JPH02503383A - ヒト腫瘍関連抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト腫瘍関連抗原 λｉ空塵１ この発明は、腫瘍関連抗原、その抗原に対する抗体、その抗原または抗体からな る診断用薬剤、多種の診断または治療の目的のための抗原または抗体の使用に関 する。

発明の背景 腫瘍に関連する抗原（即ち、腫瘍により発現される抗原）の同定及び特性決定に より、一層正確に癌を検出し診断する方法を開発する可能性は、医学上非常に興 味深い。

腫瘍関連抗原に対するモノクロナール抗体は、その著しい特異性のために癌の検 出に重要な役割を果たす。これまで、癌関連抗原に対応するほとんどのモノクロ ナール抗体は、免疫感作されたマウスの膵臓細胞とヒトの癌細胞系との融合また は癌患者の細胞とマウスの骨髄腫細胞系との融合から得られるハイブリドーマに よって発現される。マウスの免疫原性は、マウスのモノクロナール抗体により認 識される抗原の必要条件であり、それらは必ずしもヒトの抗体により認識される 抗原に対応するものではない、さらに、患者は、これらの抗体を異種の蛋白質と 認識しマウスの抗体に対し逆の免疫応答をするので、これら果、治療効果が無効 になり、潜在的に危険なアレルギー反応を引起こすことになる。

ヒトのモノクロナール抗体は、ヒトにおいて非相同抗体よりも免疫原性が少ない ので関連抗原を認識できると仮定すると、ヒトハイプリドーマ抗体は癌患者に投 与される診断用及び治療用薬剤として非常に有望である。

マウスのモノクロナール抗腫瘍抗体の特異性に関する問題は診断と治療に用いら れている結腸の腺癌抗体１７−ＡＩにより説明されるが、腫瘍組織と同様に正常 の組織とも反応することが判明している［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏ＠ａ ）　５巻補遺１．１９１１６年、特集Ｃａ−１７−＾ｌについて、ゼット、ステ プルウスキー（Ｚ。

５ｔｅｐｌｅｖｓｋｉ）　］。

投与されたマウスモノクロナール抗体に対する患者の免疫応答については、多く の研究者達により報告されている［例えば、エイチ、エフ、シーアズ等（Ｈ，Ｆ 、　５ｅａｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　１９８５年、 　ｉニア６２−７６５頁：及びエム、ニス、ミツチェル等（Ｍ、Ｓ、　ＭｉＬｃ ｈｅｌｌ　ｅＬ　ａｌ、）　、プログレス　キャンサー　リサーチ　セラボイテ ィックス（Ｐｒｏｇ、　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｒｅｓ、　Ｔｈｅｒ、）　２１巻、１ ９８２年、Ｒａｖｅｎ出版、二ニーヨーク］。

結腸−直腸ガンは、最頻度で発生するガンの１つであり、ガンによる主な死因の １つである。このタイプのガンの予知は、長期間に亘って改善されておらず、従 って結腸−直腸ガンの検出及びその手術に伴うアジュバント治療の新規な方法が 必要である。

従って、ヒトの癌腫瘍に関連する抗原、特に実質的に正常な組織では発現されな い抗原及び抗原に対応する抗体が診療及び治療のために必要である。

発明の説明 従って、この発明は見掛けの分子量が約４３，０００で、等電点が約５．４〜６ ．２の範囲で、かつヒトのハイブリドーマ細胞系Ｂ９１６５（ＥＣＡＣＣ８７０ ４０２０１）またはそれらの類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）により産生されるモノ クロナール抗体と反応性の、少なくとも１つのエピトープ（構造既知の抗原決定 基）を有するヒトのカルチノーマ（癌腫）に関連する抗原に関する。

本願で用いる「類似体」という用語は、この抗原と類似のアミノ酸の組成または 配列の蛋白質またはポリペプチドを示すために用いられ、類似体の免疫原性に逆 効果を及ぼさないような小さな変化は許容される。類似のポリペプチドまたは蛋 白質は、例えば組換え体生物からのような、癌Ｕ瘍組織以外の起原から誘導され るか、または一部もしくは全部が合成体であってもよい。この語はさらに例えば その免疫原性サブシイケンス（５ｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）のような抗原誘導体を 意味する。

抗原に対して特異的な反応性を存する単クローン抗体を用いる標準の方法による 免疫細胞化学的分析結果は、ヒトの結腸癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）　、乳癌腫 組織には、新しい抗原が存在するが、十二指腸腺癌（ａｄｅｎｏｅａｒｃ　ｉｎ ｏｍａ　）組織、黒色腫もしくはバーキットリンパ腫組織またはヒトの末梢血白 血球には存在しないことを示す（下記第１表参照）。

抗原に対して特異的な反応性を有する単クローン抗体を用いる標準の方法による 免疫組織化学的分析結果は、結腸腺癌腫、卵巣腺癌腫、腎臓腺癌腫、乳腺癌腫、 肺腺癌腫及び非情上皮の畢丸癌腫組織には新しい抗原の存在を示すが、しかし肺 上皮癌腫肉腫、悪性の黒色腫、Ｂ−リンパ腫もしくは胸腺腫組織、または孔管、 乳細管もしくは前位腺上皮以外の正常組織には存在しないことを示す（下記第ｎ Ａ及び１８表参照）。

従って、標準免疫細胞化学的及び免疫組織化学的分析により測定されるように、 この新規の抗原は、実質的に正常なヒトの組織には見出されず、癌腫組織、特に 腺癌腫組織により発現されるが、その他の悪性組織には発現されないことが見出 された抗原であると結論づけられる。特にこの新規の抗原は結腸腺癌腫に関連し ていると思われる。

結腸癌腫で発現される腫瘍関連抗原は、ヨーロッパ特許第１９９．５８６号に開 示されている。しかしながら、この抗原は分子量や等電点のような特性が、本発 明の抗原とは異なっており、正常な結腸組織と悪性の結腸組織の両方に存在して いることが示されている（即ち、腫瘍特異的でないようである）が、本発明の抗 原は、上記のように数種の異なる悪性組織に存在することが分かっている。

本発明の抗原は、例えば、当業者によく知られた方法に従い本発明の抗原に対す る抗体を不溶化するアフィニテイクロマトグラフィに付して、癌腫細胞の抽出物 または癌腫瘍の抽出物から分離することによって得ることができる［リジンスト ン。工＋、　（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、　Ａ、）及びソープ１．アール、　（Ｔｈ ｏｐｅ、　Ｒ，）　、イムノケミストリー　イン　プラクテイス（ｌａ＋ａｕｎ ｏｃｈｅａｉｓｔｒｙ　１ｎＰｒａｃｔｉｃｅ）　、ブラックウェル　オックス フォード　１９８７年参照］。さらに詳細な分子特性を測定し、かつ診断または 治療の目的に使用するのに十分な純粋な形で抗原を得るためには、１つまたはそ れ以上の蛋白質精製法（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマ トグラフィ、配位子アフイニテイクロマトグラフィ、疎水性インターラクション クロマトグラフィ（１ｎｔｅｒａｃ目ｏｎ　ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　 ｓ変性もしくは未変性のゲルによる電気泳動及び種々の沈殿法）による精製が必 要である。

しかしながら抗原の適当な供給を保証するために、組換えＤＮＡ法により抗原を 産生ずることが有利である。この方法は、（ａ）例えば、常法によりヒトの癌腫 細胞の相補的ＤＮＡ（ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）または遺伝子ライブラリーを作製し、 陽性のクローンをスクリーニングすることによって、抗原をコードするヌクレオ チド配列を分離し：（ｂ）適切な複製可能な発現ベクターに上記配列を挿入し； （Ｃ）適切な宿主の微生物を（ｂ）工程で産生じたベクターで形質転換し；　（ ｄ）（ｃ）工程で産生じた微生物を抗原を発現する適切な条件下で培養し：及び （ｅ）抗原を培地から収穫することからなる方法である。

