder Antikörperfragments mit dem Träger in einer solchen Menge gemischt wird, daß die gewünschte Konzentration des Antigens, Antikörpers oder Antikörperfragments in dem Mittel erhalten wird.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, das Antigen, den Antikörper oder das Antikörperfragment an einen Träger, insbesondere einen makromolekularen Träger, zu kuppeln. Der Träger ist in der Regel ein Polymer, an den das Toxin durch hydrophobe, nichtkovalente Wechselwirkung gebunden ist, wie z.B. ein Kunststoff, z.B. Polystyrol, oder ein Polymer, an den das Antigen, der Antikörper oder das Antikörperfragment kovalent gebunden ist, wie z.B ein Polysaccharid oder ein Polypeptid, z.B. Rinderserumalbumin, Ovalbumin oder Hämocyanin der Napfschnecke (KLHC). Ferner kann der Träger vorteilhafterweise aus einem Arzneimittel, z.B. einem cytotoxischen oder antineoplastischen Mittel, ausgewählt werden, woran das Antigen, der Antikörper oder das Antikörperfragment gekuppelt ist. Der Träger kann auch ein anderer Antikörper sein, der gegen einen cytotoxischen Effektormechanismus, z.B. cytotoxische Zellen, gerichtet ist. Der Träger sollte vorzugsweise nichttoxisch und nichtallergen sein. Das Antigen, der Antikörper oder das Antikörperfragment kann multivalent an den makromolekularen Träger gekuppelt sein, da dies möglicherweise eine erhöhte Immunogenität des Mittels bereitstellt.
Zur oralen Verabreichung kann das Mittel als Tablette, Kapsel, Granulat, Paste, Gel, Cemisch oder Suspension vorliegen, gegebenenfalls bereitgestellt mit einem Überzug zur Langzeitwirkung oder einem Überzug, der das Antigen bei der Passage durch den Magen schützt.
Feste Formulierungen, d.h. Granulate, Tabletten und Kapseln, können Füllstoffe, z.B. Zucker, Sorbit, Mannit und Kieselsäure; Bindemittel, z.B. Cellulosederivate, wie Carboxymethylcellulose und Polyvinylpyrrolidon; Sprengmittel, z.B. Stärke, Natriumbicarbonat und Calciumcarbonat; Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum und Calciumstearat, enthalten. Halbfeste Formulierungen, d.h. Pasten oder Gele, können ein Gelierungsmittel, wie z.B. ein Alginat, Gelatine, Carrageen, Tragant und Pektin, ein Mineralöl, wie z.B. flüssiges Paraffin, ein pflanzliches Öl, wie z.B. Maisöl, Sonnenblumenöl, Rapsöl und Weintraubenkernöl, und außerdem ein Verdickungsmittel, wie z.B. eine Stärke, ein Gummi, Gelatine usw., umfassen. Flüssige Formulierungen, d.h. Gemische und Suspensionen, können einen wäßrigen oder öligen Träger, z.B. Wasser, oder ein Mineralöl, wie z.B. flüssiges Paraffin, ein pflanzliches Öl, wie z.B. Maisöl, Sonnenblumenöl, Rapsöl, Weintraubenkernöl usw., umfassen. Das erfindungsgemäße Antigen kann in dem flüssigen Träger gemäß herkömmlicher Praxis suspendiert werden.
Der Überzug zur Langzeitwirkung kann z.B. ein magensaftresistenter Überzug sein, der ausgewählt sein kann aus Schellack, Celluloseacetatestern, wie z.B. Celluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcelluloseestern, wie z.B. Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Polyvinylacetatestern, wie z.B Polyvinylacetatphthalat, und Polymeren von Methacrylsäure und (Meth-)Acrylsäureestern.
Das Mittel kann auch für die rektale Verabreichung zubereitet werden, z.B. als Suppositorium. Ein solches Suppositorium kann herkömmliche Excipienten, wie z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antigens oder eines erfindungsgemäßen antiidiotypischen Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von menschlichem Adenocarcinom oder die Verwendung eines Antikörpers, eines Fragments eines Antikörpers oder eines anti-antiidiotypischen Antikörpers gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von menschlichem Carcinom.
