CN114249824B - 杂交瘤细胞hEGF-3A8及其产生的单克隆抗体和应用 - Google Patents

杂交瘤细胞hEGF-3A8及其产生的单克隆抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞hEGF‑3A8，并利用其产生的单克隆抗体对重组人表皮生长因子进行免疫亲和纯化。本发明获得重组人表皮生长因子的纯度可达97.8％，并且对目的蛋白的结构和生物活性影响较小。

Description

杂交瘤细胞hEGF-3A8及其产生的单克隆抗体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞hEGF-3A8及其产生的单克隆抗体和应用。
背景技术
人表皮生长因子(hEGF)是一种强有力的细胞分裂促进因子，临床上可用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。并且，血清中表皮生长因子的水平，与癌基因的表达也存在相关性。
当前，人表皮生长因子的来源，主要通过基因重组技术，利用大肠杆菌、酵母菌等生产发酵获得。重组人表皮生长因子(rhEGF)作为小分子多肽类物质，能够应用的关键所在，是它的高纯度、高活性。
早在1988年，瑞士成功上市了商品名为“Gentel”的rhEGF用于治疗眼科疾病。在所有生物技术产品的生产过程中，分离纯化加工技术成为重要的关键步骤，是生物制品产业的制约环节，因此生物大分子药物的分离纯化制约着其产业化，基因工程药物的分离纯化后处理可占整个生产成本的70％以上。
Wong等人专利报道了从E.coli发酵液中分离hEGF的工艺为：8500rpm离心30min，0.3μm膜过滤，在2升pH8.0的Tris缓冲液中用Amicom 3K凝胶二次过滤，在CG71(50-100μm)反相柱上分级分离，O-Sepharose Fast Flow柱上阴离子交换，再经RP-HPLC(C18)提纯，hEGF纯度达85％左右。Sindrey等人专利报道了用三乙基胺磷酸盐(TEAP)的阳离子对系统在C18柱上分离rhEGF，得到毛细管电泳级hEGF(CE-hEGF)。Bykov V.A.等人专利报道用多克隆抗体亲和色谱分离hEGF，谱柱载体为用CNBr激活的Sepharose，并用1mol/L醋酸洗脱，hEGF纯度可达99％。Noh Kyu-Seng等人专利报道从E.coli JM101(KCCM10027)发酵液中分离hEGF，包括：发酵液离心，在琥珀铬CG71柱上反相色谱，在Q-Sepharose FF酯上阴离子交换，C18柱RP-HPLC。Huang等人从E.coli JM101[pETacEGF]发酵液中分离hEGF，发酵液经0.45μm膜过滤，用1mol/L HCl调至pH7.4，QAE Sephadex A-25柱离子交换(用PB缓冲液平衡，用0.6×PB洗涤)，用含0-1mol/L NaCl梯度的PB洗脱(流速2mL/min)，Sephadex G-25脱盐，用0.1×PB洗脱，SP-Sepharose阳离子柱交换，40mmol/L乙酸铵(pH4.0)作为最初洗脱液，再用1mol/L乙酸铵(pH4.0)洗脱，RP-HPLC(Delta-Pale C18 8mm×100mm)，用溶有0.1％(v/v)的三氟乙酸0-80％的乙腈梯度洗脱，活性组分经RIA分析，产物纯度97-100％，得率30％。
Jo Jung-myong等人报道了从重组酵母发酵液中纯化rhEGF，工艺为：离心，调pH至7.0，阴离子树脂吸附，复溶于含NaCl的1mmol/L的Tirs缓冲液中，用YC05超滤膜浓缩，再用0.2μm滤膜浓缩。Kim Kyu-don等人专利报道使用阴离子交换柱和反向亲水性二氧化硅MC分析柱，用含乙醇的pH7.0的缓冲液过柱，可除去酵母培养基的褐色色素。Joo-Hyung Heo等人用两步从Hansenula Polymorpha甲基营养型酵母中分离rhEGF，产物纯度＞98％，总得率23％。
国内的科研工作者，在重组人表皮生长因子的表达和纯化方面，也做了大量工作。1997年，香港科技大学Leadergene公司和天琛堂公司合作开发了名为“Eurekaep-I”的含hEGF美容产品。
