NO176903B - Antistoff eller bindende fragment derav til diagnostikk av humant carcinom, eller som transportör av farmasöytiske midler, isolert, humant tumor-assosiert antigen, diagnostisk middel og fremgangsmåte for in vitro-diagnostisering - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår et isolert, humant carcinom-assosiert antigen, som er i hovedsakelig ren form, et antistoff rettet mot antigenet til diagnostikk av humant carcinom eller som transportør av diagnostiske midler, et diagnostisk middel omfattende antigenet eller antistoffet, og en fremgangsmåte til in vitro-diagnostisering av humant carcinom ved hjelp av diagnostiske midler inneholdende antigenet eller antistoffet.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Muligheten for å utvikle mer nøyaktige metoder for påvisning og diagnostisering av cancer ved identifisering og karakterisering av tumor-assosierte antigener (dvs. antigener uttrykt av tumorer) er av stor medisinsk inter-esse .

Monoklonale antistoffer mot tumor-assosierte antigener kan spille en viktig rolle for påvisning av cancer på grunn av deres store spesifisitet. Hittil har de fleste av de monoklonale antistoffer dannet mot cancer-assosierte antigener, vært av museopprinnelse og har vært uttrykt av hybridomer resulterende fra en fusjon av miltceller fra en mus immunisert med en human cancercellelinje eller celler fra en cancerpasient med en musemyelomacellelinje. Immmuno-genisitet i musen er et krav gjenkjent av murine,

monoklonale antistoffer, og de tilsvarer ikke nødvendigvis antigener gjenkjent av humane antistoffer. I tillegg kan den terapeutiske verdi av disse murine monoklonale antistoffer være begrenset, da pasienter gjenkjenner disse antistoffer som fremmede proteiner og kan derfor utvikle en fiendtlig immunrespons mot det murine antistoff. Resul-tatet kan være en nøytralisering av den terapeutiske effekt og utløsning av potensielle farlige allergiske reaksjoner.

Humane hybridom-antistoffer kan være mer lovende

som diagnostiske og terapeutiske midler for administrering til pasienter med cancer under den antagelse at humane monoklonale antistoffer er mindre immunogene i mennesker enn heterologe antistoffer og er i stand til å gjenkjenne de relevante antigener.

Problemer beslektet med spesifisiteten av murine monoklonale anti-tumor-antistoffer er illustrert ved colon-adenocarcinoma-antistoff 17-Al, som har vært anvendt ved diagnose og terapi, men som nå er blitt funnet å

reagere med normalt såvel som tumorvev (Hybridoma 5 Suppl. 1, 1986, spesialutgivelse vedr. Ca-17-Al, red. Z. Steplewski).

Immunresponsen i pasienter mot administrert, murint monoklonalt antistoff er blitt beskrevet av et utall forskere (f.eks. H.F. Sears et al., Lancet 1985, i:762-765; og M.S. Mitchell et al., Prog. Cancer Res. Ther. 21, 1982, Raven Press, New York).

Colo-rektal cancer er en av de mest hyppig fore-kommende cancere og en av hovedårsakene til død av cancer. Prognosen for denne cancertype er ikke blitt forbedret i lang tid, og nye metoder for påvisning av colo-rektal cancer og hjelpeterapi ledsaget av kirurgi, er derfor nød-vendig.

Det eksisterer derfor et behov for et humant carcinoma tumor-assosiert antigen, i særdeleshet et som hovedsakelig ikke uttrykkes av normalt vev, og antistoffer mot et slikt antigen for diagnostiske og terapeutiske for-mal.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår således et isolert, humant carcinomassosiert antigen til ikke-legemiddelanven-delse, hvilket antigen er kjennetegnet ved at det er i hovedsakelig ren form, og har en tilsynelatende molekylvekt på 43 kD og et isoelektrisk punkt i området 5,4-6,2, og at det har minst én epitop som er reaktiv med et monoklonalt antistoff som produseres av den humane hybridomcellelinje B9165 (ECACC 87040201) eller en analog derav.

Uttrykket "analog" anvendes i foreliggende sammenheng for å indikere et protein eller polypeptid av lignende aminosyresammensetning eller sekvens som foreliggende antigen, idet det tillates mindre variasjoner som ikke har ugunstig effekt på immunogenisiteten av analogen. Det analoge polypeptid eller protein kan være avledet fra en annen kilde enn carcinomavev, slik som fra en rekombinant organisme, eller kan være delvis eller fullstendig av syntetisk opprinnelse. Uttrykket er enn videre beregnet på å angi ethvert derivat av antigenet slik som en immunogen sub-sekvens derav.

Immunocytokjemisk analyse ved standardprosedyrer under anvendelse av et monoklonalt antistoff med spesifikk reaktivitet til antigenet, indikerer nærvær av det nye antigen i human coloncarcinoma og brystcarcinomavev, men ikke i duodenalt adenocarcinomavev, melanoma eller Burkitts lymfomavev eller humane, perifere blodleukocytter (se tabell I i det etterfølgende).

Immunohistokjemisk analyse ved standardprosedyrer under anvendelse av et monoklonalt antistoff med spesifikk reaktivitet overfor antigenet, indikerer nærvær av det nye antigen i colonadenocarcinoma, ovarial adenocarcinoma, renal adenocarcinoma, brystadenocarcinoma, lungeadenocarcin-oma og ikke-seminomalttestikkelcarcinomavev, men ikke i lungeepitelial carcinoma, sarcoma, ondartet melanoma, B-lymfoma eller thymomavev, eller i normalt vev bortsett fra brysttubules, brystductuli eller prostataepiteli (se tabell IIA og IIB i det etterfølgende).

Det konkluderes derfor med at det nye antigen er

et som hovedsakelig ikke finnes i normalt, humant vev og som er blitt funnet å bli uttrykt av carcinomavev, i særdeleshet adenocarcinomavev, men ikke av annet ondartet vev som bestemt ved standard immunocytokjemisk og immunohistokjemisk analyse. I særdeleshet synes det nye antigen å være ett assosiert med colonadenocarcinoma.

Et tumor-assosiert antigen uttrykt av coloncarcinoma, er beskrevet i EP 199.586. Dette antigen av-viker imidlertid fra antigenet ifølge oppfinnelsen i karakteristika slik som molekylvekt og isoelektrisk punkt, og det er angitt å være til stede i både normalt og ondartet colonvev (dvs. det synes ikke å være tumor-spesifikt), mens antigenet ifølge oppfinnelsen er blitt vist å være til stede i flere forskjellige ondartede vev, slik som angitt ovenfor.