この方法の工程（ａ）〜（ｅ）は、標準方法により行なうことができる、例えば マニアティス等（Ｍａｒｒｉａｔｉｓ　ｅＬ　ａｌ）　、（分子クローニング（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）　：ライラリー　マニュアル（Ａ　１ａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）、コールド　スプリング　ハーバ−１１９８ ２年）に記載されている。

抗原をコードする遺伝子が一旦分離されると、そのＤＮＡ配列を標準方法により ［例えばサンガー等（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　、サイエンス２１４巻、１ ９８１年、１２０５頁またはギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、サイエンス２１４ 巻、１９８１年、１３０５頁に記載のような方法で〕確立することができ、かつ そのＤＮＡ配列に基づいてアミノ酸配列を推定することができる。ついで、抗原 またはそのサブシイケンスは、通常のペプチド合成法により製造することができ る。

例えば液相または固相ペプチド合成法があり、同相ペプチド合成法が好ましい方 法である［アール、　ビー、　メリーフィールド（Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｙｆｉｅ ｌｄ）　、Ｊ、＾ｍ、　Ｃｈｅｗｒ　Ｓｏｃ　８５．　２１４９（１９６３年） 、またはスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｄ）及びヤング（Ｙｏｕｎｇ）　、５ｏｌ ｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｅｓ、　Ｆｒｅｅｓ＋ｉｎ　 ＆　Ｃｏ、、米国、サンフランシスコ、１９６９年参照］。固相合成法において アミノ酸配列は、はじめのアミノ酸を固形担体に結合し、ついで所望の長さが得 られるまでペプチド結合法によって他のアミノ酸をその配列の中に付加すること によって構成される。

他の観点では、この発明は上記の癌腫抗原に特異的に対応する抗体に関する。

上記の抗体はモノクロナール抗体の方が有利である。その理由はポリクロナール 抗体より高度に特異的であるために正確な診断測定に、有用だからである。上記 のことを考慮して患者に注入しようとする抗体はヒトに由来するものが好ましい 。即ち、これまでヒト腫瘍関連抗原に対応するモノクロナール抗体の生成に有用 であったマウスのリンパ球とマウスの骨髄腫細胞系との融合生成物よりもむしろ 、ヒトのリンパ球とヒトの細胞系との融合生成物またはヒトのリンパ球と例えば マウスの骨髄腫細胞系との融合生成物により産生されるものが好ましい。そのよ うなモノクロナール抗体は抗原の種々のエピトープに対応して生成される。有用 なモノクロナール抗体の１例は、ヒトハイブリドーマ細胞系Ｂ９１６５　（１９ ８５年４月２日に英国、ウィルトシア、サリスベリー、ボートン　ダウン、　ｔ ｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（ＥＣＡＣＣ）の応用微生物研究センターに、受託番号Ｅ ＣＡＣＣ８７０４０２０１で寄託）によって産生されたＣ−０Ｕ１と命名された 抗体である。

この発明のモノクロナール抗体は、 （ａ）癌患者から抗体産生細胞を分離し；（ｂ）抗体産生細胞と適当なヒト融合 細胞系の細胞とを融合し、得られた前記の抗体産生のハイブリドーマ細胞を選択 し、次いでクローン化し；及び （ｃ）上記抗体産生に適切な培地で工程（ｂ）の細胞を増殖させ、ついで増殖培 地から抗体を収穫することからなる方法により製造される。

ヒト融合細胞との融合に用いられる抗体産生細胞としては、牌臓またはリンパ節 の細胞が好ましい。抗体産生細胞とヒト融合細胞との融合は、実質的にキューラ −及びミルシュタイン（Ｗｏｅｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、Ｎａ ｔｕｒｅ　２５６巻１９７５年４９５頁、またはキューラ−（Ｗｏｅｈｌｅｒ） 、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＩＩ巻、１９８１年、２８５ 〜２８Ｂ頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓに記載のようにして行なわれ、すな わちポリエチレングリコールのような融合プロモーターの存在下で行なうことが 好ましい。使用されるヒト融合細胞系は選択された培地の中で生存できないタイ プのものが好ましい。細胞融合に頻繁に用いられる細胞系の１つは、ヒボキサン チン−グアニン　ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素が欠けていて、その結 果、ヒボキサンチン、アミノプリテンおよびチミジンを含有する培地（ＨＡＴ培 地）では増殖できない細胞系である。

ついで、癌腫抗原に対応する抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞の選択を、未融 合の抗体産生細胞、未融合のヒト融合細胞及び推定上の融合細胞を選択培地（Ｈ Ａ　Ｔのような）中で培養することによって行なうが、その培地中では未融合の ヒト融合細胞は増殖できず、最後に死に絶える。未融合の抗体産生細胞は限られ た時間内だけ生存でき、その後は死に絶える。一方うまく融合した細胞は、親の ヒト融合細胞から永久増殖性を、かつ親の抗体産生細胞から選択培地中で生存す る能力を遺伝されるため、増殖が続く。

産生じた抗体産生細胞は、例えばＰＲＭＩ　１６４０のような適切な培地でクロ ーン化した後、生体外で増殖させることができる。

その結果、細胞によってモノクロナール抗体が培地の上清中に分泌されるため、 モノクロナール抗体は非常に高純度で産生される。ついでその抗体は、遠心分離 法、濾過法、沈澱法、クロマトグラフィー法またはそれらの組合せのような常法 により分離することができる。

モノクローン性を必要としない場合には、抗体はポリクロナール抗体であっても よい。これは、適当な動物（例、ウサギ、マウスまたはヤギ）に抗原の実質的に 純粋の製剤を注射し、次いで最初の採血までの６ケ月間、適切な間隔（例、２週 間〜ｌケ月）をおいて１回以上の追加免疫注射を行なうことにより調製される。

ついでこの確立された免疫法を続ける間、動物は各追加免疫化を行なってから約 １週間後に採血し、次いで常法、例えばハーボエ（Ｂａｒｂｏｅ）及びインギル ド（Ｉｎｇｉｌｄ）　（Ｓｃａｎｄ。

Ｊ、１ｓｓｕｎ、、　２巻、（補遺、　ｔ）　、　ｔ９７３年、１６１〜１６４ ）に記載のような方法で、抗体を血清から分離する。

いくつかの目的のために抗体は、ハイブリッド抗体であるのが有利で、このハイ ブリッド抗体は、この発明の抗原のエピトープと特異的に対応する１つの結合部 位（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　５ｉｔｅ）と、同一抗原の他のエピトープ、他の抗原 のエピトープまたは薬剤と特異的に対応する結合部位とを有する。「結合部位（ ｃｏ■ｂ−ｉｎｉｉｇ　５ｉｔｅ）　Ｊという語は、抗体分子の種々の領域にお ける抗原認識構造を意味すると理解される。ハイブリッド抗体によって、試料中 の抗原を検出し、試薬が最大の効果を示す腫瘍の部位に、薬剤または他の生物学 的活性分子または他の抗原を結合させる特殊な方法が可能になる。有利な具体例 では、ハイブリッド抗体が反応性である他の抗原としては、細胞障害性Ｔ細胞の 分化した抗原があげられる（Ｓｔａｅｒｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ３１４巻。

１９８５年、６２８頁参照）。ハイブリッド抗体が反応性である薬剤としては、 細胞障害性薬剤または抗腫瘍性薬剤から選択されるのが好ましい（Ｃｏｌｌｉｅ ｒ、　Ｒ，Ｊ、及びＫａｐｌａｎ　Ｄ、　Ａ、、　ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅ ｒｉｃａｎ　２５１巻、１９８４年、４４頁参照）。