童望宇考察了STREAMLINE DEAE离子交换柱以填充床模式和扩张床模式初步分离浓缩E.coli分泌的rhEGF，浓缩倍数分别为2.9和4.3，得率分别为85％和80％，hEGF纯度分别达10％和20％以上，采用Sephadex G-50Superfine纯化rhEGF，成品纯度94％左右，总得率36％。陈秋东利用离子交换层析和大孔树脂建立了一条分离纯化中等纯度rhEGF的工艺流程，得到的rhEGF冻干粉含rhEGF≥32％，总得率≥53％。黄秉仁等人使用三次层析法分离Pichia pastoris发酵液中rhEGF，纯度达98％(SDS-PAGE)。Joo-Hyung Heo等人用两步从Hansenula Polymorpha甲基营养型酵母中分离rhEGF，产物纯度＞98％，总得率23％。
可见，目前重组表皮生长因子的纯化方法，主要是利用多级凝胶层析柱分离纯化，需要经过较长时间的分离和纯化流程，存在目的蛋白活性降低、得率不高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞，并利用其产生的单克隆抗体对重组人表皮生长因子进行免疫亲和纯化。
本发明采用如下技术方案：
一种杂交瘤细胞hEGF-3A8，于2021年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学。培养物名称(分类命名)：抗人表皮生长因子的杂交瘤细胞株hEGF-3A8。保藏号为CCTCC NO:C2021301。
一种如上述杂交瘤细胞hEGF-3A8的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备重组人表皮生长因子抗原工作液；
(2)采用重组人表皮生长因子抗原工作液，免疫6～8周龄的雌性小鼠，每次免疫的间隔时间为14天，8次免疫后断尾取血测定效价，选择效价大于等于1:6400的小鼠准备融合；
(3)取效价符合标准的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定培养上清，选取阳性孔的杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗人表皮生长因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
一种由上述杂交瘤细胞hEGF-3A8分泌的单克隆抗体。
一种上述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，选取大于12周的雌性BALB/c小鼠，采用杂交瘤细胞hEGF-3A8在体内诱生腹水，并通过Protein G层析柱纯化腹水，获得重组人表皮生长因子的单克隆抗体。
一种上述单克隆抗体在纯化重组人表皮生长因子中的应用。
一种上述单克隆抗体在亲和层析纯化重组人表皮生长因子中的应用。
进一步的，其包括如下步骤：
(A)单克隆抗体的预处理
(a)1～30mg/mL的单克隆抗体，4℃，用偶联缓冲液透析24h，期间每4～6h换液一次，至少换液4次，透析液的体积应500倍于抗体溶液；
(b)4℃，12000rpm离心30分钟，收集保存上清；
(c)在A280测定透析后抗体的蛋白质浓度及抗体的初始OD280始；
(d)用偶联缓冲液将透析后抗体稀释至10mg/mL，于4℃保存；
(B)亲和层析柱的制备
(i)洗涤CNBr活化琼脂糖凝胶填料，除去填料表面的溶剂；
(ii)单克隆抗体与CNBr活化琼脂糖凝胶偶联；
(iii)偶联了单克隆抗体的填料沉淀，用偶联缓冲液重悬洗涤一次；颠倒混匀3分钟；
(iv)用封闭缓冲液重悬填料，填料体积与封闭缓冲液的体积比为1:1.5或者1:2.0；室温下，摇床颠倒混匀封闭2.5h～6h；
(v)偶联了单克隆抗体的填料装柱；用NaCl溶液洗10个柱床体积，收集装柱子的液体以及清洗柱子的溶液，测定蛋白的含量；再用清洗液冲洗10个柱床体积；
(C)亲和层析获得重组人表皮生长因子
(I)亲和层析柱内加入含有目标蛋白的细胞裂解液，4℃旋转孵育过夜或室温孵育2h；
(II)15倍凝胶体积PBS洗涤亲和层析柱；
(III)用预冷的1倍凝胶体积酸性预洗液洗涤亲和层析柱，除去非特异性结合蛋白；
(IV)用预冷的3倍凝胶体积酸性洗脱液进行洗脱，每次收集1mL，收集管中预先放入中和液50μL；