Antigenet ifølge oppfinnelsen kan eksempelvis erholdes ved isolering fra ekstrakter av carcinomaceller eller ekstrakter av carcinomatumorer ved affinitetskromato-grafi på et uløseliggjort antistoff dannet mot antigenet, i henhold til prosedyrer velkjente innen faget (jfr. Johnstone, A. & Thorpe, R., Immunochemistry in Practice, Blackwell, Oxford 1987). Ytterligere rensing ved én eller flere ytterligere proteinrenseprosedyrer (f.eks. størrelse-eksklusjonskromatografi), ionebytterkromatografi, ligand-affinitetskromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, elektroforese i geler med eller uten denaturering, og forskjellige utfellingsprosedyrer) kan være nødvendig for å oppnå antigenet i tilstrekkelig ren form for detaljert molekylærkarakterisering og for anvendelse for diagnostiske formål.

For å sikre en tilstrekkelig tilførsel av antigenet kan det imidlertid være fordelaktig å produsere antigenet ved rekombinant DNA-teknikker. Disse kan omfatte (a) isolering av en nucleotidsekvens som koder for antigenet, eksempelvis ved å etablere et cDNA eller genbibliotek av humane carcinomaceller og foreta screening med hensyn til positive kloner i henhold til konvensjonelle metoder;

(b) innføring av angitte sekvens i en egnet, replika-sjonsdyktig ekspresjonsvektor; (c) transformering av en

egnet mikroorganismevert med vektoren fremstilt i trinn (b); (d) dyrkning av mikroorganismen fremstilt i trinn (c) under egnede betingelser for ekspresjon av antigenet og (e) høst-ing av antigenet fra kulturen.

Trinn (a)-(e) ved fremgangsmåten kan utføres etter standardmetoder, eksempelvis som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982.

Så snart genet som koder for antigenet er blitt isolert, kan det være mulig å etablere DNA-sekvensen ved standardprosedyrer, f.eks. som beskrevet av Sanger et al., Science 214, 1981, s. 1205, eller Gilbert, Science 214, 1981, s. 1305, og aminosyresekvensen kan utledes på basis av DNA-sekvensen. Antigenet eller en subsekvens derav kan deretter introduseres ved konvensjonell peptidsyntese,

f.eks. væske eller fast fase-peptidsyntese hvor fast fase-peptidsyntese er den foretrukne prosedyre (se R.B. Merryfield, J. Am. Chem. Soc. 85, 1963, s. 2149, eller Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, USA, 1969). Ved fast fase-syntese konstrueres aminosyresekvensen ved kopling av en første aminosyre til en fast bærer hvorpå det i rekkefølge adderes de andre aminosyrer i rekkefølge ved peptidbinding inntil den ønskede lengde er blitt erholdt.

Ifølge et annet trekk angår foreliggende oppfinnelse et antistoff eller bindende fragment derav til diagnostikk av humant carcinom, eller som transportør av farmasøytiske midler, hvilket antistoff er kjennetegnet ved at det ved immun-histokjemisk analyse på frosne, acetonfikserte vevssnitt binder til colonadenocarcinom, ovarieadenocarcinom, nyreadenocarcinom, brystcarcinom, lungeadenocarcinom, ikke-seminomalt testiscarcinom, brysttubuli, brystductuli og prostataepitel, og binder ikke til lungeepitelcarcinom, sarcom, malignt melanom, B-lymfom, thymom, ovariestroma, ovarieepiteler, renale glomeruli, renale tubuli, lungealveoler, bronkialt epitel, testis, epidermis, tonsillart lymfatisk vev, tonsillart epitel, glatte muskler eller blodkar, og som binder til et humant carcinomassosiert cytoplasmatisk antigen som har en tilsynelatende molekylvekt på 43.000 og et isoelektrisk punkt i området 5,4-6,2, og som har minst én epitop som er reaktiv med et monoklonalt antistoff som er produsert av den humane hybridomcellelinje B9165 (ECACC 87040201).

Antistoffet er fordelaktig et monoklonalt antistoff da disse er tilbøyelige til å ha høyere spesifisitet enn polyklonale antistoffer, hvilket gjør dem mer anvendbare for nøyaktige, diagnostiske bestemmelser. På grunn av de ovenfor angitte betraktninger bør antistoffet når dette er beregnet for injeksjon i pasienter, fortrinnsvis være av

human opprinnelse, dvs. ett produsert av et fusjonsprodukt

av en human lymfocytt og en human cellelinje eller et fusjonsprodukt av en human lymfocytt og f.eks. en murin

myelomacellelinje, snarere enn et fusjonsprodukt av en murin lymfocytt og en murin myelomacellelinje som hittil har vært vanlig for produksjon av monoklonale antistoffer mot humane tumor-assosierte antigener. Slike monoklonale antistoffer kan dannes mot forskjellige epitoper på antigenet. Et eksempel på et anvendbart, monoklonalt antistoff er det som er angitt som C-OUl, produsert av den humane hybridomcellelinje B9165 som er blitt deponert den 2. april 1987 ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Storbritannia, under deponeringsnr. ECACC 87040201.

Det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en metode omfattende a) isolering av antistoff-produserende celler fra en cancerpasient, b) sammensmeltning av celler som produserer antistoffet, med celler av en egnet human fusjonscellelinje, og utvelgelse

og kloning av de resulterende hybridomceller som

produserer angitte antistoff, og

c) dyrkning av cellene fra trinn b) i et egnet medium under dannelse av angitte antistoff, og høsting av antistoffet

fra vekstmediet.

De antistoff-produserende celler anvendt for fusjon til humane fusjonsceller, er fortrinnsvis milt- eller lymfeknuteceller. Fusjonen av antistoff-produserende celler og humane fusjonsceller kan utføres hovedsakelig som beskrevet av Kohler og Milstein, Nature 256, 1975, s. 495, eller Kohler, Immunological Methods vol. II, Academic Press, 1981, s. 285-298, dvs. fortrinnsvis i nærvær av en fusjons-promoter slik som polyethylenglycol. Den anvendte, humane fusjonscellelinje er fortrinnsvis av en type som ikke er i stand til å overleve i selektivt medium; og en type av cellelinje som hyppig anvendes for cellefusjoner, er en som mangler enzymet hypoxanthin-guanin-fosforibosyltransferase, og som følgelig ikke er i stand til å vokse i et medium inneholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin (HAT-medium).