Die Therapie von Krebs, insbesondere von Carcinomen, die das erfindungsgemäße Carcinomantigen exprimieren, kann nach vielen verschiedenen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Ein Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers gegen das Antigen (insbesondere ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein Fragment davon, aus den vorstehend angegebenen Gründen) kann den Krebspatienten injiziert werden, um den Tumor direkt oder über verschiedene Effektormechanismen, z.B. die komplementvermittelte Cytotoxizität oder die Antikörper-abhängige zellvermittelte Cytotoxizität, zu bekämpfen. Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann, bevor er (es) dem Patienten injiziert wird, modifiziert werden, wie vorstehend angegeben, z.B. durch Kupplung an Arzneimittel (wodurch diese an die Stelle ihrer Wirkung transportiert werden) oder an einen anderen Antikörper, der gegen einen cytotoxischen Effektormechanismus gerichtet ist, wie z.B Antigene auf cytotoxischen T-Zellen oder auf anderen cytotoxischen Zellen. Man rechnet damit, daß solche Hybridantikörper, die eine Kombinationsstelle für das Antigen und eine andere gegen ein anderes Antigen oder ein Arzneimittel, wie vorstehend beschrieben, enthalten, bevorzugt auch für einen zweigleisigen Angriff auf den betreffenden Tumor verwendet werden können.
Der erfindungsgemäße Antikörper oder ein Fragment davon kann in extrakorporalen Vorrichtungen zur Entfernung von zirkulierendem Tumorantigen oder Tumorantigen-enthaltenden Immunkomplexen verwendet werden, hierdurch wird die Immunantwort gegen Krebs neu aufgebaut, indem sich das Immunsystem von der durch das Tumorantigen oder die Immunkomplexe ausgelösten Paralyse erholen kann.
Das erfindungsgemäße Carcinomantigen kann zur Immunisierung verwendet werden, um eine Immunantwort gegen Krebs im Körper hervorzurufen. Das Antigen kann ferner in vitro verwendet werden, um durch Züchtung des Antigens mit Leukocyten aus einem Krebspatienten Effektorzellen gegen Krebs hervorzurufen.
Das Carcinomantigen kann in extrakorporalen Vorrichtungen zur Entfernung von Antitumor-Antikörper oder Immunkomplexen in ähnlicher Art und Weise wie bei Einsatz des Antikörpers verwendet werden.
Der Antikörper gegen das Carcinomantigen oder Fragment davon kann ferner verabreicht werden, um eine antiidiotypische oder anti-antiidiotypische Immunantwort hervorzurufen. Ein antiidiotypische Antikörper (ob monoclonal oder polyclonal oder ein Fragment davon), der gegen einen Antikörper hervorgerufen wurde, der mit dem erfindungsgemäßen Carcinomantigen reagiert, kann Epitope exprimieren, die denjenigen des Antigens ähnlich sind, und kann daher in ähnlicher Art und Weise zur Immunisierung verwendet werden, um eine Immunantwort gegen Krebs auszulösen. Solche Antikörper können ferner in extrakorporalen Vorrichtungen, wie vorstehend für das Antigen und den Primären Antikörper beschrieben, verwendet werden.
Anti-antiidiotypische Antikörper können ähnlich verwendet werden, wie für Primäre Antitumor-Antikörper beschrieben.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen und mit Bezug auf die beigelegten Zeichnungen ausführlicher beschrieben, wobei
Fig. 1 die immunocytochemische Färbung mit C-OU1 von COLO 201-Zellen (Colon-Adenocarcinomzellen, positiv) und die Färbung der gleichen Zellen mit einem nichtreagierenden menschlichen Hybridom-IgM (negativ) zeigt;
Fig. 2A und B die immunohistochemische Färbung einer gefrorenen Gewebeprobe von Colon-Adenocarcinom (2A) und von normalem Tonsillengewebe (2B) mit C-OU1 zeigen;
Fig. 3A und B eine elektronenmikroskopische Analyse der Reaktion von C-OU1 mit Colon 137-Zellen (Colon-Adenocarcinomzellen, positiv) (3A) und HUTU 80 (Duodenum-Adenocarcinomzellen, negativ) (3B) zeigen;
Fig. 4 eine Immunoblot-Analyse von Gewebeextrakten, die durch isoelektrische Fokussierung aufgetrennt wurden, zeigt; und
Fig. 5 eine Analyse von Carcinomantigen durch SDS-PAGE und Blotting durch Markierung mit C-OU1 zeigt. Extrakt von Colon 137 (Colon-Adenocarcinomzellen, Positiv) (5A) und Extrakt von HUTU 80 (Duodenum-Adenocarcinomzellen, negativ) (5B).

