JPH02174690A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高分子型ヒト上皮細胞成長因子に対するモノク
ロナール抗体、その製造方法及び利用方法に関する。

〔従来の技術Ｊ ヒト上皮細胞成長因子は細胞分裂促進因子（ｍｉｔｏｇ
ｅｎｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　）　　としての働きが試験管
内で知られており、組織分化の促進、各種の癌に対する
プロモーター作用などが生体内で明らかにされている。

また臨床的には角膜炎、角膜潰瘍等の治療用点眼剤、胃
潰瘍、火傷等の治療薬としての可能性が検討されつつあ
るのはよく知られている。

近年に至りヒト上皮細胞成長促進因子（以下ｈ　ＥＯＦ
と略称）の前駆体の存在がｍ几ＮＡの側から予測された
（　Ａｌａｎｅ　Ｇｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３０３　。

７２２〜７２５（１９ｇり、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｊ、Ｈａｌ
ｌｅＬａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３１３，７２８〜２３１（
１９８５））。

また別のグループは尿中においてｈ　ＥＧＦと免疫的に
交差し、レセプターを競合する物質の存在を示した（　
Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｄ、　Ｍｏｕｎｔ　ｅｔ　ａ！１Ａｒ
ｃｈｉｖｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ
　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　２５５．１〜７（１９８７）
）。この物質（以下■磨−ｈＥＧＦと略称）は分子量約
３３．０００ダルトンでＯ−グリコジル化されていた（
　ｈＥＧＦは約ｅ、ｏ　ｏ　ｏダルトン）。また本物質
のアミノ酸配列が上記ｍＲＮＡから予測された配列の一
部と全く一致した。これらのことから細胞内でより高分
子の形で合成されたｈＥＧＦが細胞外に分泌され、尿中
に一部はｈＥＧＦとして、また他の一部は若干のプロセ
スを受けた前駆体として尿中に存在することが推測され
た・３彼らは尿のセライト吸着物からＤＥＡＥ−セルロ
ーズ、ＣＭ−セルローズ、セファクリール８２００及び
逆相ＨＰＬＣ法等を用いてや＼純品に近いＢＭＷ−ｈＥ
（！Ｆを得たが、その収率は約３％であった。また原本
らのグループ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｏｌ几ｅｓｅａｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎ　１４５＋　１２．６〜１５３（１９８７））
はバイオレックス−７０イオン交換体、抗ｈＥＧ　Ｆ　
　−セファロース、セファデックスａ−ＳＯ及びセファ
クリル８−２００によるゲル濾過、さらに逆相）ＩＰＬ
Ｏを行ないＨＭＷ−ｈＥＧＦ　　を得、その収率は１．
４％であった。

最近さらに病理学的見地から重要な知見が明らかにされ
た（　Ｋｕｒｔ　８ｔｒｏｍｂｅｒｇ、　ａｔ　ａｔ、
、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　４７．１１９０〜
１１９６（１９８７）　）、即ちヒト脳腫瘍患者尿中に
著しく高濃度のＨＭＷ−ｈＥＧＦが存在することが発見
され、しかも手術により腫瘍を取り去ると尿中のＨＭＷ
−ｈＥｏＦは消失するという極めて興味ある報告である
。このことからＨＭＷ−ｈＥＧＦの病理学的及び臨床的
意義が高まってきた。

〔発明の解決しよう−とする課題Ｊ しかし前記のチャールズ・デイ・マウント（Ｃｈ・ａｒ
ｌｅｓ　Ｄ、　Ｍｏｕｎｔ　）らの報告にも見られるよ
うに尿からＢＭＷ−ｈＥＧＦの抽出収率は極めて悪く本
物質の応用へ向けての研究を妨げている現状である。