Valget av hybridomceller som produserer et antistoff mot carcinomaantigenet, kan deretter uføres ved dyrkning av ikke fusjonerte antistoff-produserende celler, ikke fusjonerte, humane fusjonsceller og antatt fusjonerte celler i et selektivt medium (slik som HAT) i hvilket de ikke fusjonerte, humane fusjonsceller ikke kan vokse og eventuelt dør ut. De ikke fusjonerte antistoff-produserende celler kan bare overleve i et begrenset tidsrom, hvoretter disse også dør ut. På den annen side fortsetter vellykket fusjonerte celler å vokse ettersom de har arvet permanente vekstegenskaper fra de humane foreldrefusjonsceller og evnen til å overleve i det selektive medium fra foreldre-antistoff-produserende celler. De resulterende antistoff-produserende celler kan dyrkes in vitro etter kloning i et egnet medium slik som RPMI 1640. Dette resulterer i produksjonen av monoklonale antistoffer med meget høy renhet ettersom disse utskilles i kultursupernatanten av cellene. Antistoffene kan deretter isoleres ved konvensjonelle metoder slik som sentrifugering, filtrering, utfelling, kromatografi eller en kombinasjon derav.

For formål som ikke krever monoklonalitet, kan antistoffet være et polyklonalt antistoff. Dette kan fremstilles ved injisering av et egnet dyr (f.eks. en kanin,

mus eller geit) med et hovedsakelig rent preparat med antigenet, etterfulgt av én eller flere boosterinjeksjoner ved egnede intervaller (f.eks. to uker til en måned) opptil seks måneder før den første blodtapning. Under opprett-holdelse av dette etablerte immuniseringssystem tappes deretter dyrene for blod ca. 1 uke etter hver booster-immunisering, og antistoff isoleres fra serumet på konvensjonell måte, f.eks. som beskrevet i Harboe og Ingild,

Scand. J. Immun. 2 (Suppl. 1), 1973, s. 161-164.

For enkelte formål kan det være en fordel at antistoffet er et hybrid-antistoff som inneholder et bindingssete rettet spesifikt mot en epitop av antigenet ifølge oppfinnelsen, og et annet rettet spesifikt mot en annen epitop av samme antigen, en epitop av et annet antigen eller et farmasøytisk middel. Uttrykket "bindingssete" skal for-stås å angi antigen-gjenkjennelsesstrukturen i den variable region av antistoffmolekylet. Hybrid-antistoffer muliggjør spesielle prosedyrer for påvisning av antigenet i en prøve og for å styre et farmasøytisk middel eller annet biologisk aktivt molekyl eller annet antigen til setet av tumoren hvor reagenset har størst effekt. I en fordelaktig utfør-elsesform er det andre antigen med hvilket hybridantistoffet er reaktivt, et differensieringsantigen av cytotoksiske T-celler (jfr. Staerz et al., Nature 314, 1985, s. 628). Det farmasøytiske middel med hvilket hybridantistoffet kan være reaktivt, er fortrinnsvis valgt fra cytotoksiske eller antineoplastiske midler (jfr. Collier, R.J. og Kaplan, D.A., Scientific American 251, 1984, s. 44).

Hybrid-antistoffet kan produseres av hybrider

mellom to monoklonale cellelinjer som produserer de to relevante antistoffer, eller kan produseres ved kjemisk binding av fragmenter av de to antistoffer.

Antistoffet kan for forskjellige formål, se neden-

for, være et anti-idiotypisk antistoff, dvs. et antistoff rettet mot setet av et antistoff som er reaktivt med epitopen på antigenet. Det anti-idiotypiske antistoff er rettet mot et antistoff som er reaktivt med antigenet ifølge oppfinnelsen. Det anti-idiotypiske antistoff kan fremstilles på en lignende måte med den som er angitt ovenfor, for det monoklonale eller polyklonale antistoff. Antistoffet kan også være et anti-anti-idiotypisk antistoff rettet mot det anti-idiotypiske antistoff definert ovenfor.

Ifølge et annet viktig trekk angår foreliggende oppfinnelse et diagnostisk middel som omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen som ovenfor beskrevet, et anti-idiotypisk antistoff som ovenfor beskrevet, eller et anti-anti-idiotypisk antistoff som ovenfor beskrevet, eller et bindende fragment av antistoff.

Selv om i enkelte tilfeller, slik som når det diagnostiske middel skal anvendes i en agglutineringsbestemm-else hvori faste partikler til hvilke antistoffet er koblet agglutinerer i nærvær av et carcinomaantigen i den prøve som underkastes testing, hvor ingen merking av antistoffet er nødvendig, foretrekkes det for de fleste formål å tilveiebringe antistoffet med en markør for å påvise bundet antistoff. I en dobbelt antistoff-("sandwich") bestemmelse kan minst ett av antistoffene være utstyrt med en markør. Substanser anvendbare som markører i foreliggende sammenheng, kan velges fra enzymer, fluorescente substanser, radioaktive isotoper og ligander slik som biotin.

Eksempler på enzymer som kan anvendes som markør-substanser, er peroxydaser, f.eks. pepperrotperoxydase, eller fosfataser, f.eks. alkaliske fosfataser. Da enzymer ikke er direkte påvisbare, må de kombineres med et substrat for å danne et påvisbart reaksjonsprodukt som f.eks. kan være fluorescent eller farget. Eksempler på anvendbare sub-strater er H^C^/o-fenylendiamin, I^C^/azinodiethylbenzthiazo-lin-sulfonsyre, H^C^/diaminobenzidin og p-nitrofenylfosfat. Slike reaksjonsprodukter kan påvises med det bare øye som

en fargeforsvinning eller -forandring, eller ved hjelp av et spektrofotometer.

Eksempler på fluorescente substanser som er anvendbare som markørsubstanser, er B^C^/p-hydroxyfenyleddiksyre og methylumbelliferylfosfat. Slike substanser kan påvises ved hjelp av et fluorescensspektrofotometer på i og for seg kjent måte.

Eksempler på radioaktive isotoper som er anvendbare som markørsubstanser, er 1-125, S-35 og P-35. Radio-aktiviteten som utstråles av disse isotoper, kan måles i en gammateller eller en scintillasjonsteller på i og for seg kjent måte.

I en foretrukket utførelsesform omfatter det diagnostiske middel minst ett antistoff koblet til en fast bærer. Dette kan anvendes i en dobbelt antistoffbestemmelse i hvilket tilfelle antistoffet bundet til den faste bærer ikke er merket, men det ubundne antistoff er merket. Den faste bærer kan være sammensatt av en polymer eller kan omfatte en matrise på hvilken polymeren er påført. Den faste bærer kan være valgt fra en plast, f.eks. latex, polystyren, polyvinylklorid, nylon, polyvinylidendifluorid, eller cellulose, f.eks. nitrocellulose, silicon, silica og et polysaccharid slik som agarose eller dextran.