BEISPIEL 1

Herstellung von menschlichem monoclonalem Antikörper (C-OU1)

Mesenterische Lymphknoten, die den Tumorbereich bei Patienten mit colorectalem Krebs ableiten, wurden unter sterilen Bedingungen zerkleinert. Zelltrümmer wurden durch Baumwolle abfiltriert und die Lymphocyten durch Zentrifugation auf Ficoll-Isopaque (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Bundesrepublik Deutschland) gereinigt.
Die Lymphocyten wurden mit der menschlichen Fusionszelllinie W1-L2-729-HF2 (nachstehend als HF2 bezeichnet) (von Tecniclone Inc., Santa Ana, Kalifornien, USA) gemäß Köhler, Immunological Methods, Bd. II, Academic Press (1981), 285- 298, fusioniert. Das Verhältnis zwischen HF2 und Lymphocyten (10&sup7;) betrug 1:2.
Nach Waschen der HF2-Zellen und der Lymphocyten zusammen in RPMI-1640-Medium und anschließender Zentrifugation wurde das Zellpellet in 0,5 ml 50% PEG (Polyethylenglykol) 6000 eine Minute lang unter fortgesetztem Schütteln resuspendiert. Vor Verdünnung des PEG mit RPMI-1640 wurden die Zellen weitere 2 Minuten inkubiert. Sodann wurde das Fusionsprodukt gewaschen und im Lösungsmedium [RPMI-1640, 10% FCS (fetales Kälberserum), angereichert mit HAT (2 x 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 x 10&supmin;&sup7; M Aminopterin, 3,2 x 10&supmin;&sup6; M Thymidin)] resuspendiert. Sodann wurden 2 x 10&sup5; Zellen in 200 ul pro Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Zellen wurden zwei Wochen in Selektivmedium gehalten. Die weitere Züchtung wurde in RPMI-1640 + 10% FCS, angereichert mit Hypoxanthin und Thymidin, durchgeführt. Das Wachstum von Hybriden wurde 10 Tage bis 4 Wochen nach der Fusion sichtbar. Die Clonierung wurde durch die limitierende Verdünnung ohne Feederzellen durchgeführt.
Die Überstände aus den Vertiefungen mit den wachsenden Clonen wurden auf Immunglobulin-Produktion untersucht, wobei ELISA ("enzyme linked immuno sorbent assay") auf Mikrotiterplatten, die mit Kaninchen-Anti-menschliches Ig (H - und L-Kette) (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark), verdünnt 1:10 000 in 0,1 M Bicarbonat, pH 9,6, beschichtet waren, verwendet wurde. Beschichtete Vertiefungen wurden mit PBS-Tween (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,05% Tween 20) gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit den 1:10 in PBS-Tween verdünnten Überständen inkubiert. Die Entwicklung wurde mit an alkalische Phosphatase (AP) gekuppeltem Antikörper, der für IgM, IgA oder IgG spezifisch war (Dakopatts, Kopenhagen), verdünnt 1:3000 in PBS-Tween, durchgeführt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Substrat p- Nitrophenylphosphat (PNPP), 1 mg/ml 10% Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 9,6, zugefügt. Die optische Dichte wurde nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC bei 405 nm gemessen. Standardkurven zur Mengenbestimmung wurden mit Verdünnungen von IgM (Cappel) oder IgG (Kabi AB, Stockholm, Schweden) erstellt.
Die Immunglobulin(Ig)-produzierenden Hybride, getestet durch ELISA, wurden durch Übertragung auf Makroplatten mit 24 Vertiefungen (Nunc A/S, Dänemark) vermehrt und die Überstände in einer immunocytochemischen Analyse auf die Reaktion mit Tumorzellen oder in einer immunohistochemischen Analyse auf die Reaktionen mit Tumorgeweben, wie nachstehend beschrieben, weiter analysiert.
Die Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201), selektiert durch die nachstehend beschriebenen Verfahren, wurde durch ELISA untersucht, wobei sich zeigte, daß sie zwischen 1 und 5 ug IgM pro ml produzierte, wenn man sie zwei Wochen ohne Austausch des Mediums wachsen ließ.