(V)用紫外检测仪测定收集峰，合并收集峰；
(VI)Tricine-SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，保存蛋白质。
(VII)用10倍柱体积清洗液清洗亲和层析柱。
进一步的，其还包括如下步骤：
(D)亲和层析柱的清洗与再生
(1)用5倍凝胶体积清洗液清洗亲和层析柱；
(2)pH3.0酸性洗脱液洗脱亲和层析柱三次，每次三倍柱体积；
(3)pH8.0中和液洗涤亲和层析柱三次，每次三倍柱体积；
(4)用至少10倍柱体积清洗液清洗亲和层析柱，检测流穿液pH，至流穿液pH为中性止；
(5)用1×PBS保存液清洗，并加入适量该保存溶液至凝胶中，混匀，保存于-20℃。
本发明的有益效果在于：本发明通过筛选得到杂交瘤细胞株hEGF-3A8，并通过该细胞分泌的单克隆抗体，开发了一种利用该单克隆抗体的免疫亲和层析法，具有高载量和高特异性、步骤少、流程短且得率高的优点，可一步获得大量且高纯度的目的蛋白，并且对目的蛋白的结构和生物活性影响较小，通过本发明获得重组人表皮生长因子的纯度可达97.8％。
附图说明
图1为杂交瘤细胞hEGF-3A8腹水型抗体效价。
图2为杂交瘤细胞hEGF-3A8分泌单克隆抗体亚型。
图3为杂交瘤细胞hEGF-3A8分泌单克隆抗体亲和力测定。
图4为杂交瘤细胞hEGF-3A8分泌单克隆抗体特异性鉴定。
图5为抗体亲和层析纯化重组人表皮生长因子结果。
图5中，M为Protein Ladder；1为大肠杆菌全细胞蛋白；2为PBS洗脱收集溶液；3为预洗脱液洗脱收集溶液；4为洗脱液洗脱收集溶液。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一、制备重组人表皮生长因子(rhEGF)抗原工作液
(1)根据NCBI的GenBank:X04571中的人表皮生长因子基因序列，合成表达基因序列；
(2)构建表达载体，通过表达载体对人表皮生长因子进行可溶性表达、纯化；
诱导剂是0.1～1mM IPTG，培养温度为24～37℃，180～220rpm，诱导培养4～12h。
(3)纯化获得的重组人表皮生长因子转移至透析袋中，在PBS缓冲液中4℃透析72h，每天换液2～3次，透析后的溶液于8000rpm离心30min，取上清-20℃保存备用。
二、制备杂交瘤细胞株
(1)BALB/c小鼠免疫
采用重组表达纯化的人表皮生长因子(抗原工作液)，免疫6～8周龄的雌性小鼠，每次免疫的间隔时间为14天，8次免疫后断尾取血测定效价，选择效价大于等于1:6400的小鼠准备融合。
(2)细胞融合
取效价符合标准的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定培养上清，选取阳性孔的杂交瘤细胞，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗人表皮生长因子(hEGF)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株hEGF-3A8。
获得的杂交瘤细胞株hEGF-3A8，于2021年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学。培养物名称(分类命名)：抗人表皮生长因子的杂交瘤细胞株hEGF-3A8。保藏号为CCTCC NO:C2021301。
三、利用杂交瘤细胞hEGF-3A8制备重组人表皮生长因子的单克隆抗体
选取大于12周个体较大的雌性BALB/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过Protein G层析柱纯化腹水，分装小管，-20℃保存，获得重组人表皮生长因子的单克隆抗体。
四、重组人表皮生长因子的单克隆抗体的测定
(1)效价测定
以1:8000稀释重组人表皮生长因子(rhEGF)包被酶标检测板，将纯化后的单克隆抗体进行1:200、1:400、1:800、……1:1024000，加入到酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，最后用TMB显色，如图1所示，结果显色纯化后的人表皮生长因子单克隆抗体浓度为1mg/mL时的效价达到1:820000。