For anvendelse i en diagnostisk bestemmelse kan

den faste bærer ha en hvilken som helst egnet form. Det kan således være i form av en plate, f.eks. et tynt lag eller fortrinnsvis en mikrotiterplate, en remse, film, et

papir eller mikropartikler slik som latexperler eller lignende .

I stedet for å være koblet direkte til den faste bærer kan det monoklonale antistoff være koblet til en avstandsforbindelse immobilisert til en fast bærer. Eksempler på avstandsforbindelser innbefatter protein A.

Det skal bemerkes at praktisk talt alle metoder eller anvendelser basert på intakte antistoffer, i stedet kan utføres under anvendelse av fragmenter av antistoffene, eksempelvis F(ab')2- eller Fab-fragmenter (jfr. Delaloye, B.

et al., J. Clin. Invest. 87, 1986, s. 301).

For anvendelse i en Sandwich-bestemmelse kan det diagnostiske middel i tillegg omfatte et annet antistoff. Dette andre antistoff kan være merket og/eller koblet til

en fast bærer som ovenfor beskrevet. I denne utførelses-form kan enten det ene eller begge antistoffene være et monoklonalt antistoff som ovenfor beskrevet.

Alternativt kan det diagnostiske middel ifølge oppfinnelsen omfatte et carcinomaantigen som ovenfor definert. Dette middel kan anvendes for å påvise nærvær av antistoffer mot carcinomaantigenet i en prøve. Det diagnostiske middel kan ellers utvise hvilke som helst av de ovenfor beskrevne trekk for diagnostiske midler, omfattende et antistoff ifølge oppfinnelsen, selv om de vil påvise bundet antistoff snarere enn binding av et antistoff til antigenet.

Ifølge et ytterligere trekk angår oppfinnelsen en metode for in vitro-diagnostisering av human carcinoma som uttrykker antigenet ifølge oppfinnelsen, omfattende å bringe en prøve av en kroppsvæske fra en pasient mistenkt for å ha cancer, i kontakt med et diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen omfattende et antistoff eller et bindende fragment av et antistoff eller et isolert antigen ifølge oppfinnelsen, og bestemme nærvær av bundet antigen, antistoff eller fragment av antistoff. Antistoffet kan være merket og/eller bundet til en fast bærer som ovenfor eksemplifisert. Kroppsvæsken kan være valgt fra blod, plasma, serum, lymfe, lungeekspektorat, urin og gastrointestinale væsker.

I en foretrukket utførélsesform av metoden inkuberes prøven med et første monoklonalt antistoff koblet til en fast bærer og deretter med et andre monoklonalt eller polyklonalt antistoff utstyrt med en markør. Et eksempel på denne utførélsesform av sandwich ELISA (enzymkjedet immunosorbentbestemmelse) beskrevet i Voller, A. et al.,

Bull. World Health Organ. 53, 1976, s. 55.

I en alternativ utførélsesform (en såkalt konkurr-erende bindingsbestemmelse) kan prøven inkuberes med et monoklonalt antistoff koblet til en fast bærer, og deretter med et merket carcinomaantigen hvor det sistnevnte konkurr-erer med hensyn til bindingsseter på antistoffet med ethvert carcinomaantigen tilstedeværende i prøven.

En alternativ utførélsesform angår en metode for

in vitro-diagnostisering av human carcinoma omfattende å bringe en vev-prøve fra en pasient mistenkt for å ha cancer, i kontakt med et diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen omfattende et antistoff ifølge oppfinnelsen, og bestemme setene på prøven til hvilke antistoff er bundet. En slik immunohistokjemisk metode kan utføres i henhold til veletablerte prosedyrer, eksempelvis som beskrevet nedenfor i eksempel 2.

En ytterligere utførélsesform av en diagnostisk metode under anvendelse av et antistoff eller et fragment av et antistoff ifølge oppfinnelsen angår en metode for lokalise-ring av tumorer (i særdeleshet carcinomaer) in vivo. Denne metode omfatter administrering av en diagnostisk effektiv mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen som er merket for å muliggjøre påvisning derav, og bestemmelse av lokaliserings-stedet av bundet antistoff. Antistoffet kan merkes ved hjelp av en radioaktiv isotop og deretter injiseres og lokaliseres etter kjente metoder, f.eks. gammastråledetektor av egnet kon-figurasjon (jfr. Mach, J.-P. et al., Nature 248, 1974, s. 704).

En ytterligere utførélsesform angår en metode for in vitro diagnostisering av human carcinoma, omfattende å bringe en prøve av en kroppsvæske fra en pasient mistenkt for å ha cancer, i kontakt med et diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen omfattende antigenet eller det anti-idiotypiske antistoff ifølge oppfinnelsen, og bestemme nærvær av bundet antistoff mot antigenet ifølge oppfinnelsen tilstedeværende i angitte kroppsvæske.

Ifølge et ytterligere trekk angår oppfinnelsen et antistoff ifølge oppfinnelsen eller et bindende fragment derav som transportør av et farmasøytisk preparat for behandling av human carcinoma. Preparatet omfatter et antigen ifølge oppfinnelsen eller et antistoff ifølge oppfinnelsen, et farmasøytisk middel og en farmasøytisk akseptabel eksipient.

Eksipienten anvendt i preparatet kan være en hvilken som helst farmasøytisk akseptabel bærer.

Denne bærer kan være en hvilken som helst bærer som vanlig-vis anvendes ved fremstilling av injiserbare preparater, eksempelvis et fortynningsmiddel, suspenderingsmiddel, etc, slik som isotonisk eller bufret saltvann. Preparatet kan fremstilles ved blanding av en diagnostisk effektiv mengde av antistoffet med bæreren i en mengde resulterende i den ønskede konsentrasjon av antigenet eller antistoffet i preparatet.