BEISPIEL 2

Charakterisierung des Antigens

a) Immunocytochemische Analyse

Die Analyse auf Antitumor-Reaktivität wurde durch die immunocytochemische Analyse und durch die immunohistochemische Analyse durchgeführt. Die immunocytochemische Analyse wurde auf Zellabstrichen durchgeführt, die von verschiedenen menschlichen Tumorzellinien und peripheren menschlichen Blutleucocyten hergestellt wurden. Die Zellen wurden durch Behandlung mit Formol-Aceton (9,5% Formaldehyd, 43% Aceton in 86 mM Phosphat-Puffer, pH 7,2) auf Objektträger fixiert. Etwa 50 ul des C-OU1-Überstands (aus dem Hybridom B9165; ECACC 87040201) wurden auf den fixierten Zellausstrich aufgebracht und über Nacht bei 4ºC in einer feuchten Kammer inkubiert, anschließend gespült und eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierten Kaninchen- Anti-menschlichen IgM (Dakopatts), verdünnt auf 1:80 in PBS- Tween, inkubiert. Schließlich wurde das Peroxidase-Substrat (0,01% H&sub2;O&sub2; und Diaminobenzidin mit 0,6 ug/ml in PBS) zugegeben. Die Ausstriche wurden mit Hämatoxylin leicht gegengefärbt und auf Objektträger aufgebracht. Tabelle I zeigt die Ergebnisse die durch Analyse von C-OU1 auf Ausstrichen verschiedener Zellen erhalten wurden. Tabelle I Reaktivität von C-OU1, getestet durch immunocytochemische Analyse Zelltyp Name Reaktion 1. Colon-Adenocarcinom 3. Melanom 4. Mammacarcinom 5. Duodenum-Adenocarcinom 6. Burkitt-Lymphom 7. menschliche periphere Blutleucocyten Colon 137 COLO 201 positiv negativ
Eine selektive Reaktivität ist offensichtlich. Alternativ wurden die lebenden Zellen mit dem Hybridomantikörper bei 4ºC und anschließend mit enzymmarkiertem Anti-Ig-Antikörper inkubiert. Sodann wurden die Zellen auf Objektträger ausgestrichen, mit Glutaraldehyd fixiert (0,17% in PBS) und mit Substrat inkubiert. Fig. IA zeigt die Färbung von lebenden COLO 201-Zellen (Colon-Adenocarcinomzellen) mit C-OU1, während Fig. 1B die fehlende Färbung zeigt, wenn man in der ersten Schicht einen nichtreaktiven menschlichen Hybridom-IgM einsetzt. Das verwendete Verfahren ist ein eingeführtes Standardverfahren zur Markierung von an der Zelloberfläche exponierten Molekülen, die in Fig. 1 gezeigte Markierung wird demgemäß durchgeführt.

b) Immunohistochemische Analyse

Die immunohistochemische Analyse wurde an gefrorenen, in Aceton fixierten Gewebeschnitten durchgeführt. Endogenes IgM wurde durch Inkubation mit Fab'-Fragmenten des Anti-u-Kette- Antikörpers (bezogen von Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark) vor der Inkubation mit dem Hybridomantikörper C-OU1 (0,5 ug/ml) blockiert (die Fab'-Fragmente wurden gemäß B. Nielsen et al., Hybridoma 6 (1) (1987), 103-109) (der Hybridomantikörper wurde durch Fällung mit 2 M Ammoniumsulfat eingeengt). Anschließend wurde der gebundene Hybridomantikörper, wie vorstehend bei der immunocytochemischen Analyse beschrieben, sichtbar gemacht. In diesem Fall wurde das gleiche Antikörperpräparat, das zur Herstellung von Fab'-Fragmenten verwendet wurde, mit Peroxidase markiert. Fig. 2A zeigt, daß nach Einsatz von C-OU1 nur die Tumorzellen in einem Schnitt eines Colon-Adenocarcinoms angefärbt werden. Fig. 2B zeigt die fehlende Färbung von Tonsillengewebe. In Tabelle IIA und B wird die auf verschiedenen Geweben analysierte Reaktivität zusammengefaßt, wobei Tabelle IIA die Ergebnisse aus malignen Geweben und Tabelle IIB die Ergebnisse aus nichtmalignem Gewebe zeigt. Tabelle IIA Reaktivität von C-OU1 (0,5 ug/ml) auf gefrorenen, mit Aceton fixierten Gewebeschnitten von menschlichen malignen Geweben, analysiert durch immunohistochemische Techniken Gewebe Ergebnis Colon-Adenocarcinom Ovar-Adenocarcinom Nieren-Adenocarcinom Mammacarcinom Lungen-Adenocarcinom Lungenephithelcarcinom Nicht-Seminom-Hodencarcinom Sarcom malignes Melanom B-Lymphom Thymom a) Anzahl der positiven / Anzahl der getesteten Proben35 Tabelle IIB Reaktivität von C-OU1 (0,5 ug/ml) auf gefrorenen, mit Aceton fixierten Gewebeschnitten von normalen menschlichen Geweben, analysiert durch immunohistochemische Techniken Gewebe Ergebnis Ovarstroma Ovarepithel Nierenglomeruli Nierentubuli Brustdrüsentubuli Brustdrüsenduktuli Lungenbläschen Bronchialepithel Hoden Epidermis Tonsillen-Lymphgewebe Tonsillenepithel glatte Muskeln Blutgefäße Prostataepithel negativ positiv
Normales Colonepithel zeigte eine Bindung von allen analysierten menschlichen IgM, monoclonalen Antikörpern, Myelom- IgM und außerdem normalem polyclonalem menschlichem IgM. Diese allgemeine Bindung von IgM an normales Colonepithel wurde somit als nichtspezifisch eingestuft, eine Interpretation, die durch Analyse mittels Elektronenmikroskopie und durch isoelektrische Fokussierung gestützt wurde (vgl. nachstehend). Diese nichtspezifische Antikörperbindung stimmt auch mit dem Wissen des Fachmanns überein.