しかも本物質がその性質上ｈＥＧＦと免疫的に交差する
ため通常の方法では定量が困難である。

従って脳腫瘍と体液中の本物質の濃度との関連を検討す
るについても、本物質の簡便且つ正確な測定法が期待さ
れている。

〔課題を解決するための手段Ｊ 本発明者らは大量の尿から独自の方法でＦＩＭＷ−ｈＥ
ＧＦを分離、精製しこれを材料として抗ＨＭＷ−ｈＥＧ
Ｆモノクロナール抗体産生ハイブリドーマを作製し、得
られた細胞株約ｔ、ａａａ種の中からｈＥ（ＩＦには反
応しないが、ＨＭＷ−ｈＥＧＦのみ反応する株数種を発
見し、これらの細胞株を利用して抗ＨＭＷ−ｈＥＧＦ抗
体を多量生産、精製し検討を重ねた結果、ＨＭＷ−ｈＥ
ＧＦを選択的に定量し得る２つの酵素抗体法による測定
法の確立に成功した。

更に本抗体を固定化した担体を用いアフィニティークロ
マトグラフを行なうことにより、ヒト尿から迅速に且つ
簡便なＨＭＷ−ｈＥＧＦを製造する方法を確立した。

本発明はこれらの新知見に基づくもので、イムノグロブ
リンＩｇＧに属し、約３５キロダルトンのヒト上皮細胞
成長因子を認識しないが、約３５キロダルトンの高分子
型ヒト上皮細胞成長因子を認識するモノクロクロナール
抗体多約３３キロダルトンの高分子型ヒト上皮細胞成長
促進因子を抗原として免疫されたホ乳動物の細胞とミエ
ローマ細胞とのハイブリドーマを培養し、その培養物か
ら抗高分子型ヒト上皮細胞成長因子モノクロナール抗体
を採取することを特徴とする上記モノクロナール抗体の
製造法；試料中に含有される高分子型を含むヒト上皮細
胞生長促進因子を固定化し、これに上記のモノクロナー
ル抗体を作用させ、その作用量を酵素標識法により測定
することを特徴とする高分子型ヒト上皮細胞成長因子の
酵素免疫測定法；高分子型ヒト上皮細胞成長因子を含む
液体を、前記のモノクロナール抗体を固定した充填材の
カラムに通して上記成長因子を充填材に吸着させ、次い
でカラムから上記成長因子を溶出することを特徴とする
高分子型ヒト上皮細胞成長因子の製造法；および高分子
ヒト上皮細胞成長因子を抗原として免疫されたホ乳動物
の細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマである前記の
モノクロナール抗体を産生する株である。

本発明のモノクロナール抗体やハイブリドーマの製造に
必要なＨＭＷ−ｈＥＧＦは既知の方法で得られるが、本
発明者らはヒト尿を硫安塩析した後アンバーライトＩＲ
Ａ−９３、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５、のイオ
ン交換クロマトを行なった後Ｂ１ｏ−Ｇｅ１ｐ　−１０
のゲル濾過、抗Ｅ、ＧＦ−セファロースを用いたアフイ
ニティクロマトグラフ、セファデックスＧ−１００のゲ
ル濾過を行なって約７％の収率でＨＭＷ−ｈＥＧＦを得
た。（原料尿中のｈ−ＥＧＦ　十〇ＭＷ−ｈＥＧＦを１
００％として）次に上に得たＨＭＷ　−ｈ　ＥＧＦを用
いて、たとえば、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスのような動物を常
法で免疫し、その肺臓を摘出し、その中のリンパ球を精
製した後、予め培養したミエローマ細胞と融合させるこ
とによりＢＭＷ−ｈＥＧＦに対するモノクロナール抗体
を産生ずるハイブリドーマが得られる。融合はポリエチ
レングリコールやエレクトロポレーション等を用いて行
うことができる。ハイブリドーマ細胞の選択はアミノプ
テリン耐性を利用したＨＡＴ培地を用いて行なうことが
できる。抗体産生能を有するハイブリドーマのスクリー
ニングはヒト尿から得たＨＭＷ−ｈＥＧＦを用いた酵素
免疫側法で行なうことができる。このようなスクリーニ
ングには他の免疫学的方法、即ちラジオイムノアッセイ
、ラジオレセプターアッセイ、ラジオイムノプレシビテ
ーシ３ン、ウェスタンプロティング等の方法も用いられ
る。