I enkelte tilfeller kan det være fordelaktig å koble antigenet eller antistoffet til en bærer, i særdeleshet en makromolekylær bærer. Bæreren er typisk en polymer til hvilken toksinet bindes ved hydrofob, ikke-covalent inter-aksjon, slik som en plast, f.eks. polystyren, eller en polymer til hvilken antigenet eller antistoffet er covalent bundet, slik som et polysaccharid eller et polypeptid, eksempelvis kvegserumalbumin, ovalbumin eller albuskjell-hemocyanin. Enn videre kan bæreren fordelaktig være valgt fra et farmasøytisk middel, f.eks. et cytotoksisk eller anti-neoplastisk middel, til hvilket antigenet eller antistoffet er koblet. Bæreren kan også være et annet antistoff rettet mot en cytotoksisk effektormekanisme, eksempelvis cytotoksiske celler. Bæreren skal fortrinnsvis være ikke-toksisk og ikke-allergenisk. Antigenet eller antistoffet kan være multivalent koblet til den makromolekylære bærer da dette kan tilveiebringe en øket effektivitet av preparatet.

For oral administrering kan preparatet være i form

av en tablett, kapsel, granulat, pasta, gel, blanding eller suspensjon, eventuelt utstyrt med et belegg med forlenget frigivelse, eller et belegg som beskytter antigenet eller antistoffet mot passasje gjennom magen.

Faste formuleringer, dvs. granulater, tabletter og kapsler, kan inneholde fyllstoffer, f.eks. sukkere, sorbitol, mannitol og siliciumsyre; bindemidler, f.eks. cellulose-derivater slik som carboxymethylcellulose og polyvinylpyrro-lidon; oppbrytende midler, f.eks. stivelse, natriumbicar-bonat og calciumcarbonat; smøremidler, f.eks. magnesium-stearat, talkum og calciumstearat. Halvfaste formuleringer, dvs. pastaer eller geler, kan omfatte et geleringsmiddel slik som et alginat, gelatin, carrageenan, tragantgummi og pectin, en mineralolje slik som flytende paraffin, en vegetabilsk olje slik som maisolje, solsikkeolje, rapsolje og druekjerneolje, såvel som et fortykningsmiddel slik som stivelse, gummi, gelatin, etc. væskeformige formuleringer, dvs. blandinger og suspensjoner, kan omfatte en vandig eller olje-aktig bærer, f.eks. vann eller en mineralolje slik som flytende paraffin, en vegetabilsk olje slik som maisolje, solsikkeolje, rapsolje, druekjerneolje, etc. Antigenet ifølge oppfinnelsen kan suspenderes i den væskeformige bærer i henhold til vanlig praksis.

Belegget med forlenget frigivelse kan eksempelvis

være et enterisk belegg som kan velges fra shellac, cellulose-acetatestere slik som celluloseacetatfthalat, hydroxypropyl-methylcelluloseestere slik som hydroxypropylmethylcellulose-fthalat, polyvinylacetatestere slik som polyvinylacetat-fthalat, og polymerer av methacrylsyre og (meth)acrylsyre-estere.

Preparatet kan også tilpasses for rektal administrering, eksempelvis som en stikkpille. En slik stikkpille kan inneholde konvensjonelle eksipienter slik som kakaosmør og andre glycerider.

Sluttelig angår oppfinnelsen anvendelse av antigenet ifølge oppfinnelsen eller et anti-idiotypisk antistoff ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et middel til diagnostikk av human adenocarcinoma, eller anvendelse av et antistoff eller anti-anti-idiotypisk antistoff ifølge oppfinnelsen og for fremstilling av et middel til diagnostikk av human carcinoma.

Behandling av cancer, i særdeleshet carcinomaer,

som uttrykker carcinomaantigenet ifølge oppfinnelsen, kan ut-føres ved et utall av prosedyrer velkjente innen faget. Et antistoff mot antigenet (i særdeleshet et monoklonalt antistoff av de ovenfor angitte grunner) som er koplet som trans-portør til et farmasøytisk middel, kan injiseres i cancer-pasienter for å bekjempe tumoren direkte, eller via forskjellige effektormekanismer, eksempelvis komplement-formidlet cytotoksisitet eller antistoff-avhengig, celle-formidlet cytotoksisitet. Antistoffet kan modifiseres for injeksjon i pasienten som ovenfor angitt, eksempelvis ved kobling til farmasøytiske midler (og således transportere disse til deres aktivitetssted), eller til annet antistoff rettet mot en cytotoksisk effektormekanisme slik som antigener på cytotoksiske T-celler eller på andre cytotoksiske celler. Det tas i betraktning at hybridantistoff inneholdende et bindingssete for antigenet og et annet mot et annet antigen eller et farmasøytisk middel som ovenfor beskrevet, også

med fordel kan anvendes for å tilveiebringe et toveisangrep på den angjeldende tumor.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i ekstrakorporale anordninger for fjerning av sirkulerende tumorantigen eller immune komplekser inneholdende tumorantigen, og derved rekonstituere den anti-cancerimmune respons ved å muliggjøre at det immune system får gjenvinnes fra paralyse fremkalt av angitte tumorantigen eller immunokomplekser.

Carcinomaantigenet ifølge oppfinnelsen kan anvendes for immunisering for å utløse en anti-cancerimmunrespons i kroppen. Antigenet kan ytterligere anvendes in vitro for å danne effektorceller mot cancer ved dyrkning av antigenet med leukocytter fra en cancerpasient.

Carcinomaantigenet kan anvendes i ekstrakorporale anordninger for fjerning av anti-tumorantistoff eller immunokomplekser på lignende måte som ved anvendelse av antistoffet.

Antistoffet mot carcinomaantigenet kan ytterligere administreres for å utløse en anti-idiotypisk eller anti-anti-idiotypisk immunrespons. Et anti-idiotypisk antistoff (enten monoklonalt eller polyklonalt eller et fragment av disse) dannet mot et antistoff som reagerer med carcinomaantigenet ifølge oppfinnelsen, kan uttrykke epitoper lik de av antigenet, og kan derfor anvendes på en lignende måte for immunisering for å danne en anti-carcinoma immunrespons. Slike antistoffer kan ytterligere anvendes i ekstrakorporale anordninger som beskrevet ovenfor, for antigenet og primært antistoff.

De anti-anti-idiotypiske antistoffer kan anvendes på 'lignende måte med de som er beskrevet for primære anti-tumor-antistoffer.