c) Elektronenmikroskopie

Zur Elektronenmikroskopie wurden 10&sup5; Adenocarcinomzellen pro ml in RPMI-1640-Medium, 10% FCS, in Röhrchen mit Kunststoffstöpseln drei Tage gezüchtet, bis eine einzellige Schicht erhalten worden war. Die Zellen wurden in 0,1% (Vol./Vol.) Glutaraldehyd in 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 bis 60 Minuten bei 4ºC fixiert und anschließend in PBS, angereichert mit Rinderserumalbumin (BSA) und Lysin-HCl, über Nacht bei 4ºC gewaschen. Die Zellen wurden in 30 bis 90% Ethanol bei immer niedrigeren Temperaturen bis zu -20ºC entwässert und sodann in Lowicryl K4M (Chemische Werke Lowi, Bundesrepublik Deutschland) bei -35ºC infiltriert und über Nacht bei -35ºC unter ultraviolettem Licht und danach weitere zwei Tage bei Raumtemperatur polymerisiert.
Ultradünnschnitte (50 bis 60 nm) des Zellen-enthaltenden Lowicryls, die auf beschichtete Nickel-Trägernetzchen aufgebracht worden waren, wurden eingesetzt. Das Verfahren zur Immunomarkierung, das aus dem Schwimmenlassen der Trägernetzchen mit den Schnitten nach unten auf verschiedenen Lösungen bestand, umfaßte die folgenden Schritte: 1. Die Trägernetzchen wurden auf Tropfen von 1% (Gew./Vol.) NaBH&sub4; in PBS 10 Minuten aufgelegt; 2. nach zweimal fünfminütigem Waschen in 0,1% (Gew./Vol.) BSA-Tris wurden die Trägernetzchen auf Tropfen von 3% BSA-Tris überführt (15 Minuten); 3. die Trägernetzchen wurden auf Tropfen von C-OU1-Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur aufgelegt; 4. die Trägernetzchen wurden in 0,1% BSA-Tris 2 x 5 Minuten gewaschen ; 5. die Trägernetzchen wurden auf Tropfen von Kaninchen-Anti-menschliches IgM, gelöst in 3% BSA-Tris, überführt und eine Stunde bei Raumtemperatur belassen; 6. nach Waschen in 0,1% BSA-Tris, 2 x 5 Minuten, wurden die Trägernetzchen auf Tropfen von Ziegen-Anti- Kaninchen-IgG, markiert mit Goldsonden (Janssen Pharmaceuticals) von 15 nm, gelöst in 3% BSA-Tris, gelegt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; 7. die Trägernetzchen wurden in 0,1% BSA-Tris 2 x 5 Minuten und in zweimal destilliertem Wasser 2 x 5 Minuten gewaschen und getrocknet; und 8. die Ultradünnschnitte wurden mit 1% Uranylacetat 10 Minuten und mit 0,4% Bleicitrat zwei Minuten bei Raumtemperatur gefärbt.
Tween 20 und 0,5 M NaCl wurde zu allen Antikörper- und Waschlösungen zugefügt.
Die Ultradünnschnitte wurden in einem bei 80 kV arbeitendem JEOL 100-CX-Elektronenmikroskop untersucht.
Um die Spezifität der immunocytochemischen Reaktionen zu prüfen, wurden Experimente durchgeführt, in denen der primäre Antikörper weggelassen und ein menschliches IgM (Cappel) als primärer Antikörper eingesetzt wurde.
Fig. 3A zeigt das deutliche Muster der Markierung von Colon-Adenocarcinomzellen (Colon 137) in Bereichen, die die Enden von intermediären Filamenten umgeben, und Fig. 3B zeigt das Fehlen von Markierung (durch ein ähnliches Verfahren) von Duodenum-Adenocarcinomzellen (HUTU 80). Schnitte von Colon- Adenocarcinom-Krebsgewebe zeigten eine Markierung nur der Tumorzellen, die wieder mit intermediären Filamenten assoziert waren (nicht gezeigt). Normales Colonepithel zeigte keine Markierung. Durch die Elektronenmikroskopie wurde somit herausgefunden, daß das Zielantigen in Assoziation mit cytoplasmatischen Strukturen vorliegt.