ハイブリッド抗体は、２つの関連抗体を産生ずる２つのモノクロナール細胞系間 のハイブリッドにより製造されるかまたはその２つの抗体のフラグメント（片） を化学的に結合することにより製造される。

種々の目的のためには抗体は下記に示すように、抗イデイオタイプ抗体（ａｎｔ ｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　、即ち抗原エビオトープと反応 性の抗体部位に対応する抗体であってもよい。抗イデイオタイプ抗体はこの発明 の抗原と反応性の抗体に対応する。

抗イデイオタイプ抗体はモノクロナールまたはポリクロナール抗体についてさき には概説したのと同様な方法で製造できろ。

抗体は上記定義した抗イデイオタイプ抗体に対応する抗抗イディオタイプ抗体で あってもよい。

一層重要な観点では、この発明は、上記のようなこの発明の抗体、上記のような 抗イデイオタイプ抗体、または上記のような抗抗イディオタイプ抗体からなる診 断用薬剤に関する。

いくつかの場合、例えばテストを受ける試料中、癌腫抗原の存在下、抗体が凝集 して結合する固形粒子の凝集定量法に、この診断用薬剤が用いられる時には、抗 体の標識化は必要でないが、多くの目的のためには結合抗体を検出するために、 抗体に標識をつけた方が好ましい。二重抗体検定法（サンドイツチ法）では、抗 体の少なくとも１つが標識を備えている。これに関連して標識として有用な物質 は、酵素、蛍光物質、放射性同位元素及びビオチンのような配位子から選択され る。

標識物質として用いられる酵素の例としては、ベルオキシターゼ、例えばホース ラディシュ（ワサビダイコン）ベルオキシターゼ、またはホスファターゼ類、例 えばアルカリホスファターゼ類が挙げられる。酵素は直接検出できないので、酵 素は例えば蛍光性または着色性で検出可能な反応生成物を形成するような基質と 結合しなければならない。有用な基質の例としては、過酸化水素１０−フェニレ ンジアミン、過酸化水素／アジノジエチルベンゾチアゾリンスルホン酸、過酸化 水素／ジアミノベンジジン及びｐ−ニトロフェニルホスフェートが挙げられる。

このような反応生成物は発色または変色を目視によりまたは分光光度計で検出で きる。

標識物質として有用な蛍光物質の例として、過酸化水素／ｐ−ヒドロキシフェニ ル酢酸及びメチルランベリフェニルホスフェートが挙げられる。このような物質 は、それ自体公知の方法で蛍光分光光度計により検出できる。

標識物質として有用な放射性同位元素の例としては、！−１２５，５−３５及び Ｐ−３５が挙げられる。これらの同位元素により放射される放射線は、それ自体 公知の方法でγ線カウンターまたはシンチレーションカウンターにより検出され る。

好ましい具体例では、診断用薬剤は固形担体に結合した少なくとも１つの抗体で 構成される。これは未結合抗体は標識されているが、固形担体に結合した抗体は 標識されない場合の二重抗体検定法に用いられる。固形担体は、ポリマーからな るか、またはポリマーが塗布されるマトリックスから構成されていてもよい。固 形担体はプラスティック（例、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナ イロン、ポリビニリデンジフルオリト）、セルロース（例、ニトロセルロース） 、シリコン、シリカ及びアガロースもしくはデキストランのような多糖類から選 択される。

診断法に用いるには、固形担体は、通常の形態のいずれであってもよい。即ち、 板状影、（例えば薄層または好ましくはマイクロタイター板のような）、ストリ ップ、フィルム、紙またはラテックスビーズなどのような微粒子の形態であって もよい。

モノクロナール抗体は、固形担体に直接結合させるのではなくて、固形担体の上 に固定されたスペーサーと結合させてもよい。スペーサーの例としてはプロティ ンＡが挙げられる。

実用的には、完全な抗体に基づくすべての方法または応用法は、完全な抗体の代 わりに抗体のフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）＊またはＦａｂフラグメント、 を用いて行なうことができるということは注目すべきである（Ｄｅｌａｌｏｙｅ 、　Ｂ、　ｅｔ、、Ｊ、　Ｃｈｉｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ　８１巻、１９８６年、３０１頁参照）。

サンドイッチ検定法に使用する際には、診断用薬剤はさらに他の抗体から構成さ れていてもよい。この他の抗体はｔｙ＋識され、及び／または上記の固形担体と 結合してもよい。この具体例では、抗体の一方または両方が上記のようにモノク ロナール抗体であってもよい。

別に、この発明の診断用薬剤は上に定義したような癌腫抗原から構成されてもよ い。この薬剤は試料中の癌腫抗原に対応する抗体の存在を検出するのに用いられ る。この診断用薬剤は、この発明の抗体からなる診断用薬剤として前記したいず れの特徴も別の方法で示すが、抗原と抗体とが結合するのを検出するよりもむし ろ結合した抗体を検出する。

さらに別の観点では、この発明は、ガンの疑いのある患者からの体液の試料を、 この発明の抗体からなるこの発明の診断用薬剤に接触させ、結合した抗原の存在 を測定することからなるこの発明の抗原を発現するヒト癌腫生体外診断法に関す る。抗体は標識をつけられ、及び／または上に例示した固形担体に結合されてい てもよい。体液は、血液、血漿、血清、リンｌ（液、喀痰、尿及び胃腸液から選 択される。

この方法の好ましい具体例では、試料は固形担体に結合した第１のモノクロナー ル抗体と共に培養され、次に標識をつけた第２のモノクロナール抗体まはポリク ロナール抗体と共に培養される。この具体例の１例としてサンドイッチ　ェライ サ法（ＥＬＩＳＡ）　（酵素結合免疫吸着検定法、ｅｎｚｙｍｅ−１１ｎｋｅｄ ｉ＊５ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ、　ａｓｓａｙ）　（Ｖｏｌｌｅｒ、　Ａ、等、、 　Ｂｕｌｌ、　ｆｏｒｌｄ　ＩｌｅａｌｔｈＯｒｇａｎ、　５３巻、１９７６年 、５５頁に記載）がある。

別の具体例（いわゆる競合的結合測定法）では、試料は固形担体に結合したモノ クロナール抗体と共に培養し、次に標識をつけた癌腫抗原と共に培養して、後者 （標識をつけた癌腫抗原）は、試料中に存在する癌腫抗原と、抗体の結合部位に ついて競合する。

その他の具体例は、癌の疑いのある患者からの組織試料にこの発明の抗体からな るこの発明の診断用薬剤を接触させ、試料の抗体が結合される部位を測定するこ とからなる、この発明の抗原を発現するヒト癌腫生体外診断法に関する。このよ うな免疫組織化学的方法は十分に確立された方法、例えば下記実施例２に記載し た方法で行なうことができる。

この発明の診断法のさらなる具体例は、この発明の抗体による生体内腫瘍（特に 癌腫）の位置確認法に関する。この方法は検出が可能なように標識をつけたこの 発明の抗体の診断上有効な量を投与し結合した抗体の位置する部位を決定するこ とからなる方法である。抗体は放射性同位元素により標識され、ついで注入し、 公知方法、例、適切な構成のγ線検出器により位置を決定する（Ｍａｃｈ、　Ｊ 、−Ｐ、等、Ｎａｔｕｒｅ　２４８＠、１９７４年、７０４頁参照）。

なおさらなる具体例は、癌の疑いのある患者からの体液試料に、この発明の抗原 または抗イデイオタイプ抗体から構成されるこの発明の診断用薬剤を接触させ、 上記体液中に存在するこの発明の抗原に対応する結合抗体の存在を測定すること からなる、この発明の抗原を発現するヒト癌腫生体外診断法に関する。