本発明者らは以上述べたスクリーニングで約１ｔｏｏｏ
株の中から４株のＨＭＷ−ｈＥＯＦ特異モノクロナール
抗体産生株を確立した。その１株は工業技術院微生物工
業技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−１０２ψυとして寄託さ
れた。更にＨＭＷ−ｈＥＧＦ及びｈＥＯＦを認識する抗
体産生株２株を得た。上記６種の株は何れもマウス腹腔
内でもよく生育し容易に大量の抗体を得ることができる
。

これらの抗体はよく知られた精製法、例えば塩析、イオ
ン交換、プロティンＡを用いたアフィニティクロマトグ
ラフ、ハイドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフ
等で高純度に精製される。

更にそれらの抗体或いは抗体をペプシンで消化すること
により得られるＦａｂ’を用いてＥＬＩ８Ｈの系を組む
ことができる。その際抗体に直接アルカリフォスファタ
ーゼやペルオキシダーゼを結合させて得られる酵素標識
抗体を用いてもよく、或いは抗マウス■ｇＧ抗体などを
酵素標識したものを二次抗体として用いてもよい。この
ような方法を組合せることにより、前記ＨＭＷ−ｈＥＧ
Ｆ特異モノクロナール抗体生産株の培養上清から得られ
たモノクロナール抗体を利用して体液中のＥＩＭＷ−ｈ
ＥＧＦをｈ−ＥＧＦの交差なしに特異的に測定すること
ができる。なお上記モノクロナール抗体を用いて、ウェ
スタン、プロア　）　法（ＨａｒｒｙＴｏｗｂｉｌｎ　
、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ　、ＵＳＡ７６．４３５０〜４３５４（１９
７９））を利用する測定法を設定することができる。こ
のＨＭＷ−ｈＥＧＦの測定法は臨床診断へのもう一つの
応用法として非常に有用である。

即ち患者体液を電気泳動した後、蛋白を適当な支持体例
えばニトロセルローズ膜Ｆζ熱処理或いは電気的に移行
させ、膜の非吸着部分、・を脱脂粉乳含有ＰＢＳ←）で
ブロックした後、ＢＭＷ−ｈＥＧＦ抗体と反応させ、酵
素標識した抗マウスＩＣＩＱ或いはＨ６Ｉ　　標識した
プロティンＡ等を用いて膜上のＨＭＷ−ｈＥＧＦを検出
することができる。

さらに有用な成果は上記モノクロナール抗体をセファロ
ース等の担体に固定化してアフィニティクロマトグラフ
を作製できることである。またとのカラムを利用すれば
これまで繁雑な方法で、しかも極めて低収率でしか得ら
れなかったヒト尿からＨＭＷ−ｈＥＧＦの分離精製が一
工程でしかも高収率での行うことが可能になったことで
ある。

参考例 ＨＭＷ−ｈＥＯＦの抽出、精製は発明者らの昭和６１年
年度来生化学会の報告に従って次のように行なった。ヒ
ト新鮮尿を硫酸アンモニウムで塩析した後、アンバーラ
イトＩＲＡ−９３（オルガノａ［、東京）、ＤＥＡＥ−
セファデックス（ファルマシア、ジャパン社製、東京）
のイオン交換樹脂で精製、さらにＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　−
１０（バイオランド社製、米国）でゲル沖過し、ＥＧＦ
活性の検出できる両分をポリクロナール抗体米を固定し
たセファロース４Ｂ（ファルマシア、ジャパン製、東京
）を用いてアフィニティクロマトグラフによって精製し
た。溶出液をセファデックス（］−１００（ファルマシ
ア、ジャパン社製、東京）でゲル濾過し、高分子領域で
ｈＥＧＦ活性を示す両分を得た。ｈＥＧＦ活性はＨｅ　
１ｍ細胞を用いてラジオレセプターアッセイで測定した
。尿中のｈＥＧＦ活性を１００％としたとき、高分子分
画として回収されるｈＥＧＦ活性は６〜８％であった。