Kort beskrivelse av tegningene

Oppfinnelsen beskrives ytterligere i detalj i de etterfølgende eksempler og under henvisning til de medfølg-ende tegninger, hvori

fig. 1 viser immunocytokjemisk beising med C-0U1 av COLO 201-celler (coloniske adenocarcinomaceller, positive) og beising av de samme celler med et ikke-reagerende, humant hybridom IgM (negativt);

fig. 2A og B viser immunohistokjemisk beising med C-0U1 av en fryst vevprøve fra colonisk adenocarcinoma (2A) og normalt, tonsillart vev (2B);

fig. 3A og B viser en elektronmikroskopianalyse av reak-sjonen av C-0U1 med Colon 137-celler (coloniske adenocarcinomaceller, positive) (3A) og HUTU 80 (duodenale adenocarcinomaceller, negative) (3B);

fig. 4 viser en immuno-blotanalyse av vevekstrakter separert ved isoelektrisk fokusering; og

fig. 5 viser en analyse av carcinomaantigen ved SDS-PAGE-blotting med merking med C-0U1. Ekstrakt av Colon 137

(colon adenocarcinomaceller, positive) (5A) og ekstrakt av HUTU 80 (duodenale adenocarcinomaceller, negative) (5B).

Eksempel 1

Fremstilling av humant monoklonalt antistoff (C-0U1)

Mesenterale lymfeknuter som tømmer tumorområdet i pasienter med colo-rektal cancer, ble oppmalt under sterile betingelser. Cellerester ble fjernet ved filtrering gjennom bomull, og lymfocyttene ble renset ved sentrifugering på "Ficoll-Isopaque" (Boehringer-Mannheim, Mannheim, BRD).

Lymfocyttene ble fusjonert med den humane fusjonscellelinje W1-L2-729-HF2 (i det etterfølgende angitt som HF2)

(fra Tecniclone Int., Santa Ana, California, USA) i henhold til Kohler, Immunological Methods, vol. II, Academic Press, 1981, s. 285-298. Forholdet mellom HF2 og lymfocytter (IO<7>) var 1:2.

Etter vasking av HF2 og lymfocyttene sammen i RPMI-1640-medium etterfulgt av sentrifugering, ble cellepelleten resuspendert i 0,5 ml 50% PEG (polyethylenglycol) 6000 over et tidsrom på 1 minutt under konstant risting. Før fortynning av PEG med RPMI-1640 ble cellene inkubert i ytterligere 2 minutter. Fusjonsproduktet ble deretter vasket og resuspendert i løsningsmedium (RPMI-1640, 10% FCS (kalvefoster--4 -7

serum) supplert med HAT (2x10 M hypoxanthin, 4x10 M aminopterin, 3,2x10 ^ M thymidin). Cellene ble anbrakt til 2x10^ celler i 200 yl pr. brønn av 96-brønns mikrotiterplater. Cellene ble opprettholdt i selektivt medium i to uker. Ytterligere dyrking ble utført i RPMI-1640 + 10% FCS supplert med hypoxanthin og thymidin. Voksende hybrider fremkom 10 dager til 4 uker etter fusjon. Kloning ble utført ved begrensende fortynning uten foreceller.

Supernatanter fra brønner med voksende kloner ble analysert med hensyn til immunoglobulinproduksjon ved ELISA (enzymkjedet immunosorbentbestemmelse) på mikrotiterplater belagt med kanin anti-humant lg (H-og L-kjede) (Dakopatts, København, Danmark) fortynnet 1:10.000 i 0,1 M bicarbonat, pH 9,6. Belagte brønner ble vasket med PBS-"Tween" (fosfat-bufret saltvann - 0,05% "Tween" 20) og ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur med supernatanter fortynnet 1:10 i PBS-"Tween". Fremkalling ble foretatt med alkalisk fosfatase (AP)-koblet antistoff spesifikt for IgM, IgA eller IgG (Dakopatts, København), fortynnet 1:3000 i PBS-"Tween". Etter inkubering i 1 time ved romtemperatur ble substratet, p-nitrofenylfosfat (PNPP), 1 mg/ml 10% diethanolamin, 1 mM MgC^, pH 9,6, tilsatt. Optisk densitet ble målt ved 405 nm etter 1 times inkubering ved 37°C. Standardkurver for kvantifisering ble konstruert med fortynning av IgM (Cappel) eller IgG (Kabi AB, Stockholm, Sverige). Hybrider som produserte immunoglobulin (lg) bestemt ved ELISA, ble for-mert ved overføring til 24-brønns makroplater (Nunc A/S, Danmark), og supernatantene ble ytterligere analysert ved immunocytokjemisk analyse med hensyn til omsetning med tumorceller eller ved immunohistokjemisk analyse med hensyn til reaksjoner med tumorvev som beskrevet i det etterfølgende.

Hybridomcellelinjen B9165 (ECACC 87040201) utvalgt ved de nedenfor beskrevne metoder, ble ved ELISA vist å produsere mellom 1 og 5 yg IgM pr. ml når den fikk vokse i to uker uten noen forandring av medium.

Eksempel 2

Antigenkarakterisering

a) Immunocytokjemisk analyse

Analysen med hensyn til anti-tumorreaktivitet ble

utført ved immunocytokjemisk analyse og ved immunohistokjemisk analyse. Immunocytokjemisk analyse ble utført på cellefilmer fremstilt fra forskjellige humane tumorcelle-linjer og perifere, humane blodleukocytter. Cellene ble fiksert på objektglass ved behandling med formol-aceton (9,5% formaldehyd, 43% aceton i 86 mM fosfatbuffer, pH 7,2). Ca. 50 yl C-0U1 supernatant (fra hybridomet B9165;

ECACC 87040201) ble anbrakt på filmen av fikserte celler og ble inkubert over natten ved 4°C i et fuktet kammer før skylling og inkubering i 1 time ved romtemperatur med pepperrotperoxydase (HRP)-merket kanin-anti-humant IgM (Dakopatts) fortynnet 1:80 i PBS-"Tween". Sluttelig ble peroxydasesubstrat (0,01% H202 og diaminobenzidin til 0,6 ug/ml i PBS) tilsatt. Filmene ble lett motbeiset med hematoxylin og montert. Tabell I viser resultatene erholdt ved analyse av C-0U1 på filmer av forskjellige celler.

Reaktivitet av C-0U1 bestemt ved immunocytokjemi

En selektiv reaktivitet er tydelig. Alternativt ble de levende celler inkubert med hybridomantistoffet ved 4°C, etterfulgt av det enzym-merkede anti-Ig-antistoff. Cellene ble deretter utstrøket på objektglass, fiksert med glutaraldehyd (0,17% i PBS) og inkubert med substrat.