さらなる観点では、この発明は、この発明の抗原、またはこの発明の抗体及び医 薬的に受容な賦形剤からなる、ヒト癌腫治療用医薬組成物に関する。

この発明の組成物に用いられる賦形剤は、医薬的に受容な基剤のいずれでもよい 、この基剤は、注射用組成物の製造に通常用いられる基剤、例えば等張液または 緩衝生理食塩水のような希釈剤、懸濁剤等のいずれでしよい。組成物は、抗原ま たは抗体の治療上の育効鳳に組成物中の抗原または抗体の所望な濃度を生成する ような基剤量を混合して製造される。

いくつかの場合、抗原または抗体を担体、特に高分子担体と結合させるのが有利 である。担体としては、通常、毒素が疎水性非共有結合の相互作用により結合す るプラスチックのようなポリマー、例えばポリスチレン、または抗原または抗体 が共有結合する多糖類またはポリペプチドのようなポリマー、例えばウシ血清ア ルブミン、卵アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　１ｉｓ ｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）が挙げられる。さらに担体は、抗原または抗体 が結合される薬剤、例えば細胞障害性剤または抗腫瘍性剤から選択されるのが有 利である。または担体は細胞障害性エフェクター（ｅ４ｒｅｃＬｏｒ）機構、例 えば細胞障害細胞に対応する他の抗体であってもよい。担体は無毒性でかつ非ア レルギー誘発物であるのが好ましい。高分子担体が組成物の免疫原性を高めるよ うに、抗原または抗体は高分子担体と多価結合させてもよい。

経口投与には、組成物は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、パスタ剤、ゲル剤、混合物 または任意に徐放性剤皮もしくは胃を通過する際抗原を保護する剤皮を備えた懸 濁剤の形態であってもよい。

固形製剤、即ち顆粒剤、錠剤及びカプセル剤は、充填剤（例えば、糖、ソルビト ール、マンニトール及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロー スのようなセルロース誘導体及びポリビニルピロリドン）、崩壊剤（例えば、澱 粉、炭酸水素ナトリウム及び炭酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸 マグネシウム、タルク及びステアリン酸カルシウム）を含有していてもよい。半 固形製剤、即ちパスタ剤またはゲル剤は、アルギン酸塩、ゼラチン、カラゲナン 、トラガントゴム及びペクチンのようなゲル剤、流動パラフィンのような鉱物油 、トウロモコシ油、ヒマワリ油、ナタ油及びブドウ種子の口部（ｇｒａｐｅ　ｋ ｅｒｎｅｌ　ｏｉｌ）のような植物油、並びに澱粉、ゴム、ゼラチンのような増 結剤等から構成されていてもよい。液体製剤、即ち混合物及び懸濁剤は、水性ま たは油性基剤、例えば水、流動パラフィンのような鉱物油、トウロモコシ油、ヒ マワリ油、ナタネ油、ブドウ種子口部のような植物油から構成されていてもよい 。この発明の抗原は、通常の方法に従って液体基剤中に懸濁される。

徐放性剤皮は、例えば腸溶剤皮が挙げられ、シェラツク（ｓｈｅｌｌａｃ）、セ ルロースアセテートフタレートのようなセルロースアセテートエステル類、ヒド ロキシブロビルメチルセ°ルロースフタレートのようなヒドロキシプロピルメチ ルセルロースエステル類、ポリビニルアセテート　フタレートのようなポリビニ ルアセテートエステル類、及びメタクリル酸と（メタ）アクリル酸エステルとの ポリマー類から選択される。

この組成物は、例えば坐剤のような直腸投与にも適用される。

この上うな坐剤は、カカオ脂または他のグリセリドのような通常の賦形剤を含有 してもよい。

最後に、この発明は、ヒト腺癌治療薬剤の製造のためのこの発明の抗原もしくは こ“の発明の抗イデイオタイプ抗体の使用、またはヒト癌腫治療薬剤の製造のた めのこの発明の抗体もしくは抗抗イディオタイプ抗体の使用に関する。

この発明の癌腫抗原を発現する癌、特に癌腫の治療は、当業者に公知の多種の方 法で行われる。抗原に対応する抗体（特に上記の理由のヒトモノクロナール抗体 ）が癌患者に注射され、腫瘍を、直接攻撃するかまたは多種のエフェクター機構 、例えば補体媒介細胞障害作用または抗体依存性細胞媒介細胞障害作用によって 攻撃する。この抗体は、上記のように患者に注射する前に、例えば薬剤に結合す るか（即ち、この薬剤が抗体の活性部位に輸送されて）、または細胞障害性Ｔ細 胞もしくは他の細胞障害性細胞における抗原のような細胞障害エフェクター機構 に対応する他の抗体と結合することにより修飾されてもよい。

抗原に対する１つの結合部位と、上記のような他の抗原または薬剤に対する他の 結合部位とを有するハイブリッド抗体は、問題の腫瘍に対して二通りの攻撃を行 うのに有利に用いられる。

この発明の抗体は、循環腫瘍抗原または腫瘍抗原を含有する免疫複合体を除去し 、その結果上記腫瘍抗原または免疫複合体によって誘発された麻痺から免疫系を 回復させて抗癌免疫応答を再構成する生体外装置に用いられる。

この発明の癌腫抗原は、体内に抗癌免疫応答を誘発するための免疫化に用いられ る。さらにこの抗原は、癌患者の白血球と共に抗原を培養することにより癌に対 応するエフェクター細胞を産生させるために生体外で用いられる。

癌腫抗原は、抗体を用いるのと同様な方法で、抗腫瘍抗体または免疫複合体を除 去する生体外装置で用いられる。

さらに癌腫抗原に対応する抗体は、抗イデイオタイプまたは抗抗イディオタイプ の免疫応答を誘発するために投与される。

この発明の癌腫抗原と反応する抗体に対応する抗イデイオタイプ抗体（モノクロ ナール、ポリクロナールまたはこれらのフラグメントのいずれか）は、抗原のエ ピトープと同様なエピトープを発現し、従って、抗腫瘍免疫応答を誘発する免疫 化に対して同様の様式で用いられる。このような抗体は、さらに抗原及び第１の 抗体に対して、上記のような生体外装置中で用いられる。

抗抗イディオタイプ抗体は、第１の抗腫瘍抗体と同様な方法で用いられる。

図面の簡単な説明 この発明は、次の実施例及び添付の図面によりさらに詳細に説明される。

第１図はＣ０ＬＯ２０１細胞類（結腸の腺癌細胞類、陽性）のＣ−０υｌによる 免疫細胞化学的染色及び同細胞類の非反応性ヒトハイブリドーマ１ｇ引二よる染 色（陰性）を示す。

第２Ａおよび２Ｂ図は、結腸腺癌の冷凍組織標本（２Ａ図）と正常な扁桃腺組織 （２Ｂ図）のＣ−０ＵＩによる免疫細胞化学的染色を示す。

第３Ａ図および３Ｂ図は、Ｃ−０１１１とＣｏ１ｏｎ１３７細胞ＷＡ（結腸性腺 癌細胞類、陽性）との反応（３Ａ図）及びＩＩＵＴＵ　８０　（−二指腸線癌細 胞類、陰性）との反応（３Ｂ図）の電子顕？１鏡による分析結果を示す。

第４図は、等電点電気泳動法によって分離された組織抽出物の免疫プロット分析 結果を示す。

第５図は、Ｃ−０ＵＩで標識をつけて、５ＤＳ−ＰＡＧＥプロット法で癌腫抗原 を分析した結果を示す。Ｃｏ１ｏｎ１３７　（結腸腺癌細胞、陽性）の抽出物（ ５Ａ図）及びＨＵＴｔｌ　８０　（−二指腸線癌細胞、陰性）の抽出物（５Ｂ図 ）である。