本画分を５ＤＳ−電気泳動で分析すると、ＨＭＷ−ｈＥ
ＧＦの純度は９０％以上であった。

米　ｈＥＯＦを抗原として家兎に免疫して得られた抗Ｅ
ＯＦ血清をプロティンＡ−セファロース（ファルマシア
、ジャパン社製、東京）ヲ用いて精製した上で固定化し
た。

実施例１　ハイブリドーマの作製 Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（静岡実験動物社から入手、静岡）
に参考例で得たＨＭＷ−ｈＥＧＦｌ　７．６μＪ　をフ
ロイント完全アジュバント（ディスコ社製、米国）で乳
化した上で皮下に投与した。２週間後及び４週間後にフ
ロイント不完全アジュバント（ディスコ社製、米国）で
乳化した同量のＨＭＷ−ｈＥＧＦを静脈内投与した。さ
らに２週間後に７ジユバンドなしに同様に投与し、３日
後に肺臓を摘出した。

肺臓を２価のイオンを含まないダルベツコ処方のリン酸
食塩緩衝液（以下ＰＢＳ←）と略す）で洗浄した後、す
りつぶし牌細胞の懸濁液を得た。一方本牌細胞と融合さ
せるマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８８５５　　株は
アラバマ大学カーニー博士（Ｄｒ。

Ｊ、　Ｆ、　Ｋ、ｅａｒｒ＋、ｄｙ　）から供与を受け
た。本株はＢａ１ｔｉ／Ｃマウス由来で、抗体関連蛋白
の合成能を全く失った免疫グロブリン非分泌性細胞であ
り、融合することによってはじめて抗体の分泌が可能に
なる。本株は１０％の牛胎児血清（大日本製薬社製、東
京）を添加したＲＰＭＩ−１８４０（日永製薬社製、東
京）の培地で増殖させた。１０８個のミエローマ細胞を
ｊ５００ｒｐｍ　　で５分間遠心分離して回収した後、
２匹のマウスより調製した牌細胞と混和した。１５００
ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＰＢＳ（ハ）で再懸濁
した。この操作をくり返し洗浄した細胞にＰＥＧ　　４
０００（シグマ社製、米国）をＰＢＳ（−）で２倍に希
釈した液を１．５　ｍ＝Ｊ滴下した。１分間放置後、血
清を含まないＲＰＭＩ−１６４０液４０ｍ１を滴下し、
直ちに１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。融合した
細胞沈渣をＨＡＴ培地米に懸濁した。この懸濁液を、９
枚の９６穴マイクロプレート（コーニング社製、米国）
に、各人１００μぎずつ滴下した。これを５％の炭酸ガ
ス濃度に調整した３７°Ｃのインキュベーター中で２〜
３週間培養した。ＨＡＴ培地中で増殖可能となる牌細胞
−ミエローマの融合細胞を週択した。

米　１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に、
１００μＭのヒポキサンチン、０．１μＭのアミーノプ
テリン、１．６μＭのチミジン（いずれもシグマ社製、
米国）を添加して作った。

実施例・２、抗体産生ハイブリドーマの検索９６穴のマ
ニフオールド（バイオドツト；バイオラド社製、米国）
にニトロセルローズ膜（０，４５μｍ、バイラド社、米
国）を固定し各人の膜上に７０ｎｇ相当のＨＭＷ−ｈＥ
ＧＦを吸着させた。