Fig. IA viser beisingen av levende COLO 201-celler (coloniske adenocarcinomaceller) med C-0U1, mens fig. IB viser mangel på beising ved anvendelse av et ikke-reaktivt, humant hybridom IgM i det første laget. Den anvendte metode er den aksepterte standardprosedyre for merking av molekyler eksponert på celleoverflaten, og merkingen vist i fig. 1, er i overensstemmelse med dette.

b) Immunohistokjemisk analyse

Immunohistokjemisk analyse ble utført på fryste vev-snitt fiksert i aceton. Endogent IgM ble blokkert ved inkubering med Fab'-fragmenter av anti-u-kjede-antistoff (levert fra Dakopatts, København, Danmark) før inkubering med hybridomantistoffet C-0U1 (0,5 yg/ml) (Fab'-fragmentene ble fremstilt i henhold til B. Nielsen et al., Hybridoma 6 (1), 1987, s. 103-109) (hybridomantistoffet ble konsentrert ved utfelling med 2M ammoniumsulfat). Det bundne hybridomanti-stof f ble deretter synliggjort som beskrevet ovenfor, for den immunocytokjemiske analyse. I dette tilfelle ble det samme antistoffpreparat merket med peroxydase slik som det som ble anvendt for fremstilling av Fab'-fragmentene. Fig. 2A viser at etter påføring av C-0U1 var bare tumorcellene beiset i et snitt av colon adenocarcinoma. Fig. 2B viser mangel på beising av tonsillart vev. Tabell IIA og B oppsummerer reaktiviteten som analysert på et utall av vev, idet tabell IIa viser resultatene fra ondartet vev, og tabell IIB viser resultatene fra ikke-ondartet vev.

Normalt colonepitel utviste binding av alt analysert, humant IgM, monoklonale antistoffer, myeloma IgM såvel som normalt, polyklonalt, humant IgM. Denne generelle binding av IgM til normalt colonepitel ble således bedømt til å være ikke-spesifikk, en fortolkning som ble ytterligere understøttet av analyse ved elektronmikroskopi og isoelektrisk fokusering (se nedenfor). Denne ikke-spesi-fikke binding av antistoff er også i overensstemmelse med fagmannens kunnskap.

c) Elektronmikroskopi

For elektronmikroskopi ble 10 5/ml adenocarcinomaceller dyrket i RPMI-1640-medium, 10% FCS, i rør med plast-dekkglass i 3 dager inntil et monolag var blitt erholdt. Cellene ble fiksert i 0,1% (v/v) glutaraldehyd i 0,1 M PBS,

pH 7,2, i 30-60 minutter ved 4°C og ble deretter vasket i PBS supplert med kvegserumalbumin (BSA) og lysin-HCl over natten ved 4°C. Cellene ble dehydratisert i fra 30% til 90% ethanol ved progressivt lavere temperaturer til -20°C, og ble deretter infiltrert i "Lowicryl" K4M (Chemische Werke Lowi, BRD) ved -35°C og ble polymerisert over natten ved -35°C under ultrafiolett lys og deretter i ytterligere 2 dager ved omgivende temperatur.

Ultratynne (50-60 nm) snitt av celleholdig "Lowicryl" montert på belagte nikkelgittere, ble anvendt. Immuno-markeringsprosedyren bestående i å la gitrene med snittene rettet nedover, flyte på toppen av forskjellige løsninger, omfattet følgende trinn: 1) gitrene ble plassert på dråper av 1% (w/v) NaBH4 i PBS i 10 minutter; 2) etter vasking i 0,1%

(w/v) BSA-Tris i 2x5 minutter, ble gitrene overført til dråper av 3% BSA-Tris (15 minutter); 3) gitrene ble anbrakt på dråper av C-0U1 antistoff i 1 time ved romtemperatur; 4) gitrene ble vasket i 0,1% BSA-Tris i 2x5 minutter; 5) gitrene ble over-ført til dråper av kanin-anti-humant IgM oppløst i 3% BSA-Tris i 1 time ved romtemperatur; 6) etter vasking i 0,1% BSA-Tris i 2x5 minutter ble gitrene anbrakt på dråper av geite-anti-kanin IgG merket med gullprober (Janssen Pharmaceuticals) på 15 nm, oppløst i 3% BSA-Tris, inkubert i 30 minutter ved romtemperatur; 7) gitrene ble vasket i 0,1% BSA-Tris i 2x5 minutter og i redestillert vann i 2x5 minutter og ble tørket; og 8) de ultratynne snitt ble beiset med 1% uranyl-acetat i 10 minutter og 0,4% blycitrat i 2 minutter ved romtemperatur.

"Tween" 20 og 0,5 M NaCl ble tilsatt til alle antistoff- og vaskeløsninger.

De ultratynne snitt ble undersøkt i et "JEOL" 100-CX elektronmikroskop som ble drevet ved 80 kV.

Forsøk på å fastsette spesifisiteten av de immunocytokjemiske reaksjoner innbefattet utelukkelse av det primære antistoff og anvendelse av et humant IgM (Cappel) istedenfor det primære antistoff.

Fig. 3A viser det distinkte mønster av merkingen av colon adenocarcinomaceller (Colon 137) i regioner rundt endene av mellomliggende filamenter, og fig. 3B viser mangel på merking (med en lignende prosedyre) av duodenale adenocarcinomaceller (HUTU 80). Snitt av colon adenocarcinoma-cancervev viste merking bare av tumorcellene, igjen assosiert med mellomliggende filamenter (ikke vist). Normalt colonepitel viste ingen merking. Elektronmikroskopi viser således nærværet av målantigenet i assosiasjon med cyto-plasmiske strukturer.

d) Isoelektrisk fokusering

Molekylær karakterisering av målantigenet ble utført

ved isoelektrisk fokusering. Tumorceller eller cancervev og normalt vev ble oppløst ved ultralydbehandling (4x30 sek-under på is) i ekstraksjonsbuffer (75 mM NaCl, 75 mM KC1, 10 mM Hepes, 5 mM EDTA, 5% 2-mercaptoethanol, 5 mg/l "Trasylol", 0,01 mM "Lenpeptin", 0,01 mM "Pepstatin"). Etter ultralydbehandling ble urea tilsatt til 6 M sammen med 80 mg sucrose, og homogenatet ble inkubert i 30 minutter ved 37°C. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering (5 minutter ved 15.000 x g).