(2)亚型鉴定
采用购自Sigma公司的鼠源单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，如图2所示，重组人表皮生长因子(rhEGF)单克隆抗体亚型为IgG1。
(3)亲和力测定
采用非竞争酶联免疫法测定重组人表皮生长因子(rhEGF)单克隆抗体的亲和力常数，如图3所示，亲和力常数Ka＝3.8×107L/mol。
(4)特异性测定
用ELISA测定单克隆抗体与人表生长因子、小牛血清、转空载体大肠杆菌裂解物和转空载体酵母裂解物等交叉反应率，结果如图4所示，该抗体特异性良好，基本上与小牛血清、转空载体大肠杆菌裂解物和转空载体酵母裂解物等没有非特异性反应。
五、利用重组人表皮生长因子单克隆抗体纯化重组人表皮生长因子的方法
1、抗体预处理
(1)1～30mg/mL的抗体，4℃，用偶联缓冲液(0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH8.4)透析24h，期间每4～6h换液一次，至少换液4次。透析液的体积应500倍于抗体溶液。
(2)4℃，12000rpm离心30分钟，除去聚集体，收集保存上清。
(3)利用Nanodrop仪器，在A280测定透析后抗体的蛋白质浓度及抗体初始OD280始。
(4)用偶联缓冲液将透析后抗体稀释至10mg/mL，于4℃保存。
2、亲和层析柱的制备
(1)根据所准备的抗体的量，吸取适量的填料于离心管中，使用1×PBS多次洗涤，除去填料表面的溶剂；
(2)抗体蛋白与CNBr活化琼脂糖凝胶偶联
填料(CNBr活化琼脂糖凝胶)体积与配基溶液(抗体蛋白质溶液)的体积比为1:1.5或者为1:2。将偶联缓冲液透析后的抗体蛋白质与填料迅速混合，在摇床上振荡，25℃偶联6小时。
计算抗体与CNBr-Sepharose的偶联效率：
G0：抗体使用总量，单位：mg；
G1：偶联反应后未偶联的抗体的量，单位：mg；
V：填料的体积，单位：mL。
(3)填料(偶联后琼脂糖凝胶)沉淀，用偶联缓冲液重悬洗涤一次。颠倒混匀3分钟(要轻柔颠倒混匀，勿剧烈)；
(4)用封闭缓冲液重悬填料，填料体积与封闭缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 8.3)的体积比为1:1.5或者1:2.0。室温下，摇床颠倒混匀封闭2.5h～6h；
(5)偶联了抗体蛋白质的填料装柱。用NaCl溶液洗10个柱床体积，收集装柱子的液体以及清洗柱子的溶液，测定蛋白的含量。再用清洗液(1×PBS)冲洗10个柱床体积。
(6)可直接用于后续纯化目标(抗原)蛋白。
(7)如果长期不用，将抗体偶联琼脂糖凝胶自层析柱中移入离心管中，4℃，7000rpm离心3分钟，小心弃去上清。按抗体偶联琼脂糖凝胶与保存液1:2比例，将保存液加入到抗体偶联琼脂糖凝胶沉淀中，颠倒混匀，-20℃保存备用。
3、亲和层析获得重组人表皮生长因子
(1)制备好的偶联琼脂糖凝胶自-20℃取出，恢复至室温。
(2)颠倒温柔重悬(抗体-琼脂糖凝胶)，至亲和纯化凝胶混合均匀，吸取适量的凝胶至纯化层析柱中。
(3)3倍体积清洗液(1×PBS)冲洗亲和凝胶(此处清洗要彻底)。
(4)加入含有目标蛋白的细胞裂解液，4℃旋转孵育过夜或室温孵育2h。
(5)15倍凝胶体积PBS洗涤凝胶。
(6)用预冷的1倍凝胶体积酸性预洗液(0.15M PBS buffer，pH 5.0)洗涤纯化凝胶，除去非特异性结合蛋白。
(7)用预冷的3倍凝胶体积酸性洗脱液(0.15M Gly-HCl缓冲液，pH3.0)进行洗脱，每次收集1mL，收集管中预先放入中和液50μL。
(8)用紫外检测仪测定收集峰，合并收集峰。
(9)Tricine-SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。
(10)用10倍柱体积清洗液(0.15M PBS buffer，pH7.5)清洗亲和纯化柱。如需获得更大量的目标纯化蛋白，则可重复上样即可；如短时间内使用，存放于4℃即可。
(11)若需长时间保存，则需进行“亲和纯化柱的清洗与再生”。
4、亲和层析柱的清洗与再生
(1)用5倍凝胶体积清洗液清洗纯化柱。