吸着はＨＭＷ−ｈＥＧＦ溶液を自然落下により通過させ
ることで行なった。膜の非吸着部をブロックするため、
１％牛血清アルブミン（シグマ社製、米国）を含むＰＢ
Ｓを２５０μＩずつ、各人に加えた。各人を０，０５％
のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ（−）　（Ｔ　Ｐ　Ｂ
　Ｓ←））で吸引法により洗浄した。融合細胞を植え込
んｔご後ＨＡＴ培地中で細胞の増殖が見られる各人の培
養上清を１００μｌずつマニフォールドの各人に移し、
１時間反応させた。反応後ＴＰＢＳで洗浄した後、アリ
カリフォスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ　（、プ
ロメガ社製、米国）を１％牛血清アルブミンを含むＰＢ
Ｓ（→で１０００培に希釈した溶液各１００μｌと反応
させた。反応後ＴＰＢＳで洗浄した後、１ｍＭ塩化マグ
ネシウム、３０ｍｇ／ｄｇ　のニトロブルーテトラゾリ
ウム、１５ｒｒ＋ｇ／ｄｌのブロモクロロインドリルリ
ン酸を含むトリス塩酸バッファーｐＨ９の基質溶液各１
００μｌを各人に滴下し発色させた。その結果濃い青色
の色素が沈着した穴に対応するハイブリードーマを抗体
産生陽性法として拾い上げた。この方法によって約３０
０株の抗体産生陽性法が得られた。

実施例３　ハイブリドーマの産生ずる抗体の特異性の決
定 実施例２で拾い上げた株の産生ずる抗体の特異性をラジ
オイムノプレシピテーション法で決定した。従来の方法
で精製したｈＥＧＦ及びＨＭＷ−ｈＥＧＦ　１ｍｇ／１
ｍＪを０．１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，６に十分透析し
た後、ポルトンハンター試薬（アマ−ジャム社製、英国
）でヨード化した。本試薬は極めて温和な条件で蛋白を
ヨード化することができ、ヨード化後も抗原性がよく維
持されることが知られている。ポルトンハンター試薬各
２５０μｌをＶ型底のバイアル中で乾燥窒素ガスを用い
て乾燥させた。これに５μｌのｈＥＧ　ＦあるいはＢＭ
Ｗ−ｈＥＧＦ溶液を添加した。

４°Ｃで一晩反応した後、セファデックス０−２５（フ
ァルマシア、ジャパン社製、東京）　１０　ｍｌを充填
したカラムを用いてゲル濾過することにより未反応のポ
ルトンハンター試薬や遊離ヨードをヨード化したｈＥＧ
Ｆから分離した。ゲル濾過に当っては非特異的吸着を避
けるため、０．２％のゼラチンを含むＰＢＳ←）を使用
した。上記２種のヨード標識ｈＥ（）Ｆを２０．０００
　ｃｐｍから２００，０００ｃｐｍずつ混でた上、実施
例２で抗体産生陽性が確認された細胞株の上清と一夜、
４°Ｃで反応させた。反応はエッペンドルフ製の１．５
ｍｌ遠心チューフ中で行なった。反応後、５μｌのウサ
ギ抗マウスＩｇＧ（カッヘル社ｉ１、米ｍ　）、５０μ
ｅのパニソルピン（カルビオケム社製、米国）を加え１
時間反応させた。つぎに微量遠心機を用い遠心して沈澱
を得た。この沈澱を非イオン性界面活性剤、ノニデッ）
Ｐ−４０（シグマ社製、米国）を０．１％含有のＰＢＳ
（→で４回洗浄した後、沈澱を２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（８１）Ｓｉバイオラド社製、米国）グリセロール
、少量のブロムフェノールブルー（バイオラド社製、米
国）を含む２０ｍＭのトリス塩酸緩ｍ液ｐＨ７，０のロ
ーディング、バッファーｔ−用いてベニソルビン上に吸
着した放射性ｈＥＧＦを溶出した。これを１５％５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。４０Ｖ、
１２時間通電した後、ゲルを取出し、Ｘ線フィルム上に
露出し、オートラジオグラフを撮った。放射活性が現わ
れる位置の易動度からＨＭＷ−ｈＥＧＦ　（３３キロダ
ルトン）か、ｈＥＧＦ　（６，０００ダルトン）かを判
断することによって、各々の細胞株が分泌するモノクロ
ナール抗体の特異性を決定した。以上の方法で、Ｎｎｌ
　６　、ｍ２５　、Ｎｎ５７及び陽１１２の諸株から得
られる抗体がＨ’Ｍｗ−ｈＥＧ　Ｆには反応するが、ｈ
ＥＧＦには反応しない抗体であることが明らかになった
。それらのイムノグロブリンサブタイプはハイクロン社
（米国）製タイピングキット用いて決定した。すべてＩ
ｇＧ１であった。