Isoelektrisk fokusering ble utført med ekstraktene anbrakt på 1% agarose tynnskiktsgel ("Agarose" IEF, Pharma-cia) inneholdende 6 M urea, 3% (v/v) servalytes 3-10 og 1%

(w/v) servalytes 4-6 (Serva). Som støtte ble det anvendt gelbasert film (LKB). Fokusering ble utført ved 1500 V/h før elektroforetisk overføring av proteinene på nitrocellulose. Gjenværende bindingsseter ble blokkert ved inkubering av nitrocellulosen i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, inneholdende 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2 og 0,05% "Tween" 20. Nitrocellulosen ble skåret opp i remser, inkubert i 2 timer ved romtempera-

tur med hybridomantistoffet C-0U1 fortynnet i PBS-"Tween" til ca. 200 ng/ml. Etter vasking med PBS-"Tween" ble nitro-celluloseremsene inkubert med alkalisk fosfatasekonjugert F(ab')2-anti IgM antistoff (Jackson Immunoresearch), etterfulgt av et substrat (en løsning av 5-brom-4-klorindoxyl-fosfat og nitroblått tetrazolium).

Fig. 4, venstre felt, viser beisingen av ekstrakter av en colon adenocarcinomatumor, og fig. 4, høyre felt, et ekstrakt av normalt colonepitel. I. beising av totalt protein med India-blekk; II. beising med C-0U1; og III. beising med et forskjellig hybridom IgM. C-0U1 viser tydelig distinkt beising av sure proteiner (pl 5,4-6,2) i tumorekstraktet, men ikke i ekstraktet av normalt colon.

e) SDS-PAGE og Western blotting

Ekstrakter av Colon 137 (colon adenocarcinomaceller) og HUTU 80 (duodenale adenocarcinomaceller) ble fremstilt ved oppløsning med detergenter (2% SDS, 4M urea,

10 mM jodacetamid) og ble inkubert i 15 minutter før PAGE

på 5 til 20% gradientgeler. Proteinene ble deretter elektroforetisk overført til nitrocelluloseark. Nitrocellulose-arkene ble oppkuttet i 3 mm remser og inkubert over natten ved 4°C med C-0U1, etterfulgt av inkubering i 2 timer med AP-kanin-anti-humant IgM (Sigma). Avtrykkene ble vasket i PBS og fiksert ved inkubering i 15 minutter med 0,2% glutaraldehyd i PBS. Alkalisk fosfatase ble synliggjort ved inkubering i 1 time ved 37°C med substrat, nitroblått tetrazolium og 5-brom-4-klorindoxylfosfatase. Molekylvekten ble beregnet fra mobiliteten av følgende pre-beisede mole-kylvektmarkører: 8-galactosidase (116 K), fructose-6-fosfatasekinase (84 K), pyruvatkinase (58 K), fumarase

(48,5 K), melkesyre-dehydrogenase (36,5 K), triosefosfat-ase-isonerase (26,6 K).

Resultatene i fig. 5 viser at C-0U1 reagerer med

et protein med en molekylvekt på 43.000 som finnes i ekstraktene av colon adenocarcinoma, og ikke i ekstrakter av duodenal adenocarcinoma.

Claims (13)

1. Antistoff eller bindende fragment derav til diagnostikk av humant carcinom, eller som transportør av farmasøyt-iske midler, karakterisert ved at det ved immunhisto-kjemisk analyse på frosne, acetonfikserte vevssnitt binder til colonadenocarcinom, ovarieadenocarcinom, nyreadenocarcinom, brystcarcinom, lungeadenocarcinom, ikke-seminomalt testiscarcinom, brysttubuli, brystductuli og prostataepitel, og binder ikke til lungeepitelcarcinom, sarcom, malignt melanom, B-lymfom, thymom, ovariestroma, ovarieepiteler, renale glomeruli, renale tubuli, lungealveoler, bronkialt epitel, testis, epidermis, tonsillart lymfatisk vev, tonsillart epitel, glatte muskler eller blodkar, og som binder til et humant carcinomassosiert cytoplasmatisk antigen som har en tilsynelatende molekylvekt på 43.000 og et isoelektrisk punkt i området 5,4-6,2, og som har minst én epitop som er reaktiv med et monoklonalt antistoff som er produsert av den humane hybridomcellelinje B9165 (ECACC 87040201).

2. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.

3. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er fremstilt av en human lymfocytt.

4. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et polyklonalt antistoff.

5. Antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at det er fremstilt av en human-human hybridomcellelinje.

6. Antistoff ifølge krav 5, karakterisert ved at den human-humane hybridomcellelinje er B9165 (ECACC 87040201).

7. Isolert,humant carcinomassosiert antigen til ikke-legemiddelanvendelse, karakterisert ved at det er i hovedsakelig ren form, og har en tilsynelatende molekylvekt på 43 kD og et isoelektrisk punkt i området 5,4-6,2, og at det har minst én epitop som er reaktiv med et monoklonalt antistoff som produseres av den humane hybridomcellelinje B9165 (ECACC 87040201) eller en analog derav.

8. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et hybrid-antistoff som inneholder et kombinasjonssted som spesifikt er rettet mot en epitop på et antigen ifølge krav 7 eller 8, og et annet som spesifikt er rettet mot en annen epitop på det samme antigen, en epitop på et annet antigen, f.eks. et differensieringsantigen av cytotoksiske T-celler, eller et farma-søytikum som f.eks. er valgt blant cytotoksiske og antineoplastiske midler.

9. Anti-idiotypisk antistoff til diagnostikk av humant carcinom, eller som transportør av farmasøytiske midler, karakterisert ved at det er rettet mot et antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1-6 og 8.

10. Anti-anti-idiotypisk antistoff til diagnostikk av humant carcinom, eller som transportør av farmasøytiske midler, karakterisert ved at det er rettet mot et anti-idiotypisk antistoff ifølge krav 9.

11. Diagnostisk middel, karakterisert ved at det omfatter et antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1-6 eller 9-10, eller et bindende fragment av et antistoff ifølge krav 1-6 eller 9-10.

12. Diagnostisk middel, karakterisert ved at det omfatter et antigen ifølge krav 7.

13. Fremgangsmåte for in vitro-diagnostisering av humant carcinom, karakterisert ved at en vevsprøve eller en prøve av en kroppsvæske fra en formodet cancerpasient bringes i kontakt med et diagnostisk middel ifølge krav 11 eller 12, hvilket middel omfatter et antistoff eller et bindende fragment av et antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1-6 eller 9-11, eller et antigen ifølge krav 7, eller et anti-idiotypisk antistoff ifølge krav 9, hvoretter de steder på vevsprøven bestemmes hvortil det er bundet antistoff eller fragment av antistoff, eller tilstedeværelsen av antigen fra prøven av kroppsvæske bundet til antistoffet eller fragmentet av antistoffet eller tilstedeværelsen av bundet antistoff mot et antigen ifølge krav 7 som finnes i kroppsvæsken, bestemmes.