(2)酸性洗脱液(0.15M Gly-HCl缓冲液，pH3.0)洗脱纯化柱三次，每次三倍凝胶体积。
(3)中和液(1M Tris-HCl缓冲液，pH8.0)洗涤柱子三次，每次三倍凝胶体积。
(4)用至少10倍凝胶体积清洗液(1×PBS)清洗纯化柱，检测流穿液pH，至流穿液pH为中性止。
(5)用1×PBS清洗，并加入适量该保存溶液至凝胶中，混匀，保存于-20℃。
5、亲和层析纯化试验结果
大肠杆菌发酵后，经处理后，用亲和层析柱纯化后，用Tricine-SDS-PAGE鉴定纯度，结果如图5所示。
经凝胶成像仪软件处理计算后，获得重组人表皮生长因子的纯度可达97.8％。

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞hEGF-3A8，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:C2021301。
2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞hEGF-3A8分泌的单克隆抗体。
3.一种如权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，选取大于12周的雌性BALB/c小鼠，采用杂交瘤细胞hEGF-3A8在体内诱生腹水，并通过Protein G层析柱纯化腹水，获得重组人表皮生长因子的单克隆抗体。
4.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在纯化重组人表皮生长因子中的应用。
5.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在亲和层析纯化重组人表皮生长因子中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其包括如下步骤：
(A)单克隆抗体的预处理
(a)1～30mg/mL的单克隆抗体，4℃，用偶联缓冲液透析24h，期间每4～6h换液一次，至少换液4次，透析液的体积应500倍于抗体溶液；
(b)4℃，12000rpm离心30分钟，收集保存上清；
(c)在A280测定透析后抗体的蛋白质浓度及抗体的初始OD280始；
(d)用偶联缓冲液将透析后抗体稀释至10mg/mL，于4℃保存；
(B)亲和层析柱的制备
(i)洗涤CNBr活化琼脂糖凝胶填料，除去填料表面的溶剂；
(ii)单克隆抗体与CNBr活化琼脂糖凝胶偶联；
(iii)偶联了单克隆抗体的填料沉淀，用偶联缓冲液重悬洗涤一次；颠倒混匀3分钟；
(iv)用封闭缓冲液重悬填料，填料体积与封闭缓冲液的体积比为1:1.5或者1:2.0；室温下，摇床颠倒混匀封闭2.5h～6h；
(v)偶联了单克隆抗体的填料装柱；用NaCl溶液洗10个柱床体积，收集装柱子的液体以及清洗柱子的溶液，测定蛋白的含量；再用清洗液冲洗10个柱床体积；(C)亲和层析获得重组人表皮生长因子
(I)亲和层析柱内加入含有目标蛋白的细胞裂解液，4℃旋转孵育过夜或室温孵育2h；
(II)15倍凝胶体积PBS洗涤亲和层析柱；
(III)用预冷的1倍凝胶体积酸性预洗液洗涤亲和层析柱，除去非特异性结合蛋白；
(IV)用预冷的3倍凝胶体积酸性洗脱液进行洗脱，每次收集1mL，收集管中预先放入中和液50μL；
(V)用紫外检测仪测定收集峰，合并收集峰；
(VI)Tricine-SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，保存蛋白质；
(VII)用10倍柱体积清洗液清洗亲和层析柱。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其还包括如下步骤：
(D)亲和层析柱的清洗与再生
(1)用5倍凝胶体积清洗液清洗亲和层析柱；
(2)pH3.0酸性洗脱液洗脱亲和层析柱三次，每次三倍柱体积；
(3)pH8.0中和液洗涤亲和层析柱三次，每次三倍柱体积；
(4)用至少10倍柱体积清洗液清洗亲和层析柱，检测流穿液pH，至流穿液pH为中性止；
(5)用1×PBS保存液清洗，并加入适量该保存溶液至凝胶中，混匀，保存于-20℃。
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