更に階１４３及び陽２９６株はＨＭＷ−ＥＧＦとｈＥＧ
Ｆの両方を認識する抗体産生株であることが分った。

実施例４　　ＨＭＷ−ｈＥＧＦ定量用酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳＡ法） ｈＥＧＦを用いて常用に従いニューシーラントホワイト
種家兎（静岡実験動物社から入手）を免疫し゛て得た抗
ｈＥＧＦ血清をプロティンＡ−セファロース（ファルマ
シア、ジャパンａ製、東京）　を用いて精製した。

実施例３で得た南２５株に由来するＨＭＷ−ｈ　ＥＧＦ
モノクローナル抗体及びＮｎ１４３株に由来するｈＥＯ
，Ｆ及びＨＭＷ　ｈＥＧＦ両方を認識する抗体を精製し
工ｇＧを得た。これらのＩｇＧはいずれもＩｇＧ１のサ
ブタイプを有しておりバイオランド社製マンブスキット
を用いてさらに精製した。各々１００ｍ１の培養上清か
ら３ｍｇ及びＬ２ｍｇの精製ｘｇａが得られた。これら
の抗体を用いて同相法のＥＬＩＳＡ系を確立した。

精製ウサギ抗ｈＥＧＦ抗体をＰ　Ｂ　Ｓ　（−）を用い
て５００　ｐｇ／ｍｌに、希釈し、これを１００　Ｉｌ
ｌずつ９６大のＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（イムロ
ン社製、米国）に滴下し、１晩４°Ｃに保存することで
抗体を吸着させた。

プレート中の未吸着部分を１％牛血清アルブミンを含む
ＰＢＳ（→を各人に２００μｌずつ滴下し１時間室温で
インキュベートしてブロックした。

Ｔ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）でプレートをよく洗浄した後、
既知の濃度のｈＥＧＦ及びＨＭＷ−ｈＥＧＦを１％牛血
清アルブミンを含むＰＢＳ（→で段階希釈したものを試
料として加え１時間反応させた。反応後ＴＰＢＳでよく
洗浄した後、階２５株あるいはＮｎ１４３株の培養上清
より精製したＩｇＧを１％牛血清アルブミン含有のＰＢ
Ｘ（→で１００μｇ／ｍｅに希釈して、これを１００μ
ｇずつ各人に滴下した。１時間室温で反応させた後、Ｔ
ＰＢＳで洗浄した上で、酵素抗体法用アルカリフォスフ
ァターゼ標識抗Ｙウス１　ｇＱ　（バイオラド社製、米
国）の３０００培希釈液を１００　ｐｌずつ各人に滴下
した。抗体の希釈は１％牛血清アルブミン含有Ｐ　Ｂ　
Ｓ　（−）を用いた。

１時間反応させた後、ＴＢＢＳでよく洗浄した。

ｘｉｇｉはパラニトロフェニールリン１２錠（バイオラ
ド社製、米国）をｔ　Ｏｍｌジェタノールアミンバッフ
ァー（バイオラド社、米国）に溶かして調製した。これ
を１００μｌずつ、プレートの各人に滴下して３０分間
発色させた。１／２規定のＮａＯＨ液１００μｌずつ各
人に加え、発色反応を停止した。発色の強度を４０５　
ｎｍのフィルターを装備したタイターチックマルチスキ
ャン（Ｔｉ・ｔｅｒｔｅｋ　ＭｕＦｔｉｓｋａｎ　）　
（フロー社製、米国）を用いて測定した。