d) Isoelektrische Fokussierung

Die molekulare Charakterisierung des Zielantigens wurde durch isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Tumorzellen oder Krebsgewebe und normales Gewebe wurden durch Ultraschallbehandlung (4 x 30 Sekunden auf Eis) in Extraktionspuffer (75 mM NaCl, 75 mM KCl, 10 mM Hepes, 5 mM EDTA, 5% 2-Mercaptoethanol, 5 mg/l Trasylol, 0,01 mM Leupeptin, 0,01 mM Pepstatin) solubilisiert. Nach der Ultraschallbehandlung wurde Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M zusammen mit 80 mg Saccharose zugesetzt und das Homogenisat 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Unlösliches Material wurde abzentrifugiert (5 Minuten bei 15 000 x g).
Die isoelektrische Fokussierung wurde mit den Extrakten durchgeführt, die auf 1% Agarose-Dünnschichtgel (Agarose IEF, Pharmacia), enthaltend 6 M Harnstoff, 3% (Vol./Vol.) Servalyte 3-10 und 1% (Gew./Vol.) Servalyte 4-6 (Serva), aufgetragen. Als Träger wurde ein-auf Gel basierender Film (LKB) verwendet. Die Fokussierung wurde bei 1500 V/h vor der elektrophoretischen Übertragung der Proteine auf Nitrocellulose durchgeführt. Verbliebene Bindungsstellen wurden durch Inkubation der Nitrocellulose in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl&sub2; und 0,05% Tween 20, blockiert. Die Nitrocellulose wurde in Streifen geschnitten und zwei Stunden bei Raumtemperatur mit dem Hybridomantikörper C-OU1 inkubiert, der in PBS-Tween auf etwa 200 ng/ml verdünnt worden war. Nach Waschen mit PBS-Tween wurden die Nitrocellulosestreifen mit dem mit alkalischer Phosphatase konjugierten F(ab')&sub2;-Anti-IgM-Antikörper (Jackson Immunoresearch) und anschließend mit den Substraten (eine Lösung von 5-Brom-4-chlorindoxylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium) inkubiert.
Fig. 4, linkes Feld, zeigt die Färbung von Extrakten eines Colon-Adenocarcinomtumors und Fig. 4, rechtes Feld, eines Extraktes von normalem Colonepithel. I. Färbung des gesamten Proteins mit Indischer Tusche; II. Färbung mit C-OU1; und III. Färbung mit verschiedenen Hybridom-IgM. C-OU1 zeigte eine deutliche Färbung von sauren Proteinen (pI 5,4 bis 6,2) im Tumorextrakt, nicht jedoch im Extrakt eines normalen Colons.

e) SDS-PAGE und Western-Blotting

Extrakte von Colon 137 (Colon-Adenocarcinomzellen) und HUTU 80 (Duodenum-Adenocarcinomzellen) wurden durch Solubilisierung mit Detergentien (2% SDS, 4 M Harnstoff, 10 mM Iodacetamid) hergestellt und 15 Minuten inkubiert, anschließend wurde die PAGE auf 5 bis 20% Gradientengelen durchgeführt. Die Proteine wurden sodann elektrophoretisch auf Nitrocellulosebögen übertragen. Die Nitrocellulosebögen wurden in 3 mm-Streifen geschnitten und über Nacht bei 4ºC mit C-OU1 inkubiert, worauf eine zweistündige Inkubation mit AP- Kaninchen-Anti-menschlichem IgM (Sigma) folgte. Die Blots wurden in PBS gewaschen und durch fünfzehnminütige Inkubation in 0,2% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Die alkalische Phosphatase wurde durch einstündige Inkubation bei 37ºC mit Substrat, Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlorindoxylphosphatase sichtbar gemacht. Das Molekulargewicht wurde aus der Mobilität der nachstehenden, vorher gefärbten Molekulargewichtsmarker berechnet: β-Galactosidase (116 K), Fructose-6- Phosphatase-Kinase (84 K), Pyruvatkinase (58 K), Fumarase (48,5 K), Milchsäure-Dehydrogenase (36,5 K), Triosephosphatase-Isomerase (26,6 K).
Die Ergebnisse in Fig. 5 zeigen, daß C-OU1 mit einem Protein mit einem Molekulargewicht von 43 000 reagiert, das in den Extrakten von Colon-Adenocarcinom und nicht in den Extrakten von Duodenum-Adenocarcinom gefunden wurde.