寒亙■上 ヒトモノクロナール抗体（Ｃ−００１）の産生結腸−直腸癌患者の腫瘍領域をド レーンする（ｄｒａｉｎｉｎｇ）腸間膜リンパ節を無菌条件下で細かくきざんだ 。破片を脱脂綿で濾過して除去し、フィコール−イソバク（Ｆｉｅｏｌｌ−１ｓ ｏｐａｑｕｅ）　（ベーリンガーーマンハイム社、西ドイツ、マンノ＼イム）で 遠心分離してリンパ球を精製した。キューラ−［Ｋ５ｈｌｅｒ　（イムノロギカ ル　メソッド■巻、アカデミツク・プレス、　１９８１年、２８５〜２９８頁） に従って、リンパ球を、ヒト融合細胞系１ｌ−Ｌ２−７２９−）ＨＦ２（以下、 ＨＦ２と称する）［テクニクローン研究所、米国、カリフォルニア州、サンタ・ アナ］と融合させた。ＨＦ２とリンｌ（球（ｔｏ’）の比は！＝２であった。

［ＩＰＭ＋−１６４０培地中のＨＦ２とリンパ球を洗浄後、遠心分離にかけ、得 られた細胞ペレットを、１分間振盪して、０．５ｚｃＶの５０％ＰＥＧ（ポリエ チレングリコール）６０００中に再度懸濁し、得られたＰＥＧをＲｐＨ１ｌ−１ ６４０で希釈する前に、細胞をさらに２分間培養した。

ついで、融合生成物を洗浄し、溶液培地［ＲＰＭＩ−１６４０，ＨＡＴ　（２Ｘ １０−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ　１０−’Ｍアミノプテリン、３．２Ｘ　１Ｇ −”Ｍチミジン）を補ったｌＯ％ＦＣ３（子牛の胎児の血清）コ中に再懸濁した 。この細胞を、９６ウエルのマイクロタイタープレートに、ｌウェル当り２ＸＩ Ｇ’個の細胞含有の２００μＱずつを入れた。

この細胞は、選択培地の中で２週間保持された。さらに培養を、ＲＰＭＩ−１６ ４０＋ヒボキサンチンとチミジンを補ったｌＯ％ＦＣ８中で行なった。融合後増 殖したハイブリッドが、１０日から４週間にあられれた。クローン化は、支持細 胞なしで希釈を制限することにより行われた。

増殖したクローンの入ったウェルの上清液を、　０．１Ｍ重炭酸塩（ｐＨ９，６ ）で１：１Ｇ、０００に希釈されたウサギ抗ヒトＩｇ（Ｈ及びし鎖）［ダコパッ ツ社（ＤａｋｏｐａｔＬｓ）、デンマーク、コペンハーゲン）で被覆したマイク ロタイタープレート上で、ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　１ｍ５ ｕｎｏｓｏｒｂｅｎＬ　ａｓｓａｙ）により免疫グロブリン産生について分析し た。被覆されたウェルを、ＰＢＳ−ツウイーン液（リン酸緩衝生理食塩水−０， ０５％ツウィーン２０）で洗浄し、ＰＢＳ−ツウイーンで１：１０に希釈した上 清液と共に室温で２時間培養した。ＰＢＳ−ツウイーンでｌ　：　３０００に希 釈した ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＧ（ダコパッツ社、コペンハーゲン）に特異的なアル カリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体により展開が行われた。室温で１時間培養 した後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（ＰＮＰＰ）、ｌ　ｎ／ｘ（１１ ０％ジエチルアミン、Ｉｄ塩化マグネシウム、ｐＨ９，６を１．加えた。３７℃ で１時間培養後、光学濃度を４０５ｎ−で測定した。定量用の標準曲線は、Ｉ　 ｇ　Ｍ　（Ｃａｐｐｅｌ）またはＩ　ｇ　Ｇ　（Ｋａｂｉ　ＡＢ、スウェーデン 、ストックホルム）を希釈して作製した。ＥＬＩＳＡ法で検定した免疫グロブリ ン（Ｉｇ）産生ハイブリッドを、２４ウエルのマクロプレートに移して増殖させ ［ナンク（Ｎｕｎｃ）Ａ／ｓ、デンマーク）、さらに上清液を、下記のように、 腫瘍細胞との反応について免疫細胞化学的に分析するかまたは腫瘍組織との反応 について免疫組織化学的に分析した。

下記の方法により選択されたハイブリドーマ細胞系Ｂ９１６５（ＥＣＡＣＣ８７ ０４０２０１）は、培地を全く変えずに２週間増殖させた時、ＩｇＭを％１１ｆ ｆ当り１〜５μり産生することがＥｌ！ＳＡ法により分かった。

実施例２ 抗原の特性決定 λ）免疫細胞化学的分析 抗腫瘍反応性の分析は免疫細胞化学的分析及び免疫組織化学的分析により行われ た。免疫細胞化学的分析は、種々のヒト腫瘍細胞系とヒト末梢血液白血球とから 調製した細胞の塗まつ標本について行われた。細胞類を、ホルモルーアセトン（ ９，５％ホルムアルデヒド、４３％アセトンの８６ｍＭホスフェート緩衝液、ｐ Ｈ７，２）で処理してスライドグラス上に固定した。Ｃ−０ＵＩ上清液（ハイブ リドーマＢ９１６５：ＥＣＡＣＣ８７（１４０２０１由来）約５０μｇを、固定 した細胞塗まつ標本の上に置き、加湿室中４℃で！夜培養し、次にすすいでから 、ＰＢＳ−ツウイーンでｌ二８０に希釈したホースラディツシュ　ペルオキシダ ーゼ（ＨＲＰ）で標識したウサギ抗ヒトＩｇＭ（ダコバッツ）と共に室温で１夜 培養した。最後に、ペルオキシダーゼ基質（ＰＢＳ中、０．Ｏ１％Ｈｔ　Ｏｚと ジアミノベンジジン０．６μ９／Ｉｔりを加えた。塗まつ標本を、ヘマトキシリ ンで軽くカウンタースティン（ｃｏｕｎｔｅｒ　５ｔａｉｎ）し、封じ込めた。

第１表は、種々の細胞の塗まつ標本についてＣ−０ｔｌｌを分析して得られた結 ・果を示す。

第１表 免疫細胞化学により検定されたＣ−０Ｕ　ｌの反応性細胞の　　　　　　　名　 　　　　応 １、結腸腺癌腫Ｃｏ１ｏｎ＋３７陽性 ２、結腸腺癌腫Ｃ０ＬＯ２０１陽性 ３、黒　　　色　　　腫　１１０３７３　　　陰性４、乳　　　癌　　　腫　Ｍ ＣＦ−７陽性５、十二指腸腺癌Ｉｔ　ＨＬＩＴＵ　８０　　陰性６、バーキット リンパ踵　ＥＢ−２陰性７、ヒト末梢血液白血球　ＰＢＬ　　　　陰性反応性が 選択的であることは明らかである。別に、生細胞類を、４℃でハイブリドーマ抗 体と共に、ついで酵素で標識した抗！ｇ抗体と共に培養し、ついで細胞類をスラ イドグラス上に塗抹され、グルタルアルデヒド（ＰＢＳ中０．１７％）で固定し 、基質と共に培養した。第１Ａ図は、生Ｃ０ＬＯ２０１細胞類（結腸腺癌腫細胞 類）のｃ−ｏｕ　ｉによる染色を示し、一方、第１Ｂ図は、第１層に非反応性ヒ トハイブリドーマｔｇＭを用いた際の染色の欠如を示す。用いられる方法は、細 胞表面に露出された分子を標識するための受容な標準方法であり、第１図に示す 標識化は、この方法によるものである。