上記方法に於てＮｎ２５株ＩｇＧを用いた場合ｈ　ＥＧ
Ｆは１ｍｇ／ｍ／？の濃度でも全く検出されなかったが
、ＨＭＷ−ｈＥＧＦは１ｍｇ／ｍ／まで用量作用的に反
応し発色した。尚１４３株工ｇＧを用いた場合、ｈＥＯ
Ｆは１ｐｇ／ｍｅまで、ＨＭＷ−ｈＥＧＦは１１００ｎ
／ｍ／Ｊ　　まで検出することができた。

実施例５　ウェスタンブロッティング法による酵素免疫
測定法 ５０μｇ／ｍｌの濃度ノＩ（ＭＷ−ｈＥ　Ｇ　Ｂ”及び
ｈＥＧＦ各５μｇをとり、これにβ−メルカプトエタノ
ールを含むゲルローディングバッファ（実施例３）を１
０μｅ加え、５分間１００°Ｃの水浴中で処理した。こ
れを１５％のポリアクリルアミドゲル上で、０．１％Ｓ
Ｄ８の存在下に電気泳動した。

ゲル上に分離された蛋白質はトランスプロット装置（バ
イオラド社、米国）中で電気的にニトロセルローズ膜に
移行させた。

本過程は上記装置のセル中で、２０％メタノタンヲ含む
トリスグリシンバッフアラ用い、２００ｍＡで２時間通
電することで行った。移行後膜上の検体が遊離するのを
防ぐため６．２％のグルタルアルデヒド（和光紬薬社製
、東京）中で、１時間処理することにより固定した。膜
をＰＢＳ（→でよく洗った後、５％の脱脂粉乳を含むＰ
ＢＳ←）中に１時間保持して非吸着部をブロックした。

つぎに各モノクロナール抗体あるいは免疫マウス血清（
ポシティグ、コントロール）と１００μ’Ｊ　／　ＩＴ
Ｉ　ｌの濃度で反応させた。名抗体は上述のブロック液
で希釈し、反応は室温で一晩行なった。反応後膜をＴ　
Ｐ　Ｂ　８　（−）でよく洗浄した後、アルカリフォス
ファターゼ標識抗マウスＩｇＧと反応させ、さらに実施
例２に倣いニトロブルーテトラゾリウム、ブロモクロロ
インドクールリン酸含有の基質溶液で発色させた。

陥２５株、阻１１２株、１４３株、２９６株の培養上清
及び免疫マウス血清はこの試験で陽性を示した。ＩｔＬ
２６株及びＮＣ１１１２株の培養上清はＨＭＷ−ｈＥＧ
Ｆをのみ認識したのに対して、その他の培養ヒ清及び血
清はｈＥＧＦ及びＨＭＷ−ｈＥＧＦ両方を認識した。

実ｍ例ｅ　　ＨＭＷ−ｈＥＧＦモノクロナール抗体を利
用したアフィニティクロマトグラフ ィによる。）ＩＭＷ−ｈＥＧＦの抽出、精製バイオラン
ド社製マツプスキットを用いて階２５株培養上清からＨ
ＭＷ−ｈＥＧＦモノクロナール抗体を精製した。得られ
た精製Ｉｇ０２０　ｍｇを１００ｍ１のブロモシアン活
性化セファロース（ファルマシア、ジャパン社製、東京
）に常法通りカップリングした。０，１Ｍのグリシン緩
衝液ｐＨ８で遊離のブロモシアン基をブロックした後、
このセファロースをカラムに詰めＰＢＳ（→でバッファ
ライズした。男子新鉾尿１０１をｐ）ｆ８．５に調整し
析出する不溶物を濾過して除き、ｐＨ７，５に調整して
上記のカラムにチャージした。カラムをＩ　Ｑ　Ｑ　ｒ
ｎｅのＰＢＳ（→、さらに１Ｍ塩化ナトリウムを含むＰ
Ｅ５（→１００　ｍｌで洗浄した後、０．１Ｍクエン酸
水溶液ｐＨ２，０で吸着したＨＭ’Ｗ−ｈＥＧＦを溶出
した。