Claims

1. Antikörper, der bei der immunohistochemischen Analyse von gefrorenen, in Aceton fixierten Gewebeschnitten an Colon-Adenocarcinom, Ovar-Adenocarcinom, Nieren-Adenocarcinom, Mammacarcinom, Lungen-Adenocarcinom, Nicht-Seminom-Hodencarcinom, Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenduktuli und Prostataepithel bindet und nicht an Lungenepithelcarcinom, Sarcom, malignes Melanom, B-Lymphom, Thymom, Ovar-Stroma, Ovar-Epithel, Nierenglomeruli, Nierentubuli, Lungenbläschen, Bronchialepithel, Hoden, Epidermis, Tonsillen-Lymphgewebe, Tonsillenepithel, glatte Muskeln oder Blutgefäße bindet und der an mit menschlichem Carcinom assoziiertes cytoplasmatisches Antigen bindet, welches ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 43 000 und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,4 bis 6,2 aufweist, und das mindestens ein Epitop enthält, das mit einem monoclonalen Antikörper reagiert, welcher durch die menschliche Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) produziert wird.

2. Antikörper nach Anspruch 1, der ein monoclonaler Antikörper ist.

3. Antikörper nach Anspruch 1, der von einem menschlichen Lymphocyten stammt.

4. Antikörper nach Anspruch 1, der ein polyclonaler Antikörper ist.

5. Antikörper nach Anspruch 3, der von einer Mensch-Mensch- Hybridomzellinie produziert wird.

6. Antikörper nach Anspruch 5, wobei die Mensch-Mensch-Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) ist.

7. Fragment eines Antikörpers nach Anspruch 1, der als eine Alternative zum vollständigen Antikörper verwendet werden kann.

8. F(ab')&sub2;- oder Fab-Fragment eines Antikörpers nach Anspruch 1.

9. Mit menschlichem Carcinom assoziiertes cytoplasmatisches Antigen, das mindestens ein Epitop aufweist, welches in gefrorenen, mit Aceton fixierten Cewebeschnitten von Colon-Adenocarcinom, Ovar-Adenocarcinom, Nieren-Adenocarcinom, Mammacarcinom, Lungen-Adenocarcinom, Nicht-Seminom-Hodencarcinom, Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenduktuli und Prostataepithel so exponiert ist, daß es an den monoclonalen Antikörper bindet, der von der Mensch-Mensch- Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) produziert wird, und das nicht so ausgesetzt ist in gefrorenen, in Aceton fixierten Gewebeschnitten von Lungenepithelcarcinom, Sarcom, malignem Melanom, B-Lymphom, Thymom, Ovar- Stroma, Ovar-Epithel, Nieren-Glomeruli, Nieren-Tubuli, Lungenbläschen, Bronchialepithel, Hoden, Epidermis, Tonsillen-Lymphgewebe, Tonsillen-Epithel, glatten Muskeln oder Blutgefäßen, wobei das Antigen ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 43 000 und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,4 bis 6,2 aufweist, oder ein Analog davon.

10. Antigen nach Anspruch 9, das in im wesentlich reiner Form vorliegt.

11. Antikörper, nämlich ein Hybridantikörper, der eine Kombinationsstelle aufweist, die spezifisch gegen ein Epitop des Antigens nach Anspruch 9 gerichtet ist, und eine andere, die spezifisch gegen ein Epitop eines anderen Antigens gerichtet ist, oder ein Arzneimittel.

12. Antikörper nach Anspruch 11, wobei das andere Antigen ein Differenzierungsantigen von cytotoxischen T-Zellen ist.

13. Antikörper nach Anspruch 11, wobei das Arzneimittel aus cytotoxischen und antineoplastischen Mitteln ausgewählt ist.

14. Anti-idiotypischer Antikörper, der gegen einen Antikörper gerichtet ist, der mit dem Antigen nach Anspruch 10 reagiert.

15. Anti-anti-idiotypischer Antikörper, der gegen den anti- idiotypischen Antikörper nach Anspruch 14 gerichtet ist.

16. Diagnosemittel, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ein Antikörperfragment nach Anspruch 7 oder 8, einen anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 14, oder einen anti-anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 15.

17. Diagnosemittel nach Anspruch 16, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment mit einem Marker versehen ist.

18. Diagnosemittel nach Anspruch 17, wobei der Marker ausgewählt ist aus Enzymen, fluoreszierenden Substanzen, radioaktiven Isotopen und Liganden, wie Biotin.

19. Diagnosemittel nach Anspruch 16, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment direkt oder über einen Spacer an einen festen Träger gekuppelt ist.

20. Diagnosemittel nach Anspruch 19, wobei der feste Träger ein Polymer oder eine mit einem Polymer beschichtete Matrix umfaßt.

21. Diagnosemittel nach Anspruch 20, wobei das Polymer ausgewählt ist aus Kunststoff, Cellulose (z.B. Nitrocellulosepapier), Silicon, Siliciumdioxid und einem Polysaccharid, wie Agarose oder Dextran.

22. Diagnosemittel nach Anspruch 19, wobei der feste Träger in Form einer Platte, eines Streifens, eines Films, als Mikropartikel oder als Papier vorliegt.

23. Diagnosemittel nach Anspruch 19, wobei der Spacer Protein A ist.

24. Diagnosemittel, umfassend ein Antigen nach Anspruch 10.

25. Diagnosemittel nach Anspruch 24, wobei das Antigen mit einem Marker versehen ist.

26. Diagnosemittel nach Anspruch 25, wobei der Marker ausgewählt ist aus Enzymen, fluoreszierenden Substanzen, radioaktiven Isotopen und Liganden, wie Biotin.

27. Diagnosemittel nach Anspruch 24, wobei das Antigen direkt oder über einen Spacer an einen festen Träger gekuppelt ist.

28. Diagnosemittel nach Anspruch 27, wobei der feste Träger ein Polymer oder eine mit einem Polymer beschichtete Matrix umfaßt.

29. Diagnosemittel nach Anspruch 28, wobei das Polymer ausgewählt ist aus Kunststoffen, Cellulose, Silicon, Siliciumdioxid und einem Polysaccharid, wie Agarose oder Dextran.

30. Diagnosemittel nach Anspruch 27, wobei der feste Träger in Form einer Platte, eines Streifens, eines Films, als Mikropartikel oder als Papier vorliegt.

31. Diagnosemittel nach Anspruch 27, wobei der Spacer Protein A ist.

32. Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers für ein Coloncarcinom-assoziiertes cytoplasmatisches Antigen, das ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 43 000 und einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,4 bis 6,2 aufweist und das mindestens ein Epitop enthält, das mit einem monoclonalen Antikörper reagiert, welcher von der menschlichen Hybridomzellinie B9165 (ECACC 87040201) produziert wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellung von Lymphocyten, die von mesenterischen Lymphknoten stammen, die vom Tumorbereich in einem Patienten mit Colonkrebs ableiten, Fusionieren dieser Lymphocyten mit einer menschlichen Zellinie, die zur Verwendung in einer Fusion für den Zweck der Erzeugung von Mensch-Mensch-Hybridomen geeignet ist, Absuchen der erhaltenen Hybridomzellen auf Hybridome, die einen monoclonalen Antikörper sekretieren, der spezifisch an Colon-Adenocarcinom, Ovar-Adenocarcinom, Nieren-Adenocarcinom, Mammacarcinom, Lungen-Adenocarcinom, Nicht-Seminom-Hodencarcinom, Brustdrüsentubuli, Brustdrüsenduktuli und Prostataepithel bindet und nicht an Lungenepithelcarcinom, Sarcom, malignes Melanom, B-Lymphom, Thymom, Ovar-Stroma, Ovar- Epithel, Nierenglomeruli, Nierentubuli, Lungenbläschen, Bronchialepithel, Hoden, Epidermis, Tonsillen-Lymphge webe, Tonsillen-Epithel, glatte Muskeln oder Blutgefäße bindet.

33. Verfahren zur in vitro-Diagnose von menschlichem Carcinom, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit von einem vermutlichen Krebspatienten mit einem Diagnosemittel nach einem der Ansprüche 16 bis 23, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Antikörperfragment nach Anspruch 7 oder 8, und Bestimmung der Gegenwart von an den Antikörper oder das Antikörperfragment gebundenem Antigen.

34. Verfahren zur in vitro-Diagnose von menschlichem Carcinom, umfassend das Inkontaktbringen einer Gewebeprobe eines vermutlichen Krebspatienten mit einem Diagnosemittel nach einem der Ansprüche 16 bis 23, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Antikörperfragment nach Anspruch 7 oder 8, und Bestimmung der Probenbereiche, an die Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden wird.

35. Verfahren zur in vitro-Diagnose von menschlichem Carcinom, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit von einem vermutlichen Krebspatienten mit einem Diagnosemittel nach einem der Ansprüche 27 bis 31, umfassend das Antigen nach Anspruch 10, oder mit einem Diagnosemittel nach einem der Ansprüche 20 bis 23, umfassend den anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 14, und Bestimmung der Gegenwart von gebundenem Antikörper gegen das Antigen nach Anspruch 10, das in der Körperflüssigkeit vorliegt.

36. Arzneimittel für die Behandlung von menschlichem Carcinom, umfassend ein Antigen nach Anspruch 10 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Antikörperfragment nach Anspruch 7 oder 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten.

37. Arzneimittel zur Behandlung von menschlichem Carcinom, umfassend einen anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 14 oder einen anti-anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 15 und einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten.

38. Verwendung eines Antigens nach Anspruch 10 oder eines anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von menschlichem Carcinom.

39. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Antikörperfragments nach Anspruch 7 oder 8 oder eines anti-anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von menschlichem Carcinom.