ｂ）免疫組織化学的分析 免疫組織化学的分析はアセトンの中に固定した冷凍組織切片について行われた。

内在性１ｇＭを、抗μ鎖抗体のＦａｂ’片（ダコパッツ、デンマーク、コペンハ ーゲンより購入）との培養により遮断され、次いでハイブリドーマ抗体Ｃ−００ １（０，５μｖ／ｘＱ）と共に培養した（Ｆａｂ’片はＢ、Ｎ１ｅｌｓｅｎ　ｅ Ｌ　ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６（１）＠。

１９８７年、１０３〜１０９頁に従って作製した）（ハイブリドーマ抗体を２Ｍ 硫酸アンモニウムで沈澱させて濃縮した）。ついで得られた結合ハイブリドーマ 抗体は、免疫細胞化学的分析用に上記のようにして目視できるようにした。この 場合に、Ｆａ＋ｂ′片の産主に用いられたのと同じ抗体製剤をペルオキシダーゼ で標識した。第２Ａ図は、Ｃ−０１ＪＩの適用後、結腸腺癌の切片中、腫瘍細胞 だけが染用されることを示す。第２Ｂ図は扁桃腺組織が染色欠除していることを 示す。第１［Ａ及び１８表は、多種の組織について分析された反応性を要約する ものであり、第１ＩＡ表は悪性腫瘍組織からの結果を示し、第ｎＢ表は、非悪性 ｌ！瘍組織からの結果を示す。

第１ＩＡ表 免疫組織化学的方法により分析された、ヒト悪性腫瘍組織の冷凍アセトン固定の 組織片に対するＣ−０ＬＩＩ　（０，５μ９／Ｉｌりの反応性 組織　　　　　結果 結腸腺癌１！　　　　　　　　　　１９／２１　ａ）卵巣腺癌腫　　　　　　　 　　２／２ 肝臓腺癌ｉｔ　　　　　　　　　　ｌ／２乳癌腫　　　　　　　　　　　７／９ 肺腺癌腫　　　　　　　　　　フ／７ 肺上皮癌腫　　　　　　　　　０／６ 非精上皮性畢丸癌踵　　　　　１／１ 肉ＭＯ／３ 悪性黒色［！　　　　　　　　　　Ｏ／７ＢリンパＩＩ　　　　　　　　　　　 Ｏ／１胸腺踵　　　　　　　　　　　０／１ λ）陽性の数／試験数 第１１Ｂ表 免疫組織化学的方法により分析された、ヒト正常組織の冷凍アセトン固定の組織 片に対するＣ−０１１１（０，５Ｍｇ／ｘ（１）の反応性 組　織　　　　　　　　　　　　結果 卵巣　支質　　　　　　　　　　　陰性卵巣　上皮　　　　　　　　　　　陰性 腎臓糸球体　　　　　　　　　　　陰性前細管　　　　　　　　　　　　　陰性 孔細管　　　　　　　　　　　　　陽性孔小管　　　　　　　　　　　　　陽性 肺胞　　　　　　　　　　　　　　陰性気管支上皮　　　　　　　　　　　陰性 畢丸　　　　　　　　　　　　　陰性 表皮　　　　　　　　　　　　　　陰性扁桃腺リンパ組織　　　　　　　　陰性 扁桃腺上皮　　　　　　　　　　　陰性平滑筋　　　　　　　　　　　　　陰性 血管　　　　　　　　　　　　　　陰性Ｆ立線　上　　　　　　　　　　　陽性 正常な結腸上皮は、ヒトＩｇＭ、モノクロナール抗体、骨髄種１ｇＭ並びに正常 なポリクロナールヒトＩｇＭの分析された全部と結合することを示した。したが って正常な結腸上皮１こ対するＩｇＭのこの一般的結合は非特異的であると判断 され、この説明は、電子顕微鏡及び等電点電気泳動法による分析によって裏付け られた（下記参照）。抗体のこの非特異的結合は、当業者の知識とも一致するも のである。

Ｃ）電子顕微鏡 電子顕微鏡用に、腺癌細胞１０”／ｘＱを、単層が得られるまで、プラスチック カバースリップをつけた管中、ｌＯ％ＦＣ３のＲＰＭＩ−１６４０培地内で３日 間培養した。この細胞類を、０．１％（Ｖ／Ｖ）ゲルタールアルデヒドの０．１ Ｍ生理食塩水溶液（ＰＢＳ。

ｐｉ−＋　７．２）中４℃で３０〜６０分間固定し、ついでウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）とリジン−１１ｃＩとを補ったＰＢＳで４℃にて１夜洗浄した。この 細胞類を、−２０℃まで漸次低温にして、３０％から９０％エタノールで脱水し 、ついで−３５℃でロウイクリルに４Ｍ　（Ｌｏｖｉｃｒｙｌ、ヘミッシエ・ベ ルト・コライ社、西ドイツ）に浸し、−３５℃で！夜、紫外線下で重合させ、つ いでさらに２日間常温で重合させた。

被覆ニッケルグリッド（格子）上に載せた細胞含有ロウイクリルの超薄切片（５ ０〜６０ｎｓ）が用いられた。下側に切片を有する格子を種々の溶液に浮遊させ ることからなる免疫マーキング法は、次の工程からなる：ｌ）グリッドを１％（ Ｗ／Ｖ）水素化ホウ素ナトリウム滴の上に１０分間置き：　２）０．１％（１／ Ｙ）ＢＳＡ−トリス液中で５分間ずつ２回洗浄後、グリッドを３％ＢＳＡ　−ト リス滴の上に移しく１５分）；３）グリッドをＣ−０ＵＩの抗体滴の上に室温で １時間置き：４）グリッドを０．１％ＢＳ＾−トリス中で５分間ずつ２回洗浄し ：５）グリッドをウサギ抗ヒトＩｇＭの３％ＢＳＡ−トリス溶液の滴上に移して 室温で１時間置き、：６）０．１％ＢＳＡ−）リスで５分間ずつ２回洗浄後、グ リッドを、１５ｎｓの金プローブ（Ｊａｎｓｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌｇ）で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧの３％ＢＳＡ−トリス溶液の滴上において 、室温で３０分間培養し；７）グリッドを、Ｃ，ｔ％ＢＳＡ　−トリスで５分間 ずつ２回及び再蒸留水で５分間づつ２回洗浄して、乾燥し：および８）超薄切片 を室温で、１０分間１％酢酸ウラニルで、染色し次に２分間０．４％クエン酸鉛 で染色する工程である。

ツウイーン２０及び０．５Ｍ食塩液を、抗体と洗液全体に加えた。

超薄切片は、８０ｋＶで作動するＪＥＯＬ　１００−ＣＸ電子顕微鏡で検査した 。

免疫細胞化学的反応の特異性を評価する実験では、第１抗体を除き、第１抗体を ヒトＩ　ｇ　Ｍ　（Ｃａｐｐｅｌ）で置換した。

第３Ａ図は細胞質フィラメントの末端周辺領域における結腸腺癌細胞類（Ｃｏ１ ｏｎ１３７）の標識の明確なパターンを示し、第３Ｂ図は（同様な方法による） 十二指腸腺癌細胞類（ｔｌＵＴＵ　８０）の標識の欠除を示す。結腸腺癌の癌組 織切片は、細胞質フィラメント（図示せず）に関連する腫瘍細胞のみ標識してい ることを示した。正常な結腸上皮は標識を全く示さなかった。このように、電子 顕微鏡は細胞質構造に関連する標的抗原の存在を示す。

ｄ）等電点電気泳動法 標的抗原分子の特性決定を、等電点電気泳動法によって行つた。ｌｌ瘍細胞類ま たは癌組織及び正常組織を抽出緩衝液（７５ｍＭＮａＣ１，７５ａｉ　ＫＣｌ、 １０５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　（グツドの緩衝用試薬）　、５ａｌｌ　ＥＤＴＡ。