本操作により５０μｑのＨＭ、Ｗ−ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆが１
ステツプで得られた。８ＤＳ−電気泳動で純度を検定す
ると約８５％であった。収率を実施例４のＥＬＩ　ＳＡ
法で検定すると９０％であった。

上記のクエン酸水溶液の代りにアンモニア水溶液、チオ
シアン酸水溶液のようなカオトロピック（ｃｈａｏｔｒ
ｏｐｉｃ　）イオンを含む水溶液を用いて溶出しても同
様の結果が得られた。

〔発明の効果Ｊ 本発明により新規なＨＭＷ−ｈＥＧＦモノクロナール抗
体を産生ずる細胞をつくることができる。

それによりＨＭＷ−ｈＥＧＦモノクロナール抗体を大量
生産することが可能になった。またこのモノクロナール
抗体と用いてヒト尿から分離の困難なＨＭＷ−ｈＥＧＦ
を簡便な方法で高収率で得ることができるようになった
。更に本抗体はヒ１〜体液中のＩ−ｆＭＷ−ｈＥＧＦを
特異的に測定するのに極めて有用である。本抗体を用い
た測定法によって脳腫瘍等の癌疾患の迅速なモニターリ
ングが可能になった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　イムノグロブリンＩｇＧに属し、約６，０００ダル
   トンのヒト上皮細胞成長因子を認識しないが、約３３キ
   ロダルトンの高分子型ヒト上皮細胞成長因子を認識する
   モノクロナール抗体。 ２　高分子型ヒト上皮細胞成長因子を抗原として免疫さ
   れたホ乳動物の細胞とミエローマ細胞とのハイブリドー
   マを培養して得られた培養物から得られた請求項１記載
   のモノクロナール抗体。 ３　約３３キロダルトンの高分子型ヒト上皮細胞成長促
   進因子を抗原として免疫されたホ乳動物の細胞とミエロ
   ーマ細胞とのハイブリドーマを培養し、その培養物から
   抗高分子型ヒト上皮細胞成長因子モノクロナール抗体を
   採取することを特徴とする請求項１もしくは２に記載さ
   れたモノクロナール抗体を製造する方法。 ４　試料中に含有される高分子型を含むヒト上皮細胞生
   長促進因子を固定化し、これに請求項１または２記載の
   抗高分子型ヒトモノクロナール抗体を作用させ、その作
   用量を酵素標識法により測定することを特徴とする高分
   子型ヒト上皮細胞生長促進因子の酵素免疫測定法。 ５　モノクロナール抗体を作用させたのち、該抗体の由
   来するホ乳動物のイムノグロブリンの抗体を酵素標識し
   て作用させ、その作用により結合する標識酵素を測定す
   る請求項４記載の測定法。 ６　モノクロナール抗体を酵素標識して作用させ、その
   作用により結合する標識酵素を測定する請求項４記載の
   測定法。 ７　高分子型ヒト上皮細胞成長因子を含む体液を、請求
   項１または２記載のモノクロナール抗体を固定した充填
   材のカラムに通して上記成長因子を充填材に吸着させ、
   次いでカラムから上記成長因子を溶出することを特徴と
   する高分子型ヒト上皮細胞成長因子の製造法。 ８、高分子ヒト上皮細胞成長因子を抗原として免疫され
   たホ乳動物の細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマで
   ある請求項１または２記載のモノクロナール抗体を産生
   する株。 ９　ホ乳動物の細胞が脾細胞であり、ミエローマ細胞が
   免疫グロブリン非分泌性である請求項６記載の株。