５％２−メルカプトメタノール、５１９／（ｌ　トラシロール、Ｏ，Ｏ１ｄレン ペブチン、０．ＯＬｓＭペプスタチン）中で超音波処理（氷上で３０秒、４回） して可溶化した。超音波処理後、尿素を６Ｍまでショ糖ｇ（１Ｍｙとともに加え 、得られたホモジネートを３７℃で３０分間培養した。遠心分離（１５０００Ｘ ９．５分間）により不溶物質を除去した。

等電点電気泳動法を、６Ｍ尿素、３％（Ｖ／Ｖ）サーバライツ３−１０　（ｓｅ ｒｖａｌｙＬｅｓ　３−１０）及び１％（１／Ｖ）サーバライツ４−６（５ｅｒ ｖａ）含有の１％アガロース薄層ゲル（アガロースＩＥＦ、Ｐｈａｒ−ｓａｃｉ ａ）上に塗布した抽出物で行なった。支持体としてゲルをベースにしたフィルム （ＬＫＢ）を用いた。ニトロセルロースの上へ蛋白質を電気泳動的に移す前にフ ォーカシング（ｆｏｃｕｔｉｎｇ）は１５００ｖ／ｈで行なった。残っている結 合部位は、０．１Ｍ塩化ナトリウム、２−Ｍ塩化マグネシウム及び０．０５％ツ ウィーン２０を含有する０、ＩＭ）リス−塩酸、ｐ）（７，５中でニトロセルロ ースを培養することにより遮断された。ニトロセルロースを、ストリップに切断 し、ＰＢＳ−ツウィーンで約２００ｎｇ／１１２に希釈したハイプリドーマ抗体 Ｃ−０ＵＩと共に室温で２時間培養した。ＰＢＳ−ツウイーンで洗浄後、ニトロ セル口、−スストリップを、アルカリホスファターゼをコンジユゲートしたＦ（ ａｂ’）ｍ−抗１ｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌｍ５ｕｎｏ　ｒｅｓｅｒｃｈ） と共に培養し、続いて基質（５−ブロモ−４−クロロインドキシルホスフェート とニトロブルーテトラゾリウムとの溶液）と共に培養された。

第４図の左パネルは、結腸腺癌腫瘍抽出物の染色を示し、第４固在パネルは正常 な結腸上皮の抽出物であり、■はインディア・インクによる全蛋白質の染色：■ はＣ−０１１１による染色：及び■は異なるハイブリドーマＩｇＭによる染色で ある。結局、Ｃ−０１１１は、腫瘍抽出物の酸性蛋白質（等電点５．４〜６．２ ）が明確に染色されていることを示しているが、正常結腸抽出物については染色 を示していない。

ｅ　）　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウ ェスタンプロット法 Ｃｏ１ｏｎ１３７　（結腸腺癌細胞類）及びＢＵＴυ８０（−二指腸線癌細胞類 ）の抽出物は、界面活性剤（２％ＳＤＳ、４１１尿素、１０１Ｍヨードアセトア ミド）により可溶化して製造され、５〜２０％の勾配のゲル上でＰＡＧＥ処理す る前に、１５分間培養した。次いで、蛋白質をニトロセルロースシート上に電気 泳動的に移動した。得られたこのニトロセルロースシートを３ｍｉ＋のストリッ プに切断し、Ｃ−０υｌと共に４℃でｌ夜培養し、ついでＡＰ−ウサギ抗ヒトＩ ｇＭ（シグマ社）と共に２時間培養した。得られたプロットを、ＰＢＳで洗浄し 、０．２％ゲルタールアルデヒド含有のＰＢＳ溶液と共に１５分間培養して固定 した。アルカリホスファターゼを基質、ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブ ロモー４−クロロインドキシホスファターゼ、と共に３７℃で１時間培養すると 、目視できるようになった。その分子量は、次の予め着色された分子量マーカー の移動度から計算した。すなわちβ−ガラクトシダーゼ（１１６Ｋ）、フルクト ース−６−リン酸キナーゼ（８４Ｋ）、ピルビン酸キナーゼ（５８Ｋ）、フラマ ーゼ（４８，５Ｋ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（３６，５Ｋ）およびトリオースリ ン酸イソメラーゼ（２６，６Ｋ）である。

第５図の結果は、結腸腺癌抽出物に見出されたが十二指腸腺癌抽出物には見出さ れなかった分子量４：ｌ、０００の蛋白質と、Ｃ−０１１１が反応することを示 している。

第１Ａ図 第２Ａ図 薯電点電気沫動軒に８絽、耐氏抽廿物の免疫プロット令析糸り唐洛紬出物　　　 　　　　　　正常１ｖ陽上皮補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成１年１０月−３日濡出 ｌ１国際出願の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８　Ｂ１０００５９ ２、発明の名称 ヒト腫瘍関連抗原 ３、特許出願人 住　所　　デンマーク、ディケイ−５２３０オデンセ　エム、フィンセンス　ア レ　２８ 氏　名　　　ジェンセニウス、ジエンス　クリスチャン　（ほか２名４、代理人 　〒５３０ 住　所　　大阪市北区西天満５丁目１−３クォーター・ワンビル５、補正音の提 出年月日 １９８９年４月２７日 ６、添付書類の目録 （１）補正音の翻訳文　　　　　　　　　　　　　　　　１通７、前記以外の特 許出願人 （１）住　所　　デンマーク、ディケイ−５７９２アースレーヴ、クリスチャン 　ランドスヴエイ　１ 氏　名　　　　　ボウラップ−クリスチャンセン、ベール（２）住　所　　デン マーク、ディケイ−５７００スヴエントボルグ、ベルヴエデレ　１１ 氏　名　　　　エルブ、カリン 請求の範囲 Ｌアセトンに固定された冷凍組織切片の免疫組織化学的分析において、結腸腺癌 腫、卵巣腺癌腫、腎臓腺癌腫、乳癌腫、肺腺癌腫、非精上皮の畢丸癌腫、乳細管 、乳小管及び前立腺上皮と結合するが、肺上皮癌腫、肉腫、悪性黒色腫、Ｂ−リ ンパ腫、胸腺腫、卵巣支質、卵巣上皮、腎臓糸球体、腎細管、肺胞、気管支上皮 、畢丸、−表皮、扁桃腺のリンパ管組織、扁桃腺上皮、平滑筋または血管とは結 合しない抗体。

１、モノクロナール抗体である請求項りの抗体。

３、ヒトリンパ球から誘導される請求項１の抗体。

Ｌ、ポリクロナール抗体である請求項りの抗体。

０１）である請求項５の抗体。

腫、ト精上　の畢丸癌腫、乳細管、乳小管及び前立腺上皮のアセトン中に固定し た冷凍組織切片において、請求　６の抗体と結合するために露出され、かつ肺上 幻ユ（、肉腫、悪性黒色腫、Ｂ−リンパ腫、胸腺腫、卵巣　　、卵巣上　１．織 糸球体」細管、肺胞、気管支上皮、畢丸、表皮、扁桃腺のリンパ管組織、扁桃腺 上皮、平滑筋または血管の冷凍組織切片では露出されない請求項８のエピトープ 。

つの結合部位と、他の抗原のエピトープまたは薬剤と特異的に結合する他の結合 部位とを含有するハイブリッド抗体である請オタイプ抗体。

１６、請求項１５の抗イデイオタイプ抗体に対応する抗抗イディオタイプ抗体。

＋７．請求項！−７のいずれか１つの抗体、請求項１５（７）抗イデイオタイプ 抗体または請求項１６の抗抗イディオタイプ抗体からなる診断用薬剤。

のようなりガントから選択される請求項＋８の診断用薬剤。

旦、固形担体がポリマー、またはポリマーを塗布したマドセルロース紙）、シリ コン、シリカ、及びアガロースまたはデキストランのような多糖類から選択され る請求項旦の診断用薬剤。

薬剤。

２８、抗原が直接またはスペーサーを介して固形担体と結合している請求項２５ の診断用薬剤。

シリカ及びアガロースもしくはデキストランのような多糖類か薬剤。

床癌腫、肉腫、悪性黒色腫、Ｂ−リンパ腫、胸腺腫、卵巣基質、卵巣上皮、−ス 五床体」Ｊ、肺胞」１叉上皮、畢丸、表皮、扁桃腺のリンパ管組織、扁桃腺上皮 、平滑筋または血管とは結合しないモノクロナール抗体を　泌するハイブリドー マを選別することからなる結腸腫瘍関連抗原用モノクロナートｉｔ　Ｋ旦匡↓方 夾。

診断用薬剤に接触させ、結合抗体の存在を測定することからなる請求項１０の抗 原を発現するヒト癌腫生体外診断法。

３６、癌の疑いのある患者の組織試料を請求項１−７のいずれか１つの抗体から なる請求項１７〜２４のいずれか１つの診断用薬剤に接触させ、結合抗体の存在 を測定することからなる請求頂上見の抗原を発現するヒト癌腫生体外診断法。

か鵞つの抗体の診断的有効量を投与し、結合抗体の局在化部位を測定することか らなる請求項旦の抗原を発現するヒト癌腫生体外診断法。

のいずれか１つの診断用薬剤に接触させ、上記体液中に存在すの抗体及び医薬的 に受容な賦形剤からなるヒト癌腫の治療用医薬組成物。

抗体の使用。

国際調査報告 栖、ゆ−、アｌＡ、−１１．．１軸　ＰＣ丁／ＤＫ８８１０００５９１１、Ｉ□ Ａ、１１昧ＰＣＴ／ＤＫ８８１０００５９

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．約４３，０００の見掛けの分子量及び約５．４〜６．２の範囲の等量点を有 し、ヒトハイプリドーマ細胞系Ｂ９１６５（ＥＣＡＣＣ８７０４０２０１）また はその類似体により産生されたモノクロナール抗体と反応性の少なくとも１つの エピトープを有するヒト癌腫関連抗原。
2. ２．癌腫（特に腺癌腫）組織によって発現されるが、正常なヒト組織または他の 癌組織では発現されない請求項１の抗原。
3. ３．実質的に純粋な形態の請求項１または２の抗原。
4. ４．請求項１〜３のいずれか１つの抗原と特異的に対応する抗体。
5. ５．モノクロナール抗体である請求項４の抗体。
6. ６．ヒト起原の請求項４の抗体。
7. ７．ヒトハイプリドーマ細胞系Ｂ９１６５（ＥＣＡＣＣ８７０４０２０１）によ り産生される抗体である請求項５の抗体。
8. ８．ポリクロナール抗体である請求項４の抗体。
9. ９．請求項１〜３のいずれか１つの抗原のエピトープと特異的に対応する１つの 結合部位と、同一抗原の他のエビトープ、他の抗原のエピトープまたは薬剤と特 異的に対応する他の結合部位とを含有するハイブリッド抗体である請求項４の抗 体。
10. １０．他の抗原が細胞障害性Ｔ細胞の分化抗原である請求項８の抗体。
11. １１．薬剤が細胞障害性薬剤及び抗腫瘍性薬剤から選択される請求項８の抗体。
12. １２．請求項１〜３のいずれか１つの抗原と反応性の抗体に対応する抗イディォ タイプ抗体。
13. １３．請求項１２の抗イディォタイプ抗体に対応する抵抗イディオタイプ抗体。
14. １４．請求項４〜１１のいずれか１つの抗体、請求項１２の抗イディオタイプ抗 体または請求項１３の抵抗イディオタイプ抗体からなる診断用薬剤。
15. １５．抗体が標識を備えている請求項１４の診断用薬剤。
16. １６．標識が酵素、蛍光物質、放射性同位元素及びビオチンのようなリガンドか ら選択される請求項１５の診断用薬剤。
17. １７．抗体が直接またはスペーサーを介して固形担体と結合される請求項１４の 診断用薬剤。
18. １８．固形担体がポリマー、またはポリマーを塗布したマトリックスからなる請 求項１７の診断用薬剤。
19. １９．ポリマーがプラスチック類、セルロース（例、ニトロセルロース紙）、シ リコン、シリカ、及びアガロースまたはデキストランのような多糖類から選択さ れる請求項１８の診断用薬剤。
20. ２０．固定担体が板、ストリップ、フィルム、微粒子または紙の形態である請求 項１７の診断用薬剤。
21. ２１．スペーサーがプロティンＡである請求項１７の診断用薬剤。
22. ２２．請求項１〜８のいずれか１つによる抗原からなる診断用薬剤。
23. ２３．抗原が標識を備えている請求項２２の診断用薬剤。
24. ２４．標識が酵素、蛍光物質、放射性同位元素及びビオチンのようなリガンドか ら選択される請求項２３の診断用薬剤。
25. ２５．抗原が直接またはスペーサーを介して固形担体と結合される請求項２２の 診断用薬剤。
26. ２６．固形担体がポリマー、またはポリマーを塗布したマトリックスからなる請 求項２５の診断用薬剤。
27. ２７．ポリマーがプラスチック類、セルロース、シリコン、シリカ及びアガロー スもしくはデキストランのような多糖類から選択される請求項２６の診断用薬剤 。
28. ２８．固形担体が板、ストリップ、フィルム、微粒子または紙の形態である請求 項２５の診断用薬剤。
29. ２９．スペーサーがプロティンＡである請求項２５の診断用薬剤。
30. ３０．癌の疑いのある患者の体液試料を、請求項４〜１１のいずれか１つの抗体 からなる請求項１４〜２１のいずれか１つの診断用薬剤に接触させ、結合抗体の 存在を測定することからなる、請求項１〜３のいずれか１つの抗原を発現するヒ ト癌腫を生体外で診断する方法。
31. ３１．癌の疑いのある患者の組織試料を請求項４〜１１のいずれか１つの抗体か らなる請求項１４〜２１のいずれか１つによる診断用薬剤に接触させ、結合抗体 の存在を測定することからなる、請求項１〜３のいずれが１つの抗原を発現する ヒト癌腫の生体外診断法。
32. ３２．検出可能なように標識をつけた請求項４〜１１のいずれか１つの抗体の診 断的有効量を投与し、結合抗体の局在化部位を測定することからなる、請求項１ 〜３のいずれか１つの抗原を発現するヒト癌腫の生体外診断法。
33. ３３．癌の疑いのある患者の体液試料を請求項１〜３のいずれか１つの抗原から なる請求項２２〜２９のいずれか１つの診断用薬剤または請求項２の抗イディオ タイプ抗体からなる請求項１８〜２１のいずれか１つの診断用薬剤に接触させ、 上記体液中に存在する請求項１〜３のいずれか１つの抗原に対応する結合抗体の 存在を測定することからなる、請求項１〜３のいずれか１つの抗原を発現するヒ ト癌腫の生体外診断法。
34. ３４．請求項１〜３のいずれか１つの抗原または請求項４〜１１のいずれか１つ の抗体及び医薬的に受容な賦形剤からなるヒト癌腫の治療用医薬組成物。
35. ３５．ヒト癌腫の治療用薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれか１つの抗 原または請求項１２の抗イディオタイプ抗体の使用。
36. ３６．ヒト癌腫の治療用薬剤の製造のための、請求項４〜１１のいずれか１つの 抗体または請求項１３の抵抗イディオタイプ抗体